CZ154498A3 - Použití proteinového produktu GDNF-faktoru k přípravě farmaceutických přípravků pro léčbu poškození nebo degenerace fotoreceptorů - Google Patents

Použití proteinového produktu GDNF-faktoru k přípravě farmaceutických přípravků pro léčbu poškození nebo degenerace fotoreceptorů Download PDF

Info

Publication number
CZ154498A3
CZ154498A3 CZ981544A CZ154498A CZ154498A3 CZ 154498 A3 CZ154498 A3 CZ 154498A3 CZ 981544 A CZ981544 A CZ 981544A CZ 154498 A CZ154498 A CZ 154498A CZ 154498 A3 CZ154498 A3 CZ 154498A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gdnf
factor
protein product
cells
photoreceptor
Prior art date
Application number
CZ981544A
Other languages
English (en)
Inventor
Jean-Claude Marcel Louis
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of CZ154498A3 publication Critical patent/CZ154498A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Non-Volatile Memory (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Použití proteinového produktu GDNF-faktoru k přípravě farmaceutických přípravků pro léčbu poškození nebo degenerace fotoreceptorů.
Oblast techniky
Vynález popisuje způsoby léčby poškození nebo degenerace neuronů sítnice využívající podání proteinového neurotrofického faktoru pocházejícího z linie gliových buněk (GDNFfaktor, glial cell line-derived neurotrophic factor). Vynález specificky popisuje způsoby léčby patologických stavů jako například dědičných degenerací retiny a retinopatií (onemocnění sítnice) spojených s věkem, onemocnění nebo poranění, při kterých dochází k degeneraci fotoreceptorů a kde tato degenerace způsobuje ztrátu zraku.
Dosavadní stav techniky
V nedávné době bylo identifikováno několik přirozeně se vyskytujících proteinových molekul, které vykazují trofickou aktivitu vůči různým typům neuronů. Neurotrofické faktory jsou endogenní, rozpustné proteinové molekuly, které hrají významnou roli při přežívání a růstu neuronů v průběhu vývoje a rovněž při udržování funkčnosti a plasticity maturovaných (zralých) neuronů; viz. Fallon a Laughlin, Neurotrophic Factors, Academie Press, San Diego, CA, 1993. Vzhledem ke schopnosti neurotrofických faktorů stimulovat regeneraci a bránit degeneraci a odumírání neuronů se předpokládalo, že neurotrofické faktory mohou být užitečné pro léčbu neurodegenerativních stavů jakými jsou například Parkinsonova cho1
roba, Alzheimerovo onemocnění, amyotrofní laterální skleróza a mrtvice.
Poškození nervů je způsobeno patologickými stavy, které znemožňují přežití a/nebo řádné fungování jednoho nebo více typů nervových buněk. Mezi tyto patologické stavy patří: (1) fyzické poranění, které způsobuje degeneraci axonů (která následně vede k úmrtí takto poškozené nervové buňky) a/nebo degeneraci těla nervových buněk v blízkosti místa poranění; (2) dočasné nebo trvalé přerušení přísunu krve (ischémie) do některé části nervového systému, jako v případě mrtvice; (3) úmyslné nebo náhodné vystavení působení neurotoxinů, jako například chemoterapeutických látek dideoxycitidinu (AIDS) nebo cisplatiny (rakovina); (4) chronická metabolická onemocnění, jako například diabetes nebo selhání ledvin; (5) neurodegenerativní onemocnění jako například Parkinsonova choroba, Alzheimerovo onemocnění a amyotrofní laterální skleróza, které jsou důsledkem degenerace specifických populací neuronů. Aby byl určitý neurotrofický faktor potenciálně použitelný k léčbě poškození nervových buněk, musí daná (nebo dané) populace poškozených nervových buněk reagovat na přítomnost tohoto faktoru; různé neurotrofické faktory mají obvykle vliv na odlišné populace nervových buněk. Bylo zjištěno, že ne všechny populace neuronů reagují na přítomnost různých neurotrofických faktorů stejným způsobem, a že tyto populace nejsou rovněž různými neurotrofickými faktory ovlivněny stejnou měrou.
Prvním identifikovaným neurotrofickým faktorem byl růstový faktor neuronů (NGF-faktor; nerve growth factor). NGFfaktor je prvním zástupcem rodiny trofických faktorů nazývaných neurotrofiny. Do této rodiny v současné době patří neurotrofický faktor pocházející z mozku (BDNF-faktor, brain-derived neurotrophic factor) , neurotrofin-3 (NT-3), NT-4/5 a NT-6 (Thoenen, Trends. Neurosci., 14:165 až 170, • · · ·» ·· ·· ·· ··.
··· · · · · ♦ · · · ···· ·· · ···· • · φ · - · · ······ • · φ · · · · ·····« ·· · · · · · · ··
1991; Lapchak a další, Rev. Neurosci., 3:1 až 10, 1993; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18:223 až 253, 1995). Je známo, že tyto neurotrofiny účinkují prostřednictvím receptorů rodiny trk pro tyrosin kinázu, například prostřednictvím trkA, trkB, trkC a nízkoafinitního receptoru p75 (Lapchak a další, Rev. Neurosci., 3:1 až 10, 1993; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18:223 až 253, 1995; Chao a další, TINS, 18:321 až 326, 1995) . V centrálním nervovém systému je receptor trkA, který je receptorem pro NGF-faktor, exprimován téměř výlučně na cholinergních neuronech nacházejících se v bazální části předního mozku (Venero a další, Neuroreport, 4:959 až 962, 1993). Tyto cholinergní neurony v bazální části předního mozku rovněž exprimují receptory p75 a trkB. Vzhledem ke skutečnosti, že degenerace cholinergních neuronů a/nebo jejich dystrofie jsou charakteristickým znakem Alzheimerova onemocnění (Hefti, J. Neurobiol., 25:1418 až 1435, 1994; Olson, Neurochem. Jul., 15:1 až 3, 1994), je těmto neuronům v současnosti věnována zvláštní pozornost. Cholinergní neurony bazální části předního mozku mohou být v morfologických preparátech snadno identifikovány pomocí histochemických metod namířených na acetylcholinesterázu nebo imunohistochemicky s využitím protilátek proti cholin acyltransferáze (ChAT), enzymu syntetizujícímu acetylcholin, nebo s využitím protilátek proti receptoru p75 (Batchelor a další, J. Comp. Neurol., 284:187 až 204, 1989; Kiss a další, Neurosci., 27:731 až 748, 1988; Woolf a další, Neuroscience, 30:143 až 152, 1989).
Neurotrofický faktor pocházející z linie gliových buněk (GNDF-faktor) je v nedávné době objeveným proteinem, který byl identifikován a purifikován s využitím stanovení založeného na schopnosti tohoto faktoru podporovat přežití a stimulovat fenotyp (vzhledem k povaze transmiteru) dopaminergních neuronů středního mozku in vitro (Lin a další, • · · · · · · ······ ·· · · ·· · · · ·
Science, 260:1130 až 1132, 1993). GDNF-faktor je glykosylovaný homodimer spojený disulfidickými vazbami, který je vzdáleně příbuzný rodině (neurotrofních proteinů) transformujícího růstového faktoru β (TGF-β, transforming growth factor β) (Krieglstein a další, EMBO J., 14:736 až 742, 1995; Poulsen a další, Neuron, 13:1245 až 1252, 1994). GDNFfaktor byl klonován a rekombinantní lidský GDNF-faktor (rhuGDNF) podporuje přežívání a vykazuje trofickou aktivitu vůči dopaminergním neuronům černé hmoty (substantia nigra) a motorickým neuronům míchy in vitro a rovněž in vivo (Beck a další, Nátuře, 273:339 až 341, 1995; Henderson a další, Science, 266:1130 až 1132, 1994; Tomac a další, Nátuře, 273:335 až 339, 1995; Yan a další, Nátuře, 273:341 až 343, 1995; Zurn a další, Neuroreport, 6:113 až 118, 1994).
V experimentech prováděných in vivo stimuluje působení exogenním GDNF-faktorem fenotyp dopaminergních neuronů černé hmoty a normalizuje funkční deficity vyvolané operativním odstraněním axonů nebo působením dopaminergních neurotoxinů u živočišných modelů Parkinsonovy choroby, což je neurodegenerativní onemocnění charakterizované úbytkem dopaminergních neuronů (Hudson a další, Brain Res. Bull., 36:425 až 432, 1995; Hoffer a další, Neurosci. Lett., 182:107 až 111, 1994). Ačkoliv se původně předpokládalo, že GDNF-faktor vykazuje, přinejmenším in vitro, relativně specifickou aktivitu vůči dopaminergním neuronům, následné experimenty prokázaly, že GDNF-faktor má neurotrofickou aktivitu vůči cholinergním motorickým neuronům mozkového kmene a míchy, a to jak in vivo, tak in vitro (Oppenheim a další, Nátuře, 373:344 až 346, 1995; Zurn a další, Neuroreport, 6:113 až 118, 1994; Yan a další, Nátuře, 273:341 až 343, 1995; Henderson a další, Science, 266:1130 až 1132, 1994). GDNFfaktor je tudíž faktorem, který může být potenciálně využí4
ván při léčbě degenerativních poruch motorických neuronů míchy, jako například amyotrofické laterální sklerózy.
V současné době se objevují důkazy které naznačují, že GDNF-faktor může být aktivní vůči širšímu spektru neuronů, než pouze vůči dopaminergním neuronům středního mozku a somatickým motorickým neuronům (Yan a Matheson, Nátuře, 373:341 až 344, 1995; Miller a další, Soc. Neurosci. Abstr., 20:1300, 1994) . Messengerová RNA (mRNA) pro GDNF-faktor byla detekována ve svalech a Schwannových buňkách periferního nervového systému a rovněž v astrocytech typu I v centrálním nervovém systému (Schaar a další, Exp. Neurol., 124:368 až 371, 1993). mRNA pro GDNF-faktor je rovněž ve velké míře exprimována v corpus striatum mladých potkanů (Stromberg a další, Exp. Neurol., 124:401 až 412, 1993) a v menší míře pak v oblastech centrálního nervového systému dospělých potkanů a lidí, včetně corpus striatum, hippokampu, mozkové kůry a míchy (Springer a další, Exp. Neurol., 127:167 až 170, 1994) .
Obecně užitečná pro tento patent je publikace WO93/06116 (Lin a další, Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture), publikovaná 1. dubna, 1993, která popisuje skutečnost, že GDNF-faktor je použitelný k léčbě poškození nervů, včetně poškození spojeného s Parkinsonovou chorobou. Užitečné jsou rovněž zmínky, že mRNA pro GDNF-faktor je detekovatelná a její množství je zvýšeno po záchvatu indukovaném působením pilokarpinu (v publikaci Schmidt-Kastner a další, Mol. Brain Res., 26:325 až 330, 1994,); že astrocyty bazální části předního mozku exprimují při kultivaci in vitro nepříliš velká množství mRNA pro GDNF-faktor, ale že GDNF-faktor nemá v bazální části předního mozku vliv na cholinacyltransferázovou aktivitu (Schaar a další, Exp. Neurol., 124:368 až 371, 1993; Schaar a další, Exp. Neurol., 130:387 až 393, 1994); a zmínka v přihlášce US 08/535682 podané 28. září
1995 (která je dosud v řízení) popisující skutečnost, že GDNF-faktor je použitelný k léčbě poranění nebo degenerace cholinergních neuronů bazální části předního mozku.
U savců je množství neurodegenerativních stavů nebo onemocnění očí spojeno s poškozením nebo degenerací fotoreceptorů. Trofické faktory schopné podporovat přežití nebo regeneraci těchto neuronů by poskytly účinné prostředky pro léčbu takových onemocnění.
Fotoreceptory jsou specializovanou subpopulací neuronů sítnice (retiny) a umožňují vidění. Mezi fotoreceptory patří čípky a tyčinky, což jsou fotosenzitivní buňky sítnice. Každý čípek nebo tyčinka vytváří specializovaný útvar, označovaný jako zevní segment, který obsahuje systém odpovědný za fototransdukci. Tyčinky obsahují rhodopsin, specifický zrakový pigment absorbující světlo. U lidí existují tři druhy čípků, které jsou charakterizovány expresí odlišných zrakových pigmentů: jedná se o pigmenty s maximální citlivostí v krátkovlnné (modré), středovlnné (zelené) a dlouhovlnné (červené) oblasti světla. Rhodopsin nacházející se v tyčinkách zprostředkovává skotopické vidění (za šera), zatímco pigmenty čípků jsou odpovědné za fotopické vidění (za světla). Červené, modré a zelené zrakové pigmenty rovněž vytvářejí základ pro barevné vidění u lidí. Zrakové pigmenty v tyčinkách a čípcích reagují na světlo a vytvářejí akční (fotoreceptorový) potenciál v bipolárních buňkách. Tento signál je následně přenesen na gangliové buňky retiny a vytváří zrakový podnět ve zrakové kůře.
Množství onemocnění sítnice u člověka zahrnuje postupnou degeneraci a následný zánik fotoreceptorů, vedoucí neúprosně ke slepotě. Všechny degenerace fotoreceptorů, způsobené například dědičnou dystrofií sítnice (například retinis pigmentosa, pigmentová zvrhlost sítnice), degenerací makuly spojenou s věkem a jinými makulopatiemi nebo odchlípením
sítnice, jsou charakterizovány postupnou atrofií a ztrátou funkce zevních segmentů fotoreceptorů. Zánik fotoreceptorů nebo ztráta funkce fotoreceptorů navíc vede, u pacientů postižených dystrofiemi sítnice, k ústupu retinálních neuronů druhého řádu (tyčinkových bipolárních buněk a horizontálních buněk), a tudíž ke snížení celkové účinnosti šíření elektrického signálu vytvářeného fotoreceptory. Trofické faktory, které jsou schopny zachránit fotoreceptory před buněčnou smrtí a/nebo jsou schopny obnovit činnost nefunkčních (atrofováných nebo dystrofováných) fotoreceptorů, mohou představovat prostředky pro léčbu takových patologických stavů.
Existují důkazy, že určité proteinové faktory mohou podporovat přežívání fotoreceptorů. Přežívání fotoreceptorů může být například do určité míry stimulováno použitím bazického růstového faktoru fibroblastů (bFGF-faktor, basic fibroblast growth factor) u potkanů Royal College of Surgerons (potkani RSC) a bílých potkanů, u kterých byly fotoreceptory poškozeny stálým působením světla (Faktorovich a další, Nátuře, 347:83 až 86, 1990). Potkani RSC mají dědičnou mutaci v genu exprimovaném v buňkách pigmentového epitelu sítnice (RPE - retinal pigment epithelium) a důsledkem toho je (1) neschopnost RPE fagocytovat neustále odvrhované (obnovující se) části zevních segmentů fotoreceptorů; a (2) degenerace fotoreceptorů a v konečném stádiu jejich zánik. Jedna dávka (injekce) bFGF-faktoru do sklivce nebo do subretinálního prostoru (extracelulární prostor obklopující čípky a tyčinky), podaná na počátku degenerativního procesu, přechodně tyto fotoreceptory chrání (Faktorovich a další, Nátuře, 347:83 až 86, 1990). U modelu bílých potkanů s poškozením vyvolaným působením světla, měla injekce bFGF-faktoru do sklivce nebo do subretinálního prostoru, podaná dva dny před začátkem stálého působení světelných paprsků, za následek ochranu fotoreceptorů před poškozením způsobeným světlem a zamezení úmrtí buněk (LaVail a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:11249 až 11253, 1992). U tohoto modelu bylo přežívání fotoreceptorů pozorováno rovněž za použití kyselého FGF (aFGF-acidic fibroblast growth factor), neurotrofického faktoru odvozeného z mozku (BDGF), ciliárního (řasinkového) neurotrofického faktoru (CNTF-ciliary neurotrophic factor) a interleukinu -1β (IL-ΐβ). Mírné účinky byly pozorována při použití neurotrofinu-3 (NT-3), růstového faktoru II podobného insulinu (IGF-II-faktor, insulin-like growth factor II) a tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF-alfa-faktor, tumor necrosis factor alfa). Růstový faktor neuronů (NGF-faktor), epidermální růstový faktor (EGF), růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF-faktor, platelet-derived growth factor) a IGF-I-faktor nevykazovaly žádný vliv (LaVail a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:11249 až 11253, 1992; a rovněž publikace WO 93/15608).
Ačkoliv je bFGF-faktor účinný u modelů potkanů RCS a potkaních modelů s poškozením fotoreceptorů vyvolaným působením světla, je jeho použitelnost u člověka velmi omezena, a to vzhledem k jeho hypotenzním, mitogenním a silným angiogenním účinkům. Ve skutečnosti způsobuje bFGF-faktor injikovaný do sklivce vnikání makrofágů z krevního řečiště do vnitřní vrstvy sítnice a může způsobit silnou vitreoretinopatii (Faktorovich a další, Nátuře, 347:83 až 86, 1990).
S využitím polymerázové řetězcové reakce bylo rovněž zjištěno, že mRNA pro GDNF-faktor je exprimována v očích potkanů starých 6 dní a rovněž v očích dospělých potkanů, a že tato mRNA je v podstatě asociována s nervovými buňkami retiny a buňkami pigmentového epitelu retiny. Buňky pigmentového epitelu retiny vytvářejí, uskladňují a transportují množství nej různějších faktorů, které jsou odpovědné za přežití a udržení funkčnosti fotoreceptorů. Buňky pigmentového epitelu •· •· · ♦ •· •· retiny jsou rovněž nepostradatelné při procesu fototransdukce: odstraňují odvržené konce zevních segmentů fotoreceptorů a recyklují vitamín A. Transplantace (zavedení) buněk pigmentového epitelu retiny do sítnice potkanů RCS zabrání zániku fotoreceptorových buněk (Li a Turner, Exp. Eye Res., 47:911 až 917, 1988; Mullen a LaVail, Science, 192:799 až 801, 1976), což naznačuje, že buňky pigmentového epitelu retiny produkují difuzibilní trofické faktory fotoreceptorů.
Neustále existuje potřeba nových způsobů a terapeutických přípravků použitelných k léčbě poškození buněk fotoreceptorů. Tyto způsoby a terapeutické přípravky budou v ideálním případě chránit fotoreceptory před postupným poškozováním a budou podporovat přežívání a regeneraci poškozené populace neuronů, a to bez výrazných vedlejších účinků.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje způsoby léčby ztráty zraku způsobené degenerací fotoreceptorů. Tyto způsoby zahrnují podání terapeuticky účinného množství proteinového produktu neurotrofického faktoru pocházejícího z linie gliových buněk (GDNFfaktor). Jedna stránka vynálezu se týká způsobů léčby ztráty zraku způsobené degenerací fotoreceptorů, kde tyto způsoby zahrnují podání terapeuticky účinného množství proteinového produktu GDNF-faktoru. Předpokládá se, že tyto proteinové produkty GDNF-faktoru budou zahrnovat GDNF-faktor, jehož aminokyselinová sekvence je znázorněna jako SEK. ID. Č: 1, a rovněž varianty a deriváty zmíněného faktoru. Vynález je založen na novém objevu, že podání proteinového produktu GDNF-faktoru podporuje přežívání a regeneraci poškozených • ··« · · · ······ • · « · · · · ······ · · · · · · · · ·· fotoreceptorových neuronů, které jsou hlavní populací neuronů poškozených při degeneraci sítnice vedoucí ke slepotě.
Proteinový produkt GDNF-faktoru může být podáván intraokulárně (introočně) v dávce v intervalu přibližně 0,001 mg/den až 10 mg/den, ve výhodném provedení v dávce v rozmezí přibližně 0,01 mg/den až 1 mg/den a nejvýhodněji pak v dávce v rozmezí přibližně 0,1 mg/den až 0,5 mg/den. Do rozsahu vynálezu rovněž spadá léčba degenerace nebo poškození fotoreceptorů pomocí proteinového produktu GDNF-faktoru podávaného spolu s další terapeutickou látkou včetně, ale nejenom, neurotrofického faktoru pocházejícího z mozku, neurotrofinu3, neurotrofinu-4/5, neurotrofinu-6, růstového faktoru podobného insulinu, ciliárního (řasinkového) neurotrofického faktoru, kyselého a bazického růstového faktoru fibroblastů, růstového faktoru-5 fibroblastů, transformujícího růstového faktoru-β a transkriptu regulovaného dvojicí kokainamfetamin. Mezi výhodné způsoby podávání proteinového produktu GDNF-faktoru při léčbě onemocnění nebo patologických stavů očí patří podávání ve formě přípravků pro místní aplikaci, očních čípků, injekcí do oka, očních implantátů a rovněž lze použít metody buněčné nebo genové terapie.
Vynález rovněž popisuje použití proteinového produktu GDNF-faktoru při výrobě léků nebo farmaceutických přípravků sloužících k léčbě poranění nebo degenerace fotoreceptorů. Mezi tyto farmaceutické přípravky patří přípravky pro místní, orální nebo parenterální aplikaci, obsahující proteinový produkt GDNF-faktoru. Odborníci rovněž jistě ocení, že podání může být uskutečněno způsoby buněčné nebo genové terapie (jak je popsáno dále). Jiná stránka vynálezu popisuje způsob získávání buněk fotoreceptorů pro účely implantace, kde jsou tyto buňky fotoreceptorů kultivovány v přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru. Vynález dále popisuje přípravky, které obsahují buňky fotoreceptorů spolu s takovým množstvím proteinového produktu GDNF-faktoru, jenž podporuje přežívání a umožňuje další růst a maturaci (zrání) buněk fotoreceptorů. Po přečtení oddílu „Příklady provedení vynálezu, který popisuje výhodná provedení vynálezu, budou odborníkům zřejmé další stránky a výhody vynálezu.
Popis obrázků na výkresech
Obrázek 1 znázorňuje vliv proteinového produktu neurotrofického faktoru pocházejícího z linie gliových buněk (GDNF-faktor) na přežívání fotoreceptorů v buněčné kultuře neuronu sítnice. Každá hodnota je uvedena ve tvaru průměr + směrodatná odchylka (pro tři kultivace). ED50 je přibližně 30 pg/ml.
Obrázek 2 znázorňuje pozitivní vliv proteinového produktu GDNF-faktoru na růst neuritů fotoreceptorů. Hodnoty jsou uvedeny jako graf distribuce kumulované četnosti délky neuritů. V grafu je uvedena závislost procenta fotoreceptorů (svislá osa) s neurity delšími než daná délka v mikrometrech (vodorovná osa). Trojúhelníky zastupují kontrolu (bez přídavku proteinového produktu GDNF-faktoru) a kroužky (s křížkem uvnitř) zastupují průměrné délky neuritů při kultivaci v přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru. Průměrná délka neuritů při kontrolním experimentu je 27 μτη a při kultivaci v přítomnosti GDNF-faktoru je 68 μπι.
Obrázek 3 znázorňuje stimulaci příjmu kyseliny glutamové v přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru v buněčných kulturách fotoreceptorů. Hodnoty jsou uvedeny jako procenta hodnot (dpm/jamka, dpm-počet rozpadů za minutu) získaných při kontrolní (bez přítomnosti proteinového produktu GDNFfaktoru) kultivaci. Každý bod je uveden ve tvaru průměr + • · · · · • · · · · · · · · ·· • · · · ·· · · · ·· • · · · · · · ······ • · · · · ·· ······ ·· · · · · ·· · · směrodatná odchylka (ze tří jamek v reprezentativním experimentu) . ED50 je přibližně 25 pg/ml.
Obrázek 4 znázorňuje pozitivní vliv proteinového produktu GDNF-faktoru na přežívání fotoreceptorů v buněčné kultuře neuronů sítnice. Ve grafech jsou znázorněny změny počtu fotoreceptorů v závislosti na koncentraci proteinového produktu GDNF-faktoru přidaného k buněčným kulturám odvozených z myší ve stáří 18 (obrázek 4A) a 36 (obrázek 4B) dnů. Každá hodnota je uvedena ve tvaru průměr ± směrodatná odchylka (pro dvě až tři kultivace).
Obrázek 5 znázorňuje pozitivní vliv proteinového produktu GDNF-faktoru na přežívání fotoreceptorů v buněčných kulturách ze sítnic myší rd/rd. Přežívání fotoreceptorů bylo vyjádřeno počtem neuronů obsahujících arestin v jamce o průměru 6 mm. Každá hodnota je uvedena ve tvaru průměr + směrodatná odchylka (pro tři až čtyři kultivace). Tmavé sloupce reprezentují kontroly, světlé pak hodnoty při kultivaci v přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru o koncentraci lng/ml.
Obrázek 6 znázorňuje vliv proteinového produktu GDNFfaktoru na přežívání fotoreceptorů v buněčných kulturách ze sítnic kuřat. Přežívání fotoreceptorů bylo vyjádřeno počtem čípků v pruhu o obsahu 6 milimetrů čtverečních (reprezentuje přibližně 21% z celkové plochy jamky o průměru 6 mm). Každá hodnota je uvedena ve tvaru průměr ± směrodatná odchylka (pro tři kultivace). ED50 je přibližně 50 pg/ml.
Příklady provedení -vynálezu
Postatou vynálezu je zjištění, že proteinový produkt GDNF-faktoru má neurotrofickou aktivitu vůči fotoreceptorům. Dříve neexistovaly žádné náznaky ani zmínky o tom, že by • · · * · · · ···· ·· • · · · · · · · · ·· • · ·« · · · « · ·· • · ♦ · · · · ··»··· • · · · · ·· ······ · · ······ ·· proteinový produkt GDNF-faktoru mohl tuto neurotrofickou aktivitu vykazovat. Vynález popisuje způsob léčby poranění nebo degenerace neuronů sítnice, zvláště pak fotoreceptorů, který využívá podání terapeuticky účinného množství proteinového produktu neurotrofického faktoru pocházejícího z linie gliových buněk (proteinový produkt GDNF-faktor) ve formě farmaceutických přípravků, implantací buněk exprimujících GDNF-faktor nebo genovou terapií pro GDNF-faktor. Vynález může být prováděn za použití jakéhokoliv biologicky aktivního proteinového produktu GDNF-faktoru, včetně GDNFfaktoru, jehož aminokyselinová sekvence je znázorněna jako SEK. ID. Č: 1, a rovněž jeho variant a derivátů.
Za účelem produkce populací neuronů sítnice, používaných ke stanovení vlivu přítomnosti proteinového produktu GDNFfaktoru na fotoreceptory, byl vyvinut speciální postup pro kultivaci buněk. Tento postup je podrobněji popsán v dalším textu. V experimentech sledujících působení proteinového produktu GDNF-faktoru na zmíněné fotoreceptory bylo zjištěno, že kromě podpory přežívání fotoreceptorů, stimuluje přítomnost proteinového produktu GDNF-faktoru u fotoreceptorů rovněž prodlužování výběžků podobných axonům, což ukazuje vliv GDNF-faktoru na morfologický vývoj fotoreceptorů. Sledování příjmu glutamátu dále ukazuje, že působení proteinového produktu GDNF-faktoru na fotoreceptory zvyšuje jejich funkční diferenciaci. Získané výsledky naznačují, že potenciálními výhodami při léčbě pomocí proteinového produktu GDNF-faktoru jsou stimulace přežívání fotoreceptorů, regenerace axonů fotoreceptorů a zevních segmentů a obnova zrakových funkcí. Podávání proteinového produktu GDNF-faktoru by tudíž bylo prospěšné v případech, kdy je ztráta zraku způsobena degenerací fotoreceptorů, jak je tomu například u dědičných degenerací fotoreceptorů, degenerace makuly spojené • ··♦· · · ·· · · · · • · · · · · · ···· • · · · ·· · · * · · • ··· · · · ······ • · · · · · · ······ ·· · · · · 9 · · ♦ s věkem, degenerací sítnice navozených zraněním a dystrofií sítnice.
Vynález dále ukazuje, že působení proteinového produktu GDNF-faktoru stimuluje přežívání fotoreceptorů v kulturách buněk sítnice odvozených z myší postižených dědičnou degenerací retiny. Analýzy fotoreceptorů z myší rd/rd ukazují, že léčba pomocí proteinového produktu GDNF-faktoru posiluje rezistenci fotoreceptorů vůči škodlivému vlivu mutace rd/rd. Tato skutečnost naznačuje, že léčba pomocí proteinového produktu GDNF-faktoru by byla užitečná pro snížení četnosti a prevenci degenerací a zániku fotoreceptorů a dokonce pro zvrácení degenerace fotoreceptorů u pacientů s dědičnými poškozeními sítnice (charakterizovanými degenerací fotoreceptorů) , jakým je například pigmentová zvrhlost sítnice. Jak je doloženo příklady uvedenými v dalším textu, podávání proteinového produktu GDNF-faktoru může být prospěšné u množství patologických stavů, které jsou charakterizovány degenerací fotoreceptorů a kde tato degenerace vede ke ztrátě zraku. Mezi takové patologické stavy patří dědičné degenerace sítnice jako například pigmentová zvrhlost sítnice, Bardet-Biedlův syndrom, Bassen-Kornizweigúv syndrom (abetalipoproteinémie), Bestova choroba (voskově žlutá dystrofie), choroideremie, kruhová atrofie, dědičná amauróza (slepota), Refsumův syndrom. Stadgardtova choroba a Usherův syndrom. Mezi další retinopatie, u kterých může být prospěšné podávání proteinového produktu GDNF-faktoru, patří degenerace makuly spojená s věkem (suchá a vlhká forma), diabetická retinopatie, periferní vitreoretinopatie, fotické retinopatie, retinopatie vyvolané chirurgickým zákrokem, virální retinopatie (jako například HIV retinopatie spojená s AIDS), ischemické retinopatie, odchlípení sítnice a úrazová retinopatie .
• · ♦· · · · ·9 · · · · • 9 · 9 9 9 9 9 9 99
9 99 99 ·9999
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 99
9 999 99 999999 99
Ve výhodných provedeních vynálezu je proteinový produkt GDNF-faktoru podáván intraokulárně (introočně) v dávce v intervalu přibližně 0,001 mg/den až 10 mg/den, výhodněji pak v dávce v rozmezí přibližně 0,01 mg/den až 1 mg/den a nejvýhodněji pak v dávce v rozmezí přibližně 0,1 mg/den až 0,5 mg/den. Do rozsahu vynálezu rovněž spadá léčba degenerace nebo dystrofie sítnice pomocí proteinového produktu GDNFfaktoru podávaného spolu s účinným množstvím jiné terapeutické látky. Jako „druhá terapeutická látka mohou být použity (výčet však není limitující): mitogeny jako například insulin, růstové faktory podobné insulinu, epidermální růstový faktor, vasoaktivní růstový faktor, polypeptid aktivující adenylát cyklázu podvěsku mozkového, interferon a somatostatin; neurotrofické faktory jako například neurotrofický faktor pocházejícího z mozku, neurotrofin-3, neurotrofin4/5, neurotrofin-6, růstový faktor podobný insulinu, ciliární (řasinkový) neurotrofický faktor, kyselý a bazický růstový faktor fibroblastů, růstový faktor-5 fibroblastů, transformující růstový faktor-β a transkript regulovaný dvojicí kokain-amfetamin; a jiné růstové faktory jako například epidermální růstový faktor, leukemický inhibiční faktor, interleukiny, interferony a faktory stimulující růst kolonií; rovněž tak molekuly a látky, které svou funkcí odpovídají zmíněným faktorům.
Vynález rovněž popisuje použití proteinového produktu GDNF-faktoru při formulaci léčivých přípravků použitelných k léčbě poranění nebo degenerace fotoreceptorů, včetně léčby onemocnění a patologických stavů popsaných výše. Farmaceutické přípravky obsahující proteinový produkt GDNF-faktoru jsou detailně popsány v dalším textu.
Termín „proteinový produkt GDNF-faktoru používaný v tomto textu zahrnuje purifikovaný neurotrofický faktor pocházející z linie gliových buněk, a to bud' přirozeně se • · »· to ·« · to · ·· · • to * to to to to · · · to toto·· toto · · · ·· • · · · · · to ····«· • to · · to ·to • ·· to · · ·· « · ·· ···· vyskytující, připravený uměle nebo rekombinantními technikami. Tento termín dále zahrnuje biologicky aktivní formy GDNF-faktoru (včetně forem obsahujících delece, inzerce nebo substituce) a jejich chemicky modifikované deriváty. Termín „proteinový produkt GDNF-faktoru rovněž zahrnuje GDNFfaktory, které vykazují vysoký stupeň homologie k lidskému GDNF-faktoru o aminokyselinové sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č:l. Ve svých biologicky aktivních formách mohou proteinové produkty GDNF-faktoru existovat jako homodimery nebo heterodimery.
Termín „biologicky aktivní používaný ve vynálezu označuje skutečnost, že proteinový produkt GDNF-faktoru má podobné neurotrofické vlastnosti, i když ne nezbytně veškeré vlastnosti a vlastnosti ve stejném rozsahu, jako GDNF-faktor o aminokyselinové sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č:l. Výběr požadovaných neurotrofických vlastností závisí na účelu, za jakým jsou podávány.
Termín „vykazující vysoký stupeň homologie používaný ve vynálezu označuje skutečnost, že stupeň homologie k GDNFfaktoru o aminokyselinové sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č:1 přesahuje ve výhodném provedení vynálezu 70%, ve výhodnějším provedení pak přesahuje hranici 80% a nejvýhodněji pak přesahuje 90% nebo 95%. Například stupeň homologie mezi potkaním a lidským GDNF-faktorem je přibližně 93% a předpokládá se, že výhodně používané savčí GDNF-faktory budou vykazovat podobný stupeň homologie. Procento homologie, tak jak je chápáno v této přihlášce, je definováno jako procento aminokyselinových zbytků přítomných v kratší ze dvou sekvencí, které jsou srovnávány, přičemž při přiřazování odpovídajících si aminokyselinových zbytků mohou být, za účelem maximalizace přiřazení, do řetězce o délce 100 aminokyselin zavedeny čtyři mezery. Tento předpis je navržen v publikaci Dayhoff, „Atlas of Protein Science and Structure, svazek 5, · ·· · · * · a v · · · • »> · · · 9 9 · ·· « Μ· · 9 9 9 9 99
9 · · · · · »»♦··· • · · · · ·V
Λ 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 strana 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C., 1972, která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Mezi entity „vykazující vysoký stupeň homologie jsou rovněž řazeny jakékoliv proteinové produkty GDNF-faktoru, které mohou být izolovány na základě křížové reaktivity s protilátkami proti GDNF-faktoru o sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č:l, nebo jakékoliv proteinové produkty GDNFfaktoru, jejichž geny mohou být izolovány s využitím hybridizace s genem nebo částmi genu kódujícími GDNF-faktor o sekvenci znázorněné jako SEK. ID. Č:l.
Proteinové produkty GDNF-faktoru podle vynálezu mohou být izolovány nebo vytvořeny pomocí postupů odborníkům dobře známých. Ukázky postupů sloužících k přípravě proteinových produktů GDNF-faktoru (používaných v této přihlášce) jsou popsány v přihlášce US 08/182183 podané 23. května 1994 a v jejích rodičovských přihláškách; v přihlášce PCT/US92/07888 podané 17. září 1992 a vydané jako WO 93/06116 (Lin a další, Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture); v evropské patentové přihlášce 92921022.7 vydané pod číslem EP 610254; a v přihlášce US 08/535681 podané 28. září 1995 („Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor), která je dosud v řízení. Zmíněné publikace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Přirozeně se vyskytující proteinové produkty GDNFfaktoru mohou být izolovány z preparátů savčích nervových buněk nebo z buněčných linií savčích buněk sekretujících nebo exprimujících GDNF-faktory. Například publikace WO93/06116 popisuje izolaci GDNF-faktoru z bezsérového kultivačního média, v němž byly kultivovány glioblastomy B49. Proteinové produkty GDNF-faktoru mohou být rovněž připraveny chemickou syntézou a to postupy odborníkům dobře známými.
9 ·»· 9* · ··· ·· • · * · r 9 · · · ·· • 4 4 · ·· 9 ♦ *« • 9*9 ♦ 9 9 99« ·* ♦ • 9 9 * * 99 ··» 949 ·· *994 99··
Proteinové produkty GDNF-faktoru jsou ve výhodném provedení produkovány s využitím rekombinantních postupů, jelikož s využitím těchto technik je možné dosáhnout vyšších výtěžků proteinu o vyšší čistotě. K formám rekombinantních proteinových produktů GDNF-faktoru patří glykosylováné a neglykosylované formy tohoto proteinu a protein je exprimován v bakteriálních, savčích nebo hmyzích buněčných systémech.
Obecně lze říci, že rekombinantní postupy zahrnují izolaci genů kódujících GDNF-faktor, klonování takového genu do vhodných vektorů pro příslušné typy buněk a, je-li to nezbytné, modifikaci zmíněného genu tak, aby kódoval požadovanou variantu proteinového produktu GDNF-faktoru. Dále následuje exprese tohoto genu za účelem produkce proteinového produktu proteinového produktu GDNF-faktoru. Jinou možností je chemická syntéza nukleotidové sekvence kódující požadovaný proteinový produkt GDNF-faktoru. Do rozsahu vynálezu rovněž spadá exprese proteinového produktu GDNF-faktoru za použití nukleotidových sekvencí, které se liší v použitých kodonech, kde tato odlišnost vyplývá z degenerace genetického kódu nebo z odlišnosti jednotlivých alelických forem. Publikace WO93/06116 popisuje izolaci a sekvenování klonu cDNA genu pro potkaní GDNF-faktor a izolaci, sekvenování a expresi klonu genomové DNA genu pro lidský GDNF-faktor. Publikace WO93/06116 rovněž popisuje vektory, hostitelské buňky a podmínky kultivace používané při expresi proteinového produktu GDNF-faktoru. Jiné vektory vhodné pro expresi proteinového produktu GDNF-faktoru v E. coli jsou popsány v evropské patentové přihlášce EP 0423980 („Stem Cell Factor - Faktor kmenových buněk) vydané 24. dubna 1991, která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Nukleotidová sekvence genu kódujícího maturovaný lidský GDNF-faktor a aminokyselinová sekvence tohoto GDNF-faktoru jsou v publikaci WO93/06116 znázorněny • · · ♦ • · • · <>
na obrázku 19 (SEK. ID. Č: 5). Obrázek 19 nezobrazuje celou kódující sekvenci pre-pro formy GDNF-faktoru, nicméně prvních 50 aminokyselin lidského pre-pro GDNF-faktoru je v publikaci WO93/06116 zobrazeno na obrázku 22 (SEK. ID. Č: 8) .
Přirozeně se vyskytující GDNF-faktor vytváří ve své biologicky aktivní formě dimery spojené disulfidickou vazbou. Materiál izolovaný po expresi v bakteriálním systému je v podstatě biologicky neaktivní a vyskytuje se v monomerní formě. K vytvoření biologicky aktivních dimerních molekul spojených disulfidickou vazbou je nutno protein refoldovat. Postupy používané pro refolding a vytvoření biologicky aktivní formy GDNF-faktoru (exprimovaného v bakteriálním systému) jsou popsány v publikaci WO93/06116. V publikaci WO93/06116 a ve spoluvlastněné přihlášce US 08/535681 podané
28. září 1995 (která je dosud v řízení) jsou rovněž popsány standardní in vitro stanovení sloužící k určení aktivity GDNF-faktoru. Tyto publikace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
A. Varianty GDNF-faktoru
Termín „varianta GDNF-faktoru (varianta proteinového produktu GDNF-faktoru) používaný v tomto textu zahrnuje polypeptidy, ve kterých byla aminokyselinová sekvence přirozeně se vyskytujícího GDNF-faktoru pozměněna tím, že z ní některé aminokyseliny byly odstraněny („deleční varianty), nahrazeny jinými aminokyselinovými zbytky („substituční varianty) nebo do ní byly nějaké aminokyseliny přidány („varianty s vloženými aminokyselinami). Takové varianty jsou vytvářeny zavedením odpovídajících změn do nukleotidové sekvence DNA kódující zmíněný polypeptid nebo chemickou syntézou požadovaného polypeptidu prováděnou in vitro. Odborníkům je zřejmé, že může být provedeno množství delecí • · (odstranění), substitucí nebo inzercí (a jejich kombinací), jejichž výsledkem je vznik molekuly GDNF-faktoru vykazující biologickou aktivitu.
Odborníkům jsou dobře známy postupy mutageneze sloužící k substituci, inzerci nebo deleci jednoho nebo více zvolených aminokyselinových zbytků (například přihláška US 4518584, která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu). Při vytváření variant polypeptidů existují dvě hlavní proměnné: umístění mutovaného místa a povaha mutace. Při návrhu variant GDNFfaktoru bude výběr umístění mutovaného místa a povaha mutace záviset na vlastnosti (vlastnostech) GDNF-faktoru, která má být modifikována. Mutovaná místa mohou modifikována jednotlivě nebo po skupinách, například (1) nejprve substitucí konzervativními aminokyselinovými zbytky a následně, v závislosti na dosažených výsledcích, zbytky daleko odlišnějšími; (2) deleci (odstraněním) požadovaného aminokyselinového zbytku nebo; (3) vložením aminokyselinových zbytků do míst těsně přiléhajících k danému místu. Ve výhodném provedení jsou upřednostňovány konzervativní záměny 1 až 20 aminokyselin. Jakmile je určena aminokyselinová sekvence požadovaného proteinového produktu GDNF-faktoru, je snadné určit nukleotidovou sekvenci, která bude použita pro expresi zmíněného proteinu. Varianty s delecemi na N-konci nebo C-konci mohou být vytvořeny proteolytickým štěpením.
Co se týká delečních variant GDNF-faktoru, počet odstraněných aminokyselinových zbytků se přibližně pohybuje v rozmezí 1 až 30 zbytků, obvykleji pak 1 až 10 zbytků a typicky v rozmezí 1 až 5 po sobě jdoucích aminokyselinových zbytků. Jako možnost se jeví delece na N-konci, C-konci nebo ve vnitřní sekvenci. Za účelem ovlivnění aktivity GDNFfaktoru mohou být odstraněny (deletovány) oblasti (části oblastí), které vykazují nízký stupeň homologie k jiným • · v · ·· · · ·· ·· • ·· · · · · · « · · · · · · • · · · ······ • · · · · • · ···· · · ·· zástupcům rodiny TGF-β. Delece provedené v oblastech s vysokým stupněm homologie k jiným zástupcům rodiny TGF-β budou s větší pravděpodobností daleko výrazněji modifikovat biologickou aktivitu GDNF-faktoru. Počet po sobě jdoucích delecí bude vybrán tak, aby byla zachována terciální struktura proteinového produktu GDNF-faktoru (například spojení cysteinovým můstkem) v doméně, kde je tato delece prováděna. Příkladem delečních variant jsou zkrácené proteinové produkty GDNF-faktoru, u kterých je z N-konce GDNF-faktoru odstraněno 1 až 40 aminokyselinových zbytků nebo zkrácené proteinové produkty GDNF-faktoru, které postrádají C-koncový aminokyselinový zbytek, nebo jejich kombinace. Tyto varianty jsou popsány ve spoluvlastněné přihlášce US 08/535681 podané 28. září 1995 (která je dosud v řízení). Tato publikace je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Co se týká variant GDNF-faktoru s vloženými aminokyselinovými zbytky, jedná se obvykle o přidání aminokyselinových sekvencí na N-konec a/nebo C-konec, přičemž počet přidaných aminokyselinových zbytků se pohybuje v rozmezí 1 až 100 nebo více aminokyselin. Jeden nebo více aminokyselinových zbytků může být vloženo rovněž do vnitřní oblasti sekvence. Do vnitřní oblasti sekvence je obvykle vkládáno přibližně 1 až 10 aminokyselinových zbytků, obvykleji pak 1 až 5 zbytků a typicky 1 až 3 aminokyselinové zbytky. Příkladem variant s aminokyselinovými zbytky vloženými na N-konec je GDNFfaktor s methioninem vloženým na N-konec (artefakt exprese GDNF-faktoru v buněčné kultuře rekombinantních bakterií), který je označován [Met'1] GDNF-faktor, a fúzní proteiny obsahující heterologní N-koncovou signální sekvenci usnadňující sekreci maturovaného GDNF-faktoru z rekombinantních hostitelských buněk připojenou k N-konci GDNF-faktoru. Používané signální sekvence budou obvykle získány • ·
z hostitelských buněk použitých pro expresi a budou tudíž, ve vztahu k hostitelské buňce, homologní. Vložené sekvence aminokyselin mohou být rovněž odvozeny ze sekvencí jiných neurotrofických faktorů. Ve výhodných provedeních vynálezu je používán rekombinantní lidský [Met'1] GDNF-faktor.
U substitučních variant GDNF-faktoru je alespoň jeden aminokyselinový zbytek z aminokyselinové sekvence GDNFfaktoru odstraněn a na jeho místo je vložen zbytek odlišný. Mezi takové substituční varianty patří alelické formy, jenž jsou charakterizovány přirozeně se vyskytujícími změnami v nukleotidové sekvenci u populace daného druhu, přičemž tyto změny mohou, ale nemusí, vést ke změně aminokyselinové sekvence. Příklady substitučních variant (například SEK. ID. Č: 50) jsou popsány ve spoluvlastněné přihlášce US 08/535681 podané 28. září 1995 (která je dosud v řízení). Tato publikace je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.
Specifické mutace v aminokyselinové sekvenci GDNFfaktoru mohou zahrnovat modifikace místa glykosylace (například šeřinu, threoninu nebo asparaginu). Absence glykosylace nebo pouze částečná glykosylace jsou důsledkem substituce nebo delece (odstranění) aminokyselin nacházejících se v sekvenci rozpoznávané při N-glykosylaci (na asparaginu) nebo jsou důsledkem substituce nebo delece (odstranění) aminokyselin v jakémkoliv místě molekuly, které je modifikováno připojením sacharidu prostřednictvím O-glykosidické vazby. Sekvence rozpoznávaná při N-glykosylaci (na asparaginu) zahrnuje tripeptid, který je specificky rozpoznáván enzymy odpovědnými za N-glykosylaci. Zmíněné tripeptidy mají buď sekvenci Asn-Xaa-Thr nebo Asn-Xaa-Ser, v níž symbol Xaa zastupuje jakoukoliv aminokyselinu vyjma prolinu. Je možno provést velké množství záměn nebo delecí aminokyselin nacházejících se na prvním a třetím místě v sekvenci rozpoznávané • · · · « · v · · ··· • · · • · · · ·· · * při N-glykosylaci (jednotlivě nebo současně) a/nebo deleci aminokyseliny na druhém místě tak, aby v místě takto modifikovaného tripeptidu nedocházelo ke glykosylaci. Výsledkem exprese tímto způsobem vhodně pozměněných nukleotidových sekvencí jsou varianty, které nejsou v daném místě glykosylovány. Jinou možností je modifikace aminokyselinové sekvence GDNF-faktoru, kterou se do molekuly zavedou místa pro glykosylaci.
Jeden způsob, který slouží k identifikaci aminokyselinových zbytků nebo oblastí GDNF-faktoru vhodných k mutagenezi, je „mutageneze záměnou za alanin, jak je popsána v článku autorů Cunningham a Wells (Science, 244:1081 až 1085, 1989). Při této metodě je identifikován jeden nebo skupina aminokyselinových zbytků (například nabité zbytky jako například Arg, Asp, His, Lys a Glu) a tyto jsou následně nahrazeny neutrálními nebo negativně nabitými aminokyselinami (ve výhodném provedení alaninem nebo polyalaninem). Tato záměna má vliv na interakci zmíněných aminokyselin s okolním vodným prostředím uvnitř nebo vně buněk. Domény, jejichž funkce je zmíněnými substitucemi ovlivněna, jsou dále modifikovány zavedením dalších aminokyselinových zbytků nebo záměnou stávajících aminokyselin v místech substitucí. Takže shrnuto: je nalezeno cílové místo pro zavedení změn do aminokyselinové sekvence, následuje „mutageneze záměnou za alanin nebo náhodná mutageneze odpovídajícího cílového kodonu nebo sekvence v molekule DNA a exprimované varianty GDNF-faktoru jsou testovány za účelem nalezení varianty GDNF-faktoru s optimální kombinací požadovaná aktivita/stupeň aktivity.
Místa, která jsou z hlediska mutageneze zavádějící do sekvence jiné aminokyselinové zbytky nej zajímavější, zahrnují oblasti, v nichž se aminokyseliny GDNF-faktorů z jednotlivých druhů podstatně liší ve velikosti, náboji a/nebo hydrofobicitě postranního řetězce. Dalšími místy, • ·
zajímavými z hlediska mutageneze zavádějící do sekvence jiné aminokyselinové zbytky, jsou oblasti, v nichž jsou aminokyseliny GDNF-faktorů z jednotlivých druhů identické. Tato místa jsou obvykle důležitá pro biologickou aktivitu proteinů. Na počátku je v těchto místech provedena v podstatě konzervativní záměna. Takové konzervativní záměny jsou zobrazeny v Tabulce 1. ve sloupci s názvem „Výhodná substituce. Dojde-li po zavedení těchto substitucí ke změně biologické aktivity, následuje zavedení podstatnějších změn (sloupec Příklady jiných substitucí) a/nebo mohou být do sekvence přidány (adice) nebo ze sekvence odstraněny (delece) aminokyseliny a u takto získaných produktů je testována jejich aktivita.
Tabulka 1
Aminokyselinové substituce
Původní aminokyse- lina Výhodná substi- tuce Příklady jiných sub- stitucí
Ala (A) Val Val; Leu; Ile
Arg (R ) Lys Lys; Gin; Asn
Asn (N) Gin Gin; His; Lys; Arg
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gin (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro Pro
His (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg
Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; norleucin
Leu (L) Ile Ile; Val; Met; Ala; Phe; norleucin
• · • ·
Lys (K) Arg Arg; Gin; Asn
Met (M) Leu Leu; Phe; Ile
Phe (F) Leu Leu; Val; Ile; Ala
Pro (P) Gly Gly
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr
Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser
Val (V) Leu Leu; Ile; Met; Ala; Phe; norleucin
Předpokládá se, že výsledkem konzervativních změn v aminokyselinové sekvenci (a odpovídajících změn v kódujících nukleotidových sekvencích) bude vznik proteinových produktů GDNF-faktoru, které budou funkčně a svými chemickými charakteristikami podobné přirozeně se vyskytujícím GDNF-faktorům. Podstatných změn ve funkci a/nebo chemických charakteristikách proteinových produktů GDNF-faktorů může být naproti tomu dosaženo zavedením substitucí, které podstatně pozměňují (a) strukturu hlavního řetězce polypeptidu v místě substituce, například pozměňují konformaci ahelixu nebo β-skládaného listu; (b) náboj nebo hydrofobicitu dané molekuly v cílovém místě; nebo (c) velikost postranního řetězce. Přirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky jsou na základě společných charakteristik postranního řetězce děleny do následujících skupin:
1. Hydrofobní: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2. Neutrální hydrofilní: Cys, Set, Thr;
3. Kyselé: Asp, Glu;
4. Zásadité: Asn, Gin, His, Lys, Arg;
5. Zbytky ovlivňující orientaci řetězce: Gly, Pro; a
6. Aromatické: Trp, Tyr, Phe.
• · · ·
Nekonzervativní záměny mohou zahrnovat záměnu některého zástupce jedné z těchto skupin za aminokyselinu z jiné skupiny. Tyto substituce mohou být zavedeny do oblastí GDNFfaktoru, které jsou homologní s oblastmi v jiných proteinech rodiny TGF-β. Jinou možností je zavedení zmíněných substitucí do oblastí GDNF-faktoru, které homologní (s proteiny rodiny TGF-β) nejsou.
B. Deriváty GDNF-faktoru
Chemicky modifikované deriváty GDNF-faktoru nebo různých variant GDNF-faktoru mohou být odborníkem připraveny s využitím postupů popsaných v tomto vynálezu. Nejvhodnějšími sloučeninami k přípravě derivátů jsou polymery ve vodě rozpustné. Použití nějakého polymeru rozpustného ve vodě je žádoucí zejména proto, že protein, ke kterému je tento polymer připojen, ve vodném prostředí, jako například ve fyziologickém prostředí, neprecipituje. Ve výhodném provedení bude zmíněný polymer přijatelný pro farmaceutickou přípravu léčivého produktu nebo přípravku. Odborník bude schopen zvolit požadovaný polymer na základě takových úvah, jako například bude-li konjugát polymer/protein používán terapeuticky, a jestliže ano, pak vzhledem k požadovanému dávkování, požadované době setrvání v krevním oběhu, rezistenci vůči proteolýze a jiným faktorům. Účinnost (přípravy) derivátů může být stanovena podáním daného derivátu v požadované formě (například osmotickou pumpou nebo ve výhodném provedení injekcí nebo ve formě infuze nebo dále ve formě pro orální, pulmonární nebo jiná podávání) a následným měřením účinku .
Mezi vhodné polymery rozpustné ve vodě patří (nejenom) polyethylenglykol (PEG), kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylalko26 • · • · · · · · · ··· ··«· · · · · · · .
• ··· · · · · · · · · « « · · · ······ ·· ···· · · ·· hol, polyvinylpyrrolidon, poly-1,3-dioxolan, poly-1,3,6trioxan, kopolymer ethylenu a anhydridu kyseliny maleinové, polyaminokyseliny (buď homopolymery nebo kopolymery s náhodnou sekvencí) a dextran nebo poly(nvinylpyrrolidon)polyethylenglykol, homopolymer propylenglykolu, kopolymery polypropylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylované polyoly (například glycerol), polyvinylalkohol, a jejich směsi. Při výrobě může být s výhodou používán, vzhledem ke své stabilitě ve vodě, polyethylenglykolpropionaldehyd.
Zmíněné polymery mohou mít jakoukoliv molekulovou hmotnost a mohou být rozvětvené nebo nerozvětvené. V případě polyethylenglykolu se ve výhodném provedení jedná o molekuly s molekulovou hmotností v intervalu přibližně 2 kDa až přibližně 100 kDa, a to pro jejich snadnou manipulovatelnost a výrobu (termín „přibližně naznačuje, že v preparátech polyethylenglykolu se vyskytují molekuly s vyšší nebo naopak nižší molekulovou hmotností než udává daný údaj).
V závislosti na požadovaném terapeutickém profilu (například požadavek přetrvávajícího a prodlouženého účinku, snadná manipulovatelnost, stupeň nebo nepřítomnosti antigenních vlastností a jiné známé účinky polyethylenglykolu na terapeutický protein nebo jeho varianty) je možné použít molekuly s odlišnou molekulovou hmotností.
Počet takto připojených molekul polymerů se může případ od případu lišit a odborník bude schopen stanovit jejich vliv na funkci. K derivatizaci mohou být použity jedna, dvě tři nebo čtyři molekuly téhož polymeru nebo směs molekul s chemicky totožnými nebo odlišnými částmi (například polyethylenglykoly o různých molekulových hmotnostech). Poměr počtu molekul polymerů k počtu molekul proteinů (peptidů) se bude lišit a stejně tak budou odlišné jejich koncentrace v reakčni směsi. Obvykle bude optimální poměr (vzhledem • · · · · · · «····* ·» · · · * · · ·* k účinnosti reakce tak, aby se v reakční směsi nevyskytoval nadbytek nezreagovaného proteinu nebo polymeru) stanoven v závislosti na požadovaném stupni derivatizace (například mono-, di-, tri-deriváty a podobně), molekulové hmotnosti zvoleného polymeru, typu polymeru (rozvětvený nebo nerozvětvený polymer) a reakčních podmínkách.
Molekuly polyethylenglykolu (nebo jiné chemické sloučeniny) by měly být k danému proteinu připojeny s ohledem na jejich vliv na funkční nebo antigenní domény tohoto proteinu. Odborníkům je známo množství dostupných způsobů připojení. Tyto způsoby jsou popsány například v publikaci EP 0401384 (navázání PEG k G-CSF), která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu, a v publikaci Malik a další, Exp. Hematol. 20:1028 až 1035, 1992 (popisuje navázání polyethylenglykolu na GM-CSF za použití tresylchloridu). Polyethylenglykol může být například kovalentně navázán prostřednictvím reaktivních skupin aminokyselinových zbytků. Takovými reaktivními skupinami jsou například volná aminoskupina nebo karboxylová skupina. Reaktivními skupinami jsou takové skupiny, na které může být navázána aktivovaná molekula polyethylenglykolu. Aminokyselinové zbytky s volnou aminoskupinou jsou lysin a N-koncový aminokyselinový zbytek. Mezi aminokyselinové zbytky s volnou karboxylovou skupinou patří kyselina aparágová, kyselina glutamová a C-koncový aminokyselinový zbytek. Molekula (molekuly) polyethylenglykolu mohou být rovněž připojeny prostřednictvím reaktivní -SH skupiny. Z terapeutického hlediska je upřednostňováno navázání prostřednictvím aminoskupiny, jako například připojení na N-konec nebo na volnou aminoskupinu lysinu. Je-li žádoucí vazba na receptor, nemělo by se navázání uskutečňovat prostřednictvím aminokyselinových zbytků důležitých při vazbě na tento receptor.
• ·
V některých případech může být zvláště žádoucí protein chemicky modifikovaný na N-konci. Použijeme-li polyethylenglykol jako ilustraci sloučeniny pro modifikaci daného proteinu, je možné volit z množství molekul polyethylenglykolu (vzhledem k molekulové hmotnosti, větvení a podobně), poměr počtu molekul polyethylenglykolu k počtu molekul proteinu (nebo peptidu) v reakční směsi, typ reakce použité pro navázání polyethylenglykolu a způsob izolace zvoleného proteinu s polyethylenglykolem navázaným na N-konec. Způsobem k získání produktu s polyethylenglykolem navázaným na Nkonci (například je-li to nezbytné oddělením takových produktů od jiných produktů s navázanou jednou molekulou polyethylenglykolu) může být purifikace materiálu s polyethylenglykolem navázaným na N-konci z populace proteinových molekul s polyethylenglykolem navázaným jiným způsobem. Selektivní chemické modifikace N-konce může být rovněž dosaženo redukční alkylací, při níž je využito rozdílné reaktivity odlišných typů primárních aminoskupin (lysin oproti N-konci) dostupných při derivátizaci daného proteinu. Za vhodných reakčních podmínek je, za použití polymeru nesoucího karboxylovou skupinu, dosaženo v podstatě selektivní derivatizace proteinu na N-konci. Selektivního navázání polyethylenglykolu na N-konec proteinu je možné například dosáhnout tak, že je reakce prováděna při hodnotě pH umožňující využít rozdílů v hodnotách pKa mezi εaminoskupinou lysinu a α-aminoskupinou N-koncové aminokyseliny daného proteinu. Při této selektivní derivátizaci je připojení polymeru rozpustného ve vodě cílené: konjugace daného polymeru s proteinem probíhá přednostně na N-konci tohoto proteinu a ve významné míře nedochází k modifikaci dalších reaktivních skupin, jako například postraních řetězců lysinu. Při redukční alkylací mohou být polymery rozpustné ve vodě stejného typu jak je popsáno výše a tyto polymery ··· · · · ···· ···· ·· ··*· • ········» • · · · ·· ······ ·· ····· · by měly mít jednu reaktivní aldehydovou skupinu použitelnou k vazbě na protein. Může být použit polyethylenglykolpropionaldehyd nesoucí jednu reaktivní aldehydovou skupinu.
Vynález popisuje použití derivátů, kterými jsou GDNFfaktor (nebo jeho varianty), exprimovaný v prokaryotickém expresívním systému, připojený k přinejmenším alespoň jedné molekule polyethylenglykolu. Vynález rovněž popisuje použití GDNF-faktoru (nebo jeho variant) s jednou nebo více molekulami polyethylenglykolu navázanými na tento GDNF-faktor prostřednictvím alkylové nebo acylové vazby.
Navázání polyethylenglykolu může být provedeno jakoukoliv reakcí v současnosti za tímto účelem používanou; viz. například publikace Focus on Growth Factors, 3 (2): 4 až 10, 1992; EP 0154316, která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu; EP 0401384; a další publikace, týkající se postupů sloužících k připojení polyethylenglykolu k proteinům, citované v této přihlášce. Navázání polyethylenglykolu může být provedeno acylací nebo alkylací proteinu reaktivní molekulou polyethylenglykolu (nebo podobně reagujícím polymerem rozpustným ve vodě).
Při acylačním navázání polyethylenglykolu je obvykle využívána reakce aktivního esterového derivátu polyethylenglykolu s proteinovým produktem GDNF-faktoru nebo jeho variantami . K acylačnímu navázání polyethylenglykolu na proteinový produkt GDNF-faktoru nebo jeho varianty může být využita jakákoliv známá nebo v budoucnosti objevená reaktivní molekula polyethylenglykolu. Ve výhodném provedení je jako aktivovaný ester polyethylenglykolu používán ester s Nhydroxysukcinimidem. Termín „acylační navázání používaný ve vynálezu zahrnuje bez jakýchkoliv omezení následující typy vazeb mezi terapeutickým proteinem a polymerem rozpustným ve vodě (jakým je například polyethylenglykol): amid, karbamát, • · • · ···· ·· · · * • · · · · ····· • · · · · · ··*··· · · ···· · ♦ urethan a podobně; viz. Bioconjugate Chem., 5:133 až 140, 1994. Jako reakční podmínky mohou být zvoleny jakékoliv podmínky v současnosti používané (nebo v budoucnosti objevené) pro navázání polyethylenglykolu, nicméně reakce by neměla probíhat za podmínek (teplota, hodnota pH nebo druh rozpouštědla) , které vedou k inaktivaci modifikovaných GDNFfaktorů nebo jejich variant.
Výsledkem acylačního navázání polyethylenglykolu obvykle bude proteinový produkt GDNF-faktoru nebo jeho variant s více (než jednou) navázanými molekulami polyethylenglykolu. Ve výhodném provedení bude spojující vazbou vazba amidová. Rovněž výhodné je, aby vzniklý produkt obsahoval téměř výhradně (například > 95%) jednu, dvě nebo tři molekuly polyethylenglykolu na jednu molekulu proteinu. V závislosti na použitých reakčních podmínkách může nicméně dojít ke vzniku produktů s vyšším počtem molekul polyethylenglykolu navázaných na jednu molekulu proteinu. Je-li to žádoucí, mohou být produkty s vyšším počtem molekul polyethylenglykolu z reakční směsi odstraněny s využitím standardních purifikačních postupů včetně (mimo jiné) dialýzy, vysolování, ultrafiltrace, chromatografie na iontoměničích, gelové filtrace nebo elektroforeticky.
Při alkylačním navázání polyethylenglykolu je obvykle využívána reakce derivátu polyethylenglykolu nesoucího na konci molekuly aldehydovou skupinu s proteinovým produktem GDNF-faktoru nebo jeho variantami v přítomnosti redukčního činidla. Výsledkem alkylačního navázání polyethylenglykolu obvykle rovněž bude GDNF-faktor nebo jeho varianty s více (než jednou) navázanými molekulami polyethylenglykolu. Reakční podmínky můžou být rovněž upraveny tak, aby docházelo k navázání polyethylenglykolu v podstatě pouze na aaminoskupinu na N-konci proteinového produktu GDNF-faktoru nebo jeho variant (tj. vznik produktu s jedinou navázanou • · · ·
molekulou polyethylenglykolu). Skupiny polyethylenglykolu jsou ve výhodném provedení k proteinu připojeny vazbou -CH2NH- (ať. už je k molekule proteinu připojena jedna nebo více molekul polyethylenglykolu). S odkazem na skupinu -CH2- je tento typ vazby označován jako „alkylová vazba.
Derivatizace prováděná metodou redukční alkylace tak, aby výsledný produkt obsahoval pouze jednu navázanou molekulu polyethylenglykolu, využívá rozdílnou reaktivitu různých typů primárních aminoskupin (aminoskupiny lysinu a N-koncové aminoskupiny) využitelných k derivatizaci. Tato reakce je prováděna při hodnotě pH umožňující využít rozdílů v hodnotách pKa mezi ε-aminoskupinou lysinu a aaminoskupinou N-koncové aminokyseliny daného proteinu. Při této selektivní derivatizaci je připojení polymeru rozpustného ve vodě nesoucího nějakou reaktivní skupinu, jako například aldehydovou skupinu, cílené: konjugace daného polymeru s proteinem probíhá přednostně na N-konci tohoto proteinu a ve významné míře nedochází k modifikaci dalších reaktivních skupin, jako například postraních řetězců lysinu. Jedna podstatná stránka vynálezu se týká použití v podstatě homogenních molekul konjugátů monopolymer/proteinový GDNF-faktor (nebo jeho varianty). Termínem „v podstatě homogenní molekula konjugátů monopolymer/proteinový GDNF-faktor (nebo jeho varianty) jsou označovány proteinové GDNF-faktory nebo jejich varianty, ke kterým je molekula polymeru připojena v podstatě (tj. >95%) pouze v jednom místě. Je-li použit polyethylenglykol, pak tento vynález rovněž zahrnuje použití proteinového GDNFfaktoru nebo jeho variant s navázaným polyethylenglykolem, kde tyto molekuly neobsahují žádné potenciálně antigenní spojovací skupiny a molekula polyethylenglykolu je přímo připojená k proteinovému GDNF-faktoru nebo jeho variantám.
Mezi proteinové produkty GDNF-faktoru používané v souladu s tímto vynálezem mohou patřit GDNF-faktor nebo jeho varianty s navázanou (navázanými) molekulou (molekulami) polyethylenglykolu, kde je (jsou) tato (tyto) molekula (molekuly) připojena prostřednictvím acylových nebo alkylových skupin. Jak již bylo řečeno v předešlém textu mohou zmíněné produkty obsahovat jednu nebo více molekul polyethylenglykolu (například 2 až 6 a ve výhodném provedení 2 až 5 molekul polyethylenglykolu). Molekuly polyethylenglykolu jsou obvykle k danému proteinu připojeny prostřednictvím anebo ε-aminoskupin aminokyselin, nicméně tyto molekuly polyethylenglykolu mohou být rovněž navázány prostřednictvím jakékoliv aminoskupiny připojené k danému proteinu a to v případě, jsou-li tyto aminoskupiny dostatečně reaktivní k tomu, aby mohly být za vhodných reakčních podmínek připojeny k molekule polyethylenglykolu.
Molekuly polymerů, použité pro zmíněnou acylační nebo alkylační reakci, mohou být vybrány ze skupiny polymerů rozpustných ve vodě popsané výše. Zvolený polymer by měl být modifikován tak, aby nesl jednu reaktivní skupinu, jako například aktivní ester v případě acylace nebo nějakou aldehydovou skupinu v případě alkylace. Ve výhodném provedení by měla existovat možnost řídit stupeň polymerizace s využitím v současnosti známých způsobů. Příkladem polyethylenglykolu s reaktivní aldehydovou skupinou je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je stabilní ve vodném prostředí, nebo jeho mono Cl až C10 alkyloxy nebo aryloxy deriváty (viz. Patentová přihláška US 5252714). Tento polymer může být rozvětvený nebo nevětvený. Při acylačních reakcích by měl zvolený polymer (polymery) obsahovat jednu reaktivní esterovou skupinu. Při redukční alkylaci by měl zvolený polymer (polymery) obsahovat jednu reaktivní aldehydovou skupinu. Polymer rozpustný ve vodě nebude obvykle vybírán ze skupiny přirozeně
se vyskytujících glykosylových reziduí, jelikož tato mohou být snadno připravena v savčích rekombinantních expresívních systémech. Zmíněný polymer může mít jakoukoliv molekulovou hmotnost a může být větvený nebo nevětvený.
Polymerem rozpustným ve vodě, který je zvláště výhodný pro použití podle vynálezu, je polyethylenglykol. Termín „polyethylenglykol používaný v přihlášce zahrnuje jakoukoliv z forem polyethylenglykolu, která byla použita k přípravě derivátu jiných proteinů, jako například mono-(Cl až C10) alkyloxy- nebo aryloxy-polyethylenglykol.
Derivátizace může být obecně provedena za jakýchkoliv reakčních podmínek vhodných pro reakci aktivní látky s molekulou aktivovaného polymeru. Postupy sloužící k přípravě proteinového GDNF-faktoru nebo jeho variant s připojenou molekulou (molekulami) polyethylenglykolu budou obvykle zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinového GDNF-faktoru nebo jeho variant s polyethylenglykolem (jako například s reaktivním esterem nebo derivátem polyethylenglykolu nesoucím aldehydovou skupinu) za podmínek, které umožní připojení proteinu k jedné nebo více molekulám polyethylenglykolu; a (b) získání reakčního produktu (produktů). Optimální reakční podmínky acylačních reakcí budou obvykle stanovovány případ od případu na základě známých parametrů a požadovaných výsledků. Čím vyšší je například poměr polyethylenglykol :protein, tím vyšší bude procentuální zastoupení produktů s několika připojenými molekulami polyethylenglykolu.
Redukční alkylace sloužící k přípravě v podstatě homogenní populace konjugovaných molekul monopolymer/proteinový GDNF-faktor (nebo jeho varianty) bude obvykle zahrnovat následující kroky: (a) reakci proteinového GDNF-faktoru nebo jeho variant s reaktivní molekulou polyethylenglykolu, a to za podmínek pro redukčních alkylaci a při hodnotě pH, které umožní selektivní modifikaci α-aminoskupiny na N-konci zmíněného proteinového GDNF-faktoru nebo jeho variant; a (b) získání reakčního produktu (produktů).
Reakční podmínky redukční alkylace použité k přípravě v podstatě homogenní populace konjugovaných molekul monopolymer/proteinový GDNF-faktor (nebo jeho varianty) jsou takové podmínky, které umožní selektivní připojení molekuly polymeru rozpustného ve vodě na N-konec proteinového GDNFfaktoru nebo jeho variant. Tyto reakční podmínky obvykle využívají rozdíly v hodnotách pH mezi aminoskupinami lysinu a a-aminoskupinami na N-konci (hodnota pH odpovídá hodnotě pH, při které má 50% aminoskupin kladný náboj (je protonizováno) a 50% aminoskupin protonizováno není). Hodnota pH při reakci má rovněž vliv na použitý poměr molekul polymeru k molekulám proteinu. Obecně lze říci, že při nižším pH bude žádoucí použít větší nadbytek polymeru vzhledem k proteinu (tzn. čím méně reaktivní je N-koncová α-aminoskupina, tím větší množství polymeru je nutno použít k dosažení optimálních podmínek). Je-li hodnota pH vyšší, nemusí být poměr polymer/protein tak vysoký (tzn., že čím reaktivnější skupiny jsou dostupné, tím méně molekul polymeru je třeba). Hodnoty pH používané pro účely popsané v této přihlášce spadají do intervalu 3 až 9 a ve výhodném provedení do intervalu 3 až 6.
Jinou důležitou proměnnou je molekulová hmotnost polymeru. Obecně lze říci, že čím je molekulová hmotnost polymeru vyšší, tím méně molekul tohoto polymeru bude připojeno k danému proteinu. Při optimalizaci reakčních podmínek by mělo být bráno v potaz rovněž případné větvení použitého polymeru. Obecně lze říci, že čím je molekulová hmotnost polymeru vyšší (nebo čím větší je větvení), tím je nutno použít vyšší poměr polymer:protein. Obecně lze říci, že pro reakce proteinů s polyethylenglykolem, popisované v této • ···· · · ·· • · · ···· · · ·· • · · · ·· · · * ·♦ • ··· · · · ·♦···· • · · · · ·· ·«· ··· ·· »··· ·· ·· přihlášce, je ve výhodných provedeních používán polyethylenglykol s průměrnou molekulovou hmotností v intervalu přibližně 2 kDa až přibližně 100 kDa. Výhodněji se jedná o molekuly s průměrnou molekulovou hmotností přibližně 5 kDa až 50 kDa, ještě výhodněji pak o molekuly s průměrnou molekulovou hmotností přibližně 12 kDa až 25 kDa. Poměr molekul polymeru rozpustného ve vodě k molekulám proteinového GDNFfaktoru (nebo jeho variant) bude obvykle v intervalu 1:1 až 100:1, ve výhodném provedení 1:1 až 20:1 (pro přípravu GDNFfaktoru nebo jeho variant s více než jednou připojenou molekulou polyethylenglykolu) a 1:1 až 5:1 (pro přípravu GDNFfaktoru nebo jeho variant s jednou připojenou molekulou polyethylenglykolu).
Za podmínek naznačených výše bude alkylaci v redukčním prostředí dosaženo selektivního připojení zmíněného polymeru k proteinovému GDNF-faktoru nebo jeho variantám s aaminoskupinou na N-konci a rovněž bude získán v podstatě homogenní preparát konjugátů monopolymer/GDNF-faktor (nebo jeho varianta). Termín „konjugát monopolymer/GDNF-faktor (nebo jeho varianta) označuje v této přihlášce kompozici zahrnující proteinový GDNF-faktor nebo nějakou z jeho variant s jedinou připojenou molekulou polymeru. Konjugát monopolymer/GDNF- faktor (nebo jeho varianta) bude ve výhodném provedení obsahovat molekulu polymeru připojenou na N-konci a ne na postranní aminoskupině lysinu. Ve zmíněném preparátu bude ve výhodném provedení více než 90% konjugátů monopolymer/GDNF- faktor (nebo jeho varianta) a výhodněji pak více než 95% konjugátů monopolymer/GDNF-faktor (nebo jeho varianta) , přičemž ostatní pozorovatelné molekuly budou nezreagované (tzn. protein postrádající molekulu polymeru).
Při popisované redukční alkylaci by redukční činidlo mělo být stabilní ve vodném prostředí a ve výhodném provedení by mělo účinně redukovat pouze Schiffovu bázi vytvořenou • · ·· · · ·· • ·· · · ·· · • · · · * · · • · · » ··· ·· · • · · · · • · ··· 4 ·· ·· v počátečním kroku redukční alkylace. Výhodně používanými redukčními činidly jsou tetrahydroboritan sodný, kyanoborohydrid sodný, dimethylamiboran, trimethylamiboran a pyridinboran. Zvláště výhodné je použití kyanoborohydridu sodného jako redukčního činidla. Ostatní reakční podmínky, jako například rozpouštědlo, reakční čas, teploty a podobně a způsoby purifikace reakčních produktů, mohou být stanoveny případ od případu na základě publikovaných informací týkajících se přípravy derivátů proteinů s využitím polymerů rozpustných ve vodě (viz. publikace citované v této přihlášce).
C. Farmaceutické přípravky s proteinovým produktem GDNFfaktoru
Farmaceutické přípravky s proteinovým produktem GDNFfaktoru zpravidla obsahují terapeuticky účinné množství proteinového produktu GDNF-faktoru ve směsi s jednou nebo více farmaceuticky a fyziologicky přijatelnými látkami používanými při přípravě (formulaci) léčivých přípravků. Vhodnými látkami používanými při přípravě (formulaci) léčivých přípravků jsou, nejenom, antioxidanty, konzervační činidla, barviva, ochucovadla, ředicí látky, emulgátory, suspenzační činidla, rozpouštědla, plniva, rozvolňovadla, pufry, vehikula, adjuvans a/nebo pomocné látky. Vhodnými vehikuly pro přípravky ve formě injekcí mohou být například voda, fyziologický roztok nebo uměle připravený mozkomíšní mok (CSF) a přípravek může být doplněn dalšími látkami obvykle používanými v přípravcích pro parenterální aplikaci. Jinými příklady vehikul jsou neutrální fyziologický roztok nebo fyziologický roztok spolu se sérovým albuminem.
Primární rozpouštědla ve vehikulu mohou být svým charakterem vodná nebo nevodná. Vehikulum může navíc obsahovat jiné farmaceuticky přijatelné látky sloužící ve farmaceutickém přípravku k modifikaci nebo udržování hodnoty pH, osmo larity, viskozity, čirosti, barvy, sterility, stability, rychlosti rozpouštění nebo zápachu. Vehikulum může podobně obsahovat jiné farmaceuticky přijatelné látky sloužící k modifikaci nebo udržování rychlosti uvolňování proteinového produktu GDNF-faktoru nebo látky sloužící k usnadnění absorpce a pronikání proteinového produktu GDNF-faktoru přes membrány oka. Těmito látkami jsou takové substance, které jsou obvykle a běžně využívány pro formulaci přípravků (v jednodávkové nebo vícedávkové formě) pro parenterální aplikaci.
Jakmile je léčivý přípravek vyroben, může být skladován ve sterilních nádobkách ve formě roztoku, suspenze, gelu, emulze, pevné látky nebo dehydratovaného nebo lyofilizovaného prášku. Tyto přípravky mohou být skladovány bud' ve formě určené k přímému použití nebo ve formě (například lyofilizované), u které je před aplikací nutná rekonstituce obsahu.
Optimální forma léčivých přípravků bude odborníkem stanovena s ohledem na takové požadavky jako například způsob aplikace a požadovaná dávka; viz. například publikace Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co., Easton, PA 18082, strany 1435 až 1712, 1992, která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Formulace těchto přípravků může mít vliv na fyzikální stav, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost clearence in vivo proteinových GDNF-faktorů, jejich variant a derivátů.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají jiné účinné aplikační formy jako například parenterální přípravky s přetrvávajícím a prodlouženým účinkem, inhalační přípravky nebo přípravky podávané orálně. Například u přípravků s přetrvávajícím a prodlouženým účinkem může být proteinový produkt GDNFfaktoru navázán nebo začleněn do nanočástic polymerních sloučenin (jako například kyseliny polymléčné, polyglykolové ···· a podobně) nebo lipozomů. Může být rovněž použita kyselina hyaluronová a její použití může mít vliv na delším setrváním v krevním oběhu. Léčivé přípravky proteinového produktu GDNF-faktoru mohou být rovněž připraveny ve formě pro parenterální podávání, například jako injekce nebo infůze podávané nitroočně; tyto přípravky mohou rovněž zahrnovat pomocné látky umožňující přetrvávající a prodloužený účinek. Takové parenterálně podávané léčivé přípravky se obvykle nacházejí ve formě bezpyrogenních vodných roztoků přijatelných pro parenterální aplikaci a obsahují proteinový produkt GDNFfaktoru ve farmaceuticky přijatelném vehikulu. Ve výhodném provedení je jako vehikulum použita sterilní destilovaná voda.
Do rozsahu vynálezu rovněž spadají přípravky pro orální podávání, které obsahující proteinový produkt GDNF-faktoru. Proteinový produkt GDNF-faktoru podávaný tímto způsobem může být zapouzdřen (v tobolce) a může být v přípravku spolu s nebo bez pomocných látek běžně používaných při formulaci tuhých aplikačních forem. Tobolky mohou být navrženy tak, aby uvolňovaly aktivní složku přípravku v místě gastrointestinálního traktu, kde je zaručena maximální biologická dostupnost a je minimalizována degradace předcházející průniku do krevního oběhu. Za účelem usnadnění absorpce proteinového produktu GDNF-faktoru mohou být rovněž použity další pomocné látky. Dále mohou být použity ředící látky, ochucovadla, vosky s nízkým bodem tuhnutí, rostlinné oleje, kluzné látky, suspenzační činidla, látky ovlivňující rozpad tablet a pojivá .
Odborníci dobře znají způsob přípravy topických očních léčivých přípravků mezi něž patří oční vodné roztoky, suspenze a oční masti; viz. publikace Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání, Mack Publishing Co., kapitola 86, strany 1581 až 1592, 1990. Jsou rovněž dostupné jiné způsoby .: ;··· .··.···. : ···. .:: . ’··· ’··· • · · · · · · ······ · · ···· ♦· ·· aplikace včetně intrakamerálních injekcí (injekce přímo do přední komory oční nebo do sklivce), subkonjunktiválních (pod spojivku) a retrobulbálních (za oko) injekcí. Odborníci rovněž znají způsoby a prostředky k přípravě očních preparátů vhodných pro zmíněné způsoby aplikace.
Termín „extraokulární používaný v této přihlášce označuje povrch oka a (vnější) prostor mezi oční bulvou a víčkem. Příkladem extraokulárních oblastí jsou spojivková klenba, povrch spojivky a povrch rohovky. Tato místa jsou vzhledem ke všech očním tkáním umístěna „externě a pro přístup do této oblasti není třeba používat invazivních technik. Příkladem systémů používaných extraokulárně jsou čípky a místně aplikované kapky, gely nebo masti; tyto přípravky mohou být využity k umístění léčivé látky do zmíněných oblastí. Extraokulární systémy se dají obvykle snadno odstranit a tuto proceduru může provést sám pacient.
Následující patentové přihlášky popisují extraokulární systémy, které jsou používány k aplikaci léčivých látek do extraokulárních oblastí. Higuchi a další popisuje v přihláškách US 3981303, 3986510 a 3995635 biologicky degradovatelné oční inzerty obsahující účinnou látku. Tyto inzerty mohou být připraveny v různých tvarech a umístěny do spojivkového vaku, což je extraokulární prostor mezí očním víčkem a oční bulbou. Přihlášky popisují několik běžně používaných biokompatibilních polymerů vhodných k výrobě těchto inzertů. Zmíněnými polymery mohou být alginát zinečnatý, kyselina polymléčná, polyvinylalkohol, polyanhydridy a kyselina polyglykolová. Tyto patentové přihlášky rovněž popisují systémy s membránou na povrchu a se sníženou rychlostí pronikání léčiva a léčivých přípravků umístěných v dutých komorách.
Theeuwes popisuje v patentové přihlášce US 4217898 mikroporézní zásobníky používané k řízenému uvolňování léčiva.
.: :··· .··..*·. : : ···. .:: .* · ’··· ··; ····· ·· ·’
Tato zařízení jsou umístěna extraokulárně ve spojivkovém vaku. Mezi jinými, jsou zde používány kopolymery polyvinylchloridu a polyvinylacetátu. Kaufman popisuje v patentových přihláškách US 4865846 a 4882450 systémy k aplikace očních léčivých látek do spojivkového vaku, kde tyto systémy obsahují alespoň jednu biologicky odbouratelnou složku nebo biologicky odbouratelný mastový základ. Jako systémy vhodné při aplikaci jsou zmíněny polymerní sloučeniny jako například polylaktid, polyglykolid, polyvinylalkohol a zesíúovaný kolagen.
Při popisovaném použití proteinového produktu GDNFfaktoru k léčbě onemocnění nebo poškození sítnice lze u topicky aplikovaných očních přípravků rovněž s výhodnou použít nějakou látku usnadňující pronikání nebo transport léčivé složky do oka. V současnosti jsou takové látky známé. Ke a další například popisují v patentové přihlášce US 5220696 použití materiálů, které zvyšují rychlost penetrace očních přípravků přes rohovku.
Intraokulární systémy jsou takové systémy, které jsou vhodné pro použití v jakémkoliv místě uvnitř, mezi nebo v okolí jednotlivých vrstev tkáně tvořící oko. Mezi tato místa řadíme oblast pod spojivkou (pod oční mukózní membránou přilehlou k oční kouli), očnicový prostor (prostor za oční bulbou) a intrakamerální prostor (uvnitř komor v oční kouli). Na rozdíl od extraokulárních oblastí je k přístupu do těchto míst nutno použít nějakou invazivní proceduru, jako například injekci nebo implantaci.
Níže zmíněné patentové přihlášky popisují intraokulární systémy. Wong popisuje v patentové přihlášce US 4853224 léčiva zapouzdřená v mikrokapsulích používaných k zavedení do oční komory. Polymery použitými v tomto systému jsou polyestery a polyethery. Lee popisuje v patentové přihlášce US 4863457 biologicky degradovatelný systém, který je chi • · rurgicky implantován dovnitř oka a postupně uvolňuje léčivou látku. Tento systém je navržen za účelem chirurgické implantace pod spojivku (mukózní membránu oční koule). Krezancaki popisuje v patentové přihlášce US 4188373 farmaceutické vehikulum, které při teplotě lidského těla získá konzistenci gelu. Toto vehikulum je vodná suspenze léčivé látky a syntetických derivátů pryskyřic nebo celulózy. Haslam a další popisuje v patentových přihláškách US 4474751 a 4474752 systém polymer-léčivá látka, který je kapalný při pokojové teplotě a při tělesné teplotě přechází do konzistence gelu. Vhodnými polymery pro tento systém jsou polyoxyethylen a polyoxypropylén. Davis a další popisuje v patentové přihlášce US 5384333 biologicky degradovatelný polymer umožňující aplikaci léčivé látky ve formě injekcí, kde tento polymer umožňuje dlouhodobé uvolňování léčivé látky. Léčivý přípravek je vyroben z farmaceuticky účinné látky v biologicky degradovatelné matrix, kde tato polymerní matrix je tuhá při teplotách v intervalu 20°C až 37°C a polotekutá při teplotách v intervalu 38°C až 52°C. Použití zmíněného polymeru není omezeno pouze na aplikaci rozpustných nebo kapalných léčivých přípravků. Tento polymer může být například použit jako matrix ke stabilizaci nebo zadržování mikročástic nebo lipozomů obsahujících léčivo v místě injekce.
Zvláště vhodným vehikulem pro intraokulární injekce je sterilní voda, která je použita k přípravě sterilního izotonického a vhodně konzervovaného roztoku proteinového produktu GDNF-faktoru. Jiné oční přípravky mohou zahrnovat proteinový produkt GDNF-faktoru spolu s látkou, jako například mikročásticemi nebo lipozomy aplikovatelnými injekcí, která umožňuje přetrvávající a prodloužené uvolňování zmíněného proteinu, který může být aplikován ve formě depotní injekce. Jinými vhodnými způsoby pro intraokulární aplikaci proteino42 • · · · » ······ ♦ · ···· · · vého produktu GDNF-faktoru jsou implantovatelné systémy umožňující přísun léčiva.
Oční přípravky podle vynálezu, a zvláště pak topické přípravky, mohou zahrnovat i jiné složky, například konzervační látky přijatelné pro přípravu očních přípravků, látky upravující osmotický tlak, další rozpouštědla, smáčedla, komplexotvorné látky, tlumivé látky, antibakteriální látky, antioxidanty a povrchově aktivní látky, které jsou v současnosti dobře známé. Mezi vhodné látky upravující osmotický tlak například patří halogenidy alkalických kovů (ve výhodném provedení chlorid sodný nebo draselný), manitol, sorbitol a podobně. Do přípravku, který bude vkapáván do očí, je ve výhodném provedení přidáno dostatečné množství látky upravující osmotický tlak tak, aby vzniklý přípravek byl hypotonický nebo v podstatě izotonický. Mezi vhodné konzervační látky patří (nejenom) chlorid benzylalkonia, timerosal, 2-fenylethylalkohol, methylparaben, propylparaben, chlorohexidin, kyselina sorbová a podobně. Jako konzervační činidlo může být rovněž použit peroxid vodíku. Mezi vhodné kosolventy náleží (nejenom) glycerin, propylenglykol a polyethylenglykol. Vhodnými komplexotvornými látkami jsou kafein, polyvinylpyrrolidon, beta-cyklodextrin nebo hydroxypropyl-beta-cyklodextrin. Mezi vhodné povrchově aktivní látky nebo smáčedla patří (nejenom) estery kyseliny sorbové, polysorbáty jako například polysorbát 80, tromethamin, lecithin, cholesterol, tyloxapol a podobně. Jako tlumivé roztoky mohou být použity běžné pufry jako například boritanový, citrátový, fosfátový, uhličitanový nebo Tris-HCl pufr.
Jednotlivé složky jsou v léčivém přípravku zastoupeny v koncentracích, které jsou přijatelné pro extraokulární nebo intraokulární aplikaci. Například tlumivé roztoky jsou ve zmíněném přípravku použity za účelem udržování fyziolo43 • ·
gické hodnoty pH nebo hodnoty pH nepatrně nižší. Tyto hodnoty pH se obvykle pohybují v intervalu přibližně 5 až 8.
Mezi jiné složky použité při přípravě léčivého přípravku patří například látky, které umožňují delší setrvání léčivého přípravku aplikovaného extraokulárně v oblasti oka, a tím maximalizují kontakt a podporují absorpci. Mezi takové vhodné látky patří polymery nebo sloučeniny tvořící gely, které zvyšují viskozitu očník přípravků. U kapalných očních léčivých přípravků s přetrvávajícím a prodlouženým účinkem je jako látka odpovědná za řízené uvolňování účinné látky zvláště vhodný chitosan (viz. patentová přihláška US 5422116, Yen a další). Použitelnost léčivých přípravků podle vynálezu pro řízené uvolňování (například přetrvávající nebo prodloužené uvolňování) léčivé látky v oku může být stanovena různými způsoby v současnosti známými. Jedná se například o způsoby popsané v Journal of Controlled Release, 6:367 až 373, 1987 a rovněž o způsoby podobné.
Jiné oční léčivé přípravky mohou obsahovat účinné množství proteinového produktu GDNF-faktoru ve směsi s netoxickými pomocnými látkami (přijatelnými pro přípravu očních přípravků) vhodnými pro přípravu tablet. Rozpuštěním tablet ve sterilní vodě nebo jiném vhodném vehikulu mohou být připraveny kapalné oční léčivé přípravky v jednotkové dávkovači formě. Mezi vhodné pomocné látky patří (nejenom) inertní rozpouštědla jako například uhličitan vápenatý, uhličitan nebo hydrogenuhličitan sodný, laktóza nebo fosforečnan vápenatý; pojivá jako například škrob, želatina nebo arabská guma; nebo kluzné látky jako například stearát horečnatý, kyselina stearová nebo mastek.
D. Podávání/přísun proteinového produktu GDNF-faktoru
Proteinový produkt GDNF-faktoru může být aplikován parenterálně a to subkutánně, intramuskulárně, intravenózně,
·· *· ·· ·· • · 9 · · · · • · · · · · • · · · ····· * · · 9 « · ···* ·· ·· transpulmonálně (do plíce), transdermálně, intratekálně (do cerebrospinální kapaliny) a intracerebrálně (do mozku). Za účelem léčby patologických stavů oka může být proteinový produkt GDNF-faktoru rovněž aplikován extraokulárně nebo intraokulárně (způsoby popsanými v předchozím textu) a to topickou aplikací, s využitím inzertů, injekcí, implantátů, buněčnou terapií nebo genovou terapií. K přísunu proteinového produktu GDNF-faktoru mohou být například použity implantáty obsahující příslušný neurotrofický faktor zapouzdřený v biologicky degradovatelné polymerní matrix pozvolna uvolňující léčivou látku. Proteinový produkt GDNF-faktoru může být aplikován extracerebrálně ve formě, které byla chemicky modifikována nebo formulována tak, aby umožnila pronikání hematoencefalickou bariérou. Proteinový produkt GDNF-faktoru může být rovněž podáván extracerebrálně spolu s jednou nebo více látkami, které umožní přestup tohoto produktu přes hematoencefalickou bariéru. Obdobně může být proteinový produkt GDNF-faktoru aplikován intraokulárně nebo může být podáván extraokulárně spolu s jednou nebo více látkami, které umožní pronikání nebo transport proteinového produktu GDNF-faktoru přes membrány oka. Dávkování bude záviset na farmakokinetických parametrech léčivého přípravku obsahujícího proteinový produkt GDNF-faktoru a na způsobu aplikace.
Specifická dávka může být vypočítána s ohledem na tělesnou hmotnost, povrch těla nebo velikost cílového orgánu. Další zpřesnění výpočtu, které je nezbytné ke stanovení dávky vhodné k léčbě s využitím každého z výše zmíněných léčivých přípravků, je odborníky běžně prováděno a spadá do oblasti rutinně prováděných úkonů, zvláště pak s využitím informací o dávkách a stanoveních popisovaných v této patentové přihlášce. Vhodné dávkování může být stanoveno s využitím zavedených postupů sloužících ke zjišťování dávkování ve spojení s odpovídajícími daty popisujícími odezvu • · · · • · · · · · · • · · · ··· ·♦· • · · · · J · ···· ·· ♦ ♦ organizmu na podání dávky. Podle výhodných provedení vynálezu je proteinový produkt GDNF-faktoru podáván intraokulárně v dávkách v intervalu přibližně 0,001 mg/den až 10 mg/den, výhodněji pak v dávkách v intervalu přibližně 0,01 mg/den až 1 mg/den a nejvýhodněji v dávkách v intervalu přibližně 0,1 mg/den až 0,5 mg/den. Odborníci zajisté ocení, že velikosti dávek použitých při intraokulární aplikaci léčivých přípravků budou ve srovnání s dávkami pro systemické injekce nebo orální podávání velmi malé.
Výsledný režim dávkování použitý při léčbě výše zmíněných patologických stavů bude stanoven ošetřujícím lékařem na základě nej různějších faktorů, které ovlivňují účinek léčivých látek. Těmito faktory jsou například věk, stav pacienta, tělesná hmotnost, pohlaví a stravovací režim pacienta, závažnost infekce, doba podávání a jiné klinické faktory. Probíhající studie poskytnou další informace týkající se vhodného režimu dávkování pro léčbu nej různějších onemocnění a patologických stavů.
Předpokládá se, že při léčbě může být výhodné kontinuální podávání GDNF-faktoru nebo aplikace léčivých přípravků s přetrvávajícím účinkem obsahujících GDNF-faktor. Kontinuálního podávání může být dosaženo s využitím mechanických prostředků, jako například pomocí infúzní pumpy, ale v praxi je možné využít i jiných způsobů kontinuálního nebo téměř kontinuálního podávání. Různé formy zmíněného proteinu s prodlouženým účinkem, umožňující stálou přítomnost léčivé látky v předvídatelných množstvích v závislosti na stanoveném režimu dávkováním, mohou být připraveny chemickou derivát izací nebo zapouzdřením léčivé látky. Termín „proteinové produkty GDNF-faktoru tudíž zahrnuje derivatizované proteiny nebo proteiny ve formě léčivých přípravků umožňující kontinuální podávání.
• · • · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ·····* · · · ···
Do rozsahu vynálezu rovněž spadá buněčná terapie proteinovým produktem GDNF-faktoru, například intraokulární implantace buněk produkujících proteinový produkt GDNFfaktoru. Takové provedení vynálezu by zahrnovalo implantaci buněk schopných syntetizovat a sekretovat nějakou biologicky aktivní formu proteinového produktu GDNF-faktoru do organizmu pacienta. Takovými buňkami produkujícími proteinové produkty GDNF-faktoru mohou být buňky produkující proteinové produkty GDNF-faktoru přirozeně (buňky analogní buňkám glioblastomu B4 9) nebo rekombinantní buňky, jejichž schopnost produkovat proteinové produkty GDNF-faktoru byla zesílena transformací prostřednictvím genu (umístěného do vhodného vektoru umožňujícího expresi a sekreci) kódujícího požadovaný proteinový produkt GDNF-faktoru. Aby byla minimalizována potenciální imunologická odpověď pacienta, do jehož organizmu bude podán proteinový produkt GDNF-faktoru z cizího druhu, je upřednostňováno použití buněk produkujících proteinové produkty GDNF-faktoru přirozeně a produkce lidského proteinového produktu GDNF-faktoru. Při použití rekombinantních buněk produkujících proteinový produkt GDNF-faktoru jsou tyto buňky ve výhodném provedení transformovány expresívním vektorem nesoucím gen kódující lidský proteinový produkt GDNF-faktoru. Implantované buňky mohou být zapouzdřeny, aby nedocházelo k infiltraci buněk z okolní tkáně. Lidské nebo živočišné (z jiných druhů) buňky mohou být do organizmu pacienta implantovány v biokompatibilních, semipermeabilních polymerních pouzdrech nebo membránách, které umožňují uvolňování proteinového produktu GDNF-faktoru, ale současně brání destrukci těchto buněk činností imunitního systému pacienta nebo působení jiných škodlivých faktorů z okolní tkáně. Takové implantáty mohou být například připojeny k bělimě za účelem produkce a uvolňování proteinového produktu GDNF-faktoru přímo do sklivce.
• v · · · ·· ·· ·· · · · · i I • .·· ·· · · • · · · · · · • · · · · ······ ·· ····
Vynález rovněž počítá s tím, že mohou být ex vivo transformovány vlastní buňky pacienta. Tyto buňky pak budou produkovat proteinový produkt GDNF-faktoru a mohly by být implantovány přímo bez předchozího zapouzdření. Tyto buňky by byly transformovány vhodným vektorem a transplantovány zpět do sítnice pacienta, kde by produkovaly a uvolňovaly požadovaný GDNF-faktor nebo jeho variantu.
U živočišných modelů degenerace sítnice byly s úspěchem provedeny studie transplantace fotoreceptorových buněk, při kterých byly v sítnici poškozené onemocněním nebo poraněním nahrazeny defektní nebo chybějící buňky (Silverman a Hughes, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 30:1684 až 1690, 1989; Gouras a další, Neuro-Ophthalmol., 10:165 až 176, 1990). Vynález rovněž počítá se skutečností, že buňky fotoreceptorů mohou být získány z oka dárce, a že tyto buňky budou udržovány v buněčné kultuře (jak je popsáno v přihlášce). Tyto buňky by následně byly použity jako zdroj purifikovaných receptorů, které by byly přes subretinální prostor transplantovány do sítnice pacientů postižených onemocněním nebo poškozením sítnice. Těmto pacientům budou podávána imunosupresiva, aby byly eliminovány imunitní odpovědi organizmu a odvržení transplantovaných buněk. Sítnice dárců budou ex vivo kultivovány v přítomnosti GDNF-faktoru, aby byl stimulován jejich růst a přežívání. Pacientům, jenž budou příjemci transplantátů buněk fotoreceptorů, bude injekční formou intravitreálně (do sklivce) podán GDNF-faktor, který bude nezbytný ke stimulaci přežívání a maturaci transplantovaných fotoreceptorů .
Vynález rovněž zahrnuje genovou terapii proteinovým produktem GDNF-faktoru in vivo, při níž je gen kódující proteinový produkt GDNF-faktoru zaveden do cílových buněk prostřednictvím lokální injekce konstruktu nukleově kyseliny nebo jiných vhodných vektorů (Hefti, J. Neurobiol., 25:1418 • · ··.· ·· · · • · · · · · · • · · · · «····« · · ···· až 1435, 1994). Za účelem introdukce do buněk sítnice může být například nukleotidová sekvence kódující proteinový produkt GDNF-faktoru umístěna do vektoru asociovaného s adenovirem nebo do genomu adenoviru. Jinými použitelnými virálními vektory jsou (nejenom) vektory odvozené z retrovirů, viru herpes simplex a papiloma viru. Vlastní introdukce, prováděná in vivo nebo ex vivo, může být uskutečněna s využitím lipozomů, přímou injekcí (samotná DNA), s využitím receptorů (komplex DNA-ligand), elektroporací, precipitací s fosforečnanem vápenatým nebo bombardováním mikročásticemi (genová pistole).
Odborníkům jsou důvěrně známy způsoby zapouzdření živých buněk do membránových systémů a zapouzdření buněk a jejich implantace do organizmu pacientů mohou být provedeny bez přílišného experimentování; viz. patentové přihlášky US 4892538, 5011472 a 5106627, které jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Systém použitelný k zapouzdření živých buněk je popsán v přihlášce PCT WO 91/10425 (Aebischer a další), která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Viz. rovněž přihláška PCT WO 91/10470 (Aebischer a další); Winn a další, Exper. Neurol., 113:322 až 329, 1991; Aebischer a další, Exper. Neurol., 111:269 až 275, 1991; Tresco a další, ASAIO, 38:17 až 23, 1992. Všechny tyto publikace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Další implantovatelná zařízení jsou popsána v publikaci WO 93/21902 (mezinárodní přihláška PCT/US93/03850), která je zde uvedena náhradou za přenesení jejího celého obsahu do popisu tohoto vynálezu. Postupy k přípravě různých jiných systémů, jako například nosiče na bázi lipozomů, biologicky degradovatelné mikročástice nebo kuličky a depotní injekce, • · • · · ·
použitelných k řízenému nebo přetrvávajícímu a prodlouženému uvolňování léčivé látky, jsou odborníkům rovněž známy.
Mělo by být zřejmé, že léčivé přípravky obsahující proteinový produkt GDNF-faktoru spadající do rozsahu vynálezu, mohou být použity ve veterinární i humánní medicíně a termín „pacient by neměl být používán v úzkém smyslu. V případech použití ve veterinární medicíně by dávkování mělo být shodné s dávkováním popsaným výše.
Další stránky a výhody vynálezu budou zřejmé z následujících ilustrativních příkladů provedení vynálezu. Tyto příklady se týkají vlivu proteinového produktu GDNFfaktoru na jak normální tak mutované neurony sítnice. Příklady provedení vynálezu rovněž popisují jedinečné postupy použitelné ke kultivaci buněk sítnice.
Příklady provedení vynálezu
Materiál a metody
Materiál používaný v následujících příkladech byl získán následovně.
Média pro kultivaci buněk
Eaglovo médium modifikované podle Dulbecca s vysokým obsahem glukózy (DMEM; kat. č. 11965-092), Hamsovo médium F12 (F12; kat.č. 11765-021), Leibovitzovo médium L15 bez hydrogenuhličitanu sodného (kat. č. 41300-039), suplement B27 (kat. č. 17504-010), penicilin/streptomycin (kat. č. 15070014), L-glutamin (kat. č. 25030-016), fosfátový fyziologický roztok podle Dulbecca (D-PBS; kat. č. 14190-052), Hankův roztok solí s vápenatými a hořečnatými solemi (HBSS; kat. č. 24020-026), kyselina N-2-hydroxyethylpiperazin-N'ethansulfonová (HEPES; kat. č. 15630-015), myší laminin
• * · · • · · · · · · • · • · · · (kat. č. 23017-015), bovinní sérový albumin frakce V (kat. č. 110-18-017) byly zakoupeny od společnosti GIBCO/BRL, Grand Island, NY. Tepelně inaktivované koňské sérum bylo zakoupeno od společnosti HyClone, Logan, Utah. Poly-Lornitin hydrobromid (P-3655), bovinní insulin (1-5500), lidský transferin (T-2252), putrescin (P-6024), progesteron (P-6149) a seleničitan sodný (S-9133) byly zakoupeny od společnosti Sigma Chemical Company, Saint-Louis, MO. Papain, deoxyribonukleáza I (DNAza I) a ovalbumin (Papain dissociation systém) byly zakoupeny od společnosti Worthington Biochemicals, Freehold, NY. Sterilní 96-jamkové mikrotitrační destičky Falcon (kat. č. 3072), plastové příslušenství pro tkáňové kultury a polypropylénové centrifugační zkumavky byly zakoupeny od společnosti Beckton-Dickinson, Oxnard, CA. Krycí sklíčka pro tkáňové kultury s komorami Nunc Lab-Tek (kat. č. 136439) byly zakoupeny od společnosti Baxter, Irvine, CA. Nylonové síto Nitex 20 μτα (kat. č.460) bylo zakoupeno od společnosti Tetko, Elmsford, NY. Chirurgické pinzety a chirurgické nůžky byly zakoupeny od společnosti Roboz Surgical, Washington, DC.
Protilátky, radioizotopy a příbuzné sloučeniny
Polyklonální králičí protilátka a myší monoklonální protilátka rho4D2 proti bovinnímu rhodopsinu byly získány z University of British Columbia, Vancouver, Kanada. Polyklonální králičí protilátka byla namířena proti následující synteticky připravené peptidové sekvenci proteinu arestin (specificky se vyskytující v tyčinkách): Val-Phe-Glu-GlyPhe-Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cys (SEK. ID. Č: 2). Koňská protilátka namířená proti myším IgG značená biotinem, kozí protilátka namířená proti králičím IgG značená biotinem, komplex avidin/biotin konjugovaný s peroxidázou a streptavidin konjugovaný s červení Texas (ABC Elitě; kit PK-6100)
byly zakoupeny od společnosti Vector Laboratories, Burlingame, CA. Králičí protilátky namířené proti myším Ig konjugované s fluoresceinisothiokyanátem byly zakoupeny od společnosti Dako Corporation, Carpinteria, CA. 3' ,3' diaminobenzidin byl získán od Cappel Laboratories, West Chester, PA. Blokovací pufr Superblock v PBS (kat. č.37515) byl zakoupen od společnosti Pierce, Rockford, IL. TritonX100 (X-100), Nonidet P-40 (N6507) a peroxid vodíku (30%, v/v; H1009) byly zakoupeny od společnosti Sigma. Kyselina L[3,4-3H]-glutamová (NET-490; 40 až 80 Ci/mmol) byla zakoupena od společnosti New England Nuclear, Boston, MA. Scintilační koktejl Optiphase Supermix byl zakoupen od společnosti Wallac, Turku, Finsko. Bílé mikrotitrační destičky ViewPlate-96 (kat. č. 6005182) byly zakoupeny od společnosti Packard Instruments Corporation, Meriden, CT. Není-li uvedeno jinak, byla všechna ostatní chemická činidla zakoupena od společnosti Sigma Chemical Company, Saint-Louis, MO.
Příprava kultivačních médií
Základní médium bylo připraveno jako směs médií DMEM a F12 v poměru 1:1 a bylo doplněno suplementem B27 přidaným jako 50-krát koncentrovaný zásobní roztok. Suplement B27 obsahuje biotin, L-karnitin, kortikosteron, ethanolamin, D(+)-galaktózu, redukovaný glutathion, kyselinu linoleovou, progesteron, putrescin, retinylacetát, selen, T3 (trijod-1thyronin), DL-alfa-tokoferol (vitamín E), DL-alfa-tokoferol acetát, bovinní sérový albumin, katalázu, insulin, superoxidizmutázu a transferin. Výsledná koncentrace L-glutaminu byla přibližně 2 mM, penicilinu přibližně 100 IU/ml a streptomycinu přibližně 100 mg/ml. Tepelně inaktivované koňské sérum bylo přidáno na výslednou koncentraci přibližně 2,5%, výsledná koncentrace D-glukózy byla přibližně 5 g/1, pufrační činidlo HEPES bylo přidáno na výslednou koncentraci při52 • ·
bližně 20 mM, výsledná koncentrace bovinniho insulinu byla přibližně 2,5 mg/ml a lidský transferin byl přidán na výslednou koncentraci přibližně 0,1 mg/ml. Po smícháni byla hodnota pH upravena na přibližně 7,3 a médium bylo uchováváno při 4°C. Aby byly minimalizovány odchylky mezi jednotlivými experimenty, byla média připravována vždy čerstvá těsně před použitím. Kvůli omezení adsorpce proteinů na minimum byly v experimentech používány plastové pipety a nádoby.
Roztoky proteinových produktů GDNF-faktoru
Purifikované proteinové produkty lidského rekombinantního GDNF-faktoru byly připraveny ve formě roztoků o koncentraci 1 mg/ml v D-PBS (fosfátový fyziologický roztok připravený z destilované vody) obsahujících 5% bovinniho sérového albuminu. Tyto roztoky byly uskladněny v alikvotech při teplotě -85°C. Na 96-ti jamkové mikrotitrační destičky byla nanesena média s postupným ředěním GDNF-faktoru a to tak, že do kultivačních médii s buněčnými kulturami (90 μΐ) byly přidávány 10-krát koncentrované roztoky proteinového produktu GDNF-faktoru v objemech 10 μΐ. Jako kontrola byly použity buněčné kultury s přídavkem D-PBS s 5% albuminem (10 μΐ). Přídavek proteinového produktu GDNF-faktoru byl uskutečněn jednu hodinu po vysetí buněk a v některých případech byl GDNF-faktor přidáván každý druhý den.
Kultivační substrát
Aby bylo umožněno optimální přichyceni fotoreceptorů na substrát a stimulován růst zevních segmentů a neuritů, byl povrch mikrotitračních destiček (kultivační substrát) modifikován potažením poly-L-ornithinem a následným povlečením lamininem. Celý postup probíhal následovně. Povrch destiček byl po dobu alespoň jedné hodiny při pokojové teplotě kompletně pokryt sterilním roztokem polyornithinu o koncentraci
• ·
0,1 mg/ml v 0,1 M kyselině borité (pH 8,4). Poté byly destičky promyty vodou Super-Q, voda byla odsáta a na destičky byl nanesen roztok myšího lamininu o koncentraci 1 pg/ml v PBS. Inkubace probíhala při 37°C po dobu 2 hodin. Celý tento postup byl prováděn těsně před použitím destiček, aby byla zajištěna reprodukovatelnost získaných výsledků.
Příprava buněčných kultur fotoreceptorů kuřat a myši
Kuřecí embrya White Leghorn o stáří 17 dni a myší mláďata C57BI/6 ve stáří 5 dní (získané z Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) byly usmrceny dekapitací a jejich oči byly sterilně vyjmuty a přeneseny do média L15 (bez hydrogenuhličitanu sodného). V jednom experimentu bylo zpracováno maximálně 24 očí. Oči byly rozpůleny a byly z nich odstraněny čočky a sklivec. Byly opatrně sebrány sítnice a od vrstvy neuronů byl odstraněn pigmentový epithel. Sítnice zbavené pigmentového epithelu byly rozřezány na malé (přibližně 1 mm čtvereční nebo menší) kousky a tyto byly umístěny do vychlazeného D-PBS. Následně byly buňky sebrány, přeneseny do 10 ml disociačního média (120 jednotek papainu a 2000 jednotek DNázy v HBSS). Buňky byly inkubovány při 37°C po dobu 45 minut na rotační třepačce při 200 otáčkách za minutu. Poté byly buňky dispergovány s využitím vyžíhaných Pasteurových pipet, přefiltrovány přes nylonové sítko Nitex 20 pm (aby byly odstraněny nedisociované tkáně) a centrifugovány při 200xg po dobu 5 minut v centrifuze IEC. Získaná buněčná peleta byla rozsuspendována v HBSS obsahujícím ovalbumin a přibližně 500 jednotek DNázy a touto suspenzí byl převrstven 4% roztok ovalbuminu (v HBSS). Následovala centrifugace při 500xg po dobu přibližně 10 minut. Získaná buněčná peleta byla rozsuspendována v kompletním kultivačním médiu (viz. výše), počet buněk byl upraven na 15000 buněk/ml a buňky byly v alikvotech o objemu 90 μΐ vysety na 96-ti jamkové
mikrotitračni destičky (průměr jamek 6 mm), které byly předtím povlečeny polyornithinem a lamininem. Adheze buněk proběhla rychle a účinnost výsevu byla přibližně 75%.
Buněčné kultury fotoreceptorů ze sítnic dospělých myší
Buněčné kultury fotoreceptorů ze sítnic dospělých myší byly ustaveny vysetím disociovaných buněk sítnic získaných z myší ve stáří 18 až 39 dni po narození na jednovrstevné buněčné kultury gliových buněk ze sítnic myší ve stáří 5 dní (po narození) nebo na jednovrstevné buněčné kultury potkaních buněk pigmentového epithelu sítnice. Postup disociace a použitá kultivační média byly totožné s postupem a médii popsanými výše. Buněčné kultury gliových buněk sítnice a buněk pigmentového epithelu byly ustaveny v lahvích pro tkáňové kultury (láhve Costar, 225 cm2) a kultivovány dokud nebylo dosaženo konfluence. Následně byly buňky od plastiku odděleny krátkou (přibližně 2 minuty) inkubací s roztokem 0,1% trypsinu a vysety na 96-ti jamkové mikrotitračni destičky nebo na 16-ti jamková skleněná krycí sklíčka. Disociované buňky ze sítnic dospělých myší byly přidány po 3 až 5 dnech.
Buněčné kultury fotoreceptorů ze sítnic myší rd/rd
Myši C57BI/6 rd/rd (získané z Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) jsou postiženy dědičnou degenerací fotoreceptorů, která je důsledkem exprese mutantní podjednotky beta fosfodiesterázy (tento enzym je lokalizován v zevních segmentech a účastní se procesů fototransdukce). Tyto myši jsou užitečným modelem ke studiu vlivu trofických receptorů na poškozené fotoreceptory. Rychlost odumírání fotoreceptorů je u myší rd/rd maximální přibližně 10 dní po narození. Buněčné kultury fotoreceptorů rd/rd byly ustaveny z myší ve stáří 5 dní a tyto fotoreceptory byly v buněčných kulturách udržová55 ·
ny po dobu 8 dni, čímž bylo zahrnuto období maximálního odumírání fotoreceptorů. Disociované buňky sítnice byly vysety na jednovrstevnou buněčnou kulturu gliových buněk (viz. výše) v hustotě přibližně 10000 buněk na jamku o průměru 6 mm a v kultivačním médiu byly udržovány postupem popsaným výše.
Imunohistochemie fotoreceptorů
K charakterizaci myších fotoreceptorů bylo použito nepřímé imunochemické značení peroxidázou (s menšími modifikacemi zmíněnými v dalším textu) popsané v publikacích Louis a další (J. Pharmacol. Exp. Therap., 262:1274 až 1283, 1992; Science 259:689 až 692, 1993). Buněčné kultury fotoreceptorů byly po dobu 30 minut při pokojové teplotě fixovány 4% formaldehydem v D-PBS pH 7,4 a následně třikrát promyty v D-PBS (200 μΐ na jamku o průměru 6 mm). Fixované buňky byly poté inkubovány v blokovacím pufru Superblock v PBS obsahujícím jedno procento detergentu Nonidet P-40. Tato inkubace má usnadnit pronikání protilátek do buněk. K buňkám byly následně přidány protilátky proti rhodopsinu (králičí a myší) v ředěních 1:1000 až 1:4000 v pufru o stejném složení a buňky byly inkubovány jednu hodinu při 37°C na rotační třepačce. Po třech promytích v D-PBS následovala detekce protilátek navázaných na receptory. Tato detekce byla prováděna prostřednictvím kozích protilátek proti králičím IgG značených biotinem nebo prostřednictvím koňských protilátek proti myším IgG značených biotinem (kit Vectastain, Vector Laboratories, Burlingame, CA) v ředění přibližně 1:500. Buňky byly s těmito sekundárními protilátkami inkubovány přibližně jednu hodinu při 37°C a následovalo trojnásobné promytí v DPBS. Sekundární protilátky byly poté značeny komplexem avidin-biotin-peroxidáza v ředění 1:500 a inkubace probíhala přibližně 45 minut při 37°C. Po trojnásobném promytí v D-PBS byly značené buněčné kultury po dobu 5 až minut barveny v roztoku 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,04% 3' ,3'diaminobenzidin-(HC1), 0,06% N1CI2 a 0,02% peroxid vodíku.
Při experimentech s dvojnásobným značením byly buněčné kultury kultivovány na 16-ti jamkových krycích sklíčcích. Po fixaci paraformaldehydem, permeabilizaci a zablokováni nespecifických vazebných míst (postupem popsaným výše) byly buňky inkubovány s králičí protilátkou namířenou proti arestinu a myší protilátkou proti rhodopsinu. Přítomnost arestinu byla zjišťována inkubací s kozí protilátkou proti králičím IgG značenou biotinem a následnou vizualizací streptavidinem konjugovaným s červení Texas (ředění 1:200). Přítomnost rhodopsinu byla zjišťována inkubací s králičí protilátkou proti myším IgG konjugovanou s fluoresceinisothiokyanátem. Fluorescence byla stanovována za použití vhodných kombinací filtrů pro fluorescein a červeň Texas.
Stanovení přežívání fotoreceptorů
Buněčné kultury myších fotoreceptorů byly fixovány, zpracovány a imunochemicky značeny postupem popsaným výše a tyto kultury fotoreceptorů byly následně zkoumány optickým mikroskopem ve světlém poli při 200-násobném zvětšení. Značené neurony byly počítány v pásu 1x6 mm procházejícím středem kultivační jamky, což představuje přibližně 20% z celkového povrchu jamky o průměru 6 mm. Za životaschopné receptory byly považovány buňky s pravidelným tvarem buněčného těla a obvykle krátkými výběžky podobnými axonům. Do celkového počtu nebyly zahrnuty fotoreceptory vykazující známky degenerace, jako například fotoreceptory s nepravidelnou nebo vakuolami vyplněnou cytoplazmou obklopující jádro nebo fotoreceptory s fragmentovanými neurity (většina degenerovaných fotoreceptorů se nicméně oddělila od kultivačního substrátu). Počet buněk byl vyjádřen jako počet buněk/jamka o průměru 6 mm nebo jako násobek změny vzhledem k hustotě kontrolních buněk.
Analýza neuritů
Morfometrická analýza vývoje neuritů (tj. výběžků z těla fotoreceptorů) byla prováděna na buněčných kulturách (starých 6 dnů) ze sítnic myší. Buněčné kultury o počtu přibližně 10000 neuronů v jedné jamce o průměru 6 mm byly imunochemicky označeny na přítomnost arestinu a pozorovány ve světlém poli optického mikroskopu. Video kamerou Optronics byly snímány náhodně vybrané oblasti v jamkách (6 mm) s kontrolními buněčnými kulturami a buněčnými kulturami vystavenými působeni proteinového produktu GDNF-faktoru. Snímky byly zpracovány na přibližně 800-násobné výsledné zvětšení. Velikost neuritů byla stanovována měřením délky neuritů každého fotoreceptorů pomocí jehly připojené k tabletu SummaSketchlI (Summagraphics Corporation, Houston, TX) s využitím programu pro digitalizaci (MacMeasure 1.9) a osobního počítače Macintosh Centris 650.
Výsledky
Příklad 1
Stimulace přežívání a vývoje fotoreceptorů-tyčinek v buněčných kulturách ze sítnic myší (postnatálních)
Buněčné kultury ze sítnic myší byly použity k prokázání vlivu proteinového produktu GDNF-faktoru na přežívání fotoreceptorů. Kultury fotoreceptorů byly ustaveny vysetím disociovaných buněk sítnice (v počtu 12500 buněk na jamku o průměru 6 mm) na mikrotitrační destičky povlečené polyornithinem a lamininem v médiu DMEM/F12 doplněném suplementem B27, tepelně inaktivovaným koňským sérem, D-glukózou, pufrem
HEPES, insulinem a transferinem. Fotoreceptory byly identifikovány na základě imunochemického stanovení přítomnosti arestinu (antigen specifický pro tyčinky) a rhodopsinu (zrakový pigment specificky přítomný v tyčinkách).
Po šesti dnech kultivace in vitro byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem a fotoreceptory v buněčné kultuře byly imunochemicky značeny na přítomnost arestinu, což je markér identifikující savčí tyčinky (typ fotoreceptorů). Po imunoznačení, provedeném postupem popsaným výše, byly pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem v oblastech s výskytem různých typů buněk sítnice fotoreceptory identifikovány (identifikované jako malé buňky pokryté po imunochemickém značení na přítomnost arestinu hnědým reakčním materiálem), neurony a Muellerovy gliové buňky. Pozorováním daných oblastí ve světlém poli optického mikroskopu bylo zjištěno, že antisérum proti arestinu, získané z králíka imunizovaného synteticky připraveným peptidem o sekvenci odpovídající části sekvence arestinu, se váže výlučně na tyčinkové fotoreceptory a neváže se na jiné neurony sítnice nebo na Muellerovy gliové buňky.
Na základě imunoreaktivity vůči arestinu bylo zjištěno, že přibližně 90% buněk v buněčných kulturách jsou fotoreceptory. Zbylými buňkami byly velké multipolární a menší unipolární neurony obsahující NSE (neurospecifická enoláza). Buňky byly následně imunochemicky značeny na přítomnost rhodopsinu. Jak bylo stanoveno imunoznačením s využitím myší monoklonální protilátky namířené proti rhodopsinu, exprimovalo přibližně 50% fotoreceptorů tento zrakový pigment tyčinek. Fotoreceptory se jevily jako okrouhlé buňky s malým průměrem těla a jedním nebo dvěma neurity a v některých případech s krátkým vertikálním výběžkem reprezentujícím spojující cilium. Při používaných rozlišeních nebyla patrna tvorba zevních segmentů.
V buněčných kulturách (6 dnú po ustavení) ze sítnic postnatálních myší byl stanovován vliv proteinového produktu GDNF-faktoru na přežívání fotoreceptorů. Buněčné kultury fotoreceptorů (10000/jamka o průměru 6 mm) byly vystaveny působení proteinového produktu lidského rekombinantního GDNF-faktoru (desetinásobné postupné ředění od 10 ng/ml do 1 pg/ml). Po šesti dnech byly buňky fixovány a imunochemicky značeny na přítomnost arestinu. Přežívání fotoreceptorů bylo stanovováno jako počet buněk obsahujících arestin v oblasti o obsahu 6 mm2 (reprezentuje přibližně 21% z celkového povrchu jamky o průměru 6 mm).
V buněčných kulturách, které nebyly vystaveny působení proteinového produktu GDNF-faktoru, neustále v průběhu experimentu klesal počet fotoreceptorů až, po šesti dnech kultivace, na hodnotu přibližně 25% počátečního stavu. Přítomnost proteinového produktu rekombinantního lidského GDNF-faktoru exprimovaného v E. coli v buněčných kulturách měla za následek přibližně dvojnásobné zvýšení počtu životaschopných fotoreceptorů obsahujících arestin po šestidenní kultivaci (viz. obrázek 1; každá hodnota je ve tvaru průměr ± směrodatná odchylka (pro tři kultivace)). Vliv proteinového produktu GDNF-faktoru byl maximální při koncentraci přibližně 200 pg/ml s hodnotou ED50 přibližně 30 pg/ml.
Mimo stimulace přežívání fotoreceptorů stimuloval přídavek proteinového produktu GDNF-faktoru rovněž prodlužování výběžků podobných axonům (dále označovaných jako neurity), čímž byl prokázán vliv zmíněného faktoru na morfologický vývoj fotoreceptorů. Buněčné kultury fotoreceptorů byly po dobu 6 dnů inkubovány bez nebo s přídavkem proteinového produktu rekombinantního lidského GDNF-faktoru (1 ng/ml). Tyto kultury byly následně imunochemicky značeny na přítomnost arestinu. Přibližně 715 fotoreceptorů ze dvou nezávislých kontrolních kultivací a 710 fotoreceptorů ze dvou nezá60 • · · · ··* * . · ···· .··· · * , . ··.··· • · · * ϊ . · ·
’..........
vislých buněčných kultur vystavených působení proteinového produktu GDNF-faktoru bylo vyfotografováno a byly u nich analyzována délka neuritů. Vliv přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru na růst neuritů byl kvantifikován měřením délky neuritů na fotoreceptorech. Obrázek 2 znázorňuje pozitivní vliv GDNF-faktoru na růst neuritů fotoreceptorů. Hodnoty jsou uvedeny jako graf distribuce kumulované četnosti délky neuritů. V grafu je uvedena závislost procenta fotoreceptorů (svislá osa) s neurity delšími než daná délka v mikrometrech (vodorovná osa). Přítomnost proteinového produktu GDNF-faktoru posunula distribuci délek neuritů směrem k vyšším hodnotám ve srovnání s kultivacemi prováděnými bez přítomnosti zmíněného faktoru. Některé fotoreceptory v buněčných kulturách vystavených působení proteinového produktu GDNF-faktoru měly neurity o délce přibližně 180 μτη, zatímco nej delší pozorované neurity v buněčných kulturách bez přítomnosti zmíněného faktoru dosahovaly délky pouze 100 μη. Průměrná délka neuritů při kontrolním experimentu byla 27 μη a při kultivaci v přítomnosti GDNF-faktoru pak 68 μη.
Fotoreceptory využívají jako neurotransmiter pro signalizaci neuronům druhého řádu kyselinu glutamovou (glutamát). V buněčných kulturách obsahujících více něž 90% fotoreceptorů indikuje hodnota příjmu glutamátu buňkami počet a aktivitu vysokoafinitních přenašečů pro zpětné vychytávání glutamátu přítomných na fotoreceptorech a tudíž odráží funkční diferenciaci těchto fotoreceptorů. Za účelem stanovení účinku proteinového produktu GDNF-faktoru na funkční diferenciaci fotoreceptorů byl hodnocen vliv přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru na zvýšení příjmu glutamátu. Buňky byly po dobu 6 dnů kultivovány způsobem popsaným výše bez nebo v přítomnosti proteinového produktu rekombinantního lidského GDNF-faktoru. Způsobem popsaným níže byl v těchto buněčných kulturách stanovován příjem [3H]-glutamátu.
• · · · e · ·· **
Stanovení příjmu glutamátu
Příjem glutamátu byl stanovován v buněčných kulturách fotoreceptorů z mláďat myší ve stáří 5 dnů. Experimenty byly prováděny v 96-ti jamkových mikrotitračních destičkách. Buňky byly promyty 100 μΐ předehřátého pufru použitého pro stanovení příjmu glutamátu (dále jen „příjmový pufr). Tento pufr se skládá z modifikovaného Krebsova-Ringerova roztoku, pH 7,4, obsahujícího přibližně 120 mM NaCl, 4,7 mM KC1, 1,8 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 2 mM NaHPO4, 1,3 mM EDTA a 5,6 mM Dglukózu. Následně byly buňky preinkubovány po dobu 10 minut při 37°C v „příjmovém pufru. Poté byl k buněčným kulturám přidán L-glutamát radioaktivně značený izotopem 3H (přibližně 60 Ci/mmol) v koncentraci přibližně 50 nM v 75 μΐ „příjmového pufru. Buňky byly inkubovány přibližně 60 minut při 37°C. Příjem glutamátu byl zastaven odstraněním inkubačního média a následovalo trojnásobné promytí pomocí přibližně 120 μΐ ledově vychlazeného „příjmového pufru. Poté byly buňky lyžovány přídavkem 200 μΐ scintilačního koktejlu Optiphase Supermix (Wallac) a radioaktivita byla stanovována scintilační spektrometrií s využitím čítače 96-ti jamkových destiček Wallac MicrobetaPlus. Výsledky jsou vyjádřeny jako dpm (počet rozpadů za minutu) na jamku o průměru 6 mm nebo ve formě násobku změny vzhledem ke kontrolnímu experimentu.
Bylo zjištěno, že stimulace příjmu glutamátu proteinovým produktem GDNF-faktoru je přímo úměrná použitému množství tohoto faktoru a maximální aktivity je dosaženo při koncentraci přibližně 200 pg/ml a při ED50 přibližně 25 pg/ml. Získané výsledky jsou zobrazeny na obrázku 3. Každý bod je uveden ve tvaru průměr ± směrodatná odchylka (ze tří jamek v reprezentativním experimentu). Podobné výsledky byly získány ze dvou nezávislých experimentů. Získané výsledky uka62 • · zují, že mimo stimulace přežívání a morfologického vývoje fotoreceptorů, stimuluje GDNF-faktor rovněž maturaci funkcí spojených s neurotransmisí, jako například příjem glutamátu, které jsou nezbytné pro fototransdukci.
Příklad 2
Stimulace přežívání a regenerace fotoreceptorů-tyčinek v buněčných kulturách ze sítnic dospělých myší
Vývoj fotoreceptorů je ukončen přibližně tři týdny po narození. Do této doby se u fotoreceptorů vyvinuly funkční zevní segmenty, ve kterých je shromážděna buněčná mašinérie nezbytná k fototransdukci, včetně zrakových pigmentů. Maturované fotoreceptory byly získány ze sítnic dospělých potkanů ve stáří 18 a 39 dnů a tyto buňky byly udržovány v buněčné kultuře déle než jeden týden. Zmíněné neurony byly vysety (v hustotě přibližně 2500/jamka o průměru 6 mm) na povrch dříve založené jednobuněčné vrstvy gliových buněk sítnice. Gliové buňky stimulují adhezi disociovaných fotoreceptorů a poskytují jim nutriční látky a faktory nezbytné pro jejich vývoj. Maturované fotoreceptory kultivované spolu s gliovými buňkami sítnice byly identifikovány dvojitým imunochemickým značením na přítomnost arestinu a rhodopsinu s využitím protilátek a postupů popsaných v předchozím textu .
Buněčné kultury byly vystaveny působení proteinového produktu rekombinantního lidského GDNF-faktoru (0,1, 1 nebo 10 ng/ml). Po sedmi dnech kultivace byly buňky fixovány a imunochemicky značeny na přítomnost arestinu. Přežívání fotoreceptorů bylo určováno počtem neuronů obsahujících arestin v jamce o průměru 6 mm. Počet fotoreceptorů tyčinek v buněčných kulturách ze sítnic dospělých potkanů ve stáří 18 a 39 dnů byl přibližně 3,5-krát vyšší v kulturách s přídavkem proteinového produktu GDNF-faktoru než • ···· ·· ·· · * ·· ··· * · · · ··· • ··· · · · · · · .
φ · φ · * ······· • · · · · · ·«···· · · 9 9 9 9 9 · · 3 v kontrolních kulturách (viz. obrázek 4; každá hodnota je uvedena ve tvaru průměr ± směrodatná odchylka (pro dvě až tři kultivace)). Maximální růst byl pozorován při koncentracích proteinového produktu GDNF-faktoru přibližně 300 pg/ml s ED50 přibližně 40 pg/ml. Získané výsledky ilustrují změny v počtu fotoreceptorů a tudíž ukazují na stimulaci přežívání fotoreceptorů v reakci na působení proteinovým produktem GDNF-faktoru.
V dalším experimentu byly disociované buňky sítnice vysety (v hustotě přibližně 1000 buněk sítnice/jamka o průměru 6 mm) na povrch dříve založené jednobuněčné vrstvy myších gliových buněk sítnice a k této buněčné kultuře byl přidán proteinový produkt rekombinantního lidského GDNF-faktoru (1 nebo 10 ng/ml). Po sedmi dnech kultivace byly buňky fixovány a imunochemicky značeny na přítomnost arestinu. Bylo zjištěno, že mimo stimulace přežívání fotoreceptorů, proteinový produkt GDNF-faktoru silně stimuluje morfologický vývoj fotoreceptorů, což bylo demonstrováno přerůstáním axonálních výběžků fotoreceptorů a v některých případech růstem krátkých apikálních výběžků připomínajících nezralé zevní segmenty. Tyto buněčné kultury pocházely ze sítnic dospělých jedinců, kde byly fotoreceptory plně vyvinuty. Jelikož tyto fotoreceptory ztratily své výběžky při jejich disociaci od dalších buněk sítnice, ukazují tato data, že proteinový produkt GDNF-faktoru má u fotoreceptorů schopnost stimulovat vývoj axonálních výběžků a zevních segmentů, které jsou nezbytné pro proces vidění. Získané výsledky naznačují, že podávání proteinového produktu GDNF-faktoru může být užitečné při léčbě onemocnění, jakými jsou například degenerace makuly spojené s věkem, dědičné degenerace sítnice a jiné dystrofie sítnice, při nichž je ztráta zraku způsobena degenerací fotoreceptorů.
• · • ·
Příklad 3
Stimulace přežívání fotoreceptorů-tyčinek v buněčných kulturách ze sítnic myší s dědičnou degenerací sítnice (rd/rd)
Myši rd/rd mají mutaci v podjednotce beta fosfodiesterázy (tento enzym je lokalizován v zevních segmentech a účastní se procesů fototransdukce) a tato mutace způsobuje špatné fungování zmíněného enzymu a zapříčiňuje brzký nástup degenerace fotoreceptorů a v konečném důsledku jejich zánik. Mutace podobné mutaci rd/rd můžeme nalézt u člověka a tyto mutace jsou odpovědné za část případů pigmentové zvrhlosti sítnice. Odumírání fotoreceptorů u myší rd/rd je maximální přibližně 10 dnů po narození. Tyto mutantní myši představují užitečný model pro studium účinků proteinového produktu GDNF-faktoru na přežívání fotoreceptorů rd/rd.
Buněčné kultury fotoreceptorů rd/rd byly ustaveny z myší ve stáří 5 dnů a buňky byly kultivovány po dobu sedmi dnů, tj. po dobu zahrnující výskyt maximálního odumírání fotoreceptorů. Vzhledem k jejich dědičné zranitelnosti byly disociované fotoreceptory rd/rd vysety (v hustotě přibližně 2500/jamka o průměru 6 mm) na povrch předem připravené jednobuněčné vrstvy gliových buněk sítnice (jak je popsáno výše) . Kultury buněk ze sítnic myší rd/rd byly srovnávány s buněčnými kulturami ze sítnic „normálních myší (divokého typu) získaných z pokusných zvířat stejného stáří a zpracovaných stejným způsobem. Buněčné kultury byly vystaveny působení proteinového produktu rekombinantního lidského GDNF-faktoru (mg/ml), po sedmi dnech fixovány a imunochemicky značeny na přítomnost arestinu. Přežívání fotoreceptorů bylo stanovováno jako počet neuronů obsahujících arestin v jamce o průměru 6 mm.
• · • · · · * ·«···· ·· · · · ·
Přídavek proteinového produktu GDNF-faktoru měl za následek mírný (přibližně 15%), ale statisticky významný nárůst počtu fotoreceptorů po 7 dnech kultivace in vitro (viz. obrázek 5; každá hodnota je uvedena ve tvaru průměr ± směrodatná odchylka (pro tři až čtyři kultivace)). Naopak při kultivaci bez přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru došlo, i přes přítomnost gliových buněk, k rychlému snížení počtu fotoreceptorů v buněčných kulturách odvozených z myší rd/rd a počet buněk v těchto kulturách dosáhl po sedmi dnech kultivaci přibližně 40% počtu fotoreceptorů odvozených z myší divokého typu. Při kultivaci v přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru (1 mg/ml) byl počet přeživších fotoreceptorů rd/rd zvýšen přibližně 2,5 násobně a dosáhl úrovně přeživších buněk pozorované u buněk fotoreceptorů divokého typu kultivovaných bez přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru. Získaná data ukazují, že působení proteinového produktu GDNF-faktoru učinilo mutantní fotoreceptory odolnější vůči stresu způsobenému mutací rd/rd. To naznačuje, že podávání proteinového produktu GDNF-faktoru může být užitečné při léčbě dědičných degenerací retiny, jako například pigmentové zvrhlosti sítnice.
Příklad 4
Stimulace přežívání čípků a vývoje zevních segmentů v buněčných kulturách odvozených ze sítnice embrií kuřat
Vývoj zrakového systému kuřat je daleko časnější než je tomu u hlodavců. Vyrůstání zevních segmentů fotoreceptorů začíná přibližně v 11 až 12 dni zárodečného vývoje, a v době vylíhnutí jsou již fotoreceptory plně vyvinuty. Vliv podávání proteinového produktu GDNF-faktoru na přežívání a regeneraci fotoreceptorů může být tedy studován v buněčných kulturách odvozených ze sítnice embrií kuřat.
Buňky odvozené ze sítnic kuřecích embrií starých 17 dnů byly kultivovány na 96-ti jamkových mikrotitračních destičkách (postupem popsaným výše) a po šesti dnech kultivace in vitro fixovány 4% paraformaldehydem. Bylo zjištěno, že tyto buněčné kultury obsahují přibližně 60% buněk fotoreceptorů a 40% velkých multipolárních buněk. Pomocí mikroskopie s fázovým kontrastem byla v reprezentativní oblasti kontrolních buněčných kultur zjištěna přítomnost dvou hlavních typů buněk sítnice: (1) čípků, charakterizovaných přítomností lipidové kapénky v apikální části těla buněk a; (2) neuronů sítnice. Buňky fotoreceptorů měly oválné tělo téměř úplně vyplněné buněčným jádrem, krátký vnitřní segment s malou lipidovou kapénkou, jeden krátký, nevětvený neurit (vyrůstající vzhledem ke zmíněné lipidové kapénce z místa na opačné straně buňky) a krátké distální cilium. To jsou charakteristické znaky čípků. Postupem popsaným výše bylo u buněk kultivovaných 6 dnů provedeno imunochemické značení na přítomnost rhodopsinu a pozorováním ve světlém poli optického mikroskopu byla identifikována přítomnost čípků. Bylo zjištěno, že přibližně 20% fotoreceptorů jsou čípky. Zbylých 80% fotoreceptorů byly tyčinky, které neobsahují rhodopsin.
Obrázek 6 znázorňuje vliv proteinového produktu GDNFfaktoru na přežívání fotoreceptorů v buněčných kulturách odvozených ze sítnic kuřecích embrií starých 17 dnů. Kultury disociovaných buněk sítnice (vysetých v hustotě přibližně 10000/jamka o průměru 6 mm) byly vystaveny působení proteinového produktu rekombinantního lidského GDNF-faktoru (desetinásobné postupné ředění v intervalu 10 ng/ml až 1 pg/ml). Po šesti dnech kultivace byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem a pozorovány mikroskopem s fázovým kontrastem. Čípky byly identifikovány na základě výskytu lipidové kapénky ve světlém poli. Zmíněná lipidová kapénka označuje spoj mezi vnitřním a zevním segmentem. Přežívání fotoreceptorů bylo • · · · • ·
stanovováno počítáním čípků v pásu 1x6 mm procházejícím středem kultivační jamky (což představuje přibližně 21% z celkového povrchu jamky o průměru 6 mm). Každá hodnota je uvedena ve tvaru průměr + směrodatná odchylka (pro tři kultivace) . Počet čípků v buněčných kulturách odvozených ze sítnic kuřat byl přibližně dvojnásobně vyšší při kultivaci v přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru než v buněčných kulturách kultivovaných bez přítomnosti zmíněného faktoru. Maximální účinek proteinového produktu GDNFfaktoru byl pozorován v koncentracích přibližně 200 pg/ml s ED50 přibližně 50 pg/ml.
Morfologie buněk fotoreceptorů byla pozorována s využitím mikroskopie s fázovým kontrastem a bylo zjištěno, že proteinový produkt GDNF-faktoru stimuluje vývoj jak vnitřních segmentů tak zevních segmentů a axonálních výběžků. Na rozdíl od buněk, které nebyly vystaveny působení proteinového produktu GDNF-faktoru, obsahovaly buněčné kultury kultivované v přítomnosti zmíněného faktoru (1 ng/ml po dobu 7 dnů) větší podíl čípků, které se jevily jako velmi protažené, polarizované buňky s různými kompartmenty. Tyto čípky obsahovaly protažený vnitřní segment, který byl v některých případech připojen k trojrozměrné struktuře (jevící se v zorném poli mikroskopu s fázovým kontrastem jako světlá entita) odpovídající zevnímu segmentu. U jiných čípků se vyvinul tlustý, dlouhý a větvený neurit.
V některých případech byly v buněčných kulturách kultivovaných v přítomnosti proteinového produktu GDNF-faktoru pozorovány zdvojené čípky se dvěmi zevními segmenty (typické pro sítnice ptáků). Kromě účinků na přežívání/proliferaci buněk byla prokázána schopnost proteinového produktu GDNF-faktoru stimulovat regeneraci zevních segmentů poškozených při disociaci buněk; tato schopnost byla demonstrována prokázáním vlivu proteinového produktu GDNF-faktoru na vývoj zevních • ·
segmentů v buněčných kulturách odvozených ze sítnic kuřat. Získané výsledky naznačují, že podání proteinového produktu GDNF-faktoru by bylo užitečné, mimo léčby dědičných degenerativních onemocnění sítnice a retinopatií, rovněž při léčbě dystrofií sítnice.
Předpokládá se, že po prostudování popisu výhodných provedení vynálezu přijdou odborníci na řadu modifikací a změn při praktickém využití vynálezu. Tudíž jedinými omezeními pro rozsah této přihlášky jsou omezení, která jsou definována patentovými nároky.
• ·
SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL: Jean-Claude Louis (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Použití proteinového produktu GDNF-faktoru k přípravě farmaceutických přípravků pro léčbu poškození nebo degenerace fotoreceptorů (iii) POČET SEKVENCÍ: 2 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:
(A) ADRESÁT: ČERMÁK-HOŘEJŠ-VRBA, Advokátní a patentová kan- celář
(B) ULICE: Národní 32
(C) MĚSTO: Praha 1
(D) STÁT: Česká Republika
(E) PSČ: 116 66
(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release č. 1.0, Verze č. 1.25
DATA 0 SOUČASNÉ PŘIHLÁŠCE
(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:
(B) DATUM PODÁNÍ:
(C) ZATŘÍDĚNI:
INFORMACE 0 ZÁSTUPCI:
(A) JMÉNO: Curry, Daniel R.
(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 32727
(C) ČÍSLO SPISU: A-363
(ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:
(A) TELEFON:
(B) TELEFAX: 0422 242 141 87 • · • · · ·
• » · · • · · · t · · · · to · to · · · * (C) TELEX:
(2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:l:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 134 aminokyselinových zbytků (B) TYP: protein (C) TOPOLOGIE: lineární (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: aminokyselinová sekvence maturovaného lidského GNDF-faktoru (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:l:
Ser 1 Pro Asp Lys Gin 5 Met Ala Val
Gin Ala Ala Ala 20 Ala Asn Pro Glu
Gly Gin Arg 35 Gly Lys Asn Arg Gly 40
Asn Val 50 Thr Asp Leu Gly Leu 55 Gly
Phe 65 Arg Tyr Cys Ser Gly 70 Ser Cys
Lys Ile Leu Lys Asn 85 Leu Ser Arg
Val Gly Gin Ala 100 Cys Cys Arg Pro
Phe Leu Asp 115 Asp Asn Leu Val Tyr 120
Lys Arg 130 Cys Gly Cys Ile
Leu Pro 10 Arg Arg Glu Arg Asn 15 Arg
Asn 25 Ser Arg Gly Lys Gly 30 Arg Arg
Cys Val Leu Thr Ala 45 Ile His Leu
Tyr Glu Thr Lys 60 Glu Glu Leu Ile
Asp Ala Ala 75 Glu Thr Thr Tyr Asp 80
Asn Arg 90 Arg Leu Val Ser Asp 95 Lys
Ile 105 Ala Phe Asp Asp Asp 110 Leu Ser
His Ile Leu Arg Lys 125 His Ser Ala
• ·
2) INFORMACE O SEK. ID. Č.:2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 12 aminokyselinových zbytků (B) TYP: protein (C) TOPOLOGIE: lineární (ix) CHARAKTERISTICKÝ ZNAK:
(A) NÁZEV/KLÍČ: synteticky připravená peptidová sekvence arestinu - proteinu charakteristického pro tyčinky (xi) POPIS SEKVENCE: SEK. ID. Č.:2:
Val Phe Glu Glu Phe Ala Arg Gin Asn Leu Lys Cys

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití proteinového produktu neurotrofického faktoru pocházejícího z linie gliových buněk (GDNF-faktor) k přípravě farmaceutických přípravků pro léčbu poškození nebo degenerace fotoreceptorů.
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde zmíněné poškození nebo degenerace fotoreceptorů je spojeno s pigmentovou zvrhlostí sítnice, Bardet-Biedlovým syndromem, BassenKornizweigovým syndromem (abetalipoproteinémie), Bestovou chorobou (voskově žlutá dystrofie), choroideremií, kruhovou atrofií, dědičnou amaurózou (slepota), Refsumovým syndromem, Stadgardtovou chorobou a Usherovým syndromem, degenerací makuly spojenou s věkem, diabetickou retinopatií, periferními vitroretinopatiemi, fotickými retinopatiemi, retinopatiemi vyvolanými chirurgickým zákrokem, virálními retinopatiemi, ischemickými retinopatiemi, odchlípením sítnice nebo úrazovou retinopatií.
  3. 3. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde zmíněný farmaceutický přípravek obsahuje GDNF-faktor o aminokyselinové sekvenci zobrazené jako SEK. ID. Č: 1 nebo nějakou z variant nebo derivátů zmíněného GDNF-faktoru.
  4. 4. Použití podle nároku 3, kde zmíněný farmaceutický přípravek obsahuje [Meť1] GDNF-faktor.
  5. 5. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde zmíněný farmaceutický přípravek obsahuje GDNF-faktor připojený k nějakému polymeru rozpustnému ve vodě.
    • ·
  6. 6. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde zmíněný farmaceutický přípravek obsahuje zkrácený lidský GDNF-faktor.
  7. 7. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde zmíněný farmaceutický přípravek obsahuje buňky, které byly modifikovány tak, aby produkovaly a sekretovaly proteinový produkt GDNF- faktoru.
  8. 8. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde zmíněný farmaceutický přípravek dále obsahuje účinné množství druhé terapeutické látky pro léčbu onemocnění sítnice.
  9. 9. Použití podle nároku 8, kde zmíněná druhá terapeutická látka je vybrána ze skupiny zahrnující neurotrofický faktor pocházející z mozku, neurotrofin-3, neurotrofin4/5, neurotrofin-6, růstový faktor podobný insulinu, ciliární (řasinkový) neurotrofický faktor, kyselý a bazický růstový faktor fibroblastů, růstový faktor-5 fibroblastů, transformující růstový faktor-β a transkript regulovaný dvojicí kokain-amfetamin.
  10. 10. Použití podle nároků 1 nebo 2, kde zmíněný farmaceutický přípravek je formulován jako oční inzert, injekce pro aplikaci do oka nebo oční implantát.
  11. 11. Způsob pro získávání buněk fotoreceptorů pro implantace vyznačující se tím, že tento způsob zahrnuje kultivaci disociovaných buněk fotoreceptorů v přítomnosti proteinového produktu neurotrofického faktoru pocházejícího z linie gliových buněk (GDNF-faktor).
  12. 12. Přípravek obsahující buňky fotoreceptorů a proteinový produkt neurotrofického faktoru pocházejícího z linie
    9 * gliových buněk (GDNF-faktor) vyznačuj ící se tím, že tyto buňky a GDNF-faktor jsou zde obsaženy v množstvích, která stimulují přežívání a umožňují kontinuální růst a maturaci zmíněných buněk fotoreceptoo
CZ981544A 1995-11-29 1996-11-22 Použití proteinového produktu GDNF-faktoru k přípravě farmaceutických přípravků pro léčbu poškození nebo degenerace fotoreceptorů CZ154498A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/564,833 US5641750A (en) 1995-11-29 1995-11-29 Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ154498A3 true CZ154498A3 (cs) 1999-05-12

Family

ID=24256084

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ981544A CZ154498A3 (cs) 1995-11-29 1996-11-22 Použití proteinového produktu GDNF-faktoru k přípravě farmaceutických přípravků pro léčbu poškození nebo degenerace fotoreceptorů

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5641750A (cs)
EP (1) EP0863766B1 (cs)
JP (1) JP2000502057A (cs)
KR (1) KR19990071540A (cs)
CN (1) CN1203532A (cs)
AT (1) ATE194773T1 (cs)
AU (1) AU698062B2 (cs)
BR (1) BR9611750A (cs)
CZ (1) CZ154498A3 (cs)
DE (1) DE69609422T2 (cs)
DK (1) DK0863766T3 (cs)
ES (1) ES2149511T3 (cs)
GR (1) GR3034393T3 (cs)
HU (1) HUP9802374A2 (cs)
IL (1) IL124601A0 (cs)
MX (1) MX9803993A (cs)
NO (1) NO982275L (cs)
PT (1) PT863766E (cs)
SK (1) SK65998A3 (cs)
WO (1) WO1997019694A1 (cs)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020064870A1 (en) * 1993-03-03 2002-05-30 Pascale Briand Recombinant adenoviruses and use thereof in gene therapy for treating eye diseases
FR2704556B1 (fr) 1993-04-30 1995-07-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants et leur utilisation en thérapie génique.
FR2710846B1 (fr) 1993-10-04 1995-12-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Compositions pharmaceutiques et leur utilisation, notamment dans le traitement des maladies neurogénératives.
US8431119B2 (en) * 1993-10-04 2013-04-30 Aventis Pharma S.A. Pharmaceutical compositions and utilization thereof particularly for the treatment of neurodegenerative diseases
US7153827B1 (en) 1994-03-08 2006-12-26 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2 and methods of use
US7186688B1 (en) 1994-03-08 2007-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Methods of stimulating angiogenesis in a patient by administering vascular endothelial growth factor 2
US6608182B1 (en) 1994-03-08 2003-08-19 Human Genome Sciences, Inc. Human vascular endothelial growth factor 2
US7109308B1 (en) 1994-03-08 2006-09-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human vascular endothelial growth factor 2
US6040157A (en) 1994-03-08 2000-03-21 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
DE69434538T2 (de) 1994-03-08 2006-08-10 Human Genome Sciences, Inc. Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor 2
US5731284A (en) * 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US6184200B1 (en) * 1995-09-28 2001-02-06 Amgen Inc. Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor
US5641750A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US6878544B2 (en) * 1996-04-19 2005-04-12 Neurotech Sa Retinal cell lines with extended life-span and their applications
US6677135B1 (en) 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
CN1233963A (zh) 1996-09-13 1999-11-03 有限会社最先端医学研究所 神经营养因子的眼科用组合物、视神经机能障碍治疗药和视神经机能障碍治疗方法
EP0937258A2 (en) * 1996-10-29 1999-08-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center, Inc. Cell stress regulated human mhc class i gene
NZ501423A (en) * 1997-04-17 2002-02-01 Univ Washington Receptors for TGF-beta-related neurotrophic factors and use for treating disease
US20030121064A1 (en) * 1997-06-11 2003-06-26 Ann Logan CNS neuroregenerative compositions and methods of use
DE69821629T2 (de) * 1997-09-19 2005-01-13 Biopharm Gesellschaft Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh Kombinationen von Cytokinen mit neurotroper Aktivität
US6337340B1 (en) 1998-08-14 2002-01-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Carboxylic acids and isosteres of heterocyclic ring compounds having multiple heteroatoms for vision and memory disorders
US7338976B1 (en) 1998-08-14 2008-03-04 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters or amides for vision and memory disorders
US6506788B1 (en) 1998-08-14 2003-01-14 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked urea or carbamate of heterocyclic thioesters for vision and memory disorders
US6218423B1 (en) 1998-08-14 2001-04-17 Gpi Nil Holdings, Inc. Pyrrolidine derivatives for vision and memory disorders
US6376517B1 (en) 1998-08-14 2002-04-23 Gpi Nil Holdings, Inc. Pipecolic acid derivatives for vision and memory disorders
US6399648B1 (en) 1998-08-14 2002-06-04 Gpi Nil Holdings, Inc. N-oxides of heterocyclic ester, amide, thioester, or ketone for vision and memory disorders
US7265150B1 (en) 1998-08-14 2007-09-04 Gpi Nil Holdings Inc. Carboxylic acids and carboxylic acid isosteres of N-heterocyclic compounds for vision and memory disorders
US7410995B1 (en) 1998-08-14 2008-08-12 Gpi Nil Holdings Inc. N-linked sulfonamide of heterocyclic thioesters for vision and memory disorders
US6339101B1 (en) 1998-08-14 2002-01-15 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked sulfonamides of N-heterocyclic carboxylic acids or isosteres for vision and memory disorders
US6333340B1 (en) 1998-08-14 2001-12-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule sulfonamides for vision and memory disorders
US6335348B1 (en) 1998-08-14 2002-01-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Nitrogen-containing linear and azepinyl/ compositions and uses for vision and memory disorders
US6384056B1 (en) 1998-08-14 2002-05-07 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic thioesters or ketones for vision and memory disorders
FR2784898A1 (fr) * 1998-10-26 2000-04-28 Univ Pasteur Utilisation du gdnf pour le traitement de la degenerescence retinienne
TWI246421B (en) * 1998-12-03 2006-01-01 Alcon Mfg Ltd Use of neurotrophic factor stimulators for the treatment of ophthalmic neurodegenerative diseases
US6906077B1 (en) * 1998-12-03 2005-06-14 Alcon Manufacturing, Ltd. Use of neurotrophic factor stimulators for the treatment of ophthalmic neurodegenerative diseases
IT1305294B1 (it) * 1999-01-29 2001-05-04 Alessandro Lambiase Uso del nerve growth factor nella terapia di patologie a carico deitessuti intraoculari.
CA2361615A1 (en) * 1999-02-08 2000-08-10 Human Genome Sciences, Inc. The use of vascular endothelial growth factor 2 antagonist in the treatment of an injury to or disorder of an eye
US7223724B1 (en) 1999-02-08 2007-05-29 Human Genome Sciences, Inc. Use of vascular endothelial growth factor to treat photoreceptor cells
US20070071734A1 (en) * 1999-04-06 2007-03-29 Weng Tao ARPE-19 as platform cell line for encapsulated cell-based delivery
US6361771B1 (en) * 1999-04-06 2002-03-26 Neurotech S.A. ARPE-19 as a platform cell line for encapsulated cell-based delivery
WO2001074400A1 (fr) 2000-04-03 2001-10-11 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Transporteurs et systeme de distribution de medicament les utilisant
US6864243B1 (en) * 2000-05-12 2005-03-08 Inspire Pharmaceuticals, Inc. Method for treating retinal degeneration with purinergic receptor agonists
NZ518077A (en) 2000-08-04 2003-11-28 Human Genome Sciences Inc Biologically active fragments, analogues and derivatives of VEGF-2 for the treatment of peripheral artery diseases such as critical limb ischemia and coronary disease
PL366000A1 (en) * 2000-08-08 2005-01-24 M.G.V.S.Ltd. Nucleic acid constructs, vascular cells transformed therewith, pharmaceutical compositions and methods utilizing same for inducing angiogenesis
EP1378247B1 (en) 2001-04-11 2016-08-24 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Visual function disorder improving agents
AU2002257142B2 (en) 2001-04-13 2008-09-04 Human Genome Sciences, Inc. Vascular endothelial growth factor 2
US7402312B2 (en) 2001-04-13 2008-07-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to vascular endothelial growth factor 2 (VEGF-2)
KR20110025239A (ko) * 2001-09-28 2011-03-09 산텐 세이야꾸 가부시키가이샤 약물-폴리에틸렌글리콜 결합체를 함유하는 안조직 내 주입제
WO2003047525A2 (en) * 2001-12-03 2003-06-12 The Regents Of The University Of California Expression of glial-derived neurotrophic factor for treatment of diseases of the eye
AU2002359786A1 (en) * 2001-12-19 2003-07-09 Hiroaki Mizukami Adeno-associated virus-mediated delivery of gdnf to skeletal muscles
AU2003209297A1 (en) * 2002-01-18 2003-09-02 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods and compositions for preserving the viability of photoreceptor cells
JP2006506970A (ja) * 2002-07-12 2006-03-02 ユニバーシティ オブ ワシントン 神経細胞の延長されたインビトロ培養のための方法および系
CA2689424A1 (en) * 2002-09-29 2004-04-08 Surmodics, Inc. Methods for treatment and/or prevention of retinal disease
US8518390B2 (en) 2003-06-27 2013-08-27 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of stroke and other acute neural degenerative disorders via intranasal administration of umbilical cord-derived cells
US20060223177A1 (en) 2003-06-27 2006-10-05 Ethicon Inc. Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making and using the same
ES2564044T3 (es) 2003-06-27 2016-03-17 DePuy Synthes Products, Inc. Células posparto derivadas de tejido del cordón umbilical y métodos de preparación y uso de las mismas
US8790637B2 (en) 2003-06-27 2014-07-29 DePuy Synthes Products, LLC Repair and regeneration of ocular tissue using postpartum-derived cells
US9592258B2 (en) 2003-06-27 2017-03-14 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of neurological injury by administration of human umbilical cord tissue-derived cells
US7875272B2 (en) 2003-06-27 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of stroke and other acute neuraldegenerative disorders using postpartum derived cells
US7875273B2 (en) 2004-12-23 2011-01-25 Ethicon, Incorporated Treatment of Parkinson's disease and related disorders using postpartum derived cells
US8491883B2 (en) * 2003-06-27 2013-07-23 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using umbilical derived cells
US9572840B2 (en) 2003-06-27 2017-02-21 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue using postpartum-derived cells
GB0328021D0 (en) 2003-12-03 2004-01-07 Inst Of Ophthalmology Method
WO2006101548A2 (en) * 2004-12-21 2006-09-28 Ethicon, Inc. Postpartum cells derived from umbilical cord tissue, and methods of making, culturing, and using the same
WO2006083394A2 (en) * 2004-12-21 2006-08-10 Ethicon, Inc. Postpartum cells derived from placental tissue, and methods of making, culturing, and using the same
US20060153815A1 (en) * 2004-12-21 2006-07-13 Agnieszka Seyda Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
US8309057B2 (en) * 2005-06-10 2012-11-13 The Invention Science Fund I, Llc Methods for elevating neurotrophic agents
US8409263B2 (en) * 2005-08-05 2013-04-02 Gholam A. Peyman Methods to regulate polarization of excitable cells
WO2007019427A2 (en) * 2005-08-08 2007-02-15 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Methods and compositions for preserving the viability of photoreceptor cells
ITRM20050447A1 (it) * 2005-08-19 2007-02-20 Anabasis S R L Uso del nerve growth factor in collirio nella terapia di patologie del sistema nervoso centrale, quali la malattia di alzheimer e il morbo di parkinson.
PL1971681T3 (pl) * 2005-12-16 2018-01-31 Depuy Synthes Products Inc Kompozycje oraz sposoby do hamowania niepożądanej odpowiedzi immunologicznej w przypadku transplantacji z brakiem zgodności tkankowej
US9125906B2 (en) 2005-12-28 2015-09-08 DePuy Synthes Products, Inc. Treatment of peripheral vascular disease using umbilical cord tissue-derived cells
ES2628129T3 (es) * 2005-12-28 2017-08-01 DePuy Synthes Products, Inc. Tratamiento de la enfermedad vascular periférica utilizando células derivadas del posparto
US20080145405A1 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Kunzler Jay F Drug delivery devices
JP5371953B2 (ja) 2007-04-20 2013-12-18 アキュセラ インコーポレイテッド 眼の疾患及び障害を治療するスチレニル誘導体化合物
WO2009005794A2 (en) 2007-06-29 2009-01-08 Acucela, Inc. Alkynyl phenyl derivative compounds for treating ophthalmic diseases and disorders
RU2014151622A (ru) 2007-10-05 2015-08-20 Акусела Инк. Композиции и способы лечения нейродегенеративных заболеваний
ES2525718T3 (es) * 2007-10-05 2014-12-29 DePuy Synthes Products, LLC Reparación y regeneración de tejido renal mediante células derivadas de tejido de cordón umbilical humano
WO2009128057A2 (en) 2008-04-18 2009-10-22 UNIVERSITY COLLEGE DUBLIN, NATIONAL UNIVERSITY OF IRELAND, DUBLIN et al Psycho-pharmaceuticals
EP2379089B1 (en) * 2008-12-19 2019-04-17 DePuy Synthes Products, Inc. Regeneration and repair of neural tissue following injury
CA2747794C (en) 2008-12-19 2018-10-30 Advanced Technologies And Regenerative Medicine, Llc Treatment of lung and pulmonary diseases and disorders
US10179900B2 (en) * 2008-12-19 2019-01-15 DePuy Synthes Products, Inc. Conditioned media and methods of making a conditioned media
AU2009327382B2 (en) * 2008-12-19 2014-07-17 DePuy Synthes Products, LLC Umbilical cord tissue derived cells for treating neuropathic pain and spasticity
SG174551A1 (en) * 2009-03-26 2011-10-28 Ethicon Inc Human umbilical cord tissue cells as therapy for alzheimer' s disease
PL2794854T3 (pl) 2011-12-23 2018-12-31 DePuy Synthes Products, Inc. Wykrywanie ludzkich komórek pochodzących z tkanki pępowinowej
CN104703598A (zh) 2012-01-20 2015-06-10 奥克塞拉有限公司 用于疾病治疗的取代的杂环化合物
EP2970099A4 (en) 2013-03-12 2016-12-21 Acucela Inc SUBSTITUTED 3-PHENYLPROPYLAMINE DERIVATIVES FOR THE TREATMENT OF EYE DISEASES AND DRESSES
EP2968462B1 (en) 2013-03-15 2020-12-23 The Jackson Laboratory Methods for promoting wound healing and hair growth
US10883108B2 (en) 2016-03-31 2021-01-05 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Endomucin inhibitor as an anti-angiogenic agent
EP3538560A4 (en) 2016-11-10 2020-06-17 Keros Therapeutics, Inc. GDNF FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE
EP3541408A4 (en) 2016-11-15 2020-06-24 The Schepens Eye Research Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF ABERRANT ANGIOGENESIS
US11260048B2 (en) 2017-10-03 2022-03-01 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Compounds and compositions for inhibiting retinal pigment epithelium degeneration and methods using the same
JP7416700B2 (ja) 2017-11-14 2024-01-17 ザ スキーペンズ アイ リサーチ インスティチュート インコーポレイテッド 増殖性硝子体網膜症および上皮間葉転換と関連付けられる状態の治療のためのｒｕｎｘ１阻害の方法
CN113759131A (zh) * 2021-09-28 2021-12-07 嘉兴蔚康科技有限公司 一种靶标蛋白组合在检测视网膜黄斑病变中的应用

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3995635A (en) * 1971-09-09 1976-12-07 Alza Corporation Ocular insert
US3981303A (en) * 1971-09-09 1976-09-21 Alza Corporation Bioerodible ocular device
US3986510A (en) * 1971-09-09 1976-10-19 Alza Corporation Bioerodible ocular device
US4188373A (en) * 1976-02-26 1980-02-12 Cooper Laboratories, Inc. Clear, water-miscible, liquid pharmaceutical vehicles and compositions which gel at body temperature for drug delivery to mucous membranes
US4217898A (en) * 1978-10-23 1980-08-19 Alza Corporation System with microporous reservoir having surface for diffusional delivery of agent
US4474452A (en) * 1981-05-13 1984-10-02 Pitney Bowes Inc. Safety device for cam yoke used in electrophotocopier reciprocating carriage
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4474751A (en) * 1983-05-16 1984-10-02 Merck & Co., Inc. Ophthalmic drug delivery system utilizing thermosetting gels
US4474752A (en) * 1983-05-16 1984-10-02 Merck & Co., Inc. Drug delivery system utilizing thermosetting gels
EP0154316B1 (en) * 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4863457A (en) * 1986-11-24 1989-09-05 Lee David A Drug delivery device
US5158881A (en) * 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US4892538A (en) * 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5106627A (en) * 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US4853224A (en) * 1987-12-22 1989-08-01 Visionex Biodegradable ocular implants
US4865846A (en) * 1988-06-03 1989-09-12 Kaufman Herbert E Drug delivery system
US4882150A (en) * 1988-06-03 1989-11-21 Kaufman Herbert E Drug delivery system
US5011472A (en) * 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
WO1990006952A1 (en) * 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5221696A (en) * 1989-03-29 1993-06-22 Alcon Laboratories, Inc. Use of monoacyl phosphoglycerides to enhance the corneal penetration of ophthalmic drugs
ATE403713T1 (de) * 1989-10-16 2008-08-15 Amgen Inc Stamzellfaktor
WO1991010470A1 (en) * 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
US5252714A (en) * 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
EP1243652A3 (en) * 1991-09-20 2003-03-26 Amgen Inc., Glial derived neurotrophic factor
US5470582A (en) * 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
AU677951B2 (en) * 1992-02-14 1997-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prevention of retinal injury and degeneration by specific factors
US5384333A (en) * 1992-03-17 1995-01-24 University Of Miami Biodegradable injectable drug delivery polymer
AU4114993A (en) * 1992-04-24 1993-11-29 Polymer Technology Group, Inc., The Biocompatible, therapeutic, implantable device
WO1995017203A1 (en) * 1993-12-22 1995-06-29 The University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel nucleic acid sequences isolated from glial cells
US5422116A (en) * 1994-02-18 1995-06-06 Ciba-Geigy Corporation Liquid ophthalmic sustained release delivery system
US5733875A (en) * 1994-11-15 1998-03-31 Amgen Inc. Methods of using GDNF as a neuroprotective agent
US5641750A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5641749A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product

Also Published As

Publication number Publication date
NO982275L (no) 1998-07-29
EP0863766B1 (en) 2000-07-19
US5641750A (en) 1997-06-24
NO982275D0 (no) 1998-05-19
SK65998A3 (en) 1999-09-10
PT863766E (pt) 2000-11-30
DK0863766T3 (da) 2000-10-23
WO1997019694A1 (en) 1997-06-05
MX9803993A (es) 1998-09-30
IL124601A0 (en) 1998-12-06
KR19990071540A (ko) 1999-09-27
AU698062B2 (en) 1998-10-22
US5736516A (en) 1998-04-07
ES2149511T3 (es) 2000-11-01
BR9611750A (pt) 1999-04-06
DE69609422D1 (de) 2000-08-24
DE69609422T2 (de) 2001-02-15
GR3034393T3 (en) 2000-12-29
EP0863766A1 (en) 1998-09-16
JP2000502057A (ja) 2000-02-22
CN1203532A (zh) 1998-12-30
HUP9802374A2 (hu) 1999-02-01
ATE194773T1 (de) 2000-08-15
AU1059297A (en) 1997-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ154498A3 (cs) Použití proteinového produktu GDNF-faktoru k přípravě farmaceutických přípravků pro léčbu poškození nebo degenerace fotoreceptorů
JP4066201B2 (ja) 膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）蛋白産生物を用いる網膜神経節細胞損傷の治療方法
JP4028598B2 (ja) 神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｄｎｆ）タンパク質産物を使用する感覚神経性聴力損失及び前庭障害の予防及び治療方法
US6043221A (en) Method for preventing and treating hearing loss using a neuturin protein product
US5837681A (en) Method for treating sensorineural hearing loss using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
JP3764047B2 (ja) 網膜ニューロン死の防止及び眼病の治療方法
AU696772C (en) Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
CA2236157A1 (en) Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (gdnf) protein product
MXPA00000862A (en) Method for preventing and treating hearing loss using a neurturin protein product

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic