JPH06500016A

JPH06500016A - キメラ神経栄養因子

Info

Publication number: JPH06500016A
Application number: JP3514152A
Authority: JP
Inventors: シューター，エリック　エム．; スーター，ウルリック; アイピー，ナンシー; スクイント，ステファン　ピー．; ファース，マーク　イー．; リンゼイ，ロナルド　エム．; ヤンコパウロス，ジョージ　ディー．
Original assignee: リジェネロン　ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド
Priority date: 1990-08-08
Filing date: 1991-08-07
Publication date: 1994-01-06
Also published as: IE912793A1; US5512661A; HUT68259A; LTIP1529A; KR930700599A; FI930526A0; HU211525A9; LV10293B; NZ239312A; US5169764A; WO1992002620A1; SK7193A3; LV10293A; IL99128A; IL99128A0; AU8396991A; HU9300308D0; PT98619A; CA2088990A1; EP0542892A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、得られるキメラ分子が神経栄養活性をもつように、天然因子の一部分と、少なくとも１つのその他の分子の一部分とからなるキメラ神経栄養因子に関する。本発明は、部分的には、２つの異なる神経栄養因子の部分からなるキメラ分子が実質的に完全な生物活性を保持し、また少なくともいくつかの場合においては、単一の分子が両方の親分子の活性を有するような神経栄養活性の独特の領域をもつ、という発見に基づく。

体内のある種の細胞は、メツセンジャーとして作用して他の細胞と連絡しあい、これによって生物的機能を調整するサイトカインと呼ばれる因子を生産することができる。例えばリンパ球は、免疫系の各種成分と相互作用して免疫応答を有効に統合する因子であるリンホカインを生産する。神経栄養因子は神経系の成分の生存および／または分化を促進することができるサイトカインである。

細胞間メツセンジャーとして、サイトカインは通常サイトカイン受容体分子を介して特定の細胞集団と相互作用する。したがって、サイトカインは特定の受容体保持細胞を標的とする。サイトカインは、サイトカインを毒性物質と結合することによって毒性物質を細胞集団に送達するのに用いられることが示されていた。

例えば、Ｓｉｅｇａｌｌら（１９８９，Ｆｅｄ、Ａ＋ｎ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　３：２８４７−２６５２）はサイトカイン形質転換成長因子アルファをコードするｃＤＮＡを、細胞認識ドメインを欠くシュードモナス外毒素（Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ　ｅｘｏｔｏｘｉｎ）Ａの修飾形をコードする遺伝子の５ °末端と融合した。得られたキメラ分子を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）中で発現させ、単離したところ、上皮増殖因子受容体を特異的に表す細胞にとって極めて細胞障害性であることが見いだされた。Ｏｇａｔａら（１９８９゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８６：４２１５−４２１９）は、シュードモナス外毒素（Ｐ　Ｅ）の結合細胞ドメインをマウスリンホカイン・インターロイキン４　（ＩＬ−４）で置き換えた組換えキメラ毒素を作成したところ、キメラタンパク質ＩＬ−４−ＰＥ４０はマウスＩＬ− ４受容体保持細胞系にとって細胞障害性であることが見いだされた。Ｂａｎｋｅｒら（１９８９，Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１３９：５ｌ−５７）は、上皮成長因子−リシンＡ鎖キメラを記載する。Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９８７，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｎｇ、　１：４９３−４９８）は、ジフテリア毒素受容体結合ドメインを、インターロイキン２　（ＩＬ−２）と翻訳停止シグナルをコードする合成遺伝子で置き換えた。ジフテリア毒素／ＩＬ−２融合タンパク質はＩＬ−２受容体保持細胞中のタンパク質合成を選択的に阻害するが、ＩＬ−２受容体を発現しない細胞系は毒素作用に耐性であることが分かった。

その他の研究者もサイトカイン遺伝子とバクテリア遺伝子の少なくとも一部からなる組換えＤＮＡ分子を構築した。Ｄｉｃｏｕら（１９８９，Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、　２２：１３−１９）は、完全なマウスプレプロ神経成長因子ＤＮＡを、大腸菌のベーターガラクトシダーゼ遺伝子のカルボキシル末端と融合し、またヒト神経成長因子遺伝子のコドン１１から１０６に対応するゲノムＤＮＡ断片を、ベーターガラクトシダーゼのアミノ末端の第５コドンと融合した。

どちらのバクテリアベクターも大量のキメラタンパク質の発現に関与していた。

バクテリア細胞の溶菌後はキメラマウスプレプロ神経成長因子の大半は不溶性となるように思われたが、ヒトキメラベータ神経成長因子の大部分は上清中に存在するように思われた。

神経栄養活性は報告されていない。

最近の研究において、Ｉｂａｎｅｚら（１９９０，ＥＭＢＯＪ、　９＋１４７７ −１４８３）は部位特異的突然変異誘発によって改変した神経成長因子の研究を記載する。Ｘｉｅら（１９９０，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８７：３１８０−３１８４）は、アヘン剤受容体の研究においてキメラオピオイドペプチドの使用を記載する。Ｒａｙら（１９９０，Ｍｏｌ。

Ｂｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１０２：１０１）は、ゲノムエキランの交換から得られる成長ホルモン特異性の受容体結合特異性における改変を議論している。Ｃｕｎｎ　ｉ　ｎｇｈａｍら（１９９０，５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１３３０）は、成長ホルモン受容体と結合することのできない突然変異ホルモンを同定するために、成長ホルモンの部分を系統的に置換した。Ｃｕｎｎ　ｉ　ｎｇｈａｍら（１９９０，５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６１）は、観察されたプロラクチンの部分特異的突然変異誘発を関連づけて、成長ホルモン受容体に結合することのできるプロラクチン変異体を作成した。

２．２．神経栄養因子神経系の発生と維持は神経栄養因子として知られるタンパク質に依存する。広範な神経細胞死は中枢および末梢神経系の正常な発生を伴い、一定の標的領域に突出するニューロンの数を制御する（Ｂｅｒｇ、　Ｄ、　Ｋ、、　１９８２．　Ｎｅｕｒｏｎａｌ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　２９７−３３１）ｏ発生途中での末梢標的組織の切除および移植研究によって、その突出領域において生産される限られた量の生存因子（″神経栄養因子″）に対してニューロンが競合する結果、神経細胞死がおきることが示された。今までに同定された４つの重要な神経栄養因子とは、神経成長因子（ｎｅｒｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ　；　Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ　ａｎｄ　Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、　１９６８．　Ｐｈｙｓ、　Ｒｅｖ、　４８：５３４）　；ニューロトロフィン−３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３：　ＮＴ　−３；　Ｈｏｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎａｔｕｒｅ　３４４：３３９；　Ｍａｉｓｏｎｐｊｅｒｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６）；脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃ　ｔ　ｏ　ｒ　：　ＢＤＮＦ　；Ｂａｒｄｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　ＥＭＢＯＪ、　１：５４９）、および毛様体神経栄養因子（ｃｉｌｉａｒｙ　ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ：ＣＮＴＦ；Ｌｉｎｅｔａｌ、、１９７９，５ｃｉｅｎｃｅ２４６：１０２３）である。

２、　２．　１．神経成長因子神経成長因子（ＮＧＦ）はこれらの神経栄養分子のうちで最もよく解明されたものであり、ヒナとラットの発生初期における交感神経および神経稜由来の知覚ニューロンの生存にとって、１ｎｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの両方で不可欠であることが示された（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ　ａｎｄ　Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、　１９６３．　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、　７：６５３−６５９；　Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９６８．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ。

４８　：５２４−５６９）。発生中のヒナ胚に精製ＮＧＦを注射すると、を髄知覚ニューロンおよび交感神経ニューロンの生存性と肥大化の増加をもたらすことが見いだされた（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ　ｈｎｄ　Ｂｏｏｋｅｒ、１９６０．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　４６：３７３−３８４；　Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　１：６Ｏ−７１）。逆に新生児ラットに毎日抗ＮＧＦ抗体を注射することによって、内在性ＮＧＦを除去または隔離することが交感神経系の事実上の破壊と関連する（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ　ａｎｄ　Ｂｏｏｋｅｒ、　１９６０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　４６：３８４−３９１；　Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ　ａｎｄ　Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、　１９６６、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｒｅｖ、　１８：６１９−６２８）。子宮内での抗体注射によるか、あるいは母親の抗体の受動的経胎盤移入によって、たとえ発生の初期にでもＮＧＦ抗体にさらされると、を髄および背面内側の三叉神経知覚ニューロンのような神経稜由来の知覚ニューロンの実質的欠失をもたらすことが示された（Ｇｏｅｄｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：１５８０−１５８４；　Ｇｏｒｉｎ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　１９７９．　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７６：５３８２−５３８６）。最近に至るまで、ＮＧＦのほとんど全ての研究は末梢神経系におけるその役割に的を絞って来たが、ＮＧＦは中枢神経系における特定のニューロン集団の発生と維持にも影響を及ぼすように思われる（Ｔｈｏｅｍｅｎ　ｅｔａｌ、、　１９８７．　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　１０９：１４５−１７８；Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ　ａｎｄ　Ｓｅｉｇｅｒ、　１９８７．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　Ｒｅｖ、　１２：４３９−４６４）。

マウス下顎腺における大量のＮＧＦタンパク質のおかげで比較的慣用的なタンパク質化学手法によって一次配列が決定された（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ　ａｎｄ　Ｂｒａｄｓｈａｗ、　１９７１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　６８：２４１７−２４２０）。適当なオリゴヌクレオチドプローブをデザインするためのマウスＮＧＦのタンパク質配列の利用可能性に基づく実質的には慣用的分子生物学を用いて、ＮＧＦ遺伝子は今や多くの種、例えばマウス（Ｓｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０２：５３８−５４０）、ヒト（Ｕｉｌｒｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：８２１−８２５）、ウシおよびヒナ（Ｍｅｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　ＥＭＢＯＪ、　５：１４８９−１４９３）、ならびにラット（Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、、　２０：４０２−４１０）からクローニングされている。大量のＮＧＦが入手できるようになったことは、ＮＧＦ受容体についての研究をもおおいに容易なものとし、ついにはヒトおよびラットからのＮＧＦ受容体の１成分の分子クローニングに至った（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１１、４７：５４５−５５４；　Ｒａｄｅｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２５：５９３−５９７）。

ＮＧＦは偏在する神経栄養因子ではないことが今や確立されている。ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの研究から決定されたように、末梢神経系においては、ＮＧＦは副交感神経ニューロン、神経板由来知覚ニューロンまたは腸ニューロンに対する生存因子ではないように思われる。さらにＮＧＦは発生期の運動ニューロンに対する生存因子でもないように思われる（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ。

１９８２、　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｎｅｕｒａｌ、　２１０：１７４−１８９）。

もつとも、これらのニューロンは発生中のＮＧＦ受容体の少なくとも低親和性種を発現すると思われる（Ｒａｉｖｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　ＥＭＢＯＪ、　４：６３７−６４４）。

これらのタイプのニューロンに対するＮＧＦの影響の欠如が神経栄養因子、特にを髄運動ニューロンおよび／または毛様体神経節の副交感神経ニューロンの生存性を支えるような因子の探索を促進した。

２、　２．　２．脳由来神経栄養因子ｉｎ　ＶｉｔｒＯでヒナ胚のを髄神経節ニューロンの生存性を保持することのできる神経栄養活性が、う・ソトＣ−６グリオーマ細胞を培養しておいた”ならし培地”中で同定された（Ｂａｒｄｅ　ｅｔａｌ、、　１９７８．　Ｎａｔｕｒｅ　２７４：８１８）。この活性はマウスＮＧＦに対する抗体によっては中和されず、このことはならし培地中に他の神経栄養因子の存在することを示唆する。ＮＧＦ抗体によって阻害されない同様の活性が次いで正常成人ラット脳天グリア細胞の培養（Ｌｉｎｄｓａｙ、　１９７９．　Ｎａｔｕｒｅ　２８２：８０−８２；　Ｌｉｎｄｓａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２゜Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　２４３：３２９−３４３）および発生期と成人ラット脳ノ抽出物（Ｂａｒｄｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７７：１１９９−１２０３）ならびに発生期と成熟ヒナを髄（Ｌｉｎｄｓａｙ　ａｎｄ　Ｐｅｔｅｒｓ。

１９８４、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　１２：４５−５１）中に報告された。しかしながら、いずれの場合にも活性因子は単離も同定もされず、これらの観察された活性が同じ因子によるのか、異なる因子によるのかは疑問のままである。

ブタ脳を出発材料として用いて、Ｂａｒｄｅら（１９８２，ＥＭＢＯＪ、　１：５４９−５５３）は、現在脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と呼ばれる、ＥＩＯ／Ｅｌｌヒナ胚からのを髄神経節ニューロンの生存性を促進すると思われる因子を報告した。神経栄養活性は、ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）ゲル電気泳動で１２．３ｋＤの分子量の単一バンドとなるきわめて塩基性のタンパク質（等電点ｐＩ：１０．１）中に存在することが見いだされた。ＢＤＮＦの高塩基的性質および分子サイズがＮＧＦモノマーにきわめてよく似ていることが注目される。

ＢＤＮＦ遺伝子のクローニングは１９８９年８月３０日出願の米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｕｍｂｅｒ　０７／４００，５９１　（本明細書に参照として包含される）に記載の方法で最初に実施された。簡単に説明すると、微量のＢＤＮＦタンパク質をブタ脳から精製して、アミノ酸配列の断片を決定し、次いでこれを用いて対応するオリゴヌクレオチドをデザインした。次にこれらの合成オリゴヌクレオチドを、ＢＤＮＦ生産細胞から調製したｃＤＮＡ鋳型を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして用いた。ＰＣＲの産物をプローブとして用いて、ヒト、ブタ、ラットおよびマウスを含む多くの種からの完全長ｃＤＮＡおよび／またはゲノムＢＤＮＦ遺伝子のクローニングが可能となり、これら遺伝子の配列が決定された。組換えＢＤＮＦの発現はＣＯ８細胞で実施した。ＮＧＦとは異なるＢＤＮＦの神経特異性を最初に示したのは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで精製ＢＤＮＦが、Ｅ６、Ｅ９またはＥ１２のヒナ胚の神経板由来の節状神経節から解離した知覚ニューロンの４０−５０％の生存を支持することを示したことであった（Ｌｉｎｄｓａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｓｃｉ、　５ｕｐｐ、　３：１１５−１２９）。ＮＧＦはそれ自体またはＢＤＮＦと共に、これらニューロンに明確な影響を与えなかった。ＢＤＮＦが、生存ならびに錐体、膠状および腹側外側三叉神経節を含むその他の神経板由来の知覚神経節（これらのいずれも今までにＮＧＦに対して反応性であるとはわかっていなかった）からの神経突起伸出を支持することが、後になって移植片培養の研究で示された（Ｄａｖｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　６：１８９７−１９０４）、上記研究の全てにおいて、ＮＧＦに対する中和抗体は観察されたＢＤＮＦ活性に何ら影響を与えなかった。末梢神経節からの培養ニューロンに対する影響に加えて、ＢＤＮＦはウズラ神経稜からの細胞培養物の生存と神経分化を刺激することが見いだされた（Ｋａｌｃｈｅｉｍ　ａｎｄ　Ｇｅｎｄｒｅａｕ。

１９８８、　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　４１ニア９−８６）。

しかしながら、最近のＢＤＮＦに関する２つの研究（Ｋａｌｃｈｅｉｎｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　ＲＭＢＯＪ、　６：２８７１−２８７３；　Ｈｏｆｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｒｄｅ、　１９８８゜Ｎａｔｕｒｅ　３３１：２６１−２６２）は、鳥類ＰＮＳ発生におけるＢＤＮＦの生理学的役割を示唆してきた。Ｅ３／Ｅ４　（３日目または４日目の胚）の卵で、発生中のを髄神経節（ｄｏｒｓａｌ　ｒｏｏｔ　ｇａｎｇｌｉａ：ＤＲＧ）と神経管におけるそのＣＮＳ標的との間に障害物を置くと、多くのＤＲＧニューロンが死んでしまうことが観察された（Ｋａｌｏｈｅｉｍ　ａｎｄ　Ｌｅ　Ｄｏｕｒａｒｉｎ、　１９８６．　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉ。

１、１１６：４５１−４６）。このニューロンの死は、ＣＮＳ　（神経管）由来の神経栄養因子が奪われたためであったことが推測された。ラミニンコートのシアラスティック（ｓ　ｉａ　ｌａｓ　ｔ　ｉ　ｃ）膜に付けたＢＤＮＦがこの細胞死を防ぐことができる、ことが次いで観察された’（Ｋａｌｃｈｅｉｍ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　ＥＭＢＯＪ、　６：２８７１−２８７３）。発生中のウズラの卵にＢＤＮＦを注射すると、節状神経節における自然の細胞死を減少することが発見されたが、これはＮＧＦには見られない効果である（Ｈｏｆｅｒ　ａｎｄ　Ｂａｒｄｅ、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：２６１−２６２）。神経稜および神経板由来の末梢知覚ニューロンに対するその効果に加えて、ＢＤＮＦは発生期のＣＮＳニューロンの生存を支持することが見いだされた。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８６，Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　６：３０３１−３９３８）は、ＢＤＮＦがＥ１７ラツト胚から培養した網膜神経節細胞の生存を支持することを示唆するデータを提出した。これによって、ならし培地と網膜神経節細胞の標的領域から調製した脳抽出物がこれらニューロンの生存を支持する、ことを示した以前の研究をさらに広げた（ＭｃＣａｆｆｅｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２゜Ｅｘ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　４８：３７−３８６；　５ａｒｔｈｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　３：２５３２−２５４４；　Ｔｕｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｄｅｗ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　６：７７−８３）。

培養状態での発生期のニューロンの生存に対するその効果に加えて、ＢＤＮＦは培養成人末梢および中枢神経系ニューロンに対しても効果を有することが示された。成人知覚ニューロンは３ないし４週間の間ｉｎ　ＶｉｔｒＯで維持するのに神経栄養因子を必要としないように思われたが、ＢＤＮＦはＮＧＦと同様、培養下での成人ラットＤＲＧニューロンからの軸索の再生を刺激することが示された（Ｌｉｎｄｓａｙ、　１９８８．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　８：２３９４− ２４０５）。

さらに、成人ラット網膜の培養において、ＢＤＮＦは生存と網膜神経節細胞からの軸索の伸長との両方を促進することが観察された（Ｔｈａｎｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９．　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、１：１９−２６）。さら ↓こ、免疫細胞化学を用いるチロシンヒドロキシラーゼにポジティブな細胞の数によって測定したところ、ＢＤＮＦは腹側中脳培養での細胞の生存を長くすることが示された。さらに、ＢＤＮＦはラット中隔領域から由来の解離細胞培養におけるコリン作動性ニューロンの生存を増強する（１９８９年８月３０日出願の米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｕｍｂｅｒ　０７／４００，５９１）。ＮＧＦとＢＤＮＦの生物学的効果の比較を表１に示す。

（本頁以下余白）表１成熟ＢＤＮＦの予測される一次構造の分析によって、ＮＧＦとの驚く程の類似性が明らかになった。最大のマツチングを得るためにはたった３つのギャップをＮＧＦ配列に導入すればよく、各種ＮＧＦ　（ヘビからヒトまで）とＢＤＮＦとの間に５１の同一性があった。この同一性のうちには６つのシスティン残基が含まれることは重要である。

２．２．３．ニューロトロフィン−３ −ＮＧＦとＢＤＮＦとの間の顕著な類似性は、両者が密接に関連する神経栄養分子の大きな族の一員であることを示唆する。相同領域を用いてＢＤＮＦ／ＮＧＦ遺伝子族の新しい構成員を同定するためのポリメラーゼ連鎖反応用オリゴヌクレオチドプライマーを作成する際に、二二一口トロフィン−３と命名されるこの族の別の構成員が発見され、ＮＴ−３遺伝子をマウス、ラットおよびヒトからクローニングした（１９９０年３月７日出願の米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、０７／４９０，００４参照、なお該特許は参照としてその全てを本明細書に包含される）。１１９アミノ酸からなり、約９．５のｐＩと推定される成熟マウスＮＴ −３タンパク質の全体の構造はＮＧＦおよびＢＤＮＦで確立された構造に類似することがわかった。１８アミノ酸（そのうちのそれぞれ５および９アミノ酸がＢＤＮＦおよびＮＧＦと同一である）からなる推定のシグナル配列に、１２１アミノ酸のプロ配列（マウスＮＧＦでの１０３アミノ酸のプロ配列およびマウスＢＤＮＦでは１１２アミノ酸のプロ配列と比較されたい）が続くと思われる。成熟マウスＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３の比較から、５４アミノ酸の同一性が明らかとなった（図１）。ＮＧＦおよびＢＤＮＦではジスルフィド架橋の形成に関与することが知られている（Ｌｅｉｂｒｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４１：１４９−１５２；　Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ、　１９７３、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２：１００−１１５）　６つのシスティン全てが保存残基にある。同様に、成熟ラットＮＴ−３はラットＮＧＦとは５７％のアミノ酸相同性を有し、ラットＢＤＮＦとは５８％の相同性を有しており、１２０残基のうちの５７（４８％）がこれら３つのタンパク質の全てに共通である（図ＩＤ）。また、ラットＮＧＦおよびＢＤＮＦの６つのシスティン残基はラットＮＴ−３においても完全に保存されており、３つのタンパク質の間で最も相同な領域はこれらシスティン残基のクラスター周囲に集まっている。

棟内のＮＴ−３、ＮＧＦおよびＢＤＮＦの相同性に加えて、ラットとヒトＮＴ− ３の間には成熟ポリペプチド（１１９アミノ酸）をコードする領域での核酸配列に高度の保存が見られた。ヒトおよびラット遺伝子はＤＮＡ配列で約９２％の相同性であることが見いだされた。しかしながら、この領域でのヒトとラットの間のヌクレオチド配列における相違はいずれもアミノ酸置換には至らず、すなわち成熟ラットおよびヒト（マウスＮＴ−３でも同様）の推定されるアミノ酸配列は全く同一であり、ラット、マウス、ヒトおよびブタの成熟ポリペプチドのアミノ酸配列に完全な同一性を示すＢＤＮＦの高度の保存を暗示するものである。これとは対照的に、成熟ヒトＮＧＦおよびげっし類ＮＧＦ　（マウスまたはラット）のアミノ酸配列は約ｌＯ％異なる。

ＮＴ−３の神経栄養活性に関する研究は、ＮＴ−３が培養下での解離を髄神経節ニューロンの神経突起の生存と伸出を促進することができることを示唆している。さらに、ＮＴ−３は節状神経節および交感神経神経節の両方の移植片培養からの神経突起の伸出を促進するのが見られたが、ＢＤＮＦは節状神経節からの伸出は促進したが、交感神経神経節からの伸出は促進せず、ＮＧＦは交感神経神経節からの伸出は促進したが、節状神経節移植片がらの伸出は促進しなかった。したがって、ＮＴ−３はＢＤＮＦまたはＮＧＦよりも広い特異的活性をもつと思われる。

ＮＴ−３は神経系の発生に重要であるかもしれない。新生児と成人マウスの脳中のＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３転写物の相対量を比較すると、新生児脳のＮＴ−３レベルは成人脳でのレベルよりも高いことがわかった。中枢神経系におけるＮＴ−３ＲＮＡレベルは胎児発生期にきわめて高く、次いで成人レベルへと減少することが見られた。

２、　２．　４．毛様体神経栄養因子毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は、胚状ヒナの毛様神経節（ｃｉｌｉａｒｙ　ｇａｎｇｌｉｏｎ：ＣＧ）＝ニー０ンが１ｎｖｉｔｒｏで生存するのを特異的に促進するタンパク質である（ＭＯｎｔｈＯｒｐｅ　ｅｔａｌ、、　１９８０．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　３４：６９−７５）　ｏ毛様神経節は解剖学的には眼窩洞内に位置し、側方直筋と視神経の鞘との間にあり、毛様筋および瞳孔括約筋を刺激する眼球運動神経から副交換神経繊維を受け取る。

毛様神経節ニューロンは、一定期間での細胞死を示す神経細胞集団に属することが見いだされた。ヒナ毛様神経節においては、８日胚（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｄａｙ　８：Ｅ８）で存在するニューロンのうちの半数がＥ１４までに死ぬことが観察された（Ｌａｎｄｍｅｓｓｅｒ　ａｎｄ　Ｐｉｌｌａｒ、　１９７４．　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２４１ニア５ｌ−７３６）　。この同じ期間内で毛様神経節ニューロンはその標的組織、すなわち毛様体および眼の脈絡膜との関係を形成する。Ｌａｎｄｍｅ　ｓ　ｓ　ｅｒ　ａｎｄ　Ｐ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ａ　ｒ　（１９７４，Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　２４１ニア５ｌ−７３６）は、細胞死の期間の前に眼を摘出すると、同側神経節における毛様神経節ニューロンが完全に失われることを観察した。逆に、Ｎａｒａｙａｎａｎ　ａｎｄ　Ｎａｒａｙａｎａｎ　（１９７８，Ｊ、Ｅｍｂｒｙｏｌ、　Ｅｘ、　Ｍｏｒｐｈｏｌ、　４４＋５３ −７０）は、別の眼原基を移植して、これによって使用できる標的組織の数を増加することによって、毛様神経節ニューロンの細胞死が減少することを観察した。これらの結果は、毛様神経節ニューロンに作用する神経栄養因子が存在することと一致する。

培養下では、毛様神経節（ＣＧ）ニューロンは生存のための１または複数の因子を必要としていることが観察された。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の活性はヒナ筋肉細胞ならし培地内（ｈｅｌｆａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７６、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　５０：５４１−５４７；　Ｈｅ１ｆａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７８、　Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｅｓ、　１１３二３９−４５；　Ｂｅｎｎｅｔｔ　ａｎｄ　Ｎｕｒｃｏｍｂｅ、　１９７９、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１７３：５４３−５４８；　Ｎ１５ｈｉ　ａｎｄ　Ｂｅｒｇ、　１９７９．　Ｎａｔｕｒｅ　２７７：２３２−２３４；　Ｖａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１７３：２９−４５　）　；筋肉抽出物内（ＭｃＬｅｎｎａｎ　ａｎｄ　Ｈｅｎｄｒｙ、　１９７８．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、工０：２６９−２７３；　Ｂｏｎａｈａｎｄｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、　１８：ｌ９７−２０１）：ヒナ胚抽出物内（Ｖａｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１７３：２９−４５；　Ｔｕｔｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　１８３：１６１−１８０）　、および心臓細胞でならした培地内で同定された（議論のためには、さらにＡｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、１９７９．５ｃｉｅｎｃｅ　２０４：１４３４−１４３６およびＲａｒｂｊｎｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　４３：１４６８−１４７８参照）。

ＣＮＴＦがラット座骨神経から精製され、各種断片のアミノ酸配列が気相微量配列決定法によって決定され、得られたアミノ酸配列をポリメラーゼ連鎖反応に基づくクローニング法によるラン１−ＣＮＴＦ遺伝子のクローニングに用いた（１９８９年９月１５日出願の米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、０７／４０８，１７２および１９８９年１０月３１日出願の米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、０７／４２９，５１７：これらは参照としてその全てを本明細書に包含する）。次いでラットＣＮＴＦプローブを用いてヒトＣＮＴＦ遺伝子をクローニングした。

ヒトとラットのＣＮＴＦ遺伝子の核酸配列を比較すると、ヒト遺伝子はラットＣＮＴＦ遺伝子と同じ位置に単一のイントロンを有することを示唆した。このイントロン中では、コード領域での実質的保存とはきわめて対照的に、ヒト配列はラットとはかなり分岐したように思われる。

ヌクレオチド配列に基づいて、ＣＮＴＦは約２２．８ＫＤの分子量をもつと予測され（約２００アミノ酸の大きさと予測して計算）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析からの天然ＣＮＴＦの予測値（２２，５ＫＤ　；　５ａａｄａｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｌ。

１０８：１８０７−１８１６）と合致する。したがって、ＣＮＴＦのアミノ酸配列は、細胞質ゾルタンパク質の性質を示す、すなわちシグナルペプチドがなく、グリコジル化のためのコンセンサス配列がなく、また位置１７にただ１つのシスティン残基をもつ。ＣＮＴＦおよびＮＧＦ、ＢＤＮＦ、または繊維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒ。

ｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＦＧＦ）およびプルプリン（これらの各々はＣＮＴＦの生存活性と同様な生存活性に関連する）の間に相同性は見られなかった　（Ｕｎｓｊｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８４：　５４５９−５４６３；　５ｃｈｕｂｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０２：２２９５−２３０１　）。

多数の生物学的効果がＣＮＴＦにより生ずるものと見なされていた。ＣＮＴＦは元来、副交換神経系の成分であるＥ８ヒナ毛様神経節のニューロンの生存を支える活性として記載された。５ａａｄａｔら（１９８９，Ｊ、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１０８：１８０７−１８１６）は、彼らの最もよく精製したラット座骨神経ＣＮＴＦ調製物が、培養下のラット交換神経ニューロンのコリン作動性分化を誘導することを観察した。また、Ｈｏ　ｆ　ｆ　ｍ　ａ　ｎ　（１９８８，Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　５１：１０９−１１３）は、ヒナの眼由来のＣＮＴＦ活性が網膜細胞単層培養においてコリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ活性のレベルを増加することを見いだした。

Ｈｕｇｈｅｓら（１９８８，Ｎａｔｕｒｅ　３３５ニア０−７３）は、周産期のラット視神経および脳の、２種の異なった組織に発育しつるグリア始原細胞の集団を研究したところ、この細胞集団はまず最初に寡突起神経膠細胞となり、次いでタイプ２星状膠細胞となると考えられる。研究によれば、寡突起神経膠細胞の分化は寡突起神経膠細胞−タイブ２−星状膠細胞（０−２Ａ）始原細胞がらなんら特定の成長因子が存在しなくてもおこることを示唆しており、一方タイブ２星状膠細胞の分化は特定の誘導タンパク質の存在を必要とするように思われる。Ｈｕｇｈｅｓらは、タイプ２星状膠細胞誘導タンパク質はＣＮＴＦと同一であるが、または類似のものであることを観察した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　１９８９．　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　１２−８３−８５も参照されたい）。

さらに、組換えＣＮＴＦが培養下における中央背面を髄ニューロンの生存を促進することが示され、精製ラット座骨神経ＣＮＴＦは新生ラットの損傷頭面神経における運動ニューロンの損傷誘導化細胞死を防ぐことが観察された（１９８９年ｌｏ月３１日出願の米国特許出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、０７／４２９，５１７：参照として本明細書にその全てを包含する）。

表２はＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびＣＮ　Ｔ　Ｆ　ｉ、：関連する活性リストの要約であり、まだ同定されていない追加の活性が記載される予定である。

（本頁以下余白）表２１、ＮＧＦに応答する細胞Ａ、交感神経Ｂ、神経稜由来の知覚ニューロンＣ，Ｅ６−Ｅ１２を髄神経節り、基底前脳コリン作動性ニューロンＩ１．ＢＤＮＦに応答する細胞Ａ、神経稜由来の知覚ニューロン（ｉ）を髄神経節（Ｅ　１０／Ｅ　１１）（ｉｉ）頚動脈神経節（ｉｉｉ）背中線三叉神経神経節（ｉｖ　）三又神経中脳核Ｂ、外胚葉板由来の知覚ニューロン（ｉ）節状神経節（ｉｆ）前庭神経節（ｉｉ）錐体神経節（ｉｖ　）原状神経節（ｖ）腹側外側三叉神経神経節Ｃ１網膜神経節り、腹側中脳ドーパミン作動性ユニーロンＥ、基底前庭コリン作動性ニューロンＩ［ｒ、ＮＴ−３に応答する細胞Ａ、を髄神経節Ｂ、交感神経神経節Ｃ９節状神経節ＩＶ、ＣＮＴＦに応答する細胞Ａ、Ｅ８毛様体神経節Ｂ、交感神経コリン作動性ニューロンＣ，タイプ２星状膠細胞り、背面中部を髄ニューロンＥ、運動ニューロン（例えば、顔面神経運動ニューロン）Ｆ、Ｅｌｏ　ＤＲＧニューロン３、　発明の要約本発明は、天然に存在する細胞因子の少なくとも一部と少なくとも１つの他の分子の一部を含むキメラ神経栄養因子（ｃｈｆｍｅｒｆｃ　’ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）に関するものであり、得られるキメラ分子は神経栄養活性を有する。本発明は、幾分かは、ＮＧＦとＢＤＮＦの両方の一部分を含むキメラ分子が神経栄養活性をもつらしく、ある事例ではどちらの親分子よりも大きい活性スペクトルを示すという発見に基づいている。さらに、それは、神経栄養因子配列と他のペプチド配列を含むキメラ分子が神経栄養活性を保持し、ある事例では親因子よりも強力な活性を示しつるという発見に基づいている。

本発明は、キメラ神経栄養因子をコードする核酸、これらのキメラ神経栄養因子の発現方法、キメラ神経栄養因子タンパク質およびそのペプチドフラグメント並びに誘導体、特異的決定基を規定するためにキメラ神経栄養因子に対して誘導された抗体、および本発明のキメラ神経栄養因子を利用する神経障害の診断・治療法を提供する。また、本発明は生物学的に活性なニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）をコードする多くの特定の組換えプラスミドを提供する。

本発明のキメラ神経栄養因子は自然界に存在する神経栄養因子と比べて多くの利点をもたらす。キメラ神経栄養因子は、例えば単一の分子で２種の神経栄養因子の活性を与えたり、あるいは内因性の神経栄養因子のスーパーアゴニストとして作用して、より低い用量で生物学的応答を増強させたりする。さらに、本発明のキメラ神経栄養因子は、神経栄養因子に応答する細胞へ活性化合物を運搬するのに有用であろう。その上、特定の生物学的活性を保持するが、あるサブセットの因子応答性細胞に向かうキメラ神経栄養因子のデザインは、親分子のより広範な活性の合併症を回避しつつ神経障害の治療を可能にするだろう。

４、　図面の説明図１．　３つのオリゴヌクレオチドブライマーと１段階ポリメラーゼ・チェーン・リアクションを用いたＢＤＮＦ−ＮＧＦキメラの構築において採用された戦略の模式図。プライマーは、反応生成物がＮａｒｌおよびＮｏｔｌ制限酵素切断部位（ｐＣ８ｈＢ（Ｐｌ）発現プラスミド中のＢＤＮＦプレプロ領域の後に生成物を挿入させる）を含むようにデザインされた。斜線の領域はＮＧＦ配列を表し、中空の領域はＢＤＮＦ配列を表す。

図２．３段階ポリメラーゼ・チェーン・リアクションで４つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＢＤＮＦ−ＮＧＦキメラの構築において採用された戦略の模式図。斜線の領域はＮＧＦ配列を表し、中実の領域はベクター配列を表し、そして中空の領域はＢＤＮＦ配列を表す。

図３．ｍｙｃ付加した神経栄養因子キメラの構築において採用された戦略の模式図。

Ａ、ｍｙｃ付加ＮＧＦの構築；ｍｙｃ配列には細線を引いてあり、中空の領域はＮＧＦ配列を表す。

Ｂ、ｍｙｃ付加ＢＤＮＦの構築；ｍｙｃ配列には細線を引いてあり、中空の領域はＢＤＮＦ配列を表す。

図４．５０μＩのａｓＳ標識ＣＯＳ細胞上清を１５％ＳＤＳ　ＰＡＧＥで分割し、標識タンパク質をナイロンメンブランに電気泳動的に移行させた。このメンプランをフィルムに一晩露光させ、得られたオートラジオグラフの写真を撮った。

レーンｉ、ｃｏｓ擬似；レーン２．ヒトＢＤＮＦ　、レーン３．ｈＢＤＮＦ／３ °ｍＶｃ　（ＢＭＩ）；レーン４．ｍＮＧＦ　；レーン５．ｍＮＧＦ／３’　ｍｙｃ　（ＮＭＩ）。分子量標準を示しである。

図５．キメラ神経栄養因子Ｒ１−ＲＩＯ，ＢＭＩおよびＮＭＩの推定アミノ酸配列。

図６．（Ａ）ＢＤＮＦ　；　（Ｂ）ＮＧＦまたは（Ｃ）ＢＭＩ、ｍｙｃ付加ＢＤＮＦで処理したを髄神経節（ＤＲＧ）または交感神経節（ＳＧ）のＭＴＴ比色定量アッセイの結果。５７０−６５０ｎｍでの吸光度を、神経栄養活性を含むｃｏｓ細胞上清の次第に増加する希釈度の関数としてプロットしである。

図７．３段階ポリメラーゼ・チェーン・リアクションで４つのオリゴヌクレオチドブライマーを用いたＮＧＦ−ＢＤＮＦキメラの構築において採用された戦略の模式図。プライマーＡはＴ７プライマーであり、プライマーＢとＣは作製された１２のキメラの間で異なり、表１０に示され、そしてプライマーＤはＴ３プライマーである。斜線の領域はベクター配列を表し、中空の領域はプレプロ配列を表し、点刻した領域は成熟ＮＧＦ配列を表し、そして中実の領域はＢＤＮＦ配列を表す。

図８．Ａ、ＮＧＦ−ＢＤＮＦキメラ神経栄養因子の発現に使用した修飾ｐＢＪ− ５ベクター。このベクターはアンピシリン耐性遺伝子（中実の矢印）、ｐＢＲ３２２複製起点（中空の矢印）、ＳＲプロモーター（点刻した矢印ゴａｋｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、　８：　４６６−４７２）およびスプライス接合部、ポリＡ部位、Ｎｏｔｌ、５ａｃｌＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むクローニング部位（斜線の矢印）を含んでいる。

Ｂ、野生型ＮＧＦ、ベクター（対照）およびＮＧＦ−ＢＤＮＦキメラ５ｌ−Ｓ１２でトランスフェクトしたＣＯ８細胞の代謝標識付けの結果。４０μｌのＣＯ８細胞上清を直接１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに負荷し、電気泳動を行った。

Ｃ０抗ＮＧＦ抗体て免疫沈降させた、野生型ＮＧＦ、ベクター（対照）およびＮＧＦ−ＢＤＮＦキメラ５ｔ−３１２でトランスフェクトしたＣＯ８細胞の上清中の代謝標識タンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動。４００μｍの上清に対して免疫沈降を行った。電気泳動は１２．５％５ＤＳ−ポリアクリルアミド上で行った。

図９、キメラ５ｌ−３１２の図。中空の領域はＮＧＦ配列を、中実の領域はＢＤＮＦ配列を表す。

Ａ）上段パネル：異なる種から単離されたＮＧＦ分子のアミノ酸配列比較。

Ｂ）下段パネル：ＮＧＦとＢＤＮＦ配列のアミノ酸配列比較。

高い棒：この位置では高度に変化するアミノ酸が可能である。

低い棒：この位置では保存的アミノ酸変化のみが可能である。

棒なし：この位置でのアミノ酸はあらゆる既知のＮＧＦとＢＤＮＦを通して保存されている。

図１０．キメラ神経栄養因子５ｌ−８１２の推定アミノ酸配列。

図１１．ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３のアミノ酸配列。矢印はシスティン残基を示す。可変領域Ｖｌ−Ｖ４は上位の横線で示しである。

５、　発明の詳細な説明発明の詳細な説明を限定せずに明瞭なものとするために、次の小分節に分けて記載することにする：（ｉ）本発明のキメラ神経栄養因子；（ｉｉ）キメラ神経栄養因子の構築；（ｉｉｉ）キメラ神経栄養因子の発現；（ｉｖ）キメラ神経栄養因子の活性およびニューロン特異性を同定するための神経栄養因子アッセイ；（ｖ）キメラ神経栄養因子に対して誘導された抗体；および（ｖｉ）本発明の有用性。

５．１．　本発明のキメラ神経栄養因子本発明は、（ｉ）細胞因子の少なくとも一部と少なくとも１つの他のタンパク質の一部を含み、かつ（ｉｉ）神経栄養活性を有するキメラ神経栄養因子を提供する。本発明のキメラ神経栄養因子は細胞因子またはその一部を含み、それら自体が神経栄養活性をもっていてもいなくてもよ（、細胞因子の数種の名を挙げると、神経成長因子、脳由来の成長因子、ニューロトロフィン−３、毛様体神経栄養因子、繊維芽細胞増殖因子（酸性または塩基性および関連ファミリーのメンバー）、上皮増殖因子、腫瘍増殖因子β、腫瘍増殖因子α、インターロイキン１、インターロイキン２、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、成長ホルモン、バソアクティブ・インテステイナル・ペプチド、バソプレッシン、インシュリンなどが含まれるが、これらに限定されない。

本発明のキメラ分子は細胞因子の少なくとも一部と少なくとも１つの他のペプチドまたはタンパク質の一部を含み、前記ペプチドまたはタンパク質は神経栄養活性をもつ化合物に由来してもしなくてもよい。このペプチドまたはタンパク質は、例えば神経栄養因子、細胞因子、トキシン、酵素、免疫グロブリン、または機能的活性と関連がある又はない、あるいは抗原性がある又はない他のペプチド配列の全部または一部を含むだろう。

例えば、制限するものではないが、本発明は、以下の第５．４０節に記載するような神経栄養活性を示す次のキメラ分子を提供する：（ｉ）−緒に結合された２つの完全な神経栄養因子を含むキメラ分子；（ｉｉ）　１つの完全な非神経栄養細胞因子に結合された１つの完全な神経栄養因子を含むキメラ分子；（ｉｉｉ）　２つの神経栄養因子の一部を含むキメラ分子；（ｉｖ）神経栄養因子の一部と非神経栄養細胞因子の一部を含むキメラ分子；（ｖ）神経栄養因子の少なくとも一部と抗原性がある又はないペプチド配列を含むキメラ分子；（ｖｉ）　２つの神経栄養因子の少なくとも一部と抗原性がある又はないペプチド配列を含むキメラ分子。

本発明のキメラ神経栄養因子はペプチド以外の化合物に結合されていてもよい。

例えば、キメラ神経栄養因子に炭水化物、リピド成分または他の有機化合物を結合させることが望ましいだろう。

このような化合物には毒性物質、抗増殖剤、高度免疫原性物質、血管形成剤、抗血管形成剤、凝血剤、抗凝血剤、蛍光化合物、放射性化合物などが含まれる。

神経栄養因子または他の細胞因子の一部と別の神経栄養因子または他の細胞因子の一部を結合させる場合は、１つの因子の一部を欠失して別の因子の一部で置き換え、これにより親因子の一方の大体の大きさを維持するようにキメラ分子をデザインすることが好ましいが、本発明はこれに限定されない。さらに、２つの因子が相同領域を含む場合は、その相同領域を互いに交換し、これにより両方の親因子に相同であるが親因子とは異なるキメラ分子を作ることが好適である。別の態様では、最小の機能をもつと考えられる因子の領域を、生物学的に活性であると考えられる他の因子または他のペプチドの領域と置き換えることもできる。このようなキメラは親因子と比べて増強された生物学的活性を示すだろう。また、望ましくない生物学的活性と関連していると思われる因子の領域は、望ましくない活性が軽減または排除されるように、他の因子またはペプチドの一部と置き換えてもよい。かかる態様は望ましくない副作用や毒性が最小限のキメラ神経栄養因子の開発に有用であろう。

これとは別に、本発明のキメラ分子は、細胞因子をコードする配列がペプチドまたはタンパク質をコードする配列によって中断される核酸配列によりコードされてもよく、このような分子によりコードされるキメラ神経栄養因子は因子タンパク質内部への挿入により特徴づけられる。さらに、本発明は、因子の少なくとも一部と他のペプチドとのアミノ末端またはカルボキシ末端融合体を提供する。

いくつかの事例において、２つの因子の相同部分が交換される場合、キメラ分子は１個のアミノ酸によってその鋭化合物の一方と効果的に相違することがある。

このようなキメラ神経栄養因子は本発明によって意図され、以下の第８節で論じられるキメラＳ−６および５−１１により例示される。

本発明の好適な態様では、関連した神経栄養因子の対応部分を交換することによりキメラ神経栄養因子が作製される。本発明の好ましい特定の態様において、キメラ神経栄養因子の分子は、最近確認された“ニューロトロフィン”ファミリー（ＮＧＦＳＢＤＮＦ、ＮＴ−３およびこれまでに確認された他のメンバーを含む）の２以上のメンバーの一部を含む。これらの特定の態様によれば、ニューロトロフィンファミリーのメンバーの一部がこの分子の二次および／または三次構造を保持するように再配列されよう。本発明の別の態様では、ニューロトロフィンファミリーのメンバーと関連した二次および／または三次構造とコンホメーションが保持されるように、非ニューロトロフィンファミリーのペプチド配列の挿入、またはニューロトロフィンファミリーのコード配列の一部と非ニューロトロフィンファミリーのペプチド配列との置換が達成されよう。ここで用いる「二二一口トロフィンファミリーのメンバーと関連した二次および／または三次構造とコンホメーション」なる表現は、ニューロトロフィンファミリーのメンバーにより共有される配列、構造および化学的特徴を意味するように解釈され、これらの特徴はつまり約１２０アミノ酸残基の長さ、約９−１０のｐＩ、およびアミノ酸１４．５７．６７．７９．１０Ｂおよび１１０付近（約５アミノ酸以内）に、または二二一口トロフィンファミリーのメンバーにより共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、位置づけられた６個のシスティン残基のことである。例えば、魚のＮＧＦ配列は成体アミノ酸６５に２２ｂｐの挿入を保有し、これは哺乳類のＮＧＦに類似したコンホメーションをこの分子の残部の構造がとるように多分ループを作っているだろう。本発明の好ましい特定の態様において、少なくとも１つのニューロトロフィンファミリーメンバーの一部を含むキメラ神経栄養因子は、上記の位置付近に少なくとも４個のシスティン残基を含む。より好ましい特定の態様では、本発明のキメラ神経栄養因子は上記の位置付近に少な（とも５個のシスティン残基を含む。本発明の最も好ましい特定の態様では、キメラ分子は上記の位置付近に６個のシスティン残基を含む。本発明の別の好ましい特定の態様では、キメラ神経栄養因子は上記の位置付近に少なくとも４個のシスティン残基を含み、かつ約９−１ＯのｐＩを示す。本発明のより好ましい特定の態様では、キメラ神経栄養因子は上記の位置付近に少なくとも５個のシスティン残基を含み、かつ約９−１ＯのｐＩを示す。本発明の最も好ましい特定の態様では、キメラ分子は上記の位置付近に６個のシスティン残基を含み、かつ約９−１ＯのｐＩを示す。

本発明は、キメラ神経栄養因子をコードする核酸、並びにキメラ神経栄養因子タンパク質およびそのペプチドフラグメントおよび誘導体を提供する。本発明の好ましい態様において、キメラ神経栄養因子はＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３（これらの配列は図１１に示す）を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの二二一口トロフィンファミリーメンバー（上記参照）の一部を含む。本発明の好ましい特定の態様では、キメラ神経栄養因子はキメラ分子Ｒ１−ＲＩＯ１ＢＭＩ、ＮＭＩおよび５ｌ−Ｓ１２について図５および１０に示したようなアミノ酸配列を有する。本発明のキメラ神経栄養因子の分子は、−次アミノ酸配列として、実質的に図５およびｌＯに示したアミノ酸配列（この配列内の残基を機能的に等しいアミノ酸残基で置換して、サイレント変化を生じさせた改変配列を含む）の全部または一部を含むものであるが、これらに限定されない。例えば、この配列内の１個以上のアミノ酸は、機能的均等物として作用してサイレント変化をもたらす類似の極性の他のアミノ酸と置き換えることができる。この配列内のアミノ酸の代替アミノ酸はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選ばれる。

例えば、無極性（疎水性）アミノ酸としてはアラニン、ロイシン、イソロイシン、ノくリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンがある。極性中性アミノ酸としてはグリシン、セリン、トレオニン、システィン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンがある。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リシンおよびヒスチジンがある。負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスノ（ラギン酸とグルタミン酸がある。翻訳の間または後に、例えばグリコジル化、加水分解切断、抗体分子や他の細胞リガンドへの結合などにより、修飾されたキメラ神経栄養因子タンノ（り質またはそのフラグメントもしくは誘導体も本発明の範囲内に含まれる。また、本発明は図５およびＩＯに示したアミノ酸配列をコードする核酸分子、またはその一部もしくは機能的均等物を提供する。さらに、本発明は第１０節に示したプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−ｓｉないし１２、ｐ　Ｃ８ｈ　Ｂ／ｈＮ−Ｒ１ないし１０、ｐＣ８１ｍＮ／ｍｙｃ−ＮＭｌおよびｐＣ８ｈＢ／ｍｙｃ−ＢＭＩ、並びにそれらが含む核酸配列によりコードされるキメラ神経栄養因子を提供する。

本発明は、ヒト、サル、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、鰯歯類またはトリの細胞因子を含むがこれらに限定されない生きている生物由来の細胞因子を含むキメラ神経栄養因子を提供する。

５．２．　キメラ神経栄養因子の構築キメラ神経栄養因子をコードする核酸は標準的な組換えＤＮＡ法を使って、例えば細胞因子および／または他のペプチドをコードする核酸を制限酵素とＤＮＡリガーゼで切断およびスプライスすることにより構築することができる。別法として、核酸配列は固相ホスホルアミダイト法のような化学合成により構築することもできる。本発明の好ましい態様では、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Ｐ　ＣＲ；　５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０−１３５４）を用いて、重複伸長（Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｇｅｎｅ７７：６ｌ−６８）による核酸配列のスプライシングを達成し、これにより本発明のキメラ神経栄養因子を作製する。以下の第６節で詳述するように、キメラ神経栄養因子は３つのオリゴヌクレオチドブライマーを用いた１段階ＰＣＲにより、または４つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた３段階ＰＣＲにより作製される。図１および２はこれら２つの技法の模式図である。例えば、細胞因子（Ｘ）の少なくとも一部をコードする核酸は、３つのオリゴヌクレオチドプライマーを作製することにより真核生物ペプチド（Ｙ）をコードする核酸配列にスプライスされる。３つのプライマーのうち１つはＸ配列の一部に対応しくＸプライマー）、もう１つはＹ配列の一部に対応しくＹプライマー）、そして３つ目はＸ配列とＹ配列の両方の一部を含む（ＸＹプライマー）。さら（こ、プライマー中に有用な制限エンドヌクレアーゼの切断部位を組み込むことが好ましい。以下の表３はＢＤＮＦ−ＮＧＦキメラを作るために使用しうるプライマーの例を示している。これら３つのオリゴヌクレオチド（図１ではそれぞれプライマーＡ、ＣおよびＢで表される）を１段階ＰＣＲで一緒にするが、ＸとＹプライマーはＸＹプライマーよりも多量に、例えば約１００：１：１００のＸ：ＸＹ：Ｙの比で存在することが望ましい。ＰＣＲで使用される鋳型はスプライスすべき細胞因子とタン、＜り質またはペプチドをコードする核酸の混合物でありうる。スプライス部位の位置は架橋ヌクレオチド（例えば、ＸＹプライマー）により決定される。当分野で日常的に用いられる増幅条件を採用することができ、例えば標準ＰＣＲ反応溶液および方法を使って、約９４℃で１分、約４３℃で２分、および約７２℃で３分を３５サイクル行う。その後、得られたＰＣＲフラグメントはゲル電気泳動によりゲル精製し、適切な制限エンドヌクレアーゼ酵素で切断し、そして適当なりローニングベクターに挿入する。

また、図２に示すように、キメラ神経栄養因子は４つのオリゴヌクレオチドを用いた３段階ＰＣＲにより作製することもできる。

例えば、ＢＤＮＦ−ＮＧＦまたはＮＧＦ−ＢＤＮＦキメラを作るために使用しうるオリゴヌクレオチドはそれぞれ表４と１０に示しである。ヌクレオチド配列ＸとＹの間でスプライスを行うために、次のプライマーが構築されよう＝（ｉ）プライマーＸ、Ｘ配列に対応する（図２のプライマーＡ）；プライマーＹ、Ｙ配列に対応する（図２のプライマーＤ）；プライマーｘｙ、ｘとＹの両方の部分配列に対応する（図２のプライマーＢ）；およびプライマーＸＹ’　、これもＸとＹの両方の部分配列に対応するが、さらにプライマーＸＹに相同である（図２のプライマーＣ）。１つのＰＣＲ反応では、プライマーＸとＸＹを配列Ｘ鋳型から増幅し、ＸおよびＹ配列の一部を含む核酸を作る。別のＰＣＲ反応で、プライマーＹとＸＹ’　を配列Ｘ鋳型から増幅し、他のＰＣＲ反応で得られた核酸分子のＹ部分と重複するＸおよびＹ配列の一部を含む核酸を作る。２つのＰＣＲの生産物を一緒にしてＰＣＲで増幅すると、Ｘ配列にＹ配列が挿入された核酸分子が作製される。２つの異なる鋳型を用いるこの方法の変法も本発明に従って採用することができる。その後、得られたキメラ神経栄養因子遺伝子をクローン化するために、ＰＣＲ，ＰＣＲ産物の精製、制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断が上記のように使用されよう。

ＤＮＡ反応産物は当分野で知られた方法を使ってクローン化することができる。

当分野で知られた多くのベクター／宿主系を使用しうる。可能なベクターとしてはコスミド、プラスミドまたは修飾ウィルスがあり、これらに限定されないが、ベクター系は用いる宿主細胞と適合しうるちのでなければならない。このようなベクターにはラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ■（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミド誘導体のようなプラスミドが含まれるが、これらに限定されない。

組換え分子は形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションなどにより宿主細胞に導入することができる。

５．３．　キメラ神経栄養因子の発現キメラ神経栄養因子タンパク質をコードするヌクレオチド配列は適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写・翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入される。必要な転写・翻訳シグナルは天然のキメラ神経栄養因子遺伝子および／またはそのフランキング領域によって供給されてもよい。タンパク質コード配列を発現させるために、種々のベクター／宿主系を利用しうる。

これらにはウィルス（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルスなど）に感染した補乳動物細胞系；ウィルス（例えば、バキュロウィルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母、バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌のような微生物が含まれるが、これらに限定されない。これらのベクターの発現要素はそれらの強さおよび特異性が異なっている。使用する宿主／ベクター系に応じて、多くの転写・翻訳要素のいずれか１つが使用されよう。

ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入について以前に記載された方法のどれかを用いて、適当な転写／翻訳調節シグナルとタンパク質コード配列から成るキメラ神経栄養因子遺伝子を含む発現ベクターを構築する。これらの方法にはｉｎ　ｖＨｒｏ組換えＤＮＡ法、合成法およびｉｎ　ｖｉｖｏ組換え（遺伝的組換え）が含まれる。

キメラ神経栄養因子タンパク質またはペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現は、キメラ神経栄養因子タンパク質またはペプチドが組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現されるように、第二の核酸配列により調節することができる。

例えば、キメラ神経栄養因子の発現は当分野で知られたプロモーター／エンハンサ−要素によりコントロールできる。キメラ神経栄養因子の発現をコントロールするために使用しつるプロモーターとしてはサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、５Ｖ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ　ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ、　１９８１゜Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−３１０）　、ラウス肉腫ウィルスの３°　ロング・ターミナル・リピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８０、　Ｃｅ１ｌ　２２ニア８７−７９７）　、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

７８：１４４−１４４５）　、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２）；原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７８、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７５：３７２７−３７３１）、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：２ｌ−２５）、また５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、　１９８０゜２４２ニア４−９４中の“組換えバクテリアがらの有用なタンパク質”も参照；ツバリンシンターゼプロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０３：２０９−２１３）またはカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ　ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８１．　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９：２８７１）を含む植物発現ベクター、および光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　＆１．，１９８４＋　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：１１５−１２０）；酵母や他の真菌からのプロモーター要素、例えばＧａ１４プロモータ＋、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示しかつトランスジェニック動物において利用された次の動物転写調節領域：膵臓の線屑細胞において活性のエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：６３９−６４６；　０ｒｎｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、　１９８７．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　７：４２５−５１５）；膵臓のベータ細胞において活性のインシュリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ、　１９８５゜Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５−１２２）、リンパ球系細胞において活性の免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：６４７−６５８；　Ａｄａｍｅｓ　ｅｔ　ａｔ、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：１４３６−１４４４）、畢丸、乳房、リンパ球系およびマスト細胞において活性のマウス乳癌ウィルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４５：４８５−４９５）、肝臓において活性のアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８７、　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　Ｉ：２６８−２７６）　、肝臓において活性のα−フェトプロティン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８５．　Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：１６３９−１６４８；　Ｈａｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５：５３−５８）　；肝臓において活性のαｌ−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７．　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　１：１６１−１７１）、骨髄球様細胞において活性のβ−グロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−３４０；　Ｋｏｌｌｉａｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８゜Ｃｅ１ｌ　４６：８９−９４）；脳の乏突起神経膠細胞において活性のミニリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７゜Ｃｅ１ｌ　４８ニア０３−７１２）；骨格筋において活性のミオシン軽鎖−２遺伝予調節領域（Ｓａｎｉ、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１４：２８３−２８６）　、および視床下部において活性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３７２−１３７８）が含まれるが、これらに限定されない。

キメラ神経栄養因子遺伝子の挿入物を含む発現ベクターは３通りの一般的手法：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）　“マーカー”遺伝子機能の有無、および（Ｃ）挿入配列の発現により同定することができる。最初の方法では、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在を、挿入したキメラ神経栄養因子遺伝子に相同な配列から成るプローブを用いてＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出できる。２番目の方法では、ベクターへの外来遺伝子の挿入によってもたらされるある種の“マーカー”遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウィルスでの封入体の形成など）の有無に基づいて、組換えベクター／宿主系を同定し、選択することができる。例えば、キメラ神経栄養因子遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列の内部に挿入されると、キメラ神経栄養因子挿入物を含む組換え体はマーカー遺伝子機能の不在により同定できる。３番目の方法では、組換え体により発現された外来遺伝子産物を検定することにより組換え発現ベクターを同定しうる。このような検定は、例えば、以下の第５．４１節に記載するようなバイオアッセイ系でのキメラ神経栄養因子遺伝子産物の物理的または機能的性質に基づくものである。

ひとたび特定の組換えＤＮＡ分子が同定されて単離されると、それを増殖させるために当分野で知られた幾つかの方法が用いられる。適当な宿主系と増殖条件が確立されたら、組換え発現ベクターを増殖させて大量に調製することができる。

先に説明したように、使用できる発現ベクターには次のベクターまたはそれらの誘導体：２．３の名を挙げると、ワタシニアウイルスやアデノウィルスのようなヒトまたは動物ウィルス；バキュロウィルスのような昆虫ウィルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）；プラスミドおよびニスミドＤＮＡベクターが含まれるが、これらに限定されない。

さらに、挿入配列の発現を調整するか、あるいは希望する特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択することもできる。ある種のプロモーターからの発現はある種の誘導物質の存在下で高められる。かくして、遺伝子操作されたキメラ神経栄養因子タンパク質の発現をコントロールすることができよう。さらに、個々の宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後のプロセッシングと修飾（例えば、グリコジル化、切断）のための特殊な機構をもっている。発現された外来タンパク質の希望する修飾およびプロセッシングを確実にするように、適切な細胞系や宿主系が選ばれる。例えば、細菌系による発現は非グリコジル化コアタンパク質産物の生産に用いられよう。酵母による発現はグリコジル化産物をもたらすだろう。哺乳動物細胞による発現は異種キメラ神経栄養因子タンパク質の“天然”グリコジル化を確実にするよう用いられる。さらに、種々のベクター／宿主発現系は加水分解切断のようなプロセッシング反応に様々な程度で影響を及ぼすだろう。

本発明の特定の態様において、キメラ神経栄養因子をコードするＤＮＡは、以下の第６および８節に記載する方法に従ってＣＯ８細胞系で発現される。ひとたびキメラ神経栄養因子遺伝子を発現する組換え体が同定されたら、その遺伝子産物を分析すべきである。これは遺伝子産物の物理的または機能的性質に基づいたアッセイにより達成されよう。第５．４９節を参照されたい。

キメラ神経栄養因子タンパク質が同定されたら、それをクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、および大きさにより分画化するカラムクロマトグラフィー）、遠心、分別溶解といった標準方法、またはタンパク質精製のための他の標準手法により単離・精製する。

さらに、本発明のキメラ神経栄養因子タンパク質およびペプチドは当分野で公知の標準ペプチド化学合成法を使って製造するこ本発明のキメラ神経栄養因子は神経栄養活性を示す。ここで用いる“神経栄養活性”という用語は、ニューロン、星状細胞、ダリア細胞、乏突起神経膠細胞、小ダリア細胞およびシュヴアン細胞を含むがこれらに限定されない神経系細胞に対する生物学的作用を意味すると解釈されるべきである。生物学的作用とは、キメラ神経栄養因子に直接または間接的にさらすことにより生じる神経系細胞の構造および／または生理現象の変化のことである。生物学的作用の例としては生存の延長、神経突起の発生、分化した機能（例えば、コリンアセチルトランスフェラーゼやチロシンヒドロキシラーゼのような酵素の発現）の維持または発生、あるいは逆に、細胞の死または老化、もしくは脱分化がある。

神経栄養活性の存在はこのような活性の既知のアッセイや今後開発されうる系を用いて調べることができる。アッセイ系には、例えば組織移植片、組織から調製された細胞または不死化細胞系（例えば、脳、を髄、末梢神経系に由来するもの）を用いる組織培養バイオアッセイ系のようなｒｎ　ｖｉｔｒｏ試験系、およびキメラ神経栄養因子を動物に投与し、このような動物における神経栄養作用を化学的、組織学的または挙動試験により検出するｉｎ　ｖｉｖ。

試験系が含まれる。さらに、ヒト以外のトランスジェニック動物にトランスジーンとしてキメラ神経栄養因子を組み込み、前記動物においてその生物学的作用を測定することもできよう。

例えば、限定するものではないが、神経栄養活性は次の公知のバイオアッセイ系のいずれかを用いて測定することができる＝（ｉ）を髄神経節アッセイ系、Ｂａｒｄｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７：１１９９−１２０３に記載される（参照によりその全体をここに引用する）；（ｉｉ）下神経節アッセイ系、Ｌｉｎｄｓａｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ。

１１２：３１９−３２８に記載される（参照によりその全体をここに引用する）；（ｉｉｉ）交感神経節アッセイ、Ｂａｒｄｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　ＥＭＢＯＪ、　１：５４９−５５３に記載される（参照によりその全体をここに引用する）；（ｉｖ）毛様体神経節アッセイ、Ａｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．５ｃｉｅｎｃｅ２０４：１４３４−１４３６に記載される（参照によりその全体をここに引用する）；（Ｖ）を髄ニューロン：簡単に説明すると、を髄を試験動物から無菌的に摘出し、延髄の後端で切断し、知覚神経節と髄膜を取り除く。次に、別々に培養するためにを髄を腹側セグメントと中背側セグメントに分割し、組織を細かく刻み、そして３３ｍＭグルコース、２ｍＭグルタミン、１５ｍＭ　ＮａＨＣＯｌ　、ｌｏｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　２５８ｇ／ｍｌインシュリン、１００μｇ／ｍＩ　トランスフェリン、６０μｍプトレシン、２０ｎＭプロゲステロン、３０ｎＭ　Ｎａセレナイト、０．５　μｇ／ｍｌペニシリンＧ、０．５μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２．５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを補給した５０％ＤＭＥＭ　（Ｇｉｂｃｏ）および５０％Ｈａｍ’　ｓ栄養培地Ｆ１２　（Ｇｉｂｃｏ）中でパスツールピペットにより摩砕して解離させる。その後、摩砕を２回繰り返し、上清をプールし、４０μｍＴｅｔｋｏフィルターを通して濾過する。解離した腹側細胞はポリーＤ−リシ、ン被覆（１０μｇ／ｍり培養皿に３５　ｍｍ皿あたり５０万個の細胞の密度でまく。解離した中背側細胞はポリー〇−リシン（１０μ ｇ／ｍｌ）　、ポリーＬ−オルニチン（１０ｔ１ｇ／ｍｌ）またはポリーＬ−オルニチンとラミニン（５μｇ／ｍｌ）を被覆した３５　ｍｍ皿あたり１５０万個の細胞の密度でまく；（ｖｉ）基底前脳コリン作動性ニューロン（米国特許出願Ｓ、Ｎ。

０７／４００．５９１参照）；（ｖｉｉ）腹側中脳ドパミン作動性ニューロン（米国特許出願Ｓ、　Ｎ。

０７／４００．５９１参照）；および（ｖｉｉｉ）Ｐ　Ｃ１２細胞。

５．５．　キメラ神経栄養因子に対して誘導された抗体本発明によれば、キメラ神経栄養因子タンパク質、またはそのフラグメントもしくは誘導体は、抗キメラ神経栄養因子抗体を生産するための免疫原として使用される。抗キメラ神経栄養因子免疫応答を生ずる可能性を改善するために、キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列を分析して、免疫原性の増強と関連する分子の部分を同定することができる。例えば、アミノ酸配列をコンピュータ分析にかけて、Ｂ型肝炎表面抗原の抗原性ペプチドの同定に使用して成功を収めたＨｏｐｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓの方法（１９８１，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８：３８２４−３８２８）により表面エピトープを同定しつる。また、異なる種からのキメラ神経栄養因子の推定アミノ酸配列を比較し、相対的に非相同性の領域を同定することができよう。これらの非相同領域はいろいろな種にわたって免疫原性があるようだ。

キメラ神経栄養因子に対するモノクローナル抗体を調製するために、培養下の連続細胞系による抗体分子の生産をもたらす技術はどれも使用できる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７５゜Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７）によって最初に開発されたハイブリドーマ技法、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　ｒｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４ニア２）　、およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃａｆｅｅｔ　ａｌ、、１９８５．　ｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　ＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ”　、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、　ｐｐ、　７７−９６）などが本発明の範囲内である。

治療用のモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体またはキメラ・ヒト−マウス（または他の種）モノクローナル抗体でありうる。ヒトモノクローナル抗体は当分野で知られた多くの技術により作ることができる（例えば、Ｔｅｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０ニア３０８−７３１２；　Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３゜Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４ニア２−７９；　０１ｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２．　Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９２：３−１６）。キメラ抗体分子はマウス抗原結合領域とヒト不変領域を含むものを製造しうる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：６８５１；　Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｔ、。

１９８５、　Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４５２）。

当分野で知られた種々の方法が、キメラ神経栄養因子のエピトープに対するポリクローナル抗体を製造するために使用できる。

抗体の製造のために、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラットなどを含み、これらに限定されない）はキメラ神経栄養因子タンパク質またはそのフラグメントもしくは誘導体を注射して免疫する。免疫応答を高めるために、宿主動物種に応じて、各種アジュバントを使用することができ、アジュバントとしてはフロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）やコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）のような有用でありうるヒトアジュバントがあるが、これらに限定されない。

キメラ神経栄養因子のエピトープに対する抗体の分子クローンは既知の方法により作製することができる。組換えＤＮＡ法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照）を使って、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築しうる。

抗体分子は既知の方法、例えば免疫吸着またはイムノアフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）のようなりロフトグラフィー法、あるいはこれらの組合せにより精製することができる。

抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは既知の方法により作製することができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ“）２フラグメント、Ｆ　（ａｂ’　）　ｉフラグメントのジスルフィド橋を還元することにより得られるＦａｂ’　フラグメント、および抗体分子をパパインと還元剤で処理することにより得られる２ＦａｂまたはＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。

（本頁以下余白）５．６８発明の用途本発明は、多様な診断および治療への応用に利用できるキメラ神経栄養因子遺伝子とタンパク質を提供するものである。本発明のキメラ神経栄養因子としては、（ｉ）２つの神経栄養因子の活性を単一の分子中で結合させ、（ｉｉ）天然に存在する因子に対応する活性の独特のスペクトルを示し、（ｉｉｉ）天然に存在する因子のスーパーアゴニストとして機能するか、または（ｉｖ）天然に存在する因子のアンタゴニストもしくはインヒビターとして機能する分子が挙げられる。

本発明のキメラ神経栄養因子は、診断的応用に利用できる。例えば、本発明のキメラ神経栄養因子は、抗原性ペプチド付加、例えば、標識した抗体に結合することのできるｍｙｃ付加物（下記第７章を参照）からなっていてもよい。そのようなキメラ神経栄養因子は、神経栄養因子に応答する細胞に結合してもよく、間接的に標識を結合させることにより、神経栄養因子応答細胞のインディケータ−として働き、神経系の障害の診断または研究に有用となりうる手法として役立つであろう。最小の向神経性活性を有するキメラ神経栄養因子を診断目的のために設計することは望ましいものであろう。

また、本発明は多様な診断的応用におけるキメラ神経栄養因子の用途も提供するものである。キメラ神経栄養因子は、特別な例において、単一分子中で幾つかの神経栄養因子に典型的に関連のある活性を与えるという利点を提供し、および／または、活性の範囲をキメラの親分子の活性以上に拡げるという利点を提供する。

例えば、キメラＮＭＩは、ｍｙｃ抗原性ペプチドに結合したＮＧＦからなリ、を髄神経節、節状神経節、および交感神経節を用いるバイオアッセイにおいて活性を示した；　対照的に、天然のＮＧＦは、節状神経節アッセイにおいて、殆どもしくは全く活性を有していない。従って、ＮＭＩは、その親分子であるＮＧＦに一般的には応答しない細胞タイプにその影響を与えるので、拡がった範囲の活性を示す。このことは、交感神経系ニューロン、副交感神経系二ニー−ロン、および感覚ニューロンにおける応答、例えばアミロイド多発神経障害、糖尿病性神経障害、および自律異常多発性神経障害−における応答を誘導することが望ましいような状況において特に重要であることを表わすものであろう。を髄神経節、交感神経節、および節状神経節も、ニューロトロフィンの組合せ、例えばＢＤＮＦとＮＧＦの組合せに対して、またはＮＴ−３因子のみに対して応答するであろうが、全ての３つの細胞タイプに影響を与えているキメラ分子は、ＢＤＮＦプラスＮＧＦまたはＮＴ−３のみの投与により引き起こされうる副作用が比較的無いことであろう。更に、キメラ神経栄養因子は、それらの天然に存在する対応物よりも高い活性を示すであろう；　例えば、第６図に示すように、ＢＤＮＦとｍｙｃペプチドの部分からなるＢＭＩは、を髄神経節および交感神経節アッセイにおいて、ＢＤＮＦよりも高い生存促進活性を示すことが発見された。ＮＧＦおよびＢＤＮＦは、付加的な向神経性活性を有することが観察された；　本発明によれば、単一のキメラ神経栄養因子を利用して、多数の親因子の活性を単一分子で提供できる。

更に別の実施態様において、キメラ神経栄養因子は毒素成分を含んでもよく、キメラ神経栄養因子に応答する細胞、例えば、神経系起源の、ウィルス感染の細胞もしくは腫瘍に応答する病的細胞の除去のために用いてもよい。

本発明の多様な実施態様において、キメラ神経栄養因子タンパク質、ペプチドフラグメントまたはペプチド誘導体は、神経系が、外傷、手術、虚血、感染（例えば、ポリオまたはエイズ）、代謝異常、栄養不足、悪性腫瘍、または毒物により損傷しているような患者に投与することができる。本発明の更に別の実施態様において、キメラ神経栄養因子タンパク質もしくはそれに由来するペプチドフラグメントまたは誘導体は、アルツハイマー病、老化、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチングトン舞踏病および運動性ニューロンの疾患と異常などの、しがしこれらに限定されることのない先天的条件または神経変性異常を治療するために用いることができる。

発明の具体的な実施態様において、キメラ神経栄養因子タンパク質、または、それに由来するペプチドフラグメントまたは誘導体の投与は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症および他の運動性ニューロン疾患（例えば、ウェルドニゲ・ホフマン病を含む）、およびパーキンソン病の治療において、組織の外科的移植または他の持続的放出性組成物と連係させて用いることができる。アルツハイマー病は、基部大脳でコリン作動性の選択的損失を伴うものであることが示されており、パーキンソン病の約３５パーセントの患者が、アルツハイマータイプの痴呆に苦しんでいる；　本発明により作られるキメラ神経栄養因子は、この病気複合のための有用な単一薬剤治療であることが判明するであろう。同様に、本発明により作られるキメラ神経栄養因子を治療的に用いて、ダウン・シンドロームに連係するアルツハイマー病を治療できるであろう。本発明により作られるキメラ神経栄養因子は、多様な痴呆並びに生来的学習障害の治療に用いることができる。

本発明の更に別の実施態様において、キメラ神経栄養因子タンパク質、フラグメントまたは誘導体は、他のサイトカインと連係させて用いて、所望の向神経性効果を達成することができる。キメラ神経栄養因子、それから作られたタンパク、ペプチドフラグメントまたは誘導体、もしくは（キメラ神経栄養因子タンパク質、ペプチドフラグメント、または誘導体に対する）抗体または抗体フラグメント、または、キメラ神経栄養因子と第２の薬剤（例えばＮＧＦ）の組合せからなってもよい本発明の活性組成物は、塩溶液、綬衝性塩溶液、デキストロース、および水等の、しかしそれらに限定されることのないどんな滅菌生物適合性担体中において投与してもよい。

特別な障害や状態の治療に効果的となるであろうキメラ神経栄養因子タンパク、ペプチドフラグメント、誘導体、または抗体の量は、その障害または状態の性質に依存するであろうし、標準的な臨床技術により決定することができる。可能であれば、投与・応答曲線と本発明の医薬組成物を、最初にインビトロで、例えば、上記のキメラ神経栄養因子バイオアッセイ系で決定し、次に、ヒトでの試験前に有用な動物モデル系で決定することが望ましい。

投入の方法として、皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、および鼻内があるが、これらに限定されない。更に、本発明の医薬組成物を、心室内および包膜内の注入等の適当な経路により中枢神経系中に投入することは望ましいものであろう；心室内注入は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのりザーバーに取り付けられた心室内用カテーテルにより容易になるであろう。投入の方法は、再充填可能もしくは生物的分解の可能な器具によってもよい。

更に、本発明の医薬組成物を治療の必要な部分に局所的に投与することも望ましいものであろう；　これは、例えば、手術中の局所注入により、注射により、カテーテルの手段により、またはラジウム挿入管（該ラジウム挿入管は、シアルアエティック（ｓｉａｌａｅｔｉｃ）膜などの膜またはファイバー等の多孔性、非多孔性、もしくはゲル状の材質からなる）によって達成することができるが、これらに限定されることはない。

また、本発明は、リポソーム、マイクロ粒子、またはマイクロカプセルを経て投与されたキメラ神経栄養因子タンパク質、ペプチドフラグメント、または誘導体も提供するものである。本発明の多様な実施態様において、キメラ神経栄養因子およびキメラ神経栄養因子関連生成物の持続的放出を達成するために、そのような組成物を用いることは有用であろう。

６、実施例：　ＢＤＮＦ／ＮＧＦおよびｍｙｃで付加されたキメラ神経栄養因子の作成と発現多くの遺伝的に修飾されたＮＧＦおよびＢＤＮＦの分子は、そのような修飾がＮＧＦまたはＢＤＮＦの作用の特異性を変えるものであるかを調べるために作成した。コンストラクト（構築体）は、重複伸長による遺伝子スプライシングを達成するために、ポリメラーゼ鎖反応を用いて作った（Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｇｅｎｅ　７７：６ｌ−６８）。

６、ｌ、材料と方法６、ｌ、１．キメラ分子の構築３つのオリゴヌクレオチドブライマーを利用する一段階のポリメラーゼ鎖反応、または、その代わりに４つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用する３段階ポリメラーゼ鎖反応によりキメラ分子を作るプロトコールを設計した。これらの方法を用いて、８ＯＮＦとＮＧＦをコードする配列の部分からなるＲ２〜ＲＩＯと称される９種類のキメラおよびＮＭＩとＢＭＩの２種類のキメラ（この２種類のキメラは、それぞれがＮＧＦとＢＤＮＦ上に「付加されたＪ　ｍｙｃタンパク質の部分をコードする核酸からなる；　この付加配列は、ｇｌｕ−１ｙｓ−１ｅｕ −ｉｌｅ−ｓｅｒ−ｇｌｕ−ｇｌｕ−ａｓｐ−１ｅｕである）を作った。

キメラＲ１のために、ｈＮＧＦを、Ｃ１ａｌ制限部位を含む５°−オリ培とＮｏｔ１部位を含む３゛−オリゴにより増幅した。次に、ＰＣＲフラグメントをｐＣ８ｈＢ　（ＰＩ）のＮａｒｌ／Ｎｏｔ１部位にサブクローン化した。

キメラＲ１を作るために用いたオリゴヌクレオチドは以下の通り５　’　−ＧＣＴＡＴＧＣＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＡＴＣＴＣＡＣＡＧＣＣ第１図は、ｔｔｏｒｔｏｎらにより記載された方法（１９８９，Ｇｅｎｅ　７７：６ｌ− ６８）の改良法を用いて、重複伸長による遺伝子スプライシングを行なうために、３種類のオリゴヌクレオチド（ＡＳＢ、およびＣと称する）を一段階ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ；　５ａｉｋｆ　ｅｔ　ａｌ。

１９８５、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：　１３５０−１３５４）に使用することを示す図である。

３種類のオリゴＡ”、Ｂ″、および“Ｃ′″は、１００：ｌ：１００の比率で、ｈＢＤＮＦ　（ｐＣ８−ｈａ　（ＰＩ）と称される、ｐＣＤＭａ中のヒトＢＤＮＦのための発現プラスミド）およびｈＮＧＦ　（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ、より購入したヒト合成ＮＧＦ遺伝子）である二つの鋳型を用いる一段階ＰＣＲ反応に用いた。最初の２〜３ステツプ中の非対称増幅の結果として、主として一末鎖生成物Ａ−Ｂができた。

次に、これはオリゴＣで増幅され、融合生成物Ａ−Ｃを形成した。

この方法を用いて、ＢＤＮＦ分子の主な部分の置換は、成熟ＢＤＮＰ分子の一部をＮＧＦ分子の一部と融合させることにより行なった。融合の位置は、５°末端のＮＧＦ配列と３′末端のＢＤＮＦ配列から構成される中間オリゴ（“Ｂ″）により規定される。通常用いられる増幅条件は、３５サイクルのために、９４℃で１分間、４３℃で２分間それに７２℃で３分間であった。ＰＣＲフラグメントはゲルにより精製し、Ｎａｒｌ／Ｎｏｔｌで消化し、ｐｃ８ｈＢ　（ＰＩ）の対応部位中にサブクローン化した。この方法を用いて、キメラＲ２〜５　（ｐｃ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ１−９Ｃ８ｈＢ／、ｈＮ−Ｒ５と称する）を構築した。表３は、５ °オリゴヌクレオチド（図１のプライマーＡに対応する）、中間オリゴヌクレオチド（図１のプライマーＢに対応する）、および３′オリゴヌクレオチド（図１のプライマーＣに対応する）を含む、キメラＲ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５を作るために用いた３種類のオリゴヌクレオチドを示している。

（本頁以下余白）表３Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５キメラの構築に用いたオリゴヌクレオチドプライマー中間オリゴ同じ５°−オリゴと３°−オリゴをキメラＲ３〜Ｒ５のために用いた（本頁以下余白）６．１．ｌ、２．三段階ポリメラーゼ鎖反応を用いるキメラ分子第２図は、重複伸長による遺伝子スプライシングを行なうために、４種類のオリゴヌクレオチド（Ａ、Ｂ、Ｃ，およびＤと称する）を３段階ＰＣＲ反応に使用することを示す概要図である。プライマーＢおよびＣは、ＮＧＦ配列の部分を含んでいたので、最終的な反応生成物は、ＢＤＮＦの比較的小さい配列がＮＧＦ配列により置換されたキメラ分子であった。

第２図に示すように、ブルースクリプト・ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中のｈＢＤＮＦを５°オリゴ（Ａ）および中間オリゴ（Ｂ）により増幅Ｌ、一方、９００Ｍ８中ノｈＢＤＮＦハ、中間オリゴ（Ｃ）および３゜−オリゴ（Ｄ）により増幅した。これらの２種類のＰＣＲフラグメントは、ゲルにより精製し、アリコートをそれに続く反応で結合した。その２種類の中間オリゴヌクレオチドは、それらの５′末端で重複するＮＧＦ配列を含んでいたので、その２種類のＰＣＲフラグメントＡ〜ＢとＣ〜Ｄは、重複域において互いにハイブリダイズすることができ、従って、５゛および３°オリゴヌクレオチドにより増幅することができ、その結果、ＮＧＦによる小さい置換を含んだＰＣＲフラグメントができた。このフラグメントは、Ｎａｒｌ／Ｎｏｔｌで消化し、ｐＣ８−ｈＢ　（ＰＩ）中の対応する部位の中にクローン化した。

出発物質として異なるベクター中にクローン化された、各々が独自の末端オリゴ（それぞれプライマーＡおよびＤ）を有する２種類のＢＤＮＦ鋳型を用いることにより、偽のネガティブ（ｆａｌｓｅ　ｎｅｇａｔｉｖｅｓ）が得られる可能性を回避した。この方法を用いて、キメラＲ６〜１０　（ｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ６、ｐＣ８ｈＢ／　ｍＮ−Ｒ７〜ｐＣ８ｈＢ／　ｍＮ−ＲＩＯ）を作成した。キメラＲ６のために、ｐＢＳ−ｈｅをプライマーＡおよびＢのための鋳型として用い、一方、合成ｈＮＧＦをプライマーＣおよびＤのための鋳型として用いた。

表４は、キメラＲ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびＲＩＯの構築に用いたオリゴヌクレオチドブライマーを示している。

（本頁以下余白）表４Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲＩＯＮＭＩおよびＢＭＩキメラの作成に用いたオリゴヌクレオチド同じ５′−オリゴと３°−オリゴをキメラＲ８〜ＲＩＯのために用いたキメラ　ＲｌＯｈｉ中間オリゴＭ１６．１．１．３．　ｍｙｃ付加を含むキメラ分子の作製前述の、３つのオリゴヌクレオチドプライマーを利用する一段階ＰＣＲ反応を使用して、ヒトｍｙｃ蛋白質の１０個のアミノ酸より成る抗原ペプチド断片で付加しである、ＮＧＦもしくはＢＤＮＦをコードする発現プラスミド類を作製した（本明細書中に参照により引用される、１９９０年６月１日付けの、米国特許出願Ｎｏ、０７１５３２，２８５を参照）。この一段階ＰＣＲ技術を用いて、２つのグリシンをコードする架橋を通して１０個のアミノ酸のｍｙｃエピトープをコードする配列に接続されているマウスのＮＧＦ遺伝子（長いＮＧＦ前駆体をコードするプラスミドであるｐＢ１５−ＮＧＦに由来する）を含むＰＣＲ産物を作成したが、このＰＣＲＣラプライマー類然のＮＧＦ遺伝子の最後の２つのコドンを削除したＰＣＲ産物をもたらすように設計されており、その理由は、これらのコドンによりコードされているアミノ酸がｍｙｃエピトープの欠失を結果的に招く蛋白質分解の開裂部位に相当する可能性があるためである。３°端にｍｙｃを付加しであるｍＮＧＦ　（ｐＣ８１ｍＮ／ｍｙｃ−ＮＭＩと表示する）を作製するために、長いプレプロを有するマウスのＮＧＦ　（２０ｎ　ｇ）を、５“オリゴヌクレオチド、中間部分のオリゴヌクレオチド、及び、３′オリゴヌクレオチドをそれぞれ１００．１１及び１１００ｎの濃度で用いて増幅させた（図３Ａ）。使用した増幅条件は以下に示すとおりである２９４℃で１分、４３℃で２分、及び、７２℃で３分を３５サイクル。結果として生じるＰＣＲ産物を、その後、Ｘｈｏｌ／Ｎｏｔｌで消化し、更に、Ｘｈｏｌ／Ｎ。

ｔｌで消化しであるＣＤＭ８ベクター内にクローン化した。３゛端にｍｙｃエピトープを付加しであるＢＤＮＦ　（ｐＣ８ｈＢ／ｍｙｃ−ＢＭＩと表示する）を同様の手法を使用して作製した（図３Ｂ）。

同様の技術を使用して、２つのグリシンをコードする架橋を通して、１０個のアミノ酸より成るｍｙｃエピトープをコードする配列に接続しであるヒトＢＤＮＦ遺伝子を含むＰＣＲ産物を作製したが、ＮＧＦ／ｍｙＣキメラについてと同様に、このＰＣＲＣラプライマー類然のＢＤＮＦ遺伝子の最後の３つのコドンが除去されたＰＣＲ産物を生じるように設計されており、その理由は、これらのコドンによりコードされているアミノ酸類がｍｙｃエピトープの欠失を結果として生じる蛋白質分解の開裂部位に相当する可能性があるためである。このＰＣＲ産物を、その後、Ｎａｒ１／Ｎｏｔｌで消化し、更に、親プラスミドであるヒトＢＤＮＦ発現プラスミド、ｐＣ８ｈＢ　（ＰＩ）内にサブクローン化して発現プラスミドｐＣ８ｈＢ／ｍｙｃ　（ＢＭＩ）を作製した。

８、　１．　２．キメラ神経栄養因子発現構造物のトランスフェクション及びＣＯ８細胞中における発現前述の哺乳類の発現構造物類の各々についてのプラスミドＤＮＡを、塩化セシウム濃度勾配を通して２回のバンド形成（ダブルバンディング）を行うことにより調製した。精製したプラスミドＤＮＡを、その後、リン酸カルシウム共沈殿法（Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：２７４５　（１９８７）　）によりＣ０８−Ｍ５細胞中にトランスフェクトさせた。Ｃ０８−Ｍ５細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、６０ｍｍプレート内に、グルコース（４５００ｔｔｇ／ｍｌ）及び１０％のウシ胎児血清を含む２．５ｍ１のダルベラ：Ｉ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）改変型イーグル（Ｅａｇｌｅ）培地中で、プレート当たり５Ｘ１０’細胞の密度でまいた。トランスフェクトさせた細胞からの培地を、バイオアッセイのためにトランスフェクションの４８時間後に収集した。代謝ラベル化もこの時に行った（下記）。

トランスフェクション後４８時間して、ＣＯ８−Ｍ５細胞を、メチオニン及びシスティンを含まず、かつ、インシュリン、トランスフェリン及びセレニウムを含む、３ｍｌのＤＭＥＭ　（無血清）中に入れた。この細胞を、５％のＣＯ２中において３７℃で１時間、アミノ酸飢餓状態に曝した。１ミリリツトルの無血清ＤＭＥＭを除去し、更に、Ｃ０８−Ｍ５細胞を、３′ｓ−メチオニン及び３５８− システィン（各１００μＣｉ／ｍｌ）で４時間ラベルした。ラベル化したＣ０８ −Ｍ５細胞上清を回収してＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。図４は、代謝的にラベル化したｈＢＤＮＦ、ｍＮＧＦ、ｈＢＤＮＦ／ｍｙｃ　（キメラＢＭＩ）、及び、ｍＮＧＦ／ｍｙｃ　（キメラＮＭＩ）の分割を示ＮＧＦ及びＢＤＮＦ遺伝子の一部分を、ポリメラーゼ・チェーン・リアクションにおけるプライマーの重複伸長を利用して一緒にスプライスした。比較的大きい（キメラ　Ｒ１−Ｒ５）もしくは小さい（Ｒ６−ＲＩＯ）領域がＮＧＦ配列に置換されているキメラ分子が作製された。Ｒ１−Ｒ１Ｏのアミノ酸配列を図５に示しである。キメラ　Ｒ１からＲ６はヒトＢＤＮＦ及びヒトＮＧＦの一部分を含み、かつ、キメラ　Ｒ７がらＲＩＯはヒトＢＤＮＦ及びマウスＮＧＦの一部分を含む。表５は、キメラ　Ｒ１がらＦｌｏにおけるＢＤＮＦ及びＮＧＦ配列の大まがな領域の概略を示（本頁以下余白）表５Ｒ１プレプロ配列　完全な成熟配列Ｒ２プレプロ配列　残基１８−１２０残基１〜１７Ｒ３プレプロ配列　残基５９−１２０残基１−５８Ｒ４プレプロ配列　残基７３−１２０残基１−７２残基６７−１１８残基８０−１１８更に、ｍｙｃ蛋白質の１０アミノ酸抗原ペプチドで付加しであるＮＧＦ及びＢＤＮＦをコードするキメラ分子類を作製した。ＮＧＦ／ｍｙｃ　（キメラ　ＮＭＩ）及びＢＤＮＦ／ｍｙｃ　（キメラＢＭＩ）の推定アミノ酸配列を図５に示しである。

このキメラ構造を各々リン酸カルシウム共沈殿によりＣＯＳ　−Ｍ５細胞中にトランスフェクトさせた。キメラ　Ｒ１−ＲＩＯの発現は代謝ラベル化及び生物活性アッセイにより検証される。ＮＭｌ及びＢＭＩの発現を証明する目的で、ＮＭＩもしくはＢＭＩでトランスフェクトさせたＣＯ８細胞を［’Ｓ］　−メチオニンで代謝的にラベル化し、その上清をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、更にその後、電気泳動的に分離した蛋白質をナイロン膜に移してオートラジオグラフィーを行った（図４）。ＢＤＮＦ及びキメラ　ＢＭＩについては、同定されたラベル化蛋白質の主要バンドはこれらの蛋白質類の前駆体型に相当する３１ｋＤのバンドであった。前駆体バンドの強度を比較することにより、これら２つの蛋白質はほぼ同等に発現されていることが明白である。

この３１ｋＤの蛋白質バンドはＣＯ３−擬似レーン（レーンｌ）には存在しない。ＮＧＦ及びキメラ　ＮＭＩについては、これらの蛋白質類の成熟型（約１２．５ｋＤ）の同等の発現が観察された。予想されたように、ｍｙｃが付加されているＮＧＦ　（ＮＭＩ）は、ＮＧＦに比較して若干遅れて泳動した。全てのＢＤＮＦ／ＮＧＦキメラ（Ｒ１−ＲＩＯ）は、ＢＤＮＦに類似するレベルで３１ｋＤの前駆体蛋白質を主に発現した。

全てのキメラ（Ｒ１−ＲＩＯｌ並びに、ＢＭＩ、及び、ＮＭＩ）、及び、天然のＢＤＮＦ及びＮＧＦを先に記載したようにＣ０３−Ｍ５細胞中で発現させた。トランスフェクトさせた細胞から収集した上清は、組織移植片及び解離させた細胞培養物を利用して特定の神経節の神経突起の発生を誘発させる能力についてバイオアッセイで測定した。

キメラ類の活性は、を髄神経節（Ｄ　ＲＧ）もしくは交感神経節（ＳＧ）からの培養解離細胞の生存率の測定により検定した。簡単に述べると、Ｒ８−９のニワトリの胚から神経節を切り出し、血清含有培地（１０％のＦＢＳ、ストレプトマイシン、ペニシリン、及び、グルタミンを補給しであるＤＭＥＭ）中に集めた。

０．５％のトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）でのトリプシン処理後、細胞を緩やかに摩砕し、その後、６０ｍｍの表面未処理プラスティック皿上に予備プレートした。この予備プレート段階（２−３時間）により非ニューロン細胞が付着する。付着しなかったニューロン細胞をその後−まとめにし、遠心し、血清含有培地中に再懸濁させ、更に、血球針によりカウントした。ニューロンの生存は、細胞数の定量化、あるいは、ＭＴＴ　（３−（４゜５−ジメチルチアゾール −２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）の生存細胞による紫色の産物への変換に基づく比色定量アッセイのいずれかにより評価することができる。細胞計測法については、細胞を、２４，０００細胞７３５ｍｍ皿の密度でまき、細胞数測定の前に、発現されたキメラ蛋白質を含むＣＯ８上清の存在もしくは非存在下で４８時間培養した。ＭＴＴ法については、細胞を、１０００細胞／Ａ２ウエルの密度でまいた。まいた後４０時間目に、ＭＴＴ染料を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加した。生存細胞に取り込まれた染料を８時間後にイソプロパツール中の０．０８ＮのＨＣＩの添加により可溶化させ、更に、吸光度（５７０−６５０ｎｍ）を測定した。吸光度は添加したＣＯ８上清の様々な希釈度の関数としてプロットした。

？、１．２．　ＰＣ１２細胞のバイオアッセイトランスフェクトさせた細胞からのＣ０８−Ｍ５細胞上清を、ＰＣＩ２細胞分化アッセイのために、トランスフェクト後４８時開目に収集した。ＰＣＩ２細胞を、ウェル当たりｌＸｌ０６細胞の密度で２４ウエルのプレー）（Ｃｏｓｔａｒ社）にまいた。ＰＣＩ２細胞を、６％のウシ胎児血清及び６％のウマ血清を含むＲＰＭ１１６４０中で培養した。ＣＯＳ上清を、１：５と１：５００との間の様々な希釈率で、ＰＣ１２細胞培養物（総容量１ｍ１）に添加した。神経突起の発生を、＋（大部分の細胞が神経突起を発現する）、もしくは、−（あるとしてもほんの僅かな細胞が神経突起を発現する）のいずれかで評価した。

ニワトリの末梢神経節を使用するインビトロアッセイが、ＮＧＦとＢＤＮＦの生物活性を識別するために使用されている。両方の因子が神経層に由来するを髄神経節（ＤＲＧ）中に存在する知覚ニューロン群に作用する一方、ＢＤＮＦのみが板（Ｐｌａｃ。

ｄｅ）由来の節状神経節（ＮＧ）の知覚ニューロンに作用する。

対照的に、ＮＧＦはを椎傍鎖系の交感神経節（ＳＧ）のニューロンの生存及び増殖を促進することができるが、ＢＤＮＦにはその作用がない。我々は、これらのインビトロでの神経節アッセイを使用して、特定のキメラ構造が、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、もしくは、ＢＤＮＦとＮＧＦの両方の生物活性を発現しているか否かを決定した。

キメラ　Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、ＲＩＯｌＢＭＩ、及び、ＮＭＩは、を髄神経節、節状神経節、あるいは、交感神経節の移植片アッセイにおいて、神経栄養活性について測定した。

既に証明したように、ＮＧＦとＢＤＮＦとの両方が、Ｒ８のニワトリのを髄神経節（ＤＲＧ）からの神経突起の成長を促進する。ＢＤＮＦのみが、節状神経節（ＮＧ）と共にアッセイした場合に神経突起成長の活性を発現したが、ＮＧＦは交感神経節（ＳＧ；表６）についての活性を発現し、ＢＤＮＦは発現しなかった。

ＢＤＮＦ／ＮＧＦキメラ　Ｒ８は、ＤＲＧ及びＳＧの両方からの神経突起の発生を促進し、ＮＧＦ様生物活性の特性を示した。

ｃ−ｍｙｃプロト腫瘍遺伝子のｌＯアミノ酸エピトープで付加したキメラの内のＢＭＩはＳＧ活性を発現してＮＧＦ様活性の特性を示す一方、ＮＭＩはＢＤＮＦ様活性に特徴的なＮＧについての幾分かの活性を発現した（表６）。

（本頁以下余白）表６移植したニワトリの胚のを髄神経節（ＤＲＧ）　、節状神経節（ＮＧ）　、及び、交感神経節（ＳＧ）についてアッセイした場合のＢＤＮＦＳＮＧＦ、ＢＤＮＦ／ＮＧＦキメラ類及びｍｙｃで付加見ム豊旦未！恩五ｑ焦軟−一一−−一一−− −−−−−−−−−Ｒ７（２５０μｌ）　３　１　０Ｒ８（２５０μｍ）　３−４　２　３Ｒ９（２５０μｍ）　２−３　２　０ＲＩＯ（２５０μｍ）　３−４　２　０ＮＧＦ　５　１　５ＢＤＮＦ　・　３　２　０．５ｐＣＤＭ８対照（２５０μｍ）Ｏ−１０，５０，５ＢＭＩ（２５０μｍ）　２− ３　２　１２ＮＭＩ（１００μｌ）　５　３　５評定値は観察された神経突起の成長及び分岐の程度を反映し、５が最高評定値であり、かつ、０は神経突起の成長が無い場合である。評定値は３回の独立した実験の代表値である。神経突起の成長は、神経栄養因子の添加後２４時間と４８時間の間に評定した。

表８から、用量反応実験において、神経突起の成長の誘導に関して、ＮＭＩはを髄神経節及び交感神経節アッセイにおいてＮＧＦに匹敵する活性を有することがわかったが、ＮＭＩは節状神経節アッセイにおいてより活性が高かったことがわかる。ｍｙｃで付加したＮＧＦに関して、表７からは、ＮＭＩが５０μｌでを髄神経節ニューロンの約６３パーセントを救済する一方、ＮＧＦは約４７パーセントのみを救済することがわかった。これにより、ＮＭＩはニューロン生存に関してＮＧＦのアゴニストとして作用しうろことが判明した。

図６は、ＢＤＮＦ、ＮＧ、もしくは、ＢＭＩにさらしたＤＲＧ及びＳＧニューロンについてのＭＴＴを用いた比色定量アッセイの結果を示している。図６中に示されているように、ＢＭＩの生存促進活性は、ＤＲＧ及びＳＧの両方において、ＢＤＮＦよりも有意に高かった。ＮＧＦに類似して、ＤＲＧ及びＳＧの両方におけるこの活性は、ＢＭＩのＣＯ８上清の１：１０００希釈液においてさえも滴定値が０にならなかった。従って、ＢＤＮＦ分子の３’　ｍｙｃの付加はその分子にＳＧ活性を付与する。

（本貫以下余白）表７Ｅ８のニワトリ胚からの解離したＤＲＧニューロンの生存についてアッセイした場合のＮＧＦ及びＮＭＩ活性の比較ＤＲＧニューロンの数ＮＧＦ　５μ　３３６２０μ　４４０５０μ　４０８ＮＭＩ　５μ　３３４２０μ　４４６５０μ　５４２カウントされたＤＲＧニューロンの数は総面積の３．６％に相当し、これは、２つの皿から得られた結果の平均値である。ＮＧＦのＣＯ８上清は５０μｌで約４７％のＤＲＧニューロンを救済するが、等容量のＮＭＩは約６３％のニューロンを救済する。

（本頁以下余白）表８Ｅ８のニワトリのＤＲＧＳＮＧ、及び、ＳＣＧの移植片についてアッセイした場合のＮＧＦ及びＮＭＩ活性の比較ＤＲＧ　ＮＧ　ＳＣＧ神経突起の成長は、神経栄養因子の添加の２４時間後に評定した。

７．２．２．　ＰＣ１２バイオアッセイラットＰＣＩ２細胞は神経成長因子を初めとする数々の作用因子に反応して分化することがわかっている。神経成長因子により誘導される分化反応は、細胞増殖の停止及び長い神経突起伸長部の成長に関連している。従って、この分化アッセイは、神経成長因子様活性を有する分子を同定するために有用である。我々は我々のキメラ構造物類の全て及び天然のＢＤＮＦとＮＧＦとを、それらがＰＣ１２細胞の神経突起の成長を誘導する能力についてテストした。

表９に示されているように、ＮＧＦは、１：２５０の希釈においてさえ有意な神経突起促進活性を有した。ＮＭＩもやはり１：２５０希釈において活性であった。キメラ　Ｒ８（これは交感神経節に対して活性を発現した一表１を参照）は、ｌ：５０希釈において、ＰＣＩ２細胞の神経突起の成長を誘導することが可能であった。驚いたことに、同様の結果がＢＭＩについても得られ、ＢＭＩは親分子であるＢＤＮＦにおいては存在しない神経栄養活性を示した。ＢＤＮＦのみが、１：５の希釈で、ＰＣ１２細胞について弱い神経突起の成長活性を発現した。ＣＯ３−擬似は活性を示さなかった。キメラ　Ｒ１−Ｒ５、及び、Ｒ７、Ｒ９、及び、Ｒ１０は活性を示さなかった。

従って、組織移植片及びＰＣＩ２細胞の両方についてのアッセイでは、ＢＤＮＦ及びＮＧＦ分子のＣ末端への無関係な配列の付加が、親分子中に存在しない新規な生物学的活性を付与している。

（本頁以下余白）表９キメラ　１：５　１：２５　１：５０　１：１００　１：２５０　１：５００ＣｏＳ−ＭＯＣＫ　−−−−−＋ＰＣ１２細胞は、神経栄養因子の添加後２４時間と４８時間の間に、神経突起の成長について評定した。

（本頁以下余白）８、実施例：　ＮＧＦ／ＢＤＮＦキメラ神経栄養因子類の作製及ＮＧＦの領域をＢＤＮＦの対応する領域で置換したキメラ神経栄養因子類を作製した。

ＮＧＦ／ＢＤＮＦキメラを、前述の第６．１．１．２節において記載したように、４つのオリゴヌクレオチドを用いる３段階ＰＣＲ反応により作製した。各事例においては、最も外側のプライマー（図２及び図７中のＡ及びＤに対応する）はオリゴヌクレオチド　Ｔ７及びＴ３　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）であった。図７はキメラの作製に使用した方法の概略図であり、表１Ｏは図７中のプライマーＢ及びＣに対応するオリゴヌクレオチドプライマーの配列を示している。Ｔ３プライマーの配列は、５’　−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡ　ＣＴＡＡＡＧ−３°であり、かつ、Ｔ７プライマーの配列は、５’　−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３°である。簡単に述べると、マウスのベーターＮＧＦをコードするｃＤＮＡを、もとのＳｍａ　Ｉ及びＰｓｔＩ部位で切断しく５ｃｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ　３０２：５３８）　、更に、ｐＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＳｍａＩ／ＰｓｔＩ制限部位内へサブクローン化させた。結果として生じるプラスミドＫＳ−ＮＧＦは、以下に続＜ＰＣＲ増幅全てのための鋳型として役立てた。

キメラ分子類は、ＮＧＦ及びＢＤＮＦの希望する部分に広がるオリゴヌクレオチドブライマーと共にＴ７プライマーを使用して５°断片を増幅することにより作製した。その後、３°断片を、Ｔ３プライマー及び２回目用に設計したＮＧＦ／ＢＤＮＦプライマーを使用して増幅させた。第２ＰＣＲ増幅段階においては、１１００−３００ｎの各断片を−まとめにし、融合させ、更に、Ｔ７及びＴ３プライマーを使用して増幅させた。全てのＰＣＲ反応は、以下に示す条件下において行った。

変性は、９４℃において３分間行い、次に、９４℃において１分、５０℃において２分、及び、７２℃において３分からなる２５サイクルの変性／復元を行った。その後、７２℃において１０分間伸長反応を行わせた。ＰＣＲＧｅｎｅ−Ａｍｐ　ｋ　ｉ　ｔ　（Ｃｅｔｕｓ）を、製造元の指示に従って使用した。

増幅させた断片を、その後、ＥｃｏＲＩ及び５ａｃＩＩで切断し、更に、ＳＲアルファープロモーターを含む改変させたｐＢＪ−５発現ベクターの対応する制限部位内にサブクローン化させた（図８　；　Ｔａｋｅｂｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８：４６６）　ｏ　しかしながら、キメラＩにおいてはサブクローニングについて５ａｃＩＩの代わりにＮｏｔ■を使用したが、それは、内部のＳａｃ　Ｉ■部位を既に作製してあったためである。全てのキメラは、シークエナーゼプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を使用して、完全に増幅した領域にわたる配列を決定した。

（本頁以下余白）表１０プライマー２（Ｃ）　（コ３−ｍａｒ）５１　−　ＣＧ　ＧＡＣＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＧＧ　ＧＡＧ　ＴｒＣＴＣＡ　ＧＴＧ　？　−３１プライ７−　ＣＮＧＦ’ＴＹＲ−５４Ｂ：　５ｌ−ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＣＴＣＡＴＡ　ＡＡＡ　ＧＴＡ　ＣＴＧ　−３＃（Ｃ）　ＮＧＦＳＥＲ−１０８Ｂ＝　５’　−ＣＡ　ＣＡＣＡＣＡ　ＧＧＡ　ＡＧＴ　ＧＴＣＴＡＴ　Ｃ−３’８．１，２．　ＣＯ８細胞中におけるキメラ神経栄養因子類ＣＯ８−７細胞をＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキン法を使用してキメラ構造物でトランスフェクトさせた。簡単に述べると、細胞培養物をトランスフェクションの一日前にそぎ取り、６０ｍｍの培養皿当たり約７５０．０００細胞が存在するようにした。５μｍのＤＮＡ　（約５μｇ）、１ｍｌのＤＭＥＭ　（無血清）、及び、２５μｍの２０ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストランを含むトランスフェクション混合物を調製した。培養したＣ０８−７細胞を、その後、５　ｍ　ｌの無血清ＤＭＥＭで３回洗浄した。先のトランスフェクション混合物（上述）を添加し、更に、３７℃において３０分間インキュベートした。２ｍｌの無血清ＤＭＥＭをその後２０μｍの８ｍＭクロロキンと合わせ、更に、ＣＯ８−７細胞／ＤＮＡ／ＤＥＡＥ−デキストラン混合物に直接添加し、それをその後、３７℃において２時間３０分インキュベートした。

上清をその後細胞から吸引して除き、１０％のジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）を含む２ｍｌの無血清ＤＭＥＭで置換した。

この細胞をその後室温で２分３０秒インキュベートし、この後、細胞を５ｍｌのＤＭＥで洗浄し、この洗浄液を吸引で除去し、更に、６％のウマ血清及び６％の鉄分を補給したウシ血清を添加しである約２．５ｍｌの新鮮なりＭＥＭで置換した。細胞はその後以下に述べであるように４８から７２時間後にキメラ神経栄養因子の発現についてアッセイした。

８．２．　結果及び考察ＮＧＦをコードするＤＮＡの一部分が一定の間隔で対応するＢＤＮＦ領域により置換されているキメラ核酸分子を作製した。表１１には、各キメラについて、ＮＧＦ領域の欠失を対応するＢＤＮＦ領域の挿入と共に示しである。Ｓ−６及び５ −１１は、３段階ＰＣＲによっても作製される点突然変異のみを有することに留意されたい。

（本頁以下余白）表１１５−１０　８ＧＦ　（Δ９２−１０１　／　ＢＤＮＦ　９２−１０２）ＢＤＮＦ配列の置換領域を図９にグラフで示し、更に、５ｌ−１２のアミノ酸配列を図１０に示した。５ｌ−１２の各々は、マウスＮＧＦのコーディング配列及びヒトＢＤＮＦのコーディング配列の一部分を含むことに留意されたい。

このキメラ神経栄養因子５ｌ−１２を、各々、ＤＥＡＥ−デキストラン−クロロキン法を使用してＣＯ５−７細胞中にトランスフェクトさせた。キメラ神経栄養因子類の発現は、［”Ｓ］　−メチオニンでの代謝ラベル化及びそれに続くラベル化細胞上清のポリアクリルアミドゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーにより測定した。データは、野生型ＮＧＦに対するパーセントとして表１２に示した。このデータは、約１３ｋｄにおける成熟ＮＧＦバンド上に特別に焦点を当てたオートラジオグラフィー（図８Ｂ）、及び、抗−ＮＧＦ抗体を使用した野生型ＮＧＦ及びＮＧＦ／ＢＤＮＦキメラ類の免疫沈降後のオートラジオグラフィー（図８０）のラベル化強度を比較することにより作製される。

を髄神経節（ＤＲＧ）　、交感神経節（ｓＧ）、節状神経節（ＮＧ）、及び、ＰＣ１２好クローム性細胞腫細胞株を利用するバイオアッセイを、主に、上述の第７節において記載されているようキメラ　５ｌ−１２のＮＧＦ活性は、最初にＰＣ１２細胞を使用して評価した。ＰＣｌ３の神経突起成長を、ＮＧＦ活性の指標さして使用した。各キメラの活性は、トランスフェクトさせたＣ０８−７細胞により発現される組換え野生型ＮＧＦ　（ＮＧＦ−ｗｔ）の活性に比較して決定するが、この組換え野生型ＮＧＦ活性を任意に１００パーセントの発現値とした（表１２）。各キメラについての特異活性を、代謝ラベル化してトランスフェクトさせたＣＯ３−７細胞の上清の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用してキメラ神経栄養因子濃度を推定することにより決定したが、やはり、ＮＧＦ−ｗｔでトランスフェクトさせたＣ０８−７細胞に関連する神経栄養活性を任意に１００パーセントの値とした。

Ｅ８のニワトリ胚から取得されたを髄神経節（ＤＲＧ）、節状神経節（ＮＧ）　、及び、交感神経節（Ｓ　Ｇ）の移植片培養物を、その後、等量の５Ｌ−１２、ＮＧＦ−ｗｔ、及び、ベクター（陰性対照）でトランスフェクトしたＣＯ３−７細胞上清にさらした。２４時間培養後、組換え野生型ＮＧＦ、陰性対照ベクター、もしくは、キメラ　５ｌ−１２に反応する繊維の成長を、用量範囲０から２０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦに対するＥ８ニワトリのＤＲＧのピコグラム／ｍｌのＮＧＦに対する典型的な応答に等しい）を有する検出可能な活性を意味し、評定２は明らかなハロ（ｈａｌ。

の豊富な成長を伴う強い活性を意味し、かつ、評定５は飽和レベルのＮＧＦ　（約１−１０ナノグラム／ｍ１）に対する最大反応に匹敵する大量の繊維の成長を意味する。表１２における移植片の結果は、用量反応アッセイにおいて決定された各上清の飽和レベルにおいて観察された最大の繊維成長を示している。上清は、最終容量２ｍｌとして、０．　１から８３μｍの範囲にわたりアッセイした。

他の移植片実験においては、より高い濃度の８４が、より高い成長評定値に関係していた。

（本頁以下余白）表１２相対発現　ＰＣ１２細胞に　移植片データネクローン　レベル　対する比活性　ＤＲＧ　ＮＧ　Ｓ、Ｃ。

ＮＧＦ−ｗｔ　ｌｏｏｍ　１ｏｏｋ　５　１　５ベクター　−−−−−−ｏ　ｏ　０５−１　２００％　２５％　５　１　５Ｓ−２１００ｍ　ｌｏｏｍ　５　２　５Ｓ−３１ｏｏｔｌｏｏｋ５コ５Ｓ−４２０％　Ｌｏｏｔ　ｌ　１　１ｇ−５５％　Ｒｏｏｔ　ｌ　ｌ　１５−６１ｏｏｔ１ｏｏｔ−５３５Ｓ−７５（ｎ　ｌｏｏｍ　５　２　５Ｂ−８Ｌｏｏｔ　１ｏｏｋ　５　２　５Ｓ−９１ｏｏｔ　１ｏｏｔ　５　４　５ｓ−１０１ｏｏｔ　１００ｍ　５　４　５Ｓ−ＬＬ　Ｓｏｔ　５０智　５　１５ｇ−１２１ｏｏｔ　５０％　５　３　５＊　２４時間にわたる繊維の成長９．３．　考察驚くべきことに、このデータは、ＢＤＮＦ配列でのＮＧＦ領域の置換にもかかわらず、多くのＮＧＦ−ＢＤＮＦキメラ類が、ＮＧＦ応答細胞に対して完全な活性を保持していることを示唆している。等量の大部分のキメラ神経栄養因子がＰＣ１２細胞についての高レベルの神経突起成長促進活性を示し、この活性は野生型ＮＧＦの活性に匹敵するものであった。例外が存在し、つまり、Ｓ−１は野生型ＮＧＦと比較して著しく低い活性を示しているようであり、更に、キメラ　５− １１及び５−１２はＮＧＦの比活性の約５０パーセントを示すことが観察された。しかしながら、大部分のキメラにおける完全なＮＧＦ活性の保持は予期できないことであった。というのも、ＮＧＦ配列の重要な領域におけるいくつかの小さい変化が実質的な活性消失へ導きうろことが当初より予測されていたためである。

更に、ＮＧＦのように、本明細書中において論議されている多くのキメラ神経栄養因子類は、を髄神経節及び交感神経節の移植片に対して最大の反応を誘導することが観察されている。表１２に示されるように、テストした全てのキメラは実質上、を髄神経節及び交感神経節に対して最大の活性を示した。キメラ　５−１２は、を髄神経節の移植片に対して、ＮＧＦよりも３−５倍強い比活性を有することが観察され、これにより、５−１２は少なくともある種の標的細胞に対するＮＧＦ活性の「スーパーアゴニスト」であることがわかる。５−１２のスーパーアゴニスト活性についての可能な説明は、ＢＤＮＦ配列の置換がＮＧＦの構造におけるコンホメーシコンの変化を生じさせ、それが結果的にＮＧＦレセプターについての５−１２の親和性を増大させるか、あるいは、分解過程に対する５−１２の安定性を増大させることがあるということかもしれない。

更に、多くのキメラ類は、ＮＧＦよりもＢＤＮＦに対して通常より反応性が高い神経節に対して、追加的な活性を示すことが観察された。ＮＧＦはニワトリ胚のを髄神経節の知覚ニューロン及びニワトリ胚のを椎傍の交感神経節の移植片培養物の生存及びそれからの神経突起の成長を促進するが、板（Ｐ　ｌ　ａ　ｃ　ｏ　ｄ　ｅ）由来の節状神経節の知覚ニューロンの移植片には何の効果も示さなかった（Ｌｉｎｄｓａｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５、Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　１１２：３１９）　、逆に言えば、ＢＤＮＦは、を髄神経節の移植片及び節状神経節の移植片の生存及びそれからの神経突起の成長を促進するが、交感神経節には何の効果も示さない。表１２に示されているように、多くのＮＧＦ−ＢＤＮＦキメラ神経栄養因子類はを髄神経節の移植片の中程度から強い繊維の成長を誘導し、これにより、ＢＤＮＦ様活性が示される。キメラ　３．４．６．９、ｌＯｌ及び、１２の全てのものは、ＮＧＦで観察された効果に比較するとかなり強い、節状神経節についての活性を示すことが観察された。従って、ＮＧＦのアミノ末端からカルボキシ末端にわたる範囲の多様な配列変換は、ＢＤＮＦ様活性もしくはニューロトロフィンファミリーの他のメンバーの活性を付与しつることが明らかであろう。

１０、微生物類の寄託以下に示すｃＤＮＡは、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（メリーランド州ロックビル）に寄託した。

キメラ分子名　略称　受託番号ｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−８４Ｓ４　４０８５９ｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−８９Ｓ９　４０８６１１）ＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−８ＬＯＳＩｏ　４０８５８１ＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−８１２Ｓ１２　４０８６０ｐＣ８ｈＢ／ｍＮ−Ｒ８Ｒ８４０８６２ｐＣ８ｍＮ／ｍｙｃ−ＮＭＩ　ＮＭＩ　４０８６４ｐＣ８ｈＢ／ｍｙｃ−ＢＭＩ　ＢＭＩ８　４０８６３本発明は、本明細書中において記載されている特別な実施態様による範囲内に限定されるものではない。実際に、本明細書中において記載されているものに加えて、本発明の様々な改変が、前述の記載及び添付の図面から当業者には明白となることであろう。このような改変は、添付される特許請求の範囲内に含まれるものである。

（本貫以下余白）ＦｆＧ、４５０μｚ　ｃｏｓ上清からの希釈ＦＩＧ、６Ａ５０μｚ　ｃｏｓ上清がらの希釈ＦｊＧ、６Ｂ −Ｏ−Ｅ９ｃＤＲＧ　８ＭＩＦＩＧ、６ＣＦｆＧ、７ＦＩＧ、８Ａベクター野生型嘲し −偕吟：、　−喫一−ａｍ≠湯費臂好浄・コシか１９゛”−％　−−１、ベクターＭ　ＮＧＦ　Ｓ−Ｉ　Ｓ−２Ｓ−３５−４５−５Ｓ−６野生型ＦＩＧ、　８ＧベクターＭ　Ｓ−７Ｓ−８Ｓ−９５−１０ＮＧＦ　５−１１　５−１２野生堅賑区区区国際調査報告 ’Ｅｅｒｉｓｌ　Ｎｏ、ＰＣＴ／ＬＩ８９１１０５ｇ１＠＾ｒｔ　Ｕｎｉｔ　１８１４＾ｔｔｍｃｈ＋ａｅｎｔ　ｔｏ　Ｆｏｒｍ　Ｐｃｔ／ＸｓＡ／２１の　Ｐａｒｔ　Ｖ！論剋１ｂ口独と１とｋｏｆ鵬駄Ｓｕｍｍｅｒ　ｏｆ　Ｃｌａｉｍｓ　Ｇｒｏｕ　ｉｎ　＠Ｔｈｅ　ｅｌａｉ＊ｓｗ工。９．。ｔｌ。ｎｓ　ｐｒｅ“°°１°ｐｌｕｒａｌｉｔｙ　ｏｆ”ｔｕａｌｌｙ　ｅｘｅｌ“１゛°１°６゛２°ｎｄｅｎｔ＠１１　ｆｏｌｌｏｖｓ＋フロントページの続き（７２）発明者　スーター、ウルリックアメリカ合衆国　９４０２５　カリフォルニア州　メン口　パーク、シャロン　パークドライブ　エフナンバー３０４．３５０（７２）発明者　アイビー、ナンシーアメリカ合衆国　０６９０２　コネチカット州スタムフォード、エメリー　ドライブ（７２）発明者　スクイント、ステファン　ピー。

アメリカ合衆国　１０５３３　ニューヨーク州アーヴイントン、バーク　レーン　２８１（７２）発明者　ファース、マーク　イー。

アメリカ合衆国　１０８０３　ニューヨーク州ペラム、バイブルック　アベニュー　斜（７２）発明者　リンゼイ、ロナルド　エム。

アメリカ合衆国　１０５１０　ニューヨーク州プライアークリフ　メイナー、チャッパカ　ロード　４７９（７２）発明者　ヤンコパウロス、ジョージ　ディー。

アメリカ合衆国　１０５１０　ニューヨーク州プライアークリフ　メイナー、スリーピー　ホロー　ロード　４２８

Claims

【特許請求の範囲】

１．神経栄養活性を有し、かつ（ｉ）細胞因子の少なくとも一部および（ｉｉ）他のペプチドの少なくとも一部を含む、キメラ神経栄養因子。
２．細胞因子が神経栄養因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
３．細胞因子が神経成長因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
４．細胞因子が脳由来の神経栄養因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
５．細胞因子がニューロトロフィン−３である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
６．細胞因子が毛様体の神経栄養因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
７．ペプチドが細胞因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
８．ペプチドが神経栄養因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
９．ペプチドが神経成長因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
１０．ペプチドが脳由来の神経栄養因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
１１．ペプチドがニューロトロフィン−３である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
１２．ペプチドが毛様体の神経栄養因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
１３．ペプチドが抗原性ペプチドである、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
１４．ペプチドがｍｙｃタンパク質の一部である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
１５．ペプチドが配列【配列があります】を有するペプチドである、請求項１４記載のキメラ神経栄養因子。
１６．細胞因子がニューロトロフィン遺伝子ファミリーのメンバーの神経栄養因子である、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
１７．約９−１０のｐＩを有する、請求項１６記載のキメラ神経栄養因子。
１８．キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置：アミノ酸１４付近、アミノ酸５７付近、アミノ酸６７付近、アミノ酸７９付近、アミノ酸１０８付近、およびアミノ酸１１０付近、のうちの４つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、４個のシステイン残基を含む、請求項１６記載のキメラ神経栄養因子。
１９．キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置：アミノ酸１４付近、アミノ酸５７付近、アミノ酸６７付近、アミノ酸７９付近、アミノ酸１０８付近、およびアミノ酸１１０付近、のうちの５つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、５個のシステイン残基を含む、請求項１６記載のキメラ神経栄養因子。
２０．キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置：アミノ酸１４付近、アミノ酸５７付近、アミノ酸６７付近、アミノ酸７９付近、アミノ酸１０８付近、およびアミノ酸１１０付近、のうちの６つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、６個のシステイン残基を含む、請求項１６記載のキメラ神経栄養因子。
２１．キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置：アミノ酸１４付近、アミノ酸５７付近、アミノ酸６７付近、アミノ酸７９付近、アミノ酸１０８付近、およびアミノ酸１１０付近、のうちの４つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、４個のシステイン残基を含む、請求項１７記載のキメラ神経栄養因子。
２２．キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置：アミノ酸１４付近、アミノ酸５７付近、アミノ酸６７付近、アミノ酸７９付近、アミノ酸１０８付近、およびアミノ酸１１０付近、のうちの５つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、５個のシステイン残基を含む、請求項１７記載のキメラ神経栄養因子。
２３．キメラ神経栄養因子のアミノ酸配列中の次の位置：アミノ酸１４付近、アミノ酸５７付近、アミノ酸６７付近、アミノ酸７９付近、アミノ酸１０８付近、およびアミノ酸１１０付近、のうちの６つの位置に、またはニューロトロフィンファミリーのメンバーにより共有される相同配列中の挿入または欠失に関連した同様の位置に、６個のシステイン残基を含む、請求項１７記載のキメラ神経栄養因子。
２４．実質的に図１０でキメラＳ１について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ１またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
２５．実質的に図１０でキメラＳ２について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ２またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
２６．実質的に図１０でキメラＳ３について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ３またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
２７．実質的に図１０でキメラＳ４について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードする、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号４０８５９を指定されたプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ４またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
２８．実質的に図１０でキメラＳ５について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ５またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
２９．実質的に図１０でキメラＳ６について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ６またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３０．実質的に図１０でキメラＳ７について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ７またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３１．実質的に図１０でキメラＳ８について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ８またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３２．実質的に図１０でキメラＳ９について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードする、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号４０８６１を指定されたプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ４またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３３．実質的に図１０でキメラＳ１０について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードする、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号４０８５８を指定されたプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓｌ０またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３４．実質的に図１０でキメラＳ１１について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドＰＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ１１またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３５．実質的に図１０でキメラＳ１２について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードする、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号４０８６０を指定されたプラスミドｐＢＪ５１ｍＮ／ｈＢ−Ｓ１２またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３６．実質的に図５でキメラＲ１について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ１またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３７．実質的に図５でキメラＲ２について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ２またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３８．実質的に図５でキメラＲ３について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ３またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
３９．実質的に図５でキメラＲ４について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ４またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
４０．実質的に図５でキメラＲ５について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ５またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
４１．実質的に図５でキメラＲ６について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ６またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
４２．実質的に図５でキメラＲ７について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードする、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号−を指定されたプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ７またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
４３．実質的に図５でキメラＲ８について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ８またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
４４．実質的に図５でキメラＲ９について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ９またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
４５．実質的に図５でキメラＲ１０について示した通りのアミノ酸配列を有するキメラ神経栄養因子をコードするプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｈＮ−Ｒ１０またはその機能的均等物によりコードされる、請求項２記載のキメラ神経栄養因子。
４６．図５におけるＮＭ１をコードする、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号４０８６４を有するプラスミドｐＣ８ｈｍＮ／ｍｙｃ−ＮＭ１またはその機能的均等物によりコードされる、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
４７．図５におけるＢＭ１をコードする、ＡＴＣＣに寄託されて受託番号４０８６３を有するプラスミドｐＣ８ｈＢ／ｍｙｃ−ＢＭ１またはその機能的均等物によりコードされる、請求項１記載のキメラ神経栄養因子。
４８．神経栄養活性を有し、かつ（ｊ）細胞因子の少なくとも一部および（ｉｉ）他のペプチドの少なくとも一部を含むキメラ神経栄養因子を含有する医薬組成物。
４９．細胞因子が神経栄養因子である、請求項４８記載の医薬組成物。
５０．請求項１６、１７または１８記載のキメラ神経栄養因子を含有する医薬組成物。
５１．請求項１記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
５２．請求項２記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
５３．請求項３記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
５４．請求項４記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
５５．請求項５記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
５６．請求項６記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
５７．請求項７記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
５８．請求項８記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
５９．請求項９記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６０．請求項１０記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６１．請求項１１記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６２．請求項１２記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６３．請求項１３記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６４．請求項１４記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６５．請求項１５記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６６．請求項１６記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６７．請求項１７記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６８．請求項１８記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
６９．請求項１９記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７０．請求項２０記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７１．請求項２１記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７２．請求項２２記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７３．請求項２３記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７４．請求項２４記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７５．請求項２５記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７６．請求項２６記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７７．請求項２７記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７８．請求項２８記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
７９．請求項２９記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８０．請求項３０記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８１．請求項３１記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８２．請求項３２記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８３．請求項３３記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８４．請求項３４記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８５．請求項３５記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８６．請求項３６記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８７．請求項３７記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８８．請求項３８記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
８９．請求項３９記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９０．請求項４０記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９１．請求項４１記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９２．請求項４２記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９３．請求項４３記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９４．請求項４４記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９５．請求項４５記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９６．請求項４６記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９７．請求項４７記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。
９８．請求項４８記載のキメラ神経栄養因子またはその機能的均等物をコードする核酸分子。