JP2003500455A - 骨盤部の末梢神経機能障害の処置における神経向性因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、骨盤部の末梢神経機能障害の患者を処置する方法にに関する。この障害は、神経症、糖尿病、急性陰茎打撲、陰茎手術、前立腺手術、膀胱手術および／または他の骨盤手術を含む疾患から生じるものである。本発明は、神経向性因子の使用を開示する。この因子は、勃起機能障害を含む末梢神経機能障害の患者の処置のための促進性または抑制性の栄養機能として作用する。神経向性因子は、タンパク質、タンパク質をコードするヌクレオチド、その受容体、その結合物質、モジュレーターを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、骨盤部の末梢神経機能障害の処置における促進性または抑制性の栄
養機能を提供する医薬を製造するために、神経向性因子を使用することに関する
。この種の障害の患者は、末梢神経症、自律性神経症、骨盤手術、骨盤打撲、陰
茎の神経支配の発達障害、糖尿病などの末梢神経症に関連する疾患の患者である
。さらに、本発明は、上記の機能障害および疾患を処置する方法を開示する。

【０００２】 （発明の背景） 勃起は主に神経仲介の血管系事象である。副交感神経系の骨盤神経が陰茎膨張
に要する平滑筋の弛緩に一義的な重要性を有する。なお、交換神経系の下腹部神
経も同様になんらかの役割を果たす。男性において陰茎支配副交感神経は出力を
供給する脊髄から骨盤中の神経節細胞に伸びる。骨盤は放出および生殖の機能に
関与する交換神経と副交感神経の集まる場所である（Dail, 1996)。主要骨盤神
経節（ＭＰＧ）の勃起誘導ニューロンは、海綿体神経を介して軸索を送り、陰茎
の血管および勃起組織に供給する（Dail, 1996; Quinlan, 1989)。最近、一酸化
窒素(ＮＯ)の基本的役割が陰茎の動脈および海綿体平滑筋における神経伝達物質
としての作用であることが、いくつかの哺乳動物でよく解明されてきた（Anders
son, 1995)。この物質は、平滑筋中に分散し、ｃＧＭＰの合成を増加し、細胞質
基質のＣａ^２＋を低下し、そして弛緩を誘導する（Buj-Bello)。男性の正常な陰
茎勃起は、無傷の神経支配、適当な血液供給、正常な勃起組織に依存する（Ande
rsson, 1995)。従って、ニューロン性経路の断絶および神経筋接合部に関連する
障害が、勃起機能障害を起こすようである（Batra, 1991)。

【０００３】 外科手術の進歩にかかわらず、やはり神経原性インポテンスは、前立腺、膀胱
、直腸の根治的な手術における望ましくないがしばしば起きる結果である（Wals
h, 1982)。インポテンスはまた、糖尿病などの自律性かつ感覚性の末梢神経障害
における通常の症状である（Eardley, 1991)。臨床的に、陰茎神経の生存をはか
り再生を高める分子を発見する必要がある。

【０００４】 最近、成長ホルモンがラットである種の陰茎神経の再生を改善することが報告
された（Jung, 1998)。この作用はインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）によ
り仲介されることが示唆される。この因子は、中枢および末梢の神経系における
多くのニューロン群について強力な神経向性因子である（Ishii, 1993)。基本的
な線維芽成長因子Ｉ（ＦＧＦ−Ｉ）も陰茎勃起の生理にある種の役割をなすと考
えられている（Te, 1994)。神経系のいくつかの疾患および障害における可能な
療法として、神経向性タンパク質またはその小分子模倣体を治療に使用すること
が示唆されている（Hefti, 1997; Skaper, 1998)。しかし、これらの分子を神経
原性インポテンスにうまく使用するには、陰茎ニューロンの保持および再生を調
節する生理因子についての一層の知識を必要とする。

【０００５】 ラットにおいてＧＤＮＦおよびその受容体のｍＲＮＡ発現を調べて、本発明者
は、ＧＤＮＦおよびその受容体がネズミの陰茎の神経支配で役割を演じることを
示す結果を得た。この観察結果に勇気つけられて、本発明者は、研究計画を続行
して神経向性因子についてさらに広範な有用性を見出すことができた。上記のい
くつかの問題、すなわち骨盤部の末梢神経機能障害（限定でないが、勃起機能障
害を含む）の処置に対する解決は、この予備的な観察を基にしている。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明の特徴的性質は特許請求の範囲のとおりである。

【０００７】 （図面の簡単な説明） 図１は、陰茎根部におけるＮＴＮｍＲＮＡ発現を示す。 図２は、ＭＰＧにおけるＮＴＮ受容体成分についてのｍＲＮＡ発現を示す。 図３は、成ラットの骨盤臓器におけるＮＴＮｍＲＮＡ発現のノーザンブロット
分析を示す。 図４は、^１２５Ｉ−ＮＴＮの陰茎根部からＭＰＧおよびＤＲＧへの逆行性軸索
性輸送を示す。 図５は、両側海綿体神経の軸索切開（ａｘ）および擬操作後の成ラットの陰茎
中のＮＴＮｍＲＮＡレベルを示す。 図６は、ＧＦＲα２^-1-および野生型マウスの陰茎におけるＮＡＤＰＨジアフ
ォラーゼの組織化学を示す。 図７は、陰茎根部におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現を示す。 図８は、成ラットの骨盤臓器におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現のノーザンブロッ
ト分析を示す。 図９は、^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの成ラットＭＰＧおよび異なるＤＲＧへの逆行性
輸送についての数量化および特性を示す。 図１０は、^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの陰茎根部からＭＰＧおよびＤＲＧへの逆行性
軸索性輸送を示す。 図１１は、受胎１３日のマウス三叉神経の神経節のコラーゲンゲルにおける３
日後の軸索発芽後成長を示す。 図１２は、成マウスＭＰＧにおけるＧＦＲα３およびＲｅｔのｍＲＮＡ発現お
よびＳ１ＤＲＧにおけるＧＦＲα３のｍＲＮＡ発現を示す。 図１３は、成マウスの骨盤におけるＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３のｍＲＮＡの
ＲＮＡ調製およびノーザンハイブリダイゼーションを示す。 図１４は、^１２５Ｉ−ＮＴＮ、^１２５Ｉ−ＢＤＮＦ、^１２５Ｉ−ＭＴ−３の成
ラットＭＰＧおよび異なるＤＲＧへの逆行性輸送についての数量化および特性を
示す。 図面は、発明の一般的説明の後に詳細に説明する。

【０００８】 発明の一般的説明 （引例） 本出願では多くの公表文献を引用する。多くの場合、括弧の中に第１著者の姓
と発表年を示す。その公表文献の完全な書誌事項は発明の一般的説明の終に記述
する。本出願において、これらの文献は出典明示により本明細書の一部とする。

【０００９】 （定義） 本発明において使用する用語は、生化学、薬理学、形質転換動物の生産に関連
する組替えＤＮＡ技術の分野で一般的に用いられている意味をもつが、いくつか
の用語については、幾分はずれた意味、または通常の状況よりも広い意味で用い
る。したがって、不明瞭な意味の用語に起因する不確かさを避けるために、本明
細書および特許請求の範囲において用いる幾つかの用語は、以下に詳しく定義す
る。

【００１０】 「神経向性因子」なる用語は、神経膠細胞系誘導の神経向性因子（ＧＤＮＦ）
ファミリー関連化合物またはニューロトロフィン（ＮＴＦ）、その受容体および
その結合物質を含む。さらに、該因子をコードするヌクレオチド配列もこの定義
に含まれる。ＧＤＮＦファミリー関連化合物は、ニュールツリン（ＮＴＮ）、神
経膠細胞系誘導の神経向性因子（ＧＤＮＦ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）および／
またはペルセフィン（ＰＳＰＮ）を含む。ニューロトロフィン（ＮＴＦ）は、神
経因子（ＮＧＦ）、脳誘導の神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−
３（ＮＴ−３）および／またはニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）を含
む。

【００１１】 さらに「神経向性因子」は、受容体または補受容体(co-receptor)上で該神経
向性因子と実質的に同じ効果を示す保存的に置換された変種または誘導体も含む
。その受容体または補受容体は、受容体ｐ７５のみならずＲｅｔチロシンキナー
ゼ、ＧＤＮＦファミリー受容体α：ｓ（ＧＦＲαｓ）およびｔｒｋ蛋白チロシン
キナーゼ受容体（ｔｒｋＡ−Ｃ）を含む。

【００１２】 「ニューロトロフィン（ＮＴＦ）」は、神経の分化、成熟および存続を統制す
るタンパク質である。ＮＴＦには神経因子（ＮＧＦ）、脳誘導の神経向性因子（
ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／
５（ＮＴ−４／５）がある (Davies, 1994; Sariola et al., 1994)。ＮＴＦは
ｔｒｋタンパク質のチロシンキナーゼ受容体に特異的に結合し、それを活性化す
る (Barbacid,1995)。すなわち、ＮＧＦはｔｒｋＡを活性化し、ＢＤＮＦおよび
ＮＴ−４／５はｔｒｋＢを活性化する。またＮＴ−３はｔｒｋＣのリガンドであ
って、効率は悪いがｔｒｋＡおよびｔｒｋＢのリガンドでもある。ｔｒｋ受容体
の完全長の触媒型に加えて、別途に継ぎ合わせたｔｒｋ異性体も幾つか存在する
。完全長触媒型ｔｒｋＢ（ｔｒｋＢ．ＴＫ＋）のｍＲＮＡは、別に２個の切断型
アイソホーム(isoform)（ｔｒｋＢ．Ｔ１およびｔｒｋＢ．ＴＳ）に継ぎ合わせ
られる。さらに、チロシンキナーゼ領域に挿入物を持つ他のアイソホームに加え
て、４個の切断型がｔｒｋＣにはある。

【００１３】 「誘導体または変種」なる用語は、本発明の「神経向性因子」の二つの主たる
グループとして、その各受容体のシグナル伝達に作用する化合物を意味する。「
誘導体または変種」は、該神経向性因子のヒト型と、アミノ酸レベルで少なくと
も８０％、好ましくは８５％、極めて好ましくは９０％以上の意味ある類似性ま
たは同等性を持つ「実質的に同族」のポリペプチドを含む。

【００１４】 「神経向性因子およびその保存的に置換された変種」なる用語は、上に定義し
た「神経向性因子」に特有の構造、性質および機能を持つポリペプチドを含む。
すなわち、「神経向性因子およびその保存的に置換された変種」なる用語は、上
記の神経向性因子を含み、そこでは１個またはそれ以上のアミノ酸残基が別のア
ミノ酸残基で置換されている。さらに、該神経向性因子の切断型、複合型または
化学的置換型もこの用語に含まれる。化学的置換型は、神経向性因子の性質およ
び機能を妨げない限り、メチル基またはエチル基のような小さい分子を用いた置
換度の小さい、アルキル型、エステル型、エーテル型、アミド型などを含む。該
ポリペプチドの切断型、複合型および／または置換型変種は、酵素的および組替
えＤＮＡ技術を含め、合成的または半合成的に作ることができる。他の前提要件
は、変種が実質的に同族であって該神経向性因子に特有の性質を持ち、および／
またはその機能を発現することである。

【００１５】 「神経向性因子および保存的に置換された変種」なる用語は、上に定義した「
神経向性因子」の可能なすべての継ぎ合せ型変種を含む。「神経向性因子」は異
なったアイソホームで存在し得る。「アイソホーム」なる用語は、組織のような
、出所の違いに由来する同じタンパク質の異なる型を指す。タンパク質またはポ
リペプチドのアイソホームは、哺乳類であるヒトおよびネズミ起源のような異な
った種の異なった組織に存在する対立遺伝子によって発現される。本発明での用
語は、フラグメント、複合体およびその変種を含む。神経向性因子のアイソホー
ムはプロタンパク質の切断によって生み出される。異なった酵素的および非酵素
的反応、およびタンパク質分解および非タンパク質分解を含む種々の反応が、神
経向性因子およびその保存的変種の切断型、誘導型、複合型を作ることができる
。

【００１６】 好ましくは、ヒトおよびネズミの神経向性因子、または該因子の少なくとも１
個の特異部位を含む、自然の哺乳類を認識しそれと特異的に結合できる結合物質
を使えば、すべての「神経向性因子およびその保存的変種」は認識できるはすで
ある。このような結合物質とは、例えば神経向性因子、ＧＦＲα：ｓ（ＧＦＲα
１−４）に関連する神経向性因子の受容体、ｔｒｋタンパク質チロシンキナーゼ
受容体（ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ）、または他の結合タンパク質、または
ＧＦＲα：ｓの特異部位を含むペプチドを特異的に認識してそれと結合する抗体
またはリガンドである。しかし、それらは、とりわけ少なくとも１個の神経向性
因子の単独または組み合わせで特異的に認識し得る抗体を意味する。抗体はフラ
グメントまたはその誘導体だけでなく、ポリクロナールおよび／またはモノクロ
ナール抗体の両方を含む。好ましくは、このような結合物質は神経向性因子の特
異的エピトープまたは活性部位を認識しそれと結合するはずである。

【００１７】 また結合物質は「神経向性因子」または各々の「受容体」に特異的に結合し得
る小さな分子を含む。「結合物質」は、該「神経向性因子」の特異領域を使って
、それらが各々のシグナル経路において機能できる必要前提要件を備えた受容体
だけでなく、それらの異性体、フラグメント、受容体、誘導体、変種、および複
合体を生み出すことができる。

【００１８】 「神経向性因子」は抗原として作用し、そのまま、または配合物として、各々
の「神経向性因子またはその保存的変種」に特異的な抗体応答を引き出す。該抗
体はものクロナール抗体のみならず、ポリクロナール抗体を生産する常套の技術
によって製造可能である。。モノクロナール抗体を生成する方法はハイブリドー
マ技術を含む。抗体のフラグメントまたは特異的結合ペプチドのような他の結合
タンパク質はファージ表示技術によって発現され、組換えＤＮＡ技術によって生
産できる。すべての方法は当業者によく知られており、また研究用ハンドブック
に記載されている。

【００１９】 本発明において「核酸配列」なる用語は、好ましくは哺乳類、特にヒト由来の
ものと実質的な類似性を持つ「神経向性因子」または「核酸配列」をコードする
、分離および精製したヌクレオチド配列またはそのフラグメントを意味し、その
核酸配列は本発明の神経向性因子をコードすることができる。本発明の「核酸配
列」は、上に定義した「神経向性因子」をコードしてそのまま使うことができ、
または適切な形質転換または発現ベクターに導入することができる。これらは順
に適切な宿主セルまたは宿主生体に導入されて神経向性因子タンパク質を生産す
るインビトロ方法を提供し、または機能障害に罹った患者の適切な組織に細胞ま
たは細胞株を埋め込むインビボ方法を提供する。こうして、上に挙げた機能障害
または疾患を処置するための遺伝子治療が本発明によって提供される。細胞が患
者の適切な器官または組織に挿入されると、神経向性因子のレベルを変化して発
現できる。

【００２０】 本発明の「核酸配列」は自然の状態のものではなく、適切な組織から一時的に
発現したｍＲＮＡとして、好ましくは自然環境から分離され精製される。その後
ｍＲＮＡは、該神経向性因子、その誘導体または変種をコードし得る新たなコピ
ーを技術的手法により供給するため、精製されインビトロで増殖される。

【００２１】 これに関連して、「ｃＤＮＡ」はゲノムＤＮＡ配列から翻訳したｍＲＮＡの逆
翻訳により入手可能なＤＮＡ配列を意味する。また、アンチセンス・ヌクレオチ
ド配列は本発明の応用に有用である。

【００２２】 「アンチセンス技術」なる用語は、正しいセンスにあるＲＮＡメッセージの逆
を意味する。「インセンス」は、ＤＮＡ鎖の一つのコピーが転写される際、配列
が元のコードに厳密に相補的である場合を除き、ＤＮＡ塩基の配列が保存される
ことを意味する。それ自身の言葉でＤＮＡからの命令を持つｍＲＮＡが、ポリペ
プチドに次いで翻訳される。もし正しく翻訳されるならば、メッセージは正しい
センスであると言われる。しかし、もし厳密に相補的な（すなわちアンチセンス
）ＲＮＡがセンスＲＮＡと結合して存在するならば、センスＲＮＡのメッセージ
は無価値となる。

【００２３】 ＲＮＡ補体を作るために、アンチセンス・メッセージが「他のＤＮＡの鎖」か
ら作成され細胞に挿入されるか、またはアンチセンス遺伝子が挿入された後で、
アンチセンス・メッセージはその細胞により翻訳される。センスＲＮＡは、その
アンチセンスＲＮＡとカップルまたはハイブリッドする際、リボゾームと結合で
きず不活性化される。こうして、もとの遺伝子は他の遺伝子に影響せずにそれ自
身のアンチセンスＲＮＡによってブロックされる。アンチセンス技術は神経の栄
養機能を調節および修飾する手段に含まれる。

【００２４】 「神経向性因子をコードする核酸配列」なる用語は、神経膠細胞系誘導の神経向
性因子（ＧＤＮＦ）ファミリー関連化合物またはニューロトロフィン（ＮＴＦ）
、その受容体およびその結合物質をコードする核酸配列を意味する。さらに、該
因子をコードするヌクレオチド配列もこの定義に含まれる。ＧＤＮＦファミリー
関連化合物は、ニュールツリン（ＮＴＮ）、神経膠細胞系誘導の神経向性因子（
ＧＤＮＦ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）および／またはペルセフィン（ＰＳＰＮ）
を含む。ニューロトロフィン（ＮＴＦ）は、「実質的に同等または類似の核酸配
列」のみならず、神経因子（ＮＧＦ）、脳誘導の神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニ
ューロトロフィン−３（ＮＴ−３）および／またはニューロトロフィン−４／５
（ＮＴ−４／５）を含む。該「ヌクレオチド配列」または、その相補的配列また
はその一部を構成する配列、例えば３’−末端または５’−末端で切断したフラ
グメントおよび点変異を含むヌクレオチド配列は、該核酸配列を運ぶ細胞または
細胞株を生産するためのＤＮＡ構成物を作るプローブまたはプライマーとして特
に有用である。

【００２５】 しかしながら、神経向性因子をコードできて、その生産に有用な他の核酸配列
が作成可能であることは、当業者にとっては明白である。神経向性因子をコード
する核酸配列は厳格な条件下でハイブリッドができるはずである(Sambrook, J.,
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor, NY
: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)。

【００２６】 本発明の「核酸配列」は上で定義した神経向性因子をコードする配列と「実質
的な類似性」をもつべきである。これに関連して「実質的な類似性」とは、ヌク
レオチド配列が上で定義した前提要件を満たし、該配列と少なくとも６０％、好
ましくは７０％、極めて好ましくは８０％以上の意味ある類似性を持つことを意
味する。これは保存的に置換された変種を定義する適切な基準でもある。コドン
縮退を考慮すべきである。

【００２７】 「神経向性因子をコードする核酸配列」なる用語は、該神経向性因子の性質お
よび／または機能のみならず、必須構造上の特徴を持つアミノ酸配列をコードす
ることができる限り、該核酸配列の点変異だけでなくその切断型または複合型を
含む。核酸はそのままで、あるいは代わって形質転換または発現ベクターまたは
宿主において有用であり、さらに該「核酸配列」は、該「神経向性因子」を明確
に認識する「結合物質」により、認識可能な該「神経向性因子」をコードし発現
することができる。

【００２８】 「神経向性因子」なる用語は、ポリペプチドまたはタンパク質に加えて、「神
経向性因子およびその保存的に置換された変種」をコードする「核酸配列」も含
む。それは結合ペプチドまたはリガンドだけでなく、プライマー、プローブ、抗
体、受容体を含む。該物質は、勃起機能障害を含む骨盤部の末梢神経機能障害の
研究にだけでなく、特に診断および処置するのに有用である。「ゲノム配列」な
る用語は、「ヌクレオチド配列」がイントロンを伴いまたは伴わずにエクソンを
含む哺乳動物細胞の核の中に存在することを意味する。

【００２９】 「栄養機能」なる用語は、神経の存続を支援し再生を増進する物質、化合物、
または分子を意味する。該物質は、ある生成物の活性または量を促進または増加
することにより、神経の再生および存続を支援することができるし、一方では、
ある化合物の量または活性を廃止、阻害、抑制、または低下することによって、
その存続および再生を改善することもできる。

【００３０】 「治療的処置」なる用語は、１個またはそれ以上の神経向性因子を単独または
配合で、神経向性因子結合物質を単独または機能的配合で、また神経向性因子を
コードする核酸配列を有効成分として含む組成物を投与することにより、処置の
必要な患者を処置する方法を含む。遺伝子治療は、骨盤部の機能障害により乱さ
れた遺伝子生成物の生成レベルを相殺するために、すなわち栄養機能として作用
するように、本発明の核酸配列または遺伝子を導入することを含む。投与される
「神経向性因子の量」とは、有効であるが適切で測定可能な効果が、処置された
組織内で得られるような「有効量」である。「神経向性因子の量」は、神経向性
因子またはその各結合物質の既知量を基準として用い、それ自体よく知られた免
疫測定によって現在好んで決定または選別される。

【００３１】 「組成物」なる用語は、有効成分および投与経路に適合し薬学的に許容される
、少なくとも１個の助剤と配合した、神経向性因子、神経向性因子をコードする
核酸分子、該神経向性因子のモジュレーター、および／またはその抗体を含む本
発明の有効成分を意味する。助剤は液体または固体の担体、および他の液体また
は固体の添加剤を含む。組成物は、注射針および使用説明書と共に、容器、包装
、またはディスペンサーの中に入れることができる。本発明の核酸配列は、適切
な細胞、ベクターまたはそれ自体よく知られた他の送達システムによって遺伝子
治療に使うことができる。

【００３２】 「埋め込まれた細胞」は、処置の必要な患者の適切な組織および／または体液
中に活性な神経向性因子の拡散を可能とし、また内容物、神経向性因子をコード
するベクターまたは核酸配列のみならず、それを細胞の攻撃、破壊または分解か
ら患者の免疫系を同時に防ぐところの半透過膜に好ましく封入される。

【００３３】 本発明において「神経向性因子」として定義される「核酸配列」、タンパク質
、タンパク質同族体、モジュレーター、受容体およびその抗体は、薬物スクリー
ニング試験、診断検査、治療方法、薬理ゲノムおよび臨床試験中治療効果のモニ
ターに用いられる。

【００３４】 本発明の「核酸配列」は、哺乳類の細胞または細胞株に導入可能な哺乳類ベク
ターを提供するために使われる。原核細胞および真核細胞の適切な発現系は、Sa
mbrook et al., 1989 に記載されている。宿主細胞は本発明の神経向性因子を発
現するのに使うことができる。本発明の宿主細胞は、勃起不全を含む骨盤部の機
能障害を改善することができる、試薬、化合物、薬物、医薬品等を同定するため
に考えた、スクリーニング試験に有用な非ヒト形質転換動物を作成するのにも役
立つ。該神経向性因子は単体または組成物として、またはその複合体または混合
物として、そのいずれかで用いることができる。「神経向性因子応答細胞」は、
ここで使うように、上に挙げた神経向性因子の少なくとも１個によって調節（例
えば、促進または阻害）することができる生理活性をもった細胞を含む。

【００３５】 神経向性因子によって引き出される反応は、細胞のタイプに応じて異なる。陰
茎を支配する感覚神経におけるニュールツリン、ＧＤＮＦ，ペルセフィン、アル
テミンおよび／またはニューロトロフィンの受容体発現および逆行性輸送は、こ
れらが骨盤部の末梢神経障害、特に勃起機能障害の処置に使えることを示唆して
いる。これら障害は、末梢神経症、自律性神経症、骨盤手術、骨盤打撲、陰茎の
神経支配の発達障害、糖尿病などの末梢神経症に関連する疾患に起因するもので
ある。

【００３６】 （発明の一般的説明） 発明の背景に記載したように、勃起は主として神経介在の血管上の事象である
。交感神経系の胃下部神経もいくらか役割を果たしているが、副交感神経系骨盤
神経は陰茎の膨張に必要とされる平滑筋の弛緩に大変重要である。ヒトにおいて
、陰茎神経支配の交感神経は、骨盤神経叢の神経節細胞に情報を入力する仙骨脊
髄に起因している。骨盤神経叢は除去と再生機能に関係する交感神経系ニューロ
ンと副交感神経系ニューロンの連合体である(Dail, 1996)。雄ラットでは、骨盤
神経叢は単一大神経叢と大骨盤神経節（ＭＰＧ）の両方で特徴づけられ、後者に
よってラットは勃起研究での優れた動物モデルとなる(Quinlan, 1989)。ヒトに
おける正常な陰茎勃起は、無傷の神経支配、適切な血液供給および健全な勃起組
織に依存している(Andersson, 1995)。したがって、神経経路の遮断または神経
筋接合部に影響する障害は、勃起障害を引き起こすと思われる(Batra, 1991)。

【００３７】 ＮＴＮは感覚ニューロン、交感神経系ニューロン、腸ニューロン、運動ニュー
ロン、および中脳ドーパミン作用性ニューロンなどに対する生存促進活性を持っ
ていることが知られている(Kotzbauer, 1996; Heuckeroth, 1999; Klein, 1997; Horger, 1998)。ＧＤＮＦファミリー族の生理作用は、ＧＤＮＦファミリー受容
体α１−４と称する成分を結合する、グリコシルフォスファチジルイノシトール
（ＧＰＩ−）を連結したリガンドからなる多成分受容体複合体を経て仲介され、
またシグナル変換受容体であるチロシンキナーゼＲｅｔが証明されている(Airak
sinen, 1999)。

【００３８】 インビトロ試験の結果、ＮＴＮ―ＧＦＲα２とＧＤＮＦ―ＧＦＲα１、ＡＲＴ
Ｎ―ＧＦＲα３とＰＳＰＮ―ＧＦＲα４といった優位なペアーが示されている。
ＧＦＲα：ｓのリガンド特異性に関わる混乱はまだあるが、最近の遺伝子除去の
研究で、ＧＰＩ連結補受容体とＧＤＮＦファミリー族間の相互作用についてのイ
ンビボ特異性が示唆されている(Airaksinen, 1999)。

【００３９】 ＧＦＲα２またはＮＴＮ遺伝子が除去されたマウス間での驚くべき表現型類似
性は、ＧＦＲα２がＮＴＮの生理的補受容体であるとの概念を支持する(Rossi,
1999; Heuckeroth, 1999)。示されたマウスには、副交感神経系に重大な欠陥が
あって、このことはＮＴＮが神経節後の副交感神経系ニューロンの進展および／
または維持に必要であることを示唆する。

【００４０】 ＧＤＮＦは、多重ＧＦＲα／Ｒｅｔ複合体とインビトロで相互作用できる(Bal
oh, 1997; Jing, 1997; Sanicola, 1997; Suvanto, 1997)。しかしながら、ＧＤ
ＮＦまたはＧＦＲα１を欠いたマウスが同様の欠陥を示す最近の遺伝子除去研究
によると(Cacalano, 1998; Enomoto, 1998; Moore, 1996; Pichel, 1996; Sanch
ez, 1996)、ＧＤＮＦはインビボでＧＦＲα１を経て実質的に作用することが明
らかとなっている。記載のマウスは腎臓および小腸神経系を発達することができ
ず、生後数日以内に死亡し、また中枢および末梢神経の両方に類似の欠陥を示し
ている。

【００４１】 末梢神経は神経支配の標的臓器で生成する神経向性因子を絶え間なく必要とす
ることが知られている(Davies, 1994; Henderson, 1996)。神経向性因子は、神
経変性疾患の動物モデルにおいてその強い薬理効果を示すため、傷害した神経系
の処置に有望な薬物であると示唆されている(Hefti, 1997; Skaper, 1998)。神
経向性因子には、発育中および成体の萎縮または死亡を防ぐ能力がある。神経原
性インポテンツは重大な問題であり、陰茎勃起誘導ニューロンに重要な神経向性
因子については殆ど知られていない。その潜在的な神経防御的性質は治療的価値
を持っているであろうから、陰茎神経向性物質を同定することは実用的であるよ
うに思われる。ＧＤＮＦは、胚胎状態のラットの腹側中脳ドーパミン作用性ニュ
ーロンの存続および分化を促進する能力に基づいて、元は単離された(Lin, 1993
)。ＧＤＮＦは変換増殖因子−ｂ（ＴＧＦ−ｂ）スーパーファミリーの遠縁関係
の一員であり、またニューツリン（ＮＴＮ）(Kotzbauer, 1996)、ペルセフィン
（ＰＳＰＮ）(Milbrandt, 1998)、およびアルテミン（ＡＲＴＮ）(Baloh, 1998)
と共にＧＤＮＦを構成する。ＧＤＮＦは中枢神経系のドーパミン作用性ニューロ
ン、ノルアドレナリン作用性ニューロン、および運動ニューロン (Arenas, 1995
; Henderson, 1995; Lin, 1993; Oppenheim, 1995; Tomac, 1995; Yan, 1995)、
さらに末梢知覚ニューロンおよび交感神経系ニューロンの種々の亜母集団(Buj-B
ello, 1995; Ebendal, 1995; Trupp, 1995) を維持する。

【００４２】 さらに、ＧＤＮＦまたはＧＦＲα３のどちらかを欠いたマウスの交感神経系上
位の頚部神経節における欠陥が示唆するのは、ＧＤＮＦの生理効果のいくらかが
ＡＲＴＮの優位なリガンド結合受容体であるＧＦＲα３を経て仲介されているこ
とである(Moore, et al., 1996; Sanchez et al., 1996; Baloh et al., 1998;
Nishino et al., 1999)。

【００４３】 ＧＦＲα３ ｍＲＮＡが大骨盤神経節（ＭＰＧ）の大型ニューロン中で主とし
て発現されるとの観察結果は、成熟ラットにおいてＡＲＴＮは骨盤アドレナリン
作用性ニューロンの維持因子であるという仮説に合致する。ＭＰＧにおいても、
陰茎投射神経の亜母集団はＧＦＲα３のｍＲＮＡを発現した。興味深いことに、
ラットＭＰＧ中のＧＦＲα３の分布は、ニューロペプチドＹ（ＮＰＹ）について
の記述と似ている(Keast および de Groat, 1989)。しかし、補受容体のＧＦＲ
α３およびＮＰＹが同じニューロンに発現するのかどうかは、未解決のままであ
る。さらに価値あることは、ＧＦＲα３ ｍＲＮＡは陰茎感覚ニューロンのほぼ
半分に、さらに小および中細胞においては優先的に発現されることである。この
ことは、ＧＤＮＦおよびＡＲＴＮは、それぞれＧＦＲα１およびＧＦＲα３の主
要なリガンドであるが、陰茎感覚ニューロンのはっきりした母集団に少なくとも
部分的に影響を及ぼすことを示唆している。加えて、ＭＰＧおよびＳ１背根神経
節（ＤＲＧ）でのＧＦＲα３ ｍＲＮＡの発現は、ＡＲＴＮもまた成熟ラットに
おける骨盤自律神経系および感覚ニューロンの亜母集団にとって神経向性因子と
して役立ことを可能性として暗示している。

【００４４】 機能的な副交感神経系神経の供給が陰茎の勃起には必要であるので、陰茎の副
交感神経系ニューロンの神経向性因子としてＮＴＮの必要性が研究された。ラッ
トはしっかりした大骨盤神経節（ＭＰＧ）を持っているため、ラットが実験動物
として選ばれたが、そのＭＰＧは前立腺に左右相称的に位置し、遠心性の陰茎一
酸化窒素作用性神経の主たる源である(Quinlan, 1989; Ding, 1993)。この神経
節はまた体内の生殖器官、下部腸および尿路を神経支配する交感神経と副交感神
経の混合物を含んでいる。

【００４５】 ニューロトロフィン（ＮＴＦ）は神経の分化、成熟、存続を統制するタンパク
質である。起源を特定するため、４個ののＮＴＦについて記す。神経因子（ＮＧ
Ｆ）、脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）
、およびニューロトロフィン４／５（ＮＴ−４／５）(Davies, 1994; Sariola,
1994)。ＮＴＦは特異的にｔｒｋタンパク質のキナーゼ受容体に結合し、これを
活性化する(Barbacid, 1995)。すなわち、ＮＧＦはｔｒｋＡを活性化し、ＢＤＮ
ＦおよびＮＴ−４／５はｔｒｋＢを活性化する。またＮＴ−３はｔｒｋＣのリガ
ンドであって、効率は悪いがｔｒｋＡおよびｔｒｋＢのリガンドでもある。

【００４６】 ｔｒｋ受容体の完全長触媒型に加えて、継ぎ合わせたｔｒｋ異性体も幾つか別
に存在する。完全長触媒型ｔｒｋＢ（ｔｒｋＢ．ＴＫ＋）のｍＲＮＡは、２個の
切断型のアイソホーム（ｔｒｋＢ．Ｔ１およびｔｒｋＢ．ＴＳ）に別に継ぎ合わ
せられる。さらに、チロシンキナーゼ領域に挿入物を持つ他のアイソホームに加
えて、４個の切断型がｔｒｋＣにはある(Barbacid, 1995)。

【００４７】 陰茎は、感覚、交感神経系および副交感神経系の神経線維によって刺激される
から、ＮＴＦの役割を研究するのに興味深いモデルである。しかし、陰茎神経に
おける受容体（ＴＲＫ）の分布は研究されていない。ニューロトロフィンに関す
るわずかの研究報告は、ＮＧＦについてと、雌の骨盤神経節と関係を断ったニュ
ーロンについてのものである。しかし、神経支配には雄と雌との間に大きな差が
あり、したがって雌に関するデータは雄に一般化できない。骨盤神経節のｔｒｋ
受容体の組織局在性は知られていない。成熟ラットでのＮＴＦおよびその受容体
の発現は系統的に研究されていないので、ラットの陰茎におけるすべてのニュー
ロトロフィンとその受容体について詳しく研究が行なわれた。

【００４８】 ＮＴＮの役割は、陰茎の副交感神経系ニューロンに対する標的誘導の神経向性
因子として特徴づけられた。得られたデータは、いくつかのＧＤＮＦファミリー
族が陰茎の感覚および副交感神経系ニューロンの機能を制御するのと協調して作
用することを示している。陰茎神経に対するＧＤＮＦおよびＮＴＮの役割を評価
するため、成熟ラットの陰茎の根部におけるその発現が、インシトゥ・ハイブリ
ッド形成法およびノーザン・ハイブリッド形成法によって研究された。ＧＤＮＦ ｍＲＮＡを発現する陰茎細胞の特徴づけに免疫細胞化学が用いられた。^１２５ Ｉ−ＧＤＮＦまたは^１２５Ｉ−ＮＴＮが静脈内投与され、その逆行性輸送が知覚
および副交感神経系陰茎神経で研究された。陰茎でのＮＴＮ ｍＲＮＡの合成が
神経細胞性制御下にあるかどうかを調べるため、その発現が海綿体神経の軸索切
断後に研究された。陰茎投射神経のＧＦＲα２媒介シグナリングの生理学的重要
性をさらに明らかにするため、ＧＦＲα２^−１−マウスにて陰茎神経支配が研究
された。その結果は、陰茎の感覚神経および勃起誘発神経の神経支配／維持／再
生におけるニューロトロフィンの役割を示唆する。

【００４９】 ニューツリン（ＮＴＮ）および、これに限定しないがアルテミンおよびペルセ
フィンを含む、神経向性因子の神経膠細胞系誘導の神経向性因子（ＧＤＮＦ）フ
ァミリーの他のメンバーは、発育中および成熟したげっ歯類における中脳ドーパ
ミン作用性ニューロン、感覚ニューロンおよび運動ニューロンを含む、中枢性お
よび末梢性神経系ニューロンの幾つかの母集団の存続を促進する。ＮＴＮは陰茎
投射の副交換神経性ニューロンの内因性栄養因子と同定された。ＮＴＮ ｍＲＮ
Ａは、成熟ラットの陰茎血管平滑筋および陰茎海綿体、ならびに他の二、三の骨
盤器官内にもに発現された。ＮＴＮ受容体構成要素であるＧＦＲα２およびＲｅ
ｔ ｍＲＮＡは陰茎副交感神経系ニューロンの至る所で発現された。副交感神経
系および感覚ニューロンにおける、陰茎に注射した^１２５Ｉ−ＮＴＮの逆行性輸
送によって、この系のＮＴＮの機能性が確認された。陰茎内のＮＴＮ ｍＲＮＡ
レベルは、両側性空洞性神経の軸索切断後も変わらなかった。ＧＦＲα２^−１− マウスの背面陰茎神経および海綿体神経の両方において、神経線維を含む一酸化
窒素合成酵素（ＮＯＳ）の意味ある大きな減少は、陰茎神経支配に対するＧＦＲ
α２の生理的重要性を示した。

【００５０】 ＧＤＮＦ受容体構成要素であるＲｅｔ、ＧＦＲα１およびＧＦＲα２は、成熟
ラットの大骨盤神経節（ＭＧＰ）および背根神経節の陰茎ニューロンに発現する
ことが示された。逆行性軸索輸送は過剰の非ラベルＧＤＮＦにより阻害されるが
、過剰のシトクロムｃは輸送にまったく影響を及ぼさなかった。これは輸送が軸
索末端に存在する特異的受容体との結合によって仲介されることを示唆する。イ
ンシトゥ・ハイブリッド形成法は、陰茎根部におけるＧＤＮＦ ｍＲＮＡの生成
を明らかにした。ＧＤＮＦ ｍＲＮＡの発現は白膜と勃起組織の境界にある細胞
列において見られる。この細胞はビメンチンおよびＳ１００ｂｅｔａに対する抗
体により認識されるが、一方平滑筋アルファ・アクチンおよびＰＧＰ９.５に対
する抗体はなんら免疫活性を示さなかった。合わせて考えると、これらのデータ
は、ＮＴＮが神経節前ニューロンを含む陰茎勃起の標的誘導の存続因子および／
または軸索生成因子として作用することを示している。以上の結果、ＧＤＮＦは
成熟ラットの陰茎における標的誘導の神経向性因子として作用することが示され
た。

【００５１】 ニューロトロフィンの発現およびその高・低親和性受容体のｍＲＮＡの発現が
、成熟ラットの陰茎および骨盤神経叢における放射活性のインシトゥ・ハイブリ
ッド形成法により研究された。ＮＴ−３およびＮＧＦ ｍＲＮＡの転写が陰茎で
見られた。完全長ｔｒｋＣ．ＴＫ＋は、成熟ラットの骨盤神経叢の陰茎神経支配
のフッ素−金標識ニューロンの亜母集団に発現したが、ｔｒｋＡおよびｐ７５
ｍＲＮＡはラットの大骨盤神経節（ＭＰＧ）の非陰茎投射ニューロンに主として
発現した。低レベルのＢＤＮＦ ｍＲＮＡはノーザン・ハイブリッド形成法によ
って検出されたが、ＭＰＧからｔｒｋＢ ｍＲＮＡは検出されなかった。ヨウ素
化ＮＧＦはＳ１背根神経節に逆行的に輸送された。すべてのｔｒｋ ｍＲＮＡは
、成熟ラットの陰茎に求心性神経支配をもたらす感覚神経節のＳ１ ＤＲＧに発
現した。成熟ラットの陰茎根部におけるＮＴ−３ ｍＲＮＡおよび陰茎神経支配
ニューロンにおけるｔｒｋＣ．ＴＫ＋ ｍＲＮＡの発現は、陰茎ニューロンの神
経支配および再生におけるＮＴ−３の役割を示唆する。陰茎神経支配Ｓ１ ＤＲ
Ｇニューロンにおけるすべてのｔｒｋ受容体ｍＲＮＡの発現も、糖尿病により引
き起こされる感覚神経障害のような、神経に影響する疾患の処置でのニューロト
ロフィンの役割を示唆する。

【００５２】 ＧＤＮＦの黒線状体ドーパミン栄養活性の特徴づけが、かなりの興味を生み出
し、また同様の生存促進活性を持つ類似の因子を見つける努力を引き起こした。
ＮＴＮの発見に続いて間もなく、末梢および中枢神経系の神経母集団の生存を促
進するＮＴＮの能力が証明された。しかし、骨盤器官におけるＮＴＮの役割は研
究されていない。ＮＴＮ ｍＲＮＡは、他の骨盤器官だけでなく陰茎平滑筋にお
いて発現されるが、一方、陰茎神経支配の大骨盤神経節（ＭＰＧ）ニューロンは
ＲｅｔおよびＧＦＲα２のｍＲＮＡを発現し、ＮＴＮを特異的に取り込んで輸送
することができる。このように、ＮＴＮは骨盤部内で栄養回路の役割をになって
いるようである。多くのＭＰＧニューロンにおけるＧＦＲα２およびＧＦＲα１
の共発現は、他のＧＤＮＦファミリー族がこれらニューロンの機能を調節できる
との可能性を提起する。ＧＦＲα２およびＧＦＲα１ ｍＲＮＡについて同様の
部分的重複発現が、中枢神経系 (Trupp, 1998; Sanicola, 1997; Naveilhan, 19
98; Widenfalk, 1997; Golden, 1998)、また末梢性感覚神経節および交感神経節
において(Yu, 1998; Bennet, 1998; Baloh, 1997) 広く見られる。それにも関わ
らず、このような共同発現の生理学的役割はよく理解されていない。

【００５３】 遠位軸索末端から神経細胞体への逆行性輸送はニューロンの神経向性因子の機
能についての重要な基準である。本発明は、成熟ラットの陰茎投射の大骨盤神経
節（ＭＰＧ）ニューロンにおけるＮＴＮの結合、取り込み、および逆行性軸索輸
送を明示する。本発明はこれらニューロンに対する標的誘導の栄養因子としてＮ
ＴＮの役割を明確に示す。同様の栄養回路は、例えば線条体内に注射したＧＤＮ
Ｆが中脳のドーパミンニューロンによって逆行輸送される、黒色線条体系におい
て知られている(Tomac, 1995)。非放射活性な親タンパク質のそれに匹敵する神
経突起成長促進活性をもつ^１２５Ｉ−ＮＴＮが、１００倍程度過剰のＮＴＮの存
在下では輸送されないが、１００倍過剰のシトクロムｃの存在下で輸送された、
という事実は、軸索末端で特異的な受容体によって逆行性輸送が仲介されている
ことを示唆している。ＭＰＧに加えて^１２５Ｉ−ＮＴＮは、陰茎の求心性神経を
供給することが知られるＳ１ ＤＲＧに、ある程度輸送されることがオートラジ
オグラフィーで明らかとなった(Dailey, 1989)。Ｓ１ ＤＲＧの放射活性が低レ
ベルであるのは、ＧＦＲα２ ｍＲＮＡがわずか６％発現したのに対し、ＧＦＲ
α１はＳ１ ＤＲＧ内の陰茎投射ニューロンの５７％を発現した（データは示さ
ず）。事実、陰茎ニューロンにおける^１２５Ｉ−ＮＴＮの逆行性輸送についての
予備的結果は、ＧＤＮＦおよびＮＴＮがＤＧＲニューロンの異なった母集団に大
部分輸送されることを示唆している。このことは、インビボＮＴＮシグナリング
がＧＦＲα２に結合して仲介される、という見解を支持する。

【００５４】 陰茎平滑筋におけるＮＴＮ ｍＲＮＡのニューロン指向接触と発現との間に一
致が見られるということは、神経支配が標的でのＮＴＮの生成を調節する可能性
を示す。しかしながら、陰茎海綿体神経の両側性軸索切断は、ＮＴＮ ｍＲＮＡ
の量を著しく変えることはなく、これは副交感神経支配が陰茎平滑筋でのＮＴＮ
発現を調整するものではないことを示唆している。このことは新生児と成熟動物
における自律神経の除去実験の結果と一致する。例えば、新生児期ラットの心臓
、および成熟ラットの虹彩の両方において、交感神経切除後もＮＧＦ ｍＲＮＡ
のレベルは変わらなかった(Shelton, 1986)。

【００５５】 ＮＴＮ ｍＲＮＡは軸索切断に呼応して増加はしないが、交感神経切除後の心
臓および虹彩内、または感覚神経切断後の皮膚内のＮＧＦについて報告されてい
るように(Shelton, 1986; Harper, 1999)、ＮＴＮタンパク質は逆行性輸送を欠
くため標的器官に蓄積する。仮説的に増加し局在するＮＴＮは、一側性海綿体神
経切断後に起こることが報告されているように、陰茎の再神経支配を促進する。
なお、ここで健全な軸索は、対側性に神経を除去された側に伸展することが示さ
れている(Jung, 1998; Carrier, 1995)。しかしながら、本仮説の確認は、さら
なる実験を必要とする。

【００５６】 ＧＦＲα２^−１−マウスには(Rossi, 1996)、すべてではないが幾つかの副交
感神経系ニューロンに欠陥があるとの最近の観察が、陰茎の一酸化窒素作用性神
経支配がこの遺伝子の除去によって変わるかどうかを研究するきっかけとなった
。ＧＦＲα２を欠くマウスは、背面神経および陰茎脚の両方に線維を含む、かな
り減少した数のＮＯＳを持っていることが分った。陰茎における一酸化窒素作用
性線維の密度の減少がニューロンの欠損または軸索分枝の減少に因るのかどうか
は、将来の研究で示されるであろう。理由はともあれ、現データは陰茎の副交感
神経系ニューロンへのＧＦＲα２介在シグナリングの機能的役割についての証拠
を提供する。この観点で、ＧＦＲα２^−１−マウスが多産であることは、少々驚
異的なことのように思われる(Rossi, 1999)。しかしながら、当結果が繁殖成果
のわずかなな欠陥を除外するものではない。他方、遺伝子を除去されたマウスに
おいては、除去された遺伝子に高度に依存すると思われる働きを、代償機構が引
き継ぐのは一般的なことである。例えば、神経性ＮＯＳ遺伝子の標的除去を受け
たマウスは、陰茎の内皮性ＮＯＳの発現を増加させる(Burnett, 1996)。他のＧ
ＤＮＦファミリー族の代償作用は、ＧＦＲα２^−１−マウスにおける陰茎の一酸
化窒素作用性の神経支配が部分的に存在することに対する、もうひとつの可能な
説明である。好ましい補受容体のＧＦＲα１が陰茎のＭＰＧニューロンの半分以
上で発現するから、この結果は特にＧＤＮＦの代償作用の役割を示している。他
の神経栄養因子により仲介される機能もまた合理的な可能性を持っている。

【００５７】 副交感神経系陰茎ニューロンの栄養因子としてのＮＴＮの役割は、陰茎平滑筋
におけるＮＴＮ ｍＲＮＡの発現および神経末端から大骨盤神経節（ＭＰＧ）ニ
ューロンの細胞体への^１２５Ｉ―ＮＴＮの輸送によって示される。さらに、これ
れの結果は、陰茎でのＮＴＮ ｍＲＮＡ発現は海綿体神経切除の後で変わらなか
ったことを示している。ＧＦＲα２^−１−マウスにおいて神経線維を含むＮＯＳ
の減少は、インビボ副交換神経系陰茎ニューロンへのＧＦＲα２介在シグナリン
グの生理的役割に注意を向けさせる。

【００５８】 成熟ラットの陰茎でのＧＤＮＦ ｍＲＮＡの発現は二つの別個の方法で確認さ
れた。インシトゥ・ハイブリッド形成法は被膜下細胞層のＧＤＮＦ ｍＲＮＡの
著しい発現を示し、ノーザン・ハイブリッド形成法では、以前に報告されたもの
に対応するサイズの転写体を検出した。ノーザン・ハイブリッド形成法において
、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡは成熟ラットの陰茎の根部にのみ見られたが、検討した他
の骨盤器官はハイブリッド形成を示さなかった。これは、成熟ラットの骨盤器官
におけるＮＴＮ ｍＲＮＡの広い発現に反している。これらの結果は、骨盤部の
標的誘導神経向性因子としてのＧＤＮＦの役割が陰茎のみに限られていることを
示唆している。しかしながら、神経向性因子は典型的には少量が生成するので、
感受性の検出限界以下の量でＧＤＮＦ ｍＲＮＡが骨盤器官にて発現している可
能性は排除できない。この可能性は、骨盤器官を神経支配する副交感神経系ニュ
ーロンおよび感覚ニューロンにおいて、ＧＤＮＦ受容体組成が広く発現すること
によって支持される。

【００５９】 ＧＤＮＦ ｍＲＮＡを発現する被膜下細胞の機能を決定するため、二、三の抗
体が使われた。切片を平滑筋アルファ・アクチンまたはＰＧＰ９.５の抗体で染
めても、被膜下部位に免疫活性はなかった。平滑筋アルファ・アクチンの抗体は
平滑筋細胞を認識する筈であるが(Skalli, 1986)、ＰＧＰ９.５の抗体は優れた
汎神経マーカーである(Ermisch, 1995; Thompson, 1983)。染色されないという
ことは、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡ発現細胞は平滑筋でも、ニューロンでもないことを
示唆している。しかし、明確なシグナルがビメンチンおよびＳ１００ｂｅｔａ抗
体で認められた。ビメンチン抗体はmechencymal細胞のマーカーと考えられるが(
Leader, 1987)、一方Ｓ１００ｂｅｔａの抗体は、神経膠細胞、軟骨細胞、脂肪
細胞のごとき種々のタイプの細胞を認識することが報告されている(Griffin, 19
95; Haimoto, 1987)。ビメンチンに対する免疫活性はＧＤＮＦ ｍＲＮＡ発現細
胞がmechencymal 起源であることを示す。先にDailらは（１９９５）、ラットの
陰茎の白膜と勃起組織の境界が、ＮＡＤＰＨ−ジアホラーゼに適度に染められた
主要な核を持つ小細胞によってマークされることを報告した(Dail, 1995)。検討
した細胞の、同様の局在性と形態に基づいて、この細胞はＧＤＮＦ ｍＲＮＡを
発現する細胞と同等であることが示されている。

【００６０】 成熟ラットの陰茎根部にて内在的に生成するＧＤＮＦの生理学的な役割は明ら
かにされていない。しかし、感覚神経および副交感神経の亜母集団における機能
的受容体の発現は、ＧＤＮＦがこれら陰茎神経に対する標的誘導の神経向性因子
であるとの考えを支持する。もう一つの可能性は、ＧＤＮＦが陰茎根部での局所
的な役割を持っている、ということである。しかしこの考えは、インシトゥ・ハ
イブリッド形成法によって陰茎根部にＲｅｔ ｍＲＮＡが検出されなかったこと
から、ありそうにない。陰茎での他の未知のＧＤＮＦシグナリング受容体の存在
もまた可能であって、これを排除することはできない。

【００６１】 逆行性輸送は、標的誘導の神経向性因子が神経細胞体においてその生理学的効
果を仲介する共通の機構である。現在の知見は、ラットの生理学的に活性な組替
えＧＤＮＦが静脈内注射後感覚神経および副交感神経によって逆行輸送されるこ
とを立証する。ガンマー線の計量およびオートラジオグラフィーから、Ｓ１ＤＲ
ＧおよびＭＰＧのニューロンの両者に放射活性が認められた。^１２５Ｉ−ＧＤＮ
Ｆの輸送が、過剰のシトクロムｃではなく、過剰の非標識ＧＤＮＦによって阻止
され事実は、軸索末端に位置する特異的受容体と結合することにより輸送が仲介
されていることを示唆する。

【００６２】 ＧＦＲα２は陰茎ＭＰＧニューロンの９８％で発現されるのに反し、ＧＦＲα
１ ｍＲＮＡは５４％で発現されることが示された。同様に、ＧＦＲα２はＳ１ ＤＲＧ内の陰茎感覚ニューロンのわずか６％であったが、ＧＦＲα１は５７％
が発現した。陰茎神経の^１２５Ｉ−ＧＤＮＦ逆行性輸送に関する結果は、受容体
分布とよく一致している。感覚神経における^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの輸送は^１２５ Ｉ−ＮＴＮに比べ、より効果的なようであるが（オートラジオグラフィー後、よ
り多くの標識細胞のプロフィール）、一方、^１２５Ｉ−ＧＤＮＦを注射後ＭＰＧ
には、わずかな放射活性が検出された。これらの結果は、陰茎ニューロンにおけ
る^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの輸送はＧＦＲα１によって仲介されるとの考えを支持し
、したがって、陰茎ニューロンの亜母集団のみがＧＤＮＦの栄養的影響に対して
敏感であることを示唆する。

【００６３】 逆行性輸送は神経向性因子の薬理学的送達において重要である。これらの結果
、ヒトでのＧＤＮＦの海綿体内注射が逆行性輸送を呼び起こし、それによって感
覚ニューロンおよび副交感神経系ニューロンへの栄養的影響を発揮することが示
唆される。

【００６４】 本発明は、ＧＤＮＦ ｍＲＮＡが成熟ラットの陰茎にて発現され、陰茎感覚お
よび副交換神経末端が陰茎の根部に注射された^１２５Ｉ−ＧＤＮＦと結合し、そ
れを取りこみ、ついで輸送し得ることを示している。このように、今回の結果に
基づいて、神経原性インポテンツの治療としてＧＤＮＦの使用は実際的であろう
。

【００６５】 大骨盤神経節ニューロンはｔｒｋＣ．ＴＫ＋のｍＲＮＡを発現し、^１２５Ｉ−
ＮＴ−３を逆行性輸送するが、このことはこれらのニューロンがＮＴ−３に敏感
であることを示唆する。研究したすべてのＮＴＦ（ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ
−３）はＳ１ ＤＲＧに輸送されるが、これは成熟ラットの陰茎の感覚神経支配
に対する栄養的役割を示唆している。

【００６６】 これらの結果は、ＮＴＮ、ＧＤＮＦまたはＮＴ−３が、陰茎海綿体神経の機能
障害に起因するインポテンツの処置に使用できることを示す。骨盤器官（例えば
、陰茎、膀胱、前立腺、結腸、直腸、輸精管、精嚢）への局所的投与、ＮＴＮ、
ＧＤＮＦ、ＮＴ−３または結合基質を活性化する他のＧＦＲα１、ＧＦＲα２、
Ｒｅｔ、またはｔｒｋＣ受容体の全身投与または生産性向上が、健常人および患
者の骨盤神経叢ニューロンの再生および存続を高める。

【００６７】 ＮＴＮ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３または結合基質を活性化する他のＲｅｔまたはｔ
ｒｋＣ受容体は、骨盤神経叢ニューロンの再生を高め、存続を支援し、それゆえ
、末梢神経症、自律性神経症、骨盤手術、骨盤打撲、陰茎の神経支配の発達障害
、糖尿病などの末梢神経症に関連する疾患による、ヒトの勃起機能障害の治療に
使用できるであろう。

【００６８】 ＮＴＮ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＧＦおよびＢＤＮＦの受容体発現と陰茎の求
心性（感覚）神経への逆行性輸送は、これらの成長因子が、感覚神経症にある陰
茎および他の骨盤器官を神経支配する感覚ニューロンの処置に使用し得ることを
示す。

【００６９】 結果として、本発明が骨盤部の末梢神経機能障害の処置に関連すると結論づけ
る多くの証拠が集積した。該証拠を基に、ヒトの勃起障害をも研究する方法が開
発され、これらは順に、末梢神経症、自律性神経症、骨盤手術、骨盤打撲、陰茎
の神経支配の発達障害、糖尿病などの末梢神経症に関連する様々な疾患および外
科的障害に起因する、骨盤部の末梢神経機能障害に対する新しい処置方法を提供
した。

【００７０】 本発明は、限定するものではないが、末梢神経症、自律性神経症、骨盤手術、
骨盤打撲、陰茎の神経支配の発達障害、異常または抑制された神経向性因子の活
性／発現による糖尿病などの末梢神経症に関連する疾患による、勃起機能障害を
含む骨盤部の末梢神経機能障害に罹った患者を処置する方法に関する。例えば、
発明は、上に特徴づけた骨盤部の末梢神経機能障害に罹った患者を処置する方法
に関する。その方法には、例えば陰茎、膀胱、前立腺、結腸、直腸、輸精管およ
び精嚢のような骨盤器官への全身投与または局所投与がある。第３の処置法は、
遺伝子治療またはＮＴＮ、ＧＤＮＦ、アルテミンまたはペルセフィン、ＮＧＦ、
ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、または他のＧＦＲα１、ＧＦＲα２または
、患者に処置の結果が現れるような量で、神経向性因子のモジュレーターような
結合基質を活性化するＲｅｔ、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣ、Ｐ７５受容体の
生成を高めることによる。

【００７１】 他の実施態様では、本発明は、限定するものではないが、末梢神経症、自律性
神経症、骨盤手術、骨盤打撲、陰茎の神経支配の発達障害、糖尿病などの末梢神
経症に関連する疾患による、勃起機能障害を含む末梢神経機能障害に罹った患者
を、神経向性因子のモジュレーターを処置の結果が現れるように患者に投与する
ことにより、処置する方法に関する。

【００７２】 他の実施態様において、本発明は、限定するものではないが、末梢神経症、自
律性神経症、骨盤手術、骨盤打撲、陰茎の神経支配の発達障害、糖尿病などの末
梢神経症に関連する疾患による、ヒトの勃起機能障害を含む末梢神経機能障害に
罹った患者を処置する方法に関し、さらに神経向性因子または該神経向性因子媒
介のシグナリング経路に相互作用する化合物を、処置の結果が現れるように投与
することを含む。機能障害、特に、陰茎の求心性（感覚）神経のみならず、受容
体発現および／または抑制、およびＮＴＮ、ＧＤＮＦ、アルテミンまたはペルセ
フィンと関連する骨盤部の機能障害は、これらの成長因子が陰茎および他の骨盤
器官を神経支配する感覚ニューロンを処置するのに有用であることを示唆する。
感覚神経症は、障害を持つ患者に神経向性因子またはその一部をコードする核酸
配列を、例えば対応するゲノム遺伝子を機能的に刺激することにより、処置の結
果が現れるように投与することによって、本発明に従い処置することができる。

【００７３】 これらの方法は典型的に、遺伝子をコードする神経向性因子または神経向性因
子の活性の発現を調整する化合物または試薬の能力を検定すること、それによっ
てそれぞれの障害を処置する化合物を同定することを含む。好ましい実施態様に
おいて、その方法は、機能障害に罹った患者から得た生物学的サンプルを、発現
した神経向性因子量の測定可能な化合物または試薬および／または生物学的試料
中の神経向性因子の活性の測定可能な化合物または試薬と反応させ、そして生物
学的試料中に発現した神経向性因子の量および／または細胞中の測定可能な神経
向性因子の生物学的活性を、対照試料の活性と比較することからなる。対照試料
と比較して、化合物または試薬に曝した細胞中の神経向性因子の発現量または神
経向性因子の活性の変化は、神経向性因子の発現量および／または神経向性因子
の活性のモジュレーションを示す。

【００７４】 さらに発明は、神経向性因子と相互作用する（例えば結合する）化合物または
試薬を同定する方法に関する。その方法は、神経向性因子、そのフラグメントま
たは神経向性因子を発現する細胞と化合物または試薬とを以下の条件の下で反応
させる工程を含む。その条件とは、複合体を形成する化合物を神経向性因子と結
合させ、神経向性因子と化合物との複合体の生成を検出できる条件であって、そ
の複合体中にその化合物が存在することから神経向性因子に結合する化合物の能
力が分る。

【００７５】 さらに発明は、神経向性因子と、ＮＴＮ、ＧＤＮＦ、アルテミン、ペルセフィ
ン、ＮＧＴ、またはチロシンキナーゼ受容体のＲＥＴまたはｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ
、ｔｒｋＣまたはその複合体などの標的分子との相互作用を促進または阻害のよ
うに調整する化合物または試薬を同定する方法に関する。この方法において、促
進または阻害する化合物または試薬の存在下、複合体を生成する神経向性因子と
結合させる条件で、神経向性因子は標的分子と反応させる。化合物または試薬の
ない状態で生成した複合体の量と比較して、神経向性因子と標的分子との複合体
生成の増加または減少などの変化は、神経向性因子の相互作用を調整する化合物
または試薬、および代わりの栄養機能として作用する化合物または試薬の能力を
示す。

【００７６】 本発明は、遺伝子治療において有用な細胞株を得る方法を提供する。この方法
の特徴は、機能的神経向性因子をコードするゲノム遺伝子を持つこと、また該ゲ
ノム神経向性因子コード核酸配列を統合できること、また、該統合が該ゲノム遺
伝子を機能的に不活性化するか条件的に不活性することである。

【００７７】 核酸配列をコードする機能的神経向性因子を持つ細胞株は、確立した遺伝子標
的法によって得られる。機能的な、または機能的に不活性化可能な、または条件
付で不活性化可能な神経向性因子をコードするゲノム遺伝子に統合できる核酸配
列が作成され、マーカーとして働く適切で選択可能な核酸配列と共に標的構成物
に挿入される。標的構成物またはベクターは自律神経機能障害に罹った患者に挿
入または変換される。核酸配列またはその一部を含む細胞株またはクローン、お
よび該宿主細胞または細胞株のゲノム遺伝子への統合は、マーカーとして働く選
択可能な核酸配列を認識できるプーロブを使って調べることができる。上記の方
法によって得られる細胞株は、少なくとも一つの神経向性因子を提供し、機能障
害に罹った患者への栄養機能として、増減したレベルの神経向性因子を生成する
。神経向性因子または該神経向性因子のモジュレーターの量は、限定されないが
勃起障害に関連する自律神経機能障害を処置する際、適切で測定可能な効果が得
られるようなものであるべきである。

【００７８】 以下の実施例は、本発明をより詳細に記述するものである。これらの実施例は
、本発明の保護範囲を限定することを意図したものではなく、いかにして本発明
を実施するのかを示し、本発明の請求の範囲で定義したされた疾患を治療するた
めに有用な製品を製造するために、当業者がどのように本結果を利用し得るかを
示すことを意図したものである。

【００７９】 実施例１ 動物 メスのウイスター・ラット（ｎ＝１６、１０〜１２週令）および成体ＧＦＲα
２^−／−もしくは野生型マウスを、Vikk Biocenter, Unversity of Helsinkiの
動物舎から得た。これらの動物を通常の日照時間および夜間のサイクルで飼育し
、食事と水を自由摂取させた。動物が被る苦痛を最小にし、用いる動物の数を最
小にするために、あらゆる努力をはらった。

【００８０】 実施例２ インシトゥ・ハイブリダイゼーションのための逆行性追跡および組織調製 上記ラットを、ミダゾラム(０.８ ｍｇ／ｋｇ)、フェンタニールシトレート(
０.２５ｍｇ／ｋｇ)およびフルアニゾン(８ｍｇ／ｋｇ)を併用して麻酔し、その
後４％のFluoro-Gold(ＦＧ:蛍光色素)水溶液(１０μｌ)を、海綿体に注射した。
１０日後、リン酸緩衝液食塩水(ＰＢＳ；０.１Ｍ リン酸ナトリウム／０.１４Ｍ
ＮａＣｌ／２.６ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７.５) (５０ｍｌ)の後に、新しいＰＢＳ中
４％パラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)（２００ｍｌ）の潅流によって麻酔下にラッ
トを殺傷した。Ｓ１レベルからのＭＰＧおよび背根神経節（ＤＲＧ）を切除し、
室温で１.５〜２時間、後固定した。陰茎根部を、未処置のラットから切除し、
４℃で１８〜３６時間、ＰＢＳ中４％ＰＦＡにより固定した。固定後、全試料を
ＰＢＳですすぎ、シラン処理スライド上に７μｍでパラフィン切片用に処理した
。

【００８１】 実施例３ インシトゥ・ハイブリダイゼーション 切片についてのインシトゥ・ハイブリダイゼーションを、若干変更したが、Wi
lkinson and Green (1990)らに従って行った。簡単に云うと、切片をキシレン中
で脱パラフィンし、再水和し、ＰＢＳ中４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＦＡにより固定
し、ＰＢＳですすぎ、プロテイナーゼＫ（２０μｇ／ｍｌ、Sigma）で５〜１５
分間処理し、ＰＢＳ中４％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＦＡにより再固定し、アセチル化
して脱水し、空気乾燥し、５２℃で一晩cＲＮＡプローブとハイブリダイズした
。プローブを欠いたハイブリダイゼーション混合物とのプレハイブリダイゼーシ
ョン（５２℃で１〜１.５時間）を行った。ハイブリダイゼーション後、該切片
を高緊縮条件下で、３０分間すすぎ、リボヌクレアーゼＡ（Boehringer Mannhei
m）で処理して脱水し、空気乾燥した。切片をエマルジョン(Kodak, NTB-２)に浸
漬して５週間曝露した。続いて、スライドを現像し（Kodak D19 現像剤, NTB-2
）、ハリス・ヘマトキシリン(Harris hematoxylin)により対比染色し、Permount
（Fisher Chemical）に取りつけた。センス・オリエンテーションにおける近接
切片とプローブのハイブリダイゼーションを、負の対照として使用した。

【００８２】 実施例４ 画像分析およびイラストレーションの加工 暗および明のフィールド画像を、Photometrix SenSys ＣＣＤカメラ（Photome
trics）およびImage ProPlus 3.0 Software(Media Cybernetics) を備付けたOly
mpus AX 70 Provis 顕微鏡（Olympus Optical Co）を用いてデジタル化した。最
終のイラストレーションをAdobe Photoshop 4.0 software(Adobe Systems)で作
成した。

【００８３】 実施例５ ＦＧ標識化ニューロンにおける受容体ｍＲＮＡ発現に関する定量分析 インシトゥ・ハイブリダイゼーションとエマルジョン自動ラジオグラフィーと
の間のＭＰＧおよびＳ１ ＤＲＧにおけるＦＧ標識化ニューロンを視覚化し、Ｕ
Ｖ照射下でデジタル化した。ＦＧ標識化を、デジタル化した画像を用いてインシ
トゥ・ハイブリダイゼーションシグナルと比較した。明確に見える核を含む明る
い蛍光性ニューロンのプロファイルのみを、１つの神経節全体を４番目毎の切片
から計測した。このインシトゥ・ハイブリダイゼーション・シグナルを、核の付
近での粒子密度がバックグラウンドレベルの２倍であった場合に陽性とみなした
。ＦＧ標識化ニューロンにおける受容体ｍＲＮＡの発現を、４匹のラットで片側
だけ数量化した。

【００８４】 実施例６ ＲＮＡ調製およびノーザン・ハイブリダイゼーション 全ＲＮＡを、酸性グアニジニウムチオシアネート・フェノールクロロホルム抽
出法（Chomczynski,1987）により凍結試料から単離した。（ポリＡ）ｍＲＮＡを
、Oligotex mRNA Mid Kit (Qiagen)を用いて精製した。精製後、（ポリＡ）ｍＲ
ＮＡを、１.２％アガロース−ホルムアルデヒドゲルで分画し、ナイロン膜（Mag
na, MSI）に移した。移した後に、この膜をＵＶ照射により固定し、プレハイブ
リダイゼーションを行い、６５℃で１Ｍ ＮａＣｌ、１％硫酸ドデシルナトリウ
ム、１０％デキストラン硫酸および超音波処理したニシン精子ＤＮＡ（１００μ
ｇ／ｍｌ）で^３２Ｐ−標識化ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズした。２回の高
緊縮条件（０.１xクエン酸ナトリウムの生理食塩水（ＳＳＣ）、０.５％硫酸ド
デシルナトリウム、５５〜６０℃、１５分間）下での洗浄後、このブロットをph
osphoimager（Fuji BAS 1500)で分析するか、もしくは−７０℃で１〜７日間、
Ｘ線フィルムに曝露した。異なるレーンでのｍＲＮＡの相対レベルを比較するた
めに、該膜をグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素(ＧＡＰＤＨ)プローブ
と再びハイブリダイズした。

【００８５】 実施例７ ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡプローブ インシトゥ・ハイブリダイゼーションのために、単鎖のアンチセンスとセンス
ｃＲＮＡプローブを作成し、適当なＲＮＡポリメラーゼ(SP6, T7, Promega)を用
いて^３５Ｓ−ＵＴＰ(Amersham)で標識した。ＤＮＡ鋳型は、カルロス博士（Dr.
Carlos F. Ibanez）からのご好意により得たラットＧＦＲα１（U 59486 のヌク
レオチド 294-1039)ラットＧＦＲα２（AF 003825 のヌクレオチド 85-257）マ
ウスＮＴＮ(U 78109 のヌクレオチド349-936)、およびラットＲｅｔ(U 22514 の
ヌクレオチド21-200)であった。ノーザン・ハイブリダイゼーション用にｃＤＮ
Ａプローブを、Prime -a- Gene Labeling System（Promega）を使用して^３２Ｐ
−ｄＣＴＰで標識した。^３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ｃＤＮＡプローブを調製するため
のＤＮＡ鋳型は、マウスＮＴＮ（インシトゥ・ハイブリダイゼーションと同じヌ
クレオチド）およびラットＧＡＰＤＨ（X 02231 のヌクレオチド137-949 ）であ
った。ラットＧＦＲα２、ＲｅｔおよびＧＡＰＤＨｃＤＮＡをＰＣＲによってク
ローンした。クローン化したフラグメントの同一性を、ファルマシアＡ.Ｌ.Ｆ自
動化ＤＮＡシークエンサーを用いるダイレクト・シークエンシングにより照合し
た。

【００８６】 実施例８ ^１２５Ｉ標識化ＮＴＮ(^１２５Ｉ−ＮＴＮ)の調製および生物活性試験 Ｅ.coli（PeproTech）で生成したヒト組換え体ＮＴＮを、ラクトペルオキシダ
ーゼ法（Marchalonis, 1969）によって放射性ヨード化を行った。以下の成分を
混合して、終体積５０μｌとし、室温で１８分間で保存した：１ｍＣｉ Ｎａ^１
２５Ｉ（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）、１０μｇ ＮＴＮタンパク質、０.５Ｕラクトペ
ルオキシダーゼ、０.０３％Ｈ_２Ｏ_２（２μｌ）および０.１Ｍ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ６.０）。インキュベーションの開始９分後、さらにＨ_２Ｏ_２（
２μｌ）を添加した。該反応を、０.４２Ｍ ＮａＣｌ、０.１Ｍ リン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７.５）と０.１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７.５, ２２μ
ｌ）中２.５％ＢＳＡを含む緩衝液の３倍体積を添加して停止した。比活性およ
び標識効率を、反応混合物のアリコートをトリクロロ酢酸により沈殿後に計測し
た。遊離ヨードを分離し、^１２５Ｉ−ＮＴＮを、ナノスピン・プラス・カラム(N
anoSpin Plus colums)[4000 MWCO, Gelman Sciences]を用いて濃縮した。放射活
性を、1271 Riagamma counter (Wallac)を用いて測定した。^１２５Ｉ−ＮＴＮは
、４４.７μＣｉ／μｇの比活性を示した。標識化ＮＴＮを、コラーゲンマトリ
ックスにおいて外移植し、神経フィラメント抗体で染色（Arumae, 1993;Ebendah
l,1989）した胎児日数１３.５のマウス三叉神経節からの神経突起全体の刺激に
ついてバイオアッセイした。

【００８７】 実施例９ ^１２５Ｉ−ＮＴＮ注射および逆行性輸送 ラットを、実施例２に記載したように麻酔し、その後に、^１２５Ｉ−ＮＴＮ（
２００ｎｇ）単独または非標識のＮＴＮ(２０μｇ)またはシトクロムＣ(２０μ
ｇ)との組合せを含む溶液を、５μｌの体積で１０μｌのハミルトン・シリンジ
（1701N）を用いて両方の海綿体に注射した。ラットを、ＰＢＳ(５０ｍｌ)に続
いて、ＰＢＳ中４％ＰＦＡ（２５０ｍｌ）による噴門潅流による昏睡下で２４時
間後に殺傷した。潅流後、ＭＰＧおよびＤＲＧ（レベルＬ４−Ｓ２）を切除し、
１.５〜２時間の後固定した。神経節の放射線活性をγ計測によって測定した。
固定後、クリオスタット切片(１０μｍ)を調製し、脱水し、エマルジョンに浸漬
して２〜３週間曝露した。次いで、スライドを現像し、ヘマトキシリンで対比染
色し、検鏡板に固定した。

【００８８】 実施例１０ 海綿体神経軸索切断 成体ラットを、ケタミン(１０５ｍｇ／ｋｇ)およびキシラジン(６ｍｇ／ｋｇ)
の組合物によって麻酔した。海綿体神経を曝露し、ＭＰＧに対して末端に向って
両側に切断した。神経セグメントの再結紮を最小にするために、両切除末端を偏
向させた。シャム手術したラットでは、海綿体神経を切断しないで同定した。ラ
ットを、軸索切断後１、３、７および１４日に殺傷した。陰茎根部を切除し、液
体窒素で凍結させ、−７０℃で保存した。ｍＲＮＡを単離し、ノーザン・ブロッ
トを実施例６に記載のように行った。

【００８９】 実施例１１ ＮＡＤＰＨ対比染色 マウス陰茎根部を、ＰＢＳ中の冷４％ＰＦＡで５時間固定した。組織をＰＢＳ
中の冷３０％シュクロースで一晩凍結防止した。該組織を、Tissue-Tek O.C.T.
化合物(Sakura)で包埋し、ドライアイス上で固定し、−７０℃で貯蔵した。クリ
オスタット切片（１０μｍ）を調製し、Super Frost Slides (Menzel-Glaeser)
上に付着させた。 短時間の空気乾燥後、これを０.１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０.２
ｍＭ ニトロブルー・テトラゾリウムおよび０.１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の
０.２％トライトンＸ−１００(ｐＨ８.０)により、９０分間、室温でインキュベ
ートした。この反応を水で洗浄して停止した。該切片を、Mowiolを基にした固定
培地と共にカバースリットを被せた。染色パターンを、海綿体の３つのランダム
フィールド(４００ｘ)および全脊椎神経に存在するＮＡＤＰＨ陽性神経線維の数
を片側だけ測定することによって評価した。

【００９０】 実施例１２ ｃＤＮＡおよびＲＮＡプローブ インシトゥ・ハイブリダイゼーションのために、単鎖のアンチセンスとセンス
ｃＲＮＡプローブを作成し、適当なＲＮＡポリメラ−ゼ(SP6, T7, Promega)を用
いて^３５Ｓ−ＵＴＰ(Amersham)で標識した。使用したＤＮＡ鋳型は、ラットＧＤ
ＮＦ（L 15305 のヌクレオチド 52-688）であった。ノーザン・ハイブリダイゼ
ーションのためにｃＤＮＡプローブを、Prime-a- Gene Labeling System（Prome
ga）を使用して^３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。^３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ｃＤＮＡプ
ローブを調製するために使用したＤＮＡ鋳型は、ラットＧＤＮＦ（インシトゥ・
ハイブリダイゼーションと同じヌクレオチド）およびラットＧＡＰＤＨ（X 0223
1 のヌクレオチド137-949）であった。

【００９１】 実施例１３ ^１２５Ｉ−標識ＧＤＮＦ(^１２５Ｉ−ＧＤＮＦ)の調製および生物活性 バクロウイルス接種した昆虫細胞で遺伝子を発現して生成したラット組替え体
ＧＤＮＦを、Bolton & Hunter試薬（Bolton, 1973）を用いて放射性ヨード化を
行った。０.１Ｍ ホウ素緩衝液（ｐＨ８.５、２０μｌ）中のＧＤＮＦタンパク
質（１０μｇ）を、乾燥状の２ｍＣｉ（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）のBolton & Hunte
r試薬に置換し、この反応混合物を４℃で１５分間インキュベートした。反応を
、０.２Ｍ グリシンを含有する０.１Ｍ ホウ素緩衝液の溶液（ｐＨ８.５、０.５
ｍｌ）を添加して停止した。遊離ヨウ素およびグリシンコンジュゲートを分離し
、^１２５Ｉ−ＧＤＮＦを、ナノスピン・プラス・カラム(NanoSpin Plus colums)
[4000 MWCO, Gelman Sciences]を用いて濃縮した。放射活性を、Wallac 1271 Ri
agamma gamma counter(Wallac)を用いて測定した。^１２５Ｉ−ＧＤＮＦは、６１
.３μＣｉ／μｇの比活性を示した。標識化ＧＤＮＦを、記載のように、コラー
ゲンマトリックスにおいて、記載したＥ１３−Ｅ１３.５マウス三叉神経胚から
の神経突起全体の刺激についてバイオアッセイした（Arumae, 1993;Ebendahl,19
89）。

【００９２】 実施例１４ ^１２５Ｉ−ＧＤＮＦ注射およびエマルジョンオートラジオグラフィー 該ラットを実施例２に記載したように麻酔し、^１２５Ｉ−ＧＤＮＦ単独または
非標識ＧＤＮＦ(２０μｇ)もしくはシトクロムｃ（２０μｇ）の組合せ物を含む
溶液を、５μｌの体積で、２６Ｇ針のハミルトン・シリンジを用いて、両方の陰
茎根部に注射した。動物を、昏睡下にＰＢＳ（５０ｍｌ）に続くＰＢＳ中４％Ｐ
ＦＡ（２５０ｍｌ）の潅流によって、２４時間後に殺傷した。潅流後に、大骨盤
神経節および背根神経節（レベルＬ４−Ｓ２）を回収して１.５〜２時間の後固
定した。固定後の期間中の神経節をγ計測に用いた。固定後に、クリオスタット
切片（１０μｍ）を調製し、脱水し、エマルジョン（Kodak NTB-2）に浸漬し、
２〜３週間曝露した。次いで、スライドを現像（Kodak D19 現像剤）し、ハリス
・ヘマトキシンによる対比染色を行い、Permount(Fischer Chemical)に取りつけ
た。

【００９３】 実施例１５ 免疫細胞化学 ラット陰茎根部を、１７〜１８時間、コールドの新しく調製したＰＢＳ中の４
％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＦＡで浸漬固定した。固定後、試料をＰＢＳですすぎ、Su
per Frostスライド（Menzel-Glaeser）上に１０μｍでパラフィン切片用に処理
した。切片をキシレンで脱パラフィン化し、再水和し、４％ＢＳＡおよび０.４
％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳで１時間室温でインキュベートし、次いで
、Ｓ１００beta （１：５０００, Swant）に対する１次ポリクローナル抗体、Ｐ
ＧＰ９.５（１：２０００, Affinity）またはビメンチンに対するマウスモノク
ローナル抗体(１：２０, Amercham)または平滑筋αアクチン（１：２０００, Pr
ogen）で１８時間インキュベーションした。染色は、クロモゲンとしてジアミノ
ベンジジンを有するアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ系（Vector Laborat
ories）により視覚化した。最終の切片を脱水し、Ｐermountに取りつけた(Fisch
er Chemical)。

【００９４】 実施例１６ ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡプローブ インシトゥ・ハイブリダイゼーションのために、適当なＲＮＡポリメラーゼ（
ＳＰ６、Ｔ７、Promega, WI, USA）を用いて単鎖アンチセンスおよびセンスｃＲ
ＮＡプローブを生成し、^３５Ｓ−ＵＴＰ（Amersham Pharmacia Biotech）により
標識した。ＤＮＡ鋳型はＧＦＲα３（AF184920のヌクレオチド81-489）であった
。

【００９５】 実施例１７ ｃＤＮＡおよびｃＲＮＡプローブ インシトゥ・ハイブリダイゼーションのために、適当なＲＮＡポリメラーゼ（
ＳＰ６、Ｔ７、Promega）を用いて、単鎖アンチセンスおよびセンスｃＲＮＡプ
ローブを生成し、^３５Ｓ−ＵＴＰ（Amersham）で標識した。ラットＮＧＦ、ＢＤ
ＮＦ、ＮＴ−３、trkＡ、trkＢ.ＴＫ＋、trkＣ.ＴＫ＋およびｐ７５に対するプ
ローブは以前に記載した（Arume et al., 1993 ; Pirvola et al.,1992: Pivola
et al., 1994 ; Ylikoski et al., 1993;Hiltunen et al., 1996）。ＴrkＣ.Ｔ
Ｋ＋プローブは、４つ全てのＴＫドメイン含有アイソホームを認識し、ラットtr
kＣ ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド２３０８−２５５２を示す（Merlio et al., 1
992）。ＢＤＮＦフラグメントは、ラットＢＤＮＦｃＤＮＡ配列（Maisonpierre
et al.,）のヌクレオチド５１７−８８２をトラバースし、proＢＤＮＦｍＲＮＡ
に属する最初の２つのヌクレオチドを除く成熟ＢＤＮＦｍＲＮＡに局在化した。 ^３２ Ｐ−ｄＣＴＰ標識ｃＤＮＡプローブを作成するためのＤＮＡ鋳型は、インシ
トゥ・ハイブリダイゼーションおよびラットＧＡＰＤＨ（X02231 のヌクレオチ
ド137-949）の場合と同じであった。

【００９６】 実施例１８ ^１２５Ｉ−標識ＮＴＦ（^１２５Ｉ−ＮＴＦ）の調製および生物活性 組替え体タンパク質を、ラクトペルオキシダーゼ法(Marchalonis, 1969)を用
いて放射性ヨード化した。比活性および標識効率を、反応物のアリコートのトリ
クロロ酢酸による沈殿後に計測した。遊離ヨードを分離し、^１２５Ｉ−ＮＴＦを
、ナノスピン・プラス・カラム(NanoSpin Plus colums)[4000 MWCO, Gelman Sci
ences]を用いて濃縮した。放射活性を、1271 Riagramma counter(Wallac)を用い
て測定した。^１２５Ｉ−ＮＴＮ（ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＢＤＮＦ）は、３０〜
１００μＣｉ／μｇの比活性を示した。標識化ＮＴＦを、前述のコラーゲンマト
リックスで外移植した胚日数９〜１０のヒヨコＤＲＧからの神経突起全体の刺激
についてバイオアッセイした（Arumae, 1993 ; Ebendahl,1989）。

【００９７】 実施例１９ ^１２５Ｉ−ＮＴＦ注射および逆行性輸送 ラットを、実施例２に記載したように麻酔し、その後に^１２５Ｉ−ＮＴＦ（Ｎ
ＧＦ、ＮＴ−３またはＢＤＮＦ）単独（２００ｎｇ）または非標識のＮＴＦ(２
０μｇ)またはシトクロムＣ(２０μｇ)との組合せを含む溶液を、５μｌの体積
で、ハミルトン・シリンジ（1701N）を用いて両方の海綿体に注射した。ラット
を、ＰＢＳ(５０ｍｌ)に続いてＰＢＳ中４％ＰＦＡ（２５０ｍｌ）の潅流により
昏睡下で２４時間後に殺傷した。潅流後、大骨盤神経節および背根神経節（レベ
ルＬ４−Ｓ２）を切除し、１.５〜２時間後固定した。神経節の放射活性をγ計
測によって測定した。固定後、クリオスタット切片（１０μｍ)を調製し、脱水
し、エマルジョンに浸漬し、２〜３週間曝露した。次いで、スライドを現像し、
ヘマトキシリンで対比染色し、検鏡板に固定した。

【００９８】 結果１ ラットの陰茎におけるＮＴＮ、およびラットのＭＰＧおよびＤＲＧにおけるＧ
ＦＲα２、ＧＦＲα１、Ｒｅｔの発現 図１に示す結果によると、ＮＴＮｍＲＮＡが陰茎血管および海綿体の平滑筋で
広く発現される。ハイブリダイゼーションが動脈および静脈の両方で見られ、尿
道の上皮でもある程度見られる。インシトゥハイブリダイゼーションでは、陰茎
根部でのＲｅｔおよびＧＦＲα２の発現が検出されなかった。海綿体で弱い拡散
ＧＦＲα１発現のみが見られた。しかし、ノーザンハイブリダイゼーションが陰
茎根部における全受容体ｍＲＮＡの弱い発現を示した（データを表示せず）。

【００９９】 ＲｅｔおよびＧＦＲα２のｍＲＮＡがＭＰＧの大部分のニューロンで発現され
た（図２、ＡおよびＢ）。陰茎突起において、すなわちＦＧ陽性、ＭＰＧニュー
ロン発現がそれぞれ全および９８％でみられた（図２、ＤおよびＥ）。ＧＦＲα
１ｍＲＮＡが陰茎ＭＰＧニューロンの５４％で発現された。ＦＧ標識ニューロン
の箇所において、ＧＦＲα１ｍＲＮＡを発現しなかった小ニューロンが存在した
。また、ＧＦＲα１がＭＰＧにおいて等しく発現されるようであった（図２Ｃ）
。Ｓ１ＤＲＧの成ラット中で、Ｒｅｔ、ＧＦＲα１、ＧＦＲα２のｍＲＮＡがそ
れぞれ陰茎ニューロンの６２％、５７％、６％で発現された（データを表示せず
）。Ｓ１ＤＲＧ中のＲｅｔｍＲＮＡ発現がすべてのサイズに細胞で見られ、ＧＦ
Ｒα１ｍＲＮＡが中間および大きいサイズの細胞で優先的に発現され、ＧＦＲα
２ｍＲＮＡが小さいおよび中間サイズの細胞で優先的に発現された。ＭＰＧまた
はＳ１ＤＲＧにおいてＮＴＮｍＲＮＡの検出可能な発現がなかった。

【０１００】 結果２ 他の骨盤臓器でのＮＴＮ発現 ０.９ｋｂの単一ＮＴＮ複写体が調べたすべての骨盤臓器で検出された（図３
）。最高の発現が陰茎、膀胱、精管で見られ、一方、結腸、前立腺、精嚢におけ
るシグナルは弱かった。

【０１０１】 結果３ ニューロン突起陰茎における^１２５Ｉ−ＮＴＮの逆行性輸送 ^１２５Ｉ−ＮＴＮ（２０ｎｇ／ｍｌ）がマウス胚三叉神経の神経節における強
い軸索発芽後成長を誘導した（図４Ｅ)。一方、神経向性因子の不存在で培養し
た対照神経節において軸索がなかった（図４Ｆ)。^１２５Ｉ−ＮＴＮおよび非放
射活性ＮＴＮが試験したすべての濃度で類似の軸索原効果を示した（５−２０ｎ
ｇ／ｍｌ、データは表示せず）。２００ｎｇの^１２５Ｉ−ＮＴＮの両海綿体への
注入２４時間後で、オートラジオグラフィがＭＰＧおよびＳ１ＤＲＧにおける標
識を表示した（図４、ＡおよびＣ）。オートラジオグラフィの分解能は限られて
いるが、クラスター銀色粒が神経細胞体のみでの標識の存在を示唆した。輸送体
の特性を表すために、同量の^１２５Ｉ−ＮＴＮを過剰の非標識ＮＴＮとともに注
入した。これは逆行性輸送をブロックする。検出されるようなＭＰＧおよびＤＲ
Ｇの放射活性がほとんど無くなるからである（図４、Ｂ、Ｄ、Ｇ）。図４Ｇから
すると、^１２５Ｉ−ＮＴＮ注入後に顕著な量の放射活性が陰茎神経支配の神経節
でのみ、すなわちＭＰＧおよびＳ１ＤＲＧで検出された。過剰タンパク質のブロ
ック作用を除外するために、^１２５Ｉ−ＮＴＮも過剰のシトクロムｃとともに注
入した。これは、^１２５Ｉ−ＮＴＮの逆行性輸送を増加し、おそらく過剰のシト
クロムｃが^１２５Ｉ−ＮＴＮのシリンジおよび組織との非特異的結合を表すこと
を意味する。

【０１０２】 結果４ 両側海綿体神経の軸索切開後の陰茎におけるＮＴＮｍＲＮＡ発現 図５は、ＮＴＮｍＲＮＡ発現が両側海綿体神経の軸索切開後も比較的変化なし
に留まるを示す。

【０１０３】 結果５ ＧＦＲα２^-1-マウスの陰茎神経におけるＮＡＤＰＨジアフォラーゼ着色の喪
失 ＧＦＲα２^-1-および野生型マウスの陰茎根部およびクラーレの近位部分につ
いての組織化学的検査において、ＮＡＤＰＨ陽性神経線維の明白なパターンを認
めた。ＧＦＲα２^-1-マウスは背面陰茎神経に非常に少ないＮＡＤＰＨ陽性神経
線維を有し、一方、野生型マウスの線維密度はラットでの報告（Jung, 1998）に
同じであった（図６、Ａ、Ｂ、Ｅ）。クラーレの海綿体管を供給する神経の染色
パターンに明確な差異がなかった（図６、ＣおよびＤ)。しかし、クラーレにお
いてＮＡＤＰＨ陽性神経線維が血管周囲部の外側で顕著に減少した（図６、Ｃ、
Ｄ、Ｅ）。

【０１０４】 結果６ 成ラットの陰茎根部におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現 図７は、^３５Ｓ標識ＧＤＮＦリボプローブとのハイブリダイゼーション後に得
た組織切片を示す。強いシグナルが白膜と海綿体との境界に位置する細胞層に見
られる（図７、ＡおよびＣ）。一方、センスプローブとハイブリダイズされた切
片では検出可能なシグナルがなかった（図７Ｂ）。ＧＤＮＦｍＲＮＡ発現細胞は
ヘマトキシリン着色の明白な核を有する（図７Ｃ）。ビメンチンまたはＳ１００
βに対する抗体で着色された隣接切片が、これらの細胞において免疫反応性を表
した（図７、ＤおよびＥ）。ＰＧＰ９.５に対する抗体および平滑筋αアクチン
での着色は、これらの細胞で免疫反応性を示さなかった（データを表示せず）。

【０１０５】 結果７ 他の骨盤臓器におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現 ４.４ｋｂの単一ＧＤＮＦ輸送が陰茎で見られた（図８）。膀胱、精管、結腸
、前立腺、精嚢で検出可能なシグナルがなかった。２００ｎｇの^１２５Ｉ−ＧＤ
ＮＦの両海綿体への注入２４時間後でニューロン突起の陰茎中の^１２５Ｉ−ＧＤ
ＮＦの逆行性輸送について、オートラジオグラフィがＭＰＧおよびＳ１ＤＲＧに
おける標識を表示した（図１０、ＡおよびＣ）。センサー神経節において標識が
中程度および大きいサイズのニューロンにおいて高い比率で見られた。オートラ
ジオグラフィの分解能は限られているが、クラスター銀色粒が神経細胞体のみで
の標識の存在を示唆した。輸送体の特性を表すために、同量の^１２５Ｉ−ＧＤＮ
Ｆを過剰の非標識ＧＤＮＦとともに注入した。これはＭＰＧおよびＤＲＧへの逆
行性輸送をブロックする（図１０、ＢおよびＤ、図９）。図９からすると、^{１２ ５} Ｉ−ＧＤＮＦの海綿体注入後に顕著な量の放射活性が陰茎神経支配の神経節で
のみ、すなわちＭＰＧおよびＳ１ＤＲＧで検出された。過剰タンパク質のブロッ
ク作用を除外するために、^１２５Ｉ−ＧＤＮＦも過剰のシトクロムｃとともに注
入した。これは、^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの逆行性輸送に影響を与えなかった。

【０１０６】 結果８ 放射標識ＧＤＮＦの生物活性 ^１２５Ｉ−ＧＤＮＦおよび元のＧＤＮＦ（１ｎｇ／ｍｌ）がマウス三叉神経の
神経節のコラーゲンゲルの類似の軸索発芽後成長を誘導した（図１１、Ａおよび
Ｂ）。ＧＤＮＦの不存在で培養した対照の神経節においては軸索がなかった（図
１１Ｃ）。軸索発芽後成長の促進活性は、調べたすべての濃度において^１２５Ｉ
−ＧＤＮＦと非放射活性ＧＤＮＦとで同じであった（１−２０ｎｇ／ｍｌ、デー
タを表示せず）。

【０１０７】 結果９ 成ラットの陰茎根部におけるＮＴ−３、ＮＧＦ、ＢＤＮＦのｍＲＮＡ発現 成ラットの陰茎におけるＮＴ−３およびＮＧＦのｍＲＮＡ発現がインシトゥハ
イブリダイゼーション（データを表示せず）およびノーザンブロットにより成ラ
ットの陰茎根部において見られた（図１３）。

【０１０８】 結果１０ 陰茎ニューロンにおけるＮＴ−３、ＮＧＦ、ＢＤＮＦの逆行性輸送体 調べたすべてのタンパク質が、陰茎根部に注入後に成ラットの陰茎を支配する
センサー神経節に輸送し、機能的受容体の存在を示した。ＮＴ−３のみが主要骨
盤神経節に輸送した（図１４、Ａ−Ｃ）。

【０１０９】 結果１１ ＭＰＧおよびＳ1ＤＲＧにおけるＧＦＲα３ｍＲＮＡの発現 成ラットＭＰＧにおいて、ＧＦＲα３ｍＲＮＡの発現が、大きいサイズの、す
なわち非陰茎突起の短い交感神経ニューロン大部分で見られたが（Dail, 1996)
、小さいサイズの、すなわち副交感神経ニューロンのごく僅かに見られた（図１
２Ａ）。一方、ＲｅｔｍＲＮＡ発現が神経節すべてで見られた（図１２Ｂ）。Ｇ
ＦＲα３ｍＲＮＡが５.３±２.６％の陰茎突起（ＦＧ陽性ＭＰＧニューロン）で
発現された（平均±ＳＤ、ＦＧ標識ニューロンを３ラットで片側数量化した。ｎ
＝４１４）。Ｓ1ＤＲＧにおいて、ＧＦＲα３ｍＲＮＡ発現が小さいまたは中程
度のサイズの細胞で優先的に見られ（図１２Ｃ）、陰茎突起ニューロンの４５.
６±６.３％で検出した（平均±ＳＤ、ＦＧ標識ニューロンを３ラットで片側数
量化した。ｎ＝５０５）。

【０１１０】 （図面の詳細な説明） 図１は、陰茎根部におけるＮＴＮｍＲＮＡ発現を示す。ハイブリダイゼーショ
ンが、背動脈（小矢印）、背静脈（大矢印）、海綿体（ｃｃ）の血管および平滑
筋に見られる。オートラジオグラフィの暗画像で表示されている。アステリスク
は尿道、矢印は背面神経を指し、挿入図は海綿体血管におけるハイブリダイゼー
ションを表す。［尺度バー：１ｍｍ；挿入図、２０μｍ］。

【０１１１】 図２は、ＭＰＧにおけるＮＴＮ受容体成分についてのｍＲＮＡ発現を示す。（
Ａ−Ｃ）隣接切片の暗画像はＲｅｔ、ＧＦＲα２、ＧＦＲα１のｍＲＮＡについ
てのほぼユビキチン性のシグナルを示す。（Ｃ）点線の円はニューロンを突起す
る陰茎の豊富な箇所を示す。この箇所でＧＦＲα１シグナルは弱い。（Ｄおよび
Ｅ）矢印はＦＧ（Ｄ）およびＧＦＲα２のプローブと共標識されたＭＰＧニュー
ロンを指す。［尺度バー：Ａ−Ｃ、１５０μｍ；ＤおよびＥ、５０μｍ］。

【０１１２】 図３は、成ラットの骨盤臓器におけるＮＴＮｍＲＮＡ発現のノーザンブロット
分析を示す。^３２Ｐ標識ＮＴＮプローブを、表示の組織からのｍＲＮＡを持つブ
ロットにハイブリダイズした。脳を正対照とした。ＧＤＮＦプローブのハイブリ
ダイゼーションは保持を表す。

【０１１３】 図４は、^１２５Ｉ−ＮＴＮの陰茎根部からＭＰＧおよびＤＲＧへの逆行性軸索
性輸送を示す。（ＡおよびＣ）オートラジオグラフィは、^１２５Ｉ−ＮＴＮ（４
００ｎｇ）の海綿体への注入２４時間後でＭＰＧ（Ａ）およびＳ１ＤＲＧ（Ｃ）
におけるニューロン細胞体上の点状シグナルを示す。（ＢおよびＤ）過剰の非標
識ＮＴＮが^１２５Ｉ−ＮＴＮのＭＰＧ（Ａ）およびＳ１ＤＲＧへの逆行性輸送を
無くする。（ＥおよびＦ）２０ｎｇ／ｍｌの^１２５Ｉ−ＮＴＮの存在（Ｅ）およ
びその不存在（Ｆ）での、受胎１３日のマウス三叉神経の神経節のコラーゲンゲ
ルにおける３日後の軸索発芽後成長を示す。軸索を抗神経フィラメント着色で視
覚化した。（Ｇ）成ラットＭＰＧおよび異なるＤＲＧへの^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの
逆行性輸送についての数量化および特性を示す。^１２５Ｉ−ＮＴＮの陰茎への注
入を、それのみまたは１００倍過剰の非標識ＮＴＮまたはシトクロムｃとともに
行った。各群４匹についての結果を平均±ＳＥＤで示す。^＊、Ｐ＜０.０５；^＊
＊、Ｐ＜０.０１。（Scheff's補正を用いるANOVA）。［尺度バー：Ａ−Ｄ、１０
０μｍ；ＥおよびＦ、２５０μｍ］。

【０１１４】 図５は、両側海綿体神経の軸索切開（ａｘ）および擬操作後の成ラットの陰茎
中のＮＴＮｍＲＮＡレベルを示す。ノーザンハイブリダイゼーションによると、
ＮＴＮｍＲＮＡが有意に影響されない。対照は非処置ラットからのｍＲＮＡを表
す。各レーンは５匹のラットからのプールされたｍＲＮＡに相当する。等しい保
持がＧＡＰＤＨハイブリダイゼーションで確認される。

【０１１５】 図６は、ＧＦＲα２^-1-および野生型マウスの陰茎におけるＮＡＤＰＨジアフ
ォラーゼの組織化学を示す。野生型（Ａ）およびＧＦＲα２^-1-（Ｂ）マウスの
陰茎根部の近位部分の断面図である。背面陰茎神経の着色（矢印）がＧＦＲα２ ^-1- マウスで顕著に消失する。（ＣおよびＤ）野生型および４匹のＧＦＲα２^-1- マウスについての結果を平均±ＳＥＤで示す。^＊＊、Ｐ＜０.０１（２テイルStu
dent's t 検定が不均衡分散を推定する）。［尺度バー：Ａ−Ｄ、１００μｍ］
。

【０１１６】 図７は、陰茎根部におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現を示す（Ａ、Ｃ）。ハイブリ
ダイゼーションが白膜と海綿体との境界に見られる。（Ｃ）拡大倍率では、ＧＤ
ＮＦｍＲＮＡを発現する亜膜細胞がヘマトキシリン着色の明白な核を有する。（
Ｂ）センスプローブとインキュベートされた切片の暗画像はハイブリダイゼーシ
ョンを示さない。（ＤおよびＥ）ビメンチン（Ｄ）またはＳ１００β（Ｅ）に対
する抗体で着色された隣接切片が亜膜細胞において免疫反応性を表す。アステリ
スクは尿道、矢印は背面神経を指す。ｃｃ、海綿体；ｔａ、白膜。［尺度バー：
ＡおよびＢ、１ｍｍ；Ｃ−Ｅ、５０μｍ］。

【０１１７】 図８は、成ラットの骨盤臓器におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現のノーザンブロッ
ト分析を示す。^３２Ｐ標識ＧＤＮＦプローブを、表示の組織からのｍＲＮＡを持
つブロットにハイブリダイズした（３μｇ／レーン）。

【０１１８】 図９は、成ラットＭＰＧおよび異なるＤＲＧへの^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの逆行性
輸送についての数量化および特性を示す。^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの陰茎への注入を
、それのみまたは１００倍過剰の非標識ＮＴＮまたはシトクロムｃとともに行っ
た。各群４匹についての結果を平均±ＳＥＤで示す。^＊、Ｐ＜０.０５；^＊＊、
Ｐ＜０.０１。（Scheff's補正を用いるANOVA）。

【０１１９】 図１０は、^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの陰茎根部からＭＰＧおよびＤＲＧへの逆行性
軸索性輸送を示す。（ＡおよびＣ）オートラジオグラフィは、^１２５Ｉ−ＧＤＮ
Ｆ（４００ｎｇ）の海綿体への注入２４時間後でＭＰＧ（Ａ）およびＳ１ＤＲＧ
（Ｃ）におけるニューロン細胞体上の点状シグナルを示す。（ＢおよびＤ）過剰
の非標識ＧＤＮＦが^１２５Ｉ−ＧＤＮＦのＭＰＧ（Ｂ）およびＳ１ＤＲＧ（Ｄ）
への逆行性輸送を無くする。［尺度バー：Ａ−Ｃ、１００μｍ］。

【０１２０】 図１１は、１ｎｇ／ｍｌの^１２５Ｉ−ＧＤＮＦ（Ａ）またはＧＤＮＦ（Ｂ）の
存在、または神経向性因子の不存在での、受胎１３日のマウス三叉神経の神経節
のコラーゲンゲルにおける３日後の軸索発芽後成長を示す。軸索を抗神経フィラ
メント着色で視覚化した。［尺度バー：Ａ−Ｃ、５００μｍ］。

【０１２１】 図１２は、成マウスＭＰＧのＧＦＲα３およびＲｅｔのｍＲＮＡ発現およびＳ
１ＤＲＧのＧＦＲα３のｍＲＮＡ発現を示す。（Ａ、Ｂ）隣接切片の暗画像はＭ
ＰＧのＲｅｔおよびＧＦＲα３についての顕著なシグナルを示す。ＧＦＲα３シ
グナルが大きいサイズのニューロン上に主に見られ（Ａ）、Ｒｅｔシグナルが神
経節すべてで見られる（Ｂ）。Ａ中の挿入図はＧＦＲα３プローブとハイブリダ
イズしたＭＰＧ切片の輝画像を示す。矢印はＧＦＲα３ｍＲＮＡを発現しない小
さいニューロンを指す。（Ｃ）暗画像はＳ１ＤＲＧ中のニューロン上のＧＦＲα
３を示す。小矢印はＦＤ（Ｄ）およびＧＦＲα３（Ｅ）プローブで共標識された
Ｓ１ＤＲＧニューロンを示す。矢印はＦＧ標識ニューロン（Ｄ）を示す。このニ
ューロンはＧＦＲα３ｍＲＮＡ（Ｅ）を発現しない。［尺度バー：Ａ−Ｃ、２５
０μｍ；ＤおよびＥ、５０μｍ］。

【０１２２】 図１３は、成マウスの骨盤におけるＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３のｍＲＮＡ発
現のノーザンブロット分析を示す。^３２Ｐ標識ＧＤＮＦプローブを、表示の組織
からのｍＲＮＡを持つブロットにハイブリダイズした（３μｇ／レーン）。脳を
正対照とした。ＧＡＰＤＨプローブのハイブリダイゼーションは保持を表す。

【０１２３】 図１４は、成ラットＭＰＧおよび異なるＤＲＧへの^１２５Ｉ−ＮＴＮ、^１２５ Ｉ−ＢＤＮＦ、^１２５Ｉ−ＭＴ−３の逆行性輸送についての数量化および特性を
示す。ヨード化ニューロトロフィンの陰茎への注入を、それのみまたは１００倍
過剰の非標識ニューロトロフィンまたはシトクロムｃとともに行った。

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【図面の簡単な説明】

【図１】 陰茎根部におけるＮＴＮｍＲＮＡ発現を示す。

【図２】 ＭＰＧにおけるＮＴＮ受容体成分についてのｍＲＮＡ発現を示す
。

【図３】 成ラットの骨盤臓器におけるＮＴＮｍＲＮＡ発現のノーザンブロ
ット分析を示す。

【図４】 ^１２５Ｉ−ＮＴＮの陰茎根部からＭＰＧおよびＤＲＧへの逆行性
軸索性輸送を示す。

【図５】 両側海綿体神経の軸索切開（ａｘ）および擬操作後の成ラットの
陰茎中のＮＴＮｍＲＮＡレベルを示す。

【図６】 ＧＦＲα２^-1-および野生型マウスの陰茎におけるＮＡＤＰＨジ
アフォラーゼの組織化学を示す。

【図７】 陰茎根部におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現を示す。

【図８】 成ラットの骨盤臓器におけるＧＤＮＦｍＲＮＡ発現のノーザンブ
ロット分析を示す。

【図９】 ^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの成ラットＭＰＧおよび異なるＤＲＧへの逆
行性輸送についての数量化および特性を示す。

【図１０】 ^１２５Ｉ−ＧＤＮＦの陰茎根部からＭＰＧおよびＤＲＧへの逆
行性軸索性輸送を示す。

【図１１】 受胎１３日のマウス三叉神経の神経節のコラーゲンゲルにおけ
る３日後の軸索発芽後成長を示す。

【図１２】 成マウスＭＰＧにおけるＧＦＲα３およびＲｅｔのｍＲＮＡ発
現およびＳ１ＤＲＧにおけるＧＦＲα３のｍＲＮＡ発現を示す。

【図１３】 成マウスの骨盤におけるＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３のｍＲＮ
ＡのＲＮＡ調製およびノーザンハイブリダイゼーションを示す。

【図１４】 ^１２５Ｉ−ＮＴＮ、^１２５Ｉ−ＢＤＮＦ、^１２５Ｉ−ＭＴ−３
の成ラットＭＰＧおよび異なるＤＲＧへの逆行性輸送についての数量化および特
性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/02 Ａ６１Ｐ 15/00 3/10 15/10 15/00 25/00 15/10 25/02 25/00 43/00 １１１ 25/02 Ａ６１Ｋ 37/24 43/00 １１１ 37/02 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ユッカ・オラヴィ・ヒルトゥネン フィンランド、エフイーエン−00550ヘル シンキ、カルストゥランティエ８番、エー 69 (72)発明者 マッティ・サカリ・アイラクシネン フィンランド、エフイーエン−00710ヘル シンキ、コエティランクヤ２番、エフ49 (72)発明者 エリック・マルティン・クリンゲ フィンランド、エフイーエン−00100ヘル シンキ、シュグナエウクセンカトゥ10番、 ベー28 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA09 CA12 DA02 DA06 HA14 HA17 4C076 AA53 BB01 BB32 CC17 FF67 FF68 4C084 AA02 AA13 BA44 CA28 DB01 DB63 MA01 MA37 MA52 MA55 MA67 NA06 NA10 NA13 NA14 ZA181 ZA201 ZA202 ZA811 ZC032 ZC212 ZC351 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA37 MA52 MA55 MA67 NA06 NA10 NA13 ZA18 ZA20 ZA81 ZC03 ZC21 ZC35

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 末梢神経機能障害の患者を処置する方法であって、処置を必
   要とする患者に促進性または抑制性の栄養機能として作用する医薬を、少なくと
   も１つの神経向性因子またはその保存的に置換された変種を単独または併用で投
   与することにより、提供することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 神経向性因子が、神経膠細胞系誘導の神経向性因子（ＧＤＮ
   Ｆ）ファミリー関連化合物またはニューロトロフィン、その受容体、その結合物
   質、および/または該因子およびその機能的部分をコードするヌクレオチド配列
   を含むことを特徴とする、請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ＧＤＮＦファミリー関連化合物が、ニュールツリン（ＮＴＮ
   ）、神経膠細胞誘導の神経向性因子（ＧＤＮＦ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）およ
   び／またはペルセフィン（ＰＳＰＮ）を含むことを特徴とする、請求項１の方法
   。
4. 【請求項４】 ニューロトロフィン（ＮＴＦ）が、神経因子（ＮＧＦ）、脳
   誘導の神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）および
   ／またはニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）を含むことを特徴とする
   、請求項１の方法。
5. 【請求項５】 末梢神経機能障害が、神経症、糖尿病、急性陰茎打撲、陰茎
   手術、前立腺手術、膀胱手術および／または他の骨盤手術を含む疾患から生じる
   ことを特徴とする、請求項１の方法。
6. 【請求項６】 末梢神経機能障害が陰茎勃起機能障害であることを特徴とす
   る、請求項１の方法。
7. 【請求項７】 促進性または抑制性の栄養機能として作用する医薬が、骨盤
   神経叢に位置する陰茎神経支配ニューロンに提供されることを特徴とする、請求
   項１の方法。
8. 【請求項８】 促進性または抑制性の栄養機能として作用する医薬が、腰仙
   背面根神経節の陰茎神経支配ニューロンに提供されることを特徴とする、請求項
   １の方法。
9. 【請求項９】 骨盤部の機能障害が、骨盤神経叢を神経支配する神経節前の
   自律性ニューロンにより起こされることを特徴とする、請求項１の方法。
10. 【請求項１０】 神経向性因子が、経口または非経口で投与される組成物と
    して提供されることを特徴とする、請求項１の方法。
11. 【請求項１１】 神経向性因子が、神経向性因子を発現し得るヌクレオチド
    配列で形質転換された細胞が陰茎の海綿体または根部に埋め込まれることにより
    、提供されることを特徴とする、請求項１０の方法。
12. 【請求項１２】 形質転換細胞が半透過性膜に封入されることを特徴とする
    、請求項１１の方法。
13. 【請求項１３】 神経向性因子が組換えＤＮＡ法によりつくられたベクター
    で提供され、該ベクターが該因子を発現し得る少なくとも１つの神経向性因子コ
    ードヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１０の方法。
14. 【請求項１４】 神経向性因子が、投与経路に適合する少なくとも１つの任
    意の薬学的に許容される補助物質とともに提供されることを特徴とする、請求項
    １０の方法。
15. 【請求項１５】 患者の骨盤神経叢または陰茎感覚ニューロンについての栄
    養機能が、Ｒｅｔ、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、ｔｒｋＣのチロシン・キナーゼ受容体
    についての結合基質の投与により提供されることを特徴とする、請求項１の方法
    。
16. 【請求項１６】 栄養機能が、Ｒｅｔチロシン・キナーゼ受容体により仲介
    されるシグナル輸送の調節により仲介されることを特徴とする、請求項１の方法
    。
17. 【請求項１７】Ｒｅｔチロシン・キナーゼ受容体がｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよ
    び/またはｔｒｋＣの受容体を含むことを特徴とする、請求項１の方法。
18. 【請求項１８】 末梢神経機能障害の患者を処置するための、促進性または
    抑制性の栄養機能として作用する医薬を製造するために、少なくとも１つの神経
    向性因子またはその保存的に置換された変種の単独または併用での使用。
19. 【請求項１９】 神経向性因子が、神経膠細胞系誘導の神経向性因子（ＧＤ
    ＮＦ）ファミリー関連化合物またはニューロトロフィン、その受容体、その結合
    物質、および/または該因子およびその機能的部分をコードするヌクレオチド配
    列を含むことを特徴とする、請求項１８の使用。
20. 【請求項２０】 ＧＤＮＦファミリー関連化合物が、ニュールツリン（ＮＴ
    Ｎ）、神経膠細胞誘導の神経向性因子（ＧＤＮＦ）、アルテミン（ＡＲＴＮ）お
    よび／またはペルセフィン（ＰＳＰＮ）を含むことを特徴とする、請求項１８の
    使用。
21. 【請求項２１】 ニューロトロフィン（ＮＴＦ）が、神経因子（ＮＧＦ）、
    脳誘導の神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およ
    び／またはニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）を含むことを特徴とす
    る、請求項１８の使用。
22. 【請求項２２】 末梢神経機能障害が、神経症、糖尿病、急性陰茎打撲、陰
    茎手術、前立腺手術、膀胱手術および／または他の骨盤手術を含む疾患から生じ
    ることを特徴とする、請求項１８の使用。
23. 【請求項２３】 促進性または抑制性の栄養機能として作用する医薬が、経
    口または非経口投与のための組成物として提供されることを特徴とする、請求項
    １８の使用。
24. 【請求項２４】 促進性または抑制性の栄養機能として作用する医薬が、神
    経向性因子の発現可能ヌクレオチド配列で形質転換された細胞を陰茎の海綿体ま
    たは根部に埋め込まれることにより提供されることを特徴とする、請求項１８の
    使用。
25. 【請求項２５】 埋め込まれた細胞が半透過性膜に封入されることを特徴と
    する、請求項２４の使用。
26. 【請求項２６】 医薬が組換えＤＮＡ法でつくられたベクター中に提供され
    た促進性または抑制性の栄養機能として作用し、該ベクターが神経向性因子をコ
    ードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１
    ８の使用。
27. 【請求項２７】 栄養機能が、活性成分としての神経向性因子に加えて、投
    与経路に適合する少なくとも１つの任意の薬学的に許容される補助物質を含むこ
    とを特徴とする、請求項１８の使用。
28. 【請求項２８】 患者の骨盤神経叢または陰茎感覚ニューロンについての促
    進性または抑制性の栄養機能として作用する医薬が、Ｒｅｔ、ｔｒｋＡ、ｔｒｋ
    Ｂ、ｔｒｋＣのチロシン・キナーゼ受容体およびｐ７５受容体についての結合基
    質であることを特徴とする、請求項１８の使用。
29. 【請求項２９】 促進性または抑制性の栄養機能として作用する医薬が、Ｒ
    ｅｔチロシン・キナーゼ受容体により仲介されるシグナル輸送の調節により仲介
    されることを特徴とする、請求項１８の使用。
30. 【請求項３０】 Ｒｅｔチロシン・キナーゼ受容体がｔｒｋＡ、ｔｒｋＢ、
    ｔｒｋＣおよび/またはｐ７５を含むことを特徴とする、請求項１７の使用。
31. 【請求項３１】 神経症、糖尿病、急性陰茎打撲、陰茎手術、前立腺手術、
    膀胱手術および／または他の骨盤手術を含む疾患から生じる骨盤部の末梢神経機
    能障害の患者の処置方法における、神経向性因子またはその保存的に置換された
    変種の使用。