PT863766E - Metodos de tratamento de lesao ou degeneracao de fotorreceptores utilizando o produto proteico factor neurotrofico derivado da linha de celulas da glia (gdnf) - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO “Métodos de tratamento de lesão ou degeneração de fotorreceptores utilizando o produto proteico factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF)”

Campo da invenção A presente invenção refere-se de um modo geral a métodos para o tratamento de lesão ou degeneração de neurónios retinais por administração de produto proteico factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF). A invenção refere-se especificamente a métodos para o tratamento de condições patológicas, tais como degenerações retinais hereditárias e envelhecimento, doença ou retinopatias relacionadas com a lesão, em que ocorre degeneração de fotorreceptores e é responsável por perda de visão.

Antecedentes da invenção

Recentemente, foram identificadas várias moléculas proteínicas que ocorrem na Natureza, com base na sua actividade trófica sobre vários tipos de neurónios. Estas moléculas são denominadas "factores neurotróficos". Os factores neurotróficos são proteínas endógenas, solúveis, que desempenham um papel principal na sobrevivência e crescimento dos neurónios durante o desenvolvimento, bem como na manutenção funcional e plasticidade de neurónios maduros; veja-se Fallon e Laughlin, Neurotrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA (1993). Com vista na sua capacidade para promover a regeneração de neurónios e para evitar a morte e a degeneração dos neurónios, postulou-se que os factores neurotróficos podiam ser úteis no tratamento de condições neurodegenerativas do sistema nervoso, tais como, por exemplo, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, esclerose amiotrófica lateral e ataque. O dano nos nervos é causado por condições que comprometem a sobrevivência e/ou o adequado funcionamento de um ou mais tipos de células nervosas, incluindo: (1) lesões físicas, que causam a degeneração dos processos axónicos (que por sua vez causa morte de células nervosas) e/ou de corpos de células nervosas próximo do local da lesão, (2) cessação temporária ou permanente do fluxo sanguíneo (isquemia) a partes do sistema nervoso, como no ataque, (3) exposição intencional ou acidental a neurotoxinas, tais como os agentes

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 2 quimioterapêuticos para ο cancro e a SIDA, respectivamente cisplatina e didesoxicitidina, (4) doenças metabólicas crónicas tais como diabetes ou disfunção renal, ou (5) doenças neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer e a Esclerose Amiotrófica Lateral, que resultam da degeneração de populações específicas de neurónios. De modo a que um determinado factor neurotrófico seja potencialmente útil no tratamento de danos nos nervos, a classe ou classes de células nervosas danificadas tem que ser responsiva ao factor; diferentes factores neurotróficos afectam tipicamente diferentes classes de células nervosas. Estabeleceu-se que as populações de neurónios não são todas responsivas ou afectadas de igual modo por todos os factores neurotróficos. O primeiro factor neurotrófico identificado foi o factor de crescimento de nervos (NGF). O NGF é o primeiro membro de uma família definida de factores tróficos, denominados de neurotrofinas, que inclui actualmente o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3), NT-4/5 e NT-6 (Thoenen, Trends. Neurosci., 14:165-170, 1991; Lapchak et ai, Rev. Neurosci., 3:1-10, 1993; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci, 18:223-253, 1995). Sabe-se que estas neurotrofinas actuam através da família de receptores de tirosina-quinase trk, i.e., trkA, fr/cB, trkC, e o receptor de p75 de baixa afinidade (Lapchak et ai, Rev. Neurosci., 3:1-10, 1993; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci, 18:223-253, 1995; Chao et ai, TINS 18:321-326, 1995). No sistema nervoso central (CNS), a expressão de trkA, o receptor para NGF, está quase exclusivamente limitada aos neurónios colinérgicos no prosencéfalo basal (Venero et ai, Neuroreport, 4:959-962, 1993), que também expressam p75 e trkB. Estes neurónios colinérgicos são de particular interesse neurológico, pois a degeneração e/ou a distrofia de neurónios colinérgicos constituem uma marca de reconhecimento da doença de Alzheimer (Hefti, J. Neurobioi, 25:1418-1435, 1994; Olson, Neurochem. Jui, 15:1-3, 1994). Os neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal podem ser rapidamente identificados em preparações morfológicas utilizando histoquímica da acetilcolinesterase ou com imuno-histoquímica utilizando anticorpos para colina-acetiltransferase (ChAT), a enzima sintética para acetilcolina, ou para p75 (Batchelor et ai, J. Comp. Neuroi, 284:187-204, 1989; Kiss et ai, Neurosci., 27:731-748, 1988; Woolf et ai, Neuroscience, 30:143-152, 1989). O factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF) é uma proteína recentemente determinada, identificada e purificada utilizando ensaios baseados na sua eficácia para promover a sobrevivência e estimular in vitro o

fenótipo transmissor de neurónios dopaminérgicos mesencefálicos (Lin et al., Science, 260:1130-1132. 1993). O GDNF é um homodímero ligado por dissulfureto, glicosilado, relacionado de forma distante com a super-família de proteínas neurotróficas do factor β de crescimento de transformação (TGF-β) (Krieglstein et al., EMBO J., 14:736-742, 1995; Poulsen et ai, Neuron, 13:1245-1252, 1994). O GDNF foi clonado e o GDNF humano recombinante (rhuGDNF) exerce acções trófica e de promoção da sobrevivência sobre neurónios dopaminérgicos da substância negra e neurónios motores da medula espinal, in vitro, bem como in vivo (Beck et al., Nature, 273:339-341. 1995; Henderson et ai, Science, 266:1130-1132. 1994; Tomac et ai, Nature, 273: 335-339; Yan et ai, Nature, 273: 341-343; Zurn et ai, Neuroreport, 6:113-118, 1994). In vivo, o tratamento com GDNF exógeno estimula o fenótipo dopaminérgico de neurónios da substância negra e restabelece défices funcionais induzidos por axotomia ou neurotoxinas dopaminérgicas em modelos animais de doença de Parkinson, uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda de neurónios dopaminérgicos (Hudson et ai, Brain Res. Buli, 36:425-432, 1995; Hoffer et ai, Neurosci. Lett., 182:107-111, 1994). Apesar de originalmente se pensar que era relativamente específico para neurónios dopaminérgicos, pelo menos in vitro, experiências subsequentes mostraram que o GDNF tem eficácia neurotrófica sobre neurónios motores colinérgicos da medula espinal e do tronco cerebral, tanto in vivo como in vitro (Oppenheim et ai, Nature, 373:344-346. 1995; Zurn et ai, Neuroreport, 6:113-118, 1994; Yan et ai, Nature, 373: 341-344, 1995; Henderson et ai, Science, 266:1062-1064, 1994). O GDNF é, portanto, um factor com potencial benefício terapêutico no tratamento de desordens degenerativas de neurónios motores da medula espinal, tais como esclerose amiotrófica lateral.

Assim, começam a surgir evidências que indicam que o GDNF pode ter um espectro mais largo de alvos neurotróficos para além dos neurónios dopaminérgicos mesencefálicos e somáticos motores (Yan e Matheson, Nature 373:341-344, 1995·, Miller et ai, Soc. Neurosci. Abstr., 20:1300, 1994). O ARN mensageiro (ARNm) de GDNF foi detectado no músculo e em células de Schwann no sistema nervoso periférico e em astrócitos do tipo I (Schaas et ai, Exp. Neurol, 124:368-371. 1993) no sistema nervoso central. O ARNm do GDNF é também expresso em níveis elevados no estriado do rato em desenvolvimento (Stromberg et ai, Exp. Neuroi, 124:401-412. 1993), e em baixos níveis em regiões do sistema nervoso central do rato e do homem adultos, incluindo estriado, hipocampo, córtex e medula espinal (Springer et ai, Exp. Neurol, 127:167-170.1994).

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Tem interesse genérico para a presente invenção o pedido WO93/06116 (Lin et ai, Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture), publicado em 1 de Abril, 1993, que refere que o GDNF é útil para o tratamento de lesões nos nervos, incluindo lesões associadas à Doença de Parkinson. Têm também interesse um relato em Schmidt-Kastner et ai, Mol. Brain Res., 26:325-330, 1994, de que o ARNm de GDNF se torna detectável e foi regulado superiormente após ataques induzidos por pilocarpina; relatos em Schaar et ai, Exp. Neurol., 124:368-371.1993 e Schaar et ai, Exp. Neurol., 130:387-393, 1994, de que astrócitos do prosencéfalo basal expressaram níveis moderados de ARNm de GDNF sob condições de cultura, mas que o GDNF não altera a actividade de ChAT do prosencéfalo basal; e um relato no pedido actualmente pendente n°. de Série US 08/535 682, apresentado em 28 de Setembro, 1995, de que o GDNF é útil para o tratamento de lesão ou degeneração de neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal.

Em mamíferos, várias condições ou doenças oftálmicas neurodegenerativas envolvem lesão ou degeneração de fotorreceptores. Factores tráficos capazes de promover a sobrevivência ou regeneração destes neurónios proporcionariam terapias úteis para o tratamento destas doenças.

Fotorreceptores são um subconjunto especializado de neurónios retinais, que são responsáveis pela visão. Os fotorreceptores consistem em bastonetes e cones que são as células fotossensoras da retina. Cada bastonete e cone elabora um cílio especializado, referido como um segmento externo, que aloja a maquinaria de fototransdução. Os bastonetes contêm um pigmento visual específico que absorve luz, a rodopsina. Existem três classes de cones nos humanos, caracterizados pela expressão de pigmentos visuais distintos: os pigmentos de cone de azul, cone de verde e cone de vermelho. Cada tipo de proteína de pigmento visual está sintonizada para absorver o máximo de luz a diferentes comprimentos de onda. A rodopsina dos bastonetes medeia a visão escotópica (em obscuridade), enquanto os pigmentos do cone são responsáveis pela visão fotópica (em luminosidade). Os pigmentos vermelho, azul e verde formam também a base da visão a cores humana. Os pigmentos visuais em bastonetes e cones respondem à luz e geram um potencial de acção nas células de saída, os neurónios bipolares em bastonete, que é então transmitido pelos neurónios do gânglio retinal para produzir um estímulo visual no córtex visual.

No Homem, várias doenças da retina envolvem a degeneração progressiva e a eventual morte de fotorreceptores, conduzindo inexoravelmente à cegueira. A

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 5 degeneração de fotorreceptores, tais como por distrofias retinais hereditárias (e.g., retinite pigmentosa), degeneração macular relacionada com a idade e outras maculopatias, ou deslocamento da retina, são todas caracterizadas pela atrofia e perda progressivas de função de fotorreceptores dos segmentos externos. Em adição, a morte de fotorreceptores ou a perda de função dos fotorreceptores resultam na perda parcial da qualidade de aferentes dos neurónios retinais de segunda ordem (células bipolares em bastonete e células horizontais) em pacientes com distrofias retinais, diminuindo desse modo a eficiência global da propagação do sinal eléctrico gerado por fotorreceptores. Os factores tráficos que são capazes de salvar fotorreceptores da morte celular e/ou restabelecer a função de fotorreceptores disfuncionais (atróficos ou distróficos) podem representar terapias úteis para o tratamento destas condições.

Existe alguma evidência de que certos factores proteicos podem promover a sobrevivência de fotorreceptores. Por exemplo, os fotorreceptores podem ser salvos em alguma extensão pelo factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) em ratos de Royal College of Surgeons (RCS) e em ratos albinos que tenham sofrido danos por exposição a luz constante (Faktorovich et ai, Nature, 347:83-86. 1990). Os ratos RCS têm uma mutação hereditária de um gene expresso no epitélio do pigmento retinal (RPE), que resulta na falha, por parte do RPE na fagocitose de porções continuamente soltas dos segmentos esternos de fotorreceptores e causa a degeneração do fotorreceptor e eventualmente a morte celular. Uma única injecção de bFGF no corpo vítreo ou no espaço sub-retinal, o espaço extracelular que circunda os bastonetes e cones, no início da degeneração salva, de forma transiente, os fotorreceptores (Faktorovich et ai, Nature, 347:83-86. 1990 ). No modelo com danos pela luz em ratos albinos, o bFGF injectado no espaço sub-retinal ou no corpo vítreo dois dias antes do início de iluminação constante protege de forma significativa os fotorreceptores da lesão pela luz e evita a morte celular (LaVail et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:11249-11253, 1992). Neste modelo, a sobrevivência dos fotorreceptores foi também observada com FGF ácido (aFGF), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), factor neurotráfico ciliar (CNTF), e interleucina-ΐβ (IL-1 β). Observaram-se efeitos moderados com neurotrofina-3 (NT-3), factor de crescimento semelhante a insulina II (IGF-II) e factor-alfa de necrose de tumores (TNF-alfa). O factor de crescimento de nervos (NGF), o factor de crescimento epidérmico (EGF), o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o IGF-I não tiveram efeito (LaVail et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:11249-11253, 1992). Veja-se também WO 93/15608, LaVail et ai 6 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ

Apesar de ο bFGF ser eficaz no rato RCS e nos modelos de danosTnduzidos por luz em ratos, a sua utilidade terapêutica em humanos é muito limitada, devido às suas actividades hipotensora, mitogénica e angiogénica potente. De facto, o bFGF injectado no corpo vítreo causa a invasão de macrófagos derivados do sangue na retina interna e pode produzir uma vitreo-retinopatia proliferativa massiva (Faktorovich et ai, Nature, 34L83-86, 1990). Determinou-se também que, utilizando a tecnologia da reacção em cadeia com polimerase, o ARN mensageiro para GDNF é expresso nos olhos de ratos 6 dias após o nascimento e ratos adultos, essencialmente associado à retina neural e ao epitélio do pigmento retinal. As células de RPE produzem, armazenam e transportam vários factores que são responsáveis pela sobrevivência e manutenção da função de fotorreceptores. As células de RPE são também indispensáveis para o processo de fototransdução: depuram, por fagocitose as pontas soltas dos segmentos externos de fotorreceptores e reciclam a vitamina A. A transplantação de células RPE normais em retinas de ratos RCS previne a morte celular de fotorreceptores (Li e Turner, Exp. Eye Res., 47:911-917, 1988; Mullen e LaVail, Science, 192:799-801. 1976), sugerindo a produção por células RPE de um factor tráfico difundível para fotorreceptores.

Continua a existir uma necessidade de métodos e composições terapêuticas úteis para o tratamento de lesão de células fotorreceptoras. Estes métodos e composições terapêuticas protegeriam idealmente os fotorreceptores de lesões progressivas e promoveriam a sobrevivência ou a regeneração da população de neurónios danificados, sem efeitos laterais graves.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método de tratamento de perda de visão devido a degeneração de fotorreceptores por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de produto proteico factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF). De acordo com um aspecto da invenção, proporcionam-se métodos para o tratamento de perda de visão devido a degeneração de fotorreceptores por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de produto proteico GDNF. Está contemplado que tais produtos proteicos GDNF incluirão uma proteína GDNF tal como a representada pela sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1, bem como suas variantes e derivados. A invenção baseia-se na nova verificação de que a administração de produto proteico GDNF promove a sobrevivência e a regeneração

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 7 de neurónios fotorreceptores danificados, que são a população principal de neurónios danificados nas degenerações retinais que conduzem à cegueira. O produto proteico GDNF pode ser administrado por via intra-ocular numa dose entre de cerca de 0,001 mg/dia e 10 mg/dia, preferivelmente numa dose entre cerca de 0,01 mg/dia e 1 mg/dia, e mais preferivelmente numa dose entre cerca de 0,1 mg/dia e 0,5 mg/dia. Está também contemplado que a degeneração ou lesão de fotorreceptores pode ser tratada através de administração de um produto proteico GDNF em conjunção com um segundo agente terapêutico incluindo, mas não se lhes limitando, factor neurotrófico derivado do cérebro, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, neurotrofina-6, factor de crescimento semelhante a insulina, factor neurotrófico ciliar, factores de crescimento de fibroblastos ácido e básico, factor 5 de crescimento de fibroblastos, factor β de crescimento de transformação, e transcrito regulado por cocaína-anfetamina. Está também contemplado que o meio de entrega para a administração de um produto proteico GDNF no tratamento de condições ou doenças oftálmicas possa envolver, de forma vantajosa, formulações tópicas, insertos oculares, injecção ocular, implantes oculares, terapia celular ou terapia génica. A invenção também proporciona a utilização de produto proteico GDNF no fabrico de um medicamento ou composição farmacêutica para o tratamento de lesão ou degeneração de fotorreceptores. Tais composições farmacêuticas incluem formulações de produto proteico GDNF tópicas, orais ou parentéricas. Será também notado pelos peritos na arte que o processo de administração pode ser realizado através de meios de terapia celular e terapia génica, tal como adicionalmente se descreve adiante. Em ainda outro aspecto, a presente invenção inclui um método para proporcionar células fotorreceptoras para implantação em que as células fotorreceptoras são cultivadas na presença de um produto proteico GDNF. A invenção inclui ainda uma composição que contém células fotorreceptoras juntamente com um produto proteico GDNF em quantidades que aumentam a sobrevivência e permitem o crescimento e maturação continuados das células fotorreceptoras. Numerosos aspectos e vantagens adicionais da invenção serão aparentes aos peritos na arte tendo em consideração a seguinte descrição detalhada da invenção que descreve as suas concretizações presentemente preferidas.

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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 representa o efeito de produto proteico factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF) sobre a sobrevivência de fotorreceptores em culturas de neurónios retinais. Cada valor é a média ± d.p. de três culturas. A figura 2 representa a promoção de excrescência de neurites de fotorreceptores por produto proteico GDNF. Os dados são expressos como uma representação da distribuição de frequências acumuladas dos comprimentos das neurite. É representada a percentagem de fotorreceptores (ordenadas) com neurites mais longas do que um dado comprimento em micrómetros (abcissas). A figura 3 representa a estimulação da captação de glutamato por produto proteico GDNF em culturas de fotorreceptores. Os resultados são expressos como as percentagens dos valores de captação de glutamato (em dpm/poço) encontradas nas culturas de controlo. Cada ponto de dados é a média ± d.p. de 3 poços de uma experiência representativa. A figura 4 representa a promoção da sobrevivência de fotorreceptores por produto proteico GDNF em culturas de neurónios retinais. Estão representadas as alterações no número de fotorreceptores em resposta ao tratamento com produto proteico GDNF em culturas provenientes de ratinhos de 18 dias e 39 dias de idade. Cada valor é a média ± d.p. de 2-3 culturas. A figura 5 representa a promoção da sobrevivência de fotorreceptores por produto proteico GDNF em culturas de retinas de ratinho rd/rd. A sobrevivência de fotorreceptores foi determinada por contagem do número de neurónios positivos à arrestina por poço de 6 mm. Cada valor é a média ± d.p. de 3-4 culturas. A figura 6 representa o efeito de GDNF sobre a sobrevivência de fotorreceptores em culturas de retina de pinto. A sobrevivência dos fotorreceptores foi determinada por contagem do número de cones por tiras diametrais de 6 mm quad. (representando cerca de 21% da área total de um poço de 6 mm). Cada valor é a média ± d.p. de 3 culturas.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na demonstração de que o produto proteico GDNF tem actividade neurotrófica sobre fotorreceptores. Antes desta verificação, não houve sugestões ou indicações de que o GDNF pudesse ter tal actividade neurotrófica. A presente invenção proporciona um método para o tratamento de lesão ou degeneração de neurónios retinais, em particular fotorreceptores, por administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de produto proteico factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF) por meio de uma composição farmacêutica, da implantação de células que expressam GDNF, ou através de terapia génica com o gene de GDNF. A invenção pode ser posta em prática utilizando qualquer produto proteico GDNF biologicamente activo, incluindo um GDNF com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1, suas variantes, e derivados.

Desenvolveu-se uma técnica única de cultura de célula para proporcionar as populações de neurónios retinais utilizadas para atingir a capacidade de resposta de fotorreceptores à administração de produto proteico GDNF. A técnica de cultura está descrita em maior detalhe adiante. O tratamento destes fotorreceptores com um produto proteico GDNF revelou que, em adição a promover a sobrevivência dos fotorreceptores, o produto proteico GDNF também estimulava a extensão do processo semelhante aos axónios dos fotorreceptores, demonstrando deste modo um efeito sobre o desenvolvimento morfológico dos fotorreceptores. Os ensaios de captação de glutamato demonstram adicionalmente que o tratamento com produto proteico GDNF aumenta a diferenciação funcional dos fotorreceptores. Estes resultados indicam que entre os benefícios potenciais da terapia com produto proteico GDNF se encontram a promoção da sobrevivência de fotorreceptores, a regeneração dos axónios dos fotorreceptores e segmentos externos e o restabelecimento da função visual. Assim, a administração de um produto proteico GDNF beneficiará condições em que a visão é perdida devido a degeneração de fotorreceptores, tais como degenerações retinais hereditárias, degeneração macular relacionada com a idade, degenerações retinais induzidas por lesão, e distrofias retinais. A presente invenção demonstra ainda que o tratamento com produto proteico GDNF promove a sobrevivência de fotorreceptores em culturas de retina de ratinhos com uma condição de degeneração retinal hereditária. Estudos de fotorreceptores de ratinhos rd/rd ilustraram que o tratamento com produto proteico

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ GDNF aumentou a resistência aos efeito prejudiciais da mutação rd/rd nos fotorreceptores. Isto indica que o tratamento com produto proteico GDNF será útil para reduzir e prevenir a degeneração e a morte de fotorreceptores e mesmo para inverter a degeneração de fotorreceptores em doenças retinais hereditárias humanas caracterizadas por degeneração de fotorreceptores, tais como, por exemplo, retinite pigmentosa. Tal como ilustrado pelos estudos descritos adiante, a administração de produto proteico GDNF pode beneficiar várias condições patológicas em que ocorra degeneração de fotorreceptores e seja responsável por perda de visão. Estas condições incluem degenerações retinais hereditárias tais como retinite pigmentosa, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Bassen-Kornzweig (abetalipoproteinemia), doença de Best (distrofia viteliforme), coroidemia, atrofia do girado, amaurose congénita, síndrome de Refsum, doença de Stargardt e síndrome de Usher. Outras retinopatias que podem beneficiar da administração de produto proteico GDNF incluem degeneração macular relacionada com a idade (formas seca e molhada), retinopatia diabética, vitreo-retinopatias periféricas, retinopatias fóticas, retinopatias induzidas por cirurgia, retinopatias virais (tais como retinopatia por HIV relacionada com SIDA), retinopatias isquémicas, deslocamento da retina e retinopatia traumática.

De acordo com as concretizações da presente invenção actualmente preferidas, o produto proteico GDNF é mais vantajosamente administrado por via intra-ocular numa dose entre cerca de 0,001 mg/dia e 10 mg/dia, e preferivelmente numa dose entre cerca de 0,01 mg/dia e 1 mg/dia, e mais preferivelmente numa dose entre cerca de 0,1 mg/dia e 0,5 mg/dia. Está ainda contemplado que o produto proteico GDNF seja administrado em conjunto ou combinação com uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico para o tratamento de degeneração retinal ou distrofias retinais. Estes segundos agentes terapêuticos podem incluir, mas não se lhes limitam: mitogénios tais como insulina, factores de crescimento semelhantes a insulina, factor de crescimento epidérmico, factor de crescimento vasoactivo, polipéptido activador da adenilato-ciclase pituitária, interferão e somatostatina; factores neurotróficos tais como factor neurotrófico derivado do cérebro, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, neurotrofina-6, factor de crescimento semelhante a insulina, factor neurotrófico ciliar, factores de crescimento de fibroblastos ácido e básico, factor 5 de crescimento de fibroblastos, factor β de crescimento de transformação, e transcrito regulado por cocaína-anfetamina (CART); e outros factores de crescimento tais como factor de crescimento epidérmico, factor inibidor de leucemia, interleucinas, interferões, e factores

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 11 estimulantes de colónias; bem como moléculas e materiais que ''sejam os equivalentes funcionais destes factores. A invenção também proporciona a utilização de produto proteico GDNF na preparação de um medicamento para o tratamento de lesão ou degeneração de fotorreceptores, incluindo o tratamento das doenças e condições anteriormente descritas. Estas preparações farmacêuticas de produto proteico GDNF são mais completamente descritas adiante.

Tal como aqui se utiliza, a expressão "produto proteico GDNF" inclui factor neurotrófico derivado da linha de células da glia purificado, natural, sintético ou recombinante, variantes de GDNF biologicamente activas (incluindo variantes de inserção, substituição e deleção), e seus derivados quimicamente modificados. Estão também incluídos GDNF que são substancialmente homólogos ao GDNF humano com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1. Os produtos proteicos GDNF podem existir na forma de homodímeros ou heterodímeros na sua forma biologicamente activa. A expressão "biologicamente activo", tal como aqui se utiliza, significa que o produto proteico GDNF demonstra propriedades neurotróficas semelhantes, mas não necessariamente todas as mesmas propriedades, e não necessariamente no mesmo grau, que o GDNF com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1. A selecção das propriedades neurotróficas particulares de interesse depende da utilização para a qual o produto proteico GDNF está a ser administrado. A expressão "substancialmente homólogo", tal como aqui se utiliza, significa possuindo um grau de homologia com o GDNF com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:1 que é preferivelmente superior a 70%, mais preferivelmente superior a 80%, e ainda mais preferivelmente superior a 90% ou 95%. Por exemplo, o grau de homologia entre a proteína de rato e a humana é de cerca de 93%, e está contemplado que o GDNF de mamífero preferido terá um grau de homologia igualmente elevado. A percentagem de homologia, tal como aqui descrito, é calculada como a percentagem de resíduos de aminoácido encontrados na menor das duas sequências com resíduos de aminoácido idênticos no alinhamento da sequência que se está a comparar, podendo ser introduzidos quatro hiatos num comprimento de 100 aminoácidos para auxiliar naquele alinhamento, como apresentado por Dayhoff, em Atlas of Protein Sequence and

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Structure, Vol. 5, ρ. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972). Está também incluído como substancialmente homólogo qualquer produto proteico GDNF que possa ser isolado em virtude de reactividade cruzada com anticorpos para o GDNF de SEQ ID NO:1 ou cujos genes possam ser isolados através de hibridação com o gene ou com segmentos do gene que codifica o GDNF de SEQIDNO.1.

Os produtos proteicos GDNF de acordo com a presente invenção podem ser isolados ou gerados por qualquer meio conhecido dos peritos na arte. Estão descritos métodos ilustrativos para a produção de produtos proteicos GDNF úteis na presente invenção, no Pedido de patente No. US 08/182 183 apresentado em 23 de Maio, 1994 e pedidos seus aparentados; Pedido PCT No. PCT/US92/07888 apresentado em 17 Setembro, 1992, publicado como WO 93/06116 (Lin et ai, Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture); Pedido de Patente Europeia No. 92921022.7, publicado com o número EP 610 254; e Pedido de patente No. de Série US 08/535 681 apresentado em 28 de Setembro, 1995 ("Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor"), co-propriedade, copendente.

Os produtos proteicos GDNF de ocorrência natural podem ser isolados de preparações de células neuronais de mamífero, ou de uma linha de células de mamífero que segregue ou expresse GDNF. Por exemplo, em WO93/06116 descreve-se o isolamento de GDNF a partir de meio condicionado de crescimento, isento de soro, de células de glioblastoma B49. Os produtos proteicos GDNF podem também ser sintetizados quimicamente por qualquer meio conhecido dos peritos na arte. Os produtos proteicos GDNF são preferivelmente produzidos através de técnicas recombinantes porque estas são capazes de atingir quantidades de proteína comparativamente mais elevadas com maior pureza. As formas recombinantes de produto proteico GDNF incluem formas glicosiladas e não glicosiladas da proteína, e proteína expressa em sistemas celulares bacterianos, de mamífero ou de insectos.

De um modo geral, as técnicas recombinantes envolvem o isolamento dos genes responsáveis pela codificação de GDNF, a clonagem do gene em vectores e tipos de células adequados, a modificação do gene, se necessário, para codificar uma variante desejada, e a expressão do gene de modo a produzir o produto proteico GDNF. Alternativamente, uma sequência nucleotídica que codifica o produto proteico GDNF desejado pode ser sintetizada quimicamente. Está contemplado que o produto proteico GDNF pode ser expresso utilizando

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 13 sequências nucleotídicas que diferem na utilização de códãos devido a degenerescências do código genético ou variações alélicas. Em WO93/06116 descreve-se o isolamento e a sequenciação de um clone de ADNc do gene de GDNF de rato, e o isolamento, sequenciação e expressão de um clone de ADN genómico do gene de GDNF humano. Em WO93/06116 também se descrevem vectores, células hospedeiras, e condições de crescimento em cultura para a expressão de produto proteico GDNF. São descritos vectores adequados adicionais para a expressão de produto proteico GDNF em E. coli no Pedido de Patente Europeia No. EP 0 423 980 ("Stem Cell Factor") publicado em 24 de Abril, 1991. A sequência de ADN do gene que codifica para o GDNF humano maduro e a sequência de aminoácidos do GDNF estão apresentadas na Figura 19 (SEQ ID NO:5) de WO93/06116. A Figura 19 não mostra toda a sequência de codificação para a porção pre-pro de GDNF, mas são mostrados os primeiros 50 aminoácidos de GDNF pre-pro humano na Figura 22 (SEQ ID NO:8) de WO93/06116. O GDNF de ocorrência natural é um dímero ligado por dissulfureto na sua forma biologicamente activa. O material isolado após a expressão num sistema bacteriano é essencialmente biologicamente inactivo, e existe na forma de um monómero. É necessária uma redobragem para produzir o dímero biologicamente activo ligado por dissulfureto. Estão descritos em WO93/06116 processos para a redobragem e a naturação do GDNF expresso em sistemas bacterianos. São também descritos ensaios in vitro Standard para a determinação de actividade de GDNF, em WO93/06116 e no Pedido de patente No. de Série US 08/535 681 apresentado em 28 de Setembro, 1995, co-propriedade e copendente.

A. Variantes de GDNF A expressão "variantes de GDNF ", tal como aqui se utiliza, inclui polipéptidos nos quais aminoácidos foram delecionados ("variantes de deleção"), inseridos ("variantes de adição"), ou substituídos ("variantes de substituição"), no interior da sequência de aminoácidos de GDNF de ocorrência natural. Estas variantes são preparadas introduzindo alterações apropriadas de nucleótidos no ADN que codifica o polipéptido ou através de síntese química in vitro do polipéptido desejado. Será notado pelos peritos na arte que podem ser feitas muitas combinações de deleções, inserções, e substituições desde que a molécula final possua actividade biológica de GDNF.

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 14 Técnicas de mutagénese para a substituição, inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácido seleccionados são bem conhecidas dos peritos na arte (e.g., Pat. No. US 4 518 584). Existem duas variáveis principais na construção de variantes: a localização do local da mutação e a natureza da mutação. No projecto de variantes de GDNF, a selecção do local da mutação e da natureza da mutação dependerão da(s) característica(s) do GDNF a modificar. Os locais para mutação podem ser modificados individualmente ou em séries, e.g., por (1) substituição, primeiro com escolhas de aminoácidos conservativos e depois com selecções mais radicais dependendo dos resultados atingidos, (2) deleção do resíduo de aminoácido alvo, ou (3) inserção de resíduos de aminoácido adjacentes ao local localizado. Preferem-se alterações conservativas de 1 a 20 aminoácidos. Uma vez determinada a sequência de aminoácidos do produto proteico GDNF desejado, a sequência de ácido nucleico a utilizar na expressão da proteína é prontamente determinada. As variantes de deleção N-terminal e C-terminal podem também ser geradas por enzimas proteolíticas.

Para as variantes de deleção de GDNF, as deleções variam geralmente de cerca de 1 a 30 resíduos, mais usualmente de cerca de 1 to 10 resíduos, e tipicamente de cerca de 1 to 5 resíduos contíguos. Estão contempladas deleções N-terminais, C-terminais e intra-sequências internas. As deleções podem ser introduzidas em regiões de baixa homologia com outros membros da super-família dos TGF-β para modificar a actividade do GDNF. As deleções em áreas de homologia substancial com outras sequências da super-família dos TGF-β terão maior probabilidade de modificar a actividade biológica do GDNF de modo mais significativo. O número de deleções consecutivas será seleccionado de modo a preservara estrutura terciária do produto proteico GDNF no domínio afectado, e.g., reticulação de cisteínas. Os exemplos não limitantes de variantes de deleção incluem produtos proteicos GDNF truncados, com falta de um a quarenta aminoácidos N-terminais do GDNF, ou variantes a que falta o resíduo C-terminal de GDNF, ou suas combinações, como descrito no Pedido de patente No. de Série US 08/535,681 apresentado em 28 Setembro, 1995, co-propriedade, copendente.

Para variantes de adição de GDNF, as adições na sequência de aminoácidos incluem tipicamente fusões N- e/ou C-terminais variando em comprimento de um resíduo a polipéptidos contendo cem ou mais resíduos, bem como adições intra-sequências internas de um ou múltiplos resíduos de aminoácido. As adições internas podem variar de um modo geral de cerca de 1 a 10 resíduos, mais tipicamente de cerca de 1 a 5 resíduos, e usualmente de cerca

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ de 1 a 3 resíduos de aminoácido. Os exemplos de variantes de adição N-terminal incluem o GDNF com um resíduo metionilo N-terminal (um artefacto da expressão directa de GDNF em cultura de células bacterianas recombinantes), que é designado por [Met'1]GDNF, e fusão de uma sequência de sinal N-terminal heteróloga com o terminal N de GDNF para facilitar a secreção de GDNF maduro a partir de células hospedeiras recombinantes. Tais sequências de sinal, de um modo geral, serão obtidas a partir de, e assim ser-lhes-ão homólogas, das de espécies da célula hospedeira pretendida. As adições podem também incluir sequências de aminoácidos derivadas da sequência de outros factores neurotróficos. Um produto proteico GDNF preferido para utilização de acordo com a presente invenção é o [Met'1]GDNF humano recombinante.

As variantes de substituição de GDNF têm pelo menos um resíduo de aminoácido da sequência de aminoácidos de GDNF removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. Tais variantes de substituição incluem variantes alélicas, que são caracterizadas por alterações na sequência de nucleótidos de ocorrência natural nas populações de espécies que podem ou não resultar numa alteração de aminoácidos. Exemplos de variantes de substituição (veja-se, e.g., SEQ ID NO: 50) são descritas no Pedido de patente No. de Série US 08/535 681 apresentado em 28 de Setembro, 1995, co-propriedade, copendente.

As mutações específicas da sequência de aminoácidos de GDNF podem envolver modificações num local de glicosilação (e.g., serina, treonina, ou asparagina). A ausência de glicosilação ou apenas glicosilação parcial resultam de substituição ou deleção de aminoácidos em qualquer local de reconhecimento de glicosilação ligado a asparagina ou em qualquer local da molécula que é modificado por adição de um hidrato de carbono ligado a O. Um local de reconhecimento de glicosilação ligado a asparagina compreende uma sequência tripeptídica que é especificamente reconhecida por enzimas de glicosilação celulares apropriadas. Estas sequências tripeptídicas são Asn-Xaa-Thr ou Asn-Xaa-Ser, onde Xaa pode ser qualquer aminoácido que não Pro. Várias substituições ou deleções de aminoácidos numa ou ambas as posições do primeiro ou terceiro aminoácido de um local de reconhecimento de glicosilação (e/ou deleção de aminoácidos na segunda posição) resultam em não glicosilação na sequência tripeptídica modificada. Assim, a expressão de sequências nucleotídicas alteradas apropriadas produz variantes que não são glicosiladas nesse local. Alternativamente, a sequência de aminoácidos de GDNF pode ser modificada de modo a adicionar locais de glicosilação.

Um método para identificar resíduos de aminoácido ou regiões de GDNF para mutagénese é denominado "mutagénese por pesquisa de alanina" como descrito por Cunningham e Wells (Science, 244:1081-1085, 1989). Neste método, um resíduo de aminoácido ou grupo de resíduos alvo são identificados (e.g resíduos carregados tais como Arg, Asp, His, Lys, e Glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afectar a interacção dos aminoácidos com o ambiente aquoso circundante no interior ou no exterior da célula. Estes domínios que apresentam sensibilidade funcional às substituições são então refinados por introdução de resíduos adicionais ou alternativos nos locais de substituição. Assim, é determinado o local alvo para introdução de uma variação na sequência de aminoácidos, é conduzida a mutagénese por pesquisa de alanina ou aleatória no códão ou região da sequência de ADN alvo correspondentes, e as variantes de GDNF expressas são pesquisadas quanto à combinação óptima de actividade e grau de actividade desejados.

Os locais de maior interesse para mutagénese de substituição incluem locais onde os aminoácidos encontrados em proteínas GDNF de várias espécies são substancialmente diferentes em termos do volume das cadeias laterais, da carga, e/ou hidrofobicidade. Outros locais de interesse são aqueles em que resíduos particulares de proteínas semelhantes a GDNF, obtidas de várias espécies, são idênticos. Estas posições são geralmente importantes para a actividade biológica de uma proteína. Inicialmente, estes locais são substituídos de uma maneira relativamente conservativa. Estas substituições conservativas estão mostradas na Tabela 1 na coluna com o título substituições preferidas. Se estas substituições resultarem numa alteração na actividade biológica, então são introduzidas alterações mais substanciais (substituições ilustrativas), e/ou podem ser feitas outras adições ou deleções, e os produtos resultantes são pesquisados quanto à actividade. (Segue Tabela 1)

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 17 TABELA 1

Substituições de Aminoácidos Resíduo Substituições Substituições ilustrativas original preferidas Ala (A) Vai Vai; Leu; lie Arg (R) Lys Lys; Gin; Asn Asn (N) Gin Gin; His; Lys; Arg Asp (D) Glu Glu Cys (C) Ser Ser Gin (Q) Asn Asn Glu (E) Asp Asp Gly(G) Pro Pro His (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg lie (I) Leu Leu; Vai; Met; Ala; Phe; norleucina Leu (L) lie norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gin; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; lie Phe (F) Leu Leu; Vai; lie; Ala Pro (P) Gly Gly Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Vai (V) Leu He; Leu; Met; Phe; Ala; norleucina

Espera-se que modificações conservativas na sequência de aminoácidos (e as correspondentes modificações nas sequências de ácido nucleico codificantes) produzam produtos proteicos GDNF com características funcionais e químicas similares às do GDNF natural. Em contraste, modificações substanciais nas características funcionais e/ou químicas dos produtos proteicos GDNF podem ser realizadas seleccionando substituições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura do esqueleto polipeptídico na área da substituição, por exemplo, na forma de uma conformação em folha ou hélice, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) do volume da cadeia 18 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ lateral. Os resíduos de ocorrência natural dividem-se em grupos com base em propriedades comuns da cadeia lateral: 1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, lie; 2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr; 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básicos: Asn, Gin, His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

As substituições não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma destas classes por um de outra. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões da proteína GDNF que são homólogas de outras proteínas da super-família do TGF-β, ou nas regiões não homólogas da molécula.

B. Derivados de GDNF

Os derivados de GDNF ou variantes de GDNF quimicamente modificados podem ser preparados por um perito na arte dada a presente descrição. As porções químicas mais adequadas para derivatização incluem polímeros solúveis em água. Um polímero solúvel em água é desejável porque a proteína à qual é ligado não precipita num ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. Preferivelmente, o polímero será farmaceuticamente aceitável para a preparação de um produto ou composição terapêuticos. Um perito na arte será capaz de seleccionar o polímero desejado com base em considerações como se será utilizado terapeuticamente o conjugado polímero/proteína, e se assim for, a dosagem desejada, o tempo de circulação, a resistência à proteólise, e outras considerações. A eficácia da derivatização pode ser determinada por administração do derivado, na forma desejada (i.e., por bomba osmótica, ou, mais preferivelmente, por injecção ou infusão, ou, ainda formulado para vias de entrega oral, pulmonar ou outras vias), e determinação da sua eficácia.

Os polímeros solúveis em água adequados incluem, mas não se lhes limitam, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinilpirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (e.g., glicerol),

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 19 poli(álcool vinílico), e suas misturas. O polietilenoglicolpropionaldeído pode ter vantagens no fabrico devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ter qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. Para o polietilenoglicol, são preferidas gamas de peso molecular de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa para facilidade de manuseamento e fabrico (a expressão "cerca de" indica que em preparações de polietilenoglicol, algumas moléculas terão maior peso, e algumas menor peso, do que o peso molecular indicado). Podem ser utilizados outros tamanhos, dependendo do perfil terapêutico desejado (e.g., a duração da libertação sustentada desejada, os efeitos, se existirem, sobre a actividade biológica, a facilidade de manuseamento, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietilenoglicol sobre uma proteína ou variante terapêuticas). O número de moléculas de polímero assim ligadas pode variar, e um perito na arte será capaz de determinar o efeito sobre a função. Pode-se mono-derivatizar, ou pode-se proporcionar uma di-, tri-, tetra- ou qualquer combinação de derivatização, com porções químicas iguais ou diferentes (e.g., polímeros, tais como diferentes pesos de polietilenoglicóis). A proporção de moléculas de polímero para moléculas de proteína (ou péptido) variará, tal como variarão as suas concentrações na mistura reaccional. Em geral, a razão óptima (em termos de eficiência de reacção, na medida em que não existam excessos de proteína ou polímero que não reajam) será determinada por factores tais como o grau de derivatização desejado (e.g., mono-, di-, tri-, etc.), o peso molecular do polímero seleccionado, se o polímero é ramificado ou não ramificado, e as condições reaccionais.

As moléculas de polietilenoglicol (ou outras porções químicas) deverão ser ligadas à proteína tendo em consideração efeitos sobre domínios funcionais ou antigénicos da proteína. Existem vários métodos de ligação disponíveis aos peritos na arte. Veja-se por exemplo, EP 0 401 384 (acoplamento de PEG a G-CSF), veja-se também Malik et al., Exp. Hematol., 20:1028-1035, 1992 (que relata a ligação a PEG (“pegilação”) de GM-CSF utilizando cloreto de tresilo). Por exemplo, o polietilenoglicol pode ser ligado de forma covalente a resíduos de aminoácido através de um grupo reactivo, tal como, um grupo amino ou carboxilo livres. Os grupos reactivos são aqueles aos quais pode ser ligada uma molécula de polietilenoglicol activada. Os resíduos de aminoácido com um grupo amino livre podem incluir resíduos lisina e. o resíduo de aminoácido N-terminal. Os que

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 20 possuem um grupo carboxilo livre podem incluir resíduos ácido aspártico, resíduos ácido glutâmico, e o resíduo de aminoácido C-terminal. Podem também ser utilizados grupos sulfidrilo como grupo reactivo para a ligação da(s) molécula(s) de polietilenoglicol. Para fins terapêuticos, prefere-se a ligação num grupo amino, tal como a ligação no terminal N ou no grupo lisina. A ligação em resíduos importantes para a ligação a receptores deve ser evitada se for desejada a ligação aos receptores.

Pode-se desejar especificamente uma proteína quimicamehte modificada no terminal N. Utilizando polietilenoglicol como ilustração das presentes composições, pode-se seleccionar de entre várias moléculas de polietilenoglicol (por peso molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculas de polietilenoglicol para moléculas de proteína (ou péptido) na mistura reaccional, o tipo de reacção de ligação de PEG a realizar, e o método de obtenção da proteína com PEG ligado no terminal N seleccionada. O método de obtenção da preparação ligada a PEG no terminal N (i.e., separação desta porção de outras porções com mono-ligação a PEG se necessário) pode ser por purificação do material ligado a PEG no terminal N da população das moléculas de proteína ligadas a PEG. A modificação química selectiva no terminal N pode ser conseguida por alquilação redutora que explora a reactividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus o terminal N) disponíveis para derivatização numa proteína particular. Sob as condições reaccionais apropriadas, é conseguida a derivatização substancialmente selectiva da proteína no terminal N com um polímero contendo um grupo carbonilo. Por exemplo, pode-se ligar o PEG selectivamente no terminal N da proteína realizando a reacção a um pH que permita tirar vantagem das diferenças de pKa entre o grupo ε-amino dos resíduos lisina e o do grupo <x-amino do resíduo N-terminal da proteína. Através desta derivatização selectiva, é controlada a ligação de um polímero solúvel em água a uma proteína: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal N da proteína e não ocorre modificação significativa de outros grupos reactivos, tais como grupos amino da cadeia lateral da lisina. Utilizando alquilação redutora, o polímero solúvel em água pode ser do tipo descrito anteriormente, e deverá ter um único aldeído reactivo para acoplamento à proteína. Pode ser utilizado polietilenoglicolpropionaldeído contendo um único aldeído reactivo. A presente invenção contempla a utilização de derivados que são, GDNF ou suas variantes, expressos em procariotas, ligados a pelo menos uma molécula de

85 502 ΕΡ Ο 863 766/ΡΤ 21 polietilenoglicol, bem como a utilização de GDNF, ou suas variantes, ligados a uma ou mais moléculas de polietilenoglicol através de uma ligação acilo ou alquilo. A ligação a PEG pode ser realizada através de qualquer das reacções para ligação a PEG conhecidas na arte. Veja-se, por exemplo: Focus on Growth Factors, 3(2):4-10,1992; EP 0 154 316 cuja descrição é aqui incorporada por referência; EP 0 401 384; e as outras publicações aqui citadas que se referem a ligação de PEG. A ligação a PEG pode ser realizada através de uma reacção de acilação ou uma reacção de alquilação com uma molécula reactiva de polietilenoglicol (ou um polímero reactivo análogo solúvel em água). A ligação a PEG por acilação envolve geralmente a reacção de um derivado éster activo de polietilenoglicol com a proteína GDNF ou variante. Qualquer molécula de PEG reactiva, conhecida ou subsequentemente identificada, pode ser utilizada para realizar a ligação de PEG à proteína GDNF ou à variante. Um éster de PEG activado preferido é o PEG esterificado em N-hidroxissuccinimida. Tal como aqui se utiliza, "acilação" pretende incluir, sem limitação, os seguintes tipos de ligações entre a proteína terapêutica e um polímero solúvel em água tal como PEG: amida, carbamato, uretano, e semelhantes. Veja-se Bioconjugate Chem., 5:133-140, 1994. As condições reaccionais podem ser seleccionadas a partir de quaisquer das conhecidas na arte da ligação a PEG ou subsequentemente desenvolvidas, mas devem-se evitar condições de temperatura, solventes, e pH que inactivem o GDNF ou a variante a modificar. A ligação a PEG por acilação resultará geralmente numa proteína GDNF ou variante com poli-ligações a PEG. Preferivelmente, a ligação de junção será uma ligação peptídica. Também preferivelmente, o produto resultante terá substancialmente apenas (e.g., >95%) mono-ligação, di- ou tri-ligações a PEG. Contudo, algumas espécies com graus superiores de ligações a PEG podem ser formadas em quantidades que dependem das condições reaccionais específicas utilizadas. Se desejado, podem ser separadas da mistura espécies com ligação a PEG mais purificadas, em particular espécies que não reagiram, por técnicas de purificação Standard, incluindo, entre outras, diálise, dessalinização, ultrafiltração, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel e electroforese. A ligação a PEG por alquilação envolve geralmente a reacção de um aldeído terminal derivado de PEG com a proteína GDNF ou a variante, na presença de um agente redutor. A ligação a PEG por alquilação pode também resultar numa

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ proteína GDNF ou variante com poli-ligações a PEG. Em adição, podem-se manipular as condições reaccionais de modo a favorecer a ligação do PEG substancialmente apenas no grupo a-amino do terminal N da proteína GDNF ou da variante (i.e., uma proteína com mono-ligação a PEG). Em qualquer dos casos, de mono-ligação ou poli-ligações a PEG, os grupos PEG são preferivelmente ligados à proteína através de um grupo -CH2-NH-. Com particular referência ao grupo -CFfe-, este tipo de ligação é aqui referido como uma ligação de "alquilo". A derivatização através de alquilação redutora para produzir um produto com mono-ligação a PEG explora a reactividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina versus o terminai N) disponíveis para derivatização. A reacção é realizada a um pH que permite tirar vantagem das diferenças de pKa entre os grupos s-amino dos resíduos lisina e o do grupo α-amino do resíduo do terminal N da proteína. Através desta derivatização selectiva, é controlada a ligação de um polímero solúvel em água que contém um grupo reactivo tal como um aldeído, a uma proteína: a conjugação com o polímero ocorre predominantemente no terminal N da proteína e não ocorre modificação significativa de outros grupos reactivos, tais como os grupos amino da cadeia lateral da lisina. Num aspecto importante, a presente invenção contempla a utilização de uma preparação substancialmente homogénea de moléculas de conjugado monopolímero/proteína GDNF (ou variante) (significando a proteína GDNF ou variante à qual uma molécula de polímero foi ligada substancialmente apenas numa única localização (i.e., >95%)). Mais especificamente, se for utilizado polietilenoglicol, a presente invenção também abrange a utilização de proteína GDNF ou variante ligada a PEG possivelmente com falta de grupos de ligação antigénicos, e possuindo a molécula de polietilenoglicol, directamente acoplada à proteína GDNF ou variante.

Assim, está contemplado que produtos proteicos GDNF para utilização de acordo com a presente invenção possam incluir proteína GDNF ou variantes com ligação a PEG, em que o(s) grupo(s) PEG é (são) ligado(s) através de grupos acilo ou alquilo. Tal como anteriormente discutido, estes produtos podem ter mono-ligação ou poli-ligações a PEG (e.g., contendo 2-6, e preferivelmente 2-5, grupos PEG). Os grupos PEG são geralmente ligados à proteína nos grupos a- ou ε-amino de aminoácidos, mas está também contemplado que os grupos PEG possam estar ligados a qualquer grupo amino da proteína, que seja suficientemente reactivo para se ligar a um grupo PEG em condições reaccionais adequadas. 23 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ

As moléculas de polímero utilizadas tanto na abordagem de acilação como na de alquilação podem ser seleccionadas de entre polímeros solúveis em água tal como anteriormente descrito. O polímero seleccionado deverá ser modificado de modo a possuir um único grupo reactivo, tal como um éster activo para acilação ou um aldeído para alquilação, preferivelmente, de modo a que o grau de polimerização possa ser controlado tal como proporcionado nos presentes métodos. Um exemplo de aldeído de PEG reactivo é o polietilenoglicolpropionaldeído, que é estável em água, ou seus derivados mono-alcoxi C1-C10 ou ariloxi (veja-se, Pat. No. US 5 252 714). O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. Para as reacções de acilação, o(s) polímero(s) seleccionado(s) deve(m) possuir um único grupo éster reactivo. Para a presente alquilação redutora, o(s) polímero(s) seleccionado(s) deve(m) possuir um único grupo aldeído reactivo. Geralmente, o polímero solúvel em água não será seleccionado de entre os resíduos glicosilo de ocorrência natural uma vez que estes são usualmente mais convenientemente preparados através de sistemas de expressão recombinantes de mamífero. O polímero pode ter qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado.

Um polímero solúvel em água particularmente preferido para utilização na invenção é o polietilenoglicol. Tal como aqui se utiliza, polietilenoglicol pretende englobar qualquer das formas de PEG que foram utilizadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono-alcoxi(CrCio)- ou ariloxi-polietilenoglicol.

Em geral, a derivatização química pode ser realizada sob qualquer condição adequada utilizada para fazer reagir uma substância biologicamente activa com uma molécula activada de polímero. Os métodos para a preparação de proteína GDNF, ou variante, ligada a PEG compreenderão geralmente os passos de (a) reacção de uma proteína GDNF ou variante com polietilenoglicol (tal como um éster ou aldeído reactivos derivados de PEG) sob condições nas quais a proteína se liga a um ou mais grupos PEG, e (b) obtenção do(s) produto(s) da reacção. Em geral, as condições reaccionais óptimas para as reacções de acilação serão determinadas, caso a caso, com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado. Por exemplo, quanto maior a razão de PEG:proteína, maior a percentagem de produto com poli-ligações a PEG. A alquilação redutora para produzir uma população substancialmente homogénea de molécula de conjugado mono-polímero/proteína GDNF (ou variante) compreenderá geralmente os passos de: (a) reacção de uma proteína GDNF ou I 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 24

variante com uma molécula de PEG reactiva sob condições de alquilação redutora, a um pH adequado para permitir a modificação selectiva do grupo α-amino no terminal amino da referida proteína GDNF ou variante; e (b) obtenção do(s) produto(s) da reacção.

Para uma população substancialmente homogénea de moléculas de conjugado mono-polímero/proteína GDNF (ou variante), as condições reaccionais da alquilação redutora são as que permitem a ligação selectiva da porção de polímero solúvel em água ao terminal N da proteína GDNF ou variante. Estas condições reaccionais geralmente proporcionam diferenças de pKa entre os grupos amino da lisina e o grupo α-amino no terminal N (sendo o pKa o pH ao qual 50% dos grupos amino estão protonados e 50% não estão). O pH também afecta a razão de polímero para proteína a utilizar. Em geral, se o pH é inferior, será desejado um maior excesso de polímero para proteína (i.e., quanto menos reactivo o grupo α-amino N-terminal, mais polímero é necessário para atingir as condições óptimas). Se o pH é superior, a razão polímero.proteína necessária não será tão grande (i.e., estão disponíveis mais grupos reactivos, de modo que são necessárias menos moléculas de polímero). Para os fins da presente invenção, o pH cairá geralmente dentro da gama de 3-9, preferivelmente 3-6.

Outra consideração importante é o peso molecular do polímero. Em geral, quanto maior o peso molecular do polímero, menos moléculas de polímero podem ser ligadas à proteína. De modo semelhante, a ramificação do polímero deve ser tomada em consideração quando se optimizam estes parâmetros. Geralmente, quanto maior o peso molecular (ou quanto mais ramificações) maior a razão polímero:proteína. Em geral, para as reacções de ligação a PEG aqui contempladas, o peso molecular médio preferido é de cerca de 2 kDa a cerca de 100 kDa. O peso molecular médio preferido é de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, em particular preferivelmente de cerca de 12 kDa a cerca de 25 kDa. A razão de polímero solúvel em água para proteína GDNF ou variante estará geralmente na gama de 1:1 a 100:1, preferivelmente (para poli-ligações a PEG) de 1:1 a 20:1 e (para mono-ligação a PEG) de 1:1 a 5:1.

Utilizando as condições anteriormente indicadas, a alquilação redutora proporcionará a ligação selectiva do polímero a qualquer proteína GDNF ou variante com um grupo α-amino no terminal amino, e proporcionará uma preparação substancialmente homogénea de conjugado monopolímero/proteína GDNF (ou variante). A expressão "conjugado monopolímero/proteína GDNF (ou 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 25

variante) " é aqui utilizada para significar uma composição constituída por uma única molécula de polímero ligada a uma molécula de proteína GDNF ou proteína variante de GDNF. O conjugado monopolímero/proteína GDNF (ou variante) terá preferivelmente uma molécula de polímero localizada no terminal N, mas não em grupos amino laterais da lisina. A preparação terá preferivelmente mais que 90% de conjugado monopolímero/proteína GDNF (ou variante), e mais preferivelmente mais de 95% de conjugado monopolímero/proteína GDNF (ou variante), sendo o restante das moléculas observáveis moléculas que não reagiram (i.e., proteína sem a porção de polímero).

Para a presente alquilação redutora, o agente redutor deverá ser estável em solução aquosa e preferivelmente ser capaz de reduzir apenas a base de Schiff formada no processo inicial de alquilação redutora. Os agentes redutores preferidos podem ser seleccionados de entre boro-hidreto de sódio, cianoboro-hidreto de sódio, dimetilamina-borano, trimetilamina-borano e piridina-borano. Um agente redutor particularmente preferido é o cianoboro-hidreto de sódio. Outros parâmetros reaccionais, tais como solventes, tempos de reacção, temperaturas, etc., e meios de purificação de produtos, podem ser determinados caso a caso com base em informação publicada relacionada com derivatização de proteínas com polímeros solúveis em água (vejam-se as publicações anteriormente citadas).

C. Composições farmacêuticas de produto proteico GDNF

As composições farmacêuticas de produto proteico GDNF incluem tipicamente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um produto proteico GDNF em mistura com um ou mais materiais de formulação farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis. Os materiais de formulação adequados incluem, mas não se lhes limitam, antioxidantes, conservantes, corantes, aromatizantes e agentes de diluição, agentes emulsionantes, agentes de suspensão, solventes, cargas, agentes avolumantes, tampões, veículos de entrega, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. Por exemplo, um veículo adequado pode ser água para injecção, solução salina fisiológica, ou CSF artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parentérica. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são exemplos adicionais de veículos. O solvente principal num veículo pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Em adição, o veículo pode conter outros excipientes farmaceuticamente 26 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ aceitáveis para modificação ou manutenção do pH, osmolaridade, viscosidade, limpidez, cor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução, ou odor da formulação. De modo semelhante, o veículo pode conter ainda outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis para modificação ou manutenção da taxa de libertação de produto proteico GDNF, ou para a promoção da absorção ou da penetração de produto proteico GDNF através das membranas do olho. Estes excipientes são as substâncias usualmente e normalmente empregues em dosagens formuladas para administração parentérica quer na forma de dose unitária quer de doses múltiplas.

Uma vez formulada a composição terapêutica, esta pode ser armazenada em ampolas estéreis na forma de uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, ou pó desidratado ou liofilizado. Estas formulações podem ser armazenadas quer numa forma pronta para utilizar quer numa forma, e.g., liofilizada, que requeira reconstituição antes da administração.

As formulações farmacêuticas óptimas serão determinadas por um perito na arte dependendo de considerações tais como a via de administração e a dosagem desejada. Veja-se por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) páginas 1435-1712. Tais formulações podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de libertação in vivo, e a taxa de depuração in vivo das presentes proteínas GDNF, variantes e derivados.

Outras formas de administração eficazes, tais como formulações parentéricas de libertação lenta, nebulizações para inalação, ou formulações oralmente activas, são também contempladas. Por exemplo, numa formulação de libertação sustentada, o produto proteico GDNF pode ser ligado ou incorporado em preparações em partículas de compostos poliméricos (tais como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), etc.) ou em lipossomas. Pode também ser utilizado ácido hialurónico, e este pode ter o efeito de promover a duração sustentada na circulação. A composição farmacêutica de produto proteico GDNF também pode ser formulada para administração parentérica, e.g., por infusão ou injecção intra-oculares, e pode também incluir formulações de libertação lenta ou sustentada na circulação. Tais composições terapêuticas administradas por via parentérica são tipicamente na forma de uma solução aquosa isenta de pirogénios, parentericamente aceitável, compreendendo o produto proteico GDNF num veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo preferido é água destilada estéril.

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Estão também contempladas certas formulações contendo produto proteico GDNF para administração oral. O produto proteico GDNF que é administrado deste modo pode ser encapsulado e pode ser formulado com ou sem os transportadores normalmente utilizados na composição de formas de dosagem sólidas. A cápsula pode ser concebida para libertação da porção activa da formulação no ponto do tracto gastrointestinal em que é maximizada a biodisponibilidade e é minimizada a degradação pré-sistémica. Podem ser incluídos excipientes adicionais para facilitar a absorção de produto proteico GDNF. Podem também ser empregues diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes desintegrantes de comprimidos, e aglutinantes. A formulação de preparações tópicas oftálmicas, incluindo soluções, suspensões e unguentos oftálmicos, é bem conhecida dos peritos na arte (veja-se Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, Capítulo 86, páginas 1581-1592, Mack Publishing Company, 1990). Estão disponíveis outros modos de administração, incluindo injecções intra-câmara (que podem ser realizadas directamente na câmara anterior ou directamente na câmara vítrea), injecções subconjunctiva e injecções retrobulbares, e são também bem conhecidos métodos e meios para a produção de preparações oftálmicas adequadas para estes modos de administração.

Tal como utilizado neste pedido de patente, "extra-ocular" refere-se à superfície ocular e ao espaço (externo) entre o globo ocular e a pálpebra. Exemplos de regiões extra-oculares incluem o fórnix da pálpebra ou “cul-de-sac”, a superfície conjuntiva e a superfície corneana. Esta localização é externa a todo o tecido ocular e não é necessário um procedimento invasivo para aceder a esta região. Os exemplos de sistemas extra-oculares incluem insertos e gotas, geles ou unguentos, aplicados “topicamente”, que podem ser utilizados para entregar o material terapêutico nestas regiões. Os dispositivos extra-oculares são geralmente facilmente removíveis, mesmo pelo paciente.

As patentes seguintes descrevem sistemas extra-oculares que são utilizados para administrar drogas às regiões extra-oculares. Higuchi et al. descrevem nas Pat. Nos. US 3 981 303, 3 986 510 e 3 995 635, um inserto ocular biodegradável que contém uma droga. O inserto pode ser feito em diferentes formatos para retenção no “cul-de-sac” do globo ocular, o espaço extra-ocular entre o globo ocular e a pálpebra. São descritos vários polímeros biocompatíveis comuns como adequados para utilização no fabrico deste dispositivo. Estes polímeros incluem

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 28 alginato de zinco, poli(ácido láctico), poli(álcool vinílico), poli(anidridos) e poli(ácido glicólico). As patentes descrevem também dispositivos revestidos de membranas com permeação reduzida à droga e câmaras ocas que retêm a formulação de droga.

Theeuwes, Pat. No. US 4 217 898, descreve reservatórios microporosos que são utilizados para entrega controlada de drogas. Estes dispositivos são colocados extra-ocularmente no “cul-de-sac” ocular. Entre os sistemas poliméricos de interesse estão copolímeros de poli(cloreto de vinilo)-co-poli(acetato de vinilo). Kaufman descreve nas Pat. Nos. US 4 865 846 e 4 882 150 um sistema oftálmico de entrega de drogas que contém pelo menos um material bio-erodível ou transportador para unguento para o saco conjunctivo. A patente descreve sistemas poliméricos, tais como de poli(lactido), poli(glicolído), poli(álcool vinílico) e colagénio reticulado como sistemas de entrega adequados.

Na utilização presentemente descrita do produto proteico GDNF no tratamento de doença ou lesão retinal é também vantajoso que uma formulação oftálmica aplicada topicamente inclua um agente para promover a penetração ou o transporte do agente terapêutico para o olho. Tais agentes são conhecidos na arte. Por exemplo, Ke et ai, Pat. No. US 5 221 696 descrevem a utilização de materiais para potenciar a penetração de preparações oftálmicas através da córnea.

Os sistemas intra-oculares são os sistemas que são adequados para utilização em qualquer compartimento de tecido no interior, entre ou em tomo das camadas de tecido do próprio olho. Estas localizações incluem a subconjunctiva (sob a membrana mucosa ocular adjacente ao globo ocular), a orbital (por detrás do globo ocular), e a intra-câmaras (no interior das câmaras do próprio globo ocular). Em contraste com os sistemas extra-oculares, é necessário um procedimento invasívo que consiste em injecção ou implantação, para aceder a éstas regiões.

As seguintes patentes descrevem dispositivos intra-oculares. Wong, Pat. U.S. No. 4 853 224, descreve drogas microencapsuladas para introdução na câmara do olho. Os polímeros que são utilizados neste sistema incluem poliésteres e poliéteres. Lee, Pat. No. US 4 863 457, descreve um dispositivo biodegradável que é implantado cirurgicamente, intra-ocularmente, para a libertação sustentada de agentes terapêuticos. O dispositivo é concebido para implantação cirúrgica sob a conjuntiva (membrana mucosa do globo ocular). Krezancaki, Pat. U.S. No. 4 188 373, descreve um veículo farmacêutico que forma um gel à temperatura 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 29

corporal humana. Este veículo consiste numa suspensão aquosa da droga e gomas ou derivados sintéticos derivados de celulose. Haslam et al. descrevem nas Pat. Números US 4 474 751 e 4 474 752, um sistema polímero-droga que é líquido à temperatura ambiente e forma geles à temperatura corporal. Os polímeros adequados utilizados neste sistema incluem polioxietileno e polioxipropileno. Davis et al. descrevem em US 5 384 333 um polímero de entrega de drogas biodegradável e injectável que proporciona libertação de drogas de longo termo. A composição de droga é constituída por um agente farmaceuticamente activo numa matriz polimérica biodegradável, onde a matriz poiimérica é um sólido a temperaturas na gama de 20°C a 37°C, e é fluida a temperaturas na gama de 38°C a 52°C. O polímero de entrega de drogas não se limita à entrega de formulações de droga solúveis ou líquidas. Por exemplo, o polímero pode ser utilizado como uma matriz para a estabilização e retenção no local da injecção, de microesferas, lipossomas contendo a droga ou drogas ligadas a outras partículas. É um veículo particularmente adequado para injecção intra-ocular a água estéril destilada em que o produto proteico GDNF é formulado na forma de uma solução isotónica estéril, conservada de modo adequado. Ainda outra preparação oftálmica pode envolver a formulação do produto proteico GDNF com um agente, tal como microesferas ou lipossomas injectáveis, que proporcionam a libertação lenta ou sustentada da proteína que pode então ser entregue na forma de uma injecção de depósito. Outros meios adequados para a introdução intra-ocular do produto proteico GDNF incluem, dispositivos de entrega de drogas implantáveis que contêm o produto proteico GDNF.

As preparações oftálmicas da presente invenção, em particular preparações tópicas, podem incluir outros componentes, por exemplo conservantes, agentes de tonicidade, co-solventes, agentes molhantes, agentes complexantes, agentes tamponantes, antimicrobianos, antioxidantes e tensioactivos, oftalmicamente aceitáveis, como são bem conhecidos na arte. Por exemplo, os agentes potenciadores de tonicidade adequados incluem halogenetos de metais alcalinos (preferivelmente cloreto de sódio ou de potássio), manitol, sorbitol e semelhantes. É vantajosa mente adicionado suficiente agente potenciador de tonicidade para que a formulação que vai ser instilada no olho seja hipotónica ou substancialmente isotónica. Os conservantes adequados incluem, mas não se lhes limitam, cloreto de benzalcónio, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico e semelhantes. Pode também ser utilizado peróxido de hidrogénio como conservante. Os co-solventes adequados incluem, mas não se lhes limitam, 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 30

glicerina, propilenoglicol e polietilenoglicol. Os agentes complexantes adequados incluem cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina. Os agentes tensioactivos ou molhantes adequados incluem, mas não se lhes limitam, ésteres de sorbitano, polisorbatos tais como polisorbato 80, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapol e semelhantes. Os tampões podem ser tampões convencionais tais como borato, citrato, fosfato, bicarbonato ou Tris-HCI.

Os componentes da formulação estão presentes em concentrações que sejam aceitáveis para o local de administração extra-ocular ou intra-ocular. Por exemplo, os tampões são utilizados para manter a composição a um pH fisiológico ou a um pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro da gama de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

Componentes de formulação adicionais podem incluir materiais que proporcionem uma residência ocular prolongada do agente terapêutico administrado extra-ocularmente de modo a maximizar o contacto tópico e promover a absorção. Os materiais adequados incluem polímeros ou materiais que formam geles, que proporcionam viscosidade aumentada à preparação oftálmica. O Chitosan é um material particularmente adequado como agente de controlo da taxa de libertação ocular em formulações oftálmicas líquidas de libertação sustentada da droga (veja-se US 5 422 116, Yen, et ai). A adequabilidade das formulações da presente invenção para libertação controlada (e.g., entrega sustentada e prolongada) de um agente de tratamento oftálmico no olho pode ser determinada através de vários procedimentos conhecidos na arte, e.g., como descrito em Journal ofControlled Release, 6:367-373, 1987, bem como suas variações.

Ainda outra preparação oftálmica pode envolver uma quantidade eficaz de produto proteico GDNF numa mistura com excipientes não tóxicos oftalmicamente aceitáveis que são adequados para o fabrico de comprimidos. Dissolvendo os comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, podem ser preparadas soluções oftálmicas na forma de doses unitárias. Os excipientes adequados incluem, mas não se lhes limitam, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose, ou fosfato de cálcio; ou agentes aglutinantes, tais como amido, gelatina, ou goma arábica; ou agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico, ou talco.

D. Administracão/Entreqa de produto proteico GDNF O produto proteico GDNF pode ser administrado por via parentérica através de uma via subcutânea, intramuscular, intravenosa, transpulmonar, transdérmica, intratecal ou intracerebral. Para o tratamento de condições oftálmicas, o produto proteico GDNF pode ser também administrado de modo vantajoso, por via extra-ocular ou intra-ocular, como anteriormente descrito, por aplicação tópica, insertos, injecção, implantes, terapia celular ou terapia génica. Por exemplo, implantes de libertação lenta contendo o factor neurotrófico embebido numa matriz de polímero biodegradável podem entregar o produto proteico GDNF. O produto proteico GDNF pode ser administrado extra-cerebralmente numa forma que tenha sido modificada quimicamente ou revestida de modo a passar a barreira hematoencefálica, ou pode ser administrado em conjunção com um ou mais agentes capazes de promover a penetração do produto proteico GDNF através da barreira. De modo semelhante, o produto proteico GDNF pode ser administrado intra-ocularmente, ou pode ser administrado extra-ocularmente em conjunção com um ou mais agentes capazes de promover a penetração ou o transporte do produto proteico GDNF através das membranas do olho. A frequência das doses dependerá dos parâmetros farmacocinéticos do produto proteico GDNF tal como formulado, e da via de administração. A dose específica pode ser calculada de acordo com considerações relativas ao peso corporal, à área da superfície corporal ou ao tamanho do órgão. O refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para o tratamento envolvendo cada uma das formulações anteriormente mencionadas é feito de modo rotineiro pelos peritos na arte e está no âmbito das tarefas de rotina realizadas, especialmente com vista na informação sobre dosagem e ensaios aqui descritos. As dosagens apropriadas podem ser determinadas através de utilização dos ensaios estabelecidos para a determinação de dosagens utilizados em conjunto com dados apropriados de resposta à dose. De acordo com as concretizações presentemente preferidas da presente invenção, o produto proteico GDNF é de forma mais vantajosa administrado por via intra-ocular numa dose entre cerca de 0,001 mg/dia e 10 mg/dia, e preferivelmente numa dose entre cerca de 0,01 mg/dia e 1 mg/dia, e mais preferivelmente numa dose entre cerca de 0,1 mg/dia e 0,5 mg/dia. Os peritos na arte notarão que a dosagem utilizada em formulações administradas intra-ocularmente será minúscula em comparação com a utilizada numa injecção sistémica ou administração oral.

0 regime de dosagem final envolvido num método para o tratamento das condições anteriormente descritas será determinado pelo médico assistente, considerando vários factores que modificam a acção de drogas, e.g., a idade, a condição, o peso corporal, o sexo e a dieta do paciente, a gravidade de qualquer infecção, o tempo de administração e outros factores clínicos. À medida que forem conduzidos estudos, mais informação emergirá relativamente aos níveis de dosagem apropriados para o tratamento de várias doenças e condições.

Prevê-se que a administração contínua ou a entrega sustentada de GDNF pode ser vantajosa para um dado tratamento. Embora a administração contínua possa ser realizada através de um meio mecânico, tal como com uma bomba de infusão, é contemplado que outros modos de administração contínua ou praticamente contínua possam ser praticados. Por exemplo, derivatização química ou encapsulação podem resultar em formas de libertação sustentada da proteína que tenham o efeito de presença contínua, em quantidades previsíveis, com base num determinado regime de dosagem. Assim, os produtos proteicos GDNF incluem proteínas derivatizadas ou de outro modo formuladas para efectuar uma tal administração contínua. A terapia celular com produto proteico GDNF, e.g., implantação intra-ocular de células que produzem o produto proteico GDNF, está também contemplada. Esta concretização envolveria a implantação nos pacientes de células capazes de sintetizar e segregar uma forma biologicamente activa de produto proteico GDNF. Estas células produtoras de produto proteico GDNF podem ser células que são produtores naturais de produto proteico GDNF (análogas às células de glioblastoma B49) ou podem ser células recombinantes cuja capacidade para produzir produto proteico GDNF foi aumentada por transformação com um gene que codifica o produto proteico GDNF desejado num vector adequado para a promoção da sua expressão e secreção. De modo a minimizar uma potencial reacção imunológica nos pacientes a que é administrado o produto proteico GDNF de uma espécie estranha, prefere-se que as células naturais que produzem produto proteico GDNF sejam de origem humana e produzam um produto proteico GDNF humano. Do mesmo modo, prefere-se que as células recombinantes que produzem o produto proteico GDNF sejam transformadas com um vector de expressão contendo um gene que codifica um produto proteico GDNF humano. As células implantadas podem ser encapsuladas para evitar a infiltração de tecido envolvente. As células animais, humanas ou não humanas, podem ser implantadas em pacientes sob 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 33 €h-i

revestimentos poliméricos semi-permeáveis biocompatíveis, ou membranas, que permitam a libertação do produto proteico GDNF mas que evitem a destruição das células pelo sistema imunitário do paciente ou por outros factores prejudiciais do tecido envolvente. Um tal implante pode, por exemplo, ser fixo à esclerótica para produzir e libertar o produto proteico GDNF directamente no humor vítreo.

Está também contemplado que as células do próprio paciente possam ser transformadas ex vivo para produzir produto proteico GDNF e sejam directamente implantadas sem encapsulação. As células seriam transformadas com um vector apropriado e transplantadas de novo para a retina do paciente onde produzirão e libertarão a proteína GDNF ou variante de proteína GDNF desejada.

Estudos de transplantação de células fotorreceptoras concebidas para substituir células defeituosas ou perdidas devido a uma doença ou dano retinal foram realizados com sucesso em modelos animais de degeneração retinal (Silverman e Hughes, Invest. Ophthalmol. Vis. Sei., 30:1684-1690, 1989; Gouras et ai., Neuro-Ophthalmol., 10:165-176, 1990). Está contemplado que as células fotorreceptoras possam ser obtidas de olhos de dadores e mantidas em cultura como anteriormente descrito. As células seriam então utilizadas como uma fonte de fotorreceptores purificados para transplantar através do espaço sub-retinal na retina de pacientes que sofrem de doença ou dano retinal. Estes pacientes serão tratados com terapias imunossuppressoras para eliminar respostas imunológicas e rejeição das células enxertadas. As retinas do dador serão cultivadas ex vivo na presença de GDNF, de modo a aumentar o seu crescimento e sobrevivência. Os pacientes que receberão os transplantes de células fotorreceptoras serão tratados com injecções intravitreo de GDNF, que será necessário para promover a sobrevivência e a maturação dos fotorreceptores enxertados.

A terapia génica com produto proteico GDNF in vivo é também contemplada, por introdução do gene que codifica para o produto proteico GDNF em células alvo através de injecção local de uma construção de ácido nucleico ou outros vectores de entrega apropriados. (Hefti, J. Neurobiol., 25:1418-1435, 1994). Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico que codifica um produto proteico GDNF pode estar contida num vector virai adeno-associado ou vector de adenovírus para entrega nas células retinais. Vectores virais alternativos incluem, mas não se lhes limitam, vectores de retrovírus, vírus de herpes simples e vírus de papiloma. A transferência física, quer in vivo quer ex vivo conforme apropriado, pode também ser conseguida por transferência mediada por lipossomas, injecção directa (ADN

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 34 nu), transferência mediada por receptores (complexo ligando-ADN), electroporação, precipitação com fosfato de cálcio ou bombardeamento com micropartículas (canhão génico). A metodologia para a encapsulação em membranas de células vivas é familiar aos peritos na arte, e a preparação das células encapsuladas e a sua implantação em pacientes pode ser realizada sem experimentação indevida. Veja-se, e.g., Pat. Nos. US 4 892 538, 5 011 472, e 5 106 627. Um sistema para encapsulação de células vivas é descrito no Pedido PCT WO 91/10425 de Aebischer et ai Veja-se também, o Pedido PCT WO 91/10470 de Aebischer et ai, Winn et ai, Exper. Neuroi, 113:322-329, 1991, Aebischer et ai, Exper. Neuroi, 111:269-275, 1991; Tresco et ai, ASAIO, 38:17-23, 1992. Estão descritos em WO 93/21902 (Pedido Internacional No. PCT/US93/03850) dispositivos implantáveis adicionais. As técnicas para a formulação de vários outros meios de entrega sustentada ou controlada, tais como lipossomas transportadores, partículas bio-erodíveis ou contas e injecções de depósito, são também conhecidos dos peritos na arte.

Deve notar-se que as formulações de produto proteico GDNF aqui descritas podem ser utilizadas em aplicações veterinárias bem como em aplicações para humanos e que o termo "paciente" não deve ser entendido de um modo limitante. No caso de aplicações veterinárias, as gamas de dosagem deverão ser as mesmas que anteriormente se especificou.

Outros aspectos e vantagens da presente invenção serão entendidos após consideração dos seguintes exemplos ilustrativos. Os exemplos dirigem-se ao efeito de produto proteico GDNF em neurónios retinais normais e mutados. Em adição, os exemplos estabelecem técnicas únicas para a cultura de células retinais.

EXEMPLOS

MATERIAIS E MÉTODOS

Os materiais utilizados nos Exemplos seguintes foram obtidos como se segue.

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Meios de cultura de células O Meio de Eagle modificado por Dulbecco com alto teor de glucose (DMEM; #11965-092), o meio F12 de Ham (F12; #11765-021), o meio L15 de Leibovitz sem bicarbonato de sódio (#41300-039); o suplemento de meio B27 (#17504-010), a penicilina/estreptomicina (#15070-014), a L-glutamina (#25030-016), a solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (D-PBS; #14190-052), a solução salina equilibrada de Hank com sais de cálcio e magnésio (HBSS; #24020-026), o ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanossulfónico (HEPES; #15630-015), a laminina de ratinho (#23017-015), a albumina sérica bovina e a fracção V (#110-18-017) eram todos de GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y. O soro de cavalo inactivado por calor era de HyClone, Logan, Utah. O bromidrato de poli-L-ornitina (P-3655), a insulina bovina (1-5500), a transferrina humana (T-2252), a putrescina (P-6024), a progesterona (P-6149) e o seleneto de sódio (S-9133) eram todos de Sigma Chemical Company, Saint-Louis, Mo. A papaína, a desoxirribonuclease I (ADNase) e a ovalbumina (sistema de dissociação de papaína) eram de Worthington Biochemicals, Freehold, N.J. As microplacas Falcon de 96 poços estéreis (#3072), os utensílios de plástico para cultura de tecidos e os tubos de centrífuga de polipropileno eram de Beckton-Dickinson, Oxnard, CA. As lamelas da câmara de cultura de tecidos Nunc Lab-Tek (#136439) eram de Baxter, Irvine, CA. O crivo de nylon Nitex de 20 μηι (#460) era de Tetko, Elmsford, N.Y. Os fórceps de dissecação de 4” e as tesouras de dissecação de 4" eram de Roboz Surgical, Washington, D.C.

Anticorpos, radio-isótopos e reagentes relacionados O anticorpo policlonal de coelho e os anticorpos monoclonais de ratinho rho4D2 anti-rodopsina de bovino eram de University of Brítish Columbia, Vancouver, Canadá. O anticorpo policlonal de coelho era dirigido para a sequência peptídica sintética seguinte da proteína específica de bastonetes, arrestina: Val-Phe-Glu-Glu-Phe-Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cys (SEQ ID NO:2). A IgG biotinilada de cavalo anti-ratinho, a IgG biotinilada de cabra anti-coelho, o complexo de biotina/avidina conjugada com peroxidase e a estreptavidina conjugada com Texas Red (ABC Elite; estojo PK-6100) eram de Vector Laboratories, Burlingame, CA. As imunoglobulinas de coelho anti-ratinho conjugadas com isotiocianato de fluoresceína eram de Dako Corporation (Carpinteria, CA.). A 3',3'-diaminobenzidina era de Cappel Laboratories, West Chester, PA. O tampão de bloqueio Superblock em PBS (#37515) era de Pierce, Rockford, IL. O Triton X-100 (X100), o Nonidet P-40 (N6507) e o peróxido de hidrogénio (30%, v/v; H1009) eram de Sigma. O ácido

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 36 L-[3,4-3H]-glutâmico (ΝΕΤ-490; 40-80 Ci/mmol) era de New England ^Nuclear, Boston, MA. O cocktail de cintilação Optiphase Supermix era de Wallac, Turku, Finlândia. As microplacas White ViewPlate-96 (#6005182) eram de Packard Instruments Corporation, Meriden, CT. Todos os outros reagentes foram obtidos de Sigma Chemical Company (Saint-Louis, Mo.), a menos que especificado em contrário.

Preparação de meios

Preparou-se um meio base na forma de uma mistura 1:1 de DMEM e meio F12, e suplementou-se com suplemento de meio B27, adicionado na forma de uma solução-mãe concentrada 50 vezes. O suplemento de meio B27 consiste em biotina, L-carnitina, corticosterona, etanolamina, D(+)-galactose, glutationa reduzida, ácido linoleico, ácido linolénico, progesterona, putrescina, acetato de retinilo, selénio, T3 (triodo-1 -tironina, DL-alfa-tocoferol (vitamina E), acetato de DL-alfa-tocoferol, albumina sérica bovina, catalase, insulina, superóxido-dismutase e transferrina. Adicionou-se L-glutamina numa concentração final de cerca de 2 mM, penicilina a cerca de 100 IU/I, e estreptomicina a cerca de 100 mg/l. Adicionou-se soro de cavalo inactivado por calor até uma concentração final de cerca de 2,5 porcento, adicionou-se D-glucose até uma concentração final de cerca de 5 g/l, adicionou-se agente tamponante HEPES até uma concentração final de cerca de 20 mM, adicionou-se insulina bovina até uma concentração final de cerca de 2,5 mg/ml, e adicionou-se transferrina humana até uma concentração final de cerca de 0,1 mg/ml. Após mistura, ajustou-se o pH a cerca de 7,3 e manteve-se o meio a 4°C. Os meios foram preparados de fresco imediatamente antes da utilização de modo a minimizar variações inter-experiências. Utilizaram-se sempre pipetas e recipientes de plástico para minimizar a adsorção de proteínas.

Soluções de produto proteico GDNF

Prepararam-se produtos proteicos GDNF humanos recombinantes purificados na forma de soluções a 1 mg/ml em D-PBS (solução salina tamponada com fosfato preparada com água destilada) contendo cinco porcento de albumina sérica bovina. Armazenaram-se as soluções a -85°C em alíquotas. Prepararam-se diluições em série em microplacas de 96 poços. Adicionaram-se dez microlitros de soluções de produto proteico GDNF concentradas dez vezes, ao meio de cultura contendo as culturas de células (90 μΙ). As culturas de controlo receberam D-PBS com 5 porcento de albumina (10 μΙ). Os tratamentos com o produto proteico GDNF

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ foram iniciados uma hora após as células serem semeadas e, em alguns casos, repetidos dia sim, dia não.

Substrato da cultura

Para encorajar a fixação óptima de fotorreceptores sobre o substrato, excrescências de segmento externo e excrescências de neurites, as superfícies da placa de microtítulo (o substrato de cultura) foram modificadas por revestimento sequencial com poli-L-ornitina seguida por laminina de acordo com o procedimento seguinte. As superfícies das placas foram completamente cobertas com uma solução estéril a 0,1 mg/ml de poliomitina em ácido bórico 0,1 M (pH 8,4) durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente, seguida por uma lavagem estéril com água Super-Q. A água de lavagem foi então aspirada e adicionou-se uma solução a 1 μg/ml de laminina de ratinho em PBS e incubou-se a 37°C durante duas horas. Estes procedimentos foram conduzidos imediatamente antes da utilização das placas de modo a assegurar a reprodutibilidade dos resultados.

Preparação de culturas de fotorreceptores de pinto e de ratinho

Mataram-se por decapitação embriões de pinto White Leghorn de dezassete dias de idade e filhotes de ratinho C57BI/6 de 5 dias de idade (obtidos de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) e dissecaram-se os olhos esterilmente para meio L15 (sem bicarbonato de sódio). Processou-se um máximo de 24 olhos por experiência. Os olhos foram hemi-seccionados, e removeram-se os cristalinos e os vítreos. Removeram-se cuidadosamente as retinas neurais e dissecaram-se de modo a ficarem isentos do epitélio do pigmento, cortaram-se em pequenos fragmentos (cerca de 1 mm quadrado ou menos) e colocaram-se em D-PBS gelado. Recolheram-se as células, e depois transferiram-se para 10 ml de meio de dissociação (120 unidades de papaína e 2000 unidades ADNase em HBSS). Incubaram-se as células durante 45 minutos a cerca de 37°C num agitador de plataforma rotativa a cerca de 200 rpm. Dispersaram-se então as células por trituração através de pipetas de Pasteur polidas ao fogo, crivaram-se através de um crivo de nylon Nitex de 20 μπι para eliminar o tecido não dissociado, e centrifugaram-se durante cinco minutos a'200 x g utilizando uma centrífuga clínica IEC. Ressuspendeu-se a pelete de células resultante em HBSS contendo ovalbumina e cerca de 500 unidades de ADNase, verteu-se em camada sobre o topo de uma solução de ovalbumina a 4 porcento (em HBSS) e centrifugou-se durante cerca de 10 minutos a 500 xg. Ressuspendeu-se a pelete final em meio de

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ cultura completo (veja-se acima), ajustou-se a cerca de 15 000 células/ml, e semeou-se em alíquotas de 90 μΙ nos poços de 6 mm de microplacas de 96 poços previamente revestidos com poliornitina e laminina. A fixação das células ocorreu rapidamente, e a eficiência de plaqueamento foi de cerca de 75 porcento.

Culturas de fotorreceptores provenientes de retina de ratinhos adultos

Obtiveram-se culturas de fotorreceptores adultos por sementeira de células retinais dissociadas de ratinhos 18 a 39 dias após o seu nascimento, sobre o topo de monocamadas preestabelecidas de células gliais da retina de ratinho 5 dias após o nascimento ou células de epitélio de pigmento de retina de rato. Os procedimentos de dissociação e os meios de cultura foram os mesmos que se descreveram anteriormente. As culturas de células gliais da retinas e células do epitélio do pigmento foram estabelecidas em frascos de cultura de tecidos (frascos Costar de 225 cm2) e crescimento até se atingir a confluência. As células foram então destacadas através de um curta incubação (cerca de dois minutos) com tripsina a 0,1% e foram plaqueadas em microplacas de 96 poços ou em câmaras de lamelas de vidro de 16 poços. Adicionaram-se células retinais adultas dissociadas após cerca de 3 a 5 dias.

Culturas de fotorreceptores provenientes de retina de ratinhos rd/rd

Ratinhos C57BI/6 rd/rd (obtidos de Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) possuem uma degeneração de fotorreceptores hereditária que resulta da expressão de uma mutação na subunidade beta da fosfodiesterase (uma enzima localizada nos segmentos externos e envolvida nos processos de fototransdução). Estes ratinhos proporcionam um útil modelo para o estudo do papel de factores tráficos sobre fotorreceptores lesionados. A morte de fotorreceptores em ratinhos rd/rd apresenta um pico a cerca de 10 dias após o nascimento. Estabeleceram-se culturas de fotorreceptores rd/rd provenientes de ratinhos de 5 dias de idade e mantiveram-se em culturas durante oito dias, cobrindo o período de morte máxima dos fotorreceptores. As células retinais dissociadas foram semeadas sobre o topo de uma monocamada preestabelecida de células gliais da retinas (veja-se acima) a uma densidade de cerca de 10 000 células por poço de 6 mm e foram mantidas no meio de cultura acima descrito.

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Imuno-histoauímica de fotorreceptores

Para caracterizar fotorreceptores de ratinho, utilizou-se um método indirecto com imunoperoxidases descrito por Louis et al. (J. Pharmacol. Exp. Therap., 262:1274-1283. 1992; Science, 259:689-692. 1993), com ligeiras modificações como se segue. Fixaram-se as culturas de fotorreceptores durante cerca de 30 minutos à temperatura ambiente com 4 porcento de paraformaldeído em D-PBS, pH 7,4, seguindo-se três lavagens em D-PBS (200 μΙ por poço de 6 mm). Incubaram-se então as culturas fixadas em tampão de bloqueio Superblock em PBS, contendo um porcento de Nonidet P-40 para aumentar a penetração dos anticorpos. Os anticorpos anti-rodopsina (coelho e ratinho) foram então aplicados numa diluição entre 1:1000-1:4000 no mesmo tampão, e incubaram-se as culturas durante uma hora a 37°C num agitador rotativo. Após três lavagens com D-PBS, os anticorpos ligados a fotorreceptores foram detectados utilizando IgG biotinilada de cabra anti-coelho ou de cavalo anti-ratinho (estojo Vectastain de Vector Laboratories, Burlingame, CA) numa diluição de cerca de 1:500: estes anticorpos secundários foram incubados com as células durante cerca de uma hora a 37°C, as células foram então lavadas três vezes com D-PBS. Os anticorpos secundários foram então marcados com um complexo de avidina-biotina-peroxidase diluído de 1:500, e as células foram incubadas durante cerca de 45 minutos a 37°C. Após mais três lavagens com D-PBS, as culturas de células marcadas foram feitas reagir durante 5-20 minutos numa solução de Tris-HCI 0,1 M, pH 7,4, contendo 3',3'-diaminobenzidina-(HCI)4 a 0,04%, NiCL a 0,06 porcento e peróxido de hidrogénio a 0,02 porcento.

Para as experiências de dupla coloração, as culturas cresceram em câmaras de lamelas de vidro. Após fixação com paraformaldeído, permeabilização e bloqueio dos locais não específicos (como descrito acima), incubaram-se as culturas com anticorpos de coelho anti-arrestina e de ratinho anti-rodopsina. A arrestina foi revelada através de incubação adicional com IgG biotinilada de cabra anti-coelho, seguida de estreptavidina conjugada com Texas-Red (diluição de 1:200). A rodopsina foi revelada através de incubação adicional com IgG de coelho anti-ratinho conjugada com isotiocianato de fluoresceína. A fluorescência foi visualizada sob epifluorescência, utilizando as combinações de filtros apropriadas para o Texas Red e a fluoresceína.

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Determinação da sobrevivência de fotorreceptores

Fixaram-se culturas de fotorreceptores de ratinho, processaram-se e imunocoraram-se como descrito anteriormente, e examinaram-se então as culturas de fotorreceptores com ópticas de luz brilhante com amplificação de 200x. Contou-se o número de neurónios corados numa tira diametral de 1 x 6 mm, representando cerca de 20 porcento da área total da superfície de um poço de 6 mm. Os fotorreceptores viáveis eram caracterizados por possuírem um corpo celular de formato regular, com um processo semelhante aos axónios normalmente curto. Os fotorreceptores que apresentavam sinais de degeneração, tais como pericários irregulares e vacuolados ou neurites fragmentadas, foram excluídos das contagens (a maior parte dos fotorreceptores degenerantes, destacaram-se contudo do substrato de cultura). Os números de células foram expressos quer como células/poço de 6 mm quer como a alteração, em número de vezes, relativamente à densidade das células de controlo.

Análise de neurites

Realizou-se a análise morfométrica do desenvolvimento de neurites (/.e., o processo no corpo da célula fotorreceptora) utilizando culturas de 6 dias de retina de ratinho. Culturas contendo cerca de 10 000 neurónios por poço de 6 mm foram imunocoradas quanto à arrestina e examinadas com ópticas de campo claro. Tiraram-se fotografias de campos escolhidos aleatoriamente de fotorreceptores em culturas em poços de 6 mm, de controlo e tratadas, com uma câmara de vídeo Optronics e ampliaram-se até uma ampliação final de aproximadamente 800 vezes. Determinou-se o tamanho das neurites por medição do comprimento das neurites de cada fotorreceptor com um estilete acoplado a um comprimido de digitalização SummaSketchll (Summagraphics Corporation, Houston, Texas), utilizando um programa de digitalização (MacMeasure 1.9) e um computador pessoal Macintosh Centris 650.

RESULTADOS

Exemplo 1

Promoção de sobrevivência e desenvolvimento de fotorreceptores bastonete em culturas de retina de ratinhos recém-nascidos. 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 41

Utilizaram-se culturas de retinas de ratinho para demonstrar o efeito de produto proteico GDNF sobre a sobrevivência de fotorreceptores. Estabeleceram-se as culturas de fotorreceptores por sementeira de células retinais dissociadas em microplacas revestidas com poliornitina-laminina a uma densidade de cerca de 12 500 por poço de 6 mm em DMEM/F12 suplementado com suplemento de meio B27, soro de cavalo inactivado por calor a 2,5%, D-glucose, HEPES, insulina e transferrina. Identificaram-se os fotorreceptores pela presença de imunorreactividade cóm arrestina (um antigénio específico de bastonetes) e rodopsina (o pigmento visual específico de bastonetes).

Após 6 dias in vitro fixaram-se as células com paraformaldeído a 4%, e imunocoraram-se os fotorreceptores nas culturas utilizando arrestina, um marcador que identifica fotorreceptores bastonete de mamífero. Após imunocoloração, como anteriormente descrito, microfotografias de contraste de fases de um campo seleccionado quanto à presença de diferentes tipos de células retinais revelaram fotorreceptores (identificáveis como pequenas células cobertas por um material reaccional castanho após imunocoloração para a arrestina), neurónios e células de Mueller da glia. O exame em campo claro de um campo definido demonstrou que o anti-soro anti-arrestina, criado em coelho contra um péptido sintético específico de arrestina, se ligava exclusivamente a fotorreceptores bastonete e não se ligava a outros neurónios retinais, ou a células de Mueller da glia.

Com base na imunorreactividade com arrestina, determinou-se que cerca de 90 porcento das células nas culturas eram fotorreceptores. As restantes células eram grandes neurónios multipolares e pequenos neurónios unipolares positivos ao NSE. As células foram então imunocoradas para a rodopsina. Cerca de 50% dos fotorreceptores expressavam a rodopsina do pigmento visual bastonete, como determinado por imunocoloração com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-rodopsina. Os fotorreceptores apareciam como células arredondadas com um diâmetro do corpo celular pequeno, uma ou duas neurites e, em alguns casos, um curto processo vertical que representa o cílio de ligação. Com este nível de resolução, não houve evidências de formação de segmentos externos.

Avaliaram-se então culturas de retina de ratinho 6 dias após o nascimento, quanto ao efeito da administração de produto proteico GDNF sobre a sobrevivência de fotorreceptores. As culturas de fotorreceptores (10 000/poço de 6 mm) foram tratadas com produto proteico GDNF humano recombinante (diluições em série de dez vezes que variaram de 10 ng/ml a 1 pg/ml). Fixaram-se as culturas após seis 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 42

dias e imunocoraram-se para a arrestina. Determinou-se a sobrevivência dos fotorreceptores por contagem do número de células positivas à arrestina por campos de 6 mm quad. (representando cerca de 21% da área total da superfície de um poço de 6 mm).

Em culturas que não foram tratadas com produto proteico GDNF, o número de fotorreceptores diminuiu de modo regular ao longo do tempo até atingir cerca de 25 porcento do número inicial após seis dias em cultura. O tratamento das culturas com produto proteico GDNF humano recombinante expresso em E. coli resultou numa diminuição de cerca de duas vezes no número de fotorreceptores viáveis positivos à arrestina após seis dias em cultura (veja-se Figura 1; cada valor é a média ± d.p. de três culturas.) O efeito do produto proteico GDNF foi máximo a cerca de 200 pg/ml, com uma ED50 de cerca de 30 pg/ml.

Em adição à promoção de sobrevivência de fotorreceptores, a adição do produto proteico GDNF também estimulou a extensão dos seus processos semelhantes a axónios (também referidos como neurites), demonstrando assim um efeito sobre 0 desenvolvimento morfológico dos fotorreceptores. As culturas de fotorreceptores foram incubadas durante seis dias com ou sem produto proteico GDNF humano recombinante (1 ng/ml). As culturas foram então imunocoradas para a arrestina. Cerca de 715 fotorreceptores de duas culturas de controlo independentes e 710 fotorreceptores de duas culturas independentes tratadas com produto proteico GDNF, foram fotografadas e analisadas quanto aos comprimentos das neurites. O efeito da administração de produto proteico GDNF sobre a excrescência de neurites foi quantificado por medição dos comprimentos das neurites dos fotorreceptores. A Figura 2 representa a promoção da excrescência de neurites de fotorreceptores pelo produto proteico GDNF. Os dados são expressos como um gráfico de distribuição de frequências acumuladas dos comprimentos das neurites. É representada a percentagem de fotorreceptores (ordenadas) com neurites mais longas do que um dado comprimento em micrómetros (abcissas). A adição de produto proteico GDNF desviou a distribuição de comprimentos de neurites para valores mais elevados em comparação com culturas não tratadas. Alguns fotorreceptores nas culturas tratadas com produto proteico GDNF apresentaram neurites com cerca de 180 pm de comprimento, enquanto as neurites mais longas observadas nas culturas não tratadas tinham 100 pm de comprimento. O comprimento médio das neurites de fotorreceptores em culturas tratadas com produto proteico GDNF foi de 68 pm, em comparação com 27 pm nas culturas de controlo.

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Os fotorreceptores utilizam giutamato como o seu neurotransmissor de sinais para os neurónios de segunda ordem. Em culturas consistindo em >90% de fotorreceptores, o grau de captação de giutamato pelas células indica o número e a actividade de locais transportadores de nova captação de giutamato de alta afinidade presentes em fotorreceptores e reflecte deste modo a sua diferenciação funcional. A estimulação da captação de giutamato pela administração de produto proteico GDNF foi avaliada para determinar os seus efeitos sobre a diferenciação funcional dos fotorreceptores. Cresceram-se as culturas como descrito anteriormente e trataram-se ou não com produto proteico GDNF humano recombinante durante seis dias. Processaram-se então as culturas quanto à captação de [3H]-glutamato (50 nM; 1,5 milhões dpm/ml; uma hora de incubação a 37°C) de acordo com o procedimento seguinte.

Ensaio de captação de giutamato: A captação de giutamato foi determinada em culturas de fotorreceptores provenientes de filhotes de ratinho de 5 dias de idade que tinham sido estabelecidas em microplacas de 96 poços. As culturas foram lavadas com cerca de 100 μΙ de tampão de captação pré-aquecido que consiste numa solução de Krebs-Ringer modificada, pH 7,4 contendo cerca de 120 mM de NaCI, 4,7 mM de KCI, 1,8 mM de CaCI2, 1,2 mM de MgS04, 32 mM de NaHP04, 1,3 mM de EDTA, e 5,6 mM de D-glucose. Pré-incubaram-se então as células a 37°C durante cerca de 10 minutos em tampão de captação. Adicionou-se então L-glutamato tritiado (cerca de 60 Ci/mmol) às culturas a uma concentração de cerca de 50 nM em 75 μΙ de tampão de captação e incubaram-se as culturas durante cerca de 60 minutos a 37°C. Interrompeu-se a captação por aspiração do meio de incubação seguida de três lavagens rápidas com cerca de 120 μΙ de tampão de captação gelado. As células foram então lisadas por adição of 200 μΙ de cocktail de cintilação Optiphase Supermix (Wallac), e a radioactividade foi determinada por espectrometria de cintilação utilizando um contador de microplacas de 96 poços Wallac MicrobetaPlus. Os resultados são expressos em dpm/poço de 6 mm ou em alteração, em número de vezes, em relação a culturas de controlo.

Verificou-se que o produto proteico GDNF estimula a captação de giutamato de uma maneira dependente da dose, com a actividade máxima atingida a cerca de 200 pg/ml e uma ED50 de cerca de 25 pg/ml. Os resultados estão ilustrados na Figura 3. Cada ponto de dados é a média ± d.p. de 3 poços de uma experiência representativa. Obtiveram-se resultados semelhantes em duas experiências

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ independentes. Os resultados demonstram que em adição a promoverem a sobrevivência e o desenvolvimento morfológico de fotorreceptores, o GDNF aumenta a maturação de funções relacionadas com a neurotransmissão, tais como a captação de glutamato, que são críticas para o processo de transdução visual.

Exemplo 2

Promoção de sobrevivência e regeneração de fotorreceptores bastonete em culturas de retina de ratinho adulto. O desenvolvimento dos fotorreceptores está completo cerca de três semanas após o nascimento. Nessa altura, os fotorreceptores desenvolveram segmentos externos funcionais que concentram a maquinaria celular necessária para a fototransdução, incluindo os pigmentos visuais. Os fotorreceptores de rato maduros foram dissociados de retinas de 18 e 39 dias de idade e mantidos em cultura durante mais de uma semana. Os neurónios foram semeados (a uma densidade de cerca de 2 500/poço de 6 mm) sobre o topo de uma monocamada preexistente de células gliais da retinas. As células da glia encorajam a adesão de fotorreceptores dissociados e proporcionam-lhes nutrientes e factores essenciais para o seu desenvolvimento. Os fotorreceptores adultos da co-cultura com células gliais da retinas foram identificados por imunocoloração dupla para a arrestina e para a rodopsina utilizando os anticorpos e técnicas de imunocoloração acima descritas.

As culturas foram tratadas com produto proteico GDNF humano recombinante (0,1, 1 ou 10 ng/ml). As células foram fixadas após sete dias e imunocoradas para a arrestina. A sobrevivência de fotorreceptores foi determinada por contagem do número de neurónios positivos para a arrestina por poço de 6 mm. O número de fotorreceptores bastonete em culturas de retinas com 18 e com 39 dias de idade foi cerca de 3,5 vezes mais elevado em culturas tratadas com produto proteico GDNF (veja-se a Figura 4; cada valor é a média ± d.p. de 2-3 culturas). O suporte máximo foi encontrado com concentrações de produto proteico GDNF de cerca de 300 pg/ml, com uma ED50 de cerca de 40 pg/ml. Estes resultados ilustram as alterações no número de fotorreceptores, e portanto, a promoção de sobrevivência de fotorreceptores, em resposta ao tratamento com produto proteico GDNF.

Num estudo adicional, semearam-se células de retina dissociadas sobre o topo de uma monocamada preestabelecida de células gliais de retina de ratinho

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ (1000 células de retina/poço de 6 mm) e trataram-se com produto proteico GDNF humano recombinante (1 ou 10 ng/ml). As culturas foram fixadas após sete dias e imunocoradas para a arrestina. Em adição a promover a sobrevivência de fotorreceptores, verificou-se que o produto proteico GDNF aumentava fortemente o desenvolvimento morfológico dos fotorreceptores como demonstrado pela excrescência dos seus processos axónicos e, em alguns casos, pela excrescência de um curto processo apical reminescente de um segmento externo imaturo. Estas culturas eram originárias de retinas adultas nas quais os fotorreceptores estavam completamente desenvolvidos. Uma vez que os fotorreceptores perdem os seus processos durante o procedimento de dissociação, os presentes dados demonstram a capacidade do produto proteico GDNF para promover a regeneração de fotorreceptores, e em particular para promover o desenvolvimento dos seus processos axónicos e segmentos externos que são críticos para o processo visual. Estes resultados indicam que a administração de um produto proteico GDNF pode constituir uma terapia útil para condições em que a visão é perdida devido à degeneração de fotorreceptores, tais como a degeneração macular senil, degenerações retinais hereditárias e outras distrofias retinais.

Exemplo 3

Promoção de sobrevivência de fotorreceptores bastonete em culturas de retina proveniente de ratinhos com degeneração retinal hereditária (rd/rd).

Os ratinhos rd/rd são portadores de uma mutação na subunidade beta da fosfodiesterase (uma enzima localizada nos segmentos externos e envolvida nos processos de fototransdução), que resulta no seu malfuncionamento e causa o início precoce de degeneração de fotorreceptores e a morte fulminante de fotorreceptores. Encontram-se mutações semelhantes à rd/rd em humanos e são responsáveis por um subconjunto de casos de retinite pigmentosa. A morte de fotorreceptores em ratinhos rd/rd atinge um pico cerca de 10 dias após o nascimento. Estes ratinhos mutantes proporcionam um útil modelo para o estudo dos efeitos do produto proteico GDNF sobre a sobrevivência de fotorreceptores rd/rd.

Estabeleceram-se culturas de fotorreceptores rd/rd de ratinhos de 5 dias de idade e mantiveram-se em cultura durante sete dias, um período que cobre a ocorrência da morte máxima de fotorreceptores. Devido à sua inerente vulnerabilidade, os fotorreceptores rd/rd dissociados foram semeados (a uma 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 46

densidade de cerca de 2 500/poço de 6 mm) sobre o topo de uma monocamada preestabelecida de células gliais da retina (como descrito anteriormente). As culturas de retinas rd/rd foram comparadas com culturas de células de retinas de ratinhos normais (tipo selvagem) obtidas de animais com a mesma idade e foram processadas da mesma maneira. As culturas foram tratadas com produto proteico GDNF humano recombinante (1 ng/ml), fixadas após sete dias e imunocoradas para a arrestina. A sobrevivência de fotorreceptores foi determinada por contagem do número de neurónios positivos à arrestina por poço de 6 mm. A adição de produto proteico GDNF causou um aumento modesto (cerca de 15%) mas significativo no número de fotorreceptores após sete dias de cultura in vitro (veja-se a Figura 5; cada valor é a média ± d.p. de 3-4 culturas). Em contraste, e apesar do suporte de células da glia, quando o produto proteico GDNF não foi adicionado, o número de fotorreceptores em culturas de ratinhos rd/rd caiu acentuadamente até atingir cerca de 40% dos fotorreceptores do tipo selvagem após sete dias.. Na presença de produto proteico GDNF (1 ng/ml), o número de fotorreceptores rd/rd sobreviventes aumentou cerca de 2,5 vezes, atingindo os níveis de sobrevivência observados em culturas de fotorreceptores do tipo selvagem não tratados. Estes dados demonstram que o tratamento com produto proteico GDNF tornou os fotorreceptores mutantes mais resistentes à tensão imposta sobre eles pela mutação rd/rd. Isto indica que a administração de produto proteico GDNF pode ser útil para o tratamento de degenerações retinais hereditárias, tais como a retinite pigmentosa.

Exemplo 4

Promoção de sobrevivência de fotorreceptores cone e desenvolvimento de segmentos externos em culturas de retinas de pinto embrionário. O desenvolvimento do sistema visual do pinto é muito mais precoce do que nos roedores. A excrescência de segmentos externos de fotorreceptores inicia-se com cerca de 11-12 dias de tempo de gestação, e no momento do nascimento os fotorreceptores estão completamente desenvolvidos. Portanto, o efeito da administração de produto proteico GDNF sobre a sobrevivência e a regeneração de fotorreceptores pode ser estudado em culturas de retinas de pinto embrionário.

Fizeram-se culturas de células retina de pinto embrionário do dia 17 em microplacas de 96 poços, como anteriormente descrito, e fixaram-se com 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 47

paraformaldeído a 4% após seis dias in vitro. Verificou-se que as culturas continham cerca de 60 porcento de células fotorreceptoras e 40 porcento de neurónios multipolar grandes. As microfotografias de contraste de fase de um campo representativo das culturas de controlo revelaram os dois tipos principais de células retinais presentes na cultura: fotorreceptores cone, identificáveis pela presença de uma gotícula de lípido na parte apical da célula do soma, e neurónios retinais. As células fotorreceptoras foram identificadas por corpos celulares ovais que eram ocupados quase exclusivamente pelo núcleo, um segmento interno curto com uma pequena gotícula de lípido, uma única neurite curta, não ramificada, emergente de um posto oposto à gotícula de líquido, e um cílio distai curto. Estes aspectos são característicos de cones. Realizou-se a imunocoloração anti-rodopsina, como descrito anteriormente, e a microfotografia em campo brilhante de uma cultura de 6 dias revelou a presença de fotorreceptores bastonete. Determinou-se que cerca de 20% dos fotorreceptores eram bastonetes. Os restantes 80% dos fotorreceptores eram fotorreceptores cone, que não contêm rodopsina. A Figura 6 representa o efeito de produto proteico GDNF sobre a sobrevivência de fotorreceptores em culturas de retina de pinto embrionário do dia 17. As culturas das células de retina dissociadas (plaqueadas a uma densidade de cerca de 10 000/poço de 6 mm) foram tratadas com produto proteico GDNF humano recombinante (diluições em série de dez vezes variando de 10 ng/ml a 1 pg/ml). As culturas foram fixadas após seis dias com paraformaldeído a 4% e foram observadas com ópticas de contraste de fase. Os fotorreceptores cone foram identificados pela presença de uma gotícula de lípido em fase brilhante. A gotícula de lípido marca a junção entre os segmentos interno e externo. A sobrevivência de fotorreceptores foi determinada por contagem do número de cones por tiras diametrais de 6 mm quad. (representando cerca de 21% da área total do poço de 6 mm). Cada valor é a média ± d.p. de 3 culturas. O número de cones encontrados nas culturas de retina de pinto era cerca de duas vezes superior nas culturas tratadas com produto proteico GDNF do que em culturas não tratadas. O efeito máximo do produto proteico GDNF foi observado a cerca de 200 pg/ml, com uma ED50 de cerca de 50 pg/ml. A morfologia das células fotorreceptoras foi avaliada por microfotografia de contraste de fase, e verificou-se que o produto proteico GDNF promove o desenvolvimento tanto dos segmentos internos como dos segmentos externos e do processo axónico. Em contraste com as culturas não tratadas, as culturas tratadas

85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ com produto proteico GDNF (1 ng/ml durante sete dias) continham uma grande proporção de fotorreceptores cone que apareciam na forma de células compartimentadas altamente alongadas, polarizadas. Estes cones tinham um segmento interno alongado que estava em alguns casos ligado a uma estrutura tridimensional, em fase brilhante característica de um segmento externo. Outros cones desenvolveram uma neurite grossa, longa e ramificada. Em alguns casos, observaram-se cones duplos de que se prolongavam dois segmentos externos (típicos de retinas de aves) em culturas tratadas com produto proteico GDNF. Em adição aos efeitos de sobrevivência/proliferação de células, o efeito da administração de produto proteico GDNF sobre o desenvolvimento de segmentos externos nas culturas de pinto demonstra a sua capacidade para promover a regeneração de segmentos externos danificados pelo procedimento de dissociação. Isto indica, por sua vez, que a administração de produto proteico GDNF também seria útil no tratamento de distrofias retinais, em adição às condições retinais degenerativas e retinopatias hereditárias.

Espera-se que ocorram numerosas modificações e variações à prática da invenção vindas dos peritos na arte por consideração da anterior descrição das suas concretizações presentemente preferidas. Consequentemente, as únicas limitações que devem ser colocadas ao âmbito da presente invenção são as que surgem das reivindicações em anexo. (Segue Listagem de Sequências)

4* s: i‘ ^ 85 502 EP 0 863 766/PT 49

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: AMGEN INC. (B) RUA: 1840 DeHavilIand Drive (C) CIDADE: Thousand Oaks (D) ESTADO: Califórnia (E) PAÍS: Estados Unidas da América (F) CÓDIGO POSTAL: 91320 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE FOTORRECEPTORES UTILIZANDO PRODUTO PROTEICO FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DA LINHA DE CÉLULAS DA GLIA (GDNF) (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: EP 96941452.3 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 22 de Novembro de 1996 (C) CLASSIFICAÇÃO: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 134 resíduos de aminoácido (B) TIPO DE CADEIA: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: sequência de aminoácidos deduzida para GDNF humano maduro 50 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Ser Pro Asp Lys Gin Met Ala Vai Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg 1 5 10 15 Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg 20 25 30 Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Vai Leu Thr Ala lie His Leu 35 40 45 Asn Vai Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu lie 50 55 60 Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp 65 70 75 80 Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Vai Ser Asp Lys 85 90 95 Vai Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser 100 105 110 Phe Leu Asp Asp Asn Leu Vai Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser Ala 115 120 125 Lys Arg Cys Gly Cys lie 130 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 resíduos de aminoácido (B) TIPO DE CADEIA: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: sequência peptídica sintética da proteína arrestina específica de bastonetes (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Vai Phe Glu Glu Phe Ala Arg Gin Asn Leu Lys Cys 1 5 10

Lisboa, ~5. '^í. 2003

Por AMGEN INC.

Claims (12)

1. 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um produto proteico factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF) para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de condições associadas a lesão ou degeneração de fotorreceptores.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação. 1 em que a lesão ou degeneração dos fotorreceptores está associada a retinite pigmentosa, síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Bassen-Kornzweig (abetalipoproteinemia), doença de Best (distrofia viteliforme), coroidemia, atrofia do girado, amaurose congénita, síndrome de Refsum, doença de Stargardt e síndrome de Usher, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabética, vitreo-retinopatias periféricas, retinopatias fóticas, retínopatias induzidas por cirurgia, retinopatias virais, retinopatias isquémicas, deslocamento da retina ou retinopatia traumática.
3. 3. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que a composição farmacêutica compreende uma sequência de aminoácidos de GDNF estabelecida em SEQ ID NO:1 ou uma sua variante ou derivado.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3 em que a composição farmacêutica compreende [Met'1]GDNF.
5. 5. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que a composição farmacêutica compreende GDNF ligado a um polímero solúvel em água.
6. 6. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que a composição farmacêutica compreende uma proteína GDNF humana truncada.
7. 7. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que a composição farmacêutica compreende células que foram modificadas para produzir e segregar o produto proteico GDNF.
8. 8. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que a composição farmacêutica compreende ainda uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico para tratamento de doenças retinais. 85 502 ΕΡ 0 863 766/ΡΤ 2/2
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8 em que o segundo agente terapêutico é seleccionado de entre factor neurotrófico derivado do cérebro, neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, neurotrofina-6, factor de crescimento semelhante a insulina, factor neurotrófico ciliar, factores de crescimento de fibroblastos ácidos e básicos, factor 5 de crescimento de fibroblastos, factor β de crescimento de transformação, e transcrito regulado por cocaína-anfetamina.
10. 10. Utilização de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que a composição farmacêutica é formulada na forma de um inserto ocular, uma injecção ocular ou um implante ocular.
11. 11. Método para proporcionar células fotorreceptoras para implantação compreendendo a cultura de células fotorreceptoras dissociadas na presença de um produto proteico factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF).
12. 12. Composição compreendendo células fotorreceptoras e um produto proteico factor neurotrófico derivado da linha de células da glia (GDNF) em quantidades para aumentar a sobrevivência e permitir o crescimento continuado e a maturação das referidas células fotorreceptoras. Lisboa, -5. $£]'. 200# Por AMGEN INC. -O AGENTE OFICIAL-