JP2023515672A

JP2023515672A - 心筋細胞発現マイクロｒｎａによる遺伝子ベクター制御

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Publication number: JP2023515672A
Application number: JP2022552551A
Authority: JP
Inventors: ローラロンバルディ，; エレナシー．レオン，; タウニーニールクレシ，; キャスリンエヌ．アイビー，
Original assignee: テナヤセラピューティクス，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2023-04-13
Also published as: KR20220149590A; AU2021230476A1; IL295989A; BR112022017551A2; CA3173567A1; EP4114421A1; CN115552022A; US20230103731A1; WO2021178246A1

Abstract

本開示は、マイクロＲＮＡ結合部位を使用して導入遺伝子（例えば、心筋細胞リプログラミング因子）の発現を細胞型特異的に抑制するためのベクター及びそれらの使用方法を提供する。本発明は、一般に、導入遺伝子（例えば、心筋細胞リプログラミング因子）の発現を細胞型特異的に抑制するためのベクター及びそれらの使用方法に関連する。本開示は、心臓線維芽細胞と比較して、心筋細胞及び心筋前駆細胞における導入遺伝子（例えば、心筋細胞リプログラミング因子）の発現の特異的抑制を促進するように構成されたマイクロＲＮＡ結合部位を含むベクターを提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年３月２日に出願された米国仮特許出願第６２／９８４，１８３号に対する優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されており、．ｔｘｔ形式で電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、２０２１年２月２５日に作成された、サイズが２３０キロバイトの「ＴＥＮＡ＿０１７＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルの配列表が含まれている。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は、一般に、遺伝子療法ベクターに関する。

心臓のダイレクトリプログラミングは、新しい心筋細胞を作成するための戦略として浮上しており、心筋症、心不全、又はその他の心臓病と診断されたか、又はその危険性がある患者において心機能の改善をもたらす。遺伝的及び化学的リプログラミング因子の様々な組み合わせが、他の細胞（例えば、線維芽細胞）の心臓細胞（特に、心筋細胞）へのリプログラミングを促進することが示されている。例えば、３つの心臓発生転写因子－ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（ＧＭＴ）の組み合わせを使用して、マウスにおいて、真皮又は心臓線維芽細胞を誘導心筋細胞（ｉＣＭ）様細胞にリプログラムすることができる。ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＭＥＳＰ１、及びＭＹＯＣＤ（ＧＭＴＭＭ）は、因子のカクテルとして一緒に発現されると、細胞の形態を紡錘状から棒状に変化させ、細胞が自発的なＣａ^２＋振動を示すようにする。ＨＡＮＤ２、ＮＫＸ２．５、マイクロＲＮＡのｍｉＲ－１及びｍｉＲ－１３３、ＪＡＫ又はＴＧＦ－βは、このようなリプログラミングを促進することが示されている。ヒトでは、ＧＭＴにＥＴＳ２及びＭＥＳＰ１を添加すると、心臓特異的な遺伝子発現及びサルコメア形成が誘導される。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ及びＤｅＷｉｔｔ．Ｃｅｌｌ１６６：１３８６－９６（２０１６）で概説されているように、ダイレクトリプログラミングのための因子の他の組み合わせが当技術分野で説明されている。
しかしながら、ベクター又はベクター系などの代替的及び改良されたリプログラミング方法並びにそれらの方法を実施するための手段に対する必要性が、当技術分野において依然として存在する。本開示は、このアンメットニーズに対処する。

Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ及びＤｅＷｉｔｔ．Ｃｅｌｌ１６６：１３８６－９６（２０１６）

本発明は、一般に、導入遺伝子（例えば、心筋細胞リプログラミング因子）の発現を細胞型特異的に抑制するためのベクター及びそれらの使用方法に関連する。本開示は、心臓線維芽細胞と比較して、心筋細胞及び心筋前駆細胞における導入遺伝子（例えば、心筋細胞リプログラミング因子）の発現の特異的抑制を促進するように構成されたマイクロＲＮＡ結合部位を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、心臓線維芽細胞の心筋細胞へのリプログラミングを誘導する有効量の組成物で心臓線維芽細胞を処理し、プログラミングプロセス中で発現し、任意選択的に、リプログラミングプロセスの後期に発現される同定されたマイクロＲＮＡに対して、心臓線維芽細胞における１つ以上のマイクロＲＮＡの発現を測定することによって、選択される。いくつかの実施形態において、選択されたマイクロＲＮＡは、所定の時間後にのみ、心臓線維芽細胞で発現される。いくつかの実施形態において、組織及び細胞型特異的な発現の抑制は、非標的細胞型（例えば、心筋細胞）における発現を抑制しながら、標的細胞型（例えば、心臓線維芽細胞）における発現を可能にする。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、標的細胞の非標的細胞への効果的な変換を引き起こすのに十分な時間、標的細胞における発現を可能にする。

一実施形態によるベクターマップを示す。ＭＯＩ１６０ｋのＡＡＶによるｉＰＳＣ－ＣＭ形質導入の４日後、フローサイトメトリー分析により評価されたＧＦＰ導入遺伝子発現の抑制を示す。ＭＯＩ１６０ｋのＡＡＶによるｈＣＦ形質導入の４日後、フローサイトメトリー分析により評価されたＧＦＰ導入遺伝子発現の抑制の欠失を示す。ＭＯＩ５００ｋのＡＡＶによるｉＰＳＣ－ＣＭ形質導入の４日後、フローサイトメトリー分析により評価されたＧＦＰ導入遺伝子発現の抑制を示す。ヒトｉＰＳＣ－ＣＭと比較した、Ｍｙ^Δ３Ａリプログラミングカクテルで処理した後にｑＰＣＲで測定したマイクロＲＮＡの発現レベルを示す。ＡＡＶ（ＭＯＩ５００ｋ）による形質導入の４日後のｉＰＳＣ－ＣＭのフローサイトメトリー分析を示す。ＡＡＶ（ＭＯＩ１６０ｋ）による形質導入の２日後のｈＣＦのフローサイトメトリー分析を示す。ＭＯＩ６４０ｋのＡＡＶによるリプログラミングの３週間後の免疫蛍光分析を示す。ｍｉＲ－２０８標的カセットを伴うＭｙ^Δ３Ａが、研究の過程を通じて、駆出率％の動的心エコー検査データによって、心筋梗塞に対して有効であることを示す。注射後８週目でのインビボ試験終了時の心エコーデータを示し、ＧＦＰをコードする陰性対照と比較して全ての群で有意な増加を示している（ｎ＝１０～１３マウス／群）。筋肉が赤く染色され、線維性組織が青く染色されるトリクローム染色に基づく線維化の分析を示す。全ての群にわたって線維性である心臓の横断面の％の定量化は、全ての処置群で有意な減少を示した（ｎ＝６～８心臓／群、５断面／心臓）。陰性対照及びＡＡＶ５ｚ：Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４の代表的なトリクローム染色された心臓横断面を示す。注射後９週目までの、虚血性損傷のある処置ブタ及び未処置ブタの駆出率％における変化のグラフを示すＡＡＶ（ＭＯＩ５００ｋ）による形質導入の４日後のｉＰＳＣ－ＣＭのフローサイトメトリー分析を示す。注射後４週目のラットの虚血性損傷研究における駆出率パーセントのグラフを示す

本発明者らは、遺伝子療法ベクター内に選択されたマイクロＲＮＡ結合部位を含めることにより、ベクターの細胞型特異性を高めることができることを認識した。本開示のベクターは、心筋細胞又は心筋前駆細胞で発現されるマイクロＲＮＡに対する結合部位を利用して、それらの細胞型における導入遺伝子の発現を抑制する。これらのベクターは、インビボ遺伝子療法の有効性及び／又は安全性を高める可能性がある。いくつかの実施形態において、発現は、標的細胞型において許容及び／又は維持される一方で、他の細胞型（例えば、骨格筋）において抑制される。いくつかの実施形態において、標的細胞型は、心臓線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞型は、心筋細胞にリプログラミングできる細胞である（例えば、インビボ細胞リプログラミングのための）。いくつかの実施形態において、標的細胞型は、遺伝子の機能喪失変異による機能欠陥を有する細胞である（例えば、遺伝子置換療法のための）。本開示のベクターのいくつかの実施形態は、リプログラミングプロセスの後期に発現されるマイクロＲＮＡに対するマイクロＲＮＡ結合部位を利用する。そのような実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位の選択により、早期の発現抑制なしに、ベクターからの心筋細胞リプログラミング因子の発現が可能になる。

本開示は、例えば細胞を心筋細胞に直接リプログラミングすることによって、非心筋細胞から心筋細胞を生成するための組成物及び方法を更に提供する。細胞を心筋細胞にリプログラムする力が限られている、又はそのような力がない選択されたマイクロＲＮＡの能力は、選択されたマイクロＲＮＡがＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１、又はＭＹＯＣＤ単独とともに発現される場合に増加する。更に、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、又はＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１が細胞を心筋細胞にリプログラムする能力は、選択されたマイクロＲＮＡの発現によって増加する。したがって、本開示は、ＭＹＯＣＤ及びマイクロＲＮＡを発現することができる、又はＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、及びマイクロＲＮＡを発現することができる組成物、並びにそれらの使用方法を提供する。有利なことに、分化細胞（例えば、線維芽細胞）の心筋細胞へのリプログラミングは、これらの因子単独の発現と比較して増強される。

本開示は、マイクロＲＮＡ、ＭＹＯＣＤタンパク質、及び任意選択的にＡＳＣＬ１タンパク質を集合的にコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、ベクターなどの組成物を提供する。単一のベクターが使用される場合、コーディングポリヌクレオチドは、ベクター内の任意の５’から３’の順で、及びベクター内の同じ又は異なるポリヌクレオチド鎖上に提供され得る。本開示は更に、２つ以上のベクターから構成されるベクター系を提供する。一部のベクターはポリシストロン性ベクター、例えば、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１又はＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含むベクターなどであるが、これらに限定されない２Ａ結合ポリシストロン性ベクターである。

ベクターには、脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込みレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、及び非組み込みＬＶＶなどであるが、これらに限定されないウイルスベクター及び非ウイルスベクターが含まれる。ポリヌクレオチドの各々は、任意選択的に、対応する遺伝子の天然のヒトポリヌクレオチド配列と配列同一性を共有するか、又は対応する天然のヒトタンパク質と同一又は配列同一性を共有するタンパク質をコードする異種配列を有する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドによってコードされるＭＹＯＣＤタンパク質は、操作されたミオカルジンである。例えば、ＭＹＯＣＤは、そのサイズを縮小するがその機能を維持する内部欠失を含めるように設計される場合がある。

本開示は更に、前述のベクター及びベクター系を使用する方法を提供する。使用方法には、分化細胞において（インビボ又はインビトロで）心筋細胞表現型を誘導する方法、及び心臓病に罹患している、又は心臓病の危険性がある対象において心臓病を治療する方法が含まれる。本開示は更に、心臓病の治療に使用するための説明書付きのベクター及びベクター系を含むキットを提供する。

本開示は、他の細胞型をリプログラミングすることによるｉＣＭ細胞の生成（インビボ、インビトロ、又はエクスビボ）に関する方法及び組成物を提供する。特に、本発明者らは、分化した細胞、例えば線維芽細胞が、マイクロＲＮＡ並びにＭＹＯＣＤ及び／又はＡＳＣＬ１の発現によって心筋細胞にリプログラムされ得ることを発見した。

マイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子内の相補配列との塩基対合を介して、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する小さな非コードＲＮＡ分子である。標準命名法では、接頭辞「ｍｉＲ」の後にダッシュ及び数字が続く。「ｍｉＲ－」は、ｍｉＲＮＡの成熟形態を指す。「ｍｉｒ－」は、一次ｍＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）又は前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）を指し、「ＭＩＲ」は、それらをコードする遺伝子を指す。ほぼ同一の配列を持つｍｉＲＮＡには、追加の小文字で注釈が付けられている。起源の種は、３文字の接頭辞で指定される。例えば、ヒトは「ｈｓａ－」である。同一の成熟ｍｉＲＮＡにつながるが、ゲノム内の異なる場所にあるｍｉＲＮＡ遺伝子は、追加のダッシュ－数字の接尾辞、例えば、ｍｉＲ－１９４－１及びｍｉｒ－１９４－２で示される。天然のヒトｍｉＲＮＡは通常、１００ヌクレオチド超のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして転写され、これが処理されて、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡが形成され、これが更に処理されて、成熟ｍｉＲＮＡが形成される。

ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡをコードする配列を宿主細胞で活性なプロモーターに作動可能に連結することにより、ベクター、例えばウイルスベクターから発現させることができる。例えば、ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓのｐＭＸｓレトロウイルス発現ベクターは、推定上のヘアピン構造を維持しながら個々のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをクローニング及び発現するように設計されており、内因性プロセッシング機構及び調節パートナーとの生物学的に関連する相互作用を確実なものとし、適切に切断されたマイクロＲＮＡをもたらす。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡに加えて、各５’側又は３’側に約１５０ｂｐのそれ自体のフランキング配列を含んでもよく、又は当該技術分野で公知の方法に従って、同じ成熟ｍｉＲＮＡを生成するために異なるフランキング配列を使用することができる。目的のマイクロＲＮＡの例には、ｍｉＲ－１３３ａ－２、ｍｉＲ－１３３ａ－１、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－１－１、ｍｉＲ－１２９８、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１－２、ｍｉＲ－９２ａ－２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｍｉＲ－２０２、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－５０９－１、ｍｉＲ－５０９－２、ｍｉＲ－１２４－３、ｍｉＲ－１２４－２、ｍｉＲ－３７８ａ、ｍｉＲ－３７８ｅ、ｍｉＲ－３７８ｈ、ｍｉＲ－３７８ｉ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－６７１、ｍｉＲ－２４－１、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－３０２ｄ、ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－３０ｃ－２、及びｍｉＲ－１４６ｂが含まれる。成熟ｍｉＲＮＡを発現するために使用されるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列を表１に示す。成熟ｍｉＲＮＡ配列は大文字で示す。

ミオカルジン（ＭＹＯＣＤ）は、血清応答因子の平滑筋及び心筋特異的な転写コアクチベーターである。非筋肉細胞で異所性に発現すると、ＭＹＯＣＤは血清応答因子との会合によって平滑筋分化を誘導することができる。Ｄｕｅｔａｌ．ＭＹＯＣＤｉｓａｃｒｉｔｉｃａｌｓｅｒｕｍｒｅｓｐｏｎｓｅｆａｃｔｏｒｃｏｆａｃｔｏｒｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｐｒｏｇｒａｍｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２４２５－３７（２００３）。

Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅファミリーｂＨＬＨ転写因子１（ＡＳＣＬ１）は、主に、神経系、神経細胞、及び神経内分泌の発達におけるその役割で知られている。細胞のリプログラミングの文脈において、ＡＳＣＬ１は、非神経細胞の機能的ニューロンへの変換に関連する因子として当技術分野で知られている。実際、他のリプログラミング因子と組み合わせたＡＳＣＬ１の発現は、当技術分野では、心筋細胞のリプログラミングの逆効果である、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を心筋細胞表現型から神経細胞型（Ｔｕｊ１＋ｃＴｎＴ－）又は神経細胞様表現型（Ｔｕｊ１＋ｃＴｎＴ＋）に変換するために使用されている。対照的に、本開示は、ＡＳＣＬ１を使用して線維芽細胞からｉＣＭ細胞を生成することに由来する組成物及び方法を提供する。

Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、「機能的心筋細胞」という用語は、電気信号を送信又は受信できる分化した心筋細胞を指す。いくつかの実施形態において、心筋細胞は、活動電位及び／又はＣａ^２＋トランジェントなどの電気生理学的特性を示す場合、機能的心筋細胞であると言われる。

本明細書で使用される場合、「分化した非心臓細胞」は、成体生物の全ての細胞型に分化することができない（すなわち、多能性細胞ではない）細胞であり、心臓系統以外の細胞系統（例えば、神経細胞系統又は結合組織系統）の細胞を指すことができる。分化細胞には、多能性細胞、複能性細胞、単能性細胞、前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、より強力でない細胞は、より強力な細胞に関して「分化した」とみなされる。

本明細書で使用される場合、「タンパク質コード遺伝子」とは、ベクターの成分を指す場合、ベクターの機能に関連する遺伝子以外の、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。例えば、タンパク質コード遺伝子という用語は、リプログラミング活性を有するヒトタンパク質又はその機能的バリアントをコードするポリヌクレオチドを包含する。ベクターに関して「他のタンパク質コード遺伝子を含まないベクター」という語句は、ベクターが、列挙されている目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むが、多能性又は心筋細胞表現型のいずれかを促進することが当技術分野で知られている他のタンパク質などのリプログラミング活性を有する別のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まないことを意味することが意図される。「他のタンパク質コード遺伝子を含まないベクター」という語句は、ベクターの機能に必要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを除外せず、それは任意選択的に存在してもよく、タンパク質をコードしないポリヌクレオチドも除外しない。そのようなベクターは、非コードポリヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ分子（マイクロＲＮＡなど）をコードするポリヌクレオチドを含み得る。逆に、特定のタンパク質コード遺伝子のみが列挙されている場合、リプログラミングを更に促進するタンパク質をコードするタンパク質コード遺伝子など、他のタンパク質コード遺伝子が更に存在する可能性があることを意味する。

「体細胞」とは、生物の体を構成する細胞のことである。体細胞には、生物の器官、皮膚、血液、骨、及び結合組織を構成する細胞が含まれるが、生殖細胞は含まれない。

「心臓病理学」又は「心臓機能不全」という用語は互換的に使用され、心臓のポンプ機能の障害を指す。これには、例えば、収縮性の障害、弛緩能力の障害（拡張機能障害と呼ばれることもある）、心臓弁の異常又は不適切な機能、心筋の疾患（心筋症と呼ばれることもある）、狭心症などの疾患、心筋への不十分な血液供給を特徴とする心筋虚血及び／又は心筋梗塞、アミロイドーシス及びヘモクロマトーシスなどの浸潤性疾患、全体的又は局所的な肥大（例えば、ある種の心筋症又は全身性高血圧症で発生する可能性がある）、並びに心腔間の異常な伝達が含まれる。

本明細書で使用される「心筋症」という用語は、心臓が異常に肥大し、肥厚し、及び／又は硬化する、心筋（心臓の筋肉）の任意の疾患又は機能不全を指す。その結果、通常、心臓の筋肉が血液を送り出す能力が低下する。疾患又は障害の病因は、例えば、炎症性、代謝性、毒性、浸潤性、線維形成性、血液学的、遺伝性、又は原因不明であってもよい。心筋症には、虚血性（酸素欠乏に起因する）及び非虚血性の２つの一般的なタイプがある。

本明細書で使用される場合、「目的の遺伝子」という用語は、リプログラミング因子又はリプログラミング因子をコードする核酸を指す。例えば、リプログラミング因子がタンパク質である場合、目的の遺伝子は、文脈から明らかなように、タンパク質又は対応するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかである。目的の遺伝子の導入、投与、又は他の使用は、遺伝子、遺伝子産物、又は遺伝子産物の機能的バリアントの発現を増加させるか、又はそれらの活性を増加させる任意の手段を指すと理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、核酸（例えば、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ））として目的のポリヌクレオチド、例えば、ＡＳＣＬ１及び／又はＭＹＯＣＤをポリヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ））としての標的細胞に導入することを含む、ｉＣＭ細胞を生成する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、ウイルス、非ウイルスベクターにて、裸のポリヌクレオチド若しくはトランスフェクション試薬と複合体化したポリヌクレオチドと細胞を接触させることによって、又はエレクトロポレーションによってなどを含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている様々な手段のうちのいずれかで細胞に導入することができる。目的の遺伝子を核酸として使用することには、目的の遺伝子の発現若しくは活性の間接的な改変、例えば、内因性遺伝子をコードする遺伝子座の遺伝子編集、転写因子若しくは調節因子の発現、目的の遺伝子の低分子活性化因子を細胞に接触させること、又は核酸としての目的の遺伝子の発現若しくは活性を改変するためのＤＮＡ若しくはＲＮＡに基づく方法を含む遺伝子編集方法の使用を含んでもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、調節領域（エンハンサー又はプロモーター）を編集することによって、スプライス部位を改変することによって、マイクロＲＮＡ認識部位を除去又は挿入することによって、マイクロＲＮＡを抑制するためにアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）を投与することによって、マイクロＲＮＡミメティックを投与することによって、又は目的の遺伝子の発現若しくは活性を調節する他の任意の様々な手段によって、目的の遺伝子の転写を抑制解除することを含む。

本明細書で使用される「マイクロＲＮＡ」は、成熟マイクロＲＮＡを指す。マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、一般に、宿主細胞におけるその発現がその細胞における成熟マイクロＲＮＡの形成をもたらす任意のポリヌクレオチドを指す。マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、対応するプレＲＮＡと１００％の配列同一性を共有し得る。成熟マイクロＲＮＡ配列をコードするステム間のループにおける１つ以上の置換は、場合によっては許容される。二本鎖のいずれかの鎖が機能的なｍｉＲＮＡとして作用する可能性はあるが、通常は、一方の鎖のみがＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで、ｍｉＲＮＡ及びそのｍＲＮＡ標的が相互作用する。マイクロＲＮＡを使用するための従来の技術は、例えば、Ｌａｗｒｉｅ，ｅｄ．（２０１３）ＭｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅにて提供されている。

本明細書で使用される「対象」又は「患者」という用語は、飼育された動物、動物園の動物、又はヒトなどの任意の動物を指す。「対象」又は「患者」は、イヌ、ネコ、ウマ、家畜、動物園の動物、又はヒトなどの哺乳動物であり得る。対象又は患者は、トリ、ペット、又は農場の動物などの任意の飼育された動物であることもできる。「対象」及び「患者」の具体例としては、心疾患又は障害を有する個体、及び心疾患に関連する特徴又は症状を有する個体が挙げられるが、これらに限定されない。

本開示の実施は、別段の指示がない限り、当業者の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、細胞生物学及び組換えＤＮＡの従来の技術を使用する。

文脈が別段で示していない限り、本明細書に記載の本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用することができることが特に意図されている。更に、本開示はまた、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の任意の特徴又は特徴の組み合わせを除外又は省略することができることを企図している。例示するために、複合体が成分Ａ、Ｂ、及びＣを含むと明細書が述べている場合、Ａ、Ｂ、若しくはＣのうちのいずれか又はそれらの組み合わせを単独又は任意の組み合わせで省略及び放棄することができることが特に意図されている。

ｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量などの範囲を含む全ての数値表示は、必要に応じて、１．０若しくは０．１の増分で、又は代替的には＋／－１５％、又は代替的には１０％、又は代替的には５％、又は代替的には２％の変動によって、（＋）若しくは（－）変化する近似値である。常に明確に述べられているわけではないが、全ての数値表示の前に「約」という用語が付けられていることを理解されたい。このような範囲形式は、便宜上及び簡潔性のために使用されていることが理解されるべきであり、範囲の限界値として明示的に列挙された数値だけでなく、各数値又は部分範囲が明示的に記載されているかのように、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分範囲を含むように柔軟に解釈されるべきである。例えば、約１～約２００の範囲の比は、約１及び約２００の明示的に列挙された限界値を含むと理解されるべきであるが、約２、約３、及び約４などの個々の比、並びに約１０～約５０、約２０～約１００などの部分範囲を含むと理解されるべきである。また、常に明確に述べられているわけではないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、その等価物は当技術分野で知られていることも理解されたい。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途文脈が明確に示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」が複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「心筋細胞」への言及は、複数の心筋細胞を含む。

本明細書で使用される場合、「及び／又は」とは、関連する列挙された項目のうちの１つ以上の任意かつ全ての可能な組み合わせ、及び代替（又は）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、それらを包含する。

「投与」、「投与する」などは、本発明の組成物に関連して使用される場合、インビトロでの非心筋細胞への投与、インビボでの非心筋細胞への投与、医療専門家による対象への投与、若しくは対象による自己投与であり得る直接投与、及び／又は本発明の組成物を処方する行為であり得る間接投与の両方を指す。細胞に関連して本明細書で使用される場合、細胞に組成物を導入することを指す。典型的には、有効量が投与され、その量は当業者によって決定され得る。任意の投与方法を使用することができる。小分子は、例えば、細胞培養培地への小分子の添加又は心臓損傷部位へのインビボ注射によって、細胞に投与され得る。対象への投与は、例えば、血管内注射、心筋内送達などによって達成することができる。

本明細書で使用される場合、「心臓細胞」という用語は、心臓収縮又は血液供給などの心臓機能を提供するか、又は心臓の構造を維持する働きをする、心臓に存在する任意の細胞を指す。本明細書で使用される心臓細胞は、心臓の心外膜、心筋又は心内膜に存在する細胞を包含する。心臓細胞には、例えば、心筋の細胞又は心筋細胞、及び冠動脈又は静脈の細胞などの心臓血管系の細胞も含まれる。心臓細胞の他の非限定的な例には、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞又は前駆細胞、心臓伝導系細胞、並びに心筋、血管及び心臓細胞支持構造を構成する心臓ペースメーキング細胞が含まれる。心臓細胞は、例えば、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞を含む幹細胞に由来し得る。

本明細書で使用される場合、「心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」又は「心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）」という用語は、骨格筋細胞とは対照的に、哺乳動物の心臓に自然に見られるサルコメア含有横紋筋細胞を指す。心筋細胞は、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、心臓α－アクチニンなどのタンパク質のような特殊な分子の発現によって特徴付けられる。本明細書で使用される場合、「心筋細胞」という用語は、任意の心筋細胞亜集団又は心筋細胞亜型、例えば、心房、心室及びペースメーカー心筋細胞を含む包括的な用語である。

「心筋細胞様細胞」という用語は、心筋細胞と特徴を共有するが、全ての特徴を共有するわけではない細胞を意味することを意図している。例えば、心筋細胞様細胞は、特定の心臓遺伝子の発現において心筋細胞とは異なり得る。

「培養」又は「細胞培養」という用語は、人工的なインビトロ環境における細胞の維持を意味する。「細胞培養系」は、本明細書では、細胞の集団が単層として又は懸濁液中で増殖され得る培養条件を指すために使用される。「培養培地」は、本明細書では、細胞の培養、成長、又は増殖のための栄養溶液を指すために使用される。培地は、細胞を特定の状態（例えば、多能性状態、静止状態など）に維持する能力、又は細胞を成熟させる能力、いくつかの実施形態において、前駆細胞の特定の系列の細胞（例えば、心筋細胞）への分化を促進する能力などであるが、これらに限定されない機能的特性によって特徴付けることができる。

本明細書で使用される場合、「発現」又は「発現する」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞又は組織試料中のｍＲＮＡ又はタンパク質の量を測定することによって決定することができる。

本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現するように構成された、タンパク質又は核酸をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むＤＮＡポリヌクレオチドである。典型的には、ポリヌクレオチドの発現は、構成的又は誘導可能なプロモーター、組織特異的調節エレメント、及びエンハンサーを含む特定の調節エレメントの制御下に置かれる。そのようなポリヌクレオチドは、調節エレメント（例えば、プロモーター）に「作動的に連結されている」又は「作動可能に連結されている」と言われる。

「誘導心筋細胞」という用語又は略語「ｉＣＭ」は、心筋細胞（及び／又は心筋細胞様細胞）に形質転換された非心筋細胞（及びその子孫）を指す。本開示の方法は、例えば、他の技術を強化するために、誘導心筋細胞を生成するために現在知られている、又は後に発見される任意の方法と併せて使用することができる。

本明細書で使用される場合、「非心筋細胞」という用語は、本明細書で定義及び使用される「心筋細胞」の基準を満たさない細胞調製物中の任意の細胞又は細胞集団を指す。非心筋細胞の非限定的な例には、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、及び幹細胞が含まれる。

「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題若しくは合併症を伴うことなく、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適な化合物、物質、組成物、及び／又は剤形を指すために本明細書で用いられる。

損傷した心臓組織の文脈で本明細書で使用される「再生する」、「再生」などの用語は、それらの通常の意味を与えられるが、更に、損傷した、例えば、虚血、梗塞、再灌流、又は他の疾患に起因して損傷した心臓又は心臓組織において新しい心臓組織を成長及び／又は発達させるプロセスも指すものとする。いくつかの実施形態において、心臓組織の再生は、心筋細胞の生成を含む。

本明細書で使用する場合、「リプログラミング」又は「分化転換」という用語は、細胞を多能性肝細胞の特徴を示す細胞へと脱分化させる中間プロセスを伴うことなく、異なるタイプの細胞（例えば、線維芽細胞）から特定の系列の細胞（例えば、心臓細胞）を生成することを指す。本明細書で使用する場合、「リプログラミング」には、分化転換、脱分化などが含まれる。

本明細書で使用される場合、「リプログラミング活性」とは、タンパク質又はポリヌクレオチドが単独で、又はリプログラミング活性を有する他のタンパク質又はポリヌクレオチドと組み合わせて、細胞に誘導されるか、細胞により発現される場合に、細胞の心筋細胞又は心筋様細胞へのリプログラミングを誘導するか、又は促進するためのリプログラミング活性を有するタンパク質又はポリヌクレオチドの能力を指す。例えば、他の因子を伴わない細胞における第１のタンパク質の発現が細胞のリプログラミングを誘導又は促進する場合、第１のタンパク質はリプログラミング活性を有する。しかし、第１のタンパク質が第２のタンパク質と組み合わせてリプログラミングを促進する場合、すなわち、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の両方が一緒に発現される場合、用語が本明細書で使用されるように、第１のタンパク質はまたリプログラミング活性を有する。

本明細書で使用される場合、「リプログラミング効率」という用語は、試料中の細胞の総数に対する、心筋細胞へのリプログラミングに成功した試料中の細胞の数を指す。

本明細書で使用される「リプログラミング因子」という用語は、誘導された心筋細胞への細胞のリプログラミングを支援するために細胞内での発現のために導入される因子を含む。リプログラミング因子には、タンパク質及び核酸（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ）が含まれる。

「幹細胞」という用語は、自己複製能力及び分化した子孫を生成する能力を有する細胞を指す。「多能性幹細胞」という用語は、３つの胚葉全て（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞を生み出すことができるが、完全な生物を生み出す能力を持たない幹細胞を指す。

「治療」、「治療すること」、及び「治療する」は、疾患、障害、状態及び／又はそれらの症状の有害又はその他の任意の望ましくない影響を軽減又は改善するために、薬剤を用いて疾患、障害、又は状態に作用することと定義される。

本明細書で使用される場合、「有効量」などという用語は、所望の生理学的結果（例えば、細胞のリプログラミング又は疾患の治療）を誘導するのに十分な量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用又は用量で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬単位が使用される期間、組成物のバイオアベイラビリティ、投与経路などを含む多くの変数に依存する。しかし、任意の特定の対象についての組成物（例えば、リプログラミング因子）の特定の量は、利用される特定の薬剤の活性、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事、投与時間、排泄速度、組成物の組み合わせ、治療される特定の疾患の重症度、及び投与形態を含む様々な要因に依存することが理解される。

本明細書で使用される場合、ポリペプチド又は核酸配列を参照しての「その等価物」という用語は、参照ポリペプチド又は核酸配列とは異なるが、必須の特性（例えば、生物学的活性）を保持するポリペプチド又は核酸を指す。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。バリアントのヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更する場合も変更しない場合もある。ヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、欠失、付加、融合、及び切断をもたらし得る。一般に、参照ポリペプチド及びバリアントの配列が全体的に非常に類似し、多くの領域で同一であるように、違いは限定される。

「単離された」という用語は、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、又はその断片が自然界で通常会合している細胞及びその他の構成要素から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、異なる表現型又は遺伝子型の組織又は細胞から分離された細胞である。当業者には明らかであるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又は細胞は、天然に存在する対応物と区別するために「単離」を必要としない。

本明細書で使用される場合、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれか、又はそれらの類似体の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、線状及び環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、及びプライマーが含まれる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これには、遺伝的にコードされた、及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドが含まれ得る。この用語は、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する又は有しない異種及び相同リーダー配列との融合、免疫標識されたタンパク質などを含むがこれらに限定されない融合タンパク質を含む。

本明細書で使用される場合、遺伝子名が先行する「ポリヌクレオチド」という語（例えば「ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド」）は、対応するタンパク質（例えば、「ＭＹＯＣＤタンパク質」）をコードするポリヌクレオチド配列を指す。

本明細書で使用される場合、遺伝子名が先行する「タンパク質」という語（例えば、「ＭＹＯＣＤタンパク質」）は、天然タンパク質又はその機能的バリアントのいずれかを指す。「天然タンパク質」は、遺伝子の機能的アイソフォーム又は機能的対立遺伝子変動のうちのいずれかでの、生物、好ましくはベクターが意図される生物（例えば、ヒト、齧歯類、霊長類、又は獣医学的目的のある動物）の遺伝子のゲノムコピーによってコードされるタンパク質である。

本明細書で使用される場合、タンパク質の「機能的バリアント」は、例えば、他の因子と組み合わせて、細胞の心筋細胞へのリプログラミングを誘導するタンパク質の能力を含む、タンパク質の機能的属性を保持する、任意の数のアミノ酸置換を有するバリアントである。機能的バリアントは、保存的置換のみを有するバリアントなど、計算によって、又はインビトロ若しくはインビボアッセイを使用して実験的に特定できる。

本明細書で使用される「前駆細胞」という用語は、特定の種類の細胞に分化するか、又は特定の種類の組織を形成することを約束された細胞を指す。前駆細胞は、幹細胞のように、１つ以上の種類の細胞に更に分化することができるが、幹細胞よりも成熟しており、分化能がより制限／拘束されている。

「ベクター」という用語は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチド又はタンパク質を含む高分子又は分子の複合体を指す。

本明細書で使用する場合、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には核酸分子の移動又は細胞のゲノムへの組み込みを促進するウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子、又は核酸移入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指す。ウイルス粒子は、典型的には、核酸に加えて様々なウイルス成分を含み、時には細胞成分も含む。

「遺伝子修飾」という用語は、新しい核酸（すなわち、細胞にとって外因性の核酸）の導入後に細胞内で誘導される永久的又は一過性の遺伝子変化を指す。遺伝子変化は、新しい核酸を心臓細胞のゲノムに組み込むことによって、又は新しい核酸を染色体外エレメントとして一時的又は安定的に維持することによって達成することができる。細胞が真核細胞である場合、細胞のゲノムへの核酸の導入によって永久的な遺伝子変化を達成することができる。遺伝子修飾の適切な方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどが含まれる。

「幹細胞」という用語は、自己複製能力及び分化した子孫を生成する能力を有する細胞を指す。「多能性幹細胞」という用語は、３つの胚葉全て（内胚葉、中胚葉、及び外胚葉）の細胞を生み出すことができるが、完全な生物を生み出す能力を持たない幹細胞を指す。いくつかの実施形態において、心筋細胞の表現型を誘導するための組成物は、リプログラミングを誘導するために細胞の集団に対して使用することができる。他の実施形態において、組成物は心筋細胞の表現型を誘導する。

「人工多能性幹細胞」という用語は、その通常の意味を与えられ、更に、多能性の少なくとも１つの特徴を示すようにリプログラムされた分化した哺乳動物体細胞（例えば、皮膚などの成体体細胞）も指すものとする。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ１３１（５）：８６１－８７２、Ｋｉｍｅｔａｌ．（２０１１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０８（１９）：７８３８－７８４３、Ｓｅｌｌ（２０１３）ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＨａｎｄｂｏｏｋ．を参照されたい。

別段の記載がない限り、本明細書を通して使用される略語は、以下の意味を有する。ＡＨＣＦ、成体ヒト心臓線維芽細胞；ＡＰＣＦ、成体ブタ心臓線維芽細胞；ａ－ＭＨＣ－ＧＦＰ、α－ミオシン重鎖緑色蛍光タンパク質；ＣＦ、心臓線維芽細胞；ｃｍ、センチメートル；ＣＯ、心拍出量；ＥＦ、駆出率；ＦＡＣＳ、蛍光活性化セルソーティング；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＧＭＴ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５；ＧＭＴｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦ－βｉ、ＷＮＴｉ；ＧＯ、遺伝子オントロジー；ＨＣＦ、ヒト心臓線維芽細胞；ｉＣＭ、誘導心筋細胞；ｋｇ、キログラム；μｇ、マイクログラム；μｌ、マイクロリットル；ｍｇ、ミリグラム；ｍｌ、ミリリットル；ＭＩ、心筋梗塞；ｍｓｅｃ、ミリ秒；ｍｉｎ、分；ＭｙＡＭＴ、ミオカルジン、Ａｓｃｌ１、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５；ＭｙＡ、ミオカルジン及びＡｓｃｌ１；ＭｙＭＴ、ミオカルジン、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５；ＭｙＭＴｃ、ミオカルジン、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦ－βｉ、ＷＮＴｉ；ＭＲＩ、磁気共鳴画像法；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＢＳＴ、リン酸緩衝生理食塩水、トリトン；ＰＦＡ、パラホルムアルデヒド；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ｑＲＴ－ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＮＡ、リボ核酸；ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＮＡ配列決定；ＲＴ－ＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；ｓｅｃ、秒；ＳＶ、一回拍出量；ＴＧＦ－β、形質転換増殖因子ベータ；ＴＧＦ－βｉ、形質転換成長因子ベータ阻害剤；ＷＮＴ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ；ＷＮＴｉ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ阻害剤；ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質；４Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、及びミオカルジン；４Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、及びミオカルジン＋ＴＧＦ－βｉ及びＷＮＴｉ；７Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５、Ｅｓｒｒｇ、ミオカルジン、Ｚｆｐｍ２、及びＭｅｓｐ１；７Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、及びＴｂｘ５、Ｅｓｒｒｇ、ミオカルジン、Ｚｆｐｍ２、及びＭｅｓｐ１＋ＴＧＦ－βｉ及びＷＮＴｉ。

本開示の詳細な説明は、読者の便宜のためだけに様々なセクションに分割されており、任意のセクションで見出される開示は、別のセクションの開示と組み合わせることができる。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料と同様又は同等の任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用され得るが、好ましい方法及び材料がこれから記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、刊行物が引用されるものに関連して方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。

ＩＩ．導入遺伝子及びマイクロＲＮＡ結合部位
本開示のベクターは、ＢＭＰＲ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＥＬＮ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ４、ＧＧＦ２、ＨＧＦ、ＯＰＲＬ１、ＰＣＳＫ９、ＲＸＦＰ１、ＳＤＦ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４、ＶＥＧＦＡ及び／又はその他を含むがこれらに限定されない１つ以上の導入遺伝子を細胞へ送達するために設計され得る。すなわち、ベクターは、ＢＭＰＲ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＥＬＮ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ４、ＧＧＦ２、ＨＧＦ、ＯＰＲＬ１、ＰＣＳＫ９、ＲＸＦＰ１、ＳＤＦ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４、ＶＥＧＦＡ及び／又はその他のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。本開示のベクターは、導入遺伝子の任意の特定のセットに限定されない。導入遺伝子は、タンパク質コーディング、ＤＮＡコーディング、又はＲＮＡコーディングであり得る。１つ以上の導入遺伝子は、遺伝子編集システム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み得る。

リプログラミング因子
いくつかの実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は、１つ以上のリプログラミング因子（例えば、心筋細胞リプログラミング因子）を含む。ベクターは、選抜された所望の細胞リプログラミングを成し遂げるに必要な因子の全て、又はそのようなリプログラミング因子の選択されたセットを送達するために使用され得る。例えば、複数のベクターを同時投与することができ、そのうちの１つだけが選択されたマイクロＲＮＡ結合部位を含む。望ましい効果を集合的に生み出すために複数の因子の発現が必要な場合、一連の因子の特定のメンバーのみがマイクロＲＮＡ結合部位によって制御されている場合、又は全てがマイクロＲＮＡ結合部位によって制御されている場合、同じ又は同様の効果及び／又は安全上の利益が見られることがある。

いくつかの実施形態において、本開示は、目的のポリヌクレオチド又はタンパク質などの１つ以上の遺伝子の発現を調節することができるリプログラミング因子及びその組成物を提供する。本発明者らは驚くべきことに、ＡＳＣＬ１及び／又はＭＹＯＣＤなどの目的のポリヌクレオチド又はタンパク質などの１つ以上の遺伝子の発現を調節する１つ以上のリプログラミング因子、並びに任意選択的にはマイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを使用して、分化した細胞をｉＣＭ細胞にリプログラミングできることを発見し、ここで、前述のポリヌクレオチドの１つ以上は、選択されたマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のリプログラミング因子は、１つ以上の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡポリヌクレオチド）として提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上のリプログラミング因子は、タンパク質として提供される。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、対応するプレマイクロＲＮＡと完全な同一性を共有する。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される１つ以上のリプログラミング因子は、１つ以上の目的のタンパク質の発現を調節する（例えば、増加又は減少させる）。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的タンパク質は、心筋細胞の分化、増殖、及び／又は機能に関与することが知られている。いくつかの実施形態において、１つ以上の標的ポリヌクレオチド又はタンパク質は、ＭＹＯＣＤ／ＭＹＯＣＤ及び／又はＡＳＣＬ１／ＡＳＣＬ１である。本開示の組成物及び方法において有用な例示的な遺伝子配列を表２に提供する。所与の目的遺伝子の２つ以上のアイソフォームが知られている場合、本開示の実施形態は、各目的遺伝子の代替アイソフォームを含む組成物及び方法を含むことが理解される。本開示の組成物及び方法は、開示された配列に限定されず、これらは例示及び説明のために提供され、非限定的である。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節するリプログラミング因子を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるリプログラミング因子は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＡＮＤＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、ＺＦＰＭ２、及びＭＩＲ－１３３から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節する。

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるリプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（すなわち、ＧＭＴ）から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるリプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＭＴ）から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるリプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＡＭＴ）から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるリプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１（すなわち、ＭｙＡ）から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるリプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、及びＭＹＯＣＤ（すなわち、４Ｆ）から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節する。他の実施形態において、本明細書に開示されるリプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＥＳＲＲＧ、ＭＹＯＣＤ、ＺＦＰＭ２、及びＭＥＳＰ１（すなわち、７Ｆ）から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＤＬＸ３、ＤＬＸ６、ＧＡＴＡ２、及びＧＡＴＡ５から選択される１つ以上の目的の遺伝子の発現を調節するリプログラミング因子を提供する。

操作されたミオカルジン（ＭＹＯＣＤ）
別の態様において、本開示は、米国仮特許出願第６２／７８８，４７９号に記載されているように、より小さなオープンリーディングフレームから発現された操作されたＭＹＯＣＤなどの、ＭＹＯＣＤの操作されたバリアントに関する。出願人は、内部欠失を含むＭＹＯＣＤがＭＹＯＣＤタンパク質の発現及び機能を保持し、内部欠失を含むＭＹＯＣＤを単独で、又は他のリプログラミング因子と組み合わせて（例えば、線維芽細胞から心筋細胞を生成するために）使用できることを見出した。本開示のいくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質は、天然のＭＹＯＣＤ（配列番号３）のアミノ酸４１４～７６４に対応する領域に少なくとも５０個のアミノ酸の欠失を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤは、内部欠失を有する１つ又は３つのＭＹＯＣＤバリアントから選択される：残基４１４～７６３の欠失を有するＭｙΔ１（配列番号１４）；残基４３９～７６３の欠失を有するＭｙΔ２（配列番号１５）；好ましくは、残基５６０～７６３の欠失を有するＭｙΔ３（配列番号１６）。

いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドである。「ＭＹＯＣＤ」又は「ミオカルジン」は、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質又は好ましくは天然のＭＹＯＣＤのいずれかを指す。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、最大５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、又はそれらの間の任意の数のアミノ酸の長さを有する操作されたＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質は、ＳＲＦ相互作用ドメイン、ＳＡＰドメイン、及びＴＡＤドメインを含む。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質は、Ｍｅｆ２Ｃ相互作用ドメインを更に含む。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、天然のミオカルジン（配列番号３）のアミノ酸４１４～７６４に対応する領域に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、又は３５０個のアミノ酸の欠失を伴う、操作されたＭＹＯＣＤをコードする。ミオカルジンの操作に使用される様々なシーケンスを表３で提供する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤの種間保存が残基５から始まるので、ＭＹＯＣＤの約４個のＮ末端残基が省略又は変更される。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤのＮ末端からの更なる残基が省略又は変更される。

いくつかの実施形態において、操作されたミオカルジンタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメイン、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、ＬＺドメイン、及びＴＡＤドメインのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、操作されたミオカルジンタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメイン、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、ＬＺドメイン、及びＴＡＤドメインを含む。いくつかの実施形態において、操作されたミオカルジンタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメイン、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、及びＴＡＤドメインを含む。いくつかの実施形態において、操作されたミオカルジンタンパク質は、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、ＬＺドメイン、及びＴＡＤドメインを含む。いくつかの実施形態において、操作されたミオカルジンタンパク質は、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、及びＴＡＤドメインを含む。

いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤは、操作されたＭＹＯＣＤをコードするポリヌクレオチドとして提供され、任意選択的に、目的の１つ以上の他のタンパク質として提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はｍＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭＹＯＣＤのアイソフォームのうちのいずれかと同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭｙΔ１（配列番号１４）、ＭｙΔ２（配列番号１５）、及びＭｙΔ３（配列番号１６）から選択される配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である操作されたＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメイン、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、ＬＺドメイン、及びＴＡＤドメインのうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つを含む。いくつかの実施形態において、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインは、配列番号１７と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、ＳＲＦドメインは、配列番号１８と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、ＳＡＰドメインは、配列番号１９と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、ＬＺドメインは、配列番号２０と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。いくつかの実施形態において、ＴＡＤドメインは、配列番号１１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である。

いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質は、リンカーによって連結された天然のＭＹＯＣＤの２つ以上のフラグメントを含む。一般に、リンカーは、ペプチド結合又はポリペプチド配列のいずれかを指す。いくつかの実施形態において、当技術分野で知られているペプチド化学で使用される様々な化学リンカーのうちのいずれかなど、他のリンカーが使用される。「ペプチド結合」への言及は、アミノ酸残基が介在することなく複合配列を生成するために、２つの配列が一緒に結合されることを意味する。例えば、ＭｙΔ３（配列番号１６）は、ペプチド結合によってＭＹＯＣＤ７６４－９８６（配列番号１１）に連結されたＭＹＯＣＤ１－５５９（配列番号１３）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、当技術分野でリンカーとして使用される様々なポリペプチドのうちのいずれかであり、例えば、限定されないが、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＳＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＳＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３４）．などのグリシン－セリンリンカーが挙げられる。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＭＹＯＣＤ以外のタンパク質のドメインである。

本開示全体を通して、ポリヌクレオチドの発現は、目的の遺伝子の発現を増加させるための当技術分野で知られている任意の手段を指し得る。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にコードされる。ｍＲＮＡは、合成又は天然のものであり得る。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、当技術分野で知られている様々な方法で化学的に修飾される。例えば、Ｗａｒｒｅｎ，Ｌ．ｅｔａｌ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ７：６１８－３０（２０１０）、ＷＯ２０１４０８１５０７Ａ１、ＷＯ２０１２０１９１６８、ＷＯ２０１２０４５０８２、ＷＯ２０１２０４５０７５、ＷＯ２０１３０５２５２３、ＷＯ２０１３０９０６４８、ＵＳ９５７２８９６Ｂ２において記載されているように使用することができる。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子の発現は、細胞へのポリヌクレオチドの送達によって増加する。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、ウイルス又は非ウイルスベクターによって送達される。いくつかの実施形態において、目的の遺伝子は、ＤＮＡポリヌクレオチドにコードされ、任意選択的には、当技術分野で知られている任意のウイルス又は非ウイルス方法によって送達される。いくつかの実施形態において、本開示は、目的の遺伝子をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子と細胞を接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の方法は、目的の遺伝子をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ＤＮＡゲノム、ネガティブセンスＲＮＡゲノム、ポジティブセンスＲＮＡゲノム、又は二本鎖ＲＮＡゲノム）を含むウイルスと細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、非組み込みレンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、及び組み込みＬＶＶから選択される。いくつかの実施形態において、細胞はプラスミドでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態において、プラスミドは、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、プラスミドは、リプログラミング因子を含むトランスポゾンを含む。

いくつかの実施形態において、リプログラミング因子は、目的の１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はｍＲＮＡポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチドにわたって、ヒトＡＳＣＬ１のヌクレオチド配列（配列番号２）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ＡＳＣＬ１のアイソフォームのうちのいずれかと同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号１）の配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＡＳＣＬ１タンパク質をコードする。

いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む、又はＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを投与することを含む、ｉＣＭ細胞又は組換えウイルス若しくは非ウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号３）の配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、少なくとも１００、２００、３００、４００又は５００ヌクレオチドにわたって、ヒトＭＹＯＣＤのヌクレオチド配列（配列番号４）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を共有する。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭＹＯＣＤのアイソフォームのうちのいずれかと同一性を共有する。

いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤは、操作されたＭＹＯＣＤをコードするポリヌクレオチドとして提供される。

いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、操作されたＭＹＯＣＤ（例えば、配列番号１４）の配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。

いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、操作されたＭＹＯＣＤ（例えば、配列番号１５）の配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。

いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、操作されたＭＹＯＣＤ（例えば、配列番号１６）の配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。

いくつかの実施形態において、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは合成ｍＲＮＡである。合成ｍＲＮＡは、目的のタンパク質を作成するための遺伝情報を提供し、免疫応答の誘発を避けるために化学的に修飾することができる。Ｚａｎｇｉｅｔａｌ．（２０１３）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ３１：８９８－９０７．ｍＲＮＡは宿主細胞のゲノムに組み込まれないため、合成ｍＲＮＡは一定期間作用し、その後細胞が分裂するにつれて消失する。いくつかの実施形態において、合成ｍＲＮＡは、例えば、シュードウリジン及び／又は５－メチル－シチジンで修飾されて、一本鎖ＲＮＡに対する自然抗ウイルス応答を低下させる。

いくつかの実施形態において、目的の１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コードされた遺伝子の機能活性が保存される限り、コドン最適化又は別の方法で改変され得る。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、コードされた遺伝子の機能活性が保存される限り、切断、挿入、欠失、又は断片を含む、１つ以上の目的の遺伝子の修飾又はバリアントをコードする。

いくつかの実施形態において、目的の１つ以上のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる。いくつかの実施形態において、発現カセットは、目的の１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態において、発現カセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の目的の遺伝子をコードする２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のポリヌクレオチドを含む。

目的の２つ以上のタンパク質が細胞内で発現される場合、１つ以上のポリヌクレオチド又は発現カセットを使用できることが理解される。例えば、１つの発現カセットが複数のタンパク質を発現する複数のポリヌクレオチドを含むことができるポリシストロン性発現カセットを使用することができる。いくつかの実施形態において、ポリシストロン性発現カセットは、単一のオープンリーディングフレーム内に２つ以上のポリヌクレオチドを含み、これらのポリヌクレオチドは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙｅｔａｌ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３－１５（２００１）及び当技術分野で知られているその改良版において記載されているような、アフトウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ポリタンパク質の２Ａ領域によって連結されている。２Ａ領域は、ペプチド結合を形成することなく、１つのコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を生成する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、翻訳後切断によって２つ以上のペプチドが生成されるように、内部切断部位を含む。

いくつかの実施形態において、本開示のマルチシストロン性ベクターは、リボソームスキッピング又は自己切断を誘導できるペプチドを含むリンカーによって連結された複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは２Ａペプチドを含む。本明細書で使用される場合、「２Ａペプチド」という用語は、単一のオープンリーディングフレームから２つ以上のタンパク質を生成するように構成されたリボソームスキッピング又は自己切断ペプチドのクラスを指す。２Ａペプチドは、真核細胞での翻訳中にポリペプチドの「切断」を媒介する１８～２２残基長のウイルスオリゴペプチドである。「２Ａペプチド」は、様々なアミノ酸配列を有するペプチドを指す場合がある。本開示において、レンチウイルスベクターが２つ以上の２Ａペプチドを含む場合、２Ａペプチドは互いに同一であっても異なっていてもよいことが理解されるであろう。２Ａペプチドの設計及び使用に関する詳細な方法論は、Ｓｚｙｍｃｚａｋ－Ｗｏｒｋｍａｎｅｔａｌ．ＤｅｓｉｇｎａｎｄＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆ２ＡＰｅｐｔｉｄｅ－ＬｉｎｋｅｄＭｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃＶｅｃｔｏｒｓ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２Ｆｅｂ１；２０１２（２）：１９９－２０４によって提供されている。文献では、２Ａペプチドは自己切断ペプチドと称されることが多いが、機序研究では、観察された「自己切断」は、実際には、リボソームが２ＡペプチドのＣ末端でグリシル－プロリルペプチド結合の形成をスキップした結果であることが示されている。Ｄｏｎｎｅｌｌｙｅｔａｌ．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ．２００１Ｍａｙ；８２（Ｐｔ５）：１０２７－４１．本発明は、理論に拘束されるものでも、２Ａペプチド機能の特定の機構的理解に限定されるものでもない。

例示的な２Ａペプチドには、表４に列挙されたものが含まれるが、これらに限定されない。

任意選択的に、リンカーの１つ以上は、残基Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙをコードする配列を更に含み、これは、いくつかの実施形態において、２ＡペプチドのＮ末端にある。２ＡペプチドのＮ末端とは、残基をコードする配列が２Ａペプチドをコードする配列の上流にあることを意味する。一般に、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙモチーフは、２ＡペプチドのすぐＮ末端にあるか、モチーフと２Ａペプチドとの間に１～１０個の他のアミノ酸残基が挿入される。いくつかの実施形態において、このモチーフをコードするポリヌクレオチド配列は、ＧＧＡＡＧＣＧＧＡである。任意のペプチドをコードするポリヌクレオチドと同様に、ヌクレオチド配列は、コードされたペプチド配列を変更することなく改変され得る。アミノ酸残基の置換は当業者の技術の範囲内であり、２Ａペプチドという用語は、所望のスキッピング／自己切断活性を保持するが、任意選択的に、参照２Ａペプチド配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の置換を有する前述のバリアントを指す。例示的な２Ａペプチドは、Ｋｉｍｅｔａｌ．ＰＬＯＳＯＮＥ６（４）：ｅ１８５５６に記載されている。いくつかの実施形態において、２つ以上の異なる２Ａペプチドが同じ構築物で使用される。様々な２Ａペプチドが発現の改善をもたらすことが報告されている。Ｌｉｕｅｔａｌ．ＳｃｉＲｅｐ．２０１７；７：２１９３を参照されたい。

いくつかの実施形態において、本開示は、５’から３’の順に、プロモーター、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチド、及びポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号３５と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、発現カセットを含む移入プラスミド、又は発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３５と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含む組換えレンチウイルス（ｒＬＶ）、発現カセットを含む移入プラスミド、又は発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＬＶは、配列番号３５と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、５’から３’の順に、プロモーター、ＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチド、及びポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号３７と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含む移入プラスミド、又は発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３７と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含む組換えｒＬＶ、発現カセットを含む移入プラスミド、又は発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＬＶは、配列番号３７と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、５’から３’の順に、プロモーター、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤをコードするポリヌクレオチド、及びポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号３９と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含む移入プラスミド、又は発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３９と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含む組換えｒＬＶ、発現カセットを含む移入プラスミド、又は発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＬＶは、配列番号３９と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、５’から３’の順に、プロモーター、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭｙΔ３をコードするポリヌクレオチド、及びポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号４１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含む移入プラスミド、又は発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号４１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、本開示は、発現カセットを含む組換えｒＬＶ、発現カセットを含む移入プラスミド、又は発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、ｒＬＶは、配列番号４１と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるポリヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、配列番号５７～６４のうちのいずれか１つ（例えば、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１、ＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤ、及びＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭｙΔ３のうちのいずれか１つ）と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。

いくつかの実施形態において、１つ以上のリプログラミング因子は、１つ以上のマイクロＲＮＡを含む。リプログラミング因子として有用なマイクロＲＮＡには、ｍｉＲ－１３３ａ－２、ｍｉＲ－１３３ａ－１、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－１－１、ｍｉＲ－１２９８、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１－２、ｍｉＲ－９２ａ－２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｍｉＲ－２０２、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－５０９－１、ｍｉＲ－５０９－２、ｍｉＲ－１２４－３、ｍｉＲ－１２４－２、ｍｉＲ－３７８ａ、ｍｉＲ－３７８ｅ、ｍｉＲ－３７８ｈ、ｍｉＲ－３７８ｉ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－６７１、ｍｉＲ－２４－１、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－３０２ｄ、ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－３０ｃ－２、及びｍｉＲ－１４６ｂが含まれる。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－１３３ａ－２、ｍｉＲ－６７１、ｍｉＲ－２４－１、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－３０２ｄ、ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－３０ｃ－２、ｍｉＲ－１４６ｂ、及びｍｉＲ－１３３ａ－２．からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１３３ａ－２、ｍｉＲ－１３３ａ－１、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－１－１、ｍｉＲ－１２９８、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１－２、ｍｉＲ－９２ａ－２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｍｉＲ－２０２、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－５０９－１、ｍｉＲ－５０９－２、ｍｉＲ－１２４－３、ｍｉＲ－１２４－２、ｍｉＲ－３７８ａ、ｍｉＲ－３７８ｅ、ｍｉＲ－３７８ｈ、ｍｉＲ－３７８ｉ、ｍｉＲ－１３７、ｍｉＲ－６７１、ｍｉＲ－２４－１、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－３０２ｄ、ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－３０ｃ－２、及びｍｉＲ－１４６ｂからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１３３ａ－２、ｍｉＲ－１３３ａ－１、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－１－１、ｍｉＲ－１２９８、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１－２、ｍｉＲ－９２ａ－２、ｍｉＲ－２０ｂ、ｍｉＲ－２０ａ、ｍｉＲ－１４１、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｍｉＲ－２０２、ｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－５０９－１、ｍｉＲ－５０９－２、ｍｉＲ－１２４－３、ｍｉＲ－１２４－２、ｍｉＲ－３７８ａ、ｍｉＲ－３７８ｅ、ｍｉＲ－３７８ｈ、及びｍｉＲ－３７８ｉからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、２つのマイクロＲＮＡをＭＹＯＣＤ及び／又はＡＳＣＬ１と組み合わせて、分化細胞（例えば、線維芽細胞）の心筋細胞へのリプログラミングを誘導する。マイクロＲＮＡの可能な組み合わせには、５’位置にｍｉＲ－１３３ａ－２、ｍｉＲ－１３３－ａ１、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－１－１、ｍｉＲ－１２９８、ｍｉＲ－１３３－ｂ、ｍｉＲ－１－２、ｍｉＲ－２０－ｂ、及びｍｉＲ－２０－ａのうちのいずれか１つ、続いて、３’位置にｍｉＲ－１３３ａ－２、ｍｉＲ－１３３－ａ１、ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｍｉＲ－３２６、ｍｉＲ－１－１、ｍｉＲ－１２９８、ｍｉＲ－１３３－ｂ、ｍｉＲ－１－２、ｍｉＲ－２０－ｂ、及びｍｉＲ－２０－ａのうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも３つ、４つ、又は５つのｍｉＲＮＡなど、複数のｍｉＲＮＡが組み合わされる。同じマイクロＲＮＡの１、２、３、４、５又はそれ以上のコピーなど、同じｍｉＲＮＡの複数のコピーを使用することができる。

目的のマイクロＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はマイクロＲＮＡミメティック（任意選択的に、ホスホチオレート骨格、ロックド核酸、及びコレステロール修飾などの修飾を含む）を含むがこれらに限定されない任意の手段によって提供され得る。いくつかの実施形態において、目的のマイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡをプレｍｉＲＮＡとしてコードするポリヌクレオチドから発現される。マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、一般に、プロモーターに作動可能に連結される。マイクロＲＮＡは、それ自体の転写物上で、又は１つ以上の他の因子（例えば、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド）と共有する転写物上で発現することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド及び／又はＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ及びＭＹＯＣＤ及び／又はＡＳＣＬ１が同じ転写物から発現されるように、ベクター内でマイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドと配置される。いくつかの実施形態において、プレｍｉＲＮＡ配列は、タンパク質コード配列（例えば、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１、又はＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤ）に対して５’である。いくつかの実施形態において、プレｍｉＲＮＡ配列は、タンパク質コード配列（例えば、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１、又はＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤ）に対して３’である。マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、５’又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に挿入され得る。マイクロＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、イントロンに挿入され得る。

本開示の組成物及び方法において有用な例示的なプレｍｉＲＮＡ配列を表１に提供する。いくつかの実施形態において、プリｍｉＲＮＡのステム又はループにおける１、２、３、４、又はそれ以上の置換及び／又は挿入が許容される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ネイティブマイクロＲＮＡ（例えば、ネイティブヒトマイクロＲＮＡ）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号６５～９９のうちのいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１００～１３４のうちのいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１３３ａ－２、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１３３ａ－１、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１９ｂ－２、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１９ｂ－１、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－３２６、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１－１、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１２９８、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１３３ｂ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１－２、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－９２ａ－２、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－２０ｂ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－２０ａ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１４１、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１５５、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１７、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－２０２、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－２００ａ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－２０６、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－５０９－１、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－５０９－２、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１２４－３、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１２４－２、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ａ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ｅ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ｈ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－３７８ｉ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１３７、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－６７１、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－２４－１、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１８２、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－３０２ｄ、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－９６、ｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－３０ｃ－２、及びｈｓａ－ｐｒｉ－ｍｉＲ－１４６ｂのうちのいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｈｓａ－ＭＩＲ－１３３ａ－２、ｈｓａ－ＭＩＲ－１３３ａ－１、ｈｓａ－ＭＩＲ－１９ｂ－２、ｈｓａ－ＭＩＲ－１９ｂ－１、ｈｓａ－ＭＩＲ－３２６、ｈｓａ－ＭＩＲ－１－１、ｈｓａ－ＭＩＲ－１２９８、ｈｓａ－ＭＩＲ－１３３ｂ、ｈｓａ－ＭＩＲ－１－２、ｈｓａ－ＭＩＲ－９２ａ－２、ｈｓａ－ＭＩＲ－２０ｂ、ｈｓａ－ＭＩＲ－２０ａ、ｈｓａ－ＭＩＲ－１４１、ｈｓａ－ＭＩＲ－１５５、ｈｓａ－ＭＩＲ－１７、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ＭＩＲ－２０２、ｈｓａ－ＭＩＲ－２００ａ、ｈｓａ－ＭＩＲ－２０６、ｈｓａ－ＭＩＲ－５０９－１、ｈｓａ－ＭＩＲ－５０９－２、ｈｓａ－ＭＩＲ－１２４－３、ｈｓａ－ＭＩＲ－１２４－２、ｈｓａ－ＭＩＲ－３７８ａ、ｈｓａ－ＭＩＲ－３７８ｅ、ｈｓａ－ＭＩＲ－３７８ｈ、ｈｓａ－ＭＩＲ－３７８ｉ、ｈｓａ－ＭＩＲ－１３７、ｈｓａ－ＭＩＲ－６７１、ｈｓａ－ＭＩＲ－２４－１、ｈｓａ－ＭＩＲ－１８２、ｈｓａ－ＭＩＲ－３０２ｄ、ｈｓａ－ＭＩＲ－９６、ｈｓａ－ＭＩＲ－３０ｃ－２、及びｈｓａ－ＭＩＲ－１４６ｂのうちのいずれか１つと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である配列を含む。

マイクロＲＮＡ結合部位
一態様では、本開示は、１つ以上の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列と、マイクロＲＮＡに対するマイクロＲＮＡ結合部位とを含むポリヌクレオチドを含むベクターであって、マイクロＲＮＡ結合部位は、１つ以上の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され、マイクロＲＮＡは、心臓線維芽細胞と比較して、心筋細胞又は心筋前駆細胞においてより高度なレベルで発現される、ベクターを提供する。マイクロＲＮＡ結合部位は、１つ以上の導入遺伝子をコードするｍＲＮＡ転写物をコードする配列にマイクロＲＮＡ結合部位を挿入することによって、ポリヌクレオチドに作動可能に連結され得る。挿入部位は、コード領域又は非コード領域にあってもよい。コード領域への挿入は、コードされたタンパク質（例えば、ループ）で許容される位置を選択し、インフレーム挿入を使用して結合部位が確実に挿入されるようにすることによって生成され得る。結合部位は、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、つまり最後の導入遺伝子の末端とポリアデニル化部位との間に挿入することができる。結合部位はまた、一対の導入遺伝子の間又は５’ＵＴＲに挿入され得る。

マイクロＲＮＡ結合部位はまた、遺伝子調節回路を介して１つ以上の導入遺伝子に間接的に結合され得る。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位は、転写のエンハンサー、翻訳のエンハンサー、又は補因子に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは複数のｍＲＮＡ転写物をコードする。マイクロＲＮＡ結合部位は、これらの転写物の一部又は全部に提供され得る。例えば、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＡＳＣＬ１をコードするｍＲＮＡ転写物をコードするポリヌクレオチド、ミオカルジンをコードするｍＲＮＡ転写物をコードするポリヌクレオチド、又はその両方に作動可能に連結され得る。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、心臓線維芽細胞と比較して、心筋細胞又は心筋前駆細胞において１つ以上の導入遺伝子の発現の特異的抑制を促進する。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、心筋細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベル、及び／又は心筋細胞リプログラミング因子で約７日間を超えて、約１週間を超えて、約２週間を超えて、約３週間を超えて、若しくは約４週間を超えて処理された心臓線維芽細胞におけるマイクロＲＮＡの発現レベルと比較して、心臓線維芽細胞においてより低いレベルで発現され、かつ／又は心筋細胞リプログラミング因子で約７日間以内、約１週間以内、約２週間以内、約３週間以内、若しくは約４週間以内で処理された心臓線維芽細胞においてより低いレベルで発現される。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－２０８である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－１３３である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－２０８ａである。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－２０８ｂである。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐである。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、

に対して７０％を超える同一性を共有し、配列ＣＧＴＣＴＴＡを含む下線のシード領域にミスマッチを共有しない、いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡ（配列番号１３６）である。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３５）である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３７）である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する少なくとも３つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する少なくとも４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する少なくとも５つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する少なくとも６つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する最大６つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は、１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及びＭＥＳＰ１のうちの２つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及びＭＥＳＰ１のうちの３つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及びＭＥＳＰ１のうちの４つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及びＭＥＳＰ１のうちの５つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１タンパク質をコードする。

本開示は、心筋細胞リプログラミング因子をコードするベクターに限定されない。実際、本明細書に記載のベクターは、選択された非標的細胞における発現が望ましくない他の遺伝子を送達し得る。例えば、限定するものではないが、ベクターは、遺伝子療法を心筋細胞以外の細胞に送達するために使用され得る。標的細胞は、心臓線維芽細胞又は任意の他の細胞型であり得る。いくつかの実施形態において、本開示のベクターは、心臓以外の器官（例えば、肺、脳、肝臓、筋肉など）における細胞の形質導入に有用である。

いくつかの実施形態において、ＭＹＯＣＤは内部欠失を含む。例示的なＭＹＯＣＤ遺伝子は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４９１５０号に提供されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’から３’の順に、プロモーター、ＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１をコードする配列、マイクロＲＮＡ結合部位、並びにポリアデニル化配列を含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３３をコードする配列を含む。

いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクターなどである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ９ベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターはＡＡＶ５ベクターである。

別の態様では、本開示は、心臓線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするための方法であって、ａ）心臓線維芽細胞の心筋細胞へのリプログラミングを誘導する有効量の組成物で心臓線維芽細胞を処理し、心臓線維芽細胞における１つ以上のマイクロＲＮＡの発現を測定することによって、誘導された心筋細胞で特異的に発現されたマイクロＲＮＡを選択することであって、選択されたマイクロＲＮＡは、所定の時間後にのみ、心臓線維芽細胞において発現される、選択することと、ｂ）１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、選択されたマイクロＲＮＡに対する１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを含むベクターを生成することと、ｃ）心臓線維芽細胞を有効量のベクターと接触させることと、を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、心筋細胞における１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子の発現を抑制する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、骨格筋細胞における１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子の発現を抑制する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、心筋細胞における１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子の発現を抑制する。

に対して＞７０％、＞７５％、＞％８０、＞９０％、＞９５％、＞９９％、又は＞１００％の同一性を共有し、配列ＣＧＴＣＴＴＡを含む下線のシード領域にミスマッチを共有しない。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡ（配列番号１３６）である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３５）である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３７）である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、

ＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３８）に対して＞７０％、＞７５％、＞％８０、＞９０％、＞９５％、＞９９％、又は＞１００％の同一性を共有する３’ＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、
ＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴＡＡＡＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３９）に対して＞７０％、＞７５％、＞％８０、＞９０％、＞９５％、＞９９％、又は＞１００％の同一性を共有する３’ＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、
ＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡ（配列番号１４０）に対して＞７０％、＞７５％、＞％８０、＞９０％、＞９５％、＞９９％、又は＞１００％の同一性を共有する３’ＵＴＲを含む。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する少なくとも４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する最大６つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡに対する４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の態様では、本開示は、心臓線維芽細胞を有効量の請求項１～２８のいずれか一項に記載のベクターと接触させることを含む、心臓線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするための、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本方法は、心臓線維芽細胞における心筋細胞表現型の少なくとも１つのマーカーの発現を誘導する。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、及び／又はｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１に対するマイクロＲＮＡ結合部位である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－１３３に対するマイクロＲＮＡ結合部位である。

いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－２０８ａに対するマイクロＲＮＡ結合部位である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－２０８ｂに対するマイクロＲＮＡ結合部位である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１３３をコードする配列を含む。

いくつかの実施形態において、心不全は心筋梗塞によるものである。いくつかの実施形態において、心不全は、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）である。いくつかの実施形態において、本方法は、投与前の対象と比較して、対象の駆出率を増加させる。

いくつかの実施形態において、本方法は、未治療の対照対象と比較して、対象の駆出率を増加させる。いくつかの実施形態において、本方法は、対象における駆出率を少なくとも約２８％、２９％、３０％、３１％、又は３２％まで増加させる。いくつかの実施形態において、駆出率は、ＡＡＶベクターの投与後、所定の時間後、任意選択的に、８週間後に評価される。いくつかの実施形態において、本方法は、投与前の対象と比較して、対象における瘢痕組織形成を減少させる。いくつかの実施形態において、本方法は、未治療の対照対象と比較して、対象における瘢痕組織形成を減少させる。いくつかの実施形態において、本方法は、対象における瘢痕組織形成を多くとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％まで減少させる。いくつかの実施形態において、瘢痕組織形成は、ＡＡＶベクターの投与後、所定の時間後、任意選択的に、８週間後に評価される。

ＩＩＩ．ベクター
いくつかの実施形態において、細胞を心臓系統にリプログラムするために使用されるリプログラミング因子は、ベクターによって選択された細胞又は選択された細胞集団に導入することができる。いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌又は酵母人工染色体、又はウイルスベクターなどの核酸ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ナノ粒子などの非核酸ベクターである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、細胞透過性ペプチド又は細胞内在化配列などのペプチドを含む。細胞透過性ペプチドは、原形質膜を通過できる小さなペプチドである。例示的な細胞透過性ペプチドには、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ－Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ－３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ－ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ－１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ－７、Ｉ－ＩＮ－１、ＢＧＳＣ（ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール）、及びＢＧＴＣ（ビス－グアニジニウム－トレン－コレステロール）が含まれるが、これらに限定されない。

組換え遺伝学の分野における技術は、そのような組換え発現のために使用することができる。組換え遺伝学の一般的な方法を開示する基本的なテキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（３ｒｄｅｄ．２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４））が挙げられる。いくつかの実施形態において、ベクターは哺乳動物の複製起点を含まない。いくつかの実施形態において、発現ベクターはゲノムに組み込まれず、かつ／又は哺乳動物の複製起点を含まないベクターを介して導入される。

場合によっては、発現ベクターは、１つ以上のリプログラミング因子に加えて、トランスフェクト、形質導入又は感染した細胞の識別又は選択を容易にするマーカー遺伝子をコードするか、又は含む。マーカー遺伝子の例としては、蛍光タンパク質、例えば，強化された緑色蛍光タンパク質、Ｄｓ－Ｒｅｄ（ＤｓＲｅｄ：Ｄｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ．赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）；Ｂｅｖｉｓｅｔａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０（１１）：８３－８７）、黄色蛍光タンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙ、及びシアノ蛍光タンパク質をコードする遺伝子、並びに選択剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子などが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、発現ベクターは、自殺遺伝子を更に含む。自殺遺伝子の発現は、少なくとも１つの増殖及び／又は細胞周期再突入因子ポリペプチドをコードするヌクレオチドを発現する同じ又は異なるプロモーターによって調節され得る。自殺遺伝子は、細胞の負の選択を可能にする遺伝子である。本明細書に記載の方法では、自殺遺伝子が安全系として使用され、遺伝子を発現する細胞が選択剤の導入によって殺されることを可能にする。これは、組換え遺伝子が制御不能な細胞増殖を引き起こす変異を引き起こす場合に望ましい。単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ又はＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｇｐｔ遺伝子、及びＥ．ｃｏｌｉＤｅｏ遺伝子（例えば、ＹａｚａｗａＫ，ＦｉｓｈｅｒＷＥ，ＢｒｕｎｉｃａｒｄｉＦＣ：Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｓｕｉｃｉｄｅｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃａｎｃｅｒ．ＷｏｒｌｄＪ．Ｓｕｒｇ．（２００２）２６（７）：７８３－９）も参照されたい）を含む多数の自殺遺伝子系が同定されている。一実施形態において、自殺遺伝子は、ＴＫ遺伝子である。一態様では、ＴＫ遺伝子は、野生型ＴＫ遺伝子である。他の態様において、ＴＫ遺伝子は、遺伝子の変異型、例えば、ｓｒ２３ｔｋである。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを使用して殺すことができる。別の実施形態において、テトラサイクリン活性化タンパク質をコードする核酸及び自殺遺伝子は、１つのプロモーターによって調節される。

Ａ．核酸ベクター
１．ウイルスベクター
適切なウイルスベクターには、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Ｌｉｅｔａｌ．（１９９４）ＩｎｖｅｓｔＯｐｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ３５：２５４３－２５４９；Ｂｏｒｒａｓｅｔａｌ．（１９９９）ＧｅｎｅＴｈｅｒ６：５１５－５２４；ＬｉａｎｄＤａｖｉｄｓｏｎ，（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：７７００－７７０４；Ｓａｋａｍｏｔｏｅｔａｌ．（１９９９）ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ５：１０８８－１０９７；ＷＯ９４／１２６４９；ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉｅｔａｌ．（１９９８）ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ９（ｌ）：８１－８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙｅｔａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：６９１６－６９２１；Ｂｅｎｎｅｔｔｅｔａｌ．（１９９７）ＩｎｖｅｓｔＯｐｔｈａｌｍｏｌＶｉｓＳｃｉ３８：２８５７－２８６３；Ｊｏｍａｒｙｅｔａｌ．（１９９７）ＧｅｎｅＴｈｅｒ４：６８３－６９０；Ｒｏｌｌｉｎｇｅｔａｌ．（１９９９），ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ１０：６４１－６４８；Ａｌｉｅｔａｌ．（１９９６）ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ．５：５９１－５９４；ＷＯ９３／０９２３９，Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２－３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎｅｔａｌ．（１９８８）Ｖｉｒｏｌ．１６６：１５４－１６５；及びＦｌｏｔｔｅｅｔａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１０６１３－１０６１７；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉｅｔａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１０３１９－１０３２３；Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔａｌ．（１９９９）ＪＶｉｒｏｌ７３：７８１２－７８１６）；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び乳がんウイルスなどのレトロウイルス由来のベクター）などが含まれるが、これらに限定されない。多数の適切な発現ベクターが当業者に知られており、多くは市販されている。以下のベクターは、真核細胞についての例として提供されている：ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、及びｐＡｄ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。しかしながら、本開示の細胞と適合する限り、任意の他のベクターを使用することができる。

特定のウイルスが細胞に感染したり、受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に侵入したり、ウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現したりする能力により、外来核酸を細胞（哺乳動物細胞など）に移入する魅力的な候補となっている。ウイルスベクターは、目的のポリペプチドの発現のためのプロモーターなどの制御配列を含むことができる。多くのウイルスベクターは宿主細胞ゲノムに組み込まれるが、必要に応じて、そのような組み込みを可能にするセグメントを削除又は改変して、そのような組み込みを防ぐことができる。更に、いくつかの実施形態において、ベクターは哺乳動物の複製起点を含まない。転写因子をコードする核酸を選択された細胞に送達するために使用できるウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、複製欠損ウイルスに由来する。

一般に、他の有用なウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的のポリペプチドで置換されている非細胞変性真核ウイルスに基づいている。非細胞変性ウイルスには特定のレトロウイルスが含まれ、その生活環にはゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とそれに続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みが含まれる。一般に、レトロウイルスは複製欠損性である（例えば、所望の転写物の合成を指示することはできるが、感染性粒子を製造することはできない）。そのような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、一般に、インビボでのポリヌクレオチドの高効率な形質導入に有用である。

いくつかの実施形態において、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、特異的結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルス内に収容することができる。したがってウイルス粒子は、標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。いくつかの実施形態において、ウイルスは、特定のウイルス指向性を付与するように修飾され、例えば、ウイルスは、線維芽細胞、心臓細胞、又はより具体的には心臓線維芽細胞（ＣＦ）に優先的に感染する。ＡＡＶの場合、カプシドタンパク質を変異させてウイルスベクターの指向性を改変することができる。レンチウイルスの場合、異なるエンベロープタンパク質を使用することで指向性を修飾できる。これは「シュードタイピング」として知られている。

ａ．レトロウイルスベクター
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を移入し、広範囲の種及び細胞型に感染し、特別な細胞株にパッケージングされることができる（Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１５（３）：２１６－２２１，１９９２）。いくつかの実施形態において、レトロウイルスベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれないように改変される。

組換えレトロウイルスは、標的細胞への侵入を助けるウイルスポリペプチド（例えば、レトロウイルスｅｎｖ）を含み得る。そのようなウイルスポリペプチドは、例えば、米国特許第５，４４９，６１４号など、当技術分野で十分に確立されている。ウイルスポリペプチドは、元の宿主種以外の細胞を含む、複数の種に由来する細胞への侵入を助ける両指向性ウイルスポリペプチド、例えば、両指向性ｅｎｖであり得る。ウイルスポリペプチドは、元の宿主種以外の細胞への侵入を助ける異種指向性ウイルスポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態において、ウイルスポリペプチドは、元の宿主種の細胞への侵入を助ける同種指向性ウイルスポリペプチド、例えば、同種指向性ｅｎｖである。

レトロウイルスの細胞への侵入を助けることができるウイルスポリペプチドの例には、ＭＭＬＶ両指向性ｅｎｖ、ＭＭＬＶ同種指向性ｅｎｖ、ＭＭＬＶ異種指向性ｅｎｖ、水疱性口内炎ウイルス－ｇタンパク質（ＶＳＶ－ｇ）、ＨＩＶ－１ｅｎｖ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖ、ＲＤ１１４、ＦｅＬＶ－Ｃ、ＦｅＬＶ－Ｂ、ＭＬＶ１０Ａ１ｅｎｖ遺伝子、及びキメラを含むそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。Ｙｅｅｅｔａｌ．（１９９４）ＭｅｔｈｏｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌ，ＰｔＡ：９９－ｌ１２（ＶＳＶ－Ｇ）；米国特許第５，４４９，６１４号。場合によっては、ウイルスポリペプチドは、遺伝子修飾されて、発現を促進するか、又は受容体への結合を増強する。

レトロウイルス構築物は、一連のレトロウイルス、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ－１、ＳＩＶ、ＦＩＶ、又は本明細書に記載の別のレトロウイルスに由来し得る。レトロウイルス構築物は、特定のウイルスの２つ以上の複製サイクルに必要な全てのウイルスポリペプチドをコードし得る。場合によっては、ウイルス侵入の効率は、他の因子又は他のウイルスポリペプチドの添加によって改善される。他の場合では、レトロウイルス構築物によってコードされるウイルスポリペプチドは、２つ以上の複製サイクルを支持しない（例えば、米国特許第６，８７２，５２８号）。このような状況では、他の因子又は他のウイルスポリペプチドの添加は、ウイルスの侵入を促進するのに役立つ。例示的な一実施形態において、組換えレトロウイルスは、ＶＳＶ－ｇポリペプチドを含むが、ＨＩＶ－１ｅｎｖポリペプチドを含まないＨＩＶ－１ウイルスである。

レトロウイルス構築物は、プロモーター、マルチクローニング部位、及び／又は耐性遺伝子を含み得る。プロモーターの例には、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦｌａ、β－アクチン、レトロウイルスＬＴＲプロモーター、及び誘導性プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。レトロウイルス構築物はまた、パッケージングシグナル（例えば、ＭＦＧベクターに由来するパッケージングシグナル；ｐｓｉパッケージングシグナル）を含み得る。当技術分野で知られているいくつかのレトロウイルス構築物の例には、ｐＭＸ、ｐＢａｂｅＸ又はそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。Ｏｎｉｓｈｉｅｔａｌ．（１９９６）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４－３２９．場合によっては、レトロウイルス構築物は、自己不活化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ）ベクターである。Ｍｉｙｏｓｈｉｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７２（１０）：８１５０－８１５７．場合によっては、レトロウイルス構築物は、ＬＬ－ＣＧ、ＬＳ－ＣＧ、ＣＬ－ＣＧ、ＣＳ－ＣＧ、ＣＬＧ又はＭＦＧである。Ｍｉｙｏｓｈｉｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７２（１０）：８１５０－８１５７；Ｏｎｉｓｈｉｅｔａｌ．（１９９６）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４－３２９；Ｒｉｖｉｅｒｅｅｔａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：６７３３－６７３７．

レトロウイルスベクターは、いくつかのウイルス配列の代わりに核酸（例えば、目的のポリペプチド又はＲＮＡをコードするもの）をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損ウイルスを生成することによって構築することができる。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲ及びパッケージング成分を含有しないパッケージング細胞系が構築される（Ｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ３３：１５３－１５９，１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列とともに、ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドが特別な細胞株に導入されると（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列により、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物のウイルス粒子へのパッケージ化が可能となり、その後、培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓａｎｄＲｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｓｕｒｖｅｙｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｕｓｅｓ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚａｎｄＤｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４－５１３，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），ＮｅｗＹｏｒｋ：ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９－１８８，１９８６；Ｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３－１５９，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、任意選択的に、濃縮し、遺伝子移入に使用する。レトロウイルスベクターは、様々な種類の細胞に感染することができる。しかし、組み込み及び安定した発現は、典型的には、宿主細胞の分裂を伴う（Ｐａｓｋｉｎｄｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：２４２－２４８，１９７５）。

ｂ．アデノウイルスベクター
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスの遺伝子構成には、約３６ｋｂの線状の二本鎖ＤＮＡウイルスが含まれており、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片を７ｋｂまでの外来配列で置換することができる（Ｇｒｕｎｈａｕｓｅｔａｌ．，ＳｅｍｉｎａｒｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ２００（２）：５３５－５４６，１９９２））。リプログラミング因子は、アデノウイルス補助トランスフェクションを使用して細胞に導入することができる。アデノウイルス共役系を用いた細胞系でのトランスフェクション効率の増加が報告されている（ＫｅｌｌｅｈｅｒａｎｄＶｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－７，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，８９（１３）：６０９４－６０９８，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，ＮａｔＩｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４，１９９４）。

ｃ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、高い統合頻度を有し、非分裂細胞に感染可能であるため、魅力的なベクターシステムである。そのため、例えば、組織培養又はインビボにおける哺乳動物細胞へのポリヌクレオチドの送達に有用である（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９，１９９２）。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されており、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＡＡＶは複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは長さが約４．７ｋｂで、２つの１４５ヌクレオチド逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は知られている。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６（２００６）で提供され、並びにＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３（２００４）で提供される。ＡＡＶｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号で提供される。ウイルスＤＮＡの複製（ｒｅｐ）、カプシド形成／パッケージング、及び宿主細胞の染色体統合を指示するシス作用配列は、ＡＡＶＩＴＲ内に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（相対的なマップ位置からｐ５、ｐｌ９、及びｐ４０と命名される）は、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐｉ９）は、単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７及び２２２７）の異なるスプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及びｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素特性を持っている。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現し、３つのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。代替的なスプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与している。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置する。ＡＡＶの生活環及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７－１２９（１９９２）で概説されている。

ＡＡＶは、遺伝子療法などで外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとして魅力的な独自の機能を備えている。培養における細胞のＡＡＶ感染は非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染はサイレントで無症候性である。更に、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染し、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を可能とする。更に、ＡＡＶは、ゆっくりと分裂している細胞と分裂していない細胞に形質導入し、それらの細胞の寿命にわたって、転写的に活性な核エピソーム（染色体外エレメント）として本質的に存続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミドにクローン化されたＤＮＡとして挿入されるため、組換えゲノムの構築が可能となる。更に、ＡＡＶの複製及びゲノムのカプシド形成を指示するシグナルはＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されているため、ゲノムの内部の約４．３ｋｂの一部又は全て（複製及び構造カプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）は、外来ＤＮＡで置換されてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をトランスで提供することができる。ＡＡＶのもう１つの重要な特徴は、非常に安定した強力なウイルスであることである。アデノウイルスの不活性化に使用される条件（５６～６５℃で数時間）に容易に耐えられるため、ＡＡＶの冷蔵保存はあまり重要ではない。ＡＡＶは凍結乾燥することもできる。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に耐性がない。

ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶＤＮＡは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、及びＡＡＶｒｈ７４を含むがこれらに限定されない、組換えウイルスを誘導することができる任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。シュードタイプ化ｒＡＡＶの産生は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他の型のｒＡＡＶバリアント、例えば、カプシド変異を有するｒＡＡＶも企図される。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列が当技術分野で知られている。本開示のＡＡＶベクターには、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ３９、ＡＡＶ４３、ＡＡＶ．ｒｈ７４、及びＡＡＶ．ｒｈ８のＡＡＶベクターが含まれる。例示的なＡＡＶベクターは、ＵＳ７，１０５，３４５号；ＵＳ１５／７８２，９８０号；ＵＳ７，２５９，１５１号；ＵＳ６，９６２，８１５号；ＵＳ７，７１８，４２４号；ＵＳ６，９８４，５１７号；ＵＳ７，７１８，４２４号；ＵＳ６，１５６，３０３号；ＵＳ８，５２４，４４６号；ＵＳ７，７９０，４４９号；ＵＳ７，９０６，１１１号；ＵＳ９，７３７，６１８号；米国出願第１５／４３３，３２２号；ＵＳ７，１９８，９５１号で提供されており、それぞれが参照によりその全体が組み込まれる。

いくつかの実施形態において、ＡＡＶ発現ベクターは、標的化を強化するためにシュードタイプ化される。遺伝子移入を促進し、線維芽細胞での発現を維持するには、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、及びＡＡＶ８を使用できる。場合によっては、ＡＡＶ２ゲノムは、Ｂａｌａｊｉｅｔａｌ．ＪＳｕｒｇＲｅｓ．２０１３Ｓｅｐ；１８４（１）：６９１－６９８で記載されているように、シュードタイプ化ベクターＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７、及びＡＡＶ２／８をそれぞれ生成するカプシドへパッケージングされる。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ９は、Ｐｉｒａｓｅｔａｌ．ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２３：４６９－４７８（２０１６）に記載されているように、筋線維芽細胞様系統における発現を標的とするために使用され得る。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、又はＡＡＶ９が使用され、いくつかの実施形態において、ＡＡＶは、Ａｓｏｋａｒｉｅｔａｌ．ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．２０１３Ｎｏｖ；２４（１１）：９０６－９１３；Ｐｏｚｓｇａｉｅｔａｌ．ＭｏｌＴｈｅｒ．２０１７Ａｐｒ５；２５（４）：８５５－８６９；Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．ａｎｄＤ．Ｖ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ（２０１４）ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＡｄｅｎｏ－ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓｅｓｆｏｒＣｌｉｎｉｃａｌＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＧｅｎｅｔｉｃｓ，１５：４４５－４５１；及びＵＳ２０１６／０３４０３９３Ａ１、Ｓｃｈａｆｆｅｒｅｔａｌで記載されているように操作される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、ＵＳ２０１８／００６６２８５Ａ１に記載されているように、標的細胞の感染性を高めるように操作されたＡＡＶである。

ｄ．レンチウイルスベクター
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を持つ他の遺伝子を含んでいる。レンチウイルスベクターに関する情報は、例えば、Ｎａｌｄｉｎｉｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２（５２５９）：２６３－２６７，１９９６、Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ１５（９）：８７１－８７５，１９９７、Ｂｌｏｍｅｒｅｔａｌ．，ＪＶｉｒｏｌ．７１（９）：６６４１－６６４９，１９９７、米国特許第６，０１３，５１６号及び第５，９９４，１３６号に記載されており、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。レンチウイルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、及びサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病毒性遺伝子を弱毒化することによって生成されている。例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆは、ベクターを生物学的に安全にするために削除される。利用されるレンチウイルスは、複製及び／又は統合に欠陥がある場合もある。

組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、インビボ及びエクスビボの両方の遺伝子移入及び核酸配列の発現に使用することができる。例えば、適切な宿主細胞がパッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びにｒｅｖ及びｔａｔを担持する２つ以上のベクターでトランスフェクトされる、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスは、米国特許第５，９９４，１３６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、エンベロープタンパク質を特定の細胞型の受容体を標的とする抗体又は特定のリガンドと結合させることにより、組換えウイルスを標的とすることができる。例えば、標的特異的ベクターは、特定の標的細胞型上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに、目的の核酸セグメント（調節領域を含む）をウイルスベクターに挿入することによって生成することができる。

レンチウイルスベクターは当技術分野で知られており全て参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｌｄｉｎｉｅｔａｌ．，（１９９６及び１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙｅｔａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌｅｔａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号及び第５，９９４，１３６号を参照されたい。一般に、これらのベクターはプラスミドに基づくか、又はウイルスに基づくものであり、外来核酸の取り込み、選択、及び宿主細胞への核酸の移入に不可欠な配列を担持するように構成されている。場合によっては、レンチウイルスベクターは、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＲＳＶ－ｒｅｖ、ｐＭＤＬＧ－ｐＲＲＥ、及びｐＲＲＬ－ＧＯＩを含むがこれらに限定されない１つ以上のレンチウイルスパッケージングプラスミドと同時に細胞に導入される。レンチウイルスベクターを単独で、又はレンチウイルスパッケージングプラスミドと組み合わせて細胞に導入すると、レンチウイルスベクターがレンチウイルス粒子にパッケージ化される可能性がある。

２．ウイルスベクターの作製方法
一般に、ウイルスベクターは、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ構築物をプロデューサー細胞に導入することによって生成される。場合によっては、プロデューサー細胞は、外因性遺伝子を発現しない。他の場合において、プロデューサー細胞は、１つ以上の外因性遺伝子、例えば、１つ以上のｇａｇ、ｐｏｌ、若しくはｅｎｖポリペプチド及び／又は１つ以上のレトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、若しくはｅｎｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む「パッケージング細胞」である。レトロウイルスパッケージング細胞は、標的細胞への侵入を助けるウイルスポリペプチド、例えばＶＳＶ－ｇをコードする遺伝子を含み得る。場合によっては、パッケージング細胞は、１つ以上のレンチウイルスタンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、又はｎｅｆをコードする遺伝子を含む。場合によっては、パッケージング細胞は、Ｅ１Ａ又はＥ１Ｂなどのアデノウイルスタンパク質又は他のアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、パッケージング細胞によって供給されるタンパク質は、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖなどのレトロウイルス由来のタンパク質、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、及びｎｅｆなどのレンチウイルス由来タンパク質、並びにＥｌＡ及びＥ１Ｂなどのアデノウイルス由来のタンパク質であり得る。多くの例において、パッケージング細胞は、ウイルスベクターが由来するウイルスとは異なるウイルスに由来するタンパク質を供給する。パッケージング細胞から組換えウイルスを作製する方法及びその使用方法は十分に確立されている。例えば、米国特許第５，８３４，２５６号、第６，９１０，４３４号、第５，５９１，６２４号、第５，８１７，４９１号、第７，０７０，９９４号、及び第６，９９５，００９号を参照されたい。

パッケージング細胞株には、容易にトランスフェクト可能な細胞株が含まれるが、これらに限定されない。パッケージング細胞株は、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ、又はＨｅＬａ細胞株に基づくことができる。パッケージング細胞は、ウイルスのパッケージングに必要なタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が欠損しているウイルスベクタープラスミドをパッケージ化するためによく使用される。そのようなウイルスベクター又はプラスミドによってコードされるタンパク質を欠くタンパク質又はポリペプチドを供給できる任意の細胞を、パッケージング細胞として使用することができる。パッケージング細胞株の例には、プラチナ－Ｅ（Ｐｌａｔ－Ｅ）、プラチナ－Ａ（Ｐｌａｔ－Ａ）、ＢＯＳＣ２３（ＡＴＣＣＣＲＬ１１５５４）、及びＢｉｎｇ（ＡＴＣＣＣＲＬ１１２７０）が含まれるが、これらに限定されない。Ｍｏｒｉｔａｅｔａｌ．（２０００）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ７（１２）：１０６３－１０６６；Ｏｎｉｓｈｉｅｔａｌ．（１９９６）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２４：３２４－３２９、米国特許第６，９９５，００９号。市販のパッケージング株、例えば、Ａｍｐｈｏ－Ｐａｋ２９３細胞株、Ｅｃｏ－Ｐａｋ２－２９３細胞株、ＲｅｔｒｏＰａｃｋＰＴ６７細胞株、及びレトロ－Ｘユニバーサルパッケージングシステム（全てＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能）も有用である。

３．プラスミド
ウイルスベクタープラスミド（又は構築物）には、ｐＭＸｓ、ｐＭｘｓ－ＩＢ、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＭＸｓ－ｎｅｏ（ｐＭＸｓ－ＩＢは、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりにブラストサイジン耐性遺伝子を運ぶベクター）Ｋｉｍａｔｕｒａｅｔａｌ．（２００３）ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＨｅｍａｔｏｌｏｇｙ３１：１００７－１０１４；ＭＦＧＲｉｖｉｅｒｅｅｔａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：６７３３－６７３７；ｐＢａｂｅＰｕｒｏ；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎｅｔａｌ．（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：３５８７－３５９６；レトロウイルス系としてＬＬ－ＣＧ、ＣＬ－ＣＧ、ＣＳ－ＣＧ、ＣＬＧＭｉｙｏｓｈｉｅｔａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒ．７２：８１５０－８１５７等、及びアデノウイルス系としてｐＡｄｅｘｌＫａｎｅｇａｅｅｔａｌ．（１９９５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２３：３８１６－３８２１等が含まれる。例示的な実施形態において、レトロウイルス構築物は、ブラストサイジン（例えば、ｐＭＸｓ－ＩＢ）、ピューロマイシン（例えば、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ）、又はネオマイシン（例えば、ｐＭＸｓ－ｎｅｏ）を含む。Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎｅｔａｌ．（１９９０）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：３５８７－３５９６．

いくつかの実施形態において、ウイルスベクター又はプラスミドは、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾン又は転移エレメントを含む。ｐｉｇｇｙＢａｃ及びＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙなどのＤＮＡトランスポゾンを介したポリヌクレオチドの送達は、使いやすさ、より大きなカーゴの送達能力、臨床への迅速さ、及び生産コストの点で利点がある。特に、ｐｉｇｇｙＢａｃＤＮＡトランスポゾンは、ポリヌクレオチドの長期にわたる高レベルで安定した発現を可能にし、変異原性が有意に低く、発がん性がなく、かつ完全に可逆的であるという潜在的な利点を提供する。

４．導入されたＲＮＡからの直接翻訳
選択した細胞で１つ以上の導入遺伝子が一過性に発現する場合、目的の遺伝子をＲＮＡ分子として導入できる。これは、細胞の細胞質内でタンパク質に翻訳される。例えば、目的のタンパク質は、翻訳開始シグナル（例えば、強力なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナル）を含む５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、及びポリＡ末端の鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列で終了する３’非翻訳領域が隣接する、ポリペプチドのためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する導入されたＲＮＡ分子から翻訳することができる。そのようなＲＮＡ分子は、ほとんどの発現ベクター及び発現カセットで利用されるプロモーター配列を有していない。ＲＮＡ分子は、エレクトロポレーション、又はカチオン性ビヒクルと複合体を形成したＲＮＡのエンドサイトーシスを含む様々な技術によって、選択された細胞に導入することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｗａｒｒｅｎら、ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ７：６１８－３０（２０１０）を参照されたい。

タンパク質の翻訳は、特にＲＮＡ分子が修飾リボヌクレオチドの取り込みによって安定化されている場合、数日間持続する可能性がある。例えば、シチジンの場合は５－メチルシチジン（５ｍＣ）を、ウリジンの場合はシュードウリジン（ｐｓｉ）を組み込むと、導入されたＲＮＡのインビボでの半減期が改善され、タンパク質の翻訳の増加に至る。高レベルの発現が所望される場合、又は数日以上の発現が所望される場合は、選択した細胞にＲＮＡを繰り返し導入できる。タンパク質をコードするＲＮＡはまた、５’キャップ、核局在化シグナル、又はそれらの組み合わせを含むことができる。

そのようなＲＮＡ分子は、例えば、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧＡＲＣＡキャップ類似体、アデノシン三リン酸及びグアノシン三リン酸、５－メチルシチジン三リン酸及びシュードウリジン三リン酸を含むリボヌクレオチドブレンドを使用して、目的のポリヌクレオチドについての鋳型のインビトロ転写によって、作成することができる。ＲＮＡ分子をホスファターゼで処理して、細胞毒性を軽減することもできる。

マイクロＲＮＡは、細胞又は細胞集団に導入された発現カセット又は発現ベクターから発現させることができる。あるいは、マイクロＲＮＡは、例えば、リポソーム、マイクロベシクル、又はエキソソームなどの送達ビヒクル中で、細胞に直接導入することができる。単一のＲＮＡは、タンパク質コード配列及びマイクロＲＮＡの両方を含むことができる。

Ｂ．非核酸ベクター
特定の実施形態において、ベクターは、参照により本明細書に組み込まれるＫａｎａｓｔｙＲ，ＤｅｌｉｖｅｒｙｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｓｉＲＮＡｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＮａｔＭａｔｅｒ．１２（１１）：９６７－７７（２０１３）で記載されているように、脂質粒子を含む。いくつかの実施形態において、脂質に基づくベクターは、脂質ナノ粒子であり、これはサイズが約１～約１００ナノメートルの脂質粒子である。

いくつかの実施形態において、脂質に基づくベクターは脂質又はリポソームである。リポソームは、脂質二重層を含む人工の球状小胞である。

いくつかの実施形態において、脂質に基づくベクターは、小さな核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）である。ＳＮＡＬＰは、核酸をカプセル化する小さな（直径２００ｎｍ未満）脂質に基づくナノ粒子で構成される。いくつかの実施形態において、ＳＮＡＬＰは、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ分子の送達に有用である。いくつかの実施形態において、ＳＮＡＬＰ製剤は、心臓などの対象の特定の組織に核酸を送達する。

いくつかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドは、ポリマーベクターを介して送達される。いくつかの実施形態において、ポリマーベクターは、ポリマー又はポリマーソームである。ポリマーは、モノマーの任意の長い反復鎖を包含し、例えば、線状ポリマー、分岐ポリマー、デンドリマー、及び多糖類を含む。線状ポリマーは単一のモノマー列で構成されるが、分岐ポリマーはモノマーの側鎖を含む。デンドリマーは分岐分子でもあり、分子のコアの周りに対称的に配置される。多糖類は高分子炭水化物分子であり、互いに結合した長い単糖単位で構成されている。ポリマーソームは、ベシクル膜を形成する合成両親媒性共重合体で構成される人工ベシクルであり、ベシクル膜内に中空又は水性のコアを有する場合がある。

１つ以上のリプログラミング因子をコードするＤＮＡ又はＲＮＡを投与するためのビヒクルとして、様々なポリマーに基づくシステムを適合させることができる。ポリマーに基づくシステムの例としては、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド））（ＰＬＬＡ）、ＰＬＧＡ－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ－ｂＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、ＰＬＬＡ－ｂＰＥＧ－ＰＬＬＡ、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－マレイミド（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ｍａｌ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）－コ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－カプロラクトン－コ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＥＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－コ－ＰＰＯ－コ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクラレート（ｃｙａｎｏａｃｒａｌａｔｅ）、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、メタクリル酸ヒドロキシプロピル（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート；ポリエチレン及びポリプロピレンなどのポリアルキレン；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリアルキレングリコール；ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）；ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリアルキレンテレフタレート；ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル；ポリ（酢酸ビニル）などのポリビニルエステル；ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）などのポリビニルハロゲン化物；ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン；アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの誘導体化セルロース；アクリル酸のポリマー、例えば、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）（ポリアクリル酸）並びにそれらのコポリマー及び混合物；ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート）、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ（［β］－アミノエステル（ＰＢＡＥ）、及びポリホスホエステル、並びに２つ以上のそのようなポリマーのブレンド及び／又はブロックコポリマー．が挙げられる。ポリマーに基づくシステムはまた、シクロデキストリンポリマー（ＣＤＰ）に基づくナノ粒子、例えば、ＣＤＰ－アダマンタン（ＡＤ）－ＰＥＧコンジュゲート及びＣＤＰ－ＡＤ－ＰＥＧ－トランスフェリンコンジュゲートなどを含み得る。

いくつかの実施形態において、脂質に基づくベクターは、脂質カプセル化システムを含む。脂質カプセル化システムは、必要な循環時間及び生分解特性を提供するだけでなく、望ましい組織分布及び細胞侵入特性を促進するように設計できる。脂質カプセル化は、逆ミセルを含み、かつ／又は例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，１９３，３３４号に記載されるように、ポリマーマトリックスを更に含み得る。いくつかの実施形態において、粒子は、優先的な方法を含む、組織への粒子の送達を増強する親油性送達化合物を含む。そのような化合物は、ＵＳ２０１３／０１５８０２１号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような化合物は、一般に、親油性基及び共役アミノ酸又はペプチド（線状又は環状ペプチドを含む）、及びそれらの異性体を含み得る。いくつかの実施形態において、脂質カプセル化は、リン脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質、及び親油性化合物のうちの１つ以上を含む。

粒子は、脂質であろうとポリマーであろうと、あるいはその両方であろうと、インビボ核酸送達の特性を高めるのに有用な追加の成分を含むことができる（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，４５０，２９８及びＵＳ２０１２／０２５１５６０に開示されている化合物を含む）。送達ビヒクルは、特定の組織に優先的に蓄積し、それによって組織標的化効果を提供することができるが、いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは、少なくとも１つの細胞標的化リガンド又は組織標的化リガンドを更に含む。例示的な標的化リガンドを含む機能化粒子は、ＵＳ２０１０／０３０３７２３及び２０１２／０１５６１３５に開示されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

送達ビヒクルは、必要な循環時間及び生分解特性を提供するだけでなく、本明細書に記載される送達システムの望ましい組織分布及び細胞侵入特性を促進するように設計できる。例えば、脂質粒子は、ＵＳ２０１１／０００９６４１に開示されているアミノ脂質を使用することができ、これは参照により本明細書に組み込まれる。

脂質又はポリマー粒子は、約５０ｎｍ～約５μｍの範囲のサイズ（例えば、平均サイズ）を有し得る。いくつかの実施形態において、粒子は、約１０ｎｍ～約１００μｍ、又は約２０ｎｍ～約５０μｍ、又は約５０ｎｍ～約５μｍ、又は約７０ｎｍ～約５００ｎｍ、又は約７０ｎｍ～約２００ｎｍ、又は約５０ｎｍ～約１００ｎｍの範囲である。免疫系による急速なクリアランスを回避するように粒子を選択することができる。特定の実施形態において、粒子は球形又は非球形であり得る。

Ｃ．プロモーター及びエンハンサー
いくつかの実施形態において、リプログラミング因子をコードする核酸は、プロモーター及び／又はエンハンサーに作動可能に連結されて、リプログラミング因子の発現を促進することができる。利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多数の好適な転写及び翻訳制御エレメントのうちのいずれかを発現ベクターにおいて使用することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒｅｔａｌ．（１９８７）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４）。

ポリヌクレオチドのそれぞれに対して別個のプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することができる。いくつかの実施形態において、同じプロモーター及び／又はエンハンサーが、単一のオープンリーディングフレーム内の２つ以上のポリヌクレオチドに使用される。遺伝エレメントのこの構成を使用するベクターは、「ポリシストロン性」と呼ばれる。ポリシストロン性ベクターの一例は、２Ａ領域によって連結された２つ以上のポリヌクレオチドを含む単一のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたエンハンサー及びプロモーターを含み、それによってオープンリーディングフレームの発現により、複数のポリペプチドが同時に翻訳的に生成される。２Ａ領域は、コドンスキッピングによって複数のポリペプチド配列の生成を仲介すると考えられている。しかしながら、本開示はまた、翻訳後切断を利用して、同じポリヌクレオチドから目的の２つ以上の遺伝子に対するポリペプチドを生成するポリシストロン性ベクターにも関する。例示的な２Ａ配列、ベクター、及び関連する方法は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００４／０２６５９５５Ａ１に提供されている。本開示の他のポリシストロン性ベクターは、内部プロモーター、スプライシング、再開始、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質分解性切断可能部位（例えば、フサゲン）、及び遺伝子の融合を利用する。

適切な真核生物プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例には、ＣＭＶ、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、及びマウスメタロチオネイン－Ｉが含まれる。いくつかの実施形態において、心臓特異的発現を与えることができるプロモーターが使用される。適切な心臓特異的プロモーターの非限定的な例には、デスミン（Ｄｅｓ）、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、及び心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）が含まれる。適切なニューロン特異的プロモーターの非限定的な例には、シナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ、チューブリンアルファＩ、ニューロン特異的エノラーゼ及び血小板由来増殖因子ベータ鎖プロモーター、並びにサイトメガロウイルスエンハンサー（Ｅ）をそれらのニューロン特異的プロモーターに融合することによるハイブリッドプロモーターが含まれる。

発現リプログラミング因子を駆動するための適切なプロモーターの例には、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）エレメント；ＣＭＶ、ＨＳＶ１－ＴＫ、ＳＶ４０、ＥＦ－１ａ、β－アクチン、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）などの構成的プロモーター；Ｔｅｔオペレーターエレメントを含有するものなどの誘導性プロモーター；心臓特異的プロモーター、例えば、デスミン（Ｄｅｓ）、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、及び心筋トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）；神経特異的プロモーター、例えば、ネスチン、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ２）、ベータＩＩＩチューブリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、オリゴデンドロサイト系統（Ｏｌｉｇｌ／２）、及びグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；並びに膵臓特異的プロモーター、例えば、Ｐａｘ４、Ｎｋｘ２．２、Ｎｇｎ３、インスリン、グルカゴン、及びソマトスタチンが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞型特異的転写調節因子（ＴＲＥ）に作動可能に連結され、ＴＲＥはプロモーター及びエンハンサーを含む。適切なＴＲＥには、以下の遺伝子：ミオシン軽鎖２、ａ－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、及び心臓アクチン、に由来するＴＲＥが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｒａｎｚｅｔａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０－５６６；Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２－５０５；Ｌｉｎｎｅｔａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４－５９１；Ｐａｒｍａｃｅｋｅｔａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０－１８８５；Ｈｕｎｔｅｒｅｔａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ２２：６０８－６１７；及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉｅｔａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４０４７－４０５１．

プロモーターは、遺伝子又は核酸セグメントと天然に関連するものであり得る。同様に、ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）の場合、プロモーターは、マイクロＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ－３０２遺伝子）と天然に関連するものであり得る。そのような天然に関連するプロモーターは「天然プロモーター」と呼ぶことができ、コードセグメント及び／又はエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列と天然に関連するものであり得る。ただし、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに配置できる。

あるいは、コード核酸セグメントを組換えプロモーター又は異種プロモーターの制御下に配置することによって、特定の利点が得られ、これらのプロモーターは、その天然の環境における核酸と通常は関連していないプロモーターを指す。組換え又は異種エンハンサーはまた、その天然環境において核酸配列と通常関連していないエンハンサーを指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他の原核細胞、ウイルス細胞、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在しない」プロモーター又はエンハンサー、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は発現を変化させる変異を含むプロモーター又はエンハンサーが含まれ得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示された組成物と関連して、ＰＣＲ（商標）を含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して生成されてもよい（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第．５，９２８，９０６号を参照されたい）。

利用されるプロモーターは、構成的、誘導可能、発生段階特異的、組織特異的であるか、及び／又は核酸セグメントの高レベル発現を指示する適切な条件下で有用であり得る。例えば、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＨＳＶ１－ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、又はそれらの組み合わせなどの構成的プロモーターであり得る。使用できる真核生物プロモーターの例には、構成的プロモーター、例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０及びＲＳＶプロモーターなどのウイルスプロモーター、並びに制御可能なプロモーター、例えば、ｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター及びＣＲＥによって調節される合成プロモーターなどの誘導性又は抑制性プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、ニワトリベータアクチンプロモーター、及びＳＶ－４０イントロンを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、ニワトリベータアクチンプロモーター、及びＣＭＶイントロンを含む。使用できるプロモーターの他の例には、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかに関連するウイルスプロモーター、又は本明細書に記載のプロモーターのいずれかに相同な（例えば、別の種からの）プロモーターが含まれる。使用できる原核プロモーターの例には、ＳＰ６、Ｔ７、Ｔ５、ｔａｃ、ｂｌａ、ｔｒｐ、ｇａｌ、ｌａｃ、又はマルトースプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを使用して、多重遺伝子又はポリシストロン性メッセージを作成することができる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存翻訳のリボソーム走査モデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒａｎｄＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ３３４（６１８０）：３２０－３２５（１９８８））。ピコルナウイルス科の２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのＩＲＥＳエレメントが記載されており（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒａｎｄＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ３３４（６１８０）：３２０－３２５（１９８８））、並びに哺乳類のメッセージからのＩＲＥＳも記載されている（Ｍａｃｅｊａｋ＆Ｓａｍｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ３５３：９０－９４（１９９１））。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結できる。複数のオープンリーディングフレームをまとめて転写することができ、それぞれがＩＲＥＳで区切られ、ポリシストロン性メッセージが作成される。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、効率的な翻訳のためにリボソームが各オープンリーディングフレームにアクセスできる。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写する単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現することができる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号及び第５，９３５，８１９号を参照されたい）。

Ｄ．細胞へのベクター送達
ウイルスベクターは、リン酸カルシウム法、リポフェクション法（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒｅｔａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７４１３－７４１７）、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション、ヌクレオフェクションなどを含むがこれらに限定されない当該技術分野で知られている任意の方法、及び本明細書に記載の任意の方法によって、標的細胞（例えば、線維芽細胞）へ導入することができる。

手順の例としては、例えば、ＳｔａｄｔｆｅｌｄａｎｄＨｏｃｈｅｄｌｉｎｇｅｒ，ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ６（５）：３２９－３３０（２００９）；Ｙｕｓａｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ６：３６３－３６９（２００９）；Ｗｏｌｔｊｅｎ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５８，７６６－７７０（９Ａｐｒ．２００９））によって記載されたものが挙げられる。そのような方法には、ＤＮＡ送達、例えば、任意選択的にはフゲン６（Ｒｏｃｈｅ）若しくはリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるエキソビボトランスフェクションなどによる（例えば、Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４－１３４６，１９８９，Ｎａｂｅｌ＆Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ３２６：７１１－７１３，１９８７）；マイクロインジェクション（例えば、ＨａｒｌａｎｄａｎｄＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１０１：１０９４－１０９９，１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号、参照によりその全てが本明細書に取り込まれる）を含む注射による（例えば、米国特許第．５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号、及び第５，５８０，８５９号、これらの各々は参照による本明細書に取り込まれる）；エレクトロポレーションによる（例えば、参照によりその全てが本明細書に取り込まれる米国特許第５，３８４，２５３号、Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，６：７１６－７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１－７１６５，１９８４）；リン酸カルシウム沈降による（例えば、Ｇｒａｈａｍ＆ＶａｎＤｅｒＥｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６－４６７，１９７３；ＣｈｅｎａｎｄＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，７（８）：２７４５－２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１０：６８９－６９５，１９９０）；ＤＥＡＥ－デキストラン、続いてポリエチレングリコ－ルの使用による（例えば、Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，５：１１８８－１１９０，１９８５）；直接超音波ローディング（例えば、Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３－８４６７，１９８７）；リポソーム媒介トランスフェクションによる（例えば、Ｎｉｃｏｌａｕ＆Ｓｅｎｅ，ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５－１９０，１９８２，Ｆｒａｌｅｙｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８－３３５２，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７－１７６，１９８７，Ｗｏｎｇｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７－９４，１９８０，Ｋａｎｅｄａｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５－３７８，１９８９，Ｋａｔｏｅｔａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１－３３６４，１９９１）、受容体媒介トランスフェクション（例えば、ＷｕａｎｄＷｕ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７：８８７－８９２，１９８８；ＷｕａｎｄＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９－４４３２，１９８７）；カチオン性ビヒクルと複合体化したＲＮＡのエンドサイトーシスによる（Ｗａｒｒｅｎｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ７：６１８－３０（２０１０））；及びこのような方法の任意の組み合わせによるＤＮＡ送達が含まれるが、これらに限定されない。前述の参考文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

核酸分子がインビトロ又はインビボで宿主に導入されるかに応じて、本開示の核酸分子を細胞に導入するために様々な技術を使用することができる。このような技術には、核酸分子－リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥに関連する核酸分子のトランスフェクション、目的の核酸分子を含む前述のウイルスによるトランスフェクション又は感染、リポソーム媒介トランスフェクションなどが含まれる。その他の例としては、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈによるＮ－ＴＥＲ（商標）ナノ粒子トランスフェクションシステム；ＰｏｌｙｐｌｕｓＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによる昆虫細胞のためのＦｅｃｔｏＦｌｙ（商標）トランスフェクション試薬；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によるポリエチレンアミン「Ｍａｘ」；ＣｏｓｍｏＢｉｏＣｏ．Ｌｔｄ．によるユニークな非ウイルス性トランスフェクションツール；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによるＳａｔｉｓＦｅｃｔｉｏｎ（商標）トランスフェクション試薬；ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクション試薬；ＲｏｃｈｅＡｐｐｌｉｅｄＳｃｉｅｎｃｅによるＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬；ＰｏｌｙｐｌｕｓＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによるＧＭＰ適合ｉｎｖｉｖｏ－ｊｅｔＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬；及びＮｏｖａｇｅｎによるＩｎｓｅｃｔＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（登録商標）トランスフェクション試薬が含まれる。

ＩＶ．治療用組成物
マイクロＲＮＡと、ＡＳＣＬ１及びＭＹＯＣＤのうちの一方又は両方とを使用したリプログラミングは、場合によっては他のリプログラミング戦略と組み合わせて、結果を改善することができる。いくつかの実施形態において、標的組織又は開始細胞は、ＯＣＴ４ポリペプチドを発現するか、又は発現するように誘導される。標的組織又は開始細胞は、それぞれ、１つ以上のＷＮＴアゴニスト、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－ベータ阻害剤、エピジェネティック修飾因子、アデニリルシクラーゼアゴニスト、ＯＣＴ４発現活性化因子、及びそれらの任意の組み合わせを含有するリプログラミング組成物で処理又はインキュベートすることができる。組成物は、そのような薬剤の少なくとも２つ、又はそのような薬剤の少なくとも３つ、又はそのような薬剤の少なくとも４つ、又はそのような薬剤の少なくとも５つ、又はそのような薬剤の少なくとも６つを含むことができる。例えば、組成物は、ＳＢ４３１５４２（ＡＬＫ４／５／７阻害剤）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）、パルネート（ＬＳＤ１／ＫＤＭ１阻害剤、トラニルシプロミンとも呼ばれる）、及びフォルスコリン（アデニリルシクラーゼ活性化剤）を含むことができる。

特定の実施形態において、リプログラミングは、１つ以上の抗炎症剤、例えば、抗炎症性ステロイド又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の投与によって増強される。

本発明で使用するための抗炎症性ステロイドには、コルチコステロイド、特にグルココルチコイド活性を有するもの、例えばデキサメタゾン及びプレドニゾンが含まれる。本発明で使用するための非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、一般に、炎症及び疼痛を引き起こすプロスタグランジン、シクロオキシゲナーゼ－１（ＣＯＸ－１）及び／又はシクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）の産生を遮断することによって作用する。従来のＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２の両方を遮断することで機能する。ＣＯＸ－２選択的阻害剤は、ＣＯＸ－２酵素のみを遮断する。特定の実施形態において、ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ－２選択的阻害剤、例えば、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）、及びバルデコキシブ（Ｂｅｘｔｒａ）である。特定の実施形態において、抗炎症剤は、ＮＳＡＩＤプロスタグランジン阻害剤、例えば、ピロキシカムである。

組成物を調製するために、ベクター及び／又は細胞が生成され、ベクター又は細胞は、必要又は所望に応じて、精製される。ベクター、細胞、及び／又は他の薬剤は、薬学的に許容される担体に懸濁することができる。組成物が細胞を含有せずに化合物のみを含有する場合、組成物は凍結乾燥することができる。これらの化合物及び細胞は、適切な濃度に調整することができ、任意選択的に他の薬剤と組み合わせることができる。単位用量に含まれる所与の化合物及び／又は他の薬剤の絶対重量は、大きく異なり得る。投与量及び投与回数は、当業者によって最適化され得る。

例えば、約１０^２～１０^１０のベクターゲノム（ｖｇ）を投与することができる。いくつかの実施形態において、用量は、少なくとも約１０^２ｖｇ、約１０^３ｖｇ、約１０^４ｖｇ、約１０^５ｖｇ、約１０^６ｖｇ、約１０^７ｖｇ、約１０^８ｖｇ、約１０^９ｖｇ、約１０^９ｖｇ、約１０^１０ｖｇ、又はそれ以上のベクターゲノムである。いくつかの実施形態において、用量は、約１０^２ｖｇ、約１０^３ｖｇ、約１０^４ｖｇ、約１０^５ｖｇ、約１０^６ｖｇ、約１０^７ｖｇ、約１０^８ｖｇ、約１０^９ｖｇ、約１０^９ｖｇ、約１０^１０ｖｇ、又はそれ以上のベクターゲノムである。

治療に使用されるベクター及び細胞の量は、選択された特定の担体だけでなく、投与経路、治療される状態の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変化することが理解される。最終的には、担当の医療提供者が適切な投与量を決定することができる。薬学的組成物は、細胞の有無にかかわらず、投与するための単一の単位剤形で、各化合物の適切な比率で製剤化することができる。細胞又はベクターは、別々に提供されるか、化合物組成物の液体溶液と混合されるか、又は別々に投与され得る。

化合物及び／又はリプログラムされた細胞を含有する１つ以上の適切な単位剤形は、非経口（皮下、静脈内、筋肉内及び腹腔内を含む）、頭蓋内、脊髄内、経口、直腸、皮膚、経皮、胸腔内、肺内及び鼻腔内（呼吸器）経路を含む様々な経路によって投与することができる。

本発明のベクターは、水溶液、懸濁液、錠剤、硬又は軟ゼラチンカプセル、並びにリポソーム、及び成形ポリマーゲルなどの他の徐放製剤を含む多くの形態で調製され得る。ベクターの投与は、多くの場合、水溶液での非経口又は局所投与を伴う。

液体医薬組成物は、例えば、水性又は油性懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシル、使用前に水又は他の適切なビヒクルで再構成するための乾燥粉末の形態であり得る。このような液体医薬組成物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、又は防腐剤などの従来の添加剤を含み得る。

ベクターは、非経口投与（例えば、ボーラス注射又は持続注入などの注射による）用に製剤化することができ、アンプル、プレフィルドシリンジ、少量注入容器、又は防腐剤を添加した複数回投与容器中の単位剤形で提供することができる。薬学的組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルジョンの形態をとることができ、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含むことができる。適切な担体には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、及び当技術分野で一般的に使用される他の材料が含まれる。

組成物はまた、心臓の疾患、状態、及び損傷の治療に有用な薬剤などの他の成分、例えば、抗凝固剤（例えば、ダルテパリン（フラグミン）、ダナパロイド（オルガラン）、エノキサパリン（ロベノックス）、ヘパリン、チンザパリン（イノヘップ）、及び／又はワーファリン（クマジン））、抗血小板薬（例えば、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、又はジピリダモール）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、ベナゼプリル（ロテンシン）、カプトプリル（カポテン）、エナラプリル（バソテック）、フォシノプリル（モノプリル）、リシノプリル（プリニビル、ゼストリル）、モエキシプリル（ユニバスク）、ペリンドプリル（アセオン）、クイナプリル（アキュプリル）、ラミプリル（アルテース）、及び／又はトランドラプリル（マビック））、アンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬（例えば、カンデサルタン（アタカンド）、エプロサルタン（テベテン）、イルベサルタン（アバプロ）、ロサルタン（コザール）、テルミサルタン（ミカルディス）、及び／又はバルサルタン（ディオバン））、ベータ遮断薬（例えば、アセブトロール（セクトラル）、アテノロール（テノーミン）、ベタキソロール（ケルロン）、ビソプロロール／ヒドロクロロチアジド（ジアック）、ビソプロロール（ゼベタ）、カルテオロール（カルトロール）、メトプロロール（ロプレッサー、トプロルＸＬ）、ナドロール（コルガード）、プロプラノロール（インデラル）、ソタロール（ベタペース）、及び／又はチモロール（ブロカドレン））、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン（ノルバスク、ロトレル）、ベプリジル（バスコール）、ジルチアゼム（カルジゼム、チアザック）、フェロジピン（プレンジル）、ニフェジピン（アダラット、プロカルジア）、ニモジピン（ニモトップ）、ニソルジピン（スラー）、ベラパミル（キャラン、イソプチン、ベレラン）、利尿薬（例えば、アミロライド（ミダモール）、ブメタニド（ブメックス）、クロロチアニド（ジウリル）、クロルタリドン（ハイグロトン）、フロセミド（ラシックス）、ヒドロクロロチアジド（エシドリックス、ヒドロジウリル）、インダパミド（ロゾール）、及び／又はスピロノラクトン（アルダクトン））、血管拡張剤（例えば、二硝酸イソソルビド（イソジル）、ネシリチド（ナトレコール）、ヒドララジン（アプレゾリン）、硝酸塩及び／又はミノキシジル）、スタチン、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ジゴキシン、ジギトキシン、ラノキシン、又はそれらの任意の組み合わせを含むこともできる。

抗菌剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、生物学的応答修飾剤、成長因子、免疫修飾モジュレーター、モノクローナル抗体、及び／又は防腐剤などの追加の薬剤も含めることができる。本発明の組成物はまた、他の形態の療法と組み合わせて使用され得る。

本明細書に記載のウイルスベクター及び非ウイルスベクターは、疾患又は障害を治療するために対象に投与することができる。そのような組成物は、投与の目的が外傷性損傷に応答するためであるか、又はより持続的な治療目的のためであるかにかかわらず、例えば、レシピエントの生理学的状態、及び当業者に知られている他の要因に応じて、単回投与、複数回投与、連続的、又は断続的な方法であり得る。本発明の化合物及び組成物の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、又は一連の間隔をあけた用量であり得る。局所投与及び全身投与の両方が考えられる。いくつかの実施形態において、ウイルス又は非ウイルスベクターの局所送達が達成される。いくつかの実施形態において、細胞及び／又はベクターの局所送達を使用して、心臓内で細胞の集団を生成する。いくつかの実施形態において、そのような局在化した集団は、心臓の「ペースメーカー細胞」として機能する。

Ｖ．リプログラミング方法
本明細書に記載のように、標的組織又は細胞へのウイルス又は非ウイルスベクターの投与により、標的細胞（例えば、非心筋細胞）を心臓系統（例えば、心筋細胞系統）にインビボでリプログラムすることができる。いくつかの実施形態において、標的細胞は線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、標的細胞は心臓線維芽細胞（ＣＦ）細胞である。

いくつかの実施形態において、例えば、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、ＺＦＰＭ２、ｍｉＲ－１３３、又はそれらの任意の組み合わせである１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターが対象に投与される。いくつかの実施形態において、リプログラミング因子は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、及び表１から選択されるマイクロＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される。特定の実施形態において、リプログラミング因子は、ＡＳＣＬ１及びＭＹＯＣＤ（ＭｙＡ）、並びに表１から選択されるマイクロＲＮＡである。特定の実施形態において、リプログラミング因子は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ及びＴＢＸ５（ＭｙＡＭＴ）、並びに表１から選択されるマイクロＲＮＡである。いくつかの実施形態において、リプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（ＧＭＴ）、並びに表１から選択されるマイクロＲＮＡである。他の特定の実施形態において、リプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＭＴ）、並びに表１から選択されるマイクロＲＮＡである。他の特定の実施形態において、リプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、及びＭＹＯＣＤ（すなわち、４Ｆ）、並びに表１から選択されるマイクロＲＮＡである。他の実施形態において、リプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、及びＴＢＸ５、ＥＳＲＲＧ、ＭＹＯＣＤ、ＺＦＰＭ２、及びＭＥＳＰ１（すなわち、７Ｆ）、並びに表１から選択されるマイクロＲＮＡである。

いくつかの実施形態において、ベクターは、心筋細胞のより多くのマーカー遺伝子、例えば、ＴＮＮＴ２、ＡＣＴＮ２、ＡＴＰ２Ａ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、ＭＹＨ７、ＡＣＴＣＬ、ＭＹＢＰＣ３、ＰＩＮ、ＭＢ、ＬＭＯＤ２、ＭＹＬ２、ＭＹ１３、ＣＯＸ６Ａ２、ＡＴＰ５ＡＬ、ＴＴＮ、ＴＮＮＩ３、ＰＤＫ４、ＭＹＣＺ２、ＣＡＣＮＡＬＣ、ＳＣＮ５Ａ、ＭＹＯＣＤ、及びＮＰＰＡの発現を誘導又は抑制する。

ＶＩ．治療方法
本明細書に記載のベクターは、心疾患又は心臓病を有する対象を治療する方法において使用することができる。「治療すること」又は「治療を必要とする状態若しくは対象の治療」とは、（１）症状の軽減などの臨床結果を含む、有益な結果若しくは望ましい結果を得るために手順を踏むこと、（２）疾患を予防すること、例えば、疾患の素因があるかもしれないが、疾患の症状をまだ経験していない、若しくは示していない患者において、疾患の臨床症状が発症しないようにすること、（３）疾患を阻害すること、例えば、疾患の発症若しくはその臨床症状を阻止若しくは軽減すること、（４）疾患を緩和すること、例えば、疾患若しくはその臨床症状の退行を引き起こすこと、又は（５）病気を遅らせること、を指す。本発明の目的のために、有益な又は望ましい臨床結果には、誘導心筋細胞の生成及び／又は心筋再生の促進が含まれるが、これらに限定されない。

本開示の組成物、細胞、及び方法を用いた治療を必要とする対象には、先天性心疾患を有する個体、変性筋疾患を患っている個体、虚血性心臓組織をもたらす状態を患っている個体（例えば、冠動脈疾患を有する個体）などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの例において、方法は、変性筋疾患又は状態（例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、又は虚血性心筋症を伴う冠動脈疾患）を治療するのに有用である。いくつかの例では、主題の方法は、心臓又は心血管の疾患又は障害、例えば、心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管障害（脳卒中）、心血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠動脈弁膜症、拡張型動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症を伴う冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓症を有する個人を治療するのに有用である。

本開示の組成物、細胞及び方法を用いた治療に適した対象には、虚血性心臓組織などをもたらす状態を含むがこれに限定されない心臓状態を有する個体（例えば、冠動脈疾患を有する個体）（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜哺乳動物などの哺乳動物対象、マウス、ラットなどの実験用の非ヒト哺乳動物対象）が含まれる。

いくつかの例では、治療に適した個体は、心臓又は心血管の疾患又は状態、例えば、心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管障害（脳卒中）、心血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠動脈弁膜症、拡張型動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症を伴う冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓症を患っている。いくつかの例では、主題の方法による治療に適した個体には、変性筋疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、又は虚血性心筋症を結果として伴う冠動脈疾患を有する個体が含まれる。

本開示の組成物、細胞及び方法を用いた治療に適した対象には、虚血性心臓組織などをもたらす状態を含むがこれに限定されない心臓状態を有する個体（例えば、冠動脈疾患を有する個体）（例えば、ヒト、非ヒト霊長類などの哺乳動物対象、マウス、ラットなどの実験用の非ヒト哺乳動物対象）が含まれる。いくつかの例では、治療に適した個体は、心臓又は心血管の疾患又は状態、例えば、心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管障害（脳卒中）、心血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠動脈弁膜症、拡張型動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高い血圧（高血圧）、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症を伴う冠動脈疾患、僧帽弁逸脱症、心筋梗塞（心臓発作）、又は静脈血栓塞栓症を患っている。いくつかの例では、主題の方法による治療に適した個体には、変性筋疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、又は虚血性心筋症を結果として伴う冠動脈疾患を有する個体が含まれる。

リプログラムされた細胞及び／又は組成物（リプログラムされた細胞を伴う又は伴わない本明細書に記載の化合物のいずれかを含有する）を使用して治療することができる疾患及び状態の例には、任意の心臓病又は心機能不全が含まれる。治療可能な疾患及び状態には、遺伝的欠陥、身体的損傷、環境による損傷又は条件付け、悪い健康状態、肥満、及びその他の疾患リスクの結果として生じるものが含まれる。

虚血性心筋症は、冠動脈疾患（心臓の表面の冠動脈がアテローム性動脈硬化によって狭窄又は閉塞する疾患）によって引き起こされる慢性疾患である。冠動脈疾患は、酸素が豊富な血液が十分に心筋へ供給されない心虚血のエピソードを引き起こすことがよくある。

非虚血性心筋症は、一般に、主に臨床的及び病理学的特徴に基づいて、拡張型心筋症、肥大型心筋症、並びに拘束型及び浸潤型心筋症の３つの群に分類される。

別の実施形態において、心臓病は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びエメリー・ドレイフス型拡張型心筋症などの遺伝病である。

例えば、心臓病は、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心筋炎、及び不整脈からなる群から選択することができる。いくつかの実施形態において、対象は、糖尿病を有する。いくつかの実施形態において、対象は、糖尿病を有さない。いくつかの実施形態において、対象は、糖尿病性心筋症を患っている。

療法のために、組換えウイルス、非ウイルスベクター、及び／又は薬学的組成物を局所的又は全身的に投与することができる。リプログラムされた細胞集団は、注射、カテーテル、移植可能な装置などによって導入することができる。組換えウイルス又はリプログラムされた細胞の集団は、細胞に悪影響を及ぼさない生理学的に許容される任意の賦形剤又は担体中で投与することができる。例えば、組換えウイルス、非ウイルスベクター、及び／又は薬学的組成物は、静脈内又は心臓内経路（例えば、心外膜又は心筋内）を介して投与することができる。本開示の組換えウイルス、非ウイルスベクター、心筋細胞及び薬学的組成物（例えば、ベクターを含む組成物）を対象、特にヒト対象に投与する方法は、薬学的組成物（例えば、ウイルスベクターを含む組成物）又は細胞の、対象の標的部位への注射、移植、又は注入を含む。注射には、筋肉への直接注射が含まれる場合があり、注入には、血管内注入が含まれる場合がある。ベクター又は薬学的組成物は、対象への薬学的組成物又は細胞の注射又は移植による導入を容易にする送達装置に挿入することができる。このような送達装置には、チューブ、例えばカテーテルが含まれる。チューブは更にニードル、例えばシリンジを含むことができ、それを通して本発明の細胞を対象の所望の位置に導入することができる。いくつかの実施形態において、薬学的組成物又は細胞は、例えば、Ｔａｎｇｅｔａｌ．Ｃａｒｄｉａｃｃｅｌｌ－ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｍｉｃｒｏｎｅｅｄｌｅｐａｔｃｈｆｏｒｔｒｅａｔｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．ＳｃｉｅｎｃｅＡｄｖａｎｃｅｓ２８Ｎｏｖ２０１８：Ｖｏｌ．４，ｎｏ．１１，ｅａａｔ９３６５に記載されているように、マイクロニードルパッチによって送達される。

いくつかの態様では、本開示のウイルスベクターを使用して、それを必要とする対象を治療することができる。いくつかの実施形態において、組換えウイルスは、それを必要とする対象に投与することができ、対象への組換えウイルスの投与は、対象の心血管疾患を治療する。

組換えウイルスは、局所的又は全身的に投与することができる。組換えウイルスは、適切なカプシドタンパク質を選択するか、又は別のウイルス型のタンパク質でウイルスをシュードタイピングすることにより、特定の細胞型を標的とするように操作することができる。ウイルス粒子組成物の様々な治療的投与レジメン及び投与量の適合性を決定するために、組換えウイルスを最初に適切な動物モデルで試験することができる。あるレベルでは、組換えウイルスは、インビボで標的細胞に感染する能力について評価される。組換えウイルスを評価して、標的組織に移動するかどうか、宿主で免疫応答を誘導するかどうか、又は投与する組換えウイルスの適切な数又は投与量を決定することもできる。治療する疾患に応じて、組換えウイルスが免疫応答を生じることが望ましい場合もあれば、望ましくない場合もある。一般に、ウイルス粒子の反復投与が必要な場合、ウイルス粒子が免疫原性でないことが有利である。試験目的で、ウイルス粒子組成物を免疫不全動物（ヌードマウス、又は化学的若しくは照射により免疫不全にされた動物など）に投与することができる。感染期間後に標的組織又は細胞を採取し、評価して、組織又は細胞が感染しているかどうか、及び標的組織又は細胞で所望の表現型（誘導心筋細胞など）が誘導されているかどうかを判断することができる。

組換えウイルスは、心臓への直接注射又は心臓カテーテル法を含むがこれらに限定されない様々な経路によって投与することができる。あるいは、組換えウイルスは、静脈内注入などによって全身投与することができる。直接注射を使用する場合は、開心術又は低侵襲手術のいずれかによって行うことができる。場合によっては、組換えウイルスは、注射又は注入によって心膜腔に送達される。注射又は注入された組換えウイルスは、様々な方法で追跡できる。例えば、検出可能な標識（緑色蛍光タンパク質又はベータガラクトシダーゼなど）で標識された、又はそれを発現する組換えウイルスは、容易に検出することができる。組換えウイルスは、標的細胞が表面発現タンパク質又は蛍光タンパク質などのマーカータンパク質を発現するように操作することができる。あるいは、組換えウイルスによる標的細胞の感染は、試験に利用される動物によって発現されない細胞マーカーの発現によって検出することができる（例えば、細胞を実験動物に注入する際のヒト特異的抗原）。標的細胞の存在及び表現型は、蛍光顕微鏡法（例えば、緑色蛍光タンパク質若しくはベータガラクトシダーゼについて）、免疫組織化学法（例えば、ヒト抗原に対する抗体を使用して）、ＥＬＩＳＡ（ヒト抗原に対する抗体を使用して）、又は心臓の表現型を示すＲＮＡに特異的な増幅を引き起こすプライマー及びハイブリダイゼーション条件を使用したＲＴ－ＰＣＲ分析によって評価することができる。

ＶＩＩＩ．キット
本明細書に記載の組成物、化合物及び／又は薬剤のいずれかを含む様々なキットが本明細書に記載されている。キットは、本明細書に記載の任意の化合物を、乾燥形態又は水和形態で、一緒に混合するか、又は個別に包装した状態で含むことができる。本明細書に記載の化合物及び／又は薬剤は、別個のバイアル、ボトル又は他の容器に別々に包装することができる。あるいは、本明細書に記載の化合物及び／又は薬剤のいずれも、単一の組成物として、又は一緒に若しくは別々に使用できる２つ以上の組成物として、一緒に包装することができる。

ベクターは、送達装置の形で任意のキット内に提供することができる。あるいは、送達装置をキットに別個に含めることができ、説明書には、対象への投与前に送達装置を組み立てる方法を記載することができる。

キットは、本明細書の先行するセクション又は他の部分の組成物について、本明細書に記載されている補足因子又は薬物のいずれかなどの他の因子を提供することができる。

以下の非限定的な実施例は、本発明の開発に関与する実験作業のいくつかを説明する。

実施例１
この実施例では、２つの導入遺伝子、ミオカルジン（ＭＹＯＣＤ）及びＡＳＣＬ１（まとめて「ＭｙＡ」と呼ばれる）を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用した。ＭｙＡリプログラミングカクテルは、インビボ及びインビトロでの心臓線維芽細胞の誘導心筋細胞（ｉＣＭ）へのダイレクトリプログラミングを促進する（データは示さず）。ＭｙΔ３（配列番号１６）と呼ばれるこのベクターで使用されるミオカルジン導入遺伝子は、遺伝子機能に明らかな影響を与えることなく遺伝子のサイズを縮小する内部欠失を有する（データは示さず）。

本発明者らは、非標的細胞（心筋細胞）でＭｙＡの発現を抑制しながら、標的細胞（心臓線維芽細胞）でＭｙＡを発現するマイクロＲＮＡに基づくシステムを設計した。試験ベクターは、ＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１導入遺伝子をコードするポリヌクレオチドの３’ＵＴＲにおいて、選択された様々なマイクロＲＮＡの各々に対するマイクロＲＮＡ結合部位を含むように操作された。マイクロＲＮＡ結合部位は、選択されたマイクロＲＮＡを発現する細胞におけるＭｙＡの発現を抑制することを意図していた。以下に説明するいくつかの実験では、ＭｙＡの代わりに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターシステムを使用した。

ｍｉＲ－１結合部位
２つのｍｉＲ－１結合部位を試験した：ｍｉＲ－１の完全な相補体（ｍｉＲ１＿４）、及び３’ＵＴＲ又はヒトＭＹＯＣＤのネイティブｍｉＲ－１結合部位（ＭｙｍｉＲ１＿４）。各結合部位について、シード配列（下線）が変異したミスマッチ負対照が生成された（ｍｉＲ１＿４ｍｕｔ、ＭｙｍｉＲ１＿４ｍｕｔ）。

各ベクターにおいて、試験される結合部位は、ＡＡＶＣＡＧ－ＧＦＰベクターの３’ＵＴＲにタンデムで４回挿入された。ベクターはＡＡＶにパッケージ化され、ｉＰＳＣ－ＣＭの感染に使用された。ｉＰＳＣ－ＣＭは、心筋細胞を形成するように誘導された多能性幹細胞であり、培養中の初代心筋細胞を維持することは現実的ではないため、実験で使用される。ＧＦＰ－ｍｉＲ１＿４及びＧＦＰ－ＭｙｍｉＲ１＿４は両方とも、対照構築物ＧＦＰ－ｍｉＲ１＿４ｍｕｔ及びＧＦＰ－ＭｙｍｉＲ１＿４ｍｕｔと比較して、ｉＰＳＣ－ＣＭにおいて抑制された（図２Ａ）。ＧＦＰレポーターの発現は、ヒト心臓線維芽細胞（ｈＣＦ）細胞において依然として観察された（図２Ｂ）。ｍｉＲ１＿４及びＧＦＰ－ＭｙｍｉＲ１＿４構築物は、それらのｍｉＲ－１ミスマッチ対照とほぼ同じレベルでＧＦＰレポーターを発現した。したがって、ｍｉＲ－１マイクロＲＮＡ結合部位は、ＣＦ細胞と比較してＣＭ細胞における導入遺伝子の発現を選択的に抑制する。

ｍｉＲ１＿４及びｍｉＲ１＿４ｍｕｔ配列をＡＡＶＭｙ^Δ３Ａカセットの３’ＵＴＲに挿入して、ミオカルジン及びＡＳＣＬ１（ＭｙＡ）の組み合わせによる心筋細胞のリプログラミングに対する結合部位の影響を評価した。リプログラミング効率は、心筋細胞の表現型に関連する７つの遺伝子の発現を測定することによって決定された。表５のデータは、ベクターによるｈＣＦ細胞の形質導入後７日目に、ｍｉＲ－１マイクロＲＮＡ結合部位を含むＭｙＡベクターがＣＭ表現型の発現を誘導したことを実証している。

試験ベクターＭｙ^Δ３Ａ＿ｍｉＲ１＿４は、Ｍｙ^Δ３Ａ＿ｍｉＲ１＿４ｍｕｔ又は親Ｍｙ^Δ３Ａカセットよりも５～１０倍低い効力でリプログラミング活性を示した。

次に、１、２、又は３つのｍｉＲ－１結合部位を持つベクターを、４つのｍｉＲ－１結合部位を持つベクターと比較した。表６に示すように、ｍｉＲ－１結合部位を１つだけ持つベクターＭｙ^Δ３Ａ＿ｍｉＲ１＿１は、Ｍｙ^Δ３Ａ＿ｍｉＲ１＿４よりも高い効力を示したが、親Ｍｙ^Δ３Ａベクターよりも低い効力のままだった。

Ｍｙ^Δ３Ａの３’ＵＴＲ内の単一のｍｉＲ－１結合部位内のシード領域の外側に２つ（ｍｉＲ１＿１ｍｉｓ２）又は３つ（ｍｉＲ１＿１ｍｉｓ３）のミスマッチを含有する構築物を生成し、これらのｍｉＲ－１結合部位の標的化をそれを廃止することなく減少させた。

これらの構築物は、ＭｙΔ３Ａ＿ｍｉＲ１＿１と比較してリプログラミング効力を増加させたが（表７）、心筋細胞における導入遺伝子発現は十分には抑制しなかった（図３）。

ｍｉＲ－２０８ａ／ｂ結合部位
本発明者らは、Ｍｙ^Δ３Ａによって誘導される心筋細胞のリプログラミングプロセス中に、マイクロＲＮＡｍｉＲ－１及びｍｉＲ－１３３の発現増加が、ｍｉＲ－２０８ａ／ｂの発現増加に先行することを観察した（図４）。マイクロＲＮＡｍｉＲ－２０８ａ／ｂはｉＰＳＣ－ＣＭで検出されたが、最大３週間のリプログラミングを受けているｈＣＦでは検出されなかった。シード部位が変異したミスマッチ負対照ベクター（２０８＿４ｍｕｔ）とともに、完全に相補的なｍｉＲ－２０８ｂ結合部位（２０８＿４）の４Ｘタンデムアレイを持つＡＡＶＣＡＧ－ＧＦＰベクターが生成され、ヒトｉＰＳＣ－ＣＭの感染に使用された。ＧＦＰ－２０８＿４は、ＧＦＰ－ｍｉＲ１＿４と同様に導入遺伝子の発現を抑制した（図５Ａ）。ｈＣＦでは、ＧＦＰ－２０８＿４及びＧＦＰ－２０８＿４ｍｕｔの両方が、ＧＦＰ－ｍｉＲ１＿４及びＧＦＰ－ｍｉＲ１＿４ｍｕｔと比較してより低いレベルで導入遺伝子を発現した（図５Ｂ）。Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４及びＭｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４ｍｕｔは両方とも、ｈＣＦ細胞の形質導入の２１日後のＲＮＡマーカーの発現によって評価されるように、堅牢なリプログラミングを駆動することができた（表７及び図５Ｃ）。Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４及びＭｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４ｍｕｔは、同様のリプログラミング効力を示した。

マウスにおけるインビボ試験
インビボ試験では、Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４を、野生型カプシド配列を持つＡＡＶ５カプシド、又は心臓線維芽細胞の感染性が高いバリアントであるＡＡＶ５ｚカプシドのいずれかにパッケージングし（データは示さず）、心筋梗塞（ＭＩ）のＬＡＤライゲーションマウスモデルを使用してマウスで試験し、損傷時に心外膜にＡＡＶベクターの注射を実施した。ベクター設計及び投与量を表８に要約する。

有効性は、注射後２、４、６、及び８週目で心エコーによって評価された。３つの試験物質は全て、ＧＦＰをコードする対照と比較して、心機能（駆出率）を有意に維持した（図６Ａ）。８週間後、３つの試験物質は、心機能（駆出率）を有意に維持したが、ＭｙＡとＭｙＡ＋ｍｉＲ－２０８結合部位ベクターの間でリプログラミング効率に統計的に有意な差はなかった（図６Ｂ）。ＡＡＶ５：Ｍｙ^Δ３Ａ及びＡＡＶ５：Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４は、同じウイルスカプシドＡＡＶ５で送達された場合、ＭＩにおいて同等に有効であった。

代表的な顕微鏡写真（図６Ｄ）に示されるように、トリクローム染色による終末瘢痕分析及び心臓断面あたりの線維性組織のパーセンテージの定量化は、３つの処置群全てが瘢痕領域の有意な減少を示したことを示した（図６Ｃ）。

ブタにおけるインビボ試験
ベクターは、ブタ心筋梗塞（ＭＩ）モデルで更に試験された。Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４は、ＡＡＶ５ｚカプシドにパッケージ化され、虚血性損傷を導入するための９０分間のバルーン閉塞の２８日後に、ブタの心臓の境界領域に心外膜注射された。並行して、各群が１０匹の動物から構成されるように、梗塞したブタにも製剤緩衝液を注射した。心エコーは、注射後３週間、５週間、７週間、及び９週間で実施された。Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８＿４を投与されたブタは、注射後５週間、７週間、及び９週間で、対照と比較して、駆出率の有意な改善を示した（図７）。このように、心筋細胞を標的としないリプログラミングカクテルでの治療は、投与前のベースラインを上回る、心機能において平均１０％の改善をもたらした。

ｍｉＲ－１及びｍｉＲ－２０８ａ／ｂ結合部位の改善
２つの５’ヌクレオチド位置に置換を導入することにより、マイクロＲＮＡ結合部位で予測されるＲＮＡヘアピンを破壊するｍｉＲ－２０８結合部位のバリアントを試験し、結果を表９に示した。

シード領域外の更なる配列バリアントを試験して、ｉＰＳＣ－ＣＭでの発現を抑制しながら、ｈＣＦでの導入遺伝子の発現を可能にし、リプログラミングの３週間後に高品質のｉＣＭをもたらすマイクロＲＮＡ結合部位を特定した（表１０を参照されたい）。

これらのセットのｍｉＲ－２０８結合部位のいくつかについて、ｉＰＳＣ－ＣＭにおける導入遺伝子発現を抑制する能力（図８）、及び親ベクターと比較してインビトロでのリプログラミング効力を維持又は増加させる能力を試験した（表９）。ＭＥＤ１３転写産物のネイティブｍｉＲ－２０８標的化部位に基づく挿入である２０８ＭＥＤ１３は、良好に機能し、ｉＰＳＣ－ＣＭ抑制を維持しながら、リプログラミングの効力を高めた。

実施例２
この実施例では、２つの導入遺伝子、内部欠失を伴うミオカルジン（ＭＹＯＣＤ）及びＡＳＣＬ１（Ｍｙ^Δ３Ａ）、並びにマイクロＲＮＡ－１３３をコードするポリヌクレオチド（つまり、ＭｙＡ１３３の３因子の組み合わせ）を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを利用した。ｍｉＲ－１３３をコードするこの配列は、ＣＡＧプロモーターとＭＹＯＣＤ（Ｍｙ^Δ３）コード配列の間のイントロンに挿入される。

表１１に示されるように、Ｍｙ^Δ３ＡへのｍｉＲ１３３の追加は、６４０ｋのＭＯＩでのＡＡＶベクターによる形質導入後２１日目の心筋細胞のＲＮＡ発現によって評価されるように、リプログラミングを増加させた。２０８＿４と２０８ＭＥＤ１３の両方のマイクロＲＮＡ結合部位は、ベクターのリプログラミング効果を保持しており、２０８ＭＥＤ１３は２０８＿４よりも良好な結果を示している。

結果は、表１２に示すように、独立して誘導されたｈＣＦ細胞株で２つの異なるウイルス用量を使用して確認された。

ｍｉＲ－１３３の追加により、多くの心臓マーカーの発現が、３週間のインビトロリプログラミング後に、約２倍に増強された。ｍｉＲ－１３３ａを追加しても、Ｍｙ^Δ３ＡカセットとＭｙ^Δ３Ａ＿２０８ＭＥＤ１３カセットの間で効力に差はなく、これは、ｍｉＲ－１３３ａの追加によってカセットが早期に抑制されなかったことを示している。

２０８ＭＥＤ１３ｍｉＲ－２０８マイクロＲＮＡ結合部位を有するＭｙ^Δ３Ａ及びＭｙ^Δ３Ａ＋１３３ベクターを、虚血性損傷のラットＬＡＤ結紮モデルで試験した。結紮の２週間後にウイルス注射を行い、処置動物を無作為化して、処置群間で同等のベースライン駆出率を確保した。図９に示されるデータは、全ての試験物質がビヒクル対照（ＨＢＳＳ）と比較して駆出率を維持することを実証する（ｎ＝１０ラット／群）。カセットへのｍｉＲ－１３３ａの包含とは無関係に、Ｍｙ^Δ３ＡとＭｙ^Δ３Ａ＿２０８ＭＥＤ１３との間に有意差は識別できなかった。

材料及び方法
初代成体ヒト線維芽細胞の単離。成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）を単離するために、成体ヒト左心室を小片に切り刻み、心臓線維芽細胞消化培地（１０μｇ／ｍｌのリベラーゼＴＨ、１０μｇ／ｍｌのリベラーゼＴＭ、１単位／ｍｌのＤＮａｓｅＩ、０．０１％のポラキソマー）中、３７℃で１時間、消化させた。消化後、細胞を７０μＭのストレーナーを通して、５０ｍＬのファルコンチューブにろ過した。１２００×ｇで５分間スピンダウンすることにより細胞をペレット化し、線維芽細胞増殖培地中に入れた。培地は、２日ごとに交換した。４日後、ウイルス形質導入のために、ＡＨＣＦを凍結又は再度プレートに播種した。

細胞のリプログラミング。インビトロ心臓リプログラミングのために、ＡＨＣＦを培養皿又はプレートに５×１０^３／ｃｍ^２の密度で線維芽細胞増殖培地に播種した（－１日目）。細胞を播種した１日後（０日目）、線維芽細胞増殖培地を除去し、ウイルス培地を添加した。ウイルス形質導入の１日後（１日目）、ウイルス培地を、４日目まで２日ごとに、４部のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）及び１部のＧｉｂｃｏ（商標登録）培地１９９、１０％のＦＢＳ、１％の非必須アミノ酸、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで構成されるｉＣＭ培地に交換した。４日目に、培地を７５％のｉＣＭ培地並びに２５％のＲＰＭＩ及びＢ２７に変更した。７日目に、培地を５０％のｉＣＭ及び５０％のＲＰＭＩ＋Ｂ２７に変更した。１１日目に、培地を２５％のｉＣＭ並びに７５％のＲＰＭＩ及びＢ２７に変更した。１４日目に、培地を、２１日目まで毎日、ＲＰＭＩ並びにＢ２７及びＦＦＶ（１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ、１５ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ－１０、及び５ｎｇ／ｍｌのｒｈＶＥＧＦ）に交換した。

免疫細胞化学。免疫細胞化学のために、細胞を４％のパラホルムアルデヒドで２０分間固定し、室温で３０分間、０．１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００で透過処理した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロッキングした。次に、細胞を、１：２００希釈のマウスモノクローナル抗心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）抗体（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ５－１２９６０）、又は１％のＢＳＡ中の１：２００希釈のマウス抗α－アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ７８１１）で１時間でインキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を、１％のＢＳＡ中の１：２００希釈のロバ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０３）とともに１時間インキュベートした。次に、細胞イメージングマルチモードリーダー、Ｃｙｔａｔｉｏｎ（商標）５（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、細胞を画像化及び定量化した。

定量化及び統計分析。全てのデータは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を含む平均値として表示され、群当たりｎ＝２～３である。Ｐ値は、対応のない／二元配置ｔ検定又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかで計算された。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（登録商標）７ソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ（商標））を使用して、統計分析を行った。０．０５未満のＰ値は、複数のペアワイズ比較に対して補正が行われた後、全ての場合で有意であるとみなされた。

ＭＩ手術、ＡＡＶの心外膜注入、及び心エコー。マウスの手術は、９～１０週齢のＣＨＡＲＬＥＳＲＩＶＥＲ（登録商標）ＣＤ－１ＩＧＳ雄マウスで実施された。マウスを、２．４％のイソフルラン／９７．６％の酸素で麻酔し、加熱パッド（３７℃）上に仰臥位で置いた。動物に２０ゲージの静脈内カテーテルを挿管し、マウス人工呼吸器（ＭＩＮＩＶＥＮＴ（商標）、ＨａｒｖａｒｄＡｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．）で換気した。ＭＩは、左前下行枝（ＬＡＤ）を７－０プロレン縫合糸で永久的に結紮することによって誘発された。２０μｌのＡＡＶ（合計１．２Ｅ１１ＧＣ）を、組み込まれた２９ゲージニードル（ＢＤ）を備えたインスリンシリンジを通して心筋に注射した。冠動脈閉塞後の白化した梗塞領域に基づいて、梗塞ゾーン（ＩＺ）と境界ゾーン（ＢＺ）との間の境界に沿って、全量を注射した。注射後、胸部を縫合糸で閉じた。全ての外科的処置は無菌条件下で行われた。ラット梗塞は上記のように生成されたが、ウイルス投与はＬＡＤ結紮の２週間後に行われ、合計３Ｅ１１ＧＣに対して３回の３０μｌの注射が行われた。心機能は、ＶＩＳＵＡＬＳＯＮＩＣＳ（商標）ＶＥＶＯ（登録商標）３１００イメージングシステムを使用して、意識のあるマウスの２次元経胸壁心エコーによって評価された。心収縮機能の指標として、駆出率（ＥＦ）、収縮末期容積（ＥＳＶ）、及び拡張末期容積（ＥＤＶ）を用いた。全てのブタの処置及び心エコーは、ＭａｔｔａｗａｎのＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒで行われた。雄の去勢されたユカタンミニブタを、観察下で９０分間バルーン閉塞し、閉塞から２８日後に開胸心外膜注射を行った。試験物質又は製剤緩衝液は、それぞれ５００ｕｌの１０回の注射で境界ゾーンに送達され、Ｅ１４ＧＣの総用量が得られた。

実施例３
内因性ｍｉＲ－２０８の存在下での様々な形態の非標的化構築物のｍＲＮＡ及びタンパク質の安定性は、ヒトｉＰＳＣ由来心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭ）で評価される。ｈｉＰＳＣ－ＣＭは、以下のカセットを含有するＡＡＶに感染している。

Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８

Ｍｙ^Δ３Ａ＿２０８ｍｕｔ

Ｍｙ^Δ３Ａ－ＣＭＶＩｎｔ－１３３＿ＭＥＤ１３

Ｍｙ^Δ３Ａ－ＣＭＶＩｎｔ－１３３＿２０８

Ｍｙ^Δ３Ａ－ＣＭＶＩｎｔ＿２０８

形質導入後４日目及び１４日目に細胞を採取する。ＭｙΔ３Ａ転写物のＲＮＡレベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。ＡＳＣＬ１のタンパク質レベルは、ウェスタンブロットによって評価される。効果的な非標的化により、変異したｍｉＲ－２０８部位を含有する構築物と比較して、タンパク質レベルの低下がもたらされる。

これらの同じ構築物のｍＲＮＡ及びタンパク質の安定性も、様々なレベルのｍｉＲ－２０８に応じて評価される。内因性ｍｉＲ－２０８を発現しないＨＥＫ２９３細胞に、上記の構築物を感染させる。２日後、それらに、様々なレベルのｍｉＲ－２０８ａ又はｍｉＲ－２０８ｂをトランスフェクトさせる。トランスフェクション後４日目に細胞を採取する。Ｍｙ^Δ３Ａ転写物のＲＮＡレベルは、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される。ＡＳＣＬ１のタンパク質レベルは、ウェスタンブロットによって評価される。これらの結果から、非標的化構築物のそれぞれの相対的な用量応答を決定する。

様々な非標的化構築物からの発現も、インビボのブタモデルで評価される。以下の７つのカセットがＡＡＶで作成される。

７つの構築物のプールは、６匹の健康なヨークシャーブタの心臓に、開胸心外膜注射により、３つの別々の部位に送達される。各注射部位は、剖検時に識別できるように、ガラスビーズの縫合によって、印付けされている。注射後４週間（ｎ＝３）又は１２週間（ｎ＝３）で、動物を安楽死させる。ＲＮＡ及びＤＮＡ分析のために、各注射部位からの生検パンチは、剖検時に収集される。両方の時点で７つのベクターのそれぞれについて送達されたベクターゲノムに対するＲＮＡ発現を比較する。

Claims

１つ以上の導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列と、マイクロＲＮＡに対するマイクロＲＮＡ結合部位とを含むポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記１つ以上の導入遺伝子をコードする前記ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結され、前記マイクロＲＮＡは、心臓線維芽細胞と比較して、心筋細胞又は心筋前駆細胞においてより高度なレベルで発現される、ベクター。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、心臓線維芽細胞と比較して、心筋細胞又は心筋前駆細胞において前記１つ以上の導入遺伝子の発現の特異的抑制を促進する、請求項１に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡが、心筋細胞における前記マイクロＲＮＡの発現レベル、及び／又は心筋細胞リプログラミング因子で約７日間を超えて処理された心臓線維芽細胞における前記マイクロＲＮＡの発現レベルと比較して、心臓線維芽細胞においてより低いレベルで発現され、かつ／又は前記心筋細胞リプログラミング因子で約７日間以内で処理された心臓線維芽細胞においてより低いレベルで発現される、請求項１又は２に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２０８である、請求項１～３のいずれか一項に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－１である、請求項１～３のいずれか一項に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－１３３である、請求項１～３のいずれか一項に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２０８ａである、請求項４に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２０８ｂである、請求項４に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐである、請求項８に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、

に対して７０％を超える同一性を共有し、配列ＣＧＴＣＴＴＡを含む下線のシード領域にミスマッチを共有しない、請求項９に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡ（配列番号１３６）である、請求項９に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３５）である、請求項９に記載のベクター。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３７）である、請求項９に記載のベクター。
前記ポリヌクレオチドが、前記マイクロＲＮＡに対する少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のベクター。
前記ポリヌクレオチドが、前記マイクロＲＮＡに対する少なくとも４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１４に記載のベクター。
前記ポリヌクレオチドが、前記マイクロＲＮＡに対する最大６つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１４又は１５に記載のベクター。
前記ポリヌクレオチドが、前記マイクロＲＮＡに対する４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項１６に記載のベクター。
前記１つ以上の導入遺伝子が、１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のベクター。
前記１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子が、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及びＭＥＳＰ１のうちの２つ以上を含む、請求項１８に記載のベクター。
前記１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子が、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ｍｉＲ－１３３、及びＭＥＳＰ１のうちの３つ以上を含む、請求項１８に記載のベクター。
前記１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子が、ＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１を含む、請求項１８に記載のベクター。
前記ポリヌクレオチド配列がＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１タンパク質をコードする、請求項２１に記載のベクター。
前記ＭＹＯＣＤが内部欠失を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のベクター。
前記ポリヌクレオチドが、５’から３’の順に、プロモーター、ＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１をコードする配列、前記マイクロＲＮＡ結合部位、並びにポリアデニル化配列を含む、請求項２３に記載のベクター。
前記ポリヌクレオチドが、ｍｉＲ－１３３をコードする配列を含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載のベクター。
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１３８、配列番号１３９又は配列番号１４０と少なくとも９５％同一である配列を含む、請求項２４又は２５に記載のベクター。
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１～２６のいずれか一項に記載のベクター。
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２７に記載のベクター。
心臓線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするための方法であって、
ａ）心臓線維芽細胞の心筋細胞へのリプログラミングを誘導する有効量の組成物で心臓線維芽細胞を処理し、前記心臓線維芽細胞における１つ以上のマイクロＲＮＡの発現を測定することによって、誘導された心筋細胞で特異的に発現されたマイクロＲＮＡを選択することであって、前記選択されたマイクロＲＮＡは、所定の時間後にのみ、前記心臓線維芽細胞において発現される、選択することと、
ｂ）１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、前記選択されたマイクロＲＮＡに対する１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを含むベクターを生成することと、
ｃ）心臓線維芽細胞を有効量の前記ベクターと接触させることと、を含む、方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、心筋細胞における前記１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子の発現を抑制する、請求項２９に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、骨格筋細胞における前記１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子の発現を抑制する、請求項２９又は３０に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、心筋前駆細胞における前記１つ以上の心筋細胞リプログラミング因子の発現を抑制する、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２０８である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－１である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－１３３である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２０８ａである、請求項３３に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２０８ｂである、請求項３３に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐである、請求項３７に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、

に対して７０％を超える同一性を共有し、配列ＣＧＴＣＴＴＡを含む下線のシード領域にミスマッチを共有しない、請求項３８に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＡＡＡＡＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＡＡ（配列番号１３６）である、請求項３８に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３５）である、請求項３８に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ＴＧＡＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＴＣＧＴＣＴＴＡＴ（配列番号１３７）である、請求項３８に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、前記マイクロＲＮＡに対する少なくとも２つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項２９～４２のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、前記マイクロＲＮＡに対する少なくとも４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項４３に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、前記マイクロＲＮＡに対する最大６つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項４３に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドが、前記マイクロＲＮＡに対する４つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項４３に記載の方法。
前記心臓線維芽細胞を有効量の請求項１～２８のいずれか一項に記載のベクターと接触させることを含む、心臓線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするための、方法。
前記方法が前記心臓線維芽細胞における心筋細胞表現型の少なくとも１つのマーカーの発現を誘導する、請求項４７に記載の方法。
心筋細胞表現型の少なくとも１つのマーカーが、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＣＡＳＱ２、ＮＰＰＡ、又はＴＮＮＴ２のメッセンジャーＲＮＡレベルである、請求項４８に記載の方法。
心筋細胞の形成の促進を必要とする対象において心筋細胞の形成を促進する方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
心不全の治療を必要とする対象において心不全を治療する方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与することを含む、方法。
心不全の治療を必要とする対象において心不全を治療する方法であって、５’から３’の順に、プロモーター、ＭＹＯＣＤ及びＡＳＣＬ１をコードする配列、マイクロＲＮＡ結合部位、並びにポリアデニル化配列を含むポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを前記対象に投与することを含み、前記マイクロＲＮＡ結合部位が、ｍｉＲ－１、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ、及び／又はｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位である、方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１に対するマイクロＲＮＡ結合部位である、請求項５２に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－１３３に対するマイクロＲＮＡ結合部位である、請求項５２に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－２０８ａに対するマイクロＲＮＡ結合部位である、請求項５２に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－２０８ｂに対するマイクロＲＮＡ結合部位である、請求項５２に記載の方法。
前記マイクロＲＮＡ結合部位がｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐに対するマイクロＲＮＡ結合部位である、請求項５２に記載の方法。
前記ポリヌクレオチドがｍｉＲ－１３３をコードする配列を含む、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の方法。
前記心不全が心筋梗塞によるものである、請求項５２～５８のいずれか一項に記載の方法。
前記心不全が、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）である、請求項５２～５９のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、投与前の前記対象と比較して、前記対象における駆出率を増加させる、請求項５２～６０のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、未治療の対照対象と比較して前記対象における駆出率を増加させる、請求項５２～６１のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、前記対象における駆出率を少なくとも約２８％、２９％、３０％、３１％、又は３２％まで増加させる、請求項５２～６２のいずれか一項に記載の方法。
駆出率が、前記ＡＡＶベクターの投与後、所定の時間後、任意選択的に、８週間後に評価される、請求項６１～６４のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、投与前の前記対象と比較して、前記対象における瘢痕組織形成を減少させる、請求項５２～６４のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、未治療の対照対象と比較して、前記対象における瘢痕組織形成を減少させる、請求項５２～６５のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、前記対象における瘢痕組織形成を多くとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％まで減少させる、請求項６５又は６６に記載の方法。
瘢痕組織形成が、前記ＡＡＶベクターの投与後、所定の時間後、任意選択的に、８週間後に評価される、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の方法。