JPH07502980A - グリア由来神経栄養因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ダリア由来神経栄養因子 発明の分野 本発明は、神経栄養因子およびとくにダリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）に関 する。本発明にはまた、天然ソースからのＧＤＮＦの精製方法、ＧＤＮＦをコー トするラットおよびヒト遺伝子のクローニング方法、ならびにＧＤＮＦをコート するラットおよびヒ１−遺伝子の核酸配列を包含する。ＧＤＮＦ遺伝子は発現ベ クターにサブクローニングされ、このベクターは生物学的に活性なＧＤＮＦの発 現に使用された。さらに、本発明は、神経障害および神経関連疾患たとえばパー キンソン病の防止および処置のためのＧＤＮＦの使用を包含する。

ＧＤＮＦに対する抗体ならびに神経栄養因子のＧＤＮＦファミリーのメンバーの 同定方法か開示される。そして最後に、患者にＧＤＮＦを分泌する細胞を移植す ることによる神経障害の防止および処置方法か記載される。

発明の背景 神経栄養因子は神経系または神経系によって刺激される非神経組織に見出される 天然の蛋白質であり、その機能は神経および／またはダリア細胞の生残を促進神 経栄養因子は、様々な神経変性疾患の原因となる神経細胞の変性および分化機能 の喪失の処置に有用性か考えられる。

特定の神経栄養因子か神経障害の処置に有用である可能性かあるためには、その 障害神経細胞のクラスかその因子に応答するものでなければならない。異なる神 経栄養因子は通常、明らかに異なるクラスの神経細胞に対して作用する。したが って、異なる形態の疾患または損傷を起こすそれぞれのクラスの障害ニューロン を処置するためには、様々の異なる神経栄養因子を手元にもっていることが賢明 である。

神経栄養因子は、対応するニューロンを、様々な無関係の傷害に対して保護する ことかできる。たとえは、神経栄養因子神経成長因子（ＮＦＣ）は、感覚ニュー ロンの重要な部分を、軸索突起の切断によって生しる死から（Ｒｉｃｈら、　１ ９８７　Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ、　＋６：２６１　；叫Ｏら、　１９８７　Ｊ、　Ｎｅｕ ｒｏｓｃｉ、　８３：＋５６）、胚の発育時における個体発生元から（Ｈａｍｂ ｕｒｇｅｒら、　＋９８４　Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、４ニア６７）ならびにタキ ソールまたはンスブラチンの投与によって起こる障害から（Ａｐｆｅｌら、１９ ９１　Ａｎｎ　Ｎｅｕｒｏｌ、　２９：８７）救出する。この明らかに普遍的な 保護から、ある神経栄養因子か実験的障害に対して対応するニューロンを保護す るのであれば、病因は不明であったとしても、それらのニューロンの障害か関与 する疾患の患者の処置に有用であろうと考えられるようになった。

与えられた神経栄養因子は、適切な神経細胞特異性をもつと同時に、医療処置へ の使用に十分な量か利用できなければならない。神経栄養因子は通常、組織には ほとんど検出てきない程の量しか存在しないので（たとえば、１ｌｏｆｅｒ　＆ 　Ｂｒａｄｅ１９８８　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：２６１　；Ｌｉｎら、＋９８９ ５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１０２３）、医薬として使用する量の神経栄養因子を 直接動物組織から調製することは不便である。別法として、神経栄養因子の遺伝 子の位置を決定し、この蛋白質を事実上無限に生産できる組換え発現系を確立す るための基盤としてこの遺伝子を使用することか望ましい。

本出願の発明者らは、生物学的サンプルについて、パーキンソン病で変性する点 質ドーパミン作動性ニューロンの胚前駆体に対する神経栄養活性をスクリーニン グする方法を記述する。パーキンソン病の処置に有用と考えられる神経栄養因子 を同定するためのこのバイオアッセイは、以前報告されたアッセイ（Ｆｒｉｅｄ ｍａｎら、　１９８７　Ｎｅｕｒｏ、　Ｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、　７９：６５−７ ２、参考としてとくに本明細書に導入する）に基つき、本発明において改良か加 えられたものである。このアッセイは、ドーパミン作動性ニューロンに向けられ た神経栄養活性の可能性について様々なソースをスクリーニングするために使用 された。本発明はこのようなソースの一つ、膠芽腫細胞系、Ｂ４９　（Ｓｃｈｕ ｂｅｒｔら、　＋９７４　Ｎａｔｕｒｅ　２４９：２２４−２７、参考としてと くに本明細書に導入する）からの調整培養培地より精製された新規な神経栄養活 性の特性を記載する。この細胞系からの調整培地かドーパミン作動性神経栄養因 子を含有することは以前に報告されている（Ｂｏｈｎら、　＋９８９　Ｓｏｃ、 　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ａｂｓ、　１５：２７７）。

この以前の報告においては、神経栄養活性のソースは精製されておらず、化学的 に特徴づけられてもいないし、また調整培地中の単一物質によることも示されて いない。神経障害は、１種または゛２種以上の神経細胞の生残および／または正 常な機能を害する条件によって引き起こされる。このような神経障害は、以下に その一部を示すような広範囲の多様な原因によって生しる。

神経障害は生理的な損傷によって起こることがあり、これは損傷部位の近傍にお ける軸索突起および／または神経細胞体の変性を生じる。神経障害はまた、卒中 の場合のような、神経系の一部への一時的または永久的な血流の停止によって起 こる。神経障害はまた、癌およびエイズ化学療法剤たとえばそれぞれソスブラチ ナムおよびジデオキシシチジン（ｄｄｅ）への意図的または偶発的な暴露によっ て生じる。神経障害はさらに、慢性的代謝性疾患、たとえば糖尿病または腎機能 異常によって起こる。神経障害はまた、特定のニューロン集団の変性を生じる神 経変性疾患、たとえば、パーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索 硬化症（ＡＬＳ）によっても起こる。

本出願は新規な神経栄養因子を記述する。神経栄養因子とは、特定の神経細胞の 正常機能の促進および／またはそれらの細胞の様々な異なる形態の障害からの保 護に関与する天然の蛋白質である。これらの性質から、Ｃ；ＤＮＦには、」二に とくに示したような多様な形態の神経障害の処置に有用である可能性か示唆され る。

バーギンノン病は、一連の独特な症状、すなわち、筋強剛、運動緩徐、脂漏、加 速歩行、固定姿勢、温湿および［丸薬調製様」振戦によってｆ＆診される。この 疾患は世界中のすへての種族に認められ、平均発症年齢は６０歳である。

何年にも亘る理論的対立と論争ののち、パーキンソン病の生化学的基盤かその主 原因どして明らかにされてきた（たとえば、Ｂｅｒｇｍａｎ、　１９９０　Ｄｒ ｕｇ　５ｔｏｒｅ　Ｎｅｗｓ。

１２：　ｌＰ＋９参照）。パーキンソン病の理解には、点質、基底値および、と くに線状体として知られる脳の領域か極めて重要である。点質、すなわち中脳に 両側性に認められる一対の灰白質の着色層は１・−パミン伝達か関与し、一方、 正常な基底値機能には、点質に関連し、一部はドーパミン、アセチルコリンおよ びその池の物質によって仲介される一連の相互作用およびフィードバック系か包 含される。

パーギンノン病においては、ニューロンの変性によって起こる点質のｌ・−パミ ン作動活性に機能異常かある。これかドーパミンの欠乏状態を招き、活動バラン スがコリン作動性優位に移行する。したがって、アセチルコリン濃度の上昇はな いにもかかわらず、このコリン作動性メディエータ−による中枢神経系への興奮 作用（すなわち振戦）か枯渇したドーパミンの抑制作用を凌駕することになる。

現在、パーキンソン病の最も有効な処置は、レボドーパの経口投与である。レボ ドーパは中枢神経系に浸透し、基底値で酵素的にドーパミンに変換される。した かって、レボドーパの有益な作用は、脳のドーパミン濃度を上昇させることにあ ると考えられる。残念ながら、レボドーパも、またそれほど一般的には使用され ていない池の薬剤も、ドーパミン作動性ニューロンの変性によって生じるこの疾 患の進行を実際にくい止めることはない。

池の研究音速も、様々な生物学的ソース中にドーパミン作動活性の存在を報告し てきた。ＳｐｒｉｎｇｅｒらのＰＣＴ公告ＷＯ９１１０１７３９号では、末梢神 経系の細胞に由来する抽出物中に、ドーパミン作動性神経栄養活性か同定された 。同定された活性は精製されなかったが、分子量ｔｏ、　ｏｏｏダルトン未満の 因子によるものとされた。

この因子はラットの坐骨神経から単離されたか、同しくこの神経から見出されて いるＣＮＴＦ（Ｌｉｎら、１９８９５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１０２３）とは明 らかに相違する。

Ａｐｐｅｌらの米国特許第５．０１７．７３５号では、ドーパミン作動活性か尾 状核−被殻組織からの抽出物中に同定された。この場合も、活性を生しる因子は 精製されていないか、活性含有分画の見掛けの分子量は比較的小さい。またＮＮ １１ｊｉｎら。

＋９９０　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、　５２８：１５１−１５４　（成熟ラット脳の 心路を化学的に遮断した線状体）およびＬｏら、＋９９０　Ｓｏｃ、Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉ、Ａｂｓｔｒ、　＋６：８０９　（線状体由来因子）も参照されたい。さ らに、池の既知の神経栄養因子、たとえば脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）　、 ならびに酸性および塩基性線維芽細胞成長因子力洞様にドーパミン作動活性を有 することも明らかにされている。

本発明のＧＮＤＦは、ラット胚中脳から単離されたｌ・−パミン作動性神経細胞 の細胞培養体の機能的活性および生残を促進するその能力に基づいて単離された 。

これらのドーパミン作動性神経細胞は、パーキンソン病で変性する成人点質にお けるドーパミン作動性神経細胞の旺前駆体である。したがって、ＧＤＮＦには、 パーキンソン病の症状の原因となる神経変性の減弱に有用性か考えられる。

さらに、ＧＤＮＦは、ヒト患者のドーパミン作動性神経細胞に対する他の型の障 害およびその不適切な機能の処置に作用である可能性か考えられる。このような 障害および機能異常か、精神分裂病や他の種類の精神病に起こっていることも考 えられる。このような状態の最近の処置には、ドーパミン受容体に活性な薬剤か しばしは要求され、これはこれらの受容体をもつニューロン集団を支配するドー パミン作動性神経の不適切な機能かこの疾患過程に関与していることを示唆して いる。

他の神経栄養因子についての以前の経験によれば、ＧＤＮＦて処置てきる新たな 形態の神経障害は、この神経栄養因子に応答する様々な種類の神経細胞について さらに知識か増えるのに応して、明らかにされるものと思われる。たとえば、神 経成長因子（ＮＣ；Ｆ）は、アルツハイマー病で変性している前脳基底値コリン 作動性ニューロンで神経栄養因子として作用することか最近発見された時点ては 、アルツハイマー病の処置に作用である可能性のみか取り沙汰された（Ｗｉｌｌ ｉａｍｓら。

１９８６　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ　８３：９２３１ ）　。本発明においては、ＧＤＮＦで有効に処置できる池の形態の神経障害を決 定するための方法か提供される。

Ｐａｔｒｉｃｋ　Ａｅｂｉｓｃｈｅｒと共同研究者らは、ある種の環境で薬剤ま たは医薬を送達する手段どして有用な、半透過性の移植可能な膜デバイスの使用 を報告している。

たとえは彼らは、神経伝達因子を分泌する細胞のカプセル封入、およびパーキン ソン病罹患患者の脳へのこのようなデバイスの移植を提案している。Ａｅｂｉｓ ｃｈｅｒらの米国特許第４．８９２．５３８号；　Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらの米国 特許第５．０１１．４７２号。

Ａｅｂｉｓｃｈｅｒらの米国特許第５．１０６．６２７号；　ＰＣＴ出［０９１ ／１０４２５号；ＰＣＴ出願本発明は、実質的に精製されたダリア由来神経栄養 因子（ＧＤＮＦ）に関し、それを請求するものである。本発明の一実施磐様にお いては、Ｂ４９調整培地の比活性より少なくとも約２４．０００倍高い比活性を 有する実質的に精製されたＧＤＮＦか得られる。実質的に精製されたＧＤＮＦは 少なくとも約１２．０ＯＯＴ　Ｕ／μｇの比活性を有する。

本発明の実質的に精製されたＧＤＮＦは、非還元５ＤＳ−ＰＡＣＥ上で約３１〜 ４２　ｋＤ、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で約２０〜２３ｋＤの見掛けの分子量を有 する。実質的に精製されたＧＤＮＦは、アミ入酸配列（配列番号１）（Ｓｅｒ） −Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−（Ａｒｇ）−Ａｓｎ|（）− Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−（Ｓｅｒ）−Ｐｒｏ−（Ａｓｐ）− （Ａｓｎ）から実質的になるアミノ末端配列を有する。ラッ１−ＧＤＮＦの成熟 および「プレープロ」型のアミノ酸配列は図１３および１４（配列番号３および ４）に掲げる。成熟しトＧＤＮＦのアミノ酸配列は図１９（配列番号５）に掲げ る。ヒトＧＤＮＦのプレープロ型のアミノ酸配列は図１９（配列番号５）および 図２２（配列番号８）に掲げる。

本発明の一想様は、Ｉ）Ｂ４９膠芽腫細胞の無血清成育調整培地の調製：２）調 整培地の濃縮、３）ａ縮調整培地についてｌ＼バリンセファロースクロマトグラ フィーの実施：４）ヘパリンセ゛ファロースクロマトグラフィーから得られた分 画についての迅速蛋白液体クロマトグラフィーの実施：ならびに５）上記迅速蛋 白クロマトグラフィーから得られな分画についての逆相高速液体クロマトグラフ ィーの実施からなる精製ＧＤＮＦの取得方法である。−実施懸様においては、精 製ＧＤＮＦの取得方法はさらに、以下の工程＝６）逆相高速液体クロマ１〜グラ フイーで得られた分画についてのプレパラティブ５ＤＳ−ＰＡＧＥの実施、なら びにプレパラティブ５ＤＳ−ＰＡＧＥによって得られた分画についての逆相高速 液体クロマトグラフィーの実施からなる。

また、Ｂ４９細胞系より調製されたｃＤＮＡライブラリーからのクツ１−ＧＤＮ Ｆ遺伝子のクローニングか記載されている。成熟およびプレープロラットＧＤＮ Ｆをコートする核酸配列は図１３に示す（配列番号３）。ＧＤＮＦをコートする ヒト遺伝子を得る方法も開示される。成熟ヒトＧＤＮＦをコートする核酸配列は 図１９（配列番号５）に示す。ヒトＧＤＮＦのプレープロセグメントの最初の５ ０のアミノ酸をコー）〜する核酸配列は図２２（配列番号８）に示す通りである 。

本発明はまた、精製ＧＤＮＦの有効量を医薬用に適した担体中に含有してなる医 薬組成物を包含する。またさらに、ＧＤＮＦの治療有効量をそれを必要とする患 者に投与することからなる神経障害の防止または処置方法も記載される。好まし い実施聾様においては、神経障害はパーキンソン病またはドーパミン作動性神経 細胞の障害もしくは不適切な機能である。

本発明の好ましい実施態様においては、ＧＤＮＦは本明細書に記載のＧＤＮＦを コートする遺伝子を利用する組換えＤＮＡ法によって製造される。本発明は、成 熟もしくはプレープロＧＤＮＦをコードする核酸配列に発現調節要素か機能的に 連結されてなる、生物学的に活性なＧＤＮＦの製造に使用するベクター、ならび にこのようなベクターでトランスフす一ムされた宿主細胞を包含する。また、Ｇ ＤＮＦをコー１〜するＤＮＡ配列をそのＤＮＡ配列の発現に必要な調節要素から なる発現ベクター中にサブクローニングし、宿主細胞をその発現ベクターでトラ ンスフオームし：その宿主細胞をベクターか増幅しＧＤＮＦか発現する条件下に 培養し、ついてＧＤＮＦを収穫することからなるＧＤＮＦの製造のための組換え ＤＮＡ法を包含する。

本発明の宿主細胞をベクターか増幅しＧＤＮＦか発現する条件下に培養し一つい てＧＤＮＦを収穫することからなるＧＤＮＦの製造のための組換えＤＮＡ法が記 載される。

本発明は、ＧＤＮＦを認識する、実質的に精製された抗体を包含する。ダリア由 来神経栄養因子を分泌する細胞を、それを必要とする患者の体内に移植すること からなる神経障害の防止または処置方法も包含される。最後に、本発明は、半透 過性の膜とぞの膜内に封入されたＧＤＮＦを分泌する細胞からなり、その膜はＧ ＤＮＦに対しては透過性であるか患者からの細胞に有害な因子に対しては不透過 性てあり、患者に移植して神経障害を防止または処置するためのデバイスを包Ｕ ｊＪ＋は、Ｂ４９膠芽腫細胞の無血清成育調整項地中濃縮溶液についてのヘパリ ンセファ０−スクロマトグラフイーの結果を表す。結果は溶出液０．　Ｄ、　２ １０（−）、伝導度（−△−）およびＴＵてのＧＤＮＦ活性（−〇−）を示す。

バーでマークした分画はプールしてさらに精製した。

図２は、図１のプールされた分画についてのＦＰＬＣスーパーロースクロマトグ ラフィーの結果を表す。結果はＯ，Ｄ、　２１０　（）　、およびＴＵてのＧＤ ＮＦ活性（−〇−）を示す。

図３は、図２からの分画１４についてのＲＰ−ＨＰＬＣの結果を表す。結果は、 ０、　Ｄ、　２１４　と、下部にＴＵでのＧＤＮＦ活性を示す。

図４は、上記図３から得られた分画３〜１０の銀染色５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅによる 分析の結果である。レーンＳは分子量標準を含有する。

図５は図４からの分画５および６についてのプレバラテイブ５ＤＳ−ＰＡＧＥの 結果を表す。ゲルスライスについてＹＵてのＧＤＮＦ活性を試験した。ゲルスラ イスはまた、分子量マーカー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて分子量を補正した。

図６は図５からの分画１６〜２３についてのＲＰ−ＨＰＬＣの結果を表す。クロ マトグラムＡはサンプルを含有し、クロマトグラムＢは対照である（ブランクレ ーンの相当するスライスからのプールされたゲル抽出物）。

図７は、Ｉｄ６Ａからのピーク３の銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果（ レーンｌ）および分子量対照（レーンＳ）である。

図８は、精製されたＧＤＮＦから得られたアミノ末端アミノ酸配列を示す。空白 の括弧は用いた配列決定法てはアミノ酸を決定できなかった位置を指示する。

括弧内に示した残基は、その残基の同定に確信かなかったことを示す。完全な正 しいアミノ末端アミノ酸配列は以下の図１９に示す。

図９は、トリブソン消化された精製ＧＤＮＦについてのＲＰ−ＨＰＬＣの結果を 表す。クロマトグラムＡはサンプルを含有し、クロマトグラムＢは対照である（ トリプシンのみを含を）。

図１０は、図９からのピーク３７について、シアノーゲンブロミト処理後のＲＰ −ＨＰ　Ｌ　Ｃの結果を表す。

図１１は、図１Ｏからのピークｌの還元生成物のＲＰ−ＨＰＬＣの結果を表す。

図１２は、精製ＧＤＮＦから得られた中間アミノ酸配列を記載する。

図１３は、Ｂ４９細胞ライブラリーｃＤＮＡクローンλＺａｐＩＩ７６．１から 誘導されたラットＧＤＮＦについて得られた核酸配列を示す。また、ＧＤＮＦの 推定されたアミノ酸配列を示す。成熟ＧＤＮＦをコートする核酸配列には下線を 付す。最も好ましいＧＤＮＦのブレープロ型のアミノ末端配列には０印を付す。

図１４は、成熟ＧＤＮＦの推定アミノ酸配列を示す。

図１５は、精製Ｂ４９細胞ＧＤＮＦおよびヒト組換えＣＮＴＦによるトリ胚毛様 体神経節からの副交感神経ニューロンの生残の促進の結果を表す。Ｙ−軸の光学 密度の七脣はニューロンの生残の上昇を示す。Ｘ−軸は各神経栄養因子の濃度の 低下を示す。対照と表示した曲線は、ＧＤＮＦと表示した曲線を発生させるのに 使用したＧＤＮＦ含有分画に隣接する、等容量の不活性ＨＰＬＣ分画による。

図１６は、精製Ｂ４９細胞ＧＤＮＦおよびヒ１−組換えＣＮＴＦによるトリ胚交 感神経鎖神経節からの交感神経ニューロンの生残の促進結果を表す。Ｙ−軸の光 学密度の上昇はニューロンの生残の上昇を示す。Ｘ−軸は各神経栄養因子の濃度 の低下を示す。対照と表示した曲線は、ＧＤＮＦと表示した曲線を発生させるの に使用したＧＤＮＦ含（ｆ分画に隣接する、等容量の不活性ＨＰＬＣ分画による 。

図１７は、ＣＯ３細胞調整培地について、培養中脳ドーパミン作動性ニューロン によるドーパミン取り込みの上昇能のバイオアッセイの結果を表す。Ｙ−軸は、 Ｘ−軸の濃縮ＣＯ８細胞培養培地の量の」−昇に対する放射標識ドーパミンの取 り込み量を示す。Ｂｌと表示した曲線はＧＤＮＦの発現に適当な方向てＧＤＮＦ 遺伝モ遺伝へランスフエクｌ−したＣＯ８細胞からの無血清調整培地を表す。Ｃ −１ど表示した曲線はＧＤＮＦの発現を阻害する逆方向てＧＤＮＦ遺伝子をトラ ンスフェクトしたＣＯ８細胞からの無血清調整培地を表す。

図１８は、ＣＯ３細胞調整培地について、トリ胚の交感神経鎖からの培養交感神 経ニューロンの生残上昇能のバイオアッセイの結果を表す。Ｙ−軸は、培養体に よって低′Ｆ−するＭＭＴ染料の量を示し、これはニューロンの生残に比例する 。Ｘ−軸は濃縮ＣＯ８細胞培養培地の希釈度の上昇を示す。ＧＤＮＦと表示した 曲線はＧＤＮＦの発現に適当な方向てＧＤＮＦ遺伝子をトランスフェクトしたＣ Ｏ８細胞からの無血清調整培地を表す。対照と表示した曲線はＧＤＮＦの発現を 阻害する逆方向てＧＤＮＦＩ！仏子をトランスフェクトしたＣＯ８細胞からの無 血清調整培地を表す。

図１９は、以下の例２Ｃに記載に従い、ヒトＧＤＮＦについて得られた核酸配列 の部分を示し、成熟し１−ＧＤＮＦをコートする遺伝子の全部分を包含する。ま た、成熟上、１−ＧＤＮＦの推定アミノ酸配列を示す。成熟しトＧＤＮＦのアミ ノ酸配列には下線を付しである。

図２０は、ＧＤＮＦの１・−パミン取り込みを刺激する能力、およびドーパミン 作動性ニューロンにおけるチロシンヒＦロキソラーゼ（ＴＨ）免疫染色を示す。

培養は例ＩＢに記載のように確立された。ＧＤＮＦはブレーティングの日に添加 し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ９日後に補充した。Ａ、’Ｈ−ＤＡの取り込みをｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ　１５日後に測定した。Ｂ、培養体をｉｎ　ｖｉｔｒｏ　１６日後に４ ％パラホルムアルデヒドで固定し、徹底的に洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ −１００て透過性にして、ＴＨに対するポリクローナル抗体（Ｅｕｇｉｎｅ　Ｔ ｅｃｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａ１１ｅｎｄａｌｅ、ＮＪ）て染色した 。−次抗体の結合は、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌ ａｂｓ、　Ｂｕｒｌ　ｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）を使用して可視化した。

図２１は、ＧＤＮＦのドーパミン作動性ニューロンに対する特異性を表す。培養 は例ＩＢの記載に従って確立された。ＧＤＮＦはブレーティングの日こ添加した 。

Ａ、’Ｈ−ＤＡの取り込みをｉｎ　ｖｉｔｒｏ７日後に測定した。Ｂ、”Ｃ−Ｇ ＡＢＡの取り込みはｉｎ　ｖｉｔｒｏ８日後に測定した。細胞は、取り込み緩衝 液の構成を５．６１１１Ｍグルコース、１．３ｍＭＦＤＴＡ、ＩＯμＭアミノオ キシ酢酸（ＧＡＢＡの分解を防止する）、２ＩＴＩＭβ−アラニン（ＧＡＢＡの ダリアへの取り込みを阻害する）および０、　ｌ　μＭ”　Ｃ−Ｇ　Ａ　Ｂ　Ａ 　（１５０ｍｃ　ｉ／ｍｍｏｌｅ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ 、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍ`）を 含仔するクレブス−リンゲルのリン酸緩衝液、ｐＨ７，４とした以外は２Ｈ−Ｄ Ａの取り込みの場合と同様にインキュベ−１−Ｌ、処理した。”Ｃ−ＧＡＢＡの ＧＡＢＡニューロンへの取り込みの強力な阻害剤である１ｍＭジアミノ酪酸（Ｄ ＡＢＡ）の存在下には、”Ｃの取り込みは１０％に低下した。ＤＡＢＡの存在下 における対照値を実験値から差し引いた。

図２２は、以下の例２Ｄの記載に従い、ヒトＧＤＮＦについて得られた核酸配列 の部分を示し、ヒトブレープロＧＤＮＦのアミノ酸１〜５０のコート配列を包含 する。また、ヒトブレープロＧＤＮＦの最初の５０個のアミノ酸についての推定 アミノ酸配列を示す。この情報は、図１９に示したコード配列情報と組合わせて 、ヒトブレープロＧＤＮＦの全コート配列、およびヒ１−プレープロＧＤＮＦ蛋 白質についての推定アミノ酸配列を提供する。

図２３は、以下の例２Ｄに記載の、ブラスミｌ”ｐＢＳＳＫ−λ３ＡＩｕｌ内の ５ａｃｌＩおよびＰｓｔ　１部位の地図を表す。

図２４は、ＧＤＮＦのドーパミン作動性ニューロンに対する特異性を表す。培養 体は例ＩＢの記載に従って調製した。ＧＤＮＦはブレーティングの日に添加し、 取り込みはｉｎ　ｖｉｔｒｏ６日後に測定した。Ａはドーパミンの取り込みを、 Ｂはセロトニンの取り込みを示す。

図５は、リフォールディングされていないＧＤＮＦを含有する細菌抽出物のりフ ォールディング前Ｓ−セファロースカラム上クロマトグラフィーがらの分画の、 還元条件下に行ったクーマツノーブルー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥを示す（例６Ｃ参 Ｆ、）。レーン２〜８はカラム溶出液からの連続分画である。ＧＤＮＦに富む分 画３〜５をリフォールディングのためにプールした。レーンｌは分子量標準であ る（ＳＤＳ　−７０Ｌ、　Ｓｉｇｍａ）。

図２６は、リフォールディング前（レーン６および１３）、リフォールディング 後（レーン２）およびリフ十−ルディング（二ついて１５０ｍＭ　２−メルカプ ｊ・エタノールによってバック還元ｆ＆　（レーン５）のＧＤＮＦ溶液のクーマ ツシーブルー染色５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅを示す。リフォールディング前およびバッ ク還元後の物質はモノマーとして約＋６ｋＤａて泳動する。適切なりフォールデ ィング後のＧＤＮＦはダイマーとして約３０ｋＤａて（非還元）泳動する（例６ ｃ参照）。レーン１５は分子量標準である（ＳＤＳ−７ＯＬ、Ｓｉｇ潤）。

図２７は、リフす一ルディングＧＤＮＦを用い、培養トリ胚交感神経ニューロン の生残の促進能を測定したハイオアソセイの結果を表す。バイオアッセイ操作は 例４Ａの記載の通りである。Ｙ−軸に光学密度（生残ニューロンの数に比例）が 、Ｘ−軸Ｊ：（ＤＧＤＮＦ濃度（クーマノノーブルー染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル ル−ザーデンノトメトり一走査によって測定）に対してプロットされている。１ ・り胚交感神経ニューロンの生残に対するリフォールディングＧＤＮＦのＥＤ６ Ｉ、計算値は約３　ｎｇ／ｍｌである。

図２８は、リフォールディングＧＤＮＦを用い、培養ラット胚中脳における点質 ニューロンによるｌ・−パミン取り込み能の上昇を測定したノゾオアッセイの結 果を表す。パイオアンセイ操作は例ＩＢの記載の通りである。Ｙ−軸にドーパミ ンの取り込みかＸ−軸」二のＧＤＮＦｃ４度に対してプロットされている。これ らの培養体における）・−パミン取り込みの増加に対するリフォールディングＧ ＤＮＦのＥＤ、。計算値は約３　ｐｇ／ｍｌである。

好ましい実施態様の詳細な説明 現時点て好ましい本発明の実施態様の詳細を以下に示すが、これは以下の実施例 とともに、本発明の詳細な説明するのに役立つものである。

本発明以前には、ＧＤＮＦは明確な生物学的に活性な物質として同定されていな かったし、実質的に純粋な型として存在しなかった。本明細書に記載するように 、ＧＤＮＦの詳細な解説か、その物理的、化学的および生物学的特性、その利用 性、その作り方、それを含有する有用な組成物、それをコードする核酸配列、こ のような核酸配列を含有するベクター、このようなベクターでトランスフオーム された宿主細胞、その製造のための組換え技術、ならびに本発明の他の態様とと もに提供される。

ＧＤＮＦは、ダリア細胞中に同定され、ダリア細胞から得られ、神経栄養活性を 示す蛋白質である。さらに特定すれば、ＧＤＮＦは、一部は、点質ドーパミン作 動性ニューロンの胚前駆体へのドーパミン取り込みを増大させる能力にょって、 また副交感神経および交感神経細胞の生残を促進する能力によって特徴づけられ る、ドーパミン作動性神経栄養蛋白質である。実質的に精製されたＧＤＮＦはさ らに以下のいくつかの方法で特徴づけられる。

■、　少なくとも約１２．０ＯＯＴＵ／μｇの比活性を有する。

２、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ上、約２０〜２３ｋＤの分子量を存する。

３、　非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ上、約３１〜４２ｋＤの分子量を有する。

４、　８４９−調整培地の比活性より少なくとも約２４．０００倍大きい比活性 を存する。

５　培養中脳のチロシンヒドロキソラーゼ免疫反応性を上方調節する。

６、　図８に示すアミノ末端アミノ酸配列（配列番号ｌ）を有する。

７、　図１２に示す内部アミノ酸配列（配列番号２）を有する。

本発明のＧＤＮＦについて以下にさらに詳細に説明する。本発明のこの態様は、 図８に示す配列（配列番号ｌ）と同一または実質的に相同のアミノ末端アミノ酸 配列を有する任意のドーパミン作動性神経栄養蛋白質をカバーするものであるこ とを理解すべきである。本発明はまた、図１２に示す配列（配列番号２）と同一 または実質的に相同の中間アミノ酸配列ををする任意のドーパミン作動性神経栄 養蛋白質を包含する。

本発明は、本明細書においてダリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と定義される 新規なドーパミン作動性神経栄養蛋白質を包含する。ＧＤＮＦは、Ｂ　４９膠芽 腫細胞の無血清成育調整培地中に同定され、それから実質的に精製された型て単 離された。

ＧＤＮＦは精製され特徴つけられ、精製物質の部分アミノ酸配列か得られた。

得られた部分アミノ酸配列に基づき、ＧＤＮＦの組換え製造に使用できるラット ｃＤＮＡクローンを得るために、ＤＮＡプローブか設計された。このクローンの 核酸配列およびラッ１−ＧＤＮＦの推定アミノ酸配列を図１３（配列番号３）お よび図１４（配列番号４）に示す。

ＧＤＮＦのアミン末端アミノ酸配列か決定された。これを図８（配列番号１）に 示す。ＧＤＮＦの中間アミノ酸配列の部分も決定された。これを図１２（配列番 号２）に示す。精製されたＧＤＮＦは、非還元条件下５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で約３ １〜４２ｋＤ、還元条件下５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で約２０〜２３ｋＤの見掛けの分 子量を存する。このような理論によって限定されるものではないが、この情報は 、ＧＤＮＦか天然に存在する状態ではグリコジル化され、ジスルフィド結合した ダイマーであることと一致するものと考えられる。

以下の例６Ｃにさらに詳細に述へるように、細菌発現系におけるヒトＧＤＮＦ遺 伝子の発現により組換えヒトＧＤＮＦもしくはｒｈＧＤＮＦか製造される。発現 後に単離される物質は生物学的にほとんど不活性で、モノマーとして存在する。

リフす一ルディング後は、ＧＤＮＦは生物学的に活性なジスルフィド−結合ダイ マーとして存在する。したかって、ＧＤＮＦはその天然の生物学的に活性な型で は、ジスルフィド−結合ダイマーである。しかしなから、本発明はＧＤＮＦのモ ノマーおよびダイマーの両者、ならびに生物学的に不活性型および活性型の両者 を包含する。

プローブは、ヒトＧＤＮＦをコートするゲノムＤＮＡ遺伝子をクローニングする ために、ラノ１−ＧＤＮＦの核酸配列に基づいて調製された。成熟ＧＤＮＦをコ ートするヒト遺伝子、およびヒト成熟ＧＤＮＦのアミノ酸配列を図１９（配列番 号５）に示す。

ＧＤＮＦはまた、以下の例１に記載するように、点質ドーパミン作動性ニューロ ンの胚前駆体へのドーパミン取り込みを増大させる能力によって特徴づけられる 。ＧＤＮＦはさらに、以下の例４に記載するように、副交感神経および交感神経 細胞の生残を促進する能力によって特徴つけられる、ＧＤＮＦはまたさらに、培 養中脳でチロシンヒトロキソラーゼの免疫反応性を上方調節する能力によって特 徴づけられる。この特徴の実例は例ＩＥに記載され、図２０に示される。さらに 、ＧＤＮＦは、一般的なニューロンに比較してドーパミン作動性ニューロンにあ る種の特異性を存する。たとえば、これは、γ−アミノ酪醇（ＧＡＢＡ）を含有 するニューロンにおけるＧＡＢＡ取り込みに対する限られた作用によって示され た。これはまた、例ＩＥに記載され、図２１に示される。

ＧＤＮＦはさらにセロトニン作動性ニューロンにおけるセロトニン取り込みに対 して、あったとしても限られた作用しか示さなかった。これは例ＩＥに記載され 、図２４に示される。

本明細書を通して、ダリア由来神経栄養因子といえば、本明細書において特徴づ けられ記載されたＧＤＮＦと実質的に相同で生物学的に同等な、任意の起源の神 経栄養因子を指すものと解釈すべきである。ラットとヒト蛋白質の間のホモロノ ーの程度は約９３％てあり、すへての咄乳動物のＧＤＮＦは同様に高度のホモロ ノーを存するものと考えられる。このようなＧＤＮＦはその生物学的活性型では ダイマーとして存在するものと思われる。

本発明は、本明細書に記載の天然に存在するＧＤＮＦおよび組換えＧＤＮＦのグ リコジル化および非グリコジル化型、ならびにそれらの先端切断型を包含する。

さらに池の実施態様においては、ＧＤＮＦＩ！Ｉもしくは２個以上のポリエチレ ングリコール（ＰＥＧ）または他の反復ポリマー残基の結合によって修飾される 。

本発明はまた、細菌発現系て組換え法で製造され、アミン末端メチオニン残基を 含有するＧＤＮＦも包含する。

明細書および請求の範囲を通じて使用される「生物学的に同等」の語は、Ｂ４９ 調整培地から単離されたＧＤＮＦと類似の様式で同一の神経栄養活性の一部また はすへてを発揮できるか、その程度は必ずしも同一ではなくてもよい本発明の組 成物を意味する。以下に明細書および請求の範囲を通して使用される「実質的に 相同Ｊの語は、Ｂ４９調整培地から単離されたＧＤＮＦに対する、以前に報告さ れたＧＤＮＦによって示されたそれよりも高度のホモロジーを意味する。好まし くは、ホモロノーの程度は７０％以上、とくに好ましくは８０％以上、さらに好 ましくは９０％、９５％もしくは９９％以上である。本明細書に記載のホモロジ ーの％は、２つの配列をＤａｙｈｏｆｆ　（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、５．　ｐ、@１２ ４゜ １９７２、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、ＣC、参考と してとくに本明細書に導入する）の記載に従いアラインメントの補助に１００ア ミノ酸長につき４個のギヤツブを導入できるとして比較した場合、同一のアミノ 酸残基か線列するアミノ酸残基の、小さい方の配列に見出される百分率として計 算される。本町細８に記載されたＧＤＮＦに対する抗体との交叉反応性によって 、またはその遺伝子か本明細書に記載のＧＤＮＦの遺伝子もしくはその遺伝子の セグメントどのハイブリダイゼーシヨンによって単離てきる任意のＧＤＮＦも、 実質的に相同なものとして包含される。

本発明の好ましいＧＤＮＦは、Ｂ４９調整培地から単離され、実質的に精製され た盟に単離された。別の好ましいＧＤＮＦはＧＤＮＦを実質的に精製された型で 産生ずる組換えＤＮＡ法によって製造される。本出願の目的で、本明細書に開示 されるＧＤＮＦについて用いられる「純粋型」または［実質的に精製された型」 の語は、ＧＤＮＦてはない他の蛋白質を実質的に含まないプレパレーンヨンを意 味するものである。本発明のＧＤＮＦは少なくとも５０％純度であることか好ま しく、好ましくは７５％純度、さらに好ましくは８０％、９５％もしくは９９％ 純度である。

本発明の一実施悪様においては、ＧＤＮＦ蛋白プレバレーノヨンは、本技術分野 の通常の熟練者かｉ初にさらに精製工程を実施することなく、そのアミノ酸配列 の少なくとも一部を決定できるような実質的に精製された型である。

本発明の好まし、い実施態様においては、ＧＤＮＦは以下の例１の記載のように 、Ｂ４９調整培地から精製される。もちろん、本明細書に記載された情報を与え られれば、本技術分野の熟練者には、ＧＤＮＦの他のソースを同定しこのような ソースからのＧＤＮＦの精製を、本明細書に提供された精製方法に一般的に従っ て達成できることは明白であろう。

Ｃ；ＤＮＦの１・−パミン作動活性は、精製過程を容易にするために使用される 。

ｌ・−バミン作動性神経栄養活性についてのハイオアソセイは以下の例ＩＢに記 載する。略述すれば、解離させた中脳細胞の培養体を血清強化または無血清の環 境下に調製する。ドーパミン作動活性について試験するサンプルを脱塩し、培養 細胞に希釈系列として添加し、培養皿を６．５％ＣＯ７含有加湿環境下、３７° Ｃで６日間インキュベートする。次に培養体を試験物質の存在下、Ｉ・リチウム 化ドーパミン（’Ｈ−ＤＡ）とともに３７℃でインキュベートする。ドーパミン の取り込みを停止させ、細胞を洗浄し、培養液中に残存するトリチウムをシンチ レーションカウンティングによって分析する。

ＧＤＮＦの精製は以下の例ＩＣに詳述する。精製過程の詳細は表Ｉに示す。調整 培地出発原料はＢ４９膠芽腫細胞から、細胞を無血清培地中に２日間面いたのち 、調整培地を収集し、再補充することによって調製される。このサイクルを、Ｂ ４９細胞の各バッチから３回調整培地か収穫されるまで反復する。調整培地を遠 心分離し、さらに精製する前に約１０倍に濃縮する。

本明細書においてＢ　４９８芽腫の無血清成育調整培地として定義される、この 粗製混合物の調製の第一工程は、調整培地を、０．１５ＮＮ　ａ　ＣＩ含を５０ ｍＭＮ　ａ　Ｐ　ｉ緩衝液、ｐＨ８，０で平衡化したヘパリンセファロースカラ ム上に導入する工程である。溶出か安定したのちに、１．５ＮＮａＣＩ含有５０ ｍＭＮ　ａ　Ｐ　ｉ緩衝液、ｐＨ８，０で作成した勾配緩衝溶液をカラムに導入 する。このクロマトグラフィーからの分画についてＧＤＮＦ活性を測定し、ＧＤ ＮＦ活性を含む分画をプールしてさらに精製する。

プールした分画を０．５ＮＮａＣ１含有５０ｍＭＮ　ａ　Ｐ　ｉ緩衝液、ｐＨ７ ，４の溶媒緩衝液を用い、スーパーロースカラム上迅速蛋白液体クロマトグラフ ィー（ＦＰＬＣ）に付す。再び、得られた分画のＧＤＮＦ活性を測定する。この 操作からの単一分画をついて酸性にし、Ｃ−８逆相高速液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）カラム上に負荷する。ＧＤＮＦ活性を含有することか確認された分 画を合して、さらに精製および蛋白の配列決定を行う。以下の表１に示すように 、この時点て得られたＧＤＮＦは、調整培地の約２４．０００倍の比活性を有す る。この時点て得られた蛋白質のアミノ末端配列決定では、図８に示すアミノ末 端配列（配列番号ｌ）を与える。

ＨＰＬＣて得られたＧＤＮＦの更なる精製は、ＧＤＮＦ活性含存分画についてプ レハラディプ５ＤＳ−ＰＡＧＥを実施することによって達成できる。蛋白含有分 画にグリセロールおよびＳＤＳを含有する緩衝液を加え、この溶液を、非還元１ ５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上、１０°Ｃ１４０ｍΔ／ゲルの電気泳動によって、２時 間泳動させる。分子量約３０〜４２ｋＤに相当するゲル部分にＧＤＮＦ活性を含 むことかノくイオアノセイによって見出された。５ＤＳ−ＰＡＧＥから単離され た物質の第２のＨＰＬＣては、図６に示すように、ＧＤＮＦの単一のピークか得 られる。

表１．８４９細胞ＣＭからのＧＤＮＦの精製工程　蛋白　生物活性　比活性　濃 縮倍率　収率（ＭＧ）　ＣＴＯ刈０−’）　（ＴＵ／μｇ）　（％）ＣＭ　２０ ０　９４　０．５　（＋）　（＋００）１、ヘハリノ七７Ｔロース　３．１　３ ７　１２　２４　３９２、ＦＰＬＣスーハー叶ス　０．３’　３１　１０３　２ ０６　３３３、ＲＨ−ＨＰＬＣＯ，００１１′　＋２　１２．０００　２４．０ ００　＋３４、プレハラディプ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ　ｎ、ｄ　７　ｎ、ｄ　ｎ、 ｄ　７５、ＲＰ−ＨＰＬＣＯ，０００３”　５　１７．０００　３４．０００　 ５″Ｏ，Ｄ、、、。に基つく ５蛋白配列決定（ｐｉｃａｍｏｌｅ）からの回収およびＧＤＮＦの推定分子量３ ６ｋＤ　（非還元５Ｏ３−ＰＡＧＥ）に基づく ｎ、ｄ−測定せず ＧＤＮＦのアミノ末端配列はプレバラティグ５ＤＳ−ＰＡＧＥ前後のＨＰＬＣか らの物質について決定された。精製されたＧＤＮＦのアミノ酸配列を得るために 利用された操作は例ＩＤに示す。アミノ末端配列は気相蛋白ンーケンサーによっ て得られた。内部配列は、ＨＰＬＣから得られ、まだブレノくラテイブ５ＤＳ− ＰＡＧＥによってさらに精製されていない物質から得られた。内部アミノ酸配列 は精製されたＧＤＮＦをトリプシンとインキュへ−１・することによって得られ た。

得られたトリブソンフラグメントをＨＰＬＣによって分離した。１つのフラグメ ントは非処理蛋白のアミノ末端配列の最初の１３のアミノ酸残基を含むことか見 出された。第２のフラグメントはＣＮＢｒて処理し、ＨＰＬＣて精製し、還元し 、再びＨＰＬＣて精製した。得られたアミノ酸配列は図１２に示す（配列番号２ ）。

括弧内に示した配列はその決定の信頼度か低かったものである。

本発明は、ＧＤＮＦの遺伝子をクローニングする方法、およびＧＤＮＦをコート することが確認された遺伝子を包含する。ＧＤＮＦのラットおよびヒト遺伝子の クローニングのための詳細な操作は以下の例２に示す。この場合も、本明細書の 開示を参照すれば、本技術分野の熟練者にはこのような遺伝子をクローニングす る他の方法は自明であることが理解されよう。とくに、ＧＤＮＦをコードする他 の種からの遺伝子のクローニングは、本明細書に記載の開示および操作を考慮す れば自明であると考える。

本明細書に記載のラットＧＤＮＦ遺伝子は、Ｂ４９細胞から単離されたポリＡ″ ＲＮＡより構築されたｃＤＮＡライブラリーから得て、精製ＧＤＮＦから得られ たアミノ酸配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした 。ｃＤＮＡは標準操作によって得られ、ＥｃｏＲＩ−消化リンカ−を含有するよ うに処理し、λＺａｐ　ＩＩクローニングベクター中に挿入した。用いられたハ イブリダイゼーシヨンプローブは３２ｐ−標識され、以下の縮重オリゴヌクレオ チド（配列番号７）・ ５°　＞ｃｃＩＧＡＴＡＡＡＣＡＡＧＣＩＣ；ＣＩＧＣ＞３ＧＧ から構築された。数個の陽性クローンか得られ、１つのクローン（λＺａｐ　ｌ ｌ７６゜１）か、ＤＮＡ配列決定により、縮重プローブの設計に用いられなかっ たＧＤＮＦの部分をコートする陽性クローンとして確認された。

λＺａｐＩ［７６，１中に含まれるｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を得る ための操作は以下の例２Ｂに示す。ｃＤＮＡクローンの５′末端の最初の８′７ ７塩基対のヌクレオチド配列か決定され、図１３に示されている（配列番号２） 。図１３に示されたクローンは、精製されたＧＤＮＦのアミノ末端を包含し、精 製されたＧＤＮＦの切断によって得られた内部ペプチドの配列と一致する２２７ アミノ酸のオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する。

図１４に掲げた推定アミノ酸配列（配列番号４）は［成熟ＧＤＮＦＪのアミノ酸 配列を示す。「成熟ＧＤＮＦＪ　とはＢ４９調整培地から得られ精製されたＧＤ ＮＦの配列を意味する。もちろん、精製されたＧＤＮＦは、ダイマーもしくは他 のマルチマーとして存在してもよく、またグリコノル化もしくは他の方式で化学 的に修飾されていてもよい。成熟ＧＤＮＦは、カルボキシル末端において、とく にカルボキシル末端から６および５残基のｌｙｓ−ａｒｇ残基の蛋白分解プロセ ッシングによって切断されていてもよい。図１３に示すλＺａｐ　ｌｌ７６、ｌ ラットクローンの核酸配列（配列番号２）を調へると、ＧＤＮＦは最初プレープ ロＧＤＮＦポリペプチドとして翻訳され、この分子のシグナル配列および「プロ 」部分の蛋白分解的プロセッシングによって８４９調整培地から得られた配列と 同し成熟配列を有する精製されたＧＤＮＦを生じることか示唆される。ブレープ ロＧＤＮＦポリペプチドはこのクローンの５′末端で最初の、メチオニンをコー ドするＡＴＧコドン（図１３における位１１１５０）で始まるものと考えられる 。したかって、本発明は図１３に示す遺伝子から翻訳される任意のそしてすべて のプレープロＧＤＮＦポリペブチ１−１ならびに本技術分野の熟練音によれば本 明細書に記載の標準実験室操作およびクローンを用いて容易に得られるより完全 なりローンがら翻訳される任意のそしてすへてのプレープロＧＤＮＦポリペプチ ドを包含する。

図１３に示すラット核酸配列（配列番号２）を見ると、位置５１８と５３８の間 に配置される予測アミノ酸配列はＡｓｐ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａ ｓｎ−Ｌｅｕて、以下の例１の中間配列に関する部分に記載の方法によって精製 された成熟ＧＤＮＦに由来するペブチ１−について決定されたアミノ酸配列と一 致することを示している。位置７０６におけるＴＧＡストップコドンてＯＲＦは 終結する。したがって、精製ＧＤＮＦの予測される長さは１３４アミノ酸残基て あり、このポリペプチドの推定される分子量は１４．９３１である。２つの可能 性あるＮ−結合グリコノル化部位が位置４２５と５３３に存在する。これらの部 位のいずれかまたは両者でのグリコノル化がこの分子の分子量を増大させる。

精製された成熟ＧＤＮＦの配列の開始点に相当する位置２８１におけるセリン残 基の前には、ＧＤＮＦの推定前駆型のプロセッシングによりＢ４９細胞がら精製 される分子量を産生する蛋白分解的切断部位と考えられる部位を提供する配列Ｌ ｙｓ−Ａｒｇかある。可能性のある翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は配列中の位置５ ｏに存在し、これは分泌シグナルと考えられる配列に直接続いている。このＡＴ Ｇに隣接する配列は、コサツクのコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ　１９８７　Ｎ ｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：Ｉ２５−４８）と極めて類似して、この ＡＴＧか翻訳開始部位として利用される可能性を指示するものと考えられる。さ らに、このＡＴＧはｃＤＮＡクローンの配列中最も５゜側のＡＴＧである。これ らの事実はそれがＧＤＮＦの前駆型の翻訳開始部位である可能性を示唆するもの である。

ラットｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列のこれらの上述の特徴はＧＤＮＦか 最初プレープロＧＤＮＦポリペプチドとして翻訳され、この分子のシグナル配列 および「プロ」部分の蛋白分解的プロセッシングによりＢ４９細胞調整培地から 精製される型のＧＤＮＦか産生ずる可能性か示唆される。しかしながら、他の型 のＧＤＮＦの存在も上記配列データと矛盾するものてはない。たとえば、６８］ ｂｐのＯＲＦ内には他に可能性のある２つのＡＴＧ翻訳開始部位が存在する。一 つは位置２０６、もう一つは位置２４２である。これらのＡＴＧは精製されたＧ ＤＮＦのアミノ末端配列の開始部位の上流に位置する。真核生物においては、翻 訳の開始は一般にｍＲＮＡの最も５′側のＡＴＧで起こる（Ｋｏｚａｋ、前出） が、一部の翻訳開始か下流のＡＴＧで起こる場合もある。すなわち、ＧＤＮＦの 別の前駆型がこれらのＡＴＧフトンでの翻訳開始によって生しることも多分ある とも考えられる。

これらのポリペプチドの蛋白分解的プロセッシングでも、Ｂ４９細胞調整培地中 に認められるのと同じ型の精製ＧＤＮＦか産生てきる。しかも、オーブンリーデ ィングフレームはｃＤＮＡクローンの配列の５′末端を通過して延長する。した がって、翻訳の開始はｃＤＮＡクローン中には存在しない上流ＡＴＧで起こるこ とは可能である。この結果、ＧＤＮＦは、本明細書に記載されたアミノ酸配列と 付加的な上流配列を含有するさらに大きい前駆体として翻訳される可能性もある 。

この仮定される前駆型のプロセッシングでも、本明細書に記載されたＧＤＮＦの 精製型の生成を生じる。逆転写酵素を用いるプライマー延長（Ｍａｎｉａｔｉｓ ら、前出）によれば、ＧＤＮＦ遺伝子を含むｍＲＮＡの５°末端を配列決定する ことによって、上流ＡＴＧによる開始の可能性を検出することが可能であろう。

さらには、池のｃＤＮＡクローンか８４９ライブラリーがら得られ、これらのク ローンの５°末端の配列か決定される可能性も考えられる。最初のＡＴＧの上流 に位置する５’　ｍＲＮＡのサイズならば、　［Ｓ１マツピングＪ　（Ｍａｎｉ ａｔｉｓら、前出）および／または逆転写酵素反応のプライマーエクステンソヨ ン生成物の単純なサイジングによってもっとラフに決定することかてきよう。精 製されたＧＤＮＦをコートする配列を含む一次翻訳生成物には様々の推定型を考 えることかできるか、組換えファージλＺａｐ　Ｉ［７６、ｌ中に運はれるｃＤ ＮＡクローンについて本明細書に示した部分ＤＮＡ配列が、Ｂ４９細胞調整培地 から単離された精製ＧＤＮＦポリペプチドを樽成するコート配列を明瞭に定義す るものである。

以下の例２Ｃには、ＧＤＮＦをコードするヒト遺伝子のクローニングか記載され る。ヒトゲノムライブラリーを例２Ｂに記載のラットｃＤＮＡクローンから誘導 されたプローブてスクリーニングした。ヒｌ−Ｃ；ＤＮＦ遺伝子のゲノムＤＮＡ クローンか確認された。成熟ヒトＧＤＮＦをコートする遺伝子の配列は図１９に 示す（配列番号５）。

ヒトＧＤＮＦの遺伝モについて図１９に示した配列は、ＧＤＮＦのブレープロ部 分についての全コート配列を与えるものではない。ヒトブレープロＧＤＮＦの最 初の５０個のアミノ酸についてのコート配列を得る方法は以下の例２Ｄに記載さ れる。得られた配列は図２２に示す（配列番号８）。この配列を冴るために使用 したプラスミドｐ８５５に一λ３Ａｌｕｌの地図は図２３に示す通りである。

本発明はＧＤＮＦをコードする核酸配列を包含する。ラット（図１３）（配列番 号３）およびヒｌ−（図１９）（配列番号５）ＧＤＮＦをコートする、比較的ホ モロノーの高い配列は本明細書に示す通りである。本発明の範囲内にはまた、同 一のまたは高い相同性のアミノ酸配列をコートする実質的に類似の核酸配列も包 含される。たとえば、細菌発現系たとえば大腸菌内で成熟ＧＤＮＦを発現させる ための構築体を調製する場合には、図１９に示した核酸配列（配列番号５）のあ る種のコ］・ンは、よく知られた標準操作により大腸菌内で発現しゃすいコドン に置換される。このような修飾された核酸配列も本発明の範囲内に包含されるも のである。

特定の核酸配列は本技術分野の熟練音によれは修飾可能である。したかって、本 発明はまた、図１４（配列番号４）および＋９（配列番号５）に掲げる成熟ラッ トおよび成熟し１−ＧＤＮＦ、ならびに図１３（配列番号３）に掲げるプレープ ロラットＧＤＮＦおよび図１９（配列番号５）と図２２（配列番号８）に掲げる プレープロヒトＧＤＮＦのアミノ酸配列をコートするすべての核酸配列を包含す る。本発明はまた、すへてのこのような核酸配列とハイブリダイズし−一すなわ ちそれらの配列の適当な相補体でありｍ−かつドーパミン作動活性を有するポリ ペプチドをコートする核酸配列を包含する。本発明はまた、１・−パミン作動活 性を有し、かつＧＤＮＦに結合する抗体によって認識されるポリペプチドをフー ドする核酸配列を包含する。

本発明はまた、本発明の範囲内に包含される任意の核酸配列に発現調節要素か機 能的に連結してなるベクターを包含する。本発明はまた、本発明の範囲内に包含 される任意の核酸配列に発現調節要素か機能的に連結してなるベクターでトラン スフオームされたｍ−任意の変種のｍ−宿主細胞を包含するＣＯ３細胞中でのＧ ＤＮＦの発現か以下の例５に記載される。図１３に記載されたＧＤＮＦをコート する遺伝子を、クローン化遺伝子をｃｏｓｍ胞のような細胞中で一過性に発現さ せるために設計されたベクターであるプラスミドベクターｐＳＧＳ中にサブクロ ーニングした。適切および不適切な方向てＧＤＮＦ遺伝子を含有するブラスミ１ −を選択し、そのＤＮＡをＣＯ３−７細胞に１−ランスフオームした。培養後、 ｌ・ランスフオームされた細胞を収穫した。ＣＯ３−７調製培地を、１・−パミ ン作動性アッセイおよび交感神経節ニューロンアッセイの両者での生物活性につ いて試験した。適切な方向にＧＤＮＦの遺伝子を含有する細胞からの調製培地は これらのアッセイの両者において生物活性を示すことか見出され、これは、組換 えＤＮＡ法によって生物学的に活性なＧＤＮＦか効果的に製造されたことを指示 するものである。

本発明の好ましい実施態様においては、ヒトＧＤＮＦが、細菌発現系て組換えＤ ＮＡ法によって製造される。

ヒトＧＤＮＦの大腸菌における発現を以下の例６に記載する。図１９に示す成熟 ヒトＧＤＮＦをコートするヒ１−ＧＤＮＦ遺伝子の部分を使用して、ヒトＧＤＮ Ｆ構築体を調製した。このような構築体をブラスミ＋：ベクター中にリゲートシ 、これを大腸菌株ＪＭ１０７に１−ランスフオームした。トランスフオームされ た宿主細胞を培養り生成したＧＤＮＦを収穫した。成熟ヒトＧＤＮＦに期待され る分子量（約１５．０００ダルトン）の蛋白質か得られ、アミノ末端配列決定に より得られた蛋白質か成熟ヒトＧＤＮＦであることか確認された。

大ＭｈＶｉで発現されたヒトＧＤＮＦのリフォールディングおよび再生は以下の 例６Ｃに記載する。記載された本発明の実施態様においては、得られた発現蛋白 質含イ■抽出物はりフォールディングの前に、Ｓ−セファロースファーストフロ ー樹脂上イオン交換クロマトグラフィーによって部分精製した。リフォールディ ングは、ＧＤＮＦ含存抽出物に、最初ジチオスレイト−ル、ついでグルタチオン 二ナトリウム塩、ついてリフォールディング緩衝液を加えて達成された。リフォ ールディングされたｒｈＧＤＮＦは実質的に完全な生物学的活性を示し、生物学 的に活性なジスルフィド−結合ダイマーとして存在した。ＧＤＮＦはりフォール ディングの前にはｍ−またリフォールディング物質の還元後には−−モノマー状 態で存在し、実質的に生物学的に不活性である。

ＧＤＮＦはまた、他の発現系でも製造できる。たとえば、図１９に示す成熟ヒト ＧＤＮＦをコートする核酸配列を用いれは、本技術分野の熟練者には他の発現系 てＧＤＮＦを製造することか可能であろう。ＧＤＮＦをコートする核酸配列が発 現調節要素に機能的に連結して含まれるベクターを、他の微生物宿主細胞たとえ はＢａｃｉ　ｌ　Ｉｕｓ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏ口ａＳおよび酵母にトランスフオ ームすることかてきる。バキュロウィルス発現系も同様に使用できる。

上述のように、本発明は神経障害に罹患した患者の神経障害の処置方法に関する 。これらの方法は、神経障害に罹患している患者にヒト蛋白質、ダリア由来神経 栄養因子（ＧＤＮＦ）の治療有効量を投与することからなる。

神経細胞および／またはそれらの軸索突起の生残または機能か害されている場合 、疾患または医学的徴候は神経障害であると考えられる。好ましい実施態様にお いては、このような神経障害は、以下の状態のいずれかの結果として起こるもの である。すなわち。ｌ）傷害部位の近傍の軸索突起および／または神経細胞体の 変性を生しる物理的傷害、２）卒中の場合のような虚血、３）癌やエイズの化学 療法剤たとえはそれぞれンスブラチｔムおよびジデオキシシチジン（ｄｄｅ）の ような神経毒への暴露、４）慢性代謝性疾患、たとえは糖尿病または腎機能不全 、ならびに４）特定のニューロン集団の変性を生しるパーキンソン病、アルツハ イマー病、および萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。神経傷害か関与する状態 の非限定的なリストには、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬 化症、卒中、糖尿病性多発性ニューロパシー、癌化学療法剤、タキソールまたは シスプラチンもしくはビンクリスチンによって生じる中毒性末梢性ニューロパシ ー、エイズ化学療法剤、ｄｄｌまたはｄｄＣによって生じる中毒性末梢性ニュー ロパシー、ならびに脳およびを髄の物理的傷害または腕および手の圧潰または切 断創傷によって生じるような神経系に対する物理的障害が包含される。

ＧＤＮＦの製造方法も本明細書に開示される。開示される一つの方法は、ダリア 細胞系調整培地のような様々なソースからＧＤＮＦを単離する方法である。第２ の方法は、ＧＤＮＦのコートに関与する遺伝子の単離、この遺伝子の適当なベク ターへおよび細胞種へのクローニング、ならびにＧＤＮＦの製造のためのその遺 伝子の発現を包含する。一般的に組換えＤＮＡ法の例である後者の方法は、本発 明の好ましい方法である。組換えＤＮＡ法は、一部には比較的大量の蛋白質の高 純度での製造を達成できるので好ましい。組換えヒトＧＤＮＦは治療用粗製物の 製造および神経障害の処置に最も好ましい蛋白質である。

本発明はまた、ＧＤＮＦとのアミノ酸配列ホモロジーを有する蛋白質をコードす る遺伝子の同定およびクローニングのための手段、ならびにこのようにして同定 された蛋白質を包含する。

３種の神経栄養因子から構成される哺乳動物遺伝子ファミリーか報告されている 化ｅｉｂｒｏｃｋら、　１９８９　Ｎａｔｕｒｅ　３４１　：１４９−１５２； 　Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、　１９９０５ｃｉｅｎｃ■@２４７＋ １４４６−１４５１）。このファミリーを構成する３つの蛋白質の成熟型［神経 成長因子（ＮＦＣ）　、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）　、およびニューロト ロフィン−３（ＮＴ−３）は互いに約５０％のアミノ酸同一性を存する。これら の蛋白質のそれぞれに存在する６個のシスティン残基は正確に保存されている。

構造的には類似しているか、これらの３種の蛋白質は異なる組織分布（Ｅｒｎｆ ｏｒｓら、　＋９９０　Ｎｅｕｒｏｎ５：５１１−５２６：　Ｍａｉｓｏｎｐｉ ｅｒｒｅら、　１９９０　Ｎｅｕｒｏｒ＋　５：５０１−５０９　；およびＰｈ １ｌｌｉｐｓら、P９９０ ＳｃＩｅｎｃｅ　２５０：２９０−２９４）および異なるｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性 （Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ　ら、　１９９０　Ｎｅｕｒｏｎ４ニア６アー７７３：　 Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅら、１９８７　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｒｅｖ　１２二３４ ９）を示す。

ＧＤＮＦは以前報告された蛋白質と有意なホモロジーは示さないが、ＧＤＮＦに 実質的なアミノ酸配列ホモロジーを存し、異なる組織特異的分布パターンおよび ／または異なる活性スペクトルをもつ神経栄養因子として１ｎνｉｖｏて機能て きる蛋白質をコートする未確認の遺伝子か存在する可能性はある。このような蛋 白質か神経栄養因子のＧＤＮＦファミリーのメンバーを構成するのであろう。図 １３（配列番号３）および１９（配列番号５）ならびに２２（配列番号８）にそ れぞれ示したラットおよびヒトＧＤＮＦ遺伝子のＤＮＡ配列はこのような推定ｒ ＧＤＮＦ遺伝Ｆフ遺伝リファミリ−いメンバーの同定に使用することかできるも のと考えられる。

上述のｒＮＧＦ遺伝子ファミリーノまたはｒＧＤＮＦｉＩ伝子ファミリー」のよ うな遺伝子ファミリーのメンバーである蛋白質生成物間のアミノ酸配列の保存性 の結果として、ＤＮＡレベルでもかなりの保存性か認められる。したかって、適 当なハイブリダイゼーション条件下にはファミリー内の遺伝子間に核酸［交叉ハ イブリダイセーフ３ン」か起こりつる。すなわちファミリーのメンバーの一つか ら誘導された核酸プローブかそのプローブとは同一ではないか類似の配列を存す るそのファミリーの異なるメンバーからの核酸分子と安定なハイブリドニ重鎮分 沿を形成することかありうる（Ｂｅｌｔｚら、１９８３　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１００：２６６−２８５）。したかって、ＧＤＮＦに 配列ホモロジーによって類似する遺伝子を、ラット、ヒトまたは任意の他の種か らのＧＤＮＦの配列に基づく単独もしくは縮重ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）プロー ブを調製し、様々な標的ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）との不完全対の核酸二重鎖の 安定な形成を可能にする条件下にハイブリダイゼーション実験を行うことによっ てスクリーニングできる。

このようなハイブリダイゼーション条件はしばしば「低緊縮条件」と呼ばれ、文 献に詳述されている（Ｂｅｌｔｚら、前出、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、　＋９８９　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）、水溶液中で行 われるときには多くの場合ハイブリダイゼーション反応の温度低下および／また は通常は５０％ホルムアミド含仔含液溶液いるハイブリダイゼーション基におけ るホルムアミドの濃度の低下か包含される。ハイブリダイゼーション緊縮度を低 下させる他の手段も報告されていて、それらも使用可能であった（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら、前出）。これらのハイブリダイゼーション実験における核酸標的には、 １）ハクテリオファージ、プラスミド、コスミト、酵母人工染色体を包含する任 意のを利なベクターまたは任意の他の種類のベクター中にクローン化されたヒト 、ラット、もしくは任意の哺乳動物種または任意の他の種のＤＮＡを含むゲノム ＤＮＡライブラリー、 ２）任意の上述の生物体から得られる、もしくは任意の上述の生物体から得られ る任意の種類の一次細胞の培養体から得られる任意の種類の組織から、または現 在存在するもしくは一次細胞培養体から産生される任意の種類の安定な細胞系か らのＲＮＡによって発生されるｃＤＮＡライブラリー、３）制限酵素で消化され 、ゲル電気泳動によるサザンプロット分析用に準備され固体支持体上に移送され る上記ｌ）に記載のゲノムＤＮＡ、４）電気泳動に付しノザンプロット分析用に 固体支持体に移送される上に）に記載のＲＮＡ、このようなＲＮＡてあれば、総 細胞性ＲＮＡまたは分画化ポリＡ′″ＲＮΔを包含できる、 ５）ＧＤＮＦ中に存在する配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーを用い、 鋳型として上記ｌ）〜４）に記載の任意の核酸ソースを使用するポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）の生成物 を包含することか考えられる。

ＧＤＮＦベースのプローブに、ある経験的に決定された一連のハイブリダイゼ一 シヨン条件下でハイブリダイズすることか証明された任意の核酸配列について、 本技術分野の熟練者にはよく知られている様々な任意の方法でクローン化さ札配 列決定され、ＧＤＮＦ遺伝子ファミリーのメンバーの確認のために直接、配列の ホモロジーか決定される。このようなハイブリダイゼーションアプローチは、Ｎ ＧＦ配列をベースにしたプローブを用いるスクリーニングによるＮＴ−３のクロ ーニングに使用された（Ｋａｉｓｈｏら、　＋９９０　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ ｓ　２６６：１８７−１９１）。

ＧＤＮＦファミリーメンバーを同定するための別法には、ＧＤＮＦファミリーメ ンバーからの配列を増幅しついて増幅配列をクローニングし分析する、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する方法かある。ＰＣＲ用の縮重（または非縮重 ）オリゴヌクレオチドブライマーは、ＧＤＮＦの配列に基づいて合成できる。

システィン配置の保存性、およびＮＧＦファミリーに観察されるシスティン残基 の直接近傍におけるアミノ酸配列の保存性を考慮すれば、成熟ＧＤＮＦのシステ インの周辺領域がプライマー合成の明らかな候補を提供するが、様々な池のプラ イマーら、成熟およびブレープロ部分蛋白質の両者から選択できた。ＰＣＲ反応 は、ＧＤＮＦ配列のみてなく任意のＧＤＮＦファミリーメンバーの配列の増幅も 反応の生成物はゲル電気泳動によってサイズ選択し、適当なベクター中にクロー ン化し、クローン化されたＤＮＡを配列決定してＧＤＮＦファミリーメンバーを 同定できる。別法として、クローンを最初にＧＤＮＦに特異的なプローブへの高 緊縮条件下におけるハイブリダイゼーションてスクリーニングしてＧＤＮＦクロ ーンを同定することもてきる。高緊縮条件下にＧＤＮＦにハイブリダイズできな いクローンをついて配列決定するか、またはこのようなりローンを低緊縮条件下 にＧＤＮＦプローブにハイブリダイズさせ、これらの条件下にＧＤＮＦプローブ にハイブリダイズしたクローンをついて配列決定することもできる。

ＧＤＮＦファミリーメンバーのクローニングにＰＣＲを用いる第２のアプローチ では、上述のＰＣＲ反ＬＬ：の生成物を標識し、それらの生成物を、高および／ または低緊縮条件下、上に列挙した核酸標的をスクリーニングするだめのプロー ブとして使用するものである。ハイブリダイズしたクローンまたは核酸セグメン トは上に詳述したように分析して、ＧＤＮＦクローンおよびファミリーメンバー をｉ；認することかできる。このようなアプローチは、ＮＧＦおよびＢＤＮＦの 配列をヘースにしてＮＴ−３をクローニングするために使用されたＱｉｌａｉｓ ｏｎｐｉｅｒｒｅら、ｌ９９０Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５１） 。

本発明の好ましい実施態様においては、ＧＤＮＦからなる治療用もしくは医薬組 成物か、神経障害に罹患している患者に有効量投与される。本発明の好ましい実 施態様においては、ＧＤＮＦはパーキンソン病に罹患している患者の処置に治療 的に使用される。本技術分野の熟練者であれは、とのニューロンかＧＤＮＦによ るｌｈ療に応答するかを指示するために利用される各種アッセイについて晴間し ていて、ＧＤＮＦに感受性の池の受容ニューロンの決定はどくに複雑な実験を行 ・うことな〈実施てきる筈である。本技術分野の熟練者であれば、ＧＤＮＦのメ ッセーノか生体内のとこに発現し、それらの各領域においてＧＤＮＦ蛋白質はど のようなレベル存在するかは容易に決定できることである。本技術分野の熟練者 であれば、また、神経系中のＧＤＮＦの結合部位の配置を決定することもできよ う。

この情報から、本技術分野の熟練者には、ＧＤＮＦに応答すると思われるニュー ロンの種類を決定することが可能になり、これは一方、この蛋白質の適当な臨床 的適用を示唆することになろう。ＧＤＮＦかこのような適用の処置に有用である 可能性を検討するためには、ついて適当な細胞培養および動物実験を行うことが できる。

Ｂ４９調整培地から単離された精製ＧＤＮＦはまた、培養液中て副交感神経およ び交感神経細胞の生残を促進することか示されている。これらの結果は例４に詳 １　述する。

ＧＤＮＦの神経栄養機能か別個の分離可能な１または２以、Ｅの部分に備ってい る可能性もあるので、本発明の方法か、活性成分はＧＤＮＦの神経栄養機能を制 御するＧＤＮＦのその１または２以上の部分からなる治療用組成物を投与するこ とによって実施される場合も考えられる。

本発明の治療用もしくは医薬組成物は好ましくは、注射により非経口的にまたは 移植されたポンプからの連続注入により脳を髄液中に直接投与される。また、池 の効果的な投与形態、たとえば非経口徐放性処方、吸入用ミスト、経口的に活性 な処方、または坐剤も意図される。また、ＧＤＮＦの血液脳関門の透過を促進で きるｌもしくは２以上の薬剤と組合わせた投与も意図される。一つの好ましい担 体は生理食塩溶液であるが、池の医薬的に許容される担体たとえば人工Ｃ３Ｆの 使用も考えられる。一つの好ましい実施態様においては、担体とＧＤＮＦで生理 的に適合性のある徐放性処方を構成させることか考えられる。このような担体に おける一次溶媒は本質的に水性でも非水性でもよい。さらに担体には、処方のｐ Ｈ，浸透圧、粘度、澄明度、色調、滅菌性、安定性、溶出速度または臭気を改変 または維持するための医薬的に許容される他の賦形剤を含有させることができる 。同様に、担体にはさらに、Ｃ；ＤＮＦの安定性、溶出、放出もしくは吸着速度 、または血液脳関門の透過性を修飾または維持するための他の医薬的に許容され る賦形剤を含有させることかできる。このような賦形剤は、単位用量もしくは多 重用量刑形での非経口投与用または移植ポンプからの連続的もしくは周期的注入 によるＣ　Ｓ　Ｆ中への直接注入用の剤形の処方に通常および慣用的に使用され る物質である。

治療用組成物か処方されたならば、それは溶液、懸濁液、ゲル、乳化液、固体、 または脱水もしくは凍結乾燥粉末どして、滅菌バイアル中に保ｒγされる。この ような処方は、そのまま使用できる型あるいは投与直前に再構築を要する型のい ずれかとして保存できる。このような処方の好ましい保存条件は、少なくとも４ °Ｃ以下、好ましくは一７０°Ｃである。

ＧＤＮＦを含有する処方の非経口投与様式は、皮下、筋肉内、鞘膜内または脳内 の経路か好ましい。ＧＤＮＦの所望用量の投与を達成するためには、毎日または もっと低頻度で皮下もしくは筋肉内注射による投与を反復するか、または移植ポ ンプから連続的もしくは周期的にＧＤＮＦを注入する。投与頻度は使用される処 方および投Ｌｊ経路におけるＧＤＮＦの薬物動力学パラメーターに依存する。

細胞体は脳およびを髄内にあるドーパミン作動性および他の障害神経細胞に対し て所望用量のＧＤＮＦを到達させるためには、ＧＤＮＦは脳もしくはを髄のクモ 股下腔または脳室内に投与することか考えられる。投与は連続的にまたは周期的 に行い、一定もしくはプログラム可能な流速の移植ポンプによりまたは周期的注 射により達成できる。投与はまた、ＧＤＮＦの血液脳関門の透過を可能にする薬 剤と組合せて行うこともてきる。

ＧＤＮＦを含有するある種の処方では、経口的投与も意図される。好ましくは、 この様式で投与されるＧＤＮＦはカプセルに１を人される。カプセル封入ＧＤＮ Ｆは、固体剤形の調合に慣用的に使用される担体を用いてまたは用いないで処方 できる。好ましくは、カプセルは、生物学的利用性か最大になり全身作用前の分 解か最小になる時に胃腸管内において、処方の活性部分か放出されるように設計 される。ＧＤＮＦの吸収を促進する他の賦形剤を包含させることもてきる。希釈 剤、フレーバー、低融αワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、およ び結合剤も使用できる。

投与様式とは無関係に、特定の用量は、患者のおおよその体重または体表面積に よって計算される。上述の各処方か関与する処置に適当な投与量を決定するのに ｔ要な計算をさらに精密化することは、本技術分野の通常の熟練者によってルー チンに行われ、とくに本明細書に開示された投与量情報およびアッセイを参考に 、面倒な実験を行うことなく、ルーチンに実施される課題の範囲内にある。これ らの投与量は、適当な用量−反応データとともに用いられる投与量決定のための 確立されたアッセイの使用によって確認できる。

本発明の一実施懇様においては、ＧＤＮＦは、生物学的に活性な型のＧＤＮＦを 合成し分泌できる細胞を患者に移植することによって治療的に投与することかで きる。このようなＧＤＮＦ産生細胞は天然のＧＤＮＦ産生体（Ｂ４９細胞の類縁 体）の細胞であってしよく、またＧＤＮＦの産生能か、ＧＤＮＦ遺伝子をその発 現および分泌か促進される適当な型でトランスフオームすることによって増強さ れた細胞とすることもてきる。異種のＧＤＮＦを投与することにより患者に免疫 学的反応か起こる可能性を最小限にするため、天然のＧＤＮＦ産生体細胞はヒト 起源であり、ヒトＧＤＮＦを産生ずることか好ましい。同様に、以下の例５およ び６に使用されたのと類似の方法でヒトＧＤＮＦをコートする発現構築体を用い 、細胞をヒトＧＤＮＦを発現するようにトランスフオームすることか可能である 。

自然にヒトＧＤＮＦを分泌てきる細胞は以下のツールを用いて同定できる。すな わち（１）ヒトＧＤＮＦのメツセンジャーＲＮＡの部分またはヒトＧＤＮＦのメ ツセンジャーＲＮＡの部分に相補性であるオリゴヌクレオチドを使用して、ノザ ンプロット分析、ＲＮアーゼプロテクション、ｉｎ　５ｉｔｕハイブリダイゼー ソヨン、ポリメラーゼ連鎖反応もしくは他の類似方法によりヒトＧＤＮＦメツセ ージを産生ずる細胞系を発見するか、または（２）ヒトＧＤＮＦを認識するポリ クローナルもしくはモノクローナル抗体を用い、抽出物もしくは調整培地かＧＤ ＮＦ蛋白質を含む細胞系を、ウェスタンプロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放 射免疫アッセイもしくは他の類似の方法で発見する。好ましい戦略では、ＧＤＮ Ｆをそれらの培養培地中に分泌する細胞を発見するための上記（２）の方法によ り、ヒト起源の一連の細胞からの調整培地をヒトＧＤＮＦに対する抗体てスクリ ーニングする。

産生されたＧＤＮＦの確認は、Ｂ４９細胞によって産生され、それらの培養培地 中に分泌されたＧＤＮＦについて実施したように、精製ついでアミノ酸分析によ って行われる。以下の例７には、ヒト組換えＧＤＮＦに対する抗体の製造および 単離について記載する。

天然にヒトＧＤＮＦを分泌する細胞またはヒトＧＤＮＦを分泌するように１−ラ ンスフオームされた細胞を患者の処置に使用できる。ヒトまたは非−ヒト動物細 胞を、ＧＤＮＦの放出は可能であるか患者の免疫系による細胞の破壊を防止する 半透過性ポリマー封入体中に入れて患者に移植する。別法として、ｅｘ　ｖｉｖ ｏにおいてＧＤＮＦを産生ずるようにトランスフオームした患者自身の細胞を直 接、このような封入を行わないで移植することもできる。

生細胞の膜封入の方法は本技術分野の通常の熟練者にはよく知られていて、封入 された細胞の調製およびそれらの患者への移植は、とくに複雑な実験を行わない で達成できる。米国特許第４．８９２．５３８号、第５．０＋１．４７２号およ び第５．１０６．６２７１号を参照されたい。各特許は参考として本明細書に特 に導入される。生細胞を封入する系はＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出、ｆ＃０ ９１／１０４２５号に記載されている（参考として本明細書に特に導入する）。

また、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出、ａＷ０９１／１０４７０号：Ｗｉ　ｎ ｎら、１９９１　Ｅｘｐｅｒ　Ｎｅｕｒｏｌ、１１３：３２２−３２９　；　Ａ ｅｂｉｓｃｈｅｒ　ら、　１９９１　Ｅｘｐｅｒ　mｅｕｒｏｌ。

ＩＩＩ：２６９−２７５＋Ｔｒｅｓｃｏら、　１９９２　ＡＳＡＩｏ　３８：１ ７−２３も参考になる。いずれも参考として本明細書に特に導入する。

とくに、ＧＤＮＦを分泌する細胞は、パーキンソン病患者の、点質ドーパミン作 動性ニューロンの終末領域にＧＤＮＦを提供するため線条体に、またドーパミン 作動性細胞体にＧＤＮＦを提供するために点質に、移植できる。このように局所 的に適用されたＧＤＮＦはドーパミン作動性終末による線条体の成長および再神 経支配を促進し、ドーパミン作動性神経細胞のそれ以上の変性を防止することに なる。

したかって、本発明は、それを必要とする患者の生体内に、ＧＤＮＦを発生する 天然の能力によって選択されるかまたはＧＤＮＦを分泌するように操作された細 胞を移植することによって神経障害を防止または処置する方法を包含する。患者 かヒトの場合、分泌されるＧＤＮＦは好ましくはヒト成熟ＧＤＮＦである。

本明細書に記載されたＧＤＮＦ処方は、動物用にもヒト用にも同様に使用できる ものであり、「患者」の語は限定的に解釈すべきてはないことを理解すべきであ る。動物に適用する場合、その投与量の範囲は上に特定した範囲と同一である。

本発明の教示の特定の問題および環境への適用は、本明細書に含まれた教示に基 づいて本技術分野の通常の熟練者の能力内にあるものである。本発明の代表的な 使用例を以下の実施例に示す。

この例にはＧＤＮＦのバイオアッセイおよび精製方法を記載する。また精製の出 発材料であるＢ４９細胞系調整培地の調製方法も記載する。精製されたＧＤＮＦ のアミノ酸配列を得る方法、および精製された蛋白質から得られた部分アミノ酸 配列も記載される。

Ａ、材料ニ一定時期の妊娠ラットはＺｉｖｉｅ　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｌａｂ、　Ａ１ １ｉｓｏｎ　Ｐａｒｋ、　ＰＡから入手した。とくに指示にない限りすへての試 薬はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯから入手した。

妊＠１６日目にＳｐｒａＢｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胚のラッら吻側中脳披蓋を 、滅菌条件で顕微鏡下に摘出し、無Ｃａ２“−および無Ｍｇ　２″″−ダルベツ コリン酸緩衝食塩溶液（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇａｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ） 中に集め、穏やかに磨砕して機械的に解離させた。細胞を４００μ！の培地を含 有する１６−１ｍ直径の組織培養ウェル（Ｆａｌｃｏｎ、　Ｌｉ口ｃｏｉｎＰａ ｒｋ、　ＮＪ、　２４−ウェルプレート）上にウェルあたり１００μｍをブレー ティングして、ウェルあたり２．５〜３．５刈０５細胞の密度とした。培養ウェ ルは予め、１０ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８，４中０．１ｍｇ／ｍｌのボ１几 −オルニチン溶液に３７°Ｃで３時間暴露し、ｍ１ｌｌｉ−Ｑ　Ｈ，０中て３回 、アールの平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ）で１回洗浄した。栄養培地（１０／１０） は、グルコース（３３ｍＭ）　、炭酸水素ナトリウム（２４，５ｍＭ）　、グル タミン（２ｍＭ）　、ＨＥＰＥＳ　（１５ｍＭ）　、ペニシリンＧ（５Ｕ／ｍ１ ）、ストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ）　、１０％熱不活性化胎仔給液血清（ Ｇｉｂｃｏ）、および１０％熱不活性化ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ）を補給した最小 必須培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）とした。培養液を、６．５％ＣＯ２含存水蒸気 飽和大気中、３７°Ｃに保持した。

３時間後、大部分の細胞かウェルの底部に付着した時点で、培地を５００μｌの 新鮮培地に置換した。この時、各ウェルにＧＤＮＦ活性をアッセイするサンプル の希釈系列を二重試験法で添加し、プレートを３７°Ｃのインキュヘーター中で インキュベートした。１週後、培養液をフルオロデオキシウリノン（１３μｇ／ ｍｌ）およびウリジン（３３μｇ／ｍｌ　）で２４時間処理して過剰のダリアの 増殖を防止し、ついて給液ウソ血清を含まない上記培地を供給した。栄養培地は １週毎に交換した。別法として、血清を蛋白質、ホルモンおよび塩の混合物て置 換した化学的に特定された無血清培地を用いた。特定培地（ＤＭ）は、ＭＥＭお よび、グルコース（３３ｍＭ）　、グルタミン（２ｍＭ）　、ＮａＨＣＯｓ　（ ２４，５ｍＭ）　、ＨＥＰＥＳ（１５ｍＭ）を含むＦ１２栄養栄養物（いずれも Ｇｉｂｃｏ、ｌ：Ｉ；　ｖｏｌ／ｖｏｌ）の混合物に、トランスフェリン（１０ ０ｉ／ｍｌ）　、インスリン（２５ｔｔ　ｇ／ｍｌ　）　、プトレッシン（６０ μＭ）　、プロゲステロン（２０μＭ）　、亜セレン酸すトリウム（３０１Ｍ） 　、ペニシリンＧ（５０／ｍｌ）およびストレプトマイノン（５μｇ／ｍｌ）を 補充して構成された。ＤＭの浸透圧はｍ１ｌｌｉ−Ｑ　Ｈ２Ｏ（１１０〜１２５ ｍ１　Ｈ２０／Ｉ’）の添加により３２５に調整した。ＤＭを用いると、形態学 的にまたは星状細胞特異的細胞体質蛋白質であるグリア原線維酸性蛋白質（ＧＦ ＡＰ）に対する染色によって、非神経細胞はほとんど明らかでなかった。

ＧＤＮＦは血清含有および特定培地の両者でドーパミンの取り込み刺激活性を有 する。以下の実施例において到達したアッセイはすべて血清含有培地中で行われ た。

ドーパミン作動性ニューロンの機能状態はこれらの培養体中、ドーパミン作動性 ニューロンにおける特異的［スカベンジャー」　トランスポータ二を介するドー パミンの取り込みを測定することにより、また免疫組織化学的にドーパミン合成 酵素、チロシンヒドロキシラーゼに対する陽性ニューロンの数をカウントするこ とにより検定できる。培養体に、同様に１・−パミンを輸送し、またチロシンヒ ドロキシラーゼを含有することかできるノルアドレナリン作動性ニューロンが有 意に夾雑している可能性は、注意深い摘出と、ドーパミントランスポーターがノ ルアドレナリン作動性ニューロンよりもむしろドーパミン作動性ニューロンの特 徴的な薬埋像を仔することから除外された。これらの培養体におけるドーパミン の取り込みは、ドーパミン作動性ニューロンのモノアミントランスポーターのイ ンヒビターであるＧＢＲ１２９０９によって、２０μＭのＥＤ、、て阻害される 。これに反し、ツルア）・トナリン作動性ニューロンにおけるモノアミントラン スポーターのインヒビターであるデシブラミンでは少なくとも３００倍以上かそ れらの培養体におけるドーパミンの取り込み阻害には必要である。これらの値は ドーパミン作動性ニューロンにおけるモノアミントランスポーターについて報告 されていた値である。

サンプルの調製　中脳細胞培養体中のドーパミン作動性神経栄養活性のアッセイ に先立って、精製の工Ｆ１１〜工程３（以下の０項参照）から得られたすべての サンプルを以下のように脱塩した。培地１０／１０（担体として）１００μｍを Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）に加えて、１０分間静置させた。検 定すべきサンプルのアリコートをＣｅｎｔｒｉｃ叩に加え、ついて重炭酸塩は含 まないかｌＯｍＭＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓを含有するダルベツコ高グルコース改良イー グル培地、ｐＨ７，２（溶液Ａ）１ｍｌを加え、５，００ＱＸｇて７０分間遠心 分離した。沈殿物（約ｏ、１ｍ１）を新鮮な溶液へにより１．１ｍｌに戻して、 ２回再濃縮した。サンプルを、０．１１　μｍ　Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ無菌 Ｄｕｒａｐｏｒｅ＋−−−ット（Ｍｉ　Ｉｔ　１ｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ） を通して濾過し、培養ウェルに加えた。

−７２）をわずかに改変して日６または７に実施し、すべての溶液は３７°Ｃに 維持した。

略述すれば、培養培地を除去し、５．６ｍＭグルコース、１．３ｍＭ　ＥＤＴＡ 、０．１ｍＭアスコルビン酸および０．５ｍＭパルギリン、モノアミンオキシダ ーゼのインヒビターを含有するクレブス−リンゲルのリン酸緩衝液、ｐＨ７，４ からなる取り込み緩衝液０．２５ｍ１で２回洗浄した。培養体を５０μＭ　’Ｈ −ＤＡ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ。

Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ、比活性３６〜３７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　０．２５ｍ１とと もに３７°Ｃて１５分間インキュベートした。インキュベーション混合物を除去 して’Ｈ−ＤＡの取り込みを停止させ、ついて細胞を０．５ｍｌの取り込み緩衝 液で２回洗浄した。細胞から’Ｈ−ＤＡを放出させるために培養液を９５％エタ ノール０．５ｍｌ　と３７℃で３０分間インキュベートし、次にｌ０ｍ１のＥｃ ｏＬｉ　ｔｅ（ＩＣＮ、　Ｉｒｖｉｎｅ、　ＣＡ）に加え、シンチレーションカ ウンターでカウントした。ブランク値は、取り込み緩衝液に０．５ｍＭＧＢＲ− １２９０９（ＲＢ　Ｉ）、ドーパミンニューロンの高親和性取り込みポンプの特 異的インヒビター（Ｈｅｉｋｋｉ　ｌａら、　１９８４　Ｅｕｒｏ　Ｊ、Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌ、１０３：２４１−４８）を加えて得られ、通常非処理対照培養液 中’Ｈ−ＤＡ取り込みの５％未満であった。ＧＤＮＦ活性の栄養単位（ＴＵ）数 は培養液の’Ｈ−ＤＡ取り込みの５０％最大１ｉ１１激を与えた希釈の逆数と定 義された。比活性はＴＵ数をサンプル中に存在する蛋白質量て徐してめた。

Ｃ，ＧＤＮＦの精製 出発原料　Ｄ、　５ｃｈｕｂｅｒｔ、　５ａｌｋ　Ｉｎ５ｊｉ　Ｔｕｔｅ、　Ｌ ａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡがら入手したＢ４９膠芽腫細胞（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、 　１９７４　Ｎａｔｕｒｅ　２４９：２２４−２７参照）は、培養フラスコ中（ ２２５ｃｍ”、Ｃｏ５ｔａｒ、　Ｃａｒｎｂｒｉｄｇｅ、　ＩＪＡ）、１０％胎 仔給液血清、４　ｍＭグルタミン、５００／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ ｍｌストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ培地でフンフルーエンスになるまで増殖さ せた。無血清成育調整培地（ＣＭ）は、培養体を１回１０ｍ１の無血清培地で洗 浄し、ついて細胞をフラスコあたりｓｏｍ　ｌの無血清培地中に２日装置いて調 製した。ＣＭを収集し、細胞には以後日６まで２日毎に新鮮な無血清培地を補給 した。細胞の各バッチからの３回のＣＭの収穫を合せて、４°Ｃ，５，０００Ｘ ｇて２０分間遠心分離して細胞および細胞層を除去した。上清をＡｍ１ｃｏｎコ ンセントレータ−（ＹＭＩＯ膜）で約１０倍に濃縮し、４°Ｃ，４０，０００Ｘ ｇ　テ２０分間遠心分離した。

」二清を０．２μＭｉｃｒｏ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃａｐｓｕｌｅ　（Ｇｅｌｍａ ｎ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）を通して濾過した。４°Ｃで１力月まで保存可能であっ た。

工程１．ヘパリンセファロースクロマトグラフィー　上述のプレバレージョン（ ２０Ｇｍｇの蛋白質）を、Ｏ，１５ＮＮａＣＩ含有５０ｍＭＮ　ａ　Ｐ　ｉ緩衝 液、１）Ｈ８，０（）１衝液Ａ）で平衡化したヘパリンセファａ−スＣＬ　−６ Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｐｉｓｃａｊａｗａｙ、　ＮＪ）のカラム（Ｉ　Ｘ２５ｃｍ）上に負荷した。カ ラムをついて同し緩衝液により、溶出液の２８０ｒ＋ｍの光学密度（０，Ｄｔ− ０）かヘースラインに復するまで洗浄し、緩衝液Ａから１．５ＮＮａＣ１含イ￥ ５０ｍＭＮａＰｉ　、ｐＨ８，０（緩衝液Ｂ）へ至る１００ｍ１の直線勾配で溶 出した。２ｍｌの分画を集めた。分画を伝導度およびＧＤＮＦ活性について分析 した。図１にはこのクロマトグラフィーを示す。溶出蛋白像をＯＤ２．。とじて プロットした。各分画て測定した伝導度とＣ；ＤＮＦ活性のプロットを重ねであ る。ビークＧＤＮＦ活性を示し、バーて指示した分画（はぼ０．６〜０．８　Ｎ Ｎａ　Ｃ１）をプールしてさらに分析した。

工程２．ＦＰＬＣスーパーロースクロマトグラフィー：上記プールをＡｍ１ｃｏ ｎコンセントレータ−（Ａｍｉｃｏｎ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ｌｉ［Ａ、　ＹＭ ＩＯ膜）で０．４ｍｌに濃縮して、迅速蛋白液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ ）スーパーロース１２カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上、０．５ＮＮａＣ１含有 ５０ｍＭＮ　ａ　Ｐ　ｉ緩衝液ｐＨ７，４中、流速０．５ｍｌ／分でクロマトグ ラフィーに付した。１４分間溶出したのち、０．５ｍｌの分画を５μＩの０．４ ％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むシリコン処理微量遠沈管に集めた。各分画がらのアリ コートにっきＧＤＮＦ活性を分析した。図２には、ＯＤ２゜。て１〜レースした 蛋白像にＧＤＮＦ活性のパターンを重ねて、このクロマ］・グラフィーを示す。

カラムに負荷したＧＤＮＦ活性の８５％か分画番号１２〜１５に回収された。

工程３．ＲＰ−ＨＰＬＣ：上記からの分画番号１４を１０μｍの５％トリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）で酸性にした。酸性にした材料の半分を径の細いＡｑｕａｐｏ ｒｅ　ＲＰ−３００Ｃ−８逆相ＨＰＬＣカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　ｃｏｌｕｍ ｎ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ。

ＩＣＡ）　２．Ｉ　Ｘ２２０ｎｉｎ　ｉ：負荷し、Ｈ，Ｏｌｏ、１％ＴＦＡ：８ ０％７セトニトリル１０．８５％ＴＦＡ勾配て溶出した。蛋白含有分画を２１４ ＋ｕｎのＵＶ吸収に基づき、手動で、ノリコン処理微量遠沈管に集めた。各分画 のアリコートをＧＤＮＦ活性について分析した。図３には、このクロマトグラフ ィーを、Ｏ，Ｄ、、、でトレースした蛋白像により、下方パネルのその活性パタ ーンとともに示す。分画５および６がＲＰ−ＨＰＬＣて回収された活性の約９０ ％を含有し、分画７が残りの１０％の活性を含んでいた。図４は図３に示すＧＤ ＮＦ活性ピーク附近の分画を５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルに泳動し、銀染色した結果を 示す。

工程４　ブレバッチィブ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　：ビークＧＤＮＦ活性を含有する分 画５および６をプールし、１０μｌの０．４％Ｔｗｅｅｎ　２０の存在下高速真 空で２０μｍに濃縮した。サンプルに１μｍの１ＭＴｒｉｓ塩基、および４０％ グリセロールおよび５％ＳＤＳ含仔０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ６，８ ，５μｌを加え、非還元１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に流した（Ｌａｅｍｍｌｉ　 １９７０　Ｎａｔｕｒｅ　２７７：６８０−６８４）　（０，０７５ｘ１４ｘ比 ５ｃｍのスラブ、２０ウェル−コム、０．０７５　ｘＯ，４ｘ２．８ｃｍ／サン プルウェル）。電気泳動は１０°Ｃ１Ｃ１４Ｏ／ゲルで２時間実施した。ゲルス トリップを１．１４ｎｗｎのスライスに薄切した。各スライスをさらに小さな２ つの細片に切断し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　２０含有５ｍＭＮａＰｉ、ｐＨ６， ７の５μｍを３回順次交換して、２０時間にゎたり４°Ｃで絶えず振盪しなから 溶出した。溶出した物質の３つのアリコートを合せてＧＤＮＦ活性を検定しく図 ５）、最高の活性を示す溶出液（図５の３０〜４２　ｋＤに相当するゲルスライ ス番号１６〜２３）をプールした。ブランクゲルストリップ（を気泳動前に５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液のみか負荷された最頂部）も対照として同様に操作 した。

工程５．ＲＰ−ＨＰＬＣ：プールしたゲル溶出液を高速真空で約１５０μｍに濃 縮し、２０μｍの２５％ＴＦＡて酸性にし、工程３の記載と同様にしてＲＨ−Ｈ Ｐ　Ｌ　Ｃを行った。蛋白含有分画をＯ，Ｄ、、４に基づいて手動で、ソリコン 処理微量遠沈管に集め、ＧＤＮＦ活性について検定した。図６にはこのクロマト グラフィーの結果を示す。対照として、同様のサイズとしたブランクゲルスライ スからの溶出液についてもＲＨ−ＨＰ　Ｌ　Ｃを行った。上記サンプル中対照像 を超える唯一の有意なＯ，Ｄ２．４　ピークはビーク３て（図６、パネルＡ対Ｂ ）、それか・　ＨＰＬＣカラムに負荷されたＧＤＮＦ活性の約７０９６を含有す る。図７には銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル」二に通したビーク３を示す。可視化 された唯一の染色は３０〜４２ｋＤの間の極めて広いバンドで、プレパラティブ ５ＤＳ−ＰＡＧＥで認められたＧＤＮＦ活性像（図５）と一致する。典型的な精 製の要約を表Ｉに示す。

Ｄ、ｌｆｌ製ＧＤＮＦのアミノ酸配列決定了ミノ末端配列１図６のピーク３の配 列を、気相蛋白ンーケンサ−（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｊｅｍｓ）を用いて 決定した。得られた配列を図８に示す。工程３の精製後の′ビークＧＤＮＦ活性 を存する分画（図３の分画５および６）の配列決定でも、精製サンプルてｆ７ｆ 、られた図８の配列と同一の単一の配列か明らかにされた。これらの異ｆｊる分 画に共通する唯一の物質は３０〜４２ｋＤａの間をスミアとして移動する物質で ある。したかって、図４の銀染色ゲル分画５および６に見られる３０〜４２ｋＤ 領域の外側に夾雑するハントは、ａ）現在の技術では配列決定できない量（くＩ ピコモル）、ｂ）配列か３０〜４２　ｋＤスミアに類似する、またはＣ）ブロッ クされたアミノ酸末端を（ｆするのいずれかであろう。

中間配列　上述の工程３の精！２後のＧＤＮＦブレパレーノヨンを出発原料とし て使用して中間配列を１！ｔた。図３の分画５および６を９μＩの０．４％Ｔｗ ｅｅｎ　２０を含有するノリコン処理微量遠沈管にプールし、高速真空で約４０ μｍに濃縮した。

サンプルに、２．５Ｍグアニジノ塩酸塩および１μｇのトリプシンを含有する１ ６０μｍの１％ＮＨ４ＨＣＯ２を加えて、３７°Ｃて一夜インキユベートした。

混合物を２０μＩの２５９６Ｔ　Ｆ　Ａで酸性にして、高速真空て約１５０μｍ に濃縮し、ペプチドを径の細いＡｑｕａｐｏｒｅ　ＲＰ−３００Ｃ−８逆相ＨＰ ＬＣカラム（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　ｃｏｌｕｍｎ）、２．１×２２０ｍｍ上で分離 し、Ｈ２Ｏ１０，１％ＴＦＡ：８０％アセトニトリル１０．８５％ＴＦＡ勾配て 溶出した。ペプチド含有分画を２１４βｍの吸収に基ついて手動で、ソリコン処 理微量遠沈管に集めた。図９にはこのクロマトグラフィーの結果を示す。図９の ピークＩＯの配列は、図８に示す非処理蛋白質のアミノ−末端の配列（配列番号 ｌ）の最初の１３個のアミノ酸残基と同しであると決定された。図９のビーク３ ７はさらにＣＮＢｒて処理した。サンプルを高速真空で２０μＩに濃縮した。サ ンプルに、７０μｌの９０％ギ酸および５ｍｇのＣＮＢｒを加え、サンプルを暗 所、室温で一夜インキュベートした。この混合物を高速真空で２０μｍに濃縮し 、０．１％ＴＦＡ１００μｌて希釈し、上述のように逆相ＨＰＬＣて分離した。

図１Ｏにはこのクロマトグラフィーの結果を示す。図１０のピークｌを５μｌの ０．４％Ｔｗｅｅｎ　２０の存在下に高速真空で２０μｍに濃縮した。サンプル にｌＯＯμｌの１％ＮＨ，ＨＣＯ，および５μｌの５０ｍＭジチオスレイトール を加え、サンプルを室温で１時間インキュベートした。混合物を１０μｍの２５ ％ＴＦＡて酸性にして、高速真空で１００μｌに濃縮し、上述のように逆相ＨＰ ＬＣて分離した。図ＩＩには、このクロマトグラフィーの結果を示す。図１１の ビーク３３および３４の両者力洞−の配列を与えた（図１２）（配列番号２）。

において、ＧＤＮＦは５ＤＳ−ＰＡＧＥ上、３１〜４２　ｋＤの間のスミアバン ドとして移動する。サンプルを還元剤（４９６β−メルカプ）・エタノール）の 存在下に１゜Ｏ″Ｃに３時間加熱すると、ＧＤＮＦは２０〜２３ｋＤＯ間の個別 の多重バンドどして移動した。ゲルに負荷した生物活性の約５０％か前者（非還 元）の条件では回収できるか、後者の条件（還元）では回収できなかったことか ら、ＧＤＮＦはジスルフィド結合したダイマーであり、ダイマーとしてのみ活性 であると考えられる。

単一のアミノ末端はこのＧＤＮＦブレパレーソヨンはコアー次構造に関しては均 一であるか、スミアまたは多重バントのパターンは不均一なグリコノル化蛋白質 であることか示唆される。

これはドーパミン取り込みの半最大刺激か約６０ｐｇ／ｍｌという比較的低ａ度 て起こることを示している。ｖ４製されたＧＤＮＦについて測定された比活性は 、ＲＰ−ＨＰ　Ｌ　Ｃに使用された酸性存機溶媒および５ＤＳ−ＰＡＧＥにおＩ Ｊる変性条件への装置による精製時のＧＤＮＦの部分不活性化によって、幾分低 く評価されている可能性かある。

ＧＤＮＦの特異性　ＧＤＮＦは、ドーパミンニューロンにおけるドーパミンの取 り込みを増強するその能力によって精製された（図２ＯＡ）。ＧＤＭＦかドーパ ミンニューロンの生残および／または成熟の他の係数も上方調節しているかを測 定するために、中脳培養体中でのチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫反応性 も測定した。ＴＨは培養体中のドーパミンニューロンに特異的なマーカーである 。

ＧＤＮＦによる免疫反応性の−Ｅ方調節は、ドーパミンニューロンの生残の上昇 および／またはドーパミンニューロンあたりのＴＨの産生の増加によって起こり つる。ブレーティングの田こ精製ＧＤＮＦを加えて、８日後に培養体を調べると 、ＧＤＮＦを加えない対照よ１月０倍多い数のＴＨ“ニューロンを生じた。第２ 回目のＧＤＮＦを日９に加え、７Ｉコ（ｉｎ　ｖｉけ０て１６日）？＆に培養体 を調へたところ、対照に比へて同様の用量依Ｃ？！性の増大か依然として観察さ れた（図２０Ｂ）。すなわぢ、ＧＤＮＦによれば、１−一バミンニューロンの生 残の維持および／または中脳ｌ・−バミンニューロンにおけるＴＨ遺伝子の発現 の増大か可能であった。

ＧＤＮＦか１・−パミンニューロンの成熟および／または生残に特異的な刺激効 果を発揮し、すへてのニューロンに対する一般的な作用を示すものではないこと を確認するため、中脳培養物体に同様に存在するγ−アミノ醋酸（ＧＡＢＡ）を 含むニューロンのＧＤＮＦに対する応答性を分析した。様々なＧＤＮＦ濃度てそ れぞれ＋５および１６０増殖させた中脳細胞の姉妹培養体で、Ｈ３−ドーパミン ＣＨ−ＤＡ）および１４Ｃ−ＧＡＢＡの取り込みを測定した。上述のように、Ｇ ＤＮＦは中脳１・−パミンニューロンの３８−ＤＡ取り込み能をＧＤＮＦを加え ない対照以上に約１５０％増大させた（図２１Ａ）。しかしなから、ＧＤＮＦの 存在下においても”Ｃ−ＧＡＢＡの取り込みは対照の取り込みよりもわずかに約 ２０％高いだけて、ＧＤＮＦはＧＡＢＡニューロンの”Ｃ−ＧＡＢＡ取り込み能 には存意な影響を与えなかった（図２１Ｂ）。これは”Ｈ−ＤＡ／”Ｃ−ＧＡＢ Ａ取り込み比の計算値の上昇によっても例示できる（図２ＩＣ）。これらのデー タは、中脳のドーパミンおよびＧＡＢＡニューロンはＧＤＮＦの存在に対して異 なる応答を示し、中脳培養体の’Ｈ−ＤＡの取り込みに対するＧＤＮＦの作用は ＧＡＢＡニューロンとの対比から明らかなようにドーパミンに対して特異的であ ることを指示するものである。

これらの観察は、ＧＤＮＦかパーキンソン病またはドーパミン作動性ニューロン の関与する他の疾患の処置に使用される理由をさらに明確にするものである。

これらの結果は、ＧＤＮＦがドーパミン作動性ニューロンの少なくとも２つの重 要な性質、ドーパミンの取り込みとＴＨ酵素レベルを上方調節することを証明す る。これらの結果はまた、ＧＡＢＡニューロンは同じ影響を受けないことから、 ＧＤＮＦの作用は少なくとも部分的に、ドーパミン作動性ニューロンに特異的で あることを示している。

ドーパミン作動性およびＧＡＢＡ作動性ニューロンに加えて、ラット胚中脳培養 体には他のニューロン集団、セロトニン作動性ニューロンかある。一部の因子、 たとえは中脳培養体中のドーパミン作動性ニューロンによるドーパミンの取り込 みを増大させる上皮増殖因子（ＥＧＦ）は同様に、セロトニン作動性ニューロン によるセロトニンの取り込みおよびＧＡＢＡ作動性ニューロンによるＧＡＢＡの 取り込みも増大させる（Ｃａｓｐｅｒら、＋９９１　Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、 　３０：３７２参照）。これは、これらの因子かドーパミン作動性ニューロンに 特異的ではないことを指示する。

これに反し、ＧＤＮＦはセロトニン作動性ニューロンによるセロトニンの取り込 みを増大させない。３Ｈ−セロトニンの取り込みは、取り込み緩衝液か’Ｈ−Ｄ Ａの代わりに５０％Ｍの３Ｈ−セロトニン（１１Ｃｉ／ｍｏｌｅ、　Ａｍｅｒｓ ｈａｍ、　ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅＡｒｌｌｎ、　ＩＬ）を含有するほかは、例 ＩＢに記載した’Ｈ−ＤＡの取り込みの場合と同様の方法で測定した。セロトニ ンニューロンにおけるセロトニンの取り込みの強力な既知のインヒビターである シタルブラム（Ｍｏｕｎｔ　５ｉｎａｉ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ のｃ、ｕｙｔ山ｎｅｏｕ博士から恵与された）１０μＭの存在下には、用−セロ トニンの取り込みは１５％に低下した。シタルブラムの存在下における対照値が 、図２４に示す実験値から差し引かれた。

ＥＧＦのような非特異的因子とは異なり、ＧＤＮＦは、ドーパミンの取り込みか 存意に増大する条件下に、ＧＡＢＡの取り込み（図２１）およびセロトニンの取 り込み（図２４）を増大させない。これらのおよび上述の結果は、ＧＤＮＦか、 同し中脳培養体中に存在するＧＡＢＡ作動性およびセロトニン作動性ニューロン に比較した場合、中脳培養体中の！・−バミン作動性ニューロンに特異的である ことを示している。このような特異性は中脳（点質）のドーパミン作動性ニュー ロンに特異的な疾患であると考えられるパーキンソン病の処置に対するＧＤＮＦ の有用性を高めるものである。

ＧＤＮＦをコートする遺伝子のクローニングのためには、Ｂ４９細胞から単離さ れたポリＡ″ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築し、このライブラリーを、 精製されたＧＤＮＦから得られたアミノ酸配列に基づく縮重オリゴヌクレオチド プローブてスクリーニングした。このプローブにハイブリダイズしたｃＤＮＡク ロー履よ、ＤＮＡ配列決定によって、縮重オリゴヌクレオチドプローブに用いら れた配列の３′に位置し、ＧＤＮＦ中に（Ｆ、在してスクリーニングオリゴプロ ーブのヘースとしこアミノ酸配列に対してカルボキシ末端に位置するＤＮＡ配列 を含イ１することか決定された。

Ｂ４９細胞系の培養条件は上記例１に詳述されている。ＲＮＡブレバレージョン のためには、細胞を血清含仔培地中てほぼコンフルーエンスまで増殖させ、１回 無血清培地（ＤＭＥＭ）で洗浄し、ＤＭＥＭ中で４日間、２日後に１回培地を変 えて増殖させた。細胞をついて収穫し、総ＲＮＡをＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　＆ 　５ａｃｃｈｉ　１９８７ゴｄＴセルロースアフイニテイーカラムを通過させて 調製された。

ｃＤＮＡの合成はＭ−ＭＬＶ　ＲＮアーゼＨ４逆転写酵素（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１、ａｂ、　Ｇａｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を用い、 その販売業者により記載されたプロトコールに従って行われた。最初のス］・ラ ン１ル反応はオリゴｄＴ、６プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で開始し、５１ １ｇのポリΔ’　ＲＮＡあたり８単位のＲＮａｓｉｎ　（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａ ｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）も含Ｙｒさせた。第２のストランド合成は、大腸菌ＤＮＡポ リメラーゼＩ、大腸菌ＲＮアーゼＨ１および大腸菌ＤＮＡリガーゼ（すべてＢＲ Ｌより）により販売業者のプロトコールに従って行われた。クローニングを容易 にするため、ｃＤＮＡはフラッシュ末端を生成させるためにＴ４ＤＮＡポリメラ ーゼ（ＢＲＬ）で処理し、大腸菌メチラーゼ（ＢＲＬ）でメチル化した。これら の工程は酵素の販売業者によって供給されているプロトコールに従って実施した 。ｃＤＮＡはついでフェノールとクロロホルムのｌ：１混合物ｌ容量によって２ 回抽出し、水性分画を７．５ＭのＮＨ４ＨＣＩ／２容およびエタノール３容によ り室温で沈殿させた。沈殿を、室温、＋６．ｏｏｏＸｇにおいて１５分間遠心分 離して回収し、７０％エタノールて洗浄し、真空で乾燥させ、５００ピコモルの リン酸化リンカ−（ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧ、　Ｐｈａｒｉａｃｉａ）　（配 列番号９）および３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を含有する５０μｌの ５０μＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（７，６）、１０ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２．１ｍＭ 　ＡＴＰＪｎＭ　ＤＴＴ、５％のＰ　Ｅ　Ｇ３０００中に再懸濁した。リンカー リゲーソヨンは１６°Ｃで一夜（約１６時間）実施した。反応混合物をフェノー ル／クロロホルムで抽出し、上述のように沈殿させた。洗浄したペレットを乾燥 し、５０μＩのＥｃｏＲＩ消化緩衝液［１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（７， ５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５０ｍＭ　ＮａＣ１および０．０２５％Ｔｒｉｔｏ ｎ　Ｘ−１００コに再懸濁し、これに４００単位のＥｃｏＲＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を加えた。沈殿ｔ＆（上 述のようにして）、ペレットをＥｃｏＲＩ消化緩衝液に再懸濁して、第２ラウン ドのＥｃｏＲＩ消化を上述のように実施した。この反応生成物を沈殿させて、４ ０μｍの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（８，０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｌｏｏｍ Ｍ　ＮａＣｌ中に再懸濁した。このＥｃｏＲＩ消化リンカ−を含むｃＤＮＡをセ ファクリルＳ−３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）スピンカラムを通して約＋　１０ ０ｇで５分間遠心分離してサイズ分画した。このカラムからの流出液を集め、上 述のようにエタノールで沈殿させ、ＩＱ　＋＋＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（８，０ ）、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ中に約０．１Ｈｇ／μｌの濃度で再懸濁した。

ｃＤＮＡライブラリーはλＺａｐ　Ｉ［（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌ ｌａ、ＣＡ）クローニングベクター中に構築した。通常、ｌμｇのＥｃｏＲＩ　 ／ｌ！１（Ｌホスファターゼ処理ベクターアーム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより購 入）を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（７，６）　、７ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、１ ｍＭＤＴＴ、５％のＰ　Ｅ　Ｇ３０００および１ｍＭＡＴＰ中に約３Ｗｅｉｓｓ 単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いた５μｍのリゲーンヨン液中、０． １ＨｇのＥｃｏＲＩ連結ｃＤＮＡにリゲートした。リゲーションは１６°Ｃで一 夜実施した。リゲーションはＧｉｇａｐａｃｋ　ＩＦ　Ｇｏｌｄパッケージング エキストラクト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより購入）に販売業者によって供給され たプロトコールに従ってパッケージした。ライブラリーはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ により提供されたＸＬＩ−Ｂｌｕｅホスト上に滴定およびスクリーニングのため にブレーティングした。

このようなリゲーションおよびパッケージングの一つから、約２７０．０００の プラーク形成単位か計１２の１５０ｍｍ直径のぺｌ・リブレート上にプレートア ウトされた。

これらのプレートから、１Ｊａｎｉａｔｉｓらによって記載された操作ののちに 、ニトロセルロースフィルターリフ１−か二重に調製された。フィルターを以下 の２２ｐ−標識縮重オリゴヌクレオチド（配列番号７）（１＝イノシン）。

５’　＞ＣＣＩＧＡＴＡＡＡＣＡＡＧＣＩＧＣＩＧＧ＞３’ＧＧ にハイブリダイズさせた。この配列は先の例１に記載した精製ＧＤＮＦのアミノ 末端（配列番号１０）附近から得られたアミノ酸配列（図８）（配列番号１）Ｐ ｒｏ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａをヘースとしている。

オリゴヌクレオチドは”　Ｐ−Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　Ａｒ　ｌ　 ｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬ）に由来する３２ｐで、Ｔ４ポリヌクレオ チドキナーゼ（ＰｈａｒｍａｃｉａまたはＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ、ＣＩｅｖｅ−Ｉａｎｄ、ＯＨ）を用いて標識した。ハイブリ ダイゼーション反応は６ＸＳＳＰＥ、０．１％Ｓ　Ｄ　Ｓ、　Ｏ，Ｉｍｇ／ｍｌ 　ｔ　ＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）　、および２×デンハルト試薬（フィコール、ポリビニルピ ロリドン、ＢＳＡ分画Ｖ、各０．４ｍｇ／ｍｌ　）中、５０°Ｃて一夜（約１６ 時間）行った。ハイブリダイゼーション操作は、溶液１ｍｌあたり２〜３刈０＠ ｃｐｍの標識オリゴを含有した。

ハイブリダイゼーソヨン後、フィルターを２ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中室温 で２回、ついて５０°Ｃに予め加熱した同し溶液で２回洗浄した。フィルターを 風乾させ、増感スクリーンを用いて一７０°Ｃで７日間、フィルムに露出した。

現像したフィルムを調へて、スクリーニングオリゴヌクレオチドにハイブリダイ ズしたプラークを同定した。この−次スクリーニングにおいて、２４個が二重陽 性と推定された。陽性シグナルに相当するライブラリープレートの領域を切り取 り、再懸濁し、上に詳述したハイブリダイゼーション操作によって第２回のスク リーニングを行うために再ブレーティングした。この第２のスクリーニングでは 、最初の２４のうち８つか陽性として再テストされ、１６は陰性の結果を与えた 。これらの８つの陽性はさらにｌまたは２回のハイブリダイゼーションによって プラーク精製し、これらのうちの６つについて、ＧＤＮＦをコードできるＤＮＡ 配列を含むかを決定するために、ついてＤＮＡ配列決定法によって分析した。

クローン化された挿入体を含有するλＺａｐ　ＩＩファージのファージミド部分 は以下、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ−と呼ぶ。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５ Ｋ−７フージミドを、オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした各λＺ ａｐ　Ｉｔリコンビナンｌ−から切り取った。

λ石■ヘクターからのりコンビナンドｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓに一プラスミ ドの１０ｖｉｖ。

切除の操作は、販売業者のプロトコールに詳述されている。略述すれば、λ汀■ とＭ１３　ｒヘルパー」ファージのコインフエクションにより、感染性Ｍ＋３ピ リオン内にリコンビナントｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ−の−木組ＤＮＡコピ ーのノく・ソケージングか生じる。このようなピリオンか感受性細胞に感染する と、−重鎖のＤＮＡが二重鎖ＤＮＡに変換されて、プラスミドとして垂直に増殖 する。この現象に対する選択はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ−上にコードされ たアンピシリン抵抗性遺伝子によって与えられる。したかって、８つの陽性λＺ ａｐ　ＩＩクローンそれぞれからの「レスキュー」リコンビナントｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ　ＳＫ−プラスミドを含有する大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ誘導体は、Ｓ けａｔａｇｅｎｅによって記載されたプロトコールに従い、λＺａｐ　ＩＩベク ターとともに供給される「ヘルパー」ファージの使用により容易に得られた。

ＤＮＡ配列決定には、二重鎖プラスミドＤＮＡか６つのこれらのりコンビナンド プラスミドから、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　＆　Ｄａｉｌｙ　１９７９　ＮＡＲ７：ｌ ５１３−１５２３に基づく　「ミニ製造」操作によって調製された。ジデオキシ 一連鎖ターミネーテイング法を用いるＤＮＡ配列決定反応は、これらの鋳型とス クリーニングオリゴをプライマーとして用いて実施された。配列決定のだめの試 薬はキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　２．０）としてＵｎｉｔｅ ｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手し、配列決定操作は販売業 者によつ２て提供されたプロトコールに従って行われた。クローンλＺａｐｌＩ ７６．１から誘導された一つのクローン、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ−７６ 、Ｉは以下の配列（配列番号１１）。

５’　＞ＧＡＣＡＧＧＡＡＣＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣ Ａ　＞３’Ｔ　ＡＡ　ＴＡＴＡ　Ｔ を与えた。この配列は翻訳されて以下のアミノ酸配列（配列番号＋２）Ｇ　Ｉ　 ｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ａ　Ｉａ−Ａ 　Ｉ　ａ−３ｅｒ−Ｐｒ。

を与え、スクリーニングオリゴ／配列決定プライマーを発生させるために用いた アミノ酸配列の木端に５アミノ酸残基カルボキシ末端に始まるＧＤＮＦのアミノ 末端のある領域を決定するアミノ酸配列に合致する。この結果はλＺａｐ　Ｉ［ ７６、ｌ中に含まれたｃＤＮＡクローンかＢ４９細胞調整培地から精製されたＧ ＤＮＦ蛋白質の部分またはすへてをコードしなければならないことを示している 。

ｃＤＮΔクローンの５“末端の最初の８７７塩基対のヌクレオチ１へ配列か決定 された。この領域は、精製されたＧＤＮＦのアミノ末端について得られたアミノ 酸配列および精製されたＧＤＮＦの切断によって誘導された中間ペプチドに一致 する配列を包含する、２２７アミノ酸のオーブンリーディングフレーム（ＯＲＦ ）を含むことか見出さねた。このＯＲＦについて予測されたカルボキシ木端１３ ４アミノ酸は精製された成熟ＧＤＮＦ蛋白質の予測されたアミノ酸配列からなる 。先行する９３アミノ酸は、可能性のある開始ＡＴＧコドンとそれに続く推定分 泌ソゲナル配列を包含し、その蛋白質の前駆体もしくは［プレープロ」型の切断 により例１に上述したＧＤＮＦの成熟、精製型を発生させる蛋白分解的ブロセッ ソング部位の可能性かある部位を含有する。

配列決定反ＬＵのための鋳！！２ＤＮＡはプラスミＦｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　 ５Ｋ−７６，１ＤＮＡの一本鎖と二重鎖バージョンを包含する。二重ｊＱＤＮＡ はＸＬＩ−Ｂｌｕｅ　（ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−７６、１’）の培養体か ら「煮沸製造」操作（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１１４：１９３−９７） によって製造し、ＣｓＣｌ密度勾配中に層積した。一本鎖鋳型は、ＸＬＩ−Ｂｌ ｕｅ　（ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−７６、１）の、販売業者（Ｓｊｒａｔａ ｇｅｎｅ）によって供給された「ヘルパー」Ｍ１３ファージによる、ファージと ともに供給された関連プロトコールを用いた感染によって製造さ第１た。長さ１ ５〜２３ヌクレ才チ１−の−重鎖オリゴヌクレオチドプライマーはＡｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｊｙ、ＣＡ）　ＤＮＡノンセ サイザー、３８０Ａ型シンセサイザーを用いて合成し、一般的には精製しないて 使用した。配列決定はジブオキシ一連鎖ターミ不−ノヨン法を用いて実施した。

使用しこ試薬は５ｅｑｕｅｎａｓｅＶｅｒＳｉｏｎ　２．０キツト（Ｕｎｉｔｅ ｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）に包含され、販売業者によって供 給されたプロトコールに従って使用した。

精製された成熟ＧＤＮＦ蛋白質をコートする配列を含有するｃＤＮＡクローンλ Ｚａｐ　ｌｌ７６．１の５°末端の最初の８７７ヌクレオチドのヌクレオチド配 列は、図１３に（配列番号３）、この配列内に見出される６８１塩基対オーブン リーデイングフレーム（ＯＲＦ）の推定アミノ酸配列とともに示す。精製された 成熟ＧＤＮＦに相当する配列は位置２８１てセリン残基によって始まり、図１４ に示す（配列番号４）。この領域について得られたＤＮＡ配列は精製されたＧＤ ＮＦのアミノ末端に観察されたアミノ酸配列（例１参照）の最初の２３残基と完 全に一致するアミノ酸配列を予測させる。

図１３に示した遺伝子の分析に基つくと、ＧＤＮＦは最初プレープロＧＤＮＦポ リペプチドとして翻訳され、シグナル配列およびこの分子の「プロ」部分の蛋白 分解的プロ七ソノングによりＢ４９細胞調整培地から精製されるＧＤＮＦの撃か 製造されるものと考えられる。このようなプレープロ型の最も考えやすい翻訳開 始部位は図１３の配列（配列番号３）中の位置５０に存在するＡＴＧコドンであ る。

Ｃ，ＧＤＮＦをコートするヒト遺伝子のクローニング多くの神経栄養因子のアミ ノ酸配列は様々な哺乳動物種を通して高度に保存されている（Ｈａｌ　Ｉｂｏｏ ｋら、　１９９１　Ｎｅｕｒｏｎ　６：８４５−８５８：　ＭｃＤｏｎａｌｄら 、１９９１　ＢＢＡ印刷中）。

アミノ酸配列の保存の結果として、これらの蛋白質をコートする遺伝子のヌクレ オチド配列にもかなりの保存性かある。したかって、ある哺乳動物種における神 経栄養因子をコートする遺伝子か、他の哺乳動物種における因子をコートする遺 伝子と、適当なアニーリング条件下に交叉−ハイブリダイズ（すなわち安定な二 重鎖ＤＮＡバイブリドを形成）できることは、一般的に事実である。この性質か 、ＧＤＮＦの遺伝子を含むクローン化ヒ１−ＤＮＡセグメントの同定に使用され た。

ヘタターλＦＩＸＩＩ中に構築されたヒトゲノムライブラリーはＳｔｒａｔａｇ ｅｎｅ　（カタログ番号９４６２０３）から購入して、例２Ｂに上述したＧＤＮ ＦのラットｃＤＮΔクロー：／　（ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓに−７６，１） 由来の０ｐ−標識プローブを用いてスクリーニングした。プローブはポリメラー ゼ連鎖反Ｃ？（Ｓａｉｋｉら、　１９８５５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０） を用いた特異的増幅による成熟ＧＤＮＦからの約２５０ｂｐのコート配列によっ て構成され、以下のように製造された。５０μｌまたは１００μＩ　ＰＣＲ反応 を鋳型として＜ｌｎｇλ７ａｐ　ｌｌ７６．１ＤＮＡおよびラットＧＤＮＦから の配列に基づく２つの各オリゴヌクレオチド１０〜２０ｐｍｏｌを用いて実施し た。一つのオリゴは上記例２Ａに記載の「スクリーニングオリゴＪ　（Ｄ　ＨＤ 　−２１ともいう）であり、一方、第２のオリゴ（ＤＨＤ−２６）（配列番号＋ ３）は配列・５’　＞ＡＡＡＴＴＴＴＴＩＡＡＩＡＴＴＴＴＡＴＣ＞３’ＧＣＧ ＣＧ を（ｆＬ、これはＧＤＮＦの切断の内部ペプチド生成物（例１参照）から得られ たアミノ酸配列（Ａｓｐ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ’ ）　（配列番号１４）に基づいている。

反応は、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（２５°ＣてｐＨ８，３）、５０ｍＭ　Ｋ ＣＩ　、１．５ｍＭＭｇＣＩ２．１０μｇ／ｍ１ＢｓＡ　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｒ ３９６１）、各０．２ｍＭのｄＮＴＰ　（ＰｈａｒｌＴｌａｃｉａ　）中、２． ５〜５μのポリメラーゼ（ＵＳＢ）を使用して実施した。反応は３０サイクルの ２９５°Ｃて１分、４４°Ｃて１．５分および７２°Ｃて１．５分から構成され た。この反応の生成物はアガロースゲル電気泳動によって、図１３に示されたｃ ＤＮＡ配列中の２つのプライマーの位置に一致する約２５０ｂｐであることか観 察された。この非標識フラグメントはＩＩ　ｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターニ ーｎッｈ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いる遠心分離に より、販売業者のプロトコールに従ってゲルから溶出し、同し２つのオリゴプラ イマーを用いる以後のＰＣＲ［識反応に鋳型として使用した。これらの反応はコ ールドｄＣＴＰの濃度を１２．５μＭニ低下させて、反応１：　２．５　ｕ　Ｍ ３０００〜５０００Ｃｉ／ｎｖｎｏｌ　ａ−”ＰｄＣＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ ）を加えたほかは同し条件下に行った。標識反応の生成物はＢｉｏＳｐｉｎ　６ スビンカラム（ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）を通過させた。

このカラムからの流出液をヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするための プローブとして使用した。

ライブラリーは、Ｓｔｒａｌａｇｅｎｅによって提供された大腸菌株ＰＬＫＩ７ を用いてブＬ−１−アウトした。それぞれ約５０．０００のプラークを含有する １５０ｍｍベトリブレート２４個を調製した。各ブレートからＭａｎｉａｔｉｓ ら（前出）によって記載された操作に従い、ニトロセルロースフィルターリフ］ ・を二重に調製した。これらの４８個のフィルターを上述の２５０刈０’ｃｐｍ のＰＣＲプローブにより、２５０ｍ１の６ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、２×デ ンハルト試薬、０．１ｍｇ／ｍｌ　ｔ　ＲＮＡおよび３０％ホルムアミド（ＵＳ Ｂ）中、４２°Ｃにおいて一夜（約１６時間）プローブした。ついて、フィルタ ーを２５０ｍ１　（７）２ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中室温て２回、１．６１ （７）予め５０°Ｃに加熱した０、Ｉ　Ｘ５ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄 した。フィルターを室温で乾燥させ、増感スクリーンを用い一７０°Ｃで６日間 フィルムの下に置いた。フィルムを現像して評価した。６個に強い二重陽性か認 められた。陽性シグナルに相当するライブラリープレートの領域を切り取り、再 懸濁し、上に詳述したハイブリダイゼーション操作によって第２回のスクリーニ ングを行うために再ブレーティングした。６つのすへてか陽性として再テストさ れ、さらにｌラウンドのブレーティングおよびハイブリダイゼーションによって プラーク精製された。

プローブにハイブリダイズする領域の周囲のＤＮＡセグメントをサブクローンし 配列決定すること、およびこのようにしてＧＤＮＦのヒト遺伝子の配列のすべて または部分を決定することは、本技術分野の熟練者には定常的に行われる操作の 問題である。これらのクローン中に全ヒトＧＤＮＦ遺伝子か表示されなかった場 合には、ゲノムに沿って「歩いて」この領域の周囲のＤＮＡの重複セグメントを クローニングして、この遺伝子の残りの部分の配列を得て、配列決定することも ルーチンの問題である。

上述の操作および本技術分野の熟練者には自明の様々の他の操作か、他のヒト遺 伝子ライブラリーのスクリーニングに適用できた。たとえば、上述のプローブお よびハイブリダイゼーションプロトコールを用いて、ヒト被殻から抽出されたＡ “ＲＮＡから構築されたヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。クロ ーニングベクターλ１７ｔｌＯに含まれるこのライブラリーはＣ１ｏｎｔｅｃｈ 　（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ。

ＣＡ）から購入した（カタログ番号ＨＬ１０９２ａ　、ロット番号１５６＋）。

このライブラリーを大腸菌Ｌ　Ｅ３９２　（ｌｉｌａｎｉａｔｉｓら、前出）上 にプレートあたり約２０．０００プラークの密度でブレーティングしく計約２５ ０．０００プラーク）、上述の条件下のハイブリダイゼーションによってスクリ ーニングした。ハイブリダイゼーション後、フィルターを０．２　Ｘ５ＳＰＥ、 ０．１％ＳＤＳ中室温て２回、ついて５０°Ｃに予め加熱した０、Ｉ　Ｘ５ＳＰ Ｅ、０．１％ＳＤＳ中で２回洗浄した。フィルターを室温で風乾し、フィルム下 に置いた。３日間増感スクリーンを用いて７０°Ｃて露出したのち、フィルムを 現像し、８つの二重陽性か同定された。

ヒトゲノムライブラリーからの６つのλＦＩＸＩＩクローンをラットＧＤＮＦプ ローブとのハイブリダイゼーションによって同定して、均一にまでブラークー精 製した（上記参照）。各ファージのライゼートをＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ ：１９８９）によって調製した。ＤＮＡはこれらのクローンから以Ｆの操作によ って調製した。すなわち、ＤＮＡアーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＲＮＡア ーセＡ　（Ｓｉｇｍａ）を各培養液５ｍｌに加え、最終濃度１μｇ／ｍｌとした 。

この溶液を３７°Ｃて１時間インキュベートした。ついて５ｍｌの２０％ポリエ チレングリコール（ＳｉｇＩＴＩａ）、２ＭＮａＣ＋を加え、この溶液を０℃で １時間インキュベートした。λファージを１２．０００Ｘｇて１０分間遠心分離 して、ベレット化した。ファージベレソトを２５０μｌのＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ、ｐＨ７，４、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ）に再懸濁し、ついて等容量の、ａ、クロ ロホルム、ｂ、フェノール、Ｃ，クロロホルムとフェノールの１１混合物、およ びｄ、クロロホルムで抽出した。酢酸アンモニウムを最終濃度か０．２５Ｍにな るように加え、ＤＮＡは２容のエタノールの添加および＋０．ｏｏＯＸｇての遠 心分離によって沈殿させた。ＤＮＡベレットはＴＥ中に再懸濁した。

６つの各λアイソし一トからのＤＮＡを各種の制限エンドヌクレアーゼで消化し 、フラグメントをアガロースゲル上電気泳動によって分離した（Ｓａｍｂｒｏｏ ｋら）。

ＤＮＡフ→グメントを２つの同一のナイロン膜に移しく５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　 ＆　５ｃｈｕｅｌｌ）、ラソ１−ＧＤＮＦからの放射標識プローブとハイブリダ イズした。ラッ］〜ＧＤＮＦには、ヌクレオチド３５６と３５７（図１３の番号 による）の間にＥｃｏＲＩ部位かある。

これは成￥％ＧＤＮＦのコート配列内を切断する。ヒトゲノムＧＤＮＦクローン か相同の位置に部位をもつかどうかを調へるため、ヒトクローンを消化するため の制限エントヌクレアーゼの一つとしてＥｃｏＲＩを使用した。ラットＧＤＮＦ におけるＥｃｏＲＩ部位の上流（プローブＩ）または下流（プローブ２）の遺伝 子領域について特異的な放射標識プローブを作成した。プローブ１は２６Ｂｂｐ 長てラットＧＤＮＦの５゛ノ１゛翻訳領域の＋４ｂｐどコート配列の２５４ｂｐ 　（アミノ酸１〜８５）から構成された。これはポリメラーゼ連鎖反応とオリゴ ヌクレオチドブライマーＰＤ　Ｉ　（ＧＡＣＧＧＧＡＣＴＣＴＡＡＧＡＴＧ）　 （配列番号＋５）およびＤＨＤ２３　［ＧＣＩＧＣＩＧＣ（Ｃ／Ｔ）ＴＧ（Ｔ／ Ｃ）ｎ（Ａ／Ｇ）ＴＣＩＧＧＩ　（配列番号１６）を用い、λＺａｐ　ｌｌ７６ 、ｌＤＮＡの増幅によって調製された。プローブ調製の反応条件は、反応か３０ サイクルの、９５°Ｃ１分、５０°Ｃ１，５分および７２°Ｃ１６５分からなる ほかは上述の場合と同様である。プローブ２は＋９５ｂｐ長て、ラットＧＤＮＦ の３゛非翻訳領域の１７ヌクレオチドとコード配列の１７８ｔ＋ｐ　（アミノ酸 １５３〜２１１）から構成された。これはポリメラーゼ連鎖反応とオリゴヌクレ オチドブライマーＬＦ２　（ＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧＴＡＣＧＡＣＡ）　（配列番 号１７）およびＰＤ２　（ＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＡＧＧＧＴＣＡ）　（配列番号 １８）、鋳型としてλＺａｐ　ｌｌ７６、ｌＤＮＡを用いて調製した。反応条件 はプローブｌの場合と同様とした。

６つのλクローン中５つは同一のハイブリダイゼーションパターンを与えた。

プローブ１は約７００ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントにハイブリダイズし、プロ ーブ２は約２．８ｋｂ　ＥｃｏＲＩフラグメントにハイブリダイズした。２つの プローブが２つの異なるＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントにハイブリダイズしたと いう事実は、ヒトＧＤＮＦ遺伝子か相同なＥｃｏＲ１部位を含有することを強く 示唆した。７００ｂ１１ならびに１．８ｋｂ　ＥｃｏＲ１フラグメントは、別個 にＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニング された。これらの２つのフラグメントのヌクレオチド配列は例２Ｂに記載したよ うにして決定された。これらのＤＮＡフラグメントの配列は図１９に示す（配列 番号５）。この配列から、プレープロＧＤＮＦのアミノ酸５２に先行するイント ロンかあることか明らかである。成熟ヒトＧＤＮＦをコードする遺伝子の部分に はイントロンはない。成熟しトＧＤＮＦの推測されるアミノ酸配列は成熟ラット 成熟ＧＤＮＦと９３％のホモロジーを存する。これは、他の神経栄養因子につい てラットおよびヒト蛋白質の間に見出されるアミノ酸配列のホモロジーとほぼ同 程度のものである［ラットおよびヒトＣＮＴＦの間のアミノ酸配列ホモロジーは ８３％（ＭｃＤｏｎａｌｄら、ＢＢＡ　１９９１．印刷中）：ラットおよびヒト ＮＧＦの間のアミノ酸配列ホモロジーは９５％、ＢＤＮＦでは１００％、ＮＴ− ３では１００％であるＣＨａｔ　Ｉｂｏｏｋ　ら、　１９９１　Ｎｅｕｒｏｎ　 ６：８４５−８５５）］。

完全なヒトブレープロＧＤＮＦ配列を得るためには、放射標識ハイブリダイゼー ションプローブを、既に得られたヒトＧＤＮＦの配列に基づいて作成し、これを 用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングできる。ｃＤＮＡはプロセツ シングされたｍＲＮＡのコピーであるから、イントロンは存在せず、完全なコー ト配列を得ることかできる。別法として、コート配列に対するイントロンの位置 は既知であるから、イントロンの上流配列に特異的なハイブリダイゼーソヨンプ ローブはラットｃＤＮＡクローンから作成可能で、このプローブを５゛エキソン を含むクローンのためのゲノムライブラリーのスクリーニングに使用できる。

例２Ｃに詳述したように、ヒトブレープロＧＤＮＦのアミノ酸５１に相当するヌ クレオチド配列をスプリットするイントロンが存在する。分子のこの部分の配列 を得るためには、ヒトゲノムライブラリーをラットブレープロＧＤＮＦのアミノ 末端コート配列から誘導されるプローブでスクリーニングし、一つのハイブリダ イズしたクローンを配列決定し、図ｎに示すように、ヒトブレープロＧＤＮＦの アミノ酸１〜５０のコード配列を含有することを示した（配列番号８）。

このライブラリースクリーニングのために、例２Ｃに記載したように、ＰＣＲプ ローブを合成した。使用したオリゴヌクレオチドブライマーは。

Ｐ　Ｄ　Ｉ　＝　５　’　＞　ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＧＧＡＣＴＣＴＡＡ ＧＡＴＧ　＞　３　’　（配列番号＋９）ＬＦＡ＝５’　＞ＣＧＧＴＧＧＣＣＧ ＡＧＧＧＡＧＴＧＧＴＣＴＴＣ＞３’　（配列番号２０）てあった。ＰＣＲ（ｒ コールド」および２２ｐ標識体の両者）反応の条件は、反応か２５〜３０サイク ルの９５°Ｃ１分、５０°Ｃ１，５分および７２°Ｃ１分からなるほかは例２Ｂ の記載と同様である。この反応の生成物はクツｌ−プレープロＧＤＮＦの最初の ＋２２ｂｐと５°から推定イニンエータ−ＡＴＧまでの１４塩基対を含有する（ 図１３および配列番号３参照）。ヒトゲノムライブラリーのこのプローブによる スクリーニング条件は例２Ｃに記載の通りとした。成熟しトＧＤＮＦの配列をも つクローンの同定のために使用した同一のフィルターリフトは脱イオン−蒸留水 て２回洗浄し、−夜ブローブし、例２Ｃに記載のプロトコールに従って洗浄した 。フィルターを３０間増感スクリーンを用いて一７０°Ｃてフィルムに露出した 。現像すると、多くの様々な強度の二重陽性か観察された。比較的強い陽性の１ ２個を取り、これらの１０個をスクリーニング条件でハイブリダイゼーションを 繰り返し、プラーク精製した。

これらのりコンビナンドファージのクローン化ＤＮＡをサザンブロツトハイブリ ダイゼーションによって分析した。約１０００ｂｐＡ　ｌｕ　Ｉフラグメントか スクリーニングプローブにハイブリダイズすることか見出され、ＳｍａＩ−消化 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳに−にサブクローニングしてｐＢｓｓＫ−λ３Ａｌｕ ｌを製造した。このクローン化ＡｌｕＩフラグメントを、関連ＤＮＡセグメント の配列決定を容易にするためにさらにサブクローニングした。精製ｐＢＳＳＫ− λ３Ａｌｕｌ　ＤＮＡを、ベクターを１回（ポリリンカー領域内で）だけ切断す る一連の制限酵素で消化し、消化生成物をアガロースゲル電気泳動て分析した。

その結果２つの制限酵素（Ｐｓ口および５ａｃＩ［）かクローン化ＤＮＡ内を１ 回切断することか確認された。図ｎには５ａｃＩｒおよびＰｓｔ　１部位の地図 を示す。サザンプロットにより、スクリーニングプローブにハイブリダイズした クローン化セグメントの領域はクローン化Ａｌｕｌセグメントの５ａｃＩＩとＰ ｓｔ　１部位の間に位置することか明らかにされた。したかつて、配列決定には 、ｐＢＳＳＫ−λ３Ａｌｕｌの２つの欠失誘導体か構築された。一方の例は、小 さい約３００ｂｐのＰｓｔＩフラグメントを次のように欠失させた。すなわち、 ブラスミｌ’をＰｓｔ　Ｉて消化し、消化物をリゲートし、大腸菌にトランスフ オームした。トランスフォーマントについて小Ｐｓｔ　Ｉフラグメントを欠くも のをスクリーニングした。平行して３００ｂｐ　５ａｃＩＩフラグメントをｐＢ ｓｓＫ−λ３ＡＩｕ＋から同様に欠失さ昼て第２の欠失誘導体か製造された。こ れらの２つの欠失プラスミドを配列決定反応のための鋳型として使用した。配列 決定は例２Ｂの記載と同様にして実施した。

図２２（配列番号８）にはこのようにして得られた２３３塩基対の配列を表示す る。

この配列はラットブレープロＧＤＮＦをコードする最初の１５１ｂｐの配列と極 めて高度のホモロジーを示す１５１ｂｐ領域を含有する。アミノ酸レベルにおい て８８％の同一性、ＤＮＡレヘルて９５％の同一性を示す。したかって、この領 域は、ヒトブレープロＧＤＮＦのアミノ末端５０残基のコート配列および残基５ １のコドンの最初のヌクレオチドをもつエキソンの部分であると結論される。こ の１５１ｂｐ配列の直ちに３′側の配列は哺乳動物のイントロンの５′末端のコ ンセンサス配列と相同である（Ｓｈａｐｉｒｏ　＆　５ｅｎａｐａｔｈｙ　１９ ８７　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５ニア１５５−７１７４）。推定イ ニソエータ−ＡＴＧのすぐに５″側の配列は２８ｂ１１までラット配列と高いホ モロジーを示し、２８残基中２７か同一である。この点て上流配列は急速に分岐 する。分岐の点の周辺の配列は哺乳動物のイントロンの３′末端のコンセンサス 配列とかなりのホモロジーを示す（Ｓｈａｐｉｒｏ　＆　５ｅｎａｐａｔｈｙ、 前出）。したかって、直接的な証拠はないものの、これはスプライス部位である 可能性が高いものと思われる。ヒｌ−プレープロＧＤＮＦを含有するオーブンリ ーディングフレームは、イニンエータ−ＡＴＧの上流少なくとも２７塩基対延長 される。上記の好ましい実施態様の詳細の説明に述へたように、（：ｊ加的な上 流アミノ酸を含量■する他の型のブレープロＧＤＮＦか産生ずる可能性もある。

これらの型もプロセッシングを受けて、精製され配列決定されている成熟ＧＤＮ Ｆ　（例１参照）を産生するものと思われる。

ここでまた例２Ｃに示したヌクレオチド配列はヒトブレープロＧＤＮＦの全コー ト配列を含在し、これは、呻乳動物細胞中で効果的に発現され（例５参照）活性 ラッ１−ＧＤＮＦを生したラットブレープロＧＤＮＦと広範なホモロノーを示す 。

例３　実験的パーキンソニズムの防止のためのＧＤＮＦの使用この例はサルにニ ューロトキシン、ＭＰＴＰ（＋−メチル−４−フェニル−１゜２、３．６−チト ラヒトロービリジン）を適当に投与することによる実験的パーキン′ノニズムの 作成方法を記述する。また、ＭＰＴＰに暴露された動物にパーキンソニズムの発 症を緩和するためにＧＤＮＦを投与する方法を記載する。

した浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ　２００２）に接続する。ミニポンプは様々 な濃度でのＧＤＮＦまたは陰性対照としてその希釈剤を含有する。ポンプは１４ 日間０．５μｍ／ｈを送達する。カニユーレ−ポンプ移植２日後、サル（Ｃｅｂ ｕｓ　ａｐｅｌｌａ）の右頚動脈内に０．６ｍｇ／ｋｇのＭＰＴＰを注射する。

最初の移植から６週後に動物を食塩水で潅流し、脳をす早く摘出する。脳を氷上 て離断し、尾状核および被殻から組織のパンチを採取する。点質は固定液中に置 く。尾状核−被殻組織はＨＰＬＣ−ＥＣによって１・−パミンを分析し、点質は チロシンヒトロキンラーゼ（ＴＨ）免疫反応性の分析のために処理する。

Ｂ、ＧＤＮＦの効果、このサルのモデルで、黒質ドーパミン作動性神経細胞およ びそれらの尾状咳／被殻への軸索投射の変性は、実験的パーキンソニズムを生し る。ＧＤＮＦかこのニューロンの変性を防止し、またその重篤間を減弱させるこ とを示すいくつかの実験的事実かある。たとえば、ＧＤＮＦは点質におけるＴＨ 陽性神経細胞体の喪失を防止する。これは、ＭＰＴＰの毒性作用からのＧＤＮＦ による点質ｌ・−パミン作動性神経細胞の救命を指示している。ＧＤＮＦはまた 、尾状咳／被殻におけるＴＨ陽性線維の喪失を防止する。これは、ＭＰＴＰの毒 性作用からのＧＤＮＦによる点質ドーパミン作動性ニューロンの軸索投射の救済 を指示している。ＧＤＮＦはまた、尾状核／被殻におけるドーパミン含量の低下 を防止する。これは、ＭＰＴＰの毒性作用からのＧＤＮＦによる、点質ドーパミ ン作動性ニューロンから尾状核／被殻に至る軸索およびそれらのドーパミン含量 の救済を指示するものである。

例４：ＧＤＮＦの生物学的活性および考えられる臨床的適用精製されたＧＤＮＦ は、例１に示されたように、強化培地および特定培地の両者において、培養胚中 脳神経細胞中に存在するドーパミン作動性ニューロンによるドーパミンの取り込 みを増大させる。これは、ＧＤＮＦかこれらのドーパミン作動性神経細胞に対し て神経栄養因子であることを指示する。この点てＧＤＮＦはパーキンソン病で起 こるこれらのニューロンの変性の処置に有用であることか明らかである。さらに 、ＧＤＮＦは脳の他のドーパミン作動性ニューロンの不適切な機能の処置に有用 であることか明らかである。このような不適切な機能は精神分裂病や神経遮断剤 による処置を必要とする他の疾患で起こる。

Ａ　精製ＧＤＮＦは培養副交感神経および交感神経細胞の生残を促進する１、ニ ューロンの生残のアッセイ 材料 ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテ］・ラ ゾリウムブロミド（ＭＴＴ）はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ 、Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手した。給液ウシ血清はＨｙｃｌｏｎ ｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｌｏｇａｎ、　Ｕｔａｈから購入した。培養 培地および塩溶液はＩｒｖｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔ汀ｉｃ、　５ａｎｔａ　Ａｎａ 、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから入手した。培養皿はＣｏ５ｔａｒ、　Ｃａｍｂｒ ｉｄｇｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手した。生産用病原体フリーの 受精トリ胚卵は５ｐａｆａｓ、　Ｒｏａｎｏｋｅ、１ｌｌｉｎｏｉｓから入手し た。

アッセイ 初代ヒナ胚毛探体神経節および交感神経神経節の培養体は、既報（Ｃｏｌｌｉｎ ｓ１９７８　Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｉｏｌ、　６５：５０：　Ｍａｎｔｈｒｏｐｅ 　ら、　１９８６　Ｄｅｖｅｌｏｐ、Ｂｒａｉｎ、Ｒｅｓ、　Q５：１９１） のようにして調製した。略述すれは、毛様体または交感神経神経節は、加湿雰囲 気中３８°Ｃてそれぞれ８および１０日間インキュへ−１−した受精、病原体フ リーの鶏卵から摘出した。神経節は、最初、２価陽イオンを含まない、ＩＯｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，２含有ハンクスの平衡塩溶液に３７°Ｃで１０分間暴 露し、ついで上述のように改変したハンクスの平衡塩溶液中０．１２５％バクト ドリブシン（Ｄｉｆｃｏ。

Ｄｅｔｒｏｉｔ、　Ｍｉｃｈｉｇａｎ）Ｉ：２５０の溶液に３７゛Ｃて１２分間 暴露して化学的に解離させた。

トリブノン処理は、給液ウシ血清を最終濃度１０％になるように添加して停止さ せた。

この処理後に、神経節を、重炭酸塩を含まず、１０％胎仔給液血清およびＩＯｍ ＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，２を含有するダルベツコの高グルコース改良イーグ ル培地からなる溶液に移し、ガラスパスツールピペットの開口部を炎で処理して 狭くしてピペットを満たすのに２秒かかるようにしたピペットに約１０回通して 粉砕させて機械的に解離させた。

解離した神経節をついで、直径１００ｎｉｎの組織培養皿（皿あたり４０個の解 離神経節）を用い、培養培地（１０％胎仔給液つ清、４ｍＭグルタミン、６０ｍ ｇ几ペニシリンＧ、２５ｍＭＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液ｐＨ７，２を補充したダル ベツコの改良イーグル培地）中で３時間平板培養した。このプレブレーティング は、皿に付着する非神経細胞を、皿に付着しない神経細胞から分離するために行 った。３時間後に、非付着神経細胞を遠心分離によって集め、培養培地に再懸濁 し、９６ウ工ルマイクロタイター組織培養プレートの半分の領域に、各ウェルに １５００の神経細胞の密度で、各ウェルあたり５０μＩをブレーティングした。

マイクロタイターウェルは予め、１０　ｍＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ８，４中ボ １几−オルニチンのＩ　ｍｇ／ｍｌ溶液に４°Ｃで一夜暴露し、蒸留水て洗浄し 、風乾した。

神経栄養活性を検定すべきサンプルの希釈系列ｌＯμＩを各ウェルに添加し、培 養皿を７．５％Ｃ０２含存加湿雰囲気中３７°Ｃて２０時間インキュベートした 。毛様体では１８４４時間、交感神経節では４０時間後に、重炭酸塩を含まず、 ＩＯｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，２を含有するダルベツコの高グルコース改良イー グル培地中テトラゾリウム染料ＭＴＴの１．５ｍｇ／ｍｌ溶液ウェルあた引５μ ｍを加え、培養液を３７°Ｃのインキュヘーター中に４時装置いた。ついで、イ ソプロパツールＩＬあたＩ月２Ｍ　ＭＣＩを６．７ｍｌの溶液７５μｍを加えて 、各ウェルの内容物を３０回磨砕して細胞を破壊し、染料を懸濁させた。各ウェ ルについて、５７０μｍの吸収を６９０μｍの標準値に対して自動マイクロタイ タープレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ。

Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を用いて測定した。神経栄養剤を添加しなかったウェル（陰 性対照）の吸収をサンプル含有ウェルの吸収から差し引いた。得られた吸収は各 ウェル中の、染料を還元できる神経細胞として定義される、生存細胞数に比例す る。神経栄養活性の栄養単位数は、神経細胞の最大生残の５０％を与える希釈度 の逆数と定義された。非活性は栄養単位数をサンプル中の存在する蛋白質量で徐 してめられた。

結果 図１５に例示されるように、精製されたＧＤＮＦは、トリ胚毛様体神経節からの 培養副交感神経細胞の生残を促進する。図１６に例示されるように、精製ＧＤＮ Ｆは、トリ胚交感神経鎖神経節からの培養交感神経細胞の生残を促進する。

これらの結果は、ＧＤＮＦか副交感神経および交感神経ニューロンの生残因子と して作用することを示している。この点で、それは様々な形聾ての自律（すなわ ち、副交感神経および交感神経）神経系に対する神経障害の処置に有用性が考え られる。このような障害は、代謝状態、たとえば糖尿病または腎機能不全から起 こる。このような障害はまた、患者を様々な化学療法剤、たとえは癌化学療法剤 、シスプラチンおよびビンクリスチン、またはエイズ化学療法剤、ｄｄｌおよび ｄｄＣて処置する場合に起こる。このような障害はまた、遺伝的条件たとえば自 律神経症によって起こりうる。このような障害はまた、外傷によっても起こる。

全ＧＤＮＦ：Ｉ−ト配列か含まれるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ−７６、１の 約１．５ｋｂ　ＳｍａＩフラグメントを、５Ｖ４０Ｔ抗原を発現する細胞たとえ ばＣＯ８細胞中のクローン化遺伝子の一過性発現のために設計されたプラスミド ベクターｐＳＧ５　（Ｇｒｅｅｎら、１９８８　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　１６：３６９）中にサブクローン化した。

ＧＤＮＦｃＤＮＡのＤＮＡ配列（図１３）（配列番号３）および制限エンドヌク レアーゼマッピングによって、ベクターのポリリンカー中に位置するＳｍａ１部 位（ｃＤＮＡクローンの５′末端の＋８ｂｐ５’　）と成熟ＧＤＮＦのコード配 列末端に約８００ｂｐ　３’　のｃＤＮＡクローン内に位置するＳｍａ１部位で 描出される５ｆｆＩａＩフラグメントか同定された。このＳｍａｌフラグメント は、以下のようにして、ｐＳＧＳ中にクローン化された。すなわち、精製ｐｓｃ ｓプラスミドＤＮＡ（Ｓｊｒａｔ、ａｇｅｎｅ）をＥＣ０ＲＩて消化し、ウシ腸 アルカリホスファターゼ（（ｊＡＰ。

Ｐｒｏｍｅｇａ）て販売業者のプロトコールに従って処理した。ついてベクター を電気泳動に付しアガロースゲルから溶出した。精製ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　 ５Ｋ−７６、１プラスミドＤＮＡをＥＣ０ＲＩメチラーゼでメチル化し、Ｓｍａ Ｉて消化し、例２Ａに記載のＥｃｏ［ｒリンカ−分子とリアー１−シた。Ｅｃｏ ＲＩ消化してアガロース電気泳動に付したのち、問題の約１．５ｋｂ　ＳｍａＴ フラグメンｌ−にの時はＥｃｏＲＩメチル化され、リンカ−に結合している）か 溶出し、ＥｃｏＲＩ消化、ホスファターゼ処理ｐｓｃｓヘクターにリゲー１へし た。リゲーソヨン生成物を用い、ＣａＣｌ２法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前出）に よってコンピーテントな大腸菌ＸＬＩ−ＢｌｕｅをトランスフォーＩ、した。ア ンピシリン抵抗性トランスフォーマントを選択し、組換えプラスミドを制限エン Ｉ・ヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって分析した。Ｅｃｏ ＲＩによる消化により、大部分のトランスフォーマントか所望の挿入体をもつプ ラスミドを含有することか指示された。ＢａｍＨＩによる消化で、ベクター中に 存在するＳＶ４０プロモーターに対するクローン化ＧＤＮＦの方向性か確認され た（Ｂａ＋＋＋＋４１部位は図１３の配列における位置１５に存在する）。両方 の方向性か得られた。

さらに分析のため２つのトランスフォーマント遺伝了遺伝子の発現に適切な方向 で持ち、ＳＶ４０プロモーターてＲＮＡ転写か開始されるｐＳＧ５：　：　ｒＧ ＤＮＦ−７と命名されたプラスミドを含有し、一方、第２のものはＧＤＮＦ遺伝 子を逆の方向に持ち、ＳＶ４０プロモーターにおける開始によ、ってＧＤＮＦは 発現しないｐＳＧ５：　：　ｒＧＤＮＦ−４と命名されたプラスミドを含存する 。これらの両ブラスミ１−の精製されたプレバレーノヨンをＣｓＣｌ密度勾配遠 心分離によって調製し、ＣｏＳ細胞での発現実験に使用した。

Ｂ．ＧＤＮＦのＣＯＳ−７細胞中ての発現これらの構築体からのプラスミドＤＮ Ａは、アルカリ溶解法ついでＣｓＣｌ密度遠心分離により調製した（Ｍａｎｉａ ｔｉｓら．前出）。このＤＮＡをＳｏｍｐａｙｒａｃ　＆Ｄａｎｎａの方法（１ ９８１　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８ニア５７５−７ ５７８）によってＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。対照として、均等な 培養ＣｏＳ細胞を、ＧＤＮＦ挿入体を逆方向に含存し、ＧＤＮＦ蛋白質は発現さ れないプラスミドベクターＤＮＡでトランスフェクトした。１００ｍの培養皿あ たり３０μｇのりボッエフチンおよび０．３〜１μｇのプラスミドＤＮＡを使用 した。

２４時間トランスフェクトしたのち、培地を吸引して除去し、ＯｐｔｉＭＥＭ± ３％ＦＣＳて置換した。培養液は４８時間インキュベートシて、以下のように収 穫した。

ａ）培地（調整培地もしくはＣＭ）を吸引して一８０°Ｃに保存した。

ｂ）細胞ローンに５ｍｌのＰＢＳ＋２．５ｍＭＥＤＴＡを加え、５℃に３０分保 持し、ついて細胞を皿からピペツＩ・て取り出し、＋０００　Ｘ　ｇで５分間遠 心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを一８０°Ｃに保存した。

ＣＭをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０コンセントレータ−で３０倍に濃縮し、生物活 性を検定下。

細胞ペレットを５００μｌ　（７）ｌｏｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．０　＋１ｍＭベ ンザミジン、１００μＭＰＭＳＦＳ　１　ｍＭε−アミノ−Ｎ−カプロン酸中て 超音波処理した。細胞ライセードを１４．０００Ｘｇで５分間遠心分離し、上清 について生物活性を検定した。

Ｃ　発現ＧＤＮＦのバイオアッセイ ＧＤＮＦ−発現プラスミドおよび対照プラスミド（ＧＤＮＦコート配列を正しく ない方向で存する）でトランスフェクトされたＣｏＳ細胞がらの細胞ライゼート および培養培地について、培養中脳ニューロン中へのドーパミンの取り込みの増 大能（例１参興）ならびに交感神経節ニューロンの生残の増大能（例４参照）の 両者を検定した。ＧＤＮＦに期待されるように、ＣｏＳ細胞培養培地（図１７） および細胞ライゼート（データは示していない）はドーパミンの取り込みを上昇 させた。図１８に示すように、ＣｏＳ細胞培養培地および細胞ライゼートは、交 感神経鎖ニューロンの生残を、ＧＤＮＦに期待されるように、上昇させた。

これらの結果は、動物細胞におけるＧＤＮＦｉｉ伝子の発現により、精製された ＧＤＮＦに証明された生物学的活性をもつ蛋白質の産生を生しることが明らかに 指示される。

ヒトＧＤＮＦ遺伝子の配列１青ｔｒｉ！（例２Ｃ）を用いて、合成才リゴヌクレ 才チドＰＤ３およびＰＤ４を、ヒトＧＤＮＦ遺伝ｒの増幅および大腸菌内でのプ ラスミド発現ベクターからのその発現のためのプライマーどして作成した。オリ ゴヌクレオチドＰＤ３（配列番号２１）およびＰＤ４　（配列番号２２）の配列 は：Ｐ　Ｄ　３　：　５　’　ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ ＭＡＡＡＴＧＴＣＡＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴ　３　’ＰＤ４：５°ＣＧＣ ＧＧＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡ　３′である。

オリゴヌクレオチドＰＤ３は４６ヌクレオチド長である。３′末端の１７ヌクレ オチドは成熟蛋白質のＮ−末端をコードする領域のヒＩ−ＧＤＮＦ遺伝子に完全 に一致している。これらの１７ヌクレオチドの前には翻訳開始コドン、ＡＴＧが あり、したかって成熟ヒトＧＤＮＦの合成は大腸菌内で正しいアミノ酸で開始さ れることになる。他のヌクレオチドは大腸菌内での良好な発現に必要とみなされ る他のシグナルならびにＧＤＮＦ発現プラスミドの構築に必要なりａｍＨＩエン ドヌクレアーゼ制限部位を与えるように設計された。

オリゴヌクレオチドＰＤ４は２６ヌクレオチド長である。３°末端における１７ ヌクレオチドはヒトＧＤＮＦ遺伝子の停止コドンの３゛の１７ヌクレオチドに完 全に一致している。このオリゴヌクレオチドもＧＤＮＦ発現プラスミドの構築の ために、Ｋｐｎｌ制限エントヌクレアーゼ部位の再構築に必要な配列を提供する 。

ヒトＧＤＮＦの増幅のための反応条件は次の通りである。すなわち、総反応容量 は１００μｌ　とし、ｌｎｇのヒトＧＤＮＦ遺伝子含有λＤＮＡクローン、ＰＤ ３およびＰＤ４をそれぞれ２０ピコモル、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ＩＣＩ　ｐＨ ８，８、１０ｍＭ　ＫＣＩ、６ｍＭ　（ＮＨ４）２　Ｓｏ、　、１．５ｍＭＭｇ ＣＩ２、および０．１％Ｔｒｊｔｏｎ　Ｘ−１００を含有させた。反応混合物を ９５°Ｃに５分間加熱し、４４°Ｃに冷却し、２単位のＰｆｕＤＮＡポリメラー ゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加した。反応は、７２°Ｃ１，５分、９５℃１ 分、４４℃１．５分の３０サイクルによって構成した。反応終了ｉＬ　Ｍ　ｇ　 ＣＩ　ｔを最終濃度がｌ０ｍＭになるように加えた。５単位のＤＮＡポリメラー ゼＩ大（クレノー）フラグメント（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、反応混合物を３７ °Ｃて１０分間インキュベートした。ついて、１０μｌ　（７）３ＭＮａＡｃお よび２２０ＩＪｌ　ｃ７）Ｅｔ　０１−１を加えて、溶液を１２．０００Ｘｇで １５分間遠心分離してＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１００μＩの５０ ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８）、　５０ｍＭＮａＣ１、ｌ０ｍＭＭｇＣ１ｚ、 ２０単位のＢａｍＨＩおよび２゜単位のＫｐｎｌに再懸濁した。正しいサイズの ＤＮＡフラグメントは、アガロースゲルを通した電気泳動によって同定し、Ｕｌ 　ｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて精 製した。このフラグメントを大腸菌発現ベクターｐＴ３ＸＩ−２（以下に説明） 中にリゲートした。リゲーンヨン条件は次の通りである。

すなわち、総反応容量は５μｍとし、ＫｐｎｌおよびＢａｍＨＩにより線状化し た１゜ｎｇのｐＴ３　Ｘｌ−２ＤＮＡ、上述のヒトＧＤＮＦＤＮＡ：７ラグメン ト５ｎｇ、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｆｌＨ７，６，１０ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　 ２、ＩｍＭＡＴＰ、１ｍＭＤＴＴ、５％ポリエチレングリコール−８０００、お よび１単位の７４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂ ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有させた。反応混合物は１４°Ｃで２時間インキュベ ートした。

ベクターｐＴ３　Ｘ１２は以下の方法で構築した。この構築のための出発プラス ミドは、プラスミドｐＫＫ２２３−３　（Ｂｒｏｓｉｕｓ　＆　Ｈｏ１ｙ、　１ ９８４）で、Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。プラスミドｐＫＫ２２３−３は テトラサイクリン抵抗性の部分遺伝子を有する。この非機能遺伝子をプラスミｌ ’ｐＢＲ３２２がもつ完全なテトラサイクリン抵抗性遺伝子で置換した。プラス ミドｐＫＫ２２３−３を５ｐｈｌで完全に、ＢａｍＨＩで部分的に消化させた。

４．４キロヘース対フラグメントをゲル精製し、合成アダプター（配列番号２５ °　ＧＡＴＣＴＡＧＡＡＴｒＧＴＣＡＴＧｍＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴ　３　 ’３　’　ＡＴＣＴＴＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＧＴＣＧＡＡＴＡＧＴＡＧＣ ５′Ｂｇｌｉｌ　Ｃ１ａｌ およびｐＢＲ３２２（ＰＬ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　２７−４８９１−０ １）のテトラサイクリン抵抗性遺伝子のＣＩａＬ　５ｐｈＩ消化からのＤＮＡの ５３９塩基対フラグメントと混合する。得られたプラスミドはｐｃＪｌ　と命名 された。

次に、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから購入したＸｈｏｌをプラス ミドｐＣＪＩのＰｖｕ■部位に挿入してプラスミドｐＣＪＸ−１を形成させた。

この挿入により、プラスミドのコピー数を制御するｒｏｐ遺伝子か破壊される。

次に、Ｉａｃ　Ｉ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩフラグメントをプラスミドρＭＣ ９（Ｃａｌｏｓら、１９８３）から精製し、Ｘｈｏ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩアダプタ ーとともにＸｈｏＩ部位に挿入した。プラスミドｐＫＫ２２３−３中のポリリン カー領域を次にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ　Ｉで切断してイ１加的な部位を含有す るポリリンカー（配列番号２４）・５’　ＡＡＴｒＣＣＣＧＧＧ　ＴＡＣＣＡＧ ＡＴＣＴ　ＧＡＧＣＴＣＡＣＴＡ　ＧＴＣＴＧＣＡ　３’３°　ＧＧＧＣＣＣＡ ＴＧＧＴＣＴＡＧＡ　ＣＴＣＧＡＧＴＧＡＴ　ＣＡＧ　５’で置換した。こうし て得られたプラスミドベクターは　ＣＪＸＩと命名される。

Ｊｔｉ＆＋こ、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［、Ｂ ａｍＨＩ、およびＳａｉ　Ｔの認識部位を有する類似の遺伝子で置換し、重亜硫 酸塩突然変異誘発によって破壊した。以下の操作を用いてｐＢＲ３２２のテトラ サイクリン抵抗性遺伝子を変異させた。すなわち、プラスミドｐＢＲ３２２をＨ ｉｎｄ　ｍて切断し、ついて重亜硫酸ナトリウムて突然変異を誘発した（Ｓｈｏ ｒｊｌｅ　＆　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　１９８５）　ｏ突然変異誘発ＤＮＡをリゲ ートして環状ＤＮＡを形成させ、ついてＨｉｎｄ　ｍて切断して突然変異誘発を 逃れたプラスミドを線状化した。大腸菌Ｊ　ＭＩ０９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ ｒｏｎら、１９８５）。テトラサイクリン抵抗性プラスミドを単離し、テトラサ イクリン抵抗性遺伝子中のＨｉｎｄ　ｍ部位の喪失をチェックした。突然変異か 成功したプラスミドはｐＴＩ　と命名した。類似の操作によってｐＴＩ中のＢａ ｍＨＩ部位の突然変異誘発を行い、プラスミドｐＴ２か得られた。続いて、プラ スミドｐＴ２に突然変異を誘発してＳａｌ　１部位を除去してプラスミドｐＴ３ を形成させた。変異したテトラサイクリン抵抗性遺伝子を持つｐＴ３のＣ１ａｌ −３ｔｙＩフラグメントを単離し、これを用いてｐｃＪＸｌｌの相同のフラグメ ントを置換し、ｐＴ３　Ｘｌ−２を形成させた。変異したテトラサイクリン抵抗 性遺伝子はなお機能性蛋白質をコードしている。Ｉａｃプロモーター領域の下流 に、大腸菌ての発現のための遺伝子のクローニングに４７用な、とくにＢａｍＨ ＩおよびＫｐｎｌ制限部位を含有するポリリンカーを導入した。

ベクターをヒト成熟ＧＤＮＦ構築体と２時間リゲーンヨンさせたのち、反応混合 物２μｌを用いて、Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏ１１５ＵＲＥ”スーパーコンピー テント大腸菌細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の説明書に従ってトラン スフオームした。組換えプラスミドの一つのＤＮＡ配列か例２Ｂに記載のように して決定された。配列から、このプラスミドは成熟しトＧＤＮＦをコードするヒ ｌ−ＧＤＭＦ遺伝子の完全なコート配列を含有することか確認された。

Ｂ　大腸菌におけるヒトＧＤＮＦの発現ヒトＧＤＮＦをコードするＤＮＡ配列を 含有する組換えプラスミドをＪＭＩ０７のＴＩ抵抗性変異体である、大Ｍ株ＪＭ １０７φｒＭＣＢＯＯＯ５（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）に、 Ｓａｍｂｒｏｏｋら（＋９８９）に記載のＣａＣＩｚ法を用いてトランスフオー ムした。リコンビナントの一つを５０ｍ１のＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）中 、　ｌｏＯμｇ／ｍｌのアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）と、３７°Ｃで一夜振盪し ながら増殖させた。翌日、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中に ｌニア０に希釈し、３７°Ｃて振盪しながら５時間増殖させた。２０ｍ１の細胞 を８．０００　Ｘｇで１０分間遠心分離して収穫した。ペレットを４ｍｌのｌ０ ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，４に再懸濁した。細胞をフレンチプレスセル（ＳＬＭ 　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて１８．０００ｐｓ　ｉｇで破壊した。ライ ゼートを１２．０００Ｘｇ、４°Ｃで１５分間遠心分離した。ベレットをｌｏｍ ＭＥＤＴ八に再懸濁した。発酵は３７°Ｃまたは３０°Ｃよりも４２°Ｃて行わ せる方か比較的に多くのＧＤＮＦが蓄積することか見出されている。

例６Ａに記載の組換えプラスミドを用いて（ヒト成熟ＧＤＮＦのコード配列を発 現ベクターｐＴ３　Ｘ［２にクローン化）大腸菌内で高レベルのＧＤＮＦ発現を 達成する現時点て好ましい方法は、次の通りである。ＩＯＬの発酵につき５００ ｍ１の接種材料を１５μｇ／ｍｌテトラザイクリン含有ＬＢ培地（ｐＨ７）中、 ２Ｌの邪魔板振盪フラスコを用い、３７”Ｃて、光学密度（Ａｌｓｏ）が２〜３ になるまで増殖させる。

この培養液は、１２ｇ／Ｉのトリプトン、２４ｇ／ｌの酵母エキス、２５ｇ／Ｉ のグリセロール、　１．３ｇ／ｌのに４　ＨＰＯ４，０，４ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ ４、Ｏ，１ｍｌ／ＩのＭａｃｏｌ１９：ＧＥ６０の４・ｌ混合物、および１５ｍ ｇ／ｌのテトラサイクリン塩酸塩を含有する増殖培地１０Ｌの接種に使用した。

この培養体は４２°Ｃて約１２〜１８時間、光学密度約１２〜２０（Ａ６．。） まで増殖させた。発酵液のｐＨは７．０に維持し、溶解酸素は３０％飽和に保持 した。発酵後、培養液を４℃に冷却し、遠心分離で細胞を収穫した。

上述のプラスミドからのヒトＧＤＮＦの製造はこの大腸菌株に特異的ではなく、 任意の適当な株て製造できる。このプラスミドは２つの他の大腸菌株、ＪＭＩ０ ８ＣＹａｎｉｓｃｈ　Ｐｅｒｒｏｎら、＋９８５）および５ＵＲＥ”　（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）にトランスフオームされた。これらの株のいずれにも、正しい 分子量の新しい蛋白バンドか、ポリアクリルアミドゲルを通した電気泳動後のク ーマツシーブルー染色によって可視化された。

再懸濁物質のアリコートをポリアクリルアミドゲルを通した電気泳動に付した。

ゲルをクーマッンーブルーで染色した。ＧＤＮＦに期待される分子量（＋５，０ ００ダル１〜ン）の部分は、組換えヒ１−ＧＤＮＦプラスミドを含有する培養体 の場合にのみ（γ在し、ベクターｐＴ３　Ｘ　■−２のみを含む培養体では認め られなかった。回収された蛋白質は標準アミノ末端配列決定操作に付し、この蛋 白質の最初のｎのアミノ酸は図１９に示したヒトＧＤＮＦのアミノ酸配列と同一 であり、ヒトＧＤＮＦか大腸菌内て正しく発現されることが確認された。

Ｆ）を、酵母エキス（＃０１２７−０１　Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、！Ｊｌ）およびトリプトン（＃０１２３−０５　Ｄｉｆｃ ｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）ベースの複合培地［ ２４ｇ几酵母エキス、１２ｇ几トリプトン、５ｇルグリセロール、１．３ｇ几（ ７）Ｋ２　ＨＰＯ４，０，４ｇルのＫＨ２Ｐ　Ｏ４，０，１ｍｌ九のＭａｃｏｌ 　１９：ＧＥ６０（４：Ｉ）、１５ｍｇ／Ｌのテトラサイクリンコ中、ＩＰＴＧ 誘導を行わないで、３７°Ｃで定常状態まで増殖させた。細胞をＪＡ１００−タ ー中１６．０００Ｘｇ、４°Ｃて２０分間遠心分離し、細胞ペーストを一２ｏ″ Ｃて保ｒγしｌこ。

細胞は以下のように処理した。５ｍｇの細胞ペーストを、氷上、ＯＣＩＩｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔｓホモジナイサーを用いて、４０ｍ１のＩＯｍＭＥＤＴＡＳ　ｐＨ ７，０によりホモジナイズした。スラリーを２０．０００ｐｓ　ｉで３回フレン チプレスによって処理し、ついてＪＡ２０ローターにより３０．０００　Ｘ　ｇ 、４°Ｃて１０分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットを上述のようにして、 ホモジナイズおよび遠心分離した。−態様においては、再抽出からのペレットを ４０ｍ１の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４でホモジナイズし、上述のように 遠心分離して、上清を捨てた。ペレットを８Ｍの尿素を含有する２０ｍ１の５０ 　ｍＭ　ＴｒｉＳ　、ｐＨ８，０で、３０ｍＭの２−メルカプトエタノールを加 えてまたは加えないでホモジナイズし、上述のように遠心分離し、上清は残して おいた。上清はＴＵエキスと呼ぶ。好ましい実施態様においては、ペレットをＩ ｍＭ　ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０を含む４０ｍ１のｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ ８，０でホモジナイズし、上述のように遠心分離して、上清を捨てた。ペレット を以下のようにスルホニル化して可溶化した。すまわち、ペレットを８Ｍ尿素、 １００ｍＭ亜硫酸ナトリウムおよび１０ｍＭテトラチオン酸ナトリウムを含有す る２５ｍ１の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４にホモジナイズした。スル ホニル化は４°Ｃで撹拌しながら一夜進行させ、ついで　１６．０００Ｘｇ、４ °Ｃて１０分間遠心分離して溶液を澄明化した。

リフォールディング前のＴＵエキスの部分精製：ＴＵエキスをＳ−セファロース ファストフロー樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上イオン交換クロマ］・グラフィー により精製した。カラムは、８Ｍの尿素および３０ｍＭの２−メルカプトエタノ ールを含有する２５　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、ｐＨ７，４（緩衝液Ａ）で平衡化し、 室温で流した。サンプルを負荷したのち緩衝液Ａで光学密度かベースラインにな るまで洗浄し、カラムを１分間に１０％カラム容量の速度で、緩衝液Ａ１ならび に８Ｍ尿素、５００ｍＭＮ　ａ　Ｃｌおよび３０ｍＭの２−メルカプトエタノー ルを含有する１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、ｐＨ９，０（緩衝液Ｂ）それぞれ５カラ ム容量によって溶出した。カラム分画は２８０ｎｍでモニタリングし、５ＤＳ− ＰＡＧＥによって分析した。ＧＤＮＦは主要蛋白ピークとして６０〜７０％勾配 で溶出した。ＧＤＮＦに富む分画をリフォールディングのためにブはＱ−セファ ロースファストフロー樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上イオン交換クロマトグラフ ィーによって部分精製した。カラムは４Ｍの尿素含有１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、ｐ Ｈ８，０（緩衝液Ａ）で平衡化し、この液を４℃で流した。サンプルを負荷した のち緩衝液Ａで光学密度かベースラインになるまで洗浄し、カラムを１分間に５ ％カラム容量の速度で、緩衝液Ａ１ならびに４Ｍ尿素および５００ｍＭＮ　ａ　 Ｃｌを含むｌＯｍＭＴｒｉｓＳｐＨ８，０（緩衝液Ｂ）それぞれ５カラム容量で 溶出した。カラム分画は２８０ｎｍてモニタリングして、５ＤＳ−ＰＡＧＥによ って分析した。ＧＤＮＦは主要蛋白ピークとして５０％の勾配で溶出した。ＧＤ ＮＦに富む分画をリフォールディングのためにプールした。

部分精製ＴＵ抽出物のりフォールディング、上述の部分精製ＧＤＮＦを次のよう にしてリフォールディングした。すなわち、ＧＤＮＦ約１ｍ約１ｍｇ合含有する プールしたカラム溶出液４ｍｌに、ジチオスレイト−ルを５ｍＭになるように加 えた。

試験管に栓をして空気を追い出し、２５°Ｃｌ：１５分間保持した。次に、酸化 されたグルタチオンニナ１〜リウム塩を１５ｍＭになるように加え、空気を１ノ １除できるように再び栓をして、２５°Ｃに１５分間保持した。この溶液をつい て１４容量のりフォールディング緩衝液（４Ｍ尿素、５％ポリエチレングリコー ル３００、および２ｍＭシスティンを含む１００ｍＭＮａｚＨＰＯ４、ＩＯｍＭ −ｒ−タノールアミン、ｐＨ８，３）で希釈し、アルゴン下５℃に３日間保持し た。

部分精製スルホニル化抽出物のりフォールディング、上述のようにして部分精製 したＧＤＮＦを次のようにしてリフォールディングした。すなわち、ＧＤＮＦ約 ３ｍ約３ｍｇ合含有するプールしたカラム溶出液を１９容のりフォールディング 緩衝液（４Ｍ尿素、５％ポリエチレングリコール３００、および３ｍＭシスティ ンを含む１００ｍＭ　Ｎ　ａ　２　ＨＰ　Ｏｔ、ｐＨ８，３）で希釈し、アルゴ ン下５°Ｃに３日間保持した。

リフォールディングＣ；ＤＮＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析：前もって還元剤 にｉ露することなく細菌から抽出したＧＤＮＦは５ＤＳ−ＰＡＧＥ上をモノマー どして、分子量標準蛋白質の移動と比較して約１６ｋＤの見掛けの分子量で移動 する。ダイマーの−にはＧＤＮＦは検出されない。抽出時または５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅの直前ただしりフォールディングの前に還元剤（３０〜１５０ｍＭ　２−メル カプトエタノール）に暴露されたＧＤＮＦは、非還元細菌性蛋白質と識別できな い位置に、見掛けの分子量約＋６ｋＤて移動する（図２６、レーン６および＋３ ）。これは、細菌細胞から製造されたＧＤＮＦはりフォールディングの前には三 量化しないことを示している。

上述のりフォールディング後には、細菌て産生された組換えＧＤＮＦの大部分は 、５ＤＳ−ＰＡＧＥ上を明らかなダイマーとして、約＋６ｋＤて移動する（図２ ６、レーン２）。リフォールディングし？こＧＤＮＦを５ＤＳ−ＰＡＧＥの前＋ ：１５０ｍＭ２−メルカプトエタノールで還元すると、再びモノマーの位置、約 ＋６ｋＤで移動する（図２３、レーン５）。これらの結果は、ＧＤＮＦのりフォ ールディングでは蛋白質かノスルフィ１〜結合ダイマーになることを示している 。リフォールディングしたＧＤＮＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥは還元か起こることなく 進行した。ゲルを長さ方向にスライスし、そのスライスについて交感神経神経節 ニューロン生残アッセイ（下記参照）ての生物活性を検定した。

Ｓ−セファロースまたはＱ−セファロースクロマトグラフィーで部分精製された ＧＤＮＦは、リフォールディング前には、以下に示すようにして実施したＲＰ− ＨＰＬＣにおいて、保持時間約２１分で移動した。ＧＤＮＦのりフォールディン グ後には、同じ条件下で、保持時間は約１５分て移動した。ＧＤＮＦのりフォー ルディングか成功した場合には、保持時間のソフトか期待される。蛋白質のりフ ォールディング後にＲＰ−ＨＰＬＣの保持時間にシフトか観察されることは多い 。

これらのサンプルのＲＰ−ＨＰＬＣを以下のように実施した。流速：１ｍｌ／分 、０、４６ｘ２５ｃｍＣ−４カラムを次のように展開した。溶媒Ａ＝氷水中、１ ％！・リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、溶媒Ｂ−アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ； ０．５〜１．５分、Ｂを５％から２５％に増加させる、１．５〜３１．５分、Ｂ を２５％から５５％に増加させる。

リフォールディングしたＧＤＮＦのバイオアッセイによる分析：リフォールディ ングしたＧＤＮＦを、トリ胚（ＥＩＯ）交感神経神経節ニューロン生残バイオア ッセイ（例４Ａ）およびラット胚（Ｅ１６）中脳培養体ドーパミン取り込みバイ オアッセイ（例ＩＢ）の両者でバイオアッセイした。リフォールディングの前に 、３０ｍＭ　２−メルカプトエタノールに暴露し、上述のようにＳ−セファロー スまたはＱ−セファロースクロマトグラフィーで精製したＧＤＮＦは、中脳培養 体ドーパミン取り込みアッセイにおいて検知可能な生物活性を示さず、交感神経 ニューロン生残バイオアッセイにおいて著しく低い生物活性を示した。Ｓ−セフ ァロースクロマトグラフィーに付した物質の交感神経ニューロン生残バイオアッ セイでの見掛けのＥＤ、。は約ｌμｇ／ｍｌであり、これはりフォールディング ｒｈＧＤＮＦの場合（下記参照）より約３３３倍低かった。Ｑ−セファロースク ロマトグラフィーに付した物質では、交感神経ニューロン生残バイオアッセイで の見掛けのＥＤ、。は約３μｇ／ｍｌであり、これはりフォールディングｒｈＧ ＤＮＦの場合（下記参照）より約１００倍低かった。リフォールディング後には 、ＧＤＮＦは、２−メルカプ１〜エタノールに暴露してもしないても、両アッセ イで、明らかに完全な活性を示した（図２７〜２８）。この結果は、ＧＤＮＦか りフォールディングによって生物活性を獲１辱し、またリフォールディング前の 低い生物活性またはその喪失は２−メルカプトエタノールへの暴露によるもので はないことを示している。

これらのバイオアッセイにおけるリフォールディングした組換えヒトＧＤＮＦ（ ｒｈＧＤＮＦ）のＥＤ、。は、Ｂ４９細胞調整培地から精製さ第１たラットＧＤ ＮＦ番二ついて前に観察された値と類似している。交感神経ニューロン生残バイ オアッセイにおけるｒｈＧＤＮＦのＥＤＴ、は約３　ｎｇ／ｍｌて（図２７）、 ラットＧＤＮＦのＥＤ、。は約５　ｎｇ／ｍｌであった。中脳培養体ドーパミン 取り込みアッセイにおいては、ｒｈＧＤＮＦのＥＤＩ。は、約３０１１ｇ／ｍｌ で（図２８）、ラットＧＤＮＦては約５０ｐｇ／ｍｌてあった。これらの結果は 、ｒｈＧＤＮＦの実質的な部分が効果的にリフォールディングされて、完全に生 物学的に活性であることを指示している。

例７．ＧＤＮＦに対する抗体の製造および単離ｒｈＧＤＮＦに対する抗体は以下 の操作によって発生させた。この操作には、特定のアジュバント、免疫処置プロ トコールおよび動物種が使用されているが、これらは限定的なものではない。ま た、ＧＤＮＦに対する抗体は、以下の操作に示すようにリフォールディング、ネ イティブ蛋白もしくは変性、不活性蛋白、またはヒ１〜もしくは池の動物種から のＧＤＮＦ配列の連続したペプチドを用いて産生させることかてきる。

モノクローナル抗体は多くの標準操作の一つによって発生させることかできる（ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ；　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　P９８８ ［ＳＢＮ　０８７９６９−３１４−２　Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　＆　Ｄａｖｉｄ　 Ｌａｎｅ編参照）。略述すれば、通常モノクローナル抗体を発生させる操作には 、それらに限定されるものではないが、適当な動物の免疫処置および免疫処置プ ロトコールに対するこれらの動物の抗体応答のモニタリング、１もしくは２以上 の動物のたとえばリンパ系臓器からの抗体産生細胞の単離、これらの細胞の適当 な細胞たとえは骨髄腫細胞との融合による抗体分圧・不死化細胞であるバイブ「 月・−マの製造、所望のモノクローナル抗体を産生ずる川−細胞クローンか得ら れるまで連続的にハイブリドーマを単離するためのスクリーニングか包含される 。

ウサギでのポリクローナル抗体の産生は次のように行われる。０．００５〜０． ２５ｍｇのｒｈＧＤＮＦを含有する２ｍｌの滅菌食塩水をＲＩＢ＋アジュバンｌ −ＭＰＬ−ＴＤＭ−ＣＷＳエマルノーｚン（ＲｔＢｌ　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、　）のバイアルに注射し、旋回振盪して製造業者 の説明書により乳化液を形成させる。雌性ニューシーラント白色ウサギに麻酔下 、ＲＩＢＩによって示唆された免疫処置プロトコールに従って注射した。

１ｍｌのアジュバント抗原乳化液を次のように投与した。

０、３０ｍ１皮内　（６部位のそれぞれに０．０５ｍ１）０、４０ｍ１筋肉内（ 各後肢に０．２０ｍ１）０．１０ｍ１皮下　（頚部） ０．２０ｍ１腹腔内 動物には同じプロトコールで４〜６週毎に再び注射をした（ブースター投与）。

最初の注射前および各ブースター投与の１０〜１４日後に動物から採血し、中和 アッセイまたは標準ＥＬＩＳＡによって抗体の産生を試験した。

中和アッセイはラットＥＩ６中脳培養体アッセイを用いて以下のように実施した 。

ウサギ試験血清を、２５ｍＭＨＥ　Ｐ　Ｅ　ＳでｐＨ７，４に緩衝化し、５　ｍ ｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ５という）を加えたダルベツコの最小必 須培地に希釈した。

ついてこれをアッセイウェル（５００μｍの組織培養液に希釈した試験血清２５ μｍ）に加え、３７°Ｃて３０分間インキュベートした。次にｒｈＧＤＮＦを、 ６．３２％ｇａ／ｍｌのｒｈＧＤＮＦを含有するＢＳＡＳ中保存希釈溶液２５μ ｌとして添加し、アッセイ中の最終ｒｈＧＤＮＦａ度は０．３１６ｏｇｍ／ｍｌ 　とした。８日後に培養体中のドーパミン取り込みを前に記載の操作で測定した 。第２のブースターからの抗血清での結果を中和アッセイにより以下に示す（以 下の表２参照）。

表２ ウサギ番号　抗原　”Ｎｅｕｔ、ＥＣ５ｏ　’Ｅｌｉｓａ　ＦＣａ。

１６０４　リフオールドｒｈＧＤＮＦ　２０ｘｌＯ’　２５ｘｌＯ２２２５７リ フオールドｒｈＧＤＮＦ　１２ｘ１０３　７ｘｌＯ３２５０６リフオールドｒｈ ＧＤＮＦ　２ｘｌＯ’　３ｘｌＯ’９３８０　変性ｒｈＧＤＮＦ　２ｘｌＯ’　 ２ｘｌＯ２”　ＧＤＮＦ刺激ドーパミン取り込みの５０％中和のための抗血清希 釈”ＥＬＩＳＡにおける５０％最大（プラトー）シグナルのための抗血清希釈抗 血清もまた、標ＩＥＬＩｓＡにおいて、以下の操作てＧＤＮＦ抗体としての力価 を滴定した。マイクロタイタープレート（９６ウエル、Ｎｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏ ｒｐ）を５０ｍＭ炭酸水素すトリウム、ｐＨ９，６コーテイング緩衝液中１．０ μｇ／ｍ１ｒｈＧＤＮＦをウェルあたり１ｏ０１ｔｌ用い、４°Ｃて一夜コーテ ィングした。プレートをブレー）−洗浄緩衝液（ＰＷＢ　；　０．５％Ｔｗｅｅ ｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，２）で４回洗浄し、ついてウェルあ たり２００μｍのリン酸緩衡生理食塩水、ｐＨ７，２中２％ウノ血清アルブミン により３°Ｃて２時間ブロックした。プレートを再度ＰＷＢて洗浄して、滴定す べき血清サンプルを（２０９６正常ヤギ血清およびＰＷＢ中希釈１００μｍ）を ウェルに加えた。プレートを３５°Ｃて１．５時間インキュベートし、ついて再 び、ＰＷＢて洗浄した。アルカリホスファターゼ接合ヤキ抗−ウサギＩｇ　Ｇ　 （Ｊａｃｋｓｏｎ　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ’）をＰＷＢ中１：２５０ ０に希釈して各ウェル（１００μｍ）に加え、３５°Ｃて１．５時間インキュベ ートした。プレートを前回と同様にＰＷＢて洗浄した。次に、ｐ−ＮＰＰ基質（ ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウノ、　；　Ｓｉｇｒｒｋ１カタロク゛番号 ＭＰ３８９’）を各ウェルに加え（１０％ノエタノールアミン、ｐＨ９，８中１ ．０ｍｇ／ｍｌのｐ−ＮＰＰ、ｌｏｏμｌ）を加え、プレートを２５゛Ｃてイン キュベートした。プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　Ｅ ｎａｘ）によって４０５〜４９０ｎｍてプレートを読んで発色を追跡した。

抗血清はまた、以下のように、ウェスタンブロッティングによるＧＤＮＦの検出 および定量に使用した。トデソル硫酸す］・リウムポリアクリルアミトゲル電気 ン氷動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をＵ、に、Ｌａｅｍｍｌｉ　（Ｎａｔｕｒｅ　２２ ７：６８０−６８５．１９７０）　ｆこよってＲ＞Ａに記載された基本操作によ り、１２．５％アクリルアミド溶解ゲルおよび４．５％アクリル了ミド粘着ゲル を用いて実施した。ゲル（１６ｘ１４ｘ０．１５ｃｍ）　ヲ４０ｍ　ａｍｐの一 定電流で３時間電気泳動した。還元／変性のためにはＩ％ＳＤＳおよび１５０ｍ Ｍ２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液中でサンプルを＋００°Ｃに ｌＯ分ｎｎｆｍ熱した。

ウェスタンプロティングでは、ゲルをついて１ｍｍｏｂｉ　１ｏｎ−Ｐ膜（Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅカタ２０グ番号ＩＰＶ）ｌ　１５＋　５０）上に、２５ｍＭ　Ｔ ｒＩｓｂａｓｅ　、　１９２ｍＭグリノン、０，１％ＳＤＳ、および２０％エタ ノール中ａｏｍ　ｍａｍｐの一定電流でトランスプロットし、以下のように処理 した。

ｌ）膜をブロック緩衝液（＋５０ｍＭ　ＮａＣ１、０，０５％Ｔｗｅｅｎ２０． ４％スキンミルクおよび０．０２％すトリウムアット含有１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、 　ｐＨ７，４’）中２５°Ｃて１時間穏やかに振盪しなからブロックした。

２）次に、膜を、ＧＤＮＦに対する希釈−次抗血清を含有するブロック緩衝液中 ２５°Ｃて２時間穏やかに振盪しなからインキュへ−１−した。

３）膜をブロック緩衝液中で洗浄した（４〜５分洗浄）。

４）次に、膜を、希釈二次抗体（アルカリホスファターゼ接合アフィニティー精 製ヤギ抗−ウサギＩｇ　Ｇ　；　Ｃａｐｐｅｌカタログ番号５９２９９）を含有 するブロック緩衝液中で、穏やかに振盪しなから２５°Ｃて２時間インキュベー トした。

５）膜をスキンミルクを除いたブロック緩衝液中で洗浄した（４〜５分洗浄）。

６）膜を５０ｍ１の現像緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび５ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ １ｚ含有１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ９，５）中２５°Ｃて、１６５μｌのＮ ＢＴおよび８３μｍのＢＣＩＰ（Ｐｒｏｍｅｇａキットカタログ番号Ｐ３７７１ ）とともに穏やかに振盪しながら所望の染色か達成されるまで現像した。

例８：ＧＤＮＦを分泌する膜封入細胞の調製と患者への移植ＧＤＮＦを分泌する 細胞は、神経障害に罹患している患者に移植するために、半透過性膜の内部に封 入することがてきる。好ましい実施聾様においては、患者はパーキンソン病に罹 患していて、ＧＤＮＦを分泌する封入細胞はドーパミン作動性細胞体へＧＤＮＦ を提供てきるように患者の線状体に移植される。

本発明の一実施聾様においては、たとえば上記例５および６において調製され、 説明された、ＧＤＮＦを分泌するように操作された細胞か、生物適合性の、移植 可能な、回収可能なポリマー挿人体の内部に導入される。挿入体は移植細胞の周 囲の組織内に入ってＧＤＮＦを分泌させることができるか、一方、細胞に有害と 考えられる周囲組織からの因子か細胞に接触することを防止するように設計され る。

ＧＤＮＦを分泌するように操作された細胞は、公開ＰＣＴ出願Ｗ０９１／＋０４ ２５、発明の名称−Ｃｅｌｌ　Ｃａｐｓｕｌｅ　Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔ ｅｍ−に記載された方法に従って、このような半透過性の膜に封入される。膜に 封入された細胞は標準的な外科操作によって線状体に移植することかできる。

配列表 配列番号・ｌ 配列の長さ　２５ 配列の堅二アミノ酸 トポロジー、直鎖状 フラグメント！！２　Ｎ−末端フラグメント配列 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＸａａＧｉｎ　Ａｌａ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｎ配列番号　２ 配列の長さ・１３ 配列の型二アミノ酸 トポロジー：直鎖状 フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ａｓｐ　Ｘａａ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　ＡｒＢ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ（ＸａａはＬｙｓまたはＧｉｎである）配列番 号　３ 配列の長さ　８９０ 配列の型　核酸 鎖の数　一本川 配列の特徴、ラソｌ−ＧＤＭＦの核酸配列配列 ＣＣＣＣＣＧＧＧＣＴ　ＧＣＡＧＧＡＡＴｒＣＧＧＧＧ　ＧＴＣＴＡＣＧＧＡ　 ＧＡＣＣＧＧ　ＡＴＣＣＧＡ　ＧＧＴ　ＧＣＣＧＣＣ５４Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｇｌ ｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＡｌａＧＣＣＧＧＡ　 ＣＧＧ　ＧＡＣＴＣＴ　ＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＡ　ＴＧＧ　ＧＡＴ　Ｇ ＴＣＧＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＣＴＧＣ９２Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅ ｒ　Ｌｙｓ　ＩＪｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａ ｌａ　Ｖａｔ　Ｃｙ■ ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴｒＧ　ＣＴＧ　ＣＡＣＡＣＣＧＣＧ　ＴＣＴ　ＧＣＣＴＴＣ ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣＧＣＣＧＧＴ　ＡＡＧ　１４０Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ 　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ 　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＡＧＧ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＭ　ＧＣＧ　ＣＣ ＣＧＣＣＧＡＡ　ＧＡＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＣ１８８Ａ ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｈ ｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　ＡｒｇＧＴＧ　ＣＣＣＴｒＣ ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＡＧＴ　ＧＡＣＴＣＣＡＡＴ　ＡＴＧ　ＣＣＣＧＡＡ　 ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　２３６Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔ ｙｒ　Ｐｒ。

ＧＡＣＣＡＧ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＧＡＣＧＴＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ｍ　ＡＴＴ　Ｃ ＡＡ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡ　ＡＧＡ　２８４Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ａ ｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｔ ｈｒ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　ＡｒｇＣＴＧ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡ Ｔ　ＡＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＡ　ＣＴＴ　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＡＧ Ａ　ＧＡＧ@３３２ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ＋　５　１０ ＡＧＧ　ＡＡＣＣＧＧ　ＣＡＡ　ＧＣＴＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＣＡＧＣＣＣＡ　 ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＡＧＡ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　３８０Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｒ ｇ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓ ｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ＋５　２０　２５ ＧＧＴ　ＣＧＣＡＧＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣＧＧ 　ＧＧＧ　ＴＧＣＧＴＣＴＴＡ　ＡＣＴ　ＧＣＡ　４２８Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒ ｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃｙ ｓ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ１１ｅ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ 　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ 　Ｌｙｓ　ＧｌｕＧＡＡ　ＣＴＧ　ＡＴＣＴＴＴ　ＣＧＡ　ＴＡＴ　ＴＧＴ　Ａ ＧＣＧＧＴ　ＴＣＣＴＧＴ　ＧＡＡ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＡＧ　ＡＣＡ　５２４Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　ｌｌｅ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓ ｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＡＴＧ　ＴＡＣＧＡＣ ＡＡＡ　ＡＴＡ　ＣＴＡ　ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＧＡ　ＡＧＴ　 ＡＧＡ　ＡＧＧ　ＣＴＡ　ＡＣＡ　５V２ Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＴｈｒＡＧＴ　ＧＡＣＡＡ Ｇ　ＧＴＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＴＧＣＡＧＧ　ＣＣＧ　ＧＴＣＧ ＣＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣ６２０Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｎ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｓ ｐ　ＡｓｐＧＡＣＣＴＧ　ＴＣＧ　ＴＴＴ　ＴＴＡ　ＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧ 　ＧＴＴ　ＴＡＣＣＡＴ　ＡＴＣＣＡＴ　ＡＧＡ　ＡＡＧ　６６８Ａｓｐ　Ｌｅ ｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙ ｒ　Ｈｉｓ　ｌｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ＋１０　１１５　１２０　１２５ ＣＡＴ　ＴＣＣＧＣＴ　ＡＡＡ　ＣＧＧ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＴＧＴ　ＡＴＣＴＧ Ａ　ＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴ　７１８Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌ ａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ｌｌｅＧＴＧＴＡＴＴＧＣＡ　 ＴＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＣＴＧＣＧＡＡＧＡ　ＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡ　ＧＧＴＴ ＣＣＣＡＧＧ　ＡＡＡＴＡＴＴＴＧb７７８ ＣＣＡＧＡＡＡＧＧ、Ａ　、ＡＧＡＴＡＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡ　ＧＡ ＧＧＣＡＧＡＧＧ　ＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡ　ＡＧＡＡＧＡＡ`ＡＧ　８３８ 、八ＡＧＧ、＝〜ＣＧＡＡＧ　ＧＣＡＧＣＣＡＴＣＴ　ＧＴＧＧＧＡＧＣＣＴ　 ＧＴＡＧＡＡＧＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＧ　８９０配列番号　４ 配列の長さ　１３４ 配列の型　アミノ酸 鎖の数　一本川 配列 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５ Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　 Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＡｒｇＧｌｙ　Ｇｌｎ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌ ｙ　Ｌｅｕ　［ＩｅＰｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ 　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ Ｌｙｓ　［ｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　 Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＬｙｓＶａｌ　Ｇａｙ　Ｇ ｌｎ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａ ｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ＋００　１０５　１１０ Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　 ｌｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ＋１５　１２０　１ ２５ Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ配列番号　５ 配列の長さ　５６２ 配列の型　核酸 鎖の数　一本川 トポロジー・直鎖状 配列の特徴、ヒトＧＤＮＦの核酸配列 配列 ＡＴＴＴＴＣＴＣＴｒ　ＴＴＣＴｒＴｒＴＧＡ　ＡＣＡＧＣＡ　ＡＡＴ　ＡＴＧ 　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　ＧＡＴ　ＣＡf　５３ Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＧｌｎＴ ＴＣＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＴＣＡＴＧ　ＧＡＴ　ｍ　ＡＴＴ　ＣＡＡ　ＧＣＣＡＣ ＣＡＴＴ　ＡＡＡ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　＋０ＩＰｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　 Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　 Ｌｙｓ　Ａｌｇ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＡＧＧ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＡＡＡ　Ｃ ＡＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＧＴＧ　ＣＴｒ　ＣＣＴ　ＡＧＡ　ＡＧＡ　ＧＡＧ　Ｃ ＧＧ　ＡＡＴ@１４９ Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　 Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ＡｓｎＣＧＧ　ＣＡＧ　Ｇ ＣＴ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＣＡＡＣＣＣＡ　ＧＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣＡＧＡ　 ＧＧＡ　ＭＡ　ＧＧＴ　ＣＧＧ　１９７Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌ ａ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙ ｓ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＡＧＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＡＧＧ　ＧＧＣＡＡＡ　ＡＡＣＣＧ Ｇ　ＧＧＴ　ＴＧＴ　ＧＴＣＴＴＡ　ＡＣＴＧＣＡ　ＡＴＡ　ＣＡＴ　２４５Ａ ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃ ｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　ｌｌｅ　ＨｉｓＴＴＡ　ＡＡＴ　ＧＴ ＣＡＣＴ　ＧＡＣＴＴＧ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＧＧＣＴＡＴ　ＧＡＡ　ＡＣＣＡＡ Ｇ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　２９３Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｕ　ＬｅｕＡＴＴ　ｍ　ＡＧＧ　ＴＡＣＴＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＴ　ＴＧ ＣＧＡＴＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＡＧ　ＡＣＡ　ＡＣＧ　ＴＡＣ３４１１１ｅ　Ｐｈ ｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ａｌ ａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＴｙｒＧＡＣＡＡＡ　ＡＴＡ　ＴＴＧ　 ＡＡＡ　ＡＡＣＴＴＡ　ＴＣＣＡＧＡ　ＡＡＴ　ＡＧＡ　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＧＴ Ｇ　ＡＣＴ　ＧＡＣ３８９Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　 Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　 ＡｓｐＡＡＡ　ＧＴＡ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＴＧＴ　ＴＧＣＡＧＡ　ＣＣ ＣＡＴＣＧＣＣｍ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＧＡＣＣＴＧ　４３７ＴＣＧ　ｍ　ＴＴＡ 　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＡＡＣＣＴＧ　ＧＴｒ　ＴＡＣＣＡＴ　ＡＴＴ　ＣＴＡ　Ａ ＧＡ　ＡＡＧ　ＣＡＴＴＣＣ４８５Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　 Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　ｌ　ｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ 　Ｉ（ｉｓ　Ｓ■■ ＋１５　１２０　１２５ ＧＣＴ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＴＧＴ　ＧＧＡ　ＴＧＴ　ＡＴＣＴＧＡ　ＣＴＣＣＧ ＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＴＧＣＴ　ＧＴＧＴＡＴｒＧＣＡ　T３９ Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ｌｌｅＴｒＣＣＴＧＣＴＡ ＣＡＧＴＧＣＡＡＡＧＡ　ＡＡＧ　５６２配列番号＝６ 配列の長さ：１３４ 配列の￥　アミノ酸 トポロジー：直鎖状 ）配列の特徴、成熟ヒトＧＤＮＦの推定アミノ酸配列配列。

Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５ Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　 Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＡｒｇＧｌｙ　Ｇｉｎ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　ｌｌｅ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅ ｕＧｌｙ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＧＩｕ　Ｌ ｅｕ　ｌｉｅ　’Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　ＡｓｐＬ ｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａ ｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＬｙｓＶａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌ ｎ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｓ ｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　５ｅｒｔｏｏ　１０５　１１０ Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　 Ｌｉｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ１１５　＋２０　１ ２５ Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ｌｉｅ配列番号　７ 配列の長さ、２０ 配列の型　核酸 鎖の数ニ一本川 トポロジー　直鎖状 配列の特徴　オリゴヌクレオチ１−プローブ配列・ ＣＣＮＧＡＹＡＡＲＣＡＲＧＣＮＧＣＮＧＣ（位１ｔ３．１５および１８のＮは イノシン）配列番号、８ 配列の長さ　２２３ 配列の型　核酸 鎖の数　一本川 トボロン−直鎖状 配列の特徴：ヒトＧＤＮＦの核酸配列 配列 ＴＴＣＴＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＧＣＡ　ＧＧＴ　 ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡ　ＣＧＧ　ＧＡＣｍ　５５Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＰｈｅＡＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＴＴＡ　Ｔ ＧＧ　ＧＡＴ　ＧＴＣＧＴＧ　ＧＣＴ　ＧＴＣＴＧＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　 ＣＴＣＣＡＣ１０３Ｌｙｓ　Ｍｅｊ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ 　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｉ ■ ｌ　５　１０　１５ ＡＣＣＧＣＧ　ＴＣＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧ　ＣＴＧ　ＣＣＣＧＣＣＧＧＴ　ＡＡ Ｇ　ＡＧＧ　ＣＣＴ　ＣＣＣＧＡＧ　ＧＣＧ　１５１Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　 Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　 Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡｌａＣＣＣＧＣＣＧＡＡ　ＧＡＣＣＧＣＴＣＣＣＴ ＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧ　ＣＣＣｍ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　１９９Ｐｒｏ 　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ 　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　ＬｅｕＡＧＣＡＧＴ　ＧＡＣＴＧ ＴＡＡＧＡＡＣＣＧＴＴＣＣ２２３Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ 配列番号・９ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数、一本川 トボロジー：直鎖状 配列の特徴・リンカ− 配列・ ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧ　ＧＧ 配列番号、１０ 配列の長さ、７ 配列の型　アミノ酸 トポロジー・直鎖状 配列・ Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｉａ　Ａｈａ配列番号　１１ 配列の長さ　３３ 配列の型、核酸 鎖の数　一本川 トポロジー　直鎖状 配列の特徴　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　５Ｋ−７６、１からの核酸配列配列 ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＡＡＣＣＧＧ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＧＣＷ　ＧＭＷ　Ｇ’ｌ’Ｍ 　ＷＧＭ　ＣＣＷ配列番号・１２ 配列の長さ　１１ 配列の型８アミノ酸 ｌ・ボロジー、直鎖状 配列・ Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｓｅｒ　Ｐｒ。

配列番号　Ｉ３ 配列の長さ　２０ 配列のヤ、核酸 鎖の数　一本川 トボロジー、直鎖状 配列の特徴二オリゴヌクレオチＦＤＨＤ−２６配列 Ａｌｔ’ＲＴＴＹＴＩ’ＮＡ　ＲＮＡ〒ＴＲＴＣ（位置９および１２のＮはイノ シシである）配列番号　１４ 配列の長さ　７ 配列の撃、アミノ酸 トポ０ジー　直鎖状 配列。

Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ｌｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ配列番号　１５ 配列の長さ　Ｉ７ 配列の型　核酸 鎖の数ニ一本川 ｌ・ボロノー　直鎖状 配列の特徴二オリゴヌクレオチドブライマーＰＤＩ配列。

ＧＡＣＧＧＧＡＣＴＣＴＡＡＧＡＴＣ 配列番号、１６ 配列の長さ＝２０ 配列の型、核酸 鎖の数ニ一本川 トポロジー：直鎖状 配列の特徴二オリゴヌクレオチドブライマーＤＨＤ２３配列： 配列番号　１７ 配列の長さ　１７ 配列の型、核酸 鎖の数・一本川 トポロジー　直鎖状 配列の特徴　オリゴヌクレオチドブライマーＬＦ２配列： ＣＧＡＧＡＣＡＡＴＧ　ＴＡＣＧＡＣＡ配列番号＝１８ 配列の長さ・１７ 配列の型　核酸 鎖の数、一本川 トポロジー・直鎖状 Ｑ　＋０　２０　３０ 分画番号 ＦＩＧ、２ ＦＩ　Ｇ、　３ Ｓ３４５６７８９１０Ｓ ＦＩＧ　４ ＦＩＧ　、ら ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、９ ＦＩＧ、Ｉ＋ ＬＯＨｃ、＋Ｏじ　ＯＨ 添加ＧＤＮＦ　（ｐＭ） ＦＩＧ、２０ 添加ＧＤＮＦ　（ｐ　Ｍ　） ＦＩＧ、２１ Ｓａｃ　ｎ　５ａｃＩＩ　Ｐｓｉ　Ｔ　Ｐｓｔ　ＩＦＩＧ、２３ ＦＩＧ、２４　Ａ、ＤＡ取り込み Ｂ、セロトニン取り込み ・・　１　Ｃ電（−■°！１ ＦＩＧ−２５ ＦＩＧ、２Ｇ 特表千７−５０２９８０　（３１） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１６／２４ （３１）優先権主張番号　７８８，４２３（３２）優先臼　１９９１年１１月６ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　８５５，４１３（３２）優先臼　１９９２年３月１９ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎ０１ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　ドハティー、ダニエル、エイチ。

アメリカ合衆国　８０２０３　コロラド州、ポウルダー、イサ力　ドライブ　７ １９ （７２）発明者　ライル、ジャック アメリカ合衆国　８０３０８　コロラド州、ボウルダー、ピー、オー、ボックス 　１７０３３（７２）発明者　ベクテッシュ、スーザンアメリカ合衆国　８０３ ０１　コロラド州、ボウルダー、サーチイーフォーセス　ストリート　３３４４

Claims (74)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子。
2. ２．少なくとも約１２．０００ＴＵ／μｇの比活性を有する「請求項１」に記載 の実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子。
3. ３．Ｂ４９調整培地の比活性よりも少なくとも約２４，０００倍大きい比活性を 有する「請求項１」に記載の実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子。
4. ４．非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約３１〜４２ｋＤの分子量を有する「請求項１」 に記載の実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子。
5. ５．少なくとも約１２．０００ＴＵ／μｇの比活性を有するダイマーポリペプチ ド種からなる「請求項４」に記載の実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子 。
6. ６．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２０〜２３ｋＤの分子量を有する「請求項１」に 記載の実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子。
7. ７．モノマーポリペプチド配列からなる「請求項６」に記載の実質的に精製され たグリア由来神経栄養因子。
8. ８．以下のアミノ酸配列【配列があります】からなる「請求項１」に記載の実質 的に精製されたグリア由来神経栄養因子。
9. ９．図１４に示す成熟ラットグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列（配列番号 ４）からなる「請求項１」に記載の実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子 。
10. １０．図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列（配列番号 ５）からなる「請求項１」に記載の実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子 。
11. １１．（ａ）非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約３１〜４２ｋＤの見掛けの分子 量、（ｂ）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約２０〜２３ｋＤの見掛けの分子量、 および（ｃ）少なくとも約１２，０００ＴＵ／ｍｇの比活性、によって特徴づけ られる実質的に精製されたグリア由来神経栄養因子。
12. １２．図１４に示す成熟ラットグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列（配列番 号４）からなることによってさらに特徴づけられる「請求項１１」に記載の実質 的に精製された蛋白性グリア由来神経栄養因子。
13. １３．図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列（配列番号 ５）からなることによってさらに特徴づけられる「請求項１１」に記載の実質的 に精製された蛋白性グリア由来神経栄養因子。
14. １４．組換えＤＮＡ法によって製造される「請求項１１」に記載の実質的に精製 されたグリア由来神経栄養因子。
15. １５．組換えＤＮＡ法によって製造される「請求項１」に記載の実質的に精製さ れたグリア由来神経栄養因子。
16. １６．図１４に示す成熟ラットグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列（配列番 号４）からなる「請求項１５」に記載の実質的に精製されたグリア由来神経栄養 因子。
17. １７．図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列（配列番号 ５）からなる「請求項１５」に記載の実質的に精製されたグリア由来神経栄養因 子。
18. １８．実質的に精製されたダリア由来神経栄養因子の有効量を医薬用に適した担 体中に含有する医薬組成物。
19. １９．上記因子は図１４に示す成熟ラットグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配 列（配列番号４）からなる「請求項１８」に記載の医薬組成物。
20. ２０．上記因子は図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列 （配列番号５）からなる「請求項１８」に記載の医薬組成物。
21. ２１．上記因子は組換えＤＮＡ法で製造される「請求項１８」に記載の医薬組成 物。
22. ２２．上記因子は図１４に示す成熟ラットグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配 列（配列番号４）からなる「請求項２１」に記載の医薬組成物。
23. ２３．上記因子は図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列 （配列番号５）からなる「請求項２１」に記載の医薬組成物。
24. ２４．Ｂ４９膠芽腫細胞の無血清成育調整培地を調製し、調整培地を濃縮し、濃 縮調整培地に対しヘパリンセファロースクロマトグラフィーを実施し、上記ヘパ リンセファロースクロマトグラフィーから得られた分画に対し迅速蛋白液体クロ マトグラフィーを実施し、上記迅速蛋白液体クロマトグラフィーから得られた分 画に対し逆相高速液体クロマトグラフィーを実施することからなる、実質的に精 製されたグリア由来神経栄養因子を得る方法。
25. ２５．さらに、逆相高速液体クロマトグラフィーによって得られた分画をプレバ ラティプＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、プレパラティプＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得 られた分画に対し逆相高速液体クロマトグラフィーを実施することからなる「請 求項２４」に記載の方法。
26. ２６．精製され、単離されたグリア由来神経栄養因子をコードする核酸配列。
27. ２７．図１３に示す成熟ラットグリア由来神経栄養因子をコードするラット核酸 配列（配列番号３）からなる「請求項２６」に記載の核酸配列。
28. ２８．図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子をコードするヒトの核酸配 列（配列番号５）からなる「請求項２６」に記載の核酸配列。
29. ２９．プレープロダリア由来神経栄養因子をコードする精製され、単離された核 酸配列。
30. ３０．図１３に示すプレープロラットグリア由来神経栄養因子をコードするヒト 核酸配列（配列番号３）からなる「請項２８」に記載の核酸配列。
31. ３１．図１９（配列番号５）および図２２（配列番号８）に示すプレープロヒト グリア由来神経栄養因子をコードするヒト核酸配列からなる「請求項２８」に記 載の核酸配列。
32. ３２．成熟ラットグリア由来神経栄養因子をコードする「請求項２６」の核酸配 列。
33. ３３．図１４に示す成熟ラットダリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列（配列番 号４）をコードする「請求項３２」に記載の核酸配列。
34. ３４．成熟ヒトグリア由来神経栄養因子をコードする「請求項２６」の核酸配列 。
35. ３５．図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子のアミノ酸配列（配列番号 ５）をコードする「請求項３４」記載の核酸配列。
36. ３６．（ａ）図１３に記載のプレープロラットＧＤＮＦのアミノ酸配列をコード する核酸配列（配列番号３）、（ｂ）図１３に記載の成熟ラットＧＤＮＦのアミ ノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号３）、（ｃ）図１９及び２２に記載の プレープロヒトＧＤＮＦのアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号５及び ８）、（ｄ）図１９に記載の成熟ヒトＧＤＮＦのアミノ酸配列をコードする核酸 配列（配列番号５）、（ｅ）ドーパミン作動性活性を有するアミノ酸配列をコー ドし、そのアミノ酸配列はＧＤＮＦの部分に結合する抗体によって認識される核 酸配列、および（ｆ）（１）（ａ），（ｂ），（ｃ）もしくは（ｄ）の相補性配 列にハイプリダイズし、（２）ドーパミン作動性活性を有するアミノ酸をコード する核酸配列からなる群より選ばれるＧＤＮＦをコードする「請求項２６」に記 載の核酸配列。
37. ３７．グリア由来神経栄養因子の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与す ることからなる神経障害の防止または処置方法。
38. ３８．神経障害はパーキンソン病である「請求項３７」に記載の方法。
39. ３９．グリア由来神経栄養因子の有効量を医薬用に適した担体中に含有するパー キンソン病の防止または処置用医薬組成物。
40. ４０．グリア由来神経栄養因子の有効量を医薬用に適した担体中に含有するドー パミン作動性神経細胞の障害または不適切な機能の防止または処置用医薬組成物 。
41. ４１．グリア由来神経栄養因子の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与す ることからなるドーパミン作動性神経細胞の障害または不適切な機能の防止また は処置方法。
42. ４２．グリア由来神経栄養因子をコードする核酸配列に発現調節要素が機能的に 連結してなる組換えＤＮＡ分子。
43. ４３．「請求項４２」に記載のベクターでトランスフォームされた宿主細胞。
44. ４４．グリア由来神経栄養因子を製造するための組換えＤＮＡ法において（ａ） グリア由来神経栄養因子をコードするＤＮＡ配列をそのＤＮＡの発現に必要な調 節要素からなる表現ベクターにサブクローニングし、（ｂ）その発現ベクターで 宿主細胞をトランスフォームし、（ｃ）その宿主細胞をそのベクターが増幅しグ リア由来神経栄養因子が発現する条件下に培養し、（ｄ）その培養宿主細胞から グリア由来神経栄養因子を収穫することからなるグリア由来神経栄養因子の製造 のための組換えＤＮＡ法。
45. ４５．宿主細胞は動物細胞である「請求項４４」に記載の組換えＤＮＡ法。
46. ４６．宿主細胞はＣＯＳ−７細胞である「請求項４５」に記載の組換えＤＮＡ法 。
47. ４７．宿主細胞は細菌の細胞である「請求項４４」に記載の組換えＤＮＡ法。
48. ４８．宿主細胞は大腸菌である「請求項４７」に記載の組換えＤＮＡ法。
49. ４９．さらに、収穫されたグリア由来神経栄養因子のリフォールディング工程か らなる「請求項４８」に記載の組換えＤＮＡ法。
50. ５０．（ａ）「請求項４３」に記載の宿主細胞をそのベクターが増幅しグリア由 来神経栄養因子が発現する条件下に培養し、（ｂ）その培養宿主細胞からグリア 由来神経栄養因子を収穫することからなるグリア由来神経栄養因子の製造のため の組換えＤＮＡ法。
51. ５１．宿主細胞は動物細胞である「請求項５０」に記載の組換えＤＮＡ法。
52. ５２．宿主細胞はＣＯＳ−７細胞である「請求項５１」に記載の組換えＤＮＡ法 。
53. ５３．宿主細胞は細菌の細胞である「請求項５０」に記載の組換えＤＮＡ法。
54. ５４．宿主細胞は大腸菌である「請求項５３」に記載の組換えＤＮＡ法。
55. ５５．さらに、収穫されたグリア由来神経栄養因子のリフォールディング工程か らなる「請求項５４」に記載の組換えＤＮＡ法。
56. ５６．「請求項２４」に記載の方法で製造された実質的に精製されたグリア由来 神経栄養因子。
57. ５７．「請求項５５」に記載の方法で製造された実質的に精製されたグリア由来 神経栄養因子。
58. ５８．「請求項４４」に記載の方法で製造された実質的に精製されたグリア由来 神経栄養因子。
59. ５９．「請求項５０」に記載の方法で製造された実質的に精製されたグリア由来 神経栄養因子。
60. ６０．グリア由来神経栄養因子を認識する実質的に精製された抗体。
61. ６１．上記抗体はモノクローナル抗体である「請求項６０」に記載の抗体。
62. ６２．上記抗体はポリクローナル抗体である「請求項６０」に記載の抗体。
63. ６３．グリア由来神経栄養因子をそれを必要とする患者の体内に分泌する細胞を 移植することからなる神経障害の防止または処置方法。
64. ６４．患者はパーキンソン病に罹患している「請求項６３」に記載の方法。
65. ６５．細胞は「請求項４２」に記載の細胞である「請求項６３」に記載の方法。
66. ６６．細胞はグリア由来神経栄養因子を分泌する天然に存在する細胞である「請 求項６３」に記載の方法。
67. ６７．細胞は生体適合性、半透過性の膜内に保持されている「請求項６３」に記 載の方法。
68. ６８．グリア由来神経栄養因子は図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子 のアミノ酸配列（配列番号５）からなる「請求項６３」に記載の方法。
69. ６９．グリア由来神経栄養因子は図１４に示す成熟ラットグリア由来神経栄養因 子のアミノ酸配列（配列番号４）からなる「請求項６３」に記載の方法。
70. ７０．半透過性膜、およびその膜内に封入されたグリア由来神経栄養因子を分泌 する細胞からなり、その膜はそのグリア由来神経栄養因子には透過性であるが、 その細胞に有害な患者からの因子に対しては非透過性である、患者に移植して神 経障害を防止または処置するためのデバイス。
71. ７１．上記細胞は「請求項４２」に記載の細胞である「請求項７０」に記載のデ バイス。
72. ７２．上記細胞はグリア由来神経栄養因子を分泌する天然に存在する細胞である 「請求項７０」に記載のデバイス。
73. ７３．グリア由来神経栄養因子は図１９に示す成熟ヒトグリア由来神経栄養因子 のアミノ酸配列（配列番号５）からなる「請求項７０」に記載のデバイス。
74. ７４．グリア由来神経栄養因子は図１４に示す成熟ラットグリア由来神経栄養因 子のアミノ酸配列（配列番号４）からなる「請求項７０」に記載のデバイス。