ES2651716T3 - Acondicionamiento angiogénico para potenciar la reprogramación celular cardiaca de fibroblastos del miocardio infartado - Google Patents

Abstract

Combinación de vectores que comprende (a) un primer vector viral que codifica para una o más proteínas angiogénicas que inducen vascularización en el corazón del mamífero, y (b) un segundo vector viral que codifica para uno o más factores de transcripción de diferenciación cardiaca que inducen la producción de cardiomiocitos inducidos (iCM) en el corazón del mamífero para su uso en un método de tratamiento de arteriopatía coronaria en un mamífero, en la que el primer y segundo vector se administran al corazón del mamífero.

Description

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DESCRIPCION

Acondicionamiento angiogenico para potenciar la reprogramacion celular cardiaca de fibroblastos del miocardio infartado

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/721.604, presentada el 2 de noviembre de 2012.

Incorporacion como referencia de material presentado electronicamente

Se presenta una secuencia de nucleotidos/aminoacidos legible por ordenador simultaneamente con el presente documento y se identifica tal como sigue: un archivo ASCII (texto) de 1.448 bites denominado “714417SequenceListing.TXT”, creado el 1 de noviembre de 2013.

Antecedentes de la invencion

La arteriopatia coronaria (CAD) sigue siendo la principal causa de muerte en los paises occidentales, en parte debido a las opciones todavia limitadas para el tratamiento de CAD difusa, infarto de miocardio e insuficiencia cardiaca congestiva (Lloyd-Jones et al., Circulation, 119(3): 480-486 (2009); Tailor et al., J. Heart Lung Transplant, 23(7): 796-803 (2004); Lietz et al., Circulation, 116(5): 497-505 (2007); Anyanwu et al., Brit. Med. J., 326(7388): 509510 (2003)). La terapia con celulas madres cardiacas se ha adoptado como un nuevo enfoque para el tratamiento de cardiopatia en estadio final que teoricamente repuebla el miocardio de lo contrario cicatrizado permanentemente con celulas contractiles (Leor et al., Circulation, 94 (supl. 9): II332-II336 (1996); Tailor et al., Nature Med., 4(8): 929-933 (1998); Tomita et al., Circulation, 100 (supl. 19): II247-II256 (1999); Orlic et al., Nature, 410(6829): 701-704 (5 de abril de 2001); Scorsin et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 119(6): 1169-1175 (2000); Hare et al., Curr. Opin. Organ Transplant, 13(5): 536-542 (2008); Rosenzweig, N. Engl. J. Med., 355(12): 1274-1277 (2006); Murry et al., J. Am. Coll. Cardiol., 47(19): 1777-85 (2006); Menasche, J. Mol. Cell. Cardiol., 50(2): 258-265 (2010)). La creacion de celulas madre pluripotentes inducidas (iPSC) y la generacion de celulas de tipo cardiomiocitos a partir de iPSC parecen haber representado grandes avances en este campo (Min et al., J. Appl. Phys., 92(1): 288-296 (2002); Takahashi et al., Cell, 131(5): 861-872 (2007); Yu et al., Science, 318(5858): 1917-1920 (2007); Okita et al., Nature, 448(7151): 313-317 (2007); Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 106(3): 808-813 (2009); Gai et al., Cell Biol. Intl., 33(11): 1184-1193 (2009); Mauritz et al., Circulation, 118(5): 507-517 (2008); Nelson et al., Circulation, 120(5): 408416 (2009); Narazaki et al., Circulation, 118(5): 498-506 (2008); Zhang et al., Circ. Res., 104(4): e30-e41 (2009)), pero informes recientes de la inmunogenicidad y tumorigenicidad de iPSC pueden reflejar en ultima instancia los limites de la aplicabilidad clinica de las iPSC, tal como pueden ser los desafios logisticos de la administracion de iPSC en la practica clinica (Okita et al., Circ Res., 109(7): 720-721 (2011); Apostolou et al., Nature, 474(7350): 165

(2011) ; Mummery, N. Engl. J. Med., 364(22): 2160-2162 (2011); Zhao et al., Nature, 474(7350): 212-214 (2011)).

El reciente descubrimiento de que podria usarse un trio de factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca para generar cardiomiocitos inducidos (iCM) directamente a partir de celulas somaticas (Ieda et al., Cell, 142(3): 375-386 (2010)) ofrece la nueva posibilidad excitante de generar celulas autologas que presentan caracteristicas que son al menos consecuentes con las de un fenotipo de cardiomiocito (Ieda et al., Cell, 142(3): 375-386 (2010); Efe et al., Nature Cell. Bio., 13(3): 215-222 (2011); Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012); Passier et al., Cell Stem Cell, 7(2): 139-141 (2010); Song et al., Nature, 485(7400): 599-604 (2012); Srivastava et al., Circ. Res., 111(1): 5-8

(2012) ; Jayawardena et al., Circ. Res., 110(11): 1465-1473 (2012); Protze et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 53(3): 323-332 (2012)). Quiza de manera mas importante, esta estrategia regenerativa novedosa ofrece la posibilidad fascinante de sortear la estadificacion de iPSC y convertir fibroblastos cicatriciales miocardicos en iCM funcionales in situ, transformando potencialmente regiones de infarto de miocardio de nuevo en miocardio funcional (Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012); Song et al., Nature, 485(7400): 599-604 (2012); Srivastava et al., Circ. Res., 111(1): 5-8 (2012); Jayawardena et al., Circ. Res., 110(11): 1465-1473 (2012)). Sin embargo, informes recientes han proporcionado pruebas contradictorias con respecto a la eficacia potencial de tal regeneracion del miocardio in situ (Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012); Song et al., Nature, 485(7400): 599-604 (2012); Srivastava et al., Circ. Res., 111(1): 5-8 (2012); Jayawardena et al., Circ. Res., 110(11): 1465-1473 (2012); Protze et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 53(3): 323-332 (2012); Chen et al., Circ. Res., 111(1): 50-55 (2012)). El documento US 2010/166714 A1 se refiere al aislamiento de celulas madre cardiovasculares positivas para los marcadores Islet1, NKx2. y flk (VEGF).

Por consiguiente, existe la necesidad de metodos adicionales para el tratamiento y la comprension de la arteriopatia coronaria, incluyendo la generacion de celulas de iCM in situ.

Breve sumario de la invencion

La invencion proporciona materiales y metodos utiles en el tratamiento y la comprension de la arteriopatia coronaria. En un aspecto, la invencion proporciona materiales para su uso en un metodo de tratamiento de arteriopatia coronaria administrando vectores virales que codifican para una o mas proteinas angiogenicas y uno o mas factores

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de transcripcion de diferenciacion cardiaca al corazon de un mamifero.

La proteina angiogenica puede ser cualquier proteina implicada en la vascularizacion, por ejemplo, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El factor de transcripcion de diferenciacion cardiaca puede ser cualquier factor de transcripcion implicado en la diferenciacion de cardiomiocitos, por ejemplo, Gata4, Mef2c y/o Tbx5.

Los vectores son vectores virales, tales como vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores basados en virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), vectores basados en virus del herpes simple (VHS), vectores basados en adenovirus, vectores basados en parvovirus (es decir, vectores basados en virus adenoasociado) y vectores quimericos de VAA-adenovirus. En una realizacion preferida, el metodo comprende administrar un vector adenoviral que codifica para VEGF y un vector adenoviral que codifica para Gata4, Mef2c y Tbx5 (GMT).

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 es un conjunto de fotografias que muestran la generacion de lentivirus que codifican para factores de transcripcion cardiacos individuales. Los lentivirus que codifican para los factores de transcripcion Gata4, Mef2c y Tbx5 se prepararon en celulas de empaquetamiento 293T, y se detecto la expresion de proteinas mediante analisis de inmunotransferencia de tipo Western usando anticuerpos especificos frente a cada transgen. Se uso un lentivirus que expresaba un gen marcador de proteina fluorescente verde (GFP) como control para estos vectores de expresion, y se uso beta-actina como control de carga.

Las figuras 2A-F son un conjunto de fotografias y graficos que muestran la generacion de iCM in vitro. Se cultivaron celulas de fibroblastos dermicos de rata (RDF) primarios y se infectaron con un lentivirus de GMT o un lentivirus control de GFP. Catorce dias tras la infeccion, se fijaron las celulas y se tineron para detectar marcadores de cardiomiocitos especificados. La figura 2A es un conjunto de fotografias que se refieren a estudios de inmunofluorescencia. La primera columna representa la tincion con 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para identificar los nucleos celulares. La segunda columna representa la fluorescencia de GFP para identificar celulas infectadas por al menos uno de los vectores de lentivirus. La tercera columna representa la tincion de color rojo de marcadores de cardiomiocitos relevantes (primera fila: troponina cardiaca T (cTnT); segunda fila: cadena pesada de miosina 7 (MHY7); tercera fila: actinina sarcomerica a). La cuarta columna representa una fusion de las tres imagenes anteriores. Observese la coincidencia de estos marcadores respectivos y celulas binucleadas tipicas de cardiomiocito, y que las celulas GFP (-) tampoco pueden expresar los marcadores. RDF sin infectar no expresaban ningun marcador (no mostrado). Todas las fotomicrografias se tomaron a 400X aumentos (barra = 50 pm). Las figuras 2B-F son un conjunto de graficos que se refieren al analisis de clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS). Se representan graficos de FACS para la tincion de cTnT: RDF infectados con GMT, que muestran un 7% de expresion de cTnT en celulas GFPP+P (figura 2B), RDF infectados con lentivirus control de GFP (figura 2C), RDF no infectados (figura 2D), control de cardiomiocito primario (figura 2E) y RDF infectados con GMT, con el uso de un anticuerpo secundario solo (figura 2F). Los graficos muestran un minimo de 5.000 acontecimientos.

La figura 3 es un grafico que muestra la vascularizacion del miocardio. La vascularizacion de regiones de infarto se representa tal como se evalua determinando el numero de vasos por campo microscopico que se tinen para actina de musculo liso a en secciones obtenidas 7 semanas tras la ligacion coronaria y la administracion de AdVEGF- All6AP+P o el vector control de AdNull (n=12/grupo). * p < 0,05.

Las figuras 4A-E son un conjunto de fotografias y graficos que muestran la densidad de cardiomiocitos en zonas de infarto. Se realizo la tincion con el marcador MYH7 especifico de cardiomiocitos de las zonas de infarto y de borde de secciones de miocardio recogidas 7 semanas tras la ligacion coronaria y la administracion de AdVEGF-All6AP+P o el vector control de AdNull (4 semanas tras la administracion de lentivirus que codifica para GMT o un control de GFP). Las figuras 4A-D son fotomicrografias de secciones representativas de zonas de infarto de animales tratados con AdVEGF-All6AP+P/GMT (fila superior) o /AdNull/GFP (fila inferior) a 100X (izquierda) y 200X (derecha) aumentos, respectivamente. Las barras representan 100 pm. La figura 4E es un grafico de la densidad de celulas con MYH7 como porcentaje de las secciones totales analizadas (n=6/grupo). El grado I/II indica que < 50% de los campos microscopicos examinados estaban ocupados por celulas MYH7P+P, y el grado III/IV indica que > 50% de los campos microscopicos examinados estaban ocupados por celulas MYH7P+P (vease la figura 7 para campos microscopicos representativos de cada grado de densidad).

Las figuras 5A-C son un conjunto de graficos que muestran la extension de la fibrosis de la pared ventricular izquierda. Se representa el porcentaje de area de pared miocardica ventricular izquierda que muestra fibrosis tal como se determina mediante tincion tricromica de secciones de tejido de miocardio recogido 7 semanas tras la ligacion coronaria y la administracion de AdVEGF-All6AP+P o el vector control de AdNull (4 semanas tras la administracion de lentivirus que codifica para GMT o un control de GFP) en animales. La figura 5A muestra la extension de la fibrosis en animales que reciben vectores de GMT frente a control de GFP (n=12). * p < 0,01. La figura 5B muestra la extension de la fibrosis para los cuatro grupos de tratamiento (n=6/grupo). * p <0,05. La figura 5C muestra el numero de miofibroblastos identificados por campo microscopico (200X) en animales que reciben vectores de GMT frente a control de GFP (n=12), tal como se identifican mediante tincion para actina de musculo liso

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a (p = 0,09).

Las figuras 6A-C son un conjunto de graficos que muestran el analisis ecocardiografico de la funcion ventricular global tras la administracion in vivo de vectores de AdVEGF-All6AP+P y/o reprogramacion celular. Se realizaron estudios ecocardiograficos en los puntos de tiempo especificados antes y tras la ligacion coronaria y la administracion de AdVEGF-All6AP+P o el vector control de AdNull a tiempo 0, y despues de la administracion de lentivirus que codifica para GMT o un control de GFP 3 semanas despues (n=6). La figura 6A muestra la fraccion de eyeccion global para cada grupo de tratamiento. En el dia 49 (prueba de rangos de Kruskal-Wallis; p < 0,005): AdVEGF-All6AP+ P/GMTP P frente a AdNull/GFP: p < 0,05; AdVEGF-All6AP+P/GMT frente a AdVEGF-All6AP+ P/GFP: p < 0,05; AdVEGF-All6AP+ P/GMT frente a AdNull/GMT: p = 0,08; AdVEGF-All6AP+ P/GFP frente a AdNull/GFP: p = 0,86). La figura 6B muestra el cambio en la fraccion de eyeccion desde el momento de nivel inicial de administracion de lentivirus (dia 21) hasta el momento de la ecocardiografia de seguimiento 4 semanas despues (dia 49). Panel superior: animales que reciben vector de GMT frente a control de GFP (n=12). * p < 0,01. Panel inferior: cada grupo de estudio analizado por separado (n=6). * p < 0,05. AdVEGF-All6AP+ P/GMT frente a AdVEGF- All6AP+ P/GFP: p = 0,008; AdVEGF-All6AP+ P/GMT frente a AdNull/GFP: p < 0,001; AdNull/GMT frente a AdNull/GFP: p = 0,004. La figura 6C muestra la funcion de la pared posterior ventricular izquierda. Grosor de la pared posterior ventricular izquierda en la sistole final 7 semanas tras la ligacion coronaria y la administracion de AdVEGF-All6AP+P o el vector control de AdNull (4 semanas tras la administracion de lentivirus que codifica para GMT o un control de GFP). Las diferencias entre grupos no alcanzaron la significacion estadistica (p = 0,09).

La figura 7 es un conjunto de fotografias que muestran la clasificacion de densidad de celulas con MHY7. Se analizo el numero de celulas MYH7+ de una manera semicuantitativa como la densidad de celulas MYH7+ en cinco areas por portaobjetos observadas a 200X aumentos (en el centro de la zona de infarto, en las areas del medio entre el centro del infarto y la zona de borde, y en cada zona de borde adyacente al infarto). Un investigador ciego al grupo de tratamiento clasifico estos campos tal como sigue: (parte superior izquierda) grado I: < 25% del campo microscopico seleccionado muestra celulas MYH7+; (parte superior derecha) grado II: el 25%-50% del campo microscopico seleccionado muestra celulas MYH7+; (parte inferior izquierda) grado III: el 50% -75% del campo microscopico seleccionado muestra celulas MYH7+; y (parte inferior derecha) grado IV: >75% del campo microscopico seleccionado muestra celulas MYH7+.

La figura 8 es un conjunto de fotografias que muestran la vascularizacion del infarto inducida por transferencia mediada por adenovirus de VEGF. Se evaluo la vascularizacion de las regiones de infarto mediante tincion para actina de musculo liso a en secciones obtenidas 7 semanas tras la ligacion coronaria y administracion de AdVEGF- All6AP+P o el vector control de AdNull (n=12/grupo). Las fotomicrografias muestran secciones representativas de zonas de infarto observadas a 200X tras la administracion de AdNull/GMT (parte superior) o AdVEGF- All6AP+P/GMT (parte inferior). Las barras representan 100 pm.

La figura 9 es un conjunto de fotografias que muestran la densidad de miofibroblastos tras la administracion de GMT. Miofibroblastos identificados mediante tincion de la actina de musculo liso a no vascular de las zonas de infarto y de borde de secciones de miocardio recogidas 7 semanas tras la ligacion coronaria y la administracion de AdVEGF-All6AP+P o el vector control de AdNull (4 semanas tras la administracion de lentivirus que codifica para GMT o un control de GFP). Las fotomicrografias muestran secciones representativas de zonas de infarto observadas a 400X tras la administracion de AdNull/GFP (parte superior) o AdVEGF-All6AP+P/GMT (parte inferior). Las barras representan 50 pm.

Las figuras 10A-10B son un conjunto de fotografias (figura 10A) y un grafico (figura 10B) que muestran la vascularizacion de la cicatriz tras la administracion de AdNull/GFP frente a VEGF/GMT. En la figura 10A, las flechas indican zonas de vascularizacion. En la figura 10B, el grafico muestra un numero aumentado de vasos/hpf tras la administracion de VEGF. * p < 0,05, tincion de a SMA.

Las figuras 11A-B son un conjunto de fotografias (figura 11A) y un grafico (figura 11B) que muestra la densidad de celulas de iCM (MHC+).

Las figuras 12A-B son un conjunto de fotografias (figura 12A) y graficos (figura 12B) que muestran la extension de la fibrosis.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion se basa, al menos en parte, en el concepto de que, para lograr una diferenciacion cardiaca in situ eficaz, la cicatriz miocardica y el tejido circundante se acondicionan con un gen que codifica para un mediador angiogenico, proporcionando de ese modo vasculatura a una region danada del corazon que va a someterese a diferenciacion cardiaca mediante factores de transcripcion relevantes. La isquemia puede afectar de manera adversa a la supervivencia y/o funcion de iCM en una zona de infarto, puesto que provoca la perdida de cardiomiocitos nativos e implantes exogenos (de celulas madre) (Zhang et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 33(5): 907-921 (2001); Reinecke et al., Circulation, 100(2): 193-202 (1999); Laflamme et al., Nature Biotechnol., 25(9): 1015-1024 (2007);

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Retuerto et al., J. Thorac. Cardiovasc. Sung., 127(4): 1041-1049 (2004); Retuerto et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 133(2): 478-484 (2007)), de manera que una vascularizacion adecuada de la cicatriz miocardica vascularizacion puede ser un componente importante de una estrategia de reprogramacion celular in situ optimizada (Retuerto eta/., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 127(4): 1041-1049 (2004); Retuerto et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 133(2): 478-484 (2007)). El uso de acondicionamiento angiogenico mejora notablemente la eficacia del uso de factores de diferenciacion cardiaca para mejorar la funcion cardiaca tras infarto de miocardio u otra arteriopatia coronaria.

La invencion proporciona un metodo de tratamiento de arteriopatia coronaria en un mamifero, que comprende administrar al corazon del mamifero un primer vector viral que codifica para una o mas proteinas angiogenicas que inducen vascularizacion en el corazon del mamifero, y un segundo vector viral que codifica para uno o mas factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca que inducen la produccion de cardiomiocitos inducidos (iCM) en el corazon del mamifero, mediante lo cual se trata la arteriopatia coronaria en el mamifero. De manera deseable, los vectores primero y segundo se administran a la misma region del corazon.

El termino “arteriopatia coronaria” se refiere a cualquier trastorno o estado que implique a las arterias coronarias. La arteriopatia coronaria puede atribuirse habitualmente a la deposicion de placa ateromatosa en las paredes arteriales. El estrechamiento o la oclusion de la luz arterial da como resultado un suministro de oxigeno y nutrientes reducido al corazon. Aunque la oclusion arterial habitualmente avanza lentamente, tambien es posible el bloqueo subito de una arteria por un trombo o embolo. Las manifestaciones de la arteriopatia coronaria incluyen angina de pecho, isquemia, infarto de miocardio, cardiomiopatia, insuficiencia cardiaca congestiva, arritmias y formacion de aneurismas.

El termino “region del corazon” se refiere a cualquier region del corazon afectada por arteriopatia coronaria. La region del corazon puede incluir las auriculas, los ventriculos y/o los vasos del corazon. La region del corazon puede ser tambien una region danada, por ejemplo, por un infarto de miocardio. En este sentido, la region del corazon puede ser una cicatriz miocardica o region del corazon periinfartada.

El termino “mamifero” se refiere a cualquier mamifero adecuado, incluyendo, pero sin limitarse a, un raton, una rata, un gato, un perro, una cobaya, un hamster, un conejo, un gato, un perro, un cerdo, una vaca, un caballo, un primate y un ser humano. El mamifero normalmente es un ser humano.

El termino “proteina angiogenica” se refiere a una proteina que esta implicada en la vascularizacion. Por ejemplo, la proteina angiogenica puede ser una o mas de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) (por ejemplo, VEGF- A (120, 164 y 188), VEGF-B, VEGF-C, o VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F), FGF (factor de crecimiento de fibroblastos) (por ejemplo, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF- 13, FGF-14, FGF-15, FGF-16, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22 o FGF-23), PGF (factor de crecimiento placentario), NRP-1 (neuropilina-1), ANG (angiopoyetina) (por ejemplo, ANG-1 o ANG-2), PDGf (factor de crecimiento derivado de las plaquetas) (por ejemplo, PDGF-AA, PDGF-BB, o PDGF-AB), TGF-P (factor de crecimiento transformante beta) (por ejemplo, TGF-P1, TGF-P2 o TGF-P3), MCP-1 (proteina quimiotactica de monocitos-1), VE-cadherina (cadherina endotelial vascular), efrina, activador de plasminogeno o inhibidor de activador de plasminogeno, eNOS (oxido nitrico sintasa endotelial), COX-2 (ciclooxigenasa-2), CD133, MMP (metaloproteinasa de la matriz) y DLL44 (ligando de tipo delta 4). La proteina angiogenica puede ser tambien un receptor para cualquiera de las proteinas angiogenicas mencionadas anteriormente. En una realizacion preferida, la proteina angiogenica es VEGF.

El termino “factor de transcripcion de diferenciacion cardiaca” se refiere a una proteina, un agente o un factor de transcripcion que esta implicado en la induccion de diferenciacion cardiaca o la produccion de iCM, por ejemplo, la produccion de iCM a partir de fibroblastos miocardicos. Por ejemplo, el factor de transcripcion de diferenciacion cardiaca puede ser uno o mas de Hopx (proteina de homeodominio solo), Nkx2-5 (proteina de homeosecuencia Nkx-2.5), Hrt2 (factor de transcripcion relacionado con Hairy 2), Pitx2 (factor de transcripcion de homeodominio de tipo apareado 2 u homeosecuencia de la hipofisis 2), Smyd1 (proteina que contiene dominio MYND 1), Myocd (miocardina), Baf60c (factor asociado a BRG1/Brm de 60 kDa, subunidad c), Tbx5 (factor de transcripcion de caja T 5), Srf (factor de respuesta serica), Gata4 (factor de transcripcion de globina 4), Isl1 (proteina potenciadora del gen de insulina 1), Mef2c (factor potenciador especifico de miocitos 2C o factor potenciador de transcripcion de caja MADS 2, polipeptido C), Hand2 (proteina expresada en el corazon y derivados de crestas neurales 2) y Mesp1 (homologo 1 del mesodermo posterior). El factor de transcripcion de diferenciacion cardiaca puede ser tambien un receptor para cualquiera de los factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca mencionados anteriormente. En una realizacion preferida, los factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca son la combinacion de Gata4, Mef2c y Tbx5 (GMT).

El termino “vector” se refiere a cualquier vehiculo usado para transferir material genetico a una celula diana. La divulgacion proporciona un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica para una o mas proteinas angiogenicas y un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica para uno o mas factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca. Los vectores pueden ser vectores no virales, incluyendo, por ejemplo, lipoplexos, poliplexos, dendrimeros y nanoparticulas. El primer vector y el segundo vector son vectores

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virales, incluyendo, por ejemplo, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores basados en virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), vectores basados en virus del herpes simple (VHS), vectores basados en adenovirus, vectores basados en parvovirus (es decir, vectores basados en virus adenoasociado) y vectores quimericos de VAA-adenovirus. Estos vectores de transferencia genica pueden prepararse usando tecnicas de ADN recombinante convencionales descritas en, por ejemplo, Sambrook et ai., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), y Ausubel et a/., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y. (1994).

Un retrovirus es un virus de ARN que puede infectar a una amplia variedad de celulas huesped. Tras la infeccion, el genoma retroviral se integra en el genoma de su celula huesped y se replica junto con el aDn de la celula huesped, produciendo de ese modo de manera constante ARN viral y cualquier secuencia de acido nucleico incorporada en el genoma retroviral. Cuando se emplean retrovirus patogenos, por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o virus linfotroficos de celulas T humanas (VLTH), debe tenerse cuidado en la alteracion del genoma viral para eliminar la toxicidad. Un vector retroviral puede manipularse adicionalmente para hacer que el virus sea de replicacion incompetente. Como tales, se considera que los vectores retrovirales son particularmente utiles para la transferencia genica estable in vivo.

Los vectores lentivirales, tales como vectores basados en VIH, son a modo de ejemplo de vectores retrovirales usados para suministro genico. A diferencia de otros retrovirus, se sabe que los vectores lentivirales incorporan sus genes pasajeros en celulas que no se dividen, lo que hace que estos vectores lentivirales sean particularmente utiles en terapia genica. Los lentivirus se componen de dos copias de ARN, una capside nuclear (NC), una capside (CA), una matriz asociada a la membrana (MA), proteinas de la envuelta tales como glicoproteinas de superficie (SU) y proteinas transmembrana (TM), y enzimas tales como integrasa (EN), proteasa (PR) y transcriptasa inversa (RT), y proteinas auxiliares. Los vectores lentivirales se basan en la separacion fisica en diferentes plasmidos de las proteinas requeridas para la formacion de particulas de virus y la infectividad (los constructos de empaquetamiento y de la envuelta) y de secuencias de actuacion en cis suficientes para movilizar el genoma viral (el vector de transferencia). Este ultimo constituye el nucleo del vector, que es un genoma miniviral que carece de marcos de lectura abiertos (ORF) virales, pero que porta un casete de expresion para el transgen de interes. Como consecuencia de la delecion de los ORF virales del vector de transferencia, los viriones pueden experimentar una unica ronda de infeccion al final de la cual el ADN proviral expresa solo el transgen de interes (Durand et ai., Viruses, 3(2): 132-159 (2011)).

Los vectores virales basados en VHS son adecuados para su uso como vector de transferencia genica para introducir acidos nucleicos en neuronas u otros tejidos. El virion de VHS maduro consiste en una capside icosaedrica con envuelta con un genoma viral que consiste en una molecula de ADN bicatenario lineal que tiene 152 kb. La mayoria de los vectores de VHS de replicacion deficiente contienen una delecion para eliminar uno o mas genes intermedios-tempranos para impedir la replicacion. Las ventajas del vector de herpes son su capacidad para entrar en un estadio latente que puede dar como resultado expresion de ADN a largo plazo y su genoma de ADN viral grande puede alojar ADN exogeno de hasta 25 kb.

El adenovirus (Ad) es un virus de ADN bicatenario de 36 kb que transfiere eficazmente ADN in vivo a una variedad de tipos de celulas diana diferentes. Para su uso en los metodos de la invencion, el virus se hace preferiblemente de replicacion deficiente delecionando genes seleccionados para replicacion viral, tales como, por ejemplo, todo o porciones de las regiones E1, E2 y/o E4. La region E3 prescindible tambien se deleciona frecuentemente para permitir espacio adicional para un inserto de ADN mas grande. El vector puede producirse con altos titulos y puede transferir eficazmente ADN a celulas que se duplican y que no se duplican. La informacion genetica recien transferida permanece de manera epicromosomica, eliminando por tanto los riesgos de mutagenesis por insercion al azar y alteracion permanente del genotipo de la celula diana. Los vectores adenovirales pueden derivarse de cualquier serotipo de adenovirus. Las reservas adenovirales que pueden emplearse como fuente de adenovirus pueden amplificarse a partir de los serotipos de adenovirus 1 a 51, que estan disponibles actualmente de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA), o a partir de cualquier otro serotipo disponible de cualquier otra fuente. Por ejemplo, un adenovirus puede ser del subgrupo A (por ejemplo, serotipos 12, 18 y 31), subgrupo B (por ejemplo, serotipos 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34 y 35), subgrupo C (por ejemplo, serotipos 1, 2, 5 y 6), subgrupo D (por ejemplo, serotipos 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39 y 42-47), subgrupo E (serotipo 4), subgrupo F (serotipos 40 y 41), o cualquier otro serotipo de adenovirus. Preferiblemente, sin embargo, un adenovirus es de serotipo 2, 5 o 9. En una realizacion, el vector de adenovirus es de serotipo 5 y tiene deleciones en las regiones E1 y E3.

Los vectores de VAA son vectores virales de particular interes para su uso en protocolos de terapia genica (vease, por ejemplo, Santos Coura et al., Virology J., 4: 99 (2007)). VAA es un virus de ADN sin envuelta, que no se conoce que produzca enfermedad en seres humanos. VAA requiere habitualmente coinfeccion con un virus auxiliar (es decir, un adenovirus o un virus del herpes), o expresion de genes auxiliares, para lograr una replicacion eficaz. En ausencia de un virus auxiliar, los VAA establecen una infeccion latente dentro de la celula diana. El genoma de VAA consiste en un ADN lineal monocatenario de aproximadamente 4,7 kb que contiene dos marcos de lectura abiertos (ORF). El ORF izquierdo codifica para proteinas Rep no estructurales, y el ORF derecho codifica para las proteinas de la capside (Cap) VP1, VP2 y VP3. Cada extremo del genoma de VAA comprende una repeticion terminal

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invertida (ITR) de 145 bases (ITR), que contiene el origen viral de replicacion del ADN y la senal de empaquetamiento. Las secuencias de nucleotidos de ITR de VAA se han descrito anteriormente (veanse, por ejemplo, Kotin et al., Human Gene Ther., 5: 793-801 (1994); Berns “Parvoviridae and Their Replication” en Fundamental Virology, 2a edicion (B. N. Campos and D. M. Knipe, eds.)).

Los vectores de VAA usados para la administracion de un acido nucleico terapeutico pueden tener aproximadamente el 96% o mas del genoma original delecionado, de manera que solo permanecen las ITR. Esto elimina los efectos secundarios toxicos o inmunologicos debidos a la expresion de genes virales. Ademas, la administracion de la proteina Rep de VAA permite la integracion del vector de VAA que comprende ITR de VAA en una region especifica del genoma, si se desea. Las celulas huesped que comprenden un genoma de VAA integrado no muestran cambios en la morfologia o crecimiento celular (vease, por ejemplo, la patente estadounidense 4.797.368). Los vectores de VAA pueden derivarse de cualquier serotipo de vAa, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquiera de los 11 serotipos de VAA conocidos (es decir, VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5, VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10 y VAA11). Las reservas de VAA que pueden emplearse como fuente de VAA pueden amplificarse a partir de VAA1, VAA2, VAA3, VAA4 o VAA5, que estan disponibles actualmente de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA), o de cualquier otro serotipo de VAA disponible de cualquier otra fuente. VAA de serotipo 2 (VAA2) ha sido el mas extensamente estudiado de todos los serotipos de VAA. VAA2 puede infectar a muchos tipos de celulas diferentes, incluyendo celulas de musculo esqueletico, neuronas, celulas de musculo liso vascular y hepatocitos. En el contexto de la invencion, un vector de transferencia genica de VAA2 se usa preferiblemente para infectar neuronas.

La naturaleza a largo plazo persistente y no patogena de la infeccion por VAA, combinada con su amplio espectro de infectividad, ha hecho que este virus sea un candidato importante como vector de transferencia genica terapeutico. Sin embargo, si se desea, las propiedades integrativas de VAA pueden conferirse a adenovirus construyendo un vector quimerico de VAA-Ad. Por ejemplo, las ITR de VAA y el acido nucleico que codifica para la proteina Rep incorporada en un vector adenoviral permiten que el vector de adenovirus se integre en el genoma de una celula de mamifero.

Pueden proporcionarse secuencias reguladoras para su uso en el vector de la invencion a partir de promotores comunmente usados derivados de virus tales como polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simios 40. El uso de elementos reguladores virales para dirigir la expresion de la proteina puede permitir una expresion constitutiva de alto nivel de la proteina en una variedad de celulas huesped. Tambien pueden usarse promotores que se expresan de manera ubicua, incluyendo, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus tempranos (vease, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41: 521-530 (1985)), el promotor de timidina cinasa de virus del herpes (VHS-TK) (vease, por ejemplo, McKnight et al., Cell, 37: 253-262 (1984)), promotores de p-actina (por ejemplo, el promotor de P-actina humana tal como se describe por Ng et al., Mol. Cell Biol., 5: 2720-2732 (1985)), y el promotor del factor estimulante de colonias-1 (CSF-1) (vease, por ejemplo, Ladner et al., EMBO J., 6: 2693-2698 (1987)).

Alternativamente, las secuencias reguladoras del vector pueden dirigir la expresion del gen preferentemente en un tipo de celula particular, es decir, pueden usarse elementos reguladores especificos de tejido. Los ejemplos de promotores especificos de tejido que pueden usarse incluyen promotores especificos del sistema cardiovascular, es decir, promotores que son (a) esencialmente inactivos fuera del sistema cardiovascular o (b) mas activo en el sistema cardiovascular que en otros sistemas. Por ejemplo, el promotor especifico de tejido puede ser un promotor especifico para el corazon o los vasos sanguineos. El promotor puede ser especifico para tipos de celulas particulares, tales como fibroblastos, cardiomiocitos o celulas endoteliales.

Con el fin de producir particulas virales recombinantes, puede introducirse un vector viral en una celula huesped adecuada usando tecnicas conocidas, tales como mediante transfeccion. Se conocen generalmente en la tecnica varias tecnicas de transfeccion (veanse, por ejemplo, Graham et al., Virology, 52: 456-467 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a edicion, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); y Chu et al., Gene, 13: 97 (1981)). Los metodos de transfeccion particularmente adecuados incluyen coprecipitacion con fosfato de calcio (vease, por ejemplo, Graham et al., Virology, 52: 456-467 (1973)), microinyeccion directa en celulas cultivadas (vease, por ejemplo, Capecchi, Cell, 22: 479 488 (1980)), electroporacion (vease, por ejemplo, Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)), transferencia genica mediada por liposomas (vease, por ejemplo, Mannino et al., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)), transduccion mediada por lipidos (vease, por ejemplo, Felgner eta/., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84: 7413-7417 (1987)), y suministro de acidos nucleicos usando microproyectiles de alta velocidad (vease, por ejemplo, Klein et al., Nature, 327: 70-73 (1987)).

Las celulas huesped adecuadas para producir particulas virales recombinantes incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, celulas de levaduras, celulas de insectos y celulas de mamiferos, que pueden usarse, o se han usado, como receptores de una molecula de acido nucleico exogena. Por tanto, una “celula huesped” tal como se usa en el presente documento se refiere generalmente a una celula que se ha transfectado con una molecula de acido nucleico exogena. La celula huesped incluye cualquier celula eucariota o linea celular siempre que la celula o linea celular no sea incompatible con la proteina que va a expresarse, el sistema de seleccion elegido o el sistema de fermentacion empleado. Los ejemplos no limitativos incluyen celulas CHO dhfr- (vease, por ejemplo, Urlaub et al.,

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Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77: 4216-4220 (1980)), celulas 293 (vease, por ejemplo, Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)), y celulas de mieloma tales como SP2 y NS0 (vease, por ejemplo, Galfre et al., Met. Enzymol., 73: 346 (1981)).

En una realizacion, se usa la linea celular de rinon embrionaria humana estable 293 (por ejemplo, n.° de registro de la ATCC CRL1573) en la practica de la invencion. La linea celular 293 se transfecta facilmente y proporciona una plataforma particularmente conveniente en la que producir viriones recombinantes. Por ejemplo, para producir particulas lentivirales recombinantes, puede cotransfectarse una linea celular 293 humana con un vector lentiviral que contiene el transgen, un vector de empaquetamiento (por ejemplo, psPAX) y un vector de envuelta (por ejemplo, pMD2G).

Los vectores primero y segundo pueden derivarse cada uno del mismo virus, por ejemplo, el primer vector puede ser un vector adenoviral y el segundo vector puede ser un vector adenoviral. Alternativamente, los vectores primero y segundo pueden derivarse cada uno de virus diferentes, por ejemplo, el primer vector puede ser un vector adenoviral y el segundo vector puede ser un vector lentiviral. En una realizacion alternativa, un unico vector codifica para ambas de la una o mas proteinas angiogenicas y el o mas factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca, es decir, el primer y el segundo vector son el mismo (unico) vector.

Cuando los vectores primero y segundo son dos vectores, los vectores primero y segundo pueden administrarse en cualquier orden. Por ejemplo, el primer vector puede administrarse antes, despues o al mismo tiempo que el segundo vector. El primer vector puede administrarse, por ejemplo, aproximadamente 1 hora, 1 dia, 3 dias, 5 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas o 10 semanas antes o despues del segundo vector. En una realizacion preferida, el primer vector se administra aproximadamente 3 semanas antes del segundo vector.

La administracion de un vector adenoviral que codifica para tres factores de transcripcion (Gata4, Mef2c y Tbx5 (GMT)) usado como estimulo para la generacion de iCM junto con la administracion de un vector adenoviral que codifica para las tres isoformas principales de VEGF da como resultado mayores mejoras en la funcion del miocardio tras el infarto que la administracion de GMT o VEGF solo. De hecho, este descubrimiento esta en contraposicion al reciente trabajo de otros investigadores que sugiere que la reprogramacion celular mediada por la estrategia de GMT es ineficaz (Chen et al., Circ. Res., 111(1): 50-55 (2012)).

Puede considerarse que la arteriopatia coronaria del mamifero va a tratarse si resulta cualquier mejora en la funcion cardiaca o fisiopatologia de la administracion de los vectores. Por ejemplo, numeros aumentados de cardiomiocitos o iCM, fibrosis reducida, vascularizacion aumentada, funcion ventricular mejorada y fraccion de eyeccion aumentada son indicadores de un tratamiento satisfactorio de la arteriopatia coronaria. Estos indicadores pueden medirse o evaluarse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo inmunohistoquimica, inmunofluorescencia, clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS), microscopia o ecocardiografia.

El presunto origen de las mejoras en la funcion ventricular tras el infarto es la generacion de iCM funcionales en areas de cicatriz miocardica y la potenciacion de la supervivencia y/o funcion de estos miocitos “reprogramados” mediante prevascularizacion cicatricial (Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012); Passier et al., Cell Stem Cell, 7(2): 139-141 (2010); Song eta/., Nature, 485(7400): 599-604 (2012); Srivastava eta/., Circ. Res., 111(1): 5-8 (2012); Retuerto et al., J. Thorax. Cardiovasc. Surg., 127(4): 1041-1049 (2004); Retuerto et al., J. Thorax. Cardiovasc. Surg., 133(2): 478-484 (2007)). De manera interesante, las mejoras observadas en la fraccion de eyeccion y las disminuciones en la fibrosis tras la reprogramacion celular parecen exceder con mucho lo que se esperaria unicamente basandose en la generacion relativamente ineficaz de iCM a partir de celulas del sustrato (Qian eta/., Nature, 485(7400): 593-598 (2012); Passier eta/., Cell Stem Cell, 7(2): 139-141 (2010); Song eta/., Nature, 485(7400): 599-604 (2012); Srivastava eta/., Circ. Res., 111(1): 5-8 (2012)). Mas especificamente, en comparacion con una tasa de transdiferenciacion de fibroblastos del infarto en iCM in vivo en el intervalo del 1% - 20%, reducciones en la fibrosis y mejoras en la fraccion de eyeccion que oscilan hasta el 50% sugieren que mecanismos alternativos o adicionales pueden ser responsables de estos resultados (Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012); Song et al., Nature, 485(7400): 599-604 (2012); Jayawardena et al., Circ. Res., 110(11): 1465-1473 (2012)).

La generacion de iCM funcionalmente competentes, contractiles puede contribuir individualmente a la restauracion de la funcion cardiaca global. Los aumentos significativos en la densidad de celulas MYH7+ (cardiomiocitos) en animales tratados con GMT frente a control en zonas tanto de infarto como de borde, similares a las observaciones previas de Qian et al. y Song et al., apoyan este mecanismo (Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012); Song et al., Nature, 485(7400): 599-604 (2012)). Alternativamente, la generacion de iCM en zonas de infarto adelgazadas podria mejorar las tensiones de la pared y de ese modo disminuir las cargas de trabajo del miocardio globales, tal como apoyan las observaciones de la funcion sistolica mejorada de segmentos remotos de la pared ventricular izquierda en animales tratados, y tal como se postulo previamente que era un mecanismo de accion que subyacia a la eficacia de las terapias de implantes de celulas madre (Leor eta/., Circulation, 94 (supl. 9): II332-II336 (1996); Tailor et al., Nature Med., 4(8): 929-933 (1998); Tomita et al., Circulation, 100 (supl. 19): II247-II256 (1999); Orlic et al., Nature, 410(6829): 701-704 (5 de abril de 2001); Scorsin et al., J. Thorax. Cardiovasc. Surg., 119(6): 1169-1175

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(2000); Hare et al., Curr. Opin. Organ Transplant, 13(5): 536-542 (2008); Rosenzweig, N. Engl. J. Med., 355(12): 1274-1277 (2006); Murry et al., J. Am. Coll. Cardiol., 47(19): 1777-85 (2006); Menasche, J. Mol. Cell. Cardiol., 50(2): 258-265 (2010); Min et al., J. Appl. Phys., 92(1): 288-296 (2002)).

La disminucion drastica en la fibrosis observada en animales tratados segun el metodo de la presente invencion parece exceder con creces los aumentos en el numero de iCM recien generados, sugiriendo de ese modo que la disminucion en la fibrosis tambien puede contribuir a las mejoras significativas en la fraccion de eyeccion observadas en animales tratados. Es concebible que un efecto paracrino de un numero relativamente limitado de iCM pueda subyacer a esta reduccion en la fibrosis, debido a la expresion por iCM de quimiocinas tales como factor de crecimiento de fibroblastos basicos e inhibidor tisular de metaloproteinasa de la matriz (TIMP) - 2 que se ha notificado que limitan o reducen la fibrosis (Daskalopoulos et al., Microsc. Microanal., 18(1): 35-49 (2012); Fedak et al., Circ. Heart Failure, 5(3): 349-356 (2012); van den Borne et al., Nature Rev. Cardiol., 7(1): 30-37 (2010)).

Alternativamente, la administracion de reprogramacion celular y/o transgenes de VEGF puede desviar fibroblastos residentes/cicatriciales de su diferenciacion normal tras el infarto a miofibroblastos, que se sabe que producen fibrosis por medio expresion de colageno y otros componentes de la matriz extracelular, y hacia un destino mas benigno como iCM (Daskalopoulos et al., Microsc. Microanal., 18(1): 35-49 (2012); Fedak et al., Circ. Heart Failure, 5(3): 349-356 (2012); van den Borne et al., Nature Rev. Cardiol., 7(1): 30-37 (2010); Chen et al., Am. J. Physiol. Hears Circ. Physiol., 291(4): H1653-1658 (2006); Yang et al., J. Appl. Physiol., 93(3): 1140-1151 (2002); Zhang et al., Circulation, 119(13): 1776-1784 (2009); Song et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 354(4): 999-1003 (2007); Claes et al., Cardiovasc. Res., 91(3): 369-370 (2011)). La reduccion de cuatro veces de las poblaciones de miofibroblastos observada en animales tratados con GMT frente a los controles, consecuente con una tendencia similar en la extension reducida de la fibrosis, apoya esta suposicion. Teoricamente, procesos alternativos tales como funcion reprimida y/o apoptosis de miofibroblastos (es decir, expresion disminuida de componentes de la matriz extracelular) tambien podrian desempenar un papel en tales mecanismos (Daskalopoulos et al., Microsc. Microanal., 18(1): 35-49 (2012); Fedak et al., Circ. Heart Failure, 5(3): 349-356 (2012); van den Borne et al., Nature Rev. Cardiol., 7(1): 30-37 (2010); Chen et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 291(4): H1653-1658 (2006); Yang et al., J. Appl. Physiol., 93(3): 1140-1151 (2002); Zhang et al., Circulation, 119(13): 1776-1784 (2009); Song et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 354(4): 999-1003 (2007); Claes et al., Cardiovasc. Res., 91(3): 369-370 (2011)).

El uso de vectores de lentivirus y adenovirus que infectan a celulas que se dividen y que no se dividen (incluyendo cardiomiocitos) genera la posibilidad tambien de efectos de GMT/VEGf sobre cardiomiocitos residentes ademas de la seleccion como diana de fibroblastos (Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012); Passier et al., Cell Stem Cell, 7(2): 139-141 (2010); Song et al., Nature, 485(7400): 599-604 (2012); Srivastava et al., Circ. Res., 111(1): 5-8 (2012); Jayawardena et al., Circ. Res., 110(11): 1465-1473 (2012)). Algunas pruebas en la bibliografia sugieren que tales efectos podrian incluir cambios en la estructura, funcion o estabilidad/resistencia de los cardiomiocitos a la isquemia (es decir, “supercelulas cardiacas”) (Daskalopoulos et al., Microsc. Microanal., 18(1): 35-49 (2012); Fedak et al., Circ. Heart Failure, 5(3): 349-356 (2012); van den Borne et al., Nature Rev. Cardiol., 7(1): 30-37 (2010); Chen et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 291(4): H1653-1658 (2006); Yang et al., J. Appl. Physiol., 93(3): 11401151 (2002); Zhang et al., Circulation, 119(13): 1776-1784 (2009); Song et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 354(4): 999-1003 (2007); Claes et al., Cardiovasc. Res., 91(3): 369-370 (2011)). GMT y/o VEGF, cuando se administran por medio de estos vectores, podrian incluir en la diferenciacion de otras celulas que no proliferan, tales como celulas progenitoras cardiacas residentes, fibroblastos o celulas endoteliales hacia un destino de cardiomiocito y/o lejos de un fenotipo de miofibroblastos.

La vascularizacion cicatricial es importante para apoyar la supervivencia y funcion de implantes de celulas madre, y comienza una meseta en la neovascularizacion 3 semanas tras la administracion de VEGF (Retuerto et al., J. Thorax. Cardiovasc. Sung., 127(4): 1041-1049 (2004); Retuerto et al., J. Thorac. Cardiovasc. Sung., 133(2): 478-484 (2007); Amano et al., Mol Ther., 12(4): 716-724 (2005)). Estudios de supervivencia celular preliminares sugieren que se aplican consideraciones similares a la observacion de neovascularizacion aumentada que proporciona la perfusion de nutrientes necesaria para apoyar la conversion de fibroblastos con metabolismo bajo en cardiomiocitos con alto metabolismo (inducidos).

La importancia de la prevascularizacion cicatricial para la estrategia de reprogramacion celular in situ descrita en el presente documento esta apoyada por la observacion de la capacidad de AdVEGF para inducir vascularizacion cicatricial en un modelo de infarto de miocardio agudo, junto con la observacion de mejoras significativas en la fraccion de eyeccion cuando se administra VEGF como complemento a GMT. La falta de cambio en la densidad de celulas MYH7+ observada cuando se administra VEGF sin GMT sugiere que VEGF no desempena un papel significativo, independiente en la reprogramacion celular en este entorno. En cambio, en el contexto de la demora en la neovascularizacion inducida por VEGF en relacion con el transcurso de tiempo mas rapido del infarto de miocardio, y la observacion de una extension equivalente de la fibrosis en animales tratados con VEGF frente a sin VEGF, la mejora (comparativamente limitada) en la fraccion de eyeccion observada tras la administracion de VEGF (sin GMT) puede atribuirse potencialmente a las propiedades antiapoptoticas asi como angiogenicas de VEGF, en la promocion de la viabilidad y/o funcion de celulas de la zona de borde (Daskalopoulos et al., Microsc. Microanal., 18(1): 35-49 (2012); Fedak et al., Circ. Heart Failure, 5(3): 349-356 (2012); van den Borne et al., Nature Rev. Cardiol., 7(1): 30-37 (2010); Chen et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 291(4): H1653-1658 (2006); Yang et al.,

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J. Appl. Physiol., 93(3): 1140-1151 (2002); Zhang et al., Circulation, 119(13): 1776-1784 (2009); Song et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 354(4): 999-1003 (2007); Claes et al., Cardiovasc. Res., 91(3): 369-370 (2011)).

Los metodos de la divulgacion pueden combinarse con cualquier otro tratamiento conocido para la arteriopatia coronaria, tal como terapias farmacologicas o procedimientos quirurgicos/de intervencion. Las terapias farmacologicas incluyen farmacos antiplaquetarios y anticoagulantes, betabloqueants, inhibidores de ACE, nitratos y bloqueantes de canales de calcio. Los procedimientos de intervencion y las cirugias incluyen injerto de derivacion de arterias coronarias (comunmente denominada derivacion o CABG), que se reserva habitualmente para pacientes con arteriopatia coronaria grave, e intervencion coronaria percutanea (comunmente denominada angioplastia o PCI), que implica normalmente la colocacion de una endoprotesis de arteria coronaria.

El siguiente ejemplo ilustra adicionalmente la invencion pero, por supuesto, no debe interpretarse que limita en ningun modo su alcance.

EJEMPLO 1

Este ejemplo demuestra la administracion de VEGF mediado por adenovirus a miocardio infartado tras la administracion mediada por lentivirus de los factores de transcripcion de reprogramacion celular Gata 4, Mef 2c y Tbx5 (GMT).

Vectores y celulas: Se uso un vector de adenovirus (AdVEGF-All6A+) basado en la estructura principal del serotipo Ad5 con deleciones en las regiones E1 y E3 y que contenia un casete de secuencia de corte y empalme artificial para proporcionar la administracion de las tres isoformas principales de VEGF (121, 165 y 189) (Amano et al., Mol Ther., 12(4): 716-724 (2005)). Se uso un constructo analogo con un casete de expresion vacio (AdNull) como vector control.

Se construyeron vectores de lentivirus para proporcionar la expresion de Gata4, Mef2c y Tbx5 (GMT) en tejidos de miocardio seleccionados como diana. Para la construccion del vector de GMT, se aislo en primer lugar ARN de corazon de rata usando reactivo TRIzol (Invitrogen) y se convirtio en ADNc usando un kit de transcripcion inversa (Roche). Se usaron estas muestras (para Mef2c) o ADNc disponible comercialmente (para Gata4 y Tbx5; AddGene) para amplificar secuencias codificantes relevantes usando cebadores basados en las secuencias codificantes de nucleotidos de PubMed para estos tres transgenes (tabla 1) (leda et al., Cell, 142(3): 375-386 (2010); Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012)). Se disenaron los cebadores para que incluyeran un sitio de union Sal1 en 5’ y un sitio de restriccion Xho1 en 3’ de cada secuencia codificante. Se amplificaron los insertos genicos usando un kit de PCR (Roche) y se clonaron en el vector pENTR3C antes de la recombinacion homologa en el vector F12-CMV (Invitrogen) bajo el control de un promotor de CMV. F12-CMV tambien incluye un casete de eGFP bajo el control de un promotor de ubiquitina para el analisis de la eficacia y el linaje.

Tabla 1. Cebadores usados para la construccion de plasmidos

Nombre del cebador

Secuencia Tm

Gata4 5’

GGCGGTCGACATGTACCAAAGCCTGGCTATG (SEQ ID NO: 1) 72,6

Gata4 3’

GATTCTCGAGTACGCGGTGATTATGTCCCCATG (SEQ ID NO: 2) 70,9

Mef2c 5’

GGACTGTCGACATGGGGAGAAAAAAGATTCAG (SEQ ID NO: 3) 68,5

Mef2c 3’

TGTGACTCGAGTCATGTTGCCCATCCTTCAGAGAG (SEQ ID NO: 4) 71,7

Tbx5 5’

CACCGTCGACATGGCCGACGCAGATGAG (SEQ ID NO: 5) 73,4

Tbx5 3’

CCTTCTCGAGTCAAGCTATTCTCGCTCCACTCTG (SEQ ID NO: 6) 71,9

Los plasmidos Gata4, Mef2c y Tbx5 F12-CMV asi generados se transfectaron en la linea celular de fibroblastos de rinon humano 293T (ATCC) junto con el sistema de entrada usando los plasmidos pMD2G y psPAX por medio del reactivo LIPOFETAMINE™ 2000 (Invitrogen). Se aislo el sobrenadante de portaba virus y se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugacion y filtracion con jeringa (tamano de poro de 0,45 pm; Sarstedt). Se concentro adicionalmente el virus mediante centrifugacion (2 h a 10.000 x g) y entonces se aspiraron los sobrenadantes y se diluyeron los sedimentos en diluyente viral (sacarosa al 3%, Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM).

Se sembraron en placa fibroblastos dermicos derivados de biopsias de 1 cm2 de la piel abdominal de ratas Fischer 344 sobre placas de plastico (Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 106(3): 808-813 (2009); Ieda et al., Cell, 142(3): 375-386 (2010)). Se cultivaron los fibroblastos unidos durante 7 d en medio DMEM/fBs al 10% a 104/cm2. Entonces volvieron a sembrarse en placa las celulas y se infectaron con vectores apropiados tras 24 h. Se obtuvieron cardiomiocitos a partir de los ventriculos neonatales de ratas Sprague Dawley (regalo de E. Entcheva) que se cortaron en pequenos trozos y se digirieron con disolucion de colagenasa de tipo II. Entonces se obtuvo una suspension de celulas individuales de cardiomiocitos primarios mediante pase suave a traves de un colador de celulas de 40 pm y se sembraron en placa las celulas sobre placas tratadas de cultivo tisular (Thermo Scientific).

Estudios de inmunofluorescencia (IF) in vitro: Se anadieron lentivirus que codificaban para vectores de GMT o

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control de GFP en presencia de POLIBRENE™ (Millipore) 8 pg/ml a medio de cultivo de fibroblastos dermicos de rata (DMEM + FBS al 10%) durante 16 h. Entonces se retiro este medio y se permitio que las celulas se transdiferenciaran en condiciones de cultivo normales a lo largo de un transcurso de tiempo de 14 d. Se lavaron estas celulas dos veces con solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con paraformaldehido al 4% (Affymetrix) durante 10 min. Se permeabilizaron entonces las celulas con saponina al 0,5% (Sigma) a temperatura ambiente durante 10 min. Se bloquearon los portaobjetos con suero de cabra al 10% (Santa Cruz) antes de la incubacion en suero de cabra al 5% con anticuerpos primarios dirigidos hacia troponina cardiaca T (cTnT; Abcam), cadena pesada de miosina beta 7 (MYH7; Sigma) o actinina sarcomerica a (Sigma). A los anticuerpos primarios se les unio anticuerpo secundario fluorescente (647 nm; Alexafluor), y se visualizo la fluorescencia usando un microscopio fluorescente/de fase invertida Ti-S con un sistema de camara digital de 2.0 megapixeles enfriada SPOT (Nikon).

Clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS): Para analisis de FACS, se lavaron las celulas con PBS y se trataron con tripsina al 0,05% (Gibco). Entonces se sedimentaron estas celulas y se permeabilizaron con saponina al 0,1% durante 30 min a 4°C, volvieron a sedimentarse y se suspendieron en suero de cabra al 5%, y se incubaron con anticuerpos primario relevantes seguido por incubacion con un anticuerpo secundario fluorescente (647 nm; Alexafluor). Se fijaron las celulas con paraformaldehido al 1% y se analizaron para determinar la fluorescencia usando el software Cell Quest V3.3 en un citometro de flujo FACS Calibur (Becton/Dickinson) (leda et al., Cell, 142(3): 375-386 (2010); Efe et al., Nature Cell. Bio., 13(3): 215-222 (2011); Qian et al., Nature, 485(7400): 593-598 (2012)).

Infarto de miocardio en un modelo animal: Se creo un infarto de miocardio mediante ligacion coronaria, tal como se describio anteriormente, en ratas Fischer 344 macho adultas (275-300 g; Harlan; Indianapolis, EN), usando protocolos aprobados por la State University de Nueva York, Stony Brook Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Retuerto et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 127(4): 1041-1049 (2004); Retuerto et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 133(2): 478-484 (2007)). Se alojo a los animales, se utilizaron y se cuidaron en instalaciones gestionadas por la Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) en la Stony Brook University, que esta totalmente acreditada por la Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International.

En primer lugar se anestesiaron los animales con isofluorano al 4% en una caja de induccion, se incubaron y se colocaron en un ventilador para roedores (Harvard Apparatus) usando inhalacion de isofluorano (3,5%) complementado con oxigeno. Se administro lidocaina (4 mg/kg) por via intramuscular. Entonces se realizo una toracotomia izquierda, y se ligo la arteria coronaria izquierda de 1 a 2 mm desde su origen con una sutura de polipropileno 7-0. Esta preparacion produce de manera sistematica un infarto de miocardio (IM) antero-apical macroscopico (palido) con <20% de mortalidad.

En el momento de la ligacion coronaria, se administraron cinco inyecciones de 20 pl distribuidas uniformemente que contenian cada una 2 x108 pu (dosis total de 1 x109) de Ad VEGF-All6A+ o AdNull (n=12/grupo) alrededor de la zona de infarto, identificada como un area de blanqueo en la pared anterolateral del ventriculo izquierdo, por operarios ciegos al grupo de tratamiento. Entonces se cerro por sutura el torax capa a capa, y se colocaron los animales en una camara calentada y se permitio que se recuperaran bajo supervision. Se les administro ketorolaco (3-5 mg/kg) y buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por via subcutanea en el momento del cierre y cada 12-24 h tras la operacion segun se necesitase, determinado por el nivel de actividad que presentaban los animales.

Se realizo una segunda toracotomia 3 semanas despues, y los animales que recibieron anteriormente AdVEGF- All6A+ o AdNull cada uno se sometieron entonces a administracion en la zona de infarto de 1x105 TU de lentivirus (5 inyecciones de 20 pl distribuidas uniformemente) que codificaban para Gata4, Mef2c o Tbx5 acoplados a un marcador de GFP, o que codificaban para GFP solo (final n=6/grupo). Se recuperaron de nuevo los animales tal como se describio anteriormente. Se realizo posteriormente la eutanasia 4 semanas mas tarde mediante anestesia con isoflurano profunda (4%) seguido por exsanguinacion, consecuente con las directrices de AVMA.

Ecocardiografia: Se realizo la ecocardiografia bajo anestesia ligera con isoflurano al 3% usando un sistema de obtencion de imagenes Veno 770™ (VisualSonics Inc., Toronto, ON, Canada) en cinco puntos de tiempo diferentes: antes de y 3 d despues de la ligacion coronaria y AdVEGF-All6A+ o AdNull, en el momento de la administracion de GMT o GFP 21 d mas tarde (nivel inicial), y luego 2 semanas y 4 semanas mas tarde despues del nivel inicial (dia 35 y dia 49 tras la ligacion, respectivamente) (Retuerto et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 127(4): 1041-1049 (2004); Retuerto et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 133(2): 478-484 (2007)). Se obtuvieron imagenes ecocardiograficas del ventriculo izquierdo en vistas tanto del eje corto como del eje largo paraesternal por investigadores ciegos al grupo de tratamiento. Se midieron los diametros sistolico final y diastolico final del ventriculo izquierdo y el grosor posterior y del tabique del ventriculo izquierdo (en las fases tanto sistolica final como diastolica final) a partir de los trazos en modo M. Se analizaron entonces estos datos de obtencion de imagenes por investigadores ciegos al grupo de tratamiento. Se calculo el cambio en la fraccion de eyeccion (FE) como: (FE en el dia 49) - (FE en el dia 21)] / (FE en el dia 21).

Analisis histologicos: Para obtener muestras de tejido cardiaco, se exsanguinaron los animales bajo anestesia

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profunda por medio de una incision realizada en la auricula derecha. Mientras que el corazon todavia estaba latiendo, se perfundio con solucion salina normal y se fijo con solucion salina tamponada con fosfato (pH 7,2) que contenia paraformaldehido al 4% (p/v) por medio de una aguja de calibre 25 insertada en el vertice ventricular izquierdo. Entonces se recogio el corazon y se enjuago con solucion salina para quitar la sangre. Se fijaron los corazones extirpados con paraformaldehido al 4% durante 24 h, y luego paraformaldehido al 2% durante 48 h a 4°C. Entonces se corto el corazon transversalmente y se secciono para obtener dos cortes (2-3 mm), uno inmediatamente cefalico y uno inmediatamente caudal con respecto a la linea central transversal de la region de infarto, que era facilmente identificable por inspeccion macroscopica. Tras la incrustacion en parafina de estos cortes, se obtuvieron siete secciones de 5 pm de grosor a intervalos de 90 pm.

Para los analisis de la reprogramacion celular in vivo, se tineron los portaobjetos para microscopio de cada seccion alterna tal como se describio anteriormente con anticuerpos primarios contra la cadena pesada de miosina beta 7 (anti-MYH7, Sigma), luego se incubaron con anticuerpo frente a IgG secundario. Cinco campos microscopicos por portaobjetos (en el centro de la zona de infarto, en las areas medias entre el centro de la zona de infarto y la de borde [izquierdo y derecho], y en cada zona de borde adyacente al infarto [izquierdo y derecho]) observados a 200X aumentos se clasificaron de manera semicuantitativa con el fin de determinar la densidad de celulas MYH7+. La clasificacion de la densidad evaluada por un investigador ciego al grupo de tratamiento se definio tal como sigue: grado I: < 25% de del campo microscopico seleccionado muestra celulas MYH7+; grado II: el 25%-50% del campo microscopico seleccionado muestra celulas MYH7+; grado III: el 50%-75% del campo microscopico seleccionado muestra celulas MYH7+; y grado IV: >75% del campo microscopico seleccionado muestra celulas MYH7+ (figura 7).

Estas observaciones se notifican como el porcentaje de campos por animal que muestran un grado de densidad dado, y la media de estos porcentajes por grupo para todos los animales con al menos diez campos analizables dentro de una zona de infarto.

Para evaluar la extension de la fibrosis, se tineron 22 secciones por animal (a un intervalo de 120 pm entre cada seccion) obtenidas tal como se describio anteriormente con tincion tricromica de Masson. Se esbozaron el area fibrotica (color azul) y la region no fibrotica (color rojo) usando el software Adobe PHOTOSHOP™ CS5, y luego se cuantificaron con el software MATLAB & SIMULINK (Math Works, Inc). Se calculo el area total de fibrosis como: [total de pixeles de color azul de todas las secciones / total de pixeles de color azul mas rojo de todas las secciones].

Para la identificacion de miofibroblastos, se tineron dos secciones por animal que mostraban el mayor area de seccion transversal de fibrosis, tal como se determino mediante tincion tricromica, para detectar actina de musculo liso a (anticuerpo anti-actina de musculo liso, Spring Bioscience [a-SMA]). Se contaron las celulas positivas para a- SMA en estas secciones excluyendo las encontradas en estructuras vasculares o endocardio a 200X aumentos.

Para estudios de vascularizacion, se determino el numero de vasos por campo microscopico a partir de las secciones tenidas como anteriormente con a-SMA, o con factor VIII (anticuerpo anti-antigeno relacionado con factor VIII, Ventana) y se contaron a 200X o 400X, respectivamente.

Analisis estadistico: Se realizo el analisis estadistico con SAS, 9.2. Los datos se presentan como media ± error estandar de la media. Se examino la normalidad de los datos con Shapiro-Wilk. Cuando habia una distribucion normal, se realizo una prueba de ANOVA para detectar significaciones estadisticas entre multiples grupos. Cuando la prueba de ANOVA mostro significacion, se realizo una prueba de la t de Student con una correccion de Holm- Bonferroni a posteriori. Cuando no habia una distribucion normal, se realizo una prueba de Kruskal-Wallis. Cuando la prueba era significativa, se realizo la prueba de rangos de Wilcoxon con una correccion de Holm-Bonferroni a posteriori. Para variables categoricas, se realizo una prueba exacta de Fischer. Valores de p <0,05 se consideraron estadisticamente significativos.

Generacion de iCM in vitro: Se confirmo la competencia de cada uno de los lentivirus de GMT mediante ensayos de infeccion de celulas in vitro, que demostraron la expresion de los tres factores de transcripcion de reprogramacion (figura 1). La confirmacion de la capacidad de estos factores de transcripcion para inducir transdiferenciacion de iCM se obtuvo mediante tincion de inmunofluorescencia de fibroblastos dermicos de rata tras la transduccion lentiviral de GMT. En estos estudios, celulas expuestas a vectores de GMT expresaban marcadores especificos de cardiomiocitos incluyendo troponina cardiaca T (cTnT), actina sarcomerica alfa y cadena pesada de miosina beta (MYH) 7, mientras que las celulas no infectadas y los fibroblastos expuestos solo a un vector control de GFP no pudieron expresar estos marcadores (figura 2A). Mediante cuantificacion por FACS, la infeccion con GMT demostro pruebas de expresion de marcadores de cardiomiocitos en aproximadamente el 7% de los fibroblastos infectados (figuras 2B-F).

Vascularizacion del miocardio infartado: La vascularizacion de la region de infarto tal como se evaluo mediante tincion de a-SMA era significativamente mayor en animales tratados con AdVEGF-All6A+ en comparacion con animales que recibieron un vector control de AdNull: 5,5 ± 0,9 frente a 3,3 ± 0,4, respectivamente; p < 0,05 (figura 3; figura 8). Se observo un aumento similar, de aproximadamente dos veces en vasos tenidos con factor VIII en animales que recibieron AdVEGF-All6A+ solo frente a los que recibieron AdNull solo (14,1 ± 2,1 frente a 7,3 ± 1,4, p

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< 0,05). Veanse tambien las figuras 10A-B.

Evaluacion histologica de los ventriculos tras el infarto: Con el fin de evaluar la eficacia de la administracion de GMT con o sin tratamiento previo con VEGF in vivo, se realizaron una serie de analisis histologicos en secciones del corazon obtenidas 4 semanas tras la administracion de GMT/GFP (7 semanas tras la ligacion coronaria y administracion de AdVEGF-All6A+/AdNull). Estos estudios demostraron una mayor densidad de celulas que se tenian para el marcador de cardiomiocitos MYH7 en la zona de infarto en animales tratados con gMt en comparacion con animales control (figuras 4A-D). Normalmente, los animales tratados con GMT mostraban islas relativamente grandes de celulas MYH7+, en comparacion con focos dispersos de MYH7+ en animales control.

Usando una escala de grado I - IV para evaluar semicuantitativamente la densidad de celulas con MYH7, los animales tratados con GMT mostraban una densidad de celulas con MYH7 de grado III/IV en la zona de infarto en un mayor porcentaje de campos microscopicos que los animales control de GFP, tanto en la zona de infarto como en las zonas de borde (tabla 2).

Tabla 2. Densidad de celulas MYH7+*

Grado IT Grado IIT Grado IIIT Grado IVT

Area de infarto

12±5 44 ± 8 30 ± 7 14 ± 5

AdVEGF-All6A+/GMT

AdNull/GMT

29 ± 13 41 ± 8 22 ± 7 8 ± 5

61 ± 14 34 ± 13 5 ± 3 0

AdVEGF-All6A+/GFP

AdNull/GFP +/

50 ± 14 40 ± 10 10 ± 6 0

Area de zona de borde

AdVEGF-All6AGMT

4 ± 3 29 ± 9 48 ± 10 19 ± 7

AdNull/GMT

14 ± 10 24 ± 7 38 ± 9 25 ± 10

30 ± 14 48 ± 11 21 ± 12 1 ± 1

AdVEGF-All6A+/GFP

AdNull/GFP

43 ± 13 32 ± 7 22 ± 10 3 ± 2

* Porcentaje de campos microscopicos analizados que muestran un grado de densidad (n=6 animales por grupo de tratamiento). T Grado I: < 25% de campo microscopico contienen celulas MYH7+: grado II: el 25% - 50% del campo microscopico contiene celulas MYH7+, grado III: el 50% - 75% del campo microscopico contiene celulas MYH7+; grado IV: > 75% del campo microscopico contiene celulas MYH7+. Todas las mediciones a 200X

El porcentaje de campos microscopicos que muestran una densidad de celulas con MYH7 de grado III/IV era significativamente mayor en animales tratados con GMT en comparacion con animales control tratados con GFP (el 36% ± 8% frente al 7% ± 4%, p < 0,01) en la zona de infarto y en las zonas de borde adyacentes a estas zonas de infarto (el 65% ± 10% frente al 23% ± 9%, p < 0,01). De manera notable, ninguna de las secciones mostro una densidad de celulas con MYH7 de grado IV en la zona de infarto en los grupos control de GFP. La administracion de AdVEGF-All6A+ no parecia alterar la densidad de celulas con MYH7 (figura 4E). Veanse tambien las figuras 11A-B.

La extension de la fibrosis en estas secciones, tal como se detecto mediante tincion tricromica, tambien se redujo significativamente en animales tratados con GMT en comparacion con los que recibieron GFP, independientemente de la administracion de VEGF (figura 5A). El area de seccion transversal de la fibrosis en estos grupos, como porcentaje del area del miocardio del ventriculo izquierdo total en las secciones analizadas, era del 12% ± 2% frente al 24% ± 3%, (p < 0,01). No se detectaron diferencias en la extension de la fibrosis en animales tratados con AdVEGF-All6A+ sin GMT en comparacion con controles de AdNull/GFP (figura 5B). Ademas, la administracion de AdVEGF-All6A+ no redujo adicionalmente la extension de la fibrosis en comparacion con animales tratados con GMT sin VEGF. Veanse tambien las figuras 12A-B.

De manera consecuente con la reduccion en la fibrosis detectada en animales tratados con GMT, hubo una disminucion de aproximadamente cuatro veces en el numero de miofibroblastos observados en animales tratados con GMT en comparacion con animales control, independientemente de la administracion de VEGF (figura 5C; figura 9).

Mejora en la funcion ventricular tras la administracion de GMT y VEGF: Se realizo ecocardiografia para evaluar las implicaciones funcionales de los resultados observados anteriormente. Los analisis ecocardiograficos realizados antes e inmediatamente despues de la ligacion coronaria demostraron que la fraccion de eyeccion se redujo en aproximadamente el 30% con respecto a los valores de nivel inicial (figura 6A). Esta disminucion en la funcion cardiaca persistia 3 semanas despues, en el momento de la administracion de lentivirus de GMT o GFP.

Tal como se detalla en la tabla 3, la fraccion de eyeccion media 4 semanas tras la administracion de GMT o GFP era la mayor para animales que recibieron administracion de GMT con tratamiento previo con AdVEGF-All6A+ (AdVEGF- All6A+/GMT), siendo significativamente mayor que en animales que recibieron o bien AdVEGF-All6A+ sin GMT (AdVEGF-All6A+/GFP; p < 0,05) o bien ambos vectores control (AdNull/GFP; p < 0,05).

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Tabla 3. Medias de grupos de la fraccion de eyeccion tal como se evalua mediante ecocardiografia*

Tiempo (dias)T

Grupo

0 3 21 35 49

AdVEGF-All6A+/GMT

75 ± 2 55 ± 3 54 ± 2 65 ± 2 Xn CNJ +1 CO CO

AdNull/GMT

75 ± 1 56 ± 3 53 ± 2 61 ± 3 56 ± 2i

AdVEGF-All6+/AGFP

76 ± 1 51 ± 3 51 ± 2 53 ± 4 51 ± 2§#*

AdNull/GFP

74 ± 1 51 ± 2 53 ± 3 52 ± 8 48 ± 2#

Todos los datos expresados como un porcentaje de la fraccion de eyeccion (n=6 animales por grupo de tratamiento)

T Dia 0 representa el momento de la ligacion coronaria y administracion de AdVEGF-All6A o AdNull; dia 21 representa el momento de la administracion de lentivirus que codifica para GMT o GFP

* AdVEGF-All6A+/GMT frente a AdNull/GFP en el d 49: p < 0,05

§ AdVEGF-All6A+/GMT frente a AdVEGF-All6A+/GFP en el d 49: p < 0,05 ii AdVEGF-All6A+/GMT frente a AdNull/GMT en el d 49: p = 0,08

# AdVEGF-All6A+/GFP frente a AdNull/GFP en el d 49: p = 0,86________________________________________

Se hicieron observaciones similares para las diferencias entre grupos en acortamiento fraccional (tabla 4).

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Tabla 4. Metricas de la funcion ventricular tal como se evalua mediante ecocardiografia*

Parametro

Tiempo (dias)T*

Volumen diastolico final+/

0 3 21 35 49

AdVEGF-All6AGMT

217 ± 7 181 ± 13 215 ± 17 222 ± 21 234 ± 25

AdNull/GMT

206 ± 8+/ 147 ± 18 239 ± 12 208 ± 16 231 ± 23

AdVEGF-All6A+/GFP

192 ± 11+/ 197 ± 11 302 ± 30 240 ± 32 280 ± 32

AdNull/GFP

207 ± 13 193 ± 19 262 ± 17 265 ± 32 252 ± 26

Volumen sistolico final

AdVEGF-All6§/AGMT

54 ± 5 80 ± 7 99 ± 10 80 ± 11 84 ± 7

AdNull/GMT

51 ± 2 65 ± 5 112 ± 10 81 ± 10 105 ± 14

AdVEGF-All6A§/GFP

47 ± 3 97 ± 8 148 ± 17 117 ± 23 139 ± 20

AdNull/GFP

54 ± 4 95 ± 11 123 ± 11 131 ± 23 134 ± 18

Acortamiento fraccional

AdVEGF-All6AGMT

45 ± 2 30 ± 2 29 ± 1 36 ± 2 35 ± 1 ii#

AdNull/GMT

45 ± 1 29 ± 2 28 ± 1 34 ± 2 30 ± 1""

AdVEGF-All6AGFP

46 ± 1 27 ± 2 27 ± 1 28 ± 2 27 ± 1 i

AdNull/GFP

44 ± 1 27 ± 1 28 ± 2 27 ± 2 25 ± 1#**

*Todos los datos expresados como un porcentaje de la fraccion de eyeccion (n=6 animales por grupo de tratamiento) T Dia 0 representa el momento de la ligacion coronaria y administracion de AdVEGF-All6A o AdNull; dia 21 representa el momento de la administracion de lentivirus que codifica para GMT o GFP * Sin diferencia significativa entre grupos en cualquier intervalo de tiempo. §AdVEGF-All6A+/GMT frente a AdNull/GMT: p = 0,08 »AdVEGF-All6A+/GMT frente a AdVEGF-All6A+/GFP: p < 0,01 #AdVEGF-A116A+/GMT frente a AdNull/GFP: p < 0,0001 **AdNull/GMT frente a AdNull/GFP: p = 0,07

Cuando se agrupan juntos independientemente de la administracion de AdVEGF previa, los animales tratados con 15 GMT mostraron una fraccion de eyeccion media significativamente mayor en comparacion con animales control de GFP combinados de manera similar, tanto a las 2 semanas como a las 4 semanas tras la administracion de lentivirus (2 semanas: el 63% ± 2% frente al 52% ± 2%, p < 0,01); 4 semanas: el 60% ± 2% frente al 49% ±2%, p < 0,001). En comparacion, no se observaron diferencias en la fraccion de eyeccion tras la administracion de AdVEGF-All6A+ solo (sin GMT) frente a animales que recibieron vectores control.

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El cambio en la fraccion de eyeccion desde el momento de nivel inicial de administracion de lentivirus hasta el momento de la ecocardiografia de seguimiento 4 semanas mas tarde (figura 6B, panel superior) era tambien mayor en los grupos de GMT frente a GFP (el 12% ± 3% frente al -7% ± 3%, p < 0,01). Ocho (73%) animales tratados con GFP, pero ninguno de los animales con GMT, mostraron una fraccion de eyeccion disminuida durante este intervalo

Claims (11)

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2. 2.

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3. 3.

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9. 10.

   45 11.
10. 12.

    50
11. 13.

    55 14.

    REIVINDICACIONES

    Combinacion de vectores que comprende

    (a) un primer vector viral que codifica para una o mas proteinas angiogenicas que inducen vascularizacion en el corazon del mamifero, y

    (b) un segundo vector viral que codifica para uno o mas factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca que inducen la produccion de cardiomiocitos inducidos (iCM) en el corazon del mamifero

    para su uso en un metodo de tratamiento de arteriopatia coronaria en un mamifero, en la que el primer y segundo vector se administran al corazon del mamifero.

    Combinacion de vectores para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la proteina angiogenica es uno o mas de VEGF, FGF, PGF, NRP-1, ANG, PDGF, TGF-p, MCP-1, efrina, activador de plasminogeno o inhibidor de activador de plasminogeno, eNOS, COX-2, cD1 33, MMP y DLL44.

    Combinacion de vectores para su uso segun la reivindicacion 1, en la que la proteina angiogenica es VEGF.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que el factor de transcripcion de diferenciacion cardiaca es uno o mas de Hopx, Nkx2-5, Hrt2, Pitx2, Smyd1, Myocd, Baf60c, Tbx5, Srf, Gata4, Isl1, Mef2c, Hand2 o Mesp1.

    Combinacion de vectores para su uso segun la reivindicacion 4, en la que los factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca son Gata4, Mef2c y Tbx5 (GMT).

    Combinacion de vectores para su uso segun las reivindicaciones 1-5, en la que los vectores virales son vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores basados en VIH, vectores basados en VHS, vectores basados en adenovirus, vectores basados en parvovirus, vectores basados en VAA o vectores quimericos de VAA-adenovirus.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que el primer vector es un vector adenoviral, en la que opcionalmente el vector adenoviral es de serotipo 5 y tiene deleciones en las regiones E1 y E3.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el segundo vector es un vector lentiviral.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que el primer vector y el segundo vector se administran a una cicatriz miocardica o region del corazon periinfartada.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que la arteriopatia coronaria es infarto de miocardio.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, mediante lo cual se mejora la funcion ventricular del corazon del mamifero.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que los iCM se derivan de fibroblastos miocardicos.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que el primer vector se administra antes del segundo vector, de manera opcional aproximadamente 3 semanas antes del segundo vector, o en la que el primer vector se administra al mismo tiempo que el segundo vector.

    Combinacion de vectores para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que el primer vector es un vector adenoviral, el segundo vector es un vector lentiviral, la proteina angiogenica es VEGF, y los factores de transcripcion de diferenciacion cardiaca son Gata4, Mef2c y Tbx5 (GMT).