【発明の詳細な説明】
ニューロトロフィン-4発現に基く治療および診断方法
1.序論
本発明は、ニューロトロフィン-4(NT-4)、そのBDNF/NGF/NT-3遺伝子ファミリ
ーの新たに特性決定された員、並びに神経障害の治療におけるニューロトロフィ
ン-4を使用する治療方法および診断方法に関する。
2.発明の背景
神経成長因子ファミリーは、β−神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子
（BDNF）、および海馬由来神経栄養因子（HDNF）としても知られているニューロ
トロフィン-3(NT-3)を含む。これらのタンパク質のこのファミリーは、発生およ
び成体の脊椎動物の神経系の両方で重要な役割を果たし、この場合、それらは神
経細胞の生存を支持する。
マウスのNGFタンパク質のアミノ酸配列（Angelettiら,1973,Biochemistry 12:
100-115）に基いて、マウスのNGFおよびヒトのNGFをコードするDNA配列が単離さ
れた（Scottら,1983,Nature302:538-540;Ullrichら,1983,Nature 303:821-825）
。マウスのNGFとヒトのNGFの比較は、そのタンパク質が哺乳類中に保存されるこ
とを示し、そしてこれが支持されることには、NGFのような活性が幾つかの種か
ら単離された（HarperおよびThoenen,1981,Ann.Rev．Pharmacol.Toxicol．21:20
5-229）。続いて、雄ウシ（Meierら,1986,EMBO J．5:1489-1493）；ニワトリの
ひな（Meierら,1986,EMBO J．5:1489-1493;Ebendal ら,1986,EMBO J．5:1483-
1487;Wionら,1986,FEBS Letters 203:82-86）；コブラ（Selbyら，1987,J.Neuro
sci.Res．18:293-298）；ラット（Whittemoreら,1988,J.Neurosci.Res．20：403
-410）；およびモルモット（Schwarzら，1989,Neurochem．52：1203-1209）のNG
FからのDNA配列がまた決定された。脳由来神経栄養因子（BDNF）が最初にブタの
脳から単離され（Bardeら,1982,EMBO J．1:549-553）、続いてこの組織からcDNA
としてクローン化された（Leibrockら,1989,Nature 341：149-152）。NT-3の遺
伝子が、その他の二つの因子間の配列類似性に基く変性オリゴヌクレオチドを使
用してマウス（Hohnら,1990,Nature 344:339-341）、ラット（Maisonpierreら,1
990,Science 247：1446-1451；Ernforsら,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:545
4-5458）、およびヒト（Rosenthal．ら,1990,Neuron 4：767-773）から単離され
た。その三つの因子は互いに約55％のアミノ酸類似性を示し、そして殆どの配列
の相違がそれぞれのタンパク質の特徴的なアミノ酸モチーフ（amino acid motif
s）を含む５つの領域中に存在する。これらのタンパク質のうちの二つのin vitr o
における神経栄養活性は、これらの可変領域の特異的な組み合わせにより獲得
されることが最近示されていた。
NGFは末梢交換神経細胞および神経冠由来知覚神経細胞の発生および維持を支
持する（ThoenenおよびBarde,1980,Physiol.Rev.，60：1284-1325；Levi-Montal
cini,1987,Science，237：1154-1162に概説されている）。活性は末梢交換神経
細胞中のBDNFに関して見られなかったが、この因子はプラコード由来知覚神経細
胞および神経冠由来知覚神経細胞の両方の生存をin vivoにおいて支持する（Hof
erおよびBarde,1988,Nature，331：261-262）。in
vivo
においてNT-3に感受性の神経細胞は、同定されるように残存する。しかしな
がら、in vitroにおいて外植されたニワトリのひなの神経節または解離された神
経培養物中では、三つの因子は神経集団の重なりの組および特異な組の両方を支
持し、NT-3がin vivoにおいても特異的な神経栄養活性および重なりの神経栄養
活性の両方を示すことを示唆する（Hohnら,1990,Nature，344：339-341;Maisonp
eirreら，1990,Science,247：1446-1451；Ernforsら，1990，Proc.Natl.Acad.Sc
i．USA 87：5454-5458；Rosenthalら,1990，Neuron 4：767-773）。全ての三つ
の因子は、海馬中の全ての三つの因子のmRNAの最高のレベルを使って脳中の特別
な組の神経細胞中で発現される（Ayer-LeLie-vreら，1988， Science240：1339
-1341；Ernforsら，1990，Proc.Natl.Acad．Sci.USA，87：5454-5458；Ernfors
ら,1990，Neuron 5：511-526；Watmoreら,1991，Neurol．109：141-152；Hofer
ら，1990，EMBO J.，9：2459-2464；Phillipsら,1990，Science,250：290-294）
。脳中で、NGFは基底前脳のコリン作動性神経細胞を支持することが示され（Whi
ttemoreおよびSeiger,1987，BrainRes.，434；439-464；Thoenenら,1987，Rev.P
hysiol.Biochem．Pharmacol.,105:145-178；Ebendal,1989，Prog.Growth Factor
Res.1：143-159に概説されている）、そしてBDNFはin vitroで試験管内でこれ
らの神経細胞の生存を剌激すると示されていた（Aldersonら，1990，Neuron 5:2
97-306）。
３種のタンパク質の作用は、感受性細胞に存在する特異的受容体とそれらの相
互作用により媒介される。分子クローンがラット、ヒト、およびニワトリのNGF
受容体（NGF-R）に関して単離され、
そしてこれらのクローンのヌクレオチド配列の分析は、NGF-Rが一つの原形質膜
と橋かけをする領域、細胞質領域、および細胞外のシステインに富むアミノ末端
領域を含むことを示した（Johnsonら，1986，Cell，47：545-554；Radekeら,198
7，Nature，325:593-597；Largeら,1989，Neuron 2：1123-1134）。NGF-Rは腫瘍
壊死因子の受容体（Schallら,1990，Cell，61：361-370）だけでなくリンパ球表
面抗原CD40（Stamenkovicら,1989，EMBO J.，8：1403-1410）およびOX40（Malle
ttら,1990，EMBO J.，9：1063-1068）に対して低いが、重大な配列類似性を示す
。NGF-Rは、低アフィニティー状態および高アフィニティー状態として知られて
いる二つの明白な状態で生じ得る（Sutterら,1979，J.Biol.Chem.，254:5972-59
82；LandrethおよびShooter,1980，Proc.Natl.Acad.Sci．USA,77：4751-4755；S
chechterおよびBothwell,1991，Cell24：867-874）。NGF-Rの遺伝子はその受容
体の低アフィニティー状態および高アフィニティー状態の両方の部分を形成する
タンパク質をコードすることが明らかであるが（Hempsteadら，1989，Science，243:
373-375）、高アフィニティー受容体のみがNGFの生物活性を媒介すると提案
された。BDNF（Rodriguez-Tebarら,1990，Neuron,4：487-492）およびNT-3（Ern
forsら,1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：5454-5458）の両方が低アフィニテ
ィーNGF-Rと相互作用でき、これは低アフィニティーNGF-Rが未だ知られていない
方法で全ての三つの因子の生物作用の媒介に関与し得ることを示唆する。
発育している神経系中で、NGFおよびその受容体は、成長する軸索がその標的
に達する時に、それぞれ、標的領域および応答性
神経細胞中で合成されることが示された（Daviesら,1987，Nature326：353-358
）。これと一致して、発育しているニワトリのひなの胚中のNGF mRNAのレベルは
胚日８（E8）で最高に達し（EbendalおよびPersson,1988，Development,102：10
1-106）、これは知覚神経剌激伝達の時間と一致する。しかしながら、ニワトリ
のひなでは、NGF-R mRNAは神経刺激伝達の前に初期の胚段階で最大に発現され（
Ernforsら,1988，Neuron,1，983-996）、そしてE8のニワトリのひなの胚中で、
高レベルのNGF-R mRNAが間充織細胞、体節細胞および神経管細胞中で検出された
（Hallbookら,1990,Development,108：693-704；Heuerら,1990，Dev.Biol.，137
：287-304；Heuer1990，Neuron,5：283-296）。この観察は、NGF mRNAが比較的
高いレベルでE3のニワトリのひなの胚中で発現されるという事実（Eb-endalおよ
びPersson,1988，Development,102：101-106）と一緒に、NGFが神経栄養因子と
してのその機能とは区別される役割を初期の発育中に果たし得ることを示す。こ
の可能性と一致して、NGFは培養中のE14のラットの胚線条体前駆体細胞の増殖お
よび分化を調節することが最近示された（Cattaneoおよび McKay,1990，Nature,347
，762-765）。ニワトリのひなの胚中で、BDNFおよびNT-3mRNAはE4,5で最大に
発現され、そしてBDNFがin vitroで鳥類の神経冠細胞の分化を調節することが
示された（KalcheimおよびGen-dreau,1988，Dev.BrainRes.,41：79-86）。
更に、NGFの非神経機能の証拠がまた提示された。雄のマウスの顎下腺中に見
られるNGFの未だ説明されていない高レベルはNGFのその他の機能を示し得る（Le
vi-Montalcini,1987，Science,237:1154-1162）。成体のラット中で、NGFはDNA
合成を誘発し、そし
てＢ細胞中でIgM分泌を剌激することが示された（Ottenら,1989,Proc.Natl.Acad
.Sci.USA，86：10059-10063）。
更に、NGFは、モルモットの前立腺中に充分な量で存在し、その結果、Rubinお
よびBradshaw（1981,J.Neur.Res.6：451-464）がこの外分泌組織から実質的に純
粋なNGFを単離し、特性決定するのに成功した。モルモットの前立腺中の高レベ
ルのNGFは、この神経栄養因子が未だ理解されていない非神経能で機能するとい
う仮説を支持する（Bradshaw,1978,Ann.Rev.Biochem.47:191-216;Harperら,1979
,Nature 279:160-162；HarperおよびThoenen,1980,J.Neurochem．34：893-903）
。
更に、NGF mRNAは成体ラットの睾丸中の精母細胞および初期の精子細胞中で発
現され（Ayer-Lelievreら,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2628-2632）、そ
してNGFタンパク質が精母細胞から精子までの全ての段階の生殖細胞中に存在す
る（Olsonら,1987,Cell Tissue Res.,248：275-286；Ayer-Lelievreら,1988a,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA，85：2628-2632）。また、NGF-R mRNAは成体ラットの睾
丸中で検出され、そこでそれはテストステロンの負の調節のもとにセルトーリ細
胞中で発現され、そして睾丸中でNGFは減数分裂および精子遊離を調節すると示
唆された（Perssonら，1990,Science，247:704-707）。
3.発明の要約
本発明は、ニューロトロフィン-4(NT-4)、そのBDNF/NGF/NT-3遺伝子ファミリ
ーの新たに特性決定された員に関する。
本発明はNT-4をコードする核酸分子を提供する。このような分子は、図１［配
列番号１（NT-4,クサリヘビ）、配列番号２（NT-4,
アフリカツメガエル］、図４（配列番号43）、図８（配列番号49）、図14（配列
番号61）、図15（配列番号63）、図17（配列番号69）、図18（配列番号75）、図
20（配列番号93）および図21（配列番号116）中にNT-4に関して実質的に示され
た配列を含んでもよく、またはこのような配列に少なくとも約70％相同性である
配列を含んでもよい。
また、本発明は、図２［配列番号22（NT-4,クサリヘビ）、配列番号23（NT-4,
アフリカツメガエル］、図４（配列番号44）、図８（配列番号50）、図14（配列
番号62）、図15（配列番号64）、図17（配列番号70）、図18（配列番号76）、図
20（配列番号94）または図21（配列番号117）中にNT-4に関して実質的に示され
た配列を含み、またはこのような配列に少なくとも約70％相同性である配列を含
んでもよいタンパク質分子またはペプチド分子を提供する。
更に、本発明は、原核生物系および真核生物系中の生物活性NT-4分子の発現を
提供する。
更に、本発明は、治療用途および診断用途に充分な量のNT-4の生産を提供する
。同様に、抗NT-4抗体が治療用途および診断用途に利用し得る。殆どの目的に関
して、治療目的または診断目的のために同じ種からのNT-4遺伝子または遺伝子生
産物を使用することが好ましいが、NT-4の交雑種の利用が本発明の特別な実施態
様に有益であり得る。
更に、本発明は、ヒトの骨格筋、前立腺、胸腺および睾丸中のNT-4発現の検出
可能なレベルを開示することによりNT-4発現に基く治療および診断上の用途を提
供する。
4.図面の説明
図１．異なる種からのNGF、BDNF、NT-3および新規な神経栄養因子NT-4をコー
ドする単離断片のDNA配列の配列。
（A）マウスのプレプロNGF分子の略図。斜線付きボックスはシグナル配列（SS）
を示し、黒いバーはタンパク質開裂部位を表し、そして影をつけたボックスは成
熟NGFを表す。変性プライマーに使用された領域は矢印により示される。上流プ
ライマーはリシン50からスレオニン56までをコードする領域からのものであり、
そして下流プライマーはトリプトファン99からアスパラギン酸105までを含む。
増幅領域は成熟NGF分子中の塩基対（bp）168〜294からのDNA配列を含み、そして
ここまでに記載されたNGFファミリーの全ての員中で、この領域は一つのエクソ
ン中に配置される。
（B）異なる種から単離されたNGF、BDNF、NT-3およびNT-4のヌクレオチド配列の
配列。これらの断片は成熟マウスのNGF中のアミノ酸57〜98に相当する。同じ塩
基がドットにより示される。ナンバリングはマウスの成熟NGF（Scottら，1983,N
ature 300:538-540）の配列中のヌクレオチドを表す。配列番号１（NT-4,クサリ
ヘビ）、配列番号２（NT-4,アフリカツメガエル）、配列番号３（NGF、ヒト）、
配列番号４（NGF、ラット）、配列番号５（NGF、ニワトリ）、配列番号６（NGF
、クサリヘビ）、配列番号７（NGF、アフリカツメガエル）、配列番号８（NGF、
サケ）、配列番号９（BDNF、ヒト）、配列番号10（BDNF、ラット）、配列番号11
（BDNF、ニワトリ）、配列番号12（BDNF、クサリヘビ）、配列番号13（BDNF、ア
フリカツメガエル）、配列番号14（BDNF、サケ）、配列番号15（BDNF、エイ）、
配列番号16（NT-3、ヒト）、配列番号17（NT-3、ラット）
、配列番号18（NT-3、ニワトリ）、配列番号19（NT-3、アフリカツメガエル）、
配列番号20（NT-3、サケ）、配列番号21（NT-3、エイ）。
図２．異なる種由来のNGF、BDN、NT-3およびNT-4に関して推測されたアミノ酸
配列の配列。アミノ酸のナンバリング（１文字コード）は成熟マウスのNGF（Sco
ttら,1983,Nature 300:538-540）から採用される。同じ塩基がドットで示される
。同じ因子の全ての変異体中の保存アミノ酸置換を示す位置が下線を施される。
破線は、相当する配列が単離されなかったことを示す。バーは異なる分子中の可
変領域（R59〜S67およびD93〜A98）を表す。配列番号22（NT-4、クサリヘビ）、
配列番号23（NT-4、アフリカツメガエル）、配列番号24（NGF、ヒト）、配列番
号25（NGF、ラット）、配列番号26（NGF、ニワトリ）、配列番号27（NGF、クサ
リヘビ）、配列番号28（NGF、アフリカツメガエル）、配列番号29（NGF、サケ）
、配列番号30（BDNF、ヒト）、配列番号31（BDNF、ラット）、配列番号32（BDNF
、ニワトリ）、配列番号33（BDNF、クサリヘビ）、配列番号34（BDNF、アフリカ
ツメガエル）、配列番号35（BDNF、サケ）、配列番号36（BDNF、エイ）、配列番
号37（NT-3、ヒト）、配列番号38（NT-3、ラット）、配列番号39（NT-3、ニワト
リ）、配列番号40（NT-3、アフリカツメガエル）、配列番号41（NT-3、サケ）、
配列番号21（NT-3、エイ）。
図３．NGFファミリーの員の推測される系統発生。NGF（A）、BDNF（B）、およ
びNT-3（C）の種分化を示す系統樹を、ヌクレオチド配列の分析を使用して構築
した。ヒトのNT-3を（A）および（B）で基準点として使用し、ヒトのNGFおよび
ヒトのBDNFを（C）で使用
した。（A）中のスケールバーは20の相対的な相違値に相当する分枝長を表す。
同じスケールを（B）および（C）で使用した。（D）はNGFファミリーの異なる員
間の進化の関係の系統図を示す。これらのデータを推測されるアミノ酸配列から
集めた。スケールバーは20の分枝長を表す。示された全ての系統樹は、分枝が外
部基準を使用しないで相対的に測定される基盤のないものである。略号：chi、
ニワトリ；hum、ヒト；sal、サケ；vip、クサリヘビ；xen、アフリカツメガエル
。
図４．アフリカツメガエルNT-4の配列並びにNGF、BDNF、およびNT-3との比較
。
（A）潜在する翻訳開始部位が箱形にされている。推定のシグナル開裂部位がSC
と標識された矢印により示される。アフリカツメガエルのNT-4とモルモットおよ
びラットのBDNFの間で同一であるシグナル配列中のアミノ酸が星印により示され
る。N-グリコシル化の共通配列が下線を施され、そして矢印が成熟NT-4タンパク
質の予定開始を示す（配列番号43および配列番号44）。
（B）アフリカツメガエルNT-4（配列番号45）とマウスNGF（Scottら,1983,Natur
e300：538-540）（配列番号46）、マウスBDNF（Hoferら,1990,EMBO J.9：2459-2
464）（配列番号47）、およびマウスNT-3（Hohnら,1990,Nature 344：339-341）
（配列番号48）のアミノ酸（１文字コード）配列の比較。NT-4アミノ酸配列と比
較して同一のアミノ酸置換がドットにより示される。NGF、BDNF、およびNT-3の
間で異なる配列はNT-4タンパク質の配列中でも異なる。
図５．COS細胞中のアフリカツメガエルNT-4タンパク質の一時的な発現およびP
C12細胞に関するNGF-Rとその相互作用。
（A）ラットNGF遺伝子、インサートを含まない対照プラスミド、またはアフリカ
ツメガエルNT-4遺伝子でトランスフェクションされたin vivoで標識された（各
々のレーンに３×104cpm負荷された）COS細胞培養物由来のならし培地のSDS-PAG
E。Ｘ線フィルムに一夜露出した後の乾燥ゲルのオートラジオグラフが示される
。
（B）等量のNT-4（開いた円形）またはNGF（閉じた円形）タンパク質を含むトラ
ンスフェクションしたCOS細胞培地の連続希釈液を、PC12細胞上のその受容体か
ら125I-NGFを置換するそれらの能力につき検定した。１ml当たり1.5x109Mの125I
-NGFおよび１x104個の細胞を使用して結合アッセイを37℃で行った。mock移入細
胞からの培地はPC12細胞からの125I-NGFの結合を置換できなかった。それぞれの
点は３回の測定値の平均±SDを表す。
図６．ニワトリの胚神経節からの神経突起成長の刺激。
（Ａ、Ｂ、およびＣ）組換えNT-4タンパク質（A）、組換えNGF（B）、およびBDN
Fタンパク質（C）で背根神経節中で誘発された神経突起成長。（Ｄ）mockトラン
スフェクション細胞由来のならし培地に対する背根神経節の応答。（ＥおよびＦ
）NT-4（E）またはNGF（F）に応答する交感神経節からの神経突起成長の剌激。
（Ｇ、Ｈ、およびＩ）組換えNT-4（G）タンパク質、NT-3（H）タンパク質、およ
びBDNF（I）タンパク質で剌激された結節神経節。全ての図は、1.5日の培養後の
神経節の明視野顕微鏡である。
図７．異なるアフリカツメガエル組織中のNT-4 mRNAの検出。
（A）成体の雌のアフリカツメガエルの示された組織からのポリ（A）+RNA（10μ
g/スロット）をホルムアルデヒドを含むアガロースゲル中で電気泳動し、ニトロ
セルロースフィルターにブロットし、
そしてアフリカツメガエルのNT-4遺伝子の3'エクソン由来の500bpのHindI断片に
ハイブリダイズさせた。比較のために、またそのフィルターをアフリカツメガエ
ルのNGF遺伝子由来の180bpのPCR断片にハイブリダイスさせた（心臓、NGFとマー
クしたレーン）。NT-4プローブに対してハイブリダイズさせたフィルターを２日
間露出した。NGFプローブに対してハイブリダイズさせたフィルターを２週間露
出した。NT-4プローブにハイブリダイズさせたフィルターの延長した２週間の露
出は卵巣（これは異なる段階の卵母細胞を含む）以外のあらゆる組織中でNT-4 m
RNAを示さなかった。CNSと標識したレーンは脳および脊髄を含む。
（B）アフリカツメガエルの卵巣由来のポリ（A）+RNA（10μg）をNGFファミリー
の４種の員の発現につき分析した。それぞれのフィルターを、それらのそれぞれ
のアフリカツメガエル遺伝子からのPCR断片を標識することにより得られた示さ
れたプローブとハイブリダイズさせた。それらの遺伝子の3'エクソン中の標識PC
R断片の位置が図1Aに示される。フィルターを高ストリンジェンシーで洗浄し、
Ｘ線フィルムに５日間露出した。
図８．制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含むアフリカツメガエルNT-4のヌク
レオチド配列（配列番号49および配列番号50）。
図９．アフリカツメガエル・ラエビス（Xenopus laevis）の卵巣中のNT-4mRNA
発現。成体のアフリカツメガエル・ラエビス（Xenopus laevis）からの卵巣をク
リオスタット中で切断し（14μmの厚さの切片）、次にターミナルデオキシヌク
レオチジルトランスフェラーゼを使用して切片を35S-dATPで標識された示された
48-merオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。
（A）配列
を有するアフリカツメガエルNT-4 mRNA特異的オリゴヌクレオチドを使用するハ
イブリダイゼーション。
（B）同様の長さおよびG+C含量の対照オリゴヌクレオチドを使用するハイブリダ
イゼーション。
ハイブリダイゼーション後に、切片を1x SSC中で55℃で洗浄し、続いてＸ線フィ
ルムに10日間露出した。現像されたＸ線フィルムの写真が図に示される。NT-4プ
ローブによる多くの小さい細胞の強い標識および対照プローブによる標識の不在
に注目されたい。矢印は、二つのプローブのいずれかにより標識されていない大
きい（段階VI）卵母細胞を示す。スケールバー、2mm。
図10．アフリカツメガエルの卵巣中のNT-4 mRNAを発現する卵母細胞をを示す
エマルション・オートラジオグラフの明視野の彩飾。図９に記載されたアフリカ
ツメガエルNT-4 mRNA特異的プローブ（A,B）または対照プローブ（C）にハイブ
リダイズさせた切片をコダック（Ko-dak）NTB2エマルションで被覆し、５週間露
出し、現像し、クレシル・バイオレットで軽く対比染色した。この図は現像した
切片の明視野の顕微鏡写真を示す。パネルＡにおいて、小さいサイズの卵母細胞
（段階ＩおよびII）に関する強いNT-4 mRNA標識および大きいサイズの卵母細胞
（段階ＶおよびVI）に関する標識の不在に注目されたい。パネルＢはパネルＡ中
の領域で箱形にされたものの高倍率を示す。その写真に示された段階IIの卵母細
胞の細胞質の強い標識に注目されたい。
（C）対照プローブを使用すると標識が見られない。略号：ｎ、核；fc、胞細胞
；pl、着色層。Ａのスケールバー、50μm；ＢおよびＣのスケールバー、15μm。
図11．卵子形成の異なる段階においての卵母細胞中のNT-4 mRNAのレベル。ア
フリカツメガエルNT-4 mRNA特異的プローブでハイブリダイズさせた切片のエマ
ルション・オートラジオグラフ（図10に示される）を使用して面積単位中の粒子
の数をカウントした。選ばれた面積単位は段階Ｉの卵母細胞の約100分の１であ
った。15の面積単位を示された段階の10の異なる卵母細胞中で分析した。エラー
バーはS.D.を示す。
図12．アフリカツメガエル（Xenopus laevis）中の卵子形成中のNT-4 mRNA発
現のノーザンブロット分析。２種の成体アフリカツメガエル・ラエビスからの卵
巣を切開し、コラーゲナーゼで処理して胞細胞を除去し、卵母細胞を遊離した。
次に卵母細胞を、Dumont,1972,J.Morphol．136：153-180により記載された段階
に従って示されたグループに分けた。また、全体の卵巣および遊離された胞細胞
がその分析に含まれた。次に全細胞RNAを調製し、40μg/スロットのRNAをホルム
アルデヒドを含む１％のアガロースゲル中で電気泳動した。これをニトロセルロ
ースフィルターにブロットし、アフリカツメガエルNT-4遺伝子の3'エクソンから
の600bpのHincII断片にハイブリダイズさせた。フィルターを高ストリンジェン
シーで洗浄し、Ｘ線フィルムに５日間露出した。段階ＶおよびVIの卵母細胞中の
NT-4mRNAの量の著しい減少に注目されたい。
図13．変性オリゴヌクレオチドが合成され、そしてポリメラー
ゼ連鎖反応（Polymerase chain reaction）によるヒトおよびラットのゲノムDNA
の増幅を開始するのに利用された位置を示すxNT-4部分アミノ酸配列（配列番号5
1）。矢印はセンス変性オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス変性オリゴヌク
レオチドに相当するオリゴヌクレオチドを示す。プライマー2Zへの変性オリゴヌ
クレオチドの組はrBDNFのアミノ酸184-189（配列番号52）に相当する。表された
部分アフリカツメガエルNT-4のアミノ酸配列は上記の図４に記載されたアミノ酸
167-アミノ酸223由来のものである。
（B）ヒトおよびラットのNT-4のクローニングに使用した変性オリゴヌクレオチ
ド。図13中のオリゴヌクレオチド3Zは、セリンコドンの同義性を許容するために
3Zと3Z'の混合物を含む。2Y（配列番号53）、2Z（配列番号54）、3Y（配列番号5
5）、3Z（配列番号56）、（配列番号57）および4Z（配列番号58）。（C）変性オ
リゴヌクレオチド3'（配列番号59）および5'（配列番号60）に関するクローニン
グ尾部。
図14．ラットNT-4の部分をコードする単離断片のDNA配列（配列番号61）。rNT
-4核酸断片によりコードされたペプチドの予想読取り枠が１文字コードにより表
される（配列番号62）。括弧内の配列はPCRプライマーの部分である。
図15．ヒトNT-4の部分をコードする単離断片のDNA配列（配列番号63）。hNT-4
核酸断片によりコードされたペプチドの予想読取り枠が１文字コードにより表さ
れる（配列番号64）。括弧内の配列はPCRプライマーの部分である。
図16．代表的なニューロトロフィンから推測されたアミノ酸配列の配列。１文
字コードを使用してアミノ酸が示される。同じア
ミノ酸がドットで示される。破線（dushed line）はrNT-4（配列番号62）および
hNT-4（配列番号64）の両方の保存領域内の７のアミノ酸挿入を示す。xNT-4（配
列番号65）、rNGF（配列番号66）、rBDNF（配列番号67）、rNT-3（配列番号68）
。ｘ＝アフリカツメガエル、ｒ＝ラット、ｈ＝ヒト。括弧内の配列はPCRプライ
マーの部分である。
図17．（A）ヒトNT-4の部分をコードする単離断片のDNA配列（配列番号69）。
192bpのhNT-4核酸断片によりコードされた予想ペプチドが１文字コードにより表
される（配列番号70）。括弧内の配列はPCRプライマーの部分である。
（B）4Zと称される3'末端プライマー（配列番号58）［WIRIDTをコードするヌク
レオチド配列を含む］と一緒に、ヒトのゲノムDNAの一次増幅に使用されたhNT4-
5”と称される5'末端プライマーのオリゴヌクレオチド配列［ETRCKA（配列番号7
2）をコードする配列（配列番号71）を含む］。（C）一次PCR反応生産物を増幅
するのに使用された5'末端プライマーのオリゴヌクレオチド配列。hNT4-5"'と称
されるプライマー［DNAEEG（配列番号74）をコードする配列（配列番号73）を含
む］を3'プライマー、4Z（配列番号58）と共に使用して162bp（＋クローニング
尾部のbp）の断片を得た。次にその162bpのPCR断片を、本発明者らの先に使用し
た上流のPCR断片（2YZ3Zと称する）を使用するパッチPCR反応に使用して192bp＋
（A）に示されたクローニング尾部の単一断片を生じた。付加的な3'延長核酸配
列の情報を、この断片のサブクローニングおよび配列決定後に得た。
図18．ヒトNT-4をコードする単離されたヒトのゲノムファージ
クローン7-2の部分のDNA配列（配列番号75）。ゲノムクローン7-2によりコード
される予想hNT-4タンパク質がアミノ酸の１文字記号により表される（配列番号7
6）。箱形領域はhNT-4タンパク質の予想開裂部位を表す。矢印はプレ配列中の保
存残基を示す。下線が施された領域（N-R-S）はn-グリコシル化の共通配列を表
す。丸で囲んだ領域は開始メチオニンを表す。スプライスアクセプター部位は配
列番号75の塩基対461-462（AG）に位置し、イントロンの3'末端を表す。
図19．代表的なニューロトロフィンから推測されたアミノ酸配列（配列番号77
-92）の配列。１文字コードを使用してアミノ酸が示される。ヒトのゲノムファ
ージクローン7-2（配列番号77）によりコードされたアミノ酸と同じアミノ酸が
アスタリスクで示される。破線（dashed line）は配列番号77によりコードされ
たタンパク質と比較して相同性のアミノ酸中のブレイク（break）を示す。
図20．ヒトのゲノムファージクローン、2-1の部分をコードする単離断片のDNA
配列（配列番号93）。その単離された核酸断片によりコードされたペプチドの予
想読取り枠が１文字コードにより表される（配列番号94）。
図21．ヒトのゲノムファージクローン、4-2の部分をコードする単離断片のDNA
配列（配列番号116）。その単離された核酸断片によりコードされたペプチドの
予想読取り枠が１文字コードにより表される（配列番号117）。
図22．ヒトNT-4 mRNA発現のノーザンブロット分析。ヒト由来の組織特異的mRN
Aをクロンテック（Clontech）社から購入した。RNA（10μg）を１％のアガロー
ス−ホルムアルデヒドゲルによる電気
泳動により分別し、続いて10X SSC（pH7）でキャピラリーによりナイロン膜（マ
グナグラフ（MagnaGraph）、ミクロン・セパレーションズ社（Micron Separatio
ns Inc.））に移した。RNAを紫外線（ストラトリンカー（Stratlinker）、スト
ラタゲン社（Stratagen,Inc.））への暴露により膜にUV架橋し、そして0.5MのNa
PO4（pH7）、１％のウシ血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ（Sigma）社
）、７％のSDS、１ミリモルのEDTA（MahmoudiおよびLin,1989,Biotechniq-ues7:
331-333）、および100μg/mlの音波処理された変性サケ精子DNAの存在下で放射
能標識プローブ（HG7-2 NT-4の完全コード領域を含む680bpのXho1-Not1断片（下
記の実施例の項９を参照のこと））と65℃でハイブリダイズした。そのフィルタ
ーを65℃で2X SSC、0.1％のSDSで洗浄し、そして一つの増感スクリーン（クロネ
ックス（Cronex）、デュポン）およびＸ線フィルム（XAR-5、コダック）で-70℃
で一夜にわたるオートラジオグラフにかけた。ゲルのエチジウムブロマイド染色
は、全RNAの当量レベルが異なる試料につき（Misonpierreら,1990,Science247:1
446-1451に記載されているように）検定されていることを実証した。レーン１：
胎児肝臓のポリ（A）+mRNA；レーン２：胎児脳のポリ（A）+mRNA；レーン３：前
立腺のポリA+mRNA；レーン４：筋肉のポリ（A）+mRNA；レーン５：腸のポリ（A
）+mRNA；レーン６：腎臓のポリ（A）+mRNA；レーン７：肝臓のポリ（A）+mRNA
；レーン８：牌臓のポリ（A）+mRNA；レーン９：胸腺のポリ（A）+mRNA；レーン
10：卵巣のポリ（A）+mRNA；レーン11：睾丸のポリ（A）+mRNA；レーン12：胎盤
のポリ（A）+mRNA；レーン13：脳のポリ（A）+mRNA；レーン14：脳の全RNA。
図23．トランスフェクション細胞系；Q1(pCMX-HG7-2Q)、N7(pCMX-hNT3/hNT4)
およびX1(pCMX-xNT4/hNT4)由来のCOS上澄みを、DRG外植体中の神経突起促進活性
につき10μｌ、50μｌおよび250μｌの容積で試験した。mock移入COS細胞系から
の上澄みを対照として使用した。
図24.Q1(pCMX-HG7-2Q)細胞系およびM(pCMX-HG7-2M)細胞系由来のCOS上澄みを
、DRG関連細胞におけるそれらの生存促進活性につき試験した。試験した容積は
２mlの全容積中で５μｌ〜250μｌの範囲であった。
図25.E14ラットの胚から単離された運動ニューロンが豊富化された培養物をM
細胞系（pCMX-HG7-2M）由来のCOS細胞上澄みの２種の希釈液で処理した。生物活
性を、Fonnum,1975,J.Neurochem.24:407-409に記載されたコリンアセチルトラン
スフェラーゼ（CAT）活性により測定した。mockトランスフェクション済COS細胞
系（MOC COS）および未処理の運動ニューロン（C-NT）の両方が対照として示さ
れる。
5. 発明の詳細な説明
本発明は、ＮＴ−４遺伝子及びタンパク質を提供する。それは、少なくとも部
分的に、ＮＴ−４遺伝子のクローニング、特徴付け、及び発現を基礎としている
。
特に、本発明は、ＮＴ−４をコードする組み換え核酸分子を提供する。かかる
分子は、クサリヘビについて図１（配列番号：１）に、ツメガエルＮＴ−４につ
いて図１（配列番号：２）、図４（配列番号：４３）又は図８（配列番号：４９
）に、ラットＮＴ−４について図１４（配列番号：６１）に、ヒトＮＴ−４につ
いて図１５（配列番号：６３）、図１７（配列番号：６９）又は図１８（配列番
号：７５）に、ヒトＮＴ−４様配列について図２０（配列番号：９３）及び図２
１（配列番号：１１６）に実質的に記載された配列、又はかかる配列のいずれか
に対して少なくとも約７０％相同性である配列を含む。ここで、相同性とは配列
同一性をいう（例えば、第２配列に対して７０％相同性である配列は、該第２配
列と同じヌクレオチド残基を７０％共有する）。
本明細書の実施例第８節及び図１５（配列番号：６３、配列番号：６４）で詳
述する本発明の特有の局面においては、ヒトニューロトロフィン分子の一部につ
いてのヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定している。本明細書の実施例第９節
及び図１７（配列番号：６９、配列番号：７０）及び図１８（配列番号：７５、
配列番号：７６）で詳述する本発明の他の局面においては、完全なヒトニューロ
トロフィン分子についてのヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定している。本明
細書の実施例第９節及び図２０（配列番号：９３、配列番号：９４）及び図２１
（配列番号：１１６、
配列番号：１１７）で詳述する本発明の他の局面においては、図１８（配列番号
：７５）に記載したヌクレオチド及びアミノ酸配列に類似するが同一ではないヒ
トゲノミックファージクローン、２−１及び４−２それぞれの一部についてのヌ
クレオチド及びアミノ酸配列を詳述している。かかるヒトニューロトロフィン分
子を本明細書ではヒトニューロトロフィン−４というが、本明細書に記載したツ
メガエルニューロトロフィン−４のヒト相同体であっても、又は、異なるが依然
として相同なニューロトロフィン分子であってもよい。同様に、本明細書でラッ
トＮＴ−４という分子は、ＮＴ−４のラット相同体であっても、又は、異なるが
依然として相同なニューロトロフィン分子であってもよい。本発明の方法及び組
成物は、如何なる単一の命名法にも依存しない。
本発明は、また、実質的に精製されたＮＴ−４タンパク質又はペプチド分子も
提供する。かかる分子は、ＮＴ−４について図２（配列番号：１及び配列番号：
２）、図４（配列番号：４４）、図８（配列番号：５０）、図１４（配列番号：
６２）、図１５（配列番号：６４）、図１７（配列番号：７０）、図１８（配列
番号：７６）、図２０（配列番号：９４）及び図２１（配列番号：１１７）に実
質的に記載された配列、又はかかる配列のいずれかに対して少なくとも約７０％
相同性である配列を含む。本発明の追加の限定的ではない具体的態様においては
、実質的に精製されたタンパク質又はペプチドは、配列ＫＣＮＰＳＧＴＴＲ（配
列番号：９６）を含む。本発明の他の態様においては、実質的に精製されたペプ
チド又はタンパク質は、配列ＲＧＣＲＧＶＤ（配列番号：９７）を含む。本発明
のなおも他の態様においては、実質
的に精製されたペプチド又はタンパク質は、配列ＫＱＷＩＳ（配列番号：９８）
を含む。本発明の更なる態様においては、実質的に精製されたペプチド又はタン
パク質は、配列ＫＱＳＹＶＲ（配列番号：９９）を含む。本発明のなおも他の態
様においては、実質的に精製されたペプチド又はタンパク質は、配列ＧＰＧＸＧ
ＧＧ（配列番号：１００）（Ｘは一揃いの２０アミノ酸の１つを表す）を含む。
本発明に関連する態様においては、実質的に精製されたペプチド又はタンパク質
は、配列ＧＰＧＶＧＧＧ（配列番号：１０１）又はＧＰＧＡＧＧＧ（配列番号：
１０２）を含む。本発明の更なる態様においては、実質的に精製されたペプチド
又はタンパク質は、配列ＥＳＡＧＥ（配列番号：１０３）を含む。本発明のなお
更なる態様においては、実質的に精製されたペプチド又はタンパク質は、配列Ｄ
ＮＡＥＥ（配列番号：１０４）を含む。
本発明のタンパク質及びペプチドは、標準的な技術を使用する化学合成によっ
て製造しても、１９９０年８月２９日に出願されＷＯ９１／０３５６９として公
表され、参照によりそっくりそのまま本明細書に取り込まれる、ＰＣＴ出願ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９０／０４９１６に記載された如き、又はＣＯＳ細胞内での一過性発現
について以下に例示した如き（以下の第6.2.4.節及び図５を参照のこと）、当業
者に既知の原核又は真核発現系を使用し、ＮＴ−４をコードする本発明の核酸分
子を使用して製造してもよい。
本発明は、また、神経系の細胞、特に、限定するものではないが背根神経節又
は神経板誘導体の細胞の成育及び／又は生存を促進するＮＴ−４の用途も提供す
る（例えば、以下の第6.2.4.節及び図６を参照のこと）。
本発明は、また、ＮＴ−４について図１、２、４、８、１４、１５、１７、１
８、２０又は２１（先に挙げた配列番号）に実質的に記載した、実質的に同じ大
きさのＢＤＮＦ、ＮＧＦ、又はＮＴ−３のタンパク質と同一ではないＮＴ−４核
酸又はアミノ酸配列の一部分も提供する。
本発明は、更に、ＮＴ−４をコードする組み換え核酸を含有しかつ組み換えＮ
Ｔ−４タンパク質を発現する真核又は原核細胞を提供する。具体的態様において
は、該細胞はＣＯＳ細胞の如き真核細胞である。従って、本発明はＮＴ−４をコ
ードする組み換え核酸を（例えば、形質移入、形質導入、エレクトロポレーショ
ン、顕微注射等により）細胞内に挿入することにより、ＮＴ−４の発現とそれに
次ぐ該細胞からのＮＴ−４の単離を可能にする条件下で、製造される組み換えＮ
Ｔ−４タンパク質又はペプチドをも提供する。
更に、本発明は、例えば、プライマーとして以下のオリゴヌクレオチド：
ヒトＮＴ−４のための
と
及び
ラットＮＴ−４のための
と
を使用し、鋳型として適当なゲノミック又はｃＤＮＡを使用するＰＣＲにより製
造される分子を提供する。本発明の具体的態様においては、これらプライマーを
、鋳型としてのヒトｃＤＮＡと共に使用して、クローニングに適したヒトＮＴ−
４遺伝子の断片を製造してもよい。
ＮＴ−４に関連する誘導体、類縁体及びペプチドの製造及び用途が意図されて
おり、本発明の範囲内にある。望ましい神経栄養活性、免疫原性又は抗原性を有
するかかる誘導体、類縁体又はペプチドは、例えば、治療に、又は免疫測定法に
おいて、例えば、免疫感作等に使用することができる。ＮＴ−４に関連する誘導
体、類縁体又はペプチドは、当該技術分野で既知の操作により望ましい活性につ
いて試験することができる。
本発明のＮＴ−４関連誘導体、類縁体及びペプチドは、当該技術分野で既知の
種々の方法で製造することができる。それらの製造に帰着する操作は、その遺伝
子又はタンパク質レベルで存在し得る。例えば、クローン化されたＮＴ−４遺伝
子を当該技術分野で既知の多数の戦略のいずれかにより修飾することができる（
マニアチス（Maniatis，T.），1982，Molecular Cloning，A Laboratory Manual
，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York）。ＮＴ−
４配列は、適当な部位において制限エンドヌクレアーゼで切断した後、所望によ
り更に酵素的修飾を行い、単離し、そしてin vitroで連結することができる。Ｎ
Ｔ−４に関連する誘導体、類縁体又はペプチドをコードする遺伝子の作製におい
ては、該修飾遺伝子が、望ましいＮＴ−４特異的活性がコードされる遺伝子領域
内の、翻訳停止シグナルにより中断さ
れていない、ＮＴ−４と同じ翻訳リーディングフレーム内に確実に残るように注
意しなければならない。
更に、ＮＴ−４遺伝子をin vitro又はin vivoで突然変異させて、翻訳、開始
、及び／又は停止配列を作り出し及び／又は破壊し、又はコード領域において変
異を作り出し及び／又は新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか又は先
在するものを破壊して更なるin vitro修飾を助長してもよい。当該技術分野で既
知のあらゆる突然変異誘発のための技術を使用することができ、in vitro部位指
定（site-directed）突然変異誘発法（フッチンソン（Hutchinson，C.）ら，197
8，J．Biol．Chem．253：6551）、
定されない。
以下に議論するように、ＮＴ−４のプレプロ又は成熟コード領域を利用してニ
ューロトロフィンをベースとするキメラ遺伝子を構築してもよい。例えば、ＮＧ
Ｆ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３を含むがそれらに限定されないニューロトロフィン遺
伝子は、ニューロトロフィンプレプロ／ＮＴ−４成熟コード領域キメラ遺伝子の
構築のためのプレプロ領域を供給することができる。
ＮＴ−４配列の操作は、タンパク質レベルでも行うことができる。あらゆる多
数の化学的修飾を既知の技術により行うことができ、臭化シアン、トリプシン、
キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4、アセチル化、ホル
ミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下での代謝合成等による特異的化学開
裂を含むがそれらに限定されない。
更に、ＮＴ−４に関連する類縁体及びペプチドは化学的に合成
することができる。例えば、望ましい神経栄養活性を媒介するＮＴ−４の一部分
に対応するペプチドは、ペプチド合成装置を使用して合成することができる。
本発明は、更に、卵巣／卵母細胞機能障害に関連する受胎障害を治療する方法
を提供する。以下の実施例、特に第７節に示すように、ＮＴ−４は卵母細胞の成
熟に関与している。第7.3節の議論では、ＮＴ−４が卵母細胞によって産生され
、成熟卵母細胞よりむしろ未成熟卵母細胞に濃厚に存在し、そして卵子形成にお
いてある役割を担っているらしいことを実証する。卵巣におけるＮＴ−４タンパ
ク質の推定上の機能は、前卵黄形成及び初期／中期卵黄形成卵母細胞において起
こる事象と結び付いているようである。
ＢＤＮＦ／ＮＧＦ／ＮＴ−３遺伝子ファミリー、特にＮＧＦの他のメンバーは
減数成熟（meiotic maturation）に関与している（ネブラダ（Nebrada）ら，199
1，Science，252：558-563）。ＮＴ−４はＮＧＦと類似の性質を示す（以下の第
６節を参照のこと）ので、卵母細胞発達の調節に関与する因子として使用するこ
とができる。ＮＴ−４のこれらの性質は、受胎障害及び／又は卵子形成に関連す
る他の卵巣機能障害を治療する方法を提供するのに利用することができる。
従って、本発明によれば、製剤上効果のある担体中の治療的有効量のＮＴ−４
又はＮＴ−４関連ペプチドを投与することを含む、不妊障害及び／又は他の卵巣
機能障害を治療する方法が提供される。治療的有効量とは、卵母細胞の適度な成
熟及び／又は排卵を誘発する量である。例えば、治療的有効投与量は、約１〜１
００
×１０-10Ｍの濃度でＮＴ−４の循環血清レベルを維持するのに十分な量であっ
てもよい。追加の有効投与量を確立することは当業者の日常活動の範囲内である
。
適当な製剤上の担体中に配合されるＮＴ−４又はＮＴ−４関連ペプチドの有効
投与量は、注射（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等）、上皮又は粘膜ラ
イニング（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を介する吸収等を含むがそれ
に限定されないあらゆる適当な経路により投与することができる。
更に、ＮＴ−４又はＮＴ−４ペプチドはあらゆる適当な製剤上の担体中で使用
することができ、あるキャリアー又は標的指向性分子（例えば、抗体、ホルモン
、成長因子等）と組み合わせても、及び／又はin vivoで投与前にリポソーム、
マイクロカプセル、及び除放製剤の中に封入してもよい。
それぞれの哺乳動物ＮＴ−４ＤＮＡ配列を32Ｐラベル化プローブとして使用し
て、以下の第８節の、原料と方法の部分に概説した操作によりそれぞれのゲノミ
ック及びｃＤＮＡクローンを単離することができる。ラットＮＴ−４及びヒトＮ
Ｔ−４遺伝子断片を（32Ｐラベル化プローブとして）直接に又は（以下に記載し
たようなＰＣＲストラテジーを推論するために）間接に利用して、ｒＮＴ−４及
びｈＮＴ−４コード領域における７アミノ酸挿入の特有な性質、又はラット又は
ヒトＮＴ−４コード領域の他の特有な側面に基づき、他の哺乳動物ＮＴ−４ゲノ
ミック及びｃＤＮＡクローンを単離することができる。
ラット及びヒトＮＴ−４配列により開示された情報を介して単離されるあらゆ
る哺乳動物ＮＴ−４遺伝子を、限定するものでは
ないが、ツメガエルＮＴ−４について議論する種々の操作に利用することができ
る。例えば、実施例第９節において議論する完全長遺伝子の特徴付けに続く哺乳
動物ＮＴ−４のタンパク質及びペプチドは、１９９０年８月２９日に出願されＷ
Ｏ９１／０３５６９として公表されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０４９１６
に記載された如き、又はＣＯＳ細胞内での一過性発現について以下に例示した如
き（先の第6.2.4.節及び図５を参照のこと）、当業者に既知の原核又は真核発現
系においてそれぞれの哺乳動物ＮＴ−４分子を使用して産生することができる。
ツメガエルＮＴ−４について以下に記載したように、哺乳動物ＮＴ−４について
の追加の機能は、神経系の細胞、特に、限定するものではないが背根神経節又は
神経板誘導体の細胞の成育及び／又は生存の促進（例えば、第6.2.4.節及び図６
を参照のこと）、卵巣／卵母細胞機能障害に関連する不妊障害の治療（第７節を
参照のこと）、卵子形成に伴う不妊障害及び／又は他の卵巣機能障害の治療（第
６節を参照のこと）、運動ニューロン障害の治療（第１０節を参照のこと）、良
性前立腺肥大の如き上皮過形成の治療（第１０節を参照のこと）、前立腺機能に
関連するインポテンスの治療（第１０節を参照のこと）を含むが、それらに限定
されない。従って、医薬組成物を提供するために適当な製剤上の担体中に配合さ
れた前記障害の治療のための哺乳動物ＮＴ−４の治療的有効量を、注射（例えば
、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等）、上皮又は粘膜ライニング（例えば、口腔
粘膜、直腸及び腸粘膜等）を介する吸収等を含むがそれに限定されないあらゆる
適当な経路により投与することができる。
更に、ラット、ヒト又は他の哺乳動物ＮＴ−４又はＮＴ−４ペプチドはあらゆ
る適当な製剤上の担体中で使用することができ、あるキャリアー又は標的指向性
分子（例えば、抗体、ホルモン、成長因子等）と組み合わせても、及び／又はin
vivoで投与前にリポソーム、マイクロカプセル、及び除放製剤の中に封入して
もよい。
更に、ＮＴ−４をコードする核酸及びタンパク質、ペプチド断片、又はそれら
から作られる誘導体、並びにＮＴ−４タンパク質、ペプチド、又は誘導体に対し
て向けられた抗体に関する本発明は、ＮＴ−４発現のパターンの変化と関連して
いる神経系の疾患及び障害の進行状況を診断又は監視するのに使用できる。かか
る変化は、正常人における、好ましくは患者から採取した他のサンプルにおける
、又はより早い時期に同じ患者から採取したサンプルにおける変化と比較した減
少又は増加であってもよい。
本発明の種々の態様においては、ＮＴ−４遺伝子及び相補的配列を含む関連核
酸配列及びサブ配列を診断ハイブリダイゼーション測定法に使用することができ
る。ＮＴ−４核酸配列又は約１５ヌクレオチドを含むそのサブ配列をハイブリダ
イゼーションプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーション測
定法は、ＮＴ−４レベルの変化と関連している症状、障害、又は病状を探り当て
、予測し、診断し又は監視するのに使用できる。例えば、実施例第１０節に示さ
れたデータは、骨格筋並びに前立腺、胸腺及び精巣におけるヒトＮＴ−４の組織
特異的発現を明らかにしている。該筋肉組織におけるヒトＮＴ−４発現のレベル
はニューロン退化の存在又は不存在の指標となり得る。従って、患者
の組織サンプルからのポリ（Ａ）+ｍＲＮＡ又は全ＲＮＡを骨格筋組織内のヒト
ＮＴ−４ｍＲＮＡの存在について分析することができるだろう。更に、実施例第
１０節に示したデータは、ヒト前立腺におけるＮＴ−４の組織特異的発現を明ら
かにしている。ＮＴ−４をコードするＤＮＡ配列又はその一部分、並びにＮＴ−
４タンパク質又はペプチドは、前立腺疾患を治療する治療剤として有用であり得
る。
類似の方法において、診断測定法は免疫測定法であってもよい。かくして、Ｎ
Ｔ−４レベルの変化と関連している症状、障害、又は病的状態を探り当て、予測
し、診断し又は監視するために、抗体を免疫測定法に使用して患者からのサンプ
ル中のＮＴ−４のレベルを定量することができる。
使用できる免疫測定法は、いくつかの例を挙げると、放射性免疫測定法、エリ
ザ（酵素結合免疫吸着測定法）、“サンドイッチ”免疫測定法、沈降反応、ゲル
拡散沈降反応、免疫拡散測定法、凝集測定法、補体結合測定法、免疫ラジオメト
リック測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法、及び免疫電気泳動測
定法の如き技術を使用する競合的及び非競合的測定システムを含む。なお、それ
らに限定されるものではない。
結合ドメインを含有する抗ＮＴ−４抗体断片又は誘導体もかかる測定法におい
て使用できる。
該分子のイディオタイプを含有する抗体断片は既知の技術により生成すること
ができる。例えば、かかる断片は、その抗体分子のペプシン消化によって生成し
得るＦ（ａｂ'）2断片；その抗体分子のジスルフィド橋を還元することにより生
成し得るＦａｂ’
断片及びその抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより生成し得るＦ
ａｂ断片を含む。なお、それらに限定されるものではない。
診断キットも提供される。例えば、そのようなキットは適当な容器の中にＮＴ
−４特異性プローブを含んでもよい。１つの態様においては、該プローブはＮＴ
−４に特異的な抗体である。他の態様においては、該プローブはＮＴ−４核酸配
列にハイブリダイズできる核酸（分子プローブ）である。該プローブは検出でき
るようにラベル化されていてもよく；また、該キットは更に該プローブのラベル
化された特異的結合パートナーを含んでもよい。
上記ハイブリダイゼーション測定法及び免疫測定法は、また、障害、特に運動
ニューロン疾患の治療前後の患者サンプルにおけるＮＴ−４レベルを比較するこ
とによる、治療効力の指標としてＮＴ−４レベルを定量するのに使用してもよい
。
類似の様式においては、筋肉組織におけるヒトＮＴ−４ｍＲＮＡの発現は、治
療を必要とする患者に有効量のＮＴ−４因子を投与して運動ニューロンの生存、
成育、及び／又は分化を助けることを含む、運動ニューロン障害を治療し得る方
法をもたらす。ヒト筋肉内でのＮＴ−４ｍＲＮＡの発現は、ニューロン障害を診
断及び治療するための更なる方法を提起する。逆行軸索輸送（retrograde axona
l transport）はＮＴ−４に特有のものであり得る。ＮＴ−４の特異的逆行輸送
は、ニューロンが正常な又は病的な状態のいずれにおいてＮＴ−４に応答してい
るかを示すのに使用することができる。従って、本発明は、検出できるようにラ
ベル化したＮＴ−４タンパク質又はペプチドを末梢神経の中に注射して、
該ラベル化したＮＴ−４タンパク質又はペプチドが逆行して輸送されるかどうか
を確認することを含み、この際、逆行して輸送されないことが、ＮＴ−４への応
答性の欠如と正の相関関係を有し、ＮＴ−４に関連する末梢神経系障害の存在を
示すものである、ＮＴ−４関連末梢神経系障害を診断する方法を提供する。中枢
神経系障害を診断するのに類似の方法を使用することができる。逆行輸送の評価
は、ＭＲＩ、ＣＡＴ、又はシンチレーション走査を含むがそれらに限定されない
当該技術分野で既知のあらゆる方法によって行うことができる。かかる方法は、
逆行輸送が神経系の病巣に到達する際に実質的に減少する筈なので、該病巣の位
置を特定するのに使用できる。
本発明は、更に、検出できるようにラベル化したＮＴ−４タンパク質、誘導体
又は断片を容器中に含む、かかる逆行輸送の評価のためのキットを提供する。か
かるラベルは放射性同位体又は当該技術分野で既知の他のラベルであってもよい
。
本発明は、ＮＴ−４発現のパターンの変化と関連し得る又はＮＴ−４若しくは
抗ＮＴ−４抗体（又は結合ドメインを含有するその断片）への暴露から利益を受
け得る神経系の疾患及び障害を治療するのに利用できる。我々は、ヒトＮＴ−４
が骨格筋内で発現されることを示す（以下の実施例第１０節を参照のこと）。こ
の発見に基づいて、本発明は運動ニューロン疾患の治療法を提供する。多くの神
経系障害は運動ニューロンに悪影響を及ぼす。例えば、上位運動ニューロンは主
に脳血管の偶発的障害、悪性腫瘍、感染症及び外傷により悪影響を受ける。下位
運動ニューロン、又は前角細胞、はこれら作用により副次的に悪影響を受けるが
、更
に、前角細胞損失が一次的な特徴であって、筋萎縮性側索硬化症、乳児性及び若
年性脊髄性筋萎縮症、ポリオ及びポリオ後症候群、遺伝性運動及び感覚神経疾患
、及び中毒性運動神経疾患（例えば、ビンクリスチン）を含む幾つかの障害を受
ける。本発明により治療できる運動ニューロンの障害は、前述の障害を含むがそ
れらに限定されない。使用できるＮＴ−４タンパク質、誘導体、断片、又はそれ
らに対する抗体の配合及び投与方法は、先に開示したもの又は当該技術分野で既
知のものを含むがそれらに限定されない。
本発明は、また、殆どが５０才を越える男性に発生する未だよく理解されてい
ない共通の症状である、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）の治療にも利用できる。ＢＰ
Ｈにおける前立腺の増殖は、オートクリンループ現象を介してＮＴ−４の如き成
長因子により誘発され得る。ＮＴ−４の合成及び排出の後に、前立腺細胞膜上の
特異的レセプターを介してＮＴ−４が前立腺細胞の中へ逆戻りに輸送されるので
あろう。オートクリンループは、種々の成長因子分子及び腫瘍セルラインについ
て定義されてきた。幾つかの場合には、これらオートクリンループは、該オート
クリンループの分断のためのアンチセンス・アプローチを使用することによって
実験的に定義されてきた。従って、本発明の治療的応用は、前立腺内でのＮＴ−
４ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために、ヒトＮＴ−４に対してアンチセンスである
核酸又はその一部分を使用することを含む（使用できる操作については、１９９
１年７月３日に出願され、参照によってそっくりそのままここに取り込まれる係
属中の米国特許出願第０７／７２８,７８４号を参照のこと）。例えば、正常人
の前立腺におけるＮＴ−４遺伝子の転写レベルと比較して、前
立腺組織におけるＮＴ−４遺伝子の増加した転写により特徴付けられる前立腺局
在疾患を患っている患者に有効量のオリゴヌクレオチドを投与して、前立腺疾患
、好ましくは良性前立腺肥大を治療することができる。該オリゴヌクレオチドは
、少なくとも６ヌクレオチド長で、ＮＴ−４遺伝子のＲＮＡ転写体の少なくとも
一部分と相補的であるべきであり、このことから、該ＮＴ−４転写体にハイブリ
ダイズできるべきである。更に、前立腺細胞膜上のＮＴ−４の特異的レセプター
へのＮＴ−４の結合を阻害するために、抗ＮＴ−４抗体を使用してもよい。ＮＴ
−４アンチセンス核酸又は抗ＮＴ−４抗体のいずれかの治療的有効量は、先に記
載したあらゆる様式で送達することができる。
本発明は、また、他の前立腺関連機能障害、具体的にはインポテンスを治療す
るのに利用することができる。かかる慢性病は前立腺におけるＮＴ−４のレベル
が適度でないことの直接又は間接の結果であり得る。従って、該機能障害の感知
並びに治療的に有効量のＮＴ−４タンパク質又はＮＴ−４の機能断片又は誘導体
の適用を介する患者のインポテンスの治療の両方が、先に記載したいずれかの方
法により可能になる。
本発明は、ヒト胸腺組織におけるＮＴ−４発現の検出を開示している。従って
、本発明は、神経筋接合部におけるシナプス後部のヒダの中にあるアセチルコリ
ンレセプター（ＡＣｈＲ）に関連する重症筋無力症、後天性自己免疫障害を含む
がそれらに限定されない、神経筋伝達に悪影響を及ぼす免疫障害の治療にも利用
できる。該疾患は、ＡＣｈＲに対して特異的な抗体の結合によるシナプス後部Ａ
ＣｈＲ又は筋肉膜の遮断による衰弱及び筋肉疲労と
して現れる。（例えば、ドラックマン（Drachman），1983，Trends Neurosci．6
：446-451を参照のこと）。かかる免疫媒介神経障害の治療は、先に記載したい
ずれかの方法により送達される、ＮＴ−４タンパク質又は機能断片又はＮＴ−４
の誘導体の治療的適用を含む。
本発明は、治療を必要とする患者に、in vitro培養系において証明された、運
動ニューロンの生存、成育及び／又は分化を助けることのできる、有効量のＮＴ
−４タンパク質、誘導体又はペプチド断片を投与することを含む、運動ニューロ
ン障害を治療する方法を提供する。
in vitro態様においては、異なる組織供給源からの又は異なる種からの運動ニ
ューロンが神経栄養因子に対する異なる感受性を示し得るので、神経栄養因子の
有効量はその場その場の基準に基づいて決定するのが望ましい。幾つかの個々の
培養においては、神経栄養因子濃度及び運動ニューロン応答を相互に関連付ける
投与量応答曲線を作るのが望ましいといえる。運動ニューロンの生存、成育及び
／又は分化を評価するために、例えば、生存を評価するための生体色素、位相差
顕微鏡及び／又は神経突起形成を測定するための神経フィラメント染色、又はコ
リンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の如き運動ニューロン結合化合物の
生物活性を測定する技術、又は当該技術分野で既知のあらゆる他の方法を使用し
て、ＮＴ−４タンパク質、誘導体又はペプチド断片に曝された運動ニューロンを
ＮＴ−４タンパク質、誘導体又はペプチド断片に曝されていない運動ニューロン
と比較することができる。ＣＡＴ活性は、例えば、約0.1％トリトンＸ−１００
を含有
する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ8.6）溶液中に処理及び未処理運動ニューロ
ンを採取及び溶解し、数マイクロリッターのアリコートを分離し、そして、基質
として0.2ｍｌ〔１−γＣ〕アセチル−ＣｏＡ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ
臭化コリン、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、及び５０ｍＭ ＮａH2ＰO4（ｐＨ7.4）緩衝
液中の0．1ｍＭネオスチグミンを使用し、参照によりそっくりそのまま本明細書
に組み込まれるフォンナム（Fonnum），1975，J．Neurochem．24：407-409に記
載されたマイクロ−フォンナム操作を使用して、ＣＡＴ活性について測定するこ
とにより、測定される。
本発明の具体的な非限定的態様においては、運動ニューロンを次のようにして
調製し、in vitroで培養することができる。好ましくはラットの如き胚生生体か
ら得られた脊髄の少なくとも一部分を無菌状態で入手し、延髄、知覚神経節、及
び付着髄膜から分離する。次いで、運動ニューロンは脊髄の腹角（前角）に局在
しているので、脊髄の腹側セグメントを単離する。腹索セグメントを小片に切り
、カルシウム及びマグネシウム不含食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の約0.1％
トリプシン及び0.01％デオキシリボヌクレアーゼ・タイプ１中で３７℃で約２０
分間インキュベートする。次いで、該トリプシン溶液を除去し、４５％イーグル
最小必須培地（ＭＥＭ）、４５％ハム栄養混合物Ｆ１２、５％熱不活化ウシ胎児
血清、５％熱不活化ウマ血清、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧ（0.5Ｕ／
ｍｌ）、及びストレプトマイシン（0.5μｇ／ｍｌ）の如き新しい培地中で細胞
を濯いで配置する。パスツールピペットを通して穏やかに粉砕することにより該
組織を機
械的に解離させ、そして上澄み液をプールしてナイロンフィルター（例えば、ニ
テックス（Nitex，Tetko）；４０μｍ）で濾過する。次いで、濾過した細胞懸濁
液をシュナール（Schnaar）及びシャフナー（Schaffner）（1981，J．Neurosci
．1: 204-217）に記載された方法の変法を使用して分画する。全ての工程は４℃
で行われるのが望ましい。メトリザミドをＦ１２：ＭＥＭ培地（１：１）に溶解
し、１８％メトリザミドクッション（例えば、0.5ｍｌ）、３ｍｌの１７％メト
リザミド、３ｍｌの１２％メトリザミド、及び３ｍｌの８％メトリザミドからな
る不連続勾配を設ける。濾過した細胞懸濁液（例えば、2.5ｍｌ）を該段階勾配
上に重層して該試験管をスウィング・アウト・ローター（例えば、ソーバル（So
rvall）ＨＢ４）を使用して２５００ｇで約１５分間遠心分離する。遠心分離は
細胞が３層になるようにする：画分Ｉ（界面０〜８％）、画分II（界面８〜１２
％）及び画分III（界面１２〜１７％）。運動ニューロンが豊富な画分Ｉを少容
量（例えば、約１ｍｌ）に分け、グルタミン（２ｍＭ）、インシュリン（５μｇ
／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ
）、プトレッシン（１００μＭ）、及び亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ、ボッ
テンシュタイン（Bottenstein）及びサトウ，1979，Proc．Natl．Acad．Sci．U.
S.A．76：514-517を参照のこと）を補充した５０％Ｆ１２及び５０％ＭＥＭの如
き無血清規定培地で２回濯ぐ。次いで、トリパンブルー存在下での血球計計数に
より生細胞数を得る。次いで、該運動ニューロン富化細胞懸濁液を、ポリＬ−オ
ルニチン（例えば、１０μｇ／ｍｌ）及びラミニン（例えば、１０μｇ／ｍｌ）
で予備被覆した組織培
養ウェル（好ましくは６ｍｍ）に約１００，０００細胞／ｃｍ2の密度でプレー
トする。次いで、ＮＴ−４タンパク質、誘導体又はペプチド因子を加える。例え
ば、具体的態様においては、約０.０１−１００ｎｇ／ｍ、好ましくは約５０ｎ
ｇ／ｍｌの最終濃度になるようにＮＴ−４を加える。次いで、該運動ニューロン
培養物を無血清規定培地中に３７℃で９５％空気／５％ＣＯ2雰囲気中にほぼ１
００％の相対湿度で維持する。
本発明の更なる態様においては、バクテリオファージＨＧ７−２、ＨＧ４−２
及び／又はＨＧ２−１内に含有される如きＮＴ−４関連組み換え核酸配列をキメ
ラプレプロ／成熟ＮＴ−４遺伝子を構築するのに利用することができる。例えば
、in vivo又はin vitroで成熟ＮＴ−４タンパク質、誘導体又はペプチド断片を
発現することが望まれるときは、別の神経栄養遺伝子のプレプロ領域をＮＴ−４
関連配列の成熟コード領域に融合させることができる。プレプロ領域を供給する
ことのできる神経栄養遺伝子は、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、及びＮＴ−３を含むがそれ
らに限定されない。かかるキメラ構築体は、野生型ＮＴ−４ｍＲＮＡ転写体に比
べてキメラｍＲＮＡ転写体の安定性の増加を促進できるか、翻訳効率を向上でき
るか、又は生物学的に活性な成熟ニューロトロフィンタンパク質若しくはペプチ
ド断片へのタンパク質分解プロセシングのためにより適当な鋳型を生成できるの
で、発現を増加することができる。当業者は、ＮＧＦ（スコット（Scott）ら，1
983,Nature 302: 538-540；ウルリッヒ（Ullrich）ら，1983，Nature 303: 821-
825）、ＢＤＮＦ（ライブロック（Leibrock）ら，1989,Nature 341: 149-152）
及びＮＴ−３（ホーン（Hohn）ら，1990,
Nature 344: 339-341；マイソンピエルス（Maisonpierrs）ら，1990，Science 2 47:
1446-1451；エルンフォース（Ernfors）ら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci
．USA 87：5454-5458；ローゼンタール（Rosenthal）ら，1990，Neuron 4: 767-
773）の如き他のニューロトロフィン遺伝子の公表されたＤＮＡ配列、並びに融
合接合部を生成するための戦略についてのガイダンス（例えば、ダーリング（Da
rling）ら，1983，Cold Spring Harbor Symposium Quantative Biology 48：427
-434；エドワーズ（Edwards）ら，1988，J．Biol．Chem．263: 6810-6815；スー
ター（Suter）ら，1991，EMBO J．10：2395-2400）を与えられれば、かかるキメ
ラ核酸配列を構築するのに必要な知識を有している。他の態様においては、バク
テリオファージＨＧ７−２、ＨＧ４−２及びＨＧ２−１内に含有される如きＮＴ
−４関連組み換え核酸のプレプロ領域を他のニューロトロフィンの成熟領域と融
合するキメラ構築も、先に議論したように、かかる他のニューロトロフィンの効
率的な発現を促進するのに使用できる。
本発明は、また、ＮＴ−４活性を検出又は測定する方法も提供する。実施例１
２に記載したように、ｔｒｋＢがＮＴ−４のための機能的レセプターであること
を見出した。この発見に基づいて、本発明は、ｔｒｋＢを発現する細胞を試験物
質に曝し、そして、ｔｒｋＢへの該試験物質の結合を検出及び測定することを含
み、その際、ｔｒｋＢへの特異的結合が試験物質におけるＮＴ−４活性と正の相
関関係にある、ＮＴ−４活性を検出又は測定する方法を提供する。具体的態様に
おいては、ｔｒｋＢを発現する細胞は、組み換えｔｒｋＢを発現する３Ｔ３線維
芽細胞の如き形質移入さ
れた細胞であるので、該細胞の生存はニューロトロフィン−４又はＢＤＮＦへの
暴露に依存する。かくして、試験物質の結合の検出は、かかる形質移入細胞の生
存を観察することによって行うことができる。
6.実施例：神経成長因子ファミリーの進化論的研究はツメガエルの卵巣において豊富に発現される新しいメンバーを明らかにする
6.1. 原料及び方法
6.1.1. ＤＮＡ調製
標準的操作（ディビス（Davis）ら，1986，“Basic Methods InMolecular Bio
logy”，Elsevier，New York）により、ヒト白血球から及びＳＤラット、カエル
（アフリカツメガエル）及びエイ（Raja clavata）の肝臓からゲノミックＤＮＡ
を単離した。サケ（サケ）から及びクサリヘビ（Vipera lebetina）からもゲノ
ミックＤＮＡを得た。該ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、ガラスフックを使用し
て集め、８０％エタノールで洗浄し、乾燥して、最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになる
ように水中に溶解させた。サケＤＮＡ（シグマ，St．Louis，MO）を水に溶解さ
せ、フェノールで２回及びクロロホルムで１回抽出し、そして、エタノールで沈
澱させた。
6.1.2. ポリメラーゼ連鎖反応、分子クローニング及びＤＮＡ配列決定
アミノ酸配列ＫＱＹＦＹＥＴ（配列番号：１１０）（５’−オリゴヌクレオチ
ド）及びＷＲＦＩＲＩＤ（配列番号：１１１）（３’−オリゴヌクレオチド）（
図１Ａ）に対応する全ての可能な
コドンを表す２８−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの６つの別々の混合物をアプライ
ド・バイオシステムＡ３８１ＤＮＡ合成装置で合成した。該５’−オリゴヌクレ
オチドは合成ＥｃｏＲＩ部位を含有し、該３’−オリゴヌクレオチドは合成Ｈｉ
ｎｄIII部位を含有した（クノス（Knoth）ら，1988，Nucl．Acids．Res．16：10
93；ヌンベルグ（Nunberg）ら，1989，J．Virology 63：3240-3249）。次いで、
オリゴヌクレオチドのそれぞれの混合物を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）を使用して0.8μｇのゲノミックＤＮＡの増幅を開始した（Ｔａｑ ＤＮ
Ａポリメラーゼ、プロメガ（Promega））（サイキ（Saiki）ら，1985，Science 230
：1350-1354）。該ＰＣＲ生成物をＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩで制限し、２
％アガロースゲル上で分析してプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ+（スト
ラタジェン（Stratagene），La Jolla，CA）の中にクローン化した。該増幅領域
＋プライマーの大きさは、ＮＧＦについては１７９塩基対（ｂｐ）でＢＤＮＦ及
びＮＴ−３については１８２塩基対である。幾つかの場合においては内部Ｅｃｏ
ＲＩ部位の結果として、１４４ｂｐ及び９５ｂｐのより短い断片も単離された。
該クローン化したＤＮＡ断片をＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（ファルマシア，Uppsal
a）でのジデオキシヌクレオチド連鎖停止法（サンガーら，1977，Proc．Natl．A
cad．Sci．U.S.A．74:5463-5457）を使用して配列決定した。２〜２０の独立ク
ローンはそれぞれの遺伝子及び種について配列決定し、２００を越える独立クロ
ーンは全体で配列決定した。
ファージλＥＭＢＬ−３のＢａｍＨＩ部位におけるＭｂｏｌ消化ゲノミックＤ
ＮＡの挿入により調製したツメガエルゲノミック
ライブラリーからの約２,０００,０００クローンを、約５×１０8ｃｐｍ／μｇ
の比活性までニックトランスレーションにより〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰでラベルし
たツメガエルＮＴ−４の１８２ｂｐＰＣＲ断片での慣用操作を使用してスクリー
ニングした。４×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン
酸ナトリウム（ｐＨ7.0））、４０％ホルムアミド、１×デンハルツ溶液、１０
％デキストラン硫酸中、４２℃でハイブリダイゼーションを行った。該フィルタ
ーを５５℃で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ中で洗浄し、−７０℃でコダックＸＡＲ
−５フィルムに曝した。８個のファージクローンを単離し、これらクローンのう
ちの１つからのハイブリダイズする1.5ｋｂのＰｓｔＩ断片をプラスミドｐＢＳ
−ＫＳ（ストラタジェン）の中にサブクローン化した。該サブクローン化した断
片のヌクレオチド配列をジデオキシ連鎖停止法（サンガーら，1977，Proc．Natl
．Acad．Sci．U.S.A．74:5463-5457）により決定した。
6.1.3. 配列データのコンピューター解析
表Ｉに示したＤＮＡ及びアミノ酸配列の比較及び整列化は、ＵＷＧＣＧソフト
ウェアーを使用したＶＡＸコンピューターで行った（デベレウクス（Devereux）
ら，1984，Nucl．Acids Res．72:387-395）。ＵＷＧＣＧプログラムを使用した
アミノ酸配列の比較の結果は、保存アミノ酸の変化を考慮に入れて、配列間のア
ミノ酸類似性又はヌクレオチド同一性の％として出した（グリブスコフ（Gribsk
ov）及びバーゲス（Burgess），1986，Nucl．Acids Res．14：6745-6763；シュ
ワルツ（Schwartz）及びデイホフ（Dayhoff），1979,“An Atlas of Protein Se
quence and Structure”，ed.，
Natl．Biomed．Res．Found.，Washington D.C.，pp.353-358）。フィログラム（
phylogram）構築のためにパルシモニー（Parsimony）（ＰＡＵＰ版３.０ｆ）を
使用した進化系統的解析を使用した（フェルセンシュタイン（Felsenstein），1
988；Annu．Rev．Gene．22：521-555；スオフォード（Swofford）及びオルセン
（Olsen），1990，“Molecular Systematics,”Hills and Moritz，Eds.，Sunde
rland，MA.，Sinaver Assoc.，Inc．pp.441-501）。徹底的かつ発見的（分岐交
換法（branch swapping））アルゴリズムを使用して、最も蓋然性の高い進化系
統樹について調査した。
6.1.4. 組み換えタンパク質の産生、ＰＣ１２細胞への結合分析、及び神経栄養活性の分析
ＣＯＳ細胞内での組み換えタンパク質の一過性発現のために、適当なＤＮＡ断
片をベクターｐＸＭ内でクローン化した（ヤング（Yang）ら，1986，Cell 47：3
-10）。ＮＴ−４については、ツメガエルからの配列決定した１.５ｋｂのＰｓｔ
Ｉ断片をｐＸＭ内にクローン化し、ＮＧＦについては、ラットＮＧＦ遺伝子の３
’エキソンからの７７１ｂｐのＢｓｔＥII−ＰｓｔＩ断片を使用した（ハルブッ
ク（Halbook）ら，1988，Development 108: 693-704）。ＢＤＮＦタンパク質を
発現するために、マウスＢＤＮＦ遺伝子からのプレプロＢＤＮＦコード配列を含
有するＰＣＲ増幅断片（ホファー（Hofer）ら，1990，EMBO J．9: 2459-2464）
もｐＸＭ内にサブクローン化した。ＮＴ−３については、１０２０ｂｐのラット
ｃＤＮＡクローンをｐＸＭ内に挿入した（エルンフォースら，1990，Proc．Natl
．Acad．Sci．U.S.A．87：5454-5458）。
約７０％集密度まで成育したＣＯＳ細胞（グルツマン（Gluzman）
，1981，Cell3: 175-182）を１００ｍｍディッシュ当たり２５μｇのプラスミド
ＤＮＡでＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキン・プロトコールを使用して形質移
入した（ルスマン（Luthman）及びマグヌソン（Magnusson），1983，Nucl．Acid
s Res．17：1295-1305）。次いで、形質移入した細胞を完全培地（ＤＭＥＭ＋１
０％ＦＣＳ）中で成育させ、形質移入後３日目に馴化培地を集めた。並行して形
質移入した培養皿（３５ｍｍ）を形質移入後３夜目までかけて２００μＣｉ／ｍ
ｌ〔35Ｓ〕システイン（アマルシャム，UK）の存在下で成育させた。in vivoで
ラベル化した馴化培地のアリコート（各１０〜２０μｌ）を１３％ポリアクリル
アミドゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。該ゲルをエンハンス（EnHanc
e）（ニューイングランド・ヌクレアー，ボストン，MA）で処理し、乾燥し、そ
して増感板を用いてコダックＸＡＲ５フィルムに２４〜４８時間８０℃で露光し
た。島津デンシトメーターでオートラジオグラフを走査し、異なる組み換えタン
パク質の相対量を、各タンパク質に対応する面積をラットＮＧＦで得られた面積
と比較して計算することにより見積もった。ラットＮＧＦタンパク質の絶対量は
、精製したマウスＮＧＦの標準品を使用した馴化培地の定量的免疫ブロット法に
より評価し、他の組み換えタンパク質を含有するサンプル中の該タンパク質濃度
を測定するのに使用した。
ＰＣ１２細胞（グリーン（Greene）及びティシュラー（Tischler），1976，Pr
oc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．73:2424-2428）への組み換えタンパク質の結合分
析については、マウスＮＧＦを125ＩでクロラミンＴ法により７×１０7ｃｐｍ／
μｇの平均活性までラベル化した。１×１０4細胞／ｍｌ、１.５×１０-9Ｍ125
Ｉ−ＮＧＦ；及び等量のＮＧＦ又はＮＴ−４を含有する連続希釈した馴化培地を
使用して３７℃又は０℃で行った競合的分析法で定常状態の結合を測定した。全
成分を同時に添加し、平衡に達した（１〜３時間のインキュベーション）後、遠
心分離により細胞を集めた。擬似形質移入ＣＯＳ細胞からの培地を使用した対照
実験により、該馴化培地に存在する他のタンパク質はＰＣ１２細胞への125Ｉ−
ＮＧＦの結合に関して何の作用も持たないことが明らかになった。少なくとも１
０００倍過剰の未ラベル化ＮＧＦを添加した並行インキュベーションにおいて、
非特異的結合を測定した。常に全結合の１０％未満であるこの非特異的結合につ
いて、全ての結果を補正した。
異なるタンパク質の生物学的活性を、等量の組み換えタンパク質を含有する形
質移入ＣＯＳ細胞馴化培地の、Ｅ９ニワトリ胚体から移植された交感神経結節及
び背根神経節からの神経突起成長を剌激する能力により測定した（エベンダル（
Ebendal），1984,“Organizing Principles of Neural DevelopmenC”，S．Shar
ms，ed.，New York：Plenum Publishing Corp.，pp.93-107；エベンダル，1989,
“Use of Collagen Gels to Bioassay Nerve Growth Factor Activity In Nerve
Growth Factors”，R．A．Rush，ed．（キケスター（Chichester）：John Wile
y & Sons，pp.81-93）。連
続希釈した馴化培地を分析して線維の成長を計数した。
6.1.5. ＲＮＡ調製及びブロット分析
成体ツメガエルのメスからの示した組織を切除して液体窒素中で凍結した。脳
及び脊髄をプールした。異なる段階の卵母細胞を含む卵巣の幾つかの裂片を切除
した。凍結した組織サンプルを４Ｍグアニジンイソチオシアネート、０.１Ｍβ
−メルカプトエタノール、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７.０）中でホ
モジナイズし、ポリトロン（Polytron）を用いて３回１５秒間ホモジナイズした
。それぞれのホモジネートを０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ５.５）中の
５.７Ｍ ＣｓＣｌのクッション４ｍｌ上に重層し、ベックマンＳＷ４１ロータ
ーで、１５℃、３５,０００ｒｐｍで７６時間遠心分離した（チャーウィン（Chi
rgwin）ら，1979，Biochemistry 78：5294-5299）。ポリ（Ａ）+ＲＮＡをオリゴ
（ｄＴ）セルロース・クロマトグラフィーにより精製し（アビブ（Aviv）及びレ
ダー（Leder），1972，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．69：1408-1412）、ＲＮ
Ａブロット分析に使用する前に分光光度計でＲＮＡの回収率を定量した。各サン
プルからのポリ（Ａ）+ＲＮＡ（１０μｇ）を０.７％ホルムアルデヒドを含有す
る１％アガロースゲルで電気泳動した。染色したゲルのＵＶ透視法を使用して全
てのサンプルがほぼ同量の完全なＲＮＡを含有していることを確認した。次いで
、該ゲルをニトロセルロースフィルターに移した。該フィルターを示したＤＮＡ
プローブとハイブリダイズさせた。該プローブを〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰでニック
トランスレーションにより約５×１０5ｃｐｍ／μｇの比活性までラベル化し、
上に記載したようにしてハイブリダイゼーションを行
った。フィルターを高ストリンジェントで洗浄し（０.１ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤ
Ｓ、５４℃）、コダックＸＡＲ−５フィルムに露光した。
6.2. 結果
ヒト、ラット、ヘビ、カエル及び魚からのＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３をコ
ードするＤＮＡ断片を、上流プライマーについてはリシン５０とトレオニン５６
の間及び下流プライマーについてはトリプトファン９９とアスパラギン酸１０５
の間に位置するこれら３つのタンパク質中の保存領域から、縮重したプライマー
でのＰＣＲ法を使用して単離した（図１Ａ）。該増幅領域は６つのシステイン残
基のうちの３つを含有し成熟分子の約１／３に及ぶ。異なる種からの既に特徴付
けされたＮＧＦ分子内の該増幅領域の比較により、それが２つの可変領域、アル
ギニン５９〜セリン６７及びアスパラギン酸９３〜アラニン９８を含有している
ことがわかる。該分子の表面上に現れると考えられる親水性領域（ブラッドシャ
ウ（Bradshaw），1978，Ann．Rev．Biochem．47:191-216）、並びに高度に保存
された領域であるグリシン６８〜トリプトファン７６及びトレオニン８５〜トレ
オニン９１も該増幅領域に含まれている。ＢＤＮＦ及びＮＴ−３分子は、該増幅
領域にも含まれているマウスＮＧＦタンパク質の位置９４と位置９５の間の１つ
の余分なアミノ酸を有している。
マウスＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３タンパク質の完全な成熟分子の配列を、
該増幅領域がどのようにして該完全分子を表象するかを解明するために比較した
。該完全成熟分子は、ＮＧＦとＢＤＮＦの間では６５／５７％類似性（アミノ酸
配列類似性／ヌク
レオチド配列同一性）、ＮＧＦとＮＴ−３の間では７０／６１％類似性、そして
ＢＤＮＦとＮＴ−３の間では６８／５８％類似性を示す。この研究で単離された
領域を比較すると、ＮＧＦとＢＤＮＦの間の類似性は６２／５３％であり、ＮＧ
ＦとＮＴ−３の間のそれは６７／５８％であり、そして、ＢＤＮＦとＮＴ−３の
間のそれは６９／６０％である。このことは、この研究で単離された領域はその
完全分子を表象するものであること及びそれは異なる因子間の進化論的関係をモ
ニターするのに使用できることを強く示唆している。シュワルツ及びデイホフの
比較マトリックス（1979,“An Atlas of Protein Sequence and Structure”，e
d.，Natl．Biomed．Res．Found.，Washington D.C.，pp.353-358）を使用して、
保存アミノ酸の置換を考慮に入れつつ対ごとに配列の比較を行った（表Ｉ）。従
って、以下に示しかつ表Ｉに示したアミノ酸配列の比較は、同一性ではなく類似
性の％を示すものである。進化系統樹をパルシモニー解析を用いて構築した（フ
ェルセンシュタイン，1988；Ann．Rev．Genet．22：521-555；スオフォード及び
オルセン，1990，“Molecular Systematics,”P.M．Hills and C．Moritz，Eds.
，Sunderland，MA.：Sinaver Assoc.，Inc.pp.441-501）。以下に示すように、
ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３のアミノ酸配列に関連する推定アミノ酸配列を有
する全ての単離したＤＮＡ断片は、保存されたシステイン残基を正しい位置に含
有している。これは、神経成長因子遺伝子ファミリーのメンバーと考えられる配
列についての最初の判定基準として用いられた。
6.2.1. ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＤＮＦ／ＮＴ−３は進化の間高度に保存されている
6.2.1.1. 神経成長因子
ＮＧＦをコードする単離した断片のヌクレオチド配列（図１Ｂ〔ヒト（配列番
号：３）、ラット（配列番号：４）、ニワトリ（配列番号：５）、クサリヘビ（
配列番号：６）、ツメガエル（配列番号：７）、サケ（配列番号：８）〕）及び
その推定アミノ酸配列は、魚からヒトまで高度に保存されている（図２〔ヒト（
配列番号：２４）、ラット（配列番号：２５）、ニワトリ（配列番号：２６）、
クサリヘビ（配列番号：２７）、ツメガエル（配列番号：２８）、サケ（配列番
号：２９）〕）。殆どの非保存アミノ酸の変化は、可変領域であるアルギニン５
９〜セリン６７及びアスパラギン酸９３〜アラニン９８（図２）においてみられ
た。ツメガエルとヒトＮＧＦ配列の間の類似性は９３／７９％である（表Ｉ）。
ツメガエルとニワトリＮＧＦは、リシン６２からアルギニン６２への１つの保存
的変化を除いては同一である（図２）。クサリヘビとサケＮＧＦの配列は、ヒト
ＮＧＦと比較してそれぞれ（４２のうち）１１及び１９のアミノ酸の差異を含ん
でいるが、他の全ての種は４の差異を示したに過ぎない。単離したＮＧＦアミノ
酸配列のどれも、ヒトＮＧＦ配列のグルタミン酸９４とリシン９５の間にＢＤＮ
Ｆ及びＮＴ−３において存在する余分のアミノ酸残基を含有していなかった。
異なるＮＧＦ配列の種間関係を進化系統樹（図３Ａ）の構築により分析した。
サケＮＧＦ配列は、他の種から単離したＮＧＦ配列よりも多くずれているようで
ある。エイからは、記載したＰＣＲ法を使用してＮＧＦ配列を単離することがで
きなかった。これは、エイＮＧＦ配列が、我々のＰＣＲプロトコールで使用した
プ
ライマーのミスマッチ許容度を上回っていたことを示唆している。一方、軟骨魚
綱の魚におけるＮＧＦの不存在は、硬骨魚への進化の枝分かれ（約４億５千万年
前）後であるがこの枝分かれから進化した両生綱及び高等脊椎動物の進化（約４
億年前）の前にＮＧＦが現れたことを意味している。
ヌクレオチド同一性とアミノ酸類似性は、ＶＡＸコンピューターで（ＵＷＧＣＧ
からのソフトウェアーパッケージ；デベレウクスら，1984，Nucl．Acids Res．1 :
387-395）、シュワルツ及びデイホフの比較マトリックス（1979，Washington
D.C．Nat'l Biomed．Res．Found.，pp.353-358）に従い、保存アミノ酸の変化を
考慮に入れて計算した。対角線下方の数字はヌクレオチド同一性％を示す。対角
線上方の数字はアミノ酸類似性％を示す。×はそれら種から配列が単離されなか
ったことを示す（エイからのＮＧＦ及びクサリヘビからのＮＴ−３）。
6.2.1.2. 脳誘導神経栄養因子
研究した全ての種において、ヒトＢＤＮＦのＤＮＡ配列に類似するＤＮＡ配列
が見出された（図１Ｂ〔先に掲げた配列番号：１〜２１〕）。研究した最も原始
的な種であるエイとヒトの間のアミノ酸及びヌクレオチド配列における類似性は
９３／７７％である（表Ｉ）。２つだけの非保存的変化が可変領域の外側に見ら
れたのに反して、１０の類似する変化が２つの可変領域内に見出された（図２）
。ツメガエル（配列番号：３４）では、ロイシン９０が、そのコドンの第１番目
の位置におけるＣからＴへの１個の塩基対突然変異の結果としてフェニルアラニ
ンに置き換えられており、サケ（配列番号：３５）では、トリプトファン７７が
、そのコドンがＴＧＧからＴＡＴへ変化する２個の突然変異の結果としてチロシ
ンに置き換えられている（図１Ｂ〔配列番号：１４〕）。単離した全ての配列は
、ＮＧＦと比較して位置９６に余分のアミノ酸残基を含有した（図２〔配列番号
：２４〜２９〕）。異なる種からのＢＤＮＦ配列は、パルシモニー法により解析
したと
きに、同種群の配列として現れた（図３Ｂ）。
6.2.1.3. ニューロトロフィン−３
ヒト（配列番号：１６及び３７）、ラット（配列番号：１７及び３８）、ニワ
トリ（配列番号：１８及び３９）、ツメガエル（配列番号：１９及び４０）、サ
ケ（配列番号：２０及び４１）及びエイのＮＴ−３についてのヌクレオチド及び
推定アミノ酸配列は非常に類似している（図１Ｂ、図２）。違いの殆どは、コド
ンの３番目の位置における変化から生じるサイレント突然変異であり、通常は、
該塩基対のピリミジン性又はプリン性を保持する変化である。２つの可変領域内
で非保存的アミノ酸変化が見出されたのみで、２つの可変領域の外側ではアミノ
酸置換は見られなかった。サケの配列は、他の全てのＮＴ−３分子に存在するＡ
ｓｐ−９４を欠いており（図２）、進化系統樹における分岐点からの距離は、他
の種からのＮＴ−３配列より長い（図３Ｃ）。
6.2.1.4. 神経成長因子遺伝子ファミリーの新規メンバー
クサリヘビ（配列番号：１）及びツメガエル（配列番号：２）から追加のＤＮ
Ａ断片を単離し、その推定アミノ酸配列（それぞれ配列番号：２２及び配列番号
：２３）は、これら断片がＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３におけるのと同じ位置
に全３つのシステイン残基を含有していることを明らかにした（図１Ｂ，図２）
。ツメガエルＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３の配列との比較は、この新たな配列
がＮＧＦファミリーの他のメンバーの配列に関連しているが同一ではないことを
示した。従って、この配列を含む遺伝子をニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）
と名付けた。ヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較して、ツメガエル及びクサリ
ヘビの
ＮＴ−４が９１／７３％類似していることが分かった。この類似性は、ツメガエ
ルとクサリヘビのＮＧＦ及びＢＤＮＦの間に見られるものと同じ範囲内にある（
表Ｉ）。ＮＧＦファミリーの他のメンバーについては、２つの可変領域において
非保存的アミノ酸変化が見られただけである（図２）。
6.2.1.5. 神経成長因子遺伝子ファミリー中のメンバーの比較及び系統学
ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３についての進化系統樹を比較すると、ＮＧＦの
進化系統樹の枝がより長いことが分かり、進化論的変化の速度がより高いことを
示している（図３Ａ〜３Ｃ）。ＮＧＦファミリーのそれぞれのメンバーの他のメ
ンバーに対する関係を、該ファミリーの４メンバーについて推定アミノ酸配列を
比較するフィログラムを構築することにより検討した。該フィログラムは、ＮＧ
ＦがＢＤＮＦ及びＮＴ−４よりもＮＴ−３により密接に関連していることを示し
た（図３Ｄ）。ＮＴ−３は、ＢＤＮＦと同じ程度にＮＧＦに関連している。ＮＴ
−４は、明らかに、他の２メンバーよりもＢＤＮＦにより関連している。
6.2.2. ＮＴ−４タンパク質の構造的特徴
ＮＴ−４遺伝子及びその遺伝子産物のより詳細な特徴付けを可能にするため、
我々は、ＮＴ−４ＰＣＲ断片でツメガエルのゲノミックライブラリーをスクリー
ニングし、１６ｋｂ挿入体を含有するファージクローンを単離した。この挿入体
から、１.５ｋｂＰｓｔｌ断片をサブクローン化し、図４Ａに配列決定をした（
配列番号：４３）。該ヌクレオチド配列は、ＮＧＦファミリーの他のメンバーを
特徴付ける多くの構造的特徴を示す２３６アミノ酸タ
ンパク質（配列番号：４４）をコードするオープンリーディングフレームを含有
した。推定ＮＴ−４タンパク質のアミノ末端は、１８アミノ酸の推定上のシグナ
ル配列を含有し、その４アミノ酸の領域がブタ及びラットＢＤＮＦにおける対応
する領域と同一である（レイブロック（Leibrock）ら，1989，Nature 341, 149-
152；マイソンピエール（Maisonpierre）ら，1990，Science，247, 1446-1451）
。ＢＤＮＦ（図４Ａ）について提案されているものとやはり同一である潜在的な
開裂シグナル部位が次に続く。１２３アミノ酸成熟ＮＴ−４タンパク質について
の潜在的な開裂部位が、プレプロ−ＮＴ−４タンパク質中のアミノ酸１１３の後
に見出される。１個の推定Ｎ−グリコシル化部位（Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）が
推定上の開裂部位の８アミノ酸前に位置している。
成熟ＮＴ−４タンパク質をマウスからの成熟ＢＤＮＦ、ＮＴ−３及びＮＧＦタ
ンパク質と比較すると、それぞれ６０％、５８％及び５１％アミノ酸同一性であ
ることが明らかになった。成熟ＮＴ−４タンパク質に含まれるのは、ジスルフィ
ド橋の形成に関与する全６システイン残基である〔図４Ｂ（配列番号：４５〜４
８）〕。ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３の間で同一の領域も、ＮＴ−４タンパク
質において類似している。ＮＴ−４タンパク質と他の３つのタンパク質の間の殆
どの配列差異は、該ファミリーの他のメンバー中でかつて同定された同じ可変領
域内に見出された。
6.2.3. ＮＧＦ−Ｒへの結合及びＮＴ−４の神経栄養活性
１.５ｋｂツメガエルＰｓｔｌ断片を発現ベクターｐＸＭ内でクローン化して
（ヤングら，1986，Cell 47：3-10）ＣＯＳ細胞内で一過性発現した。〔35−Ｓ
〕システインでラベル化した形質移
入細胞からの馴化培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１４ＫのＭｒを有するＮＴ−４タ
ンパク質を示した（図５Ａ）。並行培養皿において産生及びラベル化したＮＧＦ
タンパク質はＮＴ−４タンパク質より幾分速く移動した。移動性におけるこの差
は、２つのタンパク質の電荷における差によるものと考えられる。類似の移動性
の差が、異なる種からの同じ大きさを有するＮＧＦタンパク質についても認めら
れている。
同量のラットＮＧＦ及びツメガエルＮＴ−４タンパク質を含有する形質移入Ｃ
ＯＳ細胞からの馴化培地を、ＰＣ１２細胞上のＮＧＦのレセプターへの125Ｉラ
ベル化ＮＧＦの結合について競合するそれらの能力について試験した。結合測定
は、３７℃で及び該細胞に結合した125Ｉ−ＮＧＦの８０％が低親和性ＮＧＦ−
Ｒに結合する条件下で行った（サッター（Sutter）ら，1979，J.Biol．Chem．25 4,
3972）。ＰＣ１２細胞から５０％の125Ｉ−ＮＧＦを追い出すのに、同じ濃度
のＮＧＦ及びＮＴ−４（６×１０-10Ｍ）が必要であった。これは、該２つのタ
ンパク質が同様な親和性で低親和性ＮＧＦ−Ｒと結合することを示している（図
５Ｂ）。より高い濃度では、ＮＴ−４タンパク質は125Ｉ−ＮＧＦを追い出すの
にあまり有効ではなかった。これは、この場合には、該細胞に結合したままの12 5
Ｉ−ＮＧＦが高親和性又は内面化したレセプターに結合したことを示唆してい
る。膜の可動化又は内面化（インターナリゼション）が起こらない０℃で行った
並行分析ではこの差異が見られなかったという事実が、高親和性レセプターによ
り独占的に媒介されていることが知られているプロセス、つまり、内面化につい
ては、ＮＴ−４タンパク質はＮＧＦと競合
することができないことを示唆している（オレンダー（Olender）及びスタック
（Stach），1980，J．Biol．Chem．255, 9338-9343；バーンド（Bernd）及びグ
リーン（Greene），1984，J．Biol.Chem．259, 15509-15516；ホサン（Hosang）
及びショーター（Shooter），1987，EMBO J．6,1197-1202）。
ＣＯＳ細胞内で一過性発現したＮＴ−４タンパク質を、移植した胚生ヒヨコ神
経節からの神経突起発育を促進するその能力について試験した。移植したニワト
リ背根神経節からの神経突起成長の明かな剌激が見られた（図６Ａ）。同量のＮ
Ｔ−４及びＮＧＦタンパク質を使用した投与量−応答曲線を比較して、ＮＴ−４
で得られる活性はＮＧＦで見られる活性よりも低いことが明らかになった（図５
Ａ及び５Ｂ）。組み換えＮＴ−４及びＢＤＮＦタンパク質は、背根神経節におけ
る神経突起成長を同様な程度にまで剌激した（図６Ａ及び６Ｃ）。ＮＴ−４タン
パク質は、弱いけれども終始変わらない神経突起成長を結節性神経節から引き出
した（図６Ｇ）のに反して、交感神経節においては如何なる活性も検出されなか
った（図６Ｅ）。これは、交感神経節からの神経突起成長を顕著に剌激するＮＧ
Ｆ（図６Ｆ）及び結節性神経節において明かな活性を示すＮＴ−３（図６Ｈ）と
対照をなしている。ＮＴ−４については、結節性神経節におけるＢＤＮＦの神経
突起成長促進活性（図６Ｉ）はＮＴ−３で見られる活性よりも低かった。
6.2.4. 異なるツメガエルの組織内でのＮＴ−４ｍＲＮＡの発現
１１の異なるツメガエル組織からポリアデニル酸化ＲＮＡを調製してノーザン
ブロット法に用いた。ツメガエルＮＴ−４プローブでのハイブリダイゼーション
で、卵巣において２.３ｋｂ及び６.
０ｋｂの高レベルの２つのＮＴ−４転写体が明かとなった（図７Ａ）。対照的に
、ＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルは、分析した他の全ての組織において検出限界以下
であった。ツメガエルＮＧＦプローブでのハイブリダイゼーションでは、心臓（
図７Ａ）及び脳において１.３ｋｂのＮＧＦｍＲＮＡが示された。しかしながら
、これら組織におけるＮＧＦｍＲＮＡの量は、卵巣におけるＮＴ−４ｍＲＮＡの
レベルよりも１００倍のオーダーで低かった。ＮＧＦｍＲＮＡも卵巣において検
出されたが、ＮＧＦｍＲＮＡの量はこの組織におけるＮＴ−４ｍＲＮＡのレベル
よりも約１００倍低かった。（図７Ｂ）。卵巣におけるＢＤＮＦ及びＮＴ−３ｍ
ＲＮＡのレベルは、いずれもその検出限界以下であった（図７Ｂ）。
6.3. 考察
我々は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を縮重オリゴヌクレオチドプライマ
ーと組み合わせて使用して、異なる種からＮＧＦファミリーの異なるメンバーの
ための遺伝子を単離した。完全な成熟ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３タンパク質
のヌクレオチド及びアミノ酸配列の比較により、得られた類似性がこの研究で分
析した遺伝子の領域を比較することにより得られた類似性と同じであることが明
らかになった。これから、この領域が該遺伝子の残余をも表象していると考えら
れ、従って、該完全成熟タンパク質の進化論的保存を研究するのに使用できる。
異なる種からのＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３遺伝子は、魚と哺乳動物の間の
完全な同一性を示す領域、並びにより低い類似性を有する領域を含む。異なる種
からのＮＧＦ配列の、ＢＤＮＦ又はＮＴ−３の対応する配列との比較により、脊
椎動物においては、
ＮＧＦ遺伝子はＢＤＮＦ及びＨＤＮＦ／ＮＴ−３のいずれよりも保存されていな
いことが示された。後者の２つの遺伝子は、ＮＴ−３がＢＤＮＦよりもあまり保
存されていないサケを除く、研究した全ての種において等しく保存されているよ
うである。このような関係においては、幾つかの枝、特にＮＧＦにおいて分子時
計が速度を上げているが他においてはそうではないように見えるという事実につ
いて推測するのは興味のあることである。タンパク質の正確な三次構造を保存す
る選択力が存在すると一般に考えられている（ディッカーソン（Dickerson），1
971，J．Mol．Evol．1, 26-45；キムラ及びオオタ，1974，Proc．Natl．Acad．S
ci．USA，71：2848-2852）。該３因子の進化論的保存における差異は、ＮＧＦ遺
伝子に対するよりもＢＤＮＦ及びＮＴ−３に対してより強い選択圧が存在したこ
とを示唆している。環境的変化が、特定の遺伝子産物の最適性能を変更する選択
圧の変化をもたらすものと提案されてきた（キムラ1983，“Evolution of Genes
and Proteins”，pp.208-233）。このような関係においては、ＢＤＮＦ及びＮ
Ｔ−３と比較してＮＧＦでみられるより広範な進化論的変化は、進化の間にＮＧ
Ｆの機能がより多く変化してきたという事実を反映したものと言える。ＮＧＦの
構造−機能の研究は、この分子がその活性プロフィールの低下又は修飾を伴わず
にかなりの構造的変化を許容できることを示してきた。このことは、ＮＧＦの進
化論的保存の程度が低いのはこのタンパク質のより安定な構造、従って、置換に
よりあまり簡単には掻き乱されない構造によるのであろうとの示唆を与える。も
う１つの考え得る説明は、異なる因子の遺伝子が位置しているゲノムのその領域
が、異なる一般的
突然変異率を有しているというものである。異なる突然変異率はゲノムの非コー
ド領域について明らかにされてきた（ヴォルフ（Wolfe）ら，1989，Nature，337 :
283-285）が、これがコード領域において変化の数を増加させるかどうかあま
り明かではない。
サケＮＧＦ及びＮＴ−３は、他の種におけるこれら分子と比較した場合、特に
より多く異なっている。ＮＧＦ中のトレオニン８２及び位置８５〜８７における
ヒスチジン−トレオニン−フェニルアラニンを含む幾つかのアミノ酸、並びに（
他の２つのタンパク質と比較して）位置９４及び９５の間のアミノ酸の不存在は
、ＮＧＦタンパク質の一貫した特徴である。単離したサケの配列がこれらＮＧＦ
に特異的な特色の全てを含んでいるという事実は、それが該ファミリーの付加的
メンバーでななく、むしろサケＮＧＦを代表していることを物語る。研究した他
の全てのＮＴ−３配列と対照的に、サケＮＴ−３は位置９５においてアミノ酸を
欠いている。エイＮＴ−３には余分のアミノ酸が存在するので、エイ及びサケの
共通の祖先は、位置９５において該余分なアミノ酸を含む祖先ＮＴ−３配列を有
していたらしい。従って、サケＮＴ−３分子における該変化は、この遺伝子が共
通の祖先から分かれた後に起こったに違いない。サケの配列のアミノ酸の変化の
殆どは、程度は低いものの他の種においても変化している同じ領域内にあり、単
離したサケＮＧＦ及びＮＴ−３配列は偽遺伝子ではないことを強く示唆している
。他の種と比較してサケＮＧＦ及びＮＴ−３が広く拡散しているのは、おそらく
硬骨魚が進化論的に高度に発展していることを反映しているのであろう。
この研究の結果は、ＮＧＦファミリーが、５億年前に、今日の
高等脊椎動物の祖先であった原始魚類におそらく存在していたであろうことを示
している。該遺伝子ファミリーは、新たな遺伝子が発達する最もありふれたメカ
ニズムであると考えられる遺伝子重複により形成されていたのであろう（リ（Li
，W.），1983，“Evolution of Genes and Proteins”，pp.14-37）。生物学的
に活性なタンパク質の合成に必要な全ての情報が３’エキソン中に含まれている
ので、機能性遺伝子の重複は促進されただろう（ハルブックら，1988，Mol．Cel
l．Biol．8: 452-456；レイブロックら，1989，Nature 341, 149-152；ホーン（
Hohn）ら，1990，Nature 344: 339-341）。該ファミリーの形成は、多くの遺伝
子重複を含んでいる（図３Ｄ）。
ＮＴ−４は、ＮＴ−３又はＮＧＦよりもＢＤＮＦにより密接に関連しているの
で、ＮＴ−４とＢＤＮＦは共通の祖先遺伝子から形成されたと考えられる。しか
しながら、現在のデータからは４因子全てについての先祖様分子を識別すること
はできないので、ＮＧＦ及びＮＴ−３の祖先に対する推定上のＢＤＮＦ／ＮＴ−
４祖先の進化論的関係を明確に確立することはできない。異なる種からのデータ
を使用するフィログラムのトポロジーは、異なる種間のコンセンサスのとれた進
化論的関係と大体一致している。しかしながら、ＮＧＦとＢＤＮＦの両方につい
ては、ニワトリの配列がフィログラムにおいて予測よりも早い分岐を示している
。クサリヘビ及びツメガエルからのＮＴ−４、ＮＧＦ及びＢＤＮＦの比較により
、これら種におけるＮＴ−４配列が、ＮＧＦ及びＢＤＮＦそれぞれの９及び８置
換に比較して、１１のアミノ酸置換を有していることが明らかになった。このこ
とは、これら種におい
て、ＮＴ−４は、ＮＧＦ又はＢＤＮＦ拡散の速度に匹敵するか又はそれより速い
速度で拡散してきたことを示唆する。
ＮＧＦ分子において高度に保存されたアミノ酸の置換はその生物学的活性を破
壊しないが、多くの場合、産生するタンパク質の量に悪影響を及ぼし、ＮＧＦタ
ンパク質の保存にとって重要であり得るタンパク質安定性の如き生物学的活性以
外の抑制が存在することを示している。更に、ＮＧＦファミリーの全メンバーが
低親和性ＮＧＦ−Ｒと相互作用できるという事実は、これら因子における一定の
領域の完全な保存が、ＮＧＦ−Ｒと相互作用できるタンパク質を保持するための
これら遺伝子への抑制によるものであり得ることを示唆している。胚の初期個体
発生のための基礎的なメカニズム及びストラテジーは全ての脊椎動物において類
似しており、おそらくは、全ての脊椎動物に保存されている遺伝子に関連してい
る。従って、神経栄養因子の進化論的保存は、それらが多くの異なる種における
初期胚発生に重要であるという説と一致している。
海馬は、脳において最高レベルのＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３、ｍＲＮＡを
含有している（エルンフォースら，1990 J．Dev．Neurosci．9, 57-66）。それ
は、両生類及び爬虫類の脳に最初に現れた、原皮質から誘導された高度に分化し
た構造である。哺乳動物の海馬は、記憶、学習及び高いニューロン適応性と関連
していることが既知である認識機能にとって重要である（クラッチャー（Crutch
er）及びコリンズ（Collins），1982，Science 277: 67-68）。これら要求が、
多分神経栄養因子の作用を受けた、適応性促進メカニズムのための系統発生の間
に選択圧を発生させた
かも知れない。しかしながら、この研究の結果は、神経栄養因子のための遺伝子
の重複が海馬の形成に断然先んじていたことを明確に示している。この発見は、
神経栄養因子は、海馬の形成の結果として発達したのではなかったことを示すと
共に、この脳の領域における神経適応性は少なくとも部分的にこれら分子による
ものであることを支持している。
原始脊椎動物、即ち、軟骨魚綱の魚の神経系の構成は、高等脊椎動物のものと
の多少の基本的類似性を示す。軟骨魚綱の魚における脳神経及び体性感覚及び自
律神経系は、概して高等脊椎動物のものと類似している（ヤング（Young，J.Z.
），1981，The Life of Vertebrates，New York Oxford University Press）。
従って、神経栄養相互作用の原理は、原始及び高等脊椎動物のいずれにおいても
同じらしい。原始脊椎動物におけるＮＧＦ様神経栄養因子の進化論的保存も、こ
れら因子がまず無脊椎動物内で発達し、その後、脊椎動物神経系の発達に機能す
るよう順応したことを示唆している。
我々のＮＧＦファミリーの進化論的保存の研究は、ニューロトロフィン−４又
はＮＴ−４と命名された、このファミリーの新規なメンバーの単離へと導き、Ｎ
Ｔ−４遺伝子からのＰＣＲ断片をツメガエル及びクサリヘビから単離し、次に、
ゲノミッククローンをツメガエルから実質的に単離した。このクローンのヌクレ
オチド配列分析により、ＮＧＦファミリーの他の３つのメンバーのものに似てい
る多くの構造的特徴を示す、２３６アミノ酸タンパク質についてのオープンリー
ディングフレームが明かになった。これらは、推定上のアミノ末端シグナル配列
及び１２３アミノ酸
成熟ＮＴ−４タンパク質を予示するタンパク質分解開裂部位に接近した潜在的Ｎ
−グリコシル化部位の存在を含む。成熟ＮＴ−４タンパク質の該部位は、ＢＤＮ
Ｆ及びＮＴ−３のそれよりも４アミノ酸長く、成熟ＮＧＦタンパク質のそれより
も５アミノ酸長い。成熟ＮＴ−４タンパク質内には、ジスルフィド橋の形成に関
与する全６システイン残基が保存されている。ＮＴ−４タンパク質は、該ファミ
リーの他のメンバーと、他の３つのファミリーメンバーの配列の間で変化のある
同じ領域において異なっている。ＮＧＦ、ＢＤＮＦ及びＮＴ−３の場合と同様に
、完全なプレプロ−ＮＴ−４タンパク質は１つの単独エキソンにおいてコードさ
れている。これから、その遺伝子構成及びその推定タンパク質の構造的特徴の両
方が、ＮＴ−４遺伝子はＮＧＦファミリーの追加のメンバーであることを示して
いる。ＮＴ−４遺伝子が爬虫類及び両生類の両方から単離されたという事実は、
それが多くの異なる種に存在することを示唆している。
ＢＤＮＦ及びＮＴ−３の両方が低親和性ＮＧＦ−Ｒと相互作用することが示さ
れた（ロドリゲス−テバー（Rodrigues-Tebar）ら，1990，Neuron 4: 487-492；
エルンフォースら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87：5454-5458）。
ツメガエルＮＴ−４タンパク質は、ＰＣ−１２細胞上のその低親和性レセプター
から125Ｉ−ＮＧＦを追い出した。これは、このファミリーの４番目のメンバー
も低親和性ＮＧＦ−Ｒと相互作用することを示しすものである。３７℃及び０℃
で得られた追い出し曲線の比較は、ＮＴ−４タンパク質が高親和性ＮＧＦ−Ｒへ
の結合については競合できまないことを示唆している。低親和性ＮＧＦ−Ｒ遺伝
子によ
りコードされたタンパク質は、低及び高親和性レセプターの両方の一部を形成し
ているようである（ヘンプステッド（Hempstead）ら，1989，Science 243: 373-
375）。速度論的に異なる２つのレセプターが同じレセプター遺伝子から形成さ
れるメカニズムは知られていないが、該２つの状態が該レセプターの細胞質ドメ
インと細胞内タンパク質の間の複合体形成により生じ得るということは提案され
ていた（ラデケ（Radeke）ら，1987，Nature 325: 593-597；ミーキン（Meakin
）及びショーター（Shooter），1991，Neuron 6: 153-163）。また別に、高親和
性レセプター鎖が別の遺伝子によりコードされ得、そしてインターロイキン−２
レセプター（ハタケヤマら，1989，Science 744: 551-556）及び血小板由来成長
因子レセプター（マツイら，1989，Science 243: 800-804）に類似しており、こ
の２つのレセプター鎖は該高親和性レセプター鎖を構成する二量体を形成するこ
とができる。ＮＧＦファミリーの全４メンバーが低親和性ＮＧＦ−Ｒと相互作用
できるという事実は、ＮＧＦ−Ｒの低親和性状態が、今のところ未知のやり方で
これら全ての因子の生物学的作用を媒介することに関与しているかも知れないと
いうことを示唆している。このような関係においては、低親和性ＮＧＦ−Ｒ遺伝
子が、ＮＧＦに応答することが知られていないニューロン及び非ニューロン起源
両方の多くの組織において発現されることが示されてきたことに注意を払うこと
は興味のあることである。これらは、ヒヨコ初期胚における間充織、原節及び神
経管細胞（ハルブックら，1990，Development 108: 693-704；ヒュアー（Heuer
）ら，1990a，Dev．Biol．137: 287-304；ヒュアーら，1990b，Neuron 5: 283-2
96）、並びに脊
髄運動ニューロンの発達及び再生を含む（エルンフォースら，1989，Neuron 2,
1605-1613；エルンフォースら，1990 J．Dev．Neurosci．9, 57-66）。従って
、これら組織又はニューロン集団のいずれにおいてＮＴ−４が機能的に重要であ
るかを探究することは興味があろう。
ＮＴ−４タンパク質の神経栄養活性を、移植されたヒヨコ胚神経節で分析した
ところ、ＮＧＦファミリーの他の３つのメンバーの場合と同様に、ＮＴ−４タン
パク質は、背根神経節からの神経突起成長の明確な剌激を示した。しかしながら
、ＮＧＦと比較した場合、ＮＴ−４タンパク質は背根神経節においてより低い活
性を示した。ＢＤＮＦ及びＮＴ−３の両方は、移植された結節性神経節において
神経突起成長を簡単に引き出すが、ＮＴ−３での応答はＢＤＮＦでのそれよりも
一貫してより強かった。ＮＧＦは交感神経節において神経突起成長を強く剌激し
、ＮＴ−３もこの神経節において活性を有しているが、ＮＧＦのものよりかなり
低い（マイソンピエールら，1990，Science，247, 1446-1451；エルンフォース
ら，1990，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．87：5454-5458）。ＮＴ−４は結節
性神経節においてＮＴ−３に比較してより弱い活性を示し、交感神経節において
は活性を示さない。末梢性移植神経節に関するＮＴ−４の生物学的活性のスペク
トルはＢＤＮＦのものに似ており、これはＮＴ−４が構造的にＢＤＮＦ類似して
いるという事実と一致している。
ツメガエルからの異なる１１組織のノーザンブロット分析は卵巣において高い
レベルのＮＴ−４を示すのに反して、ＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルは試験した他の
全ての組織においては検出限界以
下であった。２.３ｋｂ及び６.０ｋｂの２つのＮＴ−４ｍＲＮＡは卵母細胞にお
いて見られた。同じ遺伝子からの２つの転写体の存在はかつてＢＤＮＦに認めら
れており、その場合、１.４ｋｂ及び４.０ｋｂの２つのｍＲＮＡがラットの脳に
存在していた（レイブロックら，1989，Nature 341, 149-152；マイソンピエー
ルら，1990，Science，247, 1446-1451；エルンフォースら，1990a，Proc．Natl
．Acad．Sci．U.S.A．87：5454-5458）。ツメガエルＮＧＦプローブへのハイブ
リダイゼーションは、ニューロン神経剌激のための標的組織におけるＮＧＦｍＲ
ＮＡ発現の結果であると考えられる、ツメガエルの心臓におけるＮＧＦｍＲＮＡ
を明かにした。しかしながら、心臓におけるＮＧＦｍＲＮＡのレベルは、卵巣に
おけるＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルよりも１００倍以上低かった。卵巣においてＮ
Ｔ−４ｍＲＮＡのレベルが高いことはニューロン神経剌激と相関関係がないので
、この場合にＮＴ−４タンパク質が神経栄養機能だけを有しているということは
ありそうにない。その代わり、ツメガエルの卵巣におけるＮＴ−４ｍＲＮＡの豊
富な発現は、ＮＴ−４タンパク質についての付加的でかつ重要な神経栄養機能を
意味している。ＮＧＦｍＲＮＡも、ＮＴ−４ｍＲＮＡのレベルよりもほぼ１００
倍低いレベルではあるが、ツメガエルの卵巣において検出された；ＢＤＮＦｍＲ
ＮＡ及びＮＴ−３ｍＲＮＡはこの組織で検出されなかった。
２つの成長因子のためのｍＲＮＡは、ツメガエル卵母細胞における母系ｍＲＮ
Ａとして説明されている。これらｍＲＮＡのうちの１つは、塩基性線維芽細胞成
長因子との強い類似性を有するタンパク質をコードする（キメルマン（Kimelman
）及びキルシュナ
ー（Kirschner），1987，Cell 51:869-877）；その他のｍＲＮＡはトランスフォ
ーミング成長因子αと相同なタンパク質をコードする（ウィークス（Weeks）及
びメルトン（Melton），1987，Cell 51:861-867）。これら因子は、中胚葉の形
成及びそれに続く神経管の中へのこの組織の誘導のためのモルフォゲンとして機
能していると提案されてきた。ラットにおいては、in situハイブリダイゼーシ
ョン研究により、二次及び三次卵胞の上皮におけるＮＴ−３ｍＲＮＡが明らかに
なり、そして、卵子形成におけるＮＴ−３の役割が提案された（エルンフォース
ら，1990，Neuron 5, 511-526）。
７．実施例：インサイチュハイブリダイゼーションによる、アフリカツメガエル卵母細胞中でＮＴ−４ ｍＲＮＡを発現する細胞の同定
７．１．材料および方法
７．１．１．アフリカツメガエル卵細胞、胚および細胞の単離、処理ならびに培養
オスおよびメスのアフリカツメガエルを１９℃で実験室中で維持した。動物を
０．２５％トリカインメタンスルホネート（Ｓａｎｄｏｚ、スイス）で液浸麻酔
した後、卵巣葉を外科的に除去し、改変バースの食塩水Ｈｅｐｅｓ（ＭＢＳＨ）
（Gurdon and Wickens，1983，Methods Enzymol，101:370-86）で洗浄し、２ｍ
ｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含むカルシウム不含ＭＢＳＨ中、２０℃で一夜インキ
ュベートすることにより解離した。分別沈降によって卵黄形成前および卵黄形成
した卵細胞を粗分離し、これら卵細胞をさらにデュモン（１９７２、前出）の記
載する発生クラスに、解剖顕微鏡下に手で分離した。
実質的にニューポートおよびキルシュナー（１９８２）の記載するｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ受精によって同調卵割の胚を得た。
蒸留水で６０：４０（ｖ／ｖ）に希釈し、さらに１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ
７．３５）、１０μＭヒポキサンチン（Ｓｉｇｍａ）、４ｍＭグルタミンおよび
１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を補充したレイボウィッツ（Ｌｅｉｂｏｗｉ
ｔｚ）Ｌ15培地中、２０℃でＡ6アフリカツメガエル腎臓細胞を培養した。培養
物を空気で平衡化して暗所に保存した。
７．１．２．インサイチュハイブリダイゼーション
成人アフリカツメガエルからの新鮮凍結卵をクリオスタット（Ｌｅｉｔｚ、ド
イツ）を用いて切片化（１４μ）し、セクションをポリ−Ｌ−リシン（５０μｇ
／ｍｌ）前処理したスライド上で解凍し、次いで１０％ホルマリンで３０分間固
定し、ＰＢＳで２回リンスした。クロロホルム中の５分インキュベーションを含
む連続濃度のエタノール中で脱水を行い、次いでスライドを風乾した。２つの５
３−ｍｅｒのオリゴヌクレオチド、１つはアフリカツメガエルＮＴ−４ ｍＲＮ
Ａに特異的なオリゴヌクレオチド（５’ＣＣＣＡＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＧＧＣＡ
ＴＣＴＡＴＧＧＴＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＴＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＴＧＣ３
’［配列番号：１０９］）であり、他の１つは、対照としてニワトリＢＤＮＦ
ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド（成熟ニワトリＢＤＮＦタンパク質の６
１−７７アミノ酸に対応）（Hallbook et al.，1991，Neuron 6:845-58［配列番
号：１１および３２に含まれる］）を末端基デオキシリボヌクレオチド転移酵素
（ＩＢＩ、ニューヘブン）を用いて、約１×１０9ｃｐｍ／μの比活性までα35
Ｓ−ｄＡＴＰで３’末端で標識した。ハイブリダイゼーションは５０％ホルムア
ミド、４×ＳＳＣ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ溶液、１％サルコシル、０．０２Ｍ
ＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）、１０％硫酸デキストラン、０．５ｍｇ／ｍｌ酵母
ｔＲＮＡ、０．０６Ｍ ＤＤＴ、０．１ｍｇ／ｍｌせん断サケ精子ＤＮＡおよび
１×１０7ｃｐｍ／ｍｌの35Ｓ−標識オリゴヌクレオチドプローブ中、４２℃で
１６時間実施した。次いでセクションをリンスし、１×ＳＳＣ中、５５℃で４回
（各１５分）洗浄し、水中でリンスし、連続濃度のエタノール中で脱水し、風乾
した。セ
クションをＸ線フィルムに暴露し、次いでＫｏｄａｋ ＮＴＢ−３写真エマルジ
ョン（水で１：１に希釈）でコーティングし、５−６週間−２０℃で暴露し、現
像、固定し、クレシルバイオレットで対比染色した。
７．１．３．ＲＮＡブロット分析
上記試料を４Ｍグアニジンイソチオシアネート、０．１Ｍ β−メルカプトエ
タノール、０．０２５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０中でホモジェナイズし、
ポリトロンで１５秒間、３回ホモジェナイズした。それぞれのホモジェネートを
０．０２５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５．５中の５．７Ｍ ＣｓＣｌのクッショ
ン４ｍｌ上にのせてＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４２ローターで１５℃、３５，０００
ｒｐｍで１６時間遠心した。（Chirgwin et al.，1979，Biochemstry 78:5294-5
299）。ポリアデニル化ＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）をオリゴ（ｄＴ）セルロ
ースクロマトグラフィーによって精製し（Aviv and Leder，1972，PNAS 69:1408
-1412）、ＲＮＡブロット分析に用いる前にＲＮＡの回収物（４０μｇ）を分光
光学的に定量した。全細胞性ＲＮＡ（４０μｇ）または各試料からの上記ポリ（
Ａ）＋ＲＮＡ（５μｇ）を０．７％ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル
上で電気泳動に付した。染色したゲルのＵＶ透視を用いて、すべての試料が同量
の完全ＲＮＡを含んでいることを確認した。次いでゲルをニトロセルロースフィ
ルターに移し取った。フィルターを次いでアフリカツメガエルＮＴ−４遺伝子の
３’エキソンからの３５０ｂｐのＨｉｎｃＩＩ断片とハイブリダイズした（Hall
book et al.，1991，Neuron 6:845-858）。ニックトランスレーションによって
上記断片を
約５×１０8ｃｐｍ／μｇの比活性にα−（32Ｐ）−ｄＣＴＰで標識し、上記の
ようにハイブリダイゼーションを行った（Enfors et al.，1988，Neuron 1:983-
96）。高ストリンジェンシー（０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、５４℃）で
フィルターを洗浄し、−７０℃でＫｏｄａｋ ＡＲ−５フィルムに暴露した。
７．２結果
成人アフリカツメガエル卵母細胞の組織セクションを、アフリカツメガエルＮ
Ｔ−４ ｍＲＮＡに特異的な35Ｓ−ｄＡＴＰで標識したオリゴヌクレオチドプロ
ーブとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの特異性の対照として、隣
接するセクションを、同じ長さでニワトリ脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のｍ
ＲＮＡと相補的なＧＣ含量のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせ
た。ＮＴ−４ ｍＲＮＡに特異的なプローブは、卵形成の初期段階の卵母細胞に
対応する大きさ（直径５０−４００μｍ）で、卵巣全体に分散する多くの細胞を
強く標識することが明らかとなった（図９Ａ）。成熟した卵黄形成後のステージ
VIの卵母細胞にはＮＴ−４ ｍＲＮＡは検出されなかった（図９Ａ中の矢印）。
ニワトリＢＤＮＦ ｍＲＮＡに特異的な対照プローブはアフリカツメガエルの卵
巣中のいかなる細胞も標識しなかった。
ハイブリダイズしたセクションからのエマルジョンオートラジオグラフの分析
により、デュモン（１９７２、前出）の記載するステージＩの卵母細胞に対応す
る６０−２００μｍの直径で卵母細胞（図１０Ａおよび１０Ｂ）の細胞質を強く
標識することが明らかとなった。ＮＴ−４ ｍＲＮＡに特異的なプローブもまた
、ステージIIからIVに対応するよりも大きい直径で卵母細胞を標識
したが、これらの細胞を標識する強度はステージＩの卵母細胞で見られたよりも
小さかった。低倍率の暗視野照明法の分析（図９）と合致して、エマルジョンオ
ートラジオグラフはステージＶおよびVIのより成熟した卵母細胞の標識を全く示
さなかった。対照ＢＤＮＦプローブとのハイブリダイゼーション後にはいかなる
細胞にも標識は観察されなかった（図１０Ｃ）。卵形成過程におけるＮＴ−４
ｍＲＮＡのレベルをより詳細に検討するために、任意に選択した面積単位当たり
の粒子数を計数した。選択した面積単位はステージＩの卵母細胞の断面積のおよ
そ１００分の１に対応した。この分析の結果は、ステージＩの卵母細胞の標識強
度は、ステージII／IIIおよびIVの卵母細胞の標識強度のそれぞれ１．７および
４．３倍であることを示した（図１１）。ステージＶおよびVIの卵母細胞の面積
単位当たりの粒子数はバックグランド標識のレベルよりも有意に大きくはなかっ
た。
７．２．１．アフリカツメガエルの卵形成および発生初期におけるＮＴ−４ ｍＲＮＡの発現のノーザンブロット分析
種々のステージの卵母細胞および卵胞細胞からのものに富む分画から調製した
一定量の全細胞性ＲＮＡ（４０μｇ）をアフリカツメガエルＮＴ−４に特異的な
プローブを用いてノーザンブロットで分析した（ホールブックら、１９９１、前
出）。インサイチュハイブリダイゼーションの結果と合致して、２．３ｋｂおよ
び６．０ｋｂの大きさのＮＴ−４転写物のレベルは最小の卵母細胞（ステージＩ
およびII）で最も高かった（図１２）。より成熟したステージＶおよびVIの卵母
細胞ではＮＴ−４ ｍＲＮＡのレベルは急激に減少した。卵胞細胞調製物には弱
いハイブリダイゼー
ションシグナルが見られたが、これは少量のステージＩおよびIIの卵母細胞の混
入によるものと思われる。図１２に示す各種試料からの一定量（５μｇ）のポリ
アデニル化ＲＮＡを分析しても同様の結果が得られた。
卵巣中におけるＮＴ−４ ｍＲＮＡの発現の分析結果は、ＮＴ−４ ｍＲＮＡ
が未熟な卵母細胞に限定されるということを示した。ＮＴ−４ ｍＲＮＡの発現
が受精後に誘導されるという可能性を試験するために、ポリアデニル化ＲＮＡの
ノーザンブロットによって、発生期のアフリカツメガエル胚中のＮＴ−４ ｍＲ
ＮＡのレベルを評価した。分析に含まれていたアフリカツメガエルの体細胞性Ａ6
培養腎臓細胞には低レベルのＮＴ−４ ｍＲＮＡが見られた。しかしながら、
卵割性分裂の開始から神経胚ステージまでの初期の胚にはＮＴ−４ ｍＲＮＡは
検出されなかった。
７．３．議論
アフリカツメガエル卵巣中におけるＮＴ−４ ｍＲＮＡの大量の発現（ホール
ブックら、１９９１、前出）は、ＮＧＦファミリーのこのメンバーが卵形成およ
び／または初期の胚形成にある役割を果たしていることを示唆する。卵巣中にお
けるＮＴ−４ ｍＲＮＡを発現する細胞の配置により、卵巣におけるＮＴ−４タ
ンパク質の推定される機能が洞察される。両生類では、すべてのその他の脊椎動
物と同様に、卵の受精が迅速な細胞の卵割期の引き金となる。この現象は、卵形
成の過程で発現し、次の発生のために未受精卵中に蓄えられるあるクラスの可溶
性の母親のｍＲＮＡによって制御される（Davidson，1986，発生初期における遺
伝子活性（New York，Academic Press）。このクラスの母親のｍＲＮ
Ａは塩基性繊維芽細胞増殖因子（Kimelman and Kircshner，1987，Cell，51:869
-77）およびトランスフォーミング成長因子−β（Weeks and Melton，1987，Cel
l，51:861-67）という２つの成長因子、ならびにｃ−ｍｙｃ（Godeau et al.，1
986，EMBO J.，5:3571-77）；（Vriz et al.，1989，EMBO J．8:4091-97）、ｃ
−ｆｏｓ（Mohun et al.，1989，Development，107:835-46）、ｒａｓ（Andeol
et al.，1990，Dev．Biol．139:24-34）、ｅｔｓ−２（Chen et al.，1990，Sci
ence，250:1416-18）およびｃ−ｍｏｓ（Sagata et al.，1988，Nature，335:51
9-25）のようないくつかの細胞癌遺伝子を含む。未成熟なステージVIのアフリカ
ツメガエル卵母細胞が減数分裂Ｉの前期に捕獲され、ｃ−ｍｏｓ（サガタら、１
９８８）およびｅｔｓ−２（チェンら、１９９０）の両方が減数分裂の再開の過
程で機能することが示された。ステージＩおよびIIの卵母細胞では高レベルのＮ
Ｔ−４ ｍＲＮＡであるのに、ノーザンブロットおよびインサイチュハイブリダ
イゼーションのいずれでも、ステージＶおよびVIの卵母細胞では検出限界以下の
低レベルであるということは、ＮＴ−４ ｍＲＮＡが母親のｍＲＮＡのクラスに
属していないことを強く示唆する。この結果はまた、減数分裂の再開または胚形
成の初期におけるＮＴ−４タンパク質の役割に対して反論することになる。これ
と合致して、未成熟なステージVIの卵母細胞に組換えＮＴ−４タンパク質を添加
してもｉｎ ｖｉｔｒｏでの幼芽小胞（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ）の
分裂を誘導せず、またアフリカツメガエルの初期胚中にＮＴ−４ ｍＲＮＡは検
出されなかった。その代わり、卵巣におけるＮＴ−４タンパクの推定的機能は卵
黄形成
前および卵黄形成の初中期の卵巣で起こる現象と関連しているように思われる。
ＮＧＦが減数分裂の開始時のＤＮＡ合成を剌激することを示した最近の試験（Pa
rvinen et al.,1991、投稿）において、ＮＧＦ（Ayer-LeLievre et al.,1988，P
NAS 85:2628-2632）７５ｋＤの低親和性のＮＧＦレセプター（Persson et al.,1
990，Science，247:704-707）およびＮＧＦレセプターのｔｒｋＡ高親和性成分
（J.P．Merlo andH．Persson、未発表）の両方が発現する。したがって、ニュー
ロトロフィンは神経栄養因子として機能するだけでなく、生殖組織においても重
要な役割を果たしているように思われる。
８．実施例：哺乳動物ＮＴ−４をコードする核酸断片の単離および特性決定
８．１．材料および方法
８．１．１．ＤＮＡ調製
ゲノムＤＮＡを上記６．１．１．に記載の方法で単離した。
８．１．２．ポリメラーゼ連鎖反応、分子クローニングおよびＤＮＡ配列決定
アミノ酸配列ＱＹＦＦＥＴ（配列番号：５１に含まれる）およびＱＹＦＹＥＴ
（配列番号：５２）（５’−オリゴヌクレオチド）ならびに、ＷＩＳＥＣＫ、Ｃ
ＫＡＫＱＳおよびＷＩＲＩＤＴ（それぞれ配列番号：５１に含まれる）（３’オ
リゴヌクレオチド）に対応するすべての可能なコドンを表す３４−ｍｅｒのオリ
ゴヌクレオチド（尾部を含む）の混合物（図１３）を、上記６．１．２．に記載
のようにしてリンカーを用いて合成した。さらに、２Ｙ（ｘＮＴ−４［配列番号
：５０］に由来）および２Ｚ（ＢＤＮ
Ｆ／ＮＴ−３［配列番号：５１］に由来）はこの領域におけるすべての種から得
られたすべての公知のニューロトロフィンの配列を表す。ラットおよびヒトゲノ
ムＤＮＡの一次増幅を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ社）を用いて９５℃で
１分、４３℃で２分、さらに７２℃で２分のサイクルで実施した。一次ＰＣＲ反
応からのアリコートを次いで、一次増幅に用いたのと同じプライマーか、または
期待するサイズシフトをもたらすような、新しいいれこ状になった（ｎｅｓｔｅ
ｄ）縮重オリゴヌクレオチドプライマーのいずれかを用いて再増幅した。再増幅
で得られたＰＣＲ産物を以下のようにして精製した：予期される大きさのバンド
をゲル精製し、再増幅し、そしてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社の”Ｐｒｉｍｅｒａｓ
ｅ”カラムを用いてカラム精製した。次いでこれをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで
完全に消化し、分析して、Ｐｒｉｍｅｒａｓｅカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
）で再精製し、次いでＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで消化したブルースクリプトＫＳ（
−）中にライゲートした。形質転換体をスクリーニングして、およそ予期された
大きさの挿入物を含むｐＢＳ−ＫＳを探した。クローン化した断片を上記６．１
．２．に記載するＤＮＡ配列分析に付した。
８．１．３．ｒＮＴ−４およびｈＮＴ−４をコードする全長ゲノムおよびｃＤＮＡクローンの単離
λＧＴ−１０中のヒト卵巣ｃＤＮＡライブラリーはＣｌｏｎｔｅｃｈ社から入
手した。λ：ＺＡＰＩＩ中のヒト海馬ｃＤＮＡライブラリーはＳｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ社から入手した。ＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７中のヒトゲノムＤＮＡはＣｌｏ
ｎｔｅｃｈ社から
入手した。λ−ＺＡＰ中のラット脳ｃＤＮＡライブラリーはＳｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ社から入手した。
ＮＴ−４クローンの単離は以下のようにして実施した：
ｒＮＴ−４断片（図１４［配列番号：６１］）またはｈＮＴ−４断片（図１５
［配列番号：６３］）をコードするクローン化挿入物をＰＣＲによって、約５ｘ
１０8ｃｐｍ／ｎｇの比活性に標識する。ハイブリダイゼーションは、０．５ｍ
ｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中で６０℃で実施
した。フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で、６０℃で洗浄し、−７
０℃でＫｏｄａｋ ＸＡＲ−５フィルムに暴露する。あるいは、その配列が所望
の哺乳動物ニューロトロフィンに正確に対応するオリゴヌクレオチドを用いてプ
ローブを作成（例えば、キナーゼ標識）し、慣用法によって同じライブラリーを
スクリーニングするのに用いることができる。陽性のファージをプラーク精製し
、マニアティスら（Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manua
l，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York）の記載す
るように液体培地中で適当な大腸菌株に低倍率で感染させる。ＧＴ−１０および
ＥＭＢＬ３／ＳＰ６／Ｔ７ファージは以下のようにして調製する：培養物を絶え
ず振とうしながら３７℃で一夜インキュベートする。一夜インキュベートした懸
濁液を１Ｍ ＮａＣｌおよび８％ ＰＥＧ中に入れて、よく混合し、４℃で一夜
インキュベートしてバクテリオファージを沈降させる。遠心によってバクテリオ
ファージをペレットにし、ＴＭバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2）に再懸濁し、ＣｓＣｌの段階
的グラジエント上にのせて、適当な速さと時間で遠心してバクテリオファージを
バンドにする。バクテリオファージを除去し、新しいエッペンドルフ管に移し、
ホルムアミド１容量を加えて溶菌する。１００％エタノール２容量を加えてＥＭ
ＢＬ−３ ＤＮＡを沈降させる。ＥＭＢＬ−３ ＤＮＡをミクロ遠心によって除
去して、７０％エタノール中で洗浄し、ついでＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５：１ｍＭ Ｎａ2−ＥＤＴＡ）中に再懸濁する。ＤＮ
Ａをフェノール：クロロホルム：イソミルアルコール（２４：２４：１）で数回
抽出し、エタノール沈殿し、ＴＥバッファーに再懸濁し、各種制限酵素で消化し
、１％アゲロースゲルで電気泳動を行う。電気泳動に次いで、制限酵素で消化し
たＤＮＡをニトロセルロースに移しとり、上記の条件で、32Ｐ−標識したｒＮＴ
−４またはｈＮＴ−４プローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたバ
ンドをｐＢＳ−ＫＳプラスミドベクターにサブクローニングし、ジデオキシチェ
インターミネーション法によってＤＮＡ配列を分析した（Sanger et al.，1977
，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．74:5463-5467）。
λ−ＺＡＰプラスミド調製は以下のようにして行った：ＯＤ600＝１．０ Ｘ
Ｌ１−Ｂｌｕｅ細胞２００λ、高力価のフェーズストック２００λ、およびＲ４
０８ヘルパーファージ１λ（１×１０分ｐｆｕ／ｍｌ）を組み合わせる。陰性対
照にはファージストックを何も加えない。３７℃で１５分間インキュベートする
。２ＸＹＴ培地５ｍｌを加えて、３７℃で３時間振とうする。３時間経過後に陰
性対照は濁り、試料は透明である。試料を６５℃で３０分加熱し、４０００ｇで
５分回転する。上清はファージミドス
トックを含む。ファージミドを得るために、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞２００（ＯＤ600
＝１）にストック０．５λを加える。３７℃で１５分インキュベートする。
ＬＢアンピシリンプレート上に１−１００λ（好ましくは１０λ）を入れる。３
７℃で一夜インキュベートし、大きいコロニーを選ぶ。プラスミドＤＮＡを精製
した後、上記のように配列決定する。
ラムダファージｃＤＮＡライブラリーを上記の標準法によりスクリーニングす
る（マニアティスら、前出）。
陽性プラークを精製し、再単離して、上記のようにＤＮＡ配列分析に付す。
８．２．結果および議論
アフリカツメガエルのＮＴ−４コーディング配列領域を縮重オリゴヌクレオチ
ドプライマーの合成モデルとして用いた。図１３は５’−オリゴヌクレオチドプ
ライマー２Ｙ［配列番号：５３］（ＱＹＦＦＥＴ）および３’−オリゴヌクレオ
チドプライマ−３Ｙ［配列番号：５５］（ＷＩＳＥＣＫ）、３Ｚ［配列番号：５
６］（ＣＫＡＫＱＳ）および４Ｚ［配列番号：５８］（ＷＩＲＩＤＴ）はｘＮＴ
−４アミノ酸配列から由来したことを示す。５’−オリゴヌクレオチドプライマ
ー２Ｚ［配列番号：５４］（ＱＹＦＹＥＴ）はｒＢＤＮＦの相同領域から由来す
る。これらの縮重オリゴヌクレオチドのすべての可能な組み合わせを用いて、ラ
ットおよびヒトゲノムＤＮＡライブラリーからのＤＮＡを増幅した。ｘＮＴ−４
の３Ｙ［配列番号：５５］および３Ｚ［配列番号：５６］はＮＧＦ／ＢＤＮＦ／
ＮＴ−３遺伝子ファミリー中で保存されていないので、ＮＧＦ、ＢＤＮＦまたは
ＮＴ−３を増幅しないよう
に思われた。これら２つのプライマーは再増幅または二次ＰＣＲに用いた。
およそ予期できる大きさのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅、および、以下のプライマ
ーの組み合わせを用いるラットおよびヒトゲノムライブラリーの再増幅から得た
：
（１）２Ｙ／３Ｚ（一次ＰＣＲ）：２Ｙ、２Ｚ／３Ｙ（二次ＰＣＲ）
（２）２Ｙ／３Ｚ（一次ＰＣＲ）：２Ｙ、２Ｚ／３Ｚ（二次ＰＣＲ）
（３）２Ｙ／４Ｚ（一次ＰＣＲ）：２Ｙ、２Ｚ／３Ｚ（二次ＰＣＲ）
（４）２Ｚ／４Ｚ（一次ＰＣＲ）：２Ｙ、２Ｚ／３Ｚ（二次ＰＣＲ）
およそ予期できる大きさの二次ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルの電気泳動に
付して、標準法で溶出し、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、ＥｃｏＲＩ−Ｘ
ｈｏＩで消化したｐＢＳ−ＫＳＤＮＡ中にライゲートした。陽性の形質転換体を
選択し、挿入した断片をジデオキシチェインターミネーション法（サンガーら、
前出）によってＤＮＡ配列決定した。
オープンリーディングフレームはラットＮＴ−４（図１４［配列番号：６２］
）およびヒトＮＴ−４（図１５［配列番号：６４］）のアミノ酸コーディング配
列の部分であると演繹された。図１６は、ｒＮＴ−４（配列番号：６２）および
ｈＮＴ−４（配列番号：６４）断片の、ＮＧＦ／ＢＤＮＦ／ＮＴ−３遺伝子ファ
ミリーの代表的メンバーに対する相同領域を示す。
図１５に示すよりも大きいヒトＮＴ−４の部分をコードするオープンリーディ
ングフレームを図１７Ａに示す（配列番号：６９および配列番号：７０）。図１
７Ａは３’ヒトＮＴ−４コーディング領域に対する付加的３’配列情報を表す。
図の説明の欄で既に説明したように、１９２ｂｐの核酸断片を単離した。
再増幅工程から回収したＰＣＲ産物の実際の大きさは、ラットＮＴ−４（ＧＰ
ＧＶＧＧＧ）［配列番号：１０１］およびヒトＮＴ−４（ＧＰＧＡＧＧＧ）［配
列番号：１０２］ＤＮＡ断片中にある７個の付加的アミノ酸のために、予測した
よりも大きかった。
ｒＮＴ−４およびｈＮＴ−４の７個のアミノ酸挿入物は’ＧＰＧＸＧＧＧ’［
配列番号：１００］（ここでｒＮＴ−４ではＸ＝Ｖ、ｈＮＴ−４ではＸ＝Ａ）と
記載される。バリンおよびアラニンは非極性Ｒ基を有する。その他の哺乳動物Ｎ
Ｔ−４タンパク質において、位置４に非極性Ｒ基を含むように位置４が保存され
ているか否か、また７ｂｐの挿入物自体がその他の哺乳動物ＮＴ−４遺伝子の特
徴であるのか否かは現在のところ分かっていない。魚のＮＧＦは本発明で記載す
るのと同じ領域に２２アミノ酸の挿入物を有していることは興味深い。
９．実施例：ＮＴ−４ヒトゲノムクローンの単離および特性決定
本発明者らはＥＭＢＬ３ ＳＰ６／Ｔ７中のヒト胎盤ゲノムライブラリー（Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ社、宿主はＫ８０２）をスクリーニングした。大きなＮＺＹプレ
ート上に全量で１．２５×１０6ｐｆｕをのせた。Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆
Ｓｃｈｕｅｌｌ社のニトロセルロースフィルターを用いて２枚移し取り、１２０
ｂｐのプローブ（ｈＮＴ−４クローン１７Ｂから得た、このクロー
ンはプライマー２Ｚ４Ｚ、次いで２Ｚ３Ｚを用いてヒトゲノムＤＮＡから得た）
とハイブリダイズし、オリゴヌクレオチドプライマー２Ｚ／３Ｚを用いてＰＣＲ
によって標識した。フィルターを６０℃で、放射性標識したプローブ（１０6ｃ
ｐｍ／ｍｌ）と、以下のハブリダイゼーション条件でハイブリダイズした：０．
５Ｍ ＮａＰＯ4、１％ ＢＳＡ、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１
００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ。フィルターを次いで６０℃で、２×ＳＳＣおよ
び０．１％ ＳＤＳで洗浄し、オートラジオグラフィーに付した。４日間暴露し
た後、２枚のフィルター上で陽性シグナルを同定した。合計７個のプラークを取
り出し、ＳＭバッファー１ｍｌ中に入れて、２時間振とうし、以下のようにして
再び播いた：１）１０-3希釈物（１ｍｌ中に１μｌ）１００μｌを得て、細胞１
００μｌと混合して播き、ほとんどコンフルエントなプレートを得る；２）１０-5
希釈物２００μｌを得て、単離プラークを得た。２枚の移し取ったフィルター
を作成し、上記と同様にしてｈＮＴ−４の１２０ｂｐプローブでスクリーニング
した。２日間暴露した後、多くの陽性プラークを同定し、ＨＧ２、４および７を
コンフルエントなプレート上で得た。十分に単離された陽性プラークをＨＧ４−
２およびＨＧ７−２プレートの両方で同定した。ＨＧ４−２およびＨＧ７−２に
対する単一プレートを取り出してＳＭバッファー５００μｌに入れ、２時間振と
うし、次いで溶出物１００μｌを細胞１００μｌと混合して播いた。次にプレー
トにＳＭバッファー３ｍｌを注ぎ、上清を最初の高力価ストックとして回収した
。細胞１００μｌと混合したこの最初のストック１００μｌを用いて、３つのプ
レートに播い
た。プレートにＳＭバッファー３ｍｌを注ぎ、３時間室温で回転振とうした。上
清を除去し、破片を遠心して除去し、次いでクロロホルムを添加して、これを第
２の高力価ストックとして用いた。ＨＧ４−２およびＨＧ７−２の高力価ストッ
ク２μｌをＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社のニトロセルロースフ
ィルターにスポットし、ｒＮＴ−４の１８０ｂｐプローブ［アミノ酸ＧＥＬＳＶ
ＣＤ（配列番号：１１２）（縮重プライマー）およびＫＡＥＳＡＧ（配列番号：
１１３）（正確なプライマー）をコードする我々のラットＮＴ−４クローン配列
に基づいてデザインされたプライマーを用いて、ラットゲノムＤＮＡからＰＣＲ
によって得た挿入物を含むプラスミドから単離］とハイブリダイズすることを見
いだした。プレート溶菌物および液体溶菌物をＨＧ４−２、ＨＧ７−２およびＨ
Ｇ２−１について調製した。ファージＤＮＡを作成し、そのアリコートをアガロ
ースゲル上で展開してサザン分析を行った。ＨＧ４−２、ＨＧ７−２およびＨＧ
２−１は、ｒＮＴ−４の１８０ｂｐプローブ（上記のＮａＰＯ4ハイブリダイゼ
ーション、６５℃）およびヒトＰＣＲ断片クローン１７Ｂによってコードされる
アミノ酸配列ＧＧＧＣＲＧＶＤＲＲＨＷＶＳＥ［配列番号：１１５］に対応する
４５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプローブ（ＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＧ
ＧＡＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡＴＣＴＧＡＧ）［配列番号：
１１４］（６×ＳＳＣ、４５℃ハイブリダイゼーション）とハイブリダイズする
ことが見いだされた。これら３つのゲノムクローンに対する挿入物の大きさはお
よそ９−２３ｋｂである。これらはいずれもスクリーニングに使用されたプロー
ブ、ｈＮＴ４（
１２０ｂｐ）およびｒＮＴ４（１８０ｂｐ）と密接に関連する遺伝子のコーディ
ングエキソンを含む。ゲノムクローンに対するファージＤＮＡをいくつかの制限
酵素で消化してサザン分析に付した。プローブｒＮＴ４（１８０ｂｐ）とハイブ
リダイズする適当な断片をブルースクリプトベクターにサブクローニングするこ
とができる。サブクローニングするＤＮＡ断片の大きさは以下の通りである：ク
ローン２−１（１．０ｋｂ ＸｈｏＩ断片）、クローン４−２（４．０ｋｂ Ｘ
ｈｏＩ断片）およびクローン７−２（５．０ｋｂ ＢａｍＨＩ断片）。完全コー
ディング配列を得て、この情報を用いて該遺伝子を適当な発現ベクターにサブク
ローニングできるようなエキソン境界を同定することができる。
最後にヒトゲノムファージクローン７−２のヌクレオチド配列分析を実施した
が、このクローンはアフリカツメガエルＮＴ−４のＤＮＡ配列に対する縮重オリ
ゴヌクレオチドを用いてヒトゲノムＤＮＡ由来のＰＣＲ断片でヒトゲノムライブ
ラリーをスクリーニングすることによって得られた（前述の議論の項参照）。配
列分析の結果、ヒトファージクローン７−２は、ゲノムライブラリーをスクリー
ニングするためにプローブとして用いたＰＣＲ断片の配列と同じ配列を含むこと
が明らかとなった。この配列は新規神経栄養因子をコードするエキソンと思われ
る中に含まれている（図１８、配列番号：７５および配列番号：７６）
このエキソンによってコードされるタンパク質（図１９、配列番号：７７）を
公知のニューロトロフィン類と並べて比較してみたところ、上記タンパク質はす
べての公知のニューロトロフィンに見られる特徴をもっていることが明らかとな
った（図１９、配
列番号：７８−９２）。従来ニューロトロフィンと同定されたもののプレプロ領
域間で保存されているのと同じアミノ酸の多くが保存されているプレプロ領域を
このタンパク質は有している。さらに、このプレプロ領域はその他のニューロト
ロフィン遺伝子と同じ領域に位置するスプライスアクセプター部位が前について
いる。プレプロ領域はまた、適当な位置にコンセンサスなグリコシル化部位を含
み、またその他のニューロトロフィンに見られる開裂部位と非常によく似た開裂
部位で停止する（図１８）。しかしながら、７−２のプレプロ領域は、公知のニ
ューロトロフィンのプレプロ領域と比べて長さが短い点で独特である。長さの減
少はプレプロ領域のＮ末部分で起こっており、この部分はファミリーメンバーの
プレプロのうちでも最も保存されていない部分である。成熟領域は従来同定され
たすべてのニューロトロフィンに見られる６個のシステインすべてを保持してい
る。ニューロトロフィンファミリーの各種メンバー間で共通の残基の多くもまた
保存されている。ヒト７−２クローンによってコードされるタンパク質のラット
均等物に対応しうるラットゲノムＤＮＡから由来するＰＣＲ断片が共有する大き
な配列類似性を排除して、コンピューターによる配列比較は、７−２ファージク
ローンによってコードされるニューロトロフィンがアフリカツメガエルのＮＴ−
４のニューロトロフィンと最もよく似ていることを明らかにした。プレプロおよ
び成熟領域のいずれについてもそうである。公知のニューロトロフィンと比較し
て、成熟領域の第２と第３システインの間に位置する挿入物の存在のために、７
−２クローンによってコードされるタンパク質は特異である。
クローン７−２を産生したのと同じスクリーニング過程で単離されたさらに２
つのヒトクローンについても配列分析を行った（前述の議論の項参照）。これら
のクローンの配列はクローン７−２から得られた配列と似ているが同一ではなく
、このことはこれらが、その他の公知のニューロトロフィンよりももっと密接に
７−２と関連する新規ニューロトロフィンをコードする可能性を示唆している。
これらのクローンのうちの１つであるクローン２−１の部分配列を図２０に示す
（配列番号：９３および配列番号：９４）。この配列は、図１９に示す配列中の
アミノ酸番号５０に対応する位置から開始する。もう１つのクローンであるクロ
ーン４−２の部分配列を図２１に示す（配列番号：１１６および配列番号：１１
７）。
１０．実施例：ヒトＮＴ−４の組織特異的発現
ヒトゲノムＮＴ−４クローンであるＨＧ７−２の全コーディング領域を含む６
８０ｂＰのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を放射能標識し、種々のヒト組織特異的ポリ
Ａ＋ＲＮＡのノーザン分析に用いた。ヒト組織特異的ｍＲＮＡを１％アガロース
−ホルムアルデヒドゲルの電気泳動によって分画し、次いでナイロン膜に１０×
ＳＳＣで毛細管的に移し取った。ＵＶ光に暴露して膜にＲＮＡを交差結合させ、
０．５Ｍ ＮａＰＯ4（ｐＨ７）、１％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、
Ｓｉｇｍａ社）、７％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１００ｎｇ／ｍｌの音
波処理、変性サケ精子ＤＮＡの存在下で、６８０ｂｐのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ放射
能標識ＮＴ−４プローブと６５℃でハイブリダイズした。フィルターを６５℃で
、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳで洗浄し、１つの増
強スクリーンとＸ線フィルムで−７０℃で、一夜オートラジオグラフィーに付し
た。ゲルをエチジウムブロミドで染色したところ、異なる試料についても全ＲＮ
Ａのレベルは均等にアッセイされることが示された。
ヒトＮＴ−４プローブは骨格筋、前立腺、胸腺、精巣および胎盤からのｍＲＮ
Ａと強くハイブリダイズした（図２２）。ＮＴ−４プローブは前立腺ｍＲＮＡよ
りも大きい骨格筋中の転写物とハイブリダイズした。このデータは、異なる発現
レベルと転写物サイズを有する小さなヒトＮＴ−４多重遺伝子ファミリーが存在
しうることを示唆している。
骨格筋におけるヒトＮＴ−４の高発現は、本発明が神経系の疾患、特に運動ニ
ューロンに影響を及ぼす広範囲な神経学的疾患の治療に利用しうることを示唆す
る（上記議論の項参照）。さらに、前立腺におけるヒトＮＴ−４の高発現は、本
発明が前立腺の疾患、好ましくはＢＰＨおよびインポテンツの治療に利用しうる
ことを示唆している（上記議論の項参照）。最後に、胸腺におけるヒトＮＴ−４
の発現は、本発明が、これに限定するものではないが重症筋無力症を含む神経お
よび筋肉組織の免疫関連疾患の治療に利用しうることを示唆している。（上記議
論の項参照）。
１１．実施例：真核細胞発現ベクター中におけるヒトＮＴ−４の構築、および組換えヒトＮＴ−４の生物活性の測定
１１．１．材料および方法
１１．１．１．ヒトＮＴ−４をコードする真核細胞発現ベクターの構築
ヒトゲノムクローンＨＧ７−２のプレプロ前駆体コーディング
領域を含む２つの真核細胞発現ベクターをｐＣＭＸ中に構築した（ＮＲＲＬ受託
番号Ｂ−１８７９０）。１つの構築物はｐＣＭＸの通常の翻訳開始部位を用い（
ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ）、もう１つはＫｏｚａｋコンセンサス翻訳開始部位を
用いた（ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｍ）。ブルースクリプトのＢａｍＨＩ部位中にク
ローン化された全コーディング領域を含む、ＨＧ７−２の５ｋｂゲノム断片を以
下のオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって増幅した：
ｈＮＴ４−５’ＸｈｏＭとｈＮＴ４−３’Ｎｏｔとのオリゴヌクレオチドプライ
マーの組み合わせを用いてｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｍを構築し、ｈＮＴ４−５’Ｘ
ｈｏＱとｈＮＴ４−３’Ｎｏｔとの組み合わせを用いてｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ
を構築した。ＰＣＲ断片をＸｈｏ１／Ｎｏｔ１で消化して、Ｘｈｏ１／Ｎｏｔ１
消化したｐＣＭＸ中にサブクローニングした。
１１．１．２．ニュートロフィンプレプロ領域をヒトＮＴ−４の成熟コーディング領域と融合したキメラ遺伝子の構築
ヒトＮＴ−４の成熟部分をコードするさらに２つの真核細胞発現ベクターを構
築した。第１のものは、ヒトＮＴ−４のプレプロ領域をアフリカツメガエルＮＴ
−４のプレプロ領域と置換した（
ｐＣＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４）。第２のものは、ヒトＮＴ−４のプレプロ領域
をヒトＮＴ−３のプレプロ領域で置換した（ｐＣＭX−ｈＮT３／ｈＮＴ４）。ｐ
ＣＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４およびｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４の構築には以
下のオリゴヌクレオチドを用いた：
５’ＣＤＭ８およびｈＮＴ３／ｈＮＴ４融合オリゴヌクレオチドをプライマー
とするＰＣＲによってｈＮＴ−３含有プラスミドベクター（ｐＣ８−ｈＮＴ３）
を増幅した。ｈＮＴ３／ｈＮＴ４融合”ＤＳ”オリゴヌクレオチドおよびｈＮＴ
４−３’Ｎｏｔ１オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによってｈＮＴ−４含有プ
ラスミド（ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ）を増幅した。得られたＰＣＲ断片をゲルか
ら切り出して、５’ＣＤＭ８およびｈＮＴ４−３’Ｎｏｔ１オリゴヌクレオチド
をプライマーとするＰＣＲによって再増幅した。産物を次いでＨｉｎｄＩＩＩと
ＰｓｔＩで消化してＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ
中にサブクローニングした。したがって、発現プラスミドｐＣＭＸ−
ｈＮＴ３／ｈＮＴ４は、ヒトＮＴ−４の成熟コーディング領域と融合したｈＮＴ
３プレプロ領域を含んでいた。同様に、５’ＣＤＭ８およびｘＮＴ４／ｈＮＴ４
／融合”ＵＳ”オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによってヒトＮＴ−４発現プ
ラスミド（ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ）を増幅し、一方ｘＮＴ４／ｈＮＴ４／融合
”ＤＳ”オリゴヌクレオチドおよびｈＮＴ４−３’Ｎｏｔ１オリゴヌクレオチド
でｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑを増幅した。ＰＣＲ産物をゲルから切り出して、５’
ＣＤＭ８およびｈＮＴ４−３’Ｎｏｔオリゴヌクレオチドで再増幅した。産物を
次いでＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化してＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ消化した
ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ中にサブクローニングした。したがって、得られる真核
細胞発現プラスミドｐＣＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４は、ヒトＮＴ−４の成熟コー
ディング領域と融合したアフリカツメガエルＮＴ−４プレプロ領域を含む。
１１．１．３．ＣＯＳ細胞中における組換えヒトＮＴ−４の発現
１０％ ＦＢＳ、グルタミンおよびピルビン酸Ｎａを補充したＤＭＥＭ培地中
（ＦＢＳを除くすべてはＩｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入）で、
Ｃｏｓｔａｒの６ウエルディッシュの１ウエル当たり１．５×１０5細胞の密度
でＣＯＳ Ｍ５細胞を播いた。
翌日細胞を吸引し、４００μｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社）、４００μＭクロロキン（Ｓｉｇｍａ社）、４ｍＭグルタミン（Ｉｒ
ｖｉｎｅ社）、１×ＩＴＳ（インシュリン、トランスフェリン、セレニウム、Ｓ
ｉｇｍａ社）を含むＲＰＭＩ培地２ｍｌ／ウエルを再供給した。各ウエルに適当
な
ＤＮＡ２μｇを加えてゆすって混合した。以下の３つの異なる構築物を用いた：
アフリカツメガエルＮＴ−４のプレプロ前駆体を含むｐＣＭＸ−ｘＮＴ４；およ
び２つのヒトＮＴ−４構築物であるｐＣＭＸ−ＨＧ７−２ＭとｐＣＭＸ−ＨＧ７
−２Ｑ。ＤＮＡを添加した後、プレートを３７℃、５％ ＣＯ2のインキュベー
ターに３時間１５分戻した。次いで培地／ＤＮＡ混合物を吸引し、２ｍｌ／ウエ
ルのＣａ2+，Ｍｇ2+不含ＰＢＳ中の１０％ ＤＭＳＯを２分間加えた。ＤＭＳＯ
／ＰＢＳを吸引し、ウエルを１０％ＦＢＳ ＤＭＥＭで１回洗浄し、次いで１回
ＦＢＳ ＤＭＥＭを再供給した。翌朝、生物アッセイすべきプレートを規定培地
（ＤＭ）で１回洗浄してＤＭ２ｍｌ／ウエルを再供給した。トランスフェクショ
ンの後３日目に、細胞およびマイクロ遠心分離によりペレット化したデブリスか
ら上清を除いた。上清を新しい管に移して生物活性をアッセイした。
１１．１．４．運動ニューロンに富む培養物の調製
すべての実験にはＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ＨＳＤまたはＺｉｖ
ｉｃ−Ｍｉｌｌｅｒ社）からの胚（Ｅ１４）を用いた。妊娠ラットを二酸化炭素
窒息により殺して、胚を迅速に除去し、さらに切断するために氷冷培地中に入れ
た。妊娠１４日目のラット胚から脊髄を無菌的に除去した。脊髄を尾部から延髄
まで（第１後根神経節のレベルで）切断し、知覚神経節および付着している髄膜
から取り出した。次いで別々に培養するために脊髄を腹側と後根中部部分とに分
けた。腹側脊髄組織を小片に刻み、ＰＢＳ中の０．１％トリプシン（ＧＩＢＣＯ
社）と０．０１％デオキシリボヌクレアーゼタイプ１（Ｓｉｇｍａ社）中におい
て３
７℃で２０分間インキュベートした。次いでトリプシン溶液を除去して、リンス
し、４５％イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）、４５％ハムの栄養混合培地Ｆ１
２（Ｆ１２）、５％熱インキュベートしたウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ社）、５％
熱不活性化ウマ血清（ＧＩＢＣＯ社）、グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリンＧ（
０．５Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）からなる培地
で置換した。次に組織をパスツールピペットで静かに粉砕することにより機械的
に解離させ、上清を回収してナイロン繊維（Ｎｉｔｅｘ、Ｔｅｔｋｏ社、４０μ
ｍ）で濾過した。濾過した細胞懸濁液を次いでＳｃｈｎａａｒおよびＳｃｈａｆ
ｆｎｅｒ（1981，J．Neurosci．1:204-217）の記載する分画方法の変法に付した
。すべての操作は４℃で行った。Ｆ１２：ＭＥＭ（１：１）培地中にメトリザミ
ド（ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅ）を溶解して１８％メトリザミドクッション（０．
５ｍｌ）、１７％メトリザミド（３ｍｌ）、１２％メトリザミド（３ｍｌ）およ
び８％メトリザミド（３ｍｌ）からなる非連続グラジエントを作成した。上記の
ようにして得られた濾過した腹側脊髄細胞懸濁液（２．５ｍｌ）を段階勾配上に
のせ、スイングアウトローター（Ｓｏｒｖａｌｌ ＨＢ４）を用いて、管を２５
００×ｇで１５分間遠心した。遠心の結果、以下の３層の細胞が得られた：フラ
クションＩ（０−８％の界面）、フラクションII（８−１２％の界面）およびフ
ラクションIII（１２−１７％の界面）。各界面からの細胞を少量（約１ｍｌ）
取り出し、グルタミン（２ｍＭ）、インシュリン（５μｇ／ｍｌ）、トランスフ
エリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン（２０ｎＭ）、プトレシン（１０
０μＭ）、およ
び亜セレン酸ナトリウム（３０ｎＭ）を補充した５０％Ｆ１２と５０％ＭＥＭか
らなる血清不含規定培地（Bottenstein and Sato，1979，Proc．Natl．Acad．Sc
i．76:514-517）で２回リンスした。トリパンブルーの存在下で血球計によって
目視できる細胞数を計数した。分画した腹側脊髄細胞（運動ニューロンに富む）
を次いで、ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ社：１０μｇ／ｍｌ）とラミニン
（ＧＩＢＣＯ社：１０μｇ／ｍｌ）で前コーティングした６ｍｍウエル中に、１
００，０００細胞／ｃｍ2の密度で播いた。ＮＴ−４を含むＣＯＳ細胞上清によ
る処理は播いた日に行った。培養は血清不含規定培地中で３７℃、９５％空気／
５％ＣＯ2雰囲気中、ほぼ１００％相対湿度で維持した。２日（４８時間）目に
細胞を回収してフォナム（Fonnum，1975，J．Neurochem．24:407-409）の記載す
るように、コリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）の測定を行った。
１１．２．結果
１１．２．１．生物活性な組換えヒトＮＴ−４の真核細胞での発現
ｐＣＭＸを基礎とする構築物（ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ、ｐＣＭＸ−ＨＧ７−
２Ｍ、ｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４およびｐＣＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４）の
それぞれからのプラスミドＤＮＡを調製してそれぞれＣＯＳ細胞中にトランスフ
ェクションした。各トランスフェクション細胞系からのＣＯＳ上清を用いて、Ｎ
Ｔ−４の各組換え体の生物活性を評価した。試験したＣＯＳ上清の量は、全量２
ｍｌ中に１０、５０および２５０μｌであった。Ｑ１（ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ
）、Ｎ７（ｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈ
ＮＴ４融合）、およびＸ１（ｐＣＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４）は、ＤＲＧ移植物
において軸索促進活性を有していた（図２３）。さらに、Ｑ（ｐＣＭＸ−ＨＧ７
−２Ｑ）とＭ（ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｍ）の両方を、ＤＲＧ解離細胞において生
存促進活性を試験した。試験した容量は全量２ｍｌ中、５−２５０μｌであった
。解離ＤＲＧニューロンの培養物に加えてところ、擬似（ｍｏｃｋ）トランスフ
ェクションしたＣＯＳ上清が１０％の生存であるのに比較して、ｈＮＴ４を含む
ＣＯＳ上清は３０％のニューロン生存を促進した（図２４）。
ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２ＭでトランスフェクションされたＣＯＳ細胞の上清から
得たヒト組換えタンパク質の生物効果を、上記実施例１１．１．４．のセクショ
ンで述べた方法で調製した運動ニューロンに富む培養物において試験した。運動
ニューロンに富む培養物を、１：５に希釈したｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｍ由来のヒ
トＮＴ−４で処理したところ、非処理（Ｃ−ＮＴ）対照および擬似トランスフェ
クション（ＭＯＣ ＣＯＳ）対照と比較して、４８時間後にコリンアセチルトラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性を２．９倍増強した。１：５０で希釈したもので
試験したところ、ＣＡＴ活性の増強は１．７倍に落ちたので、これは用量依存性
の応答であることが示唆された（図２５）。
１１．３．議論
本発明は組換えヒトＮＴ−４を発現させるためのｉｎｖｉｔｒｏでの真核細胞
発現系の使用を提供する。本発明はＣＯＳ細胞中で、生物活性形の組換えヒトＮ
Ｔ−４を発現させるための幾つかの戦略を開示する。１つの例では、ＮＴ−４プ
レプロ前駆体を
コードするＤＮＡ配列を２つのＰＣＲ増幅戦略を用いて増幅して、ｐＣＭＸ翻訳
開始部位（ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｍ）またはＫｏｚａｋコンセンサス翻訳部位（
ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ）のいずれかを含むｐＣＭＸを基礎とする発現プラスミ
ドを作成した。他の例では、アフリカツメガエルＮＴ−４のプレプロ領域（ｐＣ
ＭＸ−ｘＮＴ４／ｈＮＴ４）またはヒトＮＴ−３のプレプロ領域（ｐＣＭＸ−ｈ
ＮＴ３／ｈＮＴ４）のいずれかをＮＴ−４の成熟コーディング領域と融合する２
つのキメラニューロトロフィン遺伝子を、ＣＯＳ細胞での発現用に構築した（ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでＮＴ−４を発現させるためのキメラ構築物の使用に関する議論
は上記セクション５を参照）。
ｉｎ ｖｉｔｒｏの真核細胞発現系における生物活性形のヒトＮＴ−４の発現
は、ヒト組換えＮＴ−４、ペプチドまたはその誘導体の生産規模を既に議論した
治療および診断双方への適用のために向上させる可能性を実質的に大きくする。
本発明の観点においては、当業者はここに開示するものと同一のＤＮＡ配列、ま
たは相同ではあるが異なるＮＴ−４様タンパク質またはその誘導体をコードする
類似のＤＮＡ配列を含むプラスミドを容易に構築することができる。当業者であ
ればまた、真核細胞発現系に使用するために、発現プラスミド構築用の当業界で
公知の多数のＤＮＡプラスミドベクターから取捨選択することができる。組換え
ヒトＮＴ−４は、それが完全プレプロ前駆体として生産されるものであっても、
あるいはニューロトロフィンを基礎とするキメラ構築物を介するものであっても
、ＤＲＧ移植物中の軸索成長における組換えＮＴ−４ ＣＯＳ上清の効果、およ
び培養運動ニューロン
の生物活性を剌激することによって示しされように生物学的に活性であることを
本発明者らは実証した。
１２．実施例：ｔｒｋＢがニューロトロフィン−４のレセプターである
ＣＯＳ細胞上清を３Ｔ３繊維芽細胞を用いる生存アッセイにおいても試験した
。このアッセイ系では、ニューロトロフィンレセプタータンパク質を発現しない
３Ｔ３繊維芽細胞をｔｒｋＡまたはｔｒｋＢのいずれかをコードする哺乳動物発
現ベクターでトランスフェクションする。３Ｔ３繊維芽細胞の生存性は、それぞ
れの神経栄養因子の添加およびそのレセプター特異的結合に依存する。
ＣＯＳ−Ｍ５細胞を培養して、実施例セクション１１．１．３．に記載するｐ
ＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ、ｐＣＭＸ−ＨＧ７−２ＭまたはｐＣＭＸ−ＨＧ７−２Ｑ
のいずれかでトランスフェクションした。
全長ラットｔｒｋＡ ｃＤＮＡクローンをスタンフォード大学のＥｒｉｃ Ｓ
ｈｏｏｔｅｒ博士から得た。ラットｔｒｋＡ ｃＤＮＡを哺乳動物発現ベクター
ｐＣＭＸにサブクローニングしてｐＣＭＸ−ｔｒｋＡを作成した。
ｔｒｋＢの最も５’および３’コーディング領域に対応するラットｔｒｋＢ−
特異的オリゴヌクレオチドでラムダＺＡＰ２ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社
）中のラット脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって全長ラ
ットｔｒｋＢ ｃＤＮＡクローンを得た。ラットｔｒｋＢ ｃＤＮＡをｐＣＭＸ
中にサブクローニングしてｐＣＭＸ−ｔｒｋＢを作成した。
３Ｔ３繊維芽細胞を培養してグラスら（Glass et al.，1991，Cell 88:405-41
3）が記載するようにトランスフェクションした。
この生存アッセイ系では、ニューロトロフィンレセプタータンパク質を発現し
ない３Ｔ３繊維芽細胞を、ＮＧＦのためのチロシンンキナーゼレセプターをコー
ドする癌原遺伝子であるｔｒｋＡ、またはＢＤＮＦおよびＮＴ−３のための機能
性結合タンパク質として作用するチロシンンキナーゼであるｔｒｋＢでトランス
フェクションした。トランスフエクションした細胞の生存性は対応するニューロ
トロフィンの添加に依存するので、ニューロトロフィンの生物活性のアッセイに
使用できるであろう。この生物アッセイにおけるＮＴ−４含有ＣＯＳ細胞上清の
添加は、３Ｔ３ ｔｒｋＢ培養物においてのみ４８時間後に生存細胞が残ること
を示した（表２）。したがって、これらの結果は、ＮＴ−４タンパク質がこの系
で生物活性を有していることを示しており、またｔｒｋＡではなくてｔｒｋＢが
ＮＴ−４の機能性結合タンパク質として作用することを示唆している。
１３．微生物の寄託
ニューロトロフィン−４に関連するヒトゲノム配列を含む以下の組換えバクテ
リオファージはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、１２３０１
Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０
８５２に１９９１年８月２２日（ＨＧ４−２およびＨＧ７−２）ならびに１９９
１年９月１１日（ＨＧ２−１）寄託され、下記の受託番号を付与された。さらに
、キメラ遺伝子構築物ｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４はアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに１９９１年１０月３０日寄託され、以下の受託番号を
付与された。
バクテリオファージ ＡＴＣＣ受託番号
ＨＧ４−２ ７５０６９
ＨＧ７−２ ７５０７０
ＨＧ２−１ ７５０９８
ｐＣＭＸ−ｈＮＴ３／ｈＮＴ４ ７５１３３
本発明は寄託された微生物またはここに記載する特定の態様の範囲に限定され
ない。実際、ここに記載するものに加えて様々な本発明の変法が上記の記載およ
び添付の図面から当業者には明らかであろう。このような変法は付属の請求の範
囲に包含されることが意図されている。
ここに引用した様々な文献は参照することによりそのすべてを本明細書に包含
される。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ０７Ｋ 19/00 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 37/02 ＡＡＡ
Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＡＢ
Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＢＡ
// Ａ６１Ｋ 39/395 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(31)優先権主張番号 ７３４，４２２
(32)優先日 1991年７月23日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ７５１，３５６
(32)優先日 1991年８月28日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ７６２，６７４
(32)優先日 1991年９月20日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ７９１，９２４
(32)優先日 1991年11月14日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，Ｎ
Ｌ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＳ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，Ｋ
Ｒ，ＮＯ，ＲＵ
(71)出願人 マックインタイアー，キャサリン ロウ
アメリカ合衆国 11746 ニューヨーク州
ディックス ヒルズ，ハーフ ホロー
ロード 640
(72)発明者 ハルブック，フィン
スウェーデン国 ウプサラ エス−75231
ガイジャースガタン 48エイ
(72)発明者 イバネッツ モリナー，カルロス フェル
ナンド
スウェーデン国 ハガーステン エス−
12638 タングヴァーゲン 29
(72)発明者 ペルッソン，ハーカン ベント
スウェーデン国 チュンバ エス−14743
ヴレータ ガード （番地なし)
(72)発明者 アイピー，ナンシー
アメリカ合衆国 06902 コネチカット州
スタムフォード，エミリー ドライブ
23
(72)発明者 ヤンコパウロス，ジョージ ディー.
アメリカ合衆国 10510 ニューヨーク州
ブライアークリフ メイナー，スリーピ
ー ホロー ロード 428
【要約の続き】