KR19990071540A - 광수용체 손상 또는 변성 치룡용 제약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF)를 투여함으로써, 망막 신경원, 특히 광수용체의 손상 또는 변성을 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 색소성망막염, 연령 - 관련 반점 변성, 당뇨병성 망막증, 말초성 유리체망막증, 광성 망막증, 외과수술 - 유도성 망막증, 바이러스성 망막증, 허혈성 망막증, 망막 박리 및 외상성 망막증과 같은 시력이 손실되는 망막 증상이나 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(ＧＤＮＦ) 단백질 산물을 사용하여 광수용체를 치료하는 방법

최근, 여러 유형의 신경원에 대한 영양 활성도를 기초로 하여 자연 발생적인 몇몇 단백성 분자들이 확인되었다. 이 분자들은 "신경영양성 인자" 라고 명명된다. 신경영양성 인자는 발생 중에 신경원의 생존 및 성장 뿐만 아니라 성숙한 신경원의 기능 유지 및 가소성 (plasticity) 에 있어 중요한 역할을 하는 가용성의 내인성 단백질이다; Fallon 및 Laughlin, Neurotrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA (1993) 문헌을 참조하시오. 신경원의 재생은 촉진시키고 신경원의 사멸과 변성을 방지하는 그 능력면에서, 신경영양성 인자는 신경계의 신경변성 증상, 이를테면, 예를들어 파킨슨병, 알쯔하이머병, 근위축성측삭경화증 및 발작을 치료하는 데 유용할 것이다.

신경 손상은 다음을 포함하는, 하나 또는 그 이상의 신경세포 형태의 생존 및/또는 고유 기능을 위협하는 조건들에 의해 유발된다 : (1)손상 부위 주변의 축삭돌기 및/또는 신경세포체의 변성을 야기시키는 (차례로 신경세포 사멸을 야기시키는) 물리적 손상, (2)발작시와 같이 신경계 일부에 대한 일시적 또는 영구적 혈액 순환 중단 (국소 빈혈), (3)각각 암 및 AIDS 화학치료제인 시스플라티늄과 디데옥시시티딘 같은 신경독에 대한 의도적이거나 우연한 노출, (4)당뇨병이나 신기능부전 같은 만성적 대사 질병, 또는 (5)특이 신경 집단의 변성을 초래하는 파킨슨병, 알쯔하이머병 및 근위축성측삭경화증 같은 신경변성 질병. 특정 신경영양성 인자가 신경 손상을 치료하는 데 잠정적으로 유용하려면, 손상된 신경세포종이나 신경세포종들은 그 인자와 반응해야 하는데 ; 전형적으로 다른 신경영양성 인자는 분명히 다른 신경세포종에 영향을 미친다. 모든 신경원 집단이 모든 신경영양성 인자와 반응하거나 이 인자에 의해 똑같이 영향받는 것은 아니라고 입증 되었다.

맨 먼저 확인된 신경영양성 인자는 신경 성장 인자 (NGF) 이다. NGF 는 뉴로트로핀 (neurotrophin) 이라 불리는 규정된 영양성 인자과의 제 1 부류이며, 이 뉴로트로핀에는 일반적으로 뇌 - 유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀 - 3 (NT - 3), NT - 4/5 및 NT - 6 이 포함된다 (Thoenen, Trends. Neurosci., 14 : 165 - 170, 1991 ; Lapchak 등의, Rev. Neurosci., 3 : 1 - 10, 1993 ; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18 : 223 - 253, 1995 참조). 이들 뉴로트로핀은 trk 티로신 키나제 수용체족, 즉 trkA, trkB, trkC 및 저친화성 p75 수용체를 통해 작용하는 것으로 알려져 있다 (Lapchak 등의 Rev. Neurosci., 3 : 1 - 10, 1993 ; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18 : 223 - 253, 1995 ; Chao 등의 TINS, 18 : 321 - 326, 1995 참조). 중추 신경계(CNS)에 있어, trkA 의 발현, NGF 에 대한 수용체는 거의 배타적으로 기초 전뇌의 콜린성 신경원으로 한정되며 (Venero 등의, Neuroreport, 4 : 959 - 962, 1993 참조), 또한 p75 와 trkB 를 발현한다. 이들 콜린작용성 신경원은 특히 신경학적으로 흥미있는데, 그 이유는 콜린작용성 신경원 변성 및/또는 영양장애가 알쯔하이머병의 각인이기 때문이다 (Hefti, J. Neurobiol., 25 : 1418 - 1435, 1994 ; Olson, Neurochem. Jul., 15 : 1 - 3, 1994 참조). 기초 전뇌 콜린작용성 신경원은, 아세틸콜린에 스테라제 조직화학을 사용하는 형태학적 제제로 쉽게 확인될 수 있거나, 아세틸콜린에 대한 합성효소인 콜린 아세틸전이효소 (ChAT)에 대한 항체 또는 p75 에 대한 항체를 사용하는 면역조직화학으로 쉽게 확인될 수 있다(Batchelor 등의, J. Comp. Neurol., 284 : 187 - 204, 1989 ; Kiss 등의, Neurosci., 27 : 731 - 748, 1988 ; Woolf 등의, Neuroscience, 30 : 143 - 152, 1989 참조).

신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자 (GDNF)는 생체내 중뇌 도파민작용성 신경원의 전달물질 표현형을 자극시키고 생존을 촉진시키는 능력에 바탕을 둔 검정법을 이용하여 확인하고 정제한, 최근에 발견된 단백질이다(Lin 등의, Science, 260 : 1130 - 1132, 1993 참조). GDNF 는 글리코실화된, 이황화물 - 결합된 동종이량체이다, 즉 신경영양성 단백질의 형질전환 성장 인자 - β (TGF - β) 와는 관계가 멀다(Krieglstein 등의, EMBO J., 14 : 736 - 742, 1995 ; Poulsen 등의, Neuron, 13 : 1245 - 1252, 1994 참조). GDNF 는 클로닝되었으며, 재조합 인체 GDNF (rhu GDNF) 는 시험관내 뿐만 아니라 생체내에서도 흑질 도파민작용성 신경원과 척수 운동성 신경원에 영양성 및 생존 - 촉진 작용을 한다(Beck 등의 Nature, 273 : 339 - 341, 1995 ; Henderson 등의, Science, 266 : 1130 - 1132, 1994 ; Tomac 등의, Nature, 273 : 335 - 339 ; Yan 등의, Nature, 273 : 341 - 343 ; Zurn 등의, Neuroreport, 6 : 113 - 118, 1994 참조). 생체내에, 외인성 GDNF 로 처리하면, 흑질 신경원의 도파민작용성 표현형이 자극되고 도파민작용성 신경원 결핍을 특징으로 하는 신경변성 질병인 파킨슨병의 동물 모델에서 축삭절단이나 도파민작용성 신경독에 의해 유도되는 기능상 결손이 회복된다(Hudson 등의, Brain Res. Bull., 36 : 425 - 432, 1995 ; Hoffer 등의, Neurosci. Lett., 182 : 107 - 111, 1994 참조). 본래 최소한 시험관내에서는 도파민작용성 신경원에 비교적 특이할 것이라고 여겨지지만, 그 다음 실험에서 생체내와 시험관내 둘 다에 있어 GDNF 가 뇌간 및 척수 콜린작용성 운동 신경원에 신경영양성 효능을 갖는다는 것이 발견되었다(Oppenheim 등의 Nature, 373 : 344 - 346, 1995 ; Zurn 등의, Neuroreport, 6 : 113 - 118, 1994 ; Yan 등의, Nature, 373 : 341 - 344, 1995 ; Henderson 등의, Science, 266 : 1062 - 1064, 1994 참조). 따라서, GDNF 는 근위축성측삭경화증 같은 척수 운동성 신경원의 변성 질병 치료시 잠재적인 치료학적 잇점을 갖는 인자이다.

따라서, GDNF 가 중뇌 도파민작용성 및 체성 운동 신경원 이외에 많은 신경영양성 표적 스펙트럼을 가질 수도 있다는 증거가 판명되기 시작하고 있다(Yan 및 Matheson, Nature, 373 : 341 - 344, 1995 ; Miller 등의, Soc. Neurosci. Abstr., 20 : 1300, 1994 참조). GDNF 메신저 RNA(mRNA) 는 말초 신경계의 근육 및 쉬반 세포와 중추 신경계의 제 Ⅰ 형 성상세포(Schaas 등의, Exp. Neurol., 124 : 368 - 371, 1993 참조)에서 검출되었다. 또한 GDNF mRNA 는 랫 선조체 발생시 고수준으로 발현되며 (Stromberg 등의, Exp. Neurol., 124 : 401 - 412, 1993 참조), 선조체, 해마, 피질 및 척수를 포함하는, 성숙한 랫 및 어른 인체 중추 신경계의 부위에서 저수준으로 발현된다(Springer 등의, Exp. Neurol., 127 : 167 - 170, 1994 참조).

일반적으로 본 발명은, GDNF 가 파킨슨병과 관련된 손상을 포함하는, 신경 손상 치료에 유용하다라고 기술한, 1993년 4월 1일자 공개된 제 WO93/06116 호 (Lin 등의, Syntex - Synergen Neuroscience Joint Venture 참조)에 흥미를 갖고 있다. 또한 흥미있는 문헌은 파일로카르핀 - 유도성 발작후에 GDNF mRNA 가 검출될 수 있었고 비조절되었음을 보고한 Schmidt - Kastner 등의 Mol. Brain Res., 26 : 325 - 330, 1994 문헌 ; 배양 조건하에서 기초 전뇌 성상세포가 중간 수준의 GDNF mRNA 를 발현하였으나, GDNF 가 기초 전뇌 chAT 활성도를 변경시키지 않았음을 보고한 Schaar 등의 Exp. Neurol., 124 : 368 - 371, 1993 문헌 및 Schaar 등의 Exp. Neurol., 130 : 387 - 393, 1994 문헌 ; 및 GDNF 가 기초 전뇌 콜린작용성 신경원의 손상 또는 변성 치료에 유용하다고 보고한, 1995년 9월 28일자 출원된 현재 계류중인 미국 특허 출원 번호 제 08/535,682 호이다.

포유동물에 있어 다수의 안신경변성 증상이나 질병은 광수용체의 손상 또는 변성과 관련되어 있다. 이들 신경원의 생존이나 재생을 촉진시킬 수 있는 영양성 인자가 그와 같은 질병 치료에 유용한 요법을 제공할 것이다.

광수용체는 망막 신경원의 분화된 아부분으로서, 시력의 원인이다. 광수용체는 망막의 광선과민 세포인 간상체와 추상체로 이루어져 있다. 각 간상체와 추상체는 외분절 (outer segment) 이라고 부르는 분화된 섬모를 생성하는데, 이 섬모가 광형질도입 기관을 수용하고 있다. 간상체는 특이 광 - 흡수 시각 색소인 로돕신을 포함한다. 인체에는 독특한 시각 색소를 발현시킴을 특징으로 하는 세 종류의 추상체가 존재한다: 청색 추상체 색소, 녹색 추상체 색소 및 붉은색 추상체 색소. 각 형태의 시각 색소 단백질은 다른 파장에서 최대로 빛을 흡수하도록 맞추어진다. 간상체 로돕신이 암순응 시력(희미한 빛에서)을 중재하는 반면 추상체 색소는 명순응 시력(밝은 빛에서)을 초래한다. 붉은색, 청색 및 녹색 색소 또한 인체에 색 시력의 기초를 형성한다. 간상체와 추상체의 시각 색소는 빛과 반응하여 배출세포, 즉 간상체 이극 신경원에 잠정적으로 작용하며, 그런 다음 망막 신경절 신경원에 의해 교대되어 시각 피질의 시각 자극을 생산한다.

사람에 있어 다수의 망막 질환은 진행성 변성 및 그 결과로서 일어나는 광수용체 사멸과 관계가 있는데, 이로 인해 실명이 초래된다. 유전적 망막 영양장애(예를들어, 색소성망막염), 연령 - 관련 반점 변성 및 다른 반점, 또는 망막 박리에 의한 것과 같은 광수용체 변성은 모두 진행성 위축과 광수용체 외분절의 기능 상실을 특징으로 한다. 게다가, 광수용체 사멸이나 광수용체의 기능 상실 결과 망막 영양장애 환자에게서 2 차 망막 신경원이 부분적으로 구심로차단되며, 이로 인해 광수용체에 의해 생성되는 전기 시그널 전달의 전체 효율이 감소한다. 세포 사멸로 부터 광수용체를 보호하고/보호하거나 기능부전(위축 또는 영양장애) 광수용체의 기능을 회복시킬 수 있는 영양성 인자가 상기 증상 치료에 유용한 요법을 대표할 수 있다.

특정 단백질 인자가 광수용체의 생존을 촉진시킬 수도 있을 거라는 일부 증거가 존재한다. 예를들어 로얄 칼리지 오브 서전 (RCS) 랫 및 일정한 빛에 노출시켜 손상시킨 알비노 랫에서 기초 섬유아세포 성장인자 (bFGF) 에 의해 광수용체는 얼마 정도는 보호될 수 있다(Faktorovich 등의, Nature, 347 : 83 - 86, 1990 참조). RCS 랫은 망막 색소 상피 (RPE)에서 발현되는 유전자의 유전적 돌연변이를 갖는데, 그 결과 RPE 가, 연속적으로 희생되는 광수용체 외분절의 부분을 식작용하지 못하게 되어 광수용체 변성을 일으켜 결국은 세포 사멸을 초래한다. 유리체 내로 또는 아망막강 내로 bFGF 를 단일 주사하면 변성이 발생할 때에 간상체와 추상체 주변의 세포외강이 일시적으로 광수용체를 보호한다(Faktorovich 등의, Nature, 347 : 83 - 86, 1990 참조). 빛 - 손상된 알비노 랫 모델에 있어, 일정한 조명을 착수시키기 2 일 전에 아망막강이나 유리체 내로 bFGF 를 주사하면 빛 손상으로 부터 광수용체가 상당히 보호되고 세포 사멸도 상당히 방지된다(LaVail 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 11249 - 11253, 1992 참조). 이 모델에서는 산성 FGF (aFGF), 뇌 - 유래 신경영양성 인자 (BDNF), 모양체 신경영양성 인자 (CNTF) 및 인터루킨 - 1β (IL - 1β)를 이용해서도 광수용체가 생존되었다. 뉴로트로핀 - 3 (NT - 3), 인슐린 - 유사 - 성장 인자 Ⅱ (IGF - Ⅱ) 및 종양 괴사 인자 - 알파 (TNF - 알파)를 사용했을 때 중간 정도의 효과가 관찰되었다. 신경 성장 인자 (NGF), 상피 성장 인자 (EGF), 혈소판 - 유래 성장 인자 (PDGF) 및 IGF - Ⅰ 는 효과를 나타내지 않았다(LaVail 등의, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 : 11249 - 11253, 1992 참조). 또한 LaVail 등의 제 WO 93/15608 호를 참조하시오.

bFGF 가 RCS 랫과 빛 - 유도 손상된 랫 모델에 효과가 있을지라도, 인체에 있어 그것의 치료학적 효용은 그것의 저압, 유사분열 촉진 및 잠재적 맥관유래 활성도 때문에 매우 한정된다. 사실, 유리체내로 bFGF 를 주사하면 내망막에 혈액 - 유래 대식세포 침범이 유발되어 광범위한 증식성 유리체망막증을 일으킨다(Faktorovich 등의, Nature, 347 : 83 - 86, 1990 참조). 또한 GDNF 에 대한 메신저 RNA 가, 본질적으로 신경 망막 및 망막 색소 상피와 관련이 있는, 생후 6 일 된 랫과 성숙한 랫의 눈에서 발현된다는 것을 폴리머라제 사슬 반응 기술을 이용하여 측정하였다. RPE 세포는 광수용체의 생존 및 기능 유지를 초래하는 다양한 인자들을 생성하고, 저장하고 수송한다. 또한 RPE 세포는 광형질도입 과정에 필수적이다 : 이것은 식작용에 의해 광수용체 외분절의 떨어지는 첨단 (shed tip)을 제거하고 비타민 A 를 재순환시킨다. RCS 랫의 망막내로 정상 RPE 세포를 이식하면 광수용세포 사멸이 방지되는데 (Li 및 Turner, Exp. Eye Res., 47 : 911 - 917, 1988 ; Mullen 및 LaVail, Science, 192 : 799 - 801, 1976 참조), 이것은 RPE 세포에 의해 광수용체에 대한 확산성의 영양성 인자가 생성된다는 것을 암시한다.

광수용세포 손상 치료에 유용한 방법 및 치료학적 조성물은 계속 필요하다. 그와 같은 방법 및 치료학적 조성물은 심각한 부작용 없이, 이상적으로 진행성 손상으로 부터 광수용체를 보호하고 손상된 신경원 집단의 생존이나 재생을 촉진시킬 것이다.

발명의 요약

본 발명은 치료학적 유효량의 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자 (GDNF) 단백질 산물을 투여함으로써 광수용체 변성으로 인한 시력 손실을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양상에 따른 방법은 치료학적 유효량의 GDNF 단백질 산물을 투여함으로써 광수용체 변성으로 인한 시력 손실을 치료하는 것이다. 그와 같은 GDNF 단백질 산물로는 서열 1 에 나타낸 아미노산 서열로 표시되는 바와 같은 GDNF 단백질 뿐만 아니라 그것의 변이체 및 유도체가 포함될 것이다. 본 발명은, GDNF 단백질 산물을 투여하면 실명을 초래하는 망막 변성에 있어 손상된 신경원의 주요 집단인 손상된 광수용체 신경원의 생존 및 재생이 촉진된다는 새로운 발견을 기초로 한다.

GDNF 단백질 산물은 약 0.001 ㎎/일 내지 10 ㎎/일의 투여량으로, 바람직하게는 약 0.01 ㎎/일 내지 1 ㎎/일의 투여량으로, 가장 바람직하게는 약 0.1 ㎎/일 내지 0.5 ㎎/일의 투여량으로 안내 투여될 수 있다. 또한 광수용체 변성이나 손상은 GDNF 단백질 산물을 제 2 치료 약물과 함께 투여함으로써 치료될 수 있는데, 이 제 2 치료 약물로는 뇌 유래 신경영양성 인자, 뉴로트로핀 - 3, 뉴로트로핀 - 4/5, 뉴로트로핀 - 6, 인슐린 - 유사 성장 인자, 모양체 신경영양성 인자, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자 - 5, 형질전환 성장 인자 - β, 및 코카인 - 암페타민 조절된 전사물이 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 안 증상이나 안 질환 치료시 GDNF 단백질 산물 투여를 위한 수송 수단은 유리하게 국소 제제형, 안구 삽입물, 안구 주사제, 안구 이식, 세포 요법 또는 유전자 요법과 관련될 수 있다.

또한 본 발명은 광수용체 손상 또는 변성 치료용 약제 또는 제약학적 조성물 제조시 GDNF 단백질 산물의 용도를 제공한다.

그와 같은 제약학적 조성물로는 국소, 경구 또는 비경구 GDNF 단백질 산물 제제형이 포함된다. 하기에 더 기술되어 있는 바와 같이, 세포 요법 및 유전자 요법 수단에 의해 이 투여 방법이 수행될 수 있다는 것을 본 분야의 기술자들은 인식할 것이다. 다른 양상에 있어, 본 발명은 이식용 광수용세포를 제공하는 방법을 포함하는 것으로, 광수용세포는 GDNF 단백질 산물의 존재하에서 배양한 것이다. 또한 본 발명은 광수용체의 생존을 증진시키며 연속적으로 성장 및 성숙시키는 양의 GDNF 단백질 산물과 함께 광수용세포를 함유하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 여러가지 부가 양상 및 잇점들은 본 분야의 기술자들이 현재 선호하는 실시구체형태를 기술하고 있는 다음 발명의 상세한 설명을 고려하면 자명해 질 것이다.

본 발명은 일반적으로 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자 (GDNF) 단백질 산물을 투여함으로써 망막 신경원의 손상 또는 변성을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 병리학적 증상, 이를테면 광수용체 변성을 유발시키며 시력손실을 초래하는, 유전적 망막 변성 및 연령, 질병 또는 손상 - 관련 망막증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

도 1 은 망막 신경원 배양물에서 광수용체 생존에 대한 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자 (GDNF) 단백질 산물의 효과를 도시한 것이다. 각 값은 세 배양물의 평균 ± 표준편차이다.

도 2 는 GDNF 단백질 산물에 의한 광수용체 신경돌기 성장 촉진을 도시한 것이다. 이 데이터는 신경돌기 길이의 누적 빈도 분포 플롯으로서 표시된 것이다. 주어진 마이크로미터의 길이(횡좌표) 보다 더 긴 신경돌기를 갖는 광수용체의 백분율 (종좌표) 이 그려져 있다.

도 3 은 광수용체 배양물에서 GDNF 단백질 산물에 의한 글루타민산염 섭취 자극을 도시한 것이다. 그 결과는 대조 배양물에서 발견된 글루타민산염 섭취값 (dpm/웰) 의 백분율로서 표시된 것이다.

각 데이터의 점은 각각의 실험에서 수득한 3 웰의 평균 ± 표준편차이다.

도 4A 및 4B는 망막 신경원 배양물에서 GDNF 단백질 산물에 의한 광수용체 생존의 촉진을 도시한 것이다. 생후 18 일 된 마우스와 생후 39 일 된 마우스로 부터의 배양물에서 GDNF 단백질 산물 처리에 반응하는 광수용체수의 변화가 도시되어 있다. 각 값은 2 - 3 배양물의 평균 ± 표준편차이다.

도 5 는 rd/rd 마우스 망막 배양물에서 GDNF 단백질 산물에 의한 광수용체 생존의 촉진을 도시한 것이다. 광수용체 생존은 6 - ㎜ 웰 당 어레스틴 (arrestin) - 양성 신경원의 수를 계산함으로써 측정하였다. 각 값은 3 - 4 배양물의 평균 ± 표준편차이다.

도 6 은 병아리 망막 배양물에서 광수용체 생존에 대한 GDNF 효과를 도시한 것이다. 광수용체 생존은 6 ㎟ 직경 조각 (6 - ㎜ 웰의 총 면적 중 약 21 % 에 상당함) 당 추상체의 수를 계산함으로써 측정하였다. 각 값은 3 배양물의 평균 ± 표준편차이다.

본 발명은 GDNF 단백질 산물이 광수용체에 대한 신경영양성 활성도를 갖는다는 증거를 기초로 한다. 이러한 발견 전에는 GDNF 가 그와 같은 신경영양성 활성도를 가질 수도 있을 거라는 제안이나 암시가 없었다. 본 발명은 제약학적 조성물에 의해 치료학적 유효량의 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자 (GDNF) 단백질 산물을 투여함으로써, GDNF - 발현 세포를 이식함으로써, 또는 GDNF 유전자 요법으로써 망막 신경원, 특히 광수용체의 손상 또는 변성을 치료하는 방법을 제공한다. 서열 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 GDNF, 그것의 변이체 및 유도체를 포함하는, 생물학적으로 활성인 GDNF 단백질 산물을 사용하여 본 발명을 실행할 수 있다.

GDNF 단백질 산물 투여에 대한 광수용체의 반응성을 평가하는 데 사용되는 망막 신경원 집단을 제공하기 위해 독특한 세포 배양 기술을 개발하였다. 이 배양 기술은 하기에 더 상세히 기술되어 있다. GDNF 단백질 산물로 이들 광수용체를 처리한 결과 광수용체 생존이 촉진되었을 뿐만 아니라 이 GDNF 단백질 산물이 광수용체의 축삭 - 유사 돌기의 연장을 자극함으로써 광수용체의 형태학적 발생에 대한 효과가 입증되었다. GDNF 단백질 산물 처리로써 광수용체의 기능 분화가 증진된다는 것이 글루타민산염 섭취 검정으로 더 입증되었다. 이들 결과는 GDNF 단백질 산물 요법의 잠정적 잇점 중의 하나가 광수용체 생존의 촉진, 광수용체의 축삭과 외분절의 재생 및 시력 기능의 회복이라는 것을 암시한다. 따라서, GDNF 단백질 산물의 투여는, 유전적 망막 변성, 연령 - 관련 반점 변성, 손상 - 유도성 망막 변성 및 망막 영양장애 같은 광수용체 변성으로 인해 시력이 손실되는 증상에 이로울 것이다.

본 발명은 GDNF 단백질 산물 치료에 의해, 유전적 망막 변성 증상을 갖고 있는 마우스로 부터의 망막 배양물내 광수용체 생존이 촉진된다는 것을 더 입증한다. rd/rd 마우스의 광수용체 연구는 GDNF 단백질 산물 치료가 광수용체에 대한 rd/rd 돌연변이의 해로운 효과에 대한 내성을 증진시킨다는 것을 설명한다. 이것은 GDNF 단백질 산물 치료가 광수용체 변성 및 사멸을 감소시키고 방지하는 데 유용할 것이며 예를들어 색소성망막염 같은 광수용체 변성을 특징으로 하는, 사람에게 유전되는 망막 질환에 있어 광수용체변성을 반전시키는 데 조차도 유용할 것이라는 사실을 암시한다. 하기 연구로 예증되는 바와 같이, GDNF 단백질 산물 투여는 광수용체 변성을 유발시켜 시력 손실을 초래하는 다양한 병리학적 증상에 이로울 수 있다. 이들 증상에는 색소성망막염, 바르데 - 비들 증후군, 베슨 - 코른 와이그 증후군 (무베타지단백혈증), 베스트병 (비텔리폼 영양장애), 맥락막 결손증, 회전상 위축, 선천성 흑내장, 레프섬 증후군, 스타르가르드병 및 유서 증후군이 포함된다. GDNF 단백질 산물 투여로 이로울 수 있는 다른 망막증에는 연령 - 관련 반점 변성 (건식 및 습윤 형태), 당뇨병성 망막증, 말초성 유리체망막증, 광성 망막증, 외과 수술 - 유도성 망막증, 바이러스성 망막증 (이를테면 AIDS 와 관련있는 HIV 망막증), 허혈성 망막증, 망막 박리 및 외상성 망막증이 포함된다.

현재 바람직한 본 발명의 실시구체형태에 따라, GDNF 단백질 산물은 약 0.001 ㎎/일 내지 10 ㎎/일의 투여량으로, 바람직하게는 약 0.01 ㎎/일 내지 1 ㎎/일의 투여량으로, 가장 바람직하게는 약 0.1 ㎎/일 내지 0.5 ㎎/일의 투여량으로 가장 유리하게 안내 투여된다. 또한 GDNF 단백질 산물을 망막 변성이나 망막 영양장애를 치료하는 제 2 치료 약물과 함께 또는 이것과 공동하여 투여한다. 그와 같은 제 2 치료 약물로는 다음이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다 : 인슐린, 인슐린 - 유사 성장 인자, 상피 성장 인자, 혈관작용 성장 인자, 하수체 아데닐산염 사이클레이스 활성 폴리펩티드, 인터페론 및 소마토스타틴 같은 마이토젠 ; 뇌 유래 신경영양성 인자, 뉴로트로핀 - 3, 뉴로트로핀 - 4/5, 뉴로트로핀 - 6, 인슐린 - 유사 성장 인자, 모양체 신경영양성 인자, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자 - 5, 형질전환 성장 인자 - β 및 코카인 - 암페타민 조절된 전사물 (CART) 같은 신경영양성 인자 ; 및 상피 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 인터루킨, 인터페론 및 군체 자극 인자 같은 다른 성장 인자 ; 뿐만 아니라 이들 인자들과 기능적으로 동등한 분자 및 물질.

또한 본 발명은 상기한 질병 및 증상의 치료를 포함하는, 광수용체의 손상 또는 변성 치료용 약제 제조시 GDNF 단백질 산물의 용도를 제공한다. 그와 같은 GDNF 단백질 산물의 제약학적 제제에 관하여는 하기에 더 충분히 기술되어 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "GDNF 단백질 산물" 이란 정제된 자연, 합성 또는 재조합 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자, 그것의 생물학적으로 활성인 GDNF 변이체 (삽입, 치환 및 결실 변이체 포함) 및 그것의 화학적으로 변형시킨 유도체를 포함한다. 또한 서열 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인체 GDNF 와 실질적으로 상동인 GDNFs 도 포함된다. GDNF 단백질 산물은 생물학적 활성 형태로 호모이량체나 헤테로이량체로서 존재할 수도 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성" 이란 GDNF 단백질 산물이 서열 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 GDNF 와 유사한 신경영양성 특성을 나타내나, 반드시 모두 이와 동일한 특성은 아니며, 반드시 이와 동일한 정도가 아님을 의미한다. 흥미 있는 특정 신경영양성 특성의 선택은 투여되는 GDNF 단백질 산물의 용도에 달려 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 상동" 이란 서열 1 에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 GDNF 에 대한 상동성 정도를 갖는다는 것을 의미하는데, 즉 70 % 를 초과하는 정도가 바람직하고, 가장 바람직하게는 80 % 를 초과하며, 90 % 나 95 % 를 초과하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 예를들어, 랫과 인체 단백질 사이의 상동성 정도는 약 93 % 인데, 선호되는 포유동물 GDNF 가 유사하게 높은 상동성 정도를 가질 것이라 예상된다. 본원에 기술한 상동성 백분율은 비교되는 서열을 동일한 아미노산으로 일직선이 되게 하여 두 서열 중 더 작은 서열에서 발견되는 아미노산 잔기의 백분율로서 계산하는데, 이 때 그와 같은 정렬을 돕기 위해 100 개 아미노산 길이에 4 개의 갭을 도입시킬 수 있다(Dayhoff, in Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972) 문헌에 기술되어 있음, 이 문헌의 내용을 본원의 참고 문헌으로 인용함). 또한 실질적으로 상동인 것에는 서열 1 의 GDNF 에 대한 항체와 교차 - 반응시킴으로써 분리할 수 있는 어떠한 GDNF 단백질 산물도 포함되거나 서열 1 의 GDNF 를 코드하는 유전자나 유전자 단편으로 혼성화시킴으로써 분리할 수 있는 유전자도 포함된다.

본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있는 어떠한 수단으로도 본 발명에 따른 GDNF 단백질 산물을 분리하거나 생성시킬 수 있다. 본 발명에 유용한, GDNF 단백질 산물을 생산하는 전형적인 방법은 1994년 5월 23일자로 제출한 미국 출원 번호 제 08/182,183 호와 그것의 모출원 ; 제 WO 93/06116 호(Lin 등의 Syntex - Synergen Neuroscience Joint Venture)로 공개된, 1992년 9월 17일자 제출된 PCT 출원 번호 제 PCT/US92/07888 호 ; 제 EP 610 254 호로 공개된 유럽 특허 출원 번호 제 92921022.7 호 ; 및 1995년 9월 28일자로 제출한 공동 - 소유, 공동 - 계류중인 미국 출원 번호 제 08/535,681 호("절두된 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자")에 기술되어 있으며, 이들 명세서 전부를 본원의 참고문헌으로 인용한다.

포유동물 신경원 세포 제제로 부터나, GDNF 를 분비하거나 발현하는 포유동물 세포주로 부터 자연 발생적인 GDNF 단백질 산물을 분리할 수 있다. 예를들어, B49 신경교아종 세포의 무혈청 성장 조정 배지로 부터 GDNF 를 분리하는 것에 관하여는 제 WO 93/06116 호에 기술되어 있다. 또한 GDNF 단백질 산물은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있는 어떠한 수단으로도 화학적으로 합성시킬 수 있다. 재조합 기술에 의해 GDNF 단백질 산물을 생산하는 것이 바람직한데, 그 이유는 비교적 더 많은 양의 단백질을 더 고 순도로 획득할 수 있기 때문이다. 재조합 GDNF 단백질 산물의 형태로는 이 단백질의 글리코실화된 형태와 비글리코실화된 형태, 및 박테리아, 포유동물 또는 곤충 세포계에서 발현되는 단백질이 포함된다.

일반적으로, 재조합 기술은 GDNF 를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이 유전자를 적합한 벡터와 세포 유형에 클로닝시키고, 필요하다면 원하는 변이체를 코딩하도록 유전자를 변형시키며, GDNF 단백질 산물을 생산하기 위해 이 유전자를 발현시킴을 포함한다. 택일적으로, 원하는 GDNF 단백질 산물을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성할 수도 있다. 유전 코드나 대립형질 변이체의 동의성으로 인해 코돈 용도가 달라 진 뉴클레오티드 서열을 사용하여 GDNF 단백질 산물을 발현시키고자 한다. 랫 GDNF 유전자의 cDNA 클론의 분리와 서열결정, 및 인체 GDNF 유전자의 cDNA 클론의 분리와 서열결정, 및 인체 GDNF 유전자의 게놈 DNA 클론의 분리, 서열결정 및 발현에 관하여는 제 WO 93/06116 호에 기술되어 있다. 또한 GDNF 단백질 산물을 발현시키기 위한 벡터, 숙주세포, 및 배양 성장 조건에 관하여는 제 WO 93/06116 호에 기술되어 있다. E. coli 에서 GDNF 단백질 산물을 발현시키기에 적합한 부가 벡터에 관하여는 1991년 4월 24일자로 공개된 공개 유럽 특허 출원 번호 제 EP 0 423980 호 ("간세포 인자")에 기술되어 있으며, 이 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용한다. 성숙한 인체 GDNF 를 코딩하는 유전자의 DNA 서열 및 이 GDNF 의 아미노산 서열은 제 WO 93/06116 호의 제 19 도(서열 5)에 나타나 있다. 제 19 도는 GDNF 의 프리 - 프로 부분에 대한 전체 코드 서열을 나타낸 것은 아니지만, 인체 프리 - 프로 GDNF 의 첫 번째 50 개 아미노산은 제 WO 93/06116 호의 제 22 도(서열 8)에 나타나 있다.

자연 발생적인 GDNF 는 생물학적 활성 형태로서 이황화물 결합된 이량체이다. 박테리아계에서 발현시킨 후 분리한 물질은 본질적으로 생물학적 비활성이며, 단량체로서 존재한다. 생물학적으로 활성인 이황화물 결합된 이량체를 생산하기 위해서는 재생(refolding)이 필요하다. 박테리아계에서 발현되는 GDNF 를 재생시키고 자연화(naturation)시키기 위한 과정은 제 WO 93/06116 호에 기술되어 있다. GDNF 활성도를 측정하기 위한 표준 시험관내 검정에 관하여는 제 WO 93/06116 호 및 1995년 9월 28일자로 제출된 공동 - 소유의 공동 - 계류중인 미국 출원 번호 제 08/535,681 호에 기술되어 있으며, 이를 본원의 참고문헌으로 인용한다.

A. GDNF 변이체

본원에 사용된 바와 같은 용어 "GDNF 변이체" 는 자연 발생적인 GDNF 의 아미노산 서열 이내의 잔기에서 아미노산을 결실시키고 ("결실 변이체"), 이 잔기 내에 아미노산을 삽입시키거나("부가 변이체"), 이 잔기 대신 아미노산을 치환시킨("치환 변이체") 폴리펩티드를 포함한다. 그와 같은 변이체는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 내로 고유 뉴클레오티드 변화를 도입시키거나 원하는 폴리펩티드를 시험관내 화학 합성하여 제조한다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 다수의 결실, 삽입 및 치환을 조합함으로써, 최종 분자가 GDNF 생물학적 활성도를 갖도록 제조할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

하나 또는 그 이상의 선택된 아미노산 잔기를 치환, 삭제 또는 결실시키기 위한 돌연변이유발 기술은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 잘 알려져 있다(예를들어, 미국 특허 번호 제 4,518,584 호 참조, 이의 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용함). 변이체 구성시 2 개의 주요 변수가 존재한다 : 돌연변이 부위의 위치와 돌연변이의 특징. GDNF 변이체를 고안하는데 있어 돌연변이 부위와 그 돌연변이의 특징을 선택하는 것은 변형시킬 GDNF 특성(들)에 달려있을 것이다. 돌연변이 부위는 개별적으로나 연속적으로 변이시킬 수 있는데, 예를들어, (1) 먼저 보존적 아미노산 선택물로 치환시킨 다음 획득된 결과에 따라 라디칼 선택물로 더 치환시키고, (2) 표적 아미노산 잔기를 결실시키거나, (3) 위치가 정해진 부위에 인접하는 아미노산 잔기를 삽입시킴으로써 변형시킬 수 있다. 1 내지 20 개 아미노산의 보존적 변화가 바람직하다. 일단 원하는 GDNF 단백질 산물의 아미노산 서열이 결정되면, 그 단백질의 발현에 사용될 핵산 서열은 쉽게 결정된다. N - 말단 및 C - 말단 결실 변이체 역시 단백질 가수분해 효소를 사용하여 생성시킬 수 있다.

GDNF 결실 변이체에 있어서, 결실은 대개 약 1 내지 30 개 잔기의 범위이고, 더 보통으로 약 1 내지 10 개 잔기이며, 전형적으로 약 1 내지 5 개의 인접 잔기이다. N - 말단, C - 말단 및 내부 서열내의 결실을 의도하고자 한다. 다른 TGF - β 상과(super family) 부류와 낮은 상동성을 갖는 부위내에 결실이 도입되면 GDNF 의 활성도가 변화될 수 있다. 다른 TGF - β 상과 서열과 실질적으로 상동성인 부위의 결실이 GDNF 생물학적 활성도를 상당히 더 변형시키는 것 같다. 영향 받은 도메인내에, 예를들어 시스테인 교차 결합된 도메인내에 GDNF 단백질 산물의 3 차 구조를 보존시키기 위해 보존적 결실수를 선택할 것이다. 결실 변이체의 비제한적인 예로는 GDNF 의 1 내지 40 개 N - 말단 아미노산이 결여된 절두형 GDNF 단백질 산물, 또는 GDNF 의 상기 C - 말단 잔기가 결여된 변이체, 또는 그것의 조합체들이 포함되는데, 이것에 관하여는 본원의 참고문헌으로 인용된, 1995년 9월 28일자로 제출된 공동 - 소유, 공동 - 계류중인 미국 출원 번호 제 08/535,681 호에 기술되어 있다.

GDNF 부가 변이체에 있어서, 아미노산 서열 부가는 전형적으로, 하나의 잔기에서 100 개 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드의 길이까지로 범위가 정해진 N - 및/또는 C - 말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 내부 서열내 부가를 포함한다. 대개 내부 부가는 약 1 내지 5 개 잔기, 및 보통 약 1 내지 3 개 아미노산 잔기로 범위를 정할 수 있다. N - 말단 부가 변이체의 예로는, [Met^-1]GDNF 라고 명명한, N - 말단 메티오닐 잔기를 수반한 GDNF(박테리아 재조합 세포 배양액에서 GDNF 를 직접 발현시킨 인공 산물), 및 재조합 숙주세포로 부터 성숙한 GDNF 의 분비를 촉진시키기 위해 GDNF 의 N - 말단에 이종성 N - 말단 시그널 서열을 융합시킨 융합체가 포함된다. 그와 같은 시그널 서열은 대개 의도한 숙주세포종으로 부터 수득할 것이며, 따라서 그 숙주세포종과 상동성일 것이다. 또한 부가는 다른 신경영양성 인자의 서열로 부터 유래된 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위해 바람직한 GDNF 단백질 산물은 재조합 인체[Met^-1]GDNF 이다.

GDNF 치환 변이체는 GDNF 아미노산 서열 중 최소한 하나의 아미노산 잔기를 제거하여 그 곳에 다른 잔기를 삽입시킨 것이다. 그와 같은 치환 변이체는 대립형질 변이체를 포함하며, 이것은 그 종 집단에서의 자연 발생적인 뉴클레오티드 서열 변화를 특징으로 하는데, 결과적으로 아미노산 변화가 초래될 수 있거나 초래되지 않을 수 있다. 치환 변이체들(예를들어, 서열 50 참조)의 예는 본원에서 참고문헌으로 인용한, 1995년 9월 28일자 제출된 공동 - 소유, 공동 - 계류중인 미국 출원 번호 제 08/535,681 호에 기술되어 있다.

GDNF 아미노산 서열의 특이 돌연변이는 글리코실화 부위(예를들어, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴)에 대한 변형과 관련될 것이다. 글리코실화의 부재 또는 단지 부분 글리코실화는 어떤 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위에서 든지 아니면 0 - 결합 탄수화물을 부가하여 변형시킨 상기 분자의 어떤 부위에서 든지 아미노산이 치환되거나 결실되어 이루어진 것이다. 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위는 고유 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열을 포함한다. 이 트리펩티드 서열은 Asn - Xaa - Thr 이나 Asn - Xaa - Ser 중 하나인데, 여기서 Xaa 는 Pro 이외의 어떤 아미노산일 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 제 1 아미노산 위치나 제 3 아미노산 위치 중 하나 또는 둘 다에서 다양하게 아미노산 치환시키거나 결실시키면(및/또는 제 2 위치에서 아미노산 결실시키면) 이 변형된 트리펩티드 서열에서 결과적으로 비글리코실화가 초래된다. 따라서, 고유한 변형 뉴클레오티드 서열을 발현시키면 그 부위에서 글리코실화되지 않은 변이체가 생산된다. 택일적으로, 글리코실화 부위를 부가하여 GDNF 아미노산 서열을 변형시킬 수도 있다.

GDNF 아미노산 잔기, 또는 "알라닌 주사(scanning) 돌연변이유발" 이라고 부르는 돌연변이유발을 위한 부위를 확인하는 한 방법은 Cunningham 및 Wells 의 문헌(Science, 244 : 1081 - 1085, 1989 참조)에 기술되어 있다. 이 방법으로, 아미노산 잔기 또는 표적 잔기군을 확인하여(예를들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu 같은 하전 잔기) 세포내 또는 외부의 주변 수성 환경과 이 아미노산과의 상호작용에 영향을 미치는 중성적으로나 음성적으로 하전된 아미노산(알라닌 또는 폴리알라닌이 가장 바람직함)으로 대체시킨다. 그런 다음 치환 부위에 부가 또는 교체 잔기를 도입시킴으로써 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 상기 도메인을 순화시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입시키기 위한 표적 부위를 결정하여, 그 DNA 서열 중 상응 표적 코돈이나 부위 상에서 알라닌 주사 또는 무작위 돌연변이유발을 수행한 후, 원하는 활성도와 활성도 정도를 갖는 최적 조합에 대해 발현된 GDNF 변이체를 선별한다.

치환 돌연변이 유발에 있어 가장 흥미 있는 부위는 곁사슬 크기, 전하, 및/또는 소수성 면에서 실질적으로 다른, 다양한 종의 GDNF 단백질에서 발견되는 아미노산 부위를 포함한다. 흥미 있는 다른 부위는 다양한 종으로 부터 수득한, GDNF - 유사 단백질의 특정 잔기 부위로서, 상기와 동일하다. 처음에, 이들 부위를 비교적 보존 방식으로 치환시킨다. 그와 같은 보존적 치환은 표 1 의 표제, 우선 치환 아래에 나타나 있다. 만일 그러한 치환이 생물학적 활성도의 변화를 초래한다면, 더 많은 치환 변화(견본 치환)를 도입시키고/도입시키거나 다른 부가 또는 결실을 이루어 결과적으로 생성된 산물을 활성도에 대해 선별한다.

표 1

아미노산 치환

원잔기 우선 치환 견본치환

Ala(A) Val Val ; Leu ; Ile

Arg(R) Lys Lys ; Gln ; Asn

Asn(N) Gln Gln ; His ; Lys ; Arg

Asp(D) Glu Glu

Cys(C) Ser Ser

Gln(Q) Asn Asn

Glu(E) Asp Asp

Gly(G) Pro Pro

His(H) Arg Asn ; Gln ; Lys ; Arg

lle(I) Leu Leu ; Val ; Met ; Ala ;

Phe ; 노르로이신

Leu(L) Ile 노르로이신 ; Ile ; Val ;

Met ; Ala ; Phe

Lys(K) Arg Arg ; Gln ; Asn

Met(M) Leu Leu ; Phe ; Ile

Phe(F) Leu Leu ; Val ; Ile ; Ala

Pro(P) Gly Gly

Ser(S) Thr Thr

Thr(T) Ser Ser

Trp(W) Tyr Tyr

Tyr(Y) Phe Trp ; Phe ; Thr ; Ser

Val(V) Leu Ile ; Leu ; Met ; Phe ;

Ala ; 노르로이신

상기 아미노산에 대한 보존적 변형(및 코딩 핵산 서열에 대한 상응 변형)으로, 자연 GDNF 의 특성과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 갖는 GDNF 단백질 산물이 생산된다고 예상된다. 대조적으로, 다음을 유지시키는 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써, GDNF 단백질 산물의 기능적 및/또는 화학적 특성의 실질적인 변형을 수행할 수 있다 : (a) 치환 영역의 폴리펩티드 골격 구조, 예를들어, 시트 또는 나선 입체 형태, (b) 표적 부위에서 상기 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 곁사슬 크기. 일반적인 곁사슬 특성을 기초로 자연 발생적인 잔기들은 다음 군으로 나뉜다 :

1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ;

2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr ;

3) 산성 : Asp, Glu ;

4) 염기성 : Asn, Gln, His, Lys, Arg ;

5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및

6) 방향성 : Trp, Tyr, Phe.

비 - 보존적 치환은 이들 종류 중 한 부류를 다른 부류로 교환시키는 것과 관련될 수 있다. 그와 같이 치환시킨 잔기를, 다른 TGF - β 상과 단백질과 상동성인 GDNF 단백질의 부위 내로, 또는 이 분자의 비 - 상동성 부위 내로 도입시킬 수 있다.

B. GDNF 유도체

본원 명세서에 주어진 기술분야의 숙련된 기술자들은 화학적으로 변형된 GDNF 의 유도체 또는 GDNF 변이체를 제조할 수 있다. 유도체화에 가장 적합한 화학 성분에는 수용성 중합체가 포함된다. 수용성 중합체는, 단백질에 부착되며 수성 환경, 예를들어, 생리학적 환경에서 침전되지 않으므로, 가장 바람직하다. 바람직하게, 이 중합체는 치료학적 산물이나 조성물의 제조를 위해 제약학적으로 용인가능할 것이다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 상기 중합체 단백질 결합체가 치료학적으로 사용될 것인지의 여부와, 만일 그렇다면, 요구 투여량, 순환 시간, 단백질 가수 분해에 대한 저항성 및 다른 고려할 사항들을 기초로 원하는 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 유도체를 원하는 형태로(즉, 삼투성 펌프에 의해, 또는 더 바람직하게, 주사나 주입에 의해, 또는 경구, 폐 또는 다른 전달 경로용으로 더 제형화시킨 형태로써) 투여하고, 그 유효성을 결정함으로써 유도체화의 유효성을 확인할 수 있다.

적합한 수용성 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체류, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리 - 1, 3 - 디옥솔란, 폴리 - 1, 3, 6 - 트리옥산, 에틸렌/무수말레산 공중합체, 폴리아미노산류(동종중합체나 무작위 공중합체 중 하나) 및 덱스트란이나 폴리(n - 비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체류, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체류, 폴리옥시에틸화된 폴리올류(예를들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그것들의 혼합물이 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가, 물내에서 안정하므로, 제조시 유리할 것이다.

중합체는 어떠한 분자량도 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우, 바람직한 분자량은 취급하고 제조하기에 용이한 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 의 범위이다(용어 "약" 은 폴리에틸렌 글리콜 제제에 있어 어떤 분자들의 분자량은 상태 분자량보다 더 많을 것이고, 어떤 분자들은 그 보다 더 적을 것이라는 것을 나타내는 것이다). 원하는 치료학적 프로필에 따라 다른 크기를 사용할 수도 있다(예를들어, 원하는 지속된 방출 기간, 효과, 만약 존재한다면, 생물학적 활성도, 취급의 용이, 항원성의 정도나 결여 및 치료학적 단백질 또는 변이체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 공지된 효과).

상기와 같이 부착시킨 중합체 분자의 수는 다양할 것이며, 본 분야의 숙련된 기술자들은 기능상 효과를 확인할 수 있을 것이다. 기술자들은 동일하거나 다른 화학 성분들(예를들어, 다른 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 같은 중합체들)로 모노 - 유도체화할 수 있거나, 디-, 트리-, 테트라 - 또는 다소 조합의 유도체화를 제공할 수 있다. 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 중합체 분자의 비율은, 반응 혼합물내 그것들의 농도에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 원하는 유도체화의 정도(예를들어, 모노-, 디-, 트리- 등), 선택한 중합체의 분자량, 중합체가 분지된 것인지 비분지된 것인지의 여부 및 반응 조건과 같은 인자들에 의해 최적 비율(반응의 효율면에서, 즉 과량의 비반응 단백질이나 중합체가 존재하지 않는다는 면에서)이 결정될 것이다.

단백질의 기능적 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려하여 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 다른 화학 성분)를 부착시켜야 한다. 본 분야의 숙련된 기술자들에게 용이한 여러 가지 부착 방법들이 있다. 예를들어, 그 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용한 제 EP 0 401384 호(G - CSF 에 대한 PEG 결합)를 참조하고, Malik 등의 Exp. Hematol., 20 : 1028 - 1035, 1992 문헌(트레실 염화물을 사용한 GM - CSF 의 폴리에틸렌 글리콜화에 관하여 보고하고 있음)도 참조하시오. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜을 유리 아미노기 또는 유리 카르복실기 같은 반응기에 의해 아미노산 잔기를 통하여 공유결합시킬 수 있다. 반응기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합될 수 있는 기들이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기로는 리신 잔기 및 N - 말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 유리 카르복실기를 갖는 아미노산 잔기로는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 및 C - 말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 분자(들)을 부착시키는 반응기로서 설프히드릴기가 사용될 수도 있다. 치료학적 목적으로, N - 말단이나 리신기에서의 부착과 같은 아미노기에서의 부착이 바람직하다. 만일 수용체 결합이 필요하면, 수용체 결합용으로 중요한 잔기에서의 부착은 피해야 한다.

특히 기술자들은 N - 말단에서 화학적으로 변형된 단백질을 원할 수도 있다. 기술자들은 본 조성물의 실례로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 경우 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 분지 등에 의함), 반응 혼합물 내 단백질(또는 펩티드)에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 수행할 폴리에틸렌 글리콜화 반응의 유형 및 선택된 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 수득하는 방법으로 부터 선택할 수 있다. N - 말단 적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 제제를 수득하는 방법(즉, 필요하다면 이 성분을 다른 모노폴리에틸렌 글리콜화된 성분들로부터 분리시킴)은 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질 분자 집단으로 부터 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 정제하는 것일 수도 있다. 특정 단백질의 유도체화에 이용가능한 다른 유형의 일차 아미노기(N - 말단 대 리신)의 차별적인 반응성을 사용하는 환원성 알킬화에 의해 선택적 N - 말단 화학 변형을 수행할 수 있다. 고유 반응 조건 하에서, 카르보닐기 함유 중합체를 수반하여 N - 말단에서 실질적으로 단백질의 선택 유도체화를 획득한다. 예를들어, 기술자들은 리신 잔기의 ε - 아미노기와 단백질의 N - 말단 잔기의 α - 아미노기 간의 pka 차이의 잇점을 얻을 수 있도록 하는 pH 에서 반응을 수행함으로써 단백질을 선택적으로 N - 말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화시킬 수 있다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한 수용성 중합체의 부착은 다음과 같이 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 우선적으로 일어나며 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기의 유의 변형은 발생하지 않는다. 환원성 알킬화를 이용할 경우, 수용성 중합체는 상기한 유형일 수 있으며 단백질에 결합하는 단일 반응성 알데히드를 가져야 한다. 단일 반응성 알데히드를 포함하는, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드를 사용할 수도 있다.

본 발명은 원핵 - 발현 GDNF 를 최소한 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합시킨 유도체, 또는 그의 변이체의 용도 뿐만 아니라 아실이나 알킬 결합에 의해 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시킨 GDNF, 또는 그의 변이체의 용도를 예상한다.

본 분야에 공지된 폴리에틸렌 글리콜화 반응 중 어떠한 반응으로도 폴리에틸렌 글리콜화를 수행할 수 있다. 예를들어 다음 문헌을 참조하시오 : Focus on Growth Factors, 3 (2) : 4-10, 1992 ; 제 EP 0 154 316 호, 이 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용함 ; 제 EP 0 401 384 호 ; 및 폴리에틸렌 글리콜화에 관련된, 본원에서 인용한 다른 공개 문헌들. 반응 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 구조유사성 반응 수용성 중합체)와 함께 아실화 반응이나 알킬화 반응시켜 폴리에틸렌 글리콜화를 수행할 수 있다.

아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 대개 폴리에틸렌 글리콜의 활성 에스테르 유도체를 GDNF 단백질이나 변이체와 반응시키는 것을 포함한다. 어떤 공지된 반응 PEG 분자나 그 후에 발견된 반응 PEG 분자도 GDNF 단백질 또는 변이체를 폴리에틸렌 글리콜화 시키는데 사용할 수 있다. 바람직한 활성화 PEG 에스테르는 N - 하이드록시숙시니미드에 대해 에스테르화된 PEG 이다. 본원에 사용된 바와 같이, "아실화"란 PEG 같은 수용성 중합체와 치료학적 단백질 간에 다음 유형의 결합을 제한없이 포함시키고자 한다 : 아미드, 카르바메이트, 우레탄등. Bioconjugate Chem., 5 : 133 - 140, 1994 문헌을 참조하시오. 반응 조건은 폴리에틸렌 글리콜화 기술분야에 공지되어 있는 조건들 중 어느 조건 또는 그 후에 발견된 조건들로부터 선택할 수 있지만, 변형될 GDNF 나 변이체를 불활성화시킬 온도, 용매 및 pH 의 조건은 피해야 한다.

아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체를 생성시킬 것이다. 바람직하게, 연결 결합은 아미드 일 것이다. 또한 바람직하게, 결과 산물은 실질적으로 오직(예를들어, > 95 %) 모노-, 디- 또는 트리- 폴리에틸렌 글리콜화된 것일 것이다. 그러나, 사용한 특정 반응 조건에 따라 더 높은 정도의 폴리에틸렌 글리콜화를 지닌 일부 종이 형성될 수도 있다. 원한다면, 혼합물로 부터 더 정제된 폴리에틸렌 글리콜화 종을 분리할 수 있으며, 특히, 표준 정제 기술, 그 중에서도 투석, 염석, 한외여과, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 포함하는 기술로써 비반응된 종을 분리할 수 있다.

알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 대개 환원제의 존재하에서 PEG 의 말단 알데히드 유도체를 GDNF 단백질 또는 변이체와 반응시키는 것을 포함한다. 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화 역시 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체를 생성시킬 수 있다. 게다가, 기술자들은 폴리에틸렌 글리콜화가 실질적으로 GDNF 단백질 또는 변이체의 N - 말단에 있는 α - 아미노기에서만 유리하도록(즉, 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질) 반응 조건을 조작할 수 있다. 모노폴리에틸렌 글리콜화나 폴리폴리에틸렌 글리콜화 중 어느 경우에나 -CH₂-NH- 기에 의해 PEG 기를 단백질에 부가시키는 것이 바람직하다. 특히 -CH₂- 기와 관련하여, 본원에서는 이 유형의 결합을 "알킬" 결합이라고 언급한다.

모노폴리에틸렌 글리콜화된 산물을 생성시키는 환원성 알킬화에 의한 유도체화에는 유도체화에 유용한 다른 유형의 일차 아미노기(N - 말단 대 리신)의 차별적인 반응성을 이용한다. 리신 잔기의 ε - 아미노기와 단백질의 N - 말단 잔기에 있는 α - 아미노기 간의 pka 차이의 잇점을 얻을 수 있도록 하는 pH 에서 이 반응을 수행한다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한, 알데히드와 같은 반응기를 포함하는 수용성 중합체의 부착이 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N - 말단에서 우선적으로 일어나는데 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기의 유의 변형은 발생되지 않는다. 한 중요한 양상에 있어, 본 발명은 실질적으로 균질한 제제인 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체 분자(GDNF 단백질 또는 변이체는 실질적으로 오직 (즉, > 95 %) 단일 위치에서 중합체 분자에 부착시킨 것을 의미함)의 실질적으로 상동성 제제의 용도를 예상한다. 더 특별하게, 폴리에틸렌 글리콜을 사용한다면, 본 발명은 가능성 있는 항원성 결합기가 결여되어 있고, GDNF 단백질 또는 변이체에 직접 결합된 폴리에틸렌 글리콜 분자를 갖는 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체의 용도 역시 포함한다.

따라서, 본 발명에 따라 사용할 GDNF 단백질 산물로는 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체가 포함될 수 있다고 예상되는데, 여기서 PEG 기(들)은 아실기나 알킬기에 의해 부착시킨다. 상기한 바와 같이, 그러한 산물은 모노 - 폴리에틸렌 글리콜화된 것이거나 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 것(예를들어, 2-6 개, 바람직하게 2-5 개 PEG 기 함유)일 수 있다. 대개 아미노산의 α - 또는 ε - 아미노기에서 PEG 기를 단백질에 부착시키지만, 또한 단백질에 부착된 어떠한 아미노기에서도 PEG 기를 부착시킬 수 있다고 예상되는데, 이 아미노기는 적합한 반응 조건 하에서 PEG 기에 부착되도록 충분히 반응성이다.

아실화 및 알킬화 접근법 모두에 사용되는 중합체 분자는 상기한 수용성 중합체 중에서 선택할 수 있다. 아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드 같이 단일 반응기를 갖도록, 선택한 중합체를 변형시켜서 중합체화 정도가 본 발명에서 제공한 대로 조절될 수 있도록 해야 한다. 전형적인 반응 PEG 알데히드는 물에 안정한, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드이거나 그것의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴록시 유도체이다(미국 특허 번호 제 5,252,714 호 참조). 이 중합체는 분지된 것이거나 분지되지 않은 것일 수도 있다. 아실화 반응에 있어, 선택한 중합체(들)은 단일 반응 에스테르기를 가져야 한다. 본 환원성 알킬화에 있어, 선택한 중합체(들)은 단일 반응 알데히드기를 가져야 한다. 일반적으로, 자연 발생적인 글리코실 잔기로 부터는 수용성 중합체를 선택하지 않을 것인데, 그 이유는 이 중합체가 보통 포유동물 재조합 발현계에 의해 더 알맞게 만들어지기 때문이다. 이 중합체는 어떠한 분자량도 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않은 것일 수도 있다.

본원에 사용하기 위해 특히 선호되는 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 본원에 사용한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은, 모노 - (C1-C10) 알콕시 - 또는 아릴록시 - 폴리에틸렌 글리콜 같은, 다른 단백질을 유도체화시키는데 사용한 PEG 의 형태 중 어떠한 형태도 포함하는 것을 의미한다.

일반적으로, 생물학적 활성 물질을 활성화된 중합체 분자와 반응시키는데 사용되는 어떠한 적합한 조건하에서도 화학 유도체화를 수행할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체를 제조하는 방법은 대개 다음 단계들을 포함한다 : (a) 상기 단백질이 하나 또는 그 이상의 PEG 기에 부착되도록 하는 조건하에서 GDNF 단백질 또는 변이체를 폴리에틸렌 글리콜(예를들어 PEG 의 반응 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응시키는 단계 및 (b) 반응 산물(들)을 수득하는 단계. 일반적으로, 아실화 반응을 위한 최적 반응 조건은 공지된 변수들 및 원하는 결과를 기초로 경우에 따라 결정할 것이다. 예를들어, PEG : 단백질의 비율이 커질수록 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 산물의 백분율은 많아질 것이다.

실질적으로 균질한 집단인 모노 - 중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체 분자를 생성시키는 환원성 알킬화는 일반적으로 다음 단계들을 포함할 것이다 : (a) 환원성 알킬화 조건하에서, 즉 상기 GDNF 단백질 또는 변이체의 아미노 말단에 있는 α- 아미노기를 선택적으로 변형시키기에 적합한 pH 에서 GDNF 단백질 또는 변이체를 반응 PEG 분자와 반응시키는 단계 ; 및 (b) 반응 산물(들)을 수득하는 단계.

실질적으로 균질한 집단인 모노 - 중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체 분자에 있어, 환원성 알킬화 반응 조건이란 GDNF 단백질 또는 변이체의 N - 말단에 수용성 중합체 성분을 선택적으로 부착시킬 수 있는 조건이다. 그러한 반응 조건은 대개 리신 아미노기와 N - 말단에 있는 α - 아미노기 간의 pka 차이를 제공한다(pka 란 상기 아미노기 중 50 % 는 양성자 첨가되어 있고 50 % 는 그러하지 않을 때의 pH 이다). 이 pH 역시 사용할 단백질에 대한 중합체의 비율에 영향을 미친다. 일반적으로, pH 가 보다 더 낮으면, 단백질에 대해 더 많은 과량의 중합체가 요구될 것이다(즉, 반응 N - 말단의 α - 아미노기가 적을 수록 최적 조건을 획득하기 위해 더 많은 중합체가 필요하다). 만일 pH 가 더 높다면, 중합체 : 단백질 비율은 그 만큼 많을 필요는 없다(즉, 더 많은 반응기가 이용되므로 더 적은 중합체 분자가 요구된다). 본 발명을 위한 pH 는 대개 3 - 9 범위, 바람직하게는 3 - 6 범위 이내일 것이다.

또 다른 중요한 고려할 사항은 중합체의 분자량이다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 더 클 수록, 더 적은 중합체 분자가 단백질에 부착될 수 있다. 유사하게, 이 변수들을 최적화할 때 중합체의 분지도 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 더 클 수록(또는 더 많이 분지되어 있을 수록) 중합체 : 단백질 비율은 더 크다. 대개, 본원에서 의도하는 폴리에틸렌 글리콜화 반응을 위해 바람직한 평균 분자량은 약 2 kDa 내지 약 100 kDa 이다. 바람직한 평균 분자량은 약 5 kDa 내지 약 50 kDa 이며, 특히 바람직하게 약 12 kDa 내지 약 25 kDa 이다. GDNF 단백질 또는 변이체에 대한 수용성 중합체의 비율은 대개 1 : 1 내지 100 : 1 의 범위일 것이며, 바람직하게 1 : 1 내지 20 : 1 (폴리에틸렌 글리콜화를 위해)이며 1 : 1 내지 5 : 1 (모노폴리에틸렌 글리콜화를 위해)이다.

상기한 조건들을 사용하여 환원성 일킬화시키면, 아미노 말단에서 α - 아미노기를 갖는 어떠한 GDNF 단백질 또는 변이체에도 중합체가 선택적으로 부착될 것이며, 실질적으로 균질한 제제인 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체가 제공될 것이다. 본원에 사용한 용어 "모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체"란 GDNF 단백질 또는 GDNF 변이체 단백질 분자에 부착된 단일 중합체 분자로 이루어진 조성물을 의미한다. 바람직하게 모노중합체/ GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체는 리신 아미노 곁사슬기가 아니라 N - 말단에 위치하는 중합체 분자를 가질 것이다. 이 제제는 90 % 이상의 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체가 바람직할 것이며, 95 % 이상의 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체가 더욱 바람직할 것인데, 그 나머지 관찰 가능한 분자들은 비반응된 것이다(즉, 중합체 성분이 결여된 단백질).

본 환원성 알킬화에 있어, 환원제는 수용액에 안정해야 하고 환원 알킬화의 초기 과정에서 형성되는 쉬프 염기만을 바람직하게 환원시킬 수 있어야 한다. 바람직한 환원제는 소디움 보로하이드리드, 소디움 시아노보로하이드리드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 피리딘 보란 중에서 선택할 수 있다. 용매, 반응 시간, 온도등과 같은 다른 반응 변수들, 및 산물의 정제 수단들은 수용성 중합체를 수반한 단백질의 유도체화와 관련되는 공개 정보를 근거로 경우에 따라 결정할 수 있다(본원에 인용된 공개 문헌 참조).

C. GDNF 단백질 산물의 제약학적 조성물

GDNF 단백질 산물의 제약학적 조성물은 일반적으로 제약학적 및 생리학적으로 용인가능한 하나 또는 그 이상의 제제형 물질과 함께 혼합시킨 치료학적 유효량의 GDNF 단백질 산물을 포함한다. 알맞은 제제형 물질로는 항산화제, 방부제, 착색제, 향료제 및 희석제, 유화제, 현탁제, 용매, 충진제, 팽창제, 완충액, 운반 매개체, 희석제, 부형제 및 / 또는 제약학적 보조제가 포함되지만 이것으로 제한되지는 않는다. 예를들어, 적당한 부형제는 주사용액, 생리학적 식염수 또는 인조 CSF 일 수 있으며 비경구 투여용 조성물에 공통적인 그외의 물질이 보충될 것이다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합한 식염수도 전형적인 부형제이다.

부형제의 주요 용매는 현실적으로 수성이거나 비수성 중 하나일 것이다. 또한, 부형제는 pH, 오스몰농도, 점성도, 정화도, 색, 멸균도, 안정성, 분해속도 또는 제제형의 향을 변형시키거나 유지시키기 위한 제약학적으로 용인가능한 그외의 부형제를 포함할 것이다. 유사하게, 부형제는 GDNF 단백질 산물의 유리율을 변경시키거나 유지시키기 위한, 또는 안막을 가로질러 GDNF 단백질 산물의 흡수나 침투를 촉진시키기 위한 그외의 제약학적으로 용인가능한 부형제도 포함할 것이다. 이러한 부형제는 단위 투여나 아니면 다중 투여 형태로 비경구 투여를 위한 투여량을 제형화하기 위하여 일반적으로 및 통상적으로 사용되는 물질이다.

일단 치료학적 조성물이 제형화되면, 용액, 현탁액, 겔, 유제, 고체 또는 탈수 분말이나 동결건조 분말로 멸균 바이알에 보관될 것이다. 이러한 제제형은 즉석 사용 형태, 또는 동결건조된 것과 같이 투여 전에 재구성할 필요가 있는 형태로 보관될 것이다.

최적의 제약학적 제제형은 투여 경로 및 바람직한 투여량 같은 고려할 사항에 따라 본 분야의 숙련자들에 의해 결정될 것이다. 예를들어 본원에서 참고문헌으로 인용한 Remington 의 Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435 - 1712 문헌을 참조하라. 이러한 제제형은 본 GDNF 단백질, 변형체 및 유도체의 물리적 상태, 안정성, 생체내 유리율 및 생체내 정화율에 영향을 미칠 것이다.

서서히 유리되는 비경구 제제형, 흡입 합제 또는 경구 활성 제제형과 같은 효과적인 다른 투여 형태도 생각된다. 예를들어, 지속적으로 유리되는 제제형에 있어, GDNF 단백질 산물은 중합체 화합물 (폴리아세트산, 폴리글리콜산 등과 같은) 또는 리포솜의 미립자 제제내로 삽입되거나 이들과 결합될 수 있다. 히알루론산(Hylauronic acid)도 사용될 수 있으며, 이것은 혈행내 존속 기간을 증진시키는 효과를 가질 것이다. 또한 GDNF 단백질 산물의 제약학적 조성물은 예를들어, 안내 주입 또는 주사에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 것이며, 서서히 유리되거나 또는 지속되는 순환 제제형도 포함할 것이다. 이처럼 비경구 투여되는 치료학적 조성물은 전형적으로, 제약학적으로 용인가능한 부형제 내에 GDNF 단백질 산물을 함유하는 무발열물질의, 용인가능한 비경구 수성 용액의 형태이다. 바람직한 부형제 중 하나는 멸균 증류수이다.

또한 GDNF 단백질 산물을 함유하는 특정 제제형을 경구투여하고자 한다. 이러한 방식으로 투여되는 GDNF 단백질 산물은 캡슐로 쌀 수 있으며, 고체 투여 형태의 조제시에 통상적으로 사용되는 담체와 함께 또는 담체 없이 제형화될 수 있다. 캡슐은 생체내이용율이 최대이고 전 - 전신성 분해가 최소일 때 위장관에서 제제형의 활성 부분이 유리되도록 제조될 것이다. GDNF 단백질 산물의 흡수가 용이하도록 하기 위해 부가 부형제를 포함시킬 수도 있다. 희석제, 향신료, 낮은 융점의 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제 및 결합제도 사용될 수 있다.

안 용액, 현탁액 및 연고를 포함하는, 국소 안 제제의 제제형은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다 [Remington 의 Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Chapter 86, pages 1581 - 1592, Mack Publishing Company, 1990 문헌 참조]. 방내(intracameral)주사 (전방 내로 직접 주사할 수 있거나 초자방 내로 직접 주사할 수 있음)를 포함한 그외의 투여 방식도 유용하며, 그러한 투여 방식에 적합한 안 제제를 제조하는 방법 및 수단 또한 공지되어 있다.

본 출원에 사용된 바와 같은 "안외"란 안구와 안검 사이의 안구표면과 (외)강을 말한다. 안외 부위의 예로는 안검 원개나 맹낭, 결막면 및 각막면이 포함된다. 이 위치는 모든 안구 조직의 외부이며, 이 부위에 접근하기 위한 침투과정은 필요하지 않다. 안외계의 예로는 이들 부위에 치료학적 물질을 수송하는데 이용되는, 삽입물 및 "국소적으로" 가하는 점적약, 겔 또는 연고가 포함된다. 안외 고안물은 환자에 의해서도 일반적으로 쉽게 제거될 수 있다.

다음 특허 문헌들은 안외 부위 약물 투여시 사용되는 안외계를 기술하고 있다. Higuchi 등의 미국 특허 번호 제 3,981,303 호, 제 3,986,510 호 및 제 3,995,635 호에는 약물을 함유하는 생물분해성 안구 삽입물에 관하여 기술하고 있다. 안구의 맹낭, 즉 안구와 안검 사이의 안외강에 유지되도록 이 삽입물을 다른 모양으로 제조할 수도 있다. 몇몇 일반적인 생체적합성 중합체가 이러한 고안물을 만드는 데 사용하기에 적합하므로 이를 기술한다. 이들 중합체에는 알지산 아염, 폴리(락트산), 폴리(비닐 알콜), 폴리(무수물) 및 폴리(글리콜산)이 포함된다. 이 특허 문헌들은 약물 제제형을 함유하는 공동 및 약물에 대한 침투를 감소시키는 막 코팅 고안물에 관해서도 기술하고 있다.

Theeuwes 의 미국 특허 번호 제 4,217,898 호에는 약물 수송을 조절하는데 사용되는 미공성 저장소에 관해 기술하고 있다. 흥미있는 중합체계 중 하나로는 폴리(비닐 클로라이드) - 공 - 폴리(비닐 아세테이트)공중합체가 포함된다. Kaufman 의 미국 특허 번호 제 4,865,846 호 및 제 4,882,150 호에는 최소한 하나의 생물 - 침식 가능한 물질이나 결막낭에 대한 연고 운반체를 함유하는 안약 수송계에 관해 기술하고 있다. 이 특허 문헌은 적합한 수송계로서 폴리(락티드), 폴리(글리콜리드), 폴리(비닐 알콜) 및 교차 결합된 콜라겐 같은 중합체계에 관해서도 기술하고 있다.

망막 질환이나 손상 치료에 대하여 기술하고 있는 GDNF 단백질 산물의 이용에 있어서, 국소적으로 가하는 안 제제형은 눈 내로 치료학적 약물의 침투 또는 수송을 촉진시키는 약물을 포함하는 것 또한 바람직하다. 그러한 약물은 본 분야에 공지되어 있다. 예를들어, Ke 등의 미국 특허 제 5,221,696 호에는 각막을 통한 안 제제의 침투를 증진시키는 물질의 용도에 대해 기술하고 있다.

안내(intraocular)계는 눈 조직층 내부, 사이 또는 주변의 어떠한 조직 구획에서도 사용하기에 적합한 계이다. 이들 위치로는 결막하(안구에 근접해 있는 안구점막하), 안와(안구 뒤), 및 방내(안구강 내부)가 포함된다. 안외계와 대조적으로, 이들 부위에 접근하기 위해서는 주사 또는 이식으로 이루어 지는 침투 과정이 필요하다.

다음 특허 문헌은 안내 고안물에 대해 기술하고 있다. Wong 의 미국 특허 번호 제 4,853,244 호에는 안구강 내로 도입시키기 위한 미소캡슐화된 약물에 관하여 기술되어 있다. 이 계에 사용되는 중합체로는 폴리에스테르와 폴리에테르가 포함된다. Lee 의 미국 특허 번호 제 4,863,457 호에는 치료약적 약물을 지속적으로 유리시키기 위해 외과 수술에 의해 안내 이식시키는 생물분해가능한 고안물에 대해 기술되어 있다. 이 고안물은 결막(점액성 안구막) 아래의 외과적 이식을 위해 고안된 것이다. Krezancaki 의 미국 특허 번호 제 4,188,373 호에는 체온에서 겔로 변하는 제약학적 부형제에 대해 기술되어 있다. 이 부형제는 약물의 수성 현탁액으로서 고무나 셀룰로스 유래의 합성 유도체이다. Haslam 등의 미국 특허 번호 제 4,474, 751 호 및 제 4,474,752 호에는 실온에서 액체지만 체온에서 겔로 변하는 중합체 - 약물계에 대해 기술되어 있다. 이 계에 사용되는 적합한 중합체로는 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌이 포함된다. Davis 등의 미국 특허 제 5,384,333 호에는 장기간의 약물 유리를 제공하는 생물분해가능하고 주사가능한 약물 수송계에 대해 기술되어 있다. 이 약물 조성물은 생물분해가능한 중합체 기질내에 함유되어 있는 제약학적 활성 약물로 구성되어 있는 것으로, 여기서 중합체 기질은 20 ℃ 내지 37 ℃ 범위의 온도에서 고체이며 38 ℃ 내지 52 ℃ 범위의 온도에서는 유동성일 수 있다. 이 약물 수송 중합체는 가용성 약물 제제형이나 액체 약물 제제형의 수송으로 국한되는 것은 아니다. 예를들어, 이 중합체는 주사 부위에 약물 - 함유 중심체, 리포솜 또는 그외의 입자상 - 결합된 약물을 안정화시키고 유지시키는 기질로서 사용될 수 있다.

안내 주사용으로 특히 적합한 부형제는 GDNF 단백질 산물을 멸균, 등장성 용액으로서 제형화시키고, 알맞게 보존하도록 하는 멸균 증류수이다. 다른 안제제로는 주사가능한 중심체 또는 리포솜 같은 인자를 수반한 GDNF 단백질 산물의 제제형이 포함될 수 있는데, 이 제제형은 상기 GDNF 단백질이 저장부 주사로서 수송될 수 있도록 이를 서서히 또는 지속적으로 유리시킨다. GDNF 단백질 산물을 안내 도입시키기 위한 그외의 적합한 수단으로는 GDNF 단백질 산물을 함유하는 이식가능한 약물 수송 고안물이 포함된다.

본 발명의 안 제제, 특히 국소 제제는 본 분야에 잘 알려져 있는 바와 같은 다른 성분들, 예컨대 안과적으로 용인가능한 방부제, 긴장제, 공동용매, 습윤제, 복합제, 완충제, 항미생물제, 항산화제 및 계면활성제를 함유할 것이다. 예를들어, 적합한 긴장 강화제는 알칼리 금속 할로겐화물(바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 눈 내로 주입될 제제형이 저장성이거나 실질적으로 등장성이도록 충분한 긴장 강화제를 가하는 것이 바람직하다. 적합한 방부제로는 염화벤잘코늄, 티메로살, 펜에틸알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 등이 포함되지만 이것으로 한정되지는 않는다. 과산화수소 또한 방부제로 사용될 수 있다. 적합한 공동용매로는 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함되지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 복합제로는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타 - 시클로덱스트린 또는 히드록시프로필 - 베타 - 시클로덱스트린이 포함된다. 적합한 계면활성제 또는 습윤제로는 소르비탄 에스테르, 폴리소르빈산염 80 같은 폴리소르빈산염, 트로메타민, 렉틴, 콜레스테롤, 틸록사폴등이 포함되지만, 이것으로 한정되지는 않는다. 완충제는 붕산염, 시트르산염, 인산염, 중탄산염 또는 트리스 - HCl 과 같은 통상적인 완충액일 수 있다.

제제형 성분은 안외 또는 안내 투여 부위에 용인가능한 농도로 존재한다. 예컨대, 완충제는 생리학적 pH 또는 그 보다 약간 낮은 pH, 일반적으로 약 5 내지 약 8 의 pH 범위로 조성물을 유지시키기 위해 사용된다.

국소적인 접촉을 최대화하고 흡수를 촉진시키기 위하여, 부가적인 제제형 성분은 안외 투여되는 치료제가 안구에 더 오래 머물도록 하는 물질을 포함할 수 있다. 적합한 물질로는 안 제제의 점성도를 높이는 중합체 또는 겔 형성 물질이 포함된다. 카이토산이, 액체 안약 제제형을 지속적으로 유리시킬 때에 안구 유리율 조절제로서 특히 적합한 물질이다(Yen 등의 미국 특허 제 5,422,116 호를 참조하시오). 눈에서 안 치료제의 유리를 조절하기 위한 (예를들어, 지속적인 수송 및 연장 수송) 본 발명 제제형의 적합성은 본 분야에서 공지된 다양한 방법, 예를들어 Journal of Controlled Release, 6 : 367 - 373, 1987 문헌에 기술되어 있는 방법 뿐만 아니라 그 변형 방법에 의해 결정될 수 있다.

다른 안 제제도 정제 제조에 적합한, 안과적으로 용인가능한 비 - 독성 부형제와 혼합하여 유효량의 GDNF 단백질 산물을 함유할 것이다. 멸균수 또는 그외의 적당한 부형제에 정제를 용해시킴으로써, 안 치료 용액을 단위 투여 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스 또는 인산칼슘과 같은 불활성 희석제; 녹말, 겔라틴 또는 아카시아와 같은 결합제; 또는 스테아르산 마그네슘, 염스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제가 포함되지만 이것으로 한정되지는 않는다.

D. GDNF 단백질 산물의 투여 / 수송

GDNF 단백질 산물은 피하, 근육내, 정맥내, 폐내외, 경피적, 초내 또는 대뇌내 경로를 통해 비경구적으로 투여될 수 있다. 안 증상을 치료하기 위해, GDNF 단백질 산물은 국소 적용, 삽입, 주사, 이식, 세포 치료 또는 유전자 치료에 의해 상기한 바와 같이 유익하게 안외 또는 안내 투여될 수 있다. 예를들어, 생물분해가능한 중합체 기질에 박혀 있는 신경영양성 인자를 함유하는, 서서히 유리되는 이식물이 GDNF 단백질 산물을 수송할 수 있다. GDNF 단백질 산물은 그것이 혈액뇌장벽을 통과하도록 하기 위해 화학적으로 변형되거나 포장된 형태로 대뇌외적으로 투여될 수 있거나, 상기 장벽을 가로질러 GDNF 단백질 산물의 침투를 촉진시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 약물과 함께 투여될 수 있다. 유사하게, GDNF 단백질 산물은 안내 투여될 수 있거나, 눈의 막을 가로질러 GDNF 단백질 산물의 침투 또는 수송을 촉진시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 약물과 함께 안외 투여될 수 있다. 투여 빈도는 제형화에 따른 GDNF 단백질 산물의 약력학적 변수, 및 투여 경로에 좌우될 것이다.

특정 투여량은 체중, 체표면적 또는 기관의 크기를 고려하여 계산될 것이다. 상기 언급한 각 제제형으로 치료하기에 알맞은 투여량을 결정할 필요가 있는 보다 정확한 계산은 본 분야의 숙련자들에 의해 일상적으로 이루어지며, 특히 본원에 기술된 투여량 정보 및 검정을 고려하여 일상적으로 실시되는 작업의 범위에 속한다. 적당한 투여량은 고유의 투여량 - 반응 데이터와 결부시켜 사용되는 투여량을 결정하기 위한 기정 검정을 이용하여 확정될 것이다. 현재 바람직한 본 발명의 실시구체형태에 따라, GDNF 단백질 산물은 약 0.001 mg/일 내지 10 mg/일의 투여량, 바람직하게 약 0.01 mg/일 내지 1 mg/일의 투여량, 가장 바람직하게 약 0.1 mg/일 내지 0.5 mg/일의 투여량으로 가장 유익하게 안내 투여된다. 본 분야의 숙련자들은 안내 투여되는 제제형에 사용되는 투여량이 전신 주사나 경구 투여에 사용되는 투여량에 비해 매우 적을 것이라는 사실을 인식할 것이다.

상기 증상의 치료방법과 관련되는 최종적인 투여 섭생은 약물 작용을 변화시키는 여러 인자, 즉 환자의 연령, 증상, 체중, 성별 및 평소의 음식, 감염의 심각성, 투여시간 및 그외의 임상 인자들을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 연구가 진행될수록, 다양한 질병과 증상을 치료하기 위한 적당한 투여량 수준에 관한 더 많은 정보가 쏟아질 것이다.

GDNF 의 연속적인 투여 또는 지속적인 수송이 주어진 치료에 유익할 것으로 생각된다. 연속적인 투여는 주입 펌프를 이용하는 것과 같은 기계적 수단을 통해 이루어 질 수 있는 반면에, 연속적이거나 거의 연속적인 다른 투여 방식도 실시될 것으로 예상된다. 예를들어, 화학적 유도체화 또는 캡슐화는 결정된 투여량 섭생에 기초하여 예상할 수 있는 양으로, 계속적인 존재 효과를 갖는 단백질을 지속적으로 유리시키는 형태가 되게 한다. 따라서, GDNF 단백질 산물은 이러한 연속적인 투여가 유효하도록 유도하거나 다른 방법으로 제형화한 단백질을 포함한다.

GDNF 단백질 산물 세포 치료, 예컨대 GDNF 단백질 산물을 생산하는 세포의 안내 이식 또한 고찰된다. 이러한 실시구체형태는 GDNF 단백질 산물의 생물학적 활성 형태를 합성하고 분비할 수 있는 세포를 환자에게 이식하는 것에 관계한다. 이러한 GDNF 단백질 산물 - 생산 세포는 GDNF 단백질 산물을 자연적으로 생산하는 세포 (B49 글리오블라스토마 세포와 유사) 이거나, 그것의 발현 및 분비를 촉진시키기에 적당한 벡터내 원하는 GDNF 단백질 산물을 코딩하는 유전자로 형질전환시킴으로써 증가되는 GDNF 단백질 산물을 생산하는 능력을 가진 재조합 세포일 것이다. 외래 종의 GDNF 단백질 산물이 투여되는 환자에게서 일어날 수 있는 면역 반응을 최소화하기 위해, GDNF 단백질 산물을 생산하는 천연 세포는 인체 기원이며 인체 GDNF 단백질 산물을 생산하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, GDNF 단백질 산물을 생산하는 재조합 세포도 인체 GDNF 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환시키는 것이 바람직하다. 이식 세포는 조직 주변의 침윤을 막기 위해 캡슐화될 것이다. 인체 또는 비-인체 동물 세포는, GDNF 단백질 산물은 유리시키지만 주변 조직으로 부터 다른 유해 인자나 환자의 면역계에 의한 세포 파괴를 방지하는 생체적합성, 반투과성의 중합성 봉입체 또는 막 내에 함유되어 환자에게 이식될 것이다. 예를들어 그러한 이식물은, 유리체액내로 직접 GDNF 단백질 산물이 생산되어 유리되도록 공막에 부착시킬 것이다.

또한 환자 자신의 세포도 GDNF 단백질 산물을 생산하기 위해 생체외에서 형질전환되어, 캡슐화되지 않고 직접 이식될 것으로 생각된다. 적당한 벡터로 이 세포를 형질전환시켜 환자의 망막내로 후부에 이식하면 이 세포가 원하는 GDNF 단백질이나 GDNF 단백질 변이체를 생산하고 유리시킬 것이다.

망막 질환이나 망막 손상으로 인한 불완전 또는 결손 세포를 대체하고자 고안된 광수용체 세포 이식 연구가 망막 변성을 지닌 동물 모델에서 성공적으로 수행되었다(Silverman 및 Hughes 의 Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 30 : 1684 - 1690, 1989 ; Gouras 등의 Neuro - Ophthalmol., 10 : 165 - 176, 1990 참조). 광수용세포는 공여체 눈에서 수득하여 본원에 기술된 바와 같이 배양하여 보존할 것이다. 그런 다음 이 세포를, 망막 질환이나 망막 손상으로 고통받고 있는 환자의 망막내로 망막하강을 통해 이식될 정제된 광수용체의 원(source)으로서 사용할 것이다. 이식된 세포의 면역학적 반응 및 거부를 제거하기 위해 이들 환자를 면역억제요법으로 치료할 것이다. 생체외 공여체 망막은, 그 성장 및 생존을 증진시키기 위해 GDNF 의 존재하에서 배양할 것이다. 광수용 세포 이식 조직편을 수용할 환자는, 이식된 광수용체의 생존 및 성숙을 촉진시키는 데 필요한 GDNF 를 유리체내 주사하여 처리할 것이다.

핵산 구성물의 국소 주사나 그외의 적당한 수송 벡터를 통해 표적 세포내로 GDNF 단백질 산물을 코딩하는 유전자를 도입시킴으로써 생체내 GDNF 단백질 산물 유전자 요법도 계획한다(Hefti, J. Neurobiol., 25 : 1418 - 1435, 1994 참조). 예를들어, GDNF 단백질 산물을 코딩하는 핵산 서열은 망막 세포로 수송하기 위한 아데노 - 관련 바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터내에 함유시킬 것이다. 택일적인 바이러스성 벡터로는 레트로바이러스(retrovirus), 허피스 단신 바이러스(Herpes simplex virus), 유두종바이러스 벡터가 포함되지만 이것으로 한정되지는 않는다. 생체내 또는 생체외에서 적당한 물리학적 전이는 리포솜 - 매개 전이, 직접 주사{있는 그대로의 DNA (naked DNA)}, 수용체 - 매개 전이(리간드 - DNA 복합체), 일렉트로포레이션, 인산칼슘 침전 또는 미립자 충격(유전자 주입기)에 의해 획득할 수 있을 것이다.

살아있는 세포의 막 캡슐화에 대한 방법학은 본 분야의 숙련자들에게 친숙하며, 캡슐화된 세포의 제조 및 환자에 대한 이식은 불필요한 실험 작업 없이 이루어질 것이다. 예를들어, 미국 특허 번호 제 4,892,538 호, 제 5,011,472 호 및 제 5,106,627 호를 참조하되, 각각은 특히 본원에서 참고문헌으로 인용하였다. 살아있는 세포를 캡슐화시키는 시스템에 관하여는 본원에서 참고문헌으로 인용한 Aebischer 등의 PCT 출원 제 WO91/10425 호에 기술되어 있다. 특히 본원에서 참고문헌으로 인용한 Aebischer 등의 PCT 출원 제 WO91/10470 호, Winn 등의 Exper. Neurol., 113:322 - 329, 1991 문헌 , Aebischer 등의 Exper. Neurol., 111: 269 - 275, 1991 문헌 ; Tresco 등의 ASAIO, 38:17 - 23, 1992 문헌 또한 참조하라. 이식가능한 부가 고안물에 관하여는 본원에서 참고문헌으로 인용한 제 WO 93/21902 호(국제 출원 번호 제 PCT/US93/03850 호)에 기술되어 있다. 리포솜 운반체, 생물분해되는 입자 또는 비드(beads) 및 저장부주사와 같은 그외의 다양한 지속적 - 또는 조절된 - 수송 수단을 명확히 설명하는 기술 또한 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.

본원에 기술된 GDNF 단백질 산물 제제형은 인체 뿐만 아니라 동물에도 적용될 것이며, 용어 "환자"는 제한된 형식으로 해석해서는 않된다. 동물에 적용할 경우에, 투여량 범위는 상기한 바와 같을 것이다.

본 발명의 다른 양상 및 잇점은 하기 실시예를 고려하여 이해될 것이다. 실시예는 정상 및 돌연변이 망막 신경원 둘 다에 대한 GDNF 단백질 산물의 효과를 기술하고 있다. 또한, 실시예는 독특한 망막 세포 배양 기술도 제시한다.

물질 및 방법

하기 실시예에 사용된 물질은 다음과 같이 수득하였다.

세포 배양 배지

높은 포도당의 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM ; #11965 - 092), 햄의 F12 배지 (F12 ; #11765 - 021), 중탄산나트륨이 없는 라이보비쯔의 L15 배지 (#41300 - 039), B27 배지 보충물 (#17504 - 010), 페니실린/스트렙토마이신 (#15070 - 014), L - 글루타민 (#25030 - 016), 둘베코 인산염완충식염수 (D - PBS ; #14190 - 052), 칼슘 및 마그네슘 염을 수반한 행크의 균형된 염 용액(HBSS # 24020 - 026), N - 2 - 히드록시에틸피페라진 - N'- 2 - 에탄술폰산(HEPES ; # 15630 - 015), 마우스 라미닌 (#23017 - 015), 소의 혈청 알부민 및 분획 V (#110 - 18 - 017) 는 모두 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 깁코/BRL 로부터 수득하였다. 말의 열 - 불활성 혈청은 미국 유타 로간에 소재하는 하이클론에서 수득하였다. 폴리 - L - 오르니틴 브롬화수소산염 (P - 3655), 소의 인슐린 (I - 5500), 인체 트란스페린(T - 2252), 푸트레신(P - 6024), 프로게스테론 (P - 6149) 및 셀렌산나트륨(S - 9133)은 미국 미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마 케미칼 캄파니에서 구입하였다. 파파인, 데옥시리보누클레아제 I (DNA 아제) 및 난 알부민(파파인 분리계)은 미국 뉴저지주 프리홀드(Freehold)에 소재하는 워팅톤 바이오케미칼스에서 구입하였다. 팔콘 멸균 96 - 웰 미량평판(#3072), 조직 배양 플라스틱 용품 및 폴리프로필렌 원심분리관은 미국 캘리포니아 옥스나드에 소재하는 벡톤 - 디킨슨에서 구입하였다. 넝크랩 - 텍 조직 배양 쳄버 커버 글라스(# 136439)는 미국 캘리포니아 어빈에 소재하는 박스터에서 구입하였다. 니텍스 20 μm 나일론 메시 (Nitex 20 μm nylon mesh) (#460)는 미국 뉴욕 엘름스포드에 소재하는 테트코(Tetko)에서 구입하였다.

항체, 방사성동위원소 및 관련 시약

폴리클로날 토끼 항체 및 마우스 모노클로날 rho4D2 의 항 - 소 로돕신 항체는 캐나다 밴쿠버에 소재하는 유니버시티 오브 브리티시 컬럼비아에서 수득하였다. 이 폴리클로날 토끼 항체는 간상체 - 특이 단백질 어레스틴(arrestin)의 다음 합성 펩티드 서열로 향했다 : Val - Phe - Glu - Glu - Phe - Ala - Arg - Gln - Asn - Leu - Lys - Cys (서열 2). 비오틴화된(biotinylated) 말의 항 - 마우스 IgG, 비오틴화된 염소의 항 - 토끼 IgG, 과산화효소 - 결합 아비딘/비오틴 복합체 및 텍사스 레드 - 결합 스트렙타비딘(ABC 엘리트 ; 키트 PK - 6100)은 미국 캘리포니아 버링게임에 소재하는 벡터 라보라토리스에서 구입하였다. 이소티오시안산 플루오레스세인 결합된 토끼의 항 - 마우스 면역글로불린은 미국 캘리포니아 카핀테리아에 소재하는 다코 코포레이션에서 구입하였다. 3', 3'- 디아미노벤지딘은 미국 펜실베니아 웨스트 체스터에 소재하는 카펠 라보라토리스에서 구입하였다. PBS 내 수퍼블록 차단 완충제(# 37515)는 미국 일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 구입하였다. 트리톤 X - 100(X100), 노니데트 P - 40 (N6507) 및 과산화수소(30 %, V/V ; H1009)는 시그마에서 구입하였다. L - [3, 4 -³H] - 글루탐산 (NET - 490 ; 40 - 80 Ci/ mmol)은 미국 메사츄세츠 보스턴에 소재하는 뉴 잉글랜드 뉴클리어에서 구입하였다. 옵티페이즈 수퍼믹스 섬광 칵테일은 핀란드 터쿠에 소재하는 월락에서 구입하였다. 화이트 뷰플레이트 - 96 미량평판(#6005182)은 미국 코네티컷 메리덴에 소재하는 팩카드 인스트루먼츠 코포레이션에서 구입하였다. 그외의 모든 시약은 달리 특정하지 않는 한, 미국 미주리 세인트루이스에 소재하는 시그마 케미컬 캄파니에서 구입하였다.

배지 제조

기초 배지는 DMEM 과 F12 배지의 1 : 1 혼합물로서 제조하였고, 50 배 농축 저장 용액으로서 가하는 B27 배지 보충물로 보충하였다. B27 배지 보충물은 비오틴, L - 카르니틴, 코르티코스테론, 에탄올아민, D(+) - 갈락토스, 환원된 글루타티온, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 레티닐 아세테이트, 셀레늄, T3 (트리오도 - 1 - 티로닌, DL - 알파 - 토코페롤 ; 비타민 E), DL - 알파 - 토코페롤 아세테이트, 소의 혈청 알부민, 카탈라아제, 인슐린, 초산화물 디스뮤타제 및 트란스페린으로 구성된다. 약 2 mM 의 최종 농도로 L - 글루타민을, 약 100 Iu/I 의 최종농도로 페니실린을, 약 100 mg/l 의 최종농도로 스트렙토마이신을 가하였다. 말의 열 - 불활성 혈청은 약 2.5 % 의 최종농도로 가하고, D - 포도당은 약 5 g/l 의 최종농도로, HEPES 완충제는 약 20 mM , 소의 인슐린은 약 2.5 mg/ml, 인체 트란스페린은 약 0.1 mg/ml 의 최종농도로 가하였다. 혼합 후, pH 를 약 7.3 으로 조절하고 배지를 4 ℃ 로 유지시켰다. 실험기간 중에 변형되는 것을 최소화하기 위하여, 배지는 사용 직전에 신선하게 제조하였다. 단백질 흡착을 최소화하기 위하여 전반적으로 플라스틱 피펫과 용기를 사용하였다.

GDNF 단백질 산물 용액

5 % 의 소의 혈청 알부민을 함유하는 D - PBS (증류수로 제조한 인산염완충식염수)내 1 mg/ml 용액으로서, 정제된 인체 재조합 GDNF 단백질 산물을 제조하였다. 용액을 분취하여 - 85 ℃ 에 저장하였다. 계열 희석액을 96 - 웰 미량평판에 준비하였다. 10 배 농축된 10 μl의 GDNF 단백질 산물 용액을, 배양 배지를 함유하는 세포 배양물(90 μl)에 가하였다. 대조 배양물에는 5 % 알부민과 함께 D - PBS 를 가하였다(10 μl). 세포를 접종한 지 1 시간 후에 GDNF 단백질 산물 처리를 시작하였으며, 어떤 경우에는 격일로 반복하였다.

배양 기질

기질에 대한 최적의 광수용체 부착, 외분절(outer segment) 성장 및 축삭 성장을 촉진시키기 위해, 다음 과정에 따라서 미량역가 평판 표면(배양기질)을 연속하여 폴리 - L - 오르니틴으로 피막시키고 라미닌으로 피막시킴으로써 변형시켰다. 실온에서 최소한 1 시간 동안 0.1 M 붕산(pH 8.4)내에 함유되어 있는 폴리오르니틴 0.1 mg/ml 멸균 용액으로 평판 표면을 완전히 덮은 다음 수퍼 - Q 물로 멸균 세척하였다. 물 세척액은 흡인시키고 PBS 내 마우스 라미닌 1 μg/ml 용액을 가하여 2 시간 동안 37 ℃ 에 배양하였다. 결과를 확실히 재현시키기 위해 평판 사용 직전에 이 과정을 수행하였다.

병아리 및 마우스의 광수용체 배양물 제조

17 일 된 화이트 레그혼 병아리의 배자(embryo)와 5 일 된 C57l/6 마우스 새끼(미국 메인 바 하버에 소재하는 잭슨 라보라토리스에서 수득)를 단두시켜 죽이고 그 눈을 무균적으로 해부하여 L15 배지(무중탄산 나트륨)내에 두었다. 실험 당 최대 24 개의 눈을 처리하였다. 눈은 반분하고, 수정체와 유리체를 제거하였다. 신경 망막을 조심스럽게 제거하여 색소 상피가 없도록 박리한 다음, 작은 (약 1 mm²또는 그 이하)단편으로 잘라서 얼음같이 찬 D-PBS 내에 두었다. 이 세포를 모아서 10 ml 해리배지(120 유닛 파파인과 2000 유닛 DNAase 가 함유되어 있는 HBSS)로 옮겼다. 약 200 rpm 회전 접시 셰이커 상에서 세포를 45 분간 37 ℃ 에서 배양하였다. 그런 다음 불로 끝마무리한 파스퇴르 피펫을 통해 세포를 분쇄시킨 다음 해리되지 않은 조직을 버리기 위해 20 μm 니텍스 나일론 메시를 사용하여 체질하고, IEC 임상 원심분리기를 사용하여 200 x g 에서 5 분간 원심분리하였다. 결과적으로 생성된 세포 펠릿을 오브알부민과 약 500 유닛 DNAase 를 함유하는 HBSS 내에 재현탁하고, 4 % 오브알부민 용액 (HBSS 내) 상단에 층을 만든 다음 500 x g 에서 약 10 분간 원심분리하였다. 최종 펠릿을 완전 배지(상기 참조)에 재현탁하여 약 15,000 세포/ml 로 맞춘 다음 미리 폴리오르니틴과 라미닌으로 피막시킨 96 - 웰 미량평판으로 된 6 mm - 웰내에 90 μl 분취량으로 접종하였다. 세포 부착은 신속히 일어났으며, 평판화 효율은 약 75 % 였다.

성숙한 마우스 망막 광수용체의 배양

성숙한 광수용체의 배양은, 미리 확립시킨(pre - established) 생후 5 일 된 마우스 망막 신경교세포나 랫 망막 색소 상피세포의 단층 표면에 생후 18 일 내지 39 일 된 마우스의 해리된 망막 세포를 접종함으로써 획득하였다. 해리 과정 및 배양 배지는 상기한 바와 같았다. 망막 신경교 세포와 색소 상피세포의 배양물은 조직 배양 플라스크(225 cm², 코스타 플라스크)에서 확립시켜 전면 성장시켰다. 세포를 0.1 % 트립신과 함께 단배양하여(약 2 분) 탈리시키고 96 - 웰 미량평판이나 16 - 웰 유리 커버슬립 쳄버에 평판화시켰다. 약 3 - 5 일 후에 해리된 성숙한 망막 세포를 가하였다.

rd/rd 마우스 망막 광수용체의 배양

rd/rd C57Bl/6 마우스(미국 메인 바 하버에 소재하는 잭슨 라보라토리스에서 수득)는 포스포디에스테라제(외분절에 위치해 있는 효소로서 광형질도입 과정과 관련되어 있음)의 베타 아단위에 돌연변이가 발현됨으로써 야기되는 유전적 광수용체 변성을 갖는다. 이들 마우스는 손상된 광수용체에 대한 영양성 인자의 역할을 연구하기 위한 유용한 모델이다. rd/rd 마우스에서 광수용체 사멸은 태어난 지 약 10 일 후에 최고가 된다. 5 일 된 마우스로 부터 rd/rd 광수용체 배양물을 확립시켜 최대 광수용체 사멸 기간을 포함하여 8 일간 배양 상태로 유지하였다. 미리 확립시킨 망막 신경교 세포의 단층 표면에 (상기 참조) 약 10,000 세포/6 - mm 웰의 밀도로 해리된 망막 세포를 접종하고 상기한 배지내에 유지시켰다.

광수용체의 면역조직화학

마우스 광수용체를 특정화하기 위해, Louis 등이 기술한 간접 면역과산화효소 방법(J. Pharmacol. Exp. Therap., 262 : 1274 - 1283, 1992 ; Science, 259 ; 689 - 692, 1993 참조)을 다음과 같이 약간 변형시켜 사용하였다. 광수용체 배양물을 pH 7.4 의 D - PBS 내 4 % 파라포름알데히드와 함께 실온에서 약 30 분간 고정시킨 다음, D - PBS(200 μl/6 - mm 웰)로 3 회 세척하였다. 항체의 침투를 증진시키기 위해 1 % 노니데트 P - 40 을 포함하여, 수퍼블록 차단 완충제를 함유하는 PBS 내에 고정 배양액을 배양하였다. 항 - 로돕신 항체(토끼 및 마우스)를 동일 완충제로 1 : 1000 - 1 : 4000 희석하여 가한 다음 이 배양물을 회전 셰이커상에서 1 시간 동안 37 ℃ 에서 배양하였다. D - PBS 로 3 회 세척한 후, 약 1 : 500 희석한 염소 - 항 - 토끼 또는 말 - 항 - 마우스 비오틴화된 IgG(미국 캘리포니아 버링게임에 소재하는 벡터 라보라토리스에서 구입한 벡타스테인 키트)를 사용하여 광수용체 - 결합 항체를 검출하였으며 이 2 차 항체를 37 ℃ 에서 약 1 시간 동안 상기 세포와 배양하고 D - PBS 로 3 회 세척하였다. 1 : 500 으로 희석된 아비딘 - 비오틴 - 과산화효소 복합체로 2 차 항체를 표지한 다음 상기 세포를 37 ℃ 에서 약 45 분간 배양하였다. D - PBS 로 3 회 이상 세척한 후, 표지된 세포 배양물을 0.04 % 3', 3' - 디아미노벤지딘 - (HCl)4, 0.06 % NiCl2 및 0.02 % 과산화수소를 함유하는 pH 7.4 의 0.1 M 트리스 - HCl 용액에 5 - 20 분간 반응시켰다.

이중 염색 실험을 위한 배양물은 유리 커버슬립 쳄버 상에 성장시켰다. 비 - 특이 부위를 파라포름알데히드 고정, 투과 및 차단시킨 후(상기한 바와 같음), 토끼의 항 - 어레스틴과 마우스의 항 - 로돕신 항체와 함께 배양물을 배양하였다. 비오틴화된(biotinylated) 염소의 항 - 토끼 IgG 와 함께, 그 다음 텍사스 - 레드 결합된 스트렙타비딘(1 : 200 희석)과 함께 더 배양함으로써 어레스틴은 드러났다. 로돕신은 플루오레스세인 이소티오시안산염 - 결합 토끼의 항 - 마우스 IgG 와 함께 더 배양함으로써 드러났다. 적합한 텍사스 레드 및 플루오레스세인용 필터 결합물을 사용하여, 에피형광하에서 형광을 가시화하였다.

광수용체 생존 측정

상기한 바와 같이 마우스 광수용체 배양물을 고정시키고, 처리하고 면역염색한 다음, 200 X 배율에서 밝은 - 빛 광학으로 이 광수용체 배양물을 조사하였다. 염색된 신경원의 수를 1 직경 1 X 6 mm 스트립으로 계수하였는데, 이것은 6 mm - 웰의 총 표면적의 약 20 % 에 해당하는 것이다. 보통 짧은 축삭 - 유사 돌기와 함께, 규칙적인 모양의 세포체를 가지는 것을 생존 광수용체로 간주하였다. 비규칙적인, 소포성 핵주위부세포체나 단편화된 신경돌기를 갖는 것과 같은 변성의 징후를 나타내는 광수용체는 계산에서 제외시켰다(대부분의 변성 광수용체는 배양 기질로 부터 탈리된다). 세포수는 대조 세포 밀도에 비례하는 배수 - 변화(fold - change)로서, 아니면 세포/6 - mm 웰로서 나타냈다.

신경돌기 분석

생후 6 일 된 마우스 망막 배양물을 사용하여 신경돌기(즉, 광수용 세포체에서의 돌기) 발육을 생물형태계측 분석하였다. 약 10,000 신경원/6 - mm 웰을 함유하는 배양물을 어레스틴으로 면역염색하고 명시야 광학으로 조사하였다. 대조 및 처리된 6 - mm 웰 배양물에서 무작위로 선택한 광수용체 영역을 옵트로닉스(Optronics) 비디오 - 카메라로 사진을 찍고 약 800 배 배율로 확대하였다. 디지털화된 프로그램(맥메저 1.9)과 메킨토시 센트리스 650 퍼스널 컴퓨터를 이용하여, 서머스케츨(SummaSketchll) 디 지털화 태블릿(미국 텍사스 휴스턴에 소재하는 서머그래픽스 코포레이션에서 구입)과 연결된 필상돌기와 함께 각 광수용체 신경돌기의 길이를 측정함으로써 신경돌기의 크기를 결정하였다.

결과

실시예 1

생후 마우스 망막 배양물내 간상체 광수용체의 생존 및 발육 촉진

광수용체 생존에 대한 GDNF 단백질 산물의 효과를 입증하기 위해 마우스 망막 배양물을 사용하였다. B27 배지 보충물, 2.5 % 열 - 불활성 말 혈청, D - 포도당, HEPES, 인슐린 및 트란스페린을 보충한 DMEM/F12 로 된, 폴리오르니틴 - 라미닌 - 피막의 미량평판내에 해리된 망막 세포를 약 12,500/6 - mm 웰의 밀도로 접종함으로써 광수용체 배양물을 확립하였다. 어레스틴(간상체 - 특이 항원) 및 로돕신(간상체 - 특이 시각 색소)의 면역반응성이 존재함에 의해 광수용체가 확인되었다.

시험관내 6 일 후에 세포를 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고, 포유동물의 간상체 광수용체를 확인시키는 표지물인 어레스틴을 사용하여 배양물내 광수용체를 면역염색하였다. 상기한 바와 같이 면역염색한 후, 다른 망막 세포 유형이 존재하는 영역을 선택하여 위상차 현미경촬영한 결과 광수용체(어레스틴 면역염색 후 갈색 반응 물질로 덮여진 작은 세포로서 확인가능함), 신경원 및 뮤엘러 신경교세포가 나타났다. 한정된 영역을 명시야 조사함으로써, 어레스틴 - 특이 합성 펩티드에 대항하여 토끼에서 나타나는 항 - 어레스틴 항혈청이 배타적으로 간상체 광수용체와 결합하였으며 다른 망막 신경원, 또는 뮤엘러 신경교 세포에 결합하지 않았음이 입증되었다.

어레스틴 - 면역반응성을 기초로, 배양물내 세포의 약 90 % 가 광수용체라는 것이 결정되었다. 나머지 세포는 다수의 다극성 NSE - 양성 신경원 및 보다 소수의 단극성 NSE - 양성 신경원이었다. 이 세포를 로돕신에 대해 면역염색하였다. 광수용체 중 약 50 % 는, 마우스 모노클로날 항 - 로돕신 항체와 함께 면역염색함으로써 결정된 바와 같은, 간상체 시각 색소 로돕신을 나타냈다. 광수용체는 작은 세포체 직경, 하나 또는 둘의 신경돌기 및, 어떤 경우에는 결합 섬모에 상당하는 짧은 수직돌기를 갖는 둥근 세포로서 나타났다. 이러한 수준의 분석에서는 외분절 형성에 관한 증거는 없었다.

광수용체 생존에 대한 GDNF 단백질 산물 투여 효과에 대하여 생후 6 일 된 마우스 망막 배양물을 평가하였다. 광수용체 배양물(10,000/6 - mm 웰)을 인체 재조합 GDNF 단백질 산물(10 ng/ml 내지 1 pg/ml 범위로 10 배 계열희석)로 처리하였다. 6 일 후 배양물을 고정시키고 어레스틴에 대해 면역염색하였다. 6 mm²영역(6 - mm 웰의 총 표면적 중 약 21 % 에 상당함) 당 어레스틴 - 양성 세포수를 계수함으로써 광수용체 생존을 측정하였다.

GDNF 단백질 산물로 처리하지 않은 배양물에 있어, 광수용체수는 배양 6 일 후 초기 수의 약 25 % 에 이르는 시간 내내 꾸준히 감소하였다. E. coli 발현 재조합 인체 GDNF 단백질 산물로 배양물을 처리한 결과 배양 6 일 후에 생존가능한 어레스틴 - 양성 광수용체의 수는 약 2 배 증가하였다(도 1 참조 ; 각 값은 세 배양물의 평균 ± 표준편차이다). GDNF 단백질 산물의 효과는 약 30 pg/ml 의 ED50 을 갖는, 약 200 pg/ml 에서 최대였다.

광수용체 생존을 촉진시키는 것 이외에, GDNF 단백질 산물의 부가 역시 축삭 - 유사 돌기(신경돌기라고도 언급함)의 신장을 자극시키는 데, 이로 인해 광수용체의 형태학적 발생에 대한 효과가 입증된다. 광수용체 배양물을 재조합 인체 GDNF 단백질 산물(1 ng/ml )과 함께 또는 이 단백질 산물 없이 6 일간 배양하였다. 그런다음 배양물을 어레스틴에 대해 염색하였다. 독립적인 두 대조 배양물로 부터의 약 715 광수용체와, 독립적인 두 GDNF 단백질 산물 - 처리 배양물로 부터의 710 광수용체를 사진촬영하고 신경돌기 길이에 대해 분석하였다. 광수용체의 신경돌기 길이를 측정함으로써 신경돌기 성장에 대한 GDNF 단백질 산물 투여 효과를 정량하였다. 도 2 는 GDNF 단백질 산물에 의해 광수용체 신경돌기 성장이 촉진되었음을 도시한 것이다. 데이터는 신경돌기 길이의 누적 빈도 분포 플롯으로서 표시되어 있다. 주어진 마이크로미터의 길이(횡좌표) 보다 더 긴 신경돌기를 갖는 광수용체의 백분율(종좌표)이 그려져 있다. GDNF 단백질 산물의 부가로, 신경돌기 길이의 분포가 비처리 배양물에 비해 더 높은 값으로 변하였다. GDNF 단백질 산물 - 처리 배양물의 일부 광수용체가 약 180μm 길이의 신경돌기를 나타낸 반면, 비처리 배양물에서 관찰된 최대 길이의 신경돌기는 100 μm 길이였다. GDNF 단백질 산물 - 처리 배양물에서 광수용체의 평균 신경돌기 길이는 68 μm 였으며, 대조 배양물에서는 27 μm 였다.

광수용체는 2 차 신경원에 시그널을 보내기 위한 신경전달 물질로서 글루타민산염을 사용한다. > 90 % 광수용체로 구성된 배양물에 있어 이 광수용 세포에 의한 글루타민산염 섭취 정도가 광수용체상에 존재하는 고 - 친화성 글루타민산염 재섭취 수송 부위의 수 및 활성도를 나타내는 데, 이에 의해 그 기능적 분화가 초래된다. 광수용체의 기능적 분화에 대한 효과를 평가하기 위해 GDNF 단백질 산물 투여에 의한 글루타민산염 섭취 자극을 평가하였다. 상기와 같이 배양물을 성장시키고 6 일 동안 재조합 인체 GDNF 단백질 산물로 처리하거나 아니면 처리하지 않았다. 그런 다음 다음 방법에 따라서 배양물을 [³H] - 글루타민산염 섭취에 대해 조사하였다(50 nM ; 1.5 밀리언 dpm/ml ; 37 ℃ 에서 1 시간 배양).

글루타민산염 섭취 검정 : 96 - 웰 미량평판에 확립시켜 놓은, 생후 5 일 된 마우스 새끼로 부터의 광수용체 배양물에서 글루타민산염 섭취를 측정하였다. 약 120 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1.2 mM MgSO₄, 32 mM NaHPO₄, 1.3 mM EDTA, 및 5.6 mM D - 포도당을 함유하는 pH 7.4 의 변형된 크렙스 - 링거 용액으로 되어 있는, 미리 - 따뜻하게 해 둔 섭취 완충액 약 100 μl 로 상기 배양물을 세척하였다. 그런 다음, 세포를 섭취 완충액내에서 약 10 분간 37 ℃ 에서 예비배양하였다. 삼중수소화된 L - 글루타민산염 (약 60 Ci/mmol)을 75 μl 의 섭취 완충액내 약 50 nM 의 농도의 배양물에 가하였다. 배양배지를 흡입시키고 약 120 μl 의 얼음같이 찬 섭취 완충액으로 3 회 신속히 세척함으로써 섭취를 정지시켰다. 그런 다음 200 μl 의 옵티페이즈 수퍼믹스 섬광 칵테일(월락)을 가함으로써 세포를 용균시키고, 월락 마이크로베타플러스 96 - 웰 미량 평판 계수기를 사용하여 섬광 분광법으로 방사능을 측정하였다. 이 결과는 dpm/6-mm 웰이나 아니면 대조 배양물에 비례하는 배수 - 변화로서 나타낸다.

GDNF 단백질 산물이 투여량 - 의존 형식으로 글루타민산염 섭취를 자극하는 것으로 밝혀졌는데, 약 200 pg/ml 의 최대 활성도와 약 25 pg/ml 의 ED50 을 갖는다. 이 결과는 도 3 에 나타나 있다. 각 데이터 점은 대표 실험으로 부터의 3 웰의 평균 ± 표준편차이다. 2 개의 독립 실험에서도 유사한 결과가 수득되었다. 이 결과는 GDNF 가 광수용체의 생존 및 형태학적 발생을 촉진시키는 것 이외에, 시각 형질도입 과정에 중요한 글루타민산염 섭취와 같은 신경절단 - 관련 기능의 성숙을 증진시킨다는 것을 입증한다.

실시예 2

성숙한 마우스 망막 배양물내 간상체 광수용체의 생존 및 재생 촉진

광수용체 발육은 생후 약 3 주 째에 완료된다. 이때까지에는, 광수용체가 시각 색소를 포함하는, 광형질도입에 필요한 세포 기구를 집중시킨 기능적 외분절을 발육시켰다. 생후 18 일 및 39 일 된 망막으로 부터 성숙한 랫 광수용체를 해리시켜 일주일 동안 배양하여 보존하였다. 미리 - 존재하는 망막 신경교 세포의 단층 표면에 신경원을 접종하였다(약 2,500/6 - mm 웰의 밀도로). 신경교 세포는 해리된 광수용체의 유착을 촉진하며 그 발육에 필요한 신경돌기 및 인자를 제공한다. 상기한 면역염색 기술과 항체들을 이용하여 어레스틴과 로돕신에 대해 이중 - 면역염색함으로써 망막 신경교 세포와 함께 공동 배양한 성숙한 광수용체를 확인하였다.

배양물을 재조합 인체 GDNF 단백질 산물(0.1, 1 또는 10 ng/ml)로 처리하였다. 7 일 후에 이 세포를 고정시키고 어레스틴에 대해 면역염색하였다. 6 - mm 웰 당 어레스틴 - 양성 신경원수를 계수하여 광수용체 생존을 측정하였다. 18 일 및 39 일 된 두 망막 배양물내 간상체 광수용체수는 GDNF 단백질 산물로 처리한 배양물에서 보다 약 3.5 배 더 많았다(도 4 참조 ; 각 값은 2 - 3 배양물의 평균 ± 표준편차이다). GDNF 단백질 산물 농도가 약 300 pg/ml 이고, ED50 이 약 40 pg/ml 라는 것이 밝혀졌다. 이들 결과는 광수용체수가 변화됨으로써, GDNF 단백질 산물 처리에 반응하여 광수용체 생존이 촉진되었음을 설명한다.

더 연구하기 위해, 미리 - 확립된 마우스 망막 신경교 세포(1000 망막 세포/6 - mm 웰) 단층의 표면에 해리된 망막 세포를 접종하고 재조합 인체 GDNF 단백질 산물(1 또는 10 ng/ml)로 처리하였다. 7 일 후 이 배양물을 고정시키고 어레스틴에 대해 면역염색하였다. GDNF 단백질 산물이 광수용체의 생존을 촉진시키는 것 이외에도, 축삭 돌기의 성장에 의해서, 어떤 경우에는, 미숙한 외분절을 암시하는 짧은 선단 돌기의 성장에 의해서 입증되는 바와 같이 광수용체의 형태학적 발육을 강하게 증진시킨다는 것이 밝혀졌다. 성숙한 망막으로 부터의 이들 배양물내 광수용체는 완전히 발육하였다. 해리과정 중에 광수용체는 그것의 돌기가 손실되므로, 현재 데이터는 광수용체의 재생을 촉진시키는, 특히 시각 과정에 중요한 축삭 돌기와 외분절의 발육을 촉진시키는 GDNF 단백질 산물의 능력을 입증한다. 이 결과는 GDNF 단백질 산물 투여가 노인성 황반 변성, 유전적 망막 변성 및 다른 망막 영양장애 같은, 광수용체의 변성으로 인해 시력이 손실되는 증상을 위한 유용한 요법일 수 있다는 것을 암시한다.

실시예 3

유전적 망막 변성을 지닌 마우스(rd/rd) 망막 배양물내 간상체 광수용체의 생존 촉진

rd/rd 마우스는 포스포디에스테라제의 베타 - 아단위체(외분절에 위치해 있으며 광형질도입 과정과 관련있는 효소)에 돌연변이를 갖고 있는 것으로, 이로 인해 이 효소의 기능부전이 초래되어 초기 - 발병 광수용체 변성 및 전격적인 광수용체 사멸을 유발한다. rd/rd 와 유사한 돌연변이가 인체에서도 발견되는 데 이로 인해 색소성망막염 증례의 아부분이 초래된다. rd/rd 마우스에서 광수용체 사멸은 생후 약 10 일에서 최고이다. 이들 돌연변이 마우스는 rd/rd 광수용체의 생존에 대한 GDNF 단백질 산물의 효과를 연구하기 위한 유용한 모델을 제공한다.

생후 5 일 된 마우스로 부터 rd/rd 광수용체 배양물을 확립하고, 최대의 광수용체 사멸 발생을 포함하는 기간인 7 일 동안 배양하여 유지시켰다. 그 본래의 민감성 때문에, 해리된 rd/rd 광수용체를 미리 - 확립된 망막 신경교 세포의 단층 표면(상기와 같음)에 접종하였다(약 2,500/6 - mm 웰의 밀도로). rd/rd 망막 배양물을, 같은 나이의 동물로 부터 수득하여 같은 방식으로 처리한 정상(야생형) 마우스 망막으로 부터의 세포 배양물과 비교하였다. 배양물을 재조합 인체 GDNF 단백질 산물(1 ng/ml)로 처리하여, 7 일 후에 고정시키고 어레스틴에 대해 면역염색하였다. 6 - mm 웰 당 어레스틴 - 양성 신경원의 수를 계수함으로서 광수용체 생존을 결정하였다.

GDNF 단백질 산물을 부가한 결과 시험관내 배양 7 일 후에 광수용체수가 상당히 증가한 것을 제외하고는 조금 (약 15 %) 증가하였다(도 5 참조 ; 각 값은 3 - 4 배양물의 평균 ± 표준편차이다). 대조적으로, 및 신경교 세포 지지에도 불구하고, GDNF 단백질 산물을 부가하지 않았을 때 rd/rd 마우스 배양물 광수용체수는 7 일 후 야생형 광수용체의 약 40 % 에 도달할 때까지 급격히 감소하였다. GDNF 단백질 산물의 존재시(1 ng/ml), 생존하는 rd/rd 광수용체의 수는 약 2.5 배 까지 증가하였는데, 이것은 비처리된 야생형 광수용체 배양물에서 나타난 생존 수준에 이르는 것이다. 이들 데이터는 GDNF 단백질 산물 처리가 rd/rd 돌연변이에 의해 강요당하는 스트레스에 더 내성인 돌연변이 광수용체를 만들어 낸다는 것을 입증한다. 이것은 GDNF 단백질 산물의 투여가 색소성망막염과 같은 유전적 망막 변성 치료에 유용할 것임을 암시한다.

실시예 4

배자 병아리 망막 배양물내 추상체 광수용체 생존 및 외분절 발육의 촉진

병아리 시각계의 발달은 설치동물에서 보다 훨씬 더 빠르다. 광수용체 외분절의 성장은 약 11 - 12 일 째에 시작하여, 태어났을 때에 광수용체는 완전히 발육된다. 따라서, 광수용체 생존 및 재생에 대한 GDNF 단백질 산물의 투여 효과는 배자 병아리 망막 배양물로 연구할 수 있다.

17 일 된 배자 병아리 망막 세포의 배양물을 상기와 같이 96 - 웰 미량평판에 성장시키고, 시험관내 6 일 후에 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다. 이 배양물에 약 60 % 의 광수용체 세포와 40 % 의 큰 다극성 신경원이 함유되어 있음이 발견되었다. 대조 배양물의 대표 영역을 위상차 사진촬영한 결과 배양물내에 존재하는 두 가지 주요 형태의 망막 세포가 나타났다 : 세포체의 선단 부분에 지질 소적이 존재함으로써 확인될 수 있는 추상체 광수용체, 및 망막 신경원. 광수용세포는, 핵, 작은 지질 소적을 갖는 짧은 내분절, 지질 소적의 반대 지점에서 나타나는 짧고, 비분절된 단일의 신경돌기 및 짧은 원위 섬모가 거의 배타적으로 자리하는 난형 세포체로서 확인되었다. 이들 특징은 추상체의 특성을 나타내고 있다. 상기한 바와 같이 항 - 로돕신 면역염색을 수행하여, 6 일 된 배양물을 명시야 현미경 촬영한 결과 간상체 광수용체가 나타났다. 광수용체 중 약 20 % 가 간상체임이 측정되었다. 광수용체 중 나머지 80 % 는 로돕신을 함유하지 않은, 추상체 광수용체였다.

도 6 은 17 일 된 배자 병아리 망막 배양물내 광수용체 생존에 대한 GDNF 단백질 산물의 효과를 도시한 것이다. 해리된 망막 세포 배양물(약 10,000/6 - mm 웰의 밀도로 평판화 됨)을 재조합 인체 GDNF 단백질 산물로 처리하였다(10 ng/ml 에서 1 pg /ml 범위로 10 배 계열희석). 6 일 후에 배양물을 4 % 파라포름알데히드로 고정시키고 위상차 광학하에서 관찰하였다. 밝은 상(phase-bright) 지질 소적의 존재로 추상체 광수용체가 확인되었다. 지질 소적은 내분절과 외분절 간의 접합부를 표시한다. 6 mm²직경 스트립(6 - mm 웰의 총 면적 중 약 21 % 에 상당함) 당 추상체의 수를 계수함으로써 광수용체 생존을 측정하였다. 각 값은 3 배양물의 평균 ± 표준편차이다. 병아리 망막 배양물에서 발견된 추상체의 수는 비처리 배양물에서 보다 GDNF 단백질 산물 - 처리 배양물에서 약 2 배 더 많았다. 최대 GDNF 단백질 산물 효과는 약 50 pg/ml 의 ED50 을 갖는 약 200 pg/ml 에서 관찰되었다. 위상차 현미경 사진 촬영으로 광수용체 세포 형태학을 평가한 결과, GDNF 단백질 산물이 내분절과 외분절 둘 다, 및 축삭돌기의 발육을 촉진시킨다는 것을 발견하였다. 비처리 배양물과 대조적으로, GDNF 단백질 산물로 처리한 배양물(7 일 동안 1 ng/ml)은 매우 길게 늘어진, 극성을 갖는, 구획화된 세포로서 나타나는 추상체 광수용체의 대부분을 함유했다. 이들 추상체에는 길게 늘어진 내분절을 갖는데, 어떤 경우에 이 내분절은 외분절의 특성을 나타내는 3 차원의, 밝은 상 구조와 연결되어 있다. 그외의 추상체는 두껍고, 길며 분지된 신경돌기로 발달한다. 어떤 경우에는 2 개의 외분절로 연장되어 있는 이중 추상체(조류 망막의 특징임)가 GDNF 단백질 산물 - 처리 배양물에서 관찰되었다. 세포 생존/증식 효과 이외에, 병아리 배양물에서 외분절 발육에 대한 GDNF 단백질 산물의 투여 효과는 해리 과정에 의해 손상된 외분절의 재생을 촉진시키는 그 능력을 입증한다. 이것은 GDNF 단백질 산물 투여가, 유전적 망막 변성 증상 및 망막증 뿐만 아니라 망막 영양장애 치료에도 유용할 것임을 암시한다.

본 발명을 실행함에 있어 바람직한 실시구체형태로 기술된 상기 발명의 상세한 설명을 고려하여 본 분야의 숙련된 기술자들에 의해 다양한 수정 및 변경이 일어날 것이라 예상된다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부한 특허청구의 범위로만 한정되어야 한다.

서열목록

(1) 서열들에 관한 일반정보 :

(i) 출원인 : 진 - 클로드 루이스

(ii) 발명의 명칭 : 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물을 사용하여 광수용체를 치료하 는 방법

(iii) 서열의 갯수 : 2

(iv) 통신 주소 :

(A) 수신인 : 암젠 인코포레이티드

(B) 스트리트 : 디하빌랜드 드라이브 1840

(C) 시 : 사우전드 오크스

(D) 주 : 캘리포니아

(E) 국명 : 미 국

(F) 우편번호 : 91320

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체타입 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종

(C) 운영체계 : PC - DOS/MS - DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25

(vi) 현 출원 데이터 :

(A) 출원 번호 :

(B) 출 원 일 :

(C) 분류 :

(viii) 대리인 /관리인 정보 :

(A) 성명 : 커리, 다니엘 알.

(B) 등록 번호 : 32,727

(C) 참조 / 문서 번호 : A - 363

(ix) 통신 정보 :

(A) 전화 번호 : 805 - 447 - 8102

(B) 팩스 : 805 - 499 - 8011

(C) 텔렉스 :

(2) 서열 번호 : 1

(i) 서열의 특성 :

(A) 서열의 길이 : 134 아미노산 잔기

(B) 서열의 타입 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 선형

(ix) 서열의 특징 :

(A) 특징을 나타내는 기호 : 성숙한 인체 GDNF 에 대한

추정 아미노산 서열

(2) 서열 번호 : 2

(i) 서열의 특성 :

(A) 서열의 길이 : 12 아미노산 잔기

(B) 서열의 타입 : 아미노산

(D) 토폴로지 : 선형

(ix) 서열의 특징 :

(A) 특징을 나타내는 기호 : 간상체 - 특이 단백질 어레스틴의

합성 펩티드 서열

Claims (12)

1. 광수용체의 손상 또는 변성 치료용 제약학적 조성물을 제조하기 위한 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물의 용도.
2. 제 1 항에 있어서, 광수용체의 손상 또는 변성은 색소성망막염, 바르데 - 비들 증후군, 베슨 - 코른와이그 증후군(무베타지단백혈증), 베스트병(비텔리폼 영양장애), 맥락막결손증, 회전상 위축, 선천성흑내장, 레프섬 증후군, 스타르가르드병 및 유서 증후군, 연령 - 관련 반점 변성, 당뇨병성 망막증, 말초성 유리체망막증, 광성 망막증, 외과수술 - 유도성 망막증, 바이러스성 망막증, 허혈성 망막증, 망막 박리 또는 외상성 망막증과 관련됨을 특징으로 하는 용도.
3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 제약학적 조성물이 서열 1 에 나타낸 GDNF 아미노산 서열, 또는 그것의 변이체나 유도체를 포함함을 특징으로 하는 용도.
4. 제 3 항에 있어서, 제약학적 조성물이 [Met^-1]GDNF 를 포함함을 특징으로 하는 용도.
5. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 제약학적 조성물이 수용성 중합체에 부착된 GDNF 를 포함함을 특징으로 하는 용도.
6. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 제약학적 조성물이 절단된 인체 GDNF 단백질을 포함함을 특징으로 하는 용도.
7. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 제약학적 조성물이 GDNF 단백질 산물을 생산하고 분비하도록 변형된 세포를 포함함을 특징으로 하는 용도.
8. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 제약학적 조성물이 망막 질환을 치료하기 위한 제 2 치료 약물의 유효량을 더 포함함을 특징으로 하는 용도.
9. 제 8 항에 있어서, 제 2 치료 약물은 뇌 유래 신경영양성 인자, 뉴로트로핀 - 3, 뉴로트로핀 - 4/5, 뉴로트로핀 - 6, 인슐린 - 유사 성장 인자, 모양체 신경영양성 인자, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자 - 5, 형질전환 성장 인자 - β 및 코카인 - 암페타민 조절 전사물 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 용도.
10. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 제약학적 조성물은 안구 삽입물, 안구 주사제 또는 안구 이식물로서 제형화됨을 특징으로 하는 용도.
11. 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물의 존재하에서 해리된 광수용세포를 배양함을 포함하는, 이식용 광수용세포를 제공하는 방법.
12. 광수용세포와, 이 광수용세포의 생존을 증진시키고 연속적으로 성장 및 성숙시키는 양의 신경교세포주 - 유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물을 포함하는 조성물.