PT98619A

PT98619A - Processo de producao de um factor neurotrofico quimerico de moleculas de acido nucleico e de composicoes farmaceuticas

Info

Publication number: PT98619A
Application number: PT98619A
Authority: PT
Inventors: Ronald M Lindsay; Mark E Furth; Nancy Ip; Stephen P Squinto; Eric M Shooter; Ulrich Suter; George D Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 1990-08-08
Filing date: 1991-08-08
Publication date: 1992-06-30
Also published as: LV10293B; EP0542892A4; LV10293A; KR930700599A; ZA916270B; US5512661A; EP0542892A1; HUT68259A; SK7193A3; IL99128A; IL99128A0; HU9300308D0; CA2088990A1; NZ239312A; AU664975B2; HU211525A9; LTIP1529A; FI930526A0; WO1992002620A1; AU8396991A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA 1. INTRODUÇÃO O presente invento refere-se a factores neurotróficos quiméricos, moléculas que compreendem uma porção de um factor que ocorre naturalmente e uma porção de pelo menos uma outra molécula, de tal forma que a molécula quimérica resultante tenha actividade neurotrófica. Baseia-se em parte, na evidência de que moléculas quiméricas contendo porções de dois factores neurotróficos diferentes retêm substancialmente a actividade biológica total e, pelo menos nalguns casos, possui uma única gama de actividade neurotrófica em que uma única molécula possui a actividade das duas moléculas que lhe deram origem.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO 2.1. CITOQUINAS QUIMÉRICAS

Determinadas células do corpo são capazes de produzir factores, chamados citoquinas, que actuam como mensageiros e comunicam com outras células, coordenando assim funções biológicas. Por exemplo, os linfócitos podem produzir linfoquinas, factores que interagem com vários componentes do sistema imunitário de forma a orquestrar de uma maneira eficaz a resposta imunitária. Os factores neurotróficos são citoquinas que podem promover a sobrevivência e/ou diferencição dos componentes do sistema nervoso.

Como mensageiros intercelulares, as citoquinas interagem tipicamente com populações específicas de células via moléculas receptoras de citoquinas. Consequentemente, uma citoquina está dirigida particularmente para células portadoras de receptores, particulares. Tem sido mostrado que as citoquinas podem ser usadas para levar substâncias tóxicas a uma população celular por ligação da citoquina à substância tóxica. Por exemplo, Siegall et al. (1989, Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 3;2647-2652) fundiram um ADNc codificante do factor alfa da citoquina modificadora do crescimento com a extremidade 5' de um gene que 73 021

que 6526-027-118 -3- codifiçava uma forma modificada da exotoxina A de Pseu<

não continha o domínio de reconhecimento da célula. A molécula quimérica resultante foi expressa em Escherichia coli. isolada, e verificou-se ser extremamente citotóxica para as células que apresentavam especificamente o receptor para o factor de crescimento epidérmico. Ogata et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86;4215-4219) produziram uma toxina quimérica recombinante em que o domínio de ligação celular da exotoxina da Pseudomonas (PE) foi substituída pela linfoquina interleucina-4 (IL-4) de murino; verificou-se que a proteína quimérica, IL-4-PE40, era citotóxica para as linhas de células portadoras do receptor de IL-4 de murino. Banker et al.(1989. J. Cell Phvsiol. 139:51-57) descreve uma quimera factor de crescimento epidérmico cadeia de ricina-A. Williams et al. (1987, Protein Eng. 1:493-498) substituíram o domínio de ligação do receptor da toxina da difteria com um gene sintético codificando a interleucina-2 (IL-2) e um sinal de terminação de transcrição. Verificou-se que a proteína de fusão toxina da difteria/IL-2 inibia selectivamente a síntese proteica em células portadoras de receptores de IL-2, ao passo que linhas de células que não expressavam o receptor de IL-2 eram resistentes à acção da toxina.

Outros investigadores construíram moléculas de ADN recombinantes que continham um gene de citoquina assim como pelo menos uma porção de um gene bacteriano. Dicou et al. (1989, J. Neurosci. Res. 22:13-19) realizaram a fusão do ADN completo do prepro-factor de crescimento do nervo de ratinho com o terminal carboxílico do gene da beta-galactosidase de Escherichia coli. e a fusão de um fragmento de ADN genómico correspondente aos codões 11 a 106 do gene do factor de crescimento do nervo humano com o quinto codão do teminal amino da beta-galactosidase. Ambos os vectores bacterianos foram associados com a expressão de grandes quantidades de proteínas quiméricas. Embora após a lise das células bacterianas a maior parte do prepro-factor de crescimento do nervo de ratinho quimérico parecesse ser insolúvel, a maioria do beta-factor de crescimento do nervo humano quimérico parecia existir no sobrenadante. Não foi relatada qualquer actividade neurotrófica.

Em estudos recentes, Ibanez et al. (1990, Embo J. 9:1477-1483) descreveu estudos sobre o factor de crescimento do nervo alterado por mutagénese dirigida a sitio. Xie et al. (1990. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:3180-3184) descreve a utilização de péptidos opioides quiméricos no estudo dos receptores de opiáceos. Ray et al. (1990, Mol. Endocrinol. 102:101) discutiu a alteração da especificidade de ligação ao receptor à especificidade da hormona do crescimento como resultante da troca de exão genómico. Cunningham et al. (1990, Science 247:1330^ substituiram sistematicamente porções da hormona do crescimento de forma a identificar hormonas mutantes que não teriam capacidade de se ligar ao receptor da hormona do crescimento. Cunningham et al. (1990, Science 247: 1461) refere-se à mutagénese dirigida a sitio da prolactina que se observou produzir uma variante de prolactina capaz de se ligar ao receptor da hormona do crescimento.

2.2. FACTORES NEUROTRÓFICOS O desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso depende de proteínas conhecidas por factores neurotróficos. A morte generalizada das células neuronais acompanha o desenvolvimento normal dos sistemas nervosos central e periférico, e aparentemente desempenha um papel crucial na regulação do número de neurónios que se projectam para uma determinada área alvo (Berg, D. K., 1982, Neuronal develooment 297-331). Estudos de ablação e transplantação de determinados tecidos periféricos alvo durante o desenvolvimento, mostraram que a morte da célula neuronal resulta da competição entre os neurónios para quantidades limitadas de factores de sobrevivência ( factores neurotróficos) produzidos nas suas áreas de projecção.Foram identificados até à data, quatro importantes factores neurotróficos: factor de crescimento do nervo (NGF; Levi-Montalcini e Angeletti, 1968, Phvs. Rev. 48:534); neurotrofina-3 (NT-3; Hohn et al.. 1990, Nature 344:339; Maisonpierre et al.. 1990, Science 247:1446), Factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF); Barde et al.. 1982, EMBO J. 1:549), e

factor neurotrófico ciliar (CNTF; Lin et al.. 1979, Science 246:1023). 2.2.1. FACTOR DE CRESCIMENTO DO NERVO 0 factor de crescimento do nervo (NGF) é até agora o mais bem caracterizado destas moléculas neurotróficas e foi mostrado, in vivo e in vitro. ser essencial para a sobrevivência dos neurónios simpáticos e neurónios sensoriais derivados da cristã neural durante o desenvolvimento precoce de galinha e de ratazanas (Levi-Montalcini e Angeletti, 1963, Develop. Biol. 7:653-659; Levi-Montalcini et al.. 1968, Physiol. Rev.

48:524-569). Verificou-se que injecções de NGF purificado no embrião de galinha em desenvolvimento causavam um aumento na sobrevivência e hipertrofia dos neurónios espinais sensoriais e neurónios simpáticos (Levi-Montalcini e Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:373-384; Hamburger et al.. 1981, J. Neurosci. 1:60-71). Ao contrário, remoção ou sequestração de NGF endógeno por injecção diária de anticorpos anti-NGF em ratazanas neonatais foi associada com a destruição virtual do sistema nervoso simpático (Levi-Montalcini e Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:384-391; Levi-Montalcini e Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18:619-628). Mostrou-se que a exposição a anticorpos para NGF ainda numa fase mais precoce do desenvolvimento, seja por injecções in utero ou por transferência passiva transplacentária dos anticorpos maternos, tem resultado numa perda substancial de neurónios sensoriais derivados da cristã neural, assim como dos neurónios sensoriais trigeminais espinais e dorsomediais (Goedert et al.. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:1580-1584; Gorin e Johnson, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:5382-5386). Até recentemente, quase todos os estudos sobre o NGF focavam o seu papel no sistema nervoso periférico, mas parece agora que o NGF também influencia o desenvolvimento e manutenção de populações específicas de neurónios no sistema nervoso central Thoenen et al.. 1987, Rev. Physiol. Biochem Pharmacol. 109:145-178; Whittemore e Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439-464. A abundância da proteína NGF na glândula submaxilar de a

73 021 6526-027-118 -6-ratinho permitiu a determinação da sequência primária por uma química de proteínas relativamente convencional (Angeletti e Bradshaw, 1971, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 68:2417-2420). O gene de NGF foi já clonado a partir de várias espécies, incluindo o ratinho (Scott et al.. 1983, Nature 302:538-540), humana (Ullrich et al.. 1983, Nature 303: 821-825), vaca e galinha (Meier et al.f 1986, EMBO J. 5: 1489-1493), e ratazana (Whittemore et al.. 1988, J. Neurosci. Res. 20: 402-410) utilizando essencialmente a biologia molecular convencional, baseada na disponibilidade da sequência da proteína de NGF de ratinho para conceber as sondas de oligonucleótidos mais indicadas. A disponibilidade de NGF em abundâcia facilitou imenso os estudos com o receptor para o NGF, que levaram por fim à clonagem molecular de um componente do receptor do NGF humano e de ratazana (Johnson et al.. 1986, Cell 47:545-554; Radeke et al.. 1987, Nature 325:593-597).

Está agora bem estabelecido que o NGF não é um factor neurotrófico de cobertura total. No sistema nervoso periférico, o NGF parece não ser um factor de sobrevivência para os neurónios parasimpáticos, neurónios sensoriais derivados de neurónios placoides ou neurónios entéricos, como determinado em estudos in vivo e in vitro. Além disso, o NGF não parece ser um factor de sobrevivência para neurónios motores em desenvolvimento (Oppenheim, 1982, J. Como. Neur. 210:174-189), embora estes neurónios pareçam expressar pelo menos uma forma de baixa afinidade para o receptor do NGF durante o desenvolvimento (Raivich et al.. 1985, Embo J. 4:637-644). A falta dos efeitos do NGF nestes tipos neuronais lançou a pesquisa para outros factores neurotróficos, especialmente os factores que podem manter a sobrevivência dos neurónios motores da espinal medula ou dos neurónios parasimpáticos do gânglio ciliar. 2.2.2. FACTORES NEUROTROFICOS DERIVADOS DO CÉREBRO Uma actividade neurotrófica capaz de manter a sobrevivência dos neurónios do gânglio dorsal da medula do embrião de galinha in vitro. foi identificada no "meio condicionado" em que células C-6 de glioma de ratazana foram cultivadas (Barde et al.. 1978,

Nature 274:818). A actividade não foi neutralizada por anticorpos

J 73 021 6526-027-118

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contra o NGF de ratinho, sugerindo a presença de outro factor neurotrófico no meio condicionado. Actividades similares, que não podiam ser bloqueadas por anticorpos para NGF eram subsequentemente relatadas em culturas de células astrogliais de cérebro de ratazana adulta (Lindsay, 1979, Nature 282:80-82; Lindsay et al.. 1982, Brain Res. 243:329-343) e em extractos de cérebro de ratazana adulta e em desenvolvimento (Barde et al. f 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:1199-1203) e na espinal-me-dula de galinha madura e em desenvolvimento (Lindsay e Peters, 1984, Neurosci. 12:45-51). No entanto, em nenhum dos casos foi isolado ou identificado o factor activo, e mantém-se ainda a questão se as actividades observadas seriam devidas ao mesmo ou a diferentes factor(es).

Utilizando cérebro de porco como material de partida, Barde et al. (1982, EMBO J. 1:549-553) relataram um factor, agora chamado factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), que parece promover a sobrevivência dos neurónios do gânglio dorsal da medula de embriões de galinha E10/E11. Verificou-se que a actividade neurotrófica residia numa proteína altamente básica (ponto isoeléctrico, pi 10.1), que migrava durante a electroforese em gel-dodecilsulfato de sódio (SDS) como uma única banda de 12.3 kD de massa molecular. Foi notado que a natureza altamente básica e o tamanho molecular do BDNF eram muito semelhantes aos do monómero de NGF. A clonagem do gene para o BDNF foi inicialmente realizada como descrito no pedido de patente: pedido de Patente US Número de Série 07/400 591, depositado em 30 de Agosto de 1989, que está aqui incorporado na sua totalidade, para referência. Resumidamente, pequenas quantidades de proteína BDNF foram purificadas de cérebro de porco, levando à determinação de fragmentos da sequência de aminoácidos que podiam, por sua vez, ser utilizados para a síntese dos oligonucleótidos correspondentes. Estes oligonucleótidos sintéticos foram então utilizados como iniciadores em reacções em cadeia de polimerase (PCR) com o ADNc molde preparado a partir das células produtoras de BDNF. Os produtos de PCR foram utilizados como sondas para

73 021 6526-027-118 -8- permitir a clonagem completa do ADNc e/ou dos ge’ genómicos de uma variedade de espécies, incluindo o Homem, o porco, a ratazana e o ratinho, e as sequências destes genes foram determinadas. A expressão de BDNF recombinante foi obtida em células COS. A primeira demonstração de que a especificidade neuronal do BDNF era distinta da do NGF, foi a demonstração in vitro de que o BDNF purificado apoiava a sobrevivência de 40-50% dos neurónios sensoriais dissociados do gânglio nodoso derivado da placa neural dos embriões de galinha E6, E9 ou E12 (Lindsay et al.. 1985, J. Cell Sei. Supp. 3:115-129). 0 NGF não apresentava efeito aparente nestes neurónios fosse por si próprio ou em conjunto com o BDNF. Foi mostrado mais tarde em estudos de culturas de explantação que o BDNF parecia apoiar a sobrevivência e crescimento externo das neurites a partir de gânglios sensoriais derivados da placa neural, incluindo os gânglios petrosal, geniculado e ventrolateral trigeminal (Davies et al.. 1986, J. Neurosci. 6:1897-1904), não mostrando nenhum deles sensibilidade ao NGF. Em todos os estudos acima mencionados, anticorpos neutralizadores para NGF não apresentavam qualquer efeito sobre a actividade observada do BDNF. Adicionalmente aos seus efeitos em neurónios cultivados a partir de gânglios periféricos, verificou-se que o BDNF estimulava a sobrevivência e diferenciação neuronal de células cultivadas a partir da cristã neural de codorniz (Kalcheim e Gendreau, 1988, Develop. Brain. Res. 41:79-86).

Dois recentes estudos com o BDNF (Kalcheim et al.. 1987, EMBO J. 6:2871-2873; Hofer e Barde, 1988, Nature 331:261-262) indicaram, no entanto, um papel fisiológico do BDNF no desenvolvimento do sistema nervoso periférico (PNS) das aves. Se uma barreira mecânica fosse colocada in ovo em E3/E4 (dia embrionário 3 ou 4), entre os gânglios da raiz dorsal em desenvolvimento (DRG) e o seu alvo no SNC, no tubo neural, observava-se a morte de muitos neurónios DRG (Kalcheim e Le Dourarin, 1986, Develop. Biol. 116:451-46). Foi postulado que esta morte neuronal pode ter sido devida à privação de um factor neurotrófico derivado do SNC (tubo neural). Foi subsequentemente

uma membrana de silástico 73 021 6526-027-118 -9- observado que o BDNF aderido a revestida com laminina podia evitar esta morte celular (Kalcheim et al.. 1987, EMBO J. 6:2871-2873). Verificou-se que injecções de BDNF em ovos de codorniz em desenvolvimento reduzia a ocorrência da morte celular natural no gânglio nodoso, um efeito que não se observa com o NGF (Hofer e Barde, 1988, Nature 331:261-262). Adicionalmente a este efeito nos neurónios sensoriais periféricos, com origem na cristã neural e placa neural, verificou-se que o BDNF apoiava a sobrevivência dos neurónios em desenvolvimento do SNC. Johnson et al. (1986, J. Neurosci. 6:3031-3038) apresentaram dados que indicavam que o BDNF apoiava a sobrevivência das células do gânglio retinal cultivadas a partir de embriões de ratazanas E17. Estes alargados estudos prévios que mostraram que meios condicionados e extractos cerebrais preparados a partir de regiões alvo das células do gânglio retinal parecem apoiar a sobrevivência destes neurónios (McCaffery et al.. 1982, Ex. Brain Res. 48:37-386; Sarthy et al.. 1983, J. Neurosci. 3:2532-2544; Turner et al.. 1983, Dev. Brain Res. 6:77-83).

Adicionalmente aos efeitos na sobrevivência de neurónios em desenvolvimento em cultura, o BDNF mostrou também efeitos em nerónios de cultura dos sistemas nervosos central e periférico adulto. 0 BDNF tal como o NGF, tem mostrado estimular a regeneração axonal de neurónios DRG de ratazana adulta em cultura (Lindsay, 1988, J. Nerosci. 8:2394-2405) embora neurónios sensoriais adultos pareçam não requerer factores neurotróficos para a sua manutenção in vitro durante 3 ou 4 semanas. Além disso, em culturas de retina de ratazana adulta, verificou-se que o BDNF promovia a sobrevivência e elongação axonal das células do gânglio retinal (Thanos et al.. 1989, Eur. J. Neurosci. 1:19-26). Adicionalmente, tem-se verificado que o BDNF prolonga a sobrevivência das células em culturas do mesencéfalo ventral, pela contagem do número de células positivas para a tirosina-hidroxilase visualizadas por imunocitoquímica. BDNF permite ainda a sobrevivência de neurónios colinérgicos em cultura de células dissociadas derivadas da região septal da ratazana (pedido de Patente US Número de Série 07/400 591, ir 73 021 6526-027-118 -10-

depositado em 30 de Àgosto de 1989). Uma comparação dos efeitos biológicos do NGF e BDNF é apresentada na tabela I. TABELA I COMPARAÇAO DAS ACTIVIDADES BIOLÓGICAS DO BDNF E NGF* SOBREVIVÊNCIA** BDNF NGF SISTEMA NERVOSO PERIFÉRICO i) DRG de galinha E6 ++ DRG de galinha E10 + Simp. de galinha E12 (Barde et al.. 1980 suoraí ++ ϋ) DRG de galinha E6-E12 ++ ++ Nódulos de galinha E6-E12 ++ - Simpáticos de galinha E-12 - ++ Ciliares de galinha E-12 (Lindsav et al.. 1985. suora) iii) Galinhas E3-E14: Jugular +/++ ++ DM-trigeminal +/++ ++ Petrosal +/++ — Geniculado +/++ - VL-trigeminal ++ - Vestibular - - Mesencefálico trigerminal ++ - (Davies et al.. 1986. sunra) (Barde et al.. 1987. Proa. Brain Res. 71:185-189Ϊ SISTEMA NERVOSO CENTRAL i) Células do gânglio retinal de ratazana (Johnson et al.. 1986. J. Neurosci. E17 ++ - 6:3031-3038) ii) Neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral ++ - iii) Neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal (pedido de Patente US Número de Série ++ - 07/400 591, depositado em 30 de Agosto de 1989) * em ordem cronológica de acordo com a data de publicação; efeitos testados in vitro ** (-): sem sobrevivência ? (+): sobrevivência moderada • r (++): boa sobrevivência. 73 021 6526-027-118 -11-

A análise da estrutura primária prevista do BDNF maduro revelou uma surpreendente semelhança com o NGF; com apenas três intervalos introduzidos nas sequências do NGF para optimizar o emparelhamento, 51 identidades eram comuns com os vários NGF (desde a cobra ao Homem) e o BDNF. Extraordinariamente estas identidades incluíam seis resíduos de cisteína. 2.2.3. NEUROTROFINA-3

As semelhanças marcadas entre o NGF e o BDNF sugerem que ambos podem ser membros de uma família mais extensa de moléculas proximamente relacionadas com as moléculas neurotróficas. Quando regiões de homologia eram usadas para conceber iniciadores oligonucleotídicos, para reacções em cadeia de polimerase para identificação de novos membros da família de genes para os BDNF/NGF, foi posto em evidência outro membro da família designado neurotrofina-3, tendo o gene da NT-3 sido clonado a partir do ratinho, ratazana e Homem ( pedido de Patente US Número de Série 07/490 004, depositado em 7 de Março de 1990, incorporado aqui como referência na sua totalidade). A estrutura global da proteína NT-3 madura de ratinho, que consiste em 119 aminoácidos com um pi calculado de cerca de 9,5, parece estar de acordo com a estabelecida para a do NGF e BDNF? uma suposta sequência sinal de 18 aminoácidos (mostrando 5 e 9 identidades de aminoácidos respectivamente com o BDNF e NGF) parece ser seguida por uma pro-sequência de 121 aminoácidos (quando comparadas com a pro-sequência de 103 aminoácidos no NGF de ratinho e uma pro-sequência de 112 aminoácidos no BDNF de ratinho). Uma comparação entre NGF, BDNF e NT-3 maduros de ratinho, revelou 54 identidades de aminoácidos (Figura 1). Todos os seis resíduos de cisteína, que se sabe estarem envolvidos na formação de pontes dissulfureto no NGF e BDNF (Leibrock et al.. 1989, Nature 341:149-152; Angeletti, 1973, Biochem. 12:100-115) estão entre os resíduos conservados. Similarmente, NT-3 madura de ratazana parece partilhar 57% de homologia de aminoácidos com o NGF de ratazana e 58% de homologia de aminoácidos com o BDNF de ratazana; 57 dos 120 resíduos (48%) parecem ser partilhados por todas as três proteínas (Figura 1D). De novo se verificou que os seis resíduos de cisteína de NGF e BDNF de ratazana eram 73 021 6526-027-118 -12-

absolutamente conservados na NT-3 de ratazana, e regiões de maior homologia entre as três proteínas parecem agrupar-se em redor destes resíduos de cisteína. Adicionalmente à homologia entre NT-3, NGF e BDNF dentro de uma espécie, foi observado um elevado grau de conservação na sequência de ácido nucleico entre a NT-3 de ratazana e humana, na região de codificação do polipéptido maduro (119 aminoácidos). Verificou-se que os genes humanos e de ratazana apresentavam cerca de 92% de homologia na sequência de ADN. No entanto, nenhuma das diferenças nas sequências nucleotídicas entre ratazana e humano nesta região levaram a substituições de aminoácidos; as sequências de aminoácidos deduzidas de ratazana e Homem maduras (assim como a NT-3 de ratinho) parecem absolutamente idênticas, reminiscentes do elevado grau de conservação do BDNF, que revela identidade completa na sequência de aminoácidos do polipéptido maduro entre a ratazana, ratinho, Homem e porco. Pelo contrário, as sequências de aminoácidos do NGF maduro humano e NGF de roedores (ratazana e ratinho) diferem aproximadamente em 10%.

Estudos de actividade neurotrófica do NT-3 indicaram que o NT-3 é capaz de promover a sobrevivência e crescimento externo de neurites de neurónios do gânglio dorsal da medula dissociados em cultura. Além disso, verificou-se que a NT-3 promovia o crescimento externo de neurites a partir de gânglios nodosos e explantes de gânglios simpáticos, enquanto o BDNF promovia o crescimento externo a partir de gânglios nodosos mas não de gânglios simpáticos e o NGF promovia o crescimento externo a partir de gânglios simpáticos mas não de explantes de gânglios nodosos. Assim, o NT-3 parece ter uma especificidade de acção mais lata do que o NGF ou'BDNF. 0 NT-3 pode ser importante no desenvolvimento do sistema nervoso. Quando se compara a abundância relativa dos transcritos NGF, BDNF e NT-3 nos cérebros de ratinhos adultos e recém nascidos, verificou-se que o nível de NT-3 no cérebro de recém nascido era superior ao do cérebro adulto. Observou-se que os níveis de ARN de NT-3 no sistema nervoso central eram dramaticamente mais altos durante o desenvolvimento fetal e *·>

verificou-se que decresciam subsequentemente para adultos. 2.2.4. FACTOR NEUROTRQFICO CILIAR Os factores neurotróficos ciliares (CNTF) são proteínas que promovem especificamente a sobrevivência dos neurónios do gânglio ciliar do embrião de galinha in vitro (Manthorpe et al. . 1980, J. Neurochem. 34:69-75). O gânglio ciliar está anatomicamente localizado na cavidade orbital, entre o rectus lateral e a bainha do nervo óptico; recebe fibras nervosas parassimpáticas do nervo oculomotor que inerva o músculo ciliar e o esfíncter da pupila.

Verificou-se que os neurónios do gânglio ciliar estavam entre as populações neuronais que exibiam períodos definidos de morte celular. No gânglio ciliar da galinha, verificou-se que metade dos neurónios presentes ao 8adia embrionário (E8) morriam antes do 14adia (E14) (Landmesser e Pilar, 1974, J. Phisiol. 241:737-749). Durante este mesmo período, os neurónios do gânglio ciliar estão a formar ligações com os seus tecidos alvo, nomeadamente o corpo ciliar e a superfície coroidal do olho. Landmesser e Pilar (1974, J. Phisiol. 241: 751-736) observaram que a remoção de um olho antes do período de morte celular resulta na perda completa dos neurónios do gânglio ciliar no gânglio ipsilateral. Inversamente, Narayanan e Narayanan (1978, J. Embrvol. Ex. Morphol. 44:53-70) observaram que, implantando um rudimento adicional de olho e assim aumentando a quantidade de tecido alvo disponível, a morte da célula neuronal do gânglio ciliar pode ser diminuída. Estes resultados são consistentes com a existência de um factor neurotrófico que actua sobre os neurónios do gânglio ciliar.

Verificou-se que em cultura, os neurónios do gânglio ciliar (CG) requerem um factor ou factores para a sua sobrevivência. Foi identificada actividade de factor(es) neurotrófico(s) ciliar(es) (CNTF) em meios condicionados de células musculares de galinha (Helfand, et al.. 1976, Dev. Biol. 50:541-547? Helfand et al. . 1978, Exp. Cell Es. 113:39-45; Bennett e Nurcombe, 1979, Brain Res. 173:543-548; Nishi e Berg, 1979, Nature 277:232-234; Varon 73 021 Μ 6526-027-118 ãf Τ —ΤΓ -1.4- et al. . 1979, Brain Res. 173:29-45), em extractos musculares (McLennan and Hendry, 1978, Neurosci. Lett. 10:269-273; Bonahandy et al♦. 1980, Neurosci. Lett. 18:197-201), em extracto de embrião de galinha (Varon et al.. 1979 Brain Res. 173:29-45; Tuttle et al.. 1980, Brain Res. 183:161-180), e em meio condicionado por células do coração (para discussão ver também Adler et al.. 1984, 1979, Science 204:1434-1436 e Barbin et al.. 1984, J. Neurochem. 43:1468-1478). O CNTF foi purificado do nervo ciático de ratazana e a sequência de aminoácidos dos vários fragmentos determinada por microsequenciação em fase gasosa; a sequência de aminoácidos resultante foi usada para clonar um gene de CNTF de ratazana usando técnicas de clonagem baseadas em reacção em cadeia de polimerase (pedido de Patente US Número de Série 07/429 517, depositado em 31 de Outubro de 1989, aqui incorporada para referência). Uma sonda para o CNTF de ratazana foi subsequentemente utilizada na clonagem do gene do CNTF humano. A comparação das sequências de ácido nucleico dos genes de CNTF de ratazana e do Homem indica que o gene humano possui um único intrão na mesma posição do gene do CNTF de ratazana. No intrão, as sequências humanas parecem divergir consideravelmente da ratazana, em contraste marcante com a substancial conservação da região de codificação.

Com base na sequência nucleotídica, pode prever-se que o CNTF terá uma massa molecular de aproximadamente 22.8 kD (calculado para um comprimento estimado de cerca de 200 aminoácidos), o que está de acordo com o estimado para o CNTF de ocorrência natural pela análise por electroforese em gel de poliacrilamida (22.5 kD; Saadat et al.. 1989, J. Cell Biol. 108:1807-1816). Assim a sequência de aminoácidos do CNTF mostra características de um proteína citosólica, isto é, sem péptido sinal, sem sequências de consenso para glicosação e apenas um resíduo de cisteína na posição 17. Não se observou homologia de sequência entre CNTF e NGF, BDNF ou factor de crescimento do fibroblasto (FGF) e purpurina, cada um dos quais associado com actividades de sobrevivência similares às do CNTF (Unsicker et 73 021 6526-027-118 -15-

al. . 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 84:5459-5463; Schubert et al.. 1986, J. Cell Biol. 102:2295-2301).

Um número de efeitos biológicos foi atribuído ao CNTF. O CNTF foi originalmente descrito como uma actividade que apoiava a sobrevivência de neurónios do gânglio ciliar de galinha E8, que é um componente do sistema nervoso parassimpático. Saadat et al. (1989, J. Cell Biol. 108:1807-1816) observaram que a sua preparação mais purificada de CNTF de nervo ciático de ratazana induzia diferenciação colinérgica dos neurónios simpáticos de ratazana em cultura. Também Hoffman (1988, J. Neurochem. 51:109-113) verificou que a actividade de CNTF derivada de olho de galinha aumentava o nível de actividade de colina-O-acetiltransferase em culturas retinais de monocamada.

Hughes et al. (1988, Nature 335:70-73) estudaram uma população de células progenitoras da glia, bipotenciais, no nervo óptico e cérebro de ratazana perinatal; supõe-se que esta população celular dê origem a oligodendrócitos, em primeiro lugar, e a astrócitos tipo 2 em segundo lugar. Estudos sugeriram que a diferenciação oligodendrocítica ocorre a partir de uma célula progenitora de oligodendrócito-astrócito tipo 2 (0-2A) na ausência de qualquer factor de crescimento em particular, enquanto a diferenciação de astrócitos tipo 2 parece requerer a presença de uma proteína indutora específica. Hughes et al. observaram que a proteína indutora dos astrócitos tipo 2 é similar ou idêntica ao CNTF (ver Anderson, 1989, Trens Neurosci. 12:83-85).

Adicionalmente, verificou-se que o CNTF recombinante promove a sobrevivência dos neurónios da espinal medula mediodorsal em cultura, e observou-se que o CNTF purificado do nervo ciático de ratazana evitava a morte celular induzida por lesão de neurónios motores em nervo facial lesionado de ratazanas recém-nascidas (pedido de Patente US Número Série 07/429 517, depositado em 31 de Outubro de 1989 aqui incorporada para referência na sua totalidade). A tabela II apresenta uma lista de actividades associadas

73 021 6526-027-118 -16-com o NGF, BDNF, NT-3 e CNTF; espera-se que actividades adicionais, ainda não identificadas venham a ser documentadas.

TABELA II

CÉLULAS QUE RESPONDEM A FACTORES NEUROTRÓFICOS I. Células que respondem ao NGF A. Neurónios simpáticos B. Neurónios sensores derivados da cristã neural C. Gânglio da raiz dorsal E6-E12 D. Neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal

Células que respondem ao BDNF A. Neurónios sensores com origem na cristã neural (i) gânglio da raiz dorsal (E10/E11) (ii) gânglio jugular (iii) gânglio trigeminal dorsomedial (iv) núcleo mesencefálico trigerminal B. Neurónios sensores com origem na placa ectodermal (i) gânglio nodoso (ii) gânglio vestibular (iii) gânglio petrosal (iv) gânglio geniculado (v) gânglio trigeminal ventrolateral C. Gânglio retinal D. Neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral

E. Neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal III. Células que respondem ao NT-3 A. Gânglio da raiz dorsal B. Gânglio simpático C. Gânglio nodoso

IV. Células que respondem ao CNTF A. Gânglio ciliar E8 B. Neurónios colinérgicos simpáticos C. Astrócitos tipo 2 D. Neurónios da espinal medula mediodorsal E. Neurónios motores (exemplo: neurónios motores do nervo facial) F. Neurónios DRG E10. 73 021 6526-027-118 -17- 3. Sumário do invento

O presente invento refere-se a factores neurotróficos quiméricos que compreendem pelo menos uma porção de um factor celular que ocorre naturalmente e uma porção de pelo menos uma outra molécula, de tal modo que a molécula quimérica resultante possui actividade neurotrófica. Está baseado, em parte, na verificação de que as moléculas quiméricas contendo porções de ambos os factores NGF e BDNF possuem provavelmente actividade neurotrófica, e que em alguns casos exibem um maior espectro de actividade do que qualquer das moléculas progenitoras. Está ainda baseado na verificação de que as moléculas quiméricas que compreendem sequências do factor neurotrófico, assim como sequências peptídicas adicionais, podem reter actividade neurotrófica, e que em alguns casos podem exibir uma actividade mais potente que o factor progenitor. 0 presente invento fornece ácidos nucleicos codificadores de factores neurotróficos quiméricos, processos de expressão destes factores neurotróficos quiméricos, proteínas factores neurotróficos quiméricos e fragmentos peptídicos e seus derivados, anticorpos dirigidos contra factores neurotróficos quiméricos para definição de determinantes de especificidade e processos de diagnóstico e tratamento de desordens neurológicas que utilizam os factores neurotróficos quiméricos deste invento. 0 presente invento também fornece um número de plasmídeos recombinantes particulares que codificam neurotrofinas biologicamente activas.

Os factores neurotróficos quiméricos deste invento proporcionam um número de vantagens em relação aos factores neurotróficos que ocorrem naturalmente. Os factores neurotróficos quiméricos podem proporcionar, por exemplo, a actividade de dois factores neurotróficos numa única molécula, ou podem servir como superagonistas de um factor neurotrófico endógeno, permitindo assim um aumento da resposta biológica em doses mais baixas. Adicionalmente, os factores neurotróficos quiméricos do invento podem ser úteis na detecção de um composto activo das células que ί

J 73 021 6526-027-118 -18

respondem ao factor neurotrófico. A construção de factores neurotróficos quiméricos que retêm actividade biológica específica mas que estão dirigidos a uma subclasse de células que respondem ao factor pode ainda permitir o tratamento de desordens neurológicas mas evitam as complicações de actividade mais alargada da molécula(s) progenitora(s). 4. Descrição das figuras FIG. 1. Diagrama esquemático da estratégia utilizada na construção das quimeras BDNF-NGF utilizando três iniciadores oligonucleotídicos e um único passo da reacção em cadeia de polimerase. Os iniciadores foram construídos de tal modo que o produto da reacção compreendia os sítios de clivagem das enzimas de restrição Nar I e Not I, que facilitarão a inserção do produto, depois da sequência da região prepro de BDNF, no plasmídeo de expressão pC8hB(Pl). As áreas a tracejado representam a sequência de NGF, as áreas a branco representam a sequência BDNF.

FIG. 2. Diagrama esquemático da estratégia utilizada na construção de quimeras BDNF-NGF utilizando quatro iniciadores oligonucleotídicos e uma reacção em cadeia de polimerase em três passos. As áreas a tracejado representam a sequência de NGF as áreas a cheio representam a sequência do vector e as áreas a branco representam a sequência de BDNF. FIG. 3. Diagrama esquemático da estratégia utilizada na construção de factores neurotróficos quiméricos marcados com myc. A. Construção de NGF marcado com myc; as sequências myc encontram-se a tracejado e as regiões a branco representam a sequência NGF. B. Construção de BDNF marcado com myc; as sequências myc estão a tracejado e as regiões a branco representam a sequência BDNF.

73 021 6526-027-118 -19- FIG. 4. Resolveram-se 50ul de sobrenadante de células COS marcadas com 35S por SDS PAGE a 15% e as proteínas marcadas foram transferidas electroforeticamente para uma membrana de nylon. A membrana foi exposta ao filme durante a noite e a autorradiografia resultante foi fotografada. Faixa 1, COS MOCK; Faixa 2, BDNF humana; Faixa 3, hBDNF/3/myc (BM1); Faixa 4, NGFm; Faixa 5, NGFm/3'myc (NM1). As massas moleculares padrão encontram-se indicadas. FIG. 5. Sequência de aminoácidos deduzida dos factores neurotróficos quiméricos RI a RIO, BMl e NM1. FIG. 6. Resultados do ensaio colorimétrico MTT para os gânglios da raiz dorsal (DRG) ou dos gânglios simpáticos (SG) tratados com (A) BDNF? (B) NGF ou (C) BMl, BDNF marcado com myc. A absorvância a 570-650nm é representada em função de uma crescente diluição do sobrenadante de células COS contendo actividade neurotrófica. FIG. 7. Diagrama esquemático da estratégia utilizada na construção de quimeras NGF-BDNF, utilizando quatro iniciadores oligonucleotídicos, numa reacção em cadeia de polimerase em três passos. 0 iniciador A é o iniciador T7, os iniciadores B e C diferem entre as doze quimeras produzidas e estão representados na Tabela 10 e o iniciador D é o iniciador T3. As áreas a tracejado representam a sequência do vector, as áreas a branco representam a sequência prepro, as áreas a sombreado representam a sequência do NGF maduro e as áreas a cheio representam a sequência BDNF. FIG. 8. A. 0 vector PBJ-5 modificado utilizado na expressão dos factores neurotróficos quiméricos NGF-BDNF. 0 vector contém o gene de resistência à ampicilina (seta a cheio), a origem de replicação de pBR322 (seta a branco), o promotor SR (seta a sombreado; Takebe et al., 1988, Mol. Cell. Biol. 8: 466-472) e um sítio de clonagem (seta a tracejado) contendo um local de junção ("splice junction"), um sítio poly A e sitíos de clivagem para as endonucleases de restrição Not I. Sac II e EcoRI.

73 021 6526-027-118 -20- B. Resultados da marcação metabólica das células COS transfectadas com NGF selvagem, vector (controlo) e quimeras NGF-BDNF (S1-S12). Aplicaram-se directamente 40 μΐ de sobrenadante de células COS e submeteram-se a electroferese em SDS-gel de poliacrilamida a 12,5%.

C. Electroforese em SDS-gel de poliacrilamida de proteínas marcadas metabolicamente nos sobrenadantes das células COS transfectadas com NGF selvagem, vector (controlo) e quimeras NGF-BDNF (S1-S12) imunoprecipitados com anticorpo anti-NGF. A imunoprecipitação foi efectuada em 400 μΐ de sobrenadante. A electroforese foi realizada em SDS-gel de poliacrilamida a 12,5%. FIG. 9. Diagrama das quimeras Sl-12, na qual as regiões a branco representam a sequência NGF e as regiões a cheio representam a sequência BDNF.

Painel superior: Comparação da sequência de aminoácidos de moléculas de NGF, isoladas de diferentes espécies.

Painel inferior: Comparação da sequência de aminoácidos das sequências NGF e BDNF.

Barras superiores: Nesta posição são permitidas elevadas variações de aminoácidos.

Barras inferiores: Nesta posição só são permitidas alterações de aminoácidos conservativas.

Sem barra: Os aminoácidos desta posição são conservados entre todos os NGF e BDNF conhecidos. FIG. 10. Sequência de aminoácidos deduzida para os factores neurotróficos quiméricos Sl-12. FIG. 11. Sequências de aminoácidos de NGF, BDNF e NT-3. As setas indicam os resíduos de cisteína. As regiões variáveis V1-V4 encontram-se indicadas por barras superiores. 5. Descrição detalhada do invento

De modo a clarificar a descrição, e não por limitação, a

73 021 6526-027-118 descrição detalhada do invento encontra-se dividida nas seguintes subsecções: (i) factores neurotróficos quiméricos do invento; (ii) a construcção de factores neurotróficos quiméricos; (iii) expressão de factores neurotróficos quiméricos; (iv) ensaios para a caracterização de actividade e especificidade neuronal dos factores neurotróficos quiméricos; (v) anticorpos dirigidos contra os factores neurotróficos quiméricos; e (vi) utilidade do invento 5.1. Factores neurotróficos quiméricos do invento O presente invento proporciona factores neurotróficos quiméricos que (i) compreendem pelo menos uma porção de um factor celular, assim como uma porção de pelo menos uma outra proteína e (ii) possuem actividade neurotrófica. Os factores neurotróficos quiméricos do invento podem compreender factores celulares, ou porções deles, que podem ou não possuir eles próprios actividade neurotrófica, incluindo mas não se limitado ao factor do crescimento do nervo, factor de crescimento derivado de cérebro, neurotrofina-3, factor neurotrófico ciliar, factor de crescimento do fibroblasto (ácido ou básico e membros da família), factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento beta do tumor, factor de crescimento alfa do tumor, interleucina 1, interleucina 2, interferão alfa, interferão beta, interferão gama, hormona do crescimento, peptido intestinal vasoactivo, vasopressina e insulina, para nomear apenas alguns.

As moléculas quiméricas do invento compreendem pelo menos uma porção de factor celular, assim como uma porção de pelo menos um outro péptido ou proteína, que pode ser ou não derivado de um composto que possui actividade neurotrófica. Este péptido ou proteína pode compreender, por exemplo, toda ou parte de um factor neurotrófico, factor celular, toxina, enzima, imunoglobulina ou qualquer outra sequência peptídica que pode estar ou não associada com actividade funcional e pode ou não ser

J 73 021 6526-027-118 antigénica. -22-

Por exemplo, e não por limitação, o presente invento proporciona as seguintes moléculas quiméricas que exibem actividade neurotrófica, como indicado na Secção 5.4., infra: (i) uma molécula quimérica que compreende dois factores neurotróficos completos ligados entre si; (ii) uma molécula quimérica que compreende um factor neurotrófico completo ligado a um factor celular completo não-neurotróf ico;

(iii) uma molécula quimérica que compreende porções de dois factores neurotróficos; (iv) uma molécula quimérica que compreende uma porção de um factor neurotrófico, assim como uma porção de um factor celular não-neurotrófico; (v) uma molécula quimérica que compreende pelo menos uma porção de um factor neurotrófico e uma sequência peptidica que pode ou não ser antigénica; e (vi) uma molécula quimérica que compreende pelo menos uma porção de dois factores neurotróficos, assim como uma sequência peptidica, que pode ou não ser antigénica.

Os factores neurotróficos do invento podem também estar ligados a compostos não-peptídicos. Por exemplo, pode ser desejável a ligação de hidratos de carbono, lípidos ou de outros compostos orgânicos ao factor neurotrófico quimérico. Tais compostos poderão incluir agentes tóxicos, agentes antiproliferativos, agentes altamente imunogénicos, agentes angiogénicos, agentes anti-angiogénicos, coagulantes, anticoagulantes, compostos fluorescentes, compostos radioactivos, e outros.

Quando porções de um factor neurotrófico ou doutro factor celular e outro factor neurotrófico ou outro factor celular, se combinam, pode ser desejável construir a molécula quimérica de tal modo que a porção de um factor sofra delecção e depois substituída por uma porção do outro factor, mantendo assim uma dimensão aproximada de um dos factores progenitores, apesar do 73 021 6526-027-118 -23-

invento não estar a tal limitado. Adicionalmente, se os dois factores possuem regiões homólogas é desejável que as regiões homólogas sejam trocadas, uma pela outra, criando deste modo uma molécula quimérica que é homóloga, mas distinta, a ambos os factores progenitores. Em concretizações adicionais, uma região de um factor de que se acredita que possua uma função mínima, pode ser substituída por uma região de outro factor ou outro péptido que se acredita ser biologicamente activo; tal quimera pode exibir um aumento de actividade biológica relativamente aos factores progenitores. Alternativamente, uma região de um factor, que se acredita estar associado com uma actividade biológica indesejável, pode ser substituída por uma porção de um outro factor ou outro péptido, de tal modo de que a actividade indesejável possa ser reduzida ou eliminada; tais concretizações podem ser úteis no desenvolvimento de factores neurotróficos quiméricos com um mínimo de efeitos laterais indesejáveis ou toxicidades.

Alternativamente, moléculas quiméricas do invento podem ser codificadas por sequências de ácido núcleico, nas quais uma sequência codificadora de um factor celular é interrompida pela sequência codificadora de um péptido ou proteína, de tal modo que o factor neurotrófico quimérico codificado por tal molécula é caracterizado por uma inserção proteína factor. Adicionalmente, o invento proporciona fusões terminais amina, assim como carboxílicas, entre pelo menos uma porção de um factor e outro péptido.

Em alguns casos, quando as porções homólogas dos dois factores são trocadas, a molécula quimérica pode diferir efectivamente de um dos seus compostos progenitores por um único aminoácido; tais factores neurotróficos quiméricos são comtemplados pelo presente invento e são exemplificados pelas quimeras S-6 e S-ll, discutidas na secção 8, infra.

Em concretizações preferidas do invento, os factores neurotróficos quiméricos são criados por troca de porções correspondentes de factores neurotróficos relacionados. Em 73 021

6526-027-118 -24-concretizações específicas do invento, moléculas de factor neurotrófico quimérico compreendem porções de dois ou mais membros da família "neurotrofina", recentemente identificada, incluindo NGF, BDNF, NT-3 e quaisquer membros adicionais, ainda por identificar. De acordo com estas concretizações específicas, porções de membros da família neurotrofina podem ser rearranjados, de modo a conservar a estrutura secundária e/ou terciária da molécula. Em concretizações adicionais do invento, a inserção de sequências peptídicas da família não-neurotrofina, ou a substituição de uma porção de uma sequência de codificação da família neurotrofina por uma sequência peptídica da família não-neurotrofina, pode ser efectuada de tal modo que a estrutura secundária e/ou terciária e a conformação associada aos membros da família neurotrofina seja conservada. Tal como aqui é utilizada, a frase estrutura secundária e/ou terciária e conformação associada com membros da família neurotrofina pode ser utilizada para referir características de sequência estruturais e químicas compartilhadas pelos membros da família neurotrofina, nomeadamente um comprimento de cerca de 120 resíduos de aminoácidos, um pi entre 9 e 10, e 6 resíduos de cisteína localizados aproximadamente (dentro de cerca de 5 aminoácidos) nos aminoácidos 14, 57, 67, 79, 108, e 110 ou em posições semelhantes com referência a uma inserção ou delecção na sequência homóloga compartilhada pelos membros da família neurotrofina; por exemplo, as sequências do NGF de peixe possuem uma inserção de 22 pb no aminoácido adulto 65, que presumivelmente forma um laço (loop), de modo a deixar a estrutura do restante da molécula com uma conformação semelhante aquela do NGF de mamífero. Em concretizações específicas preferidas do invento, factores neurotroficos quiméricos que compreendem uma porção de pelo menos um membro da família neurotrofina compreendem pelo menos quatro resíduos de císteina cerca das posições acima mencionadas. Em concretizações específicas mais preferidas, os factores neurotroficos quiméricos do invento compreendem pelo menos cinco resíduos de cisteína cerca das posições acima mencionadas. Em concretizações específicas muito preferidas do invento, as moléculas quiméricas compreendem seis resíduos de cisteína cerca das posições acima

73 021 6526-027-118 -25- mencionadas. Em concretizações específicas adicionais do invento, os factores neurotróficos quiméricos compreendem pelo menos quatro resíduos de cistelna cerca das posições acima mencionadas e exibem um pi entre 9 e 10. Em concretizações mais preferidas do invento, os factores neurotróficos quiméricos compreendem pelo menos cinco resíduos de cisteína cerca das posições acima mencionadas e exibem um pi de cerca de 9 e 10. Em concretizações específicas muito preferidas do invento, moléculas quiméricas compreenden seis resíduos de císteina cerca das posições acima mencionadas e exibem um pi entre 9 e 10. 0 presente invento proporciona ácidos nucleicos codificadores de factores neurotróficos quiméricos e proteínas de factor neurotrófico quimérico e fragmentos peptídicos e derivados deles. Em concretizações preferidas do invento, um factor neurotrófico quimérico compreende uma porção de pelo menos um membro da família neurotrofina (ver supra) incluindo mas não se limitado ao NGP, BDNP e NT-3, cujas sequências estão representadas na Figura ll. Em concretizações específicas do invento preferidas, os factores neurotróficos quiméricos possuem uma sequência de aminoácidos como aquela representada nas Figuras 5 e 10 para as moléculas quiméricas RI a R10, BM1, NM1 e SI a S12. As moléculas de factor neurotrófico quimérico do invento incluem, mas não são limitadas, aquelas contendo, como sequência de aminoácidos primária, toda ou parte da sequência de aminoácidos substancialmente como representada nas Figuras 5 e 10 incluindo as sequências alteradas, nas quais se substituem resíduos da sequência por resíduos de aminoácido funcionalmente equivalentes, resultando numa alteração silenciosa. Por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência podem ser substituídos por outro aminoácido de polaridade semelhante que actua como um equivalente funcional, resultando numa alteração silenciosa. Substitutos para um aminoácido da sequência podem ser seleccionados de entre outros membros da classe à qual o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína,

73 021 6526-027-118 -26-tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem a arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem o ácido aspártico e o ácido glutamico. Também estão incluídos no âmbito do invento as proteínas de factor neurotrófico quimérico ou seus fragmentos ou derivados que são diferencialmente modificadas durante ou depois da tradução, por exemplo, por glicosação, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular, etc. O presente invento também proporciona moléculas de ácido nucleico que codificam as sequências de aminoácidos como representadas nas Figuras 5 e 10, ou suas porções ou equivalentes funcionais. Para além disso, o presente invento proporciona os plasmídeos pBJ51mN/hB-Sl a 12, pC8hB/hN-Rl a 10, pC81mN/myc-NMl e pC8hB/myc-BMl, apresentados na Secção 10, assim como as sequências de ácido nucleico codificadoras de factores neurotróficos quiméricos que elas compreendem. 0 presente invento proporciona factores neurotróficos quiméricos que compreendem factores celulares derivados de qualquer organismo vivo, incluindo, mas não se limitado, a factores celulares humanos, símios, suínos, ovinos, bovinos, equinos, caninos, felinos, roedores ou de aves. 5.2. A construção de factores neurotróficos quiméricos Ácidos nucleicos que codificam factores neurotróficos quiméricos podem ser construídos utilizando a tecnologia padrão de ADN recombinante, por exemplo, por corte e união ("splicing") dos ácidos nucleicos que codificam factores celulares e/ou outros péptidos, utilizando enzimas de restrição e ADN ligase. Alternativamente, as sequências de ácido nucleico podem ser construídas utilizando síntese química, tal como a tecnologia de fosforamidato em fase sólida. Em concretizações preferidas do invento, a reacção em cadeia de polimerase (PCR; Saiki et al., 1985, Science 230:1340-1354) pode ser utilizada para efectuar a união das sequências de ácido nucleico por extensão por sobreposição (Horton et al., 1989, Gene 22:61-68) e produzindo deste modo factores neurotróficos quiméricos do invento. Tal como 73 021 6526-027-118 -27-

rjjtsjntK&Íl

.-.-y é discutido em detalhe na Secção 6, infra. os factores neurotróficos quiméricos podem ser produzidos por uma PCR num passo, utilizando três iniciadores oligonucleotídicos ou, alternativamente, por uma PCR em três passos utilizando quatro iniciadores oligonucleotídicos. As Figuras 1 e 2 são diagramas esquemáticos destas duas técnicas. Por exemplo, um ácido nucleico que codifica pelo menos uma porção de um factor celular (X) pode ser unida a uma sequência de ácido nucleico codificadora de um péptido eucariota (Y), por criação de três iniciadores oligonucleotídicos, um dos quais corresponde a uma porção da sequência X ("o iniciador X”), outra que corresponde a uma porção da sequência Y ("o iniciador Y") e uma terceira que contém uma porção de ambas as sequências X e Y ("o iniciador XY"). Pode ser ainda desejável incorporar sítios úteis de endonucleases de restrição nos iniciadores. A Tabela 3, infra. apresenta exemplos de iniciadores que podem ser utilizados para produzir quimeras BDNF-NGF. Estes três oligonucleotidos (representados na Figura 1 pelos iniciadores A, C e B, respectivamente) podem ser combinados numa PCR em um passo, sendo desejável que os iniciadores X e Y estejam presentes em maiores quantidades que o primer XY, por exemplo, numa razão X:XY:Y de cerca de 100:1:100. 0 molde utilizado na PCR pode ser uma mistura de ácidos nucleicos codificadores de factor celular e da proteína ou péptido a ser unido. A posição do sítio de união é determinada pelo nucleótido de ponte (por exemplo, o iniciador XY). As condições de amplificação rotineiramente empregues na arte podem ser utilizadas, por exemplo, 1 minuto a cerca de 94°C, 2 minutos a cerca de 43°C e 3 minutos a cerca de 72°C durante 35 ciclos, utilizando as soluções e os métodos padrão do PCR. O fragmento resultante do PCR pode então ser purificado utilizando uma electroforese em gel, clivado com as enzimas endonucleases de restrição apropriadas e depois inserido num vector adequado para a clonagem.

Alternativamente, tal como é representado na Figura 2, os factores neurotróficos quiméricos podem ser produzidos por uma PCR em três passos, envolvendo quatro nucleótidos. Os oligonucleótidos que podem, por exemplo, ser utilizados para 73 021 6526-027-118 -28-

Éf ί,ί ,- 4*# produzir os quimeras BDNF-NGF ou NGF-BDNF são apresentados nas Tabelas 4 e 10, respectivamente. Para efectuar uma união entre as sequências nucleotídicas X e Y, podem ser construídos os seguintes iniciadores: (i) iniciador X, correspondente à sequência X (iniciador A na Figura 2); iniciador Y, correspondente à sequência Y (iniciador D na Figura 2); iniciador XY, correspondente as subsequências de X e de Y (iniciador B na Figura 2); e iniciador XY', também correspondente às subsequências X e Y, mas adicionalmente homólogo ao iniciador XY (iniciador C na Figura 2). Numa reacção de PCR, os iniciadores X e XY servem para amplificar a sequência X do molde, de modo a produzir ácidos nucleicos contendo porções da sequência X e Y. Noutra reacção de PCR, os iniciadores Y e XY' servem para amplificar a sequência X do molde, de modo a produzir as sequências de ácido nucleico contendo porções da sequência X e Y, que se sobrepõem com a porção Y da molécula de ácido nucleico produzida noutra reacção de PCR. Quando os produtos das duas PCR são combinados e amplificados por PCR, pode ser gerada uma molécula de ácido nucleico que contém uma inserção da sequência Y na sequência X. Modificações deste método, utilizando diferentes moldes, podem também ser utilizadas de acordo com o invento. A PCR, a purificação do produto de PCR e a clivagem por enzima endonuclease de restrição, podem então ser utilizadas, como descrito acima, de modo a clonar o gene do factor neurotrófico quimérico resultante.

Os produtos de ADN da reacção podem ser clonados utilizando qualquer método conhecido na arte. Um grande número de sistemas de vector-hospedeiro conhecidos podem ser utilizados. Vectores possíveis incluem, mas não estão limitados a, cosmídeos, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema de vector tem que ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Tais vectores incluem, mas não estão limitados a, bacteriofagos tais como os derivados de lambda, ou plasmídeos tais como o pBR322, pUC, ou derivados do plasmídeo BluescriptR (Stratagene). Moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras através de transformação, transfecção, infecção, electroporação, etc.

J 73 021 6526-027-118

-29- 5.3. Expressão de factores neurotróficos quiméricos

A sequência nucleotídica codificadora da proteína do factor neurotrófico quimérico, ou uma porção dela, pode ser inserida num vector de expressão adequado, isto é, um vector que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência codificadora de proteina inserida. Os sinais necessários para a transcrição e tradução podem ser fornecidos pelo gene nativo do factor neurotrófico quimérico e/ou pelas suas regiões de flanqueadoras. Uma variedade de sistemas hospedeiro-vector pode ser utilizada para expressar a sequência codificadora da proteína. Estes incluem, mas não estão limitados a, sistemas de células de mamíferos infectadas com vírus (por exemplo, vírus da vacina, adenovírus, etc.); sistemas de células de insectos infectadas com vírus (por exemplo, baculovírus); microrganismos tal como leveduras contendo vectores de leveduras, ou bactérias transforamadas com ADN de bacteriofago, ADN plasmídico, ou ADN cosmídico. Os elementos de expressão destes vectores variam na sua intensidade e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro-vector utilizado, qualquer um dos elementos adequados de transcrição e tradução pode ser utilizado.

Qualquer um dos métodos anteriormente descrito para a inserção de fragmentos de ADN num vector pode ser utilizado para construir vectores de expressão contendo um gene de um factor neurotrófico quimérico, consistindo nos sinais apropriados de controlo de transcrição/tradução e nas sequências de codificação das proteínas. Estes métodos podem incluir técnicas in vitro de ADN recombinante e sintéticas e recombinações in vivo (recombinação genética). A expressão da sequência de ácido nucleico codificadora da proteína do factor neurotrófico quimérico, ou de um fragmento peptídico, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácido nucleico, de tal modo que a proteína do factor neurotrófico quimérico, ou péptido, é expressa num hospedeiro transformado com a molécula de ADN recombinante. Por exemplo, a expressão do factor neurotrófico quimérico pode ser controlada por qualquer elemento promotor/intensificador conhecido. Promotores que podem ser utilizados para controlar a expressão do factor neurotrófico quimérico incluem, mas não se limitam/ ao promotor citomegalovírus (CMV), a região do promotor precoce de SV40 (Bernoist e Chambon, 1981/ Nature 290:304-310). ao promotor contido na repetição terminal longa 3' do vírus do sarcoma de Rous, (Yamamoto et al.# 1980, Cell 22.:787-797), ao promotor da timidina-cinase de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78.:144-1445), as sequências reguladoras do gene da metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature) 296:39-42); vectores de expressão de procariotas como o promotor da B-lactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75,:3727-3731) ou o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80.:21-25), ver também "Useful proteins from recombinant bactéria" na Scientific American, 1980, 282: 74-94; vectores de expressão de plantas compreendendo a região do promotor da nopalina-sintetase (Herrera-Estrella et al., Nature 303: 209-213) ou o promotor do ARN 35S do vírus do mosaico de couve-flor (Gardner et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9.:2871) e o promotor da enzima fotossintética ribulose-bifosfato--carboxilase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); elementos promotores de leveduras ou outros fungus tal como o promotor Gal 4, o promotor da ADC (álcool desidrogenase), o promotor da PGK (fosfoglicerol-cinase), promotor da fosfatase alcalina, e as seguintes regiões de controlo transcricional de animais, que exibem especificidade tissular e têm sido utilizadas em animais transgénicos: região de controlo do gene elastase I, que é activo nas células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38.:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7.:425-515); região de controlo do gene da insulina que é activa nas células pancreáticas beta (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122). na região de controlo do gene da imunoglobulina que é activo nas células linfóides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38.:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7.:1436-1444), região de controlo do vírus do tumor mamário de ratinho que é activa nas células testiculares, mamárias, linfóides e mastócitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), região de controlo do gene da albumina é activa no fígado (Pinker et al., 1987, Genes and Devei. i 73 021 6526-027-118 -31

1,: 268-276), região de controlo do gene da alfa-fetoproteína que é activa no fígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5.: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); região de controlo do gene da alfa 1-antitripsina que é activa no fígado (Kelsey et al, 1987, Genes and Devei. 1: 161-171), região de controlo do gene da beta-globina que é activa nas células mielóides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340: Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94; região de controlo do gene da proteína básica da mielina que é activa nas células oligodendrocíticas no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48.: 703-712); região de controlo do gene da cadeia leve-2 da miosina que é activa no músculo estriado (Sani, 1985, Nature 314:283-286) e a região de controlo do gene da hormona de libertação da gonadotrofina que é activa no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Vectores de expressão contendo inserções do gene do factor neurotrófico quimérico podem ser identificados por três abordagens gerais: (a) hibridação ADN-ADN, (b) presença ou ausência de funções do gene "marcador”, e (c) expressão das sequências inseridas. Na primeira abordagem, a presença do gene estranho inserido num vector de expressão pode ser detectado por hibridação ADN-ADN, utilizando sondas contendo sequências que são homólogas ao gene do factor neurotrófico quimérico inserido. Na segunda abordagem, o sistema recombinante vector/ hospedeiro pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou ausência de certas funções do gene "marcador" (por exemplo, a actividade da timidina-cinase, a resistência a antibióticos, a transformação do fenótipo, a formação de corpo de oclusão em baculovírus, etc.) causado pela inserção de genes estranhos no vector. Por exemplo, se o gene do factor neurotrófico quimérico estiver inserido na sequência do gene marcador do vector, os recombinantes contendo a inserção do factor neurotrófico quimérico podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador. Na terceira abordagem, os vectores de expressão recombinantes podem ser identificados por ensaio do produto do gene estranho expresso pelo recombinante. Tais ensaios podem ser baseados, por exemplo, nas propriedades físicas ou funcionais do produto do gene do factor neurotrófico quimérico em sistemas de bioensaio como é descrito

73 021 6526-027-118 -32 abaixo, na Secção 5.4.

Uma vez identificada e isolada uma molécula de ADN recombinante particular, vários métodos conhecidos podem ser utilizados para a propagar. Uma vez estabelecidos o sistema de hospedeiro adequado e as condições de crescimento, os vectores de expressão recombinantes podem ser propagados e preparados em quantidade. Tal como foi previamente descrito, os vectores de expressão que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados, aos seguintes vectores ou seus derivados: vírus humanos ou animais tais como o vírus da vacina ou adenovírus; vírus de insectos tal como o baculovírus; vectores de leveduras; vectores de bacteriófagos (por exemplo, lambda) e vectores de ADN plasmídico e cosmídico, para nomear apenas alguns.

Adicionalmente, pode ser escolhida uma estirpe de células hospedeiras que modula a expressão das sequências inseridas ou a modifica e processa o produto do gene num modo específico desejado. A expressão a partir de certos promotores pode ser elevada na presença de certos indutores; assim, a expressão de proteínas do factor neurotrófico quimérico geneticamente manipuladas pode ser controlada. Adicionalmente, células de diferentes hospedeiros têm mecanismos característicos e específicos para a tradução e processamento e modificação pós-tradução (por exemplo, glicosação, clivagem) de proteínas. Linhas de células apropriadas ou sistemas de hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a modificação e processamento desejados da proteína estranha expressa. Por exemplo, a expressão num sistema bacteriano pode ser utilizada para produzir um produto proteico do núcleo ("core") não glicosado. A expressão em leveduras produzirá um produto glicosado. A expressão em células de mamíferos pode ser utilizada para assegurar a glicosação "nativa" da proteína do factor neurotrófico quimérico heterólogo. Adicionalmente, sistemas de expressão vector/hospedeiro diferentes podem afectar as reacções de processamento, tal com as clivagens proteoliticas, em diferentes extensões.

73 021 6526-027-118 -33-

Em aplicações específicas do invento, o ADN codificador de factores neurotróficos quiméricos pode ser expresso num sistema de células COS, de acordo com os métodos descritos nas Secções 6 e 8, infra. Uma vez um recombinante, que expresse o gene do factor neurotrófico quimérico, seja identificado, o produto de gene deve ser analisado. Isto pode ser efectuado por ensaios com base nas propriedades físicas ou funcionais do produto. Ver Secção 5.4.

Uma vez identificada a proteína do factor neurotrófico quimérico, ela pode ser isolada e purificada pelos métodos usuais, incluindo cromatografia (por exemplo, de permuta iónica, em coluna por tamanhos), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica usual para a purificação de proteínas.

Adicionalmente, as proteínas e os péptidos do factor neurotrófico quimérico do invento podem ser produzidos utilizando as usuais técnicas sintéticas químicas de péptidos, bem conhecidas na arte. 5.4. Ensaios de factor neurotrófico para factores neurotróficos quiméricos

Factores neurotróficos quiméricos do invento exibem actividade neurotrófica. 0 termo "actividade neurotrófica", tal como aqui é utilizado, é utilizado para referir o efeito biológico nas células do sistema nervoso incluido, mas não se limitando, a neurónios, astrócitos, células da glia, oligodendrócitos, microglia e células de Schwann. O efeito biológico é uma alteração na estrutura e/ou fisiologia da célula do sistema nervoso, que não ocorre na ausência de exposição directa ou indirecta ao factor neurotrófico quimérico. Exemplos de efeitos biológicos são o prolongamento da sobrevivência, prolongamento de neurites, a manutenção ou desenvolvimento de funções diferenciadas (tal como a expressão de uma enzima, como a colina-acetiltransferase ou a tirosina-hidroxilase) ou, em contrário, a morte ou senescência celular ou a desdiferenciação.

73 021 6526-027-118 -34- A presença de actividade neurotrófica pode ser determinada utilizando qualquer ensaio conhecido para tal actividade, assim como sistemas que possam vir a ser desenvolvidos no futuro. Sistemas de ensaio podem incluir sistemas de teste in vitro. tal como sistemas de bioensaio em cultura de tecidos utilizando explantes tissulares, células preparadas a partir do tecido ou linhas celulares imortalizadas, por exemplo, derivadas do cérebro, espinal-medula ou sistema nervoso periférico, assim como sistemas de teste in vivo. nos quais o factor neurotrófico quimérico pode ser administrado a um animal; os efeitos neurotróficos podem ser detectados nesses animais por testes químicos, histológicos ou comportamentais, utilizando os referidos animais. Adicionalmente um factor neurotrófico quimérico pode ser incorporado, como um transgene, num animal transgénico não-humano, e os seus efeitos biológicos podem ser medidos no referido animal.

Por exemplo, mas não como limitação, a actividade neurotrófica pode ser medida utilizando qualquer um dos seguintes sistemas de bioensaio bem conhecidos: (i) sistema de ensaio do gânglio da raiz dorsal, tal como é descrito em Barde et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:1199-1203, o qual está incorporado aqui como referência na sua totalidade; (ii) sistema de ensaio do gânglio nodoso, tal como é descrito por Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112:319-328. o qual está incorporado aqui como referência na sua totalidade; (iii) ensaio dos gânglios simpáticos, tal como é descrito por Barde et al., 1982, EMBO J. .1:549-553, o qual está incorporado aqui como referência na sua totalidade; (iv) ensaio dos gânglios ciliares, tal como é descrito em Adler et al., 1979, Science 204:1434-1436. o qual está incorporado aqui como referência na sua totalidade; (v) neurónios da espinal-medula. Resumidamente, espinais-medulas podem ser removidas assepticamente do animal a testar, desde a cauda até ao bolbo, e libertas dos gânglios sensoriais e meninges. A medula pode então ser subdividida em segmentos ventrais e mediodorsais, para culturas separadas, e os 73 021

6526-027-118 -35-tecidos em pequenos fragmentos e dissociados por trituração, através de uma pipeta de Pasteur, em 50% de DMEM (Gibco) e 50% de mistura de nutrientes de Ham F12 (Gibco) suplementado com glucose 33mM, glutamina 2mM, NaHC03 15mM, HEPES lOmM, 25Mg/ml de insulina, 10(^g/ml de transf errina, putrescina 60μια, progesterona 20nM, selenite de Na 30nM, 0,5^g/ml de penicilina G, 0,5/ng/ml de estreptomicina e 2,5^g/ml de albumina de soro bovino. A trituração pode depois ser repetida duas vezes e os sobrenadantes misturados e filtrados através de um filtro Tetko de 40μιη. As células ventrais dissociadas podem depois ser plaqueadas numa cultura em placa coberta com poli-D-lisina (l(^g/ml) a uma densidade de 0,5 milhões de células por placa de 35mm. As células mediodorsais dissociadas podem ser plaqueadas a uma densidade de 1,5 milhões de células por placa de 35mm coberta com poli-d-lisina (10μg/ml), poli-L-ornitina (10μg/ml) ou poli-L-ornitina mais laminina (5μg/ml). (vi) neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal (ver Pedido de Patente US Número de Série 07/400 591); (vii) neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral (ver Pedido de Patente US Número de Série 07/400 591); e (viii) células PC12 5.5. Anticorpos dirigidos contra factores neurotróficos quiméricos

De acordo com o invento, a proteína de factor neurotrófico quimérico, ou seus fragmentos ou derivados, podem ser utilizados como imunogénios para gerar anticorpos anti-factor neurotrófico quimérico. De modo a aumentar a probabilidade de produção de uma resposta imunitária anti-factor neurotrófico quimérico, a sequência de aminoácidos do factor neurotrófico quimérico pode ser analisada de maneira a identificar porções da molécula que possam estar associadas com o aumento de imunogenicidade. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser sujeita a análise por computador de modo a identificar os epítopos de superfície, de acordo com o método de Hopp e Woods (1981), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:3824-3828) que tem sido utilizado com sucesso para identificar péptidos antigénicos de superfície do antigénio de 73 021 6526-027-118 -36- • vf *V ' «*W."

Hepatite B. Alternativamente/ as sequências de aminoácidos deduzidas do factor neurotrófico quimérico de diferentes espécies podem ser comparadas e regiões relativamente não-homólogas identificadas; estas regiões não-homólogas têm mais probabilidade de serem imunogénicas entre as várias espécies.

Para a preparação de anticorpos monoclonais dirigidos contra factores neurotróficos quiméricos, qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo por linhas celulares contínuas em cultura pode ser utilizada. Por exemplo, a técnica do hibridoma, originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495-497). assim como a técnica do trioma, a técnica do hibridoma de células B humanas (Kozbor et al, 1983, Immunology Today 4.:72) e a técnica do hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., 1985, em "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) e semelhantes estão dentro do âmbito do presente invento.

Os anticorpos monoclonais para uso terapêutico podem ser anticorpos monoclonais humanos ou anticorpos monoclonais quiméricos humano-ratinho (ou outras espécies). Os anticorpos monoclonais humanos podem ser produzidos por qualquer uma das numerosas técnicas conhecidas na arte (por exemplo, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80.:7308-7312; Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4.: 72-79; Olsson et al., 1982 Meth. Enzymol. 92.:3-16). Podem ser preparadas moléculas de anticorpo quiméricas contendo uma região de ligação de antigénio de ratinho com regiões constantes humanas (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8JL:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:452). Vários procedimentos conhecidos na arte podem ser utilizados para a produção de anticorpos policlonais para epítopos do factor neurotrófico quimérico. Para a produção de anticorpo, vários animais hospedeiros podem ser imunizados por injecção com a proteína do factor neurotrófico quimérico, ou seus fragmentos ou derivados, incluindo, mas não se limitando, a coelhos, ratinhos,

73 021 6526-027-118 -37-ratazanas, etc. vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica, dependendo das espécies hospedeiras, e incluindo, mas não se limitando, ao adjuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerais tal como o hidróxido de alumínio, substâncias tensio-activas tal como a lisolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianinas de lapa (género Fissurella). dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tal como o BCG (Bacilo de Calmette-Guerin) e Corvnebacterium oarvum.

Um clone molecular de um anticorpo para um epítopo do factor neurotrófico quimérico, pode ser preparado através de técnicas conhecidas. A metodologia do ADN recombinante (ver por exemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) pode ser utilizada para construir sequências de ácido nucleico que codifiquem uma molécula de anticorpo monoclonal, ou uma sua região de ligação ao antigénio.

Moléculas de anticorpo podem ser purificadas por técnicas conhecidas, por exemplo, cromatografia de imunoabsorção ou imunoafinidade, métodos cromatográficos tal como o HPLC (cromatografia liquida de elevada resolução), ou uma sua combinação, etc.

Fragmentos de anticorpo que contém o idiotipo da molécula podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não se limitam: ao fragmento F(ab#)2/ que pode ser produzido por digestão com pepsina da molécula de anticorpo; aos fragmentos Fab', que podem ser gerados pela redução das pontes dissulfureto do fragmento F(ab')2 e aos fragmentos 2Fab ou Fab, que podem ser gerados por tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor. 5.6. Utilidade do invento O presente invento proporciona genes de factores neurotróficos quiméricos e proteínas que podem ser utilizadas em

/ 73021 6526-027-118 -38-várias aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Factores neurotróficos quiméricos do invento incluem moléculas que (i) combinam a actividade de dois factores neurotróficos numa única molécula; (ii) exibem espectros de actividade única relativamente aos factores que ocorrem naturalmente; (iii) funcionam como superagonistas de um factor que ocorre naturalmente; ou (iv) funcionam como antagonistas ou inibidores de um factor que ocorre naturalmente.

Os factores neurotróficos quiméricos do invento podem ser utilizados em aplicações de diagnóstico. Por exemplo, os factores neurotróficos quiméricos do invento podem compreender uma marca péptido antigénico, tal como uma marca myc (ver Secção 7, infra), que se pode ligar ao anticorpo marcado. Tal factor neurotrófico quimérico pode ser ligado às células que apresentam resposta ao factor neurotrófico e, por ligação indirecta da marca, pode servir como um indicador das células que apresentam resposta ao factor neurotrófico, uma técnica que pode ser útil no diagnóstico ou estudo de desordens do sistema nervoso. Pode ser desejável conceber um factor neurotrófico para fins de diagnóstico que possua uma actividade neurotrófica mínima. O presente invento também proporciona a utilização de factores neurotróficos quiméricos em várias aplicações terapêuticas. Os factores neurotróficos quiméricos oferecem as vantagems de, em certas ocasiões particulares, proporcionar actividades tipicamente associadas com vários factores neurotróficos numa única molécula e/ou prolongar a gama de actividades para além da molécula progenitora. Por exemplo, a quimera NM1, que compreende o NGF ligado a um péptido antigénico myc, exibe uma actividade em bioensaios utilizando gânglios da raiz dorsal, gânglios nodosos e gânglios simpáticos; em contraste, o NGF nativo possui uma actividade mínima ou nula nos ensaios com gânglios nodosos. Portanto, ο NM1 exibe uma gama alargada de actividade, já que exerce os seus efeitos em tipos de células que geralmente não apresentavam resposta à molécula progenitora, o NGF. Este facto pode ser particularmente

73021 6526-027-118 -39- importante em situações onde pode ser desejável induzir uma resposta nos neurónios simpáticos, parassimpáticos e sensoriais, por exemplo em polineuropatias amiloides, neuropatias diabéticas e polineuropatias disautonómicas. Apesar dos gânglios da raiz dorsal, gânglios simpáticos e gânglios nodosos poderem também responder a uma combinação de neurotrofinas, por exemplo ao BDNF e NGF, ou apenas ao factor NT-3, uma molécula quimérica afectando todos os três tipos de células pode estar relativamente isenta de efeitos secundários que podem ser provocados pela administração de BDNF mais NGF ou apenas a NT-3. Adicionalmente, factores neurotroficos podem exibir uma actividade mais potente do que as moléculas correspondentes que ocorrem naturalmente; por exemplo, tal como é mostrado na Figura 6, verificou-se que ο BM1, que compreende porções de BDNF e um péptido myc, exibe uma actividade promotora da sobrevivência superior à do BDNF nos ensaios com gânglios da raiz dorsal e gânglios simpáticos. Verificou-se que o NGF e o BDNF possuem actividade neurotrofica aditiva; de acordo com o invento, uma única molécula de factor neurotrofico quimérico pode ser utilizada para proporcionar a actividade dos múltiplos factores progenitores numa única molécula.

Em concretizações adicionais, factores neurotroficos quiméricos podem compreender um componente tóxico e podem ser utilizados para a eliminação de células doentes que respondem ao factor neurotrofico quimérico, por exemplo, células infectadas com vírus ou tumores com origem no sistema nervoso.

Em várias concretizações do invento, proteínas do factor neurotrofico quimérico, fragmentos peptídicos ou derivados, podem ser administrados a pacientes, nos quais o sistema nervoso foi danificado por traumas, cirúrgia, isquemia, infecção (por exemplo, poliomielite ou SIDA), doença metabólica, deficiência nutricional, doenças malignas ou agentes tóxicos. Em concretizações adicionais do invento, proteínas do factor neurotrófico quimérico ou fragmentos peptídicos ou seus derivados, podem ser utilizados para tratar condições congénitas ou desordens neurodegenerativas incluindo, mas não se limitando, à doença de Alzheimer, envelhecimento, neuropatias periféricas, 73021 6526-027-118 -40-

doença de Parkinson, coreia de Huntington e doenças e desordens dos neurónios motores.

Numa concretização específica do invento, a administração de proteína de factor neurotrófico quimérico, fragmentos peptídicos ou seus derivados, podem ser usados em conjunto com implantações cirúrgicas de tecido ou outras composições de libertação sustida no tratamento da doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e outras doenças dos neurónios motores (incluindo, por exemplo, a doença de Werdnig-Hoffman) e doença de Parkinson. Mostrou-se que a doença de Alzheimer envolve uma perda selectiva dos neurónios colinérgicos no prosencéfalo basal, e mostrou-se que aproximadamente 35% dos pacientes com a doença de Parkinson sofrem de uma demência tipo Alzheimer; o factor neurotrófico quimérico produzido de acordo com o invento pode provar ser útil como agente terapêutico único para esta complexa doença. De igual modo, o factor neurotrófico quimérico produzido de acordo com este invento pode ser usado terapeuticamente para tratar a doença de Alzheimer em conjunto com o síndrome de Down. O factor neurotrófico quimérico produzido de acordo com o invento pode ser utilizado no tratamento de uma variedade de demências assim como de desordens congénitas da aprendizagem.

Numa concretização adicional do invento, a proteína de factor neurotrófico quimérico, fragmentos ou derivados, podem ser utilizados em conjunto com outras citoquinas para alcançar o desejado efeito neurotrófico. As composições activas do invento, que podem compreender o factor neurotrófico quimérico, incluindo proteínas, fragmentos peptídicos ou derivados produzidos a partir deles, ou anticorpos (ou fragmentos de anticorpos) dirigidos contra proteínas de factor neurotrófico quimérico, fragmentos peptídicos, ou derivados, ou uma combinação de factor neurotrófico quimérico e um segundo agente, tal como o NGF podem ser administrados em qualquer transportador farmacêutico biocompatível estéril, incluindo, mas não se limitando, a solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. A quantidade de proteína de factor neurotrófico quimérico,

73021 6526-027-118 -41- fragmento peptídico, derivado, ou anticorpo, que seja eficaz no tratamento de uma desordem ou condição particular, dependerá da natureza da desordem ou condição e pode ser determinada por técnicas clínicas usuais. Quando possível, é desejável determinar primeiro in vitro a curva dose-resposta e as composições farmacêuticas do invento, por exemplo, nos sistemas de bioensaio do factor neurotrófico quimérico descritos acima, e depois em sistemas animais modelo antes do teste em humanos.

Os métodos de introdução incluem, mas não se limitam a, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutâneo, oral e intranasal. Adicionalmente, pode ser desejável introduzir as composições farmacêuticas do invento no sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo a injecção in-traventricular e intratecal; a injecção intraventricular pode ser facilitada por um catéter intraventricular, por exemplo, ligado a um reservatório, tal como o reservatório de Ommaya. Métodos de introdução podem também ser fornecidos por dispositivos recarregáveis ou biodegradáveis.

Pode ser ainda desejável administrar as composições farmacêuticas do invento localmente na área que necessita de tratamento; isto pode ser efectuado, por exemplo, e não por limitação, por infusão local durante a cirurgia, por injecção, através de um catéter ou através de uma implantação, sendo a referida implantação de material poroso, não-poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como as membranas sialásticas ou fibras. o invento também proporciona composições farmacêuticas compreendendo proteínas de factor neurotrófico quimérico, fragmentos peptídicos, ou derivados, administrados através de lipossomas, microparticulas ou microcápsulas. Em várias concretizações do invento, pode ser útil utilizar tais composições para se conseguir uma libertação sustida do factor neurotrófico quimérico e dos produtos relacionados com o factor neurotrófico quimérico. 73021 -42- 6526-027-118 6. Exemplo: Construção e expressão de factores neurotróficos quiméricos BDNF-NGF e marcados com myc

Um certo número de moléculas de NGF e BDNF geneticamente modificadas foi construído de forma a examinar se essas modificações iriam alterar a especificidade de acção do NGF e BDNF. Estas construções foram realizadas usando reacção em cadeia de polimerase para se realizar a união do gene por extensão por sobreposição (Horton et al., 1989, Gene 77:61-68). 6.1. Materiais e métodos 6.1.1. Construção das moléculas quiméricas

Os protocolos foram concebidos de modo a que as moléculas quiméricas fossem produzidas em reacção em cadeia de polimerase em um passo, utilizando três iniciadores oligonucleotídicos ou, alternativamente, uma reacção em cadeia de polimerase em três passos e utilizando quatro iniciadores oligonucleotídicos. Estes métodos foram utilizados para produzir nove quimeras, designadas por R2-R10, que compreendem porções das sequências que codificam BDNF e NGF, e duas quimeras, NM1 e BM1, compreendendo os ácidos nucleicos que codificam uma porção da proteína "marcadora" myc no NGF e no BDNF, respectivamente; sendo a sequência "marcadora" glu-lys-leu-ile-ser-glu-glu-asp-leu.

Para a quimera RI, hNGF foi amplificado com um oliqonucleotido 57, contendo um sítio de restrição Ciai. e um oligonucleótido 37, contendo o sítio Notl. O fragmento de PCR foi então subclonado nos sítios Narl/Notl de pC8hB(Pl).

Os oligonucleótidos utilizados para produzir a quimera RI foram os seguintes:

Oligonucleótido 57 5# - GCTTACCTGATCGATCATCATCCCATCCCATCTTC Oligonucleótido 37

37 - GCTATGCGCCGCGGATCCTTATCATCTCACAGCC 73021 -43- 6526-027-118 6.1.1.1. Construção de moléculas quiméricas utilizando uma reacção em cadeia de polimerase em um passo A Figura 1 é um diagrama esquemático da utilização de três oligonucleótidos (designados A,B e C) numa reacção em cadeia de polimerase em um passo (PCR; Saiki et al, 1985, Science 230:1350-1354)f de modo a efectuar a união por extensão por sobreposição utilizando uma modificação do método descrito por Horton et al. (1989, Gene 77.:61-68). Os três oligonucleótidos "A", "B" e "C" foram utilizados na razão 100:1:100, numa reacção de PCR em um só passo, utilizando os dois moldes hBDNF (plasmídeo de expressão para o BDNF humano em pCDM8, designado pC8-hB(Pl)) e hNGF (gene de NGF humano sintético adquirido à British Biotechnology Ltd.). Durante os primeiros ciclos, a amplificação assimétrica resulta predominantemente num produto A-B de cadeia simples. Subsequentemente este é amplificado com o oligonucleótido C de modo a formar o produto de fusão A-C. Utilizando este método foram efectuadas substituições de grandes porções da molécula de BDNF, através da fusão de parte da molécula de BDNF madura com parte da molécula de NGF. A posição da fusão é definida pelo oligonucleótido do meio ("B"), que era composto pela sequência de NGF na extremidade 5' e pela sequência de BDNF na extremidade 3#. A condição de amplificação rotineiramente utilizada foi de 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 43°c e 3 minutos a 72°C durante 35 ciclos. 0 fragmento de PCR foi purificado em gel, digerido com Narl/Notlr e subclonado nos correspondentes sítios do pC8hB(Pl). Este método foi utilizado para construir quimeras R2-5 (designados pC8hB/hN-Rl a pC8hB/hN-R5). A Tabela 3 apresenta os três oligonucleótidos utilizados para produzir as quimeras R2, R3, R4 e R5, incluindo o oligonucleótido 5' (correspondente ao iniciador A da Figura 1), o oligonucleótido do meio (correspondente ao iniciador B da Figura 1) e o oligonucleótido 3' (correspondente ao iniciador C da Figura 1). (Segue Tabela 3) 44- 73021 6526-027-118

Tabela 3

Iniciadores oligonucleotídicos utilizados na construção das quimeras R2, R3, R4 e R5

Quimera R2

Oligonucleótido 5' 57 - GATGCTGCAAACATGTCCATG Oligonucleótido do meio 5/ _ CTTATCCCCAACCCACACGCTAATACTGTCACACACGC Oligonucleótido 37

57 - GCTATGCGGCCGCGGATCCTTATCATCTCACAGCC

Os mesmos oligonucleótidos 57 e 37 foram utilizados para as quimeras R3 a R5

Quimera R3

Oligonucleótido do meio 57 - GACGGGATTTGGGTCCCGGCACTTGGTCTCGTAGAAG Quimera R4

Oligonucleótido do meio 57 - GAGTTCCAGTGCTTTGAGTCTATGCCCCTGCAGCC Quimera R5

Oligonucleótido do meio

57 - GACAAAGGTGTGAGTCGTTCGGCACTGGGAGTTCCAATG 6.1.1.2. Construção de moléculas quiméricas utilizando uma reacção em cadeia de polimerase em três passos A Figura 2 é um diagrama esquemático da utilização de quatro oligonucleótidos (designados A, B, C e D) numa reacção PCR em três passos, de modo a efectuar a união do gene por extensão por sobreposição. Devido aos iniciadores B e C compreenderem uma porção da sequência do NGF, os produtos de reacção final foram moléculas quiméricas, nas quais uma subsequência relativamente pequena de BDNF foi substituída por uma sequência de NGF.

73021 6526-027-118 -45-

Tal como é mostrado na Figura 2, hBDNF num vector (Stratagene) foi amplificado com um oligonucleótido 5' (A) e um oligonucleótido do meio (B), enquanto que hBDNF em pCDM8 foi amplificado com o oligonucleótido do meio (C) e um oligonucleótido 3' (D). Estes dois fragmentos de PCR foram purificados num gel e alíquotas foram combinadas na reacção subsequente. Uma vez que os dois nucleótidos do meio continham sequências sobrepostas de NGF na sua extremidade 5', os dois fragmentos de PCR, A-B e C-D, foram capazes de hibridar um com o outro na região de sobreposição e puderam, deste modo, ser amplificados com os oligonucleótidos 5' e 3', de modo a resultar num fragmento de PCR que contém uma pequena substituição pelo NGF. Este fragmento foi digerido com Narl/Notl e foi clonado nos correspondentes sítios no pC8-hB(Pl). Utilizando dois moldes BDNF clonados em diferentes vectores como material de partida, cada um com uma única extremidade oligonucleotídica (iniciador A e D, respectivamente), é obviada a probabilidade de obtenção de falsos negativos. Este método foi utilizado para construir as quimeras R6-10 (designadas pC8hB/hN-R6, pC8hB/mN-R7 a pC8hB/mN-R10). Para a quimera R6, pBS-hB foi utilizado como molde para os iniciadores A e B, enquanto que o hNGF sintético foi utilizado como molde para os iniciadores C e D. A Tabela 4 apresenta os iniciadores oligonucleotídicos utilizados na construção das quimeras R6, R7, R8, R9 e RIO. (Segue Tabela 4)

73021 6526-027-118 -46-

Tabela 4

Oligonucleotidos utilizados na construção das quimeras R6f R7, R8, R9, RIO, NM1 e BM1

Quimera R6

Oligonucleótido 5# (A)

5' - GATGCTGCAAACATGTCCATG

Oligonucleótido do meio (B)

57 - GCCTTTCTAGAGAGCACACATACACAAGAAGTGTC

Oligonucleótido do meio (C)

5' - GTGCTCTCTAGAAAGGC

Oligonucleótido 3' (D) 5'- GCTATGCGGCCGCGGATCTTATCATCTCACAGCC - 3'

Quimera R7

Oligonucleótido 5' (A) 57 - GTAAAACGACGGCCAGT - 3'

Oligonucleótido do meio (B)

5' - CAGCACTGTCACCTCCTTGCCCGACATGTCCACTGC

Oligonucleótido do meio (C) 5 7 - AAGGAGGTGACAGTGCTGGCCGAGGTCCCTGTATCAAAAGGC-3'

Oligonucleótido 37 (D) 57 - CAAAGATCCTCTAGAGTCGC-3 7

Os mesmos oligonucleotidos 57 e 37 foram utilizados para as quimeras R8-R10

Quimera R8

Oligonucleótido do meio (B) 57 - TCTGAATACACTGTTGTTAATAGGGACCTTTTCAAGGAC-37 73021 6526-027-118 -47-

Oligonucleótido do melo (C) 5/ _ ATTAACAACAGTGTATTCAGACAATACTTCTACGAGACC-37

Quimera R9

Oligonucleótido do meio (B)

57 - AACAGGATTGGAGGCTCGGCACTTGGTCTCGTAGAA

Oligonucleótido do meio (C)

57 - CGAGCCTCCAATCCTGTTGAGAGTGGCTGCAGGGGGCATAG

Quimera RIO

Oligonucleótido do meio (B) 5' - GTATGAGTTCCAGTGTTTGGAGTCTATGCCCCTGCAGCC Oligonucleótido do meio (C)

5' - TCCAAACACTGGAACTCATACTGCCGAACTACCCAGTCG NM 1

Oligonucleótido 5' 5' - CGGTACCCTCGAGCCACCATGCTGTGCCTCAAG-3'

Oligonucleótido do meio

5' - CAGATCCTCCTCAGAAATCAGCTTTTGCTCACCTCCTCTTGTAGCCTTCCTG

Oligonucleótido 3' 5 7 - GCTATGCGGCCGCTACAGATCCTCCTCAGAAATC-37 BM 1

Oligonucleótido 5'

5/ - CGGTACCCTCGAGCCACCATGACCATCCTTTTCCTT

Oligonucleótido do meio 57 - GCTATGCGGCCGCTACAGATCCTCCTCAGAAATCAGCTTTTGCTCACCTCCTTT AATGGTAATGTAC-37

Oligonucleótido 37 57 - GCTATGCGGCCGCTACAGAATCCTCCTCAGAAATC-3 7

73021 6526-027-118 -48- 6.1.1.3. Construção de moléculas quiméricas contendo uma marca myc A reacção PCR em um só passo utilizando os três iniciadores oligonucleotídicos, descrita acima, foi utilizada para a construção de plasmídeos de expressão que codificam NGP ou BDNP marcadas com um fragmento peptidico antigénico de 10 aminoácidos da proteína humana myc (Pedido de Patente US Número de Série 07/532 285, depositado em 1 de Junho de 1990, que se encontra aqui incorporada como referência). A técnica de PCR num único passo foi utilizada para gerar um produto de PCR contendo o gene de NGF de ratinho (a partir de um plasmídeo que codifica o precursor longo de NGP, pB15-NGF) ligado, através de uma ponte codificadora de duas glicinas, a uma sequência codificadora dos 10 aminoácidos do epítopo de myc; os iniciadores de PCR foram concebidos de modo a resultarem num produto de PCR no qual os dois últimos codões dos genes nativos de NGF sofressem delecção devido à possibilidade de os aminoácidos codificados por estes codões representarem um sítio de clivagem proteolítica que resultaria na perda do epítopo myc. Para construir o mNGF marcado com myc na extremidade 3' (designado pC81mN/myc-NMl), o NGF de ratinho com a prepro longa (20ng) foi amplificado com o oligonucleótido 5', o oligonucleótido do meio e o oligonucleótido 3', a uma concentração de 100, 1, lOOng, respectivamente (Figura 3A). As condições de amplificação utilizadas foram: 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 43°C e 3 minutos a 72°C durante 35 ciclos. O produto de PCR resultante foi então digerido com Xhol/Notl e clonado no vector CDM8 digerido com Xhol/Notl. O BDNF marcado com o epítopo myc na extremidade 3' (designado por pC8hB/myc-BMl) foi construído utilizando uma estratégia semelhante (Figura 3B).

Uma técnica semelhante foi utilizada para gerar o produto de PCR contendo o gene de BDNF humano ligado, através de uma ponte codicadora de duas glicinas, a uma sequência codificadora de 10 aminoácidos do epítopo myc; tal como na quimera NGF/myc, os iniciadores de PCR foram concebidos de modo a resultarem num produto de PCR, no qual os últimos três codões do gene do BDNF nativo, sofressem delecção devido à possibilidade dos aminoácidos

73021 6526-027-118 -49- codifiçados por estes codões representarem um sítio de clivagem proteolítica, que poderia resultar na perda do epitopo myc. 0 produto de PCR foi então digerido com Narl/Notl e subclonado no plasmídeo de expressão de BDNF humano progenitor, pC8hB(Pl), de modo a gerar o plasmídeo de expressão pC8hB/myc(BMl). 6.1.2. Transfecção das construções de expressão do

factor neurotrófico quimérico e expressão nas células COS 0 ADN plasmídico para cada uma das construções de expressão mamífera, descritas acima, foi preparado por um gradiente de cloreto de césio, onde surgiram duas bandas. 0 ADN plasmídico purificado foi então transfectado pelo método de coprecipitação com fosfato de cálcio (Chen e Okayama, Mol. Cell. Biol. 7.:2745 (1987)) nas células C0S-M5. As células C0S-M5 foram semeadas em placas de 60mm, 24 horas antes da transfecção, a uma densidade de 5xl05 células por placa, em 2,5 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo glucose (450(^g/ml) e 10% de soro fetal bovino. Os meios das células transfectadas foram recolhidos para bioensaio 48 horas após a transfecção. A marcação metabólica foi também efectuada nesta altura (infra). 6.1.2.1. Marcação metabólica

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células COS-M5 foram colocadas em 3ml de DMEM (isento de soro) sem metionina e císteina e contendo insulina, transferrina e selénio. As células foram mantidas sem aminoácidos durante 1 hora a 37 °C, em 5% de C02. Um mililitro de DMEM isento de soro foi removido e as células C0S-M5 foram marcadas com 35S-metionina e 35S-císteina (100/ACi/ml cada) durante 4 horas. 0 sobrenadante celular de C0S-M5 marcadas foi recolhido e analisado por uma electroforese em gel de poliacrilamida-SDS. A Figura 4 mostra a resolução de hBDNF, mNGF, hBDNF/myc (químero BM1) e mNGF/myc (químero NM1) marcados metabolicamente. 73021 6526-027-118 -50- 6.2. Resultados e discussão

Porções dos genes de NGF e BDNF foram unidas entre si utilizando a extensão por sobreposição dos iniciadores na reacção em cadeia de polimerase. Produziram-se moléculas quiméricas nas quais porções relativamente grandes (quimeras R1-R5) ou pequenas (R6-R10) foram substituídas por sequências de NGF. As sequências aminoácidos de R1-R10 são apresentadas na Figura 5. As quimeras de RI a R6 compreendem porções de BDNF humano e NGF humano e as quimeras R7 a RIO compreendem porções de BDNF humano e NGF de ratinho. A Tabela 5 apresenta um sumário da extensão aproximada das sequências de BDNF e NGF nas quimeras RI a RIO.

Ouimera Tabela 5 Seauência de BDNF Seauência de NGF RI Sequência prepro Sequência totalmente madura R2 Sequência prepro resíduos 1-17 resíduos 18-120 R3 Sequência prepro resíduos 1-58 resíduos 59-120 R4 Sequência prepro resíduos 1-72 resíduos 73-120 R5 Sequência prepro resíduos 1-81 resíduos 82-120 R6 Sequência prepro resíduos 1-110 resíduos 111-120 R7 Sequência prepro resíduos 1-33 resíduos 42-118 resíduos 34-41 R8 Sequência prepro resíduos 1-43 resíduos 51-118 resíduos 44-50 R9 Sequência prepro resíduos 1-58 resíduos 67-118 resíduos 59-66 RIO Sequência prepro resíduos 1-72 resíduos 80-118 resíduos 73-79

-51- 73021 6526-027-118

Adicionalmente, foram produzidas moléculas quiméricas que codificam NGF e BDNF marcados com um péptido antigénico com 10 aminoácidos da proteína myc. As sequências de aminoácidos deduzidas para NGF/myc (quimera NM1) e BDNF/myc (quimera BM1) são mostradas na Figura 5.

As construções quiméricas foram, cada uma delas, transfectadas em células COS-M5 através de coprecipitação com fosfato de cálcio. A expressão das quimeras Rl-RIO é evidenciada por marcação metabólica e por ensaios de bioactividade. De modo a pôr em evidência a expressão de NM1 e BM1, as células COS transfectadas com NMl ou BM1 foram marcadas metabolicamente com [35S]-metionina, os sobrenadantes foram sujeitos a uma electroforese em gel de poliacrilamida e depois as proteínas separadas electroforeticamente foram transferidas para uma membrana de nylon e autoradiografadas (Figura 4). Para o BDNF e quimera BM1: a banda principal de proteína marcada identificada foi uma banda de 31 kD, correspondente à forma precursora destas proteínas. Por comparação de intensidade da banda do precursor, é aparente que estas duas proteínas são expressas em quantidades relativamente iguais. Esta banda de proteína de 31 KD não se encontra presente na linha COS-MOCK (faixa 1). Para o NGF e quimera NMl, foram observados expressão igual para as formas maduras destas proteínas (aproximadamente de 12,5 kD). Tal como era esperado, o NGF marcado com myc (NMl) migrou relativamente mais lentamente do que o NGF. Todos as quimeras BDNF/NGF (R1-R10) expressaram predominantemente a proteína precursora de 31 kD a níveis semelhantes ao do BDNF. 7. Exemplo: Actividade neurotrófica dos factores neurotróficos quiméricos R1-R10, BMl e NMl 7.1. Material e métodos 7.1.1. Bioensaios utilizando explantes de tecido

Todos as quimeras (R1-R2, assim como BMl e NMl) e incluindo o BDNF e o NGF nativo, foram expressos em células COS-M5, tal

73021 6526-027-118 -52 como descrito acima. Os sobrenadantes colhidos das células transfectadas foram bioensaiados, utilizando explantes de tecido e culturas de células dissociadas, quanto à capacidade de induzir a proliferação de neurites em gânglios específicos. A actividade das quimeras foi determinada através da medição da sobrevivência em cultura das células dissociadas de gânglios da raiz dorsal (DGR) ou de gânglios em cadeia simpáticos (SG). Resumidamente, os gânglios foram dissecados a partir de embriões de galinha E8-9 e recolhidos em meio contendo soro (DMEM suplementado com 10% de FBS, estreptomicina, penicilina e glutamina). Após a tripsinisação com 0,5% de tripsina (Worthington), as células foram trituradas suavemente e depois preplaqueadas em placas de plástico de 60mm não revestidas. O passo de pré-plaqueamento (2-3h) permitiu que as células não neuronais se ligassem. As células neuronais não ligadas foram então recolhidas, centrifugadas, ressuspendidas em meio contendo soro e contadas nina hemacitómetro. A sobrevivência dos neurónios pode ser determinada por quantificação do número de células ou por meio de um ensaio colorimétrico baseado na conversão de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) num produto púrpura pelas células vitais. Para o método de contagem celular, as células foram plaqueadas a uma densidade de 24.000 células/placa de 35mm, e cultivadas durante 48h na presença ou ausência do sobrenadante das células COS contendo as proteínas quiméricas expressas antes da determinação do número de células. Para o método MTT, as células foram plaqueadas a uma densidade de 1000 células/alvéolo A2. Quarenta horas após o plaqueamento, o corante MTT foi adicionado a uma concentração de 0,5 mg/ml. Os corantes tomados pelas células vitais foram solubilizados, após 8 horas, pela adição de HC1 0,08N em isopropanol, e a absorvância (570 nm - 650 nm) medida. A absorvância foi traçada como uma função das várias diluições do sobrenadante das células COS adicionado. 7.1.2. Bioensaios em células PC12

Os sobrenadantes das células C0S-M5 transfectadas foram 73021 6526-027-118 -53-

recolhidos 48h após a transfecção para análise no ensaio de diferenciação de células PC12. As células PC12 foram semeadas em placas de 24 alvéolos (Costar) numa densidade de lxlO5 células/alvéolo. As células PC12 foram cultivadas em RPMI 1640 com 6% de soro fetal de vitelo e 6% de soro de cavalo. Os sobrenadantes COS foram adicionados às culturas de células PC12 (volume total de lml) a várias diluições entre 1:5 e 1:500. A proliferação de neurites foi avaliado como + (maioria das células expressam neurites) ou - (muito poucas, ou mesmo nenhumas, células expressam neurites). 7.2. Resultados e discussão 7.2.1. Ensaios de explantes e culturas de células dissociadas

Os ensaios in vitro utilizando explantes de gânglios periféricos de galinha têm sido utilizados para distinguir entre as bioactividades do NGF e do BDNF. Enquanto ambos os factores actuam em populações de neurónios sensoriais encontrados nos gânglios da raiz dorsal (DRG), derivados de cristã neural, apenas o BDNF suporta os neurónios sensoriais dos gânglios nodosos (NG) derivados da placa neural. Em contraste, o NGF, mas não o BDNF, pode suportar a sobrevivência e o crescimento de neurónios da cadeia paravertebral dos gânglios simpáticos (SG). Utilizámos estes ensaios de gânglios in vitro para determinar se as construções quiméricas específicas expressam bioactividades de BDNF, NGF ou BDNF e de NGF.

As quimeras R7, R8, R9, R10, BM1 e NM1 foram testadas quanto à actividade neurotrófica nos ensaios de explante de gânglio da raiz dorsal, de gânglios nodosos ou de gânglios simpáticos.

Tal como foi mostrado anteriormente, tanto o NGF como o BDNF promovem o crescimento de neurites a partir de gânglios da raiz dorsal (DRG) de galinha E8. Apenas o BDNF expressa a actividade da proliferação de neurites quando ensaiado com gânglios nodosos (NG) e o NGF, mas não BDNF, expressa actividade com gânglios simpáticos (SG; Tabela 6). A quimera R8 BDNF/NGF promoveu a

73021 6526-027-118 proliferação de neurites, a partir de ambos DRGs e SGs, característica de uma actividade semelhante à do NGF.

Das quimeras marcadas com um epítopo de 10 aminoácidos do proto-oncogene c-mvc, ο BM1 expressa actividade SG, característica de uma actividade semelhante à do NGF enquanto que ο NM1 expressa alguma actividade em NG, característica de uma actividade semelhante à do BDNF (Tabela 6).

Tabela 6

Comparação de BDNF, NGF, quimeras BDNF/NGF e factor neurotrófico marcado com myc ensaiados em gânglios da raiz dorsal de galinha embrionária (DRG), gânglios nodosos (NG) e gânglios simpáticos (SG) explantados.

Quimeras DRG NG SG R7 (250jUl) 3 1 0 R8 (250/íl) 3-4 2 3 R9 (250μ1) 2-3 2 0 RIO (250μ1) 3-4 2 0 NGF 5 1 5 BDNF 3 2 0,5 controlo com pCDM8 (250μ1) 0-1 0,5 0,5 BM1 (250/il) 2-3 2 1-2 NM1 (100/il) 5 3 5

Os resultados reflectem o grau de proliferação de neurites e a arborização observada, onde 5 é o grau máximo e 0 corresponde à não proliferação de neurites. Os resultados são representativos de três experiências independentes. A proliferação de neurites foi medida entre 24 e 48 horas após a adição do factor neurotrófico. A Tabela 8 mostra um estudo de dose-resposta que, em relação à indução da proliferação de neurites, mostrou que ο NM1 possui

73021 6526-027-118 uma actividade comparável ao NGF nos ensaios com os gânglios da raiz e com os gânglios simpáticos, mas foi mais activo nos ensaios com os gânglios nodosos. Relativamente ao NGF marcado com myc, a Tabela 7 mostra que o NMl recuperava aproximadamente 63% dos neurónios dos gânglios da raiz dorsal da espinal medula a 50μ1, enquanto que o NGF recupera apenas aproximadamente 47%, indicando que o NMl pode actuar como um agonista do NGF, relativamente à sobrevivência de neurónios. A Figura 6 mostra o resultado de um ensaio colorimétrico com MTT em neurónios de DRG e SG expostos a BDNF, NG ou BM1. Tal como é mostrado na Figura 6, a actividade que promove a sobrevivência de BM1 era significativamente maior do que aquela do BDNF, tanto em DRG como em SG. De tom modo semelhante ao do NGF, a actividade em DRG e SG não foi titulada mesmo numa diluição 1:1000 do sobrenadante das células COS BM1. Assim, a marcação com myc na extremidade 3' da molécula de BDNF confere-lhe actividade de SG.

Tabela 7

Comparação da actividade de NGF e NMl tal como ensaiada na sobrevivência de neurónios dissociados de DGR de embriões de galinha E8

Número de neurónios DRG NGF 5μ1 336 20μ1 440 50μ1 408 NMl 5μ1 334 20μ1 446 50μ1 542 O número de neurónios DGR contados representam 3,6% da área total e é uma média dos resultados de duas placas. 0 sobrenadante das células NGF COS recupera aproximadamente 47% dos neurónios de DGR a 50μ1; a um volume idêntico, o NMl recupera aproximadamente 63%

73021 6526-027-118 -56-dos neurónios.

Tabela 8

Comparação da actividade de NGF e NM1 tal como ensaiada nos explantes de DRG, NG e SCG de galinha E8 DRG NG SCG 5μ1 1 2 2 10μ1 4 0 , 5-1 2-3 20μ1 4-5 0,5-1 3-4 30μ1 5+ 1-2 4-5 40μ1 5+ 0 5+ 60μ1 5+2 0 5+2 5μ1 1-2 1-2 ιη ο 1 ο 10μ1 2 2-3 0,5-1 20μ1 3-4 3-4 2-3 30μ1 4-5 4-5 5 40μ1 5+ 5+ 5+ 60μ 5+2 5+3 5+2 A proliferação de neurites foi medida 24h após a adição do factor neurotrófico. 57- 73021 6526-027-118

7.2.2.BlOENSAXOS EM PC12

Mostrou-se que células PC12 de ratazana se diferenciavam em resposta a uma série de agentes incluindo o factor de crescimento do nervo. A resposta de diferenciação induzida pelo factor de crescimento do nervo, está associada com a cessação da proliferação celular e o crescimento para o exterior de extensões neuríticas longas. Contudo, este ensaio de diferenciação tem sido útil para a identificação de moléculas com actividade semelhante à do factor de crescimento do nervo. Testámos todas as nossas construções quiméricas e BDNF e NGF nativos quanto à sua capacidade de induzir o crescimento para o exterior das células PCI 2.

Como indicado na Tabela 9, o NGF tinha uma actividade promotora de neurites mesmo a uma diluição de 1:250. ο NM1 era também activo a uma diluição de 1:250. A quimera R8 (que expressava actividade no gânglio simpático - ver Tabela 1) foi capaz de induzir o desenvolvimento de neurites em células PCI2 a uma diluição de 1:50. Surpreendentemente, resultados similares foram também obtidos para BMl, indicando que BMl exibia uma actividade neurotrófica ausente na molécula progenitora BDNF. 0 BDNF apenas expressava um fraco desenvolvimento de neurites em células PC12 a diluições de 1:5. COS-MOCK não era activo. As quimeras Rl-5 e R7, R9, e R10 não eram activas.

Assim, em ensaios em explantes de tecidos e células PC12, a adição de sequências não relacionadas no terminal C das moléculas de BDNF e NGF confere toma nova actividade biológica não presente nas moléculas progenitoras. (Segue Tabela 9) 73021 6526-027-118 -58-

Tabela 9 Bioensaios de células PC12 com Quimeras

Quimeras 1:5 1:25 1:50 1:100 1:250 1:50 COS-MOCK BDNF NGF NM1 BM1 R8 +/- + + + + + + + + + + + + 1 1 1 ! + + 1 1 1 1 + + 1 1 1 1 + + 1 1 As células entre 24 e PCI2 foram pesquisadas para o crescimento neurítico 48 horas depois da adição do factor neurotrófico.

8. EXEMPLO: CONSTRUÇÃO E EXPRESSÃO DE FACTORES NEUROTRÓFICOS QUIMÉRICOS NGF/BDNF

Construiram-se factores neurotróficos quiméricos nos quais se substituíram regiões do NGF pela região correspondente do BDNF.

8.1. MATERIAIS E MÉTODOS

8.1.1 CONSTRUÇÃO DE MOLÉCULAS QUIMÉRICAS

Construiram-se quimeras NGF/BDNF por uma reacção de PCR em três passos envolvendo quatro oligonucleótidos, como descrito na secção 6.l.l.2, supra. Em cada caso, os iniciadores externos (correspondentes a A e D na Figura 2 e Figura 7 eram oligonucleótidos T7 e T3 (Stratagene). A figura 7 é um diagrama esquemático da estratégia usada na construção de quimeras, e a Tabela 10 apresenta as sequências dos oligonucleótidos iniciadores correspondentes na figura 7 aos iniciadores B e C. A

73021 6526-027-118 -59-sequência do iniciador T3 é 5'-ATTAACCCTCA CTAAAG-37 e o iniciador T7 é 5'-AATACGAC TCACTATAG-3‘. Resumidamente, o ADNc que codifica o NGF beta de ratinho foi cortado nos seus sítios originais Smal e Pstl (Scott et al. . 1983, Nature 302:538) e subclonado nos sítios de restrição Smal/Pstl do pKS (Stratagene). 0 plasmídeo resultante KS-NGF seviu como molde para todas as seguintes amplificações por PCR.

As moléculas quiméricas foram construídas por amplificação do fragmento 5'utilizando o iniciador T7 em conjunto com um oligonucleótido iniciador que se estende pelas partes desejadas de NGF e BDNF. Um fragmento 3' foi então amplificado utilizando o iniciador T3 e um segundo designado por iniciador NGF/BDNF. Os dois fragmentos resultantes foram isolados do gel e purificados. Num segundo passo de amplificação PCR, 100-3Q0ng de cada fragmento foram misturados, ligados e amplificados utilizando os iniciadores T7 e T3. Todas as reacções de PCR foram efectuadas nas seguintes condições. A desnaturação foi efectuada durante 3 minutos a 94°C seguida de 25 ciclos de desnaturação/renaturação consistindo em 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 50°C, e 3 minutos a 72°C. A extensão foi então realizada durante 10 minutos a 70°C. Um conjunto Gene-Amp (Cetus) foi utilizado de acordo com as instruções do fornecedor.

Os fragmentos amplificados foram então cortados com EcoRI e SacII e subclonados nos sítios de restrição correspondentes de um vector de expressão pBJ-5 modificado, compreendendo o promotor SR alfa (figura 8; Takebe et al.. 1988, Mol. Cell Biol. 8:466). No entanto, na quimera I, foi utilizado Notl em vez de SacII para a subclonagem porque foi criado um sítio SacII interno. Todas as quimeras foram sequenciadas inteiramente na região de amplificação utilizando o protocolo da sequenase (Stratagene). (Segue Tabela 10)

Iniciadores Oliginucleótidicos usados na construção de Quimeras CH1-12_

Quimera S-l

Iniciador 1(B) NGF(A3-9) --->BDNF 1-7 (33-mer)

57 - CGGGCGGGGTCCGAGTGGGATGAGCGCTTGCTC

Iniciador 2(C) (33-mer) 5' - CG GAC CCC GCC CGC CGC GGG GAG TTC TCA GTG T - 37

Quimera S-2

Iniciador 3(B) NGF(A10-22) --->BDNF 8-20 (37 mer) 5’ - AAT GCT CTC GCA CAC GCT CAG CTC CCC CAT GTG GAA - 37

Iniciador 4(C) (39-mer) 5' - C GTG TGC GAC AGC ATT AGC GAG TGG GTT GGA GAT AAG AC-37

Quimera S-3

Iniciador 5(B) NGF(£)23-33) — .BDNF 21-33 (45 mer)

5' - C CAC TGC CGT CTT TTT ATC CGC CGC CGT AAC CCA CAC ACT GAC AC —3'

Iniciador 6(C) (44 mer) 5' - T AAA AAG ACG GCA GTG GAC ATG TCG GGT AAG GAG GTG ACA GTG C - 3'

Quimera S-4

Iniciador 7(B) NGF (A34-42) —.BDNF (34-42) (38 mer) 57 - T TTC GAG GAC CGT GAC CGT GCC GCC CTT GAT GTC TGT G-3 7

Iniciador 8(C) (41 mer) 57 - GTC ACG GTC CTC GAA AAA GTC AAC ATT AAC AAC AGT GTA TT - 37 73021 -61- 6526-027-118

Quimera S-5

Iniciador 9(B) NGF (£43-50) —.BDNF (43-50) (30 mer) 57 - GCC TTT CGA GAC GGG CAC CTC GGC CAG CAC - 3'

Iniciador 10(C) (42 mer) 57 - CCC GTC TCG AAA GGC CAA CTG AAG CAG TAC TTT TTT GAG ACC - 37

Quimera S-6 (21-mers)

Iniciador B NGFTYR-54A: 57-CAG TAC TTT TAT GAG ACC AAG - 37 Iniciador C NGFTYR-54B: 57-CTT GGT CTC ATA AAA GTA CTG - 37

Quimera S-7

Iniciador 11(B) (38-mer) 57 - TT TGT GTA CCC CAT AGG ATT GCA CTT GGT CTC AAA AAA-37

Iniciador 12(C) (35-mer) 57 - CCT ATG GGG TAC ACA AAG GAG GGG TGC CGG GGC AT-3

Quimera S-8

Iniciador 13(B) (32-mer) 57 - GGA GTT CCA GTG CCT CTT GTC GAT GCC CCG GC-37 Iniciador 14(C) (35-mer) 57 - AGG CAC TGG AAC TCC CAG TGC ACC ACT ACT CAC A-37

Quimera S-9

Iniciador 15(B) (37-mer) 57 - AC ATA CGA CTG GGT AGT TCG GCA GTA TGA GTT CCA GT37

Iniciador 16(C) (37-mer) 57 - ACT ACC CAG TCG TAT GTG CGG GCG TTG ACA ACA GAT G—3 7 -62- 73021 6526-027-118

Quimera S-10

Iniciador 17(B) (36-mer) 5' - AT TCG TTT TTT GCT ATC CAT TGT CAA CGC CTT GAC G-3'

Iniciador 18(C) (38-mer) 5' - TG GAT AGC AAA AAA CGA ATT GGC TGG AGG TTC CGG-3'

Quimera S-ll (21-mers) (B) NGFSER-108A: 5' - G ATA GAC ACT TCC TGT GTG TG-3' (C) NGFSER-108B: 5' - CA CAC ACA GGA AGT GTC TAT C-3'

Quimera S-12

Iniciador 19(B) (37-mer) 5 ’ - TCC CCT CTT AAT GGT CAA AGT ACA CAC ACA GGC TGT G-3 7

Iniciador 20(C) (36-mer) 5' - TG ACC ATT AAA AGG GGA AGA TGA CTT GCC TGC AGG A-3 *****

8.1.2. EXPRESSÃO DE FACTORES NEUROTRÓFICOS QUIMÉRICOS EM CÉLULAS COS Células COS-7 foram transfectadas com construções quiméricas utilizando o método de DEAE-Dextrano-Cloroquina. Resumidamente, as culturas de células foram separadas um dia antes da transfecção de forma a ficarem cerca de 750 000 células por cada placa de 60mm. Foi preparada uma mistura de transfecção que continha 5μ1 de ADN (cerca de 5jug), lml de DMEM (sem soro), e 25μ1 de DEAE-Dextrano 20mg/ml. As culturas de células COS-7 foram então lavadas três vezes com 5ml de DMEM isento de soro. A mistura de transfecção (supra) foi adicionada e incubada durante 30 minutos a 37°C. Combinaram-se, então, 2ml de DMEM sem soro com 20μ1 de cloroquina 8mM e adicionados directamente à mistura células C0S-7/ADN/DEAE-Dextrano, que foi subsequentemente

73021 63 6526-027-118 incubada durante 2 horas e 30 minutos a 37°C. O sobreriàdante foi então aspirado das células e substituído por 2ml de DMEM isento de soro contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). As células foram então incubadas à temperatura ambiente durante 2 minutos e 30 segundos, depois foram lavadas com 5ml de DMEM que foi aspirado e substituído por 2,5ml de DMEM fresco com 6% de soro de cavalo e 6% de soro bovino suplementado com ferro. As células foram então ensaiadas para a expressão de factores neurotróficos quiméricos depois de 48 a 72 horas como determinado a seguir.

8.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram produzidas moléculas de ácido nucleico quimérico em que as porções de ADN codificadoras para o NGF foram substituídas pelas regiões do BDNF correspondentes, em intervalos regulares. A Tabela 11 apresenta a região de delecção do NGF em conjunto com a região de inserção correspondente do BDNF para cada quimera. Note-se que S-6 e S-ll contêm apenas mutações pontuais que foram também geradas por três passos de PCR. (segue Tabela 11) 73021 6526-027-118 -64-

TABE ΙΑ 11 ouimera Delecção na Recrião NGF Inserção na Reaião BDNF Thr Met His Arg S-l NGF (Λ 3-9 / BDNF 1-7) Gly Vai Gly Vai S-2 NGF (£10-22 / BDNF 8-20) Gly Gly Thr Gly S—3 NGF (£.23-33 / BDNF 21-33) Lys Vai Gly Vai S-4 NGF (A34-42 / BDNF 34-42) Asn Arg Pro Lys S-5 NGF (A43-50 / BDNF 43-50) Glu Cys Glu Cys S-6 NGF (£51-58 / BDNF 51-58) Arg Cys Asn Cys S-7 NGF (£59-68 / BDNF 59-68) Arg Cys Arg Cys S-8 NGF (£69-80 / BDNF 69-80) Thr Thr Arg Thr S-9 NGF (Δ81-91 / BDNF 81-91) Thr Phe Met Phe S-10 NGF (Ã92-101 / BDNF 92-102

Ile Cys Ile Cys S-ll NGF (£102-110 / BDNF 103-111)

Vai Gly Thr Arg S-12 NGF (£111-120 / BDNF 112-119)

As regiões de substituição da sequência do BDNF estão gráficamente representadas na figura 9, e as sequências de -65- 73021 6526-027-118 aminoácidos de S1-S12 estão representadas na figura 10. Note-se que cada Sl-12 contém porções da sequência de codificação do NGF de ratinho e da sequência do BDMF humano.

Os factores neurotróficos quiméricos Sl-12 foram cada um transfectados para células COS-7 utilizando um método de DEAE-Dextrano-Cloroquina. A expressão de factores neurotróficos quiméricos foi medida por marcação metabólica com metionina-[35S] seguida de electroforese em gel de poliacrilamida do sobrenadante celular marcado e autorradiografado. Os dados são apresentados na Tabela 12 como percentagem relativa em relação ao NGF original. Os dados são gerados por comparação das intensidades marcadas na autorradiografia focando especificamente a banda do NGF maduro a cerca de 13 kd (Figura 8B) e após precipitação do NGF original e das quimeras NGF/BDNF utilizando anticorpos anti-NGF (Figura 8C). 9. EXEMPLO: ACTIVIDADE NEUROTRÓFICA DOS FACTORES NEUROTRÓFICOS QUIMÉRICOS Sl-12

9.1. MATERIAIS E MÉTODOS

Foram realizados bioensaios utilizando gânglios da raiz dorsal (DRG), gânglios simpáticos (SG), gânglios nodosos (NG), e a linha celular de feocromacitoma de PC12 essencialmente como descrito na secção 7, supra.

9.2. RESULTADOS A actividade de NGF das quimeras S1-S12 foi inicialmente calculada para as células PC12. O desenvolvimento de neurites de PCI2 foi utilizado como medida da actividade do NGF. A actividade de cada quimera foi determinada relativamente à actividade do recombinante original (NGF-wt), expressa por células COS-7 transfectadas, a que foi atribuído arbitrariamente um valor de 100% (Tabela 12). A actividade específica de cada quimera foi determinada por estimação da concentração do factor neurotrófico quimérico por análise SDS-PAGE dos sobrenadantes das células metabolicamente marcadas COS-7 transfectadas, atribuindo de novo de forma arbitrária o valor de 100% à actividade neurotrófica

73021 6526-027-118 -66- associada com as células COS-7 transfectadas com NGF-wt.

Culturas de explantes do gânglio da raiz dorsal (DRG), gânglios nodosos (NG), e gânglios simpáticos(SG) obtidos a partir de embriões de galinha E8 foram expostos a iguais quantidades de Sl-12, NGF-wt, e sobrenadante de células COS-7 transfectadas com vector (controlo negativo). Άρόε 24 horas de cultura, o desenvolvimento fibroso em resposta ao NGF recombinante de tipo selvagem, ao vector controlo negativo, ou às quimeras Sl-12 foi determinado (Tabela 12) numa escala arbitrária de 0 a 5 por comparação com uma série de fotografias padrão de respostas a doses padrão do DRG de embrião de galinha E8 ao NGF na gama de dosagem de 0 a 20ng/ml. 0 valor 0 indica não haver resposta; o valor de 1 indica actividade detectável com um desenvolvimento de cerca de 10 a 50 fibras (equivalente a uma resposta típica a 20-100 picogramas/ml de NGF); o valor 2 indica actividade moderada com o desenvolvimento de muitas fibras num halo óbvio; o valor 3 indica uma boa actividade, um desenvolvimento de muitas fibras longas; o valor de 4 indica actividade forte, com dum desenvolvimento abundante de fibras, e o valor de 5 indica o desenvolvimento massivo de fibras, equivalente à resposta máxima aos níveis saturantes de NGF (cerca de l-10ng/ml). Os resultados dos explantes na tabela 12 representam o desenvolvimento máximo de fibras verificado a níveis saturantes de cada sobrenadante, determinado num ensaio de dose-resposta. 0s sobrenadantes foram ensaiados na gama de 0,1 a 83μ1 num volume final de 2 ml. Em outros estudos de explantes, maiores concentrações de S4 foram associadas com maiores valores de desenvolvimento. (segue Tabela 12) 73021 6526-027-118 -67-

TABELA 12

Lista de sobrenadantes incluídos: Nível Actividade de expressão relativa específica em células PCI2 Dados dos explantes* Clones DRG NG S.C. NGF-wt 100% 100% 5 1 5 Vector — — 0 0 0 S-l 200% 25% 5 1 5 S-2 100% 100% 5 2 5 S-3 100% 100% 5 3 5 S-4 20% 100% 1 1 1 S-5 5% 100% 1 1 1 S-6 100% 100% 5 3 5 S-7 50% 100% 5 2 5 S-8 100% 100% 5 2 5 S—9 100% 100% 5 4 5 S-10 100% 100% 5 4 5 S-ll 50% 50% 5 1 5 S-12 100% 50% 5 3 5 * desenvolvimento das fibras após 24 horas

9.3. DISCUSSÃO

Surpreendentemente, os dados sugerem que apesar das substituições das regiões do NGF pelas sequências do BDNF, a maior parte das quimeras NGF-BDNF retêm actividade total em células que respondem ao NGF. Iguais quantidades da maior parte dos factores neurotróficos quiméricos exibiam altos níveis de actividade de promoção para o desenvolvimento de neurites em células PC12, comparáveis à actividade do NGF de tipo selvagem. Apareceram excepções; verificou-se que a quimera S-l apresentava uma actividade substancialmente mais baixa do que o NGF de tipo selvagem e as quimeras, S-ll e S-12 ,exibiam cerca de 50% da actividade específica do NGF. No entanto, a retenção de actividade total do NGF na maior parte das quimeras, foi 73021 6526-027-118 -68-

inesperada, pois como tinha sido previamente previsto, algumas pequenas alterações nas regiões críticas da sequência do NGF podem levar a uma perda substancial de actividade.

Adicionalmente, verificou-se que a maioria dos factores neurotróficos quiméricos aqui discutidos, como o NGF, induziam uma resposta máxima em explantes de gânglios da raiz dorsal e gânglios simpáticos. Como se mostra na Tabela 12, virtualmente todas as quimeras testadas mostram uma actividade máxima para o gânglio da raiz dorsal e gânglios simpáticos. Verificou-se que a quimera S-12 possuía uma actividade específica 3-5 vezes superior ao NGF em explantes de gânglios da raiz dorsal, indicando que a S-12 pode ser um superagonista da actividade do NGF pelo menos em algumas células alvo. Uma possível explicação para a actividade superagonista da S-12 pode estar na substituição da sequência do BDNF que pode ter produzido uma alteração conformacional na estrutura do NGF que resultou num aumento de afinidade da S-12 para o receptor do NGF ou, alternativamente, tenha alcançado uma estabilidade aumentada da S-12 para os processos degradativos.

Além disso, foi observado que muitas das quimeras exibiam uma actividade adicional em gânglios que normalmente respondem mais ao BDNF do que ao NGF. 0 NGF apoia a sobrevivência e desenvolvimento de neurites de culturas de explantes de neurónios sensoriais do gânglio da raiz dorsal de embrião de galinha e de gânglios da cadeia simpática paravertebral de embrião de galinha, mas não tem efeitos em explantes de neurónios sensoriais de gânglios nodosos derivados da placa neural (Lindsay et al.. 1985, Dev. Biol. 112:319). Inversamente, o BDNF apoia a sobrevivência e desenvolvimento de neurites de explantes de gânglios da raiz dorsal e gânglios nodosos, mas não tem efeito sobre os gânglios simpáticos. Como se mostra na Tabela 12, muitos dos factores neurotróficos quiméricos NGF-BDNF induzem de moderado a forte desenvolvimento de fibras em explantes de gânglios nodosos, indicando actividade semelhante ao BDNF. Todas as quimeras 3, 4, 6, 9, 10, e 12 mostravam uma actividade em gânglios nodosos que era muito superior a qualquer efeito observado para o NGF. 73021 6526-027-118 -69-

Parece, deste modo, que uma variedade de modificações de sequência, desde uma extremidade amino até à extremidade carboxílica do NGF, pode conferir uma actividade semelhante à do BDNF ou uma actividade de outros membros da família das neurotrofinas. 10. DEPÓSITO DE MICROORGÃNISMOS Os ADNc seguintes foram depositados na American Type Culture Collection em Rockville, M.D.:

Na de Acesso

Designação da molécula quimérica Abreviatura pBJ51mN/hB-S4 S4 pBJ51mN/hB-S9 S9 pBJ5lmN/hB-S10 S10 pBJ51mN/hB-S12 S12 pc8hB/mN-R8 R8 pcShmN/myc-NMl NM1 pc8hB/myc-BMl BM1 0 presente invento não é limitado no seu âmbito pelas concretizações específicas aqui descritas. Desta forma, algumas das modificações do invento, além das aqui descritas, tornar-se-ão óbvias para os especialistas na matéria a partir da descrição feita e das figuras que a acompanham. Pretende-se que estas modificações estejam dentro do âmbito das reivindicações em apêndice.

Claims

73021 6526-027-118 -70-

REIVINDICACÕES 1 - Processo de produção de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína quimérica, consistindo a proteína quimérica essencialmente num primeiro factor neurotrófico, em que uma sequência com cerca de 3 a cerca de 13 aminoácidos do primeiro factor neurotrófico é substituída por uma sequência de aminoácidos de tamanho semelhante de um segundo factor neurotrófico, de tal modo que a proteína quimérica resultante difere em sequência em pelo menos 3 aminoácidos do primeiro factor neurotrófico, caracterizado por compreender: (a) a introdução da molécula de ácido nucleico num microor-ganismo hospedeiro; (b) a propagação da molécula de ácido nucleico no microorga-nismo hospedeiro; e (c) a recuperação da molécula de ácido nucleico propagada do microorganismo hospedeiro.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o primeiro e segundo factores neurotróficos serem seleccionados do grupo consistindo em factor neurotrófico derivado de cérebro, factor neurotrófico ciliar, neurotrofina-3 e factor de crescimento de nervo.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o primeiro factor neurotrófico ser factor de crescimento de nervo e o segundo factor neurotrófico ser factor neurotrófico derivado de cérebro.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-Sl, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada a seguir para a quimera Sl: (segue Sequência) 10 73021 6526-027-118 -71- NGF HUMANO NGF DE RATAZANA NGF DE RATINHO BDNF HUM NT-3 1 NGF DE RATINHO BDNF HUM 2 NGF DE RATINHO BDNF HUM 3 NGF DE RATINHO BDNF HUM 4 NGF DE RATINHO BDNF HUM 5 (NOTE ASN EM NGF DE RATINHO BDNF HUM 6 NGF DE RATINHO BDNF HUM 7 NGF DE RATINHO BDNF HUM δ NGF DE RATINHO BDNF HUM 9 NGF DE RATINHO BDNF HUM 10 NGF DE RATINHO BDNF HUM 11 NGF DE RATINHO BDNF HUM 12 NGF DE RATINHO BDNF HUM V *** *** SerSerserHisProilePheHisargGly SerSerThrHisProValPheHisMetGly SerSerThrHisProValPheHisMetGly HisSei----AspProAla—ArgArgGly TyrAlaGluHís—LysSerHisArgGly SerSer*********************Gly HisSerAspProAlaArgArg SerSerThrHisProValPheHisMet Gly SerSerThrHisProValPheHisMetGly SerSerThrHisProValPheHisMetGly 43) SerSerThrHisProValPheHisMetGly SerSerThrHisProValPheHisMetGly SerSerThrHisProValPheHisMetGly . SerSerThrHisProValPheHisMetGly . SerSerThrHisProValPheHisMetGly . SerSerThrHisProValPheHisMetGly . SerSerThrHisProValPheHisMetGly . SerSerThrHisProValPheHisMetGly . -72 73021 6526-027-118 30 *** 61 yAspLysT h r T h r A1 aT h r Asp GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GlyAspLysThrThrAlaThrAsp 20 *** *** GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluTyrSerValCysAspSerGluSerLeu TrpVal------ThrAspLysSerSerAlalleAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp *** *** *** ------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpVal GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------*** *** *** T h rA1aAlaAspLysLysThrA1aValAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp 73021 -73- 6526-027-118 j 40 50 XXX χχχ XXX XXX IleLysGlyLysGluValmetValLeuGly GluValAsnlleAsnAsnSerValPheLys IleLysGlyLysGluValThrValLeuGly GluValAsnIleAsnAsnSerValPheLys IleLysGlyLysGluValThrValLeuala GluValAsnlleAsnAsnSerValPhearg MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys IleArgGlyHisGlnValThrValLeuGly GluIleLysThrGlyAsnSerProValLys IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnlleAsnAsnSerValPheArg IlsLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnlleAsnAsnSerValPheArg . ****** LysGluValThrValLeuAla GluValAsnlleAsnAsnSerValPheArg | I MetSerGly IleLysGly****** *** *** AsnlleAsnAsnSerValPheArg GlyThrValThrValLeuGlu LysVal IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluVal************************ ProValSerLysGlyGlnLeuLys IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnIleAsnAsnSerValPheArg IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnlleAsnAsnSerValPheArg IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnIleAsnAsnSerValPheArg IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnIleAsnAsnSerValPheArg IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnIleAsnAsnSerValPheArg IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnIleAsnAsnSerValPheArg IleLysGlyLysGluValThrValLeuAla GluValAsnIleAsnAsnSerValPheArg 73021 -74- 6526-027-118 I 60 70 *** *** *** *** I GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgasp ProAsnProValaspSerGlyCysArgGly . GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla ProAsnProValGluSerGlyCysArgGly , j GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla serAsnProValGluSerGlyCysArgGly j GlnTyrPheTyrGluThrLysCysAsnPro MetGlyTyrThrLysGluGlyCysArgGly I GlnTyrPheTyrGluThrArgCysLysGlu AlaArgProValLysAsnGlyCysArgGly GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly *** ArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly GlnTyrPheTyrGluThrLysCys GlnTyrPhePheGluThrLysCys****** ****************** ArgGly . AsnPro MetGlyTyrThrLysGluGlyCys | GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCys ArgGly | GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly . GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly . GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly . GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgAla SerAsnProValGluSerGlyCysArgGly . 73021 6526-027-118 -75-

j 80 90 I | IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu I . IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu . | IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu | | IleAspLysArgHisTrpAsnSerGlnCys ArgThrThrGlnSerTyrValArgAlaLeu | | IleAspAspLysHisTrpAsnSerGlnCys LysThrSerGlnThrTyrValArgAlaLeu | \ IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu ! I I ! IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu \ I I ! IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu . I I ! IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu . \ IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu ! j i | IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu ! I j | IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu | j i j ****** *** ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu ] . IleAspLysArgHisTrpAsnSerGlnCys I I í IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys *** ********* *** J | ArgThrThrGlnSerTyrValArgAlaLeu | ! IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu . I I ! IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu ! I I ! IleAspSerLysHisTrpAsnSerTyrCys ThrThrThrHisThrPheValLysAlaLeu \ 73021 6526-027-118 -76-

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5 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S2, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S2.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S3, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S3.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB—S4, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S4.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S5, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S5.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S7, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S7.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S8, ou por um seu equivalente funcional que codifica 73021 6526-027-118 -79-

uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S8.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S9, tal como depositado no ATCC e com o nD de acesso 40861 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S9.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJSlmN/hB-SlO, tal como depositado no ATCC e com o n2 de acesso 40858 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S10.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S12, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40860 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos subs-ί tancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S12.
14 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o primeiro factor neurotrófico ser factor neurotrófico derivado de cérebro e o segundo factor neurotrófico ser factor de crescimento de nervo.
15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R7, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada a seguir para a quimera R7: 73021 6526-027-118 -80-

CLIVAGEM 10 I «PREPRO V MADURA>> *** NGF HUMANO ArgSerLysArg SerSerserHisProilePheHisargGly NGF DE RATAZANA ArgSerLysArg SerSerThrHisProValPheHisMetGly NGF DE RATINHO ArgSerLysArg SerSerThrHisProValPheHisMetGly BDNF HUM Ri BDNF HUM NGF HUMANO ArgValArgArg HisSer—AspProAla—ArgArgGly ArgValArgArg SerSerserHisProilePheHisargGly R2 BDNF HUM ArgValArgArg HisSei----AspProAla---ArgArgGly NGF HUMANO R3 BDNF HUM ArgValArgArg HisSei----AspProAla—ArgArgGly NGF HUMANO | R4 BDNF HUM ArgValArgArg HisSer—AspProAla—ArgArgGly NGF HUMANO R5 BDNF HUM ArgValArgArg HisSer—AspProAla—ArgArgGly NGF HUMANO R6 BDNF HUM ArgValArgArg HisSei----AspProAla---ArgArgGly NGF HUMANO R7 BDNF HUM ArgValArgArg HisSei----AspProAla—ArgArgGly NGF DE RATINHO R8 BDNF HUM ArgValArgArg HisSei----AspProAla---ArgArgGly NGF DE RATINHO R9 BDNF HUM ArgValArgArg HisSer—AspProAla---ArgArgGly NGF DE RATINHO RIO BDNF HUM ArgValArgArg HisSer—AspProAla---ArgArgGly NGF DE RATINHO BM1 BDNF HUM ArgValArgArg HisSer—AspProAla---ArgArgGly EPÍTOPO MYC NM1 I NGF DE RATINHO ArgSerLysArg SerSerThrHisProValPheHisMetGly - EPÍTOPO MYC | BM3 j BM1 NGF DE RATINHO ArgSerLysArg SerSerThrHisProValPheHisMetGly | 73021 -81- 6526-027-118 20 30 «XX XXX XXX XXX GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluLeuSerValCysAspSer ValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluLeuSerValCysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp CysAspSerlleSerGlu TrpValThrAlaAlaAspLysLysThrAlaValAsp GluPheSerValCysAspSerValSerVal TrpVal------GlyAspLysThrThrAlaThrAsp 73021 -82- 6526-027-118 40 50 *** *** *** *** IleLysGlyLysGluValmetValLeuGly GluValAsnlleAsnAsnSerValPheLys IleLysGlyLysGluValThrValLeuGly GluValAsnlleAsnAsnSerValPheLys IleLysGlyLysGluValThrValLeuala GluValAsnlleAsnAsnSerValPhearg MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys IleLysGlyLysGluValmetValLeuGly GluValAsnlleAsnAsnSerValPheLys IleLysGlyLysGluValmetValLeuGly GluValAsnlleAsnAsnSerValPheLys MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys MetSerGly****** *** ***ValProValSerLysGlyGlnLeuLys LysGluValThrValLeuala Glu MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValPro********************* IleAsnAsnSerValPhearg MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys IleLysGlyLysGluValThrValLeuala GluValAsnlleAsnAsnSerValPhearg MetSerGlyGlyThrValThrValLeuGlu LysValProValSerLysGlyGlnLeuLys -83- 73021 6526-027-118 I 60 70 *** *** *** *** j GlnTyrPhePheGluThrLysCysArgasp ProAsnProValaspSerGlyCysArgGly . 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120 *** *** ValLeuSerArgLysAlavalArgArgala ValLeuSerArgLysAlaAlaArgArgGly ValLeuSerArgLysAlathrArgArgGly ThrLeuThrlleLysArgGlyArg ValLeuSerArgLysAlavalArgArgala ValLeuSerArgLysAlavalArgArgala ValLeuSerArgLysAlavalArgArgala ValLeuSerArgLysAlavalArgArgala ValLeuSerArgLysAlavalArgArgala ValLeuSerArgLysAlavalArgArgala ThrLeuThrlleLysArgGlyArg ThrLeuThrlleLysArgGlyArg ThrLeuThrlleLysArgGlyArg ThrLeuThrlleLysArgGlyArg ThrLeuThrlle GlyGlyLysAspGluLeuSerThrlleVal ValLeuSerArgLysAlatArg GlyGlyLysAspGluLeuSerThrlleVal ThrLeuThrlleGlyGlyLysAspGluLeuSerThrlleVal. 73021 6526-027-118 -87-
16 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R8, tal como depositado no ATCC e com o ns de acesso 40862 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R8.
17 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R9 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R9.
18 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-—RIO ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera RIO.
19 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o primeiro e segundo factores neurotróficos serem membros da família de genes da neurotrofina.
20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a proteína quimérica compreender quatro resíduos cisteína, localizados em quatro das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições seme- lhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina. 73021 6526-027-118 -88- «*'

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21 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender cinco resíduos cisteína, localizados em cinco das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
22 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender seis resíduos cisteína, localizados nas posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
23 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracteri-zado por a proteína quimérica ter um pi entre cerca de 9 e 10.
24 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender quatro resíduos cisteína, localizados em quatro das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e £ 73021 6526-027-118 -89- «* * próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
25 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender cinco resíduos cisteína, localizados em cinco das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família do gene da neurotrof ina.
26 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender seis resíduos cisteína, localizados nas posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família do gene da neurotrofina.
27 - Processo de produção de uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína quimérica, a qual consiste essencialmente numa porção de um factor neurotrofico, e numa porção de um péptido, em que a porção peptídica confere à proteína quimérica uma actividade neurotrofica não apresentada pelo factor neurotrofico, caracterizado por compreender: 73021 6526-027-118 -90-

(a) a Introdução da molécula de ácido nucleico codificando a proteína quimérica num microorganismo hospedeiro; (b) a propagação da molécula de ácido nucleico no microorganismo hospedeiro; e (c) a recuperação da molécula de ácido nucleico recombinante do microorganismo hospedeiro.
28 - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracteriza-do por o péptido ser a proteína myc.
29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracteri-zado por a porção da sequência da proteína myc ser GLU-GLN-LYS-LEU-ILE-SER-GLU-GLU-ASP-LEU.
30 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracteriza-do por o factor neurotrófico ser factor neurotrófico derivado de cérebro.
31 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/myc-BMl, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40863, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera NM1.
32 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracteriza-do por o factor neurotrófico ser factor de crescimento de nervo.
33 - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hmN/myc-NMl, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40864, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera NM1.
34 - Processo de preparação de uma molécula de ácido nucleico pBj5lmN/hB-S6 ou de um seu equivalente funcional que codifica 73021 6526-027-118 -91-

φ uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como apresentada na reivindicação 4 para a quimera S6, caracterizado por compreender: (a) a introdução da molécula de ácido nucleico codificando a proteína quimérica num microorganismo hospedeiro; (b) a propagação da molécula de ácido nucleico no microorganismo hospedeiro; e (c) a recuperação da molécula de ácido nucleico recombinante do microorganismo hospedeiro.
35 - Processo de preparação de uma proteína quimérica caracterizado por compreender: (a) a obtenção de uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica um primeiro factor neurotrófico; (b) a substituição de uma porção com 9 a 39 nucleótidos da referida primeira molécula de ácido nucleico por uma porção de tamanho semelhante de uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um segundo factor neurotrófico, de tal modo que a molécula de ácido nucleico quimérica codificando o factor neurotrófico, resultante, codifica uma proteína quimérica que tem actividade neurotrófica e que difere, na sequência de aminoácidos, em pelo menos 3 aminoácidos do primeiro factor neurotrófico (c) a expressão da molécula de ácido nucleico quimérica codificando o factor neurotrófico quimérico numa célula hospedeira compatível; e (d) a recuperação da proteína quimérica expressa da célula hospedeira.
36 - Processo de preparação de uma proteína quimérica de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o primeiro e segundo factores neurotróficos serem seleccionados do grupo consistindo em factor neurotrófico derivado de cérebro, factor neurotrófico ciliar, neurotrofina-3 e factor de crescimento de nervo.
37 - Processo de preparação de uma proteína quimérica de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por o primeiro

73021 6526-027-118 -92 factor neurotrófico ser factor de crescimento de nervo e o segundo factor neurotrófico ser factor neurotrófico derivado de cérebro .
38 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteri-zado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-Sl, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera Sl.
39 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S2, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S2.
40 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S3, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S3.
41 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S4, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S4.
42 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteri-zado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S5, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S5. 73021 6526-027-118 -93-
43 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S7, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S7.
44 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S8, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S8.
45 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S9, tal como depositado no ATCC e com o n8 de acesso 40 8 61 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S9.
46 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ5lmN/hB-SlO, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40858 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S10.
47 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBJ51mN/hB-S12, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40860 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera 73021 -94- 6526-027-118
48 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracteriza-do por o primeiro factor neurotrófico ser factor neurotrófico derivado de cérebro e o segundo factor neurotrófico ser factor de crescimento de nervo.
49 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R7, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R7.
50 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R8, tal como depositado no ATCC e com o nB de acesso 40862 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R8.
51 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R9 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R9.
52 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R10 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera Rio.
53 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracteriza-do por o primeiro e segundo factores neurotróficos serem membros da família de genes da neurotrofina.

73021 6526-027-118
54 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender quatro resíduos cisteína, localizados em quatro das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
55 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender cinco resíduos cisteína, localizados em cinco das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
56 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender seis resíduos cisteína, localizados nas posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.

73021 6526-027-118 -96-
57 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracteri-zado por a proteína quimérica ter um pi entre cerca de 9 e 10.
58 - Processo de acordo com a reivindicação 57, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender quatro resíduos cisteína, localizados em quatro das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e I próximo do aminoácido 110, ou em posições seme lhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
59 - Processo de acordo com a reivindicação 57, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender cinco resíduos cisteína, localizados em cinco das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e ) próximo do aminoácido 110, ou em posições seme lhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família do gene da neurotrofina.
60 - Processo de acordo com a reivindicação 57, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender seis resíduos cisteína, localizados nas posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79,

73021 6526-027-118 -97- próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família do gene da neurotrofina.
61 - Processo de preparação de uma proteína quimérica, que consiste essencialmente numa porção de um factor neurotrófico, e numa porção de um péptido, em que a porção peptídica confere à proteína quimérica uma actividade neurotrófica não apresentada pelo factor neurotrófico, caracterizado por compreender: (a) a introdução da molécula de ácido nucleico codificando a proteína quimérica num microorganismo hospedeiro competente; (b) a propagação da molécula de ácido nucleico no microorganismo hospedeiro; e (c) a recuperação da proteína quimérica expressa do microorganismo hospedeiro.
62 - Processo de acordo Com a reivindicação 61, caracterizado por o péptido ser a proteína myc.
63 - Processo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por a porção da sequência da proteína myc ser GLU-GLN-LYS-LEU-ILE-SER-GLU-GLU-ASP-LEU.
64 - Processo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por o factor neurotrófico ser factor neurotrófico derivado de cérebro.
65 - Processo de acordo com a reivindicação 64, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/myc-BMl, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40863, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína possuindo um sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera BM1.
66 - Processo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por o factor neurotrófico 'ser factor de crescimento de nervo. 73021

6526-027-118 -98-
67 - Processo de acordo com a reivindicação 66, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hmN/myc-NMl, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40864, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera NM1.
68 - Processo de preparação de uma molécula de ácido nucleico quimérica codificando factor neurotrófico caracterizado por compreender: (a) a obtenção de uma primeira molécula de ácido nucleico que codifica um primeiro factor neurotrófico; (b) a substituição de uma porção com 9 a 39 nucleótidos da referida primeira molécula de ácido nucleico por uma porção de tamanho semelhante de uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um segundo factor neurotrófico, de tal modo que a molécula de ácido nucleico quimérica codificando o factor neurotrófico, resultante, codifica uma proteína quimérica que tem actividade neurotrófica e que difere, na sequência de aminoácidos, em pelo menos 3 aminoácidos do primeiro factor neurotrófico.
69 - Processo de preparação de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 68, caracterizado por o primeiro e segundo factores neurotróficos serem seleccionados de entre o grupo consistindo em factor neurotrófico derivado de cérebro, factor neurotrófico ciliar, neurotrofina-3 e factor de crescimento de nervo.
70 - Processo de preparação de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 69, caracterizado por o primeiro factor neurotrófico ser factor neurotrófico derivado de cérebro e o segundo factor neurotrófico ser factor de crescimento de nervo.
71 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracterizado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj51mN/hB-Sl, ou por um seu equivalente funcional que codifica 73021 6526-027-118 -99- φ··'-'ψ"Λ ’

uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera Sl.
72 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj51mN/hB-S2, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S2.
73 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj51mN/hB-S3, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S3.
74 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj51mN/hB-S4, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S4.
75 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteri-zado por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj51mN/hB-S5, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S5.
76 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj51mN/hB-S7, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S7.

73021 6526-027-118 -100
77 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj 5lmN/hB-S8, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S8.
78 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj51mN/hB-S9, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40861 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S9.
79 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pBj51mN/hB-S10, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40858 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S10.
80 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo i pBj51mN/hB-S12, tal como depositado no ATCC e com o na de acesso 40860 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 4 para a quimera S12.
81 - Processo de acordo com a reivindicação 69, caracteriza-do por o primeiro factor neurotrófico ser factor neurotrófico derivado de cérebro e o segundo factor neurotrófico ser factor de crescimento de nervo.
82 - Processo de acordo com a reivindicação 81, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo 73021 6526-027-118 -101-pC8hB/hN-R7, ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R7 .
83 - Processo de acordo com a reivindicação 81, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R8, tal como depositado no ATCC e com o n2 de acesso 40862 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R8.
84 - Processo de acordo com a reivindicação 81, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R9 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R9.
85 - Processo de acordo com a reivindicação 70, caracteriza-do por a proteína quimérica ser codificada pelo plasmídeo pC8hB/hN-R10 ou por um seu equivalente funcional que codifica uma proteína quimérica possuindo uma sequência de aminoácidos substancialmente como a apresentada na reivindicação 15 para a quimera R10.
86 - Processo de acordo com a reivindicação 68, caracteriza-do por o primeiro e segundo factores neurotróficos serem membros da família de genes da neurotrofina.
87 - Processo de acordo com a reivindicação 86, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender quatro resíduos cisteína, localizados em quatro das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, 73021 6526-027-118 -102-

próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições seme lhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
88 - Processo de acordo com a reivindicação 86, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender cinco resíduos cisteína, localizados em cinco das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: ) próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições seme- lhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
89 - Processo de acordo com a reivindicação 86, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender seis resíduos cisteína, localizados em seis das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, ) próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições seme- lhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
90 - Processo de acordo com a reivindicação 86, caracteri-zado por a proteína quimérica ter um pi entre cerca de 9 e 10.
91 - Processo de acordo com a reivindicação 90, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender quatro resíduos cisteína, localizados em quatro das posições seguintes da sequên- -103- 73021 6526-027-118 cia de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família da neurotrofina.
92 - Processo de acordo com a reivindicação 90, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender cinco resíduos cisteína, localizados em cinco das posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família do gene da neurotrofina.
93 - Processo de acordo com a reivindicação 90, caracteri-zado por a proteína quimérica compreender seis resíduos cisteína, localizados nas posições seguintes da sequência de aminoácidos da proteína quimérica: próximo do aminoácido 14, próximo do aminoácido 57, próximo do aminoácido 67, próximo do aminoácido 79, próximo do aminoácido 108 e próximo do aminoácido 110, ou em posições semelhantes em relação às inserções ou delecções na sequência homóloga partilhada por membros da família do gene da neurotrofina.
94 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, 73021 -104- 6526-027-118 caracterizado por se associar uma proteína quimérica que possui actividade neurotrófica com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Lisboa, "8· «GO. \jA Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. =0 AGENTE OFICIAL= ►