CZ2003444A3 - Konstrukty nukleové kyseliny, vaskulární buňky jimi transformované a farmaceutické prostředky a způsoby používající je k indukci angiogenesy - Google Patents

Konstrukty nukleové kyseliny, vaskulární buňky jimi transformované a farmaceutické prostředky a způsoby používající je k indukci angiogenesy Download PDF

Info

Publication number
CZ2003444A3
CZ2003444A3 CZ2003444A CZ2003444A CZ2003444A3 CZ 2003444 A3 CZ2003444 A3 CZ 2003444A3 CZ 2003444 A CZ2003444 A CZ 2003444A CZ 2003444 A CZ2003444 A CZ 2003444A CZ 2003444 A3 CZ2003444 A3 CZ 2003444A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cells
expression
nucleic acid
acid construct
angiogenic
Prior art date
Application number
CZ2003444A
Other languages
English (en)
Inventor
Moshe Y. Flugelman
Zoya Gluzman
Meir Preis
Belly Koren
Tzafra Cohen
Adili Tsaba
Anat Weisz
Original Assignee
M. G. V. S. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by M. G. V. S. Ltd. filed Critical M. G. V. S. Ltd.
Publication of CZ2003444A3 publication Critical patent/CZ2003444A3/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0056—Peptides, proteins, polyamino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0045—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent agent being a peptide or protein used for imaging or diagnosis in vivo
    • A61K49/0047—Green fluorescent protein [GFP]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C12N2840/206—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES having multiple IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká konstruktů nukleové kyseliny, vaskulárních buněk jimi transformovaných a farmaceutických prostředků a způsobů používajících je k indukci angiogenesy. Konkrétněji se vynález týká geneticky transformovaných vaskulárních buněk exprimujících přinejmenším jeden angiogenní proliferační faktor a přinejmenším jeden angiogenní maturační faktor a způsobů použití těchto geneticky transformovaných buněk k indukci tvorby nových cév v savčí tkáni.
Dosavadní stav techniky
Atherosklerotické obstruktivní kardiovaskulární choroby
Choroby způsobované atherosklerosou, jako jsou choroby věnčitých tepen, cerebrovaskulární choroby a choroby periferních cév jsou na západní polokouli nej běžnější příčinou smrtelných onemocnění a úmrtnosti [20].
Navzdory značným veřejným a soukromým snahám jsou choroby spojené s atherosklerosou druhé za jakoukoli jinou známou chorobou co do způsobované ekonomické zátěže. Světová zdravotnická organizace (WHO) očekává, že choroby spojené s atherosklerosou budou v roce 2020 vést mezi příčinami smrtelných onemocnění a úmrtnosti.
Rutinně se k léčbě s atherosklerosou spojených poruch používají různé invasivní metody jako jsou bypass chirurgie nebo angioplastika. I když tyto metody vedou u jednotlivců trpících atherosklerosou k prodloužení délky života, jsou omezeny svou komplexností a vysoce invasivní povahou.
Navíc tyto metody nemohou být účinně využívány u všech pacientů trpících ischemickými stavy z blokády tepenného větvení nebo blokády štěpů bypassu, ať už syntetických, ·· ·· žilných nebo tepenných. V současnosti věnují veřejná a soukromě financovaná kardiovaskulární výzkumná zařízení značný čas a zdroje do úsilí odhalit nové léčebné metody, jež by byly účinné v léčbě jednotlivců trpících atherosklerosou.
Angiogenese
Tvorba nových krevních cév je u dospělých regulována v normálních nebo nemocných tkáních dvěma procesy: Rekapitulovanou arteriogenesí (transformací již existujících tepenných vlásečnic na malé svalové tepny) a angiogenesí, rašením existujících cév (což probíhá jak v embryu, tak u dospělého jedince) [1-5]. U dospělých nastává fysiologická angiogenese během ženského hormonálního cyklu a u mnohých patologických stavů, jako je tvorba nových cév v rostoucím nádoru a kolem něj, nebo tvorba kolaterálních cév v ischemickém srdci nebo končetině [4, 5].
Proces angiogenese je regulován biomechanickými a biochemickými stimuly. Angiogenický proces sestává ze tří posloupných fází. v první fázi, nazývané iniciace, se uvolní spojení mezi endothelovými buňkami (EC) a obklopující tkání. V druhé fázi EC proliferují a invadují ischemickou tkáním, což vede k tvorbě EC výhonků. V konečné fázi angiogenického procesu nově vytvořené výhonky EC dozrávají na funkční krevní cévy. Proces maturace je charakterizován rekrutováním buněk, jež obklopují endothelové buňky. Peri-endothelové buňky, jako jsou pericyty v kapilárách, buňky hladkého svalu ve větších cévách a srdeční myocyty v srdci, jsou rekrutovány k poskytnutí udržovacích a modulačních funkcí tvořící se cévě.
Založení a přemodelování krevních cév je řízeno parakrinními signály, z nichž mnohé jsou zprostředkovány bílkovinnými ligandy, jež modulují aktivitu transmembránových tyrosin-kinásových receptorů [1, 3, 6]. Mezi tyto molekuly patří vaskulární endothelový růstový faktor (VEGF) a jeho receptorové rodiny (VEGFRl a VEGFR2), angiopoietin 1 a 2 (Ang-1 a Ang-2) a jejich receptory (Tie 2), basický fibroblastový růstový faktor (bFGF), z destiček odvozený • · · · ·· · · , · · « • · ·· růstový faktor (PDGF) a transformující růstový faktor β (TGF-β).
Dominantní role VEGF a jeho receptorů v předběžných fázích angiogenese a vaskulogenese byla jasně předvedena v heterozygotních zvířatech nulových v VEGF receptorů [7-9]. Takováto zvířata, která nepřežívají ranná stádia embryogenese, buď neprodukují endothelové buňky, když jsou heterozygotní pro VEGFl receptor, anebo nedokáží vytvářet cévy, když jsou heterozygotní pro VEGF2 receptor. Studie, jež narušovaly Tie2 receptor nebo jeho ligandy angiopoietin 1 a 3 ukázaly, že i když endothelové buňky vytvářely trubici, peříendothelové buňky nebyly rekrutovány [10-14]. Je zajímavé, že podobný fenotyp byl pozorován u zvířat, jimž chyběl PDGF-B, TGF-β a tkáňový faktor [15-18], což napovídá, že vazba angiopoietinu k jeho receptorů může vést k sekreci těchto faktorů z endothelu. Recentní studie napověděly, že VEGF zodpovídá za ranné fáze angiogenese charakterizované desintegrací endothelových buněk a unikáním plasmatických složek [19, 20]. Tytéž studie napověděly, že vazba Ang-2 a Tie2 hraje roli v regresi již existujících cév [6, 13].
Rychlostní poměry angiogenesy zahrnují změnu v lokální rovnováze mezi positivními a negativními angiogenickými faktory ovlivňujícími růst mikrocév. částečné objasnění role angiogenických faktorů a jejich receptorů vedlo k několika navrhovaným postupům genové terapie. Genová terapie se pokládá ve vaskulární terapii za výhodnou, protože transgen může být exprimován lokálně bez vedlejších systémových účinků, terapeutický účinek může být výrazný po delší časový úsek a účinek může věrně imitovat biochemickou regulaci ve vaskulární tkáni [21-24].
Genová terapie se zkoušela jak in vitro, tak na zvířecích modelech na inhibici proliferace buněk hladkého svalu po angioplastice a bypass operacích, a na indukci angiognenesy podporou proliferace endothelových buněk [23]. Navíc se použila holá DNA a rekombinantní adenovirové vektory kódující VEGF165 respektive vegf121 , pro in vivo genový přenos ke gentické modifikaci vaskulárních buněk pacientů s ischemickou chorobou nebo periferální vaskulární chorobou [25, 26].
Účinnost a bezpečnost takových terapeutických technik však byla zpochybněna po úmrtí šesti pacientů účastnících se těchto studí í.
I když bylo demonstrováno, že společné zavedení vektorů kódujících VEGF a Ang-1 ve zvířecím modelu podporovalo vývoj kolaterálních cév [39], takovéto přímé zavádění vektorů by mělo omezený terapeutický účinek v ischemické tkáni a poškozených orgánech, protože nedostatek zdravých buněk v takovýchto tkáních limituje hladiny exprese.
Takže: Pro omezení popsaná zde shora, v současnosti navrhované nebo použité metody nemohou být účinně nebo bezpečně použity k léčbě jednotlivců trpících v širokém rozsahu stavy vytvářenými oklusí periferních, koronárních nebo cerebrovaskulárních krevních cév.
Takto tedy existuje široce uznávaná potřeba účinné, bezpečné a mírně invasivní metody k indukci angiogenese v oblasti tkáně jednotlivce vyhýbající se limitacím uváděným shora, a bylo by vysoce výhodné takovouto metodu mít.
Podstata vynálezu
Podle jednoho aspektu vynálezu je poskytován konstrukt exprese nukleové kyseliny, jenž zahrnuje: a) první polynukleotidový segment kódující angiogenní proliferační faktor a b) druhý polynukleotidový segment kódující angiogenní maturační faktor.
Podle jiného aspektu vynálezu je poskytován systém konstruktů exprese nukleové kyseliny, jenž zahrnuje: a) první konstrukt exprese nukleové kyseliny obsahující první polynukleotidový segment kódující angiogenní proliferační faktor a b) druhý konstrukt exprese nukleové kyseliny obsahující druhý polynukleotidový segment kódující angiogenní maturační faktor.
Podle dalších vlastností výhodných provedení vynálezu popsaných níže, obsahuje konstrukt exprese nukleové kyseliny dále přinejmenším jednu promotorovou sekvenci k řízení exprese • · · · přinejmenším jednoho z polynukleotidových segmentů, prvního a druhého.
Podle ještě dalších vlastností výhodných provedení vynálezu popsaných níže, je první polynukleotidový segment transkripčně navázán k druhému polynukleotidovému segmentu, přičemž první a druhý polynukleotidový segment jsou pod transkripčním řízením jedné promotorové sekvence z přinejmenším jedné promotorové sekvence.
Podle ještě dalších vlastností výhodných provedení vynálezu, obsahuje konstrukt nukleové kyseliny dále sekvenci spojky umístěnou mezi první a druhý polynukleotidový segment.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je sekvence spojky vybrána ze skupiny sestávající z IRES a rozeznávacího místa štěpení proteasou.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je přinejmenším jeden promotor funkční v eukaryotických buňkách.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je přinejmenším jeden promotor vybrán ze skupiny sestávající z konstitutivního promotoru, indukovatelného promotoru a tkáňově specifického promotoru.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení, konstrukt exprese nukleové kyseliny dále zahrnuje: c) první promotorovou sekvenci k expresi prvního polynukleotidového segmentu a d) druhou promotorovou sekvenci k expresi druhého polynukleotidového segmentu.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení, první promotor a druhý promotor jsou oba vybrány ze skupiny sestávající z konstitutivního promotoru, indukovatelného promotoru a tkáňově specifického promotoru.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení, exprese z prvního promotoru a druhého promotoru je regulovatelná jedním efektorem.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení, konstrukt exprese nukleové kyseliny dále zahrnuje přinejmenším jeden další polynukleotidový segment kódující markerový polypeptid.
• · · ·
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je markerový polypeptid vybrán ze skupiny sestávající ze selekčního polypeptidu a reporterového polypeptidu.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je přinejmenším jeden další polynukleotidový segment transkripčně navázán k přinejmenším jednomu z polynukleotidových segmentů, prvnímu a druhému.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je přinejmenším jeden další polynukleotidový segment pri nejmensím prvnímu a jednomu druhému, výhodných sestávající výhodných transkripčně navázán k z polynukleotidových segmentů, prostřednictvím spojkového segmentu.
Podle ještě dalších vlastností popsaných provedení je sekvence spojky vybrána ze skupiny z IRES a rozeznávacího místa štěpení proteasou.
Podle ještě dalších vlastností popsaných provedení je přinejmenším jeden daný další polynukleotidový segment translačně fúzován s přinejmenším jedním z polynukleotidových segmentů, prvním a druhým.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je angiogenní proliferační faktor vybrán ze skupiny sestávající z VEGF, kyselého nebo basického FGF, PlGF, leptinu a HGF.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je angiogenní maturační faktor vybrán ze skupiny sestávající z angiopoietinu-1, Tie-2, TGF-βΙ, TGF-β receptoru-2, endoglinu, Smad5, VE-kadherinu, efrinuB2, PDGF, Bmx tyrosín kinasy a MCP-1.
Podle ještě jiného aspektu vynálezu je poskytována geneticky transformovaná buňka obsahující konstrukt exprese nukleové kyseliny, jenž zahrnuje: a) první polynukleotidový segment kódující angiogenní proliferační faktor a b) druhý polynukleotidový segment kódující angiogenní maturační faktor.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je transformovaná buňka vybrána ze skupiny endothelových buněk, buněk hladkého svalu, pericytů, myocytů, monocytů a fibroblastů.
• · · ·
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je transformovaná buňka vybrána ze zdroje vybraného ze skupiny sestávající ze segmentu žíly nebo tepny, buněk kostní dřeně, progenitorových buněk periferní krve, cirkulujících endothelových buněk a embryonálních kmenových buněk.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je transformovaná buňka vybrána ze zdroje vybraného z lidského dárce a zvířecího zdroje.
Podle ještě jiného aspektu vynálezu je poskytována populace buněk, jež jsou geneticky transformovány k expresi přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru a přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je populace buněk vybrána z přinejmenším dvou buněčných typů vybraných ze skupiny sestávající z endothelových buněk, buněk hladkého svalu, pericytú, myocytů, monocytů, fibroblastů a buněk odvozených z kostní dřeně.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je první buněčný typ z přinejmenším dvou buněčných typů geneticky transformován k expresi přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru přičemž dále je druhý buněčný typ z přinejmenším dvou buněčných typů geneticky transformován k expresi přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je první buněčný typ endothelová buňka přičemž dále je druhý buněčný typ buňka hladkého svalu.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení jsou jak endothelová buňka tak buňka hladkého svalu odvozeny ze segmentu krevní cévy.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je exprese kteréhokoli z přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru a kteréhokoli z přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru nezávisle regulovatelná.
• · · ··♦·
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je přinejmenším jeden z angiogenního proliferačního faktoru vybrán ze skupiny sestávající z VEGF, kyselého nebo basického FGF, PlGF, leptinu a HGF.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je přinejmenším jeden angiogenního maturačního faktoru vybrán ze skupiny sestávající z angiopoietinu-1, Tie-2, TGF-βΙ, TGF-β receptoru-2, endoglinu, smad5, VE-kadherinu, efrinuB2, pdgf, Bmx tyrosin kinasy a mcp-1.
Podle ještě jiného aspektu vynálezu je poskytován způsob indukce tvorby nových krevních cév v oblasti tkáně jednotlivce přičemž daný způsob zahrnuje kroky: a) podávání prvního buněčného typu, jenž je geneticky transformován k expresi přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru do dané oblasti tkáně savce; a b) podávání druhého buněčného typu, jenž je geneticky transformován k expresi přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru do dané oblasti tkáně savce.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení, oblast tkáně zahrnuje okludovaný nebo zúžený segment krevní cévy, ischemickou svalovou tkáň nebo štěp bypassu.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je štěp bypassu syntetický štěp nebo je odvozen z žil né nebo tepenné tkáně.
Podle ještě dalších provedení jsou první z jednotlivce.
Podle ještě vlastností popsaných druhý buněčný typ výhodných odvozeny výhodných dalších vlastností popsaných provedení je jak první tak druhý buněčný typ vybrán ze skupiny sestávající z endothelových buněk, buněk hladkého svalu, pericytů, myocytů, monocytů, fibroblastů a buněk odvozených z kostní dřeně.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je způsob používán k obejití nebo penetraci okludovaného segmentu krevní cévy nebo k založení kolaterálního toku krve do ischemické oblasti.
···· ···· • #· *
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je první a druhý typ buněk podáván společně do oblastí tkáně jednotlivce.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je exprese přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru z prvního buněčného typu regulovatelná prvním faktorem přičemž dále je exprese přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru z druhého buněčného typu regulovatelná druhým faktorem.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení jsou první a druhý faktor jediným faktorem schopným regulovat směrem dolů expresi přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru a regulovat směrem nahoru expresi přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je krok b) prováděn alespoň 12 hodin po kroku a).
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení jsou první buněčný typ a druhý buněčný typ jediným buněčným typem.
Podle ještě dalších vlastností popsaných výhodných provedení je poskytován farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku konstrukt nukleové kyseliny popsaný zde výše nebo bílkovinu jím exprimovanou, a farmaceuticky přijatelný nosič.
Tento vynález se úspěšně zaměřuje na nedostatky uspořádání známých v současnosti tak, že poskytuje konstrukty nukleové kyseliny, buňky jimi transformované a způsoby použití takovýchto transformovaných buněk k indukci angiogenese v savčí tkáni.
Stručný popis obrázků vynález je zde popsán, pouze pomocí příkladů, s odkazy na průvodní obrázky. Se specifickým odkazem na podrobnosti obrázků se nyní zdůrazňuje, že zobrazené konkrétnosti jsou pouze pro příklad a pro účely vysvětlujícího rozboru výhodných provedení vynálezu, a že jsou předváděny ve věci poskytnutí toho, co se má za nejužitečnější a nejsnadnější pro pochopení ·< · 9 · · ····
-ΙΟΙ · · · ·· ·» popisu a koncepčních aspektů vynálezu. V tomto smyslu není snahou ukazovat strukturní detaily vynálezu podrobněji než je potřebné pro základní pochopení vynálezu, přičemž popisy u obrázků činí osobám zběhlým v oboru jasno v tom, jak lze několikeré formy vynálezu provádět v praxi.
V obrázcích
Obr. 1 ilustruje konstrukt vektoru exprese VEGF podle vynálezu.
Obr. 2 ilustruje konstrukt vektoru exprese Ang-1 podle vynálezu.
Obr. 3a-b ilustrují kultivované endothelové buňky (ec) transformované konstrukty exprese VEGF-Lacz (3a) nebo VEGF-GFP (3b).
Obr. 4a-c ilustrují okludovanou krevní cévu (obrázek 4a), bypass způsob léčby takovéto okluse podle dřívějšího stavu v oboru (obrázek 4b) a způsob proniknutí nebo obejití okludované krevní cévy s použitím znalostí tohoto vynálezu (obrázek 4c).
Obr. 5a ilustruje místa okluse a měření průtoku v tepenné větvi zadní končetiny potkana uměle zablokované o znovu otevřené injekcí rekombinantního adenovirového virového vektoru exprimujícího vegf165.
Obr. 5b je graf ilustrující průtok krve ve femorální tepně potkana 3, 7 a 14 dnů po injekci VEGF165 adenovi rového vektoru nebo solného roztoku (kontrola). Hodnoty jsou uváděny jako + S.D., n = 5 pro každý časový bod.
Obr. 6a-d jsou světelné nebo fluorescenční mikrofotografie (obrázky 6a-c resp. 6b-d) zobrazující EC nebo SMC (obrázky 6a-b resp. 6c-d) infikované rAdAngl-GFP.
Obr. 7a-d jsou světelné nebo fluorescenční mikrofotografie (obrázky 7a-c resp. 7b-d) zobrazující EC nebo SMC (obrázky 7a-b resp. 7c-d) transdukované retroAngl-GFP.
Obr. 8a-b jsou fotografie zobrazující expresi Ang-1 mRNA v EC a SMC (obrázky 8a resp. 8b). Dráhy v obrázku 8a:
- kontrola, neinfikované EC; 2 - rAdAngl infikované EC;
- rAdGFP infikované EC; 4 - negativní kontrola reakce reversní transkripce; 5 - positivní kontrola plasmidu Ang-1 DNA. Dráhy v obrázku 8b: 1 - DNA plasmidu kódujícího Ang-1;
- 11 2 - negativní kontrola PCR reakce; 3 - negativní kontrola RT reakce; 4 - rAdGFP infikované SMC; 5 - rAdAngl infikované SMC; 6 - kontrola, neinfi kované SMC. Celková mRNA byla po infekci adenovirovými vektory extrahována z EC a SMC a byla provedena analýza RT-PCR jak je popsáno v sekci Příklady níže. vzorky byly normalizovány RT-PCR amplifikací mRNA β-aktinu.
Obr. 9a-b jsou fotografie zobrazující expresi Ang-1 mRNA v EC a SMC (obrázky 8a resp. 8b). Dráhy v obrázku 8a:
- kontrola, netransdukované EC; 2 - retroGFP transdukované EC; 3 - retroAngl transdukované EC; 4 - negativní kontrola RT reakce. Dráhy v obrázku 9b: 1 - kontrolní neinfikované SMC;
- retro GFP transdukované SMC; 3 - retro Ang-1 transdukované SMC; 4 - negativní kontrola RT reakce. Celková mRNA byla po transdukci retrovirovými vektory extrahována z EC a SMC a byla provedena analýza RT-PCR jak je popsáno v sekci Příklady níže. Vzorky byly normalizovány RT-PCR amplifikací mRNA β-aktinu.
Obr. 10 je fotografie zobrazující expresi bílkoviny Ang-1 v adenoviry infikovaných EC a SMC. Dráhy: 1 - kontrolní neinfikované buňky; 2 - rAdGFP infikované buňky; 3 - rAdUP50 infikované buňky; 4 - rAdAngl infikované buňky; C - positivní kontrola, rekombinantní bílkovina Ang-1.
Obr. 11 je fotografie zobrazující expresi bílkoviny Ang-1 v retroviry infikovaných EC a SMC. Dráhy: 1 - netransdukované EC; 2 - retroGFP transdukované EC; 3 - retroAngl transdukované EC; 4 - netransdukované SMC; 5 - retroGFP transdukované SMC; 6 - retroAngl transdukované SMC; 7 - Ang-1 positivní kontrola.
Obr. 12a-b jsou fotografie zobrazující Western blot analýzu exprese bílkovin Ang-1 a VEGF165 (obrázky 12a resp. 12b) při kokultivaci adenoviry infikovaných EC nadprodukujících Ang-1 s EC nadprodukujícími VEGF165. Dráhy: 1 - rAdVEGF infikované EC + rAdAngl infikované EC; 2 - rAdGFP infikované EC + rAdAngl infikované EC; 3 - rAdVEGF infikované EC + rAdGFP infikované EC; 4 - positivní kontrola, buňky 293FLYA stabilně nadprodukující Ang-1.
Obr. 13a-b jsou fotografie zobrazující Western blot analýzu exprese bílkovin Ang-1 a vegf165 (obrázky 13a resp. 13b) při kokultivaci adenoviry infikovaných EC nadprodukujících Ang-1 s SMC nadprodukujícími VEGF165.
- 12 • · • · • · • · ·
• ·
Dráhy: 1 - rAdVEGF infikované EC + rAdAngl infikované SMC; 2 rAdGFP infikované EC + rAdGFP infikované EC; 3 - positivní kontrola, buňky 293FLYA stabilně nadprodukující Ang-1.
Obr. 14 je histogram zobrazující normální proliferaci rAdAngl-GFP infikovaných EC buněk nadprodukujících Ang-1. Buňky byly infikovány rAdAngl-GFP (AdAngl), rAdVEGF-GFP (AdVEFG), rAdGFP (AdGFP) nebo nebyly infikovány (kontrola). Ukázané výsledky zobrazují rychlost proliferace ve dni 7 po infekci.
Obr. 15a-b jsou fotografie zobrazující zvýšenou fosfory!aci Tie2 receptoru u rAdAngl infikovaných EC. Bílkovinné lysáty EC buněk infikovaných rAdAngl-GFP, rAdGFP a rAdVEGF-GFP byly analyzovány na fosforylaci pomocí Western blot analýzy s nebo bez předchozí imunoprecipitace antifosfotyrosinovou protilátkou (obrázky 15a resp. 15b). Dráhy: 1 - neinfi kované EC; 2 - rAdGFP infikované EC; 3 - rAdAngl-GFP infikované EC; 4 - rAdVEGF-GFP infikované EC; 5 - negativní kontrola, buňky 293 (jen v obrázku 15a).
Obr. 16a-h jsou mikrofotografie zobrazující trojrozměrné in vitro angiogenní rašení kokultivovaných adenovirově infikovaných EC sféroidů uzavřených v kolagenovém gelu. Panely zobrazují rAdGFP infikované EC (obrázky 16a-b); kokultivované rAdGFP + rAdVEGF infikované EC (obrázky 16c-d); kokultivované rAdAngl-GFP + rAdGFP infikované EC (obrázky 16e-f); a kokultivované rAdAngl-GFP + rAdVEGF-GFP infikované EC (obrázky 16g-h). Ukázány jsou výsledky dvou 96-hodinových representativních testů.
Obr. 17a-d jsou fluorescenční mikrofotografie zobrazující trojrozměrné in vitro angiogenní rašení v kolagenovém gelu uzavřených kokultivovaných sféroidů adenovirově infikovaných EC a retrovirově transdukovaných SMC. Panely zobrazují kokultivované rAdGFP infikované EC + retroGFP transdukované SMC (obrázek 17a); kokultivované rAdVEGF-GFP infikované EC + retroVEGF-GFP transdukované SMC (obrázek 17b); kokultivované rAdGFP infikované EC + retroAngl-GFP transdukované SMC (obrázek 17c); kokultivované rAdVEGF-GFP infikované EC + retroAngl-GFP transdukované SMC (obrázek 17d). Endothelové buňky se vyznačují červenou respektive zelenou fluorescencí.
Pro každou experimentální skupinu jsou ukázány výsledky representativních 48-hodinových testů.
Obr. 18a-h jsou fluorescenční mikrofotografie zobrazující přežívání virově transformovaných vaskulárních buněk nadprodukujících diferenciační a proliferační faktory za podmínek hladovění na sérum. Panely zobrazují následovně: rAdGFP infikované SMC (obrázek 18a); rAdAngl-GFP infikované SMC (obrázek 18b); rAdGFP infikované EC (obrázek 18c); rAdVEGF-GFP infikované EC (obrázek 18d); kokultivované rAdGFP infikované SMC + rAdGFP infikované EC (obrázek 18e); kokultivované rAdGFP infikované SMC + rAdVEGF-GFP infikované EC (obrázek 18f); kokultivované rAdAngl-GFP infikované SMC + rAdGFP infikované EC (obrázek 18g); a kokultivované rAdAngl-GFP infikované SMC + rAdVEGF-GFP infikované EC (obrázek 18h).
Obr. 19a-h jsou světelné fázové (obrázky 19a, 19c, 19e a 19g) a fluorescenční (obrázky 19b, 19d, 19f a 19h) mikrofotografie zobrazující zvýšené přežívání TUNEL-barvených EC buněk retrovirově transdukovaných k nadprodukci Ang-1 po 24 hodinách sérové deprivace. ukázána jsou náhodná pole representující netransdukované EC kultivované s dodatkem nebo bez dodatku séra (obrázky 19a-b resp. 19c-d) a retroAngl-GFP transdukované EC kultivované s dodatkem nebo bez dodatku séra (obrázky 19e-f resp. 19g-h). Apoptické buňky se vyznačují zelenou fluorescencí.
Fig. 20 je histogram zobrazující procento apoptosy v EC retrovirově transdukovaných k nedprodukci Ang-1. Prezentované výsledky představují kvantifikaci tunel testu ukázaného v předešlém obrázku. Experimentální skupiny sestávaly z netransdukovaných EC kultivovaných s dodatkem nebo bez dodatku séra, sérum (+) respektive sérum (-). Výsledky jsou udávány jako procento apoptických buněk z celkové populace počítaných v šesti náhodných mikroskopických polích.
• · · · · c « -------_ j_4 _ ·· · ·· ·· ·· ··
Příklady provedení vynálezu
Tento vynález je o konstruktech nukleové kyseliny a vaskulárních buňkách jimi transformovaných, jež mohou být použity k indukci angiogenesy. Konkrétněji může být vynález použit k indukci tvorby nových krevních cév schopných obejít nebo proniknout okludovanou, poraněnou nebo ischemickou savčí tkáň.
Principy a postupy vynálezu mohou být lépe pochopeny s odkazy na obrázky a doprovodné popisy.
Před vysvětlením podrobností alespoň jednoho provedení by se mělo porozumět, že vynález není omezen co do aplikací podrobností konstrukce a uspořádání složek načrtnutých v následujícím popisu nebo ilustrovaných v obrázcích. Vynález může mít jiná provedení nebo může být praktikován nebo prováděn různými cestami. Je rovněž třeba porozumět tomu, že frazeologie a terminologie používaná zde má za účel popis a nesmí být považována za omezující.
Dosavadní nechirurgické způsoby pro indukci a regulaci angiogenesy se teprve musí stát běžnou praxí v léčbě blokády krevních cév, poranění nebo ischémie.
Takovéto metody trpí omezeními inherentními daným typům používaných angiogenních faktorů nebo praktikovaných způsobů podávání.
K překonání omezení inherentních dosavadním způsobům je vynálezci navrhován nový způsob podpory generování vaskulární tkáně, kterýžto způsob je prováděn poskytováním dvou nebo více angiogenních faktorů, včetně VEGF a Ang-1 na místo léčby jednotlivce. S jsou poskytované angiogenní faktory exprimovány a secernovány z endothelových buněk a buněk hladkého svalu transformovaných ex vivo, jž jsou podávány na místo léčby.
Podle jednoho aspektu vynálezu je tedy poskytován konstrukt exprese nukleové kyseliny, jenž zahrnuje první polynukleotidový segment kódující angiogenní proliferační faktor jako je, ale bez omezení, vegf (přístupové číslo GenBank AB021221), HGF (přístupové číslo GenBank D14012), pigf [28](přístupové číslo GenBank X54936), VEGF-C [30](přístupové číslo GenBank NM005429), bFGF [31] (přístupové číslo GenBank • · · · • · · ·
- 15 304513), aFGF (přístupové číslo GenBank S67291), Leptin [32] (přístupové číslo GenBank XM045426), nebo jakýkoli jiný faktor vedoucí k proliferaci a migraci endothelových buněk; a druhý polynukleotidový segment kódující angiogenní maturační faktor jako je, ale bez omezení, angiopoietin-1, rodina TGF-β (TGF-βΙ, TGF-β receptor-2, endoglin, Smad5) [33], VE-kadherin [34], efrinB2 [35], PDGF [36], Bmx tyrosinkinasa [37], MCP-1 [38], nebo jakýkoli jiný faktor vedoucí k maturaci a stabilizaci krevních cév.
Podle jednoho výhodného provedení tohoto aspektu vynálezu jsou angiogenní proliferační faktor a angiogenní maturační faktor exprimovány z jedné (stejné) promotorové sekvence zahrnuté do konstruktu nukleové kyseliny.
K zajištění koexprese prvního a druhého polynukleotidového segmentu z jedné promotorové sekvence lze použít různá schémata konstruktu.
Například: První a druhý polynukleotidový segment mohou být transkripčně fúzovány prostřednictvím sekvence spojky zahrnující vnitřní místo vstupu ribosomu (IRES). V tomto případě bude molekula transkribované polycistronní RNA zahrnující jak angiogenní proliferační faktor tak angiogenní maturační faktor translatována jak z pokrytého 5' konce tak z vnitřní IRES sekvence polycistronní RNA molekuly, čímž se bude produkovat jak angiogenní proliferační faktor tak angiogenní maturační faktor.
Alternativně mohou být první a druhý polynukleotidový segment translačně fúzovány prostřednictví rozeznávacího místa proteasy štěpí telného proteasou exprimovanou v buňce, jež má být transformována konstruktem nukleové kyseliny, v tomto případě bude chimérický translatovaný protein štěpen proteasou exprimovanou v buňce za tvorby jak angiogenního proliferačního faktoru tak angiogenního maturačního faktoru.
Podle jiného výhodného provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnuje konstrukt nukleové kyseliny dvě identické nebo odlišné promotorové sekvence tak, že angiogenní proliferační faktor a angiogenní maturační faktor jsou každý exprimován separátně z určené promotorové sekvence.
- 16 Bude vítáno, když expresi angiogenního proliferačního faktoru a angiogenního maturačního faktoru bude lze řídit ze dvou separátních konstruktů nukleové kyseliny.
Takto podle jiného aspektu vynálezu je poskytován systém konstruktu nukleové kyseliny. V tomto případě je první polynukleotidový segment kódující angiogenní proliferační faktor exprimován z prvního konstruktu nukleové kyseliny prostřednictví první promotorové sekvence, zatímco druhý polynukleotidový segment kódující angiogenní maturační faktor je exprimován z druhého konstruktu nukleové kyseliny prostřednictví druhé promotorové sekvence, jež může být stejná nebo odlišné od první promotorové sekvence.
Jak je dále popisováno níže, konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu se používají k transformaci savčích buněk jako jsou, ale bez omezení, endothelových buňky, buňky hladkého svalu, pericyty, myocyty, monocyty, fibroblasty a embryonální kmenové buňky nebo kmenové buňky kostní dřeně. Promotorové sekvence používané v daných konstruktech nukleové kyseliny jsou jako takové s výhodou konstitutivní, tkáňově specifické nebo regulovatelné (tj. indukovatelné) promotory funkční v takovýchto savčích buněčných typech.
K vytvoření konstruktů nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být polynukleotidové segmenty kódující angiogenní proliferační faktor nebo angiogenní maturační faktor zaligovány do komerčně dostupných vektorových systémů exprese vhodných pro transformaci savčích buněk a řízení exprese těchto faktorů v transformovaných buňkách. Bude vítáno, když takovéto komerčně dostupné vektorové systémy bude možné snadno pozměňovat pomocí běžně užívaných rekombinantních technik pro nahrazení, duplikaci nebo zmutování existujícího promotorové nebo zesilující sekvence nebo zavedení jakýchkoli dalších polynukleotidových sekvencí jako jsou například sekvence kódující další selekční markéry nebo sekvence kódující reportérové polypeptidy.
Savčí vektory exprese vhodné pro použití s tímto vynálezem zahrnují, ale bez omezení, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeosSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pBK-RSV a pBK-CMV, jež jsou dostupné od • · · · • · • · · · společnosti Stratagene, pTRES, jenž je dostupný od společnosti Clontech, a jejich deriváty.
Podle výkladu tohoto vynálezu jsou angiogenni proliferační faktor a angiogenni maturační faktor poskytovány oblast ischemické tkáně k indukcí angiogenesy v ní.
K vyhnutí se problémům s bezpečností ve spojitosti s přenosem in vivo a k podpoře tvorby nových krevních cév jsou angiogenni faktory s výhodou poskytovány ze sklizených krevních buněk transformovaných ex vivo.
Takovéto transformované buňky jsou používány k indukci tvorby nových krevních cév, například pomocí přímé injekce buněk do nebo kolem oblasti tkáně jež má být léčena s použitím speciálně navrženého kathetru, v principu podobného perfusnímu kathetru vyráběného Boston scientific (USA).
Takto je podle jiného aspektu vynálezu poskytována populace buněk geneticky transformovaných k expresi přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru a přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru.
Buňky jsou s výhodou transformovány ex vivo i když ve vynálezu může být použita též in vivo transformace xenogenní tkáně následovaná sklizní buněk.
Jak se zde používá, výraz geneticky transformovaná odkazuje na buňku transientně nebo stabilně transformovanou exogenní polynukleotidovou sekvencí/sekvencemi. U stabilní transformace jsou exogenní polynukleotidové sekvence integrovány do buněčného genomu a jako takové jsou geneticky zděděny dceřinnými buňkami, zatímco u trnasientní transformace existují exogenní polynukleotidové sekvence transientním způsobem jako jaderné nebo cytoplasmatické molekuly a jako takové nejsou geneticky zděděny dceřinnými buňkami.
Konstrukty nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být zavedeny do populace buněk pomocí kteréhokoli standardního savčího transformačního způsobu. Takovéto způsoby zahrnují, ale bez omezení, techniky přímého zachycení DNA, a transformaci zprostředkovanou viry nebo liposomy (k dalším podrobnostem viz například Methods in Enzymology, sv. 1-317, Academie Press).
- 18 Podle tohoto aspektu vynálezu zahrnuje populace buněk jeden nebo více typů buněk. Protože tvorba a maturace krevních cév zahrnuje několik buněčných typů exprimujících několik angiogenních faktorů, populace buněk podle vynálezu zahrnuje s výhodou dva různé vaskulární buněčné typy: první buněčný typ, jako je například endothelová buňka a druhý buněčný typ, jako je například buňka hladkého svalu, pericytu nebo myocytu.
S výhodou exprimuje každý buněčný typ populace buněk specifický angiogenní faktor. Například: První buněčný typ je transformován nukleovou kyselinou k expresi angiogenního proliferačního faktoru a druhý buněčný typ je transformován nukleovou kyselinou k expresi angiogenního maturačního faktoru.
Bude však vítáno, když bude populace buněk exprimovat angiogenní proliferační faktor a angiogenní maturační faktor z obou typů buněk nebo když bude populace buněk exprimovat oba faktory z jednoho typu buněk, zatímco druhý buněčný typ bude exprimovat jen jeden faktor, což se rovněž ve vynálezu předpokládá.
Jak se dále podrobně rozebírá níže, populace buněk podle vynálezu se podává do oblasti tkáně jednotlivce pro obejití nebo proniknutí například okluse v krevní cévě, jež zásobuje danou oblast tkáně. Jak se dále podrobně rozebírá v následující sekci Příkladů, takovéto podávání může být přímo do okludované krevní cévy nebo může být do tkáně obklopující okludovanou krevní cévu.
Buněčné typy buněčné populace jsou jako takové výhodně odvozeny z tkáně žíly nebo tepny nebo z tkáně kostní dřeně jednotlivce, jenž má být léčen nebo z tkáně syngenického jednotlivce. Bude vítáno, když bude pro přípravu buněčné populace možno použít i xenogenické buňky za předpokladu, že se před podávání nebo během podávání přijmou opatření, jimiž by se předešlo odmítnutí takovýchto buněk léčeným jednotlivcem, v oboru jsou známy mnohé způsoby zabránění nebo zmírnění odmítání buněk a proto zde nejsou uváděny další podrobnosti.
- 19 • · · · • · • · · · • · · ·
Podle jiného aspektu vynálezu je poskytován způsob indukce tvorby nových krevních cév v oblasti tkáně jednotlivce.
Protože vytváření nových cév závisí na časově patřičném poskytnutí každého typu buněk a, ještě významněji, každého angiogenního faktoru, způsob podle vynálezu se s výhodou provádí postupem nejvhodnějším pro vytvoření takovýchto podmínek v oblasti tkáně, jež má být léčena.
Takto podle jednoho výhodného provedení vynálezu se angiogenese navodí podáváním prvního typu buněk geneticky transformovaných k expresi přinejmenším jednoho angiogenického proliferačního faktoru do oblasti tkáně jednotlivce s následným podáváním druhého typu buněk geneticky transformovaných k expresi přinejmenším jednoho angiogenického maturačního faktoru do oblasti tkáně jednotlivce.
První buněčný typ se s výhodou podává od 12 hodin do 2 týdnů před podáváním druhého buněčného typu. To zajišťuje načasované poskytnutí angiogenního proliferačního faktoru a angiogenního maturačního faktoru tkáni, jež má být léčena a tudíž optimální podmínky pro tvorbu cév.
Bude vítáno, když načasované poskytování angiogenních faktorů bude možno provádět podáváním jednoho nebo více buněčných typů, jež exprimují angiogenní faktory z promotorové sekvence regulovatelné efektorem.
Jak se zde používá, výraz efektor nebo spojení regulační faktor zaměnitelně odkazují na molekulu nebo fyzikální stav (např. světlo, biomechanický stres, atd.) se schopností regulovat směrem nahoru nebo regulovat směrem dolů expresi polynukleotídové sekvence z promotoru regulovaného takovýmto efektorem. Příklady regulovatelných promotorů, jež mohou být použity v tomto vynálezu zahrnují chemicky regulovatelné promotory jako je například tetracyklinem regulovatelný promotor popsaný v Agha-Mohammadi S, Lotze mt. Regulatable systems: applications in gene therapy an replicating viruses. J Clinical investigations 2000;105;11771183, a biomechanický regulovatelné promotory jako je například, včetně promotoru, element odpovídající na namáhání
- 20 • · · · · · · ·· ·· · · ·· ve střihu popsaný Resnickem et al., v PNAS USA 90;4591-4595, 1993.
Jak je dále popsáno v sekci Příkladů, jež následuje, lze jeden nebo více buněčných typů transformovat konstruktem nebo konstrukty nukleové kyseliny, jež exprimují angiogenní faktory z regulovatelné promotorové sekvence/sekvencí. Takovéto promotory jsou vybrány tak, aby popodání buněčného typu(ů) do oblasti tkáně, jež má být léčena, byla exprese angiogenních faktorů regulována směrem nahoru nebo regulována směrem dolů k produkci žádoucího schématu dočasné exprese vhodného k indukci tvorby nových krevních cév.
Takto například může být exprese angiogenního proliferačního faktoru regulována prvním regulačním faktorem a exprese angiogenního maturačního faktoru regulována druhým regulačním faktorem.
Takovéto regulační faktory mohou být používány v různých časových bodech po podání buněk a takto vytvářet odlišná schémata exprese pro každý angiogenní faktor.
Alternativně mohou být promotorové sekvence vybrány tak, že exprese angiogenního maturačního faktoru je regulována směrem nahoru nějakým faktorem, zatímco exprese angiogenního proliferačního faktoru je regulována stejným regulačním faktorem směrem dolů. Takto v tomto případě lze použít jediný regulační faktor k vytvoření odlišných schémat exprese pro každý angiogenní faktor.
Bude vítáno, když bude možno vybrat regulovatelný promotor tak, aby jeho regulace byla provedena po podání buněk do oblasti tkáně, jež má být léčena. Tedy: výhodné jsou promotory, jež jsou regulovatelné podmínkami vytvářenými za tvorby krevních cév, jako jsou například síly spojené interakcemi buňky k buňce, nebo promotory, jež mohou být regulovány externě podávanými faktory, jež mohou být bezpečně poskytovány buď do oblasti tkáně anebo do krevního řečiště jednotlivce, jenž má být léčen.
Tento vynález tedy poskytuje nový přístup k léčbě ischemických tkání. Obohacení ischemického orgánu vaskulárními buňkami geneticky transformovanými k nadprodukci faktorů, jež zlepšují přežívání buněk za podpory tvorby krevních cév je
- 21 racionálnější a bezpečnější přístup než dřívější přístupy přímého přenosu genů. Spojení endothelových buněk s buňkami hladkého svalu a exprese dvou různých genů tedy zajišťuje spolupráci mezi podávanými a rekrutovanými buňkami, což zajišťuje tvorbu a údržbu krevních cév.
I když angiogenní proliferační a maturační faktory popsané shora jsou s výhodou exprimovány z podávaných buněk, takovéto faktory mohou být podávány rovněž jako polypeptidový preparát, jenž je buď chemicky synteizován nebo extrahován z transgenního prokaryotického nebo eukaryotického hostitele exprimujícího takovéto faktory.
S výhodou tvoří polypeptidový preparát součást farmaceutického prostředku. Takovýto farmaceutický prostředek by měl zahrnovat rovněž farmaceuticky přijatelný nosič, jenž slouží stabilizaci a zvyšuje cílení polypeptidových faktorů.
Příklady vhodných nosičů zahrnují, ale bez omezení, fyziologické roztoky, liposomy, micelová tělíska, virové částice a podobně.
Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou být podávány kterýmkoli způsobem známým v oboru. S výhodou jsou prostředky injikovány do oblasti tkáně jež má být léčena nebo kolem ní, jak je zde popsáno shora.
Vynález tudíž poskytuje způsoby, jež lze použít k podpoře tvorby nových krevních cév nebo zajištění nového průtoku oblastí s okludovanou nebo zúženou vaskulární tkání.
Tento vynález je podstatně méně invasivní než bypass operace nebo angioplastika a jako takový obchází rizika spojená s takovýmito chirurgickými technikami.
Další předměty, výhody a nové vlastnosti vynálezu budou osobě s normální zběhlostí v oboru jasné po prostudování následujících příkladů (které nejsou zamýšleny jako omezující). Navíc, každé z různých provedení a aspektů vynálezu jak jsou uvedeny shora a jak jsou nárokovány v nárocích nalézá v následujících příkladech experimentální oporu.
·· ···· ·· ···· ·· ····
Příklady
Nyní budou dány odkazy k následujícím příkladům, jež spolu s popisem shora ilustrují neomezujícím způsobem tento vynález.
Obecně zahrnují zde použitá terminologie a používané laboratorní postupy molekulární, biochemické, mikrobiologické techniky a techniky rekombinantní dna. Takovéto techniky jsou důkladně vysvětleny v literatuře. Viz například Molecular Cloníng: A Laboratory Manual Sambrook et al. (1989); Current Protocols in Molecular Biology sv. i-m Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Joh wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal A Practical Guide to Molecula Cloníng, John Wiley Sons, New York (1988); Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, New York; Birren et al. (ed.) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, sv. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologie jak jsou načrtnuty v U.S. patentech čís. 4 666 828; 4 683 202; 4 801 531; 5 192 659; a 5 272 057; Cell Biology: A Laboratory Handbook, sv. Ι-m Cellis, J. E., ed., (1994); Current Protocols in Immunology, sv. I-III, Coligan J. E. ed. (1994); Stí tes et al (ed.) Basic and Clinical Immunology (8. vydání), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (ed.), Selected Methods in cellular immunology, w. H. Freeman and Co., New York (1980); dostupné imunotesty jsou rozsáhle popsány v patentové a vědecké literatuře, viz například U.S. patenty čís. 3 791 932; 3 839 153; 3 850 752; 3 850 578; 3 853 987; 3 867 517; 3 879 262; 3 901 654;
935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; 4 098 876;
879 219; 5 011 771 a 5 281 521; Oligonucleotide Synthesis
Gait, M. J. ed. (1984); Nucleic Acid Hybridi žati on Hames, B. D., a Higgins S. J., ed. (1985); Transcription and
Translation Hames, B. D., a Higgins S. J., ed. (1984);
Animal Cell Culture Freshney, R. I., ed., (1986);
immobilized Cells and Enzymes IRL Press, (1986); A
Practical Guide to Molecular Cloning Perbal B., (1984) a
Methods in Enzymology, sv. 1-317, Academie Press; PCR • 4 · ··· · · · • · · · · · · · · ·
O o · · · ······· — Δ3 — · ·· ·· ·· ··
Protocols: A Guide to Methods and Applications Academie Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al. , Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual CSHL Press (1996); z nichž všechny jsou zde zahrnuty odkazem jako by byly plně zde načrtnuty. Další obecné odkazy jsou poskytovány v celém tomto dokumentu. Postupy v nich jsou považovány za dobře známé v oboru a jsou poskytovány pro pohodlí čtenáře. Veškeré informace tam obsažené jsou zde zahrnuty odkazem.
Příklad 1 vektory exprese a virové částice lak je zde popsáno shora, provedení vynálezu využívají transformované vaskulární buňky exprimující VEGF a Ang-1 pro indukci angiogensy v ischemické, poraněné nebo okludované tkáni. Příklady, jež následují, dávají popisují metody sbírání, kondicionování a transformace vaskulárních buněk a metody použití takovýchto buněk při podpoře angiogenesy.
Materiály a metody:
Příprava retrovi rových vektorů exprimujících VEGF165-GFP geny:
Obrázek 1 ilustruje konstrukt vektoru exprese VEGF-GFP podle znalostí tohoto vynálezu. Rekombinantní retrovirové vektory exprimující VEGF165 (přístupové číslo GenBank AB021221) nebo EGFP (Clontech, ca, USA) geny byly konstruovány separátním klonováním dvou různých vektorů do plasmidu LXSN (Clontech, Ca, USA). Pro konstrukci na LXSN založeného retrovirového vektoru exprimujícího samotný GFP byl 1400 bp EcoRl-Hpal fragment obsahující vnitřní místo vstupu ribosomu (IRES) a gen GFP vložen do specifických restrikčních míst mnohočetného klonovacího místa (MCS) plasmidu LXSN. Pro konstrukci LXSN-VEGF-IRES-GFP dvoucistronového plasmidu (Obrázek 1), jenž koexprimuje geny vegf165 a GFP, byly do ecori místa LXSN MCS zaligovány 2,0 kb EcoRI-MunI fragment kódující VEGF165 (600 bp) a IRES a EGFP sekvence. Exprese transgénů • »· · « 4 · « · • » · · · ·
- 24 • · • 4 ·
těmito LXSN vektory je regulována dlouhým koncovým opakováním (LTR) MoMULV (clontech, ca, USA). Pro vytvoření retrovirového vektoru bylo 10 pg lxsn-gfp nebo lxsn-vegf-gfp plasmidové dna transfekováno do 293E3 ekotropních balících buněk a inkubováno 48 hodin, po čemž byl odebrán supernatant z konfluentních kultur G418 (Gibco BRL, USA) resistentních produkčních buněk, zfiltrován (0,45 pm) a přidán k PA317 amfotropním balícím buňkám. Transdukované buňky byly vystaveny G418 selekci a supernatant kultury byl po dalších 48 hodinách kultivace sebrán a použit k infekci teflyga amfotropních balících buněk, jež unikátně exprimují GALV obálku pro vysokou transdukční účinnost EC a resistenci k inaktivaci lidským sérem. Po G418 selekci transdukovaných TEFLYGA buněk byly odebrány jednotlivé kolonie a analyzovány na expresi GFP a VEGF165. Byly stanoveny titry každé kolonie pomocí transdukce buněk TE617 a získány titry v rozsahu od 105 do 106 pfu/ml. Byly sebrány supernatanty kolonií produkujících nejvyšší titry a skladovány při -80 °C.
Shora popsané kroky byly aplikovány na konstrukci Ang-1 konstruktu vektoru exprese LXSN-Angl-IRES-EGFP (obrázek 2), jak je popsáno v Příkladu 6.
Příprava linií balících buněk:
Linie balících buněk byly připraveny podle známých postupů. Podrobný popis linií balících buněk lze najít v následujících odkazech: incorporation of fowl plague viru hemagglutinin into murine leukemia virus partie!es and analysis of the infectivity of the pseudotyped retroviruses. T. Hatziioannou, S. Valsesia-wittmann, S. J. Russel a F.-L. Cosset. 1998. Journal of Virology, 72: 5313-5317. Inverse targeting of retroviral vectors: selective gene transfer in a mixed population of hematopoietic an non-hematopoietic cells. A. K. Fielding, M. Maurice, F. J. Morling, F.-L. Cosset a S. J. Russel. 1998. Blood, 91: 1802-1809. The fusogenic Gibbon ape leukemia virus envelope glycoprotein: targeting of a cytotoxic gene by ligand display. Fileding AK, chapelFernandes S., Chadwick MP, Bullough FJ, Cosset F-L, a Russel SJ. Human Gene Therapy, 2000; 11; 817-826.
♦ 0 *·· ·
- 25 • · · ·· · • · · · · · 9
9 9 9 9 99
Příprava transformovaných buněk:
Sklízení autologních endothelových buněk:
EC jsou sklízeny z 5 cm dlouhých segmentů lidských povrchových žil z noh. Buňky jsou sklízeny zpracováním kolagenasou jak bylo dříve popsáno [27]. K zajištění stability buněčných charakteristik byly sbírány buňky z pasáží 3-9. Identita buněk je testována imunohistochemií na von Willebrandův faktor.
Sklízení autologních buněk hladkého svalu:
Buňky hladkého svalu byly kultivovány z explantátů výrůstků lidských povrchových žil z noh (HSVSMC). Buňky byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglesově médiu (DMEM) (Biological Industries, Izrael) doplněném s 10 % spojeného lidského séra (Beit Haemek, Izrael). Buňky hladkého svalu byly identifikovány s použitím protilátek proti svalovému aktinu (zymed, USA).
Infekce progenitorových buněk kostní dřeně vektorem kódujícím VEGF:
Progenitorové buňky kostní dřeně jsou infikovány rekombinantními adenovirovými vektory kódujícími vegf-gfp. Diferenciace v infikovaných buňkách je testována s použitím morfologie a imunohistochemie na von willebrandův faktor. K dalším podrobnostem sběru buněk a in vitro diferenciace spojené s neovaskularizací viz Asahara T. ef al. , EMBO J 1999; 18: 3964-72, a Huang XL, Takakura N, Suda T. Biochem Biophys Res Commun 1999, 264: 133.
Transdukce lidských a ovčích EC buněk žíly z nohy retrovirovými vektory:
EC byly naočkovány (105 buněk/35 mm misku) na misky pokryté fibronektinem (Sigma, USA) a rozrůstány v M199 (GibcoBRL, USA) obsahujícím 20 % fetálního séra. Po 24 hodinách byly buňky vystaveny kationickému polymeru DEAE-dextranu (0,1 pg/ml) po jednu hodinu před transdukcí, promyty třikrát PBS a pak transdukovány vektorem rekombinantního viru • · • · · · • · • · · ·
- 26 s vysokým ti trém, kódujícím VEGF-LacZ nebo VEGF-GFP geny. Po inkubaci 4 hodiny při 37 °C bylo médium obsahující virus nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím 20 % spojeného lidského séra. Obrázky 3a-b ilustrují transgenní expresi z VEGF-LacZ nebo VEGF-GFP konstruktů, jak je indikována Lacz aktivitou respektive GFP fluorescencí.
Regulace genové exprese po podání:
K regulaci genové exprese VEGF a Ang-1 v EC nebo SMC je používán systém exprese regulovatelný efektorem. Například: VEGF exprese je regulována směrem dolů pomocí tetracyklinu, zatímco exprese Ang-1 je přitom regulována směrem nahoru. Tyto systémy přimějí podané buňky exprimovat VEGF v prvním týdnu, když je zapotřebí proliferace, zatímco in vivo podání tetracyklinu 12 hodin až 2 týdny po in vivo implantaci buněk reguluje VEGF expresi směrem dolů a expresi Ang-1 směrem nahoru, k podpoře maturace buněk (Agha-Mohammadi S, Lotze MT. Regulatable Systems: applications in gene therapy an replicating viruses. 3 Clinical Investigations 2000;105;1177).
Příklad 2
Analýza transformovaných buněk
Analýza exprese rekombinantních bílkovin:
Hladiny VEGF a Ang-1 jsou měřeny v supernatantu sebraném z kultur geneticky modifikovaných buněk. K měření produkce VEGF nebo Ang-1 se používaly analýzy ELISA a western blot v 24-hodinových periodách. Po reinfuzi transformovaných buněk in vivo dárci, odebírá se krev a provádí ELISA analýza hladin VEGF a Ang-1.
Příklad 3
Pokusy na zvířatech
Pokusy na zvířatech in vivo\
Pro sklizeň endothelových buněk se použil krátký segment žíly experimentálního zvířete (odvozený ze zadní končetiny králíka nebo ovce). Alternativním zdrojem EC je kostní dřeň získaná odsátím nebo cirkulující progenitorové buňky endothelových buněk. Sklizené buňky se nechají růst v přítomnosti VEGF ke zvýšení diferenciace nebo proliferace. Buňky jsou v laboratoři expandovány a geneticky modifikovány pseudotypovanými retrovirovými vektory kódujícími VEGF a Ang-1.
Povrchová stehenní tepna obou zadních končetin experimentálního zvířete se podváže bezprostředně po rozvětvení hluboké stehenní tepny. Průtok krve se měří na obou stranách podvázání s použitím Dopplerova průtokoměru (Transonic Animal Research Flowmeter, NY, USA), po měřeních průtoku je populace homologních nebo heterologních vaskulárních buněk exprimujících s různými hladinami exprese VEGF a Ang-1 injikována do jedné končetiny, zatímco populace kontrolních buněk exprimujících markerový polypeptid nebo PBS je injikována do druhé končetiny. Injekce se provede proximálně k hluboké stehenní tepně. Průtok se měří na obou končetinách 3, 7, 14 a 30 dnů po podání buněk. Zvýšený průtok ve společné stehenní tepně indikuje výskyt angiogenesy.
Hodnocení morfologických změn:
Po in vivo experimenteech se ke zjištění tvorby nových krevních cév použijí počítačové analýzy digitalizovaných angiografických obrazů získaných s použitím kontrastních médií. Mikroskopické řezy relevantní tkáně se studují co do přítomnosti implantovaných buněk, jež jsou identifikovány pomocí markerových polypeptidů (např. GFP). Typ a maturační stádium nově vytvořených cév je hodnocen podle morfologie takovýchto cév (přítomnosti buněčných typů, počtu elastických membrán, atd.) • · • · · · • · · ·
- 28 Příklad 4
Léčebné přístupy
Materiály a metody:
K léčbě okludované krevní cévy lze použít třech přístupů (Obrázek 4a). Obrázek 4b předvádí bypass operaci podle dřívějších znalostí, k léčbě jednotlivé okludované cévy. Obrázek 4c představuje léčebnou alternativu k obejití nebo proniknutí okludované cévy s použitím znalostí tohoto vynálezu.
Obrázek 4c předvádí angiogenesu v okludované tkáni jako výsledek podání vaskulárních buněk exprimujících přinejmenším jeden angiogenní proliferační faktor a přinejmenším jeden angiogenní maturační faktor do okludované cévy nebo kolem ní, jak je označeno 10, nebo tvorbu obchvatu kolem okluse, jak je označeno 20.
Jak je konkrétně označeno 30, angiognesa podle znalostí tohoto vynálezu může rovněž vést k tvorbě cévního můstku,jenž spojuje okludovanou cévu s neokludovanou cévou tak, že účinně přivádí a znovu ustavuje tok krve k cílové tkáni zásobované okludovanou krevní cévou.
V každém případě kterýkoli z alternativních způsobů může být použit k nápravě dodávky krve k oblasti tkáně vyživované okludovanou nebo poraněnou cévou. Navíc lze způsoby podle vynálezu používat rovněž k nápravě dodávky krve dokonce i v případech krevních cév, jež byly dříve léčeny bypass operací nebo angioplastikou.
Příklad 5
In vivo angiogenesa indukovaná EC geneticky modifikovanými k nadprodukci vegf
Způsob podle vynálezu je určen k léčbě oklusivních vaskulárních onemocnění podáváním EC geneticky modifikovaných k indukci optimální neovaskulogenesy. Náprava průtoku krve • · · · • · · · • v • · · ·
k okludované cévě aplikací způsobu podle vynálezu byla tedy prováděna jak následuje.
Samci nebo samice potkanů sprague-Dolly vážící 400 450 g byli anestetizováni s použitím ketaminu a xylazinu. Stehenní tepny těchto potkanů byly chirurgicky podvázány distál ně k velké perforační tepně. Potkani pak byli inji kováni rekombinantním adenovi rovým vektorem kódujícím VEGF165 (109 pfu), rekombinantním adenovirovým vektorem kódujícím GFP (109 pfu), nebo normálním solným roztokem. Injekce byly dávány přímo do bočního větvení stehenní tepny proximálně k podvázanému segmentu (Obrázek 5a). průtok měřený u potkanů léčených rekombinantním adenovirovým vektorem kódujícím VEGF byl signifikantně vyšší než průtok měřený u potkanů injikovaných rekombinantním adenovirovým vektorem kódujícím GFP nebo solným roztokem (viz Obrázek 5b). Lokalizovaná exprese VEGF po injekci byla potvrzena RT-PCR svalové tkáně a měřením hladin VEGF v krevní plasmě pomocí elisa (data nejsou předvedena).
Tyto výsledky tedy ukazují účinnost způsobu podle vynálezu při léčbě oklusivních vaskulárních onemocnění indukcí neovaskularizace okludované krevní cévy EC buňkami geneticky modifikovanými k nadprodukci pro-angiogenních faktorů. Geneticky modifikované buňky podle vynálezu lze podávat rovněž do ischemického orgánu, čímž se lze vyhnout potřebě potenciálně riskantního injikování virových vektorů do krevního řečiště, při obohacení daného ischemického orgánu životaschopnými a aktivovanými vaskulárními buňkami [40].
Příklad 6
Exprese angiogenního diferenciačního faktoru Ang-1 v EC a SMC geneticky modifikovaných virovými vektory
Ideálně je léčba vaskulární onemocnění takového rázu, že oklusivní vaskulární onemocnění jsou ovlivněny tvorbou nových krevních cév, jež obejdou nebo zvolní vaskulární nedostatečnost. Indukce neovaskularizačnich procesů in vivo za použití předchozích technik však zůstává nenaplněným přáním.
- 30 • ·
Způsob podle vynálezu je navržen tak, neovaskulari zaci prostředni ctvím pro-angiogenních stimulů používaných v průběhu přirozeného pro-angiogenní stimulace že indukuje takovouto spřežení vícero vaskulárními buňkami růstu krevních cév. Takováto se projevuje u pro-angiogenního diferenciačního faktoru Ang-1 a EC růstového faktoru VEGF. vaskulární buňky exprimující takovéto faktory tedy představují ideální terapeutickou možnost, protože budou indukovat jak diferenciaci vaskulárních tkání z prekursoru, tak následný růst, čímž umožní potřebnou terapeutickou tvorbu cév.
K ovlivnění exprese pro-angiogenních faktorů ve vaskulárních buňkách pro léčbu vaskulárních onemocnění oklusivní povahy byly proto zkonstruovány virové vektory k expresi Ang-1 a VEGF a exprimovány v EC a SMC jak následuje.
Matriály a metody:
Klonování Ang-1 cdna z lidských SMC:
Lidská Ang-1 cDNA (nukleotidové koordináty 310 - 1806 v Genbank přístupovém čísle U83508) byla reversně transkribována s použitím reversní transkriptasy (RT) (Promega, USA) z celkové RNA extrahované z SMC lidské povrchové žíly. ve stručnosti: 2 pg RNA byly smíchány s 500 ng náhodných hexamerů, směs byla zahřívána na 70 °C po 10 minut a ochlazena na ledu. K této předehřáté RNA byla přidána reakční směs obsahující 0,5 mM dNTPs, 5 jednotek AMV-RT, 5 mM DTT, 32 jednotek RNAsa outu (Gibco-BRL, USA) a lx Promega RT pufr. výsledná směs byla inkubována při 38 °C po 2 hodiny s následnou inkubací 15 minut při 95 C.
Produkt cDNA z předešlého kroku byl PCR-amplifikován za použití systému Expand High Fiděli ty PCR System (Roche, Švýcarsko). K amplifikaci byly použity následující primery:
5'-AGATCTTCAAAAATCTAAAGGTCGAAT-3' (SEKV. ID. Č. 1) a 51-agatctgctggcagtacaatgacagtt-3' (sekv. id. č. 2) (podtržené sekvence představují restrikční místa Bglil použitá ke klonování. PCR byla prováděna v objemu 20 pl obsahujících 7 pl RT reakční směsi templátu produktu cdna, 20 pmol každého primeru, 5 nmol dNTPs, 1 j. Ex-Taq DNA polymerasy (Takara,
Japonsko) a PCR reakční pufr poskytnutý výrobcem. PCR reakce byla prováděna jak následuje: 94 °C/2' v lOx: [94 °C/30 v 50 °C/30 V 72 °C/1’] V 24x: [94 °C/30 V 56 °C/30 V 72 °C/ (60 + 5/cyklus)] V 72 °C/10'. Úsek 1500 bp lidské Ang-1 cDNA (nukleotidové koordináty 310 - 1806 v Genbank přístupovém čísle U83508) byl subklonován do pGEMT-easy vektoru (Promega). Obě vlákna PCR produktu byly sekvenovány a shledány ze 100 % identické s publikovanou sekvencí.
Vytvoření rekombinantních virových vektorů:
Vytvoření rekombinantích adenovirových vektorů kódujících Ang-1 gen:
Rekombinantní adenovirový vektor k expresi lidského Ang-1 genu byl zkonstruován v několika krocích, sestávajících z rutinního prokaryotického klonování a postupu homologní rekombinace v buněčné linii 293. Fragment velikosti 1500 bp obsahující cDNA lidského Ang-1 byl vložen do pCA3 plasmidu pod kontrolu konstitutivního CMV okamžitého ranného promotoru. Výsledný plasmid byl kotransformován s plasmidem pJMl7 do buněk 293, které konstitutivně exprimují adenovirový gen El. Plasmid pJMl7 obsahuje adenovirový genom, s vyloučením E3 oblasti, a se zahrnutím insertu pBRX do El oblasti viru. Homologní rekombinace mezi pCA3 kódujícím Ang-1 a pJMl7 nahradila po transfekci El oblast pJMl7 kasetou exprese CMV-Ang-1 z pCA3. Tvorba plaků nastávala 2 až 4 týdny po kotransfekci, po čemž byly isolovány jednotlivé plaky a jejich virové extrakty byly amplifikovány pomocí infekce buněk 293. Byl stanoven titr každého virového vzorku pomocí plakového testu v buňkách 293 a získány byly virové titry ~ 1011 pfu/ml.
Exprese bílkoviny Ang-1 byla potvrzena v růstovém médiu transformovaných buněk pomocí analýzy Western blot.
Vytvoření rekombinantích adenovirových vektorů kódujících jak Ang-1 gen, tak GFP:
Rekombinantní adenovirový vektor rAdAngl-GFP kódující lidský gen Ang-1 a gen GFP byl zkonstruován s použitím upraveného protokolu AdEasy (He tc et al., Proč Nati Acad Sci
- 32 USA 1998, 95:2509). Ve stručnosti: 1500 bp Bglll fragment lidské Ang-1 cDNA byl vložen do Bglll místa přehazovacího vektoru pAdTrack-CMV k expresi pod kontrolou CMV promotoru. Tento přehazovací vektor kóduje GFP gen níž po proudu transgenu pod kontrolou druhého CMV promotoru. Ang-l-GFP kódující přehazovací vektor byl linearizován digescí Pmel vyčištěn soupravou Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Německo). Kompetentní buňky BJ5183 byly kotransformovány elektroporací linearizovaným přehazovacím vektorem kódujícím Ang-1 a GFP a adenovirovým vektorem pAdEasy-1. Transformanty, které exprimovaly rekombinantní adenovirový vektor kódující geny Ang-1 a GFP byly identifikovány PCR analýzou a restrikčním mapováním. Rekombinantní adenovirový plasmidový vektor byl linearizován Paci digescí, purifikován a transfekován do buněk 293 s použitím Lipofectamine 2000 (Gibco BRL, USA). Sedm dnů po transfekci nastal cytopatický efekt; v tomto bodu 100 % buněk exprimovalo GFP. Buňky byly sklizeny a byly připraveny virové extrakty; produkce viru byla dále amplifi kována infekcí buněk 293 virovými extrakty. Titry zásobního roztoku viru byly stanoveny testem seriál ního ředění v buňkách 293 a byly získány titry ~ 1011 pfu/ml. Transgenní exprese byla potvrzena western blot analýzou média kondicionovaného infikovanými buňkami.
Klonování Ang-1 genu do retrovirového vektoru exprese:
Rekombinantní retrovirový vektor pLXSN-Ang-1 exprimující lidský Ang-1 gen pod regulační kontrolou 5' dlouhého koncového opakování (LTR) Mo-MULV byl zkonstruován klonováním 1500 bp Bglll fragmentu lidské Ang-1 cDNA do BamHl místa retrovirového plasmidového vektrou pLXSN (čís. K1060-B, Clontech, USA).
Rekombinantní dvoucistronový retrovirový vektor kódující lidské geny Ang-1 a EGFP pod regulační kontrolou 5' dlouhého koncového opakování (LTR) Mo-MULV byl zkonstruován klonováním těchto genů do retrovirového plasmidového vektrou pLXSN postupem dvou kroků, jak následuje. V prvním kroku byl EcoRlHpal 1400 bp fragment s vnitřním místem vstupu ribosomu (IRES)-EGFP vyňatý z plRES2-EGFP (čís. 6029-1 clontech) vložen do EcoRI-Hpal míst pLXSN ke konstrukci kontrolního plasmidu • · · ·
- 33 • · * · · ·
• -» · • · · · ·· «· pLXSN-lRES-EGFP. v druhém kroku byl zkonstruován pLXSN-lRESAng-l-EGFP klonováním 1361 bp EcoRl fragmentu lidského Ang-1 do ECORI pLXSN-IRES-EGFP.
Vytvoření pseudotypových retrovirů k expresi lidského Ang-1 genu:
K produkci retrovirového vektoru bylo 10 pg pLXSN-lRESegfp, pLXSN-lRES-Ang-1-EGFP nebo pLXSN-Ang-1 retrovirového vektorového plasmidu transfekováno do balících buněk 293FLYA s použitím Lipofectamine 2000 (Gibco BRL, USA). Po 48 hodinách byl sebrán supernatant z konfluentních kultur buněk producenta viru, zfiltrován 0,45 pm a přidán do 293FLY10A nebo 293FLYGALV amfotropních balících buněk. Transdukované buňky byly podrobeny selekci G418, jednotlivé kolonie byly sebrány a hodnoceny na EGFP expresi fluorescenční mikroskopií a Ang-1 exprese byla potvrzena analýzou Western blot vzorků média kondicionovaného transdukovanými buňkami. Titry viru, stanovené transdukcí buněk TE671, byly v rozsahu od 10s do 106 pfu/ml. Supernatant kolonií s nejvyššími titry virů byl sebrán a zamražen na -80 °C.
Potvrzení transgenní exprese po genovém přenosu:
Buněčné kultury:
EC lidské povrchové žíly (HSVEC) byly isolovány a kultivovány na miskách pokrytých želatinou v úplném médiu M199 (Gibco-BRL, USA) doplněném 20 % spojeného lidského séra, 2 mM L-glutaminem (Biological Industries, Izrael), 100 jednotek/ml penicilinu, 0,1 mg/ml streptomycinu (Biological Industries, Izrael), 100 pg/ml heparinu (Sigma, USA) a 2 ng/ml bFGF (laskavě poskytnutého profesorem Neufeldem, The Technicon Institute, Haifa, Izrael). Lidské EC byly identifikovány imunohistochemckými analýzami s protilátkami proti von Willebrandovu faktoru (zymed, USA). Buňky hladkého svalu byly kultivovány z SMC explantátů výrůstků lidských povrchových žil z noh (HSVSMC) a z SMC lidské levé interní mamární arterie (HLSMC). Buňky byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglesově médiu (DMEM) (Gibco-BRL, USA) doplněném s 10 % • · · · • · · ·
- 34 lidského séra, 2 mM L-glutaminem, 100 jednotek/ml penicilinu, 0,1 mg/ml streptomycinu a 2 ng/ml bFGF. Buňky hladkého svalu byly identifikovány imunohistochemckými analýzami s použitím protilátek proti α-aktinu hladkého svalu (Zymed, USA).
Linie balících buněk 293FLYA, 293FLY10A, 293FLYGALV a TEFLYGA (získané od Dr. F. L. Cosseta, Lyon, Francie) byly rozrůstány v DMEM doplněném 10 % FCS 2 mM L-glutaminem (Biological Industries, Izrael), 100 jednotek/ml penicilinu, 0,1 mg/ml streptomycinu, 6 pg/ml blasticidinu (Sigma, USA) a 6 pg/ml phleomicinu (sigma, USA).
Linie balících buněk PA317, 293E3 (získané od Dr. J.
Exelroda, Jerusalem) byly rozrůstány v DMEM doplněném 10 % FCS 2 mM L-glutaminem, 100 jednotek/ml penicilinu, 0,1 mg/ml streptomycinu.
infekce EC a SMC rekombinantními adenovirovými vektory:
Endothelové buňky a SMC byly infikovány rekombinantními adenovirovými vektory jak následuje. Ve stručnosti, buňky byly při ~ 70 % konfluence naočkovány na misky předem potažené fibrinonektinem (4,5 pg/ml) 20 hodin před infekcí a kultivovány v kompletním médiu, v den infekce bylo médium nahrazeno čerstvým M199 (bezsérovým) médiem a buňky byly infikovány rekombinantním virem při 3000 virových částic/buňku. Buňky byly inkubovány po 90 minut s jemným nakláněním každých 20 minut, po čemž bylo médium obsahující virus nahrazeno kompletním médiem (M20). Podíl infekce byl stanoven vizualizací exprese GFP s použitím inversního fluorescenčního mikroskopu (TE200 Nikon, Japonsko) vybaveného GFP fluorescenčním filtrem (GFP-LP, Nikon).
Transdukce EC a SMC rekombinantními adenovirovými vektory:
Transdukce EC a SMC rekombinantními adenovirovými vektory byla provedena jak následuje, ve stručnosti: Endothelové buňky (pasáž 4-9) byly naočkovány při 105 buněk/35 mm jamku na destičky potažené fibrinonektinem (4,5 pg/ml) a rozrůstány v kompletním médiu po 24 hodin. Jednu hodinu před transdukcí bylo kultivační médium nahrazeno bezsérovým M199 médiem • · · ·
- 35 obsahujícím 0,1 mg/ml DEAE-dextranu. Buňky byly promyty třikrát PBS a transdukce byla provedena inkubací buněk po 4 hodiny s čerstvě sebraným a zfiltrovaným (0,45 pm) supernatantem z kultur balících buněk produkujících virus. Na konci inkubace bylo médium nahrazeno čerstvým M20 médiem.
Nadprodukce Ang-1 infikovanými EC a SMC:
RT-PCR analýza transkripce Ang-1 mRNA:
K detekci transkripce Ang-1 genu byla z trnasdukovaných hsvec a hsvsmc pomocí soupravy PURESCRIPT rna isolation Kit (Gentra systems, USA) isolována celková RNA. K syntéze cDNA, 1 pg RNA byl smíchán s 500 ng náhodných hexamerů, zahříván na 70 °C po 10 minut a pak směs byla ochlazena na ledu. Reakční směs obsahující 0,4 mM dNTPs, 5 jednotek AMV-RT (Promega, USA), 5 mM DTT, 32 jednotek RNAsa outu (Gibco-BRL, USA) a lx RT pufr (Promega, USA) byla přidána k předehřáté směsi RNAhexamery. Reversní transkripce byla prováděna inkubací rekční směsi při 38 °C po 2 hodiny s následnou inkubací 15 minut při 95 °C. Pro analýzy Ang-1 mRNA exprese v HSVEC, PCR analýza cDNA byla provedena v objemu 20 pl s použitím 7 pl reversně transkribovaného cDNA produktu, 20 pmol sense primeru (5'-GCTGGCAGTACAATGACAGTT-3', SEKV. ID. č. 3) a 20 pmol anti-sense primeru (5'-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAY-3', SEKV. ID. Č. 4), 5 nmol dNTPs, 1 j. Ex-Taq DNA polymerasy (Takara, Japonsko) a PCR reakčního pufru poskytnutého výrobcem. PCR reakce byla prováděna následující sérií inkubací: 94 °C/2' V lOx: [94 °C/30 V 50 °C/30” V 72 °C/1'] V 24x: [94 °C/30 V 56 °C/30 V 72 °C/ (60 + 5/cyklus)j V 72 °C/10'. Pro analýzy Ang-1 mRNA exprese v HSVSMC, PCR analýza cDNA byla provedena v objemu 20 pl s použitím 7 pl reversně transkribovaného cDNA produktu, 10 pmol sense a anti-sense primerů (5'-gctggcagtacaatgacagtt-3', sekv. id. č. 5. resp. 5'-TCAAAAATCTAAAGGTCGAAY-3', SEKV. ID. č. 6), 5 nmol dNTPs, 1 j. Ex-Taq DNA polymerasy (Takara, Japonsko) a PCR reakčního pufru poskytnutého výrobcem. PCR reakce byla prováděna následující sérií inkubací: 94 °C/2' v lOx: [94 °c/30 v °C/30 V 72 °C/1'] V 21x: [94 °C/30 V 60 °C/30 V 72 °C/
- 36 (60 + 5/cyklus)] v 72 °C/10'. Produkty PCR byly separovány elektroforesou v 0,8 % agarosy, označeny EtBr a vizualizovány UV fluorescencí.
Analýza western blot:
Detekce exprese bílkovin Ang-1 nebo VEGF165 adenovi rově nebo retrovirově infikovaných EC nebo SMC byla prováděna Western blot analýzou buňkami kondicionovaného média 24 hodin po infekci, jak následuje. Ve stručnosti: Virus obsahující kultivační médium bylo nahrazeno bezsérovým médiem a buňky byly ponechány růst dalších 24 hodin. Secernované proteiny v 30 pl vzorcích buňkami kondicionovaného média byly rozdělány pomocí PAGE v 10 % SDS-polyakrylamidovém gelu za redukujících podmínek a elektro-přesáty na nitrocelulosovou membránu (Schleicher & Schuell, Německo). Mebrány s přenesenou bílkovinou byly blokovány inkubací v TBS obsahujícím 0,1 % netučného mléka a 0,3 % Tween-20 (TBST) za pokojové teploty po 1 hodinu s jemným promícháváním, po čemž byly inkubovány po 2 hodiny s 1:500 ředěním polyklonální ovčí anti-Ang-1 protilátky (č. sc-6319 Santa-Cruz, USA) nebo s 1:700 ředěním polyklonální králičí anti-VEGF165 protilátky (č. SC 152 Santa Cruz, USA) v blokovacím roztoku. Primární protilátkou značené bílkoviny na membráně byly promyty třikrát TBST a inkubovány za pokojové teploty po 1 hodinu s peroxidasou-konjugovanou anti-králičí nebo anti-ovčí sekundární protilátkou (Sigma, USA) ředěnou TBST podle údajů výrobce. Po třech promytích TBST byly značené bílkoviny vizualizovány reakcí s ECL reagenty (Sigma, USA) a exponovány na rentgenový film.
výsledky:
virové konstrukty:
Adenovirové a retrovirově vektory zkonstruované a použité k infekci EC a SMC buněk Ang-1 jsou seřazeny v Tabulce 1.
- 37 «*· · · » » «··· • * * ·· · * «· ··
Tabulka 1
vi rový systém Kódovaný gen/geny Označení viru
adenovi rus GFP rAdGFP
adenoví rus Ang-1 rAdAngl
adenovi rus Ang-1, GFP rAdAngl-GFP
adenovi rus VEGF165, GFP rAdVEGF-GFP
pseudotypový retrovi rus GFP retroGFP
pseudotypový retrovi rus Ang-1 retroAngl
pseudotypový retrovi rus Ang-1, GFP retroAngl-GFP
pseudotypový retrovi rus VEGF165, GFP retroVEGF-GFP
Adenovirově infikované nebo retrovirově transdukované EC a SMC exprimují Ang-l-GFP transgen:
U endothelových buněk nebo SMC infikovaných rAdAngl-GFP byla nalezena vysoká exprese GFP (obrázky 6b resp. 6d). Podobně u EC a SMC retrovirově transdukovaných retroAngl-GFP byla rovněž nalezena vysoká exprese GFP (Obrázky 7b resp. 7d). Exprese GFP byla vizualizována fluorescenční mikroskopií.
U endothelových buněk a SMC byla nalezena transkripce Ang-1 mRNA po adenovirově infekci rAdAngl-GFP (Obrázky 8a resp. 8b). Podobně u EC a SMC retrovirově transdukovaných retroAngl-GFP byla rovněž nalezena exprese Ang-1 mRNA 48 hodin po transdukci (Obrázky 9a resp. 9b).
U endothelových buněk nebo SMC byla nalezena nadprodukce bílkoviny Ang-1 24 hodin po adenovirově infekci rAdAhgl nebo retrovirově transdukci retroAngl (Obrázky 10 resp. 11).
Tyto výsledky proto prokazují, že adenovirově a retrovirově vektory podle vynálezu jsou kompetentní ke genetické modifikaci primárních lidských EC a SMC a k poskytnutí exprese Ang-1 a GFP transgenů. Tyto konstrukty tudíž mohou být použity ke genetické modifikaci lidských vaskulárních buněk k nadprodukci vaskulárního maturačního faktoru Ang-1 a mohou tedy být účinně aplikovány na léčbu vaskulárních onemocnění zaměřenou na indukci tvorby nových
-38- ··· · · · · « krevních cév schopných obejít nebo proniknout okludovanou, poraněnou nebo ischemickou savčí tkáň.
Příklad 7
Funkční koexprese Ang-1 a VEGF ve vaskulárních buňkách
K léčbě vaskulárních onemocnění způsob podle vynálezu používá podávání vaskulárních buněk koexprimujících angiogenní faktory Ang-1 a VEGF. Aby však tato terapeutická možnost byla účinná, nadprodukce kterékoli z těchto bílkovin nesmí interferovat ani s expresí, ani s funkcí druhé bílkoviny.
Schopnost těchto bílkovin být funkčně nadprodukovány je tedy prokazována, jak následuje.
Výsledky:
Udržení nadprodukce bílkovin Ang-1 a VEGF ve společných kulturách adenovirově infikovaných EC nadprodukujících Ang-1 a adenovirově infikovaných EC nebo SMC nadprodukujících VEGF:
Způsob podle vynálezu používá nadprodukci vaskulárního maturačního faktoru Ang-1 a angiogenního faktoru VEGF v geneticky modifikovaných buňkách, jako jsou EC a SMC, k optimalizaci diferenciace a růstu takovýchto buněk tak, že zprostředkovávají optimální léčebný účinek při použití takovýchto buněk k léčbě vaskulárních onemocnění. Aby však takováto léčebná strategie byla optimálně účinná, schopnost EC nadprodukovat Ang-1 a schopnost EC nebo SMC nadprodukovat VEGF musí být zajištěny tak, že nadprodukce každého transgenu se udrží při nadprodukci druhého transgenu. Udržení nadprodukci obou bílkovin, Ang-1 a VEGF, ve společných kulturách rAdVEGF infikovaných EC a rAdAngl infikovaných EC byla prokázána analýzou Western blot (Obrázky 12a resp. 12b). Podobně doprovodná nadprodukce obou bílkovin, Ang-1 a VEGF, ve společných kulturách rAdVEGF infikovaných SMC a rAdAngl infikovaných EC byla rovněž prokázána analýzou western blot (Obrázky 13a resp. 13b).
Nadprodukce Ang-1 neinhibuje proliferaci EC:
Materiály a metody:
Test proliferace:
Dvacet čtyři hodin před adenovirovou infekcí byly EC (pasáže 5 - 11) naočkovány při 104 buněk/jamku (~ 30 % konfluence) na 24-jamkové destičky předem pokryté fibronektinem (4,5 mg/ml). Buňky byly infikovány rAdAngl-GFP nebo rAdGFP a inkubovány při 37 °C po 90 minut, po čemž bylo přidáno médium doplněné sérem. Po 16 - 18 hodinách bylo médium nahrazeno M199 doplněným 2 % lidského séra a 2 ng/ml bFGF. Testy proliferace byly provedeny v triplikáctech a proliferace byla stanovena pomocí χττ kolorimetrického testu ve dnech 3, 5 a 7 po infekci.
Způsob podle vynálezu zahrnuje léčebné možnosti k terapii vaskulárních onemocnění v nichž jsou Ang-1 a VRGF společně nadprodukovány vaskulárními buňkami, jako jsou EC, ve stejném prostředí. Protože však proliferativní účinek VEGF na EC je s výhodou zapotřebí k optimálnímu účinku, zkoušena byla nepřítomnost inhibičního účinku nadprodukce Ang-1 na proliferaci rAdAngl-GFP infikovaných EC. Pro nadprodukci Ang-1 v EC bylo nalezeno, že nemá ani inhibiční, ani stimulační účinek na rychlost buněčné proliferace s proliferační rychlostí buněk infikovaných 14). Jak se očekávalo, proliferace positivní infikovaných k nadprodukci VEGF, byla zvýšena.
Tyto výsledky tedy dokládají, že koexprese VEGF a Ang-1 podle znalostí tohoto vynálezu vede k funkční expresi obou těchto bílkovin. Způsob podle vynálezu, zahrnující splečnou nadprodukci obou těchto bílkovin v geneticky modifikovaných vaskulárních buňkách může tudíž být účinně použit k léčbě vaskulárních onemocnění vyžadujících neovaskularizaci.
pri srovnám rAdGFP (obrázek kontroly, buněk
- 40 « · · · » ·» · • · ·· · · · ·
Příklad 8
Biologická aktivita nadprodukce Ang-1 ve vaskulárních buňkách
Způsob podle vynálezu používá virové konstrukty k nadprodukci Ang-1 v EC a zahrnuje možnosti, u nichž jsou k indukci neovaskulogenesy při léčbě vaskulárních onemocnění společně nadprodukovány Ang-1 a VEGF.
Funkčnost Ang-1 exprimujících adenovirových vektorů při udržování exprese biologicky aktivní bílkoviny Ang-1 a schopnost způsobu podle vynálezu optimálně indukovat neovaskularizaci prostřednictví společné nadprodukce Ang-1 a VEGF ve vaskulárních buňkách, jako jsou EC a SMC, byla tedy prokazována jak následuje.
Materiály a metody:
imunoprecipitační analýza a imunodetekční přenosová analýza fosforylace Tie2 v EC nadprodukujících Ang-1:
Endothelové buňky byly naočkovány na 60 mm misky předem pokryté fibronektinem (4,5 mg/ml) a infikovány rAdAngl-GFP, rAdGFP a rAdVEGF-GFP. Dvacet čtyři po infekci virus obsahující kultivační médium bylo nahrazeno bezsérovým médiem a buňky byly kultivovány před imunoprecipitací buněčných bílkovin dalších 24 hodin. Buňky byly promyty chladným PBS doplněným 100 pM Na3VO4 a lyžovány pufrem obsahujícím 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM Nad , 1 % Triton X-100, 10 % glycerol, 1 mM PMSF, 2 pg/ml leupeptinu, 2 pg/ml aprotininu, a 100 pM Na3VO4. Byl stanoven obsah bílkovin v supernatantu lyzátu a ali kvóty supernatantu lyzátu obsahující stejná množství bílkovin byly inkubací při 4 °C přes noc označeny protilátkou PY20 proti fosfotyrosinu (Transduction Laboratories, USA). K protilátkou označným vzorkům byla přidána zrníčka Protein-A sepharosy a imunoprecipitace byla provedena inkubací vzorků při 4 °C po 2 hodiny. Zrníčka byla následně promyta 4 krát chladným PBS, vařena ve vzorkovém pufru SDS PAGE po 3 minuty a usazena centrifugací. Bílkoviny supernatantu byly elektrickým polem přeneseny na nitrocelulosovou membránu (schleicher a Schuell,
- 41 Německo), a testovány imunoanalýzou western blot s anti-Tie2 protilátkami (Santa Cruz, USA).
Výsledky:
Biologická aktivita Ang-1: nadprodukce Ang-1 v EC vede ke zvýšené fosforylaci Tie2:
imunoprecipitační analýza a imunodetekční přenosová analýza fosforylace Tie2 v EC adenovirově infikovaných k nadprodukuci Ang-1 prokázala zvýšenou fosforylaci Tie2 (Obrázek 15b).
Tyto výsledky tedy dokazují, že bílkovina Ang-1 secernovaná konstruktem podle vynálezu je účinná ve vazbě ke kognátnímu receptoru, Tie2, a že tudíž takovéto konstrukty mohou být efektivně použity k expresi vaskulárního maturačního faktoru Ang-1 při léčbě vaskulárních onemocnění geneticky modifikovanými vaskulárními buňkami, jako jsou EC, podle způsobu podle vynálezu.
In vitro testy angiogenesy - optimální trojrozměrné rašení ndukované v kokultivovaných vaskulárních buňkách nadprodukujících Ang-1 a VEGF:
Způsob podle vynálezu používá jak vaskulární maturační faktor, tak angiogenní faktor, Ang-1 respektive VEGF, k stimulaci optimální angiogenesy pro léčbu vaskulárních onemocnění. Optimální angiogenesa vaskulárními buňkami, jako jsou EC a SMC, nadprodukujícími aba tyto faktory byla proto prokazována analýzou trojrozměrného rašení do kolagenu uložených kokultivovaných sféroidů virově transformovaných vaskulárních buněk, jak následuje.
Materiály a metody:
Rašení (7/7 vitro ekvivalent angiogenesy) adenovi rově infikovaných sféroidů EC nebo kokultivovaných sféroidů adenovirově infikovaných EC a SMC bylo zjišťováno analýzou rašení takovýchto sféroidů v kolagenových gelech, jak bylo dříve popsáno (Korff T. et al. 3 Cell Biol. 1998 143: 1341). Ve stručnosti: EC a SMC, spojené kde to náleží k tvorbě
- 42 koku!tivovaných sféroidů, byly suspendovány v kultivačním médiu obsahujícím 0,25 % (hmotn./obj.) karboxymethylcelulosy (Sigma, USA). K vytvoření EC-SMC ko-kultur, EC byly před smícháním označeny Díl-291 červeným fluorescenčním makerem tak, že umožnily rozeznávání EC od SMC v následné fluorescenční mikroskopické analýze sféroidů. Buněčné suspense byly naočkovány do neadherentních 96-jamkových destiček s kulatými dny (Nunc, Dánsko) tak, aby vytvářely jediný sféroid z ~ 750 buněk na sféroid na jamku po 24 hodinách kultivace. Sféroidy takto vytvořené byly zabudovány do kolagenových gelů, jak následuje. Zásobní roztok kolagenu byl připraven čerstvě před použitím smícháním 5 objemů kyselého extraktu kolagenu potkaního ocasu (nastaven na 2 mg/ml při 4 °C) s 1 objemem 10 x M199 média (Gibco BRL, USA) a 1 objemem 0,34 N NaOH k nastavení pH na 7,4. Zásobní roztok kolagenu byl smíchán za pokojové teploty se stejným objemem M199 média doplněného 40 % lidského séra obsahujícího 0,25 % (hmotn./obj.) karboxymethylcelulosy pro zabránění sedimentace sféroidů před polymerizací gelu. Vzorky gelu obsahující 20 30 sféroidů byly rychle přeneseny do předehřátých 24-jamkových destiček a nechány polymerizovat. Tyto gely byly inkubovány při 37 °C, 3 % CO2 a rašení přinejmenším 20 sféroidů z každé skupiny vzorků bylo dokumentováno digitální videokamerou (DXM1200 Nikon, Japonsko).
Kokultivace vaskulárních buněk nadprodukujících Ang-1 a VEGF indukuje optimální angiogenesu:
U sféroidů EC infikovaných rAdGFP (Obrázek 16a-b) bylo fluorescenční mikroskopickou analýzou pozorováno, že vykazují nízkou bazální aktivitu rašení, jež je pozorovatelně regulována směrem nahoru kokultivací sféroidů obsahujících EC infikované rAdGFP a infikované rAdVEGF-GFP (Obrázek 16c-d) jakož i EC infikované rAdAngl-GFP a infikované rAdGFP (obrázek 16e-f). Nejvyšší aktivita rašení však byla zaznamenána v kokultivovaných sféroidech obsahuj cích EC infikované rAdAngl-GFP a infikované rAdVEGF-GFP (obrázek 16g-h).
Podobné výsledky byly pozorovány při kokultivací adenovirově infikovaných EC a retrovirově transdukovaných SMC.
- 43 Ko-kultivované sféroidy obsahující EC infikované rAdVEGF-GFP a SMC infikované retroGFP ukazovaly mírné zvýšení angiogenní rašící aktivity v porovnání s kokultivací sféroidů obsahujících EC infikované rAdGFP a SMC infikované retroGFP (Obrázky 17b resp. 17a). Ko-kultivované sféroidy obsahující EC infikované rAdGFP a SMC infikované retroAngl-GFP vykazovaly vysoce směrem nahoru regulovanou angiogenní rašící aktivitu (Obrázek 17c) avšak ko-kultivované sféroidy obsahující ec infikované rAdVEGF-GFP a SMC infikované retroAngl-GFP vykazovaly synergicky zvýšené hladiny angiogenní rašící aktivity (Obrázek 17d). Tyto výsledky byly podpořeny dramaticky zvýšeným přežíváním pozorovaným v ko-kultúrách EC infikovaných rAdVEGF-GFP a smíchaných s SMC infikovanými retroAngl-GFP při kultivaci na sklíčkách po 24 hodin za podmínek hladovění na sérum (Obrázek 18h) ve srovnání s SMC infikovanými rAdGFP (Obrázek 18a), SMC infikovanými rAdAngl-GFP (Obrázek 18b), EC infikovanými rAdGFP (obrázek 18c), EC infikovanými rAdVEGF-GFP (Obrázek 18d), kokultivovanými SMC infikovanými rAdGFP + EC infikovanými rAdGFP (Obrázek 18e), kokultivovanými SMC infikovanými rAdGFP + EC infikovanými rAdVEGF-GFP (Obrázek 18f), a kokultivovanými SMC infikovanými rAdAngl-GFP + EC infikovanými rAdGFP (obrázek 18g).
Tyto výsledky tedy dokazují, že při použití koexprese vaskulárního maturačního a angiogenního faktoru Ang-1 resp. VEGF ve vaskulárních buňkách, jako jsou EC a SMC, může způsob podle vynálezu indukovat optimální angiogenesu a životnost buněk. Způsob podle vynálezu předčí jako takový techniky podle dřívějších znalostí v oboru používající k indukci neovaskularizace pro léčbu vaskulárních onemocnění pouze jeden typ angiogenního faktoru.
- 44 • ·· ·
Příklad 9
Nadprodukce Ang-1 zprostředkovává modifikovaných EC ochranu před apoptosou geneticky optimální geneti ckou
Způsob podle vynálezu používá k indukci neovaskularizace pro léčbu vaskulárních onemocnění modifikaci vaskulárních buněk, jako jsou EC, k nadprodukci EC diferenciačního faktoru Ang-1 ve spojení s nadprodukci EC růstového faktoru VEGF. Pro dosažení takto optimálního účinku je však vysoce žádoucí, aby takovéto modifikované buňky nadprodukující Ang-1 měly léčebného geneticky schopnost přeží pre-apoptické nimiž se v rozsahu genetickou podmínky s pravděpodobně setkají při všech fázích léčby, zahrnujícím sklizeň primárních buněk, jejich modifikaci, jejich ex vivo kultivaci a obzvláště podmínky za reimplantace in vivo do ischemických tkání, v nichž nízká tense kyslíku a obecně nepříznivé podmínky mohou snižovat přežívání buněk.
Schopnost EC retrovirově transdukovaných k nadprodukci Ang-1 vykazovat takovouto odolnost k pre-aptotickým podmínkám byla proto prokazována jak následuje.
Materiály a metody:
Test na apotické buňky metodou značení zaplněním koncové mezery dUTP zprostředkovaným terminál ní deoxynukleotidtransferasou (TdT) (metodou tunel):
Ve stručnosti: Neinfikované EC nebo retroAngl-GFP transdukované EC byly naočkovány při 4 x 105 buněk/jamku na 24-jamkové kultivační destičky. Po 24 hodinách kultivace byly buňky buď dále kultivovány po dalších 24 hodin v M199 médiu doplněném 20 % lidského séra, anebo kultivovány v bezsérovém médiu M199 k indukci apoptosy. Po vystavení pre-apoptickým podmínkám byly všechny buňky, vznášející se i přichycené, sebrány pomocí trypsinizace, fixovány v čerstvě připravené PBS - 4 % formaldehydu, blokovány methanolem - 3 % h2O2 a dále permeabilizovány v 0,1 % Tritonu x-100 - 0,1 % citrátu sodném. Nakonec byly fragmentované konce DNA označeny nukleotidy
- 45 • · · · • · ♦ ·
konjugovaným s fluoresceinem pomocí TdT a buňky byly zkoumány fluorescenční mikroskopií s excitací 450 - 500 nm a detekcí 515 - 565 nm (zelená). Test TUNEL byl prováděn s použitím soupravy In sítu Cell Detection Kit (kat. čís. 1684817, Roche, Německo) podle instrukcí výrobce.
výsledky:
Nadprodukce Ang-1 zprostředkovává v geneticky modifikovaných EC ochranu před apoptosou:
Endothelové buňky retrovirově transdukované k nadprodukci Ang-1 vykazují značnou resistenci k apoptose za preapoptických podmínek v porovnání s netransdukovanými buňkami (Obrázky 19h a 19d). Číselná kvantifikace provedená s mikroskopicky získanými daty shora ukazuje, že 55 % netransdukovaných EC je shledáno apoptickými po 24 hodinách deprivace na sérum proti jen 12 % EC retrovirově transdukovaných k nadprodukci Ang-1 (Obrázek 20). Podobné účinky snížení podílu apoptosy a zlepšeného přežívání byly pozorovány rovněž u směsné populace endothelových buněk exprimujících VEGF a Ang-1 (data nejsou předvedena).
Z těchto pokusů lze tedy uzavřít, že nadprodukce Ang-1 vaskulárními buňkami, s výhodou ve spojitosti s nadprodukci VEGF, optimalizuje přežití takovýchto buněk za fyziologického stresu, s nímž se pravděpodobně setkávají například v ischemických orgánech.
Způsob podle vynálezu tedy představuje zlepšení nad dřívější způsoby neovaskularizace pro léčbu vaskulárních onemocnění obecně a v patologiích zahrnujících ischemické tkáně obzvláště.
I když vynález je zde popsán ve spojitosti se svými konkrétním provedeními, je zřejmé, že osobám zběhlým v oboru budou jasné mnohé alternativy, modifikace a variace, v souladu s tím je záměrem zahrnout všechny takovéto alternativy, modifikace a variace, jež spadají do ducha a širšího rozsahu připojených nároků. Všechny publikace, patenty, patentové přihlášky, a sekvence zde zveřejněné nebo identifikované
- 46 přístupovými čísly GenBank, uváděné v této specifikaci jsou zde do specifikace zahrnuty ve své úplnosti odkazem, ve stejném rozsahu, jako kdyby jednotlivé publikace, patenty, patentové přihlášky a sekvence byly konkrétně a jednotlivě zahrnuty zde odkazem. Navíc: Citace nebo identifikace kteréhokoli odkazu v této přihlášce nesmí být chápána tak, že by se připouštělo, že takovýto odkaz je dostupný jako dosavadní znalost v oboru před tímto vynálezem.
ODKAZY
Další odkazy jsou citovány v textu
1. Korpelainen El, Alitalo K. Signaling angiogenesis and lymphanogenesis. Current Opinion in Cell Biol 1998;10:159164.
2. Rissau w. Mechanisms of angiogenesis. Nátuře 1997; 386:671674.
3. Folkman J, D'Amore PA. Blood vessel formation: What is its molecular basis? Cell 1999;87:1153-56.
4. schapper w, ito WD. Molecular mechanisms of coronary collateral vessel growth. Circ. Res 1996; 79:911-19.
5. Ware JA, Simons M. Angiogenesis in ischemic heart disease. Nátuře Med 1997; 3:158-64.
6. Hanahan D. signaling vascular morphogenesis and maintenance. Science 1997;277:48-50.
7. Ferrara N, Carver-Moore K, Chen H, et al. Embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. Nátuře 1996;380:439-42.
8. Shalaby F, Rossant J, Yamaguchi TP, et al. Failure of blood islands formation and vasculogenesis in Flk-1 deficient mice. Nátuře 1995;376:62-66.
9. Fong GH, Rossant J, Gertenstein M, et al. Role of the Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. Nátuře 1995;376:66-70.
- 48 10. Dumont DJ, Gradwhol G, Fong G-H, et al. Dominant-negative and targenull mutations in the endothelial receptor tyrosine kinase tek, reveal a critical role in vasculogenesis of the embryo. Genes Dev 1994; 8:1897-1903.
11. Sáto TN, Tzoawa Y, Deutsch U, et al. Distinct roles of the receptor tyrosine kinases Tiel and Tie2 in blood vessel formation. Nátuře 1995;376:7074.
12. Suri C, Jones PF, Patan S, et al. Requisite role of angiopoietin-1 a ligand for Tie2 receptor, during embryonic angiogenesis. Cell 1996;87:117180.
13. Maisonpierre PC, Suri c, eJones PF., et al. Angiopoietin-2 a natural antagonist for Tie2 that disrupts in-vivo angiogenesis. Science 1997;277:5560.
14. Vikkula M, Boon LM, Carraway ML, et al. Vascular dysmorphogenesis caused by an activating mutation in the receptor tyrosine kinase Tie2. Cell 1996;87:1181-90.
15. Leveen P, Pekny M, Gebre-Medhin S, et al. Genes Dev 1994;8:1875-87.
16. Carmeliet P, Mackman N, Moons L, et al. Role of tissue factor in embryonic blood vessel development. Nátuře 1996;383:73-75.
17. Lindhal P, Johansson BR, Leveen P, Hbetsholtz C. Pericyte loss and microaneurysm formation in pdgf-b deficient mice. Science. 1997;277:242-245.
18. Leaky vessels? call Angl. Nat Med 2000;6:131-2.
19. Angiopoietin-1 protects the adult vasculature against plasma leakage. Nat Med 2000;6:460-3.
20. Braunwald E. Cardiovascular medicine at the turn of the millennium: triumphs, concerns, and opportuniti es. N Eng J Med 1997;337:1360-9.
21. Anderson WF, Human gene therapy. Science 256:808-813,1992.
22. Mulligan RC. The basic science of gene therapy. Science 1993;260:926-32.
23. Lewis BS, Flugelman MY, weisz A, Keren-Tal I, schaper w. Angiogenesis by gene therapy. cardiovascular Research 1997; 35:490-7.
24. Kullo IJ, Simari RD, Schwartz rs. vascular gene transfer. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19:196-207.
25. Isner JM. Pieczek A, Schainfeld R, et al. Clinical evidence of angiogenesis after arterial gene transfer of phVEGF165 in patient with ischemic limb. Lancet 1996;348:370-4.
26. Effect of intracoronary recombinant human vascular endothelial growth factor on myocardial perfusion: evidence for a dose-dependent effect. Circulation. 2000;l O 1:118-21.
27. Flugelman MY, virmani R, Leon MB, Bowman RL, Dichek DA. Genetically engineered endothelial cells remain adherent and viable after stent deployment and exposure to pulsatile flow. Circ Res 1992;70:348-354.
28. Duli RO, Yuan J, Chang YS, Tarbell J, Jain RK, Munn LL. Kinetics of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor synergy in endothelial hydraulic conductivity and proliferation. Microvasc Res. 2001 Mar;61 (2):203-10.
- 50 ··· ·· ····
29. Sáláni D, Taraboletti G, Rosano L, Di Castro v, Borsotti P, Giavazzi R, Bagnato A. Endothelin-1 induces an angiogenic phenotype in cultured endothelial cells and stimulates neovascularization in vivo. Am J Pathol. 2000 Nov;157(5):170311.
30. Pepper MS, Mandriota SJ, Jeltsch M, Kumar v, Alitalo K. Vascular endothelial growth factor (VEGF)-c synergizes with basic fibroblast growth factor and VEGF in the induction of angiogenesis in vitro and alters endothelial cell extracellular proteolytic activity. J cell Physiol. 1998 Dec;177(3):439-52.
31. Asahara T, Bauters C, Zheng LP, Takeshita S, Bunting S, Ferrara N, Symes JF, isner JM. synergistic effect of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on angiogenesis in vivo. Circulation. 1995 Nov 1;92(9 Suppl):11365-71.
32. Cao R, Brakenhielm E, Wahlestedt C, Thyberg J, Cao Y. Leptin induces vascular permeability and synergistically stimulates angiogenesis with FGF-2 and VEGF. Proč Nati Acad Sci USA. 2001 May 22;98(11):6390-5.
33. Pepper MS. Transforming growth factor (3: vasculogenesis, angiogenesis, and vessel wall integrity. Cytokine Growth Factor Rev. 1997;8:21-43.
34. Carmeliet P. et al. Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-Cadherin gene in mice impairs VEGFmediated endothelial survival and angiogenesis. Cell 1999;98:147-157.
35. Adams RH. et al. Roles of ephrinB ligands and EphB receptor in cardiovascular development: demarcation of arterial/venous domains, vascular morphogenesis, and sprouting angiogenesis. Genes & Development 1999;13:295-306.
- 51 ·« »·*· ·· ···· ·· · ·· ·
36. Lindahl P. et al. Role of platlet-derived growth factors in angiogenesis and alveogenesis. Curr Top Pathol. 1999;93:2733.
37. Rajantie I. et al. Bmx tyrosine kinase has redundant function downstream of angiopoietin and VEGF receptors in arterial endothelium. Molecular and cellular biology. 2001;21:4647-4655.
38. Ito WD. et al. Monocyte chemotactic protein-lincreases collateral and peripheral conductance after femoral artery occlusion. Circ. Research 1997;80:829-837.
39. Chae JK, Kim I, Lim ST, chung MJ, Kim WH, Kim HG, Ko JK, and Koh GY. coadministration of Angiopoietin-1 and vascular Endothelial Growth Factor Enhances Collateral Vascularization. Arterioscler. Thromb. vasc. Biol. 2000; 20: 2573-2578.
40. Weisz A, Kořen B, Cohen T, Neufeld G, Kleinberger T, Lewis BS, Flugelman MY. Increased vascular endothelial growth factor 165 binding to kinase insert domain-containing receptor after infection of human endothelial cells by recombinant adenovirus encoding the Vegf(165) gene. Circulation 2001 Apr 10;103(14):1887-92.
• · • · ···· 9 9 ····

Claims (55)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi, jenž obsahuje
    a) první polynukleotidový segment kódující angiogenní proliferační faktor a
    b) druhý polynukleotidový segment kódující angiogenní maturační faktor.
  2. 2. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 1, jenž dále obsahuje přinejmenším jednu promotorovou sekvenci k řízení exprese přinejmenším jednoho z řečených polynukleotidových segmentů, prvního a druhého.
  3. 3. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 1, v němž první polynukleotidový segment je transkripčně navázán k druhému polynukleotidovému segmentu, přičemž první a druhý polynukleotidový segment jsou pod transkripčním řízením jediné promotorové sekvence z přinejmenším jedné řečené promotorové sekvence.
  4. 4. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 1, jenž dále obsahuje sekvenci spojky umístěnou mezi první a druhý polynukleotidový segment.
  5. 5. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 1, v němž sekvence spojky je vybrána ze skupiny sestávající z vnitřního místa vstupu ribosomu (IRES) a rozeznávacího místa štěpení proteasou.
  6. 6. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 1, v němž řečený přinejmenším jeden promotor je funkční v eukaryotických buňkách.
    • · • · · · • · • · · ·
  7. 7. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 1, v němž řečený přinejmenším jeden promotor je vybrán za skupiny sestávající z konstitutivního promotoru, indukovatelného promotoru a tkáňově specifického promotoru.
  8. 8. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 1 dále obsahující
    c) první promotorovou sekvenci k expresi prvního polynukleotidového segmentu a
    d) druhou promotorovou sekvenci k expresi druhého polynukleotidového segmentu.
  9. 9. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 8, v němž každý z řečeného prvního promotoru a řečeného druhého promotoru je vybrán za skupiny sestávající z konstitutivního promotoru, indukovatelného promotoru a tkáňově specifického promotoru.
  10. 10. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 9, u nějž exprese z řečeného prvního promotoru a řečeného druhého promotoru je regulovatelná jedním efektorem.
  11. 11. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 1 dále obsahující přinejmenším jednu další polynukleotidovou sekvenci kódující markerový polypeptid.
  12. 12. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 11, v němž markerový polypeptid je vybrán ze skupiny sestávající ze selekčního polypeptidů a reportérového polypeptidů.
  13. 13. Konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 11, v němž přinejmenším jeden další polynukleotidový segment je transkripčně navázán k přinejmenším jednomu z řečených polynukleotidových segmentů, prvnímu a druhému.
    • · · ·
  14. 14. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 13, v němž přinejmenším jeden další polynukleotidový segment je transkripčně navázán k přinejmenším jednomu z řečených polynukleotidových segmentů, prvnímu a druhému, prostřednictvím sekvence spojky.
  15. 15. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 14, v němž sekvence spojky je vybrána ze skupiny sestávající z vnitřního místa vstupu ribosomu (IRES) a rozeznávacího místa štěpení proteasou.
  16. 16. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 11, v němž řečený přinejmenším jeden další polynukleotidový segment je translačně fúzován s přinejmenším jedním z řečeného prvního polynukleotidového segmentu a řečeného druhého polynukleotidového segmentu.
  17. 17. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 1, v němž angiogenní proliferační faktor je vybrán ze skupiny sestávající z VEGF, kyselého nebo basického FGF, PlGF, leptinu a HGF.
  18. 18. Konstrukt nukleové kyseliny podle Nároku 1, v němž angiogenní maturační faktor je vybrán ze skupiny sestávající z angiopoietinu-1, Tie-2, TGF-βΙ, TGF-β receptoru-2, endoglinu, Smad5, VE-kadherinu, efrinuB2, PDGF, Bmx tyrosín kinasy a MCP-1.
    • · • · · · • · · ·
    - 55
  19. 19. Farmaceutický prostředek vyznačující se t i m, že obsahuje konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 1 jako aktivní složku a faramceuticky přijatelný nosič.
  20. 20. Geneticky transformované buňky vyznačující se t i m, že obsahují konstrukt nukleové kyseliny pro expresi podle Nároku 1.
  21. 21. Transformované buňky podle Nároku 20 vyznačující se tím, že jsou vybrány ze skupiny sestávající z endothelových buněk, buněk hladkého svalu, pericytú, myocytů, monocytů a fibroblastů.
  22. 22. Transformované buňky podle Nároku 20 vyznačující se tím, že řečené buňky jsou odvozeny ze zdroje vybraného ze skupiny sestávající ze segmentu žíly, progenitorových buněk kostní dřeně, progenitorových buněk periferní krve, cirkulujících endothelových buněk a embryonálních kmenových buněk.
  23. 23. Transformované buňky podle Nároku 20 vyznačující se tím, že řečené buňky jsou odvozeny ze zdroje vybraného ze skupiny sestávající z lidského dárce a zvířecího zdroje.
  24. 24. Systém exprese konstruktu nukleové kyseliny vyznačující se t i m, že obsahuje
    a) první konstrukt nukleové kyseliny pro expresi zahrnující polynukleotidový segment kódující angiogenní proliferační faktor a
    b) druhý konstrukt nukleové kyseliny pro expresi zahrnující polynukleotidový segment kódující angiogenní maturační faktor.
    • · · · • · · ·
    Γ Z- ··· »·······
    - Ju - ··* ···· · · · ·
  25. 25. Systém exprese konstruktu nukleové kyseliny podle Nároku 24 vyznačující se tím, že přinejmenším jeden řečeného prvního a řečeného druhého konstruktu nukleové kyseliny pro expresi obsahuje přinejmenším jeden další polynukleotidový segment kódující selekční markerový polypeptid a reportérový polypeptid.
  26. 26. Systém exprese konstruktu nukleové kyseliny podle Nároku 24 vyznačující se tím, že řečené konstruktu nukleové kyseliny pro expresi, první a druhý, oba obsahují dále promotorovou sekvenci pro řízení exprese řečeného prvního a řečeného druhého polynukleotidového segmentu.
  27. 27. Systém exprese konstruktu nukleové kyseliny podle Nároku 26 vyznačující se tím, že řečená promotorová sekvence je funkční v eukaryotických buňkách.
  28. 28. Systém exprese konstruktu nukleové kyseliny podle Nároku 26 vyznačující se tím, že řečená promotorová sekvence je vybrána za skupiny sestávající z konstitutivního promotoru, indukovatelného promotoru a tkáňově specifického promotoru.
  29. 29. Systém exprese konstruktu nukleové kyseliny podle Nároku 24 vyznačující se tím, že řečený přinejmenším jeden další polynukleotidový segment je transkripčně navázán k řečenému prvnímu pólynuk!eotidovému segmentu nebo k řečenému druhému polynukleotidovému segmentu.
  30. 30. Systém exprese konstruktu nukleové kyseliny podle Nároku 29 vyznačující se tím, že řečený přinejmenším jeden další polynukleotidový segment je transkripčně navázán k řečenému prvnímu polynukleotidovému segmentu nebo k řečenému druhému polynukleotidovému segmentu prostřednictvím sekvence spojky vybraní ze skupiny sestávající z vnitřního místa vstupu ribosomu (IRES) a rozeznávacího místa štěpení proteasou.
  31. 31. Farmaceutický prostředek vyznačující se t i m, že obsahuje systém exprese konstruktu nukleové kyseliny podle Nároku 24 jako aktivní složku a faramceuticky přijatelný nosič.
  32. 32. Populace buněk v y z n a č u j í c íc h se t í m, že jsou geneticky transformovány k expresi přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru a přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru.
  33. 33. Populace buněk podle Nároku 32 vyznačuj ící se t í m, že řečená populace zahrnuje přinejmenším dva buněčné typy vybrané ze skupiny sestávající z endothelových buněk, buněk hladkého svalu, pericytů, myocytů, monocytů a fibroblastů.
  34. 34. Populace buněk podle Nároku 32 vyznačuj ící se t í m, že první z řečených přinejmenším dvou buněčných typů je geneticky transformován k expresi řečeného přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru, přičemž dále je druhý buněčný typ z řečených přinejmenším dvou buněčných typů geneticky transformován k expresi řečeného přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru.
  35. 35. Populace buněk podle Nároku 33 v y z n a č u j í c í se tím, že řečený první buněčný typ je endothelová buňka přičemž dále řečený druhý buněčný typ je buňka hladkého svalu.
    • · · · · · • · ··· · · · · 4 · * · · · · · ·
    - 58
  36. 36. Populace buněk podle Nároku 35 vyznačující se tím, že řečená endothelová buňka je odvozena ze zdroje vybraného ze skupiny sestávající z tkáně žíly, tkáně tepny, tukové tkáně, progenitorových buněk, cirkulujících endothelových buněk a kmenových buněk kostní dřeně a přičemž dále je buňka hladkého svalu odvozena ze zdroje vybraného ze skupiny sestávající z tkáně žíly a tkáně tepny.
  37. 37. Populace buněk podle Nároku 32 v y z n a č u j í c í se t i m, že exprese řečeného přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru a řečeného přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru jsou navzájem nezávisle regulovatelné.
  38. 38. Populace buněk podle Nároku 32 vyznačující se t í m, že řečený přinejmenším jeden angiogenní proliferační faktor je vybrán ze skupiny sestávající z VEGF, kyselého nebo basického FGF, PlGF, leptinu a HGF.
  39. 39. Populace buněk podle Nároku 32 v y z n a č u j i c í se ti m, že angiogenní maturační faktor je vybrán ze skupiny sestávající z angiopoietinu-1, Tie-2, TGF-βΙ, TGF-β receptoru-2, endoglinu, Smad5, VE-kadherinu, efrinuB2, PDGF, Bmx tyrosín kinasy a MCP-1.
  40. 40. Způsob indukce tvorby nových krevních cév v oblasti tkáně jednotlivce vyznačující se t i m, že zahrnuje kroky
    a) podávání prvního buněčného typu, jenž je geneticky transformován k expresi přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru do dané oblasti tkáně jednotlivce a
    b) podávání prvního buněčného typu, jenž je geneticky transformován k expresi přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru do dané oblasti tkáně jednotlivce.
    • · · · • · · ·
  41. 41. Způsob podle Nároku 40 v y z n a č u j i c i se tím, že řečená oblast tkáně zahrnuje okludovanou nebo zúženou vaskulární tkáň nebo poraněnou vaskulární tkáň.
  42. 42. Způsob podle Nároku 40 vyznačující se tím, že řečená okludovaná nebo zúžená vaskulární tkáň je okludovaná nebo zúžená tepna.
  43. 43. Způsob podle Nároku 40 v y z n a č u j í c i se tím, že řečený první buněčný typ a řečený druhý buněčný typ jsou odvozeny z daného jednotlivce.
  44. 44. Způsob podle Nároku 40 vyznačující se tím, že řečené buňky prvního a druhého typu jsou vybrány ze skupiny sestávající zendothelových buněk, buněk hladkého svalu, pericytů, myocytů, monocytů, kmenových buněk kostní dřeně, fibroblastů a embryonálních kmenových buněk.
  45. 45. Způsob podle Nároku 40 v y z n a č u j i c i se tím, že se používá k obejití okludované nebo zúžené krevní cévy nebo k proniknutí do okludované nebo zúžené krevní cévy.
  46. 46. Způsob podle Nároku 43 v y z n a č u j í c í se tím, že řečený první buněčný typ a řečený druhý buněčný typ jsou společně podávány do oblasti tkáně jednotlivce.
  47. 47. Způsob podle Nároku 43 v y z n a č u j í c i se tím, že exprese přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru z prvního buněčného typu je regulovatelná prvním faktorem přičemž dále je exprese přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru z druhého buněčného typu regulovatelná druhým faktorem.
    • · · · • · · · • ·
    6/-, · · · «······· u — ··· ·· · · ·· · ·
  48. 48. Způsob podle Nároku 47 v y z n a č u j í c í se tím, že řečený první a řečený druhý faktor jsou jediným faktorem schopným regulovat směrem dolů expresi přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru a regulovat směrem nahoru expresi přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru.
  49. 49. Způsob podle Nároku 47 v y z n a č u j í c í se tím, že krok b) je prováděn alespoň 12 hodin po kroku a).
  50. 50. Způsob indukce tvorby nových krevních cév v oblasti tkáně jednotlivce vyznačující se tím, že zahrnuje podávání buněk do dané oblasti jednotlivce, přičemž buňky jsou geneticky transformovány k expresi
    a) přinejmenším jednoho angiogenního proliferačního faktoru do dané oblasti tkáně jednotlivce a b) přinejmenším jednoho angiogenního maturačního faktoru do dané oblasti tkáně jednotlivce, čímž je indukována tvorba nových krevních cév v dané oblasti tkáně jednotlivce
  51. 51. způsob podle Nároku 50 v y z n a č u j í c í se tím, že řečené buňky jsou endothelové buňky.
  52. 52. Farmaceutický prostředek vyznačující se t í m, že obsahuje preparát obsahující angiogenní proliferační faktor a angiogenní maturační faktor jako aktivní složku a farmaceuticky přijatelný nosič.
  53. 53. Farmaceutický prostředek podle Nároku 52 vyznačující se tím, že angiogenní proliferační faktor je vybrán ze skupiny sestávající z vegf, kyselého nebo basického fgf, pIgf, leptinu a HGF.
    Z--1 · · · ··♦····· — Ό _L ~ ··· ···· ···»
  54. 54. Farmaceutický prostředek podle Nároku 52 vyznačující se tím, že angiogenní maturační faktor je vybrán ze skupiny sestávající z angiopoietinu-1, Tie-2, TGF-βΙ, TGF-β receptoru-2, endoglinu, Smad5, VE-kadherinu, efrinuBŽ, pdgf, Bmx tyrosin kinasy a MCP-1.
  55. 55. Farmaceutický prostředek podle Nároku 52 vyznačující se t i m, že řečený farmaceuticky přijatelný nosič je vybrán ze skupiny sestávající z liposomu, mi cely a viru.
    5’ ltr VEGF-IRES-EGFP SV40 Neo
    3’ LTR » · · ·
    2/13 ··· ···« · · ·· · « · ·· · ·
    Obr. 3a
    Obr. 3b
    3/13 _Q sT u
    JO
    O
    Okluse
    Obr. 4c
    J ' Ιο 53. 4 4
    4/13 • · ·· · · ··
    Měření průtoku injekce
    Obr. 5a c
    E
    E ω
    £
    Jxí
    O •3
    Q_
    Kontrolní končetina inji kovaná končetina —♦- Kontrol a -B— rAdGFP-A— rAdVEGí
    Obr. 5a
    5/13 po V 4Ά čj • · ···· · · ···· • · · · · · « ·· · · » · · • · ·· · · ··
    Obr. 6b
    Obr. 6d
    Obr. 7a
    Obr. 7c
    Obr. 7d
    6/13
    2 3 4 5 Ang 1 β aktin
    Obr. 8a
    2 3 4 5 6
    Ang 1 β aktin
    Ang 1 β aktin
    Obr. 9a
    3 4
    Ang 1 β aktin
    Obr. 9b
    7/13
    TM 4^» G ·· *··· ·· · ·· · • · · · · · · ··· · · · · · • · · ·· ·· · ·
    Obr. 10
    2 3 4 5 6 7 ***»< «0 , Ang 1
    Obr. 11
    3 4 obr.
    OWMM. .«»»·«-Ί*
    Fig. 12b
    VEGF
    8/13
    Obr. 13a obr. 13b
    IPaPY - - - - - + + + +
    Obr. 15a
    Obr. 15b • 9 · ·
    9/13
    VO T-ι L • 4 ···· · · · · * * 1 • · ·· · · · ·
CZ2003444A 2000-08-08 2001-08-08 Konstrukty nukleové kyseliny, vaskulární buňky jimi transformované a farmaceutické prostředky a způsoby používající je k indukci angiogenesy CZ2003444A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22372700P 2000-08-08 2000-08-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2003444A3 true CZ2003444A3 (cs) 2003-10-15

Family

ID=22837748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2003444A CZ2003444A3 (cs) 2000-08-08 2001-08-08 Konstrukty nukleové kyseliny, vaskulární buňky jimi transformované a farmaceutické prostředky a způsoby používající je k indukci angiogenesy

Country Status (13)

Country Link
US (1) US7767201B2 (cs)
EP (2) EP2163642A1 (cs)
JP (1) JP2004520009A (cs)
AT (1) ATE397087T1 (cs)
AU (1) AU2001280060A1 (cs)
CA (1) CA2418936A1 (cs)
CZ (1) CZ2003444A3 (cs)
DE (1) DE60134234D1 (cs)
HU (1) HUP0300727A3 (cs)
IL (1) IL154324A0 (cs)
PL (1) PL366000A1 (cs)
WO (1) WO2002012539A2 (cs)
ZA (1) ZA200301386B (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7387645B2 (en) * 2003-04-25 2008-06-17 Medtronic Vascular, Inc. Cellular therapy to heal vascular tissue
WO2006130320A2 (en) * 2005-05-11 2006-12-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Repair of the bone marrow vasculature
US20070123486A1 (en) * 2005-11-15 2007-05-31 Andrea Banfi Composition for coordinated VEGF and PDGF expression, and methods of use
JP5121155B2 (ja) * 2006-03-14 2013-01-16 独立行政法人物質・材料研究機構 形質転換細胞集団の作成方法
WO2007136673A2 (en) * 2006-05-19 2007-11-29 Medistem Laboratories, Inc. Treatment of disc degenerative disease and compositions for same
WO2008152507A2 (en) * 2007-03-16 2008-12-18 Multigene Vascular Systems, Inc. Compositions and methods for treating ophthalmic disorders
CN102242148A (zh) * 2010-10-09 2011-11-16 苏州大学 重组载体以及转基因骨髓基质细胞修饰的丝素膜及其应用
ES2651716T3 (es) 2012-11-02 2018-01-29 Cornell University Acondicionamiento angiogénico para potenciar la reprogramación celular cardiaca de fibroblastos del miocardio infartado
US20220145258A1 (en) 2020-11-10 2022-05-12 Vessl Therapeutics Ltd Methods of preconditioning vascular cells for transduction, methods of transduction and methods of preserving transduced cells

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4900556A (en) * 1985-04-26 1990-02-13 Massachusetts Institute Of Technology System for delayed and pulsed release of biologically active substances
US5674722A (en) 1987-12-11 1997-10-07 Somatix Therapy Corporation Genetic modification of endothelial cells
US6001350A (en) * 1987-12-11 1999-12-14 Somatix Therapy Corp Genetic modification of endothelial cells
US4950483A (en) * 1988-06-30 1990-08-21 Collagen Corporation Collagen wound healing matrices and process for their production
US5219739A (en) * 1989-07-27 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequences encoding bVEGF120 and hVEGF121 and methods for the production of bovine and human vascular endothelial cell growth factors, bVEGF120 and hVEGF121
US5980885A (en) * 1991-07-08 1999-11-09 Neurospheres Holdings Ltd. Growth factor-induced proliferation of neural precursor cells in vivo
EP0642585B1 (en) * 1992-05-18 2005-12-28 Genentech, Inc. Activation of oligomerizing receptors by using fused receptor ligands
US5618544A (en) * 1992-08-12 1997-04-08 Bays-Brown Dermatologics, Inc. Method of decreasing cutaneous senescence
DE4228457A1 (de) * 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
US6007987A (en) 1993-08-23 1999-12-28 The Trustees Of Boston University Positional sequencing by hybridization
US5962427A (en) * 1994-02-18 1999-10-05 The Regent Of The University Of Michigan In vivo gene transfer methods for wound healing
US5821919A (en) * 1994-04-29 1998-10-13 Intel Corporation Apparatus for table-driven conversion of pixels from YVU to RGB format
US6090618A (en) * 1996-10-07 2000-07-18 Arch Development Corporation DNA constructs and viral vectors comprising a smooth muscle promoter
US5641750A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
JP2000502682A (ja) * 1995-12-22 2000-03-07 ローカルメッド インコーポレイテッド 血管新生を促進する成長因子の局所的血管内デリバリー
US5785965A (en) * 1996-05-15 1998-07-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior Univ. VEGF gene transfer into endothelial cells for vascular prosthesis
AU738749B2 (en) * 1996-10-23 2001-09-27 Wake Forest University Targeted cytotoxic cells
FI970784A (fi) * 1997-02-25 1998-08-26 Nokia Telecommunications Oy Prosessien välinen vuonvalvonta hajautetussa moniprosessoriympäristössä
US6099832A (en) * 1997-05-28 2000-08-08 Genzyme Corporation Transplants for myocardial scars
CA2225185A1 (en) * 1997-08-11 1999-02-11 Peter K. Law Myoblast transfer therapy for relieving pain and for treating behavioral and perceptive abnormalities
CA2266805C (en) * 1998-03-27 2015-04-28 An-Go-Gen Inc. Cell-based gene therapy in the treatment of pulmonary disorders
US6206914B1 (en) * 1998-04-30 2001-03-27 Medtronic, Inc. Implantable system with drug-eluting cells for on-demand local drug delivery
US7008781B1 (en) * 1998-12-23 2006-03-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of enhancing the biological activity of ligands
EP1016726A1 (en) * 1998-12-30 2000-07-05 Introgene B.V. Gene therapy to promote angiogenesis
US6328762B1 (en) * 1999-04-27 2001-12-11 Sulzer Biologics, Inc. Prosthetic grafts
US6554857B1 (en) * 1999-07-20 2003-04-29 Medtronic, Inc Transmural concentric multilayer ingrowth matrix within well-defined porosity
WO2002022176A1 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Genvec, Inc. Method of modulating neovascularization
US20030027751A1 (en) * 2001-04-10 2003-02-06 Genvec, Inc. VEGF fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
JP2004520009A (ja) 2004-07-08
US7767201B2 (en) 2010-08-03
EP1307582A2 (en) 2003-05-07
EP1307582B1 (en) 2008-05-28
HUP0300727A3 (en) 2005-12-28
IL154324A0 (en) 2003-09-17
WO2002012539A2 (en) 2002-02-14
PL366000A1 (en) 2005-01-24
HUP0300727A2 (hu) 2003-10-28
ZA200301386B (en) 2004-03-31
EP1307582A4 (en) 2004-09-22
WO2002012539A3 (en) 2002-05-16
CA2418936A1 (en) 2002-02-14
AU2001280060A1 (en) 2002-02-18
US20040151707A1 (en) 2004-08-05
ATE397087T1 (de) 2008-06-15
EP2163642A1 (en) 2010-03-17
DE60134234D1 (de) 2008-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7563278B2 (en) Drug-eluting intravascular prostheses and methods of use
AU706908B2 (en) Gene-transfer-mediated angiogenesis therapy
Ueno et al. Adenovirus-mediated expression of the secreted form of basic fibroblast growth factor (FGF-2) induces cellular proliferation and angiogenesis in vivo
EP1968565B1 (en) Compositions and methods for inhibiting angiogenesis
PT811074E (pt) Metodos e composicoes de terapia genica para o tratamento de defeitos no metabolismo lipoproteico
KR101702629B1 (ko) 체세포로부터 혈관 전구 세포로의 직접교차분화 유도용 조성물 및 이의 용도
JPH10501423A (ja) 遺伝子転移媒介の血管形成療法
JP2001501471A (ja) 血管新生の阻害のための遺伝子治療
Gao et al. Increased regional function and perfusion after intracoronary delivery of adenovirus encoding fibroblast growth factor 4: report of preclinical data
EP1307582B1 (en) Nucleic acid constructs, vascular cells transformed therewith, pharmaceutical compositions and methods utilizing same for inducing angiogenesis
EP1370299B1 (en) Nucleic acid constructs expressing vegf and hgf, cells transformed therewith and their use for inducing liver regeneration and alleviation of portal hypertension
WO2019027299A2 (ko) 간세포성장인자를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
EA005157B1 (ru) Методы и составы для лечения сердечной недостаточности и вентрикулярной коррекции путем доставки in vivo ангиогенных трансгенов
WO2007088418A9 (en) Drug-eluting intravascular prostheses and methods of use
CA2516486A1 (en) Method of treating ischemic disease
ES2316194T3 (es) Metodos para la regulacion de la angiogenesis y la integridad vascular utilizando los ligandos bdnf, nt-3 y nt-4.
JP4736088B2 (ja) Ｃｄ９遺伝子からなる心疾患を予防又は治療する医薬
WO2008033304A2 (en) Compositions for promoting non-leaky collateral vascularization
US20040002149A1 (en) Control of the ratio of LAP to LIP
Rauma-Pinola Adenovirus endocytosis and adenoviral gene transfer in cardiovascular and dermatologic disease models
Lei Inhibition of cardiac allograft arteriosclerosis by NOS (eNOS or iNOS) specific expression in smooth muscle or endothelial cells
MXPA00005516A (es) Composiciones y metodos para inducir la expresion de genes
JP2005052001A (ja) 遺伝子治療剤