JP3266611B2 - 毛様体神経栄養因子レセプター - Google Patents

毛様体神経栄養因子レセプター

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Description

【発明の詳細な説明】 1.技術分野 本発明は毛様体神経栄養因子レセプター（ciliary n
eurotrophic factor receptor:CNTFR）に関し、CNTF
レセプターをコードする核酸およびアミノ酸配列を提供
する。本発明はまた、（１）CNTF活性を検出するための
アッセイ系；（２）CNTFの生理学的役割を研究するため
の実験モデルシステム；（３）CNTF関連の神経学的症状
を同定するための診断法；（４）CNTF関連の神経学的症
状の治療するための治療法、および（５）CNTFRと相同
な分子を同定する方法に関する。
2.背景技術 2.1.毛様体神経栄養因子 毛様体神経栄養因子（CNTF）は、胚状ヒナの毛様神経
節（ciliary ganglion:CG）ニューロンがin vitroで
生存するために特異的に必要とされるタンパク質である
（Manthorpeら、1980,J.Neurochem.34:69−75）。毛様
神経節は解剖学的には眼窩洞内に位置し、側方直筋と視
神経の鞘との間にあり、毛様筋および瞳孔括約筋を刺激
する眼球運動神経から副交換神経繊維を受け取る。
毛様神経節ニューロンは、一定期間での細胞死を示す
神経細胞集団に属することが見いだされた。ヒナ毛様神
経節においては、８日胚（embryonic day 8:E8）で存
在するニューロンのうちの半数がE14までに死ぬことが
観察された（Landmesser and Pillar,1974,J.Physio
l.241:737−749）。この同じ期間内で毛様神経節ニュー
ロンはその標的組織、すなわち毛様体および眼の脈絡膜
との関係を形成する。Landmesser and Pillar（1974,
J.Physiol.241:751−736）は、細胞死の期間の前に眼を
摘出すると、同側神経節における毛様神経節ニューロン
が完全に失われることを観察した。逆に、Narayanan a
nd Narayanan（1978,J.Embryol.Ex.Mrophol.44:53−7
9）は、さらに眼原基を移植して、これによって使用で
きる標的組織の数を増加することによって、毛様神経節
ニューロンの細胞死が減少することを観察した。これら
の結果は、毛様神経節ニューロンに作用する標的由来の
神経栄養因子が存在することと一致する。
培養下では、毛様神経節（CG）ニューロンは生存のた
めの１または複数の因子を必要としていることが観察さ
れた。毛様体神経栄養因子（CNTF）の活性はヒナ筋肉細
胞ならし培地内（Helfandら、1976,Dev.Biol.50:541−5
47:Helfandら、1978,Exp.Cell Res.113:39−45;Bennet
and Nurcome,1979,Brain Res.173:543−548;Nishi
and Berg,1979,Nature 277:232−234;Varonら、197
9、Brain Res.173:29−45）；筋肉抽出物内（McLennan
and Hendry,1978,Neurosci.Lett.10:269−273）；ヒ
ナ胚抽出物内（Varonら、1979,Brain Res.173:29−45;
Tuttleら、1980,Brain Res.183:161−180）、および心
臓細胞でならした培地内で同定された（議論のために
は、さらにAdlerら、1979,Scince 204:1434−1436およ
びBarbinら、1984,J.Neurochem.43:1468−1478参照）。
Adlerら（1979,Science 204:1434−1436）は、CGニ
ューロンのミクロウエル培養に基づくアッセイ系を用い
て、CGニューロンが刺激する眼内標的組織中に非常に豊
富なCNTF源が見いだされることを示した。12日胚に存在
する8000栄養ユニット（TU）のうち、2500TUが眼の組織
中に存在することが見いだされ；活性は毛様体および脈
絡膜を含む分画に局在することが明らかとなった。
次いで、Barbinら（1984,Neurochem.43:1468−1478）
はヒナ胚の眼組織からのCNTFを豊富にする方法を報告し
た。CNTF活性はまた、ラット座骨神経を含む非−CG組織
とも関連することが見いだされた（Williamsら、1984,I
nt.J.Develop.Neurosci.218:460−470）。Manthorpeら
（1986,Brain Res.367:282−286）は、ヒナの眼からCN
TF活性を単離したときに用いたのと同様の分画方法を用
いて、成人ラットの座骨神経抽出物からの哺乳動物CNTF
活性の部分精製を報告した。さらに、Watters and He
ndry（1987,J.Neurochem.49:705−713）は、ヘパリン親
和性クロマトグラフィーを用いて、非変性条件下で、ウ
シ心臓組織からのCNTF活性を約20,000倍豊富にする方法
を報告した。CNTF活性はまた損傷した脳組織中にも同定
されている（Manthorpeら、1983,Brain Res.267:47−5
6;Nieto−Sampedroら、1983,J.Neurosci.3:2219−222
9）。
Carnowら（1985,J.Neurosci.5:1965−1971）およびRu
dgeら（1987,Develop.Brain Res.32:103−110）は、組
織抽出物のウェスタンブロットからCNTF様活性を同定
し、次いでニトロセルロース膜をCGニューロンを含む培
養皿中に接触することによってCNTF活性を含むタンパク
質バンドを同定し、そして生体染料を用いて細胞の生存
領域を同定する方法を記載する。この方法を用いて、Ca
rnowら（1985,J.Neurosci.5:1965−1971）は、成人ラッ
トの座骨神経および脳由来のCNTF活性はヒナCNTF（20.5
kD）とは異なる大きさ（24kD）を示すことを観察した。
Sendtnerらによる1990年８月20日出願の“毛様体神経
栄養因子”と題する米国特許出願番号07/570,651（その
全記載は引用としてここに包含される）に記載するよう
に、最近になってCNTFはクローン化され、細菌発現系で
合成された。組換えプローブを用いると、成人ラットの
組織中のCNTF−mRNAは約1.2kbの大きさであると思われ
た。ラット脳CNTFをクローン化し、77bpの短い5'非翻訳
領域と、600bpのオープンリーディングフレームとを有
するmRNAによってコードされることが見いだされ、約20
0アミノ酸のタンパク質であると予測された（Stockli
ら、1989,Nature 342:820−823）。ヒトCNTFもまたク
ローン化され、配列決定された（Sendtnerらによる1990
年８月20日出願の“毛様体神経栄養因子”と題する米国
特許出願番号07/570,651）。そのコーディング配列はラ
ット配列と比較して実質的に保持されており、一方非コ
ーディング配列はより少なく保持されていた。
2.2.毛様体神経栄養因子の機能的性質 CNTFについて多数の生物学的効果が記載されてきた。
上記のように、CNTFは元来、副交換神経系の成分である
E8ヒナ毛様神経節のニューロンの生存を支える活性とし
て報告された。CNTFを含むことが知られている調製物に
おける、その他の生物学的性質を記載するものには以下
のものが挙げられる： Saadatら（1989,J.Cell Biol.108:1807−1816）は、
彼らの最もよく精製したラット座骨神経CNTF調製物が、
培養下のラット交換神経ニューロンのコリン作動性分化
を誘導することを観察した。また、Hoffman（1988,J.Ne
urochem.51:109−113）は、ヒナの眼由来のCNTF活性が
レチナール単層培養においてコリン−Ｏ−アセチルトラ
ンスフェラーゼ活性のレベルを増加することを見いだし
た。
Hughesら（1988,Nature 335:70−73）は、分娩時の
ラット視神経および脳から由来する、２種の異なった組
織に発育しうる培養下のグリア前駆細胞の集団を研究し
たところ、これらの前駆細胞はまず最初に寡突起神経膠
細胞となり、次いでタイプ２星状膠細胞となることが示
された。培養条件下では、寡突起神経膠細胞の分化は寡
突起神経膠細胞−タイプ２−星状膠細胞（Ｏ−2A）前駆
細胞から直接おこるように思われ、一方タイプ２星状膠
細胞の分化はCNTFと似ているか、または同一の誘導タン
パク質の存在を必要とするように思われた（Anderson,1
989,Trends Neurosci.12:83−85も参照されたい）。
Heymanns and Unsicker（1979,Natl.Acad.Sci.U.S.
A.84:7758−7762）は、神経芽細胞腫の細胞抽出物の高
速上清が、ヒナ眼またはラット座骨神経から得たCNTF活
性関連の効果と類似の効果を示すことを観察し、これは
CNTFと（分子量において）似てはいるが、同一ではない
タンパク質の存在を示唆した。
Ebendal（1987,J.Neurosci.Res.17:19−24）は、多く
のラットおよびヒナ組織中のCNTF様活性を検索した。彼
はかなり広範囲のラットにCNTF様活性を観察したが、ヒ
ナ組織には観察しなかった。ラット肝臓、膵臓Ｔ細胞お
よび下顎腺細胞関連はCG生存促進活性が低レベルであ
り、一方心臓、脳、および骨格筋組織関連は高いCG生存
促進活性であった。試験した組織のうちで最も高いCNTF
様活性を示したのはラット腎臓関連であった。
多くの組織および細胞抽出物が、CNTFに対しても応答
性でもあるニューロン集団の生存性を支持する活性を含
む（すなわち、細織培養バイオアッセイにおいてE8ヒナ
の毛様節ニューロンの生存性を支持する）ことを上記の
研究は示したが、単一のまたは同一のタンパク質がこれ
らの活性をもたらしていると推測することはできない。
繊維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factors）
（FGFs）（Dionneら、1990,EMBO J.9:2685−2692）の
属で示されたように、例えば、多数の異なるポリペプチ
ドまたはタンパク質が単一のバイオアッセイで同一の生
物学的活性を有することがあるからである。
ヒナ眼およびラット座骨神経CNTFのニューロン特異性
は、最初NGFに応答性のニューロン集団といくらかオー
バーラップすることが見いだされた。CNTFはNGFといく
らかオーバーラップするニューロン特異性を有すること
が観察されたが、発生過程のニューロン集団でのCNTFと
NGFの役割研究において、これらを区別する特徴が最も
明らかとなった（Skaper and Varon,1986,Brain Re
s.389:39−46）。発生における異なる役割に加えて、分
子量、等電点、NGFに対する抗体による不活性化のない
こと、およびCGFニューロンのin vitroでの生存を支持
するCNTFの能力などによっても、CNTFはNGFと区別され
る（Barbinら、1984,J.Neurochem.43:1468−1478）。Li
nら（1989,Science 246:1023−1026）は、CNTFは従来
報告されたいかなるタンパク質とも配列相同性をもって
いない。Sendtnerら（1990年８月20日出願の“毛様体神
経栄養因子”と題する米国特許出願番号07/570,651）
は、組換えCNTFが背側中部および腹側の脊髄ニューロン
の生存を促進し、また精製ラット座骨神経CNTFが新生ラ
ットの病変顔面神経（第７頭蓋神経）における運動ニュ
ーロンの細胞死を防ぐ作用があることを観察した（Send
tnerら、1990,Nature 345:440−441）。
組換えDNA法を用いるCNTFのクローニングと発現が多
くのCNTF活性の発見へと導いた。
2.3.成長因子レセプター タンパク因子への結合を仲介し、これに応答する多く
のレセプターが過去数年の間に特徴付けられ、クローニ
ングされたが、これらにはインシュリン、血小板由来の
成長因子、上皮増殖因子およびその関連体、繊維芽増殖
因子、および各種インターロイキンおよび造血増殖因子
に対するレセプターを含む。最近のデータによると、あ
る種のレセプターは複数の（関連）成長因子に結合する
ことができ、一方その他の場合では、同じ因子が複数の
（関連）レセプターに作用することができることが明ら
かとなった（例えば、Lupuら、1990,Science 259:1552
−1555;Dionneら、1990,EMBO J.9:2685−2692;Miki
ら、1991,Science 251:72−75）。タンパク因子と結合
するほとんどのレセプターが、因子と特異的に結合する
ための細胞外領域、膜の両側をつなぐトランスメンブラ
ン領域、およびタンパク因子がレセプターの細胞外部分
と結合する際にシグナル形質導入の開始にしばしば関与
する細胞内ドメインを有しているという特徴も一般にも
つ。興味深いことに、多くのレセプターは１本鎖ポリペ
プチドからなるが、その他のレセプターは、因子と高親
和性で結合し、機能的応答をして結合に至るためには、
明らかに（少なくとも）２つの別々のサブユニットを必
要とする（例えば、Hempsteadら、1989,Science 243:3
73−375;Hibiら、1990,Cell 63:1149−1157）。レセプ
ターの細胞外および細胞内部分はしばしばその他のレセ
プターの対応する領域と共通の構造的モチーフを共有し
ており、このことは異なるレセプター間における進化上
の、および機能上の関係を示唆するものである。これら
の関係は非常に遠いことが多く、ある種の一般的ドメイ
ン構造の繰り返し使用を単に意味することもある。例え
ば、非関連の因子と結合する各種の異なるレセプターは
その細胞外部分に“免疫グロブリン”を用いているし、
その他のレセプターはその因子結合性領域に“サイトカ
インレセプター”ドメインを使用する（例えば、Akira
ら、1990,The FASEB J.4:2860−2867）。複数の異な
る細胞外結合ドメインをもつ多くのレセプター（したが
って複数の異なる因子と結合することができる）は、因
子結合に応答して活性化されるチロシン特異的プロテイ
ンキナーゼをコードする相関性のある複数の細胞質内ド
メインを含む（例えば、Ullrich and Schlessinger,1
990,Cell 61:203−212）。因子結合がシグナル形質導
入過程を“活性化する”メカニズムは、レセプターチロ
シンキナーゼの場合においてもまだよく理解されていな
い。細胞内ドメインが未知の機能のドメインをコードす
るか、あるいは結合成分が未知の機能の第２タンパク質
と関連するようなその他のレセプターの場合（例えば、
Hibiら、1990,Cell 63:1149−1157）には、シグナル形
質導入の活性化はさらに不可解である。
3.発明の概要 本発明はCNTFレセプター（CNTFR）遺伝子およびタン
パク質に関する。部分的には、本発明はヒトCNTFR遺伝
子のクローニングと性状決定、および形質転換したCOS
細胞中でのその発現に基づく。
本発明はCNTFRをコードする核酸配列並びにそれに由
来する断片を提供する。本発明はさらに、実質的に精製
されたCNTFRタンパク質およびそのペプチド断片を提供
する。
本発明の別の面においては、核酸並びに抗体プローブ
を含むCNTFRプローブをCNTFR−関連分子を同定するため
に使用する。例えば、本発明はCNTFRと複合体を形成
し、これによってCNTFR機能に関与するような分子を提
供する。その他の例としては、本発明はCNTFRと相同ま
たは抗原的に交差反応するが、CNTFRと同一ではないレ
セプター分子を提供する。これらの特定の態様は、CNTF
Rが他の生物学的に関連のある分子と相同性を有すると
いう発見に基づき、この生物学的に関連のある分子とは
特にIL−６レセプターであるが、さらにPDGFレセプタ
ー、CSF−１レセプター、プロラクチンレセプター、IL
−２およびIL−４レセプター、GM−CSF顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子レセプター、妊娠特異的アルフ
ァ１−ベー標識リコプロテイン、および癌胎児性抗原、
腫瘍マーカーを含む。
本発明はまた、高レベルのCNTFRを発現し、それゆえ
に非常に低濃度のCNTFまたはCNTF様分子にも極めて感度
のよい細胞からなる、CNTF活性を検出するためのアッセ
イ系を提供する。
さらに、本発明はCNTFの生理学的役割を研究するため
の実験モデルシステムを提供する。このようなモデルは
（１）細胞レセプターとCNTFとの結合において競合し、
これによってCNTF−枯渇状態をもたらすような循環性CN
TFRペプチドにさらされた動物、（２）CNTFRで免疫した
動物、（３）高レベルのCNTFRを発現し、したがってCNT
Fに対して高感度なトランスジェニック動物、および
（４）ゲノムから内在性CNTFR遺伝子を欠失させる胚幹
細胞方法を用いることによって得られる動物、などの動
物モデルを含む。
本発明のさらに別の態様においては、正常または疾患
状態におけるCNTFに応答性である細胞または組織を同定
するためにCNTFRプローブを用いることができる。例え
ば、CNTF関連の疾患に苦しむ患者CNTFR発現の異常を示
すであろう。
さらに、本発明のCNTFR遺伝子およびタンパク質は治
療用途に用いることができる。例えば、中枢神経系の損
傷領域におけるCNTFレベルを枯渇させるために循環性CN
TFRを用いることができるが、これに限定されない。あ
るいは、筋萎縮性側索硬化症に苦しむ患者の運動ニュー
ロンのような、CNTFに対する感度の増加によって恩恵を
受ける組織内に組換えCNTFR遺伝子を挿入することがで
きる。
4.図面の簡単な説明 図1.A.標識付きガンド結合法に用いる発現クローニング
を示す模式図である。B.初めのcDNAライブラリーで形質
転換したCOS細胞に比較して、パニングを１回行って得
られたDNAで形質転換した多くのCOS細胞がCNTF結合部位
を発現したことを示す２次ヨウ素化抗体アッセイの図で
ある（オートラジオグラフは形質転換COS細胞の60mmプ
レート上で行った；黒点のそれぞれはCNTF結合部位を発
現する１個の形質転換COS細胞を示す）。C.（Ｂ）で記
載したのと同じアッセイであるが、COS細胞をあらかじ
め非CNTFRコーディングプラスミドで形質転換しておい
たもの（ネガティブクローン）、またはCNTFRコーディ
ングプラスミドで形質転換しておいたもの（ポジティブ
クローン）を示す。それぞれのプレートのごく一部を示
す。D.（Ｃ）で記載したネガティブクローンまたはポジ
ティブクローンで形質転換したCOS細胞の蛍光活性化細
胞選別（FACS）分析の結果を示す。
図2.CNTFRコーディングcDNAの核酸配列（配列番号:1）
および演繹アミノ酸配列（配列番号:2）を示す。
図3.免疫グロブリン様ドメインおよびサイトカインレセ
プター様ドメインにおける相同性を示すためにヒトCNTF
Rを一列に並べた図である。左側にある番号は最初のメ
チオニンから始まるアミノ酸番号を示す。同じ残基およ
び保持されている置換基を実線で囲んで示す。相同性を
強調するために配列途中にギャップを入れた。IL−６＝
インターロイキン6;CEA＝癌胎児性抗原;PDGF＝血小板由
来増殖因子;CSF−１＝コロニー刺激因子1;アルファ１−
βGP＝アルファ１βグリコプロテイン;PRL＝プロラクチ
ン;EPO＝エリスロポエチン;IL−２＝インターロイキン
2;IL−４＝インターロイキン4;GM−CSF＝顆粒球マクロ
ファージコロニー刺激因子。
図4.CNTFRとその他の関連レセプターとの構造的関係を
示す。ヒトIL−６レセプターおよびCNTFRは、提唱する
因子結合ドメインのＮ末端と融合した免疫グロブリンド
メインをもっている。短い酸性のつなぎ（ジグザグ線）
は球状免疫グロブリンと提唱する因子結合ドメインを結
合する。本明細書で議論するように、gp130に似た提唱
するタンパク質がCNTFRと関連して示してある。HuGRHR
−ヒト成長ホルモンレセプター;RbPRLR−ウサギプロラ
クチンレセプター;MoEPOR−マウスエリスロポエチンレ
セプター;HuIL2Rβ−ヒトインターロイキン２レセプタ
ーβ鎖;HuIL6R−ヒトインターロイキン６レセプター;Hu
CNTFR−ヒト毛様体由来神経栄養因子レセプター;S−セ
リン;F−フェニルラニン。
図5.CNTFRメッセージの組織局在。セクション8.1.に記
載するように、ラットの各指示組織からRNAを調製し
た。CNTFRのDNA断片は、セクション8.1.で記載するよう
に、pCMX中にこれらの遺伝子を含む発現構築物から由来
した。組織：小脳（CB）；後脳（HB）；中脳（MB）；視
床（TH/HYP）；線条体（STRI）；海馬Ｂ（HIP Ｂ）；
海馬Ａ（HIP Ａ）；皮質（CORT）；嗅覚芽（OLF）；成
人脳（AD BR）；小腸（INT）；腎臓（KID）；肝臓（LI
V）；脾臓（SPL）；胸腺（THY）;E17肝臓（E17 LI
V）。
図6.hCNTF−Ｒ遺伝子挿入物を有するpCMXを示す。pCMX
の構築は同時出願の特許明細書に記載してある。
図7.骨格筋におけるCNTFレセプター発現のノーザンブロ
ット分析を示す。各レーンで10μｇの全RNAを用いた。
レーン1:マウス筋芽細胞系C2C12 mb;レーン2:マウス筋
管細胞系C1C12 mt;レーン3:ラット筋管細胞系H9C2 m
t;レーン4:ラット筋管細胞系L6 mt;レーン5:ラットヒ
ラメ筋；レーン6:ラット長指伸筋（EDL）筋；レーン7:
神経除去した骨格筋；レーン8:精製ヒト筋管；レーン9:
骨格筋（このRNAサンプルは分解している）；レーン10:
成人ラット小脳；レーン11:擬似手術したヒラメ筋；レ
ーン12:72時間神経除去したヒラメ筋；レーン13:擬似手
術したEDL筋；レーン14:72時間神経除去したEDL筋。
図8.神経除去手術に付した後肢の解剖学的図解である。
図9.UNOP＝動物群１からの未操作ヒラメ筋（表IV）；実
線の棒は右側を表し、点線の棒は左側を表す;NONE＝動
物群２からの何も注射しない障害（神経除去、右側）お
よびコントロール（擬似手術、左側）ヒラメ筋;ALB＝動
物群６からのPBS/BSA（SC）で処理した障害（右側）お
よびコントロール（左側）ヒラメ筋;CNTF＝動物群５か
らのCNTF/BSA（SC）で処理した障害（右側）およびコン
トロール（左側）ヒラメ筋。実線の棒：障害；点線の
棒：コントロール。
5.発明の詳細な説明 発明を限定するためでなく、明確にするために、本発
明の詳細な説明は以下のサブセクションに分けて行う： （１）CNTFレセプターのクローニング； （２）CNTFレセプターをコードする核酸； （３）CNTFペプチド； （４）CNTFレセプターの発現； （５）CNTFレセプターと関連する分子の同定；および （６）本発明の用途。
5.1.毛様体神経栄養因子レセプターのクローニング 本発明は、CNTFRを発現する標的細胞を選択するため
の方法を提供することによって、CNTFレセプター（CNTF
R）のクローニングを可能にする。CNTFRをコードする配
列を豊富にする方法を提供することによって、本発明は
CNTFRタンパク質の精製とCNTFRをコードするDNAの直接
クローニングとを可能にする。
例えば、CNTFRを有する標的細胞を選択し、レセプタ
ー分子の精製のための当業界で公知の方法を用いて、CN
TFRタンパク質を精製する。例えば、これに限定するも
のではないが、CNTFまたは以下のセクション5.6.3.に記
載するような検出可能な分子に付けたCNTF（CNTF/標
識）（ここで標識は２、３名前を挙げるならば、例え
ば、放射性標識、抗原決定基、または抗体である）を標
的細胞に可逆的に架橋させ、該標的細胞からの膜関連タ
ンパク質を精製法に付す。このような精製法はSDS−PAG
Eと、それに続くCNTFまたはCNTF/標識の位置をゲル中で
検出する方法を含み、例えば、放射性標識CNTFを用い
て、そのレセプターと架橋させ、ゲル中でオートラジオ
グラフィーで見ることができる。あるいは、このような
ゲル中でCNTF/レセプター複合体の位置を同定するため
に、ウエスタンブロット法において抗CNTFまたは抗標識
抗体を用いることができる。レセプターのペプチド断片
のアミノ酸配列決定を行うのに十分な量のタンパク質を
単離するために、または標的細胞抽出物からCNTFR分子
を精製するために用いることのできる抗CNTFR抗体を生
産させるために、準備用のゲル電気泳動を用いることが
できる。精製CNTFRから得られたアミノ酸配列は、ゲノ
ムDNAライブラリー中で、または好ましくはCNTFRを生産
する標的細胞から構築されたcDNAライブラリー中で、CN
TFRをコードするクローン化核酸を同定するために用い
ることのできる変質オリゴヌクレオチドプローブをデザ
インするために用いることができる。
あるいは、CNTFRを発現する標的細胞からmRNAを調製
し、次いでmRNA（またはそれから得られるcDNA）を、CN
TFRを発現しないニューロン細胞のような細胞から由来
するmRNAまたはCDNAとハイブリダイズさせることによっ
て非CNTFRコーディング配列を差し引く、消去式ハイブ
リダイゼーション法によってクローン化することができ
る。差し引いた残りの核酸はCNTFRコーディング配列を
富む傾向となる。
好ましくは内在性発現および／または上記の消去法に
よるCNTFRコーディング配列に富む標的細胞から調製し
た核酸もまた、CNTFRを直接クローンするための発現ク
ローニング法に用いることができる。例えば、CNTFRを
発現する標的細胞からの全ゲノムDNAを調製し、次いで
これをCNTFRを発現しておらず、かつ好ましくは標的細
胞種とは異なる種に由来する細胞系にトランスフェクシ
ョンする（例えば、ヒトCNTFRコーディング細胞からのD
NAをＬ細胞のようなマウス細胞にトランスフェクション
する）ことができるが、これに限定されるものではな
い。トランスフェクションされた細胞のうち比較的少数
の細胞がCNTFRを発現するが、このような細胞はロゼッ
ト法または以下のセクション5.6.3.に記載する免疫蛍光
法によって同定することができ、そして例えば、当業者
に公知の蛍光活性化細胞選別によるか、あるいは抗体結
合磁気ビーズまたは“パニング（panning）”法を用い
て単離することができる。トランスフェクションされた
細胞からゲノムライブラリーを作成し、次いでCNTFRア
ミノ酸と適合する配列か、または種特異的な遺伝要素と
相同な配列のいずれかを含むクローンを単離し、増やす
ことによって、CNTFRコーディングDNAはレセプター生産
性トランスフェクション体からクローン化することがで
き、例えば、ヒトゲノムに高頻度で分布するAlu反復配
列を介してヒトDNAを同定することができる。例えば、C
NTFRをコードするトラアンスフェクションしたヒトDNA
を含み、かつヒトCNTFRを発現する培養非ヒト細胞を選
択し、増やして、次いでこれらの細胞から調製したゲノ
ムDNAを用いて培養非ヒト細胞をトランスフェクション
し、そしてCNTFRを発現する細胞を選択することができ
るが、これに限定されない。この方法を繰り返すが、こ
の目的は各トランスフェクション工程によってCNTFRコ
ーディング細胞中に存在するヒトDNAの量を減少させる
ことである。したがって、トランスフェクションされた
ヒトCNTFR発現細胞のゲノムDNAをクローン化してライブ
ラリーを作成するとき、ヒトDNAを含むクローン（例え
ば、特色あるヒト配列要素をスクリーニングすることに
よって同定する）は、反復トランスフェクションを実施
することによりCNTFRコーディング配列をより多く含む
傾向となる。
CNTFR発現細胞系または組織源、あるいはこのような
源から得られたcDNA発現ライブラリーからのRNAをアフ
リカツメガエル卵母細胞に直接注入法によってプールで
導入することができ、CNTFRをコードするプールを注入
した卵母細胞は、このような卵母細胞をCNTFにさらすこ
とによって誘導される機能的応答（例えばイオンフラッ
クス）をアッセイすることによって、あるいはこのよう
な注入卵母細胞の表面上のCNTF結合部位の存在を検出す
ることによって、同定できる。ポジティブなプールをよ
り小さなプールへと繰り返し分けることによって、CNTF
Rをコードする１個のクローンを同定することができ
る。
あるいは、cDNA発現ライブラリーをCNTFRをもつ標的
細胞から作成し、次いでこれを過渡的発現アッセイに用
いることができる。本発明の好ましい態様では、該発現
ライブラリーは複製のSV40オリジンを含み、過渡的発現
アッセイはCOS細胞を用いて行うことができる。CNTFRを
発現するトランスフェクション体を上記のようにして同
定し、標準法を用いてCNTFRをコードするDNAを回収す
る。Sendtnerらによる1990年８月20日出願の米国特許出
願番号07/570,651に記載するように、CNTFRをコードす
る核酸配列を次いで増やし、および／またはCNTFRをコ
ードする核酸のために上記した方法を実質的に用いる発
現系に使用する。
以下のセクション６（および図１）に実施例として記
載する本発明の特定の態様では、CNTFRの発現のクロー
ニングは以下のようにして行う。SH−SY5YのようなCNTF
Rを発現している細胞系または組織からcDNAライブラリ
ーを調製し、cDNAを発現ベクターに挿入する。例えば、
DEAE/クロロキン・トランスフェクション法を用いて、
このライブラリーを次いでCOS M5細胞のような適当な
細胞系にトランスフェクションする。トランスフェクシ
ョン数日後に、細胞を培養皿から回収して、Aruffo/See
dパニング法（Seed and Aruffo,1987,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.84:365−3369）に付すが、以下の修飾を行
う： （１）トランスフェクションした細胞を抗レセプター抗
体とインキュベートするのではなく、細胞をまず標識付
きCNTF（例えば、CNTF myc）とともに氷上で約30分間
インキュベートし、リン酸緩衝溶液（PBS）/2％ フィ
コールで遠心して過剰なリガンドを除去し、次いで抗標
識抗体（例えば、抗myc抗体9E10）とともに、氷上で約3
0分間インキュベートする。
（２）次いで細胞をPBS/2％ Ficollで延伸し、抗標識
抗体を認識する抗体（例えば、抗標識抗体が9E10である
場合には、抗マウス抗体）で塗布したプレート上で“パ
ニング”する。次に、付着していない細胞をプレートか
ら洗い流した後、付着細胞からHirt上清を調製し、約10
−20μｇのtRNAの存在下にプラスミドDNAを沈殿させ
る。得られたプラスミドDNAを次いで適当な細菌（例え
ば、DH10 Ｂ細菌）に、エレクトロポレーション（ただ
し、これに限定されない）を含む標準法を用いて導入す
る。形質転換した細菌から増殖した培養物を用いてプラ
スミドDNAを調製し、これを次の真核生物のトランスフ
ェクションおよびパニングに使用する。この第２回目の
トランスフェクション、パニングおよびプラスミドDNA
調製および形質転換の後、細菌形質転換体を選択培地に
まき、個々のコロニーを取り出してプラスミドDNA調製
に用い、そしてこのような多数のコロニーから調製した
DNAを個々に用いてCOS細胞トランスフェクションを行
う。あるいは、個々のコロニーを試験する前に、さらに
何回かこの“富ませる”工程を行うことが必要となるこ
ともある。得られたCNTF結合部位を発現するCOS細胞
は、放射性標識または蛍光標識した指示抗体を用いる間
接結合アッセイ（ただし、これに限定されない）を含む
多くの方法によって同定できる。CNTFR塗布核酸の一例
は、NRRLに寄託番号Ｂ−18789で寄託さており、かつDav
is and Yancopoulosによる“哺乳動物発現ベクター”
と題する、同時出願の米国特許出願に記載されているpC
MX−hCNTFR（I2）、図６に含まれる。この方法で同定し
たクローンを次いで標準法による制限酵素断片マッピン
グおよび核酸配列決定によって分析する。次いでCNTFR
コーディングcDNAの断片を用いて、例えば、標準的ハイ
ブリダイゼーション法によるゲノムDNAライブラリーか
ら、CNTFR遺伝子を含むゲノムDNA配列を同定する。
CNTFR遺伝子を得たら、これを当業者に公知の方法を
用いてクローン化またはサブクローン化する。当業者に
公知の多数のベクター−宿主系を用いることができる。
使用できるベクターはコスミド、プラスミドまたは修飾
ウイルスを含むがこれに限定されない。ただし、ベクタ
ー系は使用する宿主細胞と適合性でなければならない。
このようなベクターはラムダ誘導体のようなバクテリオ
フォージ、pBR322、pUCのようなプラスミド、またはBlu
esctiptTM（Stratagene）プラスミド誘導体を含むが、
これに限定されない。組換え分子を形質転換、トランス
フェクション、感染、エレクトロポレーションなどによ
って宿主細胞中に導入することができる。
CNTFR遺伝子は適当な宿主細胞を形質転換、トランス
フェクションまたは感染して、該遺伝子の多数のコピー
を生産するためにクローニングベクター中に挿入するこ
とができる。これは相補的付着末端を有するクローニン
グベクター中にDNA断片をライゲーションすることによ
って実施することができる。しかしながら、もしもDNA
断片に用いる相補的制御酵素部位がクローニングベクタ
ー中に存在しない場合には、DNA分子の末端を酵素的に
修飾することができる。この方法は、ベクターへの挿入
を可能にするポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に用いるオ
リゴヌクレオチドプライマー中に、制限酵素開裂部位を
導入するのに有利である。あるいは、DNA末端にヌクレ
オチド配列（リンカー）をライゲーションすることによ
っていかなる所望の部位も作り出すことができ、これら
のライゲーションされたリンカーは、制限酵素認識配列
をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドからな
る。さらに別の方法では、開裂したベクターとCNTFR遺
伝子をホモポリメリックテーリングで修飾することがで
きる。
特定の態様においては、単離したCNTFR遺伝子、cDN
A、または合成DNA配列を含む組換えDNA分子で宿主細胞
を形質転換すると、遺伝子の多数のコピーが得られる。
かくして、形質転換体を増殖し、形質転換体から組換え
DNA分子を単離し、そして必要な場合には単離した組換
えDNAから挿入遺伝子を再生することによって、遺伝子
を多量に得ることができる。
5.2.毛様体神経栄養性因子レセプターをコードする核酸 上に詳述した方法および下記の６項の実施例を用い
て、以下の核酸配列が決定され、相当するアミノ酸配列
が推定された。ヒトCNTFRの配列を図２（配列番号:1）
に示す。この配列、その機能的な等価物、または少なく
とも６ヌクレオチド長さのこの配列の断片を、本発明に
従って使用できる。さらに本発明は、CNTF活性が存在す
るブタ、ヒツジ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、またはイ
ヌ、並びに霊長類起源および他のあらゆる種から単離し
たCNTFR遺伝子に関する。CNTFR配列のハイブリダイズで
きる部分から成るサブ配列は、例えば核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット解
析等に使用される。
例えば、図２（配列番号:1）に示した核酸配列を、機
能的に等価の分子をコードする配列を提供する、置換、
添加または欠失のような突然変異で変えることができ
る。本発明によれば、分子はCNTFに結合する能力があれ
ば図２（配列番号:2）に示した配列を持つ分子に比べて
機能的に等価あるいは活性であるからそれは必ずしも天
然のCNTFRの親分性に匹敵する親分性でCNTFに結合しな
い。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、図２（配
列番号:2）に示したものと実質的に同じアミノ酸配列を
コードする他のDNA配列を、本発明の実施において使用
できる。これらは、制限するものではないが、配列内の
機能的に等価のアミノ酸残基をコードする種々のコドン
の置換により変化させた（それ故サイレントチェンジ
（silent change）を生じる）、図２（配列番号:1）に
示したCNTFR遺伝子の全てまたは一部から成る核酸配列
を含む。
さらに本発明の組換CNTFRをコードする核酸配列を、C
NTFRのプロセシングまたは発現を変更するように構築で
きる。例えば、制限するものではないが、CNTFR遺伝子
をプロモーター配列および／またはリボーム結合部位と
結合させ、またはシグナル配列を、CNTFRをコードする
配列の上位に挿入し、CNTFRを分泌させ、それにより採
収または生物学的有効性を促進することができる。
さらに既知のCNTFRをin vitroまたはin vivoで突然変
異させ、翻訳、開始、および／または終止配列をつくり
および／または破壊し、またはコード領域に変更をつく
り、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位
を形成し、または既存のものを破壊し、in vitro修飾を
さらに促進することができる。制限するものではない
が、in vitro部位特異的突然変異誘発（Hutchinson,et
al.,1978,J.Biol.Chem.253:6551）、TAB リンカー（Ph
armacia）の使用等を含む当業界で公知のいずれの突然
変異誘発技術も使用できる。
5.3.毛様体神経栄養性因子レセプターペプチド 本発明は、図２（配列番号:2）に記載のアミノ酸配列
を持つCNTFRタンパク質、その断片および誘導体または
その機能的等価物、およびそのようなタンパク質に相同
性が少なくとも約30パーセント相同なタンパク質も提供
する。本発明は、少なくとも６個のアミノ酸から成るか
または、抗原決定基から成るかまたは、機能的に活性な
CNTFRタンパク質の断片または誘導体も提供する。図２
（配列番号:2）に示したアミノ酸配列を持つCNTFRタン
パク質は約42kdの分子量を持つ。
本発明のCNTFRタンパク質、またはその断片または誘
導体は、制限するものではないが、機能的に等価のアミ
ノ酸残基が、サイレントチェンジ（silent change）を
生じる配列内の残基に置換されている変異配列を含む、
図２に示されているアミノ酸配列の全てまたは一部を一
次アミノ酸配列として実質的に含む物を含む。例えば配
列内の１以上のアミノ酸残基は機能的等価物として作用
する、同様の極性を有する別のアミノ酸で置換され、サ
イレント変化（silent alteration）を生じる。配列内
のアミノ酸の置換物は、そのアミノ酸が属しているクラ
スの他のメンバーから選ぶことができる。例えば無極性
（疎水性）アミノ酸はアラリン、ロイシン、イソロイシ
ン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトフ
ァンおよびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸はグリ
シン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、ア
スパラギン、およびグルタミンを含む。正に荷電（塩基
性）したアミノ酸は、アルギニン、リジンおよびヒスチ
ジンを含む。負に荷電（酸性）したアミノ酸は、アスパ
ラギン酸およびグルタミン酸を含む。例えばリン酸化、
グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解切断、
抗体分子、膜分子または他のリガンドへの連鎖（Fergus
onら,1988,Ann.Rev.Biochem.57:285−320）により、翻
訳中又は後に差別的に修飾される、CNTFRタンパク質ま
たはその断片または誘導体も本発明の範囲内に含まれ
る。
本発明のCNTFRペプチドは、組換え核酸発現技術、ま
たは標準ペプチド合成技術を使用する化学合成により調
整される。
5.4.繊毛神経向性因子レセプターの発現 組換えCNTFRを発現するために、CNTFRタンパク質また
はその一部分をコードするヌクレオチド配列を、適切な
発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質−コー
ド配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに
挿入する。必要な転写および翻訳シグナルも、天然のCN
TFR遺伝子および／またはその隣接領域から供給され
る。種々の宿主−ベクター系を利用しタンパク質コード
配列を発現できる。制限するものではないが、これら
は、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイ
ルス等）で感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えば、
バキュロウイルス）で感染した昆虫細胞系；酵母ベクタ
ーを含む酵母、またはバクテリオファージDNA、プラス
ミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換した細菌のよう
な微生物を含む。これらのベクターの発現要素は、その
強度および特異性において異なる。利用する宿主−ベク
ター系により、多くの好適な転写および翻訳要素のいず
れか１つが使用できる。
本発明の好ましい特定の実施態様では、CNTFR遺伝子
は、NRRLに寄託され受託番号Ｂ−18790を付与されたpCM
X発現ベクターに含まれる。
DNA断片をベクターに挿入することに関して以前に記
載されたいずれかの方法を使用して、適切な転写／翻訳
制御シグナルおよびタンパク質コード配列から成るキメ
ラ遺伝子を含む発現ベクターを構築できる。これらの方
法は、in vitro組換えDNAおよび合成技術およびin vivo
組換え（遺伝的組換え）を含むことができる。CNTFRタ
ンパク質またはペプチド断片をコードする核酸配列の発
現は、CNTFRタンパク質またはペプチドが、組換えDNA分
子で形質転換された宿主で発現されるように二次核酸配
列で調節される。例えばCNTFRの発現は、当業上で公知
のいずれのプロモーター／エンハンサー要素でも制御さ
れる、CNTFR発現を制御するのに使用できるプロモータ
ーは、制御するものではないが、SV40初期プロモーター
領域（Bernoist and Chambon,1981,Nature 290:304−31
0）、CMVプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３′末端
反復配列に含まれるプロモーター（Yamamotoら,1980,Ce
ll22:787−797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモー
ター（Wagnerら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:14
4−1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brins
terら,1982,Nature 296:39−42）；βラクタマーゼプロ
モーターのような原核発現ベクター（Villa−Kamaroff
ら,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727−3731）、
またはtacプロモーター（DeBoerら,1983,Proc.Natl.Aca
d.Sci.U.S.A.80:21−25）、Scientific American,1980,
242:74−79の“組換えバクテリアからの有用なタンパク
質”も参照;Gal4プロモーターのような酵母または他の
真菌類からのプロモーター要素、ADC（アルコールデヒ
ドロゲナーゼ）プロモーター、PGK（ホスフォグリセロ
ールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼ
プロモーター、および、組織特異性を示しトランスジェ
ニック動物で利用されている以下の動物転写制御領域：
膵臓房状細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域
（Swiftら,1984,Cell38:639−646;Ornitzら,1986,Cold
Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399−409;MacDonal
d,1987,Hepatology ７:425−515）；膵臓β細胞で活性
なインシュリン遺伝子制御領域（Hanahan,1985,Nature
315:115−122）、リンパ系細胞で活性な免疫グロブリン
遺伝子制御領域（Grosschedlら,1984,Cell 38:647−65
8;Adamesら,1985,Nature 318:533−538;Alexanderら,19
87,Mol.Cell.Biol.７:1436−1444）、精巣、胸、リンパ
系およびマスト細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領
域（Lederら,1986,Cell45:485−495）、肝臓で活性なア
ルブミン遺伝子制御領域（Pinkertら,1987,Genes and D
evel.１:268−276）、肝臓で活発なα−フェトプロテイ
ン遺伝子制御領域（Krumlaufら,1985,Mol.Cell.Biol.
５:1639−1648;Hammerら,1987,Science 235:53−58）；
肝臓で活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域
（Kelseyら,1987,Genes and Devel.１:161−171）、骨
髄細胞で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Mogram
ら,1985,Nature 315:338−340;Kolliasら,1986,Cell 4
6:89−94）；脳の乏突起謬細胞で活性なミエリン塩基性
タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら,1987,Cell 48:
703−712）；骨格筋で活性なミオシンＬ鎖２遺伝子制御
領域（Sani,1985,Nature 314:283−286）、および視床
下部で活性な生殖腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域
（Masonら,1986,Science 234:1372−1378）、を含む。
CNTFR遺伝子挿入を含む発現ベクターは３つの一般的
方法で同定できる：（ａ）DNA−DNAハイブリッド形式、
（ｂ）“マーカー”遺伝子機能の存在または非存在、お
よび（ｃ）挿入配列の発現。最初の方法では、発現ベク
ターに挿入された外部遺伝子の存在を、挿入CNTFR遺伝
子に相同な配列から成るプローブを用いてDNA−DNAハイ
ブリッド形式で検出できる。２番目の方法では、組換え
ベクター／宿主系を、ベクターへの外部遺伝子の挿入に
より生じる、ある“マーカー”遺伝子機能（例えばチミ
ジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表
現型、バキュロウイルスでの閉塞体形成等）の存在また
は非存在に基づいて、同定および選択できる。例えばCN
TFR遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入さ
れると、CNTFR挿入物を含む組換え体が、マーカー遺伝
子機能の非存在により同定できる。３番目の方法では、
組換え発現ベクターを、組換え体により発現した外部遺
伝子生成物のアッセイにより同定できる。例えばこのよ
うなアッセイは、CNTFR遺伝子生成物の物理的または機
能的特性、例えばCNTFへの、またはCNTFRを直接認識す
る抗体へのレセプターの結合に基づく。
別の実施態様では、正常ではCNTFRを発現しない細胞
を、組換えCNTFRをコードする核酸で転写し、続いて、
トランスフェクタントをCNTFに晒し、続いてcAMP値の増
加を調べることにより機能的CNTFRの発現を検査でき
る。
特定の組換えDNA分子が同定および単離されると、そ
れを増殖するのに当業上公知の幾つかの方法を使用す
る。好適当な宿主系と増殖条件が確立されると、組換え
発現ベクターを多量に増殖および調製できる。以前に説
明したように、使用できる発現ベクターは、制限するも
のではないが、以下のベクターまたはその誘導体を含
む:2−３例をあげるとワクシニアウイルスまたはアデノ
ウイルスのようなヒトまたは動物ウイルス；バキュロウ
イルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリ
オフォージベクター（例えばラムダ）、およびプラスミ
ドとコスミドDNAベクター。
さらに、挿入配列の発現を調節し、または望ましい特
定の形態で遺伝子生成物を修飾しプロセシングする宿主
細胞株を選ぶ。あるプロモーターからの発現は、ある誘
導物質の存在下で上昇させることができる；それ故、遺
伝操作CNTFRタンパク質の発現を制御できる。さらに、
種々の宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロ
セッシングおよび修飾（例えばグリコシル化、切断）に
関して特有で特定のメカニズムを持っている。発現する
外部タンパク質の望ましい修飾とプロセシングを確実に
するために、適切な細胞系または宿主系を選択する。例
えば、細菌系での発源を使用して、非グリコシル化コア
タンパク質生成物を生産できる。酵母での発現を使用し
てグリコシル化生成物を生産できる。哺乳動物細胞での
発現を使用して異種CNTFRタンパク質の“天然の”グリ
コシル化を確実にできる。さらに種々のベクター／宿主
発現系は、種々の程度でタンパク質分解切断のようなプ
ロセシングに影響する。
CNTFR遺伝子を発現する組換え体が同定されると、遺
伝子生成物を分析しなければならない。これは、生成物
の物理的または機能的特性に基づくアッセイで達成され
る。
CNTFRタンパク質は同定されると、それはクロマトグ
ラフィー（例えばイオン交換、親和性、およびサイジン
グカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、分別溶解度
を含む標準方法により、またはタンパク質精製の他のい
ずれの標準技術により、単離、および精製される。特
に、CNTFRタンパク質は、固定支持体に結合しているCNT
Fから成る親和性カラムへの結合により単離される。
CNTFRまたは機能的に活性なその一部分をコードするD
NAまたはRNA配列に相補的な核酸配列も提供する。特別
な態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが合成で
き、これは少なくともCNTFR mRNAの一部に相補的であ
る。
5.5.織毛神経向性因子レセプターに関連する分子の同定 同一の因子が多重レセプターに結合できる多重レセプ
ター−因子系が、明確にされている（上記参照）。CNTF
の場合もこれに当てはまりcDNA発現ライブラリーを製調
するために用いられたRNAの起源を除いて、ここに記載
されたCNTFRを得るために用いられた同一の方法によ
り、本発明は別の任意のCNTFレセプターの同定を可能に
する。明確なCNTFレセプターを発現するような起源を選
ぶことができる；起源は、CNTFRによるのではなくCNTF
−結合の存在で評価できる（CNTFR配列から生成した遺
伝プローブと抗体試薬を、細胞系または組織起源のCNTF
結合を生じるタンパク質とここに記載されたCNTFとを比
較するのに使用する）。さらにレセプターは１以上の関
連する因子に結合することが知られているので（上記参
照）、CNTFRの同定は、このレセプターに結合する、任
意の別の天然のリガンドの同定も可能にする。
本発明の別の態様では、CNTFR配列を、CNTFR−関連分
子の同定にも使用する。CNTFRは種々の他のレセプター
と共通するモチーフを含んでいる。CNTFRの細胞外部分
は、そのＮ−末端に“免疫グロブリン”ドメイン、並び
に短いヒンジ部で“免疫グロブリン”ドメインから分離
されている“サイトカインレセプター”とを含んでい
る。多くのレセプターは“免疫グロブリン”かまたは
“サイトカインレセプター”ドメインのいずれかに相同
であるが、ただ１つのレセプター−IL−６レセプター−
がこれらのドレインの同じ特別の配列をCNTFRと共有す
る。従って、IL6レセプターはCNTFRと最も関連するタン
パク質である。興味深いのは、IL−６結合に際して反応
の開始には明らかには必要ではない、非常に短い細胞質
内ドメインを持っている点で、IL−６レセプターは、CN
TFRと似てもいる（Hibiら,1990,Cell 63:1149−115
7）。最近gp 130と称するIL−６レセプターの新規なシ
グナルトランスデューザーが分子的にクローン化され
た。このトランスデューザーは、単独でIL−６に結合し
ないが、IL−６レセプターに高度の親和性結合を授与
し、IL−６シグナルの変換に必要である（Hibiら,1990,
Cell 63:1149−1157）。CNTFRのクローン化で、CNTFR
は、他の既知のレセプターでは見いだされない重要な特
徴をIL−６レセプターと共有していることが明らかにな
り、それ故レセプターの新しいファミリーが定義され
る。このレセプターファミリーのこれら最初の２つのメ
ンバー間の相同は、本発明で定義されるように、相同領
域に相当するDNAまたは抗体プローブを使用して、また
はアミノ酸相同の共有領域に相当する縮重オリゴヌクレ
オチドと共にポリメラーゼ連鎖反応を使用して、別の関
連するレセプターを同定するのに使用できる（例えば、
Maisonpierreら,1990,Science 247:1146−1451）。本発
明は、CNTFRがIL−６レセプターと同じシグナルトラン
スデューサーを利用するかどうか、またはCNTFRが関連
分子を利用するかどうかを検査するためにも使用でき
る。最後に、CNTFR−関連レセプターの同定は、これら
のレセプターに結合するであろう新規なリガンドの同定
の助けとなるべきである。
本発明によると、タンパク質配列データまたは図２
（配列番号:1）に記載の核酸配列のいずれかに由来す
る、CNTFR配列に相当するオリゴヌクレオチドを用い
て、（ゲノムDNAまたは好ましくはcDNAから成る）DNAラ
イブラリーのスクリーニングにより、上記のファミリー
の新しいメンバーをコードするクローンが同定できる。
ハイブリッド形成の緊密性を減少させることにより、フ
ァミリーのいくらか分岐したメンバーの同定機会を増加
できる。ファミリーのメンバーで実質的に共有されてい
る、配列が決定されている配列を使用することも望まし
い；このように高度の保存領域は、ファミリーの別のメ
ンバーの同定に特に有用であり得る。ライブラリースク
リーニングは、例えばBentonとDavis（1977、Science 1
96:180）またはGrunsteinとHogness（1975,Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.72:3961−3965）のハイブリッド形成技
術を使用して実施できる。続いて、ハイブリッド形成で
同定したクローンは、さらに解析され、そして、新しい
ファミリーのメンバーを当業上で公知の方法により、制
限断片地図作製と配列決定技術で同定できる。
CNTFRスーパーファミリーの別のメンバーを同定する
ために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saikiら,1
985,Science 230:1350−1354）を利用することが望まし
い。例えば、既知のCNTFR配列に対応するセンスおよび
アンチセンスプライマーを、好ましくは鋳型として相補
的DNAを使用して、PCRに使用できる。PCRの生成物の、
適切なクローン化ベクターへの挿入を促進する制限酵素
切断部位を含むようにこれらのプライマーをデザインす
ることが望ましい。PCRの生成物を、適切なベクターに
挿入し、次いで、生じたクローンの新しいファミリーメ
ンバーをスクリーニングする。このようなスクリーニン
グは、既知の配列に相当するプローブを使用してハイブ
リッド形成解析を含む標準技術を使用して実施できる。
例えば、上に概略したように、特徴決定したCNTFRタン
パク質の種々の領域を表す一連のプローブを、低緊縮性
でPCRを使用して発生したクローンからDNAを持つ複数の
フィルターとハイブリッド形成する。種々のクローン
が、あるプローブとハイブリダイズできるが他のものと
はできないことが観察されるであろう。新しいファミリ
ーのメンバーも、ハイブリッド形成の条件の緊密性を増
加させることにより同定でき、ここで、既知のメンバー
から由来するプローブと同一ではない新しいメンバー
は、緊密性ではハイブリッド形成があまり強くない。こ
れとは別に、新しいファミリーメンバーを、標準技術を
使用して、制限地図作製または配列解析により同定し、
制限地図または配列での既知の族メンバーに対する相異
を明らかにする。
別の実施態様では、本発明は、CNTFRと複合体を形成
し、そしてそれによりCNTFR機能に関与できる分子を提
供する。例えば、CNTFRは細胞質ドメインを有さないよ
うに見えることが、配列解析で見いだされている；事
実、CNTFRはGPI連鎖グリコシルーホスファチジルイノシ
トールを介して膜に結合できる（Fergusonら,1988,Ann.
Rev.Biochem.57:285−320参照）。これは、少なくとも
もう１つ他の分子がCNTFRと会合を形成し、細胞膜を越
えてシグナル変換に関与することを示唆する。例えば、
このような分子は、IL−6Rと会合していることが見いだ
されるGP130のようなタンパク質であり得る（Tagaら,19
89,Cell 58:573−581）；これはCNTFRとIL−６レセプタ
ー間の相同性を考慮すると共に事実らしい。細胞膜でCN
TFRと会合している分子は、制限するものではないが、
化学的架橋、抗−CNTFR抗体との共沈、またはCNTFR/標
識を介して、および／または、タンパク質または脂質精
製技術を含む、当分野の公知のいずれの方法によっても
単離し同定できる。
さらに本発明は、CNTFRに結合できるCNTF以外の分子
を提供する。このような分子は、CNTFR結合において、
他の正常リガンドを含むCNTFと競合する分子として明確
にされ、ペプチド、ペプチド誘導体および非−ペプチド
（例えば擬態ペプチド）化合物を含む。
5.6.発明の有用性 5.6.1.アッセイ系 本発明は、ペプチドまたは非ペプチド化合物にさらす
ことから生じるCNTF活性に類似するCNTF活性または活性
度が、本発明のCNTFR分子を発現するCNTFに応答する細
胞または細胞系におけるCNTFに対する生理学的応答を測
定することにより検出されるであろうアッセイ系を提供
する。生理学的応答は、2,3例をあげると、上記2.2項に
記載されているものおよびいくつかの核酸配列（例え
ば、プロモーター／エンハンサー要素および構造遺伝
子）の転写上の活性、CNTF関連のプロセシング、翻訳ま
たはリン酸化、CNTFにより直接または間接的に誘発され
る突起に応答する第二の突起の誘発および神経突起発芽
のような形態学的変化または毛様体神経節細胞、運動ニ
ューロン、プルキンエ細胞または海馬神経細胞のような
細胞の生存を維持する能力を含むがこれらに限定されな
い、CNTFの任意の生物学的作用を含んでなる。
本発明の好ましい特定の実施態様において、CNTFとCN
TFRとの間の機能的相互作用は、ｃ−fosおよびｃ−jun
を含むがこれらに限定されない多くの成長因子刺激トラ
ンスメン ブランシグナルに応答して活性化される“即
時型初期”第一次応答遺伝子の生成の増加を検出するこ
とにより観察される。例えば、即時型初期遺伝子の活性
化は即時型初期遺伝子mRNAレベルのノーザンブロット法
により検出される。本発明の好ましい実施態様におい
て、CNTF活性がｃ−fosまたはｃ−junのレベル増加によ
り証明されるところの、CNTFとインキュベートした標的
細胞から調製されたmRNAのノーザンブロット法により、
ｃ−fosまたはｃ−jun mRNAレベルは測定される。注意
すべきことは、本発明の特別の実施態様において、組換
えCNTFRをコードする核酸を含む標的細胞が生成される
かまたはCNTFに対する結合により選択された後において
は、標的細胞がCNTFまたはCNTF状活性を有する化合物に
特徴的に応答するのを確実にすることは望ましいことで
ある。本発明の文脈において、CNTF状活性という語は、
類似してはいるがCNTFのそれと同一または同一でない生
物学的活性を意味すると解釈される；そのような活性
は、上記2.2項に記載されたもの、またはfosまたはjun
プロモーターのような特別の即時型初期プロモーターの
活性を含むであろうがこれらに限定されない。
本発明はCNTFまたはCNTF状活性に関して化合物のスク
リーニングに利用される新規アッセイ系の開発を提供す
る。CNTFに結合する標識細胞は、CNTFRをコードする核
酸でトランスフェクションすることにより生成される
か、または、例えば蛍光活性化細胞選別、ロゼットの沈
降または下記5.6.3項に記載されている限界希釈により
同定され分離される。
標的細胞系が生成されるかまたは同定されると、CNTF
に非常に感度のよい細胞を選択するのが望ましい。その
ような標的細胞はより多くの数のCNTFRを有している；
相対的に多くのCNTFRを有する標的細胞は、高レベルのC
NTFに結合する標的細胞、例えば、CNTF/tagとインキュ
ベートして免疫蛍光アッセイにかけた場合、比較的高い
度合いの蛍光を生じる細胞を選択することにより同定し
得る。または、CNTFに非常に感度のよい細胞は、CNTF結
合に応答して、ｃ−fosまたはｃ−junのような即時型初
期遺伝子生成物の急激な増加のような比較的強い生物学
的応答を示す。CNTFに非常に感度のよい標的細胞を用い
るアッセイ刑を開発することにより、本発明は低レベル
のCNTF活性を検出できる、CNTFまたはCNTF状活性をスク
リーニングする方法を提供できる。
特に、組換えDNA法を用いることにより、本発明はCNT
Fに非常に感度のよいように操作されたCNTF標的細胞を
提供する。例えば、5.1項に記載された方法によりクロ
ーン化されたCNTFレセプター遺伝子を、本来CNTF応答性
があり、組換えCNTFR遺伝子を高レベルで発現し、生じ
た操作による標的細胞がそれらの細胞上に非常に多くの
数のCNTFRを発現するような細胞に挿入する。
またはあるいはさらに、CNTF/レセプター結合に応答
して高レベルで発現する組換え遺伝子を含んでなるよう
に標的細胞を操作する。そのような組換え遺伝子は容易
に検出可能な生成物と関連していることが好ましい。例
えば、限定するものではないが、即時型初期遺伝子から
の転写制御領域（すなわちプロモーター／エンハンサー
領域）を標的細胞に導入される構築物中のレポーター遺
伝子の発現を制御するために用いられる。強力なプロモ
ーター／エンハンサーまたは複製数が多いことにより標
的細胞において高レベルに発現される場合、即時型初期
遺伝子／レポーター遺伝子構築はCNTFR結合に対して増
幅応答を生じるために用いられる。例えば、限定するも
のではないが、CNTF応答性プロモーター（例えばｃ−fo
sまたはｃ−junプローモーター）は、β−ガラクトシダ
ーゼ、成長ホルモン、クロラムフェニコール アセチル
トランスフェラーゼ、ネオマイシン ホスフォトラン
スフェラーゼ、ルシフェラーゼ、またはβ−グルクロニ
ダーゼを含む検出可能なレポーター遺伝子の発現を制御
するために用いられる。当業者によく知られているよう
に、これらレポーター遺伝子の生成物検出は医薬化合物
のCNTFまたはCNTF状活性の感度のよい指標として役立
つ。
トランスフェクション、エレクトロポレーション、カ
ルシウムホスフェート/DEAEデキストラン法およびセル
ガン（cell gun）ならびにトランスジーンとして上記構
築物を有するトランスジェニック動物を作り出すこと、
を含むがこれらに限定されない当業上知られている任意
の方法を用いて、CNTFRをコードするか、または上記の
レポーター遺伝子構築物を標的細胞に挿入して、そこか
らCNTF標的細胞を上記の方法を用いて選択する。
本発明のアッセイ系はCNTF関連疾患の治療において用
いられる医薬化合物の効率的なスクリーニングを可能に
する。例えば、限定するものではないが、それはCNTF活
性および小脳退化における治療上の効能について医薬剤
をスクリーニングするのが望ましい。本発明の特定の実
施態様において、CNTFに応答性のあるプルキンエ細胞は
同定され単離され続いてマルチウエル培養プレートのミ
クロウエル中で培養される。多くの希釈物の検査剤添加
またはCNTF添加の培地を好適な対照と共にウエルに加え
る。続いて生存性の向上、神経突起発芽、その他につい
て細胞を調べ、そして検査剤およびCNTFの活性ならびに
それらの相対的活性を測定する。他の例として、運動ニ
ューロンの損傷がCNTFに対して良好に応答することが示
されている（Sendtnerら,1990,Nature 354:440）。従っ
て、CNTFのように軸索切断の後運動ニューロンの死を防
ぐCNTF状化合物を同定することが望ましい。運動神経疾
患を治療するのに有用な化合物を同定するためにアッセ
イ系におけるCNTF応答運動神経を利用し得る。脊髄損
傷、筋萎縮性側索硬化症および糖尿病性神経障害の治療
を考える場合、血液脳関門を通過することが必要な薬剤
を含む、これらの障害を治療するのに効果的な薬剤を設
計する上で明らかに非常に重要な観察である、軸索切断
の後運動ニューロンの死を防ぐのにCNTFが有効であると
わかったことを考えると、本発明が提供する方法のよう
な信頼でき、感度のよいスクリーニング系を入手する方
法を有することが重要である。他の例として、もし特定
の疾患が特定の組織におけるCNTF応答の欠陥と関連して
いることがわかったならば、その疾患に対する合理的な
治療は外来性CNTFを患者に供給することであろう。しか
しながら、外来性CNTFよりも長い半減期を有する、また
はCNTFアゴニストとして作用する、または特定の組織に
対して向う分子を開発することが望ましい。従って、本
発明の方法は、所望の特性を有する分子を同定するため
に用いられる、効率的で感度のよいスクリーニング系を
作るために用いられる。類似のアッセイ系が、CNTFアン
タゴニストを同定するために用いられ得る。
5.6.2.実験モデル系 本発明は、またCNTFの生理学的役割を研究するための
実験モデル系も提供する。これらのモデル系において、
CNTFRタンパク質、ペプチドフラグメントまたはその誘
導体が系に供給されるかまたは系内で生成される。その
ようなモデル系は、CNTF過剰またはCNTF涸渇の作用を研
究するために用いられ得る。CNTFR発現が誘導可能な、
または発生的に調節されているプロモーターにより制御
される実施態様における、細胞または組織培養物、動物
全体、動物全体の特別の細胞または組織、または組織培
養系、または特定の時間間隔（胚形成期を含む）におけ
るCNTFに対する応答増加または減少の作用を研究するた
めに、実験モデル系は用いられる。本発明の特定の実施
態様において、CMVプロモーターがトランスジェニック
動物におけるCNTFRの発現を制御するために用いられ
る。ここで用いられる、“トランスジェニック動物”と
いう語は、それらの細胞のいくつか、または全てにトラ
ンスジーンを担持し、任意のヒト以外の種を含み、マイ
クロインジェクション、細胞融合、トランスフェクショ
ン、エレクトロポレーションその他を含むが、これらに
限定されない当業上知られている任意の方法により作ら
れるトランスジェニックモザイクを含むヒト以外のトラ
ンスジェニック動物を言う。例えば、“Brinsterら,198
9,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:4438−4442に記載され
ている接合体方法であるマイクロインジェクションによ
りその動物は作られる。
本発明は、また自己免疫応答がCNTFRに向けられる、
自己免疫疾患のためのモデル系も提供する。そのような
モデルは、免疫反応を起す量のCNTFRで免疫され、好ま
しくは、抗CNTFR抗体および／または細胞性免疫を生成
することが見い出される動物を含んでなる。そのような
モデル系を作るために、Bacille Calmette Guerin（BC
G）のような免疫アジュバンドと共にCNTFRを投与するこ
とが望ましい。
5.6.2.1.CNTF活性増加モデル 例えば、限定するものではないが、過剰CNTF活性の作
用を研究するために用いられる、実験モデル系が作られ
る。そのようなシステムにおいて、CNTFに対する応答
は、そのように操作されていない細胞と比較してモデル
系の細胞にCNTFRの数を増加する操作により増加され
る。通常CNTFRを発現する細胞を選んでそこに増加したC
NTFRを与えることは好ましい。
細胞を操作して本発明のCNTFR遺伝子を担持するウイ
ルスで感染させることによりCNTFR数の増加を生じさせ
る。または、CNTFR遺伝子をトランスフェクションで細
胞に提供する。
モデル系が動物の場合、CNTFR遺伝子を担持するウイ
ルスで感染させることにより組換えCNTFR遺伝子を動物
の細胞に導入する。また、トランスジーンとしてCNTFR
遺伝子を担持する、トランスジェニック動物を作る。
CNTFRの発現を確実なものとするために、CNTFR遺伝子
を好適なプロモーター配列の制御下に置くべきである。
CNS神経細胞特異的エノラーゼ、ニューロフィラメント
およびチロシン ヒドロキシラーゼ プロモーター、例
えばメタロチオネインプロモーター、ヒト免疫不全ウイ
ルスの長い繰り返し配列中のUV活性化プロモーター（Va
leriら,1988,Nature 333:78−81）のような誘導可能な
プロモーター、またはCMVプロモーター（下記、pCMXに
含まれる）または発生的に調節されているプロモーター
を含むがこれらに限定されない構成的および／または組
織特異的プロモーターの制御下にCNTFR遺伝子を置くこ
とが望ましい。
細胞CNTFRの数を増加させることにより、内在性CNTF
の応答が増大される。モデル系がほとんどまたは全くCN
TFを含まない場合、CNTFを系に加える。過剰CNTF活性の
作用を評価するために、さらにCNTFをモデル系に加える
ことも望ましい。発現過剰CNTF（または分泌CNTF）は、
すでにCNTFRを発現している細胞で高まったレベルのCNT
F作用を研究するために好ましい方法である。さらに好
ましくは全ての細胞（一般発現）にCNTFRを発現させ、
続いてどの細胞がCNTFに対して機能的応答性を賦与され
たか決定し、その結果、もし存在するならば、第２レセ
プター成分のありうる同定を可能にする。
5.6.2.2.CNTF活性減少モデル また、限定するものではなく例として、CNTF活性減少
の作用を研究するために用いられる実験モデル系を作
る。この系はCNTFを必要とし、治療上の標的となり得る
突起または神経細胞の同定を可能にする。そのような系
において、細胞表面と関連していないか、またはCNTFに
対する応答を変換することに無力になるように操作され
ている組換えCNTFRを提供することにより、CNTFへの応
答が減少される。
例えば、供給されたレセプターがCNTF結合で内在性CN
TFRと競合し、それによってCNTFに対する応答が減少す
るようにCNTFRタンパク質、ペプチドまたは誘導体を系
に供給する。CNTFRは系に加えられたかまたは系により
生成された細胞なしのレセプターである。例えば、トラ
ンスメンブランドメインを欠くCNTFRタンパク質は、生
成細胞から分泌される固定するものがないCNTFRのよう
に系内で細胞により生成される。また、CNTFRタンパク
質、ペプチドまたは誘導体を系内において細胞外隙に加
える。
本発明の別の実施態様において、組換えCNTFRは相同
的組換えにより内在性遺伝子を不活性化または“不能”
にするために用いられ、それにより、CNTFR欠失細胞、
組織または動物を作る。例えば、限定するものではない
が、組換えCNTFR遺伝子を操作して、CNTFRを不活性化さ
せる、例えばneo遺伝子のような挿入変異を含有させ
る。好適なプロモーターの制御下で、そのような構築物
を、トランスフェクション、形質導入、注射その他のよ
うな方法により、胎児性幹細胞のような細胞に導入す
る、続いて構築物を含む細胞をG418耐性により選択す
る。続いて、完全なCNTFRを欠失している細胞を、例え
ばサザンブロットまたはノーザンブロットまたは発現の
アッセイにより同定する。続いて完全なCNTFR遺伝子を
欠く細胞を初期胎児性細胞と融合しCNTFR欠失のトラン
スジェニック動物を作る。そのような動物と内在性CNTF
を発現しない動物との比較により、別のCNTF状因子また
はレセプターの存在を意味する２つの表現型が完全に適
合するかまたは適合しないかが明らかにされるであろ
う。
そのような動物は特別の神経細胞群または通常CNTFに
依存する他の任意のin vivo突起を明確にすることに用
いられる。従って動物がCNTFRを発現せず、そしてその
結果CNTFに応答できない場合、これらの群または突起が
作用を受けていると予想される。
また、CNTFに対して内在性レセプターと競合する、組
換えCNTFRタンパク質、ペプチド、または誘導体は系内
で細胞表面に発現されるが、CNTF結合に対する応答を変
換することがないように操作される。
上記の組換えCNTFRタンパク質、ペプチドまたは誘導
体は、内在性CNTFRのCNTFに対する親和性と類似する、
または異なる親和性を有するCNTFと結合する。CNTFへの
応答をさらに効果的に減少させるために、CNTFRタンパ
ク質、ペプチドまたは誘導体を、天然のレセプターによ
り示される親和性よりも大きな親和性を有するCNTFに結
合させることが望ましい。
CNTFRタンパク質、ペプチドまたは誘導体がモデル系
内で生成される場合、CNTFRタンパク質、ペプチドまた
は誘導体をコードする核酸を感染、形質導入、トランス
フェクション、その他により系に供給する。上記のよう
に、CNTFR遺伝子を、例えば組織特異的プロモーターま
たは誘導可能なプロモーターまたは発生上調節されてい
るプロモーターのような好適なプロモーターの制御下に
置く。
本発明の特別の実施態様において、細胞の内在性CNTF
R遺伝子を相同的組換えにより変異CNTFR遺伝子と置換す
る。
本発明の別の実施態様において、CNTFRタンパク質の
発現を減少させるのに効果的なかなりの量のCNTFRアン
チセンスRNAまたはDNAをCNTFR発現細胞に提供すること
により、CNTFR発現を減少させる。
5.6.3.診断への応用 本発明により、正常または疾患状態において、CNTFに
応答性のある細胞および組織を同定するためにCNTFRプ
ローブが用いられる。本発明は、そのような細胞におけ
るCNTFRを検出することを含んでなる、CNTFに応答性の
ある細胞を同定する方法を提供する。CNTFR発現は、CNT
FR mRNAの転写またはCNTFRタンパク質の生成により明示
される。CNTFR発現は、CNTFR核酸またはタンパク質を同
定するプローブを用いることにより検出される。
CNTFR発現を検出するために用いられるプローブの一
種は、in situハイブリッド形成、ノーザンブロット
法、またはPCR関係の方法を含むがこれらに限定されな
い当業上知られている任意の方法によりCNTFRをコード
するRNAを検出するために用いられる核酸プローブであ
る。
用いられるプローブの他の種は、この出願の参照文献
として完全な文献が編入されているU.S.出願番号07/53
2,285に記載の標識CNTFである。
本発明によれば、“標識"CNTFの語は、第二の検出可
能な化合物（“標識”）に付着している、CNTF分子を意
味すると解されるべきである。検出可能な化合物は、ラ
ジオアイソトープ、蛍光部分、またはレセプターに結合
できるリガンドまたは比色定量的に検出されるかまたは
触媒活性を有する物質を含んでなる。好ましい実施態様
において、標識は抗体が標識に結合できる抗原決定基を
含んでなる。他の実施態様において、標識そのものが抗
体である；本発明の特別の実施態様において、標識はモ
ノクローナル抗体RP3−17である。標識がCNTFの生物学
的活性を妨げず、標識の検出方法がCNTFのそのレセプタ
ーへの結合を実質的に妨げないことが望ましい。
標識を当業上知られている任意の方法を用いてCNTFに
付着させる。本発明の好ましい実施態様において、標識
はCNTFに共有結合しているが、いくつかの場合におい
て、標識は非共有結合力（例えば、標識が免疫グロブリ
ン分子を含んでなる場合）により付着されることが望ま
しい。
標識は、付着したCNTFの生物学的活性を実質的に変化
させることなしにその検出機能を保存するのに好適な任
意の分子サイズである。標識が抗原決定基を提供する場
合、それが少なくとも約５−15アミノ酸を含んでなるこ
とが望ましい。
限定するのでなく説明する目的で、本発明のひとつの
好ましい特別の方法において、組換え神経栄養因子（CN
TF）を操作して、そのＣ末端部に既知の抗原決定基に相
当する10アミノ酸を担持するように“パンチ”ポリメラ
ーゼ連鎖反応を用いてCNTFを標識する。例えば、限定す
るものではないが、この抗原決定基はヒトｃ−mycプロ
トオンコジーンタンパク質の明確なエピトープに相当す
る。
例えば、限定するものではないが、“パッチ"PCR法を
次のように10アミノ酸myc標識を付着させるために用い
る（本発明は類似の方法により、付着される任意のアミ
ノ酸標識を提供する。）鋳型としてCNTF反応性細胞から
のcDNAを用いて細菌発現構築物の唯一の制限酵素切断部
位のCNTF配列上流に相当する5'PCRプライマーを、3'末
端CNTF配列に相当する核酸配列およびペプチド標識をコ
ードする核酸配列を含んでなる、“パッチ”プライマー
と共にPCR反応に利用する。
PCR反応はまたパッチプライマー配列に相当し、唯一
の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む核酸配列を含
んでいる3'プライマーも含んでなる。好ましい実施態様
において、5'とパッチプライマーとの間のPCR増幅が２
〜３回のPCRサイクルの後に止まるが、5'と3'プライマ
ーとの間の増幅が始まりそして高収量の完全な長さのCN
TF/標識配列が生成されるまで継続するようにパッチプ
ライマーよりも多く5'および3'プライマーを用いる。
“パッチ”法は、合成が難しく時間がかかる長いプライ
マーの必要性を克服する。増幅されたCNTF/標識生成物
を、ゲル精製し、生成物の末端に操作して入れられた部
位で切断する制限酵素で消化し、続いて発現ベクターの
相当する制限部位にサブクローンする。例えば、CNTF−
myc標識を生成するために、次のプライマーが用いられ
る:5'プライマー＝（5'GAC TCG AGT CGA CAT CGG AGG C
TG ATG GGA TGCC 3'（配列番号:3）；パッチプライマー
＝3'CTA AAG ACT CCT CCT AGA CAT CGC CGG CGT ATCG
5'（配列番号４）；プライマーは100ng 5'プライマー/1
00ng3'プライマー/1ngパッチプライマーの割合で用いら
れる。詳しくは下記６項参照。1990年８月20日に出願さ
れた“Ciliary Neurotrophic Factor,"という名称のU.
S.特許出願番号07/570,651に、またはSendtnerらにより
1991年４月４日に出版されたPCT公告No WO91/04316の組
換えCNTFの発現の記載のようにCNTF/標識の発現を行
う。
本発明は、免疫グロブリン分子または、その一部例え
ば抗体分子のフラグメントである、Fc、Ｆ（ab）２、ま
たはＦ（ab）’を含んでなる標識も提供する。標識は、
CNTFに結合すべきであり、ポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体である。
本発明によれば、標識CNTFを、細胞にCNTFの結合また
は付着を促進する条件下で該細胞とインキュベートす
る。多くの場合において、これは標準的培養条件のもと
で達成される。例えば、本発明の好ましい実施態様にお
いて、細胞は標識されたCNTFの存在下で約30分間インキ
ュベートする。標識が抗体分子である場合、CNTFを最初
に細胞に結合させて、続いて細胞を洗浄して未結合リガ
ンドを取り除き続いて抗CNTF抗体標識を加えることが好
ましい。
本発明の特別の実施態様において、標識に結合できる
指示細胞をCNTF/標識を有する細胞とインキュベート
し、それらが標的細胞上のCNTF/標識と粘着して、結合
した指示細胞がCNTF−標識を有する細胞のまわりにロゼ
ット状のクラスターを形成する、ロゼットアッセイによ
りCNTF応答性細胞（以後標的細胞と呼ぶ）の表面上の標
識CNTFを検出する。これらのロゼットはプレートした細
胞を標準顕微鏡法により可視化するか、または別法とし
て密度遠心法によりロゼットおよび非ロゼット細胞の分
離をする。本発明の好ましい特別の実施態様において、
神経細胞のような標的細胞を収穫し、10％ウシ胎児血清
および2mMグルタミンを有するRPM1 1640のような培地の
マルチウエル（例えば60ウエル）培養プレート中で約20
0細胞／ウエルの濃度でプレートする。プレートした細
胞を加湿、５％CO2空気のインキュベーター中で、37℃
で、約16−24時間インキュベートして細胞を付着させ
る。次に、余分な細胞培養培地を取り除き、細胞を標識
CNTFと共に室温で約30分間インキュベートする。続い
て、細胞を１％ウシ血清アルブミン（BSA）を補充したP
BS（カルシウムおよびマグネシウムを有する）で数回洗
浄し、未結合リガンドを取り除き、続いて標識分子を認
識する約10μg/mlの抗体と共に室温で約30分間インキュ
ベートした。続いて、細胞をPB Ｓで数回洗浄し、未結
合抗体を取り除いた。続いて、標的細胞（抗標識抗体に
結合したCNTF/標識を有する）を抗標識抗体（ウサギ抗
マウス免疫グロブリンを有する指示細胞のような）に結
合するロゼットになっている指示細胞の約0.2％（v/v）
懸濁物と共に室温で約１時間インキュベートする。続い
てプレートをPBSで洗浄し、位相差顕微鏡でロゼットに
ついて調べる。例えば、抗標識抗体がマウスにより生成
される場合、指示細胞は、他の種より生成される抗（マ
ウス免疫グロブリン）抗体で赤血球（ヒトO+赤血球のよ
うな）を塗布することにより生成される。Albinoら（19
81,J.Exp.Med.154:1764−1778）の方法に従い食塩中で
希釈された0.01％CrCl3・6H2Oの存在下で赤血球を抗免
疫グロブリン抗体（約1mg/ml以上の濃度で）とインキュ
ベートすることにより指示細胞を調製する。または、磁
石ビーズまたは当業上知られている他の方法を用いる。
本発明の別の実施態様において、標識と反応し、好ま
しくは抗体で、蛍光を直接または間接的に発する分子を
免疫蛍光法に用いて、標的細胞の表面の標識CNTFを検出
する。蛍光は顕微鏡で観察されるかまたは、蛍光活性化
細胞選別法によりCNTF/標識を有する細胞を区別するた
めに用いられる。例により提示される本発明の好ましい
特定の実施態様において、標的細胞を粉砕し、CNTF/標
識（過剰の濃度で）およびアジ化ナトリウム（0.05％）
を含むアッセイ緩衝液中で、４℃で約30分間懸濁する。
続いて細胞を800rpm5分間の遠心により、アッセイ緩衝
液中で３度洗浄する。続いて細胞を約10μg/mlの濃度の
抗標識抗体と４℃で約30分間インキュベートし、上記の
ように洗浄し、続いてビオチン化抗免疫グロブリンおよ
びストレプトアビジン−Texas Red接合体と共に４℃で
約30分間インキュベートする。続いて細胞を洗浄し、封
入液中で懸濁し、カバーグラスをかけ、続いて蛍光顕微
鏡で調べる。
本発明は、また色素産生性標識、触媒標識その他のよ
うな他の形態の標識を検出する方法を提供する。任意の
特定の標識を検出する方法は、標識からのシグナルを生
成するために必要な条件に依存するが、当業者には容易
に識別される。
用いられる、さらに別種のプローブは抗CNTFR抗体で
ある。
本発明によれば、CNTFRタンパク質またはフラグメン
トまたはその誘導体を抗CNTFR抗体を生成する免疫原と
して用いる。（本発明のCNTFR核酸配列に基づいた）タ
ンパク質合成の組換え法を用いて、比較的多量のCNTFR
タンパク質生成を提供することにより、CNTFRの量の制
約という問題は除去される。
抗CNTFR免疫応答生成の可能性をさらに向上させるた
めに、CNTFRのアミノ酸配列を分析し、免疫原性増大と
関連し得る分子の部分を同定する。例えば、アミノ酸配
列をコンピューター分析にかけて、CNTFRの親水性、表
面上の確率、可動性、抗原性のしるし、両親媒性、ヘリ
ックス、両親媒性シートおよび２次構造のコンピュータ
ー生成プロットを示す表面エピトープを同定する。また
は、異種からのCNTFRの推定アミノ酸配列を比較し、比
較的非相同的な領域を同定する；これらの非相同性領域
は種々の種にわたりもっとも免疫原でありうるであろ
う。
CNTFRに向けられるモノクローナル抗体を調製するた
めに、培養で継続細胞系により抗体分子の生体を提供す
る任意の方法が用いられる。例えば、（Kohler and Mil
stein（1975,Nature 256:495−497）により最初に開発
されたハイブリドーマ法、およびトリオーマ法、および
ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozborら,1983,Immunolo
gy Today ４:72），およびヒトモノクローナル抗体を生
成するEBV−ハイブリドーマ法（Cole,1985,in“Monoclo
nal Antibodies and Cancer Therapy,"Alan R.Liss,In
c.pp.77−96）その他は本発明の範囲内である。
治療上用いられるモノクローナル抗体はヒトモノクロ
ーナル抗体またはキメラヒト−マウス（または他の種）
モノクローナル抗体である。ヒトモノクローナル抗体
は、当業上知られている数々の方法のどの方法によって
も生成される（例えばTengら,1983,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.80:7308−7312;Kozborら,1983,Immunology Tod
ay 4:72−79;Olssonら,1982,Meth.Enzymol.92:3−1
6）。ヒト不変部領域とマウス抗原結合ドメインを含む
キメラ抗体分子を調製する（Morrisonら,1984,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.81:6851,Takedaら,1985,Nature 314:
452）。
当業上知られている種々の方法が、CNTFRのエピトー
プに対するポリクローナル抗体の生成のために用いられ
る。抗体の生成のために、CNTFRタンパク質またはフラ
グメントまたはその誘導体を注射することにより、ウサ
ギ、マウス、ラットその他を含むがこれらに限定されな
い種々の宿主動物を免疫にする。宿主の種によるが、フ
ロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムの
ような無機質ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオ
ール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホール
リムペット ヘモシアニン、ジニトロフェノールのよう
な表面活性剤、および有用なヒトアジュバンドでありう
る、例えばBCG（Bacille Calmette−Guerin）およびCor
ynebacterium parvum.を含むがこれらに限定されない種
々のアジュバンドを免疫応答を増大させるために用い
る。
CNTFRエピトープに対する抗体の分子クローンを既知
の方法により調製する。組換えDNA方法（例えば、Mania
tisら,1982,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,C
old Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,Ne
w York参照）を用いて、モノクローナル抗体分子または
その抗原結合領域をコードする核酸配列を構築する。
抗体分子は既知の方法、例えば、免疫吸収または免疫
親和性クロマトグラフィー、HPLC（高速液体クロマトグ
ラフィー）のようなクロマトグラフィー法またはその組
合せその他により精製する。
本発明は、抗体分子およびそのような抗体分子のフラ
グメントを提供する。分子のイディオタイプを含む抗体
フラグメントを既知の方法により生成する。例えば、そ
のようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によ
り生成されるＦ（ab'）２フラグメント、Ｆ（ab'）２フ
ラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生
成されるFab'フラグメント、および抗体分子をパパイン
および還元剤で処理することにより生成されるFabフラ
グメントを含むがこれらに限定されない。
上記プローブは実験的に用いられ、今までのところCN
TFRを発現することが示されなかった細胞または組織を
同定している。さらに、これらの方法を用いて悪性腫瘍
のような異常組織によるCNTFRの発現を同定する。別の
実施態様において、これらの方法は診断用に用いられ、
疾患にかかっている患者からの細胞、体液、または組織
中のCNTFRの発現と健康な人からの比較可能な細胞、体
液または組織を比較する。体液は任意の体内の液体であ
るが特に血液または脳脊髄液を言うと解される。健康人
と比較して、患者のCNTFRの発現レベルの相異は、患者
の疾患がCNTF代謝と第一次的にまたは第二次的に関係し
ていることを示す。例えば、CNTFRレベルの増加は、患
者の疾患がCNTFの正常レベルに対する感度の増大と関連
していることを示すから、または代償作用によりレセプ
ター数が増大され患者のCNTFレベルが低いのであると示
唆する。これらの病因は患者にCNTFを投与することによ
り互いに区別される。彼の状態が悪化する場合、彼はCN
TF過敏性にかかっているかもしれない。それがよくなる
場合、彼はCNTF欠乏症にかかっているかもしれない。CN
TFまたはCNTFアンタゴニストに基づく治療上の養生法
は、それに応じて選ばれる。発現の相異はタンパク質お
よび／またはRNAレベルで検出される。すなわち健康人
のそれらの量に比較して患者のCNTFRタンパク質またはC
NTFR RNAの量を測定する。
上記のように、またはU.S.出願番号07/532,285のよう
に、または細胞選択または細胞選別の標準方法に従い、
上記プローブを用いてアッセイ系に用いられるCNTF応答
性の細胞を選択する。
5.6.4.治療上の応用 本発明はまた神経系障害のような疾患にかかっている
患者を本発明の効果のある量のCNTFRタンパク質、ペプ
チドフラグメントまたは誘導体で治療する方法も提供す
る。CNTFR、CNTFRアゴニスト、CNTFRアンタゴニスト
（内在性CNTFと競合する）を投与することを含んでなる
治療法は本発明の範囲内である。
本発明はまた好適な薬理的担体中のCNTFRタンパク
質、ペプチドフラグメントまたは誘導体を含んでなる医
薬組成物を提供する。
CNTFRタンパク質、ペプチドフラグメントまたは誘導
体は全身的にまたは局所的に投与される。静脈内、鞘
内、動脈内、鼻腔内、口腔内、皮下、腹膜組織内、また
は局所注射または外科的埋め込みを含むが、これらに限
定されない、当業上知られている任意の適切な投与方法
を用いる。継続的放出製剤もまた提供される。
神経変性疾患／神経外傷の我々の理解がより明白にな
るにつれて、内在性CNTFの栄養作用を減少させることが
有益であることが明らかになる。したがって、神経系外
傷の分野において、CNTF結合に関して内在性細胞レセプ
ターと競合する細胞なしのCNTFRを含むが、これに限定
されないCNTFアンタゴニストを与えることが望ましい。
そのような状況下では、全身的よりもむしろ外傷部位に
CNTFアンタゴニストを局所的に与えることが望ましい。
埋め込みを提供するCNTFRの使用は望ましい。
また、いくつかの容態はCNTF反応性における増大から
便益を受ける。従って、そのような容態にかかっている
患者においてCNTFRの数または結合親和性を増大させる
ことが有益である。これは遺伝子療法により達成され得
る。組織特異的または誘導可能なプロモーターにより制
御されているCNTFR遺伝子を用いて、または組換えCNTFR
遺伝子を担持する複製欠陥ウイルスで局所感染を生成す
ることにより、適切な細胞における組換えCNTFRの選択
的発現が達成され得る。CNTFに対する感度の増大から便
益を受ける容態は、筋萎縮性側索硬化症、ヴェルドニッ
ヒ−ホフマン萎縮症、慢性近位脊髄性筋萎縮症およびポ
リオ後症候群を含む運動神経障害を特に含むがこれらに
限定されない。そのような治療は、糖尿病、パーキンソ
ン病、アルツハイマー病、およびハンチントン舞踏病と
関連した神経系障害の治療にも用いられる。
さらに、本発明は、CNTFレセプターを発現するとして
同定された特定の組織または細胞型の疾患のCNTF投与に
よる治療を提供する。特定の実施態様において、CNTFR
遺伝子が筋肉細胞で発現され（下記８項参照）そしてCN
TFは筋肉重量をin vivoの神経除去性萎縮と関連した筋
原線維タンパク質含有量（下記９項参照）との両方の減
少を防ぐことを示した。
従って、本発明は、それが発現されるように（１）CN
TFRまたは機能的に活性のある部分またはその誘導体を
コードする核酸配列を含んでなる核酸分子、または
（２）CNTFまたは機能的に活性のある部分またはその誘
導体を、そのような治療が必要な患者に投与することを
含んでなる、筋肉細胞疾患または神経筋単位に関係する
疾患の治療方法を提供する。そのような疾患は、筋肉の
萎縮性または異栄養性変化が基本的な病理的所見である
ものを含むがそれらに限定されない。例えば、そのよう
な筋肉萎縮は、神経外傷、すなわち変性、代謝性、また
は炎症性（例えばギラン−バレー症候群）末消神経障害
または環状上の毒素または薬剤により生じた神経損傷に
よる神経除去（筋肉の神経との接触の破壊）から生じ
る。他の実施態様において、筋萎縮は運動神経障害によ
る神経除去から生じる。そのような運動神経障害は、筋
萎縮性側索硬化症（ALSまたはロー・ゲリッグ（Lou Geh
rig's）症）を含む成人運動神経疾患、乳児性および若
年性脊髄性筋萎縮および多病巣性伝導障害を有する自己
免疫運動神経障害を含むがこれらに限定されない。他の
実施態様において、筋萎縮は慢性廃用から生じる。その
ような廃用萎縮は、卒中による麻痺、脊髄損傷、脳外傷
または他の中枢神経系損傷；外傷（骨折、捻挫または脱
臼）による骨格固定化または長期のベット療養を含むが
これらに限定されない状況に起因する。さらに別の実施
態様において、筋萎縮は癌性悪液質および他の慢性疾
患、断食または横紋筋変性、内分泌腺障害（例えば甲状
腺障害および糖尿病を含むがこれらに限定されない）を
含むがこれらに限定されない代謝上のストレスまたは栄
養不足から生じる。筋萎縮症はまたデュシェン、ベッカ
ー、筋障害性、顔面−肩甲−上腕、エメリ−ドレイフス
（Emery−Dreifuss）、眼咽頭、上腕骨、四肢帯、およ
び先天性型および遺伝性末梢ミオパシーとして知られる
ジストロフィーを含むがこれらに限定されない筋ジスト
ロフィー症による。別の実施態様において、筋萎縮は、
良性先天性低血圧症、筋肉中心核病、小杆状体性ミオパ
シーおよび筋管（中心核）ミオパシーを含むがこれらに
限定されない先天性ミオパシーによる。さらに、CNTFR
をコードする核酸またはCNTFおよびその活性のあるフラ
グメントまたは誘導体は後天性（毒性または炎症性）ミ
オパシーの治療において用いられる。筋肉の炎症性疾患
の結果として起るミオパシーは、多発性筋炎および皮膚
筋炎を含むがこれらに限定されない。毒性ミオパシーは
アミオダロン（amiodarone）、クロロキン、クロフィブ
ラート、コルヒチン、ドキソルビシン、エタノール、ヒ
ドロキシクロロキン、有機ホスフェート、ペリヘキシリ
ン（perihexiline）およびビンクリスチンを含むがこれ
らに限定されない薬剤による。
本発明の別の実施態様において、CNTFR過剰、CNTFに
対する過敏性、CNTF過剰、その他にかかっている患者を
CNTFR遺伝子コード領域に相当するアンチセンスRANまた
はアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの効果
的な量を投与し、それによってCNTFRの発現を減少させ
ることにより治療する。
6.実施例：毛様体神経栄養要素レセプターの発現クロー
ニング 6.1.材料および方法 6.1.1.CNTFレセプター発現ライブラリーの構築 pCDM8ベクター（Seed,1987,Nature 329:840−842）の
誘導体である、pCMX発現ベクター（1991年３月28日出願
の同時係属U.S.特許出願番号07/678,408に記載された、
上記参照）を用いて、SH−SY5Y細胞（Dr.June Biedler
から最初入手した）をcDNAライブラリー構築のためのmR
NA源として用いた。cDNAライブラリーの挿入断片は、ア
ガロースゲルで1kb以上のサイズのものを選んだ。
6.1.2.“パニング”法 Seed and Aruffo（1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
4:3365−3369）により開発された“パニング”法を次の
ように変更した：レセプターを認識する抗体を有する細
胞をインキュベートする代りに、細胞を始めCNTF/myc
（１μg/ml）と氷上で30分間インキュベートし、余分な
リガンドを取り除くためにPBS/2％フィコールを用いて
遠心し、続いてOncogene Sciences,Manhasset,N.Y.から
入手した9E10抗体と氷上で30分間インキュベートした。
この後、PBS/2％フィコールを用いてもう一度遠心し、S
igmaから入手した抗mycペプチドマウスモノクローナル
抗体を塗布したプレートに“パニング”した。プレート
を次のように調製した：殺菌学的60mmプレート（Falcon
1007またはその同等品）またはFisher 8−757−12のよ
うな10cmディッシュを抗mycマウスモノクローナル抗体
で塗布し、50mMトリスHCl,pH9.5中で1ml当り10μｇに希
釈した。3mlの抗体を核6cmディッシュを塗布するのに用
い、または10cmディッシュ当り10mlを用いた。プレート
を抗体に約1.5時間さらし、続いて抗体を取り出して次
のディッシュに移し、1.5時間静置し、続いて再び取り
出して３番目のディッシュに移した。プレートを0.15M
NaCl（洗浄ボトルがこれに便利である）で３度洗浄し、
そして3mlのPBS中の1mg/ml BSAと一晩インキュベートし
た。特に“パニング”を次のように行った。細胞を100m
mディッシュで培養した。培地を各ディッシュから吸引
し、2ml PBS/0.5mM EDTA/0.02％アジ化物を加え、混合
物を37℃で30分間インキュベートしディッシュから細胞
を引き離した。細胞を短いパスツールピペットで厳しく
粉砕し、各ディッシュから集めて遠心管に入れ2.5（200
×ｇ）の設定で４分間遠心した。細胞を0.5−1.0ml PBS
/EDTA/アジ化物/5％FBS中に懸濁し、CNTF/mycと氷上で3
0分間インキュベートした。等量のPBS/EDTA/アジ化物を
加え、3mlのPBS/EDTA/アジ化物/2％フィコールに注意し
ながら重層し、2.5の設定で４分遠心し、上清を１回の
円滑な動きで吸引した。続いて細胞を9E10抗体と氷上で
30分間インキュベートし、PBS/EDTA/アジ化物/2％フィ
コールでの遠心を繰り返した。細胞を採取して0.5mlのP
BS/EDTA/アジ化物に入れ、アリコートを3mlのPBS/EDTA/
アジ化物/5％FBSを含む抗−mycマウスモノクローナル抗
体塗布ディッシュに加えた。細胞を多くて２枚の60mmデ
ィッシュから１枚の60mmの抗体塗布プレートに加え、室
温で１−３時間静置させた。ディッシュに粘着しない過
剰の細胞をPBS/5％血清でまたは培地で穏やかに洗浄し
て（3mlの２または３度の洗浄で普通は十分であっ
た。）除いた。
6.1.3.毛様体神経栄養因子レセプター遺伝子含有のクロ
ーンの同定 標準の方法に従いDEAE/クロロキンを用いて、発現ラ
イブラリーからのプラスミドDNAをCOSM5細胞にトランス
フェクトした（100mmディッシュ当り約250−500ng;2デ
ィッシュをトランスフェクトした）、トランスフェクシ
ョンの２日後、細胞をそれらのディッシュから引き離
し、上記のように変更されたAruffo/Seedパニング方に
かけた。
非粘着細胞をプレートから洗浄した後、ハート（Hir
t）上清（Hirt,1967,J.Mol.Biol.26:365−369）を調製
し、プラスミドDNAを10−20μｇのtRNAの存在下で沈澱
させた。製造業者の使用説明書に従い、生じたDNAをエ
レクトロポレーションによりDH10B細菌（Electromax,BR
L）に導入した。エレクトロポレートした細菌から培養
した培養物を用いてもう一度のトランスフェクションと
パニングのためのプラスミドDNAを調製した。このプラ
スミドDNAでトランスフェクトされたCOS細胞のプレート
は、間接的ヨウ素化抗体結合アッセイによりCNTFRを発
現する。多くの数のCOS細胞を明らかに示した（代表的
なデータについては図1B参照、アッセイ法については下
記参照）。これらのトランスフェクタントに対する２度
目のパニング／プラスミドDNA単離／エレクトロポレー
ションの後、エレクトロポレーション工程から生じた細
菌の形質転換体をアンピシリンプレートに塗布した。個
々の殺菌コロニーを拾い出し、各々のクローンから調製
されたプラスミドDNAを、アッセイのために別々のCOS細
胞にトランスフェクトした。間接的抗体結合アッセイお
よび下記の蛍光活性化細胞選別（FACS）分析を含む種々
のアッセイにより、検査した15プラスミドのうちトラン
スフェクトされたCOS細胞において、14がCNTF結合部位
の発現をした。
6.1.4.直接125I−hCNTF結合アッセイ COS細胞をライブラリー、強化ライブラリー、または
個々のクローンからのプラスミドDNAでトランスフェク
トした。48時間後、培地を取り除き、125I−hCNTFのみ
を含むまたは未標識hCNTFを有する結合緩衝液（10％FBS
および0.1％NaN3を有するRPMI 1640）0.25mlと取り換え
た。125I−hCNTFとのインキュベーションは室温で60分
間であった。インキュベーションが終了後、125I−hCNT
F溶液を取り除き、細胞を1.0mlの結合緩衝液で三度洗浄
し、続いて0.25mlの0.1N NaOHで溶解した。この溶解物
を12×75mmポリスチレン管に移し、ガンマカウンター中
に入れた。非特異的結合は、少なくとも100倍過剰の未
標識hCNTFの添加により測定した。最後の洗浄の後、プ
レートをオートラジオグラフィーにかけた。
6.1.5.蛍光活性化細胞選別分析 トランスフェクトしたCOS細胞をCNTF/myc、9E10抗
体、およびFITC−標識ヤギ抗マウス抗体と連続的にイン
キュベートした。続いて、それらをディッシュから引き
離し、FACS分析にかけた。陰性および陽性プラスミドで
のトランスフェクションの結果を図1Dに示す；このアッ
セイによりCNTFレセプタ発現プラスミドでトランスフェ
クトされたCOS細胞は、蛍光の非常な増加を示す多くの
副次集団を含んでいる。
6.1.6.hCNTFのヨウ素化 6ng/μｌのラクトペルオキシダーゼ（Sigma）を用い
て、10μg hCtNF（10mM NaPO4,pH7.4中560μg/ml）を20
℃で15分間1mCi 125I Naでヨウ素化した。15分後、0.1M
Nal、0.1％BSAおよび0.1シトクロムＣ、0.3％HOAc、0.
05％フェノールレッドおよび0.02％NaN3を含む等量の緩
衝液で反応を止めた。アリコートをTCA沈澱計数の測定
のために取り除いた。残りを、0.05M NaPO4、0.1M NaPO
4、0.1M NaCl、0.5mg/ml硫酸プロタミインおよび1mg/ml
BSAで平衡化したBioRad PD−10 biogelカラムに負荷し
た。フラクションを集め、TCA沈澱計数を測定した。
6.1.7.CNTFRの配列決定 製造業者の使用説明書に従い、SequenaseTMを用い
て、配列決定をジデオキシ二本鎖DNAのキット（U.S.Bio
chemical）を使用して行った。
6.1.8.間接的125Iヤギ抗マウス抗体結合アッセイ COS細胞を、ライブラリー、強化ライブラリー、また
は個々のクローンからのプラスミドDNAでトランスフェ
クトした。48時間後、細胞を、１）１μg/ml CNTF−my
c、２）10μg/ml 9E10、３）125Iヤギ抗マウス抗体（Ga
M）（0.5−１μCi/ml）を含むPBS（Ca,Mgを有する）/5
％FBSと共に氷上で30分間連続的にインキュベートし
た。細胞を各工程の後PBS/5％FBS中で５分間３度洗浄し
た。最後の洗浄の後、プレートをオートラジオグラフに
かけた。
個々のクローンについては、結合全放射能の定量的評
価をガンマカウンターを手で持って行った。
6.2.結果および論考 6.2.1.制限分析 制限分析により、14の陽性クローンが４クラスに入っ
た： ａ）I2＝I7（2kb） ｂ）I1＝I5＝I6（2kb） ｃ）I4＝I8＝I9＝I11＝I14＝I15（4kb） ｄ）I10＝I12＝I13（1.6kb） （I3は陰性であった） 各クラスのメンバーは、酵素Pst Iでの消化で同一パ
ターンのバンドを生成した。さらに行った制限分析は、
クローンの４クラスが重複していることを示し、準備段
階の配列データは、それらが、それらの5'末端部で重複
配列の共通することを確認した。不思議にも、クラス
（ｂ）は、真核生物プロモーター要素に関してベクター
中で違う方向性のその挿入物を有していることを示し
た。表Ｉに見られるように、これらのクローンは他のク
ローンに比較して低発現体であった。これらのクローン
の転写は、ベクターのポリリンカーの下流の領域にある
弱い隠れたプロモーターから起こる。
6.2.2.in vitro転写および翻訳 ４クラスのクローンによりコードされているタンパク
質を特徴決定するために、それらをベクターポリリンカ
ーの5'領域のT7プロモーターから全て転写させた。in v
itro翻訳の後、生成物をポリアクリルアミドゲル上で電
気泳動した。T7プロモーターに関して違う方向性なので
クラス（ａ）はタンパク質を生成しなかった。他の３ク
ラスは全て同一サイズ（約42kd）のタンパク質を生成
し、それらが同じタンパク質をコードしていることを実
証した。
6.2.3.CNTFとの結合分析 9E10抗myc抗体および125Iヤギ抗マウス抗体を用いた
間接的CNTF−myc結合アッセイの結果を図1Bおよび1Cお
よび表Ｉに示す。
図1Bにおいて、左のプレートは強化ライブラリーのト
ランスフェクションから生じており、一方右のプレート
は１度のパニングの後レスキューされた強化ライブラリ
ープラスミドDNA（強化ライブラリーと約同じ量のDNAを
用いて）のトランスフェクションからである。注目すべ
きは右のプレート中にだけ見られる数多くの暗いスポッ
トであり、各々はラジオオートグラフィーにより検出さ
れたCNTF−myc結合部位を発現している１個のCOS細胞を
示している。
6.2.1項に記載された個々の陽性クローンに関して
は、全放射能の定量的評価はガンマカウンターを手に持
って行った。個々のクローンI1−I15についてこのアッ
セイの結果は表Ｉに示され、間接的抗体結合アッセイに
より測定されたように15クローンのうち14がCNTF結合部
位を発現することを示している。さらに、いくつかの個
々のクローンからのプレートのフラグメントをオートラ
ジオグラフィーにかけ、図1Cに示す。
図1Cに示されているように、間接的結合の第２の証明
はCNTF−mycを用い、続いて9E10抗体、FITC−標識ヤギ
抗マウス抗体そしてFACS分析と続いた。陰性クローンで
トランスフェクトされた細胞と比較して陽性クローンで
トランスフェクトされたCOS細胞はCNTFRの発現において
100倍の増加を示した。
表IIに示されるように、CNTF−mycを用いて得られた
間接的結合データは直接的125I−CNTF結合を用いて実証
された。CNTFRをクローンしたSH−SY5Y細胞がそうであ
ったように、トランスフェクトしたCOS細胞に発現され
るレセプターはヨウ素化CNTFおよびCNTF−mycリガンド
に特異的に結合する。トランスフェクトした各COS細胞
は、SH−SY5Y細胞よりも１細胞当り約30倍以上のレセプ
ターを発現する。
6.2.4.CNTFRの配列および他の成長因子レセプターとの
相同性 CNTFRは、様々な他のレセプターと共通するモチーフ
を含んでいる。CNTFRの細胞外部分は、そのＮ末端に
“免疫グロブリン”ドメインおよび短いヒンジ領域で
“免疫グロブリン”ドメインから分離される“シトキン
レセプター”の両方を含んでいる。多くのレセプターは
“免疫グロブリン”または“シトキンレセプター”ドメ
インのどちらかと相同性を有するが（図３）、ただひと
つのレセプター−IL−６レセプター−がCNTFRと３つの
ドメインの同じ特別の配置で共通している（図３および
４）。従ってIL−６レセプターはCNTFRに最も関係して
いるタンパク質である（図４）。おもしろいことに、そ
れは、IL−６結合に際して応答開始に明らかに必要でな
い非常に短い細胞質内ドメイン（Hibiら,1990,Cell 63:
1149−1157）を有していることにおいてIL−６レセプタ
ーはまたCNTFRと類似している。最近、gp130と呼ばれ
る、IL−６レセプターの新規なシグナルトランスデュー
サーが分子的にクローン化された。このトランスデュー
サーはそれ自体IL−６に結合しないが、それはIL−６レ
セプターに非常に高い親和結合性を与えそしてそれはIL
−６シグナルを変換するのに必要である（Hibiら,1990,
Cell 63:1149−1157）。CNTFRの我々のクローニングは
それが他の既知のレセプターに見られない、IL−６レセ
プターとの重要な特性で共通しており、従ってレセプタ
ーの新しいファミリーを定義することを示す。IL−6Rと
CNTFRの類似性は、CNTFRがIL−６レセプターまたは関係
した分子と同じシグナルトランスデューサーを利用して
いるように示唆している。最後に、CNTFR関係レセプタ
ーの同定は、これらのレセプターと結合する新規なリガ
ンドの同定を促進すべきである。
7.実施例:CNTFRのメッセージの組織局在化 7.1.材料および方法 7.1.1.CNTFRプローブの調製 hCNTFRのコード領域のpCMX発現ベクターへの分子クロ
ーニングは、この出願と同時に出願された“Mammalian
Expression Vector"という名称のU.S.特許出願に記載さ
れており、生成した発現ベクターは図６に示されてい
る。CNTFR配列の889塩基−1230塩基にわたるPCRプロー
ブを合成しノーザン分析のプローブとして用いた。
7.1.2.RNA調製およびノーザンブロット 選択した組織をSprague−Dawleyラットから切開し液
体窒素ですぐに凍結した。Bothwellら,1990（Methods o
f Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes,Boston,
MS,Jones and Bartlett）に記載されているようにRNAを
3M LiCl、6M尿素中で組織をホモジネートすることによ
り単離した。RNA（10μｇ）を４つの１％アガローズホ
ルムアルデヒドゲル（Bothwellら,1990,Methods of Clo
ning and Analysis of Eukaryotic Genes,Boston,MS,Jo
nes and Bartlett）で電気泳動により分画し、続いて10
×SSC（pH7）で毛管移動によりナイロン膜（MagnaGrap
h,MicronSeparations Inc.）に移した。RNAを紫外線（S
tratalinker,Stratagen,Inc.）にさらすことにより膜と
UV交差連結させ、そして0.5M NaPO4（pH7）、１％ウシ
血清アルブミン（フラクションＶ、Sigma,Inc.）、７％
SDS、1mM EDTA（Mahmoudiら,1989,Biotechnigues ７:33
1−333）、100μg/ml音波処理した変性サケ精子DNAの存
在下で放射標識したプローブと68℃でハイブリッド形成
させた。フィルターを68℃で、３×SSC、0.1％SDSで洗
浄し、１枚または２枚の増感スクリーン（Cronex,DuPon
t）とＸ線フィルム（SAR−5,Kodak）で、70℃で１日−
２週間オートラジオグラフィーにかけた。ゲルの臭化エ
チジウム染色は、当量レベルの全RNAが異なる試料につ
いてアッセイされたことを示した（Maisonpierreら,199
0,Science 247:1446−1451）のように）。
7.2.結果 図５に示すように、座骨神経と副腎および筋力におい
てはCNTFR mRNAが低レベルで中枢神経系の組織に検出さ
れた。これは、CNTFが神経栄養活性だけでなく筋親和性
活性も保持することを示すだろうし、患者が神経薄弱に
かかるデュシェン筋ジストロフィーおよび先天性筋緊張
性ジストロフィーのようないくつかの障害において中枢
神経系と筋肉と両方に関係することを説明する。筋肉の
CNTFRの発現は、CNTFが筋肉生理学において役割を有し
ていることを示唆する。従って、神経細胞に及ぼす活性
に加えて、CNTFが筋親和性作因のように機能するような
筋肉における重要な活性を有し、またはさもなければ筋
肉発達および／または分化に作用する。
8.実施例:CNTFレセプターがグリコシルホスファチジル
イノシトール（GPI）連結を介して細胞表面と連結する
証拠 8.1.材料および方法 SH−SY5Y細胞を10％不活性化ウシ胎児血清を補充した
RPMIの24ウエルプレート（Falcon）中で培養した。ホス
トホリパーゼ（および対照）処理をCNTF結合の前に行う
実験に関して、細胞をPBS（＋Ca/Mg）中で２度すすぎ、
続いて最終濃度500mU/ml（Boehringer Mannheimより購
入、カタログ＃1143−069）のホスファチジルイノシト
ール特異的ホスホリパーゼ（PI−PLC）を補充したまた
はしないPBS（＋Ca/Mg）と37℃で45分間インキュベート
した。続いて、細胞を結合緩衝液（PBS（＋Ca/Mg）およ
び５％ウシ胎児血清）で３度洗浄し、続いて1000倍過剰
の未標識CNTFを有するまたは有しないヨウ素化CNTF（約
100pM）を含む250μｌの結合緩衝液と、室温で30分間イ
ンキュベートした。ヨウ素化CNTFをPI−PLC処理の前に
結合させる実験に関しては、細胞を始めに過剰な未標識
CNTFを有するまたは有しないヨウ素化CNTFを含む結合緩
衝液中で、37℃で45分間インキュベートした。続いて細
胞をPBS（＋Ca/Mg）で２度洗浄し、続いてPI−PLC（最
終濃度500mU/ml）を補充したまたはしていないPBS（＋C
a/Mg）と45分間インキュベートした。続いて細胞を結合
緩衝液で３度すすいだ。全ての場合において、細胞を計
数する前に0.1N NaOH中で可溶化し続いて計数した。
8.2.結果および論考 コードされたタンパク質が、任意の明らかなストップ
トランスファー（stop transfer）配列または細胞質
内ドメインなしに、細胞質外ドメインの続く疎水性領域
内で終ることがCNTFレセプターの配列は示した。この構
造はトランスメンブランドメインを欠失する膜タンパク
質に見られるＣ末端を思わせるもののようであり、GPI
−連結（Ferguson and Williams,1988）を介して細胞表
面と付着している。かくして、CNTFレセプターがGPI−
連結を介して細胞表面と連結するかどうか検査するため
に実験を行った。表IIIに示すように、CNTFレセプター
がGPI連結を介して細胞表面と連結するという考え方と
一致して、SH−SY5Y細胞のPI−PLCでの処理は、SH−SY5
Y細胞の、その後にCNTFに結合する能力を完全に除去し
た。しかしながら、SH−SY5Y細胞にすでに結合したCNTF
はPI−PLC処理により遊離されない（表III）。おもしろ
いことに、IL−６レセプターの可溶性形態はIL−６シグ
ナル変換に必要な第２膜タンパク質（GP130）と密接に
関連している。かくして、CNTFレセプター遊離を事前の
CNTFへの結合により妨げるのは、CNTF、そのレセプター
およびそのシグナルトランスデューサー（GP130またはG
P130類似体）との間の会合のためである。また、CNTF結
合はCNTFレセプターの構造を変化させ、PI−PLCの影響
を受け易くなくなる（いくつかのGPI連結タンパク質はP
I−PLC耐性形態を有する）。
CNTFレセプターが、GPI連絡を介して細胞表面に付着
するという所見は重要な結果である。それはこのような
方法で膜と連結される最初に知られた成長因子レセプタ
ーを代表し、別のレセプターがGPI連結し得るという可
能性を提案する。いくつかのタンパク質はGPI連結形態
と従来のトランスメンブランドメインを含む形態との両
方を有するので、我々の所見は、CNTFレセプターがトラ
ンスメンブランドメインをコードし得る別のＣ末端を有
しそして同じようにIL−６レセプターがGPI連結形態を
有する可能性を提案する。成長因子レセプターのGPI連
結形態は、レセプター調節と遊離の新規メカニズムを利
用することができる。例えば、表面レセプターのダウン
レギュレーションは、細胞質外ホスホリパーゼ活性を活
性化することにより、GPI連結レセプターを遊離させる
ことにより敏速に起り得る。これらの遊離したレセプタ
ーは、独自に、または、CNTFに結合された場合、可溶性
IL−６レセプターがIL−６に結合し、そしてGP130を発
現する細胞を活性化することに示される同じ方法で、他
の細胞にも作用するであろう。
PI−PLCを用いた場合、CNTFレセプターの遊離がCNTF
作用を遮断し得るという可能性は重要な意味を有してい
る。それは、CNTFの観察された作用がクローン化された
CNTFレセプターによるものであることを実証するのに用
いられる。治療上、PI−PLCは、CNTF活性が有害である
と考えられる場合、CNTFレセプターを遊離させそして可
能であり得る、CNTF作用を遮断するために用いられ得
る。
CNTFレセプターのCNTFを遮断するPI−PLC遊離が、CNT
F、そのレセプター、およびあり得るシグナル変換タン
パク質との間の三次複合体の形成によるならば、レセプ
ターのこの特性は、変換分子を明確にし分子的にクロー
ン化することに用いられ得る。
9.In vivoの神経除去ラット骨格筋に及ぼすCNTFの作用 ここに記載される実験の目的は、in vivoの神経除去
骨格筋に及ぼす精製された組換えCNTFの作用を調べるこ
と、そして筋肉重量および筋原線維タンパク質の減少の
ような神経除去性筋萎縮に関連した表現型変化のいくつ
かを、CNTFが防ぎ得るかどうかを決定することである。
CNTFレセプターが筋管と筋芽細胞との両方の骨格筋で発
現され、そしてCNTFが神経除去性萎縮に関連した筋肉重
量と筋原線維タンパク質含有量との両方の減少を防ぐこ
とを我々は見い出した。
9.1.CNTFレセプターは筋管と筋芽細胞との両方の骨格筋
で発現される。
図５に示すようにCNTFの第一の細胞標的を同定するた
めに、ノーザンブロット分析を様々なラット組織から得
たRNA試料に行った。ヒトCNTFレセプターコード領域か
ら得たプローブは2kb転写物（その発現は、骨格筋では
驚くほど高レベルであり、副腎腺および座骨神経で低レ
ベルであることを除いて、一般に中枢神経系に限られ
た）を同定した。
特定のラット筋肉型、精製したヒト筋肉筋管そしてマ
ウスとラット起源両方のいくつかの骨格筋細胞系から調
製したmRNAを用いて、ノーザンブロットにより、特に骨
格筋のCNTFレセプター発現のさらに詳しい分析を上記の
ように行った（図７）。CNTFレセプターのヒトプローブ
を用いて、２つのmRNA種（2.0および1.7kb）をいくつか
の筋肉RNA試料中に検出した。CNTFレセプターがマウス
（レーン１および２）またはラット（レーン３および
４）起源の筋管と筋芽筋肉細胞系との両方において、な
らびにラットの赤い緩慢単収縮ヒラメ筋と白い敏速単収
縮長指伸筋（EDL）との両方において（それぞれレーン
５および６）、発現されることを図７は示す。擬似手術
した反対側の類似部分の対照（それぞれレーン11および
13）に比較して最初72時間神経除去したヒラメ（レーン
12）とEDL筋（レーン14）との両方においてCNTFレセプ
ターmRNAのレベルは増大されるように見えた。おもしろ
いことに、発現の最高レベルはヒト胎児骨格筋から得た
筋管からのRNA試料に観察された。これらの筋管を培養
し、続いて、RNA単離の前に蛍光活性化細胞選別により
筋芽細胞および他の非筋肉細胞を除いて精製した（レー
ン８）。２つの別のCNTFレセプターmRNA種が筋肉細胞ノ
ーザンブロットで同定されること、および1.7kb CNTFレ
セプターメッセージが筋芽細胞系C2C12mb（レーン１）
に優先的に発現され、そしてレセプターのスプライス形
態を示すことに我々は注目した。
9.2.CNTFは神経除去性萎縮に関連する筋肉重量と筋原線
維タンパク質含有量との両方の減少を防ぐ 9.2.1.神経除去手術 これらの研究に用いられる種々の動物グループを下記
表IVに記載する。一般に、これらの動物はひとつのグル
ープから成っていた。全ての実験グループについて、約
20cmの最初の切開は右後肢の皮膚の大腿中間レベルに行
った。この手術処置に続いて、擬似手術を行うために20
cm切開を左後肢の大腿中間部に行った。
動物グループ２−６において、手術で大腿中間部レベ
ルの右座骨神経の２−5mm部分を取り除き32−35mmの遠
位神経断端を残すことにより、右後肢のヒラメ筋を神経
除去した（図８にＡと示す）。ヒラメ筋のその神経支配
位置から座骨神経を32−35mm優しく引張っることにより
擬似手術を行い、左ヒラメ筋を対照の役割にした。動物
が軽いクロロペントバルビトル麻酔（0.3g/kg）下にい
るうちに全ての手術を行った。動物グループ１（対照）
は何も神経除去を受けず、注射もされなかった。全ての
動物は100−150gの重量があった。
9.2.2.治療 グループ１および２の動物は処理されなかった。グル
ープ３の動物は、1mg/mlのBSA（PBS/BSA）を含むリン酸
緩衝食塩水（PBS）を筋肉内（IM）に合計４日毎日注射
された。動物の両側の大腿中間部の筋肉に多数の注射を
した。グループ４の動物は1mg/mlのBSA（CNTF/BSA）を
含む組換ラットCNTF（1mg/ml）をIMに４日間毎日注射さ
れた。上記のように動物の両側に多数の注射をした。グ
ループ５の動物もまたIMでなく皮下（SC）にrCNTF/BSA
を毎日注射された。グループ６の動物はPBS/BSAを毎日
（SC）注射された。
9.2.3.筋肉重量およびタンパク質分析 神経除去手術を行って96時間後、動物を断頭により犠
牲にし、ヒラメ筋を腱から腱へ注射して切り離した。ヒ
ラメ筋を氷上の計りボート（boat）に載せ、腱を解剖用
メスで取り除き、続いて乾燥するのを防ぐために筋肉を
すぐに検量した。筋原線維ホモジネートを調製するため
に、切断したヒラメの筋をプールし、冷蔵室の氷上で切
り刻み続いて0.32Mショ糖と3mM MgCl2（2.5％w/v）を含
むPBS中でホモジナイズした。ホモジネートを約800×ｇ
で遠心し、そして製造業者の忠告に従い、Bio−Rad Dye
Binding法を用いて、筋肉当りの全筋原線維タンパク質
について上清をアッセイした。
神経除去筋肉は96時間目に含水重量で約25％の有意
（ｐ＜0.01）な減少をしたことを図９は示す。PBS/BSA
の毎日の注射は、この神経除去依存性筋肉重量減少にな
んの作用も及ぼさなかった。しかしながら、CNTF（1mg/
kg）/BSAを毎日注射されたラットからの神経除去ヒラメ
筋は、それらの反射側の類似部分の擬似手術対照より約
５％少ない重さであった。CNTF処理神経除去と擬似手術
ヒラメ筋の含水重量は手術をしてない状態から有意には
異ならなかった。SCで４日間毎日注射された場合（グル
ープ５）、CNTFはまた筋原線維タンパク質の神経除去誘
導の減少を有意に防ぐように見え、そしてタンパク質の
減少は筋肉含水重量の減少と平行した（表Ｖ）。
毎日IMで注射された場合、全筋原線維タンパク質に及
ぼすCNTFの作用があまり顕著でないことが観察された。
CNTFレセプターが筋管と筋芽細胞との両方の骨格筋に
発現され、そしてCNTFが筋肉重量と神経除去性萎縮に関
連した筋原線維タンパク質含有量との両方の減少を防ぐ
ことを我々は見い出した。
10.微生物の寄託 次の寄託を1991年３月26日に、1815 North Universit
y Street,Peoria,Illinois,61604のThe Agricultural R
esearch Culture Collection（NRRL）に行った。
hCNTFRをコードする配列を含んでなる発現プラスミド
である、プラスミドpCMX−hCNTFR（I2）を担持するE.co
liは、受託番号NRRL B−18789を与えられた。
種々の参考文献がここで引用され、その開示は、そっ
くりそのまま参考文献として編入されている。
本発明は寄託された構築物または本発明の２−３の面
の説明として意図されている実施例に開示された実施態
様により範囲を限定されるものではなく、機能的に等価
であるいかなる実施態様もこの発明の範囲内にある。事
実、ここに示され、記載されたものに加えて本発明の種
々の変更は、当業者には明らかであろうし、それらは本
発明の請求の範囲に入るものと意図される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/577 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ７００，６７７ (32)優先日 平成３年５月15日(1991．5．15) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 スクウィント，ステファン ピー. アメリカ合衆国 10533 ニューヨーク 州 イルビントン，バーク レーン 281 (72)発明者 ファース，マーク イー. アメリカ合衆国 10803 ニューヨーク 州 ペルハム，ハイブルック アベニュ ー 54 (72)発明者 ヤンコパウロス，ジョージ ディー. アメリカ合衆国 10510 ニューヨーク 州 ブライアークリフ メイナー，スリ ーピー ホロー ロード 428 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 C07K 14/705 C12N 5/10 C12Q 1/68 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ ＭＥＤＬＩＮＥ

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】実質的に図２（配列番号１）に示した通り
    のヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】下記の（ａ）〜（ｄ）： （ａ）図２（配列番号１）の配列を有し、毛様体神経栄
    養因子（CNTF）結合能を有するポリペプチドをコードす
    る核酸分子、 （ｂ）１または数個の置換、付加または欠失により図２
    （配列番号１）の配列とは異なるが、CNTF結合能を有す
    るポリペプチドをコードする核酸分子、 （ｃ）図２（配列番号１）の配列とは異なるが、遺伝子
    コードの縮重により図２（配列番号２）のアミノ酸配列
    をコードする核酸分子、 （ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列と相補的な配
    列を有する核酸分子、 から選択される、請求項１記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】遺伝子発現を制御することができる核酸配
    列をさらに含んでなる、請求項１記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】NRRLに寄託されて寄託番号Ｂ−18789を有
    する、プラスミドpCMX−hCNTER中に含まれているCNTFR
    核酸配列を含んでなる、請求項１記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸を
    含んでなる、核酸ベクター。
  6. 【請求項６】請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸分
    子または請求項５記載のベクターで、形質転換、トラン
    スフェクト、または感染された細胞。
  7. 【請求項７】請求項６記載の細胞からなる不死化細胞
    系。
  8. 【請求項８】請求項６記載の細胞からなる微生物。
  9. 【請求項９】細菌である、請求項８記載の微生物。
  10. 【請求項１０】酵母である、請求項８記載の微生物。
  11. 【請求項１１】実質的に図２（配列番号２）に示した通
    りのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
  12. 【請求項１２】請求項１記載の核酸分子、または請求項
    ２の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）記載の核酸分子により
    コードされる、請求項11記載のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】図２（配列番号２）に示した通りのアミ
    ノ酸配列を含んでなる、請求項11または12記載のポリペ
    プチド。
  14. 【請求項１４】請求項11、12または13記載のポリペプチ
    ドを認識する、モノクローナル抗体。
  15. 【請求項１５】組換えCNTERまたはその機能的活性部分
    を発現する請求項６記載の細胞、および、図２（配列番
    号２）のCNTFRとCNTFまたはCNTFに類似した活性を有す
    る分子との相互作用を、CNTFまたはCNTFに類似した活性
    を有する分子に対する該細胞の生理学的応答を測定する
    ことにより検出するための手段を含んでなる、CNTF活性
    に関する医薬化合物をスクリーニングするためのアッセ
    イ系。
  16. 【請求項１６】CNTF関連障害を検出するための方法であ
    って、患者由来の組織または細胞における図２（配列番
    号２）のCNTFRまたはその断片の量の違いを、健康なヒ
    ト由来の比較可能な細胞または組織におけるCNTFR量と
    比較して検出することを含んでなり、その際、図２（配
    列番号２）のCNTFRまたはその断片の量が、 （ｉ）細胞または組織を、図２（配列番号２）のCNTFR
    への免疫特異的結合を生じさせ得る条件下で請求項13記
    載の抗CNTFR抗体に曝露させ、そして （ii）抗体結合の量を測定する、 ことにより測定される、検出方法。
  17. 【請求項１７】図２（配列番号２）のCNTFRの量が、 （ｉ）細胞または組織を、図２（配列番号２）のCNTFR
    への結合を生じさせ得る条件下でタグ付きCNTFに曝露さ
    せ、そして （ii）タグ付きCNTFの量を測定する、 ことにより測定される、請求項16記載の検出方法。
  18. 【請求項１８】患者のCNTF関連障害を検出する方法であ
    って、図２（配列番号１）に示された配列の少なくとも
    15ヌクレオチド部分を含んでなる核酸プローブとサンプ
    ルとをハイブリダイズさせることにより、患者由来のサ
    ンプルにおける図２（配列番号１）のDNA配列に対応す
    る配列を有するCNTFR RNAの量の違いを、健康なヒト由
    来の比較的可能なサンプルにおける図２のCNTFR RNAの
    量と比較して、検出することを含んでなる、検出方法。
  19. 【請求項１９】CNTFに結合する細胞の同定方法であっ
    て、図２（配列番号１）のDNA配列に対応する配列を有
    するCNTFR RNAの存在、または図２（配列番号２）のア
    ミノ酸配列を有するCNTFRタンパク質の存在を検出する
    ことにより、図２（配列番号２）のアミノ酸配列を有す
    るCNTFRタンパク質の細胞による発現を検出することか
    らなる、上記方法。
  20. 【請求項２０】図２（配列番号１）に示した配列の少な
    くとも15ヌクレオチド部分からなる核酸プローブに、前
    記CNTFR RNAを含むと推定される細胞からの試料をハイ
    ブリダイズさせることにより、図２（配列番号１）のDN
    A配列に対応する配列を有するCNTFR RNAの存在を検出す
    ることをさらに含んでなる、請求項19記載の方法。
  21. 【請求項２１】下記の段階： （ｉ）免疫特異的結合を生じさせ得る条件下で前記細胞
    を請求項14記載の抗体に曝露し、そして （ii）該細胞への抗体の結合を検出する、 ことにより図２のアミノ酸配列（配列番号１）を有する
    CNTF受容体タンパク質の存在を検出することをさらに含
    んでなる、請求項19記載の方法。
  22. 【請求項２２】CNTF受容体をコードする組換え核酸を含
    まない同じタイプの細胞と比較して増加した数のCNTF受
    容体を細胞表面に発現する請求項６記載の細胞を含んで
    なる、CNTFの生理学的研究用実験モデル系。
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