DD298133A5 - Ziliarer neurotroper faktor - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsaeuresequenzen, die den ziliaren neutrophen Faktor (CNTF) kodieren, sowie die daraus erzeugten Proteine, Peptide und Derivate. Diese sind zur Behandlung einer Vielzahl neurologischer Krankheiten und Stoerungen verwendbar. Weiter koennen die CNTF-Nukleinsaeuren, Proteine und Peptide zur Behandlung von Motorneuronenerkrankungen angewendet werden. Nach der Erfindung ist CNTF auch zur Wiederherstellung der Gesichtsnervenfunktion bei der Bellschen Laehmung und zur Unterstuetzung des Wachstums von Rueckenmarksneuronen verwendbar. Ferner liefert die Erfindung eine neuartige Methode zur Erzeugung von chemisch reinem CNTF. Die Erfindung bietet erstmalig ein Mittel zur Produktion von Human-CNTF unter Verwendung von Nukleinsaeuresequenzen, die Human-CNTF kodieren. Weiter ist ein Peptidfragment mit CNTF-Aktivitaet festgestellt worden, und es wurde ein Antikoerper gegen ein CNTF-Peptid erzeugt, der die CNTF-Aktivitaet neutralisiert.{ziliar; neurotroph; Faktor; Nukleinsaeuresequenz; neurologisch; Krankheit; Stoerung; Human-CNTF; CNTF-Peptid; CNTF-Aktivitaet}

Description

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Ziliarer neurotropher Faktor

1. Einführung

Die Erfindung betrifft rekombinanue DNA-Moleküle, die den ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) kodieren, sowie daraus abgeleitete Peptide und Proteine. Die CNTF- und verwandte Moleküle, die gemäß der Erfindung erzeugt werden, können zur Behandlung einer Vielzahl neurologischer Störungen angewendet werden.

2. Ausgangssituation der Erfindung

2.1. Biologie des neurotrophen Faktors

Es sind eine Reihe von Faktoren festgestellt worden, die das

Wachstum und die Entwicklung im Nervensystem beeinflussen. Man glaubt, daß diese Faktoren bei der Lebenserhaltung von Neuronenpopulationen im vollentwickelten wie im nicht vollentwickelten Nervensystem eine wichtige Rolle spielen.

Bei der normalen Entwicklung vieler Neuronenpopulationen gibt es einen definierten Zeitraum für den Zelltod, innerhalb dessen viele Elemente der Ausgangspopulation sterben (Hamburger und Levi-Montalcini, 1949, J. Exp. Zool. 111:457-507; Hamburger, 1958, Amer. J. Anat. 102:365-410; Hamburger, 1975, J. Comp. Neurol. 160:535-546; Cowan und Wenger, 1968, Z. Exp. Zool., 168:105-124; Rogers und Cowan, 1973, J. Comp. Neurol. 147:291-320; Clarke und Cowan, 1976, J.Comp. Neurol. 167:143-164; Clarke u.a., 1976, J. Comp. Neurol. 167:125-142; Hollyday und Hamburger, 1976, J. Comp. Neurol. 170:311-320; Varon und Bunge, 1978, Annu. Rev. Neurosci. 1:327-362; Cowan u.a,, 1984, Science 225:1258-1265). Es ist gezeigt worden, daß das Überleben der Neuronen proportional zur Größe des innervierten Gebiets ist; je kleiner das Zielgebiet einer vorgegebenen Neuronenpopulation, desto kleiner ist die Zahl der Neuronen, welche die Zelltodperiode überleben. Es ist darauf hingewiesen worden, daß die im Zielgebiet vorhandene Menge des neurotrophen Faktor^ u.U. mit dem Überleben der Neuronen im Zusammenhang steht.

Der Nervenwachsturnsfaktor (NGF) ist von diesen neurotrophen

Molekülen bei weitem am vollständigsten charakterisiert, und es ist sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen worden, daß er für das Überleben sympathischer und neuraler, aus der Neuralleiste gewonnener Sensorneuronen während der Frühentwicklung von Küken sowie von Ratten unentbehrlich ist (Levi-Montalcini und Angeletti, 1963, Develop. Biol. 7:653-659; Levi-Montalcini u.a., 1968, Physiol. Rev. 48:524-569). Es ist festgestellt worden, daß Injektionen von reinem NGF beim Kükenembryo im Entwicklungsstadium zu massiver Hyperplasie und Hypertrophie spinaler Sensorneuronen und sympathischer Neuronen führen (Levi-Montalcini und Booker, I960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:373-384; Hamburger u.a., 1981, J. Neurosci. 1:60-71). Umgekehrt ist die Entfernung bzw. Sequestration von endogenem NGF durch tägliche Injektion von Anti-NGF-Antikörpern bei neonatalen Ratten mit der faktischen Vernichtung des sympathischen Nervensystems in Verbindung gebracht worden (Levi-Montalcini und Booker, 1960, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 46:384-391; Levi-Montalcini und Angeletti, 1966, Pharmacol. Rev. 18:619-628). Es ist nachgewiesen worden, daß die Einwirkung von NGF-Antikörpern in einem noch früheren Entwicklungsstadium, entweder durch Antikörper-Injektionen in utero oder durch passive transplazentale Übertragung mütterlicher Antikörper, zu einem weitgehenden Verlust an neuralen, aus der Neuralleiste gewonnenen Sensorneuronen , wie z.B. spinalen und dorsomedialen trigeminalen Sensorneuronen führt (Goedert u.a., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. тт.S.A. 81:1580-1584; Gorin und Johnson, 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76:5382-5386). Bis vor kurzem konzentrierten sich alle Untersuchungen des NGF auf seine Rolle im peripheren Nervensystem, jedoch hat es jetzt den Anschein, daß der NGF auch die Entwicklung und Erhaltung spezifischer Neuronenpopulationen im zentralen Nervensystem beeinflußt (Thoenen u.a., 1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109:145-178; Whittemore und Seiger, 1987, Brain Res. Rev. 12:439-464).

Zu den neurotrophen Faktoren, die nicht so gut beschrieben sind, gehören der aus dem Hirn gewonnene neurotrophe Faktor (BDNF) und der ziliare neurotrophe Faktor (CNTF).

2.2. Ziliarer neurotropher Faktor

Ziliare neurotrophe Faktoren (CNTFs) sind Proteine, die speziell für das Überleben ziliarer embryonaler Küken-Ganglionneuronen іл vitro erforderlich sind (Manthorpe u.a., 1980, J. Neurochem. 34, 69-75). Das ziliare Ganglion befindet sich anatomisch in der Augenhöhle, zwischen dem äußeren geraden Augenmuskel und der Sehnervscheide ; zu ihm führen Nervenfasern vom Okulomotorius, die den Zillarmuskel und den Pupillenverengerer sowie den in der Chorioidea des Auges vorhandenen glatten Muskel innervieren.

Es ist festgestellt worden, daß Ziliarganglionneuronen zu den Neuronenpopulationen gehören, die definierte Perioden des Zelltods aufweisen. Beim Küken-Ziliarganglion ist beobachtet worden, daß die Hälfte der am Embryonentag 8 (E8) vorhandenen Neuronen vor E14 sterben (Landmesser und Pilar, 1974, J. Physiol. 241:737-749). Während des gleichen Zeitraums bilden die Ziliarganglionneuronen Verbindungen mit ihren Zielgeweben aus, nämlich dem Ziliarkörper und der Chorioidea des Auges. Landmesser und Pilar (1974, J. Physiol. 241:715-736) beobachteten, daß die Entfernung eines Auges vor der Periode des Zelltodes zum nahezu vollständigen Verlust der Ziliarganglionneuronen im ipsilateralen Ganglion führt. Umgekehrt beobachteten Narayanan und Narayanan (1978, J. Embryol. Ex. Morphol. 44:53-70), daß durch Implantation eines zusätzlichen Augenprimordiums und damit Vergrößerung der Menge des verfügbaren Zielgewebes der Zelltod der Ziliarganglionneuronenzellen vermindert werden kann. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Existenz ejnes neurotrophen Faktors, der auf Ziliarganglionneuronen einwirkt.

Es ist festgestellt worden, daß Ziliarganglion- (CG-) Neuronen in Kultur einen bzw. mehrere Faktoren zum Überleben benötigen. Die Aktivität eines oder mehrerer ziliarer neurotropher Faktoren (CNTF) ist in mit Kükenmuskelzellen angesetzten Medien (Bennet und Nurcombe, 1979, Brain Res. 173: 543-548; Nishi und Berg, 1979, Nature 277:232-234; Varon u.a., 1979, Brain Res. 173:29-45), in Muskelextrakten (McLennan und Hendry, 197G, Neurosci. Lett. 10:269-273; Bonhady u.a., 1980, Neurosci. Lett. 18:197-201), in Kükenembryonen-Extrakt (Varon u.a., 1979, Brain

Res. 173:29-45; Tuttle u.a., 1980, Brain Res. 183:161-180) und in einem mit Herzzellen angesetztem Medium festgestellt worden (Helfand u.a., 1976, Dev. Biol. 50:541-547; Helfand u.a., 1978, Exp. Cell Res. 113:39-45; zur Diskussion siehe auch Adler u.a., 1979, Science 204:1434-1436, und Barbin u.a., 1984, J. Neurochem. 43:1468-1478).

Adler u.a. (1Э79, Science 204:1434-1436) verwendeten ein Testsystem, das auf Mikrotiterplatten-Kulturen von Ziliarganglion-(CG-) Neuronen basierte, um zu zeigen, daß eine sehr reiche CNTF-Quelle in den von den CG-Neuronen innervierten intraokularen Zielgeweben gefunden wurde. Von 8000 trophischen Einheiten (TU), die in einem zwölf Tage alten Embryo vorhanden waren, wurden 2 500 TU im Augengewebe vorgefunden; die Aktivität war offenbar in einer Fraktion lokalisiert, die den Ziliarkörper und die Chorioidea enthielt, wobei die spezifische Aktivität etwa zwanzigmal höher war als die in Extrakten des gesamten Embryos festgestellte Aktivität.

Später berichteten Barbin u.a. (1984, J. Neurochem. 43:1468-1478) über ein Verfahren zur Reinigung von CNTF aus Kükenembryonen-Augengewebe. Es wurde auch festgestellt, daß CNTF-Aktivität in Verbindung mit CG-freien Geweben, einschließlich des Hüftnervs von Ratten, auftrat (Williams u.a., 1984, Int. J. Develop. Neurosci 218:460-470). Manthorpe u.a. (1986, Brain Res. 367:282-286) berichteten über die Reinigung von Säugetier-CNTF-Aktivität aus Hüftnervextrakten erwachsener Ratten unter Anwendung eines Fraktionierungsverfahrens ähnlich demjenigen, das zur Isolierung der CNTF-Aktivität aus dem Kükenauge benutzt wurde. Außerdem beschrieben Watters und Hendry (1987, J. Neurochem. 49:705-713) ein Verfahren zur Reinigung einer ca. 20000-fachen CNTF-Aktivität aus Rinderherzgewebe unter nicht denaturierenden Bedingungen durch Anwendung der Heparin-Affinitätschromatographie. CNTF-Aktivität ist auch in geschädigtem Hirngewebe festgestellt worden (Manthorpe u.a., 1983, Brain Res. 267:47-56; Nieto-Sampedro u.a., 1983, J. Neurosci. 3:2219-2229).

Carnow u.a. (1985, J. Neurosci. 5:1965-1971) und Rudge u.a. (1987, Develop. Brain Res. 32:103-110) beschreiben Verfahren zur Feststellung von CNTF-Aktivität aus Gewebeextrakten nach dem

Übertragen von elektrophoretisch getrennten Zellextrakten auf Nitrozellulosepapier (Western blotting) und anschließende Identifikation der Proteinbanden, die CNTF-Aktivität enthalten, durch Beeimpfen der Nitrozellulose mit CG-Neuronen und Feststellung der Überlebensbereiche der Zellen mittels Vitalfarben. Diese Verfahren wurden zur Bestimmung der scheinbaren Molekulargewichte der aktiven Polypeptide in Rohextrakten angewendet. Unter Anwendung dieses Verfahrens beobachteten Carnow u.a. (1985, J. Neurosci. 5:1965-1971)*, daß aus dem Hüftnerv- und Hirngewebe erwachsener Ratten gewonnene CNVF-Aktivitäten offenbar eine andere Große aufweisen (24 Kd) als Küken-CNTF (20,4 Kd) .

2.3. Funktionelle Eigenschaften des ziliaren neurotrophen Faktors

Eine Reihe biologischer Effekte ist dem CNTF zugeschrieben worden, obwohl die molekulare Natur dieser Aktivitäten nicht gut verstanden wurde. Wie oben erörtert, wurde der CNTF ursprünglich eis eine Aktivität beschrieben, die das Überleben von Neuronen des E8-Kükenziliarganglions unterstützte, das ein Bestandteil des parasympathischen Nervensystems ist. Es folgt eine Beschreibung anderer biologischer Eigenschaften von Präparaten, von denen bekannt ist, daß sie eine CNTF-Aktivität enthalten:

Saadat u.a. (1989, J. Cell Biol. 108:1807-1816) beobachteten, daß ihr besonders hochreines Präparat aus Rattenhüftnerv-CNTF in Kultur eine cholinerge Differenzierung von Neuronen des Ganglion cervicale superius neugeborener Ratten auslöste. Ebenso fand Hoffman (1988, J. Neurochem. 51:109-113), daß aus dem Kükenauge gewonnene CNTF-Aktivität die Konzentration der Cholin-O-azetyltransferase-Aktivität in Netzhaut-Einschichtenkulturen erhöhte.

Hughes u.a. (1988, Nacure 335:70-73) untersuchte eine Population bipotentialer Gliavorläuferzellen im perinatalen Rattensehnerv und -gehirn; von dieser Zellpopulation nimmt man an, daß sie erstens zu Oligodendrozyten und dann zweitens zu Astrozyten vom Typ 2 führt. Untersuchungen haben darauf schließen lassen, daß die Differenzierung von einer Vorläuferzelle für Oligodendrozyten/Astrozyten vom Typ 2 (0-2A-Vorläuferzelle) zu Oligodendrozyten ohne irgendeinen besonderen Wachstumsfaktor

erfolgt, während die Differenzierung zu Astrozyten vom Typ 2 anscheinend das Vorhandensein eines spezifischen auslösenden Proteins erfordert. Hughes u.a, beobachteten, daß das induzierende Protein für Astrozyten vom Typ 2 dem CNTF ähnlich oder mit ihm identisch ist (siehe auch Anderson, 1989, Trends Neurosci. 13:83-85).

Heymanns und Unsicker (1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84:7758-7762) beobachteten, daß Ultrazentrifugcm-Überstände von Neuroblastomzellextrakten Effekte ähnlich denjenigen bewirkten, die in Verbindung mit der aus Kükenaugen- bzw. Rattenhüftnervgewebe gewonnenen CNTF-Aktivität auftraten; dies ließ auf die Gegenwart eines dem CNTF (dem Molekulargewicht nach) ähnlichen, aber nicht mit ihm identischen Proteins schließen.

Ebendal (1987, J. Neurosci. Res. 17:19-24) suchte nach CNTF-Aktivität in einer Vielzahl von Ratten- und Kükengeweben. Er beobachtete eine ziemlich große Auswahl von Aktivitäten, die das Überleben von Ziliarneuronen förderten, in Ratten-, jedoch nicht in Kükengeweben; es wurde festgestellt, daß Leberzellen, MiIz-T-Zellen und Zellen der Glandula submandibularis von Ratten mit einer geringen CG-überlebensfördernden Aktivität verbunden waren, während Herz-, Hirn- und Skelettmuskelgewebe mit einer höheren überlebensfördernden Aktivität verbunden waren. Bei den getesteten Geweben wurde die höchste CNTF-Aktivität in Verbindung mit der Rattenniere beobachtet.

Wenn auch die obigen Untersuchungen gezeigt haben, daß viele Gewebe- und Zellextrakte Aktivitäten mit ähnlichen Eigenschaften wie CNTF enthalten, (d.h. sie fördern das Überleben von E8-Küken-Ziliarganglionneuronen in einem Gewebekultur-Biotest), so kann doch nicht angenommen werden, daß ein einziges oder identisches Protein für diese Aktivitäten verantwortlich ist. Wie beispielsweise für die Familie der Fibroblas^enwachstumsfaktoren (FGFs) gezeigt wurde, können eine Reihe verschiedener Polypeptide bzw. Proteine in einem einzelnen Biotest eine identische biologische Aktivität aufweisen.

Es wurde zunächst eine Überschneidung zwischen der neuronalen Spezifität von Kükenaugen- und Rattenhüftnerv-CNTF mit Neurowenpopulationen festgestellt, die auf den NGF reagierten. Bei

Untersuchungen zur Rolle von CNTF und NGF in sich entwickelnden Neuronenpopulationen wurden jedoch die charakteristischen Unterscheidungsmerkmale zwischen CNTF und NGF besonders deutlich sichtbar. Skaper und Varon (1986, Brain Res. 38S:39-46) untersuchten die Überlebensbedingungen der Spinalganglion-(DRG) Neuronen von Küken in der Zeit vom Embryonentag 6,5 (E6,5) bis E15. Es wurde beobachtet, daß diese DRG-Neuronen, die zunächst nur auf NGF reagierten, später ebenso reaktionsfähig gegenüber CNTF wurden und schließlich eine immer geringere Reaktionsfähigkeit gegenüber dem einen wie dem anderen Faktor aufwiesen. Neben den verschiedenen Rollen in der Entwicklung kann der CNTF vom NGF auch durch das Molekulargewicht, den isoelektrischen Punkt, die mangelnde Inaktivierungsfähigkeit durch NGF-Antikörper sowie durch die Fähigkeit von CNTF zur Unterstützung des Überlebens von NGF-unempfanglichen CG-Neuronen in vitro unterschieden werden (Barbin u.a., 1984, J. Neurochem. 43:1468-1478).

3. Summarische Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die den ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) kodieren, sowie die daraus erzeugten Proteine, Peptide und Derivate. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, Proteine und Peptide bei der Behandlung einer Vielzahl neurologischer Krankheiten und Störungen eingesetzt werden, einschließlich der Alzheimerschen und der Parkinsonschen Krankheit, jedoch nicht darauf beschränkt.

In weiteren Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen CNTF-Nukleinsäuren, Proteine und Peptide zur Behandlung von Motorneuronerkrankungen angewendet werden, einschließlich der amyotrophen Lateralsklerose (Lou Gehrigsche Krankheit), jedoch nicht darauf beschränkt. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann CNTF zur Wiederherstellung der Gesichtsnervenfunktion bei der Bellschen Lähmung eingesetzt werden. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann CNTF zur Unterstützung des Wachstums von Rückenmarksneuronen verwendet werden, wodurch eine Methode zur Behandlung von durch Trauma, Infarktbildung, Infektion, Nahrungsmangel oder Toxine verursachten Rückenmarksschäden zur Verfügung steht.

Ferner liefert die Erfindung eine neuartige Methode zur Erzeugung von chemisch reinem CNTF.

Die Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Präparate, die wirksame Mengen von CNTF-Genprodukten enthalten, die bei der Diagnose und Behandlung einer Vielzahl neurologischer Krankheiten und Störungen einsetzbar sind.

Die Erfindung betrifft die Klonierung, Sequenzierung und Expression von CNTF und bietet erstmalig ein Mittel zur Produktion von Human-CNTF unter Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die Human-CNTF kodieren. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen CNTF-Nukleinsäuresequenzen zur Identifikation von Nukleinsäuresequenzen , die CNTF oder CNTF-homologe Moleküle kodieren, in einer Vielzahl von Spezies und Geweben einsetzbar. In weiteren spezifischen Ausführungsformen der Erfindung ist ein Peptidfragment mit CNTF-Aktivität festgestellt worden, und es wurde ein Antikörper gegen ein CNTF-Pep^id erzeugt, der die CNTF-Aktivität neutralisiert.

3.1. Abkürzungen

BRCN Bromzyan

CG Ziliarganglion

CNTF ziliarer neurotropher Faktor

DRG Spinalganglion

E8, E9 usw. Embryonentag 8 bzw. 9 usw,

GFAP saures Gliafibrillenprotein

NGF Nervenwachstumsfaktor

TU trophische Einheit. Eine trophische Einheit pro

ml ist gleich der CNTF-Aktivitätsmenge, welche die halbe maximale Neuronenüberlebensrate pro ml Kulturmedium unterstützt.

4. Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1. cDNA-Klonierung (a); Nukleotid und daraus abgeleitete Aminosäuresequenz von Ratten-CNTF (b). Die als Starter verwendeten Oligonukleotide sind in (c) dargestellt, ihre entsprechenden Positionen in (b) . Unterstrichene Aminosäuren in (b) entsprechen den Peptidsequenzen, die aus tryptischen (T1-T8) und BRCN-Frag-

menten (CBl-4) von CNTF gewonnen wurden. Auf der Nukleotid-Ebene sind Sequenzen, die dem Kodierungsbereich entsprechen, fettgedruckt, und die Polyadenylierungssignalsequenz ist unterstrichen. Aminosäuren-Zusammensetzung von CNTF, ermittelt an gereinigtem CNTF bzw. vorausgesagt nach der CNTF-cDNA (d).

Abb. 2. Zweidimensionale Gelelektrophorese von CNTF nach Reiniguncj (a) unter Anwendung der DEAE-Ionenaustauschchromatographie und der präparativen SDS-folyacrylamidgelelektrophorese; (b) unter Anwendung der DEAE-Ionenaustauschchromatographie, der präparativen SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und weiterer Reinigung mittels Chromatographie unter Verwendung einer Bakerbond Gold C4 Widepore - Säule.

Abb. 3. Überlebensrate kultivierter E8-Küken-Ziliarneuronen in Gegenwart von Überständen und Extrakten transfizierter HeLa-Zellen: Ziliarneuronen vom Embryonentag 8 wurden in Gegenwart von Überständen (a) und Extrakten (b) von HeLa-Zellen vermehrt, die mit Plasmid ohne Einfügung (Д) und mit .Plasmid, das den Ratten-CNTF-cDNA-Klon E in sense- (0) bzw. antisense-( ) Orientierung enthielt, transfiziert wurden.

Abb. 4. Northern-blot-Analyse von (a) CNTF-mRNA in Geweben der erwachsenen Ratte (die benutzten Abkürzungen sind: BR Kirn; LIV - Leber; KID - Niere; MC - Muskel; SK - Haut; SCI Hüftnerv; SP - Rückenmark) ; RNA, gewonnen aus dem Hüftnerv neugeborener (PO) , vier Tage alter (P4) und 13 Tage alter Jungratten.

Abb. 5. Rekombinanter rCNTF in drei verschiedenen E. coli-Stämmen. Spur 1 = Standard-Proteinmarker; die Molekulargewichte von drei Proteinen sind angegeben. Spuren 1-3: Gesamt-Proteinextrakt aus E. coli W3110qF-, E. coli HBlOl und E. coli MC1061, die jeweils als Wirt für pCP-rCNTF-C-1 dienten. Die Extrakte wurden präpariert und, wie früher beschrieben, auf 8-25%-igem Polyacrylamidgradient-Gel analysiert. (Panayotatos, N., und Fontaine, A., 1988, J. Biol. Chem. 260:3173-3177).

Abb. 6. a) PCR-erzeugte Human-CNTF-Sonde in Southern-blot-Hybridisierung zu Eco Rl - Sammlungen von Human- und Rattengenom-DNAs. b) Radioaktive Ratten-CNTF-Sonde in Southern-biot-

Hybridisierung zu Eco Rl - Samirlungen von Human- und Rattengenom-DNAs.

Abb. 7. CNTF-Teilkodierungssequenz aus Humangenom-DNA, amplifiziert durch PCR; Vergleich mit bekannter Ratten-CNTF-Kodierungssequenz. unterschiede in der abgeleiteten Ar.iinosäuresequenz zwischen Mensch und Ratte sind durch ein Sternchen ( ) angezeigt. Unterschiede in der DNA-Sequenz sind durch ein Ungleichheitszeichen (φ) angezeigt.

Abb. 8. Sequenz von Human-CNTF. (a) Human-Nukleinsäure- und -aminosäuresequenz; (b) Vergleich der Aminosäuresequenzen von Mensch und Ratte; (c) Vergleich der Nukleotidsequenzen von Mensch und Ratte; (d) vollständige Restriktionskarte der Humangenom-CNTF-Sequenz.

Abb. 9. Antikörper gegen ein synthetisches Peptid (14 Aminosäuren -ISALESHYGAKDK Q) auf der Grundlage dor Sequenz von CNTF können die biologische Aktivität von gereinigtem Ratten-CNTF nach Immunpräzipitation inhibieren.

Abb. 10. Demonstration der neurotrophen Aktivität eines synthetischen CNTF-Peptidfragments mit 28 Aminosäuren.

Abb. 11. Indirekte Immunfluoreszenzuntersuchungen unter Verwendung von Kaninchen-Antikörpern gegen ein biologisch aktives CNTF-Peptid mit 28 Aminosäuren, das an fixierte Rattenhüftnerv-Schnitte gebunden und später mit rhodaminmarkiertem Anti-Kaninchen-IgG zur Reaktion gebracht wurde. Der große Pfeil zeigt die periaxonale Färbung; der kleine Pfeil zeigt auf markierte Axonstrukturen.

Abb. 12. Phasenkontrast-Mikrofotos dissoziierter Kulturen von mediodorsalen E14-Rückenmarkszellen der Ratte, die 72 Stunden lang auf einem Polyornithinsubstrat in Gegenwart von

A. Kontrollmedium,

B. mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF) der Maus ergänztem Medium oder

C. Medium, das mit einem in E. coli produzierten rekombinanten ziliaren neurotrophen Faktor der Ratte ergänzt war,

kultiviert wurden. Man beachte die extensive Überlebensrate der Neuronen und den Neuritenauswuchs in Gegenwart von CNTF. Maßstrich = 100 μΐη.

Abb. 13. Veränderungen von Motorneuronen und Gliazellen in Fazialiskernen neugeborener Ratten mit einseitigen Gesichtsnervenläsionen. Einseitige Nervenläsion mit BSA-haltigem Gelschaum-Implantat. (A) Nach Nissl gefärbte Motorneuronen im Fazialiskern auf der verletzten Seite; (B) Nach Nb;sl gefärbte Motorneuronen im Fazialiskern auf der unverletzten Seite (Kontrolle); (C) Fazialiskern auf der verletzten Seite, gefärbt mit Anti-GFAP-Antikörper; (D) Fazialiskern auf der unverletzten Seite- gefärbt mit Anti-GFAP-Antikörper.

Abb. 14. Veränderungen von Motorneuronen und Gliazellen in Fazialiskernen neugeborener Ratten mit einseitigen Gesichtsnervenläsionen. Einseitige Nervenläsion mit CNTF-haltigem Gelschaum-Implantat. (A) Nach Nissl gefärbte Motorneuronen im Fazialiskern auf der verletzten Seite; (B) nach Nissl gefärbte Motorneuronen im Fazialiskern auf der unverletzten Seite (Kontrolle); (C) Fazialiskern auf der verletzten Seite, gefärbt mit Anti-GFAP-Antikörper; (D) Fazialiskern auf der unverletzten Seite, gefärbt mit Anti-GFAP-Antikörper.

Abb. 15. Computer-Diagramme der Hydrophilität, Oberflächen-Wahrscheinlichkeit, Flexibilität, des Antigen-Index, der amphiphilen Helix, des amphiphilen Faltblatts und der Sekundärstruktur von (a) Ratten- und (b) Human-CNTF.

Abb. 16. Hauptmerkmale der Expressionsplasmide. Der Promotor (JLacUV5) , die Ribosomenbindungsstelle (rbsl) , die Gene CNTF, ampR und kanR sowie die Mutationen copl(O) und kanl(O) werden angezeigt. Die Restriktionsstellen Asel, Eagl, Ndel und Pvul wurden, wie im Text beschrieben, in Plasmidkonstruktionen verwendet.

Abb. 17. Sequenz der Human-CNTF- und der beim Klonieren verwendeten PCR-Starter. Die DNA-Sequenz des proteinkodierenden Bereichs ist fettgedruckt, darüber steht die abgeleitete Proteinsequenz. Die schwarz ausgefüllten Pfeilspitzen zeigen das letzte Nukleotid von Exon 1 und das erste Nukleotid von Exon 2

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an; die 5'- und З'-terminalen Intronsequenzen sind über den Pfeilspitzen in eckigen Klammern [] angegeben. Der Ort und die 5'- 3'-Polarität der gewählten Oligodesoxynukleotid-Starter sind durch Pfeile dargestellt. Sternchen bezeichnen Fehlpaarungen. Die Oligodesoxynukleotid-Sequenzen der Starter (5' - 3') sind die folgenden:

CNTF.23: GCTTTCACAGÄGCATTCACCG;

CNTF:21: AGGCCCTGATGCTTCACATAGGATTCCGTAAGAG;

CNTF.22: CTCTTACGGAATCCTATGTGAAGCATCAGGGCCT;

CNTF.24: GAGACGGCCGTAACTGTTACATTTTCTTGTTGTTAG;

CNTF.10: CCAAGCTTCTAGAATTCGCAGGCATCCCATCAGCCT;

CNTF.11: GACTCGAGTCGACATCGGAGATGACTGAGGCAGA.

Abb. 18. Vergleich der Expression von Human- und Ratten-CNTF unter Verwendung verschiedener Vektoren. Der Gesamt-Proteingehalt aus den angegebenen Stämmen wurde auf 8~25%-igen Poiyacrylamidgelen, die mit Coomassieblau gefärbt waren, analysiert. Die Molekulargewichte der Marker (in hundert Einheiten) sind angegeben (M) , desgleichen die Positionen der Banden, die den Human-CNTF-, Ratten-CNTF-, ampR- bzv. kanR-Proteinen entsprechen.

Abb. 19. Reinigung von CNTF. (A): Ratten-CNTF; (B): Human-CNTF. Lysat: Gesamtgehalt an zellulärem Protein, 8 M GuHCl: dialysierter Extrakt; 0,5; f; 10 und 50: Proteinmenge in μq_l mit der jede Spur nach DEAE-Sephacel bzw. Fast-S beladen war.

Abb. 20. Dosiswirkung von nativem und rekombinantem Ratten-CNTF auf Ziliarneuronen . Die Überlebensrate dissoziierter E8-Küken-Ziliarneuronen in Gegenwart zunehmender Mengen von Ratten-CNTF wurde gemessen, wie in Abschnitt 12.7 beschrieben.

Abb. 21. Mikrofotos von Explantatkulturen (A, B) von Spinalganglien (DRG) von ElO-Kükenembryonen sowie von dissoziierten, neuronenangereicherten Kulturen (C, D, E) von Ziliarganglien (CG) von E8-Kükenembryonen. A, B sind Dunkelfeld-Mikrofotos der Kontrolle (A) und der CNTF-behandelten Explantate (B; 5 ng/ml) von DRG nach 48 h in Kultur. C, D, E sind Phasenkontrast-Mikroaufnahmen der Kontrolle (C) und der CNTF-behandelten (D, 100 pg/ml; E, 5 ng/ml) dissoziierten Kulturen von Ziliar-

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ganglion-Neuronen. Maßstrich = 400 μχη (A, D) bzw. 50 μιη (C, D, E).

Abb. 22. Ausgerichtete CNTF-Proteinsequanzen. Dargestellt sind die Aminosauresequenzen von Human-(hu), Ratten-(rt) und Kaninchen-(rb)CNTF. Der Expressionsvektor, der jedes dieser Moleküle kodiert, ist auf der rechten Seite angegeben. Im Feld (A) werden mit Punkten die Reste bezeichnet, die mit dem Wildtyp der Human-CNTF-Sequenz identisch ssind. Im Feld (B) werden mit Punkten die Reste bezeichnet, die ,mit dem Wildtyp der Sequenz von der gleichen Spezies identisch sind. Reste, die sich vom Wildtyp unterscheiden, werden in Großbuchstaben dargestellt. Zusätzliche Reste, die als Teil eines Fremdpeptids anfusioniert sind, werden in kleinen Kursivzeichen dargestellt.

Abb. 23. Phasenkontrast-Mikroaufnahme von ventralen Rückenmarkszellen nach 6 Tagen in Kultur. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 0,5 χ 10⁶ Zellen/BSmm-Schale ausgestrichen und in F12MEMHS₅FCS₅ gehalten. Vergrößerung 2OX

Abb. 24. Neurofilament-Werte (NF) in Kulturen von ventralen Rückenmarksneuronen. Die Kulturen wurden am Tage des Ausstreichens mit CNTF (10 ng/ml) oder NGF (50 ng/m.l) behandelt und am Tag 7 auf NF-Werte geprüft. Das NF-Protein wurde mit NF-Antikörper (RT97) nachgewiesen, die Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von OPD als Substrat sichtbar gemacht, und die optische Dichte (OD) (Mittelwert ± SEM) wurde bei 490 nm gemessen, η = 3.

Abb. 25. Effekte von CNTF auf das Überleben von AchE-haltigen Neuronen. Ventrale Rückenmarksneuronen wurden 7 Tage lang vermehrt und dann für die AchE-Histochemie aufbereitet. Die gefärbten Zellen wurden unter 32X (Vergrößerung) gezählt und als Gesamtzahl pro 35mm-Schale angegeben, η = 3.

Abb. 26. A. Effekte von Wachstumsfaktoren auf die CAT-Aktivität in einer Kultur ventraler Rückenmarkszellen. Die Kulturen wurden mit FGF (50 ng/ml), CNTF (10 ng/ml), NGF 50 ng/ml) oder PBS/BSA (0,5 mg/ml) am Tage des Ausstreichens behandelt. Sie wurden dann am Tag 7 geerntet und auf CAT-Werte analysiert. Der CAT-Wert wird in CPM/3 5mm-Schale (CPM = Zählimpulse pro Minute)

(Mittelwert + SEM) ausgedrückt, η = 3. B. Effekte steigender CNTF-Dosen auf die CAT-Aktivität. Vorderhornze]іеч wurden am Tage des Ausstreichens mit unterschiedlichen CNTF-Dosen (ng/ml) behandelt. Am Tag 7 wurden die Kulturen geerntet, um die CAT-Aktivität zu messen (ausgedrückt in pmol/h/35mm-Schale; Mittelwert ± SEM), η = 3 für jede Dosis.

Abb. 27. Effekte von CNTF auf die CAT-Aktivität nach verzögerter Zugabe. CNTF (10 ng/ml) j^urde den Kulturen am Tag 0, 2 oder 6 zugesetzt und die Ernte zur Messung der CAT-Aktivität erfolgte am Tag 7, 9 bzw. 13. Der CAT-Wert wird in СРМ/дд .Protein/ 35mm-Schale ^Mittelwert ± SEM) ausgedrückt, η = 3.

Abb. 28. Effekte von CNTF (10 ng/ml) auf die CAT-Aktivität in Kulturen ventraler Rückenmarkszellen mit verminderter Glia. Am Tag 2 wurde den Kulturen Ära C (0,5 μΜ) zugesetzt. Am Tag 7 wurden die Zellen geerntet und auf CAT-Aktivität analysiert (ausgedrückt in CPM/35mm-Schale; Mittelwert ± SEM), η = 3.

Abb. 29. Effekte von CNTF (10 ng/ml) und NGF (50 ng/ml) auf die CAT-Aktivität in gereinigten ventralen Rückenmarksneuronen mit Metrizamid-Gradient. Der CAT-Wert (Mittelwert ± SEM) wird ausgedrückt in pmol/h/lömm-Vertiefung. η = 3.

Abb. 30. Zeitlicher Verlauf des Anstiegs der Aufnahme von GABA (= Gamma-Aminobuttersäure) hoher Affinität in CNTF-behandelten Hippocampus-Kulturen. Es wurden Kulturen von Hippocampus-Neuronen angesetzt und in Gegenwart bzw. Abwesenheit von CNTF (10 ng/ml) über verschiedene Zeiträume gehalten, bevor die GABA-Aufnahme (A) bzw. die Neurofilament-Proteinwerte (B) gemessen wurden. Die Ergebnisse geben den prozentualen Anteil der Aktivität in behandelten Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen wieder.

Abb. 31. Dosiswirkungskurven von Hippocampus-Neuronen für CNTF. Hippocampus-Neuronen wurden in Gegenwart bzw. Abwesenheit verschiedener CNTF-Konzentrationen (0,001-10 ng/ml) 8 Tage lang kultiviert. Am Ende des Kulturzeitraums wurden die Aufnahme von GABA (Gamma-Aminobuttersäure) hoher Affinität (A) , die Neurofilament-Proteinwerte (B) und die GAD-Enzymaktivität (C) gemessen.

Abb. 32. Effekt von CNTF auf die Anzahl der NSE-, GAD- und Galbindin-prjitiven Zellen. Hippocampus-Neuronen wurden in Gegenwart bzw. Abwesenheit von CNTF (10 ng/ml) 8 Tage lang kultiviert. Es wurde ein Immunfärbungstest für NSE, GAD und GaI-bindin durchgeführt, wie in A und B gezeigt.

Abb. 33. Dosisabhängige Reaktion von CNTF auf die Anzahl von GABA- und AchE-iirramnpositiven Neuronen.

Hippocampus-Neuronen wurden in Gegenwart verschiedener CNTF-Konzentrationen (0,001-10 ng/ml) kultiviert.

Es wurde ein Immunfärbungstest für GABA und AchE durchgeführt, wie in A und B gezeigt.

Abb. 34. Auswirkungen der verzögerten Zuqahfi von CNTF auf die

CNTF-induzierte Erhöhung der Aufnahme von GABA (Gamma-Aminobuttersäure) hoher Affinität. A, CNTF (10 ng/ml) wurde mit einer Verzögerung von 0, 1, 2, 3 bzw. 4 Tagen nach dem Ansetzen der Hippocampus-Zellkultur zugegeben. Die Aufnahme von GABA hoher Affinität wurde am achten Tag in Kultur bestimmt. B. CNTF (10 ng/ml) wurde den Hippocampuszellen mit einer Verzögerung von 0 bzw. 3 Tagen zugesetzt und die Aufnahme von GABA hoher Affinität wurde am elften Tag in Kultur bestimmt.

Abb. 35. Auswirkungen der verzögerten Zugabe von CNTF auf die CNTF-induzierte Erhöhung der Neurofilament-Proteinwerte. A. CNTF (10 ng/ml) wurde zu verschiedenen Zeiten (0, 1, 2 bzw. 3 Tage) nach dem Ansetzen der Hippocampus-Zellkultur zugegeben. Die Neurofilament-Proteinwerte wurden am achten Tag gemessen. B. CNTF (10 ng/mlj wurde den Hippocampuszellen mit einer Verzögerung von 0 bzw. 3 Tagen zugegeben und der Neurofilament-Proteinwert wurde am elften Tage bestimmt.

Abb. 36. Effekt von CNTF in neuronenangereicherten Kulturen. Hippocampus-Zelien wurden in Gegenwart bzw. Abwesenheit verschiedener CNTF-Konzentrationen (0,001-10 ng/ml) 8 Tage lang kultiviert. Um die Anzahl der Gliazellen zu vermindern, wurde den Hippocampus-Kulturen 24 Stunden lang Zytosinarabxnosid (0,3 μΜ) zugesetzt. Die Aufnahme von GABA hoher Affinität wurde am achten Tag in Kultur gemessen.

Abb. 37. Dichteabhängigkeit der CNTF-induzierten Erhöhung der GABA-Auf nähme und der Neurof i.lament-Proteinwerte. Hippocampus-Zellen wurden mit einer Dichte von 71400 Zellen/cm² ausgestrichen. Die Zellen wurden in Gegenwart bzw. Abwesenheit von CNTF (.10 ng/ml) 8 Tage lang kultiviert, dann wurden die GABA-Auf nähme (A) und die Neurofilament-Proteinwerte (B) gemessen.

Abb. 38. Schutzwirkung von CiITF gegen glutamatinduzierte Toxizität in Hippocampus-Kulturen. Hippocampus-Neuronen wurden in Gegenwart bzw. Abwesenheit von, CNTF (10 ng/m) 7 Tage lang kultiviert. Glutamat in verschiedenen Konzentrationen (100-1000 μΜ) wurde 15 Minuten lang zugesetzt, danach wurden die Zellen in Abwesenheit von Glutamat bzw. CNTF 20 Stunden lang kultiviert. Die Überlebensrate der Zellen wurde am Ende des Kultivierungszeitraums durch einen MTT-Test auf der Grundlage der Umwandlung von MTT (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolbromid) in ein purpurfarbiges Produkt durch Vitalzellen abgeschätzt. MTT-Farbstoff wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugesetzt. Durch lebende Zellen aufgenommene Farbstoffe wurden durch Zusatz von 0,08N HCI in Isopropanol 5 Stunden später solubilisiert und die optische Dichte (570-650 nm) wurde gemessen.

Abb. 39. Effekt zunehmender Konzentrationen von Ratten-CNTF auf den Mitoseindex von Rattenhippocampus-Astrozyten. Astrozyten wurden 24 Stunden lang den angegebenen CNTF-Konzentrationen ausgesetzt und während der letzten 2 Inkubationsstunden mit ³H-Thymidin (1 mCi/Vertiefung/150 μΐ) markiert.

Abb. 40. 2-Antikörper-Sandwichtest für CNTF. ELISA-Platten (Falcon 3915 probind) wurden mit 50 μΙ/Vertiefung Ziegen-AntiMaus IgG2b (GaMIgG2b, Caltag) in einer Konzentration von 4 ц.д/т1 überzogen. Die Platten wurden bei 4⁰C über Nacht inkubiert, gewaschen und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur in 50 mM Bikarbonatpuffer, pH 9,5, blockiert. Nach dem Waschen wurden 50 μΙ/Vertiefung Einfang-Antikörper RP3-12 (1:5-Verdünnung des Überstands einer Hybridomkultur) zugesetzt und es wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden Reihenverdünnungen eines Human-CNTF-Standards (Bereich 10 ng/ml - 7 pg/ml) bzw. Reihenverdünnungen einer Probe zugesetzt. Nach

1 h bei Raumtemperatur und anschliaßendem Waschen wurden 50 μΙ/Vertiefung eines Reporter-Antikörpers RP12-2 (1:5-Verdünnung des Kultur-Überstands) zugesetzt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden 50 μΙ/Vertiefung eines 1:1000 verdünnten, mit alkalischer Phosphatase markierten Ziegen-Anti-Maus-IgGl-Reagens (GaMIgGl, Caltag) zugesetzt. Die Platte wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, anschließend gewaschen, mit pNPP entwicklet und bei 405 nm in einem ELISA-Lesegerät (Molecular Devices Thermo Max) abgelesen.

Abb. 41. Ergebnisse des 2-Antikörper-Sandwichtests für Human-CNTF. Unter Anwendung der monoklonalen Antikörper RP3-12 und RP12-2 wurden in der in Abb. 40 beschriebenen Reaktion zunehmende Mengen von rekombinantem Human-CNTF analysiert.

Abb. 42. Spinale Kükenembryo-Motorneuronen, retrograd markiert mit Rhodaminisothiozyanat. Die Zellen wurden nach 5 h in Kultur mit 4% Formaldehyd fixiert. (A) Phasenkontrast- und (B) Fluoreszenzaufnahmen des gleichen Felds. Maßstrich = 25 дт. Man beachte, daß die kleinere Zelle rechts nicht markiert ist.

Abb. 43. Zeitlicher Verlauf der Überlebensrate spinaler Kükenembryo-Motorneuronen in Gegenwart (Vollkreise) bzw. in Abwesenheit (offene Kreise) von rekombinantem Ratten-CNTF, 5 ng/ml.

Abb. 44. Spinale Kükenembryo-Motorneuronen nach 6 Tagen in Kultur in Abwesenheit (A) bzw. in Anwesenheit (B) von rekombinantem Ratten-CNTF, 1 ng/ml. Maßstrich = 100 /im.

Abb. 45. Überlebenswirkung von rekombinantem Ratten-CNTF bei spinalen Kükenembryo-Motorneuronen in Kultur (A) und Konzentrations-Wirkungs-Kurven für CNTF (B) bzw. FGFs (C) . Die überlebensfördernden Wirkungen wurden nach 3 Tagen in Kultur analysiert. In B wurde Heparin (1 дд/ті) der Kultur nur während der ersten 24 h zugesetzt, um eine durch überschüssiges Heparin ausgelöste Zellablösung zu vermeiden, während saurer FGF 3 Tage lang anwesend war.

5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die den ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) kodieren, sowie CNTF-Proteine,

Peptidfragmente und Derivate, die in großem Maßstab daraus erzeugt werden. Außerdem betrifft die Erfindung pharmakologische Präparate sowie therapeutische und diagnostische Anwendungen des ziliaren neurotrophen Faktors.

Zum Zweck einer klaren Beschreibung und ohne Einschränkung des Schutzumfangs wird die Beschreibung der Erfindung wie folgt unterteilt:

i) Reinigung von CNTF

ii) CNTF-Biotests

iii) Sequenzierung von CNTF

iv) Klonieren von CNTF-kodierender DNA

v) Expression eines CNTF-Gens

vi) CNTF-Gene und Proteine

vll) liL-züuyimij von AiiLl-CNlT-AnÜküipum

viii) Nutzen der Erfindung 5.1. Reindarstellunq des ziliaren neurotrophen Faktors

CNTF kann unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren aus jeder verfügbaren Quelle gereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Kükenembryo-Augen, Hüftnerv und Herzmuskel^

Beispielsweise, und ohne dadurch den Schutzumfang einschränken zu wollen, kann CNTF nach dem in Barbin u.a. beschriebenen Verfahren (1984, J. Neurochem. 43:1468-147 3, das hier in seiner

Gesamtheit zur Bezugnahme aufgenommen wurde) aus Augen von

Kükenembryonen_dargestellt werden. Kurz gesagt, können die Chorioidea, der Iris-Ziliarkörper und das anhaftende Pigmentepithel, kollektiv als CIPE bezeichnet, wie in Manthorpe u.a. (1980, J. Neurochem. 34:69-75) beschrieben, aus 15 Tage alten Kükenembryo-Augen präpariert und in Salzlösung im Lösungsgleichgewicht gesammelt werden. Vorzugsweise werden Extrakte aus etwa dreihundert Embryo-Augen gewonnen, die in ca. 76 ml kaltem Wasser unter Verwendung eines Teflonglas-Homogenisators homogenisiert und dann eine Stunde lang bei etwa 4⁰C mit 10⁵ g zentrifugiert werden. Der Überstand kann dann gesammelt, in NaH₂PO₄, pH7, auf 0,01 M eingestellt und dann einer Ionenaustauschsäule (d.h. in Phosphatpuffer äquilibrierter Whatman DE52-Zellulose) zugeführt werden. Dann kann die Säule mit einer

Durchflußgeschwindigkeit von ca. 30 ml/h mit jeweils 20 ml 0,07 M, 0,25 M und 0,5 M NaCl in Phosphatpuffer eluiert werden. Das 0,25 M NaCl-Eluat kann dann durch Ultrafiltration (z.B. unter Verwendung einer 50 ml - Amicon-Zelle und einer PMlO-Ultrafiltriermembran (10000 Dalton = 1,66 χ 10"²³ kg Grenzmasse)) auf ein Volumen von ca. 2 ml eingeengt werden. Dann kann der Filterrückstand gesammelt und gleichzeitig kann die Zelle zweimal mit je 0,5 ml 0,25 M NaCl-Puffer gewaschen werden, wonach der Rückstand weiter auf* 0,4 ml eingeengt wird (z.B. unter Verwendung einer 3 ml - Amicon-Zelle und eines PMlO-Filters). Der gereinigte Extrakt kann dann über Saccharosegradienten geschichtet (z.B. 200 ml Extrakt über 4,6 ml lineare Saccharosegradienten von 5-20%) und danach zentrifugiert werden (z.B. unter Verwendung eines SW 65 - Rotors bei 65000 U/min, 15 Stunden lang bei 4⁰C). Die 4,8 ml - Gradienten können dann in vier Fraktionen geerntet werden : Fraktion I (2 ml), Fraktion II (0,3 ml), Fraktion III (1,2 ml), Fraktion IV (0,3 ml) und Fraktion V (1,0 ml). Danach kann man Fraktion III in Triton X-100 auf 0,1% einstellen und anschließend wie oben durch Ultrafiltration auf 0,2 ml einengen.

Zur analytischen Gelelektrophorese kann gereinigter CNTF unter Verwendung eines SDG-Polyacrylamid-Plattengels mit 15% Trenngel- rnd 4,5% Sammelgelanteil analysiert werden. Gereinigte CNTF- bzw. Molekulargewichts-Standards können elektrophoretisiert und das Gel kann ausgeschnitten und wie folgt verarbeitet werden: die Polypeptide können ohne Fixierung sichtbar gemacht werden, indem das protein-assoziierte SDS während einer Inkubation des Gels in 0,25 M KCl ausgefällt und die Positionen der Standards sowie die CNTF-Banden registriert werden. Die Spuren können dann fixiert und mit Coomassie-Blau gefärbt werden. Dann können andere Spuren in Scheiben geschnitten, durch Inkubation mit Triton X-100 eluiert und die Eluate auf CNTF-Aktivität getestet werden.

Hüftnervextrakt kann durch die gleichen Schritte wie bei der Reinigung des Kükenaugen-CNTF (s. oben) fraktioniert werden (DL'ÄE-Ionenaustauschchromatographie, Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und preparative SDS-PAGE), wobei das Verfahren allerdings vorzugsweise in den folgenden drei Punkten modifi-

ziert wird: (1) nach dem Beladen mit dem Nervenextrakt kann die DEAE-Ionenaustauschsäule chargenweise direkt mit 0,15 M NaCl eluiert werden (statt des Waschens mit 0,07 M NaCl und der Elution mit 0,25 M NaCl); (ii) aus dem 24 Kd-Bereich (anstelle des 20 Kd-Bereichs) des präparativen SDS-GeIs werden Scheiben herausgeschnitten; und (iii) die CNTF-Aktivität kann aus einzelnen Gelscheiben durch Homogenisierung in 0,1% Triton X-100-Detergens und anschließende Inkubation über Nacht bei 4⁰C (anstelle der über Nacht durchgeführten elektrophoretischen Elution durch Harnstoffge.le) eluiert werden. Das Triton X-100-Detergens kann dann durch eine zweistündige Inkubation des Überstands mit 100 μΐ Suspension von Extractagel-Perlen (Pierce Chemicals, Rockford, IL) bei 4⁰C entfernt werden. Die Proteinkonzentration läßt sich dann nach einem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmen.

Die obigen Methoden können vorzugsweise v/ie folgt weiter modifiziert werden: Nach der Elution aus einem präparativen SDS-PAGE-GeI kann CNTF bis zur Homogenität gereinigt und durch Umkehrphasenchromatographie von SDS befreit werden, wobei eine FPLC- oder HPLC-Säule eingesetzt wird, die ein in einer inerten Säule enthaltenes biokompatibles Fluidsystem darstellt; in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die FPLC-Säule eine Bakerbond Gold C4 Widepore - Säule (7,75 mm χ 10 cm - Säule mit Goldauskleidung, arbeitet bei einem Gegendruck von 200-250 psi (= 1,378-1,723 MPa) mit 1,0 ml/min in wäßriger mobiler Phase), die mit einem Azetonitrilgradienten vom 0 bis 60 % eluiert wird. Es ist beobachtet worden, daß CNTF als Einzelpeak bei 50-55 Prozent Azetonitril eluiert (s. Abschn. 6, weiter untsn). Der CNTF-haltige Einzelpeak kann in einem Speed Vac, aus dem die Luft mit einem Inertgas wie z.B. Argon ausgespült wurde, konzentriert werden. Das Inertgas ist offenbar wichtig, um einen CNTF-Aktivitätsverlust zu verhindern, der nach Oxidation eines oder mehrerer Methioninreste eintritt. CNTF ist offenbar sehr oxidationsanfällig, wenn es sich nicbt mehr in Lösung befindet.

Eine Aktivität, die das Überleben von Ziliarneuronen fördert, kann auch unter Anwendung der Heparin-Affinitätschromatographie aus Herzgewebe präpariert werden, wie in Watters und Hendry beschrieben (1987, J. Neurochem. 49:705-713; das Verfahren wurde

zur Bezugnahme in seiner Gesamtheit hier aufgenommen).

5.2. Biotests für den ziliaren neurotrophen Faktor

Die Aktivität des ziliaren neurotrophen Faktors kann unter Anwendung jedes beliebigen CNTF-empfindlichen, dem Fachmann bekannten in-vivo- oder in-vitro-Systems beurteilt werden. Beispielsweise, ohne hierdurch den Schutzumfang der Erfindung einschränken zu wollen, sind in-vitro-3ysteme entwickelt worden, welche die CNTF-Aktivität durch quantitative Bestimmung der 24-Stunden-Überlebensrate embryonaler (E8) Küken-Ziliarganglion-(CG-)Neuronen in einklagigen Kulturen messen.

Zum Beispiel können Ziliarganglien aus E8-Kükenembryonen gewonnen, dissoziiert (mit einer Ausbeute von ca. 20000 Zellen pro Ganglion) und dann in HEBM-Medium, das 20 Prozent Pferdeserum enthält, verdünnt werden, wie in Varon u.a. (1979, Brain Res 173:29.45) beschrieben. Mikrotiterplatten können dann mit etwa 50 μΐ Zellsuspension, die 1000 Neuronen (2000 Zellen) enthält, beimpft und die mutmaßliche CNTF-Aktivität kann hinzugefügt werden. Die Kulturplatten können dann 24 Stunden lang bei 37⁰C in 5% CO₂ gehalten werden, wonach die Kulturen durch Zugabe von 200 μΐ 2%igem Glutaraldehyd in HEBM-Medium fixiert und die Zahl der überlebenden Neuronen visuell durch Direktzählung unter dem Phasenkontrastmikroskop bestimmt werden Können.

5.3. Sequenzierung von Protein mit ziliarem neurotrophem Faktor

Das CNTF-Protein kann direkt sequenziert oder zunächst durch irgendeine Protease oder eine andere dem Fachmann bekannte Verbindung aufgespalten werden; diese Verbindungen umfassen Staphylococcus aureus V8, Trypsin und Bromzyan, sind aber nicht darauf beschränkt. Peptide können durch automatisierten Edman-Abbau in einem Gasphasen-Mikrosequenzierer nach der Methode von Hewick u.a. (1981, J. Biol. Chem. 256:7990-7997) und Hunkapillar u.a. (1983, Metho* Enzymol. 91:399-417) sequenziert werden. Dann kann der Nachweis von Phenylthiohydantoin-Aminosäuren nach Lottspeich (1985, Chromatography 326:321-327) durchgeführt werden. Überlappende Fragmente der Aminosäuresequenz können bestimmt und zur Ableitung längerer zusammenhängender Sequenzstücke benutzt werden.

5.4. Klonieren der DNA, die den ziliaren neurotrophen Faktor kodiert

Die Reindarstellung geeigneter CNTF-Proteinmengen aus dem Rattenhüftnerv für die Mikrosequenzierung ermöglichte die KIonierung einer CNTF-cDNA. Eine Standardstrategie für ein solches Klonieren könnte darin bestehen, eine komplementäre Oligonukleotidsonde auf der Basis eines Segments einer bekannten Aminosäuresequenz zu erzeugen und diese Sonde zum Sichten von cDNA-Bibliotheken zu benutzen, die aus dem Gewebe erzeugt wurden, das mutmaßlich CNTF-kodierende mRNA synthetisiert. Diese Strategie war jedoch aufgrund der relativ geringen Abundanz der mRNA problematisch, sowie auch weil die durch Mikrosequenzierung bestimmte konkrete Sequenz der CNTF-Peptide (Abb. 1) in jedem Falle einen unvorteilhaft hohen Entartungsgrad in den Oligonukleotidsonden erfordert hätte, um alle möglichen ausgewählten Codons für bestimmte Aminosäurereste unterzubringen. Die vorliegende Erfindung ermöglicht das Klonieren des Gens durch Synthese von cDNA, Ableitung eines Paares entarteter Oligonukleotid-Starter auf der Basis der Mikrosequenzierung von CNTF-Peptiden, Verwendung dieser Starter zur Amplifikation eines Segments der CNTF-kodierenden Sequenz, Verwendung eines dritten Oligonukleotids zur Bestätigung der Identität des amplifizierten Segments, Bestimmung der exakten Nukleotidsequenz dieses Segments und Synthese und Anwendung exakter Oligonukleotid-Starter zur Amplifikation des restlichen CNTF-Gens. Rod dieser erfindungsgemäßen Methode nutzt das bevorzugte Amplifikationsverfahren die Amplifikation von Gewebe-Nukleinsäuresequenzen durch Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki u.a., 1985, Science 230:1350-1354). Es folgt eine ausführliche Beschreibung der bevorzugten Methode:

Zunächst kann die aus gereinigtem CNTF-Protein gewonnene Aminosäuresequenz verwendet werden, um die Oligonukleotid-Starter zum Gebrauch bei der PCR abzuleiten. Wegen der Entartung des genetischen Kodes, wobei mehrere Tripletts die gleiche Aminosäure spezifizieren können, sollten für eine vorgegebene Aminosäuresequenz mehrere Oligonukleotide synthetisiert werden, um mehrere mögliche Nukleotidsequenz-Kombinationen zu schaffen; die resultierenden Oligonukleotide werden als entartete Starter

bezeichnet.

Die PCR (Polymerasekettenreaktion) erfordert Starter für den sense-Strang- sowie für den antisense-Strang. Demgemäß kann ein entarteter Oligonukleotid-Starter, der einem Segment der CNTF-Aminosäuresequenz entspricht, als Starter für einen DNA-Strang (z.B. den sense-Strang) und ein weiterer entarteter Oligonukleotid-Starter, der zu einem zweiten Segment der CNTF-Amino^cäuresequenz homolog ist, als Starter füx den zweiten DNA-Strang (z.B. den antisense-Strang) verwendet w.erden. Diese Starter sind vorzugsweise auf der Basis eines zusammenhängenden Stücks einer bekannten Aminosäuresequenz auszuwählen, so daß das relevante DNA-Reaktionsprodukt , das durch die Anwendung dieser Starter in der PCR entsteht, von voraussagbarer Größe sein kann (d.h. die Länge des Produkts, ausgedrückt durch die Anzahl der Basenpaare, sollte gleich der Summe der Längen der beiden Starter zuzüglich der dreifachen Zahl der Aminosäurereste in dem Proteinsegment sein, das durch die den beiden Startern entsprechenden Segmente begrenzt wird). Diese Starter können dann in der PCR mit der Nukleinsäurematrize eingesetzt werden, die mutmaßlich ClITF-kodierende Sequenzen enthält, wie z.B. genomische DNA oder vorzugsweise aus mRNA präparierte cDNA, die aus Gewebe oder Zellen gewonnen wurde, d" vermutlich CNTF synthetisieren. Die DNA-Reaktionsprodukte können dann mittels Elektrophorese analysiert werden, um festzustellen, ob ein DNA-Reaktionsprodukt eine Molekülgröße ähnlich der vorausgesagten hat. Die DNA-Reaktionsprodukte können ferner durch Hybridisierung mit einer markierten Sonde analysiert werden, die aus einem entarteten Oligonukleotid präpariert wurde, das den Aminosäuresequenzen zwischen den Segmenten der beiden für die PCR verwendeten Starter entspricht. Die Sequenzanalyse des DNA-Reaktionsprodukts der vorausgesagten Größe kann mit der ermittelten Aminosäuresequenz verglichen werden, um zu bestätigen, daß die amplifizierte Nukleinsäuresequenz tatsächlich dnu CNTK-lOptidlragmcnt kodieren kann. Obwohl jedes beliebige, dem Fachmann bekannte Verfahren der Nukleinsäuresequenzierung genutzt werden kann, ist die Anwendung der Didesoxy-DNA-Sequenzierungsmethode (Sanger u.a., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72:3918-3921) vorzuziehen. Die Sequenzierung kann unter Verwendung eines gelgereinigten oder vorzugsweise eines klonierten DNA-Reaktionsprodukts ausgeführt werden.

Ein "Schwanz", der bekannte Zielsequenzen für ausgewählte Restriktions-Endonukleasen enthält, kann am 5'-Ende jedes für die PCR verwendeten Oligonukleotid-Starters eingebaut werden, um die Klonierung der DNA-Reaktionsprodukte zu erleichtern.

Die Sequenz des DNA-Reaktionsprodukts kann dann zur Konstruktion eines Oligonukleotid-Starters verwendet werden, welcher der exakten CNTF-kodierenden Sequenz entspricht. Dieser Starter kann dann zusammen mit einem zweiten Starter in der PCR eingesetzt werden, um den Umfang der CNTF-Kodierungssequenz über den des zunächst ermittelten Fragments der exakten Sequenz hinaus zu erweitern. Zum Beispiel, womit jedoch keine Einschränkung des SchutzumfengT beabsichtigt ist, kann das Protokoll für "schnelle Amplifikdtion von cDNA-Enden" (RACE) (M.A. Frohman, M.K. Dush, G.R. Martin, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:8998-9002) verwendet werden, um Segmente aus dem Bereich der bekannten exakten Sequenz heraus an die 5'- bzw. 3'-Enden von cDNA-Molekülen zu klonieren. So kann, um einen Klon zu erhalten, der sich bis zum З'-Ende erstreckt, der Starter des sense-Strangs der exakten CNTF-Nukleotidsequenz entsprechen, während der Starter des anti-sense-Strangs homolog zu einem Segment der bekannten Sequenz sein kann, das wahrscheinlich in 3'-Richtung vom sequenzierten Fragment zu finden ist, z.B. dem З'-Polyadenosin-Schwanz der mRNA, wie er in der cDNA umgekehrt transkribiert ist; der Starter würde in diesem Falle ein Stück Oligo-dT enthalten. Es kann dann erforderlich sein, eine ähnliche Methode zum Auffinden der Sequenz in 5'-Richtung vom sequenzierten Fragment anzuwenden; beispielsweise kann der Starter des anti-sense-Strangs der exakten CNTF-Nukleotidseguenz entsprechen und der Starter des sense-Strangs kann homolog zu einem Bereich in 5'-Richtung vom sequenzierten Fragment sein, z.B. einem S'-Polyguanosin-Schwanz, der unter Verwendung terminaler Desoxynukleotid-Transferase an das 5'-Ende der cDNA angelagert wird (in diesem Falle würde der Starter ein Stück Oligo-dC enthalten).

Die amplifizierten Fragmente können dann sequenziert oder vorzugsweise kloniert und danach sequenziert werden. Sobald exakte Oligonukleotide von den 5'- und 3'-Enden der cDNA bestimmt worden sind, können dann die exakten Nukleotida in der PCR-Reaktion verwendet werden, um die dazwischenliegenden

Nukleinsäuresequenzen zu erhalten, und dann können die Produkte der PCR-Reaktion klonjert werden.

DNA-Reaktionsprodukte können unter Anwendung eines beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahrens kloniert werden. Eine große Zahl von dem Fachmann bekannten Vektor-Wirt-Systemen sind verwendbar. Mögliche Vektoren sind z.B. Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, sind jedoch nicht darauf beschränkt; das Vektorsystem muß jedoch mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Derartige Vektoren sind etwa Bakteriophagen wie z.B. Lambda-Abkömmlinge, oder Plasmide wie pBR3 22, pUC oder BLUESCRIPT¹* (Stratagene) - Plasmidabkömmlinge, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Rekombinante Moleküle können mittels Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. in Wirtszellen eingebracht werden.

Das CNTF-Gen wird in einen Klonierungsvektor inseriert, der zur Transformation, Transfektion bzw. Infektion geeigneter Wirtszellen verwendet werden kann, so daß viele Kopien der Gensequenzen erzeugt werden. Dies läßt sich bewerkstelligen, indem das DNA-Fragment in einen Klonierungsvektor mit komplementären kohäsiven Enden ligiert wird. Wenn jedoch die zur Fragmentierung der DNA verwendeten komplementären Restriktionsstellen in dem Klonierungsvektor nicht vorhanden sind, können die DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Es kann sich als vorteilhaft erweisen, Spaltstellen für Restriktionsendonuklease in die bei der Polymerasekettenreaktion verwendeten Oligonukleotid-Starter einzubauen, um die Insertion in Vektoren zu erleichtern. Ersatzweise kann irgendeine gewünschte Stelle dadurch erzeugt werden, daß Nukleotidsequenzen (Linker) an die DNA-Enden ligiert werden: diese ligierten Linker können aus spezifischen chemisch synthetisierten Oligonukleotiden bestehen, die Erkennungssequenzen für Restriktionsendonuklease kodieren. In einem anderen Verfahren können der aufgespaltene Vektor und das CNTF-Gen durch Anhängen eines homopolymeren Endes modifiziert werden.

In speziellen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, die ein isoliertes CNTF-Gen, cDNA oder eine synthetisierte DNA-Sequenz enthalten, die Erzeugung multipler Kopien des Gens. So kann das

2.9*133

Gen durch Vermehrung von Transformanten, Isolierung der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und nötigenfalls durch Wiedergewinnung des inserierten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA in großen Mengen gewonnen werden.

Entsprechend der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann, sobald ein cDNA-Klon erzeugt worden ist, der den CNTF kodiert, ein genomischer, den CNTF kodierender Klon unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardverfahren isoliert werden. Zum Beispiel kann eine markierte Nukleinsäuresonde aus dem CNTF-Klon abgeleitet und dazu verwendet werden, genomische DNA-Bibliotheken mittels Nukleinsäure-Hybridisierung zu sichten, beispielsweise unter Anwendung der Methode, die von Benton und Davis (1977, Science 196:180) für Bakteriophagen-Bibliotheken und von Grunstein und Hogness (1975, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72:3961-3965) für Plasmid-Bibliotheken beschrieben wurde. Wiederaufgefundene Klone können dann durch Restriktionsfragmentkartierungs- und Sequenzierungsverfahren nach dem Fachmann bekannten Methoden analysiert werden.

Ferner können unter Verwendung der nach der Erfindung gewonnenen Sequenzen zusätzliche cDNA-Klöne aus einer cDNA-Bibliothek identifiziert werden.

5.5. Expression eines Gens mit ziliarem neurotrophem Faktor

Die für ein CNTF-Protein kodierende Nukleotidsequenz oder ein Teil davon kann in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt werden, d.h. in einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der inserierten proteinkodierenden Sequenz enthält. Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale können auch vom nativen CNTF-Gen und/oder seinen flankierenden Bereichen geliefert werden. Es kann eine Vielzahl von Wirt-Vektor-Systemen genutzt werden, um die proteinkodierende Sequenz zu exprimieren. Dazu gehören, ohne sich auf die folgenden Beispiele zu beschränken, virusinfizierte Säugetier-Zellsysteme, (z.B. Vacciniavirus, Adenovirua usw.). virusinfizierte Insektenzellsysteme (z.B. Baculovirus); Mikroorganismen wie Hefe, die Hefevektoren enthalten, oder mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA bzw. Cosmid-DNA transformierte Bakterien. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer

Stärke und Spezifität. Je nach dem verwendeten Wirt-Vektor-System kann irgendeines aus einer Anzahl geeigneter Transkriptions- und Translationselemente verwendet werden.

Irgendeine der Methoden, die früher für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschrieben wurden, kann zur Konstruktion von Expressionsvektoren angewendet werden, die ein chimärisches Gen enthalten, das aus geeigneten Transkriptions-/Translationskontrollsignalen und ilen proteinkodierenden Sequenzen besteht. Diese Methoden können jn-vitro-rekombinante DNA und synthetische Verfahren sowie in-vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die CNTF-Protein oder ein Peptidfragment kodiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz so reguliert werden, daß CNTF-Protein bzw. Peptid in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. Zum Beispiel kann die Expression von CNTF durch irgendein dem Fachmann bekanntes Promotor-/Verstärker-Element kontrolliert werden. Als Promotoren, die zur Kontrolle der CNTF-Expression eingesetzt werden können, lassen sich beispielsweise die folgenden angeben, ohne dadurch den Schutzumfang einschränken zu wollen: der frühe Promotorbereich SV40 (Bernoist und Chabon, 1981, Nature 290:304-3.10), der in der langen 3'-terminalen Wiederholung des Rousschen Sarkomvirus enthaltene Promotor (Yamamoto u.a., 1980, Cell 22:787-797), der Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner u.a.,

1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:144-1445), die Regulationssequenzen des Metallothionin-Gens (Brinster u.a.,

1982, Nature 296:39-42); prokaryotische Expressionsvektoren wie z.B. der ß-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff u.a., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75:3727-3731) oder der tac-Promotor (DeBoer u.a., 1983, Proc. Natl Acad. Sei. U.S.A. 80:21-25); siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" (Brauchbare Proteine aus rekombinanten Bakterien) in Scientific American, 1980, 242:74-94; Pflanzen-Expressionsvektoren, die den Nopalinsynthetase-Bereich enthalten (Herrera-Estrella u.a., Nature 303:209-213) oder der 3 5S-RNA-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (Gardner u.a., 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871) sowie der Promotor für das photosynthetische Enzym Ribulosediphosphat-Carboxylase (Herrera-Estrella u.a., 1984, Nature 310:115-120); Promotor-Elemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie z.B. der

Promotor Gal 4, der Promotor ADC (Alkoholdehydrogenase), der Promotor PGK (Phosphoglycerolkinase) , der alkalische Phosphatase-Promotor sowie die folgenden tierischen Transkriptionskontrollbereiche, die Gewebe-Spezifität aufweisen und bei genmutierten Tieren eingesetzt worden sind: der in Pankreasazinuszellen aktive Elastase I-Genkontrollbereich (Swift u.a., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz u.a., 1986, Cold Spring Harl·or Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:42"-515); der in Pankreas-ß-Zellen aktive Insulin-»Genkontrollbereich, (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), der · in Lymphoidzellen aktive Immunglobulin-Genkontrollbereich (Grosschedl u.a., 1984, Cell 38:647-658; Adams u.a., 1985, Nature 318:533-538; Alexander u.a., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), der Maus-Mammatumorvirus-Kontrollbereich, der in Hoden-, Brustdrüsen-, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder u.a., 1986, Cell 45:485-495), der in der Leber aktive Albumin-Genkontrollbereich (Pinkert u.a., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), der in der Leber aktive Alpha-Foetoprotein-Genkontrollbereich (Krumlauf u.a., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer u.a., 1987, Science 235:53-58); der in der Leber aktive Alpha-1-Antitrypsin-Genkontrollbereich (Kelsey u.a., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), der in Knochenmarkzellen aktive Beta-Globin-Genkontrollbereich (Mogram u.a.,

1985, Nature 315:338-340; Kollias u.a., 1986, Cell 46:89-94); der Myelinprotein-Genkontrollbereich, der in Oligodendrogliazellen im Gehirn aktiv ist (Readhead u.a., 1987, Cell 48:703-712); der in Skelettmuskeln aktive Myosin-Leichtketten-2-Genkontrollbereich (Sani, 1985, Nature 314:283-286) und der im Hypothalamus aktive Gonadotropinausschüttungs-Genkontrollbereich (Mason u.a.,

1986, Science 234:1372-1378).

Expressionsvektoren, die CNTF-Gen-Einschübe enthalten, können nach drei allgemeinen Verfahrensweisen identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Gegenwart oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) Expression von eingefügten Sequenzen. Beim ersten Verfahren kann das Vorhandensein eines in einen Expressionsvektor inserierten Fremdgens durch DNA-DNA-Hybridisierung nachgewiesen v/erden, wobei Sonden mit Sequenzen verwendet werden, die zu einem eingefügten Gen homolog sind. Beim zweiten Verfahren läßt sich das rekombinante Vektor/Wirt-System auf der Grundlage der Gegenwart bzw. Abwesenheit

bestimmter "Marken-Genfunktionen identifizieren und auswählen (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformations-Phänotyp, Bildung von Occlusionskörpern beim Baculovirus usw.), die durch Insertion von Fremdgenen in den Vektor verursacht werden. Wenn z.B. das CNTF-Gen in die Marker-Gensequenz des Vektors eingefügt wird, können Rekombinanten, die den CNTF-Einschub enthalten, durch das Fehlen der Marker-Genfunktion identifiziert werden. Beim dritten Verfahren lassen sich rekombinante Expressionsvektdfen identifizieren, indem man das durch die Rekombinante exprimierte Fremdgenprodukt testet. Derartige Tests können z.B. auf den physikalischen oder funktioneilen Eigenschaften des CNTF-Genprodukts im Biotest basieren, wie weiter oben im Abschnitt 5.2 beschrieben.

Wenn ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül erst einmal identifiziert und isoliert ist, können verschiedene, dem Fachmann bekannte Methoden zu seiner Vermehrung angewendet werden. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und geeignete Wachstumsbedingungen geschaffen sind, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und in großer Menge angesetzt werden. Wie früher erläutert wurde, umfassen die verwendbaren Expressionsvektoren die folgenden Vektoren und ihre Abkömmlinge, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Human- oder Tierviren wie das Vacciniavirus, das Adenovirus; Insektenviren wie das Baculovirus; Hefevektoren, Bakteriophagenvektoren (z.B. Lambda) sowie Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.

Außerdem kann ein Wirtszellen-Stamm ausgewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der besonderen gewünschten Weise modifiziert und verarbeitet. Die Expression von bestimmten Promotoren aus kann in Gegenwart gewisser Induktoren verbessert werden; so läßt sich die Expression des gentechnisch erzeugten CNTF-Proteins kontrollieren. Ferner verfügen verschiedene Wirtszellen über charakteristische und spezifische Mechanismen zur translatorischen und posttranslatorischen Verarbeitung und Modifikation (z.B. Glycosylierung, Aufspaltung) von Proteinen. Es können geeignete Zellinien oder Wirtssysteme ausgewählt werden, um die gewünschte Modifikation und Verarbeitung des exprimierten Fremdproteins zu gewährleisten. Beispielsweise kann die Expression in einem bak-

teriellen System angewendet werden, um ein nicht glycosyliertes Kernproteinprodukt zu erzeugen. Die Expression in Hefe liefert ein glycosyliertes Produkt. Die Expression in Säugetierzellen kann verwendet werden, um eine "native" Glycosylierung des heteroloqen CNTF-Proteins zu sichern. Fe ier können verschiedene

Vektor-Wirt-Expressionssysteme in unterschiedlichem Grade Verarbeitungsreaktionen wie z.B. proteolytische Aufspaltungen bewirken.

In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann DNA, die CNTF kodiert, in ein pCMV-Plasmid kloniert, amplifiziert und dann zur Transformation von HeLa-Zellen nach der DEAE-Dextran-Methode verwendet werden; danach kann die CNTF-Aktivität aus Zellextrakten gewonnen werden (siehe Beispiel Abschnitt 6, weiter unten).

In einer weiteren spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann CNTF-kodierende DNA in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut und zur Transformation von E. coli verwendet werden,-wodurch biologisch aktiver CNTF entsteht (siehe Beispiel in Abschnitt 7, weiter unten).

In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Expression von CNTF in E. coli vorzugsweise unter Verwendung von Vektoren ausgeführt, die eine der folgenden Komponenten enthalten: einen Iac UV5-Promotor, der durch den Lactose-Operon-Repressor kontrolliert werden kann; eine starke Ribosomen-Bindungsstelle, zum Beispiel die Ribosomen-Bindungsstelle des Bakteriophagen TV; eine Mutation im Replikationskontrollbereich des Plasmids, welche die Kopienzahl erhöhen kann; oder eine Mutation, welche die Expression des Antibiotikaresistenzproteins begrenzt. In einer bevorzugten spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird die Expression von CNTF unter Verwendung des Vektors PRPN12 durchgeführt, was zu einer 30- bis 50-fachen Zunahme der Expression von CNTF relativ zu anderen Vektoren führen kann (Abschnitt 12, weiter unten). In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Expressionsvektor pRPN38 zur Produktion von CNTF in E. coli verwendet werden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung kann Human-CNTF unter Verwendung des Vektors pRPN40 in E. coli

exprimiert werden. Die Erfindung liefert auch Moleküle, die den Plasmiden pRPN12, pRPN38, pRPN39 und pRPN40 funktionell äquivalent sind, die Elemente enthalten (Promotoren, Ribosomen-Bindungsstellen usw.), die zu vergleichbaren Expressionswerten von CNTF führen.

5.5.1. Identifikation und Reindarstellunq des exprimierten Genprodukts

Sobald eine Rekombinante, die das CNTF-Gen exprimiert, identifiziert ist, sollte das Genprodukt analysiert werden. Dies läßt sich durch Tests erreichen, die auf den physikalischen und funktioneilen Eigenschaften des Produkts basieren.

Sobald das CNTF-Protein identifiziert ist, kann es nach dem Fachmann bekannten Standardverfahren, einschließlich der Chromatographie (z.B. Ionenaustausch-, Affinitäts- und Ausschlußchromatographie) , der Zentrifugation, der differentielien Löslichkeit, oder nach irgendeinem anderen Standardverfahren zur Reinigung von Proteinen isoliert und gereinigt werden. Die funktionellen Eigenschaften können unter Anwendung irgendeines bekannten CNTF-Tests beurteilt werden, einschließlich der Kükenembryo-Ziliarganglionneuronen, jedoch nicht darauf beschränkt.

Wichtig ist, daß Methoden, die zur Präparation von CNTF aus Hüftnervengewebe angewendet werden, da sie als letzten Schritt die präparative Elektrophorese enthalten, CNTF produzieren würden, das u.U. aufgrund der Gegenwart von restlichem SDS nicht voll aktiv ist. Im Gegensatz dazu bietet die vorliegende Erfindung eine Methode zur Reinigung eines zur Protein-Sequenzierung geeigneten CNTF mit optimaler biologischer Aktivität, unter Anwendung einer FPLC-Säule; die vorliegende Erfindung gestattet auch die Isolierung von rekombinantem CNTF, der aus rekombinanten Nukleinsauremolekülen erzeugt oder chemisch synthetisiert wird und dadurch SDS-frei und voll aktiv ist.

5.6. Gene und Proteine mit ziliarem neurotrophem Faktor

Unter Anwendung der weiter oben sowie in den Beispiel-Abschnitten 6 und 8 weiter unten ausführlich beschriebenen Methoden wurden die folgenden Nukleinsäure-Sequenzen bestimmt

und die entsprechenden Aminosäuresequenzen abgeleitet. Die cDNA des Ratten-CNTF wurde bestimmt und ist in Abb. 1 dargestellt. Die humangenomische CNTF-Sequenz wurde bestimmt und ist in Abb. 8 dargestellt. Jede dieser Sequenzen bzw. ihre funktionellen Äquivalente können gemäß der Erfindung verwendet werden. Außerdem betrifft die Erfindung CNTF-Gene und -Proteine, die aus Schweine-, Schafs-, Rinder-, Katzen-, Vogel-, Pferde-, Hundesowie Primaten-Quellen und beliebigen anderen Spezies isoliert werden, bei denen eine CNTF-Aktivität existiert. Die Erfindung zielt weiterhin auf Teilsequenzen von CNTF-Nukleinsäuren ab, die mindestens zehn Nukleotide enthalten; derartige Teilsequenzen enthalten hybridisierbare Teile der CNTF-Sequenz. die z.B. in Nukleinsäure-Hybridisierungstests, Southern- und Northern-blot-Analysen usw. von Nutzen sind. Die Erfindung liefert auch CNTF-Proteine, -Fragmente und deren Abkömmlinge entsprechend den in Abb. 1 und 8 dargestellten Aminosäuresequenzen oder ihren funktionellen Äquivalenten. Außerdem liefert die Erfindung Fragmente oder Derivate von CNTF-Proteinen, die eine oder mehrere antigene Determinanten enthalten oder die funktionell aktiv sind. Der Begriff "funktionell aktiv", wie er hier gebraucht wird, soll eine positive Aktivität in Tests für eine bekannte CNTF-Funktion bedeuten, z.B. in Kükenembryo-Ziliarganglion-Tests.

Beispielsweise können die in Abb. 1 und 8 dargestellten Nukleinsäuresequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen verändert werden, die funktionell äquivalente Moleküle liefern. Aufgrund der Entartung der Nukleotid-Kodierungssequenzen können andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz v/ie die in den Abbildungen 1 und 8 dargestellte kodieren, in der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Sequenzen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Nukleotidsequenzen, welche die in den Abbildungen 1 und 8 dargestellten CNTF-Gene ganz oder teilweise enthalten, die durch die Substitution verschiedener, einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest kodierender Codons verändert werden, so daß eine stille Veränderung erzeugt wird. Ebenso umfassen die erfindungsgemäßen CNTF-Proteine, ohne sich jedoch darauf zu beschränken, diejenigen Proteine, die als primäre Aminosäuresequenz die im wesentlichen in den Abbildungen 1 und 7 dargestellte Aminosäuresequenz ganz oder teilweise

enthalten, einschließlich veränderter Sequenzen, in denen Restgruppen innerhalb der Sequenz durch funktionell äquivalente Aminosäurereste substituiert sind, wodurch eine stille Veränderung entsteht. Beispielsweise können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure von gleichartiger Polarität substituiert werden, die als funktionelles Äquivalent wirkt, wodurch eine stille Veränderung entsteht. Austauschelemente für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können unter anderen Elementen der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beißpiel gehören Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin zu den apolaren (hydrophoben) Aminosäuren. Zu den polaren neutralen Aminosäuren gehören Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Zu den positiv geladenen (babischen) Aminosäuren gehören Arginin, Lysin und Histidin. Zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren gehören Asparaginsäure und Glutaminsäure. Ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung enthalten sind CNTF-Proteine oder deren Fragmente oder Derivate, die während oder nach der Translation unterschiedlich modifiziert werden, z.B. durch Glycosylierung, proteolytische Aufspaltung, Bindung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden usw. In Abschnitt 8 weiter unten werden Beispiele für die Expression von biologisch aktivem rekombinantem CNTF in E. coli angegeben, wodurch darauf hingewiesen wird, daß nicht glycosylierter CNTF biologisch aktiv ist.

Außerdem können die erfindungsgemäßen, den rekombinanten CNTF kodierenden Nukleinsäuresequenzen so angelegt werden, daß die Verarbeitung oder Expression von CNTF modifiziert wird. Beispielsweise, ohne daß hierdurch eine Einschränkung des Schutzumfangs beabsichtigt ist, kann in 5'-Richtung von CNTF-kodierenden Sequenzen eine Signalsequenz inseriert werden, um die Sekretion von CNTF zu ermöglichen und dadurch die Ernte bzw. die biologische Verfügbarkeit zu erleichtern.

Zusätzlich kann ein vorgegebener CNTF in vitro oder in vivo mutiert werden, um Translations-, Initiations- und/oder Terminationssequenzen zu erzeugen und/oder zu vernichten oder um Veränderungen in Kodierungsbereichen zu erzeugen und/oder neue Restriktionsendonukleasestellen zu bilden oder vorher existie-

rende zu zerstören, um eine weitere іл-vitro-Modifikation zu erleichtern. Es kann jedes dem Fachmann bekannte Mutageneseverfahren angewendet werden, einschließlich der ortsspezifischen іл-vitro-Mutagenese (Hutchinson u.a., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), der Anwendung von TAB^R-Linkern (Pharmacia) usw., jedoch nicht darauf beschränkt.

5.7. Erzeugung von Antikörpern gegen den ziliaren neurotrophen Faktor

Erfindungsgemäß können CNTF-Pro'tein bzw. dessen Fragmente oder Derivate als Immunogene zur Bildung von Anti-CNTF-Xntikörpern eingesetzt werden. Indem für die Produktion relativ großer Mengen CNTF-Protein unter Anwendung von Rekombinationstechnikon für die Proteinsynthese gesorgt wurde (auf der Basis der erfindungsgemäßen CNTF-Nukleinsäureseguenzen), ist dem Problemn begrenzter CNTF-Mengen begegnet worden.

Um die Wahrscheinlichkeit ler Erzeugung einer Anti-CNTF-Immunreaktion weiter zu erhöhen, kann die Aminosäuresequenz von CNTF analysiert werden, um Teile des Moleküls, die u.U. mit einer erhöhten Immunogenität verbunden sind, zu identifizieren. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenz einer Computeranalyse unterworfen werden, um Oberflächenepitope zu identifizieren, wie in den Abbildungen 15(a) und (b) veranschaulicht, die Computerdiagramme der Hydrophilität, der Oberflächenwahrscheinlichkeit, der Flexibilität, des Antigen-Index, der amphiphilen Helix, des amphiphilen Faltblatts und der Sekundärstruktur von Ratten- bzw. Human-CNTF darstellen. Wahlweise könnten die abgeleiteten CNTF-Aminosäuresequenzen von verschiedenen Spezijs miteinander verglichen und relativ nichthomologe Bereiche identifiziert werden; diese nichthomologen Bereiche wären mit höherer Wahrscheinlichkeit bei verschiedenen Spezies gleichermaßen immunogen.

Zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen TNTF kann jedes Verfahren angewendet werden, das für die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zeilinien in Kultur sorgt. Zum Beispiel liegen die ursprünglich von Kohler und Milstein entwickelte Hybridomtechnik (1975, Nature 256:495-497) sowie Triomtechnik, rHe Human-B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor u.a., 1983, Immunology Today 4:72) und die EBV-Hybridomtechnik zur

Erzeugung monoklonaler Human-Antikörper (Cole u.a., 1985, in "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy" (Monoklonale Antikörper und Krebstherapie), Alan R. Liss, Inc., S. ,77-96) und dergleichen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.

Die monoklonalen Antikörper zum therapeutischen Gebrauch können monoklonale Human-Antikörper oder chimärische monoklonale Mensch-Maus-Antikörper (oder andere Spezies) sein. Monoklonale Human-Antikörper können nach irgendeinem der zahlreichen dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden (z.B. Teng u.a., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:7308-7312; Kozbor u.a., 1983, Immunology Today 4:72-79; Olsson u.a., 1982, Meth. Enzymol. 92:3-16). Chimärische Antikörpermoleküle können so hergestellt werden, daß sie eine Maus-Antigen-bindende Domäne mit konstanten Human-Regionen enthalten (Morrison u.a., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S,A. 81:6851; Takeda u.a., 1985, Nature 314:452).

Zur Herstellung polyklonaler Antikörper gegen CNTF-Epitope können verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren angewendet werden. Zur Produktion des Antikörpers kann man durch Injektion mit CNTF-Protein oder mit einem Fragment oder Derivat des Proteins verschiedene Wirtstiere immunisieren, einschließlich Kaninchen, Mäuse, Ratten usw., jedoch nicht auf diese beschränkt. Zur Verstärkung der Immunantwort können, je nach der Wirtsspezies, verschiedenartige Adjuvanzien verwendet werden, einschließlich des (vollständigen oder unvollständigen) Freundschen Adjuvans, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktiver Substanzen wie Lysolecithin, Pluronpolyole, Polyanionen, Peptide, Ölemuisionen, Hämocyanine der Schlüsselloch-Napfschnecke, Dinitrophenol und möglicherweise brauchbare Human-Adjuvanzien wie BCG (Bazillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.

Ein molekularer Klon eines Antikörpers gegen ein CNTF-Epitop kann nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Es können DNA-Rekombinationsmethoden angewendet werden (siehe z.B. Maniatis u.a., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), um Nukleinsäuresequenzen zu konstruieren, die ein monoklonales Antikörpermolekül oder dessen

Antigen-ßindungsbereich kodieren.

Antikörpermoleküle können nach bekannten Verfahren gereinigt werden, z.B. durch Immunabsorption oder Immunoaffinitätschromatographie, chromatographische Verfahren wie HPLC (Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie) oder eine Kombination dieser Verfahren usw.

Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können nach bekannten Verfahren erzeugt werden. Zum Beispiel umfassen derartige Fragmente, ohne sich aber darauf zu beschränken: das Fragment F(ab')₂, das durch Aufschluß des Antikörpermoleküls mittels Pepsin erzeugt werden kann; die Fragmente Fab', die durch Reduktion der Disulfidbrücken des Fragments F(ab')₂ erzeugt werden können, und die Fragmente 2 Fab bzw. Fab, die durch Behandlung des Antikörpermoleküls mit Papain und зіпет Reduktionsmittel erzeugt werden können.

Das Beispiel in Abschnitt 8 beschreibt die Präparation von polyklonalen Antiseren gegen ein aus vierzehn Aminosäuren bestehendes Peptidfragment des CNTF-Proteins.

Das Beispiel in Abschnitt 17 beschreibt vier monoklonale Anti-CNTF-Antikörper, die nach der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, nämlich RP3-12, RP12-1, RP12-2 und RP12-9.

5.8. Nutzen der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Nukleinsäuresequenz von CNTF sowie daraus erzeugte, hochreine Proteine, Peptidfragmente oder Derivate. CNTF-Proteine, -Peptide und -Derivate, Anti-CNTF-Antikörper und CNTF-Nukleinsäuresonden können in diagnostischen und therapeutischen Anwendungen eingesetzt werden. Für die meisten Zwecke ist die Verwendung von CNTF-Genen oder -Genprodukten der gleichen Spezies für diagnostische oder therapeutische Zwecke vorzuziehen; allerdings können gekreuzte CNTF-Spezies bei spezifischen Asuführungsformen der Erfindung von Nutzen sein.

5.8.1. Diagnostische Anwendungen

Die vorliegende Erfindung, die CNTF-kodierende Nukleinsäuren und daraus gewonnene Proteine, Peptidfragmente oder Derivate sowie Antikörper gegen CNTF-Prctein, -Peptide oder -Derivate betrifft, kann zur Diagnose von Krankheiten und Störungen des Nervensystems verwendet werden, die u.U. mit Veräm?^r..-"ungenm im CNTF-Expressionsmuster verbunden sind.

In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung können CNTF-Gene und verwandtb Nukleinsäuresequenzen und Teilsequenzen, einschließlich komplementärer Sequenzen, in diagnostischen Hybridisierungstests angewendet werden. Die CNTF-Nukleinsäuresequenzen oder deren Teilsequenzen, die mindestens 10 Nukleotide enthalten, können als Hybridisierungssonden eingesetzt werden. Hybridisierungstests können zum Nachweis, zur Prognose, Diagnose oder Überwachung von Zuständen, Störungen oder Krankheiten dienen, die mit Veränderungen in der CNTF-Expression verbunden sind; dazu gehören insbesondere Zustände, die zur Schädigung und Degeneration von Neuronen führen, die bekanntermaßen auf CNTF reagieren, wie z.B. parasympathische Neuronen, cholinerge Neuronen, Rückenmarksneuronen, Neuroblastomzellen und Zellen des Nebennierenmarks. Derartige Krankheiten und Zustände umfassen, sind aber nicht beschränkt auf ZNS-Trauma, Infarkt, Infektion, degenerative Nervenerkrankung, Malignität oder postoperative Veränderungen, einschließlich der Alzheimerschen Krankheit, der Parkinsonschen Krankheit, der Huntingtonschen Chorea und der amyotrophen Lateralsklerose, jedoch nicht darauf beschränkt. Zum Beispiel kann die Gesamt-RNA in einer Gewebeprobe von einem Patienten auf Vorhandensein von CNTF-mRNA getestet werden, wobei die Abnahme der CNTF-mRNA-Menge ein Hinweis auf neuronale Degeneration ist.

In anderen Ausführungsformen der Erfindung können Antikörper gegen CNTF-Protein, -Peptidfragmente oder -Derivate zur Diagnose von Erkrankungen und Störungen des Nervensystems, wozu insbesondere die oben aufgeführten Neuronenpopulationen bzw. klinischen Störungen und Erkrankungen gehören, eingesetzt werden. Erfindungsgentäße Antikörper gegen CNTF-Proteine können beispielsweise zur inununohistochemischen Identifikation der CNTF-

Aktivität im Gewebeschnitt oder der Biopsie eines Patienten, der eine solche Auswertung benötigt, verwendet werden. In einem weiteren Beispiel können die erfindungsgemäßen Antikörper in ELISA-Verfahren zum Nachweis und/oder zur Messung der in Gewebeoder Flüssigkeitsproben vorhandenen CNTF-Mengen eingesetzt werden; in ähnlicher Weise können die erfindungsgemäßen Antikörper in der Western blot - Analyse zum Nachweis oder zur Messung des in Gewebe- oder Flüssigkeitsproben vorhandenen CNTF verwendet werden. Ein erfindungsgemäßer Antikörper, der CNTF bindet und in einer Immunpräzipitation ausfällt, wird in Abschnitt 11 weiter unten beschrieben.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können CNTF-Protein, -Peptidfragmente oder -Derivate zur Diagnose von Erkrankungen oder Störungen des Nervensystems eingesetzt werden. In einer besonderen Ausführungsform, auf die hier ohne Einschränkung des Schutzumfangs Bezug genommen wird, können markiertes CNTF-Protein bzw. markierte Peptidfragmente zur Identifikation von Geweben oder Zellen eingesetzt werden, die dem CNTF-Rezeptor exprimieren, um Abweichungen von der Expression des CNTF-Rezeptors und damit mögliche Anomalien in der Gewebe- oder Zellreaktion auf CNTF festzustellen.

Die vorliegende Erfindung liefert auch einen immunologischen Test zur Messung der CNTF-Menge in einer Flüssigkeitsprobe; hierbei handelt es sich um ein Zwei-Antikörper Sandwichverfahren, das darin besteht, daß ein erster Anti-CNTF-Antikörper ал einen festen Träger gebunden wird, der gebundene erste Antikörper einer CNTF-haltigen Lösung unter Bedingungen ausgesetzt vird, welche die Bindung des ersten Antikörpers an CNTF gestatten, und dann das an den ersten Antikörper gebundene CNTF einem zweiten Anti-CNTF-Antikörper , der vorzugsv/eise gegen ein anderes CNTF-Epitop gerichtet ist als der erste Anti-CNTF-Antikörper, unter Bedingungen ausgesetzt wird, welche die Bindung des CNTF an den zweiten Antikörper gestatten, gefolgt vom Nachweis der Bindung des zweiten Antikörpers an CNTF unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, welche die Bindung des zweiten Antikörpers an einen Immunglobulinftntikörper, der zu einer Indikatorsubstanz wie z.B. einer fluoreszierenden Verbindung konjugiert ist, oder an eine

Verbindung, die ein Radioisotop enthält, ein Enzym oder eine Substanz, die in einem kolorimetrischen Test ein Signal erzeugen kann, umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die monoklonalen Antikörper RP3-12 und RP12-2 in einem derartigen Zwei-Antikörper-Sandwichtest für Human-CNTF eingesetzt werj'-n (siehe Abschnitt 17, weiter unten). Ein solches Verfahren kann als empfindlicher Test zur Messung von CNTF-Werten dienen und in der Diagnose neurologischer Störungen*, die mit Anomalien in der CNTF-Expression verbunden sind, angewendet werden.

5.8.2. Therapeutische Anwendungen

Die vorliegende Erfindung, die sich auf CNTF-kodierende Nukleinsäuren und daraus erzeugte Proteine, Peptidfragmente oder Derivate sowie auf Antikörper gegen CNTF-Protein, -Peptide oder -Derivate bezieht, kann zur Behandlung von Krankheiten und Störungen des Nervensystems eingesetzt werden, die u.U. mit Veränderungen im CNTF-Expressionsmuater verbunden sind bzw. durch Einwirkung von CNTF oder Anti-CNTF-Antikörpern günstig beeinflußt werden können.

In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung können CNTF-Protein, -Peptidfragmente oder -Derivate Patienten verabreicht werden, deren Nervensystem durch Trauma, Chirurgie, Ischämie, Infektion (z.B. Polio oder AIDS), Stoffwechselerkrankung, Nahrungsmangel, Malignität, Giftstoffe oder eine Degenerationskrankheit noch unbekannten Ursprungs geschädigt ist. In verschiedenen spezifischen Ausführungsformen der Erfindung kann CNTF Rückenmarksneuronen zugeführt werden, die beispielsweise durch Trauma, Infarkt, Infektion, Degenerationskrankheit oder chirurgische Läsion geschädigt wurden; das Beispiel in Abschnitt 10 veranschaulicht die Anwendung von CNTF bei der Überlebensförderung von Rückenmarksneuronen.

Die erfindungsgemäßen CNTF-Nukleinsäuren, -Peptide und -Derivate können zur Behandlung von Motorneuronen-Störungen eingesetzt werden. Das Beispiel in Abschnitt 11 veranschaulicht die bemerkenswerte Wirksamkeit von CNTF bei der Überlebensförderung von Motorneuronen im durchtrennten Gesichtrnerv. Dementsprechend können in besonderen Ausführungsformen der Erfindung CNTF ode?.

Peptide oder deren Derivate zur Behandlung der Bellschen Lähmung {einer Lähmung unter Beteiligung des Gesichtsnervs) sowie anderer Erkrankungen des motorischen Systems (Motorneuronerkrankungen) eingesetzt werden, einschließlich der amyotrophen Lateralsklerose, der progressiven spinalen Muskelatrophie, der progressiven Bulbärparalyse, der primären Lateralsklerose und spinaler Muskelatrophien (Werdning-Hoffmannsche Krankheit und Kugelberg-Welandersche Krankheit) sowie des Post-Polio-Syndroms, jedoch nicht darauf beschränkt.

Degeneration und Tod von Motorneuronen im Vorderhorn des Rückenmarks sind ein Hauptaspekt des pathophysiologischen Prozesses bei amyotropher Lateralsklerose (ALS; Lou Gehrigsche Krankheit), Rückenmarksverletzung und verwandten Erkrankungen. Die Ergebnisse von Abschnitt 10 und 14 weiter unten zeigen, daß CNTF zur Steigerung der Überlebensrate von Rückenmarksneuronen bei der Behandlung dieser Erkrankungen eingesetzt werden kann.

Wie außerdem durch die im Beispiel von Abschnitt 18 weiter unten angegebenen Daten belegt wird, können pharmazeutische Präparate, die den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor oder am besten CNTF und den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor enthalten, zur Überlebensförderung von Motorneuronen eingesetzt und bei der Behandlung der obenerwähnten Motorneuronerkrankungen angewendet werden.

Die vorliegende Erfindung kann außerdem beispielsweise angewendet werden, um die Genesung von Patienten zu beschleunigen, die an Diabetikerneuropathien leiden, z.B. an multipler Mononeuropathie oder an Impotenz. In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können CNTF oder daraus gewonnene Peptidfragmente oder Derivate zur Behandlung kongenitaler Zustände oder neurovegetativer Störungen angewendet werden, einschließlich der Alzheimorschen Krankheit, des Alterns, peripethaler Neuropathien, der Parkinsonschen Krankheit, der Huntigtonschen Chorea sowie Erkrankungen und Störungen der Motorneuronen, jedoch nicht darauf beschränkt; insbesondere kann die Erfindung zur Behandlung kongenitaler oder neurodegenerativer Störungen angewendet werden, die mit einer cholinergen Neuronendysfunktion verbunden sind.

Es ist nachgewiesen worden, daß die Alzheimersche Krankheit mit einem selektiven Verlust an cholinergen Neuronen im basalen Vorderhirn verbunden ist und daß ca. 35 % der Patienten mit Parkinsonscher Krankheit an Demenz vom Alzheimerschen Typ leiden; CNTF, der gemäß der Erfindung produziert wurde, kann sich in einer Einzelmedikament-Therapie für diesen Krankheitskomplex als brauchbar erweisen. In ähnlicher Weise kann erfindungsgemäß produzierter CNTF therapeutisch zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit in Verbindung mit dem Langdon-Down-Syndrom eingesetzt werden. Erfindungsgemäß produzierter CNTF kann bei der Behandlung einer Vielzahl von Demenzen sowie kongenitaler Lernstörungen eingesetzt werden.

Wie in den Abschnitten 15 und 16 weiter unten an Beispielen erläutert wird, ist beobachtet worden, daß CNTF eine Reihe von Wirkungen auf Hippocampuszellen aufweist, einschließlich erhöhter GABA-Aufnähme, verstärkter Expression von Neurofilament-Protein und GAD-Enzym, erhöhter Überlebensrate von GABA-ergen Neuronen, erhöhter Überlebensrate vron Hippocampusneuronen und erhöhter Überlebensrate von Hippocampus-Astrozyten. Dementsprechend kann in verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung CNTF angewendet werden, um diese Wirkungen in vitro oder in vivo auf Hippocampuszellen auszuüben, und kann bei der Behandlung neurologischer Störungen, die den Hippocampus betreffen, eingesetzt werden, einschließlich der Alzheimerschen Krankheit, der Infarktbildung und toxischer Verletzungen, jedoch nicht darauf beschränkt.

Der CNTF, CNTF-Peptide, Antikörper oder Derivate gemäß der Erfindung können auch zur Behandlung von Tumoren eingesetzt werden, die aus Nervengewebe entstehen, einschließlich des Glioblastoms und des Melanoms, das aus Melanozyten entsteht, die von der Neuralleiste herrühren.

Es kann wünschenswert sein, die CNTF-verwandten Peptide oder CNTF-Protein durch Adsorption an einer Membran, z.B. einer silastischen Membran, einem Gel oder einem Schaum zuzuführen, der (die) in der Nähe des geschädigten Nervs implantiert werden könnte. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann die Zufuhr von CNTF-Protein, -Peptidfragmenten oder -Derivaten

in Verbindung mit chirurgischer Implantation von Gewebe oder anderen Präparaten mit fortdauernder Freisetzung, einschließlich Mikrokugeln, Mikrokapseln oder synthetischer Implantate, bei der Behandlung der Alzheimerschen Krankheit, der amyotrophen Lateralsklerose und anderer Motorneuronerkrankungen (wozu beispielsweise die Werdnig-Hoffmansche Krankheit gehört) sowie der Parkinsonschen Krankheit angewendet werden.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können CNTF-Protein, -Fragmente oder Derivate in Verbindung mit anderen Zytokinesefaktoren zur Erzielung eines erwünschten neurotrophen Effekts eingesetzt werden. Zum Beispiel, ohne hierdurch den Sei. 'umfang einschränken zu wollen, kann CNTF erfindungsgemäß zusammen mit NGF eingesetzt werden, um einen stimulierenden Effekt auf das Wachstum und Überleben von Neuronen zu erzielen. Es wird für möglich gehalten, daß CNTF mit anderen ZNS-abgeleiteten Peptidfaktoren, die noch vollständig charakterisiert werden müssen, beim Wachstum, der Entwicklung und dem Überleben einer großen Menge neuronaler Subpopulationen im zentralen und peripheren Nervensystem zusammenwirken kann.

Es wird feiner für möglich gehalten, daß auf der Grundlage der vollständigen Charakterisierung des CNTF-Moleküls neuartige Peptidfragmente, Derivate oder Mutanten von CNTF entwickelt werden können, die in der Lage sind, als Agonisten oder Antagonisten einiger oder aller biologischen Funktionen von CNTF zu wirken.

In weiteren Ausführungsformen der Erfindung können Antikörper gegen CNTF-Protein bzw. Peptidfragmente oder deren Derivate Patienten verabreicht werden, die an vielfältigen neurologischen Störungen und Erkrankungen leiden und eine derartige Behandlung benötigen. Zum Beispiel können Patienten, die an Überproduktion von CNTF leiden, eine solche Behandlung benötigen. Anti-CNTF-Antikörper können zur Verhütung einer abweichenden Regeneration von Sensorneuronen (z.B. postoperativ) oder bei der Behandlung chronischer Schmerzsyndrome eingesetzt werden.

5.3,8. Pharmazeutische Präparate

Die wirksamen erfindungsgemäßen Präparate, die aus dem gesamten oder Teilen des CNTF-Genprodukts bestehen können, einschließlich Protein, Peptidfragmente bzw. daraus erzeugte Derivate, oder Antikörper (oder Antikörperfragmente) gegen CNTF-Protein, Peptidfragmente oder Derivate, oder eine Kombination aus CNTF und einem zweiten Mittel wie z.B. NGF können in jedem sterilen biokompatiblen pharmazeutischen Träger zugeführt werden, einschließlich physiologischer Kochsalzlösung, gepufferter Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser, jedoch nicht darauf beschrankt.

CNTF-Protein, Peptidfragment oder Derivat können aus einer Aminosäuresequenz oder einer Teilsequenz davon bestehen, wie sie im wesentlichen in Abb. 1 (Ratte) bzw. Abb. 8 (Humansequenz) dargestellt sind. CNTF kann aus Sequenzen abgeleitet werden, die den CNTF-Sequenzen irgendeiner geeigneten Spezies entsprechen, einschließlich des Menschen, des Schweins, der Ratte, des Huhns, des Rinds, des Hundes, des Schafs, der Ziege, der Katze, des Kaninchens usw., jedoch nicht darauf beschränkt.

Die Menge an CNTF-Protein, Peptidfragment, Derivat oder Antikörper, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines Zustands wirksam ist, hängt von der Natur der Störung bzw. des Zustands ab und kann nach normalen klinischen Verfahren ermittelt werden. Wenn möglich, ist es günstig, die Dosis-Wirkungs-Kurve und die pharmazeutischen Präparate vor dem Test am Menschen zunächst in vitro, z.B. in den weiter oben beschriebenen CNTF-Biotests, und dann in brauchbaren Tiermodellsystemen zu bestimmen. Auf der Grundlage von in vitro gewonnenen Daten kann bei einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ein pharmazeutisches Präparat, das bei der Überlebensförderung von Ziliarganglion-Neuronen wirksam ist, eine lokale CNTF-Proteinkonzentration von ca. 2 дд/rnl erzeugen. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform der Erfindung kann ein pharmazeutisches Präparat, das bei der Wachstums- und Überlebensförderung cholinerger Neuronen wirksam ist, eine lokale CNTF-Proteinkonzentration von ca. 40 trophischen Einheiten pro Milliliter erzeugen.

Die Zuführungsmethoden umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf die intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale und intranasale Zuführung. Außerdem kann es günstig sein, erfindungsgemäße pharmazeutische Präparate auf irgendeinem geeigneten Weg dem Nervensystem zuzuführen, einschließlich der intraventrikulären und der intrathekalen Injektion; die intraventrikuläre Injektion kann z.B. durch einen intraventrikulären Katheter erleichtert werden, der an einen Behälter angeschlossen wird, wie z.B. einen Ommaya-Behälter.

Ferner kann es günstig sein, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate dem behandlungsbedürftigen Bereich örtlich zuzuführen; dies läßt sich zum Beispiel, ohne hiermit den Schutzumfang einschränken zu wollen, durch lokale Infusion bei chirurgischen Operationen, durch Injektion, mit Hilfe eines Katheters oder eines Implantats erreichen, wobei das Implantat ein poröses, nichtporöses oder gelatinöses Material ist, einschließlich Membranen, wie z.B. silastischer Membranen, oder Fasern.

Die Erfindung liefert auch pharmazeutische Präparate, die aus CNTF-Proteinen, -Peptidfragmenten oder -Derivaten bestehen, die über Liposome, Mikroteilchen oder Mikrokapseln verabreicht werden. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann die Verwendung derartiger Präparate nützlich sein, um eine fortdauernde Freisetzung von CNTF oder CNTF-verwandten Produkten zu erreichen.

Es wird für möglich gehalten, daß Zellen, die aktiv CNTF, CNTF-verwandte Substanzen, CNTF-Antagonisten oder CNTF-Agonisten, CNTF-Antikörper in Bereiche mit erhöhtem CNTF-Bedarf eingeführt werden können.

5.8.4. Erfindunasqemäße Molekularsonden können zur Identifizierung neuer CNTF-homoloqer Moleküle verwendet werden

Moleküle, die eine CNTF-ähnliche Aktivität, jedoch abweichende Molekulargewichte aufweisen, sind in verschiedenen Spezies und Geweben festgestellt worden, u.a. im Auge des Kükenembryos, im Rattenhüftnerv, in geschädigtem Hirngewebe, in Herzzellen, in Überständen von Neuroblastomzellen (Heymanns und

Unsicker, 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84:7758-77^2) und in Nebennierenmarkzellen (Unsicker u.a., 1985, Neurosci. Lett. 60:127-132). Es ist nicht bekannt, wie viele davon mit dem hier beschriebenen CNTF identisch oder von ihm verschieden sind; wahrscheinlich werden noch weiter Quellen und Spezies von CNTF aufgefunden werden. Die erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Moleküle oder Antikörper gegen erfindungsgemäße CNTF-Proteine oder -Peptidfragmente können zur Charakterisierung neuer CNTF-homologer Moleküle verwendet werden.

Zum Beispiel, ohne hiermit den Schutzumfang einschränken zu wollen, können die CNTF-kodierenden rekombinanten DNA-Moleküle als Sonden zur Identifikation der in den Abbildungen 1 und 8 gezeigten neuen CNTF-Moleküle verwendet werden. Diese homologen Moleküle können CNTF-Aktivität aufweisen oder nicht, und sie können in Bezug auf die in Abb. 1 und 8 dargestellten Moleküle aus den gleichen oder aus verschiedenen Genomsequenzen entstehen. Vorzugsweise könnten diese neuen Moleküle unter Verwendung von Teilen der in Abb. 1 bzw. 8 dargestellten CNTF-kodierenden Sequenzen als Oligonukleotid-Starter in PCR-Reaktionen identifiziert werden, die als Matrize entweder genomische DNA oder RNA aus den Zellen verwenden, von denen man annimmt, daß sie das CNTF-Homologe exprimieren.

6. Beispiel: Molekulare Klonierung, Expression und Bereichsverteilung des ziliaren neurotrophen Faktors (CNTF) der Ratte

6.1. Materialien und Methoden

6.1.1. Reinigung und Aufspaltung von CNTF

CNTF wurde wie beschrieben gereinigt (Saadat u.a., 1989, J. Cell Biol., 108:1087-1816); zusätzlich wurde nach der Elektroelution aus präparativen Polyacrylamidgelen CNTF in eine 7,75 χ 100 mm Bakerbond Gold C4 Widepore-Säule eingebracht und mit 0,1% Trifluoressigsäure und einem Acetonitrilgradienten von 0 bis 60% eluiert. Das biologisch aktive Protein wurde in einem Peak bei 50 bis 55% Acetonitril eluiert. Die 2D-Gelanalyse von 4 jiq gereinigtem CNTF, wobei die erste Dimension aus einer isoelektrischen Fokussierung auf einem Gradienten von pH 3,5-10,0 und die zweite Dimension aus einer 12% SDS-Polyacrylamidgelelektro-

phorese bestand, zeigte, daß dieses Protein als Einzelfleck wanderte (Saadat u.a., 1989, J. Cell Biol 108:1807-1816) (Abb. 2)♦ Parallel dazu wurde eine 2D-Gelanalyse von CNTF durchgeführt, der nicht dem zusätzlichen Reinigungsschritt auf der Bakerbond Gold C4 Widepore-Säule unterworfen wurde.

Der CNTF-haltige Einzelpeak wurde in einem Speed Vac konzentriert, aus dem die Luft mit Argon ausgespült worden war. Es wurde festgestellt, daß das Argon wichtig war, um einen Verlust an CNTF-Aktivität zu verhindern, der bei Oxidation eines oder mehrerer Methioninreste auftritt. Zur BRCN-Aufspaltung wurden Ameisensäure (Endkonzentration 70% v/v) und BRCN (10% v/v) 30 дд gereinigtem CNTF zugesetzt. Nach 3h bei Raumtemperatur wurden 500 μΐ H₂O zugesetzt und das Material wurde auf 50 μΐ eingeengt und sofort in die Bakerbond Gold C4 Widepore-Säule eingebracht. Zur tryptischen Aufspaltung wurden 30 дд chromatographisch gereinigter CNTF getrocknet, wieder in 50 μΐ 0,1 M TRIC/HCl (pH 8,0) mit einem Gehalt von 10 mM CaCl₂ und 3 дд TPK-behandeltem Trypsin (Sigma) aufgelöst und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die entstehenden Fragmente wurden in die Bakerbond Gold C4 Widepore-Säule geladen und unter Anwendung der gleichen Bedingungen eluiert (Strömungsgeschwindigkeit 1 ml/min-1 , Gradient 0-60% Acetonitril in 60 Minuten, Beobachtung bei 214 nm) . Die Peaks wurden manuell aufgenommen. Die Aminosäuresequenzen der Peptide wurden unter Verwendung eines automatischen Sequenzierers von Applied Biosystems bestimmt (Eckerskorn u.a., 1988, Electrophoresis 9:830-838).

Die Aminosäure-Zusammensetzung des gereinigten CNTF wurde durch Hydrolyse von 5 дд CNTF und Derivatisierung mit Ninhydrin ermittelt (Tsugita u.a., 1987, Biochem. 102:1593-1597).

6.1.2. Erzeugung von cDNA CNTF - Klonen

cDNA wurde aus der Gesamt-RNA von kultivierten Ratten-Astrozyten (Okayama u.a., 1987, Methods Enzymol.154:3-29) unter Verwendung des Oligo-Starters 5 (Oligonukleotidstarter sind in Abb. 1С dargestellt) und von Umkehrtranskriptase (Bethesda Research Laboratories) synthetisiert. Der erste Strang der cDNA

diente als Matrize zur Amplifikation spezifischer Segmente des CNTF unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) (Saiki u.a.,1988, Science 239:487-491). Der Klon A wurde unter Verwendung der entarteten Starter-Oligos 1 und 2 erzeugt und das PCR-Produkt wurde mit Oligo 11 identifizert, subkloniert und sequenziert. Die Sequenz dieses Teilklons wurde zur Synthese der Starter 3 und 4 für die Amplifikation von cDNA-Enden (RACE) nach den beschriebenen Verfahren eingesetzt (Frohmann u.a., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8998-9002). Die erhaltenen cDNAs wurden in den Bluescript SK+ - Vektor subkloniert und sequenziert (Klone B und C) . Das Oligonukleotid 7 wurde aus der Sequenz eines genomischen Klons abgeleitet (Carroll, unveröffentlichte Ergebnisse). Dieser Starter wurde zur Erzeugung des Klons D unter Verwendung des gleichen RACE-Protokolls wie für Klon C verwendet. Ein cDNA-Klon (E) von voller Länge zur Expression in eukaryotischen Zellen wurde unter Verwendung der Starter 9 und 10 für die PCR gewonnen.

6.1.3. Northern Blot - Analyse

RNA wurde unter Anwendung des Guanidin-Thiocyanat-Extraktionsverfahrens (Chomczynski, P., und Sacchi, N., 1987, Anal. Biochem. 162: 156-159) aus verschiedenen Rattengeweben extrahiert. Eine gleiche Menge Gesamt-RNA (30 дд RNA, außer bei mRNA aus Muskelgewebe, deren Menge 50 дд betrug) wurde glyoxyliert und einer Elektrophorese durch l,2%iges Agarosegel unterworfen (Lindholm u.a., 1988, Biol. Chem. 263: 16348-16351). Zur Beurteilung der Entwicklungsexpression von CNTF-mRNA im Hüftnerv der Ratte wurden 25 дд aus dem Rattenhüftnerv gewonnene Gesamt-RNA entsprechend der obigen Beschreibung elektrophoretisiert; PO, P4 und P13 in Abb. 4(b) beziehen sich auf RNA, die aus dem Hüftnerv von neugeborenen, vier Tage alten bzw. λ3 Tage alten Ratten gewonnen wurde. Bekannte Mengen eines CNTF-Transkripts mit 847 bp (synthetisiert in vitro unter Verwendung des Ribosondensystems, PROMEGA) wurden ebenfalls in getrennten Spuren gleichzeitig elektrophoretisiert. um eine Quantifizierung von CNTF-mRNA in den Proben zu ermöglichen. Nach der Elektrophorese erfolgte ein Vakuum-Blotting auf Nylonfilter (Hybond-N,

Amersham), und die Filter wurden bei 5O⁰C in 50% Formamid hybridisiert (Lindholm u.a., siehe oben), wobei eine doppelsträngige ³²P-markJ.^?:t^ cDNA -Sonde für den Kodierungsbereich von CNTF (600 bp) verwendet wurde. Die Filter wurden anschließend gewaschen, 60 Stunden lang auf Röntgenfilme exponiert, und das Autoradiogramm wurde fotografiert.

6.1.4. Expression von rekombinantem CNTF

i2:n Expressionsvektor mit Zytomsgalovirus-Promotor (Geschenk von David Russell) wurde zum Subklonieren eines CNTF-Klons von voller Länge in beiden Orientierungen verwendet. Für Transfektionen wurden HeLa-Zellen verwendet, da in diesen Zellen keine Grundexpression der überlebensfördernden Aktivität für embryonale Küken-Ziliarneuronen nachgewiesen werden konnte. Jede Kulturschale (100 mm Durchmesser) wurde mit 10 ßq des Vektors nach dem DEAE-Dextran-Verfahren transfiziert (Spandidos, D.A., und Wilhie, N.M., 1984, Transcription and Translation - A Practical Approach,(Transkription und Translation - eine praktische Einführung), 1-48). Nach 43 Stunden in Kultur wurden die Überstände entfernt, die Zellen dreimal mit kaltem PBS gewaschen und in einem 5 mM Phosphatpuffer lysiert, der 30 mM NaCl (pH 7,0) enthielt. Nach einer Ultrazentrifugation (100 000 χ G, 30 min) des Lysats wurden die Proteinkonzentrationen bestimmt und die Überstände wurden in verschiedenen Konzentrationen den kultivierten E8-Ziliarneuronen zugesetzt. Die überlebenden Neuronen wurden nach 24 Stunden der Kultur gezählt, wie schon früher beschrieben (Hughes u.a., 1983, Nature 335: 70-73). Jeder Punkt in Abb. 3 gibt den Mittelwert von drei Bestimmungen an; die Striche stellen die Standardabweichungen dar.

5.2. Ergebnisse

6.2.1. Bestimmung der CNTF-Aminosäuresequenz

CNTF wurde, wie oben beschrieben, durch Reinigung aus dem Rattenhüftnerv gewonnen. Zur Mengenbestimmung der Aminosäuren, zur Produktion von Bromcyan (BRCN) und der tryptischen Fragmente

(das N-terminale Ende war blockiert) war der zusätzliche Bakerbond Gold - Reinigungsschritt notwendig. Die Aminosäuresequenz der verschiedenen Fragmente, die durch Mikrosequenzierung in der Gasphase bestimmt wurde, machte mehr als 50% der Gesamtsequenz aus, die vollkommen mit der aus der cDNA abgeleiteten Sequenz übereinstimmte; die Sequenzen sind zusammen mit der Nukleotidsequenz in Abb. 1 dargestellt. Die Aminosäure-Zusammensetzung des gereinigten CNTF ist in Abb. l(d) dargestellt.

6.2.2. Erzeugung von CNTF-cDNA-Klonen und Sequenzanalyse

Als RNA-Quelle für die molekulare Klonierung wurden Rattenhirn-Astroglia-Zellkulturen verwendet; für diese Zellen ist schon früher gezeigt worden, daß sie beträchtliche Mengen CNTF produzieren (Lillien u.a., 1988, Neuron 1: 485-494). Nach verschiedenen PCR-Schritten (dabei wurden als Starter synthetische Oligonukleotide verwendet, die aus den gemäß Abschnitt 6.2.1. gewonnenen Daten über die Aminosäuresequenz abgeleitet wurden) zeigten die Nukleotidsequenzen der Klone A, B, C einen kurzen nichttranslatierten 5'-Bereich von 77 bp und ein offenes Leseraster von 600 bp, woraus sich ein Protein mit einer Länge von 200 Aminosäuren und einem nichttransiatierten 3'-Bereich von 436 bp voraussagen läßt, das in einem PoIy-(A)-Schwanz endet (Abb. 1). Ein im Raster befindlicher Startort für die Translation wurde in Position 78-80 der Nukleotidsequenz lokalisiert. Ein Stoppcodon in 5'-Richtung von diesem Startort in Position 72-74 sowie G's in Position 75 und 81 erfüllen die Bedingungen für einen zweckmäßigen Translations-Startort gemäß Kozak, M.J. (1989, J. Cell Biol. 108: 229-241). Ein Stoppcodon in Position 678-680 schließt sich an eine Sequenz an, die das Peptid CB2 kodiert. Die letzte durch Mikrosequenzierung identifizierte Aminosäure war Homoserin, was darauf hindeutet, daß das aus der Nukleotidsequenz vorausgesagte Methionin posttranslatorisch modifiziert wurde und das C-terminale Ende darstellt.

Obwohl die zweibasige (Arg-Arg) Sequenz in Position 13 und 14 der vorausgesagten Frequenz eine potentielle posttranslatorische Spaltstelle darstellt, spricht die Aminosäurezusammensetzung des gereinigten CKTF (Abb. l(d)) gegen eine solche Spaltung: die Aminosäuren Phenylalanin, Arginin und Alanin, die im N-termina-

len Bereich vorhanden sind, sind im Vergleich zu anderen Aminosäuren, die in diesem Bereich fehlen (z.B. Isoleucin) nicht reduziert. Darüberhinaus stimmt das vorausgesagte Molekulargewicht für die 200-Aminosäuren--Sequenz (22,8 kD) vollständig mit dem aus der PAGE-Analyse (22,l> kD) überein (Saadat u.a., siehe oben). So weist die Aminosäuresequenz von CNTF die Merkmale eines zytosolischen Proteins auf, d.h. kein Signalpeptid, keine Consensus-Sequenzen für Glycosylierung und nur einen Zysteinrest in Position 17. Ein Vergleich der bestimmten CNTF-Sequenz mit denjenigen der FIR- und EMBL-Datenbanken zeigte keine signifikanten Ähnlichkeiten mit irgendeinem anderen bekannten. Protein. Insbesondere bestand keine Homologie mit dem Nervenwachstumsfaktor (NGF), dem aus Hirngewebe gewonnenen neurotrophen Faktor (BDNF) oder dem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) und Purpurin, die jeweils mit Überlebensaktivitäten ähnlich denjenigen von CNTF verbunden sind (Unsicker u.a., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 5459-5463; Schubert u.a., 1986, J. Cell Biol. 102: 2295-2301).

6.2.3. Expression von rekombinantem CNTF

Die Wahrscheinlichkeit, daß CNTF ein zytoplasmatisches Protein ist, wurde durch die Beobachtung unterstützt, daß die Expression eines cDNA-Klons von voller Länge in HeLa-Zellen aktiven CNTF ergab, der exprimiert, jedoch nicht in das Kulturmedium freigesetzt wurde (Abb. 3) . Es hat somit den Anschein, daß CNTF ein Molekül ähnlich dem FGF und Interleucin-1 (IL-I) ist, die starke Wirkungen aui Zellen ausüben, jedoch zytosolische Proteine sind. Für FGF ist kein Freisetzungsmechanismus festgestellt worden (Abraham u.a., 1986, Science 233: 545-548). Im Gegensatz dazu ist gezeigt worden, daß IL-I aus stimulierten Makrophagen durch einen unkonventionellen Mechanismus nach der Aufspaltung durch ein spezifisches Enzym (Convertase) (Kostura u.a., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 86. 5227-5231) freigesetzt wird. Von besonderem Interesse ist die neuere Feststellung, daß Makromoleküle aus dem Hefe-Zytosol durch Träger exportiert werden können, die strukturelle Homologien mit dem multiplen Medikament'inresistenz-Glycoprotein in Säugetierzellen aufweisen (McGrath und Varshasky, 1989, Nature 340: 400-404) . Ob dieses Glycoprotein auch als Proteinträger in Säugetierzellen

wirken kann, bleibt noch festzustellen

6.2.4. Northern blot-Analyse

Die Northern blot-Analyse (Abb. 4) der Verteilung von CNTF-mRNA in Geweben erwachsener Ratten ergab eine Einzelbande von etwa 1,2 kb Größe. Das bei weitem stärkste Signal trat in Northern blots des Hüftnervs auf, und eine schwache Bande wurde bei Extrakten des Rückenmarks gefunden. Bei der mRNA von Muskel und Haut ergab sich jedoch kein nachweisbares Signal, d.h. < 2 pg CNTF-mRNA in 50 jug der gesamten RNA. Die niedrigen Werte von CNTF-mRNA in Muskel und Haut zeigen, daß die im Hüftnerv vorhandene große CNTF-Menge keinen von der Peripherie zurücktransportierten CNTF darstellt, wie dies bei NGF der Fall ist, sondern daß es sich um lokal synthetisierten CNTF handelt.

Darüberhinaus unterscheidet sich der zeitliche Ablauf der Entwicklung der CNTF-mRNA-Expression vom Entwicklungsverlauf von NGF (Thoenen u.a., 1987, Biochem. Pharmacol. 109? 1^5-178). CNTF-mRNA war in Hüftnerven neugeborener Ratten nicht nachweisbar und trat erst um den Tag 4 herum in Erscheinung (Abb. 4(b)). Der zeitliche Entwicklungsverlauf der CNTF-mRNA-Expression läßt darauf schließen, daß CNTF nicht ari der Regulierung des Überlebens der Neuronen in der Perinatalperiode beteiligt ist, da der zielregulierte Neuronenzelltod zu dem Zeitpunkt, an dem die Steigerung der CNTF-Synthese beginnt, bereits eingetreten ist (Oppenheim, 1986, J. Comp. Neurol. 246: 281-236; Johnson u.a., 1980, Science 210: 916-918).

6.3. Diskussion

Die oben beschriebenen Methoden zur Reinigung von CNTF bieten zum ersten Mal ein Mittel zur Produktion eines für die Aminosäuren-Sequenzierung geeigneten CNTF. Wenn der letzte Reinigungsschritt auf der Bakerbond Gold C4 Widepore-Säule fehlte,enthielt das CNTF-Präparat eine Anzahl von verunreinigenden Peptiden, wie in Abb. 2(a) gezeigt. Nach der Reinigung auf der Bakerbond Gold C4 Widepore FPLC/HPLC-Säule wurde jedoch bei der 2D-Gelelektrophorese nur ein einziger ^pot (Fleck) festgestellt (Abb. 2(b)), was auf eine weitgehend vollständige Reinigung hindeutet. Es sollte hier angemerkt werden, daß eine Reihe

von HPLC-Säulen ohne Erfolg für die Reinigung von CNTF eingesetzt wurden, bis die Wirksamkeit der Bakerbond Gold C4 Widepore-Säule festgestellt wurde. Es wird vermutet, daß die Reaktionsträgheit der Vergoldung die Reinigung von CNTF erleichtert.

Obwohl die CNTF-Aktivität ursprünglich als ein Überlebensfaktor für Küken-Ziliarneuronen in vitro charakterisiert wurde (Adler u.a., 1979, Science 204: 1434-1536), ist in letzter Zeit nachgewiesen worden, daß als CNTF beschriebene Aktivitäten, die entweder aus Küken- oder aus Rattengewebe gewonnen wurden, das Überleben einer Vielzahl anderer Neuronenzelltypen fördern (Barbin u.a., 1984, J. Neurochem. 43: 1466-1478;Manthorpe u.a., 1986, Brain Res. 367: 282-286), und es ist gezeigt worden, daß CNTF aus dem Rattenhüftnerv die Differenzierung sympathischer E7-Küken-Neuronen durch Blockierung ihrer Replikation und durch Auslösung von Immunoreaktivität gegen vasointestinales Peptid (VIP) sowie von Cholinacety!transferase (ChAT)-Aktivität (Ernsberger u.a., 1989, Neuron 2: 1275-1284) fördert; das Gleiche gilt für sympathische Kettenganglion-Neuronen neugeborener Ratten (Saadat u.a., 1989, J. Cell Biol. 108: 1807-1816). Außerdem förderte gereinigter CNTF aus dem Rattenhüftnerv die Differenzierung bipotentialer 02A-Vorläuferzellen für Astrozyten vom Typ 2 (Hughes, 1988, Nature 335: 70-73) in vitro. Um besser feststellen zu können, welche von diesen Funktionen, wenn überhaupt, von CNTF in vivo ausgeübt werden, muß man seine Primärstruktur, seine zelluläre Expression, Entwicklungsregulierung und Lokalisierung ermitteln. Die aus cDNA abgeleitete Aminosäureseguenz und die nachfolgende Expression von cDNA-Klonen von voller Länge in HeLa-Zellen zeigt nun, daß CNTF ein zytosolisches Protein ist. Dies sowie seine Bereichsverteilung und seine Expression im Entwicklungsablauf lassen darauf schließen, daß CNTF möglicherweise kein zielabgeleiteter neurotropher Faktor ist. So weist der CNTF anscheinend erst dann neurotrophe und Differenzierungseigenschaften auf, nachdem er durch Zellverletzung oder durch einen oder mehrere bisher unbekannte Freisetzungsmechanismen verfügbar geworden ist.

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß CNTf sich von den bekannten neurotrophen Faktoren NGF und BDNF durch das Fehlen

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eines bekannten konstitutiven Freisetzungsmechanismus, durch den zeitlichen Ablauf seiner Expression während der Entwicklung und durch seine Bereichsverteilung unterscheidet. Es kann sein, daß CNTF eine physiologische Rolle als Differenzierungsfaktor spielt und daß seine neurotrophen Funktionen möglicherweise nur unter pathophysiologischen Bedingungen und nicht während der embryonalen Entwicklung ausgeübt werden.

7. Beispiel: Expression von CNTF in Escherichia coil7.1. Materialien und Methoden 7.1.1. Konstruktion eines CNTF-Expressionsvektors

Das Ratten-CNTF-(rCNTF-) Gen wurde in den Expressionsvektor pCP93 inseriert, wobei ein synthetischer Oligodesoxyribonukleotid-Starter verwendet wurde, der komplementär zu der das 5'-Ende des Gens aufspannenden Sequenz war, sowie ein zweiter Starter, der komplementär zu der Sequenz war, die das З'-Ende des Gens am gegenüberliegenden DNA-Strang aufspannte. Beide Starter waren so konstruiert, daß sie die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym BspMI enthielten, und ihre Sequenzen sind im folgenden dargestellt.

5' CAGTTACCTGCGGGGATGGCTTTCGCAGAGCAAACAC 3'

5' CAGAGGTATGAGCAGGTGGCTACATCTGCTTATCTTTGG 3'

Diese Starter produzierten in einer Standard-Polymerasekettenreaktion (PCR) mit pCMV-rCNTF-C-I DNA als Matrize und einem kommerziellen Reagenziensatz einige wenige Mikrogramm eines 637 bp-Fragments, des durch Elektrophorese an einem 6%-Polyacrylamidgel mit anschließender Elektroelution gereinigt wurde. Das eluierte Fragment wurde dann mit BspMI aufgeschlossen und das entstandene 619 bp - Fragment wurde erneut nach dem gleichen Vorfahren gereinigt. Nach dem Abstumpfen der hervorstehenden BspMI-Enden in einer Standardreaktion unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase wurde das Fragment in die einzige Sall-Restriktionsstelle des pCP93-Vektors ligiert. die durch Behandlung mit Sl-Nuklease in einer Standardreaktion abgestumpft worden war.

7.1.2. Identifikation von Bakterien, die den CNTF-Expressionsvektor enthalten

Mit dieser ligierten DNA wurden kompetente E. coli W3110i4F-Zellen transformiert und nach der Plasmidgröße klassiert und anschließend durch Restriktionsanalyse und DNA-Seguenzierung unter Anv/endung von Standardmethoden charakterisiert (Panayotatos, N., 1987, in Plasmids: A Practical Approach (Plasmide: Eine praktisches Einführung ), Hardy, K.G., Hrsg., IRL Press, Oxford).

7.2.Ergebnisse und Diskussion

Es wurde festgestellt, daß eines der Plasmide (pCP-rCNTF-C-1) das vollständige rCNTF-Gen trägt, das in der richtigen Orientierung und im translatorischen Leseraster mit dem Ribosomen-Bindungssignal des Vektors fusioniert ist. Die Kopienzahl dieses Plasmids war aufgrund der Deletion von 1400 bp der Vektor-DNA dreimal höher als die parentale.

E. coli WSIlOi^F-ZrCNTF-C-I - Zellen wurden in Flüssigkultur in Gegenwart von Laktose gehalten (so daß eine aktive Transkription und Translation durch das rCNTF-Gen erfolgten), und es wurde festgestellt, daß die Zellen signifikante Mengen (2-5% des gesamten zellulären Proteins) biologisch aktiven rCNTF enthielten. Dies wurde durch Elektrophorese an 8-25% Gradient-Polyacrylamidgelen und anschließende Coomassie-Färbung nachgewiesen, wie in Abb. 4 dargestellt. Außerdem wurden Proteinextrakte aus den gleichen Zellen gewonnen, die durch Behandlung mit Lysozym, gefolgt von drei Gefrier- und Auftauzyklen, lysiert wurden. Es wurde festgestellt, daß das Protein, das nach diesem Verfahren aus einigen Mikroliterri Kultur extrahiert wurde, das Überleben und den Neuritenauswuchs von bis zu 50% ElO Ratten-Ziliargang-1 ionneuronen und von ca. 30% E8 Spina lgang 1 ionneuronen nach 24 und 28 Stunden in vitro förderte. Die maximale Aktivität wurde bei weniger als 1 Nanogramm rCNTF beobachtet. In Kontrollextraktsn aus den gleichen Wirtszellen, die den" Plasmidvektor ohne das rCNTF-Gen trugen, konnte keine derartige Aktivität nachgewiesen werden.

Eine Human-CNTF-Sequenz, der die Intron-Sequenzen entzogen worden waren, wurde in den pCP93-Vektor inseriert und zur Transformation von kompetenten E. coli verwendet. Es wurde festgestellt, daß transformierte Bakterien, die rekombinante Human-CNTF-Sequenzen enthalten, ein Protein von passendem Molekulargewicht für Human-CNTF exprimieren; Proteinextrakte dieser Kulturen zeigten eine CNTF-Aktivität im DRG-Test.

8. Beispiel: Klonieren des Human-CNTF-Gens8.1. Materialien und Methoden

8.1.1. DNA, Plasmid und Phaqenvektoren

Humangenom-DNA wurde aus plazentaler Human-DNA (Clontech) gewonnen. Der pBLUESCRIPT-Plasmidvektor wurde von der Firma Stratagene bezogen. Der Bakteriophagenvektor EMBL-3 SP6/T7 wurde von Clontech bezogen.

8.1.2. Polvmerasekettenreaktion

Die PCR wurde unter den vom Herstellar eines Reagenziensatzes (Perkins-Elmer/Cetus) empfohlenen Standardbedingungen über 40 Zyklen ausgeführt, wobei jeder Zyklus aus einer Inkubation von 1 Minute bei 94°C, 2 Minuten bei 4O⁰C bzw. 5O⁰C und 2 Minuten bei 72⁰C bestand.

8.2. Ergebnisse und Diskussion

8.2.1. Beweise für die Existenz eines ^ ^an-CNTF-Gens

Die Southern blot-Kybridisierung einer mit EcoRI-Restriktionsendonuklease aufgeschlossenen genomischen Human-DNA unter harten Bedingungen zeigte, daß ein einzelnes DNA-Fragment von annähernd 10 kb eine schwache Homologie mit einer Ratten-CNTF-Sonde aufwies (Abb. 6, Feld b) . Um das mutmaßliche Human-CNTF-Gen molekular zu klonieren, wurde versucht, Segmente eines solchen Gens durch Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren, wobei Paare von Oligonukleotid-St^rtern verwendet wurden,

die exakten Sequenzen des Ratten-CNTF-Gens entsprachen. Für_den Erfolg dieses Versuchs war es erforderlich, daß zwei kurze Segmente der Ratten- und Human-CNTF-Gene in der DNA-Sequenz identisch oder nahezu identisch waren.

Fünf Oligonukleotid-Paare mit Längen von jeweils 17 bis 21 Basen wurden auf die Fähigkeit zum Starten der amplifizierten Synthese von DNA-Fragmenten mittels PCR unter Verwendung der gesamten genomischen Human-DNA als Matrize getestet. Alle fünf Oligonukleotid-Paare wurden aus dem Inneren des zweiten Exons des Ratten-CNTF-Gens ausgewählt. Es wurde angenommen, daß ein Human-CNTF-Gen eine dem Rattengen ähnliche Intron-Exon-Struktur haben würde. Nur ein Starterpaar, mit der Bezeichnung CNTF.10 und CNTF.11, ergab Amplifikation eines DNA-Fragments aus genomischer Human-DNA von annähernd der gleichen Größe, wie man sie mit den gleichen Startern unter Verwendung einer Ratten-DNA-Matrize (270 bp) erhalten würde. Ein höherer Amplifikationsgrad und ein geringerer Untergrund wurden beobachtet, wenn die PCR mit einer bei der höheren (härteren) Temperatur (50⁰C) auftretenden DNA-Synthese durchgeführt wurde. Die Sequenzen von CNTF.10 und CNTF.11 sind die folgenden:

CNTF.10 (36-mer, antisense für die Aminosäuren EADGMPA; je zwei Basen für die terminalen Aminosäuren; Schwanz mit multiplen Klonierungsstellen).

5'-CCAAGCTTCTAGAATTCGCAGGCATCCCATCAGCCT -3'

CNTF.11 (34-mer, sense für die Aminosäuren EMTEAE; 2 Basen für die terminale Aminosäure, finales A; multiple Klonierungsstelle am 5'-Ende des Oligonukleotids).

5'-GACTCGAGTCGACATCGGAGATGACTGAGGCAGA-3'

(Die dem Ratten-CNTF entsprechenden Sequenzen sind unterstrichen, und es wurden zusätzliche Nukleotide hinzugefügt, um multiple Klonierungsstellen für die anschließenden Klonierungsschritte zu erhalten).

Die Produkte der PCR-Reaktion wurden durch Elektrophorese an einem 2% Agarosegel (niedrige Schmelztemperatur; NuSieve) getrennt. Die positive Bande von annähernd 270 bp wurde ausge-

schnitten und nochmals unter Verwendung des gleichen Starterpaars durch PCR über 35 Zyklen amplifiziert (30 s bei 93⁰C, 1 Minute bei 5O⁰C, 1 Minute bei 72°C). Das reamplifizierte DNA-Fragment wurde wiederum durch Elektrophorese an 2% Agarose gereinigt und als Matrize zur DNA-Sequenzierung nach der Didesoxynukleotidketten-Methode eingesetzt, wobei ein handelsüblicher Reagenziensatz (der "FASTaq"-Satz von IBI) verwendet wurde. Starter für die Sequenzierung waren CNTF.10 und CNTF.11 sowie zwei interne Starter, die anhand der ursprünglichen, mit den terminalen Startern gewonnenen Sequenzdaten ausgewählt wurden. Die vollständige Sequenz des amplifizierten Segments der Human-DNA ist in Abb. 6 dargestellt. Die Sequenz bestand aus einem offenen Leseraster für ein Segment eines Polypeptids, das der. Ratten-CNTF sehr ähnlich, jedoch nicht mit ihm identisch war.

8.2.2. Klonierung eines Fragments des durch PCR amplifizierten Human-CNTF-Gens

Das amplifizierte Human-CNTF-Genfragment wurde in den pBLUESCRIPT-Plasmidvektor kloniert, indem es mit EcoRI und Xhol ausgeschnitten und mit den gleichen beiden Enzymen an die Vektor-DNA ligiert wurde. Die DNA wurde in kompetente Zellen des E. coli-Stamms XLl-Blue (Stratagene) eingeführt und die Transformanten wurden nach Ampicillinresistenz selektiert. Die Plasmid-DNA wurde nach Standardverfahren gereinigt, das inserierte Human-DNA-Fragment wurde mit EcoRI und Xhol ausgeschnitten, isoliert und für den Einsatz als Hybridisierungssonde markiert. Die Markierung erfolgte mittels PCR mit ca. 20 ng DNA als Matrize und den Oligonukleotiden CNTF.10 und CNTF.11 als Startern, in einer Reaktionsmischung, die Taq DNA - (Perkin-Elmer/Cetus), dATP, dGTP, dTTP und ³²P-dCTP enthielt; dabei wurde die PCR über 6 Zyklen von 1 Minute bei 94⁰C, 2 Minuten bei 50⁰C und 3 Minuten bei 72⁰C durchgeführt. Das markierte Fragment wurde mittels chromatographischer Standardverfahren von der nicht eingebauten dCTP getrennt.

Um festzustellen, ob das mit einer Ratten-CNTF-Sonde in genomischer Human-DNA nachgewiesene DNA-Fragment die Sequenzen enthielt, die durch PCR mit den Startern CNTF.10 und CNTF.11

amplifiziert werden konnten, wurde das radioaktiv markierte Human-Fragment als Sonde bei der Southern blot - Hybridisierung an genomischer Human- und Ratten-DNA verwendet, die mit EcoRI aufgeschlossen wurde (Abb. 6, Feld a) . Die Sonde unterlag einer starken Hybridisierung zu einer Bande von c?.. 10 kb, die von der Bande, die schwach mit einer Ratten-CNTF-Sonde hybridisierte, ununterscheidbar war. Umgekehrt hybridisierte die Humansonde schwach zu einer Bande von ca. 4 kb in genomischer Ratten-DNA, die von der Bande, welche durch die Ratten-CNTF-Sonde stark hybridisiert wurde, ununterscheidbar war. Neben den Sequenzdaten lieferten diese Ergebnisse einen deutlichen Hinweis darauf, daß Human-DNA eine zum Ratten-CNTF-Gen homologe Verbindung enthält.

8.2.3. Klonierunq des Human-CNTF-Gens aus einer Genbibliothek

Die oben beschriebene radioaktiv markierte Human-CNTF-Sonde wurde zur Auslese aus einer Genombibliothek von Human-DNA in dem Bakteriophagenvektor EMBL-3 SP6/T7 verwendet. Die Bibliothek enthielt Fragmente von plazentaler Human-DNA, die durch partiellen Aufschluß mit Restriktionsendonuklease Sau3a gewonnen und an einer BamHl-Stelle in den Vektor inseriert wurden.Der Bakteriophage wurde auf den E. coii-Stamm LE392 ausgestrichen und es wurden etwa 750 000 Plaques mit der Sonde durch Hybridisierung doppelt gesichtet, wobei im wesentlichen die gleichen Bedingungen angewendet wurden, wie von Benton & Davis (1977, Science 196: 180-182) und Hahmoudi und Lin (MahTtoudi, M. & Lin, V.K. , 1989, BioTechniques 1: 331-333) beschrieben. Es wurde eine positive Plaque identifiziert, und der rekombinante Phage wurde durch drei Runden einer Einzelplaque-Isolierung durch Hybridisierung mit der Human-CNTF-Sonde zur Identifikation von positiven Plaques gereinigt. Der rekombinante Bakteriophage, der das Human-CNTF-Gen enthielt, wurde mit hCNTF-G-1 bezeichnet. Durch Züchtung in Flüssigkultur unter Verwendung von LE392-Bakterien als Wirt wurden Vorräte für die weitere Analyse gewonnen.

Die in /\ hCNTF-G-1 vorhandenen Human-CNTF-Sequenzen wurden durch PCR-Amplifikation und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Um zu bestätigen, daß in dem gereinigten Phagenklon das richtige Fragment enthalten war, wurde eine Amplifikation mit einem

internen Starterpaar in dem ursprünglich sequenzierten 270 bp Humanfragment angewendet (siehe oben). Die Oligonukleotide wurden mit CNTF.13und CNTF.16 bezeichnet (Sequenzen siehe unten). Erwartungsgemäß wurde in einer PCR-Reaktion mit /^hCNTF-G-I als Matrize und mit diesen Startern eine Produktbande von ca. 128 bp amplifiziert. Die PCR wurde wie oben durchgeführt, jedoch mit 35 Inkubationszyklen von jeweils 1 Minute bei 94⁰C, 2 Minuten bei 50⁰C und 2 Minuten bei 72⁰C.

CNTF.13: 5'-GCAGCGACTTGGAGAAg-S' (antisense) CNTF.16: 5'-TACCTTCCATGTTTTGTTGg-S' (sense)

Dieser Starter enthielt außerdem einen 5'-"Schwanz", der Sequenzen für eine multiple Klonierungsstelln enthielt - hier ist nur der CNTF-Teil der Sequenz dargestellt).

Um festzustellen, ob der /^hCNTF-G-1-Κΐυη die 5'- und 3'-Enden der CNTF-Kodierungssequenz enthielt, wurden PCR-Reaktionen unter Verwendung exakter (d.h. nicht degenerierter) Sequenzstarter durchgeführt, die den Enden der Ratten-CNTF-Kodierungssequenz entsprachen. Hier ist zu beachten, daß die Fähigkeit zur Amplifikation von DNA aus dem genomischen Humanklon auf das Vorhandensein des entsprechenden Bereichs des Humangens hinweisen würde, während das Ausbleiben einer Amplifikation der DNA daraus resultieren könnte, daß entweder das Ende der Kodierungssequenz im Klon fehlt oder die Ratten- und die Humansequenz voneinander abweichen.

Die Starter, die zur Prüfung des Vorhandenseins des wahrscheinlichen 5'-Endes der Human-CNTF-Kodierungssiaquenz verwendet wurden, waren CNTF.13 (siehe oben) und CNTF.14. Das letztere Oligonukleotid enthielt 22 Basen, die dem 5'-Ende der Kodierungssequenz von Ratten-CNTF (sense-Strang) entsprachen, und besaß auch zusätzliche Sequenzen am 5'-Ende (nicht dargestellt), die in keiner Beziehung hierzu standen und Erkennungsstellen für multiple Restrxktionsendonuklease enthielten, um die mögliche Klonierung amplifizierter Fragmente zu erleichtern.

CNTF.14 5'-ATGGCTTTCGCAGAGCAAACAC-S' Mit dem Oligonukleotid-Paar CNTF.13 und CNTF.14 wurde ein Frag-

ment von ca. 1,4 kb aus der /jhCNTF-G-1-Matrize amplifiziert. Dies ist die Größe, die zu erwarten wäre, wenn das Human-CNTF-Gen ein Intron von etwa der gleichen Größe (ca.l kb) enthielte, wie es im Ratten-CNTF-Gen gefunden wurde.

Ein ähnlicher Versuch zur Amplifikation eines Bereichs zwischen einer bekannten internen Sequenz des Human-CNTF-Gens und des 3'-Endes der Kodierungssequenz war nicht erfolgreich. Die Starter waren CNTF. 16 (siehe eben) \xr\C CNTF. 15, der die Sequenz des 3'-Endes der Rattenkodierungssequenz (antisense) enthält:

CNTF.15 5'-CTACATCTGCTTATCTTTGG-S'

Die Sequenzanalyse wurde an Teilen des klonierten Human-CNTF-Gens durchgeführt und bestätigte die Ähnlichkeit mit dem Ratten-CNTF-Gen, zeigte aber eine Anzahl von Aminosäure-Substitutionen in dem kodierten Protein. Die Ergebnisse der DNA-Sequenzanalyse innerhalb des Human-CNTF-Kodierungsbereichs sowie Vergleiche mit der Rattensequenz sind in Abb. 8 dargestellt. Die Daten stehen im Einklang mit dem Humangen mit einem einzelnen Intron in der gleichen Position wie beim Ratten-CNTF-Gen; auf einem langen Stück, das die Intron-Exon-Verbindungsstellen umfaßt, sind die Aminosäuresequenzen identisch (ESYVKHQGLNKN). Innerhalb des Introns ergab sich eine beträchtliche Abweichung der Humansequenzen von denen der Ratte, im deutlichen Gegensatz zu. der weitgehenden Erhaltung des Kodierungsbereichs. Es gibt eine Strecke, auf der 5 von 6 Aminosäuren von Human- und Ratten-CNTF voneinander abweichen (Mensch: HVLLAR; Ratte: QGMLTK), und zwei weitere, wo 3 von 4 Aminosäuren unterschiedlich sind (Mensch: TEHS; Ratte: AEQT, Positionen 4 bis 7; und Mensch: NNKK; Ratte: KDKQ in den Positionen 196 bis 199; Abb 8(b)).

9. Beispiel: Nutzen der aus CNTF-gewonnenen Peptidfragmente

9.1. Materialien und Methoden 9.1.1. Synthese von Peptiden

Auf einem Festphasen-Peptidsynthesegerät wurden unter Anwendung chemischer f-moc-Verfahren Peptide synthetisiert.

9.1.2. Zellkultur

Kükenembryo-Ziliarganglionkulturen wurden angelegt und nach dem in Hughes u.a.( 1988, Nature 335: 70-73) beschriebenen Verfahren gehalten.

9.1.3. Immunisierungsprotokoll

Antikörper gegen das CNTF-Peptid mit 14 Aminosäuren (SALESHYGAKDKQ) wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit dem zu KLH (Hämozyanin der Schlüsselloch-Napfschmicke) konjugiertem Peptid entwickelt. Um die Kopplung an KLH zu ermöglichen, wurde das 14-Aminosäuren-Peptid C-terminal mit einem Cys-Rest erweitert. Die Kopplung von KLH und dem Peptid wurde durch Verwendung eines 100-fachen Überschusses an Peptid sowie von HBS (m-Maleimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimidylester) als Kopplungsmittel erreicht.

Ein Kaninchen wurde mit 1 mg Konjugat (Peptid-KLH) in vollständigem Freundschem Adjuvans nachgeimpft. Nach drei Wochen wurde das Kaninchen nochmals mit 1 mg Konjugat in unvollständigem Freundschem Adjuvans nachgeimpft. Zwei Wochen später wurde das Tier erneut nachgeimpft. Wiederum zwei Wochen später wurde dem Tier Blut entnommen und Serum gewonnen. Es wurde festgestellt, daß dieses Serum sowohl das Immunogen als auch gereinigten Rattenhüftnerv-CNTF durch Immunpräzipitation ausfällte.

9.2. Ergebnisse und Diskussion

9.2.1. Fähigkeit von Antikörpern gegen ein synthetisches Peptid zur Neutralisierung der CNTF-Aktivität

Sättigungsmengen von CNTF wurden mit an Protein-A-Sepharose gebundenen Antikörpern inkubiert, die aus Präimmunserum bzw. Immunserum eines Kaninchens gewonnen wurden, das mit dem synthetischen 14-Aminosäuren-Peptid (ISALESH Y GAKDK Q) immunisiert worden war. Nach Inkubation und Zentrifugation wurden die Überstände auf ihre Fähigkeit zur Wachstumsförderung von E8-Küken-Ziliarganglionneuronen getestet. Bei den Kontroll-Überständen ist eine normale CNTF-Dosiswirkung zu beobachten. Nach Immunpräzipitation mit Anti-CNTF-Peptidfragment-Antikörpern wurde praktisch keine CNTF-Aktivität nachgewiesen (Abb. 9).

9.2.2. Neurotrophe Aktivität eines synthetischen CNTF-Peptidfragments

ES-Kükenembryo-Ziliarganglionneuronen wurden zwei Tage lang in Gegenwart verschiedener Konzentrationen eines synthetischen Peptidfragments mit 28 Aminosäuren kultiviert, das aus primären CNTF-Sequenzdaten abgeleitet wurde, und die Überlebensrate der Neuronen wurde ermittelt. Zwischen dor Peptidkonzentration und der neurotrophen Aktivität wurde eine Dosis-Wirkungs-Beziehung beobachtet (Abb. 10). Die verwendete Peptidsequenz war M V L L IS QKIPENEADGMPATVGDGGLFEK.

9.2.3. Fähigkeit von Antikörpern gegen ein synthetisches Peptid zur Identifikation von CNTF-haltigen Zellen

Antikörper gegen das 28-Aminosäuren-Peptid wurden in Immunfluoreszenzuntersuchungen von Rattenhüftnervgewebe verwendet. Kaninchen-Antikörper gegen das 28-Aminosäuren-Peptid wurden mit fixierten Schnitten des Rattenhüftnervs inkubiert und danach wurden die Nervenschnitte mit Rhodamin zur Reaktion gebracht, das mit Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern markiert war. Wie in Abb. 11 dargestellt, wurde eine periaxonale Färbung beobachtet, was darauf schließen läßt, daß u.U. CNTF von Schwannschen Zellen synthetisiert wird.

Außerdem wurden in dem axonalen Zytoplasma vorhandene Strukturen sichtbar gemacht (Abb. 11, kleiner Pfeil), die entweder mit einer axonalen Synthese oder mit dem Transport von CNTF in Axone vereinbar wären. Die Markierung konnte durch Zugabe eines Überschusses von CNTF-Peptid blockiert werden (M VLLEQKIP ENEADGMPATVGDGGLFE K).

10. Beispiel: Ziliarer neurotropher Faktor fördert das Überleben

von Rückenmarksneuronen

10.1. Materialien und Methoden 10.1.1. Versuchstiere

Für alle Experimente wurden Sprague-Dawley-Ratten (HSU)

verwendet. Trächtige Ratten wurden durch Ersticken in Kohlendioxid getötet und die Embryonen wurden schnell entnommen und zur weiteren Dissektion in eisgekühlte Pucksche Salzlösung G gelegt.

10.1.2. Gewebekulturverfahren

Aus den am 14. Trächtigkeitstag entnommenen Rattenembryonen wurde das Rückenmark unter aseptischen Bedingungen entfernt. Das Rückenmark wurde caudal zur Medulla oblongata durchtrennt und von sensorischen Ganglien und Meninges befreit. Dann wurde das Rückenmark für separate Kulturen in ventrale und mediodorsale Segmente unterteilt. Die Rückenmarksgewebe wurden in kleine Stücke zerschnitten, durch Zerreiben mechanisch getrennt und durch eine Pasteur-Pipette in definiertes Kulturmedium verteilt, das aus 50% Eagle-Grundmedium (BME; Gibco) und 50% Hamscher Nährmischung F12 (Gibco) bestand, ergänzt durch Glucose (33 mM) , Glutamin (2 mM, NaHCO₃)(IS mM) , HEPES (10 mM) , Insulin (25 дд/ml), Transferrin (100 дд/ml), Putrescin (60 дМ) , Progesteron (20 nM) , Na-Selenit (30 nM) , Penicillin G (0,5 дд/ml), Streptomycin (0,5 дд/ml) und Rinderserum-Albumin (2,5 дд/ml). Das Verreiben wurde zweimal wiederholt und dia Überstände wurden gemischt und durch ein Nylonfilter (Nitex, Tetko) (40 дт) passiert. Die Gesamt-Zellausbeute wurde durch Zählung im Hämozytometer in Gegenwart von Trypanblau bestimmt. Dissoziierte ventrale Zellen wurden dann mit einer Dichte von 0,5 Millionen Zellen pro Schale auf 35 mm-Schalen ausgestrichen, die mit Poly-D-lysin (10 дд/ml), Poly-L-ornithin (10 дд/ml) oder Poly-L-ornithin mit Laminin (5 дд/ml) überzogen waren. Während des Ausstreichens wurden diese Kulturen zusätzlich behandelt. Die Kulturen wurden bei 37⁰C in einer Atmosphäre aus 95% Luft/5% CO₂ bei nahezu 100% relativer Luftfeuchte gehalten. Das Kulturmedium wurde alle drei bis vier Tage gewechselt. Nach einer Woche enthielten diese Kulturen hauptsächlich Neuronen (angefärbt mit dem monoklonalen Neurofilament-Antikörper RT97; Wood und Anderton, 1981, Biosci. Rep. 1: 263-268) mit nur wenigen Astrozyten (angefärbt mit Antikörpern gagen fibrilläres saures Gliaprotein (?) ; Bignami und Dahl, 1973, Brain Res. 49: 393-402), nachgewiesen mittels lmmunozytochemischer Verfahren.

10.2. Ergebnisse und Diskussion

10.2.1. Effekte des ziliaren neurotrophen Faktors (CNTF) auf mediodorsale (MD) Rückenmarksneuronen

Mediodorsale (MD) Neuronenkulturen überlebten nicht im definierten Medium nach den ersten 48-72 Stunden. Die Zellen begannen Klumpen zu bilden und lösten sich schließlich vom Substrat ab. Nach einer Behandlung mit CNTF (20 ng rekombinanter Ratten-CNTF in 2 μΐ E. coli-Extrakt pro ml Kultur) während des Ausstreichens zeigten die MD-Neuronen jedoch eine um 48' Stunden verlängerte Überlebensdauer; sie hafteten gut am Substrat und zeigten Neuritenauswuchs (Abb.12). Der Unterschied resultierte wahrscheinlich nicht aus dem Haftungsgrad der Zellen, da die Zellen sowohl bei den Kontroll- als auch bei den CNTF-behandelten Kulturen drei Stunden nach dem Ausstreichen gut hafteten. Weiterhin führte die Verwendung unterschiedlicher Substrate zu ähnlichen Ergebnissen. Somit läßt sich annehmen, daß CNTF in der Lage war, die Überlebensdauer der MD-Neuronen in diesen Kulturen zu verlängern. Der Proteinwert wurde gleichfalls bestimmt. CNTF-behandelte Kulturen enthielten б mal mehr Protein pro Schale als unbehandelte Kontrollkulturen und NGF-behandelte (50 ng/ml) Kulturen (Tabelle I) . Da die Kulturen in erster Linie Neuronen enthielten, läßt die Zunahme der Proteinwerte ebenfalls auf eine Zunahme der Überlebensdauer der Neuronen schließen.

10.2.2. Effekte von CNTF auf ventrale Rückenmarksneuronen

Kulturen des ventralen Rückenmarksabschnitts sind mit somatischen Motorneuronen angereichert, wie in Arbeiten über embryonale Küken-Motorneuronen exakt dokumentiert wurde (Dohrman u.a., 1986, Dev. Biol. 118: 209-221; siehe auch Beispiel 18 weiter unten), und wie in der vorliegenden Untersuchung embryonaler Ratten-Motorneuronen durch immunozytochemische Verfahren unter Verwendung von Cholinacetyltransferase (CAT)-Antikörper bestätigt wurde. Im definierten Medium überlebten ventrale Neuronen recht gut, verschlechterten sich aber schließlich nach einer Woche, wahrscheinlich aufgrund des Mangels an Faktoren, die von Gliazellen abgesondert werden (da diese Kulturen relativ v/enig Glia enthielten). In Gegenwart von CNTF (2 μΐ/ml) überlebten ventrale Neuronen länger als eine Woche bei geringem Anstieg der

Protein- und CAT-Enzymwerte im Vergleich zur Kontrolle (Tabelle II).

Tabelle I

'Mediodorsale Neuronen waren zum Zeitpunkt des Ausstreichens mit CNTF (2д1/т1) bzw. NGF (50 ng/ml) behandelt oder unbehandelt. Am Tag 7 wurden die Kulturen für Proteinmessungen nach der Bradfordschen Methode (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72:248-254) geerntet.

Kontrolle

CNTF

NGF

Protein/Schale

20

120

Tabelle II

Ventrale Neuronen waren zum Zeitpunkt '!!es Ausstreichens mit CNTF (2д1/т1) bzw. NGF (50 ng/ml) behandelt oder unbehandelt. Am Tag 7 wurden die Kulturen zur Bestimmung des CAT-Enzym-Wertr, (Hartika und Hefti, 1988, vT. Nurosci. 8:2967-2985) und zu Protoinmessungen geerntet.

Protain ßq,'Schale

CAT-Aktivität CPP./Schale

Kontrolle

CNTF

33 45 38

590 ± 26,52 959,5 ± 24,32 621,25 ± 33,59

' CPM = Zählimpulse pro Minute

11. Gereinigter CNTF aus dem Rattenhüftnerv verhütet läsionsinduzierten Zelltod von Motorneuronen im Gesichtsnerv (VII. Hirnnerv) der neugeborenen Ratte

11.1. Materialien und Methoden

Die Gesichtsnerven neugeborener Ratten wurden unilateral durchtrennt und an den Läsionsstellen wurden kleine Gelschaumimplantate eingesetzt, die entweder 5 ßq Rinderserumalbumin oder ßq CNTF enthielten. Eine Gruppe verletzter Tiere, die keine Gelschaumimplantate erhielten, wurde als Kontrolle verwendet. Nach einer Woche wurden die Tiere getötet und es wurden Schnitte ihres Hirnstamms präpariert, die einen Fazialiskern auf der gleichen Seite wie der des verletzten Nervs (ipsilateral zur Läsion) sowie einen Fazialiskern auf der zur Läsion entgegengesetzten Seite (kontralateral zur Läsion) enthielten. Der

kontralaterale Fazialiskern diente als interne Kontrolle. Die Fazialiskern-Schnitte wurden entweder nach der Nisslschen Methode (zur Färbung von Motorneuronen) oder mit einem Antikörper gegen saures fibrilläres Gliaprotein (zum Nachweis der Reaktion von Gliazellen auf die Verletzung) gefärbt.

11.2. Ergebnisse und Diskussion

Wie in den Abbildungen 13A und B gezeigt, führten die Läsion des Gesichtsnervs und das Einsetzen eines RSA-haltigen Gelschaumimplantats zu einer Abnahme der Motorneuronenzahl; ferner erschienen die verbleibenden Neuronen verdichtet und geschrumpft. Jedoch waren die Läsion des Gesichtsnervs und das Einsetzen eines CNTF-haltigen Implantats offenbar mit einer wesentlich höheren Überlebensrate der Motorneuronen verbunden (Abb. 14A und B); die Motorneuronen in Abb. 14A sahen den gesunden Motorneuronen auf der unverletzten Seite (Abb. 14B) ähnlicher als die geschrumpften, degenerierenden Motorneuronen von Abb. 13A. Weiterhin wurd<? beobachtet, daß die Wirkung von CNTF, statt auf die Glioseprävention, weitgehend auf die Förderung der Überlebensfähigkeit der Motorneuronen gerichtet war; bei RSA-behandelten und CNTF-behandelten Ratten wurde in den zur Nervenläsion ipsilateralen Fazialiskernen ein vergleichbares Ausmaß der Gliose festgestellt (Abb. 13C und 14C).

Die Zahl der Motorneuronen in Fazialiskernen unbehandelter, RSA-behandelter und CNTF-behandelter Ratten wurde ermittelt; die Daten sind in Tabelle III angegeben.

Bei verletzten Tieren, die unbehandelt oder mit Gelschaum + BSA behandelt waren, wurde ipsilateral zur Läsion ein Vorlust von 90% der Motorneuronen beobachtet. Bei Tieren, die mit einem CNTF-imprägnierten Gelschaumimplantat bebandelt waren, erreichte der Motorneuronenpool ipsilateral zur Läsion 70% des normalen Umfangs (ca. 30% Verlust).

Schließlich wurde festgestellt, daß nach Läsion des Gesichtsnervs neugeborener Ratten 90% der Motorneuronen des Fazialiskerns innerhalb einer Woche degenerieren. Die Applikation von CNTF auf den abgeschnittenen Stumpf des Gesichtsnervs der neugeborenen Ratte bewirkte eine dramatische Verminderung des Zeil-

verlusts infolge Du>nhtrennung des Nervs, wie in Abb. 14A und Tabelle III dargestellt ist; es wurde festgestellt, daß CNTF mindestens 60% der Motorneuronen des Gesichtsnervs rettet, die normalerweise nach der Axotomie abgestorben wären. Damit ist gezeigt, daß CNTF ein Überlebensfaktor für Motorneuronen in vivo ist.

Tabelle III

CNTF verhindert axotomie-induzierten Zelltod von Motorneuronen des Gesichtsnervs bei neonatalen Ratten

Behandlung	Zählergebnis der Motorneuronen	(Kontrollseite)	(530)	3360
	in den Fazialiskernen	2985	3300
	Läsionsseite kontralateral		!•1.5
		(620) (3271)
KONTROLLE (kein Gelschaum)	685	3425
	330
		2990
GELSCHAUM + BSA (5 дд)	775	3490
	645	(2120) (3301)
	440
GELSCHAUM + CNTF (5 дд)	2205
	3445
	1270
	3095

12. Beispiel: Hochgradige Expression und Reinigung rekombinanter ziliarer neurotropher Faktoren von Mensch und Ratte in Escherichia coli

12.1. Materialien und Methoden 12.1.1. Bakterienstamme und Plasmide

E. coli WSllOlaclqF-, ein Stamm mit Überproduktion des Lactose-Operon-Repressors, sowie die Elternplasmid-Vektoren pCP93, pCPHO, pblko und pblkl sind in früheren Untersuchungen verwendet worden (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357-353; Panayotatos u.a., 1989, J. Biol. Chem. 264:15066-15069).

Vektoren, die für die CNTF-Expression konstruiert sind, wurden wie folgt erzeugt, und ihre Eigenschaften sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

12.1.1.1. Ratten-CNTF-Vektoren

12.1.1.1.1. pRPNll

Ein das vollständige Ratten-CNTF-Protein kodierendes DNA-Fragment von 622 bp wurde aus einem cDNA-Klon durch Polymerasekettenreaktion (PCR) gewonnen (Stockli u.a., Nature 342:920-923) . Die zur Gewinnung dieses Fragments eingesetzten synthetischen Oligodesoxyribonukleotid-Starter wurden so gestaltet, daß sie ein 5'-Ende erzeugten, welches das Alanin am aminoterminalen Ende des Proteins kodierte, und 19 bp jenseits des TAG-Terminationscodons am З'-Ende aufhörten. Der Expressionsvektor pCP93 wurde mit Sail linearisiert, das durch Behandlung mit Sl-Nuklease abgestumpft wurde, und das entstehende Fragment von 3920 bp wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. Der Vektor und die auf diese Weise präparierten PCR-Fragmente wurden ligiert und in E. coli WSllOladqF- transformiert. Die Transformanten wurden nach Größe und Restriktionskartierung für das gewünschte Plasmid klassiert (Abb. 16), und für einen positiven Kandidaten (pP.PNll) wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt, daß er das erwartete Gen in voller Länge trug, das an das Translationsstartsignal im richtigen Leseraster anfusioniert war. Jedoch wurde, wie weiter unten erörtert wird, im Vergleich zur ursprünglichen Ratten-cDNA eine einzelne Basenpaar-Mutation in dem CNTF-Gen in pRPNi1 festgestellt, die zum Einbau von Asparagin anstelle von Tyrosin in Position 193 der Proteinsequenz führte. Diese Mutation, die während der PCR-Amplifikation entstanden sein muß, wurde in alle anderen Vektoren übertragen, die das Ratten-CNTF-Gen führten.

12.1.1.1.2. PRPN12

Dieses Plasmid ist identisch mit pRPNll, mit Ausnahme einer einzelnen Basenpaar-Mutation im Kopierkontrollbereich (copl), wodurch die Kopienzahl in Wirtszellen auf annähernd das Fünffache erhöht wird. Es wurde konstruiert, indem die DNA zwischen den Orten Eagl und Pvul (in Uhrzeigerrichtung) durch die gleiche

Sequenz aus pCPllO ersetzt wurde (Panayotatos и.л., 1989, J. Biol. Chem. 264:15066-15069).

12.1.1.1.3. PRPN37

Der DNA-Bereich zwischen den beiden Asel-Restriktionsstellen, der das ß-Lactamase-Gen in pRG12 überspannt (Abb. 16) , wurde durch ein DNA-Segment ersetzt, das Resistenz gegen Kanamycin (kanR) verleiht. In diesem Vektor befindet sich das kanR-Gen unter der Transkriptionskontrolle seines nativen Promotors.

12.1.1.1.4. pRPN38

Dieses Plasmid ist identisch mit pRPN37, mit Ausnahme einer ortsspezifischen Mutation von 4 Basenpaaren, welche die Stärke den kanR-Promotors minimiert (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357-363).

12.1.1.2.Human-CNTF-Vektoren 12.1.1.2.1. PRPN32

Dieses Plasmid ist analog zu pRPNll, außer daß es anstelle des Rattengens das Humangen trägt. Zur Expression des Human-CNTF-Proteins in Bakterien war es notwendig, das Intron zu entfernen, das die proteinkodierenden Sequenzen trennt. Dies wurde bewerkstelligt, indem PCR wie folgt zur Amplifikation und Verbindung der das Intron flankierenden Bereiche angewendet wurde. Es wurden zwei Reaktionen mit je 100 ng genC.l-DNA als Matrize eingerichtet (Abb. 17): eine enthielt 1 M CNTF.23-Starter und 10 nM CNTF. 21-Starter, die andere 1 μΚ CNTF,24-Starter und 10 nM CNTF.22-Starter. Nach 10 PCR-Zyklen (jeder Zyklus bestand aus einar Inkubation von 1 Minute bei 94⁰C, 2 Minuten bei 5O⁰C, 2 Minuten bei 72⁰C) wurden die beiden Proben kombiniert und weiteren 25 Zyklen im DNA Thermal Cycler unterworfen. Da die internen Starter CNTF.21 und CNTF.22 voll komplementär zueinander sind, können die Produkte der PCR-Reaktionen der ersten Stufe später miteinander fusionieren. Weiterhin wird in der Reaktion der zweiten Stufe die Synthese großer Mengen des gewünschten Produkts von voller Länge durch die Gegenwart hoher Konzentrationen der externen Starter CNTF.23 und CNTF.24 gesteuert. Die internen Starter wurden so gewählt, daß sie die

beiden Segmente des Kodierungsbereichs überbrückten und damit zur Deletion des Introns führten. Die Produkte der abschließenden PCR-Reaktion wurden mittels Agarosegelelektrophorese analysiert, und es wurde nur eine Hauptbande durch Färbung mit Ethidiumbromid nachgewiesen. Die Größe von ca. 600 bp sowie eine Teilnukleotidsequenz wiesen darauf hin, daß diese Bande einen präzise gespleißten Kodierungsbereich des Human-CNTF repräsentierte.

Der externe 5'-Starter CNTF.23 (Abb. 17) wurde so gestaltet, daß er ein Alanin kodierendes stumpfes Ende am Aminotermi'nus des Proteins erzeugte. Der externe 3'-Starter CNTF.24 (Abb. 17) lieferte eine Eagl-Restriktionsstelle 12 bp hinter dem Ende der CNTF-Kodierungssequenz. Dieser Starter war auch so gestaltet, daß er das natürlicherweise auftretende TAG-Terminationscodon durch TAA ersetzte, das in E. coli weniger anfällig gegen Durchlesen bei der Translation ist. Das PCR-Fragment wurde mit Eagl eingeschränkt und das entstehende 612 bp - Fragment wurde mittels Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Der Expressionsvektor pCP93, der das ATG-Startcodon liefert, wurde mit SAU linearisiert, durch Behandlung mit Sl-Nuklease abgestumpft, mit Eagl aufgeschlossen, und das resultierende Fragment von 3 63 6 bp wurde mittels Agarosegelelektrophorese gereinigt. Der Vektor und die auf diese Weise präparierten PCR-Fragmente wurden ligiert und in E. coli WSllOlacIqF- transformiert. Transformanten, welche die gewünschten Moleküle trugen, wurden durch Restriktionskartierung identifiziert und nach der Induktion auf die Gegenwart eines Proteins der erwarteten Größe getestet.

Die Analyse der Proteinsynthese durch Gelelektrophorese in induzierten Kulturen von E. coli vnilOladqF-, die eines der Kandidaten-Plasmide trugen (pRON32) zeigte das Vorhandensein einer Proteinbande von ca. 27000 MW, die in induzierten Kontroll-Bakterienkulturen, die den Plasmidvektor pCP93 trugen, nicht vorhanden war. Protein-Schnellextrakte aus diesen Kulturen zeigten das Vorhandensein von biologisch aktivem CNTF.

12.1.1.2.2. PPRPN33. pRPN39 und PRPN40

Abgesehen von der Gegenwart des Human- anstelle des Ratten-CNTF-Gens, sind diese Plasmide analog zu pRPN12, pRPN37 bzw.

pRPN38, und sie wurden in der gleichen Weise unter Verwendung pRPN32 als Elternplasmid konstruiert. Der Kopierkontrollbereich zwischen den Stellen Eaql und Pvul (in Uhrzeigerrichtung) in pRPN32 wurde durch die gleiche Sequenz aus pCPHO ersetzt, um pRPN33 zu erzeugen. Dann wurde der ß-Lactamase-Kodierungsbereich zwischen den Asel-Restriktionsstellen in pRPN33 durch den mutierten kanR-Bereich von pblkl ersetzt (Panayotatos, N., 198P, Gene 74:357-363), um pRPN40 zu erzeugen. Schließlich wurde der Bereich zwischen den Restriktioi;sstellen Ndel und BqIII von pRPN40 und pblkO (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357-363) ausgetauscht, um pRPN39 zu erzeugen, in dem das kanR-Gen von seinem Wildtyp-Promotor kontrolliert wird.

12.1.2. Induktion der Proteinsynthese

Zellen wurden bei 37⁰C in LB-Nährbouillon bis auf OD^gg ⁼ 1 geschüttelt. Es wurde Lactose bis zum Erreichen einer Endkonzentration von 1% zugesetzt und die Inkubation wurde 16 bis 20 Stundэп lang fortgesetzt.

12.1.3. "Schnelle" Proteinextraktion

Proben für die Gelelektrophorese wurden durch Wiederaufschwemmen von Zellpellets aus 0,5 ml Kultur mit OD₅₉₀ = 2 in 0,16 ml Lysispuffer (100 mM TrisHCl, 10% Glyzerin, 4% Natriumdodecylsulfat, 1 mM Dithiothreitol, 0,5 mg/ml Bromphenolblau) und 5-minütiges Sieden präpariert.

Selektive Extraktion/Solubilisierung - Es wurde das ursprünglich für rekombinantes menschliches Leukozyten-Interferon a2 beschriebene Verfahren (Thatcher, D., und Panayotatos, N., 1986, Methods Enzymol. 119:166-177) angewendet, das wie

W folgt modifiziert wurde./Zellen aus induzierten Kulturen wurden wiederaufgeschwemmt und bei einer Temperatur unter -20⁰C gelagert. Im Anschluß an die Lysozymbehandlung wurde die zähflüssige Suspension unter einem Druck von 8000 psi (= 55,1 MPa) durch eine French press (SLM-Aminco) passiert, mit 11000 χ g zentrifugiert, und das Pellet wurde verarbeitet (Thatcher, D., und Panayotatos, N., 1986, Methods Enzymol. 119:166-177). Nach erschöpfender Dialyse des durch 8M Guanidinchlorid solubilisierten Materials gegen Puffer D (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA,

0,1 τηΜ Dithiothreitol) und Zentrifugation mit 11000 χ g wurde der klare Überstand aseptisch durch ein Millipore Sterifil D-GV-Filter passiert.

12.1.4. Chromatographie

Das Filtrat wurde auf 25 mM NaCl eingestellt und mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min auf einer DEAE Sephacel-Säule (Pharmacia) mit Puffer E (20 mM Tris HCl, pH 8,0, 0,1 mM Dithiothreitol, 25 τηΜ NaCl) äquilibriert. Die Säule wurde mit einem Bettvolumen des gleichen Puffers gespült und mit drei Bettvolumina NaCl mit einem linearem Gradienten von 25-500 mM im gleichen Puffer eluiert. Rekombinanter Ratten-CNTF wurde bei 250-350 mM NaCl, Human-CNTF dagegen bei 50-100 mM eluiert.

Für Ratten-CNTF wurden gesammelte Peak-Fraktionen gegen Puffer E dialysiert, filtersterilisiert und bei -70⁰C gelagert.

Für Ншпап-CNTF wurden gesammelte Peak-Fraktionen aus der DEAE Sephacel-Säule auf 40 mM MES (Boehringer) , pH 6,0, 0,1 mM EDTA, 0,1 mM Dithiothreitol (Puffer G) eingestellt, durch ein 0,22 μΐη Millex GF - Filter passiert und einer 5 χ 10 cm Fast-S - Säule (Pharmacia) mit einem Durchsatz von 1,0 ml/h zugeführt. Nach dem Spülen mit zwei Bettvolumina Puffer G, der 250 mM NaCl enthielt, wurden drei Bettvolumina NaCl mit einem Gradienten von 250 1000 mM in Puffer G zugeführt. Human-CNTF wurde bei etwa 600 mM NaCl eluiert. Die Peak-Fraktionen wurden gegen Puffer E dialysiert, filtersterilisiert und bei -70⁰C gelagert.

12.1.5. Peptidanalyse 12.1.5.1. Ratten-CNTF

Rekombinanter Ratten-Cntf (50 дд) wurde einer Aufspaltung durch BrCN unterworfen, wie in Stockli u.a. (Nature 342:920-923) beschrieben. Die entstehenden Peptide wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von RP C4 getrennt und das Chromatogramm wurde mit dem von BrCN-gespaltenem Rattenhüftnerv-CNTF verglichen. Das früher als am stärksten C-terminal identifizierte Peptid wurde einer Aminosäure-Analyse unterworfen. Außerdem wurde das N-terminale Peptid identifiziert und einer Aminosäure-Analyse unterworfen.

12.1.5.2. Human-CNTF

Rekombinanter Human-CNTF (400 Pikomol) in 1,5 ml 0,l%igein Acetonitril wurde in einem Speedvac auf ein Endvolumen von 300 μΐ eingeengt. Die Probe wurde in eine Minisäule (Vydac C-4, 214 TPB, 300 А, Юдт) geladen, zweimal mit 0,15 TFA/10% Acetonitril gespült und mit 0,1% TFA/70% Acetonitril eluiert, Das Eluat wurde im Speedvac auf ca. 10 μΐ eingeengt. Es wurde eine C-terminale Spaltung mit 2% Carboxypeptidase Y und P (Boehringer Mannheim, Sequenzierungsqualität) in einem Gesamtvolumen von 20 μΐ bei 33⁰C und pH 3,79; 5,0 und 6,12; eingestellt durch Zugabe von Natriumnitrat (Endkonzentration von 0,02 5 bis 0,05 M) , durchgeführt. In Zeitabständen von 10 bis 50 Minuten der Inkubation wurden 3 μΐ Ameisensäure und 200 pMol Aminoethanol (das als Standard diente) zugesetzt und die Probe wurde, wie oben beschrieben, in eine Minisäule eingebracht. Die aufgespaltenen Aminosäuren wurden eluiert und die Säule wurde zweimal mit 0,1% TFA/10% Acetonitril gespült. Die Aminosäuren wurden getrocknet und nach Derivatisierung mit Phthaldialdehyd analysiert. CNTF wurde aus der Säule mit 0,1% TFA/70% Acetonitril eluiert, auf 10 μΐ eingeengt, und die Spaltung wurde wiederholt.

12.1.6. Biologische Aktivität

Die biologische Aktivität von rekombinantem CNTF wurde an Explantaten von Kükenembryo-Spinalganglien (DRG) und dissoziierten Kulturen von Ziliarganglion (CG) - Neuronen getestet, wie in Lindsay und Rohrer (1985, Devel. Biol. 112:30-48) beschrieben. Kurz gesagt, wurden Spinalganglien (DRG) aus 10 Tage lang inkubierten Kükenembryonen (ElO) präpariert und 5-6 Ganglien wurden in 1 ml einer Kollagengel-Grundmasse in 35mm-Gewebekulturschalen explantiert. Nach Erstarrung des Gels wurde 1 ml Gewebekulturmedium F14 (Imperial Labs., Großbritannien), ergänzt mit 5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum (GIBCO), zugesetzt, bevor Human-CNTF (1-20 ..1(?)) bis zum Erreichen einer Endkorzentration von 100 pg bis 100 ng/ml zugegeben wurde. Ziliarganglien (CG) wurden aus E8-Kükenembryonen präpariert und 30 Minuten in 0,15% Trypsin (Worthington) in kalzium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Die Ganglien wurden dann dreimal in F14-Medium , das 5% Pferdeserum enthielt,

gespülс, bevor sie durch Zerreiben durch die Bohrung einer Pasteur-Pipette hindurch zu einer Einzelzellsuspension dissoziiert wurden. Die Anreicherung mit CG-Neuronen wurde durch Ausstreichen der Zellsuspension über einen Zeitraum von 3,5 h in einer 60 mm-Schale erzielt, währenddessen nichtneuronale Zellen (Fibroblasten und Schwannsche Zellen) fest an dem Kunststoff hafteten, während phasenhelle Neuronen in Suspension blieben. Die gereinigten Neuronen wurden mit einer Dichte von 8000 10000 Neuronen/Schale auf polyornithin-laminin-beschichteten 35 mm-Kulturschalen ausgestrichen. In den Explantatkulturen wurde die CNTF-Aktivität durch Abschätzen des Umfangs des Faserauswuchses in behandelten Kulturen im Vergleich zu Kontrollkulturen bestimmt. Der Faserauswuchs wurde nach einer Skala von 0 bis 5+ mittels Vergleich von Kulturen mit Fotografien einer Dosisreaktion explantierter DRG und NGF bewertet. In dissoziierten CG-Neuronenkulturen wurde die CNTF-Aktivität bestimmt, indem nach 48 h die prozeßbeteiligten Neuronen in Kontroll- und CNTF-behandelten Kulturen gezählt wurden. In allen Fällen wurden die Ergebnisse aus jeweils drei Kulturen ermittelt.

12.1.7. Andere Methoden

Die Bedingungen für enzymatische Reaktionen, DNA-Elektrophorese und andere in den vorliegenden Untersuchungen angewendete Techniken sind ausführlich beschrieben worden (Panayotatos, N., 1987, in K.G.Hardy (Hrsg.) Plasmids: A Practical Approach (Plasmide: Eine praktische Einführung). IRL Press, Oxford, Großbritannien, S. 63-176). Die DNA-Sequenzierung wurde mit einer Sequenase Version 2.0 -, Ausstattung (USB Corporation) unter Verwendung von 4 mg supergeknäultem Plasmid als Matrize durchgeführt.

12.2. Ergebnisse und Diskussion

In früheren Untersuchungen der Expression von Fremdproteinen in E. coil sind verschiedene Parameter identifiziert worden, die zu einer starken Expression beitragen und die Gewinnung des biologisch aktiven Produkts erleichtern können. Wir haben Expressionsvektoren verwendet, die verschiedene wichtige Merkmale nutzten; dazu gehören: die Regulierung des lacUV5-Promotors durch den Lactose-Operon-Repressor; eine starke Ribosomenbin-

dungssteile aus dem Bakteriophagen T7; eine Mutation im Replikationskontrollbereich des Plasmids zur Erhöhung der Kopienzahl sowie eine Mutation zur Begrenzung der Expression des Antibiotikaro.sistenzproteins* Wir haben speziell die Wirkungen der letzteren beiden Merkmale auf die Produktion von CNTF in E. coli untersucht.

12.2.1. Expression von Ratten-CNTF

12.2.1.1. Effekt der Kopienzahl

Die Analyse der Proteinsynthese in lactose-induzierten Kulturen von E. coli WSIlOIaCIqF-ZpRPNIl mittels Gelelektrophorese zeigte die relativ schwache Expression eines Polypeptids von ca. 24000 kDa (=3,98xlO~¹⁷g), der erwarteten Größe für Ratten-CNTF, der in induzierten Kontrollkulturen von Bakterien, die den pCP93-Vektor trugen, nicht vorhanden war (Abb. 18). Extrakte von pRPNll-tragenden Zellen enthielten auch signifikante Konzentrationen der CNTF-Aktivität. Bemerkenswerterweise war in induzierten Kulturen von E. coli WSllOlacIqF-ZRPN^, der sich von pRPNll nur durch das Vorhandensein der Kopienzahl-Mutation copl unterscheidet, die Produktion von CNTF auf ca. 30 bis 50% des gesamten zellulären Proteins erhöht (Abb. 18) . So führte die Steigerung der Kopienzahl von pRPN12 auf das Fünffache im Vergleich zu pRPNll zu einer 30- bis 50-fachen Erhöhung der Konzentrationen an rekombinantem Protein (Tabelle IV). Dieser Effekt der copl-Mutation ist bßi anderen rekombinanten Proteinen dokumentiert worden (Buell, G., und Panayotatos, N., 1987, in "From Gene to Protein: Steps Dictating the Maximal Levels of Gene Expression" (Vom Gen zum Protein: Schritte, welche die Maximalwerte der Genexpression bestimmen), Reznikoff, W.S., und Gold, L., Hrsg., Butterworths Stoneham, Mass.).

12.2.1.2. Effekt der Antibiotikaresistenz

In früheren Untersuchungen zur Expression rekombinanter Proteine in E. coli wurde beobachtet, daß die Synthese des durch den Vektor kodierten Antibiotikaresistenzproteins die optimale Produktion von rekombinantem Protein beeinträchtigte. Diese Beeinträchtigung wurde der Konkurrenz der beiden Gene um den begrenzenden synthetischen Mechanismus der Zelle zugeschrieben

(Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357-363). Um diese Hypothese weiter zu testen und möglicherweise die CNTF-I roduktionswerte zu verbessern, wurde das B-Lactamasegen in pRPN12 durch das Kanamycinresistenz- (kanR)- Gen ersetzt, entweder unter der Transkriptionckontrolle seines nativen Promotors (pRPN37) oder unter der Kontrolle eines schwächeren mutierten Promotors (pRPN38).

Die Analyse der Proteinwerte in induzierten Zellen, die als Wirt für pRPN37 dienten, zeigte, daß Ratten-CNTF 10 bis 20% des gesamten zellulären Proteins bildete und das kanR-Protein in etwa der halben Konzentration synthetisiert wurde. Im Gegensat г dazu bildete CNTF in Wirtszellen von pRPN38 50 bis 70% des gesamten zellulären Proteins, während das kanR-Protein nicht nachweisbar war (Abb. 18 und Tabelle IV). Die signifikant höhere Expression von CNTF, die bei pRPN38 beobachtet wurde, resultiert vermutlich direkt aus der Abnahme der Expressionsstärke des Antibiotikaresistenzgens. Wie bei anderen rekombinanten, mit diesen Vektoren in hohen Konzentrationen exprimierten rekombinanten Proteinen (Panayotatos, N., 1988, Gene 74:357-363), wird durch eine möglichst geringe Stärke dei kanR-Promotorc; die Konkurrenz um die anscheinend begrenzte Synthesekapazität der Zelle auf ein Minimum reduziert.

12.2.2. Expression von Human-CNTF

Die mit verschiedenen Vektoren erhaltenen relativen Werte der Human-CNTF-Expression sind in Abb. 18 dargestellt und in Tabelle IV zusammengefaßt. Die Maximalwerte bei jedem Vektor waren niedriger als die Werte, die für die analogen Vektoren, die das Ratten-CNTF-Gen trugen, beobachtet wurden, aber das Gesamtbild war das gleiche; wieder wurde eine 30- bis 50-fache Erhöhung bei den Plasmiden mit der höheren Kopienzahl (copl) beobachtet, und die Maximalwerte wurden wiederum mit der Kombination von hoher Kopienzahl und niedriger Expression der kanR-Resistenz erreicht. Für die Expression von Human-CNTF ist der Effekt der reduzierten kanR (pRPN39 gegenüber pRPN40) etwas weniger auffällig als der Effekt auf die Expression von Ratten-CNTF (pRPN37 gegenüber pRPN38). Dies war zu erwarten, da die Konkurrenz der beiden Transkriptionseinheiten nur dann evident wird, wenn der Synthesemechanismus der Zelle begrenzend wirkt, d.h. bei extrem hohen

Werten des rekombinanten Proteins.

Die hier beschriebene Produktionsmenge von Ratten-CNTF in J?. coli ist außergewöhnlich groß. Dies ist offenbar das Ergebn'ί einer günstigen Kombination mehrerer Faktoren, einschließlich der Verwendung eines mäßig starken Promotors, eines starken Ribosomentranslationsstartsignals, eines Vektorplasmids, das stabil auf einer relativ hohen Kopienzahl gehalten wird, sowie der minimalen Synthese des selektiven Antibiotikaresistenzproteins. Außerdem wird die Produktion des rekombinanten Proteins durch die physikalischen Eigenschaften des Proteins selbst und durch seine Stabilität im Wirt bestimmt. In dieser Hinsicht scheint Ratten-CNTF für die Expression in E. coli besonders geeignet zu sein. Human-CNTF wird ebenfalls sehr wirksam exprimiert, wenn auch in etwas geringeren Konzentrationen.

12.2.3. Reinigung von Ratten- und Hu.inan-CNTF

Wie andere rekombinante Proteine, die in E. coli in hohen Konzentrationen exprimiert werden, wurde CNTF meist in unlöslichen Einschlu3körpern festgestellt; .85 bis 90% des Ratten- und 60 bis 70% des Human-Proteins waren durch einen neutralen Puffer nicht extrahierbar. Die Extraktion und Solubilisierung von CNTF und anderen (meist hydrophoben) Proteinen, die in Einschlußkörpern enthalten waren, wurde mit 8 M Guanidinchlorid ausgeführt. Die anschließende langsame Entfernung von Guanidin durch Dialyse führte zur Ausfällung der hydrophoben Wirtsproteine und beließ den Ratten-CNTF mit einer Reinheit von über 95% in Lösung, den Human-CNTF mit einer Reinheit von über 90% (Abb. 19) . An dieser Stelle genügte ein einziger Chromatographieschritt (DEAE Sephacel) zur Reinigung des rekombinanten Ratten-CNTF auf mehr als 99%, bestimmt aus den relativen Intensitäten absichtlich überladener Polyacrylamidgele (Abb. 19A) sowie durch HPLC-Analyse. Zum Teil wegen der schwächeren Affinität des Humanproteins zu DEAE Sephacel war es notwendig, einen zweiten Chromatographieschritt (Fast S) hinzuzufügen, um eine höhere Reinheit als 99% zu erreichen (Abb. 19B).

12.2.3.1. Ausbeute

Bei vorgegebenen Schätzwerten für die Expression und unter der Annahme, daß der Gesamtgehalt an Protein des feuchten Zellpellets 5 bis 15 Gew.-% Protein beträgt, würde die theoretische Ausbeute 30 bis 90 mg Ratten-CNTF bzw. 15 bis 45 mg Human-CNTF pro Gramm des nassen Zellpellets betragen. Die tatsächliche Ausbeute betrug 20 mg für Ratten-CNTF und ca. 6 mg für Human-CNTF. Der Verlust ist im Falle des Humanproteins zum größten Teil auf den während с er Präparation der Einschlußkörper extrahierten und ausgeschiedenen "löslichen" CNTF zurückzuführen.

12.2.3.2. Charakterisierung

Rekombinanter Ratten- wie au^h Human-CNTF, der nach den obigen Verfahren dargestellt wurde, hatte eine Reinheit von mehr als 99%. Die Proteine besaßen eine sehr geringe Progenität (! 5 ng/mg Protein) nach dem Limulus-Amoebozytenlysat-Test (Associates of Cape Cod). Ferner wurde festgestellt, wie weiter unten erörtert, daß sie auf der picomolaren Ebene biologisch aktiv sind.

Die rekombinanten Ratten- und CNTF-Proteine wurden mit BrCN behandelt und die N-terminalen und C-terminalen Peptide wurden identifiziert und einer Aminosäursizusammensetzungs- und/oder Sequenzanalyse unterworfen. Die Analysen der H-terminalen Peptide zeigten, daß sowom bei den Ratten- als auch bei den Humanproteinen die N-terminale Aminosäure als Alanin gewonnen wurde. Dies bedeutet, daß das Ptart-Methionin quantitativ entfernt wurde, wie dies allgemein' der Fall ist, wenn die zweite Restgruppe die nicht sperrige Aminosäure Alanin ist. Im Gegensatz dazu ist das N-terminale Ende des durch Reinigung aus dem Rattenhüftnerv gewonnenen CNTF blockiert und behält den terminalen Methioninrest bei. Am C-terminalen Ende erhielt man die erwartete Sequenz des terminalen BrCN-Peptids für rekombinanten Human-CNTF. Im Gegensatz dazu zeigte die Aminosäurezusammensetzungs-Analyse des C-terminalen Peptids von Ratten-CNTF, daß es zwar die erwartete Zusammensetzung hatte, jedoch ein erwarteter Tyrosinrest fehlte und ein zusätzliches Asparagin vorhanden war. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte eine Punktmutation, die_/ eine Substitution von Tyrosin durch Asparagin am Codon 193 bewirkte;

j 98133

diese entstand offenbar während des Kopierens einer klonierten Ratten-CNTF-cDNA durch PCR zur Konstruktion des ursprünglichen Expressionsvektors pRPNll. Wir haben festgestellt, daß die Mutation in einem Bereich von CNTF liegt, der für die biologische Aktivität nicht wesentlich ist.

Ratten·- und Human-CNTF haben die gleiche Anzahl von Aminosäuren (berechnet zu MW 22780 bzw. 22700 nach Entfernung des N-terminalen Methionins), und große Teile ihrer Sequenzen sind identisch. Jennoch wandert Human-CNTF sowohl auf reduzierenden als auch auf nichtreduzierenden SDS-Polyacrylamidgeleh etwas langsamer als Ratten-CNTF (Abb. 19) . Dieser Unterschied in der Beweglichkeit zwischen zwei Molekülen von ähnlicher Struktur und identischer Länge spiegelt wahrscheinlich eine gewisse ungewöhnliche strukturelle Behinderung im Humanprotein wider.

12.2.4. Biologische Aktivität

Rekombinanter, nach dem obigen Verfahren gereinigter Ratten-CNTF war voll aktiv. Abb. 20 zeigt Dosis-Wirkungs-Kurven dissoziierter, neuronenangereicherter Kulturen von Εθ-Kükenembryo-Ziliarganglien, die mit CNTF erhalten wurden, der durch Reinigung aus Rattenhuftnervgewebe gewonnen wurde (Stockli u.a., Nature 342:920-923), sowie mit rekombinantem Ratten-CNTF. Die Aktivität des aus dem Hüftnerv durch Reinigung gewonnenen Proteins_war bei 5 pg/ml nachweisbar, und die maximale Neuronen-Überlebensrate wurde bei 1 bis 2 ng/ml beobachtet (ECc_n = 80 pg/ml). Im gleichen Test wurde festgestellt, daß gereinigter rekombinanter Ratten-CNTF bei 2 pg/ml aktiv war, und Sättigung wurde bei 0,5 bis 1 ng/ml beobachtet (EC₅₀ = 3 5 pg/ml oder 1,5 pM).Somit war der gereinigte rekombinante Ratten-CNTF mindestens ebenso aktiv wie das durch Reinigung aus dem Hüftnerv gewonnene native Protein.

In Parallelexperimenten wurde gereinigter rekombinanter Human-CNTF auf biologische Aktivität getestet. Zunächst wurden Explantate von Küken-DRG vom Embryonentag 10 (ElO) zum schnellen und halbquantitativen Nachweis in E. coli-Lysaten angewendet. In Gegenwart von CNTF wurde Faserauswuchs beobachtet, während in Abwesenheit des exogenen neurotrophen Faktors die Kontrollganglien wenig oder gar keinen Auswuchs aufwiesen (Abb. 21A, B).

Der maximale Faserauswuchs bei Sättigungswerten von CNTF betrug ca. 50-75% des bei Sättigungswerten von NGF beobachteten Auswuchses.

Ein spezifischerer Test mißt die Überlebensrate von Neuronen in dissoziierten, neuronenangereicherten Kulturen von E8-Küken-Ziliarganglien. Nach 48 h waren in Kontrollkulturen fast alle Neuronen degeneriert (Abb. 21C), während in Gegenwart von CNTF-Sättigungswerten mindestens 60-70% der ausgestrichenen Neuronen überlebten und lange Neuriten entwickelten (Abb. 21D, E) . Diese spezifischen Effekte von Ziliarneuronen wurden bei Rohlysatmengen der Bakterienzellen unterhalb des Nanogrammbereichs und bei gereinigtem rekombinantem Protein beobachtet. Bei solchen, mit ansteigenden Mengen Reinprotein durchgeführten Experimenten wurde festgestellt, daß rekoinbinanter Human-CNTF gegenüber Küken-Ziliarneuronen ebenso aktiv ist wie Ratten-CNTF.

Die hier beschriebene Expression und Reinigung von CNTF könnte leicht in größerem Maßstab zur Produktion von Pharmazeutika ausgeführt werden. Im Lichte des kürzlich gegebenen Nachweises, daß CNTF das Überleben verletzter Motorneuronen bei Versuchstieren fördern kann (Sendtner u.a., 1990, Nature 345:440-441), mag dies von Bedeutung sein.

Tabelle IV

Plasmid	Gemeinsame Merkmale*	Spezielle Merkmale	CNTF**	Amp Qder kanR
pRPNll	lac.rbsl.ratCNTF	app.cop+	1-2	<0,5
pRPN12	Il	amp.copl	30-50	1-2
PRPN37	Il	kanO.copl	5-10	5-10
pRPN38	Il	kanl.copl	50-70	<0,l
pRPN3 2	Iac.rbsl.humCNTF	amp.cop+	1-2	<0,5
pRPN33	Il	amp.copl	10-20	1-2
pRPN39	Il	kanO.copl	15-25	5-10
pRPN40	Il	kanl.copl	25-35	<0,l

Iac: lacUVS-Promotor; rbsl: Ribosomenbindungsstelle; ratCNTF, humCNTF: Ratten- bzw. Human-CNTF-Gen; amp: Ampicillinresistenzgen; kanO, kanl: Wildtyp- oder mutierte kanR-Gene; cop+, copl: Plasmid mit normaler bzw. hoher Kopienzahl. Als Prozentsatz des gesamten zellulären Proteins

13. Beispiel: Effekte von modifiziertem und verkürztem Protein mit ziliarem neurotrophem Faktor auf die biologische

Aktivität

13.1. Materialien und Methoden

13.1.1. Konstruktion parentaler Expressionsvektoren

Die gentechnische Behandlung der parentalen rCNTF-Expressionsvektoren pRONll, pRPN37 und pRON40 wurde in den Abschnitten 12.1.1.1.1., 12.1.1.1.3. und 12.1.1.2.2. beschrieben.

13.1.2. Konstruktion modifizierter Vektoren für den menschlichen ziliaren neurotrophen Faktor

Das Plasmid pRPN108 wurde erzeugt, indem die DNA-Sequenz zwischen den einzigen Restriktionsstellen Aatll und Nhel in pRPN33 durch ein Fragment ersetzt wurde, das genau die gleiche Sequenz enthielt, die in zwei Positionen 15 bp in 5'-Richtung von der Nhel-Stelle modifiziert war. Dies wurde mit einem Oligodesoxyribonukleotid-"3'-Starter" erreicht, der die Nhel-Stelle überspannte und drei Restgruppen enthielt, der das TGT-Cystein-Codon durch das GCA-Codon für Alanin ersetzte. Dieser 3'-Starter wurde in Kombination mit einem 5'-Starter eingesetzt, der die Aatll-Position überspannte, um die gewünschte Sequenz aus pRPN33 durch Polymerasekettenreaktion (PCR) zu erhalten. Somit ist pRPN108 identisch mit pRPN33, mit Ausnahme des Alanin-Codcns für die Aminosäure 17 von hCNTF (Abb. 22).

Das Plasmid pRPN109 wurde aus pRPN3 3 in genau der gleichen Weise wie pRPN108 erzeugt, mit der Ausnahme, daß der die Nhel-Position überspannende 3'-Starter zwei Restgruppen enthielt, die das TGT-Cystein-Codon in das AGT-Codon für Serin umwandelte. So ist pRPN109 identisch mit pRPN108, mit Ausnahme des Serin-Codons für die Aminosäure 17 von hCNTF (Abb. 22).

Das Plasmid pRPN59 wurde durch Entfernen der DNA-Sequenz zwischen den einzigen Restriktionsstellen BamHl und Nrul in pRPN33 erzeugt. In pRPN59 wird die hCNTF-Sequenz hinter dem 185. Codon unterbrochen und anschließende Sequenz kodiert die 10 zusätzlichen Aminosäuren, die dem hCNTF nicht entsprechen, sowie ein Translationsstoppcodon (Abb. 22).

Das Plasmid pRPN112 wurde während der gentechnischen Gewinnung von pRPN40 aus pRPN33 (MS2) erzeugt, wenn die Orientierung des Teils des hCNTF-Gens zwischen den Asel-Positionen, der das Restriktionsfragment trug, invertiert wurde. In pRPN112 wird das hCNTF-Gen unmittelbar hinter dem 145. Codon unterbrochen und die anscrließende Sequenz bringt zwei Codone ein; eines für eine Aminosäure (Leucin), die nicht dem hCNTF entspricht, sowie ein Translationscodon (Abb. 22).

Das Plasmid pRPN82 wurde erzeugt, indem ein PCR-Fragment, das an den BstXl-Positionen endet und die letzten 133 Aminosäuren von hCNTF kodiert, in die BstXl-Position eines Gens eingefügt wurde, das ein zu CNTF nicht homologes Protein kodiert. In pRPN82 besteht das resultierende Fusionsprotein aus den ersten 35 Aminosäuren des Fremdproteins, gefolgt von 2 Glyzinresten und 133 Restgruppen von hCNTF (Abb. 22).

13.1.3. Konstruktion modifizierter Vektoren für den ziliaren neurotrophen Faktor der Ratte

Das Plasmid pRPN65 wurde erzeugt, indem zwischen den einzigen Restriktionsstellen Sacl und Nrul von pRPN12 ein PCR-Fragment inseriert wurde, das so gestaltet war, daß es unmittelbar hinter dem 165. Codon von rCNTF ein Translationsstopp-Codon einfügte. (Abb. 22).

Das Plasmid pRPNHO wurde erzeugt, indem die DNA-Sequenz zwischen den einzigen Restriktionsstellen Nhel und Eagl in pRPN12 durch ein Fragment ersetzt wurde, das genau die gleiche Sequenz trug, die an dem einzigen Nukleotid modifiziert war, das TAT-Tyrosin-Codon in das AAT-Codon für Asparagin umwandelt. Dies wurde mit einem 3'-Starter erreicht, der sich von der zu mutierenden Position zum З'-Ende des rCNTF-Gens hin erstreckte und von der durch Eagl erkannten Sequenz gefolgt wurde. Dieser 3'-Starter wurde in Kombination mit einem 5'-Starter verwendet, der die Nhel-Stelle überspannte, um die gewünschte Sequenz aus pRPN12 durch PCR zu erhalten. In pRPNHO kodiert das rCNTF-Gen ein Protein, das mit dem von der Ratten-DNA kodierten identisch ist (Abb. 22).

2ЭЯ133

13.1.4. Biologischer Test der Aktivität des ziliaren neurotrophen Faktors

Die biologische Aktivität wurde an Spinalganglien getestet und/oder dissoziierte Ziliarneuronen wurden entsprechend der Beschreibung in Abschnitt 12.1.6. bestimmt. Das löslich Protein wurde aus den induzierten Bakterien, die als Wirt für das jeweilige Plasmid dienten, nach dem in Abschnitt 12.1.3. beschriebenen "schnellen" Proteinextraktionsverfahren extrahiert.

13.2. Ergebnisse und Diskussion

Die Ergebnisse von Tests auf biologische Aktivität zeigten, daß die in pRPNlOß und pRPN109 kodierten modifizierten hCNTF-Proteine sowie das /erkürzte, in pRPN59 kodierte Protein ebenso aktiv waren wie das im parentalen Plasmid pRPN33 kodierte Protein von voller Länge. Im Gegensatz dazu war das in pRPN112 kodierte verkürzte Protein inaktiv.

Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß der einzige Cysteinrest, den die Human-, Ratten- und Kaninchen-CNTF-Gequenzen in Position 17 gemeinsam haben, ohne offensichtlichen Aktivitätsverlust modifiziert werden kann. In ähnlicher Weise sind die letzten 15 Aminosäuren von hCNTF für die Aktivität nicht notwendig. Im Gegensatz dazu wird durch Entfernen der letzte 55 Aminosäuren vom C-terminalen Ende von hCNTF die Aktivität zerstört. Daher liegt ein kritischer Bereich für aktiven hCNTF in der Region zwischen den Aminosäuren 146 und 186.

Die Ergebnisse bei den verkürzten und modifizierten Ratten-CNTF-Proteinen stehen im Einklang mit dieser Interpretation und engen den für die CNTF-Aktivität kritischen Bereich weiter ein. Die Entfernung der letzten 35 Aminosäuren in dem durch pRPN65 kodierten Protein führte zur Inaktivierung des Proteins, während der Ersatz des Tyrosins durch einen Asparaginrest in Position 193 keine Auswirkung auf die Aktivität hatte. Diese Ergebnisse engen die Grenzen des für die CNTF-Aktivität kritischen Bereichs weiter auf die Sequenz zwischen den Aminosäuren 166 und 186 ein.

14. Beispiel: Zusätzliche Effekte von CNTF auf ventrale

Rückenmarksneuronen

14.1. Materialien und Methoden 14.1.1. Versuchstiere

Bei allen Experimenten wurden Sprague-Dawley-Ratten (HSD oder Zivic-Miller) verwendet. Trächtige Ratten (E14) wurden wie in

10.1.1. beschrieben getötet.

14.1.2. Gewebekultur-Techniken

Aus den Rattenembryonen wurde, wie in 10.1.2. beschrieben, das Rückenmark unter aseptischen Bedingungen entnommen. Die Rückenmarksgewebe wurden in kleine Stücke zerschnitten und 20 Minuten lang bei 37⁰C in 0,1% Trypsin (GIBCO) und 0,01% Desoxyribonuklease Typ 1 (Sigma) inkubiert. Die Trypsinlösung wurde dann entfernt, ausgespült und durch ein Medium ersetzt, das aus 45% Eagleschem Minimalmedium (MEM), 45% Hamscher Nährstoffmischung F12 (F12), 5% fötalem Kälberserum (GIBCO), 5% Pferdeserum (GIBCO), Glutamin (2mM), Penicillin (0,5 Einheiten/ml) und Streptomycin (0,5 дд/rnl) bestand. Dies wurde dann durch schonendes Zerreiben durch eine Pasteursche Pipette hindurch zweimal im gleichen Medium mechanisch dissoziiert, und die Überstände wurden gesammelt und durch ein Nylonfilter (Nitex, Tetko; 40μΐη) passiert. Die Gesamtzahl der gewonnenen Zellen wurde durch Zählung in Gegenwart von Trypanblau auf einem Hämozytometer bestimmt. Die dissoziierten ventralen Zellen wurden dann mit einer Dichte von ca. 50000 Zellen/cm² auf Schalen ausgestrichen, die mit Poly-L-ornithin (10 дд/ml) und Laminin (5jug/ml) beschichtet waren. Die Behandlungen erfolgten am Tage des Ausstreichens, außer bei Versuchen mit verzögerter Zugabe, bei denen die Behandlungen an den Tagen 2 bzw. 6 erfolgten. Die Kulturen wurden bei 37⁰C in einer Atmosphäre von 95% Luft/5% CO₂ und einer relativen Luftfeuchte von nahezu 100% gehalten. Das Kulturmedium wurde alle 3 bis 4 Tage gewechselt. Ein Mitose-Inhibitor, Cytosinarabinosid (Ära C; 0,1 μΜ) , wurde am Tag 2 zugesetzt, um die Anzahl nichtneuronaler Zellen zu verringern. Am Tag 7 wurden die Zellen, um Messungen der Cholinacetyltransferase-(CAT; Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24:407-409) und der

Proteinwerte (Bradford, 1976, Annal. Biochem. 72:248-254), oder für den NF-Test (Doherty u.a., 1984, J. Neurochem. 42:1116-1122) und die Immunozytochemie in 4% Paraformaldehyd fixiert. Einige Kulturen wurden in einem definierten Medium angelegt, das aus 50% F12 und 50% MEM, Glutamin (2 mM), Insulin (5 дд/ті) , Transferrin (100 дд/rnl), Progesteron (20 nM) , Putrescin (100 μΜ) und Natriumselenit (30 nM) bestand (Bottenstein und Sato, 1979, PNAS 76:514-517). In diesen Kulturen wurde das serumhaltige Medium am Tag 1 durch ein definiertes Medium ersetzt.

14.1.3. Neurofilament (NF) - Test

Nach zweistündigem Fixieren der Zellen in 4%-igem Paraformaldehyd bei 4 ⁰C wurden die Kulturen dann nach den in Doherty u.a. (1984, J. Neurochem. 42:1116-1122) beschriebenen Verfahren permeabilisiert und blockiert. Das Neurofilament-Protein wurde unter Anwendung eines monoklonalen Antikörpers RT97 (Wood und Anderton, 1981, Biosci. Rep. 1:263-268) bei einer Verdünnung von 1:100 nachgewiesen. Das Reaktionsprodukt wurde unter Verwendung von O-Phenylendiamin (OPD) als Substrat sichtbar gemacht und die optische Dichte wurde bei 490 nm gemessen.

14.1.4. Cholinacetvltransferase (CAT) - Test

Die Kulturen wurden durch Lysieren der Zellen in einer 2OmM Tris-HCl-Lösung (pH 8,6), die 0,1% Triton X-100 enthielt, geerntet. Zwei Mikroliter des Zellysats wurden entnommen und nach dem Mikro-Fonnum-Verfahren (Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24:407-409) auf CAT-Aktivität getestet. Die endgültige Substratmischung bestand aus 0,2mM [1-¹⁴C] Acetyl-CoA (NEN, 54,4 mCi/mmol), 300 mM NaCl, 8 mM Cholinbromid, 20 mM EDTA und 0,ImM Neostigmin in 5OmM NaH₂PO₄-PUffer (pH 7,4). Bei diesen Enzym- und Substratkonzentrationen war die enzymatische Reaktion 90 bis 120 Minuten lang linear. Die Spezifität der Induktion für CAT wurde durch Zugabe eines spezifischen Inhibitors für CAT-Aktivität, N-hydroxyethyl-4-(l-naphthylv.inyl)pyridium (HNP) während des Tests geprüft (White und Cavallito, 1970, J. Neurochem. 17:1579-1589).

14.1.5. Histochemische Färbung für Acetylcholinesterase (AchE)

Cholinerge Zellen wurden durch histochemische Färbung für AchE nach einer Modifikation der Färbemethode von Geneser-Jensen und Blackstadt (1971, Z. Zellforsch. 114:460-481) identifiziert. Nach dem Fixieren der Kulturen in 4%-igem Paraformaldehyd wurden die Zellen 5-6 Tage lang bei 4⁰C in Gegenwart der Ache-Substratlösung mit folgender Zusammensetzung inkubiert: 4mM Acetylthiocholinjod, 2mM Kupfersulfat, 1OmM Glycin und 10μg/ml Gelatine in 5OmM Acetatpuffer (pH 5,0). Das Reaktionsprodukt wurde wie früher beschrieben sichtbar gemacht (Hartikka und Hefti, 1988, J. Neurosci. 8:2967-2985).

14.1.6. Fraktionierung von Vorderhornzellen durch Metrizamid-Dichtegradienten

Das Fraktionierungsverfahren (Dohrman u.a., 1986, Dev-. Biol. 118:209-211) war eine Modifikation der von Schnaar und Schaffner (1981, J. Neurosci. 1:204-207) beschriebenen Methode. Metrizamid wurde in F12:MEM (1:1)-Medium gelöst und es wurde ein Stufengradient präpariert, der aus 3 ml 17% Metrizamid, 3 ml 12% Metrizainid und 3 ml 8% Metrizamid bestand. Die folgenden Schritte wurden sämtlich bei 4⁰C ausgeführt. Die nach der früheren Beschreibung gewonnene Vorderhornzellsuspension (2,5 ml) wurde über den Stufenc^radienten geschichtet, das Reagenzglas wurde 20 Minuten lang bei 2500 χ g auf einer Horizontalzentrifuge zentrifugiert. Die Zentrifugation ergab drei Zellschichten an den 0-8%- (Fraktion I), 8-12%- (Fraktion II) und 12-17%-(Fraktion III) Grenzflächen. Die Zellen von jeder Grenzfläche wurden in einem kleinen Volumen (ca. 1 ml) gesammelt, ausgestrichen, behandelt und wie beschrieben getestet. Die Neuronen aus Fraktion I wurden in einem aus den kultivierten Rückenmarkszellen abgeleiteten konditionierten Medium gehalten.

14.2. Ergebnisse und Diskussion

14.2.1. Allgemeine Morphologien der Kulturen

Vorderhornzellen, die in serumhaltigem Medium kultiviert wurden, ergaben gemischte Neuronen-Gliazellen-Kulturen. Nach 24 Stunden wurden die Gliazellen flach und begannen zu wuchern,

während nur wenige Neuronen begannen, Neuriten auszustrecken. Nach 18 Stunden entwickelten jedoch viele Neuronen Neuriten und zeigten ein charakteristisches phasenhelles Soma (Abb. 23) . Nach der. Zugabe von Ära C am Tag 2 begannen nichtneuronale Zellen abzusterben und wegzuschwimmen und ließen eine neuronenangereicherte Kultur zurück, die etwa 5% Glia enthielt. In definiertem Medium enthielten die Kulturen ebenfalls ca. 5% Glia, die durch Behandlung mit Ära C weiter reduziert werden konnten. In Motorneuronen-Hornkulturen (Fraktion I) traten im wesentlichen keine Gliazellen auf, und über 90% der Neuronen waren große cholinerge Neuronen.

14.2.2. Wirkungen von CNTF auf Neurofilament (HF) - Werte

Zur Abschätzung der Effekte von CNTF auf Neuronen wurden NF-Werte gemessen. Ein 2,0-facher Anstieg des NF-Gehalts wurde in CNTF-behandelten (10 ng/ml) Vorderhornkulturen im Vergleich zu unbehandelten Kulturen festgestellt. NGF erzeugte keinen signifikanten Effekt (Abb. 24). Dies läßt darauf schließen, daß CNTF das Überleben und/oder den Neuritenauswuchs bei kultivierten ventralen Neuronen fördert.

14.2.3. Wirkungen von CNTF auf das Überleben von AchE-haltiqen Neuronen

Um festzustellen, ob der Anstieg der NF-Werte eine Erhöhung der neuronalen Überlebensrate oder des Neuritenauswuchses widerspiegelt, wurde eine histochemische Färbung für AchE durchgeführt, da die Mehrheit der Neuronen in Vorderhornkulturen cholinerge Motorneuronen sind. Es wurde ein 2,5-facher Anstieg an AchE-positiven Neuronen in CNTF-behandelten (10 ng/ml) Kulturen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen festgestellt. NGF hatte anscheinend eine geringe Wirkung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß CNTF die neuronale Überlebensrate erhöht, was u.U. den Anstieg der NF-Werte erklärt.

14.2.4. Wirkungen von CNTF auf die CAT-Aktivität

Um den Einfluß von CNTF auf phänotypische Transmitter-Expression abzuschätzen, wurden die Werte der CAT-Aktivität ermittelt.

CAT ist das geschwindigkeitsbegrenzende Enzym für die AchE-Synthese. Wie in Abb. 26 gezeigt, bewirkte die Zugabe von CNTF (10 ng/ml) im Durchschnitt einen 4,0-fachen Anstieg der CAT-Aktivität nach 7 Tagen in Kultur, während die Zugabe anderer Wachstumsfaktoren wie z.B. NGF (50 ng/ml) und FGF (50 ng/ml) keine Wirkung hatte. Dieser Anstieg der cholinergen Aktivität ist dosisabhängig und erreichte eine maximale Wirkung bei CNTF-Konzentrationen von 1 ng/ml (Abb. 26B). Dieser Anstieg war schon 3 Tage nach der Behandlung sichtbar und wurde anscheinend durch die Dichte der Kulturen nicht beeinflußt. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, daß CNTF auch die Expression cholinerger Transmitter stimuliert, da der Anstieg der CAT-Aktivität um das 1,6-fache über der Zunahme der cholinergen Neuronenzahl liegt ,d.h. die überlebenden cholinergen Neuronen produzieren mehr Ach pro Neuron.

14.2.5. Versuch mit verzögerter Zugabe

Vorderhornzellen wurden in drei Gruppen unterteilt, wie in Abb. 27 dargestellt. In Abb. 27A wurde CNTF (10 ng/ml) den Zellen zum Zeitpunkt des Ausstreichens zugesetzt, und die Zellen wurden 7 Tage lang in Gegenwart von CNTF kultiviert. In Abb. 27 B + C wurden die Kulturen 2 bzw. 6 Tage lang ohne CNTF gehalten und dann weiter 7 Tage lang mit CNTF (10 ng/ml) behandelt. Die verzögerte Zugabe von CNTF am Tag 2 führte zu einer geringeren Steigerung der CAT-Aktivität auf das 1,2-Fache. Nach 6 Tagen Verzögerung jedoch kann

CNTF die CAT-£ktivität nicht mehr beeinflussen (Abb. 27) . Dies läßt darauf schließen, daß es eine Population CNTF-empfindlicher Neuronen gibt, die normalerweise in Abwesenheit von CNTF innerhalb weniger Tage nach dem Ausstreichen abstirbt. In Gegenwart von CNTF überleben diese Zellen und exprimieren eine größere Menge Ach.

14.2.6. Wirkungen von CNTF auf Vorderhornzellkulturen in Abwesenheit von Gliazellen

Die Zahl der vorhandenen Gliazellen in Vorderhornzellkulturen wurde nach 2 Methoden vermindert: a) Behandlung mit Antimitotikum (AraC; 0,5μΜ) und b) Verwendung eines serumfreien Wachs-

tumsmediums. In beiden Fällen wurden die Gliapopulationen auf etwa 5% der gesamten Zellen verringert, aber die Auswirkungen vor» CNTF auf die CAT-Aktivität blieben unverändert (Abb. 28) . Diese Ergebnisse zeigen, daß der Effekt von CNTF auf die CAT-Aktivität wahrscheinlich nicht über Gliazellen vermittelt wird, sondern eine direkte Reaktion der Neuronen ist.

14.2.7. Wirkungen von CNTF auf Motorneuronen, die nach dem Metrizamid-Gradientenverfahren gereinigt wurden

Die Vorderhornzellkulturen waren schon mit cholinergen Neuronen angereichert. Um die Homogenität der Kulturen zu sichern, wurden die Motorneuronen aus den ventralen Rückenmarkskulturen weiter nach dem Dichtegradientenverfahren gereinigt. Ein Metrizamid-Stufengradient gestattet die Selektion von Motorneuronen aufgrund ihrer geringeren Schwebedichten. Die resultierenden Kulturen enthielten mehr als 90% Motorneuronen, wie früher von Schnaar und Schaffner (1981, J. Neurosci. 1:204-207) gezeigt wurde. In den gereinigten Motorneuronenkulturen stimulierte CNTF (10 ng/ml) einen 10-fachen Anstieg der CAT-Aktivität im Vergleich zu unbehandelten Kulturen (Abb. 29) . Der Metrizamid-Gradient kann einen möglichen Verunreinigungspool von kleinen cholinergen präganglionären sympathischen Neuronen von den großen Motorneuronen trennen. Die Ergebnisse demonstrieren, daß CNTF das Überleben der Motorneuronen fördert und die cholinerge Expression in den Motorneuronen stimuliert.

15. Beispiel: Wirkung des ziliaren neurotrophen Faktors auf

Hippocampus-Kulturen

15.1. Materialien und Methoden 15.1.1. Hippocampuszellkulturen

Hippocampi wurden aus E18-19 Rattenembryonen von Sprague-Dawley-Ratten präpariert und in FlO-Medium gesammelt. Die Gewebe wurden zerschnitten, zweimal mit FlO-Medium (GIBCO) gespült und 20 Minuten lang mit 0,25% Trypsin bei 37⁰C trypsiniert. Das Trypsin wurde durch Zusatz eines serumhaltigen Mediums, das aus Minimalmedium (MEM) mit Zusatz von fötalem Kälberserum (FCS, 10%), Glutamin (ImM), Penicillin (25 Einheiten/ml) und Strepto-

Ttiycin (25 дд/ті) bestand. Die durch schonendes Zerreiben erhaltenen dissoziierten Zellen wurden gesammelt und bei niedriger Drehzahl (500 ü/min) 30 Sekunden lang zentrifugiert. Die Zentrifugation wurde zweimal wiederholt, und dann wurden die Zellpellets wieder in serumhaltigem Medium suspendiert. Die Zellen wurden dann auf 6mm-Vertiefungen oder auf 35mm-Schalen ausgestrichen, die mit Polyornithin (10 дд/rnl) und Laminin (10дд/т1) beschichtet waren. In den meisten Versuchen wurden die Zellen mit geringer Dichte von ca. 71000 Zellen/cm² ausgestrichen. Fünf bis sechs Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen wurde das Medium gegen ein serumfreies Medium ausgetauscht, das 1% N3 und Penicillin-Streptomycin (25 Einheiten/ml bzw. 25 jug/ml) enthielt, und zu diesem Zeitpunkt wurde CNTF zugesetzt. Os^. Medium wurde alle drei bis vier Tage gewechselt, wobei der Faktor jeweils erneut zugesetzt wurde.

Um neuronenangereicherte Kulturen zu erhalten, wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden Arabinosid (Ara-C, 0,3 μΜ) zugesetzt. Unter solchen Bedingungen enthalten die Hippocampus-Kulturen nach immunohistochemischer Abschätzung durch GFAP (saures Gliafibrillenprotein) etwa 5-10% Gliazellen.

15,1.2. Test auf GAD-Enzymaktivität

Die GAD-Enzymaktivität wurde nach der Methode von Kimura und Kuriyama (1975, Jpn. J. Pharm. 25:189-195) durch Messung der Freisetzung von ¹⁴CO₂ aus L-[I-¹⁴C] Glutaminsäure bestimmt. Zellen auf 3 5 mm - Schalen wurden mit 3 0 μΐ einer Lösung lysiert, die 50 mM KH₂PO₄ (pH 7,2) und 0,25% Triton X-100 enthielt, lysiert, abgeschabt und gesammelt. Fünf Mikroliter des Zellysats wurden auf GAD-Enzymaktivität getestet. In einem typischen Test enthielt das Reaktionsgemisch 0,57 mM L-[I-¹⁴C] Glutaminsäure (NEN, NEC-715, 52,6 mCi/rcmol), Glutaminsäure (3 mM) , Pyridoxalphosphat (0,2 mM) und AET (1 mM) in einem KH₂PO₄-Puffer (50 mM, pH 7,2). Unter diesen Reaktionsbedingungen wurde festgestellt, daß die Enzymreaktion bis zu 2,5 Stunden linear war. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von 2 Stunden bei 37⁰C mit anschließender Injektion von 25 ml 8N H₂SO₄ in das Reaktionsgemisch. Dann wurde die Inkubation weitere 60 Minuten lang fortgesetzt. Das freigesetzte ¹⁴COo wurde in Hyamin-Grund-

lösung aufgefangen und gezählt.

15.1.3. Messung des Neurofilamentproteins

Die Mengenbestimmung des Neurofilamentproteins erfolgte nach der Methode von Doherty u.a. (1984, J. Neurochem. ,2:1115-1122), wie in Abschnitt 14.1.3. beschrieben.

15.1.4. Messung de · Aufnahme von GABA hoher Affinität

Die Aufnahme von GABA (Gamma-Aminobuttersäure)_hoher Affinität wurde unter Anwendung eines modifizierten Verfahrens von Tomozawa und Appel (1986, Brain Res. 399:111-124) gemessen. Die Zellen wurden in der GABA-Aufnahmepufferlösung gewaschen, die 140 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1 Wi KH₂PO₄I mM Na₃HPO₄, 6 mg/ml Glukose, 1 mM MgCl₂, 1 mm CaCl₂, 0,1% BSA enthielt. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit der GABA-Aufnahmepufferlösung 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. ³H-GABA (NEN, NET-191X, 111,4 Ci/mmol) wurde dann bei einer Endkonzentration von 12 nM zugesetzt und es wurde 10 Minuten lang bei 37⁰C inkubiert. Die Zellen wurden dann auf Eis gelagert und dreimal mit der Aufnahmepufferlösung gewaschen. Die Zellen wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 0,14 N NaOH inkubiert und das ³H-GABA im Extrakt wurde gezählt. Es ergab sich, daß die ³H-GABA-AUfnähme bis zu mindestens 30 Minuten linear war. Die Aufnahme von GABA in nichtneuronale Zellen wurde durch Zusatz von 2 mM B-Alanin inhibiert, während die neuronenspezifische Aufnahme durch Inhibition mit Nipecotinsäure bei 1 mM verifiziert wird.

15.1.5. Immunohistochemische Färbung für GAD oder GABA

Die Zellen wurden mit 4%-igem Paraformaldehyd 30 Minuten lang bei Raumtempertur fixiert und mit PBS gewaschen. Zur GAD-Färbung wurden die Zellen durch aufeinanderfolgendes Spülen mit 50%, 70% und 50% Ethanol permeabilisiert. Die Kulturen wurden blockiert, indem sie nacheinander mit PBS, das 5% normales Kaninchenserum enthielt, eine Stunde lang gespült und mit Schaf-Anti-Ziege-GÄD-Antikörper (Verdünnung 1:6000) über Nacht bei 4°C inkubiert wurden. Nach drsi Spülungen mit PBS wurden die Zellen dann mit biotinyliertem Kaninchen-Anti-Schaf-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:400 mindestens 90 Minuten lang bei Raumtemperatur

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inkubiert. Für die GABA-Färbung wurden die Zellen mit Triton X-100 (0,25%) in Tris-HCl (0,1M, pH 7,3) permeabilisiert und mit 10%-igem Ziegennormalserum 90 Minuten lang blockiert, gefolgt von einer Inkubation mit Kaninchen-Anti-GABA-Antikörper (1:5000) über Nacht bei 4⁰C. Nach drei Spülungen mit PBS wurden die Zellen dann mit biotinyliertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:200 mindestens 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. GAG- oder GABA-immunoreaktive Zellen wurden unter Verwendung des Vectastain ABC-Reagenziensatzes (Vector Labs) sichtbar gemacht,

15.1.6. Immunohistochemische Färbung für neuronenspezifische Enolase (NSE)

Nach Fixierung mit 4% Paraformaldehyd wurden die Zellen mit 10%-igem Ziegennormalserum (NGS) in PBS, das 0,1% Triton X-100 enthielt, blockiert. Die Zellen wurden dann mit dem primären Antikörper (Kaninchen-Anti-NSE, 1:5000) über Nacht bei 4 ⁰C inkubiert. Danach wurden die Zellen mit dem sekundären Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen, Verdünnung 1:200) mindestens 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. NSE-immunpositive Zellen wurden unter Verwendung des Vectastain ABC-Satzes (Vector Labs) sichtbar gemacht.

15.1.7. Histochemische Färbung für Calbindin

Die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült und mit 4% Paraformaldehyd 30 Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Waschen mit 1% Pferdenormalserum (MHS) und einstündigem Blockieren mit 5% NHS bei Raumtemperatur wurden die Zellen mit einem Maus-Anti-Calbindin-Antikörper (Verdünnung 1:1000) in 1% NHS über Nacht bei 4⁰C inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal mit 1% NHS gespült und mit dem sekundären Antikörper (Pferd-AntiMaus, Verdünnung 1:400) 90 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Immunoreaktive Zellen für Calbindin wurden unter Verwendung des Vectastain ABC-Satzes (Vector Labs) sichtbar gemacht.

15.1.8. Histochemische Färbung für Acetylcholinesterase

Die histochemische Färbung für Acetylcholinesterase wurde nach den Verfahren von Geneser - Jensen und Blackstadt (1971, Z.

Zellforsch. 114:460-481) durchgeführt. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 3G Minuten lang mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur fixiert. Die fixierten Zellen wurden dann mit einem Reaktionsgemisch inkubiert, das 50 mM Acetatpuffer (pH 5,0), 4 mM Acetylthiocholinjodid, 2 roM Kupf ersux^at, 10 mM Glycin und 10 дд/ті Gelatine enthielt. Unspezifische Cholinesterasen wurden durch Zugabe von 0,2 mM Ethopropazin zum Inkubationsmedium inhibiert. Die Spezifität der Cholinesterasefärbung wurde durch Zugabe von 5 μΜ Neostigmin verifiziert. Лт Ende der siebentägigen Inkubation wurde Gelatine durch, kurze Inkubation bei 37 ⁰C aufgelöst. Die Zellen wurden mit Wasser gewaschen, eine Minute lang mit 1,25% Na₂S behandelt und wieder mit Wasser gewaschen. Sie wurden dann 1 Minute lang mit 1% AgNO₃ behandelt und mit Wasser und PBS gewaschen.

15.1.9. Ziliarer neurotropher Faktor

Der in allen Tests verwendete CNTF war rekombinanter Ratten-CNTF, der entsprechend der Beschreibung im obigen Beispiel von Abschnitt 12 exprimiert und gereinigt wurde.

15.2. Ergebnisse

Als die Hippocampi im Entwicklungsalter von E8 entnommen und in Kultur gesetzt wurden, bestand die Neuronenpopulation zum größten Teil aus postmitotischen Pyramidenzellen. Fünf bis sechs Stunden nach dem Ausstreichen entwickelten die Neuronen schon Neuriten, und nach einem Tag in Kultur gab es Anzeichen für einen Kontakt von Zelle zu Zelle. Es zeigten sich phasenhelle Zellen mit langen Fortsätzen.

Hippocampus-Neuronen wurden in geringer Dichte (ca. 71000 Zellen/cm²) in Gegenwart oder Abwesenheit von CNTF über verschiedene Zeiträume kultiviert. Die kontinuierliche Behandlung von Hippocampus-Kulturen mit CNTF (10 ng/ml) bewirkte eine Zunahme der Fähigkeit der Zellen zur Aufnahme von ^H-GABA (Abb. 30) . Der CNTF-induzierte Anstieg der spezifischen GABA-Aufnahme erfolgte langsam, wie in Abb. 30 A gezeigt wird. Die CNTF-Behandlung (10 ng/ml) bewirkte eine geringe Zunahme der GABA-Aufnahme bis zum Tag 6, und eine maximale Zunahme um annähernd das Vierfache im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen

wurde 8 Tage nach der CNTF-Zugabe beobachtet. Eine längere Kulturdauer von bis zu 11 Tagen bewirkte keine stärkere Zunahme. Um den Effekt von CNTF auf Hippocampus-Neuronen in Kultur weiter abzuschätzen, wurde das Neurofilamentprotein unter Verwendung eines Antikörpers gegen Neurofilamentprotein (RT97), gefolgt von einem ELISA-Test, quantitativ bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Neurofilament-Menge bis zum Kulturtag 6 nur leicht zugenommen hatte und am Tag 8 die größte Zunahme um annähernd das Fünffache aufwies (Abb. 30B). Ein ähnlicher zeitlicher Verlauf sowohl bei der GABA-Aufnahme als auch beim Neurofilamentprotein wurde auch bei i ng/ml CNTF beobachtet.

Der Effekt von CNTF war offenbar dosisabhängig, wie in Abb. 31 dargestellt ist. Die spezifische neuronale GABA-Aufnahme war bei 0,01 ng/ml erhöht und erfuhr eine maximale Steigerung um annähernd das Dreifache in Zellen, die mit 0,1 ng/ml CNTF 8 Tage lang behandelt wurden (Abb. 31A). Höhere Konzentrationen bis zu 50 ng/ml CNTF führten nicht zu einer weiteren Steigerung der GABA-Aufnahme. In ähnlicher Weise nahm auch der Neurofilament-Gehalt in CNTF-behandelten Kulturen in dosisabhängiger Weise zu und erreichte ein Plateau bei 0,1 ng/ml CNTF (Abb. 31B). Höhere Konzentrationen bis zu 50 ng/ml CNTF bewirkten keine weitere Zunahme der Neurofilament-Proteinmenge.

Als ein weiterer Weg zur Untersuchung des Effekts von CNTF auf GABA-erge Neuronen wurde die GAD-Enzymaktivität in Kulturen gemessen, die in Gegenwart von CNTF 8 Tage lang inkubiert wurden. Es wurde festgestellt, daß CNTF in dosisabhängiger Weise eine Steigerung der GAD-Enzymaktivität in Hippocampus-Neuronen bewirkte (Abb. 31C). Die Form der erhaltenen Dosis-Wirkungs-Kurve ist ähnlich derjenigen, die für die GABA-Aufnahme und das Neurofilament-Protein beobachtet wurde. Eine maximale Zunahme der GAD-Enzymaktivität um das 3,8-fache wurde bei 0,1 ng/ml CNTF beobachtet.

Um zu untersuchen, ob der Effekt von CNTF auf die GAD-Enzymaktivität einer Induktion in der Enzymaktivität oder einem überlebensfördernden Effekt auf GABA-erge Neuronen zuzuschreiben war, wurde die Anzahl der GAD-immunoreaktiven Neuronen in Zellen bestimmt, die in Gegenwart bzw. in Abwesenheit von CNTF kulti-

viert worden waren. Bei einer Konzentration von 10 ng/ml erhöhte CNTF die Zahl der NSE- und GAD-positiven Neuronen um das 2,2- bzw. 2,3-fache (Abb. 32A). Die immunohistochemische Färbung unter Verwendung eines Antikörpers gegen GABA lieferte ähnliche Ergebnisse (Abb. 33A). Calbindin wurde in einer Teilpopulation von Hippocampus-Neuronen lokalisiert, die Gyrus dentatus, CAl-Pyramidenzellen und gewisse Interneuronen enthielt (Balmbridge und Miller, 1982, Brain Res. 245:223-229). Die CNTF-Behandlung (10 ng/ml) von Hippocampus-Kulturen geringer Dichte führte zu einer Zunahme der calbindin-immunopositiven Zellen um das Dreifache (Abb. 32B) . Nach 8 Tagen in Kultur war die Zahl der acetylcholinesterase-positiven Zellen in CNTF-behandelten Kulturen gegenüber Kontrollkulturen ebenfalls um annähernd das 17-fache erhöht (Abb. 33B).

Um weitere Nachweise dafür zu erbringen, daß CNTF als Überlebensfaktor zur Erhaltung von GABA-ergen Zellen in Kultur wirkte, statt die Induktion des GABA-ergen phänotypischen Merkmals zu bewirken, wurden Versuche mit verzögerter Zugabe durchgeführt. CNTF (10 ng/ml) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Ausstreichen zugesetzt und die GABA-Aufnahme bzw. die Neurofilament-Proteinwerte wurden am achten Tag in Kultur gemessen. Wie in Abb. 34A dargestellt, verringerte sich, wenn die CNTF-Zugabe um einen Tag verzögert wurde, bei einem 7 Tage später durchgeführten Test die CNTF-induzierte Steigerung der GABA-Aufnahme. Wenn die CNTF-Zugabe am dritten Tag nach dem Ausstreichen erfolgte, bewirkte CNTF keine Steigerung der GABA-Aufnahme mehr. Die CNTF-induzierte Erhöhung des Gehalts an Neurofilament-Protein wurde in ähnlicher Weise verringert, wenn die Zugabe von CNTF um 3 Tage verzögert wurde (Abb. 35A) . Um die Möglichkeit auszuschließen, daß diese Beobachtung auf eine ungenügende Exponierungsdauer gegenüber dem Faktor zurückzuführen war, wurde der folgende Versuch durchgeführt. CNTF (10 ng/ml) wurde den Zellen am dritten Tag in Kultur zugesetzc und die Zellen wurden mit dem Faktor 8 Tage lang bis zur Messung der GABA-Aufnahme und des Neurofilament-Proteins behandelt. Unter diesen Bedingungen induzierte CNTF keine Steigerung der GABA-Aufnahme und der Effekt auf das Neurofilament-Protein war stark reduziert (Abb. 34B, 35B)«

Es ist gezeigt worden, daß Astrozyten eine reiche Quelle für eine Reihe neurotropher Faktoren sind, einschließlich NGF. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß der Effekt von CNTF über die Freisetzung solcher Faktoren aus Gliazellen zustandekam, statt direkt auf die Neuronen zu wirken, wurde die CNTF-induzierte Steigerung der GABA-Aufnahme in neuronenangereicherten Kulturen untersucht. Wie in Abb. 36 dargestellt, bewirkte CNTF in AraC-behandelten Kulturen eine 2,4-fache Steigerung der GABA-Aufnahme im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen. Die Stimulation der GABA-Aufnahme war in gemischten Neuronen-Gliazellen-Kulturen (-AraC) bzw. in neuronenangereicherten Kulturen (+AraC) ähnlich. Außerdem war die Dosis-Wirkungs-Kurve für CNTF in AraC-behandelten Kulturen insofern leicht nach links verschoben, als die für eine maximale Wirkung erforderliche CNTF-Konzentration niedriger war (0,03 ng/ml im Vergleich zu 0,1 ng/ml).

Der Effekt von CNTF auf GABA-erge Neuronen war von der Dichte abhängig, mit der die Zellen ausgestrichen wurden. Bei einer niedrigen Ausstreichdichte von 71000 Zellen/cm² bewirkte CNTF (10 ng/ml) eine annähernd 2,6-fache Steigerung der GABA-Aufnahme (Abb. 37A). Bei höherer Ansstreichdichte (143000 Zellen/cm²) induzierte CNTF keine signifikante Zunahme der GABA-Aufnahme bei einer Sättigungskonzentration (10 ng/ml). Der Effekt von CNTF auf die Konzentration von Neurofilament-Protein war in ähnlicher Weise abhängig von der Zelldichte (Abb. 37B). Dies kann auf eine erhöhte Konzentration neurotropher Faktoren in Kulturen mit hoher Dichte zurückzuführen sein. Es ist früher gezeigt worden, daß Hippocampus-Neuronen in Kultur empfindlich gegen Glutamat-Neurotoxizität sind (Mattson, M.P., u.a., 1988, J. Neurosci. 8:20876-2100). Wir haben die neurotoxischen Effekte verschiedener Glutamatkonzentrationen (10-ΙΟΟΟμΜ) mittels eines kolorimetrischen MTT-Tests abgeschätzt, wie in Abb. 38 dargestellt. Eine Konzentration von 1 mM Glutamat reduzierte die Überlebensrate der Zellen auf ca. 10%. In Gegenwart von CNTF (ІОмд/ml) wurde die Überlebensrate der Zellen nach der Glutamat-Exponierung erhöht.

15.3. Diskussion

Es ist gezeigt worden, daß CNTF die Überlebensrate und das Wachstum verschiedener Neuronenpopulationen in Kultur erhöht. Außerdem ist gezeigt worden, daß eine CNTF-artige Aktivität die Differenzierung von Astrozyten des Typs 2 aus Glia-Vorlä'uferzellen in Kultur induziert (Hughes u.a., 1988, Nature 335:70-73; Linien u.a., 1988, Neuron 1:485-494). Wir haben Beweise für einen neuartigen Effekt von CNTF im Zentralnervensystem erbracht, d.h. CNTF fördert das Überleben von aus E18-Hippocampus isolierten Neuronen in vitro. Die Behandlung von fiippocampus-Neuronen mit CNTF führt zu einer Steigerung der GABA-Aufnähme, die von einer Erhöhung der GAD-Enzymaktivität begleitet wird. Die Neurofilament-Proteinwerte der Hippoceanpus-Kulturen waren in ähnlicher Weise in Gegenwart von CNTF erhöht. Dosis-Wirkungs-Untersuchungen zeigen eine Korrelation zwischen diesen verschiedenen Merkmalen, und ein maximaler Effekt von CNTF wurde bei 0,1 ng/ml CNTF erreicht. Höhere CNTF-Konzentrationen bewirkten offenbar keinen größeren Effekt.

Der Effekt von CNTF könnte durch selektive Induktion GABA-erger phänotypischer Merkmale erklärt werden. Die Ergebnisse der verzögerten Zugabe sprechen jedoch nachdrücklich für eine überlebensfördernde Wirkung von CNTF. Wir fanden, daß bei einer Verzögerung der CNTF-Zugabe um drei Tage der Faktor seine Wirkung auf die GABA-ergen Zellen nicht mehr ausüben konnte. Obwohl die Neurofilament-Proteinwerte immer noch signifikant erhöht waren, ist der Effekt viel geringer als derjenige, der bei Zugabe von CNTF am Tag 0 beobachtet wird.

Die dichteabhängigon Effekte von CNTF zeigen, daß bei hoher Dichte die Zellen anscheinend keinen CNTF zum Überleben benötigten. Dies könnte auf die lokale Freisetzung endogener neurotropher Faktoren aus Neuronen oder Astrozyten zurückzuführen sein, oder auf Zelle-Zelle-Wechselwirkungen. Es ist gezeigt worden, daß die Überlebensrate von Hippocampus-Neuronen in Gegenwart von Astrozyten erhöht wird (Banker und Cowan, 1977, Brain Res. 126:397-425). Es ist möglich, daß der beteiligte Faktor CNTF oder ein Mitglied der neurotrophen Familie ist. In neuronenangereicherten Kulturen wurde der Effekt von CNTF auf die GABA-Auf-

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nähme und den Neurofilament-Proteingehalt nicht beeinflußt. Die Daten sprechen stark gegen eine Rolle von Astrozyten bei der Wirkung von CNTF und lassen vermuten, daß der Effekt über eine direkte Wirkung auf die Neuronen vermittelt wird. Unter Verwendung eines myc-markierten CNTF-Liganden und eine^s Antikörpers gegen myc haben wir den Beweise für das Vorhandensein ei пел Rezeptors für CNTF an den Neuronen erbracht.

Die überlebensfördernde Wirkung von CNTF auf Hippocampus-Neuronen wai* offenbar nicht auf GABA-erge Neuronen beschränkt. Wir haben Beweise dafür, daß die Anzahl der acetylcholinesterase -immunopositiven Zellen ebenfalls in Gegenwart von CNTF erhöht wird. Die Intensität der histochemischen AchE-Färbung war in CNTF-behandelten Kulturen viel stärker ausgeprägt. Dies kann wichtige Folgen für die mögliche Rolle von CNTF als eines retrograden Überlebens- und Differenzierungsfaktors für die cholinergen Neuronen im medialen Septum haben.

Die Expression zweier allgemeiner Merkmale des neuronalen Phänotyps, NSE und NF, wurde in Gegenwart von CNTF verstärkt. Die Messung der NF-Protein-Akkumulation wurde unter Anwendung einer enzymverbundenen Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) durchgeführt. Der verwendete monoklonale Antikörper (RT97) erkannte überwiegend die 200kDa-Form des NF-Proteintripletts und in geringerem Maße die 150 kDa-Untereinheit. Es ist schon früher gezeigt worden, daß der Bindungsgrad von RT97 als willkürlicher Index des Neuritenauswuchses, insbesondere des axonalen Auswuchses bei kultivierten Neuronen dienen könnte (Doherty u.a., 1984, Neurosci. Lett. 51:55-60). Acht Tage alte Hippocampus-Kulturen, die mit CNTF gehalten wurden, zeigten ein dichteres und komplexeres Netz von Auswüchsen. Diese Zunahme der relativen Menge an NF-Protein könnte einfach sekundär zur verbesserten Überlebensrate der Neuronen auftreten. Im anderen Falle kann CNTF eine selektive Wirkung auf die Induktion des Neuritenauswuchses haben.

Die Spezifität der überlebensfördernden Wirkung von CNTF wurde durch die Untersuchung der Wirkungen anderer neurotropher Faktoren angesprochen, von denen man weiß, daß sie in Hippocampus vorhanden sind (Maisonpierre u.a., 1990, Science 247:1446-

1451). In Übereinstimmung mit der früheren Beobachtung, daß NGF kein Überlebensfaktor für Hippocampus-Neuronen ist, konnten wir keinerlei Effekt von NGF auf GABA-erge Neuronen nachweisen. Ein weiteres Mitglied der neurotrophen Familie, BDNF, scheint ebenfalls das Überleben GABA-erger Neuronen in Kultur nicht zu fördern. Andererseits ist gezeigt worden, daß bFGF ein wichtiger Überlebensf. ktor im Hippocampus ist (Wallicke u.a., 1986, PNAS USA 83:3012-3016), woraus geschlossen wurde, daß er als neurotropher Faktor im ZNS wirkt (Morrison u.a., 1986, PNAS USA 83:7537-7541; Anderson u.a., 1988, Nature 332:360-361). Ähnlich wie bFGF ist CNTF bei sehr niedrigen Konzentrationen wirksam.

Es ist gezeigt worden, daß der Hippocampus durch mehrere neurodegenerative Störungen beeinflußt wird, einschließlich der Alzheimerschen Krankheit. Die zugrundeliegenden Mechanismen, die zur selektiven Degeneration der Hippocampusfunktion führen, sind noch unklar. Es wurde die Hypothese aufgestellt, daß der erregende Aminosäureneurotransmitter Glutamat u.U. eine Rolle im Krankheitsprozeß spielt. Der Nachweis, daß CNTF das Überleben von Hippocampus-Neuronen in vitro fördern kann, kann eine wichtige Auswirkung bei der Gestaltung therapeutisrher Verfahren für die neurodegenerativen Krankheiten haben. Es wird wichtig sein festzustellen, ob CNTF Hippocampus-Neuronen gegen Glutamat-Neurotoxizität schützen kann, wie dies für FGF beobachtet wurde (Mattson u.a., 1986, PNAS 83:7537-7541). Die Messenger-RNA für CNTF ist kürzlich im Hippocampus durch Northern blot - Analyse nachgewiesen worden (Masiowski, persönliche Mitteilung). Die Zelltyp-Spezif ität der CNTF-Synthese in vivo ist noch nicht ermittelt worden. Die physiologische Rolle von CNTF im Hippocampus während der Entwicklung in vivo bleibt noch nachzuweisen, aber angesichts der vorliegenden Befunde kann CNTF ein endogener neurotropher Faktor sein, der möglicherweise eine Rolle bei der Regulierung des Überlebens von Neuronen im Hippocampus spielt.

16. Beispiel: Ratten-ChTF erhöht die Vermehrungsrate von Ratten-

Hippocampus-Astrozyten in Kultur

16.1. Materialien und Methoden

16.1.1. Präparation von Astrozyten aus dem Ratten-Hippocampus

Hippocampi wurden aus ElS-Rattenembryonen präpariert und in FlO-Medium (GIBCO) gesammelt, das 24 mM HEPES enthielt. Die Gewebe wurden in kleine Stücke zerschnitten und mit 0,25% Trypsin (13 Hippocampi/5 ml 0,25% Trypsin) 20 Minuten lang bei 37°C trypsiniert. DNAase wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml weitere 10 Minuten lang zugesetzt. Die Reaktion wurde mit einem gleichen Volumen DME gestoppt, das mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt wurde, und die Gewebe wurden zweimal gewaschen.

Die durch schonendes Zerreiben erhaltenen dissoziierten Zellen wurden in DME/FCS gesammelt und die Suspension wurde durch ein 20mm Nitex-Sieb (Tetko) passiert, um Materialstücken zu entfernen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Trypanblau-Ausschluß bestimmt. Die Zellen wurden dann mit einer Dichte von 4,82 χ 10⁶ Zellen/Kolben in T75-Gewebekultur-Kunststoffkolben ausgestrichen. Das Medium wurde am 1., 3., 5. und 7. Tag nach dem Ausstreichen gegen DME-FCS ausgewechselt. Nach dem 7. und dem 9. Tag wurden die Kolben von Hand geschüttelt, um Oligodendrozyten und überlebende Neuronen zu entfernen. Am 10. Tag wurden die Astrozyten mit 0,25% Trypsin entnommen und zum Test auf Platten mit 96 Wells (=Reaktionsvertiefungen) ausgestrichen.

16.1.2. CNTF-Mitosetests an Rattenhippocampus-Astrozyten

Für die Mitosetests wurden die Astrozyten mit einer Dichte von 16000 Zellen/Reaktionsvertiefung in einem Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum enthielt, ausgestrichen und 4 Stunden lang zum Anhaften stehengelassen. Die Zellen wurden dann gespült und es wurden 150 μΐ definiertes Medium (DMEM, 0,5% BSA) zugesetzt. Rekombinanter Ratten-CNTF, hergestellt wie im obigen Abschnitt 7. beschrieben, wurde zugesetzt und die Mischung 24 Stunden lang inkubiert. Die Markierung der Zellen erfolgte während der letzten 2 Stunden der 24-stündigen Inkubationszeit mit l цС ³H-Thymidin pro Reaktionsvertiefung (NEN, 20 Ci/mM).

23&4ЭЗ

Nach der Inkubation wurden die Zellen wie folgt verarbeitet: Die Vertiefungen wurden zweimal mit PBS gewaschen und über Nacht bei 4° in 50 ml 10% Trichloressigsäure (TCA) inkubiert. Nach dem Entfernen der TCA wurden die Zellen in kaltem Wasser gewaschen, in 100 μΐ 1 N NaOH solubil.isiert und in einem Flüssigkeitsszintillationszähler in 10 ml Hydrosol gezählt.

16.1.3. (H^I) CNTF-Bindungstest

Hippocampus-Astrozyten wurden in 37 mm²-Schalfη kultiviert, bis sie zu ca. 80-90% zusammengewachsen waren. Die einlagigen Astrozytenschichten wurden zunächst zweimal (2 ml) in Hamschem Medium F-12 gespült. Dann wurde Hamsches Medium F-12 augesetzt und die Zellen wurden auf Eis 15 Minuten lang inkubiert. Das Medium wurde dann durch ein gleiches Volumen Hamsches Medium ersetzt. In den Vertiefungen, die zur Bestimmung der nichtkompetitiven Bindung dienen sollten, wurde CNTF (100-facher Überschuß an nichtmarkiertem CNTF) zugesetzt und die Kulturen wurden weitere 60 Minuten lang bei 4°C inkubiert. ¹²⁵I-CNTF (präpariert unter Verwendung von Bolton-Hunter-Reagens, 10 μΐ, mit ca. 280000 dpm bei 112 дСі pro Nanomol) wurde jeder Kultur zugesetzt und die Inkubation wurde bei 4 ⁰C über verschiedene Zeitspannen bis zu 60 Minuten fortgesetzt. Der nicht gebundene CNTF wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen (je 2 ml) mit kaltem PBS entfernt, das 10 mg/ml BSA enthielt. Dann wurden die Zellen solubilisiert, indem die Kulturen mindestens 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 0,5 ml 20 mM Tris-HCl, pH 7,2; 0,15 M NaCl; 1% Triton; 0,1% SDS, 1% Desoxycholat inkubiert wurden. Die Zellysate wurden entfernt und die Kulturen wurden zweimal mit (je 250 ßl) PBS gespült, das 10 μΐ/ml BSA enthielt. Die Spülflüssigkeiten wurden zusammen mit den Z^.llysaten gesammelt und mit einem Gammazählrohr gezählt.

16.2. Ergebnisse

Die in Abb. 39 dargestellten Ergebnisse des Vermehrungstests zeigen eine zweiphasige Dosis-Wirkungs-Kurve mit ansteigenden CNTF-Konzentrationen auf Rattenhippocampus-Astrozyten. CNTF bewirkt eine Zunahme des Einbaus von ³H-Thymidin bis zu einer Dosis von 0,01 ng/ml. Bei Konzentrationen über 0,lng/ml verliert CNTF seine Fähigkeit zur Stimulation der Zellvermehrung.

Die '· Jj.ocjisehe Reaktion von Astrozyten auf CNTF zeigt, daß diese r'.iiien funktionelle CNTF-Rezeptoren tragen. Zwei zusätzliche Aussagen erhärten den ursprünglichen Befund, daß Astrozyten vom Typ 1 an ihrer Zelloberfläche CNTF-Rezeptoren exprimieren.. Bindungsexperimente mit (¹²⁵I CNTF an einlagigen Kulturen ergaben kompatible Ligand-Rezeptor-Stellen; die beobachtete maximale spezifische Bindung von ¹²⁵I-CNTF belief sich auf etwa 1% des gesamten, jeder Kultur zugesetzten CNTF. Weiterhin zeigte die Northern blot - Analyse, daß CNTF in hohem Maße die Expression des unmittelbaren frühen Gens c-fos induzierte. Die stärkste roRNA-Induktion wurde innerhalb einer Stunde beobachtet, und die Rückkehr zu normalen Basiswerten erfolgte innerhalb yon zwei Stunden.

17. Beispiel: Neue monoklonale Antikörper gegen den ziliaren neurotrophen Faktor und ein Zwei-Antikörper Sandwichtest für den menschlichen ziliaren neurotrophen Faktor

17.1. Materialien und Methoden

17.1.1. Erzeugung monoklonaler Antikörper gegen den ziliaren neurotrophen Faktor

17.1.1.1. Immunisierunqsprotokoll

Weibliche CBöFlJ-Mäuse wurden mit 10 bis 4 0 ßq rekombinantem Human-CNTF (präpariert entsprechend der Beschreibung in Beispiel 12) in vollständigem Freundschem Adjuvans geimpft und dann mit rCNTF in vollständigem Freundschem Adjuvans alle drei Wochen bis zu etwa 6 Monaten nachgeimpft.

17.1.1.2. Hybridombildunq

Milzzellen aus immunisierten Mäusen wurden mit SP2/0-Myelomzellen in einem Verhältnis von 2:1 (LymphozytenrMyelomzellen) unter Verwendung von PEG 4000 fusioniert und dann in vollständigem RPMI mit 2% HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) bei einer Zelldichte von ca. 10⁵ T,ymphozyten pro Reaktionsvertiefung zur Selektion von Hybridomen kultiviert.

17.1.1.3. Auswahl von Hybridomen nach CNTF-Reaktivität

Antikörper, die mit Human-CNTF (hCNTF) reaktionsfähig waren, wurden zunächst durch enzymverbundene Immunoadsorptionsbestiminung (ELISA) mit rekombinantem, an Plastiktestschalen gebundenem CNTF identifiziert. Die Antikörper wurden weiter durch ELISA und Western Immunblotting nach ihrer Reaktionsfähigkeit mit rekombinantem Ratten-CNTF (rCNTF) und veränderten Formen von hCNTF charakterisiert, wie weiter unten beschrieben wird.

17.1.2. Präparation von Human-CNTF-Varianten

Abweichende Formen von Human-CNTF wurden durch Expression und Reinigung der in Abschnitt 13.1.2. beschriebenen Vektoren erzeugt. Kurz gesagt, wurde die Humar-CNTF-Proteinvariante #112 durch Expression des Vektors pRPN112 gewonnen; ihr fehlen die 55 Aminosäurereste am C-terminalen Ende des Human-CNTF. Protein #49 wurde unter Verwendung von pRPN59 erzeugt, und ihm fehlen die 15 Aminosäuren am C-terminalen Ende von hCNTF. Protein #82 ist ein Fusionsprotein, in dem die ersten 66 Aminosäuren von Human-CNTF fehlen und das restliche Molekül mit einem nichtidentifizierten Humanprotein fusioniert ist (Abb. 22) .

17.1.3. Methoden für den 2-Stellen Immuntest

Um die CNTF-Menge in biologischen Materialproben zu bestimmen, wäre es vorteilhaft, einen Immuntest für das Protein zu entwickeln. Ein empfindlicher und zweckmäßiger Immuntest ist die Zwei-Antikörper-Sandwich-Methode [siehe z.B. E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Antikörper: Ein Laborhandbuch), 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 578-583]. Bei dieser Methode wird ein erster Antikörper an einen festen Träger gebunden und dann mit einer Lösung zur Reaktion gebracht, die das interessierende Antigen enthält; ein zweiter Antikörper, gewöhnlich gegen ein anderes Epitop des Antigens, wird dann zur Reaktion mit dem an den ersten Antikörper gebundenen Antigen gebracht, und die Menge des gebundenen zweiten Antikörpers (die direkt proportional zur Menge des gebundenen Antigens sein sollte) wird quantitativ bestimmt. In einer Ausführungsform dieser Methode sind sowohl der erste als auch der zweite Antikörper monoklonale Antikörper.

Der für Human-CNTF entwickelte Zwei-Stellen-Test ist schematisch in Abb. 40 dargestellt. Im wesentlichen wurde ein mittels Affinitätschromatographie gereinigter, für eine Unterklasse des Maus-Immunglobulins G (im dargestellten Fall IgG2b) spezifischer sekundärer Antikörper an einer Testplatte adsorbiert und zum Einfang des ersten monoklonalen Antikörpers RP3-12, ein Maus-IgG2b) aus verbrauchtem Kultur-Überstand von Hybridomzellen verwendet. Dann wurde Human-CNTF zugesetzt und seine Bindung an den ersten monoklonalen Antikörper abgewartet. Danach wurde der zweite monoklonale Anti-CNTF-Antikörper einer anderen Unterklasse des ersten (RP12-2, ein Maus-lgGl) zugesetzt, wiederum aus unfraktionierten Überständen der Hybridomkultur, und seine Bindung an irgendein von dem ersten monoklonalen Antikörper eingefangenen CNTF abgewartet. Alle gebundenen RP12-2-Moleküle wurden dann unter Verwendung eines durch Affinitätschromatographie gereinigten, für Meius-IgGl spezifischen, zu alkalischer Phosphatase konjugierten sekundären Antikörpers nachgewiesen, gefolgt von einer Inkubation mit dem Phosphatasesubstrat Paranitrophenylphosphat, durch dessen Aufspaltung ein farbiges Reaktionsprodukt erzeugt wird (gemessen durch Absorptionsvermögen bei 4 05 nm).

17.2. Ergebnisse und Diskussion

Monoklonale Antikörper der durch RP3-12 und RP3-17 repräsentierten Klasse wurden aus dem gleichen Fusionsexperiment unter Verwendung von Splenozyten aus einer tinzigen immunisierten Maus erzeugt. Sovohl RP3--12 als auch RP3-17 reagierten mit keiner der beiden C-torminalen Deletionsmutanten des getesteten hCNTF und gehen auch keine Bindung mit Ratten-CNTF ein, wie in Tabelle V gezeigt. Sie reagieren jedoch mit dem Fusionsprotein #82, in dem das C-törminale Ende von hCNTF erhalten bleibt. Somit erkennen diese Antikörper ein Epitop (oder eng benachbarte Epitope) in der Nähe des C-terminalen Endes von hCNTF, das innerhalb des Segments der im hCNTF-Protein #59 deletierten 15 C-terminalen Aminosäurereste liegt oder dieses Segment überlappt. Im Gegensatz dazu reagieren die monoklonalen Antikörper RP12-2 und RP12-9 sowohl mit dem hCNTF-Protein #59 als auch mit dem hCNTF-Protein #112 sowie auch dem Fusionsprotein #32. Diese beiden Antikörper müssen daher Epitope erkennen, die annähernd zwischen

den Aminosäureresten 66 und 145 von hCNTF liegen. Die Kartierungsdaten zeigen somit, daß die von RP12-2 und RP12-9 erkannten Epitope zumindest etwa 40 Aminosäurereste in 5'-Richtung von denjenigen liegen müssen, die von RP3-12 bzw. RP3-17 erkannt werden (Abb. 22). Die Antikörper RP12-2 und RP12-9 unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit zur Erkennung verschiedener Epitope, deren eines (das von RP12-9 erkannte) wahrscheinlich zwischen Nagern und Primaten gut erhalten bleibt. Die Fähigkeit all dieser monoklonalen Antikörper zur Bindung an denaturierten CNTF in einem Western Immunblotting-Test läßt darauf schließen, daß sie einfache Epitope erkennen, die, statt aus Konformationsepitopen, aus zusammenhängenden oder in sehr geringen Abständen angeordneten Aminosäureresten bestehen.

Es wurden erste Experimente ausgeführt, um festzustellen, ob Paare der monoklonalen Antikörper gegen hCNTF für die Entwicklung eines Zwei-Antikörper-Sandwichs für diesen Liganden geeignet waren. Ein Test wurde entwickelt, uir. die Antikörper in einem frühen Stadium vor der Großproduktion oder -reinigung der Reagenzien zu beurteilen, indem unterklassenspezifische Anti-Maus-Immunglobulin-Reagenzien zur Immobilisierung eines monoklonalen Antikörpers auf einem festen Träger ausgenutzt wurden, und den zweiten monoklonalen "Reporter"-Antikörper differentiell nachzuweisen. Wegen der Forderung, daß die beiden monoklonalen Antikörpern verschiedenen Unterklassen angehören müssen, konnten nur gewisse Paare monoklonaler Antikörper auf diese Weise beurteilt werden. Ausgezeichnete Ergebnisse wurden mit dem Paar RP3-12 und RP12-2 in dem beschriebenen Zwei-Stellen-Immuntests erhalten. Abb. 41 zeigt die Ergebnisse des Zwei-Antikörper-Sandwichtests bei einer Titration mit (jeweils um den Faktor Zwei) zunehmenden Mengen des rekombinantom Human-CNTF, von 7,8 Picogramm pro Test (50 μΐ bei 0,156 ng/ml) bis zu 500 Picogramm pro Test (50 μΐ bei 10,0 ng/ml). Ein überzeugendes Signal über dem Untergrund (0,044 ± 0,010 Extinktionseinheiten) war bei 15,6 Pikogramm Human-CNTF nachweisbar, und der Test war bis zum höchsten geprüften Wert linear. Durch Einsetzen irrelevanter Maus-Myelomproteine der entsprechenden Unterklasse für einen oder den anderen monoklonalen Antikörper (MOPC-141, ein IgG2b, anstelle von RP3-12; oder MOPC-21, ein IgGl, anstelle von RP12-2) verringerte sich das Signal auf Untergrundwerte..

So konnte selbst bei Verwendung ungereinigter Kultur-Überstände e' . ausgezeichneter Zwei-Antikörper-Test für Human-CNTF mit den monoklonalen Antikörpern RP3-12 und RP12-1 demonstriert werden. Diese monoklonalen Antikörper lassen sich nach herkömmlichen Verfahren durch Reinigung aus Überständen von Hybridomzellen, die in serumfreiem Medium kultiviert werden, gewinnen. Es ist abzusehen, daß sich in ganz unkomplizierter Weise ein einfacherer Sandwichtest entwickeln läßt, bei dem ein monoklonaler Antikörper direkt an einen festen Träger gebunden werden kann, während der zweite monoklonale Antikörper direkt zu einem Reporter konjugiert ist (z.B. einem Radioisotop wie ^χζ .Jod oder einem Enzym wie alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase oder ß-Galactosidase; oder einem Hapten wie Biotin, das unter Verv/endung von markiertem Avidin oder Streptavidin nachgewiesen werden kann), wodurch die Notwendigkeit typspezifischer sekundärer Antikörper entfällt.

Der hier beschriebene hochspezifische, empfindliche Antikörper-Sandwichtest findet Anwendung in vielen Situationen, in denen die guantitative Bestimmung der Gegenwart von Human-CNTF wünschenswert ist. Beispielsweise kann er zur Überwachung von Human-CNTF bei Reinigungsprozeduren eingesetzt werden. In ähnlicher Weise kann der Test zur Kontrolle von CNTF nach der Impfung von Versuchstieren angewendet werden, um die Gewebe festzustellen, in denen er sich konzentriert. Schließlich läßt sich der Test zur Bestimmung der CNTF-Werte in menschlichen Geweben und/oder Körperflüssigkeiten (z.B. in Serum oder Zerebrospinalflüssigkeit) bei gesunden und kranken Individuen verwenden. Da CNTF intrazellulär in Nerven zu finden ist und eine neurotrophe Aktivität aufweist, ist die Ansicht geäußert worden, daß das Protein als Reaktion auf verschiedene Arten von Nervenverletzungen oder -krankheiten freigesetzt werden könnte. So könnte die Konzentration von CNTF in entsprechenden extrazellulären Flüssigkeiten ein quantitatives diagnostisches Maß für Zustände wie Neuropathie und neuronale Degeneration bieten.

Tabelle V

Reaktivität monoklonaler Antikörper gegenüber Human-CNTF, Human-CNTF-Deletionsmutanten und Ratten-CNTF

Klon	Unter-	hCNTF	ELISA	Western	Blotting
RP3-12	IgG2b ++	hCNTF (59)	hCNTF rCNTF hCNTF (59)	hCNTF (112) rCNTF
RP3-17	IgG2a ++	—	++	—
RP12-2	IgGl ++	—	++	—
RP12-9	IgGl ++	++	++ +-l·	++
++	+4- ++ ++

18. Beispiel: Ziliarer neurotropher Faktor fördert Überleben spinaler Motorneuronen in Kultur

18.1. Materialien und Methoden 18.1.1. Gewebekulturverfahren

Motorneuronenstränge wurden unter einem Stereomikroskop aus dem Lumbaiteil des Rückenmarks von Kükenembryonen am 6. Tag der Embryonalentwicklung ausgeschnitten und in kalter kalzium- und magnesiumfreier ausgeglichener Hanksscher Salzlösung, die mit Glucose (4g/l) ergänzt war (HBSS), gelagert. Die Gewebe wurden mit HBSS gewaschen und mit 0,33% Trypsin in HBSS 20 Minuten lang bei 37⁰C unter leichtem Schütteln behandelt, mit kaltem HBSS gespült und schonend in drei Schritten mit je 8 Rührdurchgängen in 1 ml kaltem 0,1% Sojatrypsin-Inhibitor (Sigma) in HBSS durch eine feuerpol arte sili.konisierte Pasteur-Pipette zerrieben. Jede überstehende Zellsuspenaion wurde durch ein 50 дт-КуіопвіеЬ passiert, gesammelt und in einem silikoniesierten konischen Glasröhrchen über -\ ml kaltes 6,8% Metrizamid (Fluka) in HBSS-25 mM HEPES (pH 7,4) geschichtet. Das Röhrchen wurde 15 Minuten lang mit 400 g bei 4⁰C zentrifugiert und die Zwischenschicht (0,5 ml) wurde in ein anderes silikonisiertes Röhrchen gesammelt, das 6,5 ml kaltes Kulturmedium enthielt (eine Mischung aus mit Glucose (4 g/l) ergänztem Leibovitzschem L-15-Medium (Gibco), 0,15 M Natriumbicarbonat, hitzeinaktiviertem und gefil-

tertem Pferdeserum und Penicillin G (10⁵ Einheiten/ml) im Verhältnis von 75 : 15 : 10 : 0,1, frisch angesetzt und mit 5% CC>2 gepuffert) . Nach 7-minütiger Zentrifugation mit 100 g bei 4⁰C wurde der Überstand entfernt und die Zellen wurden schonend wieder im Kulturmedium aufgeschwemmt und mit einer Dichte von 1000 - 2000 Zellen/Vertiefung in Greinersche Kulturschalen mit 4 Reaktionsvertiefungen ausgestrichen (Vertiefungsdurchmesser 10 mm; CA. Greiner und Söhne GmbH Nürtingen, Westdeutschland) . Die Schalen waren mit Poly-DL-ornithin (Sigma, 0,5 mg in 0,15 M Natriumboratpuffer (pH 8,3)) vorbeschichtet und über Nacht bei 4⁰C stehengelassen worden, zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gespült, anschließend mit Laminin (Gibco; 10 Aig/ml im serumverarmten Kulturmedium) überzogen und bis zum Ausstreichen der Zellen in einen Inkubator mit 5% CO₂ gesvellt worden (5 - 6 Stunden). Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37⁰C in 5% CO₂ / 95% Luft inkubiert. Eine Stunde nach dem Ausstreichen wurden die Proben zugesetzt und das Kulturmedium wurde nach 24 h und 72 h gewechselt. Die anfängliche Zellenzahl wurde 3 h nach dem Ausstreichen gezählt.

18.1.2. Retrograde Markierung der Motorneuronen und Abschätzung der Reinheit der Motorneuronenkultur

In einigen Experimenten wurden die Motorneuronen vor der Präparation der Zellen retrograd mit einem Fluoreszenzfarbstoff in vivo markiert (U. Dohrinan u.a., 1986, Dev. Biol. 118:209-221), um die Motorneuroner. -Zellpopulation zu identifizieren. In die Schale von 5 Tage lang bebrüteten Eiern wurden kleine Löcher gebohrt. Kleine Rhodaminisothiocyanat-Kristallstückchen (Sigma) wurden an zwei oder drei Stellen in jeden Hinterschenkel (des Kükenembryos) eingesetzt und das Loch in der Eierschale wurde mit einem Zellophanband verschlossen. Die Eier wurden weitere 24 h bebrütet. Einige der operierten Embryonen wurden dann nach der Fixierung in Formaldehyd zu Gefrierschnitten verarbeitet. Es wurde festgestellt, daß innerhalb des Rückenmarks nur die Seitenstränge der Motorneuronen markiert waren. Die anderen Embryonen v/urden zur Präparation der Zellen nach dem oben beschriebenen Verfahren verwendet (18.1.1.). Nach 5 h in Kultur wurden die Zellen mit warmem HBSS gespült, mit 4% Formaldehyd in PBS bei Raumtemperatur 20 Minuten lang fixiert, mit PBS gespült

und dann in Glyzerin-PBS (1:1) mit Glasdeckplättchen montiert. Von den Zellen insgesamt waren etwa 83% markiert und wurden als Motorneuronen identifiziert (Abb. 42). Die meisten dieser markierten Motorneuronen waren große Zellen, der Rest war von mittlerer Größe. Kleine Zellen waren nicht markiert. Andererseits waren in Experimenten, in denen die Zellen nicht mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wurden, etwa 70% aller Zellen große, phasenhelle Zellen mit runden Zellkörpern, etwa 20% waren Neuronen von mittlerer Größe (die meisten davon wohl Motorneuronen) und etwa 10% waren kleine, nicht voll entwickelte Neuronen (sie besitzen neuronenartige Auswüchse mit Wachstumskegeln, aber phasendunkle halbflache Zellkörper). Nichtneuronale Zellen waren entweder nicht vorhanden oder machten weniger als 2% aus. Insgesamt kann man schlußfolgern, daß mindestens 83% der Zellen Motorneuronen sind, während der Rest aus nichtmarkierten Motorneuronen, einer kleinen Anzahl unidentifizierter Neuronen von mittlerer Größe und etwa 10% nicht voll entwickelter kleiner Neuronen besteht. Wir stellten auch fest, daß bei der Kultivierung markierter Zellen mit Muskelextrakt von Kükenembryonen (U. Dohrman u.a., 1986, Dev. Biol. 118:209-211) die Anzahl der fluoreszenzpositiven Zellen sich innerhalb weniger Tage verringerte. Da die Anzahl aller Zellen bzw. die Zahl der großen Zellen viel langsamer abnahmen, bedeutet dies eher einen Verlust und/oder ein Nachlassen der Fluoreszenz als den Zelltod. Zur Abschätzung der überlebensfördernden Wirkungen von Proben in Routine-Experimenten wurden daher statt fluoreszenzpositiver Zellen große phasenhelle Zellen als Motorneuronen gezählt.

18.2. Ergebnisse und Diskussion

18.2.1. Effekt des ziliaren neurotrophen Faktors (CNTF) auf spinale Motorneuronen voi. Kükenembryonen in Kultur

In Kontrollkulturen ohne CNTF starben die meisten Motorneuronen innerhalb von drei Tagen in Kultur ab. In Gegenwart von rekombinantem Ratten-CNTF waren etwa 70% nach 3 Tagen in Kultur und etwa 60% nach 6 Tagen in Kultur am Leben (Abbi 4 3 und Abb. 44). Da in Kontrollkulturen ohne CNTF die meisten Neuronen innerhalb von 3 Tagen abstarben, wurden die überlebensfördernden Aktivitäten am Tag 3 abgeschätzt. Die Konzentrations-Wirkungs-

Kurve von CNTF (Abb. 45) zeigte, daß die EC₅₀ (die für eine Überlebensrate von 50% erforderliche Konzentration) von CNTF bei nur etwa 20 pg/ml (1 pM) lag; das ist nahezu der gleiche Wert wie für Ziliarneuronen. Die signifikante überlebensfördernde Wirkung von CNTF mit sehr niedriger EC₅₀ deutet stark darauf hin, daß CNTF u.U. eine entscheidende Rolle beim Überleben von Motorneuronen in vivo spielt (siehe Beispiel 11 weiter oben; Sendtner u.a., 1990, Nature 345:440-441).

18.2.2. Überlebensfördernde Wirkungen spezifischer Moleküle und Zytokine

Von allen geprüften Molekülen erwiesen sich CNTF und der basische Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) als die wirksamsten Moleküle (Tabelle VI). Die überlebensfördernde Wirkung von saurem FGF konnte verstärkt werden, wenn die Kulturen mit Heparin ergänzt wurden, das den proteolytischen Abbau von saurem FGF behindert. Insulinartiger Wachstmisfaktor (IGF) I und II sowie Insulin zeigten geringere Wirkungen. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven für diese aktiven Moleküle (Abb. 46) zeigten, daß die höchsten Überlebenswirkungen durch folgende Faktoren erreicht werden konnten: (a) CNTF = 64% Überlebensrate bei 1 ng/ml; (b) basischer FGF = 51% bei 30 ng/ml; (c) saurer FGF = 18% bei 300 ng/ml; (d) saurer FGF in Gegenwart von 1 Mg/ml Heparin = 35% bei 100 ng/ml; (e) Insulin = 16% bei 25 μg/ml. Die EC₅₀-Werte waren 0,023 ng/ml für CNTF und 0,26 ng/ml für basischen FGF. Für IGF I und II sowie für Insulin konnten keine zuverlässigen EC_5Q-Werte bestimmt werden, da die maximalen Effekte klein im Vergleich zu den Kontrollen waren.

Die Konzentration von Heparin war kritisch für die Verstärkung der Aktivität von saurem FGF. Die in den vorliegenden Experimenten verwendeten Konzentrationen (1 дд/ніі) schienen in Bezug auf die Verstärkung der überlebensfördernden Wirkung von saurem FGF nicht die Maximalkonzentration zu sein. Höhere Heparinkonzentrationen führten jedoch zum Ablösen der Zellen von den Kulturschalen. Selbst bei 1 дд/ті Heparin begannen nach 3 Tagen Inkubation die Neuronen sich abzulösen. ßNGF, BDNF, PDGF, EGF, TGFa, TFßl, IL-Iß, IL-3 oder IL-6 oder IFNc hatten keine wahrnehmbare Wirkung, selbst wenn Konzentrationen über der maximalen

(in Bezug auf biologische Effekte auf andere Zelltypen) angewendet wurden. NT-3, ein neues neurotrophes Molekül der NGF-BDNF-Genfamilie, wurde ebenfalls in diesen Experimenten verwendet. Von transfizierten Cos-Zellen produzierte ΝΤ-3-Proteinkonzentrationen, die das Überleben embryonaler knotenförmiger Ganglionneuronen in Kultur förderten, hatten offenbar keine überlebensfördernde Wirkung auf Motorneuronen.

18.2.3. Kombination von CNTF, basischem FGF und IGF-I

Die Kombination von CNTF und basischem FGF bei optimalen Konzentrationen führte dazu, daß 100% der Motorneuronen einen Zeitraum von einer Woche überlebten (Tabelle VII). Das Gleiche galt für die Kombination von CNTF, basischem FGF und IGF-I. Der Effekt von IGF-I war an sich gering (Tabelle VI) , trat aber in Kombination mit CNTF und/oder FGF stärker hervor (Tabelle VII).

Tabelle VI Überlebensfördernde Wirkungen bekannter Moleküle auf Motorneuronen

Molekül	Konzentration Überlebena	10 /ig/ml
Kontrolle	—	10 Mg/ml -
bNGF (Maus)	_
BDNF (Schwein)	500 pg/ml + ++
NT-3	10 ng/ml ++
CNTF (Ratte, rek.)	300 ng/ml ±
basischer FGF (Mensch, rek.)	100 ng/ml + 1 Mg/ml ++
saurer FGF (Mensch, rek.)	5 ng/ml
saurer FGF + Heparin	10 ng/ml
PDGF (rek.)	10 ng/ml
EGF (Maus)	5 ng/ml
TGFa (Mensch, rek.)	100 Einheiten/ml
TGFßl (Schwein, rek.)	100 Einheiten/ml
IL-lß (Mensch, rek.)	50 Einheiten/ml
IL-3 (Maus, rek.)	1000 Einheiten/ml
IL-6 (Maus, rek.)	100 ng/ml ±
IFNc (Ratte, rek.)	300 ng/ml ±
IGF-I (Mensch, rek.)	25 дд/ml ±
IGF-II (Mensci , rek.)	100 lg/ml
Insulin (Rind)
Transferrin (Mensch)

^a Die überlebensfördernden Wirkungen wurden nach 3 Tagen in Kultur getestet und mit -, +, ++ bzw. +++ bewertet:"-¹¹ kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle (überlebende Zellen 8,3 ± 3,8%, Mittelwert ± Standardabweichung, η = 18);"±" ca. 15-20% (statistisch signifikante Abweichung von jeder Kontrollkultur, ρ < 0,01);"++" ca. 35-55%; "+++" ca. 55-75%. Die Ergebnisse wurden aus mehreren Experimenten zusammengefaßt, rek. = rekombinant.

£9S> 133

Tabelle VII Zusätzliche Wirkungen von CNTF, basischem FGF und IGF-I

Faktoren	FGF	(l дд/ші)	überlebende	Motorneuronen (%)a
Kontrolle		(30 ng/ml)	4,8	± 1,0
IGF-I	FGF	(1,5 ng/ipl)	14,5	± 0.5**
basischer		+ IGF-I	51,9	± 3,6
CNTF	FGF	+ IGF-I	60,7	± 5,8
basischer	FGF	+ CNTF	76,1	J. Λ 1 ** ± 4,1
CNTF		+ CNTF + IGF-I	87,0	j. л ir* ± 4,5
basischer		98,2	± 3,0
basischer	102,5	± 5,3NS

^a Das Überleben der Motorneuronen wurde nach 3 Tagen in Kultur durch Zellzählung in dem Bereich, der 23% des jeweiligen Vertiefungsbodens entsprach, geprüft. Angegeben ist der Mittelwert ± SEM . * ρ < 0,05; ** ρ < 0,01 ; NS - nicht signifikant. Die Ergebnisses des t-Tests wurden nur für die Vergleiche zwischen den Werten mit und ohne IGF-I angegeben, da der Effekt von IGF-I relativ gering ist. Die Unterschiede in allen anderen sinnvollen Vergleichen sind signifikant

19. Hinterlegung von Mikroorganismen

Dec folgende rekombinante Bakteriophage und die unten angegebenen rekombinanten Plasmid-DNAs wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt:

ATCC-Zugriffs- Datum der Nr. Hinterlegung

Plasmid	pCP-r-CNTF-C-1	40655	12·. 9.89
Plasmid	pCMV-rCNTF-C-1	40656	12.9.89
Bakteriophage	hCNTF-G-1	40657	12.9.89
Hybridom	RP3-12		15.8.90
Hybridom	RP12-2		15.8.90

Die folgenden rekombinanten Plasmid-DNAs wurden bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, hinterlegt:

NRRL-Zugriffs- Datum der Nr. Hinterlegung

Plasmid pRPN38 15.8.90

Plasmid pRPN40 15.8.90

Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung soll nicht durch die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen beschränkt werden. Tatsächlich werden aus der vorstehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen verschiedene Modifikationen der Erfindung neben den hier beschriebenen für den Fachmann auf diesem Gebiet ersichtlich sein. Derartige Modifikationen sollen in den Schutzumfang der beigefügten Patentansprüche fallen.

In der vorliegenden PA werden verschiedene Veröffentlichungen zitiert, auf deren Offenlegungen in ihrer Gesamtheit Bezug genommen wird.

Claims (156)

1. Patentansprüche

   1. Rekombinantes DNA-Molekül, bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, die den ziliaren neurotrophen Faktor (CNTF) kodiert, oder einer Teilsequenz davon, die mindestens 10 Nukleotide umfaßt.
2. 2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der die Nukleinsäuresequenz bzw. Teilsequenz kodierende ziliare neurotrophe Faktor iiti wesentlichen der in Abb. l(b) dargestellte ist.
3. 3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der die Nukleinsäuresequenz bzw. Teilsequenz kodierende ziliare neurotrophe Faktor im wesentlichen dem in Abbildung l(b) etwa vom Nukleotid 79 bis zum Nukleotid 581 entspricht.
4. 4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der die Nukleinsäuresequenz bzw. Teilsequenz kodierende ziliare neurotrophe Faktor im wesentlichen dem in Abb. 8(a) entspricht und eine Human-Nukleinsäuresequenz ist.
5. 5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der die Nukleinsäuresequenz bzw. Teilsequenz kodierende ziliare neurotrophe Faktor im wesentlichen dem in Abb. 8(a) etwa vom Nukleotid 126 bis zum Nukleotid 724 entspricht und eine Human-Nukleinsäuresequenz ist.
6. 6. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer cDNA-Sequenz besteht.
7. 7. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer genomischen DNA-Sequenz besteht.
8. 8. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, wie es in dem Plasmid pCMV-rCNTF-C-1 enthalten ist, das bei der ATCC unter der Zugriffsnummer 40656 hinterlegt wurde.
9. 9. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4, wie es in dem Bakteriophagen hCNTF-G-1 enthalten ist, der bei der ATCC unter

   der Zugriffsnummer 4 0657 hinterlegt wurde.
10. 10. Rekombinantes Ribonukleinsäuremolekül, das zu dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2 oder 4 komplementär ist.
11. 11. Nukleinsauresequenz, bestehend aus einer Sequenz, die ein Protein kodiert, das zu der in Abb. l(b) dargestellten Aminosäuresequenz oder zu Teilen davon im wesentlichen homolog ist.
12. 12. Nukleinsauresequenz, bestehend aus einer Sequenz, die ein Protein kodiert, das zu der in Abb. 8 dargestellten Human-Aminosäuresequenz oder zu Teilen davon im wesentlichen homolog ist.
13. 13. Nukleinsauresequenz, bestehend aus einer Sequenz, die zu der in Abb. l(b) dargestellten Nukleinsauresequenz oder zu einem hybridisierbaren Teil davon im wesentlichen homolog ist.
14. 14. Nukleinsauresequenz, bestehend aus einer Sequenz, die zu der in Abb. Я(а) dargestellten Nukleinsauresequenz oder zu einem hybridisierbaren Teil davon im wesentlichen homolog ist.
15. 15. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression der Nukleinsauresequenz, die ein Protein oder Peptidfragment mit dem ziliaren neurotrophen Faktor kodiert, durch eine zweite Nukleinsauresequenz so reguliert wird, daß aus Hirngewebe abgeleitetes Protein oder Peptid mit dem neurotrophen Faktor in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird.
16. 16. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 14, wie es in pCMV-rCNTF-C-1 enthalten ist.
17. 17. Nukleinsäurevektor, bestehend aus dem DNA-Molekül nach Anspruch 1, 2 oder 4.
18. 18. Rekombinanter Mikroorganismus, der das DNA-Molekül nach Ansprüche 1, 2, 4 oder 13 enthält.
19. 19. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein Bakterium handelt.
20. 20. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Hefe handelt.
21. 21. Zelle, die das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 15 enthält.
22. 22. Zelle, die das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 16 enthält.
23. 23. Nukleinsäuresequenz, die eine Sequenz umfaßt, welche im wesentlichen die in Abb. l(b) dargestellte Aminosäuresequenz oder eine aus einer antigentn Determinante bestehende Teilsequenz davon kodiert.
24. 24. Gereinigtes Protein, das eine Aminosäuresequenz im wesentlichen gemäß Abb. l(b) oder eine aus einer antigenen Determinante bestehende Teilsequenz davon umfaßt.
25. 25. Gereinigtes Protein, das eine Aminosäuresequenz im wesentlichen gemäß Abb. l(b) oder eine aus einem funktionell aktiven Peptid bestehende Teilsequenz davon umfaßt.
26. 26. Gereinigtes Protein, das im wesentlichen die Aminosäuresequenz

    MVI, LEQKIPENEADGMP
    ATVGDGGLFEK

    oder eine aus einem funktionell aktiven Peptid bestehende Teilsequenz davon umfaßt.
27. 27. Gereinigtes Protein, das eine Aminosäuresequenz im wesentlichen gemäß Abb. 8(a) als Human-Aminosäuresequenz oder eine Teilsequenz davon, die aus einer antigenen Determinante besteht, umfaßt.
28. 28. Gereinigtes Protein, das eine Aminosäuresequenz, im wesentlichen wie in Abb. 8(a) für den menschlichen ziliaren neurotrophen Faktor dargestellt, oder eine Teilsequenz davon, die aus einem funktionell aktiven Peptid besteht, umfaßt.
29. 29. Verfahren zur Produktion eines Proteins mit ziliarem neurotrophem Faktor oder eines Fragments davon, bestehend aus der Vermehrung eines rekombinanten Mikroorganismus, der ein DNA-Molekül nach Anspruch 1 enthält, derart daß das DNA-Molekül durch den Mikroorganismus exprimiert wird, sowie aus der Isolie-

    rung des exprimierten Proteins oder Fragments mit dem ziliaren neurotrophfin Faktor.
30. 30. Verfahren zur Produktion eines Proteins mit ziliarem neurotrophem Faktor oder eines Fragments davon, bestehend aus der Vermehrung eines rekombinanten Mikroorganismus, der ein DNA-Molekül nach Anspruch 2 oder Anspruch 4 enthält, derart daß das DNA-Molekül durch den Mikroorganismus exprimiert wird, sowie aus der Isolierung des exprimierten Proteins oder Fragments mit dem ziliaren neurotrophen Faktor.
31. 31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Bakterium ist.
32. 32. Verfahren zur Produktion eines Proteins mit ziliarem neurotrophem Faktor oder eines Fragments davon, bestehend aus (a) der Vermehrung eines rekombinanten Mikroorganismus, der das DNA-Molekül nach Anspruch 15 enthält, unter solchen Bedingungen, daß das DNA-Molekül durch diesen Mikroorganismus exprimiert wird, und (b) der Isolierung des exprimierten Proteins oder Fragments mit dem ziliaren neurotrophen Faktor.
33. 33. Verfahren zur Produktion eines Proteins mit ziliarem neurotrophem Faktor oder eines Fragments davon, bestehend aus (a) der Vermehrung eines rekombinanten Mikroorganismus, der das DNA-Molekül nach Anspruch 16 enthält, unter solchen Bedingungen, daß das DNA-Molekül durch diesen Mikroorganismus exprimiert wird, und (b) der Isolierung des exprimierten Proteins oder Fragments mit dem ziliaren neurotrophen Faktor.
34. 34. Verfahren zur Produktion eines Proteins mit ziliarem neurotrophem Faktor oder eines Fragments davon, bestehend aus (a) der Vermehrung eines rekombinanten Wirts, der das DNA-Molekül nach Anspruch 2 enthält, unter solchen Bedingungen, daß das DNA-Molekül durch den Wirt exprimiert wird, und (b) der Isolierung des exprimierten Proteins oder Fragments mit dem ziliaren neurotrophen Faktor.
35. 35. Verfahren z?ir Produktion eines Proteins mit ziliarem neurotrophem Faktor oder eines Fragments davon, bestehend aus (a) der Vermehrung eines rekombinanten Wirts, der das DNA-Mole-

    ^g

    kül nach Anspruch 4 enthält, unter solchen Bedingungen, daß daß DNA-Molekül durch den Wirt exprimiert wird, und (b) der Isolierung des exprimierten Proteins oder Fragments mit dew ziliaren neurotrophen Faktor.
36. 36. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt eine eukariotische Zelle ist.
37. 37. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirt ein nichtmenschliches genmutiertes Tier ist.
38. 38. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 29.
39. 39. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 30.
40. 40. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 31.
41. 41. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 32.
42. 42. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 33.
43. 43. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 34.
44. 42. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 35.
45. 43. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 36.
46. 44. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 37.
47. 45. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 38.
48. 46. Produkt des Verfahrens nach Anspruch 39.
49. 47. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch
50. 48. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch
51. 49. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch
52. 50. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch
53. 51. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch
54. 52. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch
55. 53. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch
56. 54. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch 45.
57. 55. Detergenzienfreies Produkt nach Anspruch 46.
58. 56. Glycosyliertes Produkt nach Anspruch 38, 42 oder 43.
59. 57. Glycosyliertes Produkt nach Anspruch 39.
60. 58. Nichtglycosyliertes Produkt nach Anspruch 38, 42 oder 43.
61. 59. Nichtglycosyliertes Produkt nach Anspruch 39.
62. 60. Pharmazeutisches Präparat, bestehend aus einer wirksamen Menge eines hochreinen Proteins mit ziliarem neurotrophem Faktor in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz.
63. 61. Pharmazeutisches Präparat, bestehend aus einer wirksamen Menge eines hochreinen, funktionell aktiven Peptidfragments oder Derivats mit ziliarem neurotrophem Faktor in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz.
64. 62. Pharmazeutisches Präparat, bestehend aus einer wirksamen Menge eines hochreinen, funktionell aktiven, eine antigene Determinante tragenden Peptidfragments oder Derivats mit ziliarem neurotrophem Faktor in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz.
65. 63. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61 oder 62, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidfragment oder Derivat mit ziliarem neurotrophem Faktor mindestens einen Teil der im wesentlichen in Abb. l(b) dargestellten Aminosäuresequenz umfaßt.
66. 64. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidfragment oder Derivat mit ziliarem neurotrophem Faktor mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz umfaßt, die im wesentlichen wie folgt aussieht:

    MVLLEQKIPENEADGMP
    ATVGDGGLFEK.
67. 65. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61 oder 62, dadurch gekennzeichnet, daß das Peptidfragment oder Derivat mit ziliarem neurotrophem Faktor mindestens einen Teil der im

    29**33

    wesentlichen in Abb. 8 (a) dargestellten Aminosäuresequenz umfaßt.
68. 66. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, daß das Pep,.idfragment oder Derivat mit ziliarem neurotrophem Faktor mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz umfaßt, die im wesentlichen wie folgt aussieht:

    MILLEYKIPRNEA ü GMP
    INVGDGGLFEK.
69. 67. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mit ziliarem neurotrophem Faktor die Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie im wesentlichen in Abb. l(b) dargestellt ist.
70. 68. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 60, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mit ziliarem neurotrophem Faktor die Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie im wesentlichen in Abb. 8(a) für die menschliche Aminosäuresequenz dargestellt ist.
71. 69. Pharmazeutisches Präparat, ; das eine wirksame Menge des Produkts nach Anspruch 38, 42 oder 43 in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz umfaßt.
72. 70. Pharmazeutisches Präparat, das eine wirksame Menge des Produkts nach Anspruch 39 in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz umfaßt.
73. 71. Pharmazeutisches Präparat, das eine wirksame Menge des Produkts nach Anspruch 47, 51 oder 52 in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz umfaßt.
74. 72. Pharmazeutisches Präparat, das eine wirksame Menge des Produkts nach Anspruch 56 in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz umfaßt.
75. 73. Pharmazeutisches Präparat, das eine wirksame Menge des Produkts nach Anspruch 57 in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz umfaßt.
76. 74. Pharmazeutisches Präparat, das eine wirksame Menge des Produkts nach Anspruch 58 in einer pharmazeutisch geeigneten

    Trägersubstanz umfaßt.
77. 75. Pharmazeutisches Präparat, das eine wirksame Menge des Produkts nach Anspruch 59 in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz umfaßt.
78. 76. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61, 62, 64, 66 oder 67, dadurch gekennzeichnet, daß es die Überlebensrate von Neuronen erhöhen kann.
79. 77. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 63,. dadurch gekennzeichnet, daß es die Überlebensrate von Neuronen erhöhen kann.
80. 78. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß es die Überlebensrate von Neuronen erhöhen kann.
81. 79. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61, 62, 64, 66 oder 67, dadurch gekennzeichnet, daß es das Neuronenwachstum verstärken kann.
82. 80. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß es das Neuronenwachstum verstärken kann.
83. 81. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß es das Neuronenwachstum verstärken kann.
84. 82. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61, 62, 64, 66 oder 67, dadurch gekennzeichnet, daß es eine differenzierte Zellfunktion fördern kann.
85. 83. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß es eine differenzierte Zellfunktion fördern kann.
86. 84. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß es eine differenzierte Zellfunktion fördern kann.
87. 85. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61, 62, 64, 66 oder 67, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein, Peptid oder Derivat glycosyliert ist.

    Z92133
88. 86. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein, Peptid oder Derivat glycosyliert ist.
89. 87. Pharmazeutisches Präparat nach Anspiach 65, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein, Peptid oder Derivat glycosyliert ist.
90. 88. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 61, 62, 64, 66 oder 67, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein, Peptid oder Derivat nicht glycosyliert ist.
91. 89. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 63, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein, Peptid oder Derivat nicht glycosyliert ist.
92. 90. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 65, dadurch gekennzeichnet, daß Jas Protein, Peptid oder Derivat nicht glycosyliert ist.
93. 91. Pharmazeutisches Präparat, das eine wirksame Menge einer Kombination aus einem hochreinen Protein oder Peptidfragment oder Derivat mit ziliarem neurotrophem Faktor und einem zweiten Mittel in einer pharmazeutisch geeigneten Trägersubstanz enthält.
94. 92. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 91, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Mittel der Nervenwachstumsfaktor ist.
95. 93. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 91, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Mittel der aus Hirngewebe gewonnene neurotrophe Faktor ist.
96. 94. Pharmazeutisches Präparat nach Anspruch 91, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Mittel der basische Fibroblastenwachstumsfaktor ist.
97. 95. Methode zur Diagnose einer Krankheit oder Störung des Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß

    (a) ein Gewebe mit einem nachweisbar markierten Nukleinsäuremolekül in Kontakt gebracht v;ird, das mindestens

    zehn Nukleotide enthält, wie sie im wesentlichen in Abb. l(b) dargestellt sind, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen, und

    (b) jede auftretende Hybridisierung nachgewiesen wird.
98. 96. Methode zur Diagnose einer Krankheit oder Störung des Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß

    (a) ein Gewebe mit einem nachweisbar markierten Nukleinsäuremolekül in Kontakt gebracht wird, das mindestens zehn Nukleotide enthält, wie sie im wesentlichen in Abb. 8(a) für die Seguenz mit dem menschlichen ziliaren neurotrophen Faktor dargestellt sind, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen, und

    (b) jede auftretende Hybridisierung nachgewiesen wird.
99. 97. Methode zur Diagnose einer Krankheit oder Störung des Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß

    (a) aus einem Gewebe gewonnene RNA mit einem nachweisbar markierten Nukleinsäuremolekül in Kontakt gebracht wird, das mindestens zehn Nukleotide enthält, wie sie im wesentlichen in Abb. l(b) dargestellt sind, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen, und

    (b) jede auftretende Hybridisierung nachgewiesen wird.
100. 98. Methode zur Diagnose einer Krankheit oder Störung des Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß

     (a) aus einem Gewebe gewonnene RNA mit einem nachweisbar markierten Nukleinsäuremolekül in Kontakt gebracht wird, das mindestens zehn Nukleotide enthalt, wie sie im wesentlichen in Abb. 8(a) für die Sequenz mit dem menschlichen ziliaren neurotrophen Faktor dargestellt sind, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen, und

     (b) jede auftretende Hybridisierung nachgewiesen wird.

     лее 133
101. 99. Methode zur Diagnose einer Krankheit oder Störung des Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß

     (a) cDNA, die aus der aus einem Gewebe gewonnenen RNA erzeugt wird, mit einem nachweisbar markierten Nukleinsäuremolekül in Kontakt gebracht wird, das mindestens zehn Nukleotide enthält, wie sie im wesentlichen in Abb. l(b) dargestellt sind, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen, und

     (b) jede auftretende Hybridisierung nachgewiesen wird.
102. 100. Methode zur Diagnose einer Krankheit oder Störung des Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß

     (a) cDNA, die aus der aus einem Gewebe gewonnenen RNA erzeugt wird, mit einem nachweisbar markierten Hukleinsäuremolekül in Kontakt gebracht wird, das mindestens zehn Nukleotide enthält, wie sie im wesentlichen in Abb. 8(a) für die Sequenz mit dem menschlichen ziliaren neurotrophen Faktor dargestellt sind, unter Bedingungen, die eine Hybridisierung ermöglichen, und

     (b) jede auftretende Hybridisierung nachgewiesen wird.
103. 101. Verfahren nach einem der Ansprüche 95, 96, 97, 98, 99 oder 100, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung des Nervensystems aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Tumoren und degenerativen Störungen besteht.
104. 102. Verfahren zur Behandlung einer Krankheit oder Störung des Nervensystems, dadurch gekennzeichnet, daß einem Patienten eine wirksame Menge eines Proteins oder eines funktionell aktiven Peptidfragments oder Derivats mit ziliarem neurotrophem Faktor verabreicht wird.
105. 103. Verfahren nach Anspruch 102, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive Peptidfragment mindestens einen Teil der Aminosäure enthält, die im wesentlichen wie folgt aussieht:

     MVLLEQKIPENEADGMP
     ATVGDGGLFEK
106. 104. Verfahren nach Anspruch 102, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive Peptidfragment mindestens einen Teil der Aminosäure enthält, die im wesentlichen wie folgt aussieht:

     MILLEYKIPRNEADGMP
     INVGDGGLFEK
107. 105. Verfahren nach Anspruch 102, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung des Nervensystems eine Degenerationskrankheit ist.
108. 106. Verfahren nach Anspruch 102, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung des Nervensystems eine Degenerationskrankheit unter Beteiligung des Rückenmarks ist.
109. 107. Verfahren nach Anspruch 102, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung des Nervensystems eine Degenerationskrankheit unter Beteiligung von Motorneuronen ist.
110. 108. Verfahren nach Anspruch 107, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung des Nervensystems eine Degenerationskrankheit unter Beteiligung von Motorneuronen des Gesichtsnervs ist.
111. 109. Verfahren nach Anspruch 107, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung des Nervensystems eine Motorneuronenerkrankung oder Degeration aus der Gruppe ist, die aus amyotropher Lateralsklerose, primärer Lateralsklerose, progressiver Bulbärparalyse, Atrophie der Wirbelsäulenmuskulatur und dem Postpolio-Syndrom besteht.
112. 110. Verfahren nach Anspruch 105, dadurch gekennzeichnet, daß die Degerationskrankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus peripherer Neuropathie, der Parkinsonschen Krankheit und der Huntingtonschen Chorea besteht.
113. 111. Verfahren nach Anspruch 102, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung des Nervensystems aus einer Schädigung des Nervensystems besteht.
114. 112. Verfahren nach Anspruch 111, dadurch gekennzeichnet, daß die Schädigung durch Ereignisse aus der Gruppe verursacht wird, die aus Trauma, Chirurgie, Infarktbildung, Infektion und

     Malignität besteht.
115. 113. Verfahren nach Anspruch 105, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung durch Einwirkung eines Toxins verursacht wird.
116. 114. Verfahren nach Anspruch 105, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung durch Nahrungsmangel verursacht wird.
117. 115. Verfahren nach Anspruch 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 oder 114, dadurch gekennzeichnet, daß an der Krankheit oder Störung des Nervensystems das Rückenmark beteiligt ist.
118. 116. Verfahren nach Anspruch 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113 oder 114, dadurch gekennzeichnet, daß an der Krankheit oder Störung des Nervensystems die cholinergen Neuronen beteiligt sind.
119. 117. Verwendung einer wirksamen Menge einer Kombination aus einem Protein bzw. einem funktionell aktiven Peptidfragment oder dessen Derivat mit dem ziliaren neurotrophen Faktor sowie aus einem zweiten Mittel zur Behandlung einer Krankheit oder Störung des Nervensystems.
120. 118. Verwendung nach Anspruch 117, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Mittel der Nervenwachstumsfaktor ist.
121. 119. Verwendung nach Anspruch 117, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Mittel der aus Hirngewebe gewonnene neurotrophe Faktor ist.
122. 120. Verwendung nach Anspruch 118, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung eine Degenerationskrankheit ist.
123. 121. Verwendung nach Anspruch 12 0, dadurch gekennzeichnet, daß die Degenerationskrankheit aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Motorneuronenerkrankung, der Alzheimerschen Krankheit oder der Huntingtonschen Chorea besteht..
124. 122. Verwendung nach Anspruch 118, dadurch gekennzeichnet, daß die Krankheit oder Störung aus einer Schädigung des Nervensystems besteht.

     Z 9#133
125. 123. Verwendung nach Anspruch 118, da lrch gekennzeichnet, daß die Störung durch ein Ereignis aus einer Gruppe verursacht wird, die aus Trauma, Chirugie, Infarktbildung, Infektion und Malignität besteht.
126. 124. Methode zur Isolierung von hochreinem ziliarem neurotrophem Faktor (CNTF), dadurch gekennzeichnet, daß

     (a) ein Extrakt aus einem Gewebe hergestellt wird, das bekanntermaßen oder vermutlich den ziliaren neurotrophen Faktor enthält;

     (b) die Aktivität des ziliaren neurotrophen Faktors mittels Ionenaustauschchromatographie fraktioniert wird;

     (c) die Aktivitität des ziliaren neurotrophen Faktors durch präparative SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gewonnen wird;

     (d) der ziliare neurotrophe Faktor unter Verwendung einer biologisch inerten Umkehrphasen-HPLC- oder -FPLC-Säule gereinigt wird und

     (e) der ziliare neurotrophe Faktor unter einer inerten Atmosphäre konzentriert wird.

     12 5. Methode nach Anspruch 124, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe Augengewebe von Kükenembryonen ist.
127. 126. Methode nach Anspruch 124, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe Hüftnervengewebe ist.
128. 127. Methode nach Anspruch 125 oder 126, dadurch gekennzeichnet, daß die Umkehrphasen-HPLC- oder -FPLC-Säule mit einem inerten Metall ausgekleidet ist.
129. 128. Methode nach Anspruch 127 , dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Metall Gold ist.
130. 129. Methode nach Anspruch 125 oder 12 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Umkehrphasen-Säule eine Bakerbond Gold C4 Widepore - Säule ist.
131. 130. Methode nach Anspruch 124, dadurch gekennzeichnet, daß der ziliare neurotrophe Faktor unter einer Argonatmosphäre konzentriert wird.
132. 131. Bei einer Methode zur Reinigung des ziliaren neurotrophen Faktors, die aus der Herstellung eines Extrakts . aus einam Gewebe, das bekanntermaßen oder vermutlich den ziliaren neurotrophen Faktor enthält, der Fraktionierung der Aktivität des ziliaren neurotrophen Faktors mittels Ionenaustauschchromatographie und der Gewinnung der Aktivität des ziliaren neurotrophen Faktors durch präparative SDS-Polyacrylaraidgelelektrophorese besteht, die Verbesserung, gekennzeichnet durch eine weitere Reinigung des ziliaren neurotrophen Faktors durch Chromatographie unter Verwendung einer biologisch inaktiven HPLC- oder FPLC-Säule.
133. 132. Bei einer Methode zur Reinigung des ziliaren neurotrophen Faktors, die aus der Herstellung eines Extrakts aus einem Gewebe, das bekanntermaßen oder vermutlich den ziliaren neuro :rophen Faktor enthält, der Fraktionierung der Aktivität des ziliaren neurotrophen Faktors mittels Ionenaustauschchromatographie und der Gewinnung der Aktivität des ziliaren neurotrophen Faktors durch präparative SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese besteht, die Verbesserung, gekennzeichnet durch eine weitere Reinigung des ziliaren neurotrophen Faktors mittels Chromatographie unter Verwendung einer Bakerbond Gold C4 Widepore - Säule.
134. 133. Rekombinanter Vektor pRPN38, wie er bei der NRRL unter

     der Zugriffsnummer hinterlegt wurde, oder ein

     funktionell äquivalenter Vektor.
135. 134. Rekombinanter Vektor pRPN40, wie er bei der NRRL unter

     der Zugriffsnummer hinterlegt wurde, oder ein

     funktionell äquivalenter Vektor.
136. 135. Verwendung einer wirksamen CNTF-Konzentration zur Erhöhung der GABA-Aufnähme in Hippocampuszellen.

     13 6. Verwendung einer wirksamen CNTF-Konzentration zur Verstärkung der Expression von Neurofilamentproteinen in Hippocampuszellen.
137. 137. Verwendung einer wirksamen CNTF-Konzentration zur Erhöhung der Überlebensrate von Hippocampuszellen.
138. 138. Verwendung einer wirksamen CNTF-Konzentration zur Erhöhung der Überlebensrate von Hippocampus-Astrozyten.
139. 139. Verwendung einer wirksamen CNTF-Konzentration zur Erhöhung der Überlebensrate von Motorneuronen.
140. 140. Verwendung einer wirksamen CNTF-Konzentration zur Erhöhung der Überlebensrate ventraler Rückenmarksneuronen.
141. 141. Verwendung einer wirksamen CNTF-Konzentration zur Förderung der Expression von Cholinacetyltransferase in ventralen
     Rückenmarksneuronen.
142. 142. Verwendung einer wirksamen CNTF-Menge zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit.
143. 143. Verwendung einer wirksamen CNTF-Menge zur Behandlung der amyotrophen Lateralsklerose.
144. 144. Verfahren zur Messung der CNTF-Menge in einer Probe, gekennzeichnet durch:

     (i) Bindung eines ersten Anti-CNTF-Antikörpers an einen festen Träger;

     (ii) Einwirkung einer CNTF-naltigen Lösung auf den immobilisierten ersten Antikörper von Schritt (i) unter Bedingungen, welche die Bindung von CNTF an den ersten Antikörper gestatten;

     (iii) Einwirkung eines zweiten Anti-CNTF-Antikörpers auf das an den ersten Anti-CMTF-Antikörper gebundene CNTF

     J 98133

     unter Bedingungen, welche die Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF gestatten, und

     (iv) Nachweis der Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper der monoklonale Antikörper RP3-12 ist, der bei der ATCC unter der Zugriffsnummer hinterlegt wurde.
145. 145. Verfahren zur Messung der CNTF-Menge in einer Probe, gekennzeichnet durch:

     (i) Binding eines ersten Anti-CNTF-Antikörpers an einen festen Träger;

     (ii) Einwirkung einer CNTF-haltigen Lösung auf den immobilisierten ersten Antikörper von Schritt (i) unter Bedingungen, welche die Bindung von CNTF an den ersten Antikörper gestatten;

     (iii) Einwirkung eines zweiten Anti-CNTF-Antikörpers auf das an den ersten Anti-CNTF-Antikörper gebundene CNTF unter Bedingungen, welche die Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF gestatten, und

     (iv) Nachweis der Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper der monoklonale Antikörper RP12-2 ist, der bei der ATCC unter der Zugriffsnummer hinterlegt wurde.
146. 6. Verfahren zur Messung der CNTF-Menge in einer Probe, gekennzeichnet durch:

     (i) Bindung eines ersten Anti-CNTF-Antikörpers an einen festen Träger;

     (ii) Einwirkung einer CNTF-haltigen Lösung auf den immobilisierten ersten Antikörper von Schritt (i) unter Bedingungen, welche die Bindung von CNTF an den ersten Antikörper gestatten;

     (iii) Einwirkung eines zweiten Anti-CNTF-Antikörpers auf das

     29*133

     an den ersten Anti-CNTF-Antikörper gebundene CNTF unter Bedingungen, welche die Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF gestatten, und

     (iv) Nachweis der Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper der monoklonale Antikörper RP3-12 ist, der bei der ATCC unter der Zugriffsnummer hinterlegt wurde.
147. 147. Verfahren zur Messung der CNTF-Menge in einer Probe, gekennzeichnet durch:

     (i) Bindung eines ersten Anti-CNTF-Antikörpers an einen festen Träger;

     (ii) Einwirkung einer CNTF-haltigen Lösung auf den immobilisierten ersten Antikörper von Schritt (i) unter Bedingungen, welche die Bindung von CNTF an den ersten Antikörper gestatten;

     (iii) Einwirkung eines zweiten Anti-CNTF-Antikörpers auf das an den ersten Anti-CNTF-Antikörper gebundene CITF unter Bedingungen, welche die Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF gestatten, und

     (iv) Nachweis der Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Antikörper der monoklonale Antikörper RP12-2 ist, der bei der ATCC unter der Zugriffsnummer hinterlegt wurde.
148. 148. Verfahren zur Messung der CNTF-Menge in einer Probe, gekennzeichnet durch:

     (i) Bindung eines ersten Anti-CNTF-Antikörpers an einen festen Träger;

     (ii) Einwirkung einer CNTF-haltigen Lösung auf den immobilisierten ersten Antikörper von Schritt (i) unter Bedingungen, welche die Bindung von CNTF an den ersten Antikörper gestatten;

     2Θ9133

     (iii) Einwirkung eines zweiten Anti-CNTF-Antikörpers auf das an den ersten Anti-CNTF-Antikörper gebundene CNTF unter Bedingungen, welche die Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF gestatten, und

     (iv) Nachweis der Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper RP3-12 und der zweite Antikörper RP12-2 ist, die jeweils bei der ATCC unter der Zugriffsnummer bzw. hinterlegt wurden.
149. 149. Verfahren zur Messung der CNTF-Menge in einer Probe, gekennzeichnet durch:

     (i) Bindung eines ersten Anti-CNTF-Antikörpers an einen festen Träger;

     (ii) Einwirkung einer CNTF-haltigen Lösung auf den immobilisierten ersten Antikörper von Schritt (i) unter Bedingungen, welche die Bindung von CNTF an den e:rsten Antikörper gestatten;

     (iii) Einwirkung eines zweiten Anti-CNTF-Antikörpers auf das an den ersten Anti-CNTF-Antikörper gebundene CNTF unter Bedingungen, welche cUe Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNT;¹ gestatten, und

     (iv) Nachweis der Bindung des zweiten Anti-CNTF-Antikörpers an CNTF, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Antikörper RP12-2 und der zweite Antikörper RP3-12 ist, J,ie jeweils bei der ATCC unter der Zugriffsnummer bzw. hinterlegt wurden.
150. 150. Monoklonaler Antikörper RP3-12, wie er durch das Hybridom RP3-12 produziert und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer hinterlegt wurde, oder ein Fragment oder Derivat dieses Antikörpers.
151. 151. Monoklonaler Antikörper RP12-2, wie er durch das Hybridom RP12-2 produziert und bei der ATCC unter der Zugriffsnummer hinterlegt wurde, oder ein Fragment oder Derivat dieses Antikörpers.
152. 152. Monoklonaler Antikörper, der die Bindung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 151 kompetitiv hemmt, oder ein Fragment oder Derivat dieses Antikörpers.
153. 153. Monoklonaler Antikörper, der die Bindung des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 152 kompetitiv hemmt, oder ein Fragment oder Derivat dieses Antikörpers.
154. 154. Methode nach Anspruch 108, dadurch gekennzeichnet, daß die Degenerationskrankheit unter Beteiligung von Motorneuronen des Gesichtsnervs die Bellsche Lähmung ist.
155. 155. Verwendung nach Anspruch 139, weiter gekennzeichnet durch die Verv/endung einer wirksamen Menge des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors.
156. 156. Verwendung nach Anspruch 140, weiter gekennzeichnet durch die Verwendung einer wirksamen Menge des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors.