PT95322A

PT95322A - Processo de producao e isolamento de factor neurotrofico ciliar,de composicoes farmaceuticas e de preparacao de molecula de adn recombinante que codifica o mesmo

Info

Publication number: PT95322A
Application number: PT95322A
Authority: PT
Inventors: Mark E Furth; Piotr Masiakowski; Vivien Wong; Nikos Panayotatos; Nancy Ip; Hans Friedrich Erwin Thoenen; Kurt A Stockli-Rippstein; Michael Sendtner; Yoshihiro Arakawa; Patrick Desmond Carroll; Rudolf Georg Gotz; Georg W Kreutzberg; Dan B Lindholm; Friedrich Lottspeich
Original assignee: Max Planck Inst Psychiatr; Regeneron Pharma
Priority date: 1989-09-15
Filing date: 1990-09-14
Publication date: 1991-05-22
Also published as: GR900100691A

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA 1. INTRODUÇÃO 0 presente invento refere-se a moléculas de ADN recombinante que codificam factor neurotrófico ciliar (CNTF) e a péptidos e proteínas provenientes delas. 0 CNTF e as moléculas afins, produzidos de acordo com o invento, podem ser usados para tratar várias desordens neurológicas.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO 2.1 BIOLOGIA DOS FÃCTORES NEUROTRÓFICOS Têm sido identificados vários factores que influenciam o crescimento e desenvolvimento no sistema nervoso. Crê-se que estes factores podem desempenhar um papel importante na manutenção da sobrevivência de populações neuronais no sistema nervoso maturo, bem como no imaturo.

Durante o desenvolvimento normal de muitas populações neuronais, existe um período definido de morte celular, no qual morrem muitos membros da população original (Hamburger e Levi-· -Montalcini, 1949, J. Exp. Zool. 111:457-501; Hamburger, 1958, Amer. J. Anat. 102:365:410; Hamburger, 1975, J. Comp. Neurol. 160:535-546; Cowan e Wenger, 1968, Z. Exp. Zool., 168:105-124; Rogers e Cowan, 1973, J. Comp. Neurol. 147:291-320; Clarke e Cowan, 1976, J. Comp. Neurol. 167:143-164;Clarke et al., 1976, J. Comp. Neurol. 167:125-142; Hollyday e Hamburger, 1976, J. Comp. Neurol. 170:311-320; Varon e Bunge, 1978, Annu. Rev. Neurosei. 1:327-362; Cowan et al., 1984, Science 225:1258-1265). A sobrevivência neuronal mostrou ser proporcional à extensão do território inervado; quanto mais pequena for a área alvo de uma dada população neuronal, menor será o número de neurónios que sobreviverão ao período de morte celular. Tem sido sugerido que a quantidade de factor neurotrófico presente na área alvo pode estar relacionada com a sobrevivência neuronal.

De entre estas moléculas neurotróficas o factor de crescimento de nervos (NGF) é de longe a molécula mais completamente caracterizada e tem-se revelado tanto in. vitro como jm vivo.

essencial para a sobrevivência dos neurónios sensoriais, derivados da cristã simpático e neuronal durante o desenvolvimento inicial tanto do pintainho como da ratazana (Levi-Montalcini e Angeletti, 1963, Develop. Biol. 7:653-659; Levi-Montalcini et al., 1968, Physiol. Rev. 48:524-569). Tem-se verificado que as injecções de NGF purificado no embrião de pintainho em desenvolvimento provocam hiperplasía maciça e hipertrofia dos neurónios sensoriais espinais e dos neurónios simpáticos (Levi-Montalcini e Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:373-384; Hamburger etal. , 1981, J. Neurosci. 1.:60-71). Pelo contrário, a remoção ou sequestramento do NGF endógeno, por injecçHo diária de anticorpos anti-NGF, em ratazanas neo-natais, têm sido associados à destruição virtual do sistema nervoso simpático (Levi-Montalcini e Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:384-391; Levi--Montalcini e Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18;619-628). Tem--se verificado que a exposição a anticorpos de NGF, mesmo num estádio inicial de desenvolvimento, por injecções de anticorpos no útero ou por transferência transplacental passiva de anticorpos maternos, tem como consequência uma perda substancial de neurónios sensoriais derivados da cristã neural, tal como dos neurónios sensoriais trigeminais dorsomediais e espinais (Goedert et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:1580-1584; Gorin e Johnson, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:5382-5386). Até há pouco, quase todos os estudos de NGF se tinham focado no seu papel no sistema nervoso periférico, mas, agora, parece que o NGF também influencia o desenvolvimento e manutenção de populações de neurónios específicas, no sistema nervoso central (Thoenen et al., 1987, Rev. Phisíol. Biochem. Pharmacol. 109:145-178; Whittemore e Seíger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439-454).

Os factores neurotróficos, que não têm sido tão bem carac-terizados como o NGF, incluem o factor neurotrófico derivado de cérebro (BDNF) e o factor neurotrófico ciliar (CNTF).

2.2 FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR

Os factores neurotróficos ciliares (CNTFs) são proteínas que são especificamente necessárias para a sobrevivência de neurónios

71 505 6526-030-118 -4- de gânglios ciliares de pintainho embrionário, _in vitro, (Man-thorpe et al., 1980, J. Neurochem. 34:69-75). 0 gânglio ciliar está, anatomicamente, localizado na cavidade orbitral, posicionado entre o recto - lateral e a bainha do nervo óptico; ele recebe fibras de nervos para-simpáticos do nervo oculomotor que inerva o músculo ciliar e o esfíncter da pupila e também o músculo liso presente na camada coróide do olho.

Tem-se verificado que os neurónios do gânglio ciliar estão entre as populações neuronais que exibem períodos de morte celular definidos. No gânglio ciliar de pintainho, observou-se que metade dos neurónios presentes no dia 8 embrionário (E8) morrem antes de E14 (Landmesser e Pilar, 1974, J.Physiol.241:737--749). Durante este mesmo período de tempo, os neurónios do gânglio ciliar formam ligações com os seus tecidos alvo, nomeadamente, o corpo ciliar e o revestimento coróide do olho, Landmesser e Pilar (1974, Physiol. 241:715-736) observaram que a remoção de um olho antes do período de morte celular resulta na perda quase completa dos neurónios do gânglio ciliar no gânglio ipsilateral. Pelo contrário, Narayanan e Narayanan (1978, J.Em— bryol. Ex. Morphol. 44:53-70) observaram que, implantando um outro prímórdium de olho e aumentando, assim, a quantidade de tecido alvo disponível, a morte celular neuronal de gânglio ciliar pode diminuir. Estes resultados são consistentes com a existência de um factor neurotrófico que actua sobre os neurónios do gânglio ciliar.

Em cultura, verificou-se que os neurónios do gânglio ciliar (CG) necessitam de um factor ou factore.s para sobreviverem. Foi ciliar(es) identificada actividade de factor(es)/ neurotrófico(s) (CNTF) em meios condicionados de células de músculo de pintainho (Bennett e Nurcombe, 1979, Brain Res. 173:543-548; Nishi e Berg, 1979, Nature 277:232-234; Varon et al., 1979, Brain Res. 173:29-45), em extractos de músculo (McLennan e Hendry, 1978, Neurosci. Lett. 10:269-273; Bonhady et al.v 1980, Neurosci. Lett. 18:197-201), em extracto de embrião di^^aron et al., 1979, Brain Res. 173:29--45; Tuttle et al., 1980, Brain Res. 183:161-180), e em meio condicionado por células de coração (Helfand et al., 1976, Dev.

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Biol. 50:541-547; Helfand et al., 1978, Exp. Cell Res. 113:39--45; para discussão, ver também Adler et al., 1979, Science 204:1434-1436 e Barbin et al., 1984, J. Neurochem. 43:1468-1478).

Adler et al. (1979, Science 204:1434-1436) usaram um sistema de ensaio baseado em culturas de neurónios de CG, em microalvéo-los, para demonstrar que se tinha encontrado uma fonte de CNTF muito rica nos tecidos intraoculares alvo que os neurónios de CG inervam. De 8000 unidades tróficas (TU) presentes num embrião de doze dias, 2500 TU estavam presentes no tecido do olho; a acti-vidade parecia estar localizada numa fracção contendo o corpo ciliar e o revestimento coróide, com uma actividade específica aproximadamente vinte vezes mais elevada do que a encontrada em extractos de embriões completos.

Subsequentemente, Barbin et al. (1984, J. Neurochem. 43: 1468-1478) relataram um procedimento para purificação de CNTF a partir de tecido de olho de embrião de pintainho. Verificou—se também que a actividade de CNTF estava associada a tecidos não CG, incluindo o nervo ciático de ratazana (Williams et al., 1984, Int. J. Develop. Neurosci 218:460-470). Manthorpe et al. (1986,

Brain Res. 367:282-286) relataram a purificação de actividade de CNTF de mamífero a partir de extractos de nervo ciático de ratazana adulta usando um procedimento de fraccionamento similar ao empregue para o isolamento da actividade de CNTF a partir de olho de pintainho. Adicionalmente, Watters e Hendry (1987, J. Neurochem. 49:705-713) descreveram um método para purificar a actividade de CNTF aproximadamente 20 000 vezes, a partir de tecido cardíaco bovino, sob condições não desnaturantes, usando cromatografia de afinidade com heparina. A actividade de CNTF foi também identificada em tecido de cérebro danificado (Manthorpe et al., 1983, Brain Res. 267:47-56; Nieto-Sampedro et al., 1983, J. Neurosci. 3:2219-2229).

Carnow et al. (1985, J. Neurosci. 5:1965-1971) e Rudge et al., (1987, Develop. Brain Res. 32:103-110) descrevem métodos para identificação da actividade de CNTF, a partir de extractos de tecido depois de sé colocarem extractos de células, separados

J 71 505 5526-030-118 -6- electroforeticamente,em papel de nitrocelulose (Western blotting) e de, em seguida, se identificarem bandas de proteínas contendo actividade de CNTF, por inoculação da nitrocelulose com neurónios de CG, e identificação de áreas de sobrevivência celular usando corantes vitais. Estes métodos foram usados para determinar os pesos moleculares aparentes dos polipéptidos activos em extractos em bruto. Usando este método, Carnow et al. (1985, J. Neurosei. 5:1965-1971) observaram que as actividades de CNTF derivado de cérebro e de nervo ciático de ratazana adulta pareciam apresentar uma dimensão diferente de (24 Kd) do CNTF de pintainho (20,4 Kd).

2.3 PROPRIEDADES FUNCIONAIS DE FACTQR NEUROTRÓFICQ CI-II AR Têm sido atribuídos ao CNTF vários efeitos biológicos, embora a natureza molecular destas actividades não esteja bem compreendida. Como se discutiu acima, o CNTF foi originalmente descrito como uma actividade que mantém a sobrevivência de neurónios do gânglio ciliar de pintainho E8, o qual é um componente do sistema nervoso para-simpático. Segue-se uma descrição de outras propriedades biológicas de preparações que se sabe conterem actividade CNTF:

Saadat et al. (1989, J. Cell. Biol. 108:1807-1816) observaram que a sua preparação mais purificada de CNTF de nervo ciático de ratazana induzia diferenciação colínérgica de neurónios ganglionares cervicais superiores de ratazana recém-nascida em cultura. Também, Hoffman (1988, J. Neurochem. 51:109-113) verificou que a actividade de CNTF derivada de olho de pintainho aumentava o nível de actividade de colina-O-acetiltransferase em culturas, em monocamadas, de retina.

Hughes et al. (1988, Nature 335:70-73) estudaram uma população de células progenitoras gliais bipotenciais do nervo óptico e do cérebro de ratazanas perinatais; pensa-se que esta população de células dá origem, primeiro, a oligodendrócitos e depois, em segundo lugar, a astrócitos do tipo 2. Estudos têm sugerido que a diferenciação em oligodendrócitos ocorre a partir de uma célula progenitora de oligodendrócito-astrócito tipo 2 (0-2A) na ausên- 71 505 6526-030-118 -7-

cia de qualquer factor de crscimento particular, enquanto que a diferenciação em astrócito do tipo 2 parece necessitar da presença de uma proteína indutora específica. Hughes et al. observaram que a proteína indutora ou astrócitos do tipo 2 é similar ou idêntica ao CNTF (ver também Anderson, 1989, Trends Neurosei. 12:83-85).

Heymanns e Unsicker (1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.Ã. 84: 7758-7762) observaram que os sobrenadantes de elevada velocidade de extractos de células de neuroblastoma produziam efeitos similares aos associados à actividade de CNTF de nervo de olho de pintainho ou nervo ciático de ratazana; foi indicada a presença de uma proteína similar, mas não idêntica, ao CNTF (a partir do peso molecular).

Ebendal (1987, J. Neurosci. Res. 17:19—24) pesquisaram a actividade de CNTF em vários tecidos de ratazana e de galinha. Eles observaram uma gama bastante alargada de actividades promotoras da sobrevivência dos neurónios ciliares em tecidos de ratazana, mas não nos de galinha; verificou-se que as células de fígado, as células T do baço e as células da glândula submandi-bular de ratazana estavam associadas h baixa actividade promotora de sobrevivência de CG, enquanto que os tecidos do coração, cérebro e ' músculo esquelético estavam associados a elevada actividade promotora de sobrevivência. Observou-se que, de entre os tecidos testados, a actividade de CNTF mais elevada estava associada ao rim de ratazana.

Embora os estudos anteriores tenham mostrado que muitos tecidos e extractos celulares contêm actividades que têm propriedades semelhantes às de CNTF (i.e. eles sustentam a sobrevivência de neurónios de gânglio ciliar de pintainho E8 num bioensaio de cultura de tecidos), não se pode presumir que apenas uma proteína ou uma proteína idêntica seja responsável por estas actividades. Como foi mostrado relativamente à família de fac-tores de crescimento de fibroblasto (FGFs), por exemplo, vários polipéptidos ou proteínas distintos podem possuir actividade biológica idêntica num único bioensaio.

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Inicialmente verificou-se que a especificidade neuronal de CNTF de nervo de olho de pintainho e de nervo ciático de ratazana coincidia com as populações neuronais responsivas a NGF. Contudo, em estudos dos papéis de CNTF e de NGF no desenvolvimento de populações de neurónios evidenciaram-se as características distintivas entre o CNTF e o NGF. Skaper e Varon (1986, Brain Res. 389:39-46) examinaram os requisitos de sobrevivência de neurónios de gânglios da raiz dorsal (DRG) de pintainho entre o dia 6 5 embrionário (E6.5) e ο E15. Estes neurónios de DRG, que inicialmente eram apenas responsivos a NGF, tornaram-se, subse-quentemente, também responsivos a CNTF, e eventualmente, mostraram-se, crescentemente não responsivos a ambos os factores. Além dos diferentes papéis no desenvolvimento, o CNTF pode também ser distinguido do NGF pelo peso molecular, ponto isoeléctrico, incapacidade de ser desactivado por anticorpos para NGF e pela capacidade, do CNTF, de manter a sobrevivência in vitro de neurónios de CG não responsivos a NGF (Barbin et al., 1984, J. Neu-rochem. 43:1468-1478).

3. SUMARIO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a sequências de ácidos nuclei-cos que codificam factor neurotrófico ciliar (CNTF) e a proteínas, péptidos e derivados produzidos a partir deles. Em várias concretizações do invento, as sequências de ácidos nucleicos, proteínas e péptidos do invento podem ser usados no tratamento de uma variedade de doenças e desordens neurológicas que inclui a doença de Alzheimer e a doença de Parkinson, mas que não se lhes limita.

Em concretizações adicionais, os ácidos nucleicos, proteínas e péptidos de CNTF do invento podem ser usados para tratar doenças motorneurónicas, que incluem a esclerose lateral amiotró-fica (doença de Lou Gehrig), mas não só. Numa concretização específica do invento, o CNTF pode ser usado para restaurar a função do nervo facial na paralisia de Bell. Numa outra concretização específica do invento, o CNTF pode ser usado para sustentar o crescimento dos neurónios da espinal medula, propor- 71 505 5526-030-118 -9-

cionando-se assim um método para tratar a danificação da espinal medula provocada por trauma, enfarte, infecção, deficiência nutricional ou agentes tóxicos. 0 presente invento proporciona ainda um novo processo para produzir CNTF quimicamente puro. 0 invento refere-se também ao processo de preparação de composições farmacêuticas compreendendo quantidades eficazes de produtos de gene de CNTF, as quais podem ser usadas no diagnóstico e tratamento de várias doenças e desordens neurológicas. 0 presente invento refere-se à clonação, sequenciação e expressão de CNTF e proporciona pela primeira vez, um meio para produzir CNTF humano utilizando sequências de ácidos nucleicos codificando CNTF humano. Além disso, as sequências de ácidos nucleicos de CNTF do invento podem ser usadas para identificar sequências de ácidos nucleicos codificando CNTF ou moléculas homólogas de CNTF em várias espécies e tecidos. Em concretizações específicas adicionais, do invento, é identificado um fragmento peptidico possuindo a actividade de CNTF e é produzido um anticorpo para um péptido CNTF que neutraliza a actividade de CNTF.

3.1 ABREVIATURAS

BRCN CG CNTF DRG E8, E9, etc. GFAP NGF TU brometo de cianogénio gânglio ciliar factor neurotrófico ciliar gânglio da raiz dorsal dia 8 ou 9, etc. embrionário proteína ácida fibrilar glial factor de crescimento de nervo unidade trófica. Uma unidade trófica por ml é igual à quantidade de actividade de CNTF que sustenta a sobrevivência neuronal semi-máxima, por ml de meio de cultura.

4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1. aminoácidos,

Clonação de ADNc (a), sequência de nucleótidos e de deduzida, de CNTF de ratazana (b). Os oligonucleó-

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71 505 6526-030-118 -10 tidos usados como iniciadores são apresentados em (c) e as correspondentes posições em (b); Os aminoácidos sublinhados em b) correspondem às sequências de péptidos obtidas a partir dos fragmentos trípticos (T1-T8) e de BRCN (CB1-4) de CNTF. Ao nível dos nucleótidos, as sequências correspondentes à região de codificação estão a negrito e a sequência de sinal de poliadenilação está sublinhada. Composição em aminoácidos do CNTF, derivado de CNTF purificado e predita a partir de ADNc de CNTF (d). FIG. 2. Electroforese bi-dimensional el gel, de CNTF, que foi purificado (a) usando cromatografia de permuta iónica-DEAE e electroforese preparativa em SDS-gel de poliacrilamida; e (b) usando cromatografia de permuta iónica-DEAE, electroforese preparativa em SDS-gel de poliacrilamida e de novo purificado por cromatografia usando uma coluna Bakerbond Gold C4 Widepore. FIG. 3. Sobrevivência de neurónios ciliares cultivados de pintainho E8 na presença de sobrenadantes e extractos de células HeLa transfectadas: no dia 8 embrionário fizeram-se crescer neurónios ciliares na presença de sobrenadantes (a) e extractos (b) de células HeLa transfectadas com plasmídeo sem inserção (4) e plasmideo contendo clone E de ADNc de CNTF de ratazana na orientação de sentido (O) e anti-sentido («). FIG. 4. Análise de mancha Northern de ARNm de CNTF em tecidos de ratazana adulta (as abreviaturas usadas são: BR, cérebro;LIV, fígado; KID, rim; MC, músculo; SK, pele; SCI, nervo ciático; SP, medula espinal); (b) ARN derivado de nervo ciático de cria de ratazana recém-nascida (PO), com quatro dias de idade (P4) e com 13 dias de idade. FIG. 5, O CNTFr recombinante em três estirpes de E. coli diferentes. Faixa M=Marcadores Standard de proteína; são indicados os pesos moleculares de três proteínas. Faixas 1-3: proteína total extractada de E. coli W3110qF-, E. coli HB101 e E. coli MC1Q61, hospedando cada um pCP-CNTFr-C-1. Os extractos foram preparados e analisados num gel com um gradiente em poliacrilamida de 8-25¾. como se descreveu anteriormente (Pa-nayotatos, N. e Fontaine, A., 1988, J. Biol. Chem. 260:3173-3177).

71 505 6526-030-118 11- FIG. 6. a) sonda de CNTF humano gerada por PCR em hibridação de namcha Southern para digeridos, com ECORI, de ADNs genómicos humano e de ratazana, b) sonda radioactiva de CNTF de ratazana em hibridação de mancha Southern para digeridos, com ECORI, de ADNs genóminos humano· e de ratazana. FIG. 7. sequência de codificação parcial de CNTF de ADN genómico humano amplificado por PCR; comparação com a sequência de codificação de CNTF de ratazana, conhecida. As diferenças entre as sequências de aminoácidos deduzidas, de humano e de ratazana, estão indicadas com um asterisco (*). As diferenças na sequência de ADN estão indicadas por um sinal de diferente (Φ). FIG. 8. Sequência de CNTF humano, (a) sequência de ácidos nucleicos e de aminoácidos humana; (b) comparação entre as sequências de aminoácidos humana e de ratazana; (c) comparação entre a sequência de nucleótidos humana e de ratazana; e (d) mapa de restrição completo da sequência de CNTF genómica humana. FIG. 9. Os anticorpos para um péptido sintético (14 aminoácidos -ISALÈSHYGAKDKQ) baseado na sequência de CNTF (região C terminal) são capazes de inibir a actividade biológica de CNTF de ratazana purificado, após imunoprecipitação. FIG. 10. Demonstração da actividade neurotrófíca de um fragmento peptídico sintético de CNTF com 28 aminoácidos. FIG. 11. Estudos de imunoflorescência indirecta usando anticorpos de coelho dirigidos a um péptido de CNTF com 28 aminoácidos biologicamente activo ligados a secções de nervo ciático de ratazana fixadas e subsequentemente reagidos com IgG anti-coelho marcada com rodamina. A seta larga indica coloração periaxonal; a seta pequena aponta estruturas axónicas marcadas. FIG. 12. Fotomicrografias de contraste de fase de culturas dissociadas de células de espinal medula médio-dorsal de ratazana E14 crescidas durante 72 horas num substrato de poliornítina na presença de: A: Meio de controlo; B: Meio suplementado com factor de crescimento de

J 71 505 6526-030-118 -12 nervo (NGF) de ratinho; ou C: Melo suplementado com factor neurotrófico ciliar (CNTF) recombinante de ratazana produzido em E. coli.

Note-se a extensiva sobrevivência neurónica e aumento desmesurado de axónio na presença de CNTF. Escala = 100 um. FIG. 13. Alterações nos neurónios motores e nas células gliais nos núcleos do nervo facial de ratazanas recém-nascidas com lesões unilaterais do nervo facial. Ã lesão unilateral do nervo transportando um implante de espuma de gel contendo BSA (A) neurónios motores coradas com Nissl no núcleo facial do lado lesionado; (B) neurónios motores corados com Nissl no núcleo facial do lado não lesionado (controlo); (C) núcleo facial do lado lesionado corado com anticorpo anti-GFAP; e (D) núcleo facial do lado não lesionado corado com anticorpo anti-GFAP. FIF. 14. Alterações nos neurónios motores e nas células gliais nos núcleos do nervo facial de ratazanas recém-nascidas com lesões unilaterais do nervo facial. A lesão unilateral do nervo transportando um implante de espuma de gel contendo CNTF (A) motor-neurónios corado.s com Nissl do núcleo facial do lado lesionado; (B) neurónios motores do núcleo facial do lado não lesionado (controlo); fC) núcleo facial do lado lesionado corado com anticorpo anti-GFAP; e (D) núcleo facial do lado não lesionado corado com anticorpo anti-GFAP. FIG. 15. Representações geradas por computador, de hidro-filicidade, probabilidade superficial, flexibilidade, índice antigénico, hélice anfifílica folha anfifílica e estrutura secundária de CNTF de (a) ratazana e (b) humano. FIG. 16. Características principais dos plasmídeos de expressão. Indicam-se o promotor (lacUVS), o sitio de ligação ao ribossoma (rbsl), os genes de CNTF, ampR e kanR, bem como as mutações copl (0) e kanl(0). Usaram-se os sítios de restrição Asei, EacrI, Ndel e Pvul nas construções de plasmídeos como se descreve no texto.

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Flg. 17. Sequência de CNTF humano e os Iniciadores de PCR usados na clonação. Ά sequência de ADN da região de codificação de proteína é mostrada a negrito, estando a sequência de proteínas deduzida por cima. Os triângulos a cheio indicam o último nucleótido· do exão 1 e o primeiro nucleótido do exão 2; as sequências do intrão 5'— e 3'— terminais estão indicadas entre parêntesis por cima dos triângulos. Ã localização e a polaridade 5'para 3', dos iniciadores do oligodesoxinucleótidos selecciona-dos está indicada por setas. Os asteriscos indicam mau empa-relhamento. As sequências de oligodesoxinucleótidos dos iniciadores (5' para 3 *) são as seguintes: CNTF.23: GCTTTCACAGAGCATTCACCG; CNTF.21: AGGCCCTGATGCTTCACATAGGATTCCGTAAGAG; CNTF.22: CTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCÃTCAGGGCCT; CNTF.24: GAGACGGCCGTAACTGTTACATTTTCTTGTTGTTAG; CNTF.10: CCAAGCTTCTAGAATTCGCAGGCATCCCATCAGCCT; CNTF.11: GACTCGAGTCGACÃTCGGAGATGACTGAGGCAGA. FIG. 18. Comparação entre a expressão de CNTF humano e de ratazana, usando vários vectores. A proteína total das estirpes indicadas foi analisada em geles de poliacrilamida 8-25¾ corados com Coomassie. Estão indicados os pesos moleculares (M) dos marcadores (em centenas), bem como as posições das bandas correspondentes às proteínas de CNTF humano, CNTF de ratazana, ampR e kanR. FIG. 19. Purificação de CNTF. (A): CNTF de ratazana; (B): CNTF humano. Lisado: proteína celular total; GuHCl 8 M: extracto dialisado; 0,5, 5, 10 e 50: quantidade de proteína, em yg, carregada em cada faixa após DEAE-Sephacel ou Fast-S. FIG. 20. Resposta à dose dos neurónios ciliares para CNTF nativo e recombinante de ratazana. A sobrevivência de neurónios ciliares de pintainho E8 dissociados, na presença de quantidades crescentes de CNTF de ratazana foi medida como se descreve na Secção 12.7. FIG. 21. Fotomicrografias de culturas de "explant" (A,B) de gânglios de raiz dorsal (DRG) de embrião de pintainho E10 e de

culturas dissociadas, ricas em neurónios (C,D,E) de gânglios ciliares (CG) de embrião de pintainho E8. A,B são vitramicrogra-fias de controlo (A) e de "explant", de DRG tratados com CNTF (B; 5 ng/ml), após 48 h em cultura. C,D,E são micrografias de contraste de fase de controlo (C) e de culturas dissociadas de neurónios de gânglio ciliar tratadas com CNTF (D, 100 pg/ml; E, 5 ng/ml). Escala = 400 um (A,B) e 50 um (C,D,E). FIG. 22. Sequências alinhadas de proteínas de CNTF. São mostradas as sequências de aminoácidos de CNTF humano (hu), de ratazana (rt) e de coelho (rb). 0 vector de expressão que codifica cada uma destas moléculas está indicado no lado direito. No quadro (A), o ponteado indica resíduos idênticos aos da sequência de CNTF humana do tipo selvagem. No quadro (B), o ponteado indica resíduos idênticos aos da sequência do tipo selvagem da mesma espécie. Os resíduos diferentes dos do tipo selvagem são apresentados em letra maiúscula. Os resíduos extra fundidos como parte de um péptido estranho são apresentados em caracteres itálicos pequenos. FIG. 23. Micrografia de contraste de fase de células da espinal medula ventral após 6 dias em cultura. As células foram depositadas a Q,5xlQ6 células/placa de 35 mm e mantidas em F12MEMHS5FCS5. 2QX. FIG. 24. Níveis de neurofilamentos (NF) em cultura de neurónios de espinal medula ventral. As culturas foram tratadas no dia da deposição com CNTF (10 ng/ml) ou NGF (50 ng/ml) e testadas relativamente aos níveis de NFF no dia 7. A proteína NF foi detectada com anticorpo para NF (RT97), os produtos da reacção foram visualizados usando OPD como substrato, e mediu-se a DO (média ± SEM) a 490nm. n=3. FIG. 25. Efeitos de CNTF na sobrevivência de neurónios contendo AchE. Os neurónios da espinal medula ventral foram feitos crescer em cultura durante 7 dias e depois processados para análise histoquímica de AchE. As células coradas foram contadas sob 32X e expressas como o número total por placa de 35 mm. n=3.

J 71 505 6526-030-118 -15 FIG. 26.A Efeitos dos factores de crescimento sobre a acti-vidade CAT em cultura de espinal medula ventral. As culturas foram tratadas com FGF, (50ng/ml), CNTF (lOng/ml), NGF (50ng/ ml), ou PBS/BSA (0,5 mg/ml) no dia da deposição. Foram então colhidas no dia 7 e analisadas relativamente aos níveis de CAT. CAT é expresso em CPM/placa de 35 mm (média ± SEM) . n=3. B. efeitos de doses crescentes de CNTF na actividade de CAT. As células do corno ventral foram tratadas com diferentes doses de CNTF (ng/ /ml) no dia da deposição. No dia 7, as culturas foram recolhidas para medição da actividade CAT (expressa em pmole/h/placa de 35 mm; média ± SEM), n=3 para cada dose. FIG. 27. Efeitos de CNTF sobre a actividade de CAT após retardamento da adição. 0 CNTF (lOng/ml) foi adicionado às culturas no dia 0, 2 ou 6 e colhido para medição da actividade CAT, no dia 7, 9 e 13 respectivamente. 0 CAT é expresso em CFM/yg de proteína/placa de 35 mm (média ± SEM). n=3. FIG. 28. Efeitos de CNTF (lQng/ml) sobre a actividade CAT em culturas de espinal medula ventral com neuróglia reduzida. Adicionou-se Ara C (0,5yM) às culturas , no dia 2. No dia 7, as células foram colhidas e analisadas relativamente à atividade CAT (expressa em CPM/placa de 35 mm; média ± SEM). n=3. FIG. 29. Efeitos de CNTF (lOng/ml) e de NGF (50ng/ml) sobre a actividade CAT em neurónios de espinal medula ventral purificados por gradiente de metrisamida. CAT (média ± SEM) é expresso em pmol/h/alvéolo de 16mm. n=3. FIG. 30. Comportamente, no tempo, do aumento da absorção e incorporação de GABA de alta afinidade em culturas hipocâmpicas tratadas com CNTF. Os neurónios hipocâmpicos foram postos em cultura e mantidos na presença ou ausência de CNTF (lOng/ml) durante vários períodos de tempo antes da medição da absorção e incorporação de GABA (A) e dos níveis de proteína de neurofilamento (B). Os resultados representam a percentagem de actividade em culturas tratadas quando comparadas com as culturas de controlo não tratadas. FIG. 31. Curvas de resposta de neurónios hipocâmpicos à dose 3

71 505 6526-030-118 de CNTF. Os neurónios hipocâmpicos foram cultivados na presença ou ausência de várias concentrações de CNTF (0,001-10ng/ml) durante 8 dias. No final do período de cultura, mediram-se a absorção e incorporação de GABA de alta afinidade (A), os níveis de proteína de neurofilamento e actividade de enzima GAD (C). FIG. 32. Efeito de CNTF sobre o número de células positivas para NSE, GAD e calbindin. Os neurónios hipocâmpicos foram mantidos em cultura na presença ou na ausência de CNTF (lOng/ml) durante 8 dias. Realizou—se a imunocoloração para NSE, GAD e cal— bindin como se mostra em A e B. FIG. 33. Resposta dependente da dose de CNTF sobre um número de neurónios imunopositivos para GABA e AchE. Fiseram-se crescer em cultura neurónios hipocâmpicos, na presença de várias concentrações de CNTF (0,ODl-lOng/ml). Realizou-se a imunocoloração para GABA e AchE, como se mostra em A e B. FIG. 34. Efeitos do retardamento da adição de CNTF sobre o aumento da absorção e incorporação de GABA de elevada afinidade induzido por CNTF. A. 0 CNTF (lOng/ml) foi adicionado depois de se esperar 0, 1, 2, 3 ou 4 dias após as células hipocâmpicas terem sido postas em cultura. A absorção e incorporação de GABA de elevada afinidade foi determinada no oitavo dia de cultura. B. Adicionou-se CNTF (IQng/ml) às células hipocâmpicas a seguir a uma espera de 0 ou 3 dias e determinou-se a absorção e incorporação de GABA de elevada afinidade no décimo primeiro dia de cultura. FIG. 35. Efeitos do retardamento da adição de CNTF sobre o aumento dos níveis proteicos de neurofilamentos, induzido por CNTF. A. 0 CNTF (lOng/ml) foi adicionado em momentos diferentes (0, 1, 2 ou 3 dias) depois das células hipocâmpicas terem sido postas em cultura. Os níveis de proteína de neurofilamento foram medidos no oitavo dia. B. 0 CNTF (lOng/ml) foi adicionado às células hipocâmpicas após uma espera de 0 ou 3 dias e o nível de proteína de neurofilamento foi determinado no décimo primeiro dia. FIG. 36. Efeito do CNTF em culturas ricas em neurónios. Man-

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71 505 6526-030-118 -17- tiveram-se culturas hipocâmpicas na presença ou ausência de várias concentrações de CNTF (0,001-10ng/ml) durante 8 dias. Adicionou-se citosina arabinosido (0,3/uM) às culturas hipocâm-picas durante 24 horas para reduzir o número de neuroglia. A absorção e incorporação de GABA de alta afinidade foi medida no oitavo dia de cultura. FIG. 37. Dependência, com a densidade, do aumento da absorção e incorporação de GABA e dos níveis de proteínas de neurofi-lamento, induzido por CNTF. As células hipocâmpicas foram depositadas em placas a uma densidade de " 71^400 células/cm^. As células foram mantidas na presença ou ausência de CNTF (10ng/ml} durante 8 dias, antes da medição da absorção e incorporação de GABA (A) e dos níveis de proteína de neurofilamento (B). FIG. 38. Efeito protector do CNTF na toxicidade, induzida por glutamato, em culturas hipocâmpicas. Mantiveram-se em cultura neurónios hipocâmpicos, na presença ou ausência de CNTF (lOng/ml) durante 7 dias. Adicionou-se glutamato a várias concentrações (100-1000uM) durante 15 minutos, e em seguida as células foram cultivadas na ausência de glutamato ou de CNTF, durante 20h. A sobrevivência das células no final do período de cultura foi determinada pelo ensaio MTT, baseado na conversão de MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)—2,5—difeniltetrazólio) num produto púrpura, pelas células vitais. Adicionou-se corante MTT até uma concentração final de 0,5mg/ml. Os corantes absorvidos pelas células vivas foram solubi1izados pela adição de HCI Q,08N em isopropanol 5 horas mais tarde, e mediu—se a D.O. (570—650 nm). FIG. 39. Efeito de concentrações crescentes de CNTF de ratazana no índice mitótico de astrócitos hipocâmpicos de ratazana. Os astrócitos foram expostos a concentrações de CNTF como indicado, durante 24 horas, e foram marcados com ^H—timidina (lmc/alvéolo/150jUl) durante as duas horas finais da incubação. FIG. 40. Ensaio de sanduíche, com dois anticorpos, para CNTF.

Revestiram-se placas de ELISA (Falcon 3915 probind) com 50 ul/alvéolo de IgG2b de cabra anti-ratinho (GaMIgG2b, Caltag) a 4 Ug/ml. As placas foram incubadas a 4° durante a noite, lavadas e

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71 505 6526-030-118 -18 bloqueadas durante 2h à t.a. em tampão de bicarbonato 50 mH, pH9.b. Após lavagem, adicionaram-se 50 u1/alvéolo de anticorpo de captura RP3-12 (diluição do sobrenadante da cultura de hibridoma 1:5) e incubou-se durante Ih à t.a. Após lavagem, adicionaram-se diluições seriadas de um padrão de CNTF humano (gama 10 ng/ml-7 pg/ml) ou diluições seriadas de uma amostra de teste. Após 1 hora h t.a., seguida por lavagem, adicionaram-se 50 μΐ/alvéolo de um anticorpo repórter RP12-2 (diluição do sobrenadante da cultura 1:5) e incubou-se durante lh à t.a. Após lavagem, adicionaram-se 50 μΐ/alvéolo de uma diluição 1:1000 de reagente IgGl de cabra anti-ratinho (GaMIgGl, Caltag) marcado com fosfatase alcalina. A placa foi incubada, durante lh à t.a., seguíndo-se lavagem, revelação com pNPP e leitura a 405nM num leitor de ELISA (Molecular Devices Thermo Max). FIG. 41. Resultados do ensaio sanduíche com 2 anticorpos para CNTF humano. Quantidades crescentes de CNTF humano recombi-nante foram analisadas usando anticorpos monoclonais RP3-12 e RP12-2, na reacção descrita na FIG. 40. FIG. 42. Neurónios motores espinais embrionários de pintainho retrogradamente marcados com isotiocianato de rodamina. As células foram fixadas com formaldeído a 4% após 5h em cultura. Fo tografias de (A) contraste de fase e (B) de fluorescência com o mesmo campo. Escala = 25 um. Note-se que a célula mais pequena à direita não está marcada. FIG. 43. Comportamento, no tempo, da sobrevivência de neurónios motores espinais embrionários de pintainho na presença (círculos a negro) ou na ausência (círculos a branco) de CNTF recombinante de ratazana, 5 ng/ml. FIG. 44. Neurónios motores espinais embrionários de pintainho após 6 dias em cultura na ausência (A) ou na presença (B) de CNTF recombinante de ratazana 1 ng/ml. Escala = 100 um. FIG. 45. Actividade de sobrevivência de CNTF recombinante de ratazana para neurónios motores espinais embrionários de pintainho em cultura (A) e curvas de resposta à concentração para CNTF (B) e FGFs (C). As actividades de sobrevivência foram analisadas

J 71 505 6526-030-118 -19 após 3 dias em cultura, a em B, adicionou-se deparina (1 jug/ml) à cultura apenas durante as primeiras 24h, para evitar a separação das células induzida pelo excesso de heparina, ao passo que o FGF ácido esteve presente durante 3 dias.

5. DE5CRIÇR0 DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento refere-se a sequências de ácido nucleico que codificam factor neurotrófico ciliar (CNTF), bem como a proteínas e fragmentos péptidos de CNTF e seus derivados produzidos em quantidade. Em adição o invento refere-se a composições farmacológicas e a usos terapêuticos e de diagnóstico do factor neurotrófico ciliar.

Com o fim de tornar a descrição mais clara, e não para a limitar, descrever-se-á o invento nas seguintes partes.

i) Purificação de CNTF

ii) Ensaios Biológicos com CNTF

iii) Sequenciação de CNTF

iv) Clonaçâo de ADN que codifica CNTF

v) Expressão de um gene de CNTF

vi) Genes e Proteínas CNTF

vii) Criação de Anticorpos Anti-CNTF viii) Utilidade do Invento

5.1 PURIFICAÇÃO DE FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR 0 CNTF pode ser purificado a partir de qualquer fonte disponível, incluindo, mas não lhes estando limitada, olhos, nervo ciático e músculo cardíaco de embrião de pintainho, usando técnicas conhecidas na arte.

Como exemplo, e não como limitação, o CNTF pode ser preparado a partir de olhos de embrião de pintainho de acordo com o método descrito em Barbin et al. (1984, J. Neurochem. 43:1468-1478, que é aqui incorporado para referência na sua globalidade). Resumidamente, pode-se dissecar dos olhos de embrião de pintainho, com 15 dias, a coróide, a iris-corpo ciliar e o epitélio do pigmento aderente, designados colectivamente por CIPE, como se descreve em

Manthorpe et al. (1980, J. Neurochem. 34:69-75) e recolher-se em solução salina equilibrada. De preferência, os extractos derivam de cerca de trezentos olhos de embrião, os quais são homogeneizados em cerca de 76 ml de água fria usando um homogeneisador de vidro Teflon e em seguida são centrifugados a 10^ x g durante uma hora a cerca de 4°C. 0 sobrenadante pode então ser recolhido e levado a 0,01 M em NaE^PO^., pH7, e em seguida aplicado a uma coluna de permuta iónica (i.e. Celulose Whatman DE52 equilibrada em tampão de fosfato). Ά coluna pode então ser eluída a um caudal de cerca de 30 ml/hora com 20 ml, respectivamente, de NaCl, 0,07, 0,25 e 0,5 M, em tampão de fosfato. 0 eluído de NaCl 0,25 M pode, em seguida ser concentrado até um volume de cerca de 2 ml, por ultrafíltração (p.exp. usando uma célula Amicon de 50 ml e uma membrana de ultrafiltração PM 10 (exclusão 10 000 dalton)). 0 pqtrido pode ser então recolhido, combinado com duas lavagens de 0,5 ml da célula com tampão de NaCl 0,25 M e concentrado de novo até 0,4 ml (p.exp. usando uma célula Amicon de 3 ml e um filtro PM 10). 0 extracto purificado pode ser então disposto em camadas em gradientes de sacarose (p.exp. 200 μ. 1 de extracto em 4,6 ml de gradientes lineares de sacarose 5-20¾) e em seguida centrifugado (p.exp. usando um rotor SW 65 a 65 000 rpm durante 15 horas a 4°C). Os gradientes de 4,8 ml podem ser colhidos em cinco fracções; fracção I (2 ml) fracção II (0,3 ml), fracção III (1,2 ml) fracção IV (0,3 ml) e fracção V (1,0 ml). A fracção III pode ser levada a 0,1¾ em Triton X-100 e em seguida concentrada a 0,2 ml usando ultrafiltração, como anteriormente.

Para electroforese analítica em gel, o CNTF purificado pode ser analisado usando um gel de SDS-poliacrilamida com 15¾ de resolução e 4,5 de cobertura de empilhamento. 0 CNTF purificado ou os padrões de peso molecular podem ser submetidos a electroforese e o gel cortado e processado como se segue: os polipéptidos podem ser visualizados sem fixação, precipitando a SDS associada à proteína durante uma incubação do gel em KC1 0,25 M e registando as posições das bandas dos padrões e do CNTF. As faixas podem então ser fixadas e coradas com azul de Coomassie. As outras faixas podem então ser cortadas em fatias, eluídas por incubação

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71 505 6526-030-118 -21- com Trlton X-100 e os eluídos podem ser analisados relativamente à actividade do CNTF. 0 extracto de nervo ciático pode ser fraccionado pelos mesmos passos (cromatografia de permuta iónica DEAE, centrifugação em gradiente de densidade de sacarose e SDS-PÃGE preparativa) usados para a purificação de CNTF de olho de pintainho (supra) com a excepção de, preferivelmente, se fazerem as três seguintes modificações ao procedimento: (1) após a introdução do extracto de nervo, a coluna de permuta iónica DEAE pode ser eluída descontinuamente, directamente com NaCl 0,15 M (em vez de se lavar com NaCl 0,07 M e se eluir com NaCl 0,25 M); (ii) as fatias são cortadas da região de 24 KD (em vez de o serem da região de 20 KD) do gel de SDS preparativa; e (iii) a actividade de CNTF pode ser eluída das fatias individuais de gel por homogeneização em detergente Triton X-lOOa 0,1¾ e em seguida incubação durante a noite a 4°C (em vez da eluição electroforética durante a noite usando geles de ureia). 0 detergente Triton X—100 pode então ser removido por incubação do sobrenadante com 100 ul de suspensão de contas Extractagel (Pierce Chemicals, Rockford, IL) durante 2h a 4DC. A concentração da proteína pode ser determinada de acordo com qualquer método conhecido na arte.

Preferivelmente, os métodos anteriores podem ser ainda modificados, como se segue a seguir à eluição de um gel de SDS--PAGE preparativo, o CNTF pode ser purificado até à homogeneidade e libertado de SDS por cromatografia de fase inversa, usando uma coluna de FPLC ou de HPLC que constitui um sistema fluido biocom-patível contido numa coluna inerte; numa concretização mais preferível, a coluna de FPLC é uma coluna Bakerbond Gold C4 Wide-pore (uma coluna de 7,75 mm x 10 cm revestida com ouro e capaz de operar a uma .pressão de retorno de 200-250 psi com 1,0 ml/min numa fase aquosa móvel), eluída com um gradiente de acetonitrilo de 0 a 60 por cento. Observou-se que o CNTF=ê eluído num único pico a 50-55 por cento de acetonitrilo (Ver Secção 6, infra). 0 pico único contendo CNTF pode ser concentrado num Speed Vac, do qual o ar tinha sido retirado com um jacto de gás inerte, como árgon. 0 gás inerte pode ser importante, por evitar-.a perda de

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71 505 6526-030-118 -22- actividade de CNTF, a qual ocorre após oxidação de um ou mais dos resíduos metionina. O CNTF parece ser mais vulnerável à oxidação quando já não está em solução.

De igual modo, pode preparar-se uma actividade promotora da sobrevivência de neurónios ciliares a partir de tecido cardíaco usando cromatografia de afinidade com heparina, como descrito por Watters e Hendry (1987, J. Neurochem. 49:705-713, o qual é aqui incorporado na sua globalidade para referência.

5.2 ENSAIOS BIOLÓGICOS DE FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR Ã actividade do factor neurotrófico ciliar pode ser avaliada usando qualquer sistema sensível a CNTF, jin vivo ou in vitro, conhecido na arte. Por exemplo, e não como limitação, têm sido desenvolvidos sistemas in vitro que medem a actividade de CNTF por quantificação da sobrevivência, em 24 horas, de neurónios de gânglio ciliar (CG) de pintainho embrionário (E8) em culturas de monocamada. 1

Por exemplo, os gânglios ciliares podem ser colhidos de embriões de pintainho E8 dissociados (produzindo aproximadamente 20 000 células por gânglio) e depois diluídos em meio HEBM con tendo 20 por cento de soro de cavalo, como descrito por Varon e al. (1979, Brain Res. 173:29-45). Podem então semear-se cerca de cinquenta microlitros de suspensão de células, contendo 1 000 neurónios (2 000 células), em placas de microtitulação e pode ser adicionada actividade de CNTF putativo. As placas de cultura podem ser então mantidas a 37°C em 5¾ de CC>2 durante 24 horas e, em seguida, as culturas podem ser fixadas pela adição de 200 u1 de glutaraldeído a 2 por cento em meio HEBM e o número de neurónios sobreviventes pode ser determinado visualmente por contagem directa sob microscopia de contraste de fase.

5.3. SEQUENCIAÇAQ DA PROTEÍNA DE FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR A proteína de CNTF pode ser sequenciada directamente ou pode ser inicialmente clivada por qualquer protease ou outro composto conhecido na arte, incluindo Staphylococcus aureus V8, tripsina e brometo de cianogénio, mas não só. Os péptidos podem ser sequen-

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71 505 6526-030-118 -23- ciados por degradação de Edman automatizada, num micro-sequencia-dor de fase gasosa, de acordo com o método de Hewick et al. (1981), J. Biol. Chem. 256:7990-7997) e Hunkapillar et al. (1983, Methods Enzymol. £1,:399-417). A detecção de aminoácidos feniltio— -hidantoína pode ser realizada de acordo com Lottspeich (1985, Cromatography 326:321-327). Os fragmentos sobrepostos da sequência de aminoácidos podem ser determinados e usados para deduzir extensões maiores da sequência contígua. 5.4. CLONACÃO do adn que codifica factor NEUROTRÓFICO ciliar A purificação de quantidades adequadas de proteína de CNTF de nervo ciático de ratazana, para permitir a micro-sequenciação, tornou possível a clonação de um ADN de CNTF.Uma estratégia Standard para esta clonação pode ser gerar uma sonda de oligonu— cleótido complementar, baseada num segmento da sequência de aminoácidos conhecida, e usar esta sonda para pesquisar bibliotecas de ADNc geradas a partir de tecidos que se pensa sintetizarem ARNm que codifica CNTF. Contudo, esta estratégia apresentou—se problemática em virtude da, relativamente, pequena abundância em ARNm e porque a sequência real dos péptidos de CNTF, determinada por micro-sequenciação (Figura 1), teria necessidade, para cada caso, de um desfavoravelmente elevado grau de degenerescência das sondas de oligonucleótidos, para contemplar todas as hipóteses possíveis de codões para resíduos de aminoácidos particulares. 0 presente invento prevê a clonação do gene por síntese de ADNc, a derivação de um par de iniciadores de oligonucleótido degenerados, com base na micro-sequenciação de péptidos de CNTF, o uso destes iniciadores para amplificar um segmento da sequência codificadora de CNTF, o uso de um terceiro oligonucleótido degenerado para confirmar a identidade do segmento amplificado, a determinação da sequência de nucleótidos exacta desse segmento e a síntese e uso dos iniciadores de o1igonucleótidos exactos para amplificar o resto do gene de CNTF. Neste processo do invento, o procedimento preferido para a amplificação utiliza a amplificação de sequências de ácido nucleico de tecido por reacção em cadeia com polimerase (PCR) (Saiki et al., 1985, Science 230:130-—1354). Segue—se uma descrição detalhada do processo preferido:

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Em primeiro lugar, pode-se usar a sequência de aminoácidos derivada de proteína de CNTF purificada para deduzir os iniciadores de oligonucleótido para uso na PCR. Em virtude da degenerescência do código genético, no qual vários tripletos podem especificar o mesmo aminoácido, têm de ser sintetizados vários oligonucleótidos para uma dada sequência de aminoácidos, de modo a proporcionar múltiplas combinações potenciais de sequência de nucleótidos; os oligonucleótidos resultantes são designados por iniciadores degenerados. A PCR necessita de iniciadores com cadeia de sentido bem como de iniciadores anti-sentido. Assim, pode usar-se um iniciador de oligonucleótido degenerado, correspondendo a um segmento da sequência de aminoácidos de CNTF, como iniciador para uma cadeia de ADN (p.exp. com sentido) e pode usar-se outro iniciador de o1igonucleótido degenerado, homólogo a um segundo segmento da sequência de aminoácidos de CNTF, como iniciador para a segunda cadeia de ADN (p.exp, anti-sentido). Preferivelmente, devem escolher-se estes iniciadores com base numa extensão contígua da sequência de aminoácidos conhecida, de modo que o produto relevante da reacção de ADN, resultante do uso destes iniciadores na PCR, possa ter um tamanho previsível (i.e. o comprimento do produto, em termos do número de pares de base, deve ser igual à soma dos comprimentos dos dois iniciadores, mais três vezes o número de resíduos de aminoácidos do segmento de proteína ligado pelos segmentos correspondentes aos dois iniciadores). Estes iniciadores podem então ser usados na PCR com um molde de ácido nucleico que se presume conter sequências de codificação de CNTF, tal como ADN genómico ou, de preferência, ADNc preparado a partir de ARNm colhido de tecido ou de células que se presume sintetizarem CNTF. Os produtos de reacção de ADN podem então ser analisados por electroforese, para determinar se um produto de reacção de ADN tem uma dimensão molecular semelhante à prevista. Os produtos de reacção de ADN podem ainda ser analisados por hibri-dação com uma sonda marcada, preparada a partir de um oligonucleótido degenerado correspondente às sequências de aminoácidos entre os segmentos dos dois iniciadores usados na PCR. A análise

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da sequência do produto de reacção de ADN com a dimensão prevista pode ser comparada com a sequência de aminoácidos determinada para confirmar que a sequência de ácidos nucleicos amplificada pode, de facto, codificar o fragmento peptídico de CNTF. Embora se possa utilizar qualquer processo de sequenciação de ácidos nucleicos conhecidos na arte, é preferível usar o método de terminação de cadeia com didesoxinucleótido (Sanger et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72^:3918-3921). A sequenciação pode ser conseguida usando produto purificado com gel ou, preferivelmente, produto de reacção de ADN clonado. Pode ser incorporada na extremidade 5' de cada iniciador de oligonucleótido utilizado para a PCR, de modo a facilitar a clonação dos produtos de reacção de ADN, uma "cauda" contendo sequências alvo conhecidas para as endonucleases de restrição conhecidas. A sequência dos produtos de reacção de ADN pode então ser usada com vista a conceber um iniciador de oligonucleótido correspondendo à sequência de codificação de CNTF exacta. Este iniciador pode então ser usado conjuntamente com um segundo iniciador na PCR, para aumentar a quantidade de sequência de codificação de CNTF para além da representada pelo fragmento da sequência exacta, inicialmente determinada. Por exemplo, e não como limitação, pode usar-se o protocolo para "rapid amplifica-tion of cDNA ends" (RACE) (M.A. Frohman, Μ. K. Dush G. R. Martin, 1988; Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:8998-9002) para clonar segmentos do interior da região da sequência exacta conhecida para as extremidades 5' e 3' das moléculas de ADNc, respectiva-mente. Assim, para se obter um clone que se estenda até à extremidade 3', o iniciador de cadeia com sentido pode corresponder à exacta sequência de nucleótidos de CNTF, enquanto que o iniciador de cadeia anti-sentido pode ser homólogo de um segmento da sequência conhecida, o qual se encontra provavelmente a jusante do fragmento sequenciado, p.exp. a cauda 3' poliadenosina de ARNm, transcrita inversamente no ADNc; neste caso, o iniciador incluiria uma extensão de oligo-dT. Pode ser necessário usar um método semelhante para recuperar a sequência a montante do fragmento sequenciado; por exemplo, o iniciador de cadeia anti-sentido

71 505 6526-030-118 -26-pods corresponder à exacta sequência de nucleótidos de CNTF e ô iniciador de cadeia com sentido pode ser homólogo de uma região a montante do fragmento sequenciado, p.e. uma cauda 5' poliguanosi— nu adicionada à extremidade 5' de ADNc usando desoxinucleótido--transferase terminal (neste caso, o iniciador incluiria uma extensão de oligo-dC).

Os fragmentos amplificados podem então ser sequenciados ou, preferivelmente, clonados e depois sequenciados. Logo que se determinem os oligonucleótidos exactos das extremidades 5' e 3' do ADNc, os nucleótidos exactos podem ser usados na reacção PCR para obter as sequências de ácidos nucleicos intervenientes e os produtos da reacção PCR podem então ser clonados.

Os produtos de reacção de ADN podem ser clonados usando qualquer método conhecido na arte. Podem ser usados vários sistemas vector-hospedeiro conhecidos na arte. Vectores possíveis incluem, não lhes estando limitados, cosmídeos, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema vector deve ser compatível com a célula hospedeira usada. Estes vectores incluem, não lhes estando limitados, bacteriofagos, tais como derivados lambda ou plasmídeos, tais como pBR322, pUC ou derivados de plasmídeos BLUESCRIPI® (Stratagene). As moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras por transformação, transfecção, infecção, electroporação, etc. 0 gene de CNTF é inserido num vector de clonação, o qual pode ser usado para transformar, transfectar ou infectar células hospedeiras apropriadas, de modo a que sejam geradas muitas cópias das sequências do gene. Isto pode ser conseguido ligando o fragmento de ADN a um vector de clonação o qual tem terminais complementares coesivos. Contudo, se os locais.de restrição complementares, usados para fragmentar o ADN, não estão presentes no vector de clonação, as extremidades das moléculas de ADN podem ser modificadas enzimaticamente. Pode ser vantajoso incorporar locais de clivagem por endonucleases de restrição nos iniciadores de oligonucleótidos, usados na reacção em cadeia com polimerase, para facilitar a inserção dos vectores. Alternativamente, pode

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ser produzido qualquer local desejado, por ligação de sequências de nucleótido (ligantes) nos terminais de ADN; estes ligantes ligados podem compreender oligonucleótidos específicos, sintetizados quimicamente, que codificam sequências de reconhecimento de endonucleases de restrição. Num método alternativo, o vector clivado e o gene de CNTF podem ser modificados por encaudamento homopo1iméri co.

Em concretizações específicas, a transformação das células hospedeiras com moléculas de ADN recombinante que incorporam um gene ADNc, ou sequência de ADN sintetizada de CNTF isolado, permite gerar múltiplas cópias do gene. Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades fazendo crescer transformantes, isolando, dos transformantes, as moléculas de ADN recombinante e, quando necessário, recuperando o gene inserido a partir do ADN recombinante isolado.

De acordo com uma concretização preferida do invento, logo que se gerou um clone derivado de ADNc, codificando CNTF, pode-se isolar um clone genómico codificando CNTF, usando técnicas padrão conhecidas na arte. Por exemplo, uma sonda de ácido nucleico marcada pode ser derivada do clone de CNTF e usada para pesquisar bibliotecas de ADN genómico por hibridação de ácido nucleico, usando, por exemplo, o método estabelecido por Benton e Davis (1977, Science 196:180) para bibliotecas de bacteriofago e Gruns-tein e Hogness (1975, Proc.Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72:3961-3965) para bibliotecas de plasmídeos. Os clones recuperados podem depois ser analisados por técnicas de mapeamento e de sequencia-ção de fragmentos de restrição de acordo com métodos bem conhecidos na arte.

Além disso, os clones de ADNc adicionais podem ser identificados a partir de uma biblioteca de ADNc usando as sequências obtidas de acordo com o invento.

5.5. EXPRESSÃO DE UM GENE DE FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR A sequência de nucleótidos que codifica uma proteína de CNTF ou uma sua porção pode ser inserida num vector de expressão apropriado, i.e. um vector que contém os elementos necessários

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para a transcrição e tradução da sequência de codificação da proteína inserida. Os sinais transcrierdn-aise de tradução necessários também podem ser fornecidos pelo gene de CNTF nativo e/ou pelas suas regiões flanqueadora. Podem ser utilizados vários sistemas hospedeiro—vector para expressar a sequência de codificação da proteína. Estes incluem, sem lhes estarem limitados, sistemas de células de mamíferos infectados com vírus (p.exp. vírus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insec-tos infectados com vírus (p. exp. baculovírus); microorganismos tais como leveduras contendo vectores de levedura ou bactérias transformadas com ADN de bacteríófago, ADN plasmídico ou ADN cosmídico. Os elementos de expressão destes vectores variam em força e especificidade. Pode ser usado qualquer elemento de transcrição e tradução adequado de vários destes elementos, dependendo do sistema hospedeiro—vector utilizado.

Qualquer dos métodos, anteriormente descritos, para a inserção de fragmentos de ADN num vector, pode ser usado para construir vectores de expressão contendo um gene quimérico consistindo nos sinais de controlo transcr:icional/de tradução apropriados e nas sequências de codificação da proteína. Estes métodos podem incluir técnicas sintéticas e de ADN recombinante in vitro e recombinações .in vivo (recombinação genética) . A expressão da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína ou o fragmento peptídico de CNTF pode ser regulado por uma segunda sequência de ácido nucleico, de modo que a proteína ou péptido de CNTF sejam expressos num hospedeiro transformado com a molécula de ADN recombinante. Por exemplo, a expressão de CNTF pode ser controlada por qualquer elemento promotor/faci1itante conhecidos na arte. Promotores que podem ser usados para controlar a expressão de CNTF incluem, sem lhes estarem limitados, a região promotora anterior de SV40 (Bernoist e Chambon, 1981, Nature 290:304-310). o promotor contido na repetição do terminal 3' longo do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), o promotor de timidina quinase do hèrpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:144-1445), as sequências reguladoras do gene da metalotionina (Brinster et al.,

71 505 6526-030-118 -29- 1982, Nature 296:39-42): vectores de expressão procarióticos tais como o promotor de β-lactamase (¥i1la-Kamaroff, et al., 1978,

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75:3727-3731), ou o promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:21-25), ver também "Useful proteins from recombinant bactéria" em Scien— tific American, 1980, 242:74-94: vectores de expressão de plantas compreendendo a região promotora de nopaline-sintetase (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) ou o promotor de ARN 35S de vírus do mosaico de couve-flor (Gardner, et al., 1981, Nucl.

Acids Res. 9:2871), e o promotor para a enzima fotossintética ribulose bifosfato-carboxilase fotossintética (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); elementos promotores de levedura ou de outros fungos, como o promotor Gal 4, o promotor ADC (álcool-desidrogenase), o promotor PGK (fosfoglicerol--quinase), o promotor de fosfatase alcalina e as seguintes regiões de controlo transcricionais, de animais que exibem especificidade relativamente a tecido e que têm sido utilizadas em animais transgénicos: região de controlo do gene da elastase I que é activa em células pancreáticas acinares (swift et al., 1984, Cel1 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); região de controlo do gene da insulina que é activa em células beta pancreáticas Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), região de controlo do gene da imunoglobulina, que é activa em células linfóides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658;

Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987,

Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); região de controlo de vírus de tumor mamário de ratinho, que é activa em células linfóides e mastócitos, da mama e testículo (Leder et al., 1986, Cell 45:485--495), região de controlo de gene de albumina, que é activa no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes e Devei. 1:258-276), região de controlo do gene de alfa feto-proteína, que é activa no fígado (Krumlauf et al., 1985. Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al; 1987, Science 235:53-58); região de controlo do gene de alfa 1-anti-tripsina que é activa no fígado (Kelsey et al., 1987,

Genes e Devei. 1.:161-171), região de controlo do gene de beta--globlina que é activa nas células mielóides (Mogram et al..

J

71 505 6526-030-118 -30- 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94; região de controlo de proteína básica mielina, que é activa em células oligodendrócíticas no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); região de controlo do gene de cadeia-2 leve da miosina que é activa no músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286) e região de controlo do gene da hormona de libertação gonadotrófica, que é activa no hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378). 0s vectores de expressão contendo inserções de gene de CNTF podem ser identificados por três abordagens gerais: (a) hibrida-ção ADN-ADN, (b) presença ou ausência de funções de gene . "marcador" e (c) expressão das sequências inseridas. Na primeira abordagem, a presença de um gene estranho, inserido num vector de expressão pode ser detectada por hibridação ADN-ADN usando sondas compreendendo sequências que são homólogas a um gene de CNTF inserido. Na segunda abordagem, o sistema recombinante vector/ /hospedeiro pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou ausência de certas funções de genes "marcadores" (p. exp. actividade da timidina-quinase, resistência a antibióticos, fenótipo de transformação, formação de corpos de oclusão em baculovírus, etc.) ocasionada pela inserção de genes estranhos no vector. Por exemplo, se o gene de CNTF é inserido na sequência marcadora de gene do vector, os recombinantes contendo as inserções de CNTF podem ser identificados pela ausência da função de gene marcador. Na terceira abordagem, os vectores de expressão recombinantes podem ser identificados analisando o produto do gene estranho expresso pelo recombinante. Estas análises podem ser baseadas, por exemplo, nas propriedades físicas ou funcionais do produto do gene de CNTF em sistemas de ensaios biológicos como descritos supra, na secção 5.2.

Depois de se ter identificado e isolado uma molécula de ADN recombinante particular podem usar-se vários métodos, conhecidos na arte, para a propagar. Logo que se tenham estabelecido o sistema hospedeiro e as condições de crescimento apropriados, os vectores de expressão recombinante podem ser propagados e preparados em quantidade. Como se explicou anteriormente, os vectores

J 71 505 6526-030-118 -31 de expressão que podem ser usados incluem, sem lhes estarem limitados, os seguintes vectores ou seus derivados: vírus humanos ou animais tais como vírus vaccinia ou adenovírus; vírus de insectos tais como baculovírus; vectores de leveduras; vectores de bacteriófago (p.exp. lambda) e vectores de ADN V - plasmídico e cosmídico, para nomear apenas alguns.

Em adição, pode escolher-se uma estirpe de célula hospedeira que module a expressão das sequências inseridas ou que modifique e processe o produto do gene da maneira específica que se deseje. A expressão a partir de certos promotores pode ser aumentada na presença de certos indutores; assim, a expressão da proteína de CNTF construída por engenharia genética pode ser controlada. Além disso, diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento e modificação da tradução e da pós—tradução (p. exp. glicosilação e clivagem) de proteínas. Podem ser escolhidos linhas de células ou sistemas hospedeiros apropriados, para assegurar a modificação e processamento desejados da proteína estranha expressa. Por exemplo, a expressão num sistema bacteriano pode ser usada para produzir um produto proteico de "core" não glicosilado. A expressão em levedura produzirá um produto glicosilado. A expressão em células de mamífero pode ser usada para assegurar a glicosilação "nativa" da proteína de CNTF heteróloga. Além disso diferentes sistemas de expressão vector/hospedeiro podem efectuar reacções de processamento tal como clivagens proteolíticas, em diferentes extensões.

Numa concretização especifica do invento, o ADN que codifica CNTF pode ser clonado no plasmídeo pCMV, amplificado e depois usado para transformar células Hela pelo método de DEAE-dextrana; a actividade de CNTF pode então ser colhida a partir de extractos de células (ver Secção 6, Exemplo, infra).

Numa outra concretização específica do invento o ADN que codifica CNTF pode ser incorporado num vector de expressão apropriado e pode ser usado para transformar E. coli, tendo como resultado CNTF biologicamente activo (ver Secção 7, Exemplo, infra) .

Em concretizações particulares do invento, a expressão de CNTF em E. coli é, preferivelmente, realizada usando vectores, que compreendem um dos seguintes elementos: um promotor lac UV 5, o qual pode ser controlado pelo repressor do operSo de lactose; um local de ligação forte de ribossoma, por exemplo, o local de ligação ao ribossoma de bacteriófago T7; uma mutação na região de controlo de replicação do plasmideo, a qual pode aumentar o número de cópias; ou uma mutação que limite a expressão da proteína de resistência a antibióticos. Numa concretização preferida do invento, a expressão do CNTF é realizada usando o vector pRPN12, da qual pode resultar um aumento, de 30 a 50 vezes, da expressão de CNTF, relativamente a outros vectores (Secção 12, infra). Numa outra concretização do invento, pode ser usado o vector de expressão pRPN38 para produzir CNTF em E. coli. Noutras concretizações preferidas do invento, o CNTF humano pode ser expresso em E. coli usando o vector pRPN40. O invento também proporciona moléculas que são funcionalmente equivalentes aos plasmídeos pRPN12, pRPN38, pRPN39 e pRPN40, os quais compreendem elementos equivalentes (promotor, local de ligação de ribossoma, etc.), do que resultam níveis de expressão de CNTF comparáveis.

5.5.1 IDENTIFICAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO PRODUTO DO GENE EXPRESSO

Logo que um recombínante que expressa o, gene de CNTF é identificado, o produto do gene deve ser analisado. Isto pode ser conseguido por ensaios baseados nas propriedades físicas ou funcionais do produto. Uma vez identificada a proteína de CNTF, ela pode ser isolada e purificada por métodos Standard incluindo cromatografia (p. exp. cromatografia de permuta iónica, de afinidade e de coluna de classificação), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica Standard para a purificação de proteínas. As propriedades funcionais podem ser avaliadas usando qualquer ensaio de CNTF conhecido, incluindo, sem lhes estar limitado, neurónios de gânglio ciliar de embrião de pintainho. É de realçar que os processos usados para preparar CNTF a 71 505 6526-030-118 -33-

partir de tecido de nervo ciático, porque envolvem, como passo final, electroforese preparativa em gel, produzirão CNTF que pode não ser totalmente activo devido à presença de SDS residual. Pelo contrário, o presente invento proporciona um processo para purificar CNTF com óptima actividade biológica e adequado para sequenciação da proteína, usando uma coluna de FPLC; o presente invento permite também o isolamento de CNTF recombinante o qual é produzido a partir de moléculas de ácido nucleico recombinante ou é quimicamente sintetizado e que está assim isento de SDS e é totalmente activo.

5.6 GENES E PROTEÍNAS DE FACTOR NE-UROTRÚFICO CILIAR

Usando os processos detalhados supra e nas Secções 6 e 8 Exemplo, infra, determinaram-se as seguintes sequências de ácido nucleico e as suas correspondentes sequências de aminoácidos deduzidas. Foi determinada a sequência de ADNc de CNTF de ratazana a qual se apresenta na FIG. 1. Foi determinada a sequência genómica humana de CNTF, a qual se apresenta na FIG. 8.Cada uma destas sequências, ou seus equivalentes funcionais, pode ser usada de acordo com o invento. Adicionalmente, o invento refere-se a genes e proteínas de CNTF isolados de fontes porcinos, ovinos, bovinos, felinos, de aves, equinos ou caninos bem como de primatas e de qualquer outra espécie na qual exista actividade de CNTF. 0 invento dirige-se ainda a subsequências de ácidos nuclei-cos de CNTF, compreendendo pelo menos dez nucleótidos, estas subsequências compreendem porções hibridáveis da sequência de CNTF, as quais têm utilidade, p.e. em ensaios de hibridação de ácidos nucleicos, análises por Southern e Northern "blot", etc. 0 invento também proporciona proteínas de CNTF, seus fragmentos e derivados, de acordo com as sequências de aminoácidos apresentadas nas FIG. 1 e 8, ou seus equivalentes funcionais. 0 invento também proporciona fragmentos ou derivados de proteínas de CNTF que compreendem determinante(s) antigénica(s) ou que são funcionalmente activo(s). Como aqui usado, funcionalmente activo, significa com actividade positiva em ensaios da função de CNTF conhecida, p.e. ensaios de gânglio ciliar de embrião de pintainho

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Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos apresentadas nas FIG. 1 e 8 podem ser alteradas por substituições, adições ou delecções que proporcionam moléculas funcionalmente equivalentes. Devido h degenerescência das sequências de codificação de nucleó-tidos, na prática do presente invento, podem usar-se outras sequências de ADN que codifiquem essencialmente a mesma sequência de aminoácidos das FIG. 1 e 8. Estas incluem, não se lhes limitando, sequências de nucleótidos compreendendo os genes de CNTF completos, ou suas porções, apresentados nas FIG. 1 e 8, as quais são alteradas pela substituição de codões diferentes que codificam um resíduo de aminoácido equivalente na sequência, produsin-do, assim, uma modificação silenciosa. De modo similar, as proteínas de CNTF, do invento ou os seus fragmentos ou derivados, incluem, não se lhes limitando, os que contêm, como sequência de aminoácido principal, toda, ou parte, da sequência de aminoácidos essencialmente como se apresenta na FIG. 1 e 7, incluindo sequências alteradas nas quais existem resíduos de aminoácidos da sequência substituídos por resíduos equivalentes, tendo como resultado uma modificação silenciosa. Por exemplo, pode substituir-se um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência por outro aminoácido com uma polaridade semelhante, que actue como equivalente funcional, tendo como resultado uma alteração silenciosa. Os substitutos para um aminoácido da sequência podem ser selecci— onados de entre os outros membros da classe à qual o aminoácido pertence. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valína, prolina, fenilala— nina, triptofano e metiónina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagi— na, e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Estão também incluídos no âmbito do invento proteínas de CNTF ou seus fragmentos ou derivados que foram diferencialmente modificados durante, ou depois, da tradução, p.e., por glicosiiação, clivagem proteolltica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular etc. A secção 8, infra, exemplifica a expressão de CNTF recombinante biologicamente activo em 71 505 6526-030-118 -35-

E. coli, indicando assim que o CNTF não glicosi lado é biologicamente activo.

Em adição, o CNTF recombinante que codifica sequências de ácido nucleico do invento pode ser construído, por engenharia genética, de modo a modificar o processamento ou expressão do CNTF, Por exemplo, e não como limitação, pode inserir-se uma sequência de sinal a montante das sequências de codificação de CNTF, para permitir a secreção de CNTF e assim facilitar a colheita ou a biodisponibi1 idade.

Adicionalmente, um dado CNTF pode sofrer mutação Tn vitro ou in vivo para criar e/ou destruir sequências de tradução, iniciação e/ou determinação, ou para criar variações nas regiões de codificação e/ou para formar novos locais de endonucleases de restrição ou para destruir os preexistentes, para facilitar outra modificação in, vitro. Pode usar-se qualquer técnica para mutagé— nese conhecida na arte, incluindo, não se lhes limitando, mutagé— nese dirigida ao local, in vitro, (Hutchinson, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), uso de lingotes TAEÍ^ (Pharmacia), etc.

5.7 CRIAÇAO DE ANTICORPOS ANTI-FACTQR NEURQTRÚFICO CILIAR

De acordo com o invento, podem usar-se, como imunogénio, proteína de CNTF ou seus fragmentos ou derivados, para gerar anticorpos anti-CNTF. Ao permitir-se a produção de quantidades relativamente abundantes de proteína de CNTF, usando técnicas recombinantes para a síntese proteica (com base nas sequências de ácido nucleico de CNTF do invento), é ultrapassado o problema de quantidades limitadas de CNTF.

Para aumentar ainda a possibilidade de produção de uma resposta imunitária anti-CNTF, a sequência de aminoácidos de CNTF pode ser analisada de modo a identificar porções da molécula que possam estar associadas à imunogenicidade aumentada. Por exemplo, a sequência de aminoácidos pode ser submetida a análise por computador para identificar epítopos de superfície, como se ilustra nas FIG. 15(a) e (b) as quais apresentam representações.

J

71 505 6526-030-118 -36- gerados por computador, de hidrofilicidade, probabilidade superficial, flexibilidade, índice antigénico e hélice anfifílica, folha anfifílica e estrutura secundária do CNTF de ratazana e humano, respectivamente. Alternativamente, as sequências de aminodcidos de CNTF, deduzidas, de diferentes espécies, podem ser comparadas e podem ser identificadas regiões relativamente não homólogas; estas regiões não homólogas serão provavelmente imuno-génicas em várias espécies.

Para a preparação de anticorpos monoclonais dirigidos a CNTF pode usar-se qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpo; por linhas de células contínuas em cultura. Por exemplo, a técnica do hibridoma, originalmente desenvolvida por Kohler e Milstein (1975, Nature 256:495-497). bem como a trioma. do técnica dõ / hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983,

Immunology Today 4:72), e a técnica do hibridoma de EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., 1985, em "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) e técnicas semelhantes fazem parte do âmbito do presente invento.

Os anticorpos monoclonais para uso terapêutico podem ser anticorpos monoclonais humanos ou anticorpos monoclonais quiméricos de humanos-ratinho (ou de outras espécies). Os anticorpos monoclonais humanos podem ser feitos por qualquer uma das numerosas técnicas conhecidas na arte (e.g·., Teng et al., 1983, Proc. Nat1. Acad. Sei. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor et al., 1983,

Immunology Today 4:72-79; Olsson et al., 1982, Meth, Enzymol. 92:3-16). Podem ser preparadas moléculas de anticorpos quiméricas contendo um domínio de ligação a antigénio de ratinho com regiões humanas constantes (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:6851, Takeda et al., 1985, Nature 314:454).

Para a produção de anticorpos policlonais para epítopos de CNTF podem usar-se vários conhecimentos conhecidos na arte. Para a produção de anticorpos podem imunizar-se vários animais hospedeiros por injecção com proteína de CNTF ou seu fragmento ou derivado, incluindo coelhos, ratinhos, ratazanas, etc., mas não

J 71 505 6526-030-118 só. Dependendo da espécie hospedeira podem usar-se vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, incluindo, mas não se lhes limitando, meio de Freund (completo e incompleto), geles minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensio--activas tais como 1isolecitina, polióis plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianinas de lapa do género fissu-rela, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis como BCG (Bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Um clone molecular de um anticorpo para um epítopo de CNTF pode ser preparado por técnicas conhecidas. Pode usar-se metodologia de ADN recombinante. (ver p.exp., Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) para construir sequências de ácido nucleico que codificam uma molécula de anticorpo monoclonal ou uma sua região de ligação a antigénio.

As moléculas de anticorpo podem ser purificadas por técnicas conhecidas, e.g., por cromatografia de imunoabsorção ou imunoafi-nidade, métodos cromatográficos tais como HPLC (cromatografia líquida de alta resolução) ou uma sua combinação, etc.

Os fragmentos de anticorpo que contém o idiotipo da molécula podem ser gerados por técnicas conhecidas. Por exemplo, estes fragmentos incluem: o fragmento F(ab')2 Que Pode ser produzido por digestão da molécula de anticorpo com pepsina; os fragmentos Fab' que podem ser gerados por redução das pontes dissulfeto do fragmento F(ab')2; e os fragmentos 2 Fab ou Fab que podem ser gerados por tratamento da molécula de anticorpo com papaína e um agente redutor; não lhes estando no entando limitados. A Secção 9, Exemplo, descreve a preparação de anti-soros policlonais dirigidos a um fragmento peptídico com catorze ami— noácidos da proteína de CNTF. A Secção 17, Exemplo, descreve quatro anticorpos monoclonais anti-CNTF que são proporcionados pelo presente invento, nomeadamente o RP3-12, o RF12-1, o RP12-2 e o. RP12-9.

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5.8 UTILIDADE DO INVENTO O presente invento refere-se à sequência de ácido nucleico de CNTF e a proteínas substancialmente puras, fragmentos peptídi-cos ou derivados produzidos a partir dela. As proteínas, péptidos e derivados de CNTF, anticorpos anti-CNTF e sondas de ácido nucleico de CNTF podem ser utilizados em aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Para a maioria dos fins é preferível usar genes ou produtos de gene de CNTF da mesma espécie para fins de diagnóstico ou terapêuticos, embora a utilidade de CNTF de espécies cruzadas se possa mostrar útil em concretizações do invento.

5.8,1 APLICAÇÕES EM DIAGNÓSTICO 0 presente invento, que se refere a ácidos nucleicos codificando CNTF e a proteínas, fragmentos peptídicos ou derivados produzidos a partir deles, bem como a anticorpos dirigidos contra proteína, peptídicos de CNTF ou derivados, pode ser utilizado para diagnosticar doenças e desordens do sistema nervoso que podem estar associadas a alterações no padrão da expressão de CNTF.

Em várias concretizações do invento, podem usar-se genes de CNTF e sequências e subsequências de ácidos nucleicos afins, incluindo sequências complementares, em ensaios de diagnóstico com hibridação. As sequências de ácido nucleico de CNTF ou as suas subsequências compreendendo pelo menos 10 nucleótidos, podem ser usadas como sondas de hibridação. Os ensaios de hibridação podem ser usados para detectar, prognosticar, diagnosticar ou monitorar condições, desordens ou estados de doença associados a alterações da expressão de CNTF, incluindo, em particular, condições de que resultem danifíciQ; e degeneração dos neurónios que se sabe responderem ao CNTF, tal como os neurónios para--simpáticos, os neurónios colinérgicos, os neurónios da espinal medula, as células de neuroblastoma, e as células da medula adrenal. Estas doenças e condições incluem trauma do SNC, enfarte, infecção, doença degenerativa dos nervos, malignidade ou alterações pós—operatórias incluindo, mas não se limitando a. Doença de Alzheimer, Doença de Parkinson, Coreia de Huntington e

J 71 505 6526-030-118 —39— esclerose amiotrófica lateral. Por exemplo, ο ARN total duma amostra de tecido de um paciente pode ser analisado, de modo a determinar a presença de ARNm de CNTF, sendo a diminuição da quantidade de ARNm de CNTF indicativa de degeneração neurónica.

Em concretizações alternativas do invento, podem usar-se anticorpos dirigidos a proteína, fragmentos peptídicos ou derivados de CNTF para diagnosticar doenças e desordens do sistema nervoso, incluindo, em particular, as populações neurónicas e desordens clínicas e doenças listadas supra. Os anticorpos dirigidos às proteínas de CNTF do invento podem ser usados, por exemplo, na identificação imuno-histoquímica da actividade de CNTF em secções ou biópsias de tecidos de um paciente que necessite desse exame. Num outro exemplo, os anticorpos do invento podem ser usados em procedimentos de ELISA para detectar e/ou medir quantidades de CNTF presentes em amostras de fluido ou de tecido; de modo análogo, os anticorpos do invento podem ser usados na análise de Western "blot" para detectar e/ou medir o CNTF presente em amostras de tecido ou de fluido. Na Secção 11, infra descreve-se um anticorpo do invento que liga e imunoprecipita o CNTF.

Noutras concretizações do invento, a proteína, fragmentos peptídicos ou derivados de CNTF podem ser usados para diagnosti-. car doenças e desordens do sistema nervoso. Numa concretização particular, não limitadora, a proteína ou fragmentos peptídicos de CNTF marcados podem ser usados para identificar tecidos ou células que expressem o receptor de CNTF, de modo a identificar aberrações da expressão de receptor de CNTF e consequentemente, anormalidades potenciais da resposta tissular ou celular ao CNTF. 0 presente invento proporciona também um ensaio imunológico para a medição da quantidade de CNTF numa amostra líquida, o qual é um método de sanduíche de dois anticorpos compreendendo a ligação de um primeiro anticorpo anti-CNTF a um suporte sólido, a exposição do primeiro anticorpo ligado a uma solução compreendendo CNTF, sob condições que permitam que ocorra a ligação do primeiro anti-corpo a CNTF e, em seguida, a exposição do CNTF ligado

71 505 6526-030-118 ao primeiro anticorpo a um segundo anticorpo anti-CNTF, o qual é, de preferência, dirigido a um epítopo de CNTF diferente do do primeiro anticorpo anti-CNTF, sob condições que permitam que ocorra a ligação do CNTF ao segundo anticorpo e, em seguida, a detecção da ligação do segundo anticorpo para CNTF, usando técnicas conhecidas na arte que incluem, mas não se limitam a, ligação do segundo anticorpo a um anticorpo, anti-imunoglobulina conjugado com uma substância indicadora, tal como um composto fluorescente ou um composto compreendendo radio-isótopo ou uma enzima ou uma substância que possa produzir um sinal num ensaio colori-métrico. Numa concretização preferida do invento, podem utilizar-se anticorpos monoclonais RP3-12. e RP12-2 num tal ensaio de sanduíche com dois anticorpos para CNTF humano (ver Secção 17, infra). Esta técnica pode ser usada como ensaio sensível para a medição dos níveis de CNTF e pode ser usada na diagnose de desordens neurológicas associadas a anormalidades na expressão de CNTF.

5.8.2. APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS 0 presente invento, que se refere a ácidos nucleicos codificando CNTF e a proteínas, fragmentos peptídicos ou derivados produzidos a partir deles, bem como a anticorpos dirigidos contra proteína, péptidos ou derivados de CNTF, pode ser usado para tratar doenças e desordens do sistema nervoso que podem estar associadas a alterações do padrão de expressão de CNTF ou que podem beneficiar da exposição a CNTF ou a anticorpos anti-CNTF.

Em várias concretizações do invento, a proteína, fragmentos peptídicos ou derivados de CNTF podem ser administrados a pacientes nos quais o sistema nervoso foi danificado por trauma, cirúrgia, isquemia, infecção (p.exp. polío ou SIDA), doença metabólica, deficiência nutricional, malignidade, agentes tóxicos ou doença degenerativa de origem até agora desconhecida. Em várias concretizações específicas do invento, o CNTF pode ser administrado a neurónios da espinal medula, que tenham sido danificados, por exemplo, por trauma, enfarte, infecção, doença degenerativa ou lesão cirúrgica; a Secção 10, Exemplo, ilustra o

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uso de CNTF na promoção da sobrevivência dos neurónios da espinal medula.

Os ácidos nucleicos, péptidos e derivados de CNTF do presente invento podem ser usados para tratar desordens dos neurónios motores. Ά Secção 11, Exemplo, ilustra a eficácia notável do CNTF na promoção da sobrevivência de neurónios motores no nervo facial afectado. Assim, em concretizações particulares do invento, o CNTF ou os seus péptidos ou derivados podem ser usados para tratar a paralisia de Bell ou outra (uma paralisia envolvendo o nervo facial) bem como outras doenças do sistema motor (Doença do Neurónio Motor) que incluem, mas não se limitam a, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal progressiva, paralisia bulbar progressiva, esclerose lateral primária e atrofias musculares espinais (doença de Werdning--Hoffman e doença de Kugelberg-Welander) e Síndrome Post-Polio. A degeneração e morte dos neurónios motores do corno anterior da medula espinal é um dos aspectos principais do processo patofisiológico na esclerose lateral amiotrófica (ALS; doença de Lou Gehrig), lesão da medula espinal e doenças afins. O resultado das Secções 10 e 14, infra, mostra que o CNTF pode ser usado para facilitar a sobrevivência e promover a expressão colinérgia dos neurónios motores da medula espinal no tratamento destas doenças.

Em adição, como suportado pelos dados apresentados na Secção 18, Exemplo, infra, as composições farmacêuticas compreendendo factor de crescimento fibroblástico básico ou, mais preferivelmente, CNTF e. factor de crescimento fibroblástico básico podem ser usadas para promover a sobrevivência de neurónios motores e usados no tratamento das doenças dos neurónios motores acima mencionados. 0 presente invento também pode ser usado, por exemplo, na aceleração da recuperação de pacientes que sofrem de neuropatias diabéticas, p.exp. mononeuropatia multiplex ou impotência. Noutras concretizações do invento, a proteína de CNTF ou fragmentos peptídicos ou derivados dela òb tidos: - podem ser

71 505 6526-030-118 -42-usados para tratar condições congénitas ou desordens neurodegenerativas que incluem, mas não se limitam a, doença de Alzheimer, envelhecimento, neuropatias periféricas, doença de Parkinson, coreia de Huntington e doenças e desordens dos neurónios motores; em particular, o invento pode ser usado para tratar desordens congénitas ou neurodegenerativas associadas à disfunção dos neurónios colinérgicos. A doença de Alzheimer envolve a perda selectiva de neurónios colinérgicos no prosencéfalo basal e verificou-se que aproximadamente 35 por cento dos pacientes com doença de Parkinson sofrem de demência do tipo Alzheimer; o CNTF produzido de acordo com o invento pode mostrar-se útil como agente único na terapia deste complexo de doenças. Analogamente, o CNTF produzido de acordo com o invento pode ser usado terapeuticamente para tratar a doença de Alzheimer em conjunção com o Síndrome de Down. 0 CNTF produzido de acordo com o invento pode ser usado no tratamento de uma variedade de demências bem como de desordens congénitas da aprendizagem.

Como se exemplifica nas Secções 15 e 16, infra, observou-se que o CNTF exibia várias actividades nas células hipocâmpícas, incluindo um aumento da absorção e incorporação de GABA, aumento da expressão de proteína de neurofilamento e enzima de GAD, aumento da sobrevivência de neurónios GABAérgicos, aumento da sobrevivência de neurónios hipocâmpicos e aumento da sobrevivência de astrócitos hipocâmpicos. Assim em várias concretizações do invento, -o CNTF pode ser usado para exercer estas actividades em células hipocâmpícas, _in vitro ou In vivo, e pode ser usado no tratamento de desordens neurológicas envolvendo o hipocampo, incluindo, mas não se limitando à doença de Alzheimer, enfarte e lesões tóxicas. O CNTF, péptidos, anticorpos ou derivados de CNTF do invento também podem ser usados, para tratar tumores proveniente do tecido do sistema nervoso, incluindo glioblastoma e melanoma, que resultam de melanócitos derivados da cristã neural.

Pode ser desejável administrar os péptidos' relacionados com o CNTF ou a proteína de CNTF por adsorpção numa membrana, p.exp. 71 505 6526-030-118 -43'

uma membrana silástica, gel ou espuma que podem ser implantados na proximidade do nervo danificado. Numa concretização específica do invento, a administração de proteína, fragmentos peptídicos ou derivados de CNTF podem ser usados em conjunção com implantação cirúrgica de tecido ou outras composições de libertação sustida, incluindo micro-esferas, microcápsulas ou implantes sintéticos, no tratamento da doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e outras doenças dos neurónios motores (incluindo, por exemplo, a doença de Werdnig-Hoffman) e a doença de Parkinson.

Noutras concretizações do invento, a proteína, fragmentos ou derivados de CNTF podem ser usados em conjunção com outras citocinas para conseguir o efeito neurotrófico desejado. Por exemplo, e não de modo limitativo, de acordo com o invento, o CNTF pode ser usado com o NGF para conseguir um efeito estimulatório no crescimento e sobrevivência de neurónios.

Prevê-se que o CNTF possa funcionar sinergicamente com outros factores peptídicos derivados do SNC ainda a caracterizar completamente, no crescimento, desenvolvimento e sobrevivência de um largo conjunto de subpopulações neuronais do sistema nervoso central e periférico.

Prevê-se ainda que, com base na completa caracterização da molécula de CNTF, possam ser desenvolvidos novos fragmentos peptídicos, derivados ou mutantes de CNTF que sejam capazes de actuar como agonistas ou antagonistas de algumas, ou todas, as funções biológicas de CNTF.

Ainda noutras concretizações do invento, os anticorpos dirigidos à proteína de CNTF, ou seus fragmentos peptídicos ou derivados, podem ser administrados a pacientes que sofrem de uma variedade de desordens e doenças neurológicas e que têm necessidade de um tal tratamento. Por exemplo, os pacientes que sofrem de produção excessiva de CNTF podem necessitar deste tratamento. Os anticorpos anti-CNTF podem ser usados na prevenção da regeneração aberrante de neurónios sensoriais (p.exp.pós--operativamente) ou no tratamento de síndromes da dor crónica.

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-44-5.8.3. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As composições activas do Invento, que podem compreender todo ou porções do produto de gene de CNTF, dele incluindo a proteína, os fragmentos peptídicos ou. os derivados produzidos a partir dela, ou anticorpos (ou fragmentos de anticorpos) dirigidos à proteína, fragmentos peptídicos ou derivados de CNTF ou uma combinação de CNTF e um segundo agente, tal como NGF, podem ser administrados em qualquer portador farmacêutico biocompatível estéril, incluindo mas não se limitando a solução salina, solução salina tamponada, dextrose e água. A proteína, fragmento peptídico ou derivado de CNTF podem compreender uma sequência de aminoácidos ou uma sua subsequência essencialmente como apresentada na FIG.l (ratazana) ou FIG.8 (sequência humana). 0 CNTF pode ser derivado de sequências correspondendo dos genes de CNTF de qualquer espécie adequada, incluindo mas não se limitando a humanos, porcos, ratazanas, galinhas, vacas, cães, carneiros, cabras, gatos, coelhos etc. A quantidade de proteína, fragmento peptídico, derivado de CNTF ou anticorpo que será eficaz no tratamento de uma desordem ou condição particular dependerá da natureza da desordem ou condição e pode ser determinada por técnicas clínicas Standard. Quando possível, é desejável determinar primeiro a curva dose-—resposta das composições farmacêuticas do invento In vitro, p.exp. em sistemas de bioensaio de CNTF descritos supra, e, em seguida, em úteis sistemas de modelos animais, antes de aquelas serem testadas em seres humanos. Com base nos dados in vitro, numa concretização específica do invento, uma composição farmacêutica eficaz na promoção da sobrevivência de neurómios de gânglios ciliares podem proporcionar uma concentração local de proteína de CNTF de cerca de 2 ng/ml. Numa concretização específica, adicional, do invento, uma composição farmacêutica eficaz na promoção do crescimento e sobrevivência de neurónios colinérgicos pode proporcionar uma concentração local de proteína de CNTF de cerca de 40 unidades tróficas por mililitro. Métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a

71 505 6526-030-118 métodos intradérmicos, intramusculares, intraperitoneais, intravenosos, subcutâneos, orais e intranasais. Poderá ainda ser desejável introduzir as composições farmacêuticas do invento no sistema nervoso central por qualquer via adequada incluindo injeçção intraventricular e intratecal; a injeçção intraventricular pode ser facilitada por um catéter intraventricular, por exemplo, ligado a um reservatório, tal como um reservatório Ommaya.

Além disso, pode ser desejável administrar, localmente, as composições farmacêuticas do invento à àrea que necessita de tratamento; isto pode ser conseguido por, por exemplo, e não como limitação, infusão local durante cirúrgia, por injeçção, por meio de um catéter ou por meio de um implante, sendo este implante um material poroso, não poroso ou gelatinoso, inclusivé membranas, tais como membranas silásticas, ou fibras. 0 invento também proporciona composições farmacêuticas compreendendo proteínas, fragmentos peptídicos ou derivados de CNTF administradas via lipossomas, micropartícuias ou microcápsulas. Em várias concretizações do invento pode ser útil usar estas composições para conseguir a libertação sustida de CNTF e de produtos relacionados com CNTF.

Prevê-se que pode ser possível introduzir células que produzem activamente CNTF, substâncias relacionadas com CNTF, antagonistas de CNTF ou agonistas de CNTF, anticorpos anti-CNTF em áreas que necessitam de concentrações de CNTF aumentadas ou diminuídas.

5.8.4. AS SONDAS MOLECULARES DO INVENTO PODEM SER USADAS PARA IDENTIFICAR NOVAS MOLÉCULAS HOMÓLOGAS A CNTF Têm sido identificadas moléculas exibindo actividade semelhante a CNTF, mas diferindo nos pesos moleculares, em várias espécies e tecidos incluindo olho de embrião de pintainho, nervo ciático de ratazana, tecido de cérebro danificado, células cardíacas, sobrenadante de células de neuroblastoma (Heymanns e Unsicker, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84--7758-7762) e células ad-renais medulares (Unsicker et al., 1385, Neurosci.

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Lett. 60:127-132). Não se sabe quantas delas são idênticas ou diferentes do CNTF descrito aqui; provavelmente encontrar-se-ão mais fontes e espécies de CNTF. As moléculas de ADN recombinante do invento ou os anticorpos dirigidos a proteínas ou fragmentos peptídicos de CNTF do invento podem ser usadas para caracterizar novas moléculas homólogas de CNTF.

Por exemplo, e não como limitação, as moléculas de ADN recombinante que codificam CNTF podem ser usadas como sondas para identificar novas moléculas que são homólogas mas não idênticas êis moléculas de CNTF apresentadas nas FIG. 1 e 8. Estas moléculas homólogas podem ou não exibir actividade de CNTF e podem ter origem nas mesmas, ou em diferentes, sequências genómicas relativas às moléculas apresentadas nas FIG. 1 e 8.

Preferivelmente, estas novas moléculas poderiam ser identificadas usando porções das sequências de codificação de CNTF apresentadas nas FIG. 1 ou 8 como iniciadores de oligonucleótidos em reacções. PCR usando, como molde, ARN ou ADN genómico das células que se pensa expressarem o homólogo de CNTF. De modo idêntico, poder-se-iam usar anticorpos anti-CNTF para precipitar polissomas que sintetizam proteínas homólogas a CNTF; o ARN assim colhido poderia então ser submetido a amplificação por PCR usando os iniciadores de oligonucleótido do invento. Usando esta técnica, crê-se que podem ser identificadas e clonadas várias moléculas relacionadas com CNTF.

6. EXEMPLO: CLONAÇÃO MOLECULAR, EXPRESSÃO E DISTRIBUIÇÃO REGIONAL DE FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR (CNTF) DE RATAZANA

6.1. MATERIAIS E MÉTODOS 6.1.1. PURIFICAÇÃO E CLIVAGEM DE CNTF 0 CNTF foi purificado como descreve (Saadat, et al., 1989, J. Cell Biol, 108: 1807-1816). Adicionalmente, depois da electroeluição dos geles preparativos de poliacrilamida, o CNTF foi aplicado a uma coluna de 7,75 x 100 mm Bakerbond Gold C4 Widepore e eluído com ácido trifluoroacético a 0,1¾ e com um gradiente de acetonitrilo de 0 a 60 por cento. A proteína 71 505 6526-030-118 -47-

biologicamente activa eluiu num pico a 50-55¾ de acetonitrilo. Ã análise de 2D-gel de 4 ug de CNTF purificado, na qual a primeira dimensSo consistia em focagem isoeléctrica num gradiente de pH de 3,5-10,0 e a segunda dimensão consistia em electroforese em 12¾ de gel de SDS-poliacrilamida, mostrou que esta proteína migrou como uma única mancha (Saadat et al., 1989, J. Cell Biol. 108:1807-1816) (FIG.2). Ά análise de 2D-gel de CNTF que não foi submetido ao passo adicional de purificação na coluna Bakerbond Gold C4 Widepore foi efectuada em paralelo. O pico único contendo CNTF foi concentrado num Speed Vac, do qual se tinha expulsado o ar, com árgon. Verificou-se que o drgon é importante na prevenção da perda de actividade de CNTF, a qual ocorre na oxidação de um ou mais dos resíduos de metionina. Para a clivagem de BRCN, adicionou-se ácido fórmico (concentração final 70¾ v/v) e BRCN (10¾ v/v) a 30 ug de CNTF purificado. Após 3 h à temperatura ambiente, adicionaram-se 500 u1 de H20 e o material foi concentrado até 50 u1 e aplicado imediatamente à coluna Bakerbond Gold C^ Widepore. Para a clivagem triptico, secaram-se 30 ug de .CNTF purificado por cromatografia, redissolveram-se em 50 μΐ de TRIC 0,1 M/HCL (pH 8,0) contendo CaCl2 lOmM e 3 ug de tripsina tratada com TPK (Sigma) e incubou--se durante a noite a 37"C. Os fragmentos resultantes foram carregados na coluna Bakerbond Gold C4 Widepore e eluídos usando as mesmas condições (Caudal 1 ml/min-1, gradiente de acetonitri lo 0-60¾ em 60 minutos, monitorizando a 214 nm). Os picos foram recolhidos manualmente. As sequências de aminoácidos dos péptidos foram determinadas usando um sequenciador automatizado Applied Biosystems (Eckerskorn et al., 1988, Electrophoresis, 9:830-838). A composição de aminoácidos de CNTF purificado foi determinada por hidrólise de 5 ug de CNTF e derivação com ninidrina (Tsugita et al., 1987, Biochem., 102:1593-1597).

6.1.2. PRODUÇÃO DE CLONES DE ADNc DE CNTF

Sintetizou-se ADNc a partir de ARN total de astrócitos de ratazana em cultura (Okayama et al., 1987, Methods Enzymol. 154:3-29) usando oligo—iniciador 5 (os iniciadores de

J 71 505 6526-030-118 -48- oligonucleotidos são apresentados na FIG. 1C) e transcriptase inversa (Bethesda Research Laboratories). Ã primeira cadeia de ADNc serviu como molde para amplificação de segmentos específicos de CNTF usando PCR (Saiki et al., 1988, Science, 239:487-491). O clone A foi gerado usando os iniciadores oligo degenerados 1 e 2, e o produto de PCR foi identificado com o oligo 11, subclonado e sequenciado. A sequência deste clone parcial foi usada para sintetizar . os iniciadores 3 e 4 para amplificação das extremidades de ADNc (RACE) de acordo com os métodos -descritos (Frohmann et al., 1988, Froc. Natl. Acad. Sei USA, 85:8998-9002). Os ADNc obtidos foram subclonados no vector Bluescript SK+ e sequenciados (clones B e C). 0 oligonucleótido 7 foi derivado da sequência de um clone genómico (Carroll, resultados não publicados). Este iniciador foi usado para criar o clone D, usando o mesmo protocolo RACE que para o clone C. Obteve-se um clone de ADNc de comprimento total (E), para expressão em células eucarióticas, usando os iniciadores 9 e 10 na PCR. 6.1.3. ANALISE POR NORTHERN "BLQT"

Extractou-se ARN de vários tecidos de ratazana usando o método de extraeção com tiocianato de guanidínio (Chomczynski, P. and Sacchi, N., 1987, Anal. Biochem., 162:156-159). Uma quantidade igual de ARN total (30 ug de ARN, com excepção de ARNm de músculo que foi de 50 ug) foi glioxilada e submetida a de electroforese em 1,2%/gel de.-, agarose (Lindholm et al., 1988, Biol. Chem. 263:16348-16351). Para avaliar a expressão, no desenvolvimento, de ARNm de CNTF no nervo ciático da ratazana, submeteram-se a electroforese, como se descreveu acima, 25 ug de ARN total derivado de nervo ciático de ratazana; PO, P4 e P13 na FIG. 4(b) refere—se a ARN derivado de nervo ciático de ratazanas recém-nascidas com 4 dias de idade e com 13 dias de idade, respectivamente. Quantidades conhecidas de um transcripto de CNTF de 847 bp (sintetizado jin vitro usando o sistema de ribo-sonda, PROMEGA) sofreram também coelectroforese em faixas separadas para permitir a quantificação de ARNm de CNTF nas amostras. A seguir à electroforese, o ARN foi "blottèd" sob vácuo em filtros de nylon (Hybond—N, Amersham) e os filtros foram hibridados a 50"C em 50¾

71 505 6526-030-118 -49 de formamida (Lindholm et al., supra) usando uma sonda de ADNc de cadela dupla marcada com 32P para a região de codificação de CNTF (600 bp). Os filtros foram, subsequentemente, lavados, expostos durante 60 h a filmes de raios X e o auto-radiograma foi fotografado.

6.1.4. EXPRESSÃO DE CNTF RECOMBINÃNTE

Usou-se um vector de expressão com promotor de citomegalo vírus (dádiva de David Russell) para sub-clonar um clone de CNTF de comprimento total em ambas as orientações. As células HeLa foram usadas para transfecções, uma vez que não pode ser detectada, nestas células, expressão basal da actividade promotora de sobrevivência de neurónios ciliares de pintainho embrionário. Cada placa de cultura (10 mm de diâmetro) foi transfectada com 10 ug de vector pelo método de DEAE-Dextrana (Spandidos, D. A., e Wilhie, N. M., 1984, Transcription and Translation—A Practical Approach, 1-48). Após 48 h em cultura, os sobrenadantes foram removidos, as células lavadas 3 vezes com PBS frio e lisadas num tampão Fosfato 5 raM contendo NaCl 30 mM (pH 7,0). Após ultracentrifugação (100000 X g, 30 min) do lisado, as concentrações das proteínas foram determinadas e adicionaram--se sobrenadantes, a diferentes concentrações, aos neurónios ciliares E8 cultivados. Os neurónios sobreviventes foram contados após 24 h de cultura como se descreveu anteriormente (Hughes et al., 1988, Nature, 335:70-73). Cada.ponto 7FIG. 3 mostra a média de três determinações; as barras representam os erros padrão.

6.2. RESULTADOS

6.2.1. DETERMINAÇÃO DA SEQUÊNCIA DE AMINOACIDOS DE CNTF

Purificou-se CNTF a partir de nervo ciático de ratazana como se descreveu supra. Para a quantificação de amínoácidos, produção de fragmentos de brometo de cianogénio (BRCN) e triptícos (o terminal N foi bloqueado), foi necessário, o passo de purificação adicional de Bakerbond Gold. A sequência de aminoácidos dos vários fragmentos, determinada por micro--sequenciação em fase gasosa, representou mais do que 50¾ da sequência total, o que coincidiu perfeitamente com o deduzido a 71 505 6526-030-118

-50- partir do ADNc, e apresenta-se com a sequência de nucleótidos mostrada na FIG. 1. A composição em aminoácidos do CNTF purificado é apresentada na FIG. l(d).

6-2.2. PRODUÇÃO DE CLONES DE ADNc DE CNTF E ANALISE DA SEQUfiNCIA

Usaram-se culturas de células astrogliais de cérebro de ratazana, como fonte de ARN, para a clonaçãó molecular; estas células mostraram, anteriormente, produzir quantidades substanciais de CNTF (Lillien et al., 1988, Neuron, 1:485-494). Após vários passos de PCR (usando, como iniciadores, oligonucleótidos sintéticos derivados dos dados da sequência de aminoácidos obtidos como se descreveu em 6.2.1., supra), as sequências de nucleótidos dos clones A,B,C revelaram uma região curta de 5' não traduzida, de 77 bp e uma estrutura de leitura aberta de 600 bp, prevendo uma proteína com um comprimento de 200 aminoácidos com uma região de 3' não traduzida de 436 bp , que termina numa cauda Poly (A) (FIG. 1). Localizou-se um sítio de iniciação na estrutura, para tradução, na posição 78-80 da sequência de nucleótidos. Um códão de paragem, localizado 5' em relação a este sítio de iniciação na posição 72-74 e G na posição 75 e 81, preenchem os requisitos para um sítio de iniciação de tradução conveniente, de acordo com Kozak, M. J. (1989, J. Cell Biol. 108:229-241). Um codão da paragem na posição 678-680 segue-se a uma sequência que codifica o péptido CB2. 0 último aminoácido identificado por micro-sequenciação foi homo-serina, indicando que a metionina, prevista a partir da sequência de nucleótidos tinha sido modificada pos-traducionalmente e representa o terminal C.

Embora a sequência dibásica (Arg-Arg) na posição 13 e 14 da sequência prevista represente um sítio de clivagem pós--traducional potencial, a' composição de aminoácidos do CNTF purificado (FIG. l(d)) atesta contra uma tal clivagem: os aminoácidos fenilalanina arginina e alanina presentes na região N—terminal não são reduzidos relativamente a outros aminoácidos que estão ausentes desta região (p.exp. isoleucina). Além disso, o PM previsto para a sequência de 200 aminoácidos (22,8 KD) está

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perfeitamente de acordo com o estimado a partir da análise PAGE (22,5 KD) (Saadat et al., supra). Assim, a sequência de aminoácidos de CNTF apresenta as características de uma proteína citosólica, i.e. sem péptido de sinal, sem sequências de consenso para glicosilaçâo e apenas um resíduo de cisteína na posição 17. A comparação entre a sequência de CNTF determinada e as das bases de dados FIR e EMBL não revelou semelhanças significativas com qualquer outra proteína conhecida. Em particular, não havia homologia com o factor de crescimento de nervo (NGF), o factor neurotrófico derivado de cérebro (BDNF) ou com o factor de crescimento de fibroblasto (FGF) e Purpurin, cada um dos quais está associado a actividades de sobrevivência semelhantes às do CNTF (Unsicker et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei.. USA, 84:5459-5463; Schubert et al., 1986, J. Cell Biol., 102:2295--2301).

6-2.3. EXPRESSÃO DE CNTF RECOMBINÃNTE A probabilidade de CNTF ser uma proteína citoplásmica é suportada pela observação de que a expressão de um clone de ADNC de comprimento total em células HeLa tem como resultado a expressão de CNTF activo mas não a sua libertação para o meio de cultura (FIG. 3). 0 CNTF parece, assim, ser uma molécula semelhante a FGF e Interleuquina-1 (IL-1), os quais exercem um profundo efeito sobre as células mas são proteínas cilpssólicas. Para o FGF não foi estabelecido nenhum mecanismo de libertação (Abraham et al., 1986, Science233:545-548). Pelo contrário, demonstrou-se que a IL-1 é libertada a partir de macrófagos estimulados por um mecanismo não convencional após clivagem por uma enzima específica (convertase) (Kostura et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 86:5227-5231). Tem interesse particular a recente verificação de que as macromoléculas podem ser exportadas do citossol de leveduras por portadores que apresentam homologias estruturais com a glicoproteína de resistência a multi-drogas em células de mamífero (McGrath e Varshasky, 1989 Nature 340:400-404). Fica por estabelecer se esta glicoproteína também pode actuar como proteína portadora em células de mamífero. 71 505

6526-030-118 -52 6-2.4. ANALISE POR NORTHERN "BLOT" A análise por Northern "blot" (FIG. 4) da distribuição de ARNm de CNTF em tecidos de ratazana adulta revelou uma única banda com um tamanho de cerca de 1,2 kb. De longe que o sinal mais forte estava presente em manchas (blots) Northern do nervo ciático, estando presente uma banda fraca em extractos da medula espinal. Contudo, não existia sinal detectável em ARNm de músculo e pele, i.e. < 2 pg de ARNm de CNTF em 50 yg de ARN total. Os baixos níveis de ARNm de CNTF no músculo e pele indicam que a grande quantidade de CNTF presente no nervo ciático não representa CNTF transportado no sentido retrógrado a partir, da periferia, como é o caso de NGF, mas representa CNTF sintetizado localmente.

Além disso, o comportamento temporal, no desenvolvimento, da expressão de ARNm de CNTF difere do do NGF (Thoenen et. al. 1987, Biochem. Pharmacol., 109: 145-178). O ARNm de CNTF era indetectavel em nervos ciáticos de ratazanas recém-nascidas, aparecendo apenas no dia 4 (FIG. 4(b)). 0 comportamento temporal, no desenvolvimento, da expressão de ARNm de CNF sugere que o CNTF não está envolvido na regulação da sobrevivência neurónica no período perinatal, uma vez que a morte celular neurónica regulada pelo alvo já terminou no momento em que se inicia o aumento da síntese de CNTF (Oppenheim, 1986, J. Comp. Neurol. 246-281-286; Johnson et al., 1980, Science 210:916-918).

6.3. DISCUSSÃO

Os processos de purificação de CNTF descritos acima proporcionam, pela primeira vez, um meio para produzir CNTF adequado para sequenciação em aminoácidos. Estando ausente o passo final de purificação na coluna Bakerbond Gold C4 Widepore estavam presentes na preparação de CNTF vários péptidos contaminantes, como se mostra na FIG. 2(a). Contudo, a seguir à purificação na coluna de FPLC/HPLC, Bakerbond Gold C4 Widepore, apenas se identificou uma única mancha, por electroforese em gel 2D (FIG. 2(b)), indicando purificação virtualmente completa. Deve notar-se que se usaram várias colunas de HPLC em tentativas

71 505 6526-030-118 -53- infrutíferas para purificar CNTF antes de se verificar que a coluna Bakerbond Gold C4 Widepore era eficaz. Põe-se a hipótese de o carácter inerte do revestimento de ouro facilitar a purificação de CNTF.

Embora a actividade de CNTF fosse originalmente caracterizada como um factor de sobrevivência para neurónios ciliares de pintainho, in vitro, (Ãdler, et al., 1979, Science, 204:1434-15362), mais recentemente, actividades descritas como CNTF, derivadas de tecido quer de pintainho quer de ratazana têm mostrado promover a sobrevivência de vários tipos de células neuronais (Barbin et al., 1984, J. Neurochem., 43:1468-1478;

Manthorpe et al., 1986, Brain Res., 357:282—286) e o CNTF de nervo ciático de ratazana mostrou afectar a diferenciação de neurónios simpáticos de pintainho E7 ao bloquear a sua replicação e ao induzir imunorreactividade do péptido vaso-intestinal (VIP) e actividade da colina-acetiltransferase (ChAT) (Ernsberger et al., 1989, Neuron 2:1275-1284) e em neurónios de gânglios da cadeia simpática de ratazana recém-nascida (Saadat et al., 1989, J. Cell Biol. 108:1807-1816). Além disso, o CNTF de nervo ciático de ratazana purificado promoveu a diferenciação de células progenitoras 02A bipotentes em astrócitos do tipo 2 (Hughes, 1988, Nature 335:70-73) in vitro. Para ajudar a estabelecer quais destas funções, se houver alguma, exerce, in vivo, o CNTF, é necessário determinar a sua estrutura primária, expressão celular, regulação do desenvolvimento e localização. A sequência de aminoácidos deduzida de ÃDNc e expressão subsequente dos clones de ADNc de comprimento total em células HeLa, demonstrou agora que o CNTF é uma proteína citossólica. Este facto, era conjunto com a sua distribuição regional e a sua expressão no desenvolvimento, sugere que o CNTF pode não ser um factor neurotrófico derivado do alvo. 0 CNTF parece, assim, exibir propriedades neurotróficos e de diferenciação somente, depois de se tornar disponível quer por lesão celular quer por um mecanismo(s) de libertação ainda desconhecido(s).

Resumidamente, o CNTF difere dos factores neurotróficos NGF e BDNF conhecidos pela ausência de um mecanismo de libertação

71 505 6526-030-118 -54- constitutívo conhecido, pelo comportamento, no tempo, da sua expressão durante o desenvolvimento e pela sua distribuição regional. É possível que o CNTF tenha um papel fisiológico como factor de diferenciação, exercendo-se a sua função neurotrófica possivelmente, apenas sob condíçóes patofisiológícas e não durante o desenvolvimento embrionário.

7. EXEMPLO: EXPRESSÃO DE CNTF EM ESCHERICIA COLI

7.1. MATERIAIS E MÉTODOS

7.1.1. CONSTRUÇÃO DE UM VECTOR DE EXPRESSÃO DE CNTF 0 gene do CNTF de ratazana (rCNTF) foi inserido no vector de expressão pCP93 usando um iniciador de oligodesoxiribonucleotido sintético, complementar à sequência abarcando a extremidade 5' do gene, e um segundo iniciador, complementar à sequência abarcando a extremidade 3' do gene na cadeia de ADN oposta. Ambos os iniciadores foram concebidos de modo a incluírem a sequência de reconhecimento para a enzima de restrição BspMI e apresentam-se abaixo as suas sequências. 5' CAGTTACCTGCGGGGATGGCTTTCGCAGAGCAAACÃC 3' 5' CAGAGGTATGAGCAGGTGGCTACATCTGCTTATCTTTGG 3'

Estes iniciadores produziram numa reacção em cadeia com polimerase (PCR) Standard usando ADN de pCMV-rCNTF-C-1 como molde e um conjunto comercial, alguns microgramas de um fragmento de 637 pb que foi purificado por electroforese num gel de poliacrilamida a 6%, seguida por electro-eluição. 0 fragmento eluído foi então digerido com BspMI e o fragmento com 619 bp resultante foi novamente purificado pelo mesmo método. Depois de se tornarem rombas as extremidades salientes de BspMI, numa reacção Standard, usando ADN polimerase de Klenow, o fragmento foi ligado no sítio de restrição Sall, único, do vector pCP93 que tinha sido tornado rombo por tratamento com SI nuclease numa reacção Standard.

7.1.2. IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS CONTENDO 0 VECTOR DE EXPRESSÃO DE CNTF Células competentes de E. coli WSllOi^F foram transformadas

71 505 6526-030-118 -55- com este ADN ligado e analisadas, relativamente ao tamanho do plasmídeo, e, subsequentemente, caracterizadas por análise de restrição e sequenciação de ADN usando metodologia Standard (Panayotatos, N., 1987, In Plasmids: A Practical Approach, Hardy, K. G., ed. IRL Press, Oxford).

7.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Verificou-se que um dos plasmídeos (pCP-rCNTF-C-1) tinha o gene de rCNTF completo fundido, na orientação correcta e na estrutura de leitura de tradução, ao sinal de ligação do rihossoma do vector. 0 número de cópias deste plasmídeo foi três vezes maior do que o do progenitor, devido à delecção de 1400 bp do ADN do vector.

Fizeram-se crescer células de E. coli W311GiqF-/rCNTF-C-l em cultura líquida, na presença de lactose (de modo a que a transcrição e tradução activas ocorressem através do gene de rCNTF) e verificou-se que elas continham quantidades significativas (2-5¾ da proteína celular total) de rCNTF biologicamente activo. Isto foi mostrado por electroforese num gradiente de 8-25¾ de geles de poliacrilamida, seguida por coloração com Coomassie, como se mostra na FIG. 4. Em adição, os extractos proteicos foram preparados a partir das mesmas células lisadas por tratamento com lisozima, seguido por três ciclos de congelamento e descongelamento. A proteína extractada por este método, a partir de alguns microlitros .de cultura mostrou promover a sobrevivência e sobre-crescimento de .axonio em, até, 50¾ dos neurónios de gânglio ciliar de ratazana E10 e em aproximadamente 30?á dos neurónios de gânglios da raiz dorsal E8 após 24 e 48 horas jin vitro. A actividade máxima foi observada a menos de 1 nanograma de rCNTF. Não pôde ser observada uma tal actividade em extractos de controlo das mesmas células hospedeiras que têm o vector plasmídico sem o gene de rCNTF. A sequência de CNTF humano, construída de modo a faltar-lhe sequências de intrão, foi inserida no vector pcP93 e usada para transformar Eh. coli competente. As bactérias transformadas possuindo sequências de CNTF humano recombinante mostraram

71 505 6526-030-118 -56-expressar uma proteína com um peso molecular apropriado para o CNTF humano, os extractos proteicos destas culturas mostraram ter actividade ce CNTF no ensaio DRG.

8. EXEMPLO: CLONACÃO DO GENE DE CNTF HUMANO

8.1. MATERIAIS E MÉTODOS

8.1.1. ADN. PLASMíDEQ E VECTORES DE FAGO 0 ADN genómico humano foi obtido de ADN placentário humano (clontech). 0 vector plasmídico pBLUESCRIPT foi obtido em

Stratagene. 0 vector de bacteriófago EMBL-3 SP6/T7 foi obtido na Clontech.

8.1.2. REACÇAO EM CADEIA COM POLIMERASE A PCR foi realizada sob condições padrão como sugerido pelo fabricante de um conjunto reagente (Perkins Elmer/Cetus) durante 40 ciclos, consistindo cada ciclo em incubação durante 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 40° ou a 50°, e 2 minutos a 72°.

8.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO 8.2.1. EVIDÊNCIA SOBRE A EXISTÊNCIA DE UM GENE DE CNTF HUMANO A hibridação por mancha Southern, sob condições restritivas, de ADN genómico humano, digerido com a endonuclease de restrição EcoRI, indicou que um fragmento de ADN simples de aproximadamente 10 kb mostrou pouca homologia com uma sonda de CNTF de ratazana (FIG. 6, painel b). De modo a clonar molecularmente o gene de CNTF humano putativo, têm sido feitos esforços para amplificar segmentos desse gene por reacção em cadeia com polimerase (PCR), usando pares de iniciadores de oligonucleótidos correspondentes às sequências exactas do gene de CNTF de ratazana. Para que esta abordagem tivesse sucesso, seria necessário que dois segmentos curtos dos genes de CNTF humano e de ratazana tivessem uma sequência de ADN idêntica ou praticamente idêntica.

Testaram-se cincò pares de oligonucleótidos, tendo, cada um, um comprimento de 17 a 21 bases, para determinar as suas capacidades de iniciar a síntese amplificada de fragmentos de ADN, por PCR, usando como molde, ADN genómico humano total. Todos 71 505 6526-030-118 -57-

os cinco pares de oligonucleótidos foram escolhidos de entre o segundo exão do gene de CNTF de ratazana. Pôs-se como hipótese que um gene de CNTF humano teria uma estrutura intrão-exão similar à do gene de ratazana. Apenas um par de iniciadores designados por CNTF.10 e CNTF.11, deu amplificação de um fragmento de ADN, de ADN genómico humano, com aproximadamente o mesmo tamanho do que o que seria obtido com os mesmos iniciadores usando um molde de ADN de ratazana (270 bp). Observaram-se um nível de amplificação superior e um "background" menor quando se realizou a PCR com a síntese de ADN a uma temperatura (50°C) mais elevada (mais restritivas). As sequências de CNTF.10 e de CNTF.11 são as seguintes: CNTF.10 (36-mero, anti-sentído para aminoácidos EADGMPA; 2 bases para cada aminoácido terminal; cauda com sítios de clonação múltipla). 51-CCAAGCTTCTAGAATTCGCAGGCATCCCATCAGCCT—31 CNTF.11 (34-mero, sentido para os aminoácidos ΕΜΤΞΑΕ; 2 bases para o aa terminal, A final; sítio de clonação múltipla na extremidade 5' do oligonucleótido). 5'-GACTCGAGTCGACATCGGAGÃTGÃCTGAGGCAGA-3 (As sequências correspondentes ao CNTF ratazana estão sublinhadas; e os nucleótidos adicionais foram adicionados para proporcionar sítios de clonação múltipla para os passos de clonação subsequentes).

Os produtos da reacção PCR foram resolvidos por electroforese num gel de agarose a 2% (temperatura abaixo da de fusão; Nusieve). Ά banda positiva de aproximadamente 270 bp foi retirada exemplificada por PCR usando o mesmo par de iniciadores para 35 ciclos (30 seg a 93°C, 1 minuto a 5Q°C, 1 minuto a 72°C). 0 fragmento de ADN reamplificado foi de novo purificado por electroforese em agarose a 2% e usado como molde para a sequenciação pelo método de terminação' de cadeia com didesoxinucleótido usando um conjunto disponível comercialmente (o "FASTaq" kit de IBI). Os iniciadores para sequenciação foram CNTF.10 e CNTF.11, bem como dois iniciadores internos escolhidos

com base nos dados da sequência inicial obtidos com os iniciadores terminais. A sequência completa do segmento amplificado de ADN humano é .apresentada na FIG. 6. A sequência compreende uma estrutura de leitura aberta para um segmento de um polipéptido muito semelhante mas não idêntico ao CNTF de ratazana.

8.2.2. CLONAÇAO DE UM FRAGMENTO DO GENE DE CNTF HUMANO AMPLIFICADO POR PCR 0 fragmento do gene de CNTF humano amplificado foi subclonado no vector plasmídico pBLUESCRIPT, cortando—o com ECORI e Xhol e ligando-o ao do ADN vector cortado com as mesmas 2 enzimas. 0 ADN foi introduzido em células competentes da estirpe XLl-Blue de E. coli (Stratagene) e seleccionaram-se os transformantes com resistência à ampicilina. 0 ADN do plasmideo foi purificado por métodos Standard, o fragmento de ADN humano inserido foi cortado com EcoRI e Xhol, isolado e marcado, para utilização como sonda de hibridação. A marcação foi realizada usando PCR, usando como molde aproximadamente 20 ng de ADN e como iniciadores os oligonucleótidos CNTF. 10 e CNTF.11, numa mistura reaccional contendo ADN polimerase Taq (Perkin-Elmer/Cetus), dATP, dGTP, dTTP, e 32P-dCTP durante 6 ciclos de 1 minuto 94°, 2 minutos 50°, e 3 minutos 72°. O fragmento marcado foi separado do dCTP não incorporado por métodos cromatogrãficos Standard.

Para determinar se o fragmento do ADN detectado no ADN genómíco humano com a sonda de CNTF de ratazana continha as sequências que poderiam ser amplificadas por PCR com os iniciadores CNTF. 10 e CNTF. 11, usou-se o fragmento humano marcado radioctivamente como sonda na hibridação, em Southern blot, de ADN genómico de ratazana e humano, digerido com EcoRI (FIG. 6, painel a). A sonda hibridou fortemente numa banda de aproximadamente 10 kb, indistinguível da banda hibridada fracamente com uma sonda de CNTF de ratazana. Inversamente a sonda humana hibridou fracamente numa banda de aproximadamente 4 kb em ADN genómico de ratazana, indistinguível da banda hibridada fortemente pela sonda de CNTF de ratazana. Estes resultados,

J 71 505 5526-030-118 -59- adicionais aos dados da sequência, indicam claramente que o ADN humano contém um homólogo do gene de CNTF de ratazana. 8.2.3. CLONAÇAQ DO GENE DE CNTF HUMANO A PARTIR DE UMA BIBLIOTECA GENÓMICA_ A sonda de CNTF humano marcada radioactivamente descrita anteriormente, foi utilizada para analisar uma biblioteca genómica de ADN humano no vector de bacteriófago EMBL-3 SP6/T7. A biblioteca continha fragmentos de ADN placentário humano obtido por uma digestão parcial com endonuclease de restrição Sau3a inseridos no vector num sítio BamHI. Os bacteriófagos foram submetidos a ensaio de placas em E. coli, estirpe LE392, e analisaram-se aproximadamente 750000 placas por hibridação, em duplicado, usando condições essencialmente idênticas às descritas por Benton & Davis (1977, Science 196:180-182) e Mahmoudi e Lin (Mahmoudí, M. & Lin, V. K., 1989, BioTechniques 1:331-333). Foi identificada uma placa positiva e purificou-se o fago recombinante através de três séries de isolamento de placa individual, usando hibridação com a sonda de CNTF humano para identificar positivos. 0 bacteriófago recombinante com o gene de CNTF humano foi designado por AhCNTF-G-l. Preparam-se concentrados para análise posterior por crescimento em cultura líquida usando bactérias LE392, como hospedeiro.

As sequências de CNTF humano presente em AhCNTF-G—1 foram ainda analisadas por amplificação por PCR e por sequenciação de ADN. A amplificação com um par de iniciadores internos para o fragmento humano de 270 bp, originalmente sequenciado (ver acima), foi usada para confirmar que estava presente no clone de fago purificado, o fragmento correcto. Os oligonucleótidos foram designados por CNTF.13 e CNTF.16 (sequências abaixo). Como se esperava, numa reacção PCR usando AhCNTF-G-l como molde e estes iniciadores, foi amplificada uma banda de produto de aproximadamente 128 bp. A PCR foi realizada como anteriormente, mas com 35 ciclos de incubação consistindo em 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 50°C, 2 minutos a 72°C. CNTF.13: 5'-GCAGCGACTTGGAGAAG-3' [anti-sentido] 71 505 6526-030-118 -60-

CNTF.16: 5'-TACCTTCCATGTTTTGTTGG-31 f sentido] (este iniciador também continha uma "cauda" 5' contendo sequências para um sitio de clonação múltipla—aqui mostra-se apenas a porção de CNTF da sequência).

Para determinar se o clone de AhCNTF-G-l continha as extremidades 3' e 5' da sequência de codificação de CNTF, realisaram-se reacções PCR usando iniciadores de sequência exacta (i.e. não degenerados) correspondentes às extremidades da sequência de codificação de CNTF da ratazana. Deve notar-se que a capacidade de amplificar ADN do clone genómico humano indicaria a presença da região correspondente do gene humano, mas que o insucesso na amplificação de ADN poderia resultar da ausência da extremidade da sequência de codificação do clone ou de divergência entre as sequências de ratazana e humana.

Os iniciadores usados para testar a presença da provável extremidade 5' dá sequência de codificação de CNTF humano foram o CNTF. 13 (acima) e o CNTF. 14. 0 último oligonucleótido continha 22 bases correspondentes à extremidade 51 da sequência de codificação de CNTF de ratazana (cadeia de sentido) e tinha também sequências adicionais não relacionadas na extremifdade 5' (não apresentada) contendo múltiplos sitíos de reconhecimento de endonuclease de restrição para facilitar a clonação potencial de fragmentos amplificados. CNTF.14 5' -ATGGCTTTCGCAGAGCAAACAC-3

Com o par de oligonucleótidos CNTF.13 e CNTF.14 foi amplificado um fragmento de aproximadamente 1,4 kb, a partir do molde AhCNTF-G-l. Este é o tamanho que se esperaria ae um gene de CNTF humano contivesse um íntrão com aproximadamenteo mesmo tamanho (aproximadamente 1 kb) do encontrado no gene de CNTF da ratazana.

Um esforço semelhante para amplificar uma região entre uma sequência interna conhecida do gene de CNTF humano e a extremidade 3' da sequência de codificação não foifsucedido. Os iniciadores foram o CNTF.16 (acima) e o CNTF.15, o qual contém a sequência da extremidade 3' da sequência de codificação de

71 505 6526-030-118 -61-ratazana (antl-sentido): CNTF.15 5'CTACATCTGCTTATCTTTGG-3' A análise da sequência foi realizada em porções do gene de CNTF humano clonado e confirmou a similaridade com o gene de CNTF de ratazana, mas revelou algumas substituições de aminoácidos na proteína codificada. Os resultados da análise à sequência de ADN da região de codificação de CNTF humano e a comparação com a sequência de ratazana são apresentadas na FIG. 8. Os dados são consistentes com o facto de o gene humano ter um único intrão na mesma posição do do gene de CNTF de ratazana; existe um longo trecho de identidade da sequência de aminoácidos (ESYVKHQGLNKN) albergando as junções intra-exão. No intrão, as sequências humanas divergiram consideravelmente das da ratazana, em contraste acentuado com a substancial conservação da região de codificação. Existe um trecho no qual cinco de seis aminoácidos diferem entre o CNTF humano e de ratazana (humano: HVLLAR; ratazana: QGMLTK), e outros dois nos quais três, em quatro, aminoácidos diferem (humano: TEHS; ratazana: AEQT, posições 4 a 7; e humano: NNKK; ratazana: KDKQ nas posições 196 a 199; FIG. S(b)) .

9. EXEMPLO: UTILIDADE DOS FRAGMENTOS PEPTíPICOS DERIVADOS DE CNTF

9.1. MATERIAIS E MÉTODOS

9.1.1. SÍNTESE DE PÉPTIDOS

Os péptidos foram sintetizados num sintetizador de péptidos de fase sólida da Applied Biosystems usando a química de f-moc.

9.1.2. CULTURA DE CÉLULAS

As culturas de gânglio ciliar de embrião de pintainho foram criadas e mantidas de acordo com o método estabelecido em (Hughes et al., 1988, Nature 335 : 70-73).

9.1.3. PROTOCOLO DE IMUNIZAÇÃO

Os anticorpos dirigidos ao péptido de CNTF com 14 aminoácidos (SALESHYGÃKDKQ) foram preparados por imunização de coelhos com o péptido conjugado com KLH (hemocianina de lapa do 7l η Ο 5 6526-030-118

-62-género Fissurela). Para que se pudesse realizar o acoplamento a KLH, o péptido com 14 aminoácidos foi estendido C-terminalmente com um residuo Cys. 0 acoplamento de KLH com o péptido foi conseguido usando um excesso de 100 vezes do péptido e MBS (éster de m-maleimidobenzoi1-n-hidroxi-succinimidilo) como agente de acoplamento.

Inoculou-se um coelho com 1 mg de conjugado (péptido-KLH) em adjuvante completo de Freund. Após 3 semanas o coelho recebeu um reforço de mais 1 mg de conjugado em adjuvante incompleto de Freund. Duas semanas mais tarde, o animal recebeu novo reforço. Duas semanas mais tarde o animal foi sangrado e preparou~se o soro. Este soro mostrou imunoprecipitar tanto o imunogénio como o CNTF de nervo ciático de ratazana purificado.

9.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

9.2.1. CAPACIDADE DOS ANTICORPOS DIRIGIDOS A UM PÉPTIDO SINTÉTICO NEUTRALIZAREM A ACTIVIDADE DE CNTF

Incubaram-se quantidades saturantes de CNTF com anticorpos, ligados a proteína-A-Sepharose, de soro pré-imune ou de soro imune de um coelho imunizado com o péptido sintético com 14 aminoácidos (I S ALESHYGÃKDKQ). Após incubação e centrifugação, os sobrenadantes foram analisados relativamente à sua capacidade para suportar o crescimento de neurómios de gânglio ciliar de pintainho E8. Observa-se uma resposta normal à dose de CNTF nos sobrenadantes de controlo. Essencialmente não se detectou actividade de CNTF após imunoprecipitação com anticorpos anti-fragmento peptídico de CNTF (FIG. 9).

9.2.2. ACTIVIDADE NEUROTRÓFICA DE UM FRAGMENTO PÉPTIDICQ SINTÉTICO DE CNTF

Cultívaram-se neurónios de gângl io=.ciliar de embrião de pintainho E8 durante dois dias na presença de uma gama de concentrações do fragmento peptídico sintético com 28 aminoácidos, derivado de dados de sequência de CNTF iniciais e quantificou-se a sobrevivência neurónica. Observou-se a relação dose-resposta entre a concentração peptídica e a actividade neurotrófica (FIG. 10). A sequência do péptido usada

J 71 505 6526-030-118 -63-

foi MVLLEQKIPENEADGMPATVGDGGLFEK.

9.2.3. CAPACIDADE DOS ANTICORPOS DIRIGIDOS A UM PÉPTIDO SINTÉTICO IDENTIFICAREM CÉLULAS CONTENDO CNTF

Os anticorpos dirigidos ao péptido com 28 aminoácidos foram usados em estudos de imunofluorescência de tecido de nervo ciático de ratazana. Incubaram-se anticorpos de coelho dirigidos ao péptido com 28 aminoácidos com secções fixadas de nervo ciático de ratazana e as secções de nervo foram subsequentemente reagidas com anticorpos IgG anti-coelho marcados com rodamina. Como se mostra na FIG. 11, observou-se coloração periaxónica sugerindo que o CNTF pode ser sintetizado por células Schwann. Em adição, foram visualizadas estruturas presentes no citoplasma axónico (FIG. 11, seta pequena), o que é consistente com sintese axónica ou transporte de CNTF para os axónios. A marcação poderia ser bloqueada pela adição de péptido de CNTF em excesso (Μ V L L EQKIPENEADGMPATVGDGGLFEK).

10. EXEMPLO: 0 FÃCTOR NEUROTRÓFICO CILIAR PROMOVE A SOBREVIVÊNCIA DE NEURÓNIOS DA ESPINAL MEDULA

10.1. MATERIAIS E MÉTODOS

10.1.1. ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Em todas as experiências usaram-se ratazanas Sprague-Dawley (HSD). As ratazanas grávidas foram sacrificadas por asfixia com dióxido de'carbono e os embriões foram rapidamente removidos e colocados em solução salina G de Puck gelada para dissecção posterior.

10.1.2. TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDO

Removeram-se assepticamente as espinais medulas de embriões de ratazana no 14Ω dia de gestação Ά espinal medula foi cortada da cauda ao bulbo, livre de gânglios sensoriais e meninges. A medula foi então subdividida em segmentos ventral e mediodorsal para culturas separadas. Os tecidos da medula foram cominuídos em pedaços pequenos e dissociados mecanicamente por trituração através de uma pipeta de Pasteur, em meio de cultura definido consistindo um meio basal de Eagle a 50¾ (BME; Gibco) e mistura

J

71 505 6526-030-118 -64- nutriente de Ham F12 a 50¾ (Gibco) suplementado com glucose (33 mM), glutamina (2 mM) NaHCOg (15 mM), HEPES (10 mM) , insulina (25 ug/ml), transferrina (100 ug/ml) putrescina (60 uM) , progesterona (20 nM) selenite de Na (30 nM) , penicilina G (0,5 ug/ml), estreptomícina (0,5 ug/ml), e albumina de soro bovino (2,5 ug/ml). A trituração foi repetida duas vezes e os sobrenadantes foram reunidos e filtrados através de um filtro (40 um) de nylon (Nitex, Tetko). 0 número total de células obtidas foi determinado por contagem hemocitométrica na presença de azul de tripano. As células ventrais dissociadas foram então revestidas a uma densidade de 0,5 milhões de células/placa de 35 mm revestida com poli-D-lisina (10 ug/ml). As células mediodorsais dissociadas foram revestidas a uma densidade de 1,5 milhões (placa de 35 mm revestida com poli-D-lisina (10 ug/ml),poli-L-ornitina (10 ug/ml) ou poli-L-ornitina com laminina (5 ug/ml). Os tratamentos destas culturas foram adicionadas na altura do revestimenmto. As culturas foram mantidas a 37"C numa atmosfera de 95¾ de ar/5% de CO2 a uma humidade relativa de aproximadamente 100¾. 0 meio de cultura foi mudado de três em três a quatro em quatro dias. Numa semana,estas culturas continham principalmente neurónios (corados com anticorpo monoclonal de neurofilamento RT97; Wood e Anderton, 1981, Biosci. Rep. .1:263-268) apenas com poucos astrócitos (corados com anticorpos para proteína ácida fibrilar glial; Bignami e Dahl, 1973, Brain Res. 49:393-402) como se demonstrou com imunocitoquímica. 10.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO 10.2.1. EFEITOS DO FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR (CNTF) SOBRE OS NEURÓNIOS DA ESPINAL MEDULA MEDIQDORSAL (MD)

As culturas mediodorsais (MD) não sobreviveram em meio definido depois das primeiras 48-72 horas. As células começaram a formar aglomerados e eventualmente destacaram-se do substrato. Contudo, após um tratamento com CNTF (20 ng de CNTF recombinante de ratazana em 2 ul de extracto E. coli por ml de cultura) na altura do revestimento, os neurónios MD mostraram uma sobrevivência aumentada, em 48 horas; elas estavam bem ligadas ao substrato e axonios extenso.s (FIG. 12). A diferença não era

J provavelmente resultado do grau de - ligação V celular, uma vez que as células das culturas de controlo e tratada com CNTF estavam bem ligadas 3 horas após revestimento. Além disso, substratos diferentes usados deram resultados similares. Assim, isto sugere que o CNTF foi capaz de aumentar a sobrevivência dos neurónios MD nestas culturas. O nível proteico foi também determinado. As culturas tratadas com CNTF continham 6 vezes mais proteína/placa do que o controlo não tratado e as culturas tratadas com NGF (50 ng/ml) (Quadro I). Uma vez que as culturas continham principalmente neurónios, o aumento dos níveis proteicos sugere também um aumento da sobrevivência neurónica. 10.2.2. EFEITOS DO CNTF SOBRE NEURÓNIOS DA ESPINAL MEDULA VENTRAL_

As culturas do segmento da espinal medula ventral estão enriquecidas em neurónios motores somáticos, como foi documentado rigorosamente no trabalho sobre neurónios motores de pintainho embrionário (Dohrman et al. ,· 1986, Dev. Biol. 118:209-221 e ver Examplo 18, infra) e confirmado no presente estudo de neurónios motores de ratazana embrionária por imunocitoquimica- usando anticorpo para colina-acetiltransferase (CAT). Em meio definido, os neurónios ventrais sobreviverão bastante bem mas deterioraram-se após 1 semana, provavelmente devido à falta de factores segregados pelas células gliais (porque estas culturas continham relativamente poucas neuroglias). Na presença do CNTF (2 jul/ml), os neuróios ventrais sobreviveriam para além de 1 semana, com um pequeno aumento nos níveis proteicos e de enzima CAT, quando comparados com os do controlo (Quadro II).

QUADRO I

Trataram-se neurónios mediodorsais com CNTF (2ul/ml), NGF (50 ng/ml) ou não se trataram na altura do revestimento. No dia 7, as culturas foram colhidas para medições de proteína usando o método de Bradford (Bradford, 1976, Anal Biochem. 72:248-254).

J

71 505 6526-030-118 -66- NGF 20

Controlo CNTF ug de placa com proteína 20 120

QUADRO II

Trataram-se neurónios ventrais com CNTF C2jU 1 / /ml), NGF (50 ng/ml) ou não se trataram, na altura do revestimento. No dia 7, as culturas foram colhidas para determinação do nível da enzima CAT (Hartika e Hefti, 1388, J. Neurosci. 8:2967:2985) e medições das proteínas.

Proteína Actividade de CAT ucr/placa_CPM/placa_

Controlo 33 590 26,52 CNTF 45 959,5 ± 24,32 NGF 38 621,25 + 33,59

11. EXEMPLO: 0 CNTF DE NERVO CIÁTICO DE RATAZANA PURIFICADO EVITA A MORTE CELULAR INDUZIDA POR LESÃO DE NEURÓNIOS MOTORES DO NERVO FACIAL (VIIg NERVO CRANIANO) DA RATAZANA RECÉM-NASCIDA

11.1. MATERIAIS E MÉTODOS

Os nervos faciais de crias de ratazana recém-nascidas foram seccionadas unilateralmente e colocaram-se nos sítios da lesão pequenos implantes de espuma de gel contendo 5 ug de albumina de soro bovino ou 5 ug de CNTF. Um grupo de aminas lesionados que não recebeu implantes de espuma de gel foi usado como cotrolo. Após uma semana os animais foram sacrificados e foram feitas secções dos seus pedúnculos cerebrais, contendo um núcleo do nervo facial do mesmo lado do nervo lesionado (ipsilateral ao da lesão) e um núcleo de nervo facial no lado oposto ao da lesão (contralateral à lesão). 0 núcleo facial contralateral serviu como controlo interno. As secções do núcleo facial foram coradas com corpos de Nissl (para corar neurónios motores) ou com anticorpo para proteína ácida fibrilar glial (para detectar a resposta das células gliais à lesão).

J 71 505 6526-030-118 71 505

-67-11.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Como se mostra nas FIG. 13A e 33, a lesão do nervo facial e a colocação de um implante de espuma de gel contendo BSÂ teve como resultado um decréscimo do número de neurónios motores; além disso, os neurónios motores restantes apareceram condensados e encolhidos. Contudo, a lesão do nervo facial e a colocação de um implante de espuma de gel contendo CNTF parecia estar associada a uma sobrevivência dos neurónios motores substancialmente maior FIG. 14A e B); os neurónios motores da FIG. 14A parecem ser mais parecidos com os neurónios motores saudáveis do lado não lesionado (FIG. 14B) do que os neurónios motores em degeneração encolhidos da FIG. 13A. Além disso, observou-se que o afecto de CNTF se dirigia preferencialmente à promoção da sobrevivência de neurónios motores, e não à prevenção da gliose; observou-se uma quantidade comparável de gliose em núcleos faciais ipsilaterais à lesão do nervo facial em ratazanas tratadas com BSA e tratadas com CNTF (FIG. 13C e 14C). 0 número de neurónios motores nos núcleos faciais de ratazanas não tratadas, tratadas com BSA-espuma de gel e CNTF--espuma de gel foram contados; apresentam-se os resultados no Quadro III.

Nos animais lesionados que não foram tratados ou que foram tratados com espuma de gel + BSA, observou-se uma perda de 90¾ dos neurónios motores ipsilaterais à lesão. Nos animais tratados com um implante de espuma de gel impregnada com CNTF, a reunião dos neurónios motores ipsilateral à lesão foi 70¾ da normal (uma perda de aproxímadamente 30¾)

Em conclusão, a seguir à lesão do nervo facial da retazana recém-nascida, verificou-se que 90¾ dos neurónios motores do núcleo do nervo facial degeneravam numa semana. A aplicação de CNTF ao coto do nervo facial de ratazana recém-nascida reduziu drasticamente a perda de células devida à secção de nervo apresentada na FIG. 14Ά e Quadro III, verificou-se que o CNTF recupera, pelo menos, 60¾ dos neurónios motores do nervo facial 71 505 6526-030-118 -68-

í <f' que normalmente morreriam após axotomia. Demonstra-se assim que o CNTF é um factor de sobrevivência para os neurónios motores in vivo.

QUADRO III

Recuperações com CNTF dos Neurónios Motores do Nervo Facial da Morte Celular Induzida por Axotomia na Ratazana Neonatal

Tratamento

Contagem dos Neurónios Motores Do Núcleo Do Nervo Facial

Lado da LesSo Contralateral (Lado do Controlo)

CONTROLO (Sem Espuma de Gel) 685 2985 330 (530) Espuma de GEL + BSA (5 ug) 775 3360 645 3300 440 (620) 315 (3271) Espuma de GEL + CNTF (5 ug) 2205 3425 3445 1270 2990 3095 (2120) 3490 (3301) 12. EXEMPLO: EXPRESSÃO DE ELEVADO NÍVEL E PURIFICAÇÃO DE FACTORES NEUROTRÓFICOS CILIARES DE RATAZANA E HUMANOS RECOMBINANTES EM ESCHERICHIA COLI_

12.1. MATERIAIS E MÉTODOS 12.1.1. ESTIRPES BACTERIANAS E PLASMÍDEOS A E. coli WSllolaclqF-, uma estirpe que "sobreproduz" o repressor do operão da lactose e os vectores plasmídicos progenitores pCP93, pCPliO, pblkO e phlkl foram usados em estudos

71 505 6526-030-118 anteriores (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357-363; Panayotatos et al., 1989, J. Biol. Chem. 2d4:15066-15069). Os vectores construídos por engenharia genética para expressão de CNTF foram criados como se segue e as suas propriedades relevantes são sumarizadas no Quadro IV. 12.1.1.1. VECTORES DE CNTF DE RATAZANA 12.1.1.1.1. pRPNll

Obteve-se um fragmento de ADN de 622 bp codificando a proteína de CNTF de ratazana completa a partir de um clone de ADNc (Stockli et al., Nature 342:920-923) por reacção em cadeia com polimerase (PCR). Os iniciadores de oligodescxiribonucleótidos sintéticos usados para obter este fragmento foram concebidos para gerar uma extremidade 5' codificando alanina no terminal amino da proteína e para terminar 19 bp para além do codão de terminação TAG na extremidade 3'. 0 vector de expressão pCP93 foi linearizado com Sall, tornado rombo por tratamento com nuclease SI e puri-ficou-se o fragmento de 3920 bp resultante por electroforese em gel de agarose. 0 vector e os fragmentos PCR assim preparados foram ligados e transformados em E. coli W31101acIqF-. Os transformantes foram analisados por tamanho e mapeamento de restrição para se obter o plasmídeo desejado (FIG. 16) e confirmou-se por sequenciaçâo de ADN, que um candidado positivo (pRPNll) tinha o gene de comprimento total, esperado, fundido ao sinal de inicio de tradução, na estrutura de leitura correcta. Contudo, como se discute abaixo, encontrou-se uma mutação de um único pb no gene de CNTF em pRPNll, relativamente ao ADNc original de ratazana, conduzindo à incorporação de asparagina no lugar de tirosina na posição 193 da sequência da proteína. Esta mutação, que deve ter tido origem durante a amplificação por PCR, foi efectuada em todos os outros vectores que têm o gene de CNTF de ratazana. 12.1.1.1.2. pRPN12

Este plasmídeo é idêntico a pRPNll, excepto no que se refere a uma mutação de um único pb na região de controlo de cópias (copl) que aumenta aproximadamente cinco vezes o número de cópias

71 505 6526-030-118 ém células hospedeiras. Ele foi construído substituindo o ADN entre os sítios Eaq I e Pvu I (sentido do relógio) pela mesma sequência de pCPUO (Panayotatos et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:15066-15069). 12.1.1.1.3. pRPN37 A região de ADN entre os dois sítios de restrição Asei albergando o gene da b-lactamase em pRG12 (FIG. 16) foi substituída por um segmento de ADN que confere .resistência a canamicina CkanR). Neste vector, o gene de kanR está sob o controlo transcricional do seu promotor nativo. 12.1.1.1.4. PRPN38

Este plasmídeo é idêntico a pRPN37, com excepção de uma mutação de 4 pares de bases dirigida ao sítio, a qual minimiza a força do promotor de kanR (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357--363).

12.1.1.2. VECT0RE5 DE CNTF HUMANO 12.1.1.2.1. PRPN32

Este plasmídeo é análogo a pRPNll, com excepção de ter o gene humano em vez do de ratazana. Para expressar a proteína de CNTF humano em bactérias foi necesário remover o intrâo que separa as sequências de codificação da' proteína. Isto foi realizado usando PCR para amplificar e. juntar as regiões flanqueadoras do intrão, como se segue. Estabeleceram-se duas reacções (FIG. 17), cada uma com 100 ng de genC.l ADN como molde: uma continha iniciador CNTF.23 1M e iniciador CNTF. 21 10 nM e a outra iniciador CNTF 24 1 ;uM e iniciador CNTF. 22 10 nM. Após 10 ciclos de PCR (constituindo cada ciclo uma incubação durante 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 50°C, 2 minutos a 72“C) as duas amostras foram combinadas e submetidas a outros 25 ciclos no DNA Thermal Cycler. Uma vez que os iniciadores internos CNTF. 21 e CNTF. 22 são completamente complementares um ao outro, os produtos da primeira etapa de reacções PCR podem subsequentemente ser têmperados. Além disso, na reacção da segunda etapa, a presença de concentrações substancialmente mais

J 71 505 5526-030-118 -71 elevadas dos Iniciadores externos CNTF. 23 e CNTF. 24 conduz à sintese. de grandes quantidades do produto de comprimento total desejado. Os iniciadores internos foram escolhidos de modo a ligarem os dois segmentos da região de codificação, conduzindo, assim, à delecção do intrão. Os produtos da reacção PCR final foram analisados por electroforese em gel de agarose e apenas se detectou uma banda principal por coloração com brometo de etídio. 0 tamanho, cerca de 500 bp, e uma sequência de nucleótidos parcial indicaram que esta banda representava uma região de codificação unida (spliced) de CNTF humano. O iniciador externo de 5', CNTF.23, (FIG. 17) foi concebido de modo a gerar uma extremidade romba que codifica alanina no terminal amino da proteína. O iniciador externo de 3', CNTF.24, (FIG. 17) proporcionou um sítio de restrição EagI 12 bp para além da extremidade da sequência de codificação de CNTF. Este iniciador foi também concebido de modo a substituir o codão de terminação de ocorrência natural TAG por TAA que é menos sujeito a "leitura continua" (readthrough) traducional em E. coli. O fragmento de PCR foi submetido a restrição com EagI e o fragmento de 512 bp resultante foi purificado por electroforese em gel de poliacrilamida. O vector de expressão pCP93, que proporciona o codão de início ATG, foi linearizado com Sal I, formado rombo por tratamento com nuclease Sl, digerido com EagI e o fragmento resultante com 3636 bp foi purificado por electroforese em gel de agarose. O vector e os fragmentos de PCR assim preparados foram •ligados e transformados em E. coli . W31QlacIqF-. Os transforman-tes tendo as moléculas desejadas foram identificados por mapeamento de restrição e testados relativamente à presença de uma proteína com o tamanho esperado, após indução. A análise da síntese proteica por electroforese em gel em culturas induzidas de E. coli W31,l01acIqF- transportando um dos plasmídeos candidatos (pRPN32) revelou a presença de uma banda de proteína de PM de aproximadamente 27000 que estava ausente em culturas de controlo, induzidas, de bactérias transportando o vector plasmídico pCP93. Os extractos de proteína rápidos destas culturas revelaram a presença de CNTF biologicamente activo. 71 505

6526-030-118 -72 12.1.1.2.2. PRPN33. pRPN39 e pRPN40

Estes plasmídeos são análogos a pRPN12, pRPN37 e pRPN38, respectivamente, com a excepção de estar presente o gene de CNTF humano em vez do gene de CNTF de ratazana, e foram construídos da mesma forma usando pRPN32 como plasmídeo progenitor. A região de controlo de cópias entre os sítios EagI e Pvul (sentido directo) em pRPN32 foi substituído pela mesma sequência de pCPUO para criar pRPN33. Em seguida, a região de codificação de 3—lactamase, entre os sítios de restrição Asei em pRPN33 foi substituída pela região kanR mutada de pblkl (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357--363) para criar pRPN40. Finalmente, a região entre os sítios de. restrição Ndel e BglII de pRPN40 e pblkO (Panayotatos, N., 1988,

Gene 74:357-363) foi mudada para criar pRPN39, no qual o gene KanR está sob o seu promotor do tipo selvagem.

12.1.2. INDUÇÃO DA SÍNTESE PROTEICA

As células foram agitadas em caldo LB a 37”C à DOggg = 1.

Adicionou-se lactose até a uma concentração final de 1 5ó e u incubação continuou durante 16 a 20 horas.

12.1.3. EXTRACÇAO "RAPIDA" DA PROTEÍNA

Prepararam-se amostras para electroforese ern gel ressuspendendo pelotas de células de 0,5 ml de cultura , DOggg = 2, em 0,16 ml de tampão de lise (TrisHCl 100 mM, glicerol a 10¾., dodecilsulfato de sódio a 4%, ditiotreitol 1 mM, azul de bromofenol 0,5 mg/ml, pH 6,8 e fervendo durante 5 minutos.

Extracção Selectiva / Solubi 1 ização- — Usou-se o método inicialmente descrito para o interferão a2 de leucócito humano recombinante (Thatcher, D. e Panayotatos, N., 1986, Methods

Enzymol. 119:166-177), modificado como se segue. As células das culturas induzidas foram ressuspensas e armazenadas a uma temperatura inferior a -20°C. A seguir ao tratamento com lisozima, a suspensão viscosa foi passada através de uma Prensa Francesa (SLM-A icon) a 8000 psi, centrifugada a 11000 x g e a pelota foi processada (Thatcher, D. e Panayotatos, N., 1986,

Methods Enzymol, 119:166—177). Após diálise exaustiva do material

J 71 505 6526-030-118 solubilizado por cloreto de guanldínío 8 M contra Tampão D (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 5 mM, ditiotreitol 0,1 mM) e centrifugação a 11000 x g, o sobrenadante claro foi passado assepticamente através de um filtro Millipore Sterifil D-GV.

12.1.4. CROMÃTOGRAFIA O filtrado foi ajustado a NaCl 25 mM e aplicado a uma taxa de 0,5 ml/min a uma coluna DEAE Sephacel com 5X10 cm (Pharmacia), equilibrada com Tampão E (Tris HC1 20 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM, ditiotreitol 0,1 mM, NaCl 25 mM). A coluna foi lavada com um volume de leito do mesmo tampão e eluída com três volumes de leito de um gradiente linear 25-500 mM de NaCl no mesmo tampão. 0 CNTF recombinante de ratazana eluiu a 250-350 mM de NaCl, enquanto que o CNTF humano eluiu a 50-100 mM.

Para o CNTF de ratazana, as fracções de pico reunidas foram dialisadas contra tampão E, esterilizadas por filtração e armazenadas a -70“C.

Para o CNTF humano, as fracç5es de pico reunidas da coluna DEAE Sephacel foram ajustadas a MES 40 mM (Boehringer) pH 6,0, EDTA 0,1 mM, ditiotreitol 0,1 mM (tampão G), passadas através de um filtro Millex GF de 0,22 um e aplicadas a uma coluna Fast-S de 5x10 cm (Pharmacia) a 1,0 ml/h. Após lavagem com dois volumes de leito de tampão G contendo NaCl 250 mM, aplicaram-se três volumes de leito de um gradiente de 250-1000 mM de NaCl em tampão G. O CNTF humano eluiu a cerca de 600 mM de NaCl. As fracções de pico foram dialisadas contra tampão E, esterilizadas por filtração e armazenadas a -70 ° C.

12.1.5. ANALISE PEPTÍDICA 12.1.5.1. CNTF DE RATAZANA 0 CNTF recombinante de ratazana (50 ug) foi submetido a clivagem por BrCN como dscrito (Stockli et al., Nature 342:920--923). Os péptidos resultantes foram separados por HPLC de fase inversa usando RP C4, e o padrão cromatográfico foi comparado com o do CNTF de nervo ciático de ratazana clivado com BrCN. 0 péptido anteriormante identificado como o mais C-terminal foi 71 505 6526-030-118 -74-

submetido a análise de aminoácidos. Em adição, o péptido N--terminal foi identificado e submetido a análise de aminoácidos.

12.1.5.2. CNTF HUMANO 0 CNTF recombinante humano (400 pícomoles) em 1,5 ml de TFA a 0,1%/acetonitrilo a 50¾ foi concentrado num Speedvac até um volume final de 300 jul. A amostra foi carregada numa minicoluna (Vydac C-4, 214 TPB, 300 A, 10 um), lavada duas vezes com TFA a 0,l?ó/acetonítrilo a 10?á, e eluída com TFA a 0,1%/acetonitrilo a 70¾. 0 eluído foi concentrado no Speedvac até aproximadamente 10 U1. A clivagem C-terminal foi realizada com 2¾ de Carboxipeptidase Y e P (Boehringer Manheim, grau de sequenciação) num volume total de 20 μ1 a 33“C a pH 3,79, 5,0 e 6,12, ajustado por adição de citrato de sódio (concentração final de 0,025 a 0,05 M) . A intervalos entre .10 e 65 minutos de incubação, adicionaram-se' 3 μΐ de ácido fórmico a 99¾ e 200 pmol de aminoetanol (usado como padrão interno) e aplicou-se a amostra à minicoluna como se descreveu anteriormente. Os aminoácidos clivados foram eluídos e a coluna foi lavada duas vezes com TFA a Ql^/acetonitrilo a 10¾. Os aminoácidos foram secos e analisados após derivação com 0-fta1-díaldeído. O CNTF foi eluído da coluna com TFA a 0, l^acetonitrilo a 70¾. concentrado até 10 ul e a clivagem foi repetida.

12.1.6. ACTIVIDADE BIOLÓGICA

A actividade biológica do CNTF recombinante foi ensaiada em explantes de gânglios da raiz dorsal de embrião de pintainho (DRG) e em culturas dissociadas de neurónios de gânglio ciliar (CG) como descrito em Lindsay e Rohrer (1985, Devei. Biol 112:30-48). Resumidamente, os DRG foram dissecados de embriões de pintainho com 10 dias de incubação (E10) e 5-6 gânglios foram explantados em 1 ml de uma matriz de gel de colagénio em placas de cultura de tecido de 35 mm. Depois do gel ter endurecido, adicionou-se 1 ml de meio de crescimento de cultura de tecido F14 (Imperial Labs., R.U.) suplementado com 5¾ de soro de cavalo inactivado pelo calor (GIBCO), antes de se adicionar CNTF humano (1-20 μ 1) até uma concentração final de 100 pg a 100 ng/ml. Os CG

J 71 505 6526-030-118 foram dissecados a partir de embriões de pintainho E8 e incubados durante 30 min em tripsina a 0,25¾ (Worthington) em solução salina tamponada com fosfato, isenta de magnésio e.isenta de cálcio. Os gânglios foram então lavados três vezes em meio F14 contendo 5¾ de soro de cavalo, antes de serem dis_sociados numa suspensão de uma única célula por trituração/c£ovesfuro de uma pipeta de Pasteur. 0 enriquecimento em neurónios de CG foi conseguido revestindo com a suspensão celular, durante 3,5 h, uma placa de 60 mm, durante as quais as células não neurónicas (fibroblastos e células de Schwann) se ligam firmemente ao plástico enquanto os neurónios da fase brilhante permanecem em suspensão. Os neurónios purificados foram revestidos em placas de cultura de 35 mm cobertas com poliornitina—lamínina a 8000-10000 neurónios/placa. Em culturas, de explantes a actividade de CNTF foi determinada estimando a extensão do sobrecrescimento de fibra em culturas tratadas quando comparadas com os controlos. O sobrecrescimento de fibra foi avaliado numa escala de 0 a 5+, comparando culturas com fotografias de uma resposta à dose de DRG e . NGF explantado. Em culturas de neurónios de CG dissociado, a actividade de CNTF foi determinada por contagem, a 48 horas, da percentagem de neurónios com processos em culturas de controlo e tratadas com CNTF. Em todos os casos, os resultados derivaram de culturas em triplicado.

12.1.7. OUTROS MÉTODOS

As condições para as reacções enzimáticas, a electroforese de ADN e outras técnicas usadas nestes estudos foram descritas em detalhe em (Panayotatos, N., 1987, In K.G. Hardy (Ed.), Plasmids: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, R.U., pp. 63-176). A sequenciação de ADN foi realizada com um conjunto Sequenase Versão 2.0 (USB Corporation) usando 4 mg de plasmídeo sob a forma de super-hélice como molde.

12.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os estudos anteriores de expressão de proteínas estranhas em E. coli identificaram vários parâmetros que podem contribuir para a expressão a nível elevado e que podem facilitar a recuperação

do ' produto biologicamente activo. Utilizámos vectores de expressão que empregam várias características importantes, incluindo: regulação do promotor lacUV5 pelo repressor do operão da lactose; um sitio de ligação ao ribossoma forte de um bacteriófago T7; uma mutação na região de controlo de replicação do plasmídeo para aumentar o número de cópias; e uma mutação para limitar a expressão da proteína de resistência a antibiótico. Explorámos específicamente os efeitos das duas últimas características na produção de CNTF em E. coli.

12.2.1. EXPRESSÃO DE CNTF DE RATAZANA

12.2.1.1. EFEITO DO NÚMERO DE CÓPIAS A análise da síntese proteica em culturas, induzidas por lactose, de E. coli \ W3l01acIqF-/pRPNll por electroforese em gel revelou a expressão relativamente fraca de um polipéptido de aproximadamente 24.000 kDa, o tamanho previsto para o CNTF de ratazana, que estava ausente em culturas de controlo de bactérias transportando o vector pCP93 (FIG. 18). Os extractos de células transportando pRPNll também continham níveis significativos de actividade de CNTF. Notavelmente, em culturas* induzidas de E. coli . W3101acIqF-/RPN12, que difere de pRPNll apenas na presença da mutação do número de cópias Copl, a produção de CNTF foi aumentada para aproximadamente 30-50¾ da proteína celular total (FIG. 18). Assim, o aumento quíntuplo do número de cópias de pRPN12, em relação a pRPNll resultou num aumento de 30 a 50 vezes nos níveis de proteína recombinante (Quadro IV). Este efeito da mutação copl foi documentado com outras proteínas recombinantes (Buell, G. e Panayotatos, N. 1987. Em "From Gene to Protein: Steps Dictating the Maximal Leveis of Gene Expression", Reznikoff, W.S. e Gold, L. eds Butterworths, Stoneham, Mass.).

12.2.1.2 EFEITO DA RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICO

Em estudos anteriores sobre a expressão de proteínas recombinantes em E. coli, observou-se que a síntese da proteína de resistência a antibiótico codificada pelo vector interferia na produção óptima da proteína recombinante. Esta interferência foi atribuída à competição entre os dois genes pela maquinaria

71 505 6526-030-118 -77- sintética limitada da célula (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357—363). Para testar ainda mais esta hipótese, e para melhorar potencialmente, os níveis de produção de CNTF, o gene de B-lactamase em pRPN12 foi substituído pelo gene de resistência à canamicina (kanR) sob o controlo transcricional do seu promotor nativo (pRPN37) ou sob o controlo de um promotor de mutante mais fraco (pRPN38). A análise dos níveis de proteína em células induzidas, hospedando pRPN37, indicou que o CNTF de ratazana constituía 10 a 20¾ da proteína celular total e que a proteína kanR foi sintetizada a aproximadamente metade desse nível. Em contraste, em células hospedando pRPN38, que porta o promotor do mutante kanR, o CNTF constituía 50 a 70¾ da proteína celular total, enquanto que a proteína de kanR era indetectável (FIG. 18 e Quadro IV). A expressão de CNTF significativamente maior observada com pRPN38 resulta presumivelmente, directamente da diminuição do nível de expressão do gene de resistência a antibiótico. Como se observou e discutiu com outras proteínas recombinantes expressas, com estes vectores, a níveis elevados (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357-363), minimizando—se a força do promotor de kanR minimiza-se a competição pela capacidade sintética aparentemente limitada da célula.

12.2.2. EXPRESSÃO DE CNTF HUMANO 0s níveis relativos da expressão de CNTF humano obtidos com vários vectores são apresentados na FIG. 18 e estão sumarizados no Quadro IV. Os níveis máximos com cada vector foram inferiores aos níveis observados para os vectores análogos transportando o gene de ratazana, mas o padrão global foi o mesmo; um aumento de 30 a 50 vezes foi de novo observado com os plasmídeos de número de cópias (copl) superior e os níveis máximos foram de novo obtidos com a combinação de número de cópias elevado e baixa expresão de resistência à canamicina. Para a expressão de CNTF humano, o efeito de kanR reduzido (pRPN39 vs pRPN40) é ligeiramente menos notável do que o efeito na expressão de CNTF de ratazana (pRPN37 vs pRPN38). Isto era esperado, uma vez que

J 71 505 6526-030-118 -78- a competição entre as duas unidades de transcrição apenas se torna evidente quando a maquinaria sintética da célula se torna limitada, i.e. a níveis extremamente elevados de proteína recom-binante. O nível de produção de CNTF de ratazana em E. coli aqui relatado é excepcionalmente elevado. Isto resulta, aparentemente, de uma combinação favorável de vários factores , incluindo o uso de um promotor moderadamente forte, um sinal de início de tradução no ribossoma forte, um plasmídeo vector que seja mantido estavelmente a um número de cópias relativamente elevado e a síntese mínima da proteína selectiva de resistência a antibióticos. Em adição, a produção de proteína recombinante é determinada pelas propriedades físicas da própria proteína e pela sua estabilidade no hospedeiro. Relativamente a este aspecto, o CNTF de ratazana parece ser particularmente acessível à expressão em E. coli. 0 CNTF humano também é expresso muito eficientemente, embora a níveis ligeiramente mais baixos.

12.2.3 PURIFICAÇÃO DE CNTF DE RATAZANA E HUMANO 0 CNTF, tal como outras proteínas recombínantes expressas a níveis elevados em E. coli, foi encontrado principalmente em corpos de inclusão insolúveis; 85 a 90¾ da proteína de ratazana e 60 a 70¾ da proteína humana foram resistentes à extracção com tampão neutro. A extracção e solubi1ização de CNTF e de outras proteínas (principalmente hidrofóbicas) retidas em corpos de inclusão foram efectuadas com cloreto de guanidínio 8 Μ. A subsequente remoção lenta do guanidínio por diálise conduz h precipitação das proteínas hidrofóbicas hospedadas e deixa na solução CNTF de ratazana com uma pureza maior do que 95¾ e CNTF humano com uma pureza maior do que 90¾ (FIG. 19). Neste ponto, um único passo de cromatografia (DEAE Sephacel) foi suficiente para purificar CNTF recombinante de ratazana a um grau superior a 99%, como se determinou a partir das intensidades relativas de geles de poliacrilamida intensionalmente sobrecarregados (FIG. 19A) e por análise por HPLC. Em parte por causa da afinidade mais fraca da proteína humana com DEAE Sephacel, foi necessário adicionar um segundo passo de cromatografia (Fast S) para se conseguir uma

J 71 505 6526-030-118 -79- pureza superior a 99¾ (FIG. 19B).

12.2.3.1 RENDIMENTO

Dado os níveis de expressão estimados e assumindo que o teor total em proteína da pelota celular húmida é de 5 a 15¾ de proteína em peso, o rendimento teórico seria de 30 a 90 mg de CNTF de ratazana e 15 a 45 mg de CNTF humano por grama de pelota celular húmida. 0 rendimento real mostrou ser de cerca de 20 mg para o CNTF de ratazana e cerca de 6 mg para CNTF humano. A maior parte da perda, no caso da proteína humana, é devida a CNTF "solúvel" extractado e descarregado durante a preparação dos corpos de inclusão.

12.2.3.2 CARACTERIZACAO 0 CNTF recombinante, tanto de ratazana como humano, preparado pelos procedimentos anteriores tinha uma pureza superior a 99¾. As proteínas tinham uma pirogenicidade muito baixa (.15 ng/ /mg de proteína) pelo teste Limulus Amebocyte Lysate (Associates of Cape Cod). Além disso, como se discutiu anteriormente, verificou-se que elas eram biologicamente activas ao nível picomolar.

As proteínas de CNTF recombinantes de ratazana e humana foram tratadas com BrCN e os péptidos N-terminal e C-terminal foram identificados e submetidos a análise de composição e/ou de sequência de aminoácidos. As análises dos péptidos N-terminais revelaram que em ambas as proteínas de ratazana e humana o ami-noácido N-terminal foi recuperado quantitativamente como alanina. Isto implica que a metionina iniciadora foi removida quantitativamente, como acontece geralmente em E. coli quando o segundo resíduo é o aminoácido não volumoso alanina. Pelo contrário, o terminal N do CNTF purificado de nervo ciático de ratazana foi bloqueado, e presumivelmente retém o resíduo terminal metionina.

Na extremidade carboxilo, foi obtida a sequência esperada do péptido terminal BrCN para o CNTF recombinante humano. Pelo contrário, a análise da composição em aminoácidos do péptido C-terminal de CNTF de ratazana indicou que, embora ele tivesse a composição esperada, faltava-lhe um resíduo tirosina esperado e tinha uma asparagina extra. A análise da sequência de ADN revelou

J

1 b05 6526-030-118 -80- uma mutação pontual, provocando a substituição de uma TÍirosrna por uma asparagina, no codão 193; isto surgiu, aparentemente, durante a cópia de um ADNc de CNTF de ratazana clonado, por PCR para construir o vector de expressão original pRPNll. Estabelecemos que a mutação se encontra numa região de CNTF não essencial para a actividade biológica. 0 CNTF de ratazana e humano têm o mesmo número de aminoáci-dos (PM calculado 22 780 e 22 700, respectivamente, após remoção da metionina N-terminal) e partilham partes extensas das suas sequências. No entanto, tanto em geles SDS-poliacrilamida redutores como não redutores, o CNTF humano migra um tanto mais lentamente do que o CNTF de ratazana (FIG. 19). Esta diferença na mobilidade entre duas moléculas semelhantes em estrutura e idênticas em comprimento reflete provavelmente algum constrangimento estrutural inusual na proteína humana.

12.2.4 ACTIVIDADE BIOLÓGICA 0 CNTF recombinante de ratazana purificado pelo procedimento anterior era completamente activo. A FIG. 20 mostra as curvas dose-resposta de culturas enriquecidas em neurónios, dissociadas, de gânglios de embrião de pintainho E8, obtidas com CNTF purificado de nervo ciático de ratazana (Stockli et al., Nature 342:920-923) e com CNTF recombinante de ratazana. A acitividade da proteína purificada a partir de nervo ciático era detectável a 5 pg/ml e a sobrevivência neuronal máxima foi observada a 1 - 2 ng/ml· (EC50 = 80 pg/ml). Em alguns ensaios, verificou-se que o CNTF recombinante de ratazana purificado era activo a 2 pg/ml e a saturação foi observada a 0,5 - 1,0 ng/ml (EC^q = 35 pg/ml ou 1,5 pM). Assim, o CNTF recombinante de ratazana purificado era, pelo menos, tão activo como a proteína nactiva purificada a partir do nervo ciático.

Em experiências paralelas, o CNTF recombinante humano purificado foi analisado relativamente à actividade biológica. Inicialmente, foram usados explantes de DRG de pintainho embrionário no dia 10 (E10) para detecção rápida e semi-quantitativa da actividade de CNTF em lisados de E. coli. Na presença de CNTF,

71 505 6526-030-118 81- observou-se um sobrecrescimento de fibras, enquanto que na ausência de factor neurotrófico exógeno não houve sobrecrescimento ou houve um pequeno sobrecrescimento dos gânglios de controlo (FIG. 21A, B). 0 sobrecrescimento máximo de fibras a níveis saturantes de CNTF foi de cerca de 50-75¾ do observado a níveis saturantes de NGF.

Um ensaio mais específico mede a sobrevivência neurónica em culturas dissociadas enriquecidas em neurónios- de gânglios ciliares de pintainho E8. Após 48h em culturas de controlo, quase todos os neurónios se tinham degenerado (FIG. 21C), enquanto que, pelo menos, 60-70¾ dos neurónios depositados na presença de níveis saturantes de CNTF sobreviveram e elaboraram longas neu-rites (FIG. 21D, E). Estes efeitos específicos nos neurónios ciliares foram observados com quantidades de sub-nanogramas de lisados de células bacterianas em bruto e com proteína recombi-nante purificada. A partir destas experiências conduzidas com quantidades crescentes de proteína pura determinou-se que o CNTF humano recombinante era tão activo como CNTF de ratazana em relação aos neurónios ciliares d-e pintainho. A expressão e purificação de CNTF descritas aqui podem ser facilmente extrapoladas para a produção farmacêutica. Isto pode ser significativo, à luz da demonstração recente de que o CNTF pode promover a sobrevivência de neurónios motores danificados em animais experimentais (Sendtner et al.,1990, Nature 345:440-441). (SEGUE QUADRO IV)

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QUADRO IV

Plasmídeos Característi-cas comuns* Característi-cas especiais* CNTF * * Amp ou KanR** pRPNll 1ac.rbs1.ratCNTF amp. copt 1-2 <0,5 pRPN12 1! amp.copl 30-50 1-2 pRPN37 II KanO.copl 5-10 5-10 pRPN38 II Kanl.copl 50-70 <0,1 pRPN32 1ac.rbs1.humCNTF amp.copt 1-2 <0,5 pRPN33 II amp.copl 10-20 1-2 pNPN39 tl kanO.copl 15-25 5-10 pRPN40 II kanl.copl 25-35 <0,1 lac: promotor lacUV5; rbsl: sítio de ligação ao ribossoma; ratCNTF, humCNTF: gene de CNTF de ratazana ou humano; amp: gene de resistência à ampicilina; kanO, kanl: genes kanR do tipo selvagem ou mutados; cop+, copl: plasmídeo de número de cópias normal ou elevado, em percentagem da proteína celular total

13. EXEMPLO: EFEITOS DA PROTEÍNA DO FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR MODIFICADA E TRUNCADA FEBRE A ACTIVIDADE BIOLÓGICA

13.1 MATERIAIS E MÉTODOS 13.1.1 CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO PROGENITORES A construção por engenharia genética dos vectores de expressão de rCNTF progenitores pRPNll, pRPN37, e pRPN40- são descritas nas secções 12.1.1.1.1., 12.1.1.1.3. e 12.1.1.2.2. 0,5-512- 71 505 6526-030-118

-sa

is. ι. 2. CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE FACTORES NEUROTRóFICO CILIAR HUMANO MODIFICADOS O plasmldeo pRPN108 foi gerado substituindo a sequência de ADN entre os sítios de restrição únicos Aatll e Nhel em pRPN33 com um fragmento transportando exactamente a mesma sequência modificada em duas posições localizadas 15 bp a montante do sítio Nhel. Isto foi conseguido com um oligodesoxiribonucleótido sintético "iniciador de 3'" que abarcava o sitio Nhel e incluía três resíduos que substituíam o codão de cisteína TGT pelo codão GCA para alanina. Este iniciador de 3' foi usado em combinação com um iniciador de 5' albergando o sítio Aatll para se obter a sequência desejada a partir de pRPN33 por reacção em cadeia com poli-merase (PCR). Assim, o pRPNlOS é idêntico ao pRPN33, com excepção do codão alanina para o aminoácido 17 de hCNTF (FIG. 22). 0 plasmídeo pRPN109 foi gerado a partir de pRPN33 exactamente da mesma maneira que o pRPN108, com excepção de o iniciador de 3' que alberga o sítio Nhel incluir dois resíduos que convertem o codão de cisteína TGT no codão ATG para serina. Assim, o pRPN109 é idêntico a pRPN108, com excepção do codão serina para o aminoácido 17 de hCNTF (FIG. 22). O plasmídeo pRPN59 foi gerado por remoção da sequência de ADN entre os sítios de restrição únicos BamHI e NruI em pRPN33. Em pRPN59, a sequência do gene de hCNTF é interrompida a seguir ao 185Q codão, a sequência seguinte codifica 10 aminoácidos adicionais que não correspondem a hCNTF e um codão de terminação de tradução (FIG. 22). O plasmídeo pRPN112 foi gerado no decurso da construção de pRPN40 a partir de pRPN33 (MS2) quando foi invertida a orientação do fragmento de restrição transportando parte do gene de hCNTF entre os sítios Asei. Em pRPN112, o gene de hCNTF é interrompido imediatamente após o 145Q codão e a sequência seguinte introduz dois codões; um para um aminoácido (leucina) não correspondendo a hCNTF e um codão de terminação de tradução (FIG. 22). 0 plasmídeo pRPN82 foi gerado por inserção de um fragmento PCR terminando em sítios BstXl e codificando ‘ os últimos 133 aminoácidos de hCNTF no sítio BstXl de um gene que codifica uma proteína não homóloga a CNTF. Em pRPN82, a proteína de fusão re-

71 505 6526-030-118 84-

sultante consiste nos primeiros 35 aminoàcidos da proteína estranha seguidos por 2 resíduos glicina e 133 resíduos de hCNTF (FIG. 22).

13.1.3. CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE FACTOR NEUROTRÓ-‘ FICO CILIAR DE RATAZANA MODIFICADOS 0 plasmídeo pRPN65 foi gerado por inserção entre os sítios de restrição únicos Saci e Nrul de pRPN12, o fragmento PCR concebido para introduzir um codão de terminação de tradução imediatamente a seguir ao 165Ω codão de rCNTF (FIG. 22). O plasmídeo pRFNHO foi gerado substituindo a sequência de ADN entre os sítios de restrição únicos Nhel e Eagl em pRPN12 por um fragmento transportando exactamente a mesma sequência modificada no único nucleótido que converte o codão tirosina TAT no codão ΑΆΤ para asparagina. Isto é conseguido com um iniciador de 3'que se estende da posição a ser mutada até à extremidade 3' do gene de rCNTF e foi seguido pela sequência reconhecida por Eagl. Este iniciador de 3' foi usado em combinação com um iniciador de 5' albergando o sítio Nhel, para se obter a sequência desejada, a partir de pRPN12, por PCR. Em pRPNHO, o gene de rCNTF codifica uma proteína idêntica à codificada por ADN de ratazana (FIG. 22).

13.1.4. ENSAIO BIOLÓGICO DA ACTIVIDADE DO FACTOR NEUROTRÓFICQ CILIAR A actividade biológica foi ensaiada em neurónios de gânglios da raiz dorsal e/ou ciliares dissociados. A proteína solúvel foi extractada a partir de bactérias induzidas hospedando cada plasmídeo pelo método de extracção "rápida" da proteína descrito na secção 12.1.3.

13.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados dos ensaios relativos à actividade biológica mostraram que as proteínas de hCNTF modificadas, codificadas em pRPN108 e pRPN109, bem como a proteína truncada codificada em pRPN59, eram tão activas quanto a proteína de comprimento total codificada oo plasmídeo progenitor pRPN33. Em contraste, a pro-proteína truncada codificada em pRPN112 era ínactiva.

Estes resultados indicam que o único resíduo cisteína que é

J 71 505 6526-030-118 -85- partilhado pelas sequências de CNTF humano, de ratazana e de coelho na posição 17 pode ser modificado sem perda óbvia de actividade. Similarmente, os últimos 15 aminoácidos de hCNTF não são necessários para a actividade. Em contraste, a remoção dos últimos 55 aminoácidos do terminal carboxilo de hCNTF abole a actividade. Por consequência, uma região crítica do CNTF activo assenta na região entre os aminoácidos 146 e 186.

Os resultados das proteínas de CNTF de ratazana truncadas e modificadas são consistentes com esta interpretação e restringem mais a região crítica para a actividade de CNTF. A remoção dos últimos 35 aminoácidos da proteína codificada por pRPN65 inactiva a proteína, enquanto que a substituição do resíduo tirosina por um resíduo asparagina, na posição 193, não teve efeito sobre a actividade. Estes resultados circunscrevem ainda mais os limites da região crítica para a actividade de CNTF à sequência entre os aminoácidos 166 e 186.

14. EXEMPLO: EFEITOS ADICIONAIS DE CNTF SOBRE NEURÓNIOS DA ESPINAL MEDULA VENTRAL

14.1. MATERIAIS E MÉTODOS

14.1.1. ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Usaram-se ratazanas Sprague-Dawley (HSD ou Zivic-Mi1 ler) em todas as experiências. As ratazanas grávidas (E14) foram sacrificadas como descrito em 10.1.1.

14.1.2. TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS

As espinais medulas foram removidas assepticarnente de embriões de ratazanas como se descreveu em 10.1.2. Os tecidos de medula foram cominuídos em pequenos pedaços e incubados em trip-sina (GIBCO) a 0,1¾ e desoxiribonuclease tipo 1 (Sigma) a 0,01?é, a 37°C durante 20 minutos. A solução de tripsina foi então removida, lavada e substituída por meio consistindo em 45¾ de meio essencial mínimo de Eagle (MEM, 45¾ de mistura nutriente F12 de Ham (F12), 5¾ de soro de vitela fetal (GIBCO), 5¾ de soro de cavalo (GIBCO), glutamina (2mM), penicilina G (0,5 U/ml) e es-treptomicina (0,5/ig/ml) . Dissociou-se mecanicamente duas vezes, por trituração suave, através de uma pipeta, de Pasteur, no mesmo 71 505 6526-030-118 -86-

meio e os sobrenadantes foram reunidos e filtrados através de um filtro de nylon (Nitex, Tetko; 40um) . 0 número total de células produzido foi determinado por contagem com hemocitómetro na presença de azul de tripano. As células ventrais dissociadas foram então depositadas a uma densidade de aproximadamente 50 000 células/cm2 sobre placas revestidas com poli-L-ortinina (10ug/ml) e laminina (5jUg/mI). Os tratamentos foram feitos no dia da deposi. ção, excepto para as experiências de adição retardada, nas quais os tratamentos foram feitos nos dias 2 ou 6. As culturas foram mantidas a 37“C em atmosfera de 95¾ 3^5¾ de CO2 a uma humidade relativa de aproximadamente 100¾. 0 meio de cultura foi mudado de 3 em 3 - 4 em 4 dias. No dia 2 adicionou-se um inibidor mitótico, citosina arabinósido (Ara C; 0,5juM) para reduzir o número de células não neurónicas. No dia 7, as células foram colhidas para medições dos níveis de colina-acetiltransferase (CAT; Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24:407—409) e de proteína (Bradford, 1976, Annal. Biochem. 72:248-254) ou foram fixadas em paraformaldeído a 4¾ para ensaio de NF (Doherty et al., 1984, J. Neurochem 42:1116-1122) e imunocitoquímica. Fizeram-se crescer algumas culturas em meio definido consistindo em 50¾ de F12 e 50¾ de MEM, glutamina (2mM), insulina (5ug/ml), transferrina (100 ug/ml), pro gesterona (20 nM), putrescina (100 iM) e selenite de sódio (30nM) (Bottenstein e Sato, 1979, PNAS 76:514—517). Nestas culturas, o meio contendo soro foi substituído por meio definido, no dia 1. 14.1.3. ENSAIO DE NEUROFILAMENTO (NF)

Após fixação das células em paraformaldeído a 4%, a 4°C durante 2 horas, as culturas foram então permeabilizadas e bloqueadas de acordo com os procedimentos descritos em Doherty et al. (1984, J. Neurochem. 42:1116-1122). A Proteína de neurofila-mento foi detectada usando um anticorpo monoclonal RT97 (Wood e Anderton, 1981, Biosci. Rep. JL:263—268) a uma diluição de 1:1000-0 produto reaccional foi visualizado usando O-fenilenodiamina (OPD) como substrato e mediu-se a densidade óptica a 490nm.

-87- 14.1.4. ENSAIO DE COLINA ACETILTRANSFERASE (CAT)

Colheram-se culturas por lise das células numa solução de Tris-HCl 20mM (pH 8,6) contendo Triton X 100 a 0,1¾. Removeram-se dois microlitros do lísado de células e analisou-se relativamente à actividade de CAT, de acordo com o procedimento de micro-Fonnum (Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24:407-409). A composição final do substrato consistia em [l-^-^C] Acetil-CoA 0,2 mM (NEN, 54,4 mCi/ /mmol), NaCl 300 mM, brometo de colina 8mM, EDTA 20mM e neostig-mina 0,lmM em tampão de NaK^PO^ 50mM (pH 7,4). A estas concentrações de enzima e substrato, a reacção enzimãtica foi linear durante 90-120 minutos. A especificidade da indução para CAT foi testada pela adição de um inibidor específico da actividade de CAT, N-hidroxietil-4-(l-naftilvinil)pirídio (HNP), durante o ensaio (White e Cavailito, 1970, J. Neurochem. 17:1579--1589). 14.1.5. C0L0RAÇA0 HISTOQUíMICA PURA ACETILCOLINA-ESTERASE fÃchE)

As células colinérgicas foram identificadas por coloração histoqulmica para AchE por uma modificação do método de coloração de Geneser-Jensen e Blackstadt (1971, Z. Zellforsch. 114:460-481). A seguir à fixação das culturas em paraformaldeído a 4%, as células foram encubadas 5-6 dias a 4°C, na presença da solução de substrato e AchE composta por: acetiltiocolina de iodo 4mM, sulfato de cobre 2mM, glicina IQmM e lOjUg/nil de gelatina em tampão de acetato 50mM (pH 5,0). A visualização do produto reaccional foi conseguida como anteriormente descrito (Hartikka e Hefti, 1988, J. Neurosei. 8:2967-2985).

14.1.6. FRÃCCIONÃMENTO DAS CÉLULAS DO CORNO VENTRAL POR GRADIENTE DE DENSIDADE DE METRIZAMIDA O procedimento de fraccionamento ÇDohrman et al., 1986, Dev. Biol. 118:209-221) usado foi uma modificação do método descrito por Schnaar and Scaffner (1981, J. Neurosci. 1.:204-207). Dissolveu-se a metrisamida em meio F12:MEM(1:1) e proporcionou-se um gradiente em passos, consistindo em 3 ml de metrizamida a 17%,

71 505 6526-030-118 -88 3 ml de metrizamida a 12¾ e 3 ml de metrizamida 38¾. Os passos seguintes foram todos realizados a 4°C. A suspensão de céluas do corno ventral (2,5 ml), obtida como se descreveu anteriormente, foi colocado em camadas sob o gradiente em passos, o tubo foi centrifugado a 25 OOOxg durante 20 minutos usando um rotor oscilante. Ά centrifugação deu origem a três camadas de células nas interfaces de 0-8¾ (fracçâo I), 8-12¾ (fracção II) e 12-17¾ (fracção III). As células de cada interface foram colhidas num pequeno volume (cerca de 1 ml), depositadas, tratadas e analisadas como se descreveu. Os neurónios da fracção I foram mantidos em meio condicionado derivado de células cultivadas da medula espinal.

14.2. RESULTADOS DA DISCUSSÃO 14.2.1. MORFOLOGIAS GERAIS DAS CULTURAS

As células do corno ventral cultivadas em meio contendo soros deram origem a culturas mistas de neurónios-células gliais. Após 24 horas, a neuróglia nivelou-se e começou a proliferar, enquanto que só alguns neurónios começaram a estender axónios. No entando após 48 horas, muitos neurónios elaboraram axónios e apresentaram um soma característico da fase brilhante (FIG. 23). Após a adição de Ara C, no dia 2, as células não neurónicas começaram a morrer e a sobrenadar, deixando uma cultura rica em neurónios contendo cerca de 5¾ de neuróglia. Em meio definido, as culturas também continham cerca de 5¾ de neuróglia que podia ainda ser reduzida por tratamento com Ara C. Em culturas de neurónios motores do corno, purificados por gradiente de metrizamida (Fracção I), não existia, virtualmente, neuróglia e mais de 90¾ dos neurónios eram neurónios colinérgicos grandes.

14.2.2. EFEITOS DO CNTF SOBRE OS NÍVEIS DE NEUROFILAMENTO (NF)

Para avaliar os efeitos de CNTF sobre neurónios mediram-se os níveis de NF. Verificou-se um aumento de 2,0 vezes no teor em NF nas culturas do corno ventral tratadas com CNTF (10ng/ml), em relação aos dos controlos não tratados. O NGF não produziu

qualquer efeito significativo. (FIG. 24). Isto sugere que o CNTF

J

71 505 6526-030-118 89- promove a sobrevivência e/ou o sobre-crescimento de axónio em neurónios ventrais cultivados.

14.2.3. EFEITOS DE CNTF SOBRE Ã SOBREVIVÊN-CIA DE NEURÓNIOS CONTENDO AchE

Para se determinar se o aumento dos níveis de NF reflecte um aumento da sobrevivência neurónica ou do sobre-crescimento de axónio, efectuou-se a coloração histoquimica para AchE, uma vez que a maioria dos neurónios das culturas do corno ventral são neurónios motores colinérgicos. Verificou-se um aumento de 2,5 vezes dos neurónios positivos a AchE em culturas tratadas com CNTF (lOng/ml); relativamente a controlos não tratados. 0 NGF pareceu ter um efeito pequeno. Estes resultados sugerem que o CNTF facilita a sobrevivência neurónica, facto que pode ser responsável pelo aumento nos níveis de NF.

14.2.4. EFEITOS DE CNTF NA ACTIVIDADE DE CAT

Para avaliar a influência de CNTF sobre a expressão fenotí-pica transmissora determinaram-se os níveis da actividade de CAT. A CAT é enzima limitadora da velocidade na síntese de Ach. Como se mostra na FIG. 26, a adição de CNTF (lOng/ml) produziu um aumento médio de 4,0 vezes na actividade de CAT após 7 dias de cultura, enquanto que a adição de outros factores de crescimento, tal como NGF (50 ng/ml) e FGF (50 ng/ml), não produziu efeito. Este aumento da actividade colinérgica é dependente da dose e atingiu a resposta máxima a concentrações de CNTF de Ing/ml (FIG. 26B). Este aumento tornou-se evidente num prazo tão curto como 3 dias após tratamento e não pareceu ser afectado pela densidade das culturas. Estes resultados sugerem que o CNTF também estimula a expressão transmissora colinérgica, uma vez que o aumento da actividade de CAT é 1,6 vezes superior ao aumento do número de neurónios colinérgicos; isto é, os neurónios colinérgicos sobreviventes expressam mais Ach/neurónio.

14.2.5 EXPERIÊNCIA DE ADIÇAQ RETARDADA

Dividiram-se células do corno ventral em três grupos como se apresenta na FIG. 27. Na FIG. 27A, o CNTF (lOng/ml) foi adicionado a células na altura da deposição e as células foram

71 505 6526-030-118 -90-mantídas na presença de CNTF durante 7 dias. Na FIG. 27B e C, as culturas foram mantidas sem CNTF durante 2 ou 6 dias e, em seguida foram tratadas com CNTF (lOng/ml) durante mais 7 dias. Ά adição retardada de CNTF no dia 2 deu origem a um aumento reduzido da actividade de CAT de 1,2 vezes. Contudo, após 6 dias de ' atraso, o CNTF já não influenciava a actividade de CAT (FIG.27). Isto sugere que existe uma população de neurónios sensíveis a CNTF que normalmente morrem na ausência de CNTF poucos dias depois da deposição. Na presença de CNTF, estas células sobrevivem e expressam uma quantidade aumentada de Ach.

14.2.6. EFEITOS DE CNTF EM CULTURAS DO COR-NO VENTRAL NA AUSÊNCIA DE NEUROGLIA A presença de células gliais em culturas do corno ventral foi reduzida por 2 métodos: a) tratamento com agente antimitótico (AraC; Q,5juM) e (b) uso de meio de crescimento isento de soro. Em qualquer dos casos, as populações gliais foram reduzidas a cerca de 5% das células totais, mas os efeitos de CNTF sobre a actividade de CAT permaneceu inalterada. (FIG. 28). Estes resultados indicam que não e provável que o efeito de CNTF sobre a actividade de CAT seja mediado via neuroglia, mas que é, antes, uma resposta directa dos neurónios.

14.2.7. EFEITOS DE CNTF SOBRE OS NEURÓNIOS MOTORES PURIFICADOS COM GRADIENTE DE METRIZAMIDA

As culturas de corno ventral eram já ricas em neurónios colinérgicos. Para assegurar a homogeneidade das culturas, os neurónios motores foram ainda purificados, a partir das culturas da medula ventral por gradiente de densidade. Um passo de gradiente de metrizamida permite a selecçao dos neurónios motores com base nas suas densidades mais leves de flutuação. As culturas resultantes continham mais de 90¾ de neurónios motores, como tinha sido mostrado anteriormente por Schnaar e Schaffner (1981 J. Neurosci. 1:204-207). Nas culturas de neurónios motores purificado, o CNTF (IQng/ml) estimulou um aumento de 10 vezes da actividade de CAT, relativamente às culturas não tratadas. (FIG. 29) o gradiente de metrizamida é capaz de separar um possível

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conjunto, contaminante, de neurónlos pequenos simpáticos pregan-gliónicos colinérgicos dos neurónios motores grandes. Os resultados demonstram que o CNTF promove a sobrevivência e estimula a expressão colinérgica dos neurónios motores. 15. EXEMPLO: EFEITO DO FACTQR NEUROTRóFICO CILIAR SOBRE CULTURAS HIPOCAMPICAS 15.1 MATERIAIS E MÉTODOS 15.1.1. CULTURAS DE CÉLULAS HIP0CÃMPICA5

Os hipocampos foram dissecados. de embriões de ratazana Ξ18-19 de ratazanas Sprague-Dawiey e colhidos em meio FIO. Os tecidos foram cominuídos, lavados duas vezes com meio FIO (Gibco) e tripsinados com tripsina a 0,25¾ (Gibco) durante 20 minutos a 37°C. A tripsina foi inactivada pela adição de um meio contendo soro, composto por meio essencial mínimo (MEM) suplementado com soro de vitela fetal (FCS, 10¾),glutamina (2mM), penicilina (25U/ /ml) e estreptomicina (25/ig/ml). As células dissociadas obtidas por trituração suave foram colhidas e centrifugadas a baixa velocidade (500 rpm) durante 30 segundos. A centrifugação foi repetida duas vezes e as pelotas de células foram, então, resuspensas em meio contendo soro. Revestiram-se então alvéolos de 6 mm ou placas de 35 mm, que tinham sido cobertas com polior— nitina (lOyg/ml) e laminina (10ug/ml), com as células. Na maior parte das experiências, as células foram depositadas a uma densidade baixa de aproximadamente 71 000 células/cm2, cinco a seis horas depois da deposição das células, o meio foi mudado para meio isento de soro contendo 1¾ de N3 e penicilina-estrepto-micina (25 unidades/ml e 25 yg/ml, respectívamente) e nessa momento adicionou-se CNTF. 0 meio foi mudado de três em três a quatro em quatro dias, com nova adição do factor.

Para se obterem culturas ricas em neurónios, adicionou-se citosina-arabinósido (Ara-C, 0,3 iM) durante um período de 24 horas. Sob estas condições, as culturas hipocâmpicas continham aproximadamente 5-10¾ de células gliais, como determinado por imuno-histoquímica de GFAP.

71 505 6526-030-118 -92- 15.1.2. ENSAIO RELATIVO A ACTIVIDÃDE DA ENZIMA GAP Ã actividade da enzima GAD foi determinada de acordo com o método de Kimura e Kuriyama (1975, Jpn J. Pharm. 25:189-195) medindo a libertação de ^C02 a partir de L-[1--^C]ácido glutâmi-co. As células sobre placas de 35 mm foram Usadas com 30 ul de uma solução contendo KH2P04 50mM (pH 7,2) e triton X-100 a 0,25^ raspadas e colhidas. Analisaram-se cinco microlitros do lisado de células relativamente à actividade da enzima GAD. Num ensaio típico, a mistura reaccional continha 0,57 mM de L-[1-^^C]ácido glutâmíco (NEN, NEC-715, 52,6 mCi/mmol), ácido glutâmico (3 mM), fosfato de piridoxal (0,2 mM) e AET (1 mM), num tampão de KH2P04 (50 mM, pH 7,2). Sob estas condições reaccionais, a reacção enzimática mostrou-se linear durante até 2,5 horas. A incubação continuou durante um período de 2 horas a 37°C e foi terminada por injecção de 25 μ.1 de H2S04 8N na mistura reaccional. A incubação foi em seguida, continuada durante mais 60 minutos. 0 -*-^C02 libertado foi retido em solução básica de Hyamine e foi contado.

15.1.3. MEDIgAQ DA PROTEÍNA DO NEUROF-ILAMENTO

Determinou-se a quantidade de proteína de neurofilamento de acordo com o método de Doherty et al. (1984, J. Neurochem. 42: :1115-1122), como se descreveu na Secção 14.1.3.

15.1.4. MEDIÇÃO DA ABSQRÇAQ DE GABA DE ELEVADA AFINIDADE A absorção de GABA de elevada afinidade foi medida usando um procedimento de Tomozawa e Appel (1986, Brain Res. 399:111-124) modificado. As células foram lavadas no tampão de absorção de GABA contendo NaCl 140 mM, KC1 2,6 mM, KH2P04 1 mM, Na2HP04 1 mM, glucose 6 mg/ml, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA a 0,1¾. A seguir à lavagem, as células foram incubadas com o tampão de absorção de GABA durante 5 minutos a 37"C. Em seguida, adicionou-se 3H-GABA (NEN, NET-191X, 111,4 Cí/mmol) até uma concentração final de 12 nM e realizou-se a incubação a 37°C durante 10 minutos. As células foram, em seguida, mantidas em gelo e lavadas três vezes com o tampão de absorção. As células foram incubadas com NaOH 0,14 N durante 2 horas à temperatura ambiente e o 3H-GABA do extracto foi contado. A absorção de JH-GABA mostrou ser linear durante.

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93-até, pelo menos, 30 minutos. Ά absorção de GABA nas células não neurómicas foi inibida por B-alanina 2 mM extra, enquanto que a absorção específica dos neuróníos foi comprovada por inibição com ácido nipecótico a 1 mM.

15.1.5. COLORACAO IMUNO-HISTOQUfMICA PARA GAP OU GABA

Fixaram-se células com paraformaIdeIdo a 4¾ durante 30 minutos, à temperatura ambiente, e lavaram-se com PBS. Para a coloração relativa GAD, as células foram permeabilisadas por lavagem sequencial com etanol a 50¾. 70¾ e 50¾. As culturas foram bloqueadas por lavagem sequencial com PBS contendo 5¾ de soro normal de coelho, durante uma hora e incubadas com anticorpo 1440 ' de carneiro anti-GAD a uma diluição de 1:6000, durante a noite, a 4°C. Depois de três lavagens com PBS, as células foram então incubadas com anticorpo de coelho anti-carneiro, biotinilado, a uma diluição de 1:400 durante, pelo menos, 90 minutos à temperatura ambiente. Para a coloração relativa^ABA, as células foram permeabi1izadas com Triton X-100 (0,25¾) em Tris-HCl (0,1M, pH 7,3) e bloqueadas com 10¾ de soro normal de cabra durante 90 minutos, antes da incubação com anticorpo de coelho anti-GABA (1:5000) durante a noite a 4°C. Depois de três lavagens com PBS, as células foram então incubadas com anticorpo de cabra anti-co-elho, biotinilado a uma diluição de 1:200 durante pelo menos 90 minutos, à temperatura ambiente. As células imunorreactivas a GAG ou GABA foram visualisadas usando o conjunto Vectastain ABC (Vector Labs). 15.1.6. COLORAÇAO IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA ENOLASE ESPECÍFICA DE NEURÓNÍOS (NSE)

Depois da fixação com paraformaldeído a 4?á, as células foram bloqueadas com 10¾ de soro normal de cabra (NGS) em PBS contendo Triton X-100 (0,1¾). As células foram então incubadas com anticorpo primário (antí-NSE de coelho, 1:5000) durante a noite a 4°C. As células foram então incubadas com o anticorpo secundário (anti-coelho de cabra, diluição de 1:200) durante, pelo menos, 90 minutos à temperatura ambiente. As células imunopositivas a NSE foram visualizadas usando o conjunto Vectastain ABC (Vector Labs). 71 505

15.1.7. COLORAÇÃO HISTOQUÍMICA PARA CALBINDINÃ Lavaram-se duas vezes células com PBS e fixaram-se com paraformaIdeido a 4¾ durante 30 minutos à temperatura ambiente. A seguir à lavagem com 1% de soro normal de cavalo (NHS) e bloquea-mento com NHS a 5¾ em PBS durante 1 hora h temperatura ambiente, as células foram incubadas com um anticorpo de ratinho anti-calbindina (diluição de 1:1000) em NHS a 1% durante a noite a 4°C. As células foram então lavadas três vezes com NHS a 0,1¾ e incubadas com o anticorpo secundário (anti-ratinho de cavalo a uma diluição de 1:400) durante 90 minutos à temperatura ambiente. As células imunorreactivas a calbindina foram visualizadas usando o conjunto Vectastain ABC (Vector Labs).

15.1.8. COLORAÇAO HISTOQUÍMICA PARA ACETLCQLINÃ-ESTERASE A coloração histoquímica relativa a acetílcolina-esterase foi realizada de acordo com os procedimentos de Geneser-Jensen e Blackstadt (1971, Z. Zellforsch 114:460-481). As células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas com paraformaIdeido a 4¾. à temperatura ambiente durante 30 minutos. As células fixadas foram então incubadas com uma mistura reaccional contendo tampão de acetato 50 mM (pH 5,0), iodeto de acetiltiocolina 4 nM, sulfato de cobre 2 nM, glicina 10 mM e gelatina 10 ftg/ml. As colina-este-rases não específicas foram inibidas incluindo etopropazina 0,2 mM no meio de incubação. A especificidade da coloração relativa a colina-esterase foi verificada pela adição de neostigmina a 5 uM. No final de uma incubação de 7 dias, a gelatina foi dissolvida por uma breve incubação a 37°C. As células foram lavadas com égua, tratadas durante um minuto com Na2S, a 1,25¾ e lavadas de novo com água. Elas foram então tratadas durante 1 minuto com AgNOg a í%, lavadas com água e PBS.

15.1.9. FACTOR NEUROTRÒFICO CILIAR 0 CNTF usado em todos os ensaios foi CNTF recombinante de ratazana, expresso e purificado como se descreveu na Secção 12 Exemplo 12 supra. 71 505 6526-030-118

-95-

15.2. RESULTADOS

Quando os hipocampos foram retirados na idade gestacional de E18 e postos em cultura, a maioria da população neurónica consistia em neurónios piramidais pós-mitóticos. Cinco a seis horas depois da deposição, os neurónios estendiam já axónios e depois de 1 dia em cultura existia evidência de contacto célula-célula. As células em fase brilhante com longos processos eram visíveis.

Os neurónios hipocâmpicos foram cultivados a uma densidade baixa (aproximadamente 71 000 células/cm^) na presença ou ausência de CNTF durante vários períodos de tempo. 0 tratamento contí-núo das culturas hipocâmpicas com CNTF (10 ng/ml) produziu um aumento da capacidade da célula absorver 3H-GABA (FIG. 30). 0 comportamento temporal do aumento induzido por CNTFda absorção de GABA neurónico específica foi lento, como se mostra na FIG. 30A. 0 tratamento com CNTF (10 ng/ml) produziu um pequeno aumento da absorção de GABA no dia 6 de cultura e observou-se um aumento máximo de aproximadamente 4 vezes, relativamente aos controlos não tratados, 8 dias depois da adição de CNTF. Um período de cultura mais longo, de até 11 dias, não produziu um aumento maior. Para avaliar ainda o efeito de CNTF sobre neurónios hipocâmpicos em cultura, determinou-se a quantidade de proteína de neurofilamento usando um anticorpo contra proteína de neurofilamento (RT97) seguido por um ensaio ELISA. Determinou-se que o neurofilamento no dia 6 da cultura apenas tinha registado um pequeno aumento e que tinha tido um aumento máximo de aproximadamente 5 vezes no dia 8 (FIG. 3QB). Qbservou-se também um comportamento temporal similar entre a absorção de GABA e a proteína de neurofilamento, a 1 ng/ml de CNTF. 0 efeito de CNTF pareceu ser dependente da dose, como se mostra na FIG. 31. A absorção neurónica específica de GABA aumentou a 0,01 ng/ml e atingiu o aumento máximo, de aproximadamente 3 vezes, em células tratadas com 0,1 ng/ml de CNTF durante 8 dias (FIG. 31Ά). Concentrações mais elevadas de até 50 ng/ml de CNTF não resultaram num aumento maior da absorção de GABA. De modo análogo, a proteína de neurofilamento em culturas tratadas com CNTF aumentou também de um modo dependente da dose, atingindo um 71 505 6526-030-118

-96-patamar a 0,1 ng/ml de CNTF (FIG 31B). Concentrações mais elevadas de até 50 ng/ml de CNTF não aumentaram mals a quantidade de proteína de neurofilamento.

Como via adicional para examinar o efeito de CNTF sobre neurónios GABAérgicos, a actividade da enzima GAD foi medida em culturas' incubadas na presença de CNTF durante 8 dias. Verificou-se que o CNTF produzia um aumento da actividade da enzima GAD em neurónios hipocâmpicos de uma maneira dependente da dose (FIG. 31C). A forma da curva dose-resposta obtida é semelhante à observada para a absorção de GABA e proteína de neurofilamento. Foi observado um aumento máximo de 3,8 vezes da actividade da enzima GAD, com 0,1 ng/ml de CNTF.

Para se examinar se o efeito de CNTF sobre a actividade da enzima GAD era devido a uma indução da actividade da enzima ou se era devido a um efeito de sobrevivência dos neurónios GABAérgi-cos, determinou-se o número de neurónios imunorreactivos a GAD, em células cultivadas na presença ou ausência de CNTF. A uma concentração de 10 ng/ml, o CNTF aumentou o número de neurónios positivos a NSE é GAD 2,2 e 2,3 vezes, respectivamente (FIG. 32A). A coloração imuno-histoquímica, usando um anticorpo contra GABA originou resultados similares (FIG 33-A). A calbindina foi localizada numa subpopulação de neurónios hipocâmpicos, incluindo gyrus dentados, neurónios piramidais CAI e alguns interneurónios (Balmbridge e Miller 1982, Brain Res. 245:223—229). 0 tratamento com CNTF (10 ng/ml) de culturas hipocâmpicas de baixa densidade deu origem a um aumento de 3 vezes nas células imunopositivas a calbindina (FIG. 32B). Após 8 dias em cultura, o número de células positivas acetiIcolina-esterase foi também aumentado em aproximadamente 17 vezes em culturas tratadas com CNTF, relativamente aos controlos (FIG. 33B).

De modo a obter-se mais provas que permitam concluir que o CNTF actuava como um factor de sobrevivência para salvar neurónios GABAérgicos em cultura e não na indução do carácter fenotípico GABAérgico, realizaram-se experiências de adição retardada. 0 CNTF (10 ng/ml) foi adicionado a vários momentos após a deposição 71 505 6526-030-118 -97-

e determinaram-se a absorção de GABA ou os níveis de proteína de neurofilamento no oitavo dia de cultura. Como se mostra na FIG. 34A, quando a adição de CNTF foi atrasada em um dia, o aumento da absorção de GABA induzida por CNTF, avaliado 7 dias mais tarde, baixou. Quando a adição de CNTF foi feita no terceiro dia após deposição, o CNTF não produziu aumento da. absorção de GABA. O aumento da proteína de neurofilamento, induzido por CNTF foi igualmente reduzido quando a adição de CNTF foi atrasada 3 dias (FIG. 35A). Para eliminar a possibilidade de esta observação ter sido devida a um tempo de exposição ao factor, insuficiente, realizou-se a seguinte experiência. Adicionou-se CNTF (10 ng/ml) as células no terceiro dia de cultura e as células foram tratadas com o factor 8 dias antes da medição da absorção de GABA e da proteína de neurofilamento. Sob estas condiçóes, o CNTF não teve efeito na indução do aumento da absorção de GABA e o efeito sobre a proteína de neurofilamento foi muito reduzida. (FIG. 34B, 35B).

Os astrócitos têm mostrado ser uma fonte rica em vários factores neurotróficos, incluindo NGF. Para examinar a possibilidade de o efeito de CNTF ser exercido via libertação destes factores a partir de células gliais e não por actuação directa sobre os neurónios, examinou-se o aumento da absorção de GABA induzido por CNTF em culturas ricas em neurónios. Como se mostra na FIG. 36, em cultruras tratadas com AraC, o CNTF produziu um amnento de 2,4 vezes na absorção de GABA, relativamente aos controlos não tratados. A estimulação da absorção de GABA foi similar em culturas mistas de neurónios-neuroglia (-AraC) e em culturas ricas em neurónios (tAraC). Em adição, a curva dose--resposta para o CNTF em culturas tratadas com AraC foi ligeiramente deslocada para a esquerda por a concentração de CNTF necessária para uma resposta máxima ser mais baixa (0,03 ng/ml, comparada com 0,1 ng/ml). 0 efeito de CNTF sobre neurónios GABAérgicos era dependente da densidade à qual as células eram depositadas. A uma densidade de deposição baixa, de 71 000 células/cm^, o CNTF (10 ng/ml) produziu um aumento de aproximadamente 2,6 vezes na absorção de GABA (FIG. 37A). A uma densidade de deposição mais elevada 71 505 5525-030-118 -98-

1 (143000 células/cm^), o CNTF não induziu um aumento significativo da absorção de GABA a uma concentração saturante (10 ng/ml). 0 efeito de CNTF sobre o nível de proteína de neurofilamento foi similarmente dependente da densidade das células (FIG. 37B). Isto pode ser devido a um nível elevado de factores neurotróficos em culturas de elevada densidade. Mostrou-se anteriormente que os neurónios hipocâmpicos em cultura são sensíveis h neurotoxicidade por glutamato (Mattson, M.P. et al. (1988) J. Neurosu. 8:2087--2100). Avaliámos os efeitos neurotóxicos de várias concentrações de glutamato (10-1000jUM) por meio de um ensaio de MTT colorimé-trico, como se mostra na FIG. 38. A uma concentração de ImM, o glutamato reduziu a sobrevivência celular a aproximadamente 10¾. Na presença de CNTF (lOyg/ml), a sobrevivência celular foi facilitada a seguir à exposição a glutamato.

15.3. DISCUSSÃO O CNTF tem mostrado facilitar a sobrevivência e crescimento de várias populações neurónicas distintas, em cultura. Além disso, tem-se mostrado que uma actividade do tipo CNTF induz diferenciação de astrócitos do tipo 2 a partir de células gliais progenitoras em cultura (Hughes et al., 1988, Nature 335:70-73. Lillien et al. , 1988, Neuron 1.:485-494). Proporcionámos evidência para um novo efeito de CNTF no SNC, i.e. o CNTF suporta a sobrevivência de neurónios isolados de hipocampo E18 in vitro. O tratamento de neurónios hipocâmpicos com CNTF dá origem a um aumento na absorção de Gaba- acompanhado por um aumento da actividade da enzima GAD. Os níveis de proteína de neurofilamento das culturas hipocâmpicas foi, similarmente, aumentado na presença de CNTF. Os estudos de resposta à dose mostram uma correlação entre os vários marcadores e um efeito máximo de CNTF alcançado a 0,1 ng/ml de CNTF. Concentrações superiores de CNTF não pareceram produzir um efeito maior. O efeito de CNTF podia ser explicado por indução selectiva de marcadores fenotípicos GABAérgicos. Contudo, os resultados da adição retardada sustentam fortemente o efeito de sobrevivência de CNTF. Verificámos que quando a adição de CNTF foi atrasada 3 71 505 6526-030-118

-99-dias, ele não podia já exercer o seu efeito· sobre as células GABAérgicas. Embora os níveis de proteína de neurofilamento fossem ainda significativamente aumentados, o efeito é muito menor ao observado quando o CNTF foi adicionado no dia 0.

Os efeitos dependentes da densidade de CNTF mostram que; a densidade elevada, as células não pareciam necessitar de CNTF para sobreviver. Isto pode ser devido à libertação local de factores neurotróficos endógenos de neurónios ou astrócitos,· ou devido a interacções célula-célula. Verificou-se que a sobrevivência neurónica hipocâmpica é facilitada na presença de astrócitos (Banker e Cowan, 1977, Brain Res. 126:397—425). É possível que o factor envolvido seja CNTF ou um membro da família da neurotrofina. Em culturas ricas em neurónios, o efeito de CNTF sobre a absorção de GABA e proteína de neurofilamento não foi afectada. Os dados argumentam fortemente contra um papel dos astrócitos na acção de CNTF e sugerem que o efeito é mediado via uma acção directa sobre os neurónios. Usando um ligando de CNTF marcado para myc e um anticorpo para myc, temos provas da presença de receptores de CNTF sobre os neurónios. A actividade promotora da sobrevivência de CNTF sobre os neurónios hipocâmpicos não pareceu estar limitada a neurónios GABAérgicos. Temos evidência de que o número de células imunopo— sitivasaaçetiIcolina-esterase também é aumentada na presença de CNTF. A ‘intensidade da coloração histoquímica para AchE foi muito mais pronunciada em culturas tratadas com CNTF. Este facto pode ter implicações importantes num possível papel de CNTF como factor de diferenciação e de sobrevivência retrógrada para os neurónios colinérgicos no septo mediano. A expressão de dois marcadores gerais do fenótipo neurónico, NSE e NF, aumentou na presença de CNTF. A medição da acumulação de proteína de NF foi realizada usando um ensaio imuno—adsorvente ligado a enzima. 0 anticorpo monoclonal (RT97) usado, reconheceu predominantemente a forma de 200KDa do tripleto proteico de NF e, numa extenção menor, a subunidade de 150KDa, Foi anteriormente mostrado que o nível de ligação de RT97 poderia servir como um 71 505 6526-030-118 -100-

índlce arbitrário do sobre—crescimento de axónio, em particular sobre-crescimento axónico, para neurónios cultivados (Doherty et al., 1984, Neurosci. Lett. Í51:55-õ0). Culturas hipocâmpicas de oito dias mantidas com CNTF mostraram uma rede de processos mais densa. e complexa. Este aumento da quantidade relativa de proteína de NF poderia simplesmente ser secundário no aumento da sobrevivência neurónica. Alternativamente, o CNTF pode ter um efeito selectivo na indução do sobre-crescimento de axónio. A especificidade da actividade promotora da sobrevivência do CNTF foi atribuída examinando as acções de outros factores neuro-tróficos que se sabe estarem presentes no hipocampo (Maisonpierre et al., 1990. Science 247:1446-1451). Consistente com a observação anterior de que o NGF não é um factor de sobrevivência dos neurónios hipocâmpicos é o facto de não termos conseguido detec-tar qualquer efeito de NGF sobre neurónios GABAérgicos. Outro membro da família da neurotrofina, BDNF, também não pareceu promover a sobrevivência de neurónios GABAérgicos em cultura. Por outro lado, o bFGF mostrou ser um importante factor de sobrevivência no hipocampo (Wallicke et al.,1986. PNAS USA 83:3012-3016) e tem-se considerado que funciona como factor neurotrófico no SNC (Morrison et al,, 1986 PNAS USA 83:7537-7541; Anderson et al.1988 Nature 332:360-361). Analogamente ao bFGF, o CNTF é activo a concentrações muito baixas.

Tem-se mostrado que o hipocampo é afectado por várias desordens neurodegenerativas, incluindo a doença de Alsheimer. 0 mecanismo subjacente que conduz à degenaração selectiva da formação hipocâmpica não está ainda percebido. Tem-se posto a hipótese de o neurotransmissor de aminoácido excitatório, glutamato, poder desempenhar um papel no processo da doença. A demonstração de que o CNTF pode suportar a sobrevivência neurónica hipocâmpica in vitro pode ter implicações importantes na concepção de abordagens terapêuticas às doenças neurodegenerativas. Será importante determinar se o CNTF pode proteger os neurónios hipocâmpicos contra a neurotoxicidade do glutamato, como foi observado para o FGF (Mattson et al. 1986, PNAS 83:7537-7541). Recentemente detec-tou-se ANR mensageiro no hipocampo, por análise Northern blot

(Masiakowski, comunicação pessoal). A especificidade para o tipo de célula da síntese de CNTF in vivo não foi ainda determinada. 0 papel fisiológico do CNTF no hipocampo durante o desenvolvimento in vivo tem ainda que ser estabelecido, mas à luz das presentes investigações, o CNTF pode ser um factor neurotrófico endógeno com um papel potencial na regulação da sobrevivência neurónica no hipocampo.

16. EXEMPLO: 0 CNTF DE RATAZANA AUMENTA A TAXA DE PROLIFERAÇÃO DE ASTRÓCITOS HIPOCAMPICOS DE RATAZANA EM CULTURA

16.1. MATERIAIS E MÉTODOS

16.1.1. PREPARAQAO DE ASTRÓCITOS HIPOCAMPICOS DE RATAZANA

Dissecaram-se hipocampos de embriões de ratazana E18 e colheram-se em meio FIO (Gibco) contendo HEPES 24 mM. Os tecidos foram cominuídos em pedaços pequenos e tripsinados com tripsina a 0,25¾ C13 hipocampos/5 ml de tripsina a 0,25¾) durante 20 minutos a 37°C. Adicionou-se DNase até uma concentração final de 0,2 mg/ml durante mais 10 minutos. A reacçSo foi interrompida com um volume igual de DME suplementado com 10¾ de soro de vitela fetal e os tecidos foram lavados duas vezes. As células dissociadas, obtidas por trituração suave, foram colhidas em DME/FCS e a suspensão foi passada através de uma peneira de 20 mm Nitex (Tetko) para remover os pedaços de material. A viabilidade das células foi determinada usando exclusão com azul de tripano. As células foram então depositadas em balões de plástico de cultura de tecido T75 a 4,82 x 10® células/balão. O meio foi mudado com DME-FCS (lOml) nos dias 1,3,5,7 e 9 após a deposição. Nos dias 7 e 9, os balões foram agitados manualmente para remover os oligo-dendrócitos e quaisquer neurónios sobreviventes. No dia 10, os astrócitos foram removidos com tripsina a 0,25¾ e depositados em placas de 96 alvéolos para análise.

16.1.2. ENSAIOS MITÕTICOS COM CNTF DE

ASTRÓCITOS HIPQCÃMPICQS DE RATAZANA

Para os ensaios mitóticos, os astrócitos foram depositados a uma densidade de 16 000 células/alvéolo em meio (DMEM) contendo 10¾ de soro de bovino fetal durante 4 h, para permitir a ligação.

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As células foram lavadas e adicionaram-se 150 ul de meio definido (DMEM, BSA a 0,5¾). Adicionou-se, durante 24 horas, CNTF de ratazana, recombinante, preparado como na Secção 7 Exemplo, supra. A marcação das células foi feita nas duas horas finais do período de incubação de 24 horas usando luC/alvéolo de 3H-timidina (NEN, 20Ci/mM). Após incubação, as células foram processadas como se segue: os alvéolos foram lavados duas vezes com PBS e incubadas a 4o durante a noite em 50 ml de ácido tricloroacético a 10¾ (TCA). Após remoção de TCA, as células foram lavadas em água fria, solubi 1 izadas em 100/il de NaQH IN e contadas num contador de cintiliação líquida em lOml de aquasol. 16.1.3. ENSAIO DE LIGAÇÃO DE (125I) CNTF '

Cultivaram-se astrócitos hipocâmpicos em placas de 37 mm2 até uma confluência de aproximadamente 80-90¾. As monocamadas de astrócitos foram primeiro lavadas (2 ml) duas vezes em meio F-12 de Ham. 0 F—12 de Ham (lml) foi então adicionado e as células foram incubadas em gelo durante 15 minutos. 0 meio foi então substituído por um volume igual de Ham frio. Nos alvéolos que se destinavam à determinação da ligação não competitiva, adicionou-se CNTF não marcado (excesso de 100 x do CNTF não marcado) e as culturas . foram incubadas a 4°C durante mais 60 minutos. Adicionou-se χ^Ι-0ΝΤΡ (preparado usando reagente de Bolton--Hunter, 10 jul, contendo aproximadamente 280 000 dpm a 112 juCi por nanomole) a cada cultura e a incubação continuou a 4eC a vários tempos até 60 minutos. 0 CNTF não ligado foi removido por lavagem das células 3 x (2ml cada) com PBS frio contendo lOmg/ml de BSA. As células foram solubi1izadas por incubação das culturas durante, pelo menos, 20 minutos à temperatura ambiente em 0,5 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 7,2, NaCl 0,15 M, Triton a 1%, SDS a Q,l?á, desoxicolato a 1¾. Os lisados das células foram removidos e as culturas foram lavadas duas vezes (250 ul cada) com PBS contendo 10 jul/ml de BSA. As lavagens foram reunidas conjuntamente com os lisados celulares e foram contada-s num contador gama. ·

16.2. RESULTADOS

Os resultados do ensaio de proliferação apresentados na FIG

71 505 5526-030-118 -103- 39 indica, uma curva de resposta à dose bifásica com concentrações crescentes de CNTF em astrócítos hipocâmpicos de ratazana. 0 CNTF origina um aumento da incorporação de ^H-timidina de até uma dose de 0,01 ng/ml. A concentrações superiores a 0,1 ng/ml, o CNTF perde a sua capacidade de estimular a proliferação celular. Ά resposta biológica dos astrócitos ao CNTF indica que estas células têm receptores de CNTF funcionais. Duas provâs adicionais suportam a verificação inicial de que astrócitos do tipo 1 expressam receptores de CNTF nas suas superfícies celulares. As experiências de ligação com CNTF em culturas de monocamada demonstram sítios ligando-receptor competente; a ligação específica máxima observada de ^^^I-CNTF representou cerca de 1% do CNTF total adicionado a cada cultura. Além disso, a análise por Northern blot mostrou que o CNTF induzia fortemente a expessão do gene precoce imediato c-fos. Observou-se a indução máxima de ARNm numa hora e em 2 horas retornou aos níveis basais normais.

17. EXEMPLO: ANTICORPOS MONOCLONAIS NOVOS PARA FACTOR NEURO-TRÕFICO CILIAR E UM ENSAIO DE SANDUÍCHE COM DOIS ANTICORPOS PARA FACTOR NEUROTROPICO CILIAR HUMANO

17.1. MATERIAIS E MÉTODOS

17.1.1. PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS PARA FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR

17.1.1.1. PROTOCOLO DE IMUNIZAÇÃO

Inocularam-se ratinhos fêmea CB6F1/J com 10 a 40 ug de CNTF humano recombinante (preparado como se descreveu no Exemplo 12) em adjuvante completo de Freund e em seguida, re-inocularam-se com rCNTF em adjuvante completo de Freund de três em três semanas durante um período de até cerca de 6 meses.

17.1.1.2. FORMAÇÃO DOS HIBRIDQMAS

Fundiram-se células de baço de ratinhos imunizados com células de mieloma SP2/0 a uma razão de 2:1 (linfócitos: células de mieloma) usando PEG 4000 e, em seguida, foram cultivados em RPMI completo com HAT a 2% (hipoxantina, aminopterina e timidina) a uma densidade celular de cerca de 10^ linfócitos por alvéolo para seleccionar hibridomas. -104 71 505 6526—030-118

17.1.3. SELECCÃO DE HIBRID0MA5 REACTIVOS A CNTF

Os anticorpos reactivos com CNTF humano (hCNTF) foram identificados inicialmente por ensaio imuno-sorvente ligados a enzima (ELISA) com hCNTF recombinante ligado a placas de ensaio de plástico. Os anticorpos foram ainda caracterizados por ELISA e imunomancha de Western relativamente à sua capacidade de reagirem com hCNTF recombinante, CNTF de ratazana recombinante (rCNTF) e formas alteradas de hCNTF como se descreve infra.

17.1.2. PREPARAÇÃO DE VARIANTES DE CNTF HUMANO

Geraram-se fornas variantes de CNTF humano via expressão e purificação dos vectores descritos na secção 13.1.2. Resumidamente, a proteína variante de CNTF humano #112, foi obtida via expressão do vector pRPN112.e faltam—lhe os 55 resíduos de amino— ácido da extremidade do terminal carboxílo do CNTF humano. A proteína #49 foi gerada usando pRPN59 e não tem os 15 amínoácidos do terminal carboxílo de hCNTF. A proteína #82 é uma proteína de fusão na qual os primeiros 66 amínoácidos do CNTF humano foram deleccionados e o resto da molécula foi fundida a uma proteína humana não identificada (FIG. 22).

17.1.3. METODOLOGIA PARA O IMUNOENSAIO DE DOIS SÍTIOS

Para determinar a quantidade de CNTF em amostras de material biológico, seria vantajoso desenvolver um ensaio imunológíco para a proteína. Um imunoensaio sensível e conveniente é o método de sanduíche com dois anticorpos [ver, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. 1988, Colde Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, páginas 578-583]. Neste método um primeiro anticorpo é ligado a um suporte sólido e deixado reagir com uma solução contendo o antigénio de interesse; um segundo anticorpo, usualmente dirigido a um epítopo diferente no antigénio é, então, deixado regir com o antigénio ligado ao primeiro anticorpo e a quantidade do segundo anticorpo ligado (que deve ser directamente proporcional à quantidade de antigénio ligado) á quantificada. Numa concretização deste método, tanto o primeiro como o segundo anticorpos são anticorpos monoclonais.

71 505 5526-030-118 -105 O ensaio de dois sítios desenvolvido para CNTF humano é apresentado esquematicamente na FIG. 40. Essencialmente, um anticorpo secundário, purificado por afinidade, específico para uma sub-classe de imunoglobina G de ratinho (IgG2b no caso apresentado) foi adsorvido numa placa de ensaio e usado para capturar o primeiro anticorpo monoclonal (RP3-12, uma IgG2b murina) do sobrenadante da cultura gasto das células de hibridoma. 0 CNTF humano foi então adicionado e deixado ligar—se ao primeiro anticorpo monoclonal. Foi então adicionado o segundo anticorpo monoclonal anti-CNTF de uma sub-classe diferente da do primeiro (RP12-2, uma IgGl murina), de novo a partir dos sobrenadantes da cultura de hibridoma não fraccionados, e deixou-se ligar a qualquer CNTF capturado pelo primeiro anticorpo monoclonal. Todas as moléculas de RP12-2 ligadas foram então detectadas usando um anticorpo secundário, purificado por afinidade, específico para IgGl murina, conjugado com fosfatase alcalina, seguindo-se incubação com o substrato de fosfatase fosfato de para-nitrofenilo, de cuja clivagem resulta um produto reaccional colorido (medido por absorvância a 405 nM).

'17.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os anticorpos monoclonais da classe representada por RP3—12 e RP3-17 foram gerados a partir da mesma experiência de fusão usando esplenócitos de um único rato imunizado. Tanto o RP3-12 como o RP3-17 não reagiram com qualquer das duas delecções do terminal carboxilo do hCNTF testado e também não ligaram CNTF de ratazana, como se mostra no Quadro V. Contudo, eles regiram com a proteína de fusão... #82, na qual .o terminal carboxilo de hCNTF fica retido. Assim, estes anticorpos reconhecem um epítopo (ou epitopos próximos) localizado perto da extremidade do terminal carboxilo de hCNTF, no segmento de 15 resíduos de aminoácido do terminal carboxilo deleccionado da proteína de hCNT #59 ou sobrepondo-se-lhe. Pelo contrário, os anticorpos monoclonais RP12-2 e RP12-9 reagem com a proteína de hCNTF #59 e com a proteína de hCNTF #112 e ainda com a proteína de fusão #82. Ambos os anticorpos devem portanto reconhecer epítopos localizados entre

J 71 505 6525-030-118 -106

aproximadamente os aminoácidos 66 e 145 de hCNTF. Os dados do mapeamento Indicam assim que os epítopos reconhecidos por RP12-2 e RP12-9 devem encontrar-se pelo menos cerca de 40 resíduos de aminoácido a montante dos reconhecidos por RP3-12 ou RP3-17 (FIG. 22). Os anticorpos RP12-2 e RP12-9 diferem na sua capacidade de reconhecerem CNTF de ratazana (Quadro V) o que implica que reconhecem epítopos distintos, um dos quais (o reconhecido por RP12-9) é provavelmente bem conservado entre os roedores e primatas. A capacidade de todos estes anticorpos monoclonais se ligarem a CNTF desnaturado no ensaio de "imuno-mancha" de Western sugere que eles reconhecem epítopos simples consistindo em resíduos de aminoácido contíguos ou muito próximos e não epítopos conformacionais.

Realizaram-se experiências iniciais para determinar quais os pares de anticorpos monoclonais que eram adequados para o desenvolvimento de uma sanduíche, de dois anticorpos, para este ligando. Concebeu-se um ensaio para avaliar os anticorpos numa etapa precoce, antes da produção a larga escala ou da purificação dos reagentes, tirando vantagem dos reagentes de imunoglobulina anti-ratinho específicas da sub-classe para imobilizar um anticorpo monoclonal num suporte sólido e para detectar diferencialmente o segundo anticorpo monoclonal "repórter". Em virtude do requisito de os dois anticorpos monoclonais serem de sub-classes diferentes, apenas puderam ser avaliados por esta via alguns pares de anticorpos monoclonais. Resultados excelentes foram obtidos com o par RP3-12 e RP12-2 no imunoensaio de dois sítios descrito. A FIG. 41 mostra o resultado do ensaio de sanduíche com dois anticorpos numa titulação com quantidades crescentes (por factores de dois) de CNTF recombinante humano, de 7,8 picogramas por ensaio (50jul a 0,156 ng/ml) a 500 picogramas por ensaio (50jul a 10,0 ng/ml). Era detectável um sinal convincente acima do "background" (0,044 ± 0,010 unidades de absorvância) com 15,6 picogramas de CNTF humano e o ensaio era linear até ao nível mais elevado testado. A substituição de qualquer dos anticorpos monoclonais (MOPC-141, uma IgG2b em lugar de RP3-12; ou MQPC-21, uma IgGl, em lugar de RP12-2), por proteínas irrelevantes de mieloma

J

71 505 5526-030-118 -107- de ratinho da sub-classe apropriada reduziu o nineis de "background".

Assim, mesmo usando sobrenadantes de culturas não purificados, o ensaio, com os anticorpos monoelonais RP3-12 e RP12-2, mostrou ser um excelente ensaio de sanduíche, de dois anticorpos, para CNTF humano. Estes anticorpos monoelonais podem ser purificados por métodos convencionais a partir de sobrenadantes de células de hibridoma cultivadas em meio isento de soro. Prevê--se que será muito fácil desenvolver um ensaio de sanduíche mais simples, no qual um anticorpo monoclonal possa ser ligado .direc-tamente a um suporte sólido, enquanto o segundo anticorpo monoclonal será conjugado directamente com um repórter (p.e. um radio-isótopo tal como ^‘^Iodo; ou uma enzima tal como fosfatase alcalina, peroxidase de rábano ou β-galactosidade; ou um hapteno tal como biotina, o qual pode ser detectado usando avidina ou estreptavidina marcada), obviando assim a necessidade de anticorpos secundários específicos de tipo. 0 ensaio de sanduíche altamente especifico sensível de anticorpos, aqui descrito, terá uso em muitas situações, nas quais é desejável determinar quantitativamente a presença de CNTF humano. Por exemplo, ele pode ser usado para seguir o CNTF humano durante os procedimentos de purificação. Similarmente, o ensaio pode ser usado para seguir o CNTF após injecção em animais experimentais, para determinar os tecidos nos quais ele se localiza Finalmente, o ensaio pode ser usado para determinar os níveis de CNTF em tecidos humanos e/ou fluidos corporais (p.exp. soro ou fluido cerebro-espinal) em indivíduos saudáveis e doentes. Uma vez que o CNTF é encontrado intracelularmente em nervos e tem uma actividade neurotrófica, tem sido sugerido que a proteína pode ser libertada em reposta a vários tipos de danos ou doenças. Assim, o nível de CNTF em fluidos extracelulares apropriados pode proporcionar uma medição de diagnóstico, quantitativa, para'estas condições, tais como neuropatia e degeneração neurónica. (SEGUE QUADRO V)

QUADRO V

REACTIVIDADE DE ANTICORPOS MONOCLONAIS COM CNTF HUMANO, MUTANTES DE DELECCAO DE CNTF HUMANO E CNTF DE RATAZANA

Clone Sub-classe ELISA "Western Blottinc" RP3-12 IgG2b hCNTF ++ hCNTF 1591 rCNTF hCNTF ++ hCNTF (59) hCNTF (112) rCNTF RP3-17 IgG2a ++ — — — — — RP12-2 IgGl ++ ++ — ++ ++ ++ — RP12-9 IgGl ++ ++ ++ ++ ++ ++

18. O FACTOR NEUROTRóFICO CILIAR PROMOVE A SOBREVI-VSNCIA DOS NEURÓNIOS MOTORES ESPINAIS EM CULTURA 18.1. MATERIAIS E MÉTODOS 18.1.1. TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS

Dissecaram—se neurónios motores sob estereomicroscópio a partir da parte lombar da espinal medula de embriões de pintainho no 6Q dia do desenvolvimento embrionário e armazenaram-se em solução salina de Hanks, equilibrada, isenta de magnésio e cálcio, fria, suplementada com glucose (4g/l) (HBSS). Os tecidos foram lavados com HBSS e tratados com tripsina a 0,03¾ em HBSS a 37°C durante 20 min com agitação suave, lavados, com HBSS frio e triturados moderadamente em três passos de agitação de 8 passagens em Iml de inibídor de tripsina de soja.(Sigma) a 0,1¾ em HBSS através de uma pipeta de Pasteur siliconada, acabada à chama. Cada suspensão de células do sobrenadante foi filtrada através de um peneiro de Nylon de 50 um, reunida e disposta em camadas em 4 ml de metrizamida a 0,8¾ fria (Fluka) em HBSS-HEPES 25 mM (pH 7,4) num tubo de vidro cónico siliconado de 12 ml.O tubo foi centrifugado a 400 g durante 15 min a 4qC e a camada intermediária (0,5ml) foi colhida noutro tubo siliconado contendo 6,5 ml de meio de cultura frio (numa mistura de meio L-15 de Leibovitz suplementado com glucose (4 g/1) (Gibco), bicarbonato de sódio 0,15 M, soro de cavalo inactivado pelo calor e filtrado e penicilina G (10^ unidades/ml) à razão de 75:15:10:0,1, prepa- 71 505 6526-030-118 -109-

rada de fresco e tamponada com 5¾ de CO2)- Após centrifugação a 100 x g durante 7 min a 4°C, o sobrenadante foi removido e as células foram suavemente resuspensas em meio de cultura e depositadas em placas de cultura de Greiner de 4 alvéolos (diâmetro do alvéolo, 10mm; C. A. Greiner und Sohne GmbH, Nurtingen, Alemanha Ocidental) a 1000 - 2000 células/alvéolo. As placas foram pré-revestidas com poli-DL-ornitina (Sigma, 0,5 mg de tampão de borato de sódio 0,15 M (pH 8,3) durante a noite a 4°C, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e subsequentemente foram revestidas com laminina (Gibco; 10 ug/ml no meio de cultura esgotado em soro) e colocadas numa incubadora com 5¾ de CO2 até à deposição das células (5 - 6h). As células foram incubadas a 37“C numa incubadora humidificada, com 5% de CC>2 e 95% de ar. As amostras foram adicionadas uma h após deposição e o meio de cultura foi mudado após 24 horas e 72 horas. Os números de células iniciais foram contados 3 h após deposição. 18.1.2. MARCAÇÃO NO SENTIDO RETRÓGRADO DE NEURóNIOS MOTORES E ESTIMATIVA DA PUREZA DA CULTURA DE NEURÓNIOS MOTORES_

Em algumas experiências, os neurónios motores foram marcados no sentido retrógrado com um corante fluorescente, in vivo, antes da preparação das células (U. Dohrman et al., 1986, Dev. Biol. 118:209-221) para identificar a população celular de neurónios motores. Fez—se um pequeno furo na casca de cada um dos ovos que tinham sido incubados durante 5 dias. Inseriram-se pequenos pedaços de cristais de isotiocianato de rodaraina (Sigma) em dois ou três pontos de cada coxa e o furo do ovo foi fechado com uma tira de celofane. Os ovos foram incubados durante mais 24 horas. Alguns dos embriões tratados foram dèpois processados de modo a obterem-se secções congeladas após fixação com formaldeído. Na espinal medula verificou-se que apenas tinham sido marcadas as colunas dos neurónios motores laterais. Os outros embriões foram usados para preparação de células usando o método descrito acima (18.1.1). —110— 6526-030-118

Após 5 horas em cultura, as células foram lavadas com HBSS quente, fixadas com formaIdeIdo a 4¾ em PBS à temperatura ambiente durante 20 min, lavadas com PBS e em seguida montadas em glicerol-PBS (1:1) com mangas de vidro. Das células totais, aproximadamente 83¾ estavam marcadas e foram identificadas como neurónios motores FIG. 42. A maior parte destes neurónios motores marcados eram células grandes e o restante eram células de tamanho intermédio. Não foi marcada nenhuma célula pequena. Por outro lado, em experiências nas quais as células - não foram marcadas com um corante fluorescente cerca de 70¾ das células totais eram células grandes da fase brilhante com somas celulares redondos, cerca de 20¾ eram neurónios de tamanho intermédio (a maior parte deles podem ser neurónios motores) e cerca de 10¾ eram neurónios pequenos imaturos (eles têm processos do tipo dos dos neurónios com cones de crescimento mas têm somas celulares semi-planos de fase escura). As células não neurónicas ou não estavam presentes ou constituíam menos do que 2¾. Em conjunto, pode concluir-se que, pelo menos, 83¾ das células são neurónios motores enquanto que o resto consiste em neurónios motores não marcados, num pequeno número de neurónios de tamanho intermédio não identificados e em cerca de 10¾ de pequenos neurónios imaturos. Verificámos também que se as células marcadas fossem cultivadas com extracto de músculo de pintainho embrionário (U. Dohrman et al., 1986, Dev. Biol. 118:209-211) o número de células positivas à fluorescência diminuía em alguns dias. Uma vez que o número de células totais ou grandes declinava muito mais lentamente, isto representa uma perda e/ou desvanecimento da fluorescência e não morte celular. Portanto, para estimar as actividades de sobrevivência das amostras, em experiências de rotina contaram-se como neurónios motores as células grandes de fase brilhante e não as células positivas à fluorescência. 18.2. RESULTADOS E DISCUSSÃO 18.2.1 EFEITO DO FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR (CNTF)

SOBRE NEURÓNIOS MOTORES DE ESPINAL MEDULA EMBRIONARIA DE PINTAINHO EM CULTURA

V A maioria dos neurónios motores morreram em três dias em cultura,· em controlos brancos. Na presença de CNTF de ratazana recombinante, cerca de 70¾ estavam vivos após 3 dias em cultura e cerca de 60¾ após 6 dias em cultura (FIG. 43 e FIG. 44). Uma vez que a maioria dos neurónios motores morreram em 3 dias nos controlos brancos, as actividades de sobrevivência foram estimadas no dia 3. A curva de resposta à concentraçSo de CNTF (FIG. 45) mostrou que a EC^q (a concentraçSo necessária para 50¾ de sobrevivência) de CNTF era tSo baixa quanto cerca de 20 pg/ml (1 pM), aproximadamente a mesma do que para os neurónios ciliares. A significativa actividade de sobrevivência de CNTF com uma EC^q muito baixa sugere fortemente que o CNTF pode desempenhar um papel crítico na sobrevivência in vivo de neurónios motores, como foi mostrado ( ver Exemplo 11, supra; Sendtner et al., 1990, Na-ture 345:440—441). 18.2.2. EFEITOS DA SOBREVIVÊNCIA DE MOLÉCULAS NEUROTRÕFICAS ESPECÍFICAS E CITOCINAS_

De entre todas as moléculas testadas, o CNTF e o factor de crescimento fibroblástico básico (FGF) mostraram ser as moléculas maís potentes (Quadro VI). A actividade de sobrevivência do FGF ácido podia aumentar quando as culturas eram suplementadas com heparina, a qual interfere com a degradação proteolítica do FGF ácido. 0 factor de crescimento do tipo insulina (IGF) I e II e a insulina apresentaram efeitos menores. As curvas de resposta à concentração para estas moléculas activas (FIG. 46) mostraram que os efeitos de sobrevivência maís elevados podiam ser obtidos por: (a) CNTF = 64¾ de sobrevivência a 1 ng/ml; (h) FGF básico = 51¾ a 30 ng/ml; (c) FGF ácido = 18¾ a 300 ng/ml; (d) FGF ácido, na presença de 1 ug/ml heparina, = 35¾ a 100 ng/ml; (e) IGF-I = 15¾ a 100 ng/ml; (f} IFG-II = 15¾ a 300 ng/ml: (g) insulina = 16¾ a 25 ug/ml. Os valores de EC5q foram de 0,023 ng/ml para CNTF e 0,26 ng/ml para FGF básico. Para IGF I e II bem como para a insulina, não puderam ser determinados valores de ECgg fiáveis, visto que os efeitos máximos eram muito pequenos quando comparados com os dos controlos. 71 505 6526-030-118 -112-

A concentração de heparina foi crítica para a facilitação da actividade de FGF ácido, as concentrações usadas nas presentes experiências (1 jug/ml) não pareceram ser máximas, relativamente à facilitação da actividade de sobrevivência de FGF ácido. Contudo, concentrações mais elevadas de heparina deram origem a um desprendimento dos neurónios das placas de cultura. Mesmo a 1 ug/ /ml de heparina, o desprendimento dos neurónios começou após 3 dias de incubação. 0 I3NGF, o BDNF, o PDGF, o TGFa, o TFG01, o IL-—1β, IL—3 ou IL—6 ou IFNc não tiveram efeito discernível mesmo quando se usaram concentrações supramáximas (em relação a efeitos biológicos em outros tipos de células). Usou-se também, nestas experiências, a NT-3, uma nova molécula neurotrófica da família do genes de NGF-BDNF. Concentrações de proteína de NT-3 produzidas por células Cos transfectadas, que suportaram a sobrevivência de neurónios de gânglio nodoso embrionário em cultura não pareceram ter um efeito de sobrevivência sobre os neurónios motores.

18.2.3. COMBINAÇÃO DE CNTF, FGF BÁSICO E IGF-I A combinação de CNTF e de FGF básico a concentrações óptimas deram origem a uma sobrevivência de 100¾ dos neurónios motores durante um período de uma semana (Quadro VII). Passou-se o mesmo com a combinação de CNTF, FGF básico e IGF-I. 0 efeito de IGF-I era pequeno por si só (Quadro VI), mas tornou-se mais evidente quando foi combinado com CNTF e/ou FGF básico (Quadro VII). (SEGUE QUADRO VI) 71 505 6526-030-118 -113-

QUADRO VI

Actividades de Sobrevivência de Neurónios Motores de Moléculas Conhecidas

Molécula Concentração Sobrevivência3 Controlo - bNGF (ratinho) 10 jug/ml - BDNF (porcino) 10 ug/ml - NT-3 - CNTF (ratazana, rec) 500 pg/ml +++ FGF básico (humano, rec.) 10 ng/ml ++ FGF ácido (humano, rec.) 300 ng/ml + FGF ácido + heparina 100 ng/ml + 1 ug/ml ++ PDGF (rec.) 5 ng/ml - EGF (ratinho) 10 ng/ml - TGFa (humano, rec.) 10 ng/ml - TGF01 (porcino, rec.) 5 ng/ml - IL-1P (humano, rec.) 100 unidades/ml - IL-3 (ratinho, rec.) 100 unidades/ml - IL-6 (ratinho, rec.) 50 unidades/ml - IFNc (ratazana, rec.) 1000 unidades/ml - IGF-I (humano, rec) 100 ng/ml ± IGF-II (humano, rec.) 300 ng/ml ± Insulina (bovina) 25 ug/ml + Transferrina (humano) 100 lg/ml " a: As actividades de sobrevivência foram avaliadas após 3 dias em cultura e estimadas com - a +++: -, não significativamente diferente do controlo (sobrevivência: 8,3 ± 3,8%, média ± DP, n=18);±, cerca de 15-20¾ (estatisticamente significante a partir de cada controlo branco, p <0,01); ++, cerca de 35—55%; +++, cerca de 55-75¾. Os resultados foram combinados a partir de diversas experiências.

Rec., recombinante.

71 505 6526-030-118

-114-QUADRO VII

Efeitos Adicionais de CNTF, FGF Básico e IGF-II

Factores Sobrevivênc ia dos neurónios motores í%)a Controlo 4,8 ± 1,0 IGF—I (1 ug/ml) 14,5 ± Λ * * 0,5 FGF Básico (30 ng/ml) 51,9 3,6 CNTF (1,5 ng/ml) 60,7 ± 5,8 FGF básico + IGF—I 76,1 ± _ . * * 4,1 CNTF + IGF-I 87,0 4,5* FGF básico + CNTF 98,2 + 3,0 FGF básico + CNTF + IGF-I 102,5 ± 5.3»s a: Ά sobrevivência dos neurónios motores foi avaliada apôs 3 dias em cultura, por contagem das células na área que corresponde a 23¾ de cada fundo de alvéolo. Média ± SEM (n=4). *, p <0,05; **, p <0,0.1; NS, não significante. Os resultados do teste t foram indicados apenas para comparação entre os valores com e sem IGF-I, visto que o efeito de IGF é relativamente pequeno. As diferenças em quaisquer outras comparações são significantes (p <0,01).

19. DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

Depositaram-se os seguintes ADN de bacteriófago recombinante e de plasmídeo recombinante na American Type Culture Collection, 12301 Farklawn Drive, Rockville, Maryland 20852: NS de acesso Data de ao ATCC Depósito plasmídeo pCP-r-CNTF—C-l 40655 9-12-89 plasmídeo pCMV—rCNTF—C—1 40656 9-12-89 bacteriófago AhCNTF-G-l 40657 9-12-89 hibridoma RP3-12 8-15-90 hibridoma RP12-2 8-15-90

Os ADN de plasmídeos recombinantes que se seguem foram depositados na Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, 71 505 6526-030-118 -115-

Peoria, Illinois 61604: NQ de acesso

ao NRRL

Data de Depósito plasmídeo plasmídeo

pRPN38 pRFMO 8-15-90 8-15-90 0 âmbito do presente invento não deve ser limitado pelas concretizações específicas aqui descritas. De facto, da descrição anterior e dos desenhos anexos, tornar—se—ão evidentes para os peritos na arte várias modificações do invento, em adição às descritas aqui. Pretende-se que estas modificações caiam no âmbito das reivindicações anexas. São aqui citadas várias publicações, cujas revelações são incorporadas na sua globalidade por referência.

Claims

71 505 6526-030-118 -116 REIVINDICAÇÕES 1 - Processo de produção de proteína de factor neurotrófico ciliar ou de um seu fragmento, caracterizado por compreender fazer crescer um microrganismo recombinante contendo uma molécula de ADN recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico codificando factor neurotrófico ciliar (CNTF) ou uma sua subsequência compreendendo, pelo menos, cerca de 10 nucleótidos, de tal modo que a molécula de ADN seja expressa pelo microrganismo; e isolar a proteína de factor neurotrófico ciliar ou fragmento expressos.
2 - Processo de produção de proteína de factor neurotrófico ciliar ou de um seu fragmento, caracterizado por compreender fazer crescer um microrganismo recombinante contendo uma molécula de ADN cuja sequência ou subsequência de ácido nucleico é essencialmente a seguinte a) 1 AGTCACATTTCTTATTTGGACTAGTGAAGACAGAAGCAAACCAGCTCACTTGTGTCCTGGGACAGTTGATT 72 TAGGGGATGGCTTTCGCAGAGCAAACACCTCTGACCCTTCACCGCCGGGACCTCTGTAGCCGTTCTATCTGG 1 * MAFAEQTPLTLHRROLCSRS I W 78 145 CTAGCAAGGAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTATGGAATCTTATGTAAAACATCAGGGCCTGAATAAA 23 LAR K I R $ OLTALMESYV K H Q G L N K T6 217 aatatcaaccttgactcagtggatggtgtaccagtggcaagcactgatcgttggagtgagatgactgaggca 47 HINLDSVD-6VPVAS T D R W S E Η T E A 73 75 289 GAGCGACTCCAAGAGAACCTCCAGGCTTACCGTACCTTCCAAGGGATGTTAACCAAGCTCTTAGAAGACCAG 71 JL R LOENLOAY R TFOGMLTK L L E D Q 77 74 C84 361 AGAGTACATTTCACCCCAACTGAAGGTGACTTCCATCAGGCAATACATACTCTTATGCTCCAAGTTTCTGCC 95 RVHFTPTEGDFHQAIHTLML 0 V S A CB3 433 TTTGCCTACCAGCTAGAGGAGTTAATGGTGCTTCTGGAACAGAAGATCCCTGAAAATGAGGCTGATGGGATG 119 FAYOLEE L H VLLEOKIPENEAOG H CB1 71 505 CCTGCCACAGTTGGAGATGGTGGTCTCTTTGAGAAGAAGCTATGGGGCTTGAAGGTCCTTCAAGAGCTCTCA 143 PATVGDGGLFE K K L W G L K V L Q E L S . T2 577 CAGTGGACTGTGAGGTCTATCCATGACCTTCGTGTCATTTCTTCTCATCAGATGGGAATCTCAGCACTTGAG 167 QWTVRSIHDLRVISSHQMG I S A L E CB2 649 AGCCATTATGGGGCCAAAGATAAGCAGATGTAGCCATTCGCTCATACCTCTGTCTCCCTTTTTGATCTAATG 191 SHVGAKDKO M *

721 AAATATTGATAGTTCCCTGGAGCCTAGTTTTCTCAGCATCAATTTTGGAACACTTTAGACCACATGCATTTC 793 ATCAAGTAGGGTTGGCCCACATATGAATAGATAGATATACATGGTTATTCTGGCTATGCAAATGTGTGCACC 865 CATTTTGGTTTGCATTGGGTGGTATAATAAATGGATGGCCCACCTATCCCTTTCACCATAGTAGTGCTTTAA 937 CCTTCCTGATACTAAGTAACCTTTTCAGGTGTTTAACAGTCTTACAGGCAGAAGAGAAATTGTAACTCGTTT 1009 TGGTTGACTTCTGAAAAGACTGAATAAACAAATTGGAAGTCCTAGACTATCTTCATTCAAACTACCCGAATA 1081 AAAAGAGTATTGTTGTACAGAGAAAAAAAAAAA ou b) GTGCA CAATCCCATTAGTAGAGAATGCCAGTGGGTTTAGTCTTTGAGAGTCACATCTCTTATT7G GACCAGTATAGACAGAAGTAAACCCAGCTGACTTGTTTCCTGGGACAGTTGAGTTAAGGG MAFTEHSPLTPHRRDLCSRS ATGGCTTTCACAGAGCATTCACCGCTGACCCCTCACCGTCGGGACCTCTGTAGCCGCTCT IWLARKIRSDLTALTE5YVK ATCTGGCTAGCAAGGAAGATTCGTTCAGACCTGACTGCTCTTACGGAATCCTATGTGAAG HQGLNKNINLDSADGMPVAS CATCAGGGCCTGAACAAGAACATCAACCTGGACTCTGCGGATGGGATGCCAGTGGCAAGC TDQWSELTEAERLQENLQAY actgatcagtggagtgagctgaccgaggcagagcgactccaagagaaccttcaagcxtat RTFHVLLARLLEDQQVHFTP cgtaccttccatgttttgttggccaggctcttagaagaccagcaggtgcattttacccca tegdfhqaihtlllqvaafa accgaaggtgacttccatcaagctatacatacccttcttctccaagtcgctgcctttgca YQIEELMILLEYKIPRNEAD taccagatagaggagttaatgatactcctggaatacaagatcccccgcaatgaggctgat GMP INVGDGGLFEKKLWGLK gggatgcctattaatgttggagatggtggtctctttgagaagaagctgtggggcctaaag VLQELSQWTV RS I HDLRF IS gtgctgcaggagctttcacagtggacagtaaggtccatccatgaccttcgtttcatttct shqtgipargshyiannkkm tctcatcagactgggatcccagcacgtgggagccattatattgctaacaacaagaaaatg tagcagttagtcccttctctcttccttactttctcttctaatggaatatgcgtagtt

71 505 6526-030-118 de tal modo que a molécula de ADN seja expressa pelo microrganismo; e isolar a proteína de factor neurotrófico ciliar ou fragmento expressos.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o microrganismo ser uma bactéria.
4 - Processo de produção de proteína de factor neurotrófico ciliar ou de um seu fragmento, caracterizado por compreender (a) fazer crescer um microrganismo recombinante contendo uma molécula de ADN na qual a expressão da sequência de ácido nucleico codificando a proteína ou o fragmento peptídico de factor neurotrófico ciliar é regulada por uma segunda sequência de ácido nucleico, sob condições tais que a molécula de ADN seja expressa por esse microrganismo; e (b) isolar a proteína de factor neurotrófico ciliar ou fragmento expressos.
5 - Processo de produção de proteína de factor neurotrófico ciliar ou de um seu fragmento, caracterizado por compreender (a) fazer crescer um microrganismo recombinante contendo uma molécula de ADN com uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência essencialmente homóloga à apresentada em b) da reivindicação 2, ou uma sua porção hibridável quando contida em pCMV--rCNTF-C-1, sob condições tais que a molécula de ADN seja expressa pelo microrganismo; e (b) isolar a proteína de factor neurotrófico ciliar ou fragmento expressos.
6 - Processo de produção de proteína de factor neurotrófico ciliar ou de um seu fragmento, caracterizado por compreender (a) fazer crescer um hospedeiro recombinante contendo uma molécula de uma ADN com/sequência ou subsequência de ácido nucleico codificando factor neurotrófico ciliar essencialmente como apresentada em a) da reivindicação 2, sob condições tais que a molécula de ADN seja expressa pelo hospedeiro; e em seguida (b) isolar a proteína de factor neurotrófico ciliar ou fragmento expressos.
7 - Processo de produção de proteína de factor neurotrófico ciliar ou de um seu fragmento, caracterizado por compreender (a) fazer crescer um hospedeiro recombinante contendo uma molécula de ADN como a apresentada em b) na reivindicação 2, sob condições

71 505 6526-030-118 -119- tais que a molécula de ADN seja expressa pelo hospedeiro; e em seguida (b) isolar a proteina de factor neurotrófico ciliar ou fragmento expressos.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado por o hospedeiro ser uma célula eucariótica.
9 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz de uma proteina de factor neurotrófico ciliar essencialmente pura, com um portador farmaceuticamente adequado.
10 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica capaz de aumentar a sobrevivência ou o crescimento de neurónios ou capaz de suportar a função diferenciada da célula, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz de um fragmento peptidico ou derivado de factor neurotrófico ciliar, funcionalmente activo e essencialmente puro, com um portador farmaceuticamente adequado.
11 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica capaz de aumentar a sobrevivência ou o crescimento de neurónios ou capaz de suportar a função diferenciada da célula, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz de um fragmento peptidico ou derivado de factor neurotrófico ciliar, essencialmente puro, comportando um determinante antigénico, com um portador farmaceuticamente adequado.
12 - Processo de· acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por o fragmento peptidico ou derivado de factor neurotrófico ciliar compreender, pelo menos, uma porção da sequência de aminoácidos essencialmente como se apresenta em a) da reivindicação 2.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o fragmento peptidico ou derivado de factor neurotrófico ciliar compreender, pelo menos, uma porção da sequência de aminoácidos essencialmente como segue: MVLLEQKIPENEADGMP ATVGDGGLFEK.

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14 - Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por o fragmento peptidico ou derivado de -factor neurotrófico ciliar compreender, pelo menos, uma porção da sequência de aminoácidos essencialmente como se apresenta em b) da reivindicação 2, para a sequência de aminoácidos humana.
15 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o fragmento peptidico ou derivado de factor neurotrófico ciliar compreender, pelo menos, uma porção da sequência de aminoácidos essencíalmente como segue: MILLEYKIPRNEADGMP INVGDGGLFEK.
16 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a proteína de factor neurotrófico ciliar compreender a sequência de aminoácidos essencialmente como se apresenta em a) da reivindicação 2.
17 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a proteína de factor neurotrófico ciliar compreender. a sequência de aminoácidos essencialmente como se apresenta em b) da reivindicação 2 para a sequência de aminoácidos humana.
18 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz do produto preparado nas reivindicações 1, 5 ou 6, com um portador farmaceuticamente adequado.
19 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz do produto preparado na reivindicação 2 com um portador farmaceuticamente adequado.
20 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz do produto preparado nas reivindicações 1, 5 ou 6, isento de detergente, com um portador farmaceuticamente adequado.
21 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz do produto preparado nas reivindicações 1, 5 ou 6, glicosado com um

71 505 6526-030-118 -121 portador farmaceuticamente adequado.
22 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar uma quantidade eficaz do produto preparado na reivindicação 2, glicosado,com um portador farmaceuticamente adequado.
23 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz do produto preparado nas reivindicações 1, 5 ou 6, não.glicosado, com um portador farmaceuticamente adequado.
24 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz do produto preparado na reivindicação 2 não glicosado , com um portador farmaceuticamente adequado.
25 - Processo de acordo com a reivindicação 10, 11, 13, 15 ou 16, caracterizado por a proteína, péptido ou derivado estarem glicosados.
26 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a proteína, péptido ou derivado estarem glicosados.
27 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a proteína, péptido ou derivado estarem glicosados.
28 - Processo de acordo com a reivindicação 10, 11, 13, 15 ou 16, caracterizado por a proteína, péptido ou derivado não estarem glicosados.
29 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a proteína, péptido ou derivado não estarem glicosados.
30 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a proteína, péptido ou derivado não estarem glicosados.
31 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz de uma combinação de proteína ou fragmento peptídico de factor neurotrófico ciliar ou de um seu derivado,substancialmente puros, e de um segundo agente, com um portador farmaceuticamente adequado.

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32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteriza-do por o segundo agente ser factor de crescimento de nervo.
33 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteriza-do por o segundo agente ser factor neurotrófico derivado de cérebro.
34 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteriza-do por o segundo agente ser factor de crescimento de fibroblasto básico.
35 - Processo para o diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, em particular um tumor ou uma doença degenerativa, caracterizado por compreender : (a) fazer contactar um tecido com uma molécula de ácido nucleico marcada detectavelmente, a qual contém, pelo menos, dez nucleótidos essencialmente como se apresentam na reivindicação 2 a), sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.
36 - Processo para o diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, em particular um tumor ou uma doença degenerativa, caracterizado por compreender: (a) fazer contactar um tecido com uma molécula de ácido nucleico marcada detectavelmente, a qual contém, pelo menos, dez nucleótidos essencialmente como se apresentam na reivindicação 2b), da sequência de factor neurotrófico ciliar humano, sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.
37 - Processo para o diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, em particular um tumor ou uma doença degenerativa, caracterizado por compreender: (a) fazer contactar ARN recolhido de um tecido com uma molécula de ácido nucleico marcada detectavelmente, a qual contém, pelo menos, 10 nucleótidos essen-

71 505 6526-030-118 -123 cialmente como se apresenta na reivindicação 2 a), sob condições que permitam a ocorrência da hibri-dação; e (b) d&t&ctar qualquer hibridação que tenha ocorrido.
38 - Processo para o diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, em particular um tumor ou uma doença degenerativa, caracterizado por compreender: (a) fazer contactar ARN recolhido de um tecido,com uma molécula de ácido nucleico marcada detectavelmente, a qual contém, pelo menos, 10 nucleótidos essencialmente como se apresenta na reivindicação 2 b), para a sequência de factor neurotrófico ciliar humano, sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.
39 - Processo para o diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, em particular um tumor ou uma doença degenerativa, caracterizado por compreender: (a) fazer contactar ADNc, produzido a partir de ARN recolhido de um tecido,com uma molécula de ácido nucleico marcada detectavelmente, a qual contém, pelo menos, 10 nucleótidos essencialmente como se apresenta na reivindicação 2 a), sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.
40 - Processo para o diagnóstico de uma doença ou desordem do sistema nervoso, em particular um tumor ou uma doença degenerativa, caracterizado por compreender: (a) fazer contactar ADNc, produzido a partir de ARN recolhido de um tecido,com uma molécula de ácido nucleico marcada detectavelmente, a qual contém, pelo menos, 10 nucleótidos essencialmente como se apresenta na reivindicação 2 b), para a sequência 71 505 6526-030-118 -124-

de factor neurotrófico ciliar humano, sob condições que permitam a ocorrência da hibridação; e (b) detectar qualquer hibridação que tenha ocorrido.
41 - Processo para o isolamento de factor neurotrófico ciliar (CNTF) substancialmente puro, caracterizado por compreender : (a) preparar um extracto de tecido que se sabe ou se suspeita que contém factor neurotrófico ciliar; (b) fraccionar actividade do factor neurotrófico ciliar por cromatografia de permuta iónica; (c) recolher actividade neurotrófica ciliar a partir de electroforese preparativa de SDS-gel de poliacril-amida; (d) purificar o factor neurotrófico ciliar usando uma coluna de FPLC ou de HPLC de fase inversa, biologicamente inerte; e (e) concentrar factor neurotrófico ciliar sob uma atmosfera inerte.
42 - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por o tecido ser tecido de olho de embrião de pintainho.
43 - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por o tecido ser nervo ciático.
44 - Processo de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado por a coluna de FPLC ou HPLC de fase inversa e inerte ser revestida com um metal inerte.
45 - Processo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado por o metal inerte ser ouro.
46 - Processo de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado por a coluna de fase inversa inerte ser uma coluna Bakerbond Gold C4 Widepore.
47 - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por o factor neurotrófico ciliar ser concentrado sob uma

71 505 6526-030-118 atmosfera de árgon.
48 - Processo para purificar factor neurotrófico ciliar, o qual compreende preparar um extracto de tecido que se sabe ou suspeita que contenha factor neurotrófico ciliar, fraccionar a actividade de factor neurotrófico ciliar por cromatografia de permuta iónica e recolher actividade de factor neurotrófico ciliar a partir de electroforese preparativa em SDS - gel poliacrilamida, caracterizado por compreender purificar adicionalmente o factor neurotrófico ciliar por cromatografia, usando uma coluna HPLC ou FPLC biologicamente inerte.
49 - Processo para purificar factor neurotrófico ciliar, o qual compreende preparar um extracto de tecido que se sabe ou suspeita que contenha factor neurotrófico ciliar, fraccionar actividade de factor neurotrófico ciliar por cromatografia de permuta iónica e recolher actividade de factor neurotrófico ciliar a partir de electroforese preparativa em SDS - gel de poliacrilamida, caracterizado por compreender uma purificação adicional do factor neurotrófico ciliar por cromatografia, usando uma coluna Bakerbond Gold 04 Widepore.
50 - Processo para aumentar a absorção e incorporação de GABA em células hipocâmpicas, caracterizado por compreender expõr as células hipocâmpicas a uma concentração eficaz de CNTF.
51 - Processo para aumentar a expressão de proteínas de neurofilamentos em células hipocâmpicas, caracterizado por compreender expor as células hipocâmpicas a uma concentração eficaz de CNTF.
52 - Processo para o aumento da sobrevivência de células hipocâmpicas, caracterizado por compreender expor as células hipocâmpicas a uma concentração eficaz de CNTF.
53 - Processo para o aumento da sobrevivência de astrócitos hipocâmpicos, caracterizado por compreender expor os astrócitos hipocâmpicos a uma concentração eficaz de CNTF.
54 - Processo para o aumento da sobrevivência de neurónios motores, caracterizado por compreender expor os neurónios motores 71 505 6526-030-118 -126-

a uma concentração eficaz de CNTF.
55 - Processo para o aumento da sobrevivência de neurónios da espinal medula ventral, caracterizado por compreender expor os neurónios da espinal medula ventral a uma concentração eficaz de CNTF.
56 - Processo de promoção da expressão de colina-acetil-transferase em neurónios da espinal medula ventral, caracterizado por compreender expor os neurónios da espinal medula ventral a uma concentração eficaz de CNTF.
57 - Processo para a medição da quantidade de CNTF numa amostra, caracterizado por compreender: (i) ligar um primeiro anticorpo anti-CNTF a um suporte sólido; (ii) expor o primeiro anticorpo imobilizado do passo (i) a uma solução que compreende CNTF, sob condições que permitam a ligação de CNTF ao primeiro anticorpo; (iii) expor o CNTF ligado ao primeiro anticorpo anti--CNTF a um segundo anticorpo anti-CNTF, sob condições que permitam a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF; e (iv) detectar a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF, sendo o primeiro anticorpo, o anticorpo monoclonal RP3-12, depositado no ATCC com o número de acesso
58 - Processo para a medição da quantidade de CNTF numa amostra, caracterizado por compreender: (i) ligar um primeiro anticorpo anti-CNTF a um suporte sólido; (ii) expor o primeiro anticorpo imobilizado do passo (i) a uma solução que compreende CNTF, sob condições que permitam a ligação de CNTF ao primeiro anticorpo; -127- expor o CNTF ligado ao primeiro alTt^corpcF' anti--CNTF a um segundo anticorpo anti-CNTF, sob condições que permitam a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF; e detectar a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF, sendo o primeiro anticorpo, o anticorpo monoclonal RP12-2, depositado no ATCC com o número de acesso . J
59 - Processo para a medição da quantidade de CNTF numa amostra, caracterizado por compreender: (i) ligar um primeiro anticorpo anti-CNTF a um suporte sólido; (ii) expor o primeiro anticorpo imobilizado do passo (i) a uma solução que compreende CNTF, sob condições que permitam a ligação de CNTF ao primeiro anticorpo; (iii) expor o CNTF ligado ao primeiro anticorpo anti--CNTF a um segundo anticorpo anti-CNTF, sob condições que permitam a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF; e J 71 505 6526-030-118 (iii) (iv)

(iv) detectar a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF, sendo o segundo anticorpo, o anticorpo monoclonal RP3-12, depositado no ATCC com o número de acesso *
60 - Processo para a medição da quantidade de CNTF numa amostra, caracterizado por compreender: (i) ligar um primeiro anticorpo anti-CNTF a um suporte sólido; (ii) expor o primeiro anticorpo imobilizado do passo (i) a uma solução que compreende CNTF, sob condições que permitam a ligação de CNTF ao primeiro anticorpo; 71 505 6526-030-118 (iii) expor o CNTF ligado ao primeiro anticorpo anti--CNTF a um segundo anticorpo anti-CNTF, sob condições que permitam a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF; e (iv) detectar a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF, sendo o segundo anticorpo, o anticorpo monoclonal RP12-2, depositado no ATCC com o número de acesso ♦ j
61 - Processo para a medição da quantidade de CNTF numa amostra, caracterizado por compreender: (i) ligar um primeiro anticorpo anti-CNTF a um supoi— te sólido; (ii) expor o primeiro anticorpo imobilizado do passo (i) a uma solução que compreende CNTF, sob condições que permitam a ligação de CNTF ao primeiro anticorpo; (iii) expor o CNTF ligado ao primeiro anticorpo anti--CNTF a um segundo anticorpo anti-CNTF, sob condições que permitam a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF; e J

(iv) detectar a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF, sendo o primeiro anticorpo RP3-12, e o segundo anticorpo RP12-2, depositados no ATCC com os números de acesso } res- pectivamente,
62 - Processo para a medição da quantidade de CNTF numa amostra, caracterizado por compreender: (i) ligar um primeiro anticorpo anti-CNTF a um suporte sólido; (ii) expor o primeiro anticorpo imobilizado do passo (i) a uma solução que compreende CNTF, sob condições que permitam a ligação de CNTF ao primeiro anticorpo; -129- 71 505 6526-030-118 (iii) expor o CNTF ligado áo primeiro anticorpo anti--CNTF a um segundo anticorpo anti-CNTF, sob condições que permitam a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF; e (iv) detectar a ligação do segundo anticorpo anti-CNTF a CNTF, sendo o primeiro anticorpo RP12-2, e o segundo anticorpo RP3-12, depositados no ATCC com os números de acesso , res- pectivamente.
63 - Processo de acordo com a reivindicação 54, caracteriza-do por compreender ainda expor os neurónios motores a uma concentração eficaz de factor de crescimento de fibroblasto básico.
64 - Processo de acordo com a reivindicação 55, caracteriza-do por compreender expor os neurónios motores a uma concentração eficaz de factor de crescimento de fibroblasto básico. Lisboa, 14. SET. 1990 Por MAX PLANCK INSTITUT FUR PSYCHIATRIE e REGENERON PHARMACEUTICALS, INC. - 0 AGENTE OFICIAL -