TW202404992A - 用於斑菲素蛋白—２（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｌｉｎ—２）基因療法之蛋白殼 - Google Patents
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Abstract
本文提供用於斑菲素蛋白-2(plakophilin-2) (PKP2)基因療法之蛋白殼，包括含有工程化蛋白殼蛋白之重組腺相關病毒(rAAV)病毒粒子，其用於治療心臟病，諸如致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌病(ACM)。特定而言，本發明提供編碼PKP2之AAV9病毒粒子，該等病毒粒子含有工程化AAV9蛋白殼、AAV5/9嵌合蛋白殼或組合型蛋白殼，以達成增加的心臟轉導效率、增加的心臟/肝臟比率及/或其他所需特性。
Description
致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌病(ACM)為於1/2000至1/5000人中發現的遺傳心臟疾病。ARVC的特徵為心肌中的纖維脂肪組織置換、心肌萎縮、主導性右心室擴張、心室心律不齊及心因性猝死(Wang等人, 2018)。該疾病由於其亞臨床表現而難以藉由習知成像及ECG診斷，尤其在其早期。在晚期，該疾病進展至更明顯的臨床表現，諸如心室心律不齊及心室的形態學異常。年輕人及運動員的心跳驟停經發現與ARVC及運動相關的心臟壁應激相關。迄今為止，ARVC不存在有效療法(Wang等人, 2018)。
腺相關病毒(AAV)擁有用於基因療法及其他生醫應用的前景。特定而言，AAV可用於活體外與活體內將基因產物遞送至各種組織及細胞。AAV蛋白殼蛋白在很大程度上決定AAV載體的免疫原性及向性。
就心臟組織而言，AAV亞型9 (AAV9)因其在全身遞送之後能夠轉導心臟而為較佳AAV載體。儘管AAV9可對心臟達成中度轉導，但大部分載體遷移至肝臟。此外，為了在心臟中達成治療程度的轉導，需要相對較高的全身劑量，此潛在地導致全身炎症且繼而導致中毒。
需要開發含有工程化蛋白殼蛋白的腺相關病毒以達成改善的心臟向性，且視情況達成改善的對心臟組織而非對肝臟之選擇性。本發明提供AAV9蛋白殼及/或AAV5/AAV9嵌合蛋白殼的變異體，其形成的rAAV病毒粒子與包含野生型AAV9蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，能夠以更大的效率及/或更大的選擇性轉導心臟組織及/或細胞類型，從而可用於安全且有效的心臟基因療法。
本文提供重組腺相關病毒(rAAV)，其包含本文所提供之任何斑菲素蛋白-2 (plakophilin-2，PKP2)表現卡匣且編碼本文所提供之任何rAAV蛋白殼蛋白。
本文亦提供治療有需要之個體之心臟疾病或病症的方法，包含將本發明之rAAV投與該個體。
本文進一步提供用於治療個體之心臟疾病或病症的本發明rAAV。
本文另外提供包含本發明之rAAV及醫藥學上可接受之緩衝液的組成物。
在一個態樣中，本文提供重組腺相關病毒(rAAV)病毒粒子，其包含蛋白殼蛋白及斑菲素蛋白-2 (PKP2)表現卡匣，其中該蛋白殼蛋白或所含序列與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%胺基酸序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含：位置584、或位置583與584之間的胺基酸插入，包含天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者；位置585、或位置584與585之間的胺基酸插入，包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者；位置586、位置585與586之間的胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸(L)中之一或多者；位置587、位置586與587之間的胺基酸插入，包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者；位置588、位置587與588之間的胺基酸插入，包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者；位置589、位置588與589之間的胺基酸插入，包含甘胺酸(G)及麩醯胺酸(Q)中之一或多者；一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、N452I、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H；及/或一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582L、T582E、T582A、T582F、T582R、T582P、N583V、N583T、H584R、H584Q、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584T、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585C、Q585V、Q585L、Q585N、Q585S、Q585P、Q585A、Q585M、Q585E、Q585Y、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586T、S586G、S586K、S586M、S586N、S586I、S586Q、S586L、S586P、S586F、S586R、A587F、A587S、A587T、A587N、A587L、A587P、A587V、A587K、A587I、A587R、A587H、A587G、A587M、A587D、A587W、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588G、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588Y、Q588H、Q588M、Q588K、Q588D、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y、Q590L、A591I、G594Q及G594D。在一些實施例中，蛋白殼蛋白在VR-VIII位點包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在VR-VIII位點中的位置584至590包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入，或在VR-VIII位點中的位置585至590包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：(i)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582E、N583V、H584Q、S586K、A587P、A587S、Q588G、Q588M、A589S、A591I、G594Q及G594D；(ii)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582L、T582A、T582F、T582R、T582P、H584R、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584Q、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585N、Q585M、Q585E、Q585V、Q585H、S586T、S586G、S586Q、S586I、S586L、S586F、S586D、S586R、S586M、A587F、A587I、A587H、A587M、A587N、A587W、Q588Y、Q588S、Q588T及Q588R；(iii)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585C、Q585S、S586I、A587V及A587G；或(iv)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585V、Q585T、Q585L、Q585C、Q585N、Q585S、Q585M、Q585E、Q585P、Q585A、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586G、S586T、S586M、S586N、S586L、S586R、S586I、S586K、A587S、A587T、A587N、A587L、A587V、A587K、A587I、A587F、A587P、A587R、A587D、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588H、Q588Y、Q588M、Q588K、Q588D、Q588G、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y及Q590L。在一些實施例中，蛋白殼蛋白：(i)具有心臟向性；(ii)相較於親本序列，在心臟細胞中展現增加的轉導效率；(iii)相較於親本序列，在肝臟細胞中展現降低的轉導效率；及/或(iv)相較於親本序列，對心臟細胞而非對肝臟細胞展現增加的選擇性。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、N452I、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在位置452包含選自由以下組成之群的胺基酸：K及N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置584之選自由以下組成之群的胺基酸：R及H；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R、I及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R、P及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y及A；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L、M及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；位置584之選自由以下組成之群的胺基酸：R及H；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R、I及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R、P及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y及A；以及位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L、M及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置584之胺基酸R；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H及L；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R及I；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R及P；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D及G；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E及Y；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L及M。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者或所有八者：(i)位置452的胺基酸K；(ii)位置584的胺基酸R；(iii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H及L；(iv)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R及I；(v)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R及P；(vi)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D及G；(vii)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E及Y；以及(viii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L及M。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V、T及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G、D及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N、V及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I、R及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I、R及A；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H、R及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V、T及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G、D及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N、V及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I、R及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I、R及A；以及位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H、R及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V及T；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G及D；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N及V；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I及R；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I及R；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者或所有七者：(i)位置452之胺基酸K；(ii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V及T；(iii)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G、D；(iv)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N及V；(v)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I及R；(vi)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I及R；以及(vii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M、C及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D、N及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S、I及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I、R及A；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、R及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M、C及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D、N及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S、I及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I、R及A；以及位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、R及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M及C；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D及N；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N及V；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S及I；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I及R；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者或所有七者：(i)位置452之胺基酸K；(ii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M及C；(iii)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D及N；(iv)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N及V；(v)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S及I；(vi)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I及R；以及(vii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；以及位置587之胺基酸取代A587T；且視情況在選自由以下組成之群的一個、兩個或更多個位置包含胺基酸N或R：584、585、586、588、589及590。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；以及選自由以下組成之群之一個、兩個或更多個位置的胺基酸N或R：584、585、586、588、589及590。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；以及選自由以下組成之群之兩個或更多個位置的胺基酸S：585、586、587、588、589及590。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；且在VR-VIII位點之區域585至590中的三個、四個、五個或六個位置包含選自由以下組成之群的胺基酸：N、S、T、R及I。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在VR-VIII位點之區域585至590中的三個、四個、五個或六個位置包含：選自由以下組成之群的胺基酸：N、S、T及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586N、A587T、Q588V、A589S、Q590I及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586T、A587L、Q588F、A589N、Q590S及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L、Q590G及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585G、A587I、Q588L、A589T、Q590H及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585M、S586M、A587T、Q588T及Q590R；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L及Q590G；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585C、A587T、Q588S、A589I及Q590R；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586D、A587N、Q588I、A589R及Q590S；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586D、A587N、Q588I、A589R、Q590S及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、S586N、A587V、Q588I、A589S、Q590G及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586G及Q588Y；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586A、A587N、Q588Y、A589G及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含位置581-583之胺基酸ATN及位置591-594之胺基酸AQTG。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含位置581-584之胺基酸ATNH及位置591-594之胺基酸AQTG。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：(i) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHENTVSIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(ii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHQTLFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(iii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNSTYLGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(iv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHGSILTHAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(v) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHMMTTARAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(vi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNSTYLGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(vii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHCSTSIRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(viii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHEDNIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(ix) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHEDNIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(x) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNNVISGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(xi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHQGAYAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHQANYGQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(xiii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNMNRVNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xiv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNNVISGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSNSVQSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xvi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSSTFQGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xvii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHVSSFTSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xviii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSTTNFRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xix) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSSIFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xx) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHAGNYNNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHTSVISIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHHSRVEIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxiii)VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSSIIYSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxiv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSGRDSYAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSSSYNNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxvi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHHNPSINAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxvii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNRNGLLAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxviii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHESTSVRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxix) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNIRTEMAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxx) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHQTLFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxxi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHLSVSSIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxxii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHEDIIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxxiii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNRQTAQAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；或(xxxiv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNRQIAQAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：(i)位置584之胺基酸插入，包含天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者；(ii)位置585之胺基酸插入，包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者；(iii)位置586之胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸中之一或多者；(iv)位置587之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者；(v)位置588之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者；及/或(vi)位置589之胺基酸插入，包含甘胺酸(G)及麩醯胺酸(Q)中之一或多者。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：(i)位置584之胺基酸插入，其由TY、FN或AT組成；(ii)位置585之胺基酸插入，其由MH組成；(iii)位置586之胺基酸插入，其由HY、VT、AI、WM或ML組成；(iv)位置587之胺基酸插入，其由PI組成；及/或(v)位置588之胺基酸插入，其由IT或PT組成。在一些實施例中，除指定的修飾之外，蛋白殼蛋白與或所含序列與根據SEQ ID NO: 487的AAV9 VP3序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，除指定的修飾之外，蛋白殼蛋白與或所含序列與根據SEQ ID NO: 486的AAV9 VP2序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，除指定的修飾之外，蛋白殼蛋白與或所含序列與根據SEQ ID NO: 1的AAV9 VP1序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與由以下組成之群中之任一者至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708、710、772及774，或其功能片段。在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含由以下組成之群中之任一者的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成：SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708、710、772及774。在一些實施例中，rAAV病毒粒子轉導心臟細胞。在一些實施例中，rAAV病毒粒子轉導心肌細胞。在一些實施例中，rAAV病毒粒子遷移至除肝臟之外的至少一種器官。在一些實施例中，rAAV病毒粒子遷移至心臟。在一些實施例中，rAAV病毒粒子展現的心臟轉導效率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子。在一些實施例中，rAAV病毒粒子展現的心臟/肝臟轉導比率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，視情況高至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，與投與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，將rAAV病毒粒子投與個體引起肝臟病毒負荷降低，視情況降低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，rAAV病毒粒子展現更高的轉導效率，視情況展現更高的心臟轉導效率，其係在靈長類動物中所評估。在一些實施例中，與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，rAAV病毒粒子展現更高的心臟/肝臟轉導比率，視情況高至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，其係在靈長類動物中所評估。在一些實施例中，與投與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，將rAAV病毒粒子投與個體引起肝臟病毒負荷降低，視情況降低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，其係在靈長類動物中所評估。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含與SEQ ID NO: 782或SEQ ID NO: 783具有至少95%一致性的序列。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含與SEQ ID NO: 786具有至少95%一致性的核酸序列。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含心臟特異性啟動子。在一些實施例中，心臟特異性啟動子引導心肌、心包膜或兩者中的基因表現。在一些實施例中，心臟特異性啟動子為肌鈣蛋白啟動子，或α-肌凝蛋白重鏈啟動子。在一些實施例中，肌鈣蛋白啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 784具有至少95%一致性。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含PKP2啟動子。在一些實施例中，PKP2啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 785具有至少95%一致性。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含組成型啟動子。在一些實施例中，組成型啟動子係β-肌動蛋白啟動子。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含心臟特異性增強子。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含3'元件。在一些實施例中，3'元件包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)、牛生長激素聚腺苷酸化(bGH polyA)序列或其組合。
在另一態樣中，本文提供醫藥組成物，其包含根據本文所提供之任何實施例的rAAV病毒粒子及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本文提供轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與根據本文所提供之任何實施例的rAAV病毒粒子接觸，其中該rAAV病毒粒子轉導心臟細胞。在一些實施例中，心臟細胞係心肌細胞。在一些實施例中，rAAV病毒粒子對細胞展現的轉導效率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子。
在另一態樣中，本文提供將一或多種基因產物遞送至心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與根據本文所提供之任何實施例的rAAV病毒粒子接觸。在一些實施例中，心臟細胞係心肌細胞。
在另一態樣中，本文提供治療有需要之個體之心臟疾病或病症的方法，包含將治療有效量之根據本文所提供之任何實施例的rAAV病毒粒子投與該個體，其中該rAAV病毒粒子轉導心臟組織。在一些實施例中，心臟疾病或病症為致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌病(ACM)。在一些實施例中，靜脈內、心臟內、心臟周圍或動脈內投與AAV病毒粒子。在一些實施例中，該方法逆轉、減輕或預防以下中的至少一者：纖維脂肪組織置換、心肌萎縮、主導性右心室擴張、心室心律不齊、心因性猝死或運動觸發的心臟事件。在一些實施例中，該方法逆轉、減輕或預防心肌、心包膜或兩者的纖維脂肪組織置換。在一些實施例中，該方法恢復橋粒(desmosome)結構及/或功能。在一些實施例中，該方法恢復PKP2蛋白及活性程度。在一些實施例中，該方法恢復PKP2誘導的基因表現。在一些實施例中，該方法恢復以下中之一或多者的表現：蘭尼鹼(Ryanodine)受體2 (Ryr2)、錨蛋白-B (Ank2)、Cacna1c (CaV1.2)、三聯蛋白(Trdn)或隱鈣素-2 (Casq2)。在一些實施例中，經鑑別，個體的橋粒蛋白中出現至少一種變異。在一些實施例中，橋粒蛋白為PKP2。在一些實施例中，變異包含缺失、插入、單核苷酸變異或複本數變異。
在另一態樣中，本文提供根據本文所提供之任何實施例的rAAV病毒粒子，其用於治療有需要之個體之心臟疾病或病症的方法中，其中該rAAV病毒粒子轉導心臟組織。在一些實施例中，心臟疾病或病症為致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌病(ACM)。在一些實施例中，靜脈內、心臟內、心臟周圍或動脈內投與AAV病毒粒子。在一些實施例中，該方法逆轉、減輕或預防以下中的至少一者：纖維脂肪組織置換、心肌萎縮、主導性右心室擴張、心室心律不齊、心因性猝死或運動觸發的心臟事件。在一些實施例中，該方法逆轉、減輕或預防心肌、心包膜或兩者的纖維脂肪組織置換。在一些實施例中，該方法恢復橋粒結構及/或功能。在一些實施例中，該方法恢復PKP2蛋白及活性程度。在一些實施例中，該方法恢復PKP2誘導的基因表現。在一些實施例中，該方法恢復以下中之一或多者的表現：蘭尼鹼(Ryanodine)受體2 (Ryr2)、錨蛋白-B (Ank2)、Cacna1c (CaV1.2)、三聯蛋白(Trdn)或隱鈣素-2 (Casq2)。在一些實施例中，經鑑別，個體的橋粒蛋白中出現至少一種變異。在一些實施例中，橋粒蛋白為PKP2。在一些實施例中，變異包含缺失、插入、單核苷酸變異或複本數變異。
以引用的方式併入
本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各個別公開案、專利或專利申請案經具體且個別地指示以引用的方式併入一般。
交互參考
本申請案主張2023年4月11日申請之美國臨時申請案第63/329,787號之權益，該案以全文引用之方式併入本文中。
致心律失常右心室心肌病(ARVC)的最普通遺傳基礎係編碼橋粒蛋白之基因的突變。在功能上，橋粒為細胞間的黏著性連接，其將所插入的心肌細胞保持在一起。斑菲素蛋白-2 (PKP2)，橋粒基因之一，最常鑑別為ARVC之因果因子。位於膜定域複合物內部的PKP2與橋粒蛋白斑珠蛋白(PKG)及橋體斑蛋白(DSP)相互作用。DSP錨定於中間纖絲結蛋白，形成交織的網狀結構以使心臟細胞、肌節及其他細胞器的收縮單元穩定(圖1, Brodehl等人, 2018；Moncayo-Arlandi及Brugada, 2017)。咸信橋粒的損失會影響心肌細胞的細胞-細胞黏附、信號轉導及電耦接(Wang等人, 2018)。另外，消失的信號轉導及電耦接為含有連結蛋白之間隙連接(GJ)額外塌縮的接合缺乏結果。GJ係細胞電耦合必不可少的且藉由允許小分子在細胞之間流動而促進節拍同步(Green等人, 2019) (圖2概述ARVC疾病適應症及可能的機制)。另外，心包膜分化可有助於纖維脂肪重塑，此在ARVC或ACM患者中觀測到(Kohela等人, 2021)。
為了描繪橋粒的功能，產生遺傳小鼠品系及患者源iPSCM模型。小鼠心臟PKP2基因剔除模型(Delmar小鼠模型，Cerrone等人，2017)顯示早期深刻地出現雙心室擴張、纖維化及調控Ca
2 +體內恆定之基因的顯著減少，揭露出心律不齊可能發生於明顯結構變化之前的潛在機制。含有PKP2突變的若干患者源iPSCM株系顯示PKP2表現減少、Ca
2 +操控缺乏及脂滴聚積，脂滴聚積係藉由在生脂誘導培養基中培養而誘導(Brodehl等人, 2019)。
據報導，在具有PKP2突變之ARVC患者心臟樣本中，mRNA與蛋白質層面上的PKP2減少(Akdis等人, 2016；Asimaki等人, 2009)。已提出無義介導之mRNA分解(NMD)作為一些橋粒基因突變，包括PKP2突變，表明平衡突變轉錄本與蛋白質之表現的細胞機制仍很不詳(Gerull及Brodehl, 2020；Mura等人, 2003)。彼等觀測結果表明，恢復心臟中之WT PKP2表現量有可能達成基於基因療法的ARVC介入。
在其他態樣中，本發明提供包含工程化蛋白殼蛋白的重組腺相關病毒(rAAV)病毒粒子。特定而言，本發明提供工程化蛋白殼蛋白(包括嵌合蛋白殼蛋白)、其鑑別方法及其使用方法。鑑別本文所揭示之新穎蛋白殼蛋白的方法廣泛適用於AAV的任何血清型，包括嵌合蛋白殼蛋白。另外，利用此方法或其他方法，可應用其迭代地改良具有突變的蛋白殼蛋白。一般而言，本發明方法係關於製備呈
cap基因聚核苷酸形式之AAV蛋白殼的隨機化或半隨機化文庫、製備包含此類蛋白殼的AAV病毒粒子(藉由將
cap基因文庫併入AAV基因體中或將其以反式提供，諸如在轉染至封裝株系中的質體上)、正向或負向選擇AAV病毒粒子，及回收
cap基因用於定序。在一些實施例中，回收及定序包括奈米孔定序。可使用其他高通量或下一代定序(NGS)方法。
在一些實施例中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)病毒粒子，其包含：
a)如本文所述的蛋白殼蛋白；及
b)包含編碼一或多種基因產物之核苷酸序列的異源核酸。
在另一態樣中，本文提供重組腺相關病毒(rAAV)病毒粒子，其包含蛋白殼蛋白及斑菲素蛋白-2 (PKP2)表現卡匣，其中該蛋白殼蛋白與或所含序列與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%胺基酸序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含：位置584、或位置583與584之間的胺基酸插入，包含天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者；位置585、或位置584與585之間的胺基酸插入，包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者；位置586、或位置585與586之間的胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸(L)中之一或多者；位置587、或位置586與587之間的胺基酸插入，包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者；位置588、位置587與588之間的胺基酸插入，包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者；位置589、或位置588與589之間的胺基酸插入，包含甘胺酸(G)及麩醯胺酸(Q)中之一或多者；一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、N452I、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H；及/或一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582L、T582E、T582A、T582F、T582R、T582P、N583V、N583T、H584R、H584Q、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584T、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585C、Q585V、Q585L、Q585N、Q585S、Q585P、Q585A、Q585M、Q585E、Q585Y、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586T、S586G、S586K、S586M、S586N、S586I、S586Q、S586L、S586P、S586F、S586R、A587F、A587S、A587T、A587N、A587L、A587P、A587V、A587K、A587I、A587R、A587H、A587G、A587M、A587D、A587W、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588G、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588Y、Q588H、Q588M、Q588K、Q588D、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y、Q590L、A591I、G594Q及G594D。
在本文所揭示之rAAV病毒粒子的一些實施例中，蛋白殼蛋白在VR-VIII位點中包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在VR-VIII位點中的位置584至590包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入，或在VR-VIII位點中的位置585至590包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：(i)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582E、N583V、H584Q、S586K、A587P、A587S、Q588G、Q588M、A589S、A591I、G594Q及G594D；(ii)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582L、T582A、T582F、T582R、T582P、H584R、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584Q、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585N、Q585M、Q585E、Q585V、Q585H、S586T、S586G、S586Q、S586I、S586L、S586F、S586D、S586R、S586M、A587F、A587I、A587H、A587M、A587N、A587W、Q588Y、Q588S、Q588T及Q588R；(iii)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585C、Q585S、S586I、A587V及A587G；或(iv)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585V、Q585T、Q585L、Q585C、Q585N、Q585S、Q585M、Q585E、Q585P、Q585A、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586G、S586T、S586M、S586N、S586L、S586R、S586I、S586K、A587S、A587T、A587N、A587L、A587V、A587K、A587I、A587F、A587P、A587R、A587D、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588H、Q588Y、Q588M、Q588K、Q588D、Q588G、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y及Q590L。在一些實施例中，蛋白殼蛋白：(i)具有心臟向性；(ii)相較於親本序列，在心臟細胞中展現增加的轉導效率；(iii)相較於親本序列，在肝臟細胞中展現降低的轉導效率；及/或(iv)相較於親本序列，對心臟細胞而非對肝臟細胞展現增加的選擇性。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、N452I、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在位置452包含選自由以下組成之群的胺基酸：K及N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置584之選自由以下組成之群的胺基酸：R及H；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R、I及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R、P及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y及A；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L、M及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；位置584之選自由以下組成之群的胺基酸：R及H；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R、I及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R、P及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y及A；以及位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L、M及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置584之胺基酸R；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H及L；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R及I；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R及P；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D及G；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E及Y；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L及M。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者或所有八者：(i)位置452的胺基酸K；(ii)位置584的胺基酸R；(iii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H及L；(iv)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R及I；(v)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R及P；(vi)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D及G；(vii)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E及Y；以及(viii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L及M。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V、T及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G、D及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N、V及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I、R及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I、R及A；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H、R及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V、T及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G、D及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N、V及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I、R及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I、R及A；以及位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H、R及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V及T；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G及D；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N及V；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I及R；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I及R；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者或所有七者：(i)位置452之胺基酸K；(ii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V及T；(iii)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G、D；(iv)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N及V；(v)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I及R；(vi)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I及R；以及(vii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M、C及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D、N及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S、I及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I、R及A；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、R及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M、C及Q；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D、N及S；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V及A；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S、I及Q；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I、R及A；以及位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、R及Q。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M及C；位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D及N；位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N及V；位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S及I；位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I及R；及/或位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者或所有七者：(i)位置452之胺基酸K；(ii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M及C；(iii)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D及N；(iv)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N及V；(v)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S及I；(vi)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I及R；以及(vii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；以及位置587之胺基酸取代A587T；且視情況在選自由以下組成之群的一個、兩個或更多個位置包含胺基酸N或R：584、585、586、588、589及590。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；以及選自由以下組成之群之一個、兩個或更多個位置的胺基酸N或R：584、585、586、588、589及590。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；以及選自由以下組成之群之兩個或更多個位置的胺基酸S：585、586、587、588、589及590。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；且在VR-VIII位點之區域585至590中的三個、四個、五個或六個位置包含選自由以下組成之群的胺基酸：N、S、T、R及I。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在VR-VIII位點之區域585至590中的三個、四個、五個或六個位置包含：選自由以下組成之群的胺基酸：N、S、T及R。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586N、A587T、Q588V、A589S、Q590I及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586T、A587L、Q588F、A589N、Q590S及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L、Q590G及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585G、A587I、Q588L、A589T、Q590H及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585M、S586M、A587T、Q588T及Q590R；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L及Q590G；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585C、A587T、Q588S、A589I及Q590R；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586D、A587N、Q588I、A589R及Q590S；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586D、A587N、Q588I、A589R、Q590S及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、S586N、A587V、Q588I、A589S、Q590G及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586G及Q588Y；以及位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586A、A587N、Q588Y、A589G及N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含位置581-583之胺基酸ATN及位置591-594之胺基酸AQTG。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含位置581-584之胺基酸ATNH及位置591-594之胺基酸AQTG。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：(i) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHENTVSIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(ii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHQTLFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(iii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNSTYLGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(iv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHGSILTHAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(v) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHMMTTARAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(vi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNSTYLGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(vii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHCSTSIRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(viii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHEDNIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(ix) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHEDNIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(x) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNNVISGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(xi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHQGAYAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHQANYGQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K；(xiii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNMNRVNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xiv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNNVISGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSNSVQSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xvi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSSTFQGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xvii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHVSSFTSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xviii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSTTNFRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xix) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSSIFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xx) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHAGNYNNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHTSVISIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHHSRVEIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxiii)VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSSIIYSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxiv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSGRDSYAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHSSSYNNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxvi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHHNPSINAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxvii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNRNGLLAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxviii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHESTSVRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxix) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHNIRTEMAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxx) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHQTLFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxxi) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHLSVSSIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxxii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNHEDIIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；(xxxiii) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNRQTAQAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；或(xxxiv) VR-VIII位置581-594之胺基酸序列ATNRQIAQAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：(i)位置584之胺基酸插入，包含天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者；(ii)位置585之胺基酸插入，包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者；(iii)位置586之胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸中之一或多者；(iv)位置587之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者；(v)位置588之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者；及/或(vi)位置589之胺基酸插入，包含甘胺酸(G)及麩醯胺酸(Q)中之一或多者。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：(i)位置584之胺基酸插入，其由TY、FN或AT組成；(ii)位置585之胺基酸插入，其由MH組成；(iii)位置586之胺基酸插入，其由HY、VT、AI、WM或ML組成；(iv)位置587之胺基酸插入，其由PI組成；及/或(v)位置588之胺基酸插入，其由IT或PT組成。在一些實施例中，除指定的修飾之外，蛋白殼蛋白與或所含序列與根據SEQ ID NO: 487的AAV9 VP3序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，除指定的修飾之外，蛋白殼蛋白與或所含序列與根據SEQ ID NO: 486的AAV9 VP2序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，除指定的修飾之外，蛋白殼蛋白與或所含序列與根據SEQ ID NO: 1的AAV9 VP1序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與由以下組成之群中之任一者至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708、710、772及774，或其功能片段。在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含由以下組成之群中之任一者的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成：SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708、710、772及774。
在一些實施例中，rAAV病毒粒子轉導心臟細胞。在一些實施例中，rAAV病毒粒子轉導心肌細胞。在一些實施例中，rAAV病毒粒子遷移至除肝臟之外的至少一種器官。在一些實施例中，rAAV病毒粒子遷移至心臟。在一些實施例中，rAAV病毒粒子展現的心臟轉導效率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子。在一些實施例中，rAAV病毒粒子展現的心臟/肝臟轉導比率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，視情況高至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，與投與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，將rAAV病毒粒子投與個體引起肝臟病毒負荷降低，視情況降低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些實施例中，與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，rAAV病毒粒子展現更高的轉導效率，視情況展現更高的心臟轉導效率，其係在靈長類動物中所評估。在一些實施例中，與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，rAAV病毒粒子展現更高的心臟/肝臟轉導比率，視情況高至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，其係在靈長類動物中所評估。在一些實施例中，與投與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子相比，將rAAV病毒粒子投與個體引起肝臟病毒負荷降低，視情況降低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，其係在靈長類動物中所評估。
在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含與SEQ ID NO: 782或SEQ ID NO: 783具有至少95%一致性的序列。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含與SEQ ID NO: 786具有至少95%一致性的核酸序列。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含心臟特異性啟動子。在一些實施例中，心臟特異性啟動子引導心肌、心包膜或兩者中的基因表現。在一些實施例中，心臟特異性啟動子為肌鈣蛋白啟動子，或α-肌凝蛋白重鏈啟動子。在一些實施例中，肌鈣蛋白啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 784具有至少95%一致性。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含PKP2啟動子。在一些實施例中，PKP2啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 785具有至少95%一致性。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含組成型啟動子。在一些實施例中，組成型啟動子係β-肌動蛋白啟動子。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含心臟特異性增強子。在一些實施例中，PKP2表現卡匣包含3'元件。在一些實施例中，3'元件包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)、牛生長激素聚腺苷酸化(bGH polyA)序列或其組合。
在一些實施例中，本文所揭示之rAAV病毒粒子包含如本文所揭示之AAV9蛋白殼蛋白。在一些實施例中，本文所揭示之rAAV病毒粒子包含如本文所揭示之AAV5/AAV9嵌合蛋白殼蛋白。在一些實施例中，本文所揭示之rAAV病毒粒子包含如本文所揭示之組合型蛋白殼蛋白
在一些實施例中，本文所述的AAV9蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性的序列，如下文所示。在一些實施例中，本文所述的AAV9蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性的序列。VP1、VP2及VP3之N端殘基以及VR位點(VR-IV、VR-V、VR-VII及VR-VIII)指示(粗體及加下劃線)於以下全長VP1 之序列(SEQ ID NO: 1)中。野生型AAV9 VP1具有SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。野生型AAV9 VP2具有SEQ ID NO: 486之胺基酸序列。野生型AAV9 VP3具有SEQ ID NO: 487之胺基酸序列。
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治療方法及用途
本文在各種態樣中所提供之PKP2基因療法載體適用於治療患有心臟疾病或病狀的個體。在其他態樣中，本文所提供之PKP2基因療法載體係用於治療患有心臟疾病或病狀的個體。「治療」或「治療病狀或有需要之個體」係指(1)採取步驟以獲得有益或所需的結果，包括諸如症狀減輕等臨床結果；(2)預防疾病，例如使得易患該疾病之患者(例如橋粒基因(諸如PKP2)中存在遺傳突變、但尚未經歷或顯示該疾病之症狀的攜帶者)不出現該疾病的臨床症狀；(3)抑制該疾病，例如遏制或減少該疾病或其臨床症狀的發展；(4)緩解該疾病，例如促使該疾病或其臨床症狀消退；或(5)延遲該疾病。在一個態樣中，本文提供用於治療有需要之個體之心臟疾病或病症的方法。在一些情況下，該方法包含投與組成物，該組成物包含基因療法載體及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，該基因療法載體包含可操作地連接至至少一個啟動子之編碼斑菲素蛋白2 (PKP2)多肽或其片段的核酸。在一些情況下，心臟疾病或病症為致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌病(ACM)。在一些情況下，本文中的治療方法減輕致心律失常心肌病的至少一種症狀，包括但不限於該方法逆轉、減輕或預防以下中的至少一者：纖維脂肪組織置換；心肌萎縮；主導性右心室擴張；心室心律不齊；心因性猝死；或運動觸發的心臟事件；右心室心肌病、擴張或心臟衰竭；左心室心肌病、擴張或心臟衰竭；心房心律不齊；暈厥；心悸；呼吸短促；或胸痛。在一些實施例中，該方法逆轉、減輕或預防心肌、心包膜或兩者的纖維脂肪組織置換。在一些情況下，該方法恢復橋粒結構及/或功能。在一些情況下，該方法恢復PKP2 mRNA表現及/或PKP2蛋白質及活性程度。在一些情況下，該方法恢復PKP2誘導的基因表現。在一些情況下，PKP2誘導的基因表現包含其表現為直接或間接因果因子、產生一或多種疾病表型的基因表現。在一些實施例中，該方法恢復一或多種基因的表現，該等基因對心臟疾病的一或多種症狀具有直接或間接的影響。在一些情況下，該方法恢復以下中之一或多者的表現：蘭尼鹼受體2 (Ryr2)、錨蛋白-B (Ank2)、Cacna1c (CaV1.2)、三聯蛋白(Trdn)或隱鈣素-2 (Casq2)。
在本文所提供之治療方法的一些實施例中，基因療法載體包含病毒載體。考慮適用於本文方法中的任何病毒載體，包括但不限於選自由以下組成之群的病毒載體：腺相關病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、痘瘡病毒及疱疹病毒。在一些情況下，基因療法載體為腺相關病毒。在一些情況下，腺相關病毒係選自由以下組成之群：AAV6、AAV8及AAV9或其衍生物。在一些情況下，腺相關病毒為AAV9或其衍生物。在一些情況下，AAV9的核酸序列與SEQ ID NO: 7具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，腺相關病毒經修飾以改善心肌或心包膜中之受影響細胞(諸如心肌細胞)的轉導，例如在一些情況下，腺相關病毒為AAV6、AAV8或AAV9之衍生物。在一些情況下，衍生物為美國專利申請案第63/012,703號中所述的任何AAV，該案以全文引用的方式併入本文中。
在本文所提供之一些實施例或治療方法中，包含基因療法載體的組成物經由到達受影響細胞的任何適合途徑投與。舉例而言，在一些情況下，靜脈內、心臟內、心臟周圍或動脈內投與組成物。
在本文所提供之治療方法的一些實施例中，PKP2係藉由適於表現的任何啟動子表現於心肌或心包膜中之受影響細胞及組織中，例如心肌細胞。舉例而言，在一些情況下，啟動子係心臟特異性啟動子。在一些情況下，心臟特異性啟動子係肌鈣蛋白啟動子或α-肌凝蛋白重鏈啟動子。在一些情況下，啟動子係PKP2啟動子。在一些情況下，心臟特異性增強子與啟動子組合。在一些情況下，肌鈣蛋白啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 784具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，PKP2啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 785具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，啟動子係組成型啟動子。在一些情況下，組成型啟動子係β-肌動蛋白啟動子。
在本文所提供之治療方法的一些實施例中，編碼PKP2基因的核酸具有編碼PKP2多肽的任何適合序列，例如編碼具有序列SEQ ID NO: 789之多肽的任何核酸。舉例而言，在一些情況下，PKP2基因的序列與SEQ ID NO: 782具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，PKP2基因的序列與SEQ ID NO: 783具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，編碼PKP2基因之核酸序列經密碼子優化。
在本文所提供之治療方法的一些實施例中，基因療法載體含有具有約3 kb至約5 kb之尺寸的基因表現卡匣。在一些實施例中，基因表現卡匣具有約4 kb至約5 kb的尺寸。在一些實施例中，基因表現卡匣具有約4.2 kb至約4.8 kb的尺寸。在一些實施例中，基因表現卡匣具有約4.5 kb的尺寸。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.9 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.8 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.7 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.6 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.4 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.3 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.2 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.1 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.9 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.8 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.7 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.6 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.1 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.3 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.7 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.9 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.1 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.2 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.3 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.4 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.6 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.7 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.8 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.9 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約5 kb。
在本文方法之各種實施例中，包含PKP2基因的基因療法載體調配成包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的組成物。舉例而言，在一些情況下，醫藥學上可接受之載劑或賦形劑包含緩衝液、聚合物、鹽或其組合。
在本文所提供之治療方法的一些實施例中，經鑑別，個體的橋粒蛋白中存在至少一種變異。在一些情況下，橋粒蛋白為PKP2。在一些情況下，變異包含缺失、插入、單核苷酸變異或複本數變異。在一些情況下，經由DNA定序、PCR、qPCR、原位雜交或鑑別個體中之基因變異的另一種其他適合方法鑑別，個體的橋粒蛋白中存在至少一種變異。
基因療法載體
在另一態樣中，提供基因療法載體，其包含可操作地連接至至少一個啟動子的斑菲素蛋白2基因。在一些情況下，基因療法載體包含病毒載體。在一些情況下，病毒載體為適用於治療心臟疾病或病狀的任何病毒載體。在一些情況下，病毒載體適於將基因遞送至心肌、心包膜或兩者中之細胞。在一些情況下，病毒載體係選自由以下組成之群：腺相關病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、痘瘡病毒及疱疹病毒。在一些情況下，基因療法載體為腺相關病毒。在一些情況下，腺相關病毒係選自由以下組成之群：AAV6、AAV8及AAV9或其衍生物。在一些情況下，腺相關病毒為AAV9或其衍生物。在一些情況下，AAV9的核酸序列與SEQ ID NO: 711具有至少95%一致性。在一些情況下，腺相關病毒為AAV6、AAV8或AAV9之衍生物，其經最佳化以根據本文中的治療方法轉導細胞。在一些情況下，衍生物為美國專利申請案第63/012,703號中所述的任何AAV，該案以全文引用的方式併入本文中。
在本文所提供之基因療法載體的一些實施例中，PKP2係藉由適於表現的任何啟動子表現於受影響細胞及組織中，例如心肌細胞。在一些情況下，PKP2係藉由在心肌、心包膜或兩者之細胞中具有活性的啟動子表現。舉例而言，在一些情況下，啟動子係心臟特異性啟動子。在一些情況下，心臟特異性啟動子係肌鈣蛋白啟動子或α-肌凝蛋白重鏈啟動子。在一些情況下，啟動子係PKP2啟動子。在一些情況下，心臟特異性增強子與啟動子組合。在一些情況下，肌鈣蛋白啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 784具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，PKP2啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 785具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，啟動子係組成型啟動子。在一些情況下，組成型啟動子係β-肌動蛋白啟動子。
在本文所提供之基因療法載體的一些實施例中，編碼PKP2基因的核酸具有編碼PKP2多肽的任何適合序列，例如編碼具有序列SEQ ID NO: 712之多肽的任何核酸。舉例而言，在一些情況下，PKP2基因的序列與SEQ ID NO: 782具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，PKP2基因的序列與SEQ ID NO: 783具有至少80%、85%、90%、95%或99%一致性。在一些情況下，編碼PKP2基因之核酸序列經密碼子優化。
在本文所提供之基因療法載體的一些實施例中，基因療法載體包含3'元件。在一些實施例中，3'元件使基因療法載體的轉錄產物(例如PKP2轉錄本)穩定。在一些實施例中，3'元件包含牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化序列。在一些實施例中，3'元件包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。
在本文所提供之基因療法載體的一些實施例中，基因療法載體含有具有約3 kb至約5 kb之尺寸的基因表現卡匣。在一些實施例中，基因表現卡匣具有約4 kb至約5 kb的尺寸。在一些實施例中，基因表現卡匣具有約4.2 kb至約4.8 kb的尺寸。在一些實施例中，基因表現卡匣具有約4.5 kb的尺寸。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.9 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.8 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.7 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.6 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.4 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.3 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.2 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4.1 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約4 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.9 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.8 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.7 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.6 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸不大於約3.5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.1 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.3 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.7 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約3.9 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.1 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.2 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.3 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.4 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.5 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.6 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.7 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.8 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約4.9 kb。在一些實施例中，基因表現卡匣的尺寸為至少約5 kb。
在本文所提供之基因療法載體的各種實施例中，包含PKP2基因的基因療法載體調配成包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的組成物。舉例而言，在一些情況下，醫藥學上可接受之載劑或賦形劑包含緩衝液、聚合物、鹽或其組合。
在一些實施例中，本文中的基因療法載體包含下表1中所提供的核酸序列。
具有變異型多肽序列的蛋白殼蛋白
| 表 1 ： 序列 | ||
| 名稱 | 序列 | SEQ ID NO: |
| 人類PKP2 | ATGGCAGCCCCCGGCGCCCCAGCTGAGTACGGCTACATCCGGACCGTCCTGGGCCAGCAGATCCTGGGACAACTGGACAGCTCCAGCCTGGCGCTGCCCTCCGAGGCCAAGCTGAAGCTGGCGGGGAGCAGCGGCCGCGGCGGCCAGACAGTCAAGAGCCTGCGGATCCAGGAGCAGGTGCAGCAGACCCTCGCCCGGAAGGGCCGCAGCTCCGTGGGCAACGGAAATCTTCACCGAACCAGCAGTGTTCCTGAGTATGTCTACAACCTACACTTGGTTGAAAATGATTTTGTTGGAGGCCGTTCCCCTGTTCCTAAAACCTATGACATGCTAAAGGCTGGCACAACTGCCACTTATGAAGGTCGCTGGGGAAGAGGAACAGCACAGTACAGCTCCCAGAAGTCCGTGGAAGAAAGGTCCTTGAGGCATCCTCTGAGGAGACTGGAGATTTCTCCTGACAGCAGCCCGGAGAGGGCTCACTACACGCACAGCGATTACCAGTACAGCCAGAGAAGCCAGGCTGGGCACACCCTGCACCACCAAGAAAGCAGGCGGGCCGCCCTCCTAGTGCCACCGAGATATGCTCGTTCCGAGATCGTGGGGGTCAGCCGTGCTGGCACCACAAGCAGGCAGCGCCACTTTGACACATACCACAGACAGTACCAGCATGGCTCTGTTAGCGACACCGTTTTTGACAGCATCCCTGCCAACCCGGCCCTGCTCACGTACCCCAGGCCAGGGACCAGCCGCAGCATGGGCAACCTCTTGGAGAAGGAGAACTACCTGACGGCAGGGCTCACTGTCGGGCAGGTCAGGCCGCTGGTGCCCCTGCAGCCCGTCACTCAGAACAGGGCTTCCAGGTCCTCCTGGCATCAGAGCTCCTTCCACAGCACCCGCACGCTGAGGGAAGCTGGGCCCAGTGTCGCCGTGGATTCCAGCGGGAGGAGAGCGCACTTGACTGTCGGCCAGGCGGCCGCAGGGGGAAGTGGGAATCTGCTCACTGAGAGAAGCACTTTCACTGACTCCCAGCTGGGGAATGCAGACATGGAGATGACTCTGGAGCGAGCAGTGAGTATGCTCGAGGCAGACCACATGCTGCCATCCAGGATTTCTGCTGCAGCTACTTTCATACAGCACGAGTGCTTCCAGAAATCTGAAGCTCGGAAGAGGGTTAACCAGCTTCGTGGCATCCTCAAGCTTCTGCAGCTCCTAAAAGTTCAGAATGAAGACGTTCAGCGAGCTGTGTGTGGGGCCTTGAGAAACTTAGTATTTGAAGACAATGACAACAAATTGGAGGTGGCTGAACTAAATGGGGTACCTCGGCTGCTCCAGGTGCTGAAGCAAACCAGAGACTTGGAGACTAAAAAACAAATAACAGGTTTGCTGTGGAATTTGTCATCTAATGACAAACTCAAGAATCTCATGATAACAGAAGCATTGCTTACGCTGACGGAGAATATCATCATCCCCTTTTCTGGGTGGCCTGAAGGAGACTACCCAAAAGCAAATGGTTTGCTCGATTTTGACATATTCTACAACGTCACTGGATGCCTAAGAAACATGAGTTCTGCTGGCGCTGATGGGAGAAAAGCGATGAGAAGATGTGACGGACTCATTGACTCACTGGTCCATTATGTCAGAGGAACCATTGCAGATTACCAGCCAGATGACAAGGCCACGGAGAATTGTGTGTGCATTCTTCATAACCTCTCCTACCAGCTGGAGGCAGAGCTCCCAGAGAAATATTCCCAGAATATCTATATTCAAAACCGGAATATCCAGACTGACAACAACAAAAGTATTGGATGTTTTGGCAGTCGAAGCAGGAAAGTAAAAGAGCAATACCAGGACGTGCCGATGCCGGAGGAAAAGAGCAACCCCAAGGGCGTGGAGTGGCTGTGGCATTCCATTGTTATAAGGATGTATCTGTCCTTGATCGCCAAAAGTGTCCGCAACTACACACAAGAAGCATCCTTAGGAGCTCTGCAGAACCTCACGGCCGGAAGTGGACCAATGCCGACATCAGTGGCTCAGACAGTTGTCCAGAAGGAAAGTGGCCTGCAGCACACCCGAAAGATGCTGCATGTTGGTGACCCAAGTGTGAAAAAGACAGCCATCTCGCTGCTGAGGAATCTGTCCCGGAATCTTTCTCTGCAGAATGAAATTGCCAAAGAAACTCTCCCTGATTTGGTTTCCATCATTCCTGACACAGTCCCGAGTACTGACCTTCTCATTGAAACTACAGCCTCTGCCTGTTACACATTGAACAACATAATCCAAAACAGTTACCAGAATGCACGCGACCTTCTAAACACCGGGGGCATCCAGAAAATTATGGCCATTAGTGCAGGCGATGCCTATGCCTCCAACAAAGCAAGTAAAGCTGCTTCCGTCCTTCTGTATTCTCTGTGGGCACACACGGAACTGCATCATGCCTACAAGAAGGCTCAGTTTAAGAAGACAGATTTTGTCAACAGCCGGACTGCCAAAGCCTACCACTCCCTTAAAGACTGA | 782 |
| 人類PKP2 (經密碼子優化) | ATGGCTGCTCCTGGTGCTCCTGCCGAGTACGGCTACATCAGAACAGTGCTGGGCCAGCAGATCCTGGGACAGCTGGATTCTAGCTCTCTGGCCCTGCCTTCTGAGGCCAAGCTGAAACTGGCCGGCAGTTCTGGAAGAGGCGGCCAGACAGTGAAGTCCCTGCGGATCCAAGAACAGGTGCAGCAGACCCTGGCCAGAAAGGGCAGATCTTCTGTCGGCAACGGCAACCTGCACAGAACCAGCTCTGTGCCCGAGTACGTGTACAATCTGCACCTGGTGGAAAACGACTTCGTCGGCGGCAGATCCCCTGTGCCTAAGACCTACGATATGCTGAAGGCCGGCACCACCGCCACCTATGAAGGCAGATGGGGAAGAGGCACAGCCCAGTACAGCAGCCAGAAAAGCGTGGAAGAGAGAAGCCTGCGGCACCCTCTGCGGAGACTGGAAATCAGCCCTGATAGCAGCCCAGAGAGAGCCCACTACACCCACAGCGACTACCAGTACTCCCAGAGATCTCAGGCCGGCCACACACTGCACCACCAAGAGTCTAGAAGGGCCGCTCTGCTGGTGCCTCCTAGATACGCCAGATCTGAGATCGTGGGCGTGTCCAGAGCCGGCACAACAAGCAGACAGAGACACTTCGACACCTACCACCGGCAGTATCAGCACGGCAGCGTGTCCGATACCGTGTTCGATAGCATCCCCGCCAATCCTGCTCTGCTGACATACCCTAGACCTGGCACCTCCAGATCCATGGGCAATCTGCTGGAAAAAGAGAACTACCTGACCGCCGGACTGACCGTGGGACAAGTTCGACCTCTGGTTCCTCTGCAGCCCGTGACACAGAACAGAGCCAGCAGAAGCAGCTGGCACCAGTCCAGCTTCCACAGCACCAGAACACTGAGAGAAGCTGGCCCTAGCGTGGCCGTGGATTCTTCTGGTAGAAGGGCTCACCTGACAGTTGGCCAAGCAGCTGCAGGCGGAAGCGGAAATCTGCTGACCGAGAGAAGCACCTTCACCGACAGCCAGCTGGGCAACGCCGACATGGAAATGACACTGGAACGGGCCGTGTCCATGCTGGAAGCCGATCACATGCTGCCCAGCAGAATTAGCGCCGCTGCCACCTTTATCCAGCACGAGTGCTTCCAGAAGTCTGAGGCCCGGAAGAGAGTGAACCAGCTGAGAGGCATCCTGAAGCTGCTGCAGCTCCTGAAGGTGCAGAACGAGGATGTGCAGAGGGCTGTGTGTGGGGCCCTGAGAAATCTGGTGTTCGAGGACAACGACAACAAGCTGGAAGTGGCCGAGCTGAACGGCGTGCCAAGACTGCTGCAGGTTCTGAAACAGACCCGCGACCTGGAAACAAAGAAGCAGATCACCGGCCTGCTCTGGAACCTGAGCAGCAACGACAAGCTGAAGAACCTGATGATCACAGAGGCCCTGCTGACCCTGACAGAGAACATCATCATCCCTTTCAGCGGCTGGCCCGAGGGCGATTACCCTAAAGCTAATGGCCTGCTGGACTTCGACATCTTCTACAACGTGACCGGCTGCCTGAGAAACATGTCTAGCGCTGGCGCCGATGGCAGAAAGGCCATGAGAAGATGTGACGGCCTGATCGACAGCCTGGTGCACTATGTGCGGGGCACAATCGCCGATTACCAGCCTGATGATAAGGCCACCGAGAACTGCGTGTGCATCCTGCACAACCTGAGCTACCAGCTGGAAGCAGAGCTGCCCGAGAAGTACAGCCAGAACATCTACATCCAGAACCGGAACATCCAGACCGACAACAACAAGAGCATCGGCTGCTTCGGCAGCCGCAGCCGGAAAGTGAAAGAACAGTACCAGGACGTGCCCATGCCTGAGGAAAAGTCTAACCCCAAAGGCGTGGAATGGCTGTGGCACAGCATCGTGATCCGGATGTACCTGAGCCTGATCGCCAAGAGCGTGCGGAATTACACCCAAGAGGCATCTCTGGGCGCCCTGCAGAATCTGACAGCAGGATCTGGCCCTATGCCTACCTCTGTGGCTCAGACCGTGGTGCAGAAAGAGTCTGGCCTGCAGCACACCCGGAAGATGCTGCATGTGGGAGATCCCAGCGTGAAGAAAACCGCCATCAGCCTGCTGAGAAACCTGAGCCGGAATCTGTCTCTGCAGAATGAGATCGCCAAAGAGACACTGCCCGACCTGGTGTCTATCATCCCTGACACCGTGCCTAGCACCGACCTGCTGATTGAGACAACAGCCAGCGCCTGCTACACCCTGAACAACATCATTCAGAACTCCTACCAGAACGCCCGCGATCTGCTGAACACAGGCGGCATCCAGAAAATCATGGCCATCTCTGCCGGCGACGCCTACGCCTCTAACAAGGCCTCTAAAGCCGCCAGCGTGCTGCTGTATTCTCTGTGGGCCCATACCGAGCTGCACCATGCCTATAAGAAGGCCCAGTTCAAAAAGACCGACTTCGTGAACAGCCGGACCGCCAAGGCCTACCACTCTCTGAAAGAT | 783 |
| pcTNT啟動子 | GTCATGGAGAAGACCCACCTTGCAGATGTCCTCACTGGGGCTGGCAGAGCCGGCAACCTGCCTAAGGCTGCTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGTCCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCA | 784 |
| PKP2啟動子 | CATCTCAGCATCATGGTTGGATGTTTCCACCTGGCTACATAAGCAAGCTTTACACAAGGTGTAATTTGCCTAAATAGTGGTCCATTCTATTGGGGTGGGAGCAATTGCTTCCAGGACTCACATCCATATGGCTCCCACTTAGCCATGTGGCCTGCTGACAAAGGGTGGCGGAACTGTCACTACTCTGTTGTCCACGCTTTCAGTCCTTTGGTTTCCTCTTCACTCCCTGGACGCTCATGTAAAAAGGGAGGCCATATACCTGTGCATTGTGTGTCTAAGCATTCAGTGTGTGTCTAAAGGCAGAAGGGTGTGGGTAGGAAAACAAAGACGAGGGAAGCTGCGTTCTCCAAACACTTCAGACTTGAGTAAGTGGGGTTTTGCAGCAATTGAGTGATTTGAGGGAAAGTGAACATACAAACCCAAGCAATCAAAGGGAATATTATCTTAATACCAGGGATACATGTTTTTCTTTCTGCCTCTTAAGTCCAAAGAGGCAAATCAGGACAAGTGGCTTTGGTTGTAAACTTTAAGGTCAAGGATCCTTTCTGTTGAGCTTAGCTCTCAAGTTCTCAGTAGTCAACTGCGGTGAAACATAATTAATAGCACGATAAATACAAGTTGTGGAAGATTCGATTGAAAGTTGGAGGCCCTCTCCGTGGATCTCTCTACAAAGAGCCTGTAATAAAGAGGACTTAATCAACGTTAGCAGGGCTATTTAAAAAGCATCGTCTATTAAAATTCATTTCTTCTCTAGAGCCTCTTGTTGGAGTTTCTCTGTGTGGGTGTGTTCGTAAGAGAGGAATGGGTTAGCAAGAGTACTGGGTACAATTTGTGTATCCAAGAGAAAACAGAAGCTCTCAATGAGGAAGAACATATGTTTCTGGGACTGCATCTGTGCAAAAAGTACATAGTCCTGACGTTGTACTAAGAAAAAAAACACTCTCTTTAGAAAGTCTTTTATTTCACACGTTATCTTCTTGGCACATTTCCCTCATATTGCCCTTTCCGCCTGACCAAATAGCCCTTTCTCACCCTCAGGTCCAGGAAAACCAGGAAACGTTTCCAACAGTGCGACAAAGCCTGACTAACCAGACATACTACTCGCTCGGGGATCCCGGAGGCAAGCCTCAGTCCAAGAACAGGAGTGACTCTCGAGGGCTCACCTGCCTGCAGGGCAGCCCCTCCCTGCATCGAGCGGAAATCCATCCTGTCCAGCGCGGGGCGTGGGCAGAGCGGGGCGCGGCCCCGGCAGGCGGTATCCGCTGGGACTCCGACAACGTGCGCGACCCCAGGCGAACCGCGCCCCTCTCCCCACCTCCCCGCGGGCGGGTACAAGTCTCCAGGTGTCCGCGCGCTCAGCGGGTCCGGCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGGGCCCGACTGCGCGTGCCCGGCCGGAGCCGCGCCCCCTCCTCAGGGAAGGCCGGGCGTCCGGCCCACGAGGCCGAGCTCCCCCCCGGCCCGGGCCTCTCACCGGCGCGGGGGGCGGGCCAGGGGCGGGGCCGGACTCGAGCGGGGCGGGGCTCGCGCCAGCGCCCCCAGCTCCGTGGCGGCTTCGCCCGCGAGTCCAGAGGCAGGCGAGCAGCTCGGTCGCCCCCACCGGCCCC | 785 |
| AAV人類PKP2a表現卡匣(pcTnT啟動子，經密碼子優化) | ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcGCCCTTAAGTCATGGAGAAGACCCACCTTGCAGATGTCCTCACTGGGGCTGGCAGAGCCGGCAACCTGCCCAAGGCTGCTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGTCCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCAGCCACCATGGCTGCTCCTGGTGCTCCTGCCGAGTACGGCTACATCAGAACAGTGCTGGGCCAGCAGATCCTGGGACAGCTGGATTCTAGCTCTCTGGCCCTGCCTTCTGAGGCCAAGCTGAAACTGGCCGGCAGTTCTGGAAGAGGCGGCCAGACAGTGAAGTCCCTGCGGATCCAAGAACAGGTGCAGCAGACCCTGGCCAGAAAGGGCAGATCTTCTGTCGGCAACGGCAACCTGCACAGAACCAGCTCTGTGCCCGAGTACGTGTACAATCTGCACCTGGTGGAAAACGACTTCGTCGGCGGCAGATCCCCTGTGCCTAAGACCTACGATATGCTGAAGGCCGGCACCACCGCCACCTATGAAGGCAGATGGGGAAGAGGCACAGCCCAGTACAGCAGCCAGAAAAGCGTGGAAGAGAGAAGCCTGCGGCACCCTCTGCGGAGACTGGAAATCAGCCCTGATAGCAGCCCAGAGAGAGCCCACTACACCCACAGCGACTACCAGTACTCCCAGAGATCTCAGGCCGGCCACACACTGCACCACCAAGAGTCTAGAAGGGCCGCTCTGCTGGTGCCTCCTAGATACGCCAGATCTGAGATCGTGGGCGTGTCCAGAGCCGGCACAACAAGCAGACAGAGACACTTCGACACCTACCACCGGCAGTATCAGCACGGCAGCGTGTCCGATACCGTGTTCGATAGCATCCCCGCCAATCCTGCTCTGCTGACATACCCTAGACCTGGCACCTCCAGATCCATGGGCAATCTGCTGGAAAAAGAGAACTACCTGACCGCCGGACTGACCGTGGGACAAGTTCGACCTCTGGTTCCTCTGCAGCCCGTGACACAGAACAGAGCCAGCAGAAGCAGCTGGCACCAGTCCAGCTTCCACAGCACCAGAACACTGAGAGAAGCTGGCCCTAGCGTGGCCGTGGATTCTTCTGGTAGAAGGGCTCACCTGACAGTTGGCCAAGCAGCTGCAGGCGGAAGCGGAAATCTGCTGACCGAGAGAAGCACCTTCACCGACAGCCAGCTGGGCAACGCCGACATGGAAATGACACTGGAACGGGCCGTGTCCATGCTGGAAGCCGATCACATGCTGCCCAGCAGAATTAGCGCCGCTGCCACCTTTATCCAGCACGAGTGCTTCCAGAAGTCTGAGGCCCGGAAGAGAGTGAACCAGCTGAGAGGCATCCTGAAGCTGCTGCAGCTCCTGAAGGTGCAGAACGAGGATGTGCAGAGGGCTGTGTGTGGGGCCCTGAGAAATCTGGTGTTCGAGGACAACGACAACAAGCTGGAAGTGGCCGAGCTGAACGGCGTGCCAAGACTGCTGCAGGTTCTGAAACAGACCCGCGACCTGGAAACAAAGAAGCAGATCACCGGCCTGCTCTGGAACCTGAGCAGCAACGACAAGCTGAAGAACCTGATGATCACAGAGGCCCTGCTGACCCTGACAGAGAACATCATCATCCCTTTCAGCGGCTGGCCCGAGGGCGATTACCCTAAAGCTAATGGCCTGCTGGACTTCGACATCTTCTACAACGTGACCGGCTGCCTGAGAAACATGTCTAGCGCTGGCGCCGATGGCAGAAAGGCCATGAGAAGATGTGACGGCCTGATCGACAGCCTGGTGCACTATGTGCGGGGCACAATCGCCGATTACCAGCCTGATGATAAGGCCACCGAGAACTGCGTGTGCATCCTGCACAACCTGAGCTACCAGCTGGAAGCAGAGCTGCCCGAGAAGTACAGCCAGAACATCTACATCCAGAACCGGAACATCCAGACCGACAACAACAAGAGCATCGGCTGCTTCGGCAGCCGCAGCCGGAAAGTGAAAGAACAGTACCAGGACGTGCCCATGCCTGAGGAAAAGTCTAACCCCAAAGGCGTGGAATGGCTGTGGCACAGCATCGTGATCCGGATGTACCTGAGCCTGATCGCCAAGAGCGTGCGGAATTACACCCAAGAGGCATCTCTGGGCGCCCTGCAGAATCTGACAGCAGGATCTGGCCCTATGCCTACCTCTGTGGCTCAGACCGTGGTGCAGAAAGAGTCTGGCCTGCAGCACACCCGGAAGATGCTGCATGTGGGAGATCCCAGCGTGAAGAAAACCGCCATCAGCCTGCTGAGAAACCTGAGCCGGAATCTGTCTCTGCAGAATGAGATCGCCAAAGAGACACTGCCCGACCTGGTGTCTATCATCCCTGACACCGTGCCTAGCACCGACCTGCTGATTGAGACAACAGCCAGCGCCTGCTACACCCTGAACAACATCATTCAGAACTCCTACCAGAACGCCCGCGATCTGCTGAACACAGGCGGCATCCAGAAAATCATGGCCATCTCTGCCGGCGACGCCTACGCCTCTAACAAGGCCTCTAAAGCCGCCAGCGTGCTGCTGTATTCTCTGTGGGCCCATACCGAGCTGCACCATGCCTATAAGAAGGCCCAGTTCAAAAAGACCGACTTCGTGAACAGCCGGACCGCCAAGGCCTACCACTCTCTGAAAGATTAAtaagcttggatccaatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaATCATcgtcctttccTtggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgagatctgcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggaCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCgaattcccgataaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag | 786 |
| AAV人類PKP2a表現卡匣(PKP2啟動子，經密碼子優化) | ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcGCCCTTAACATCTCAGCATCATGGTTGGATGTTTCCACCTGGCTACATAAGCAAGCTTTACACAAGGTGTAATTTGCCTAAATAGTGGTCCATTCTATTGGGGTGGGAGCAATTGCTTCCAGGACTCACATCCATATGGCTCCCACTTAGCCATGTGGCCTGCTGACAAAGGGTGGCGGAACTGTCACTACTCTGTTGTCCACGCTTTCAGTCCTTTGGTTTCCTCTTCACTCCCTGGACGCTCATGTAAAAAGGGAGGCCATATACCTGTGCATTGTGTGTCTAAGCATTCAGTGTGTGTCTAAAGGCAGAAGGGTGTGGGTAGGAAAACAAAGACGAGGGAAGCTGCGTTCTCCAAACACTTCAGACTTGAGTAAGTGGGGTTTTGCAGCAATTGAGTGATTTGAGGGAAAGTGAACATACAAACCCAAGCAATCAAAGGGAATATTATCTTAATACCAGGGATACATGTTTTTCTTTCTGCCTCTTAAGTCCAAAGAGGCAAATCAGGACAAGTGGCTTTGGTTGTAAACTTTAAGGTCAAGGATCCTTTCTGTTGAGCTTAGCTCTCAAGTTCTCAGTAGTCAACTGCGGTGAAACATAATTAATAGCACGATAAATACAAGTTGTGGAAGATTCGATTGAAAGTTGGAGGCCCTCTCCGTGGATCTCTCTACAAAGAGCCTGTAATAAAGAGGACTTAATCAACGTTAGCAGGGCTATTTAAAAAGCATCGTCTATTAAAATTCATTTCTTCTCTAGAGCCTCTTGTTGGAGTTTCTCTGTGTGGGTGTGTTCGTAAGAGAGGAATGGGTTAGCAAGAGTACTGGGTACAATTTGTGTATCCAAGAGAAAACAGAAGCTCTCAATGAGGAAGAACATATGTTTCTGGGACTGCATCTGTGCAAAAAGTACATAGTCCTGACGTTGTACTAAGAAAAAAAACACTCTCTTTAGAAAGTCTTTTATTTCACACGTTATCTTCTTGGCACATTTCCCTCATATTGCCCTTTCCGCCTGACCAAATAGCCCTTTCTCACCCTCAGGTCCAGGAAAACCAGGAAACGTTTCCAACAGTGCGACAAAGCCTGACTAACCAGACATACTACTCGCTCGGGGATCCCGGAGGCAAGCCTCAGTCCAAGAACAGGAGTGACTCTCGAGGGCTCACCTGCCTGCAGGGCAGCCCCTCCCTGCATCGAGCGGAAATCCATCCTGTCCAGCGCGGGGCGTGGGCAGAGCGGGGCGCGGCCCCGGCAGGCGGTATCCGCTGGGACTCCGACAACGTGCGCGACCCCAGGCGAACCGCGCCCCTCTCCCCACCTCCCCGCGGGCGGGTACAAGTCTCCAGGTGTCCGCGCGCTCAGCGGGTCCGGCCCGCCCCCGCCCCCGCCCCCGGGCCCGACTGCGCGTGCCCGGCCGGAGCCGCGCCCCCTCCTCAGGGAAGGCCGGGCGTCCGGCCCACGAGGCCGAGCTCCCCCCCGGCCCGGGCCTCTCACCGGCGCGGGGGGCGGGCCAGGGGCGGGGCCGGACTCGAGCGGGGCGGGGCTCGCGCCAGCGCCCCCAGCTCCGTGGCGGCTTCGCCCGCGAGTCCAGAGGCAGGCGAGCAGCTCGGTCGCCCCCACCGGCCCCATGGCTGCTCCTGGTGCTCCTGCCGAGTACGGCTACATCAGAACAGTGCTGGGCCAGCAGATCCTGGGACAGCTGGATTCTAGCTCTCTGGCCCTGCCTTCTGAGGCCAAGCTGAAACTGGCCGGCAGTTCTGGAAGAGGCGGCCAGACAGTGAAGTCCCTGCGGATCCAAGAACAGGTGCAGCAGACCCTGGCCAGAAAGGGCAGATCTTCTGTCGGCAACGGCAACCTGCACAGAACCAGCTCTGTGCCCGAGTACGTGTACAATCTGCACCTGGTGGAAAACGACTTCGTCGGCGGCAGATCCCCTGTGCCTAAGACCTACGATATGCTGAAGGCCGGCACCACCGCCACCTATGAAGGCAGATGGGGAAGAGGCACAGCCCAGTACAGCAGCCAGAAAAGCGTGGAAGAGAGAAGCCTGCGGCACCCTCTGCGGAGACTGGAAATCAGCCCTGATAGCAGCCCAGAGAGAGCCCACTACACCCACAGCGACTACCAGTACTCCCAGAGATCTCAGGCCGGCCACACACTGCACCACCAAGAGTCTAGAAGGGCCGCTCTGCTGGTGCCTCCTAGATACGCCAGATCTGAGATCGTGGGCGTGTCCAGAGCCGGCACAACAAGCAGACAGAGACACTTCGACACCTACCACCGGCAGTATCAGCACGGCAGCGTGTCCGATACCGTGTTCGATAGCATCCCCGCCAATCCTGCTCTGCTGACATACCCTAGACCTGGCACCTCCAGATCCATGGGCAATCTGCTGGAAAAAGAGAACTACCTGACCGCCGGACTGACCGTGGGACAAGTTCGACCTCTGGTTCCTCTGCAGCCCGTGACACAGAACAGAGCCAGCAGAAGCAGCTGGCACCAGTCCAGCTTCCACAGCACCAGAACACTGAGAGAAGCTGGCCCTAGCGTGGCCGTGGATTCTTCTGGTAGAAGGGCTCACCTGACAGTTGGCCAAGCAGCTGCAGGCGGAAGCGGAAATCTGCTGACCGAGAGAAGCACCTTCACCGACAGCCAGCTGGGCAACGCCGACATGGAAATGACACTGGAACGGGCCGTGTCCATGCTGGAAGCCGATCACATGCTGCCCAGCAGAATTAGCGCCGCTGCCACCTTTATCCAGCACGAGTGCTTCCAGAAGTCTGAGGCCCGGAAGAGAGTGAACCAGCTGAGAGGCATCCTGAAGCTGCTGCAGCTCCTGAAGGTGCAGAACGAGGATGTGCAGAGGGCTGTGTGTGGGGCCCTGAGAAATCTGGTGTTCGAGGACAACGACAACAAGCTGGAAGTGGCCGAGCTGAACGGCGTGCCAAGACTGCTGCAGGTTCTGAAACAGACCCGCGACCTGGAAACAAAGAAGCAGATCACCGGCCTGCTCTGGAACCTGAGCAGCAACGACAAGCTGAAGAACCTGATGATCACAGAGGCCCTGCTGACCCTGACAGAGAACATCATCATCCCTTTCAGCGGCTGGCCCGAGGGCGATTACCCTAAAGCTAATGGCCTGCTGGACTTCGACATCTTCTACAACGTGACCGGCTGCCTGAGAAACATGTCTAGCGCTGGCGCCGATGGCAGAAAGGCCATGAGAAGATGTGACGGCCTGATCGACAGCCTGGTGCACTATGTGCGGGGCACAATCGCCGATTACCAGCCTGATGATAAGGCCACCGAGAACTGCGTGTGCATCCTGCACAACCTGAGCTACCAGCTGGAAGCAGAGCTGCCCGAGAAGTACAGCCAGAACATCTACATCCAGAACCGGAACATCCAGACCGACAACAACAAGAGCATCGGCTGCTTCGGCAGCCGCAGCCGGAAAGTGAAAGAACAGTACCAGGACGTGCCCATGCCTGAGGAAAAGTCTAACCCCAAAGGCGTGGAATGGCTGTGGCACAGCATCGTGATCCGGATGTACCTGAGCCTGATCGCCAAGAGCGTGCGGAATTACACCCAAGAGGCATCTCTGGGCGCCCTGCAGAATCTGACAGCAGGATCTGGCCCTATGCCTACCTCTGTGGCTCAGACCGTGGTGCAGAAAGAGTCTGGCCTGCAGCACACCCGGAAGATGCTGCATGTGGGAGATCCCAGCGTGAAGAAAACCGCCATCAGCCTGCTGAGAAACCTGAGCCGGAATCTGTCTCTGCAGAATGAGATCGCCAAAGAGACACTGCCCGACCTGGTGTCTATCATCCCTGACACCGTGCCTAGCACCGACCTGCTGATTGAGACAACAGCCAGCGCCTGCTACACCCTGAACAACATCATTCAGAACTCCTACCAGAACGCCCGCGATCTGCTGAACACAGGCGGCATCCAGAAAATCATGGCCATCTCTGCCGGCGACGCCTACGCCTCTAACAAGGCCTCTAAAGCCGCCAGCGTGCTGCTGTATTCTCTGTGGGCCCATACCGAGCTGCACCATGCCTATAAGAAGGCCCAGTTCAAAAAGACCGACTTCGTGAACAGCCGGACCGCCAAGGCCTACCACTCTCTGAAAGATGTCGACGGATCCGGTACCGATTACAAGGACGACGATGACAAGTGAAGCTTAATAAAAGATCTTTATTTTCATTAGATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGCTGGGGACTCGAGTTAAGGGCgaattcccgataaggatcttcctagagcatggctacgtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag | 787 |
| AAV9基因體序列 | ACGGCGGGGTTTTACGAGATTGTGATTAAGGTCCCCAGCGACCTTGACGAGCATCTGCCCGGCATTTCTGACAGCTTTGTGAACTGGGTGGCCGAGAAGGAATGGGAGTTGCCGCCAGATTCTGACATGGATCTGAATCTGATTGAGCAGGCACCCCTGACCGTGGCCGAGAAGCTGCAGCGCGACTTTCTGACGGAATGGCGCCGTGTGAGTAAGGCCCCGGAGGCCCTTTTCTTTGTGCAATTTGAGAAGGGAGAGAGCTACTTCCACATGCACGTGCTCGTGGAAACCACCGGGGTGAAATCCATGGTTTTGGGACGTTTCCTGAGTCAGATTCGCGAAAAACTGATTCAGAGAATTTACCGCGGGATCGAGCCGACTTTGCCAAACTGGTTCGCGGTCACAAAGACCAGAAATGGCGCCGGAGGCGGGAACAAGGTGGTGGATGAGTGCTACATCCCCAATTACTTGCTCCCCAAAACCCAGCCTGAGCTCCAGTGGGCGTGGACTAATATGGAACAGTATTTAAGCGCCTGTTTGAATCTCACGGAGCGTAAACGGTTGGTGGCGCAGCATCTGACGCACGTGTCGCAGACGCAGGAGCAGAACAAAGAGAATCAGAATCCCAATTCTGATGCGCCGGTGATCAGATCAAAAACTTCAGCCAGGTACATGGAGCTGGTCGGGTGGCTCGTGGACAAGGGGATTACCTCGGAGAAGCAGTGGATCCAGGAGGACCAGGCCTCATACATCTCCTTCAATGCGGCCTCCAACTCGCGGTCCCAAATCAAGGCTGCCTTGGACAATGCGGGAAAGATTATGAGCCTGACTAAAACCGCCCCCGACTACCTGGTGGGCCAGCAGCCCGTGGAGGACATTTCCAGCAATCGGATTTATAAAATTTTGGAACTAAACGGGTACGATCCCCAATATGCGGCTTCCGTCTTTCTGGGATGGGCCACGAAAAAGTTCGGCAAGAGGAACACCATCTGGCTGTTTGGGCCTGCAACTACCGGGAAGACCAACATCGCGGAGGCCATAGCCCACACTGTGCCCTTCTACGGGTGCGTAAACTGGACCAATGAGAACTTTCCCTTCAACGACTGTGTCGACAAGATGGTGATCTGGTGGGAGGAGGGGAAGATGACCGCCAAGGTCGTGGAGTCGGCCAAAGCCATTCTCGGAGGAAGCAAGGTGCGCGTGGACCAGAAATGCAAGTCCTCGGCCCAGATAGACCCGACTCCCGTGATCGTCACCTCCAACACCAACATGTGCGCCGTGATTGACGGGAACTCAACGACCTTCGAACACCAGCAGCCGTTGCAAGACCGGATGTTCAAATTTGAACTCACCCGCCGTCTGGATCATGACTTTGGGAAGGTCACCAAGCAGGAAGTCAAAGACTTTTTCCGGTGGGCAAAGGATCACGTGGTTGAGGTGGAGCATGAATTCTACGTCAAAAAGGGTGGAGCCAAGAAAAGACCCGCCCCCAGTGACGCAGATATAAGTGAGCCCAAACGGGTGCGCGAGTCAGTTGCGCAGCCATCGACGTCAGACGCGGAAGCTTCGATCAACTACGCAGACAGGTACCAAAACAAATGTTCTCGTCACGTGGGCATGAATCTGATGCTGTTTCCCTGCAGACAATGCGAGAGAATGAATCAGAATTCAAATATCTGCTTCACTCACGGACAGAAAGACTGTTTAGAGTGCTTTCCCGTGTCAGAATCTCAACCCGTTTCTGTCGTCAAAAAGGCGTATCAGAAACTGTGCTACATTCATCATATCATGGGAAAGGTGCCAGACGCTTGCACTGCCTGCGATCTGGTCAATGTGGATTTGGATGACTGCATCTTTGAACAATAAatgacttaaaccaggtATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTTAGTGAAGGAATTCGCGAGTGGTGGGCTTTGAAACCTGGAGCCCCTCAACCCAAGGCAAATCAACAACATCAAGACAACGCTCGAGGTCTTGTGCTTCCGGGTTACAAATACCTTGGACCCGGCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCGGTCAACGCAGCAGACGCGGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAGGCCGGAGACAACCCGTACCTCAAGTACAACCACGCCGACGCCGAGTTCCAGGAGCGGCTCAAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAAAAGAGGCTTCTTGAACCTCTTGGTCTGGTTGAGGAAGCGGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGGCCTGTAGAGCAGTCTCCTCAGGAACCGGACTCCTCCGCGGGTATTGGCAAATCGGGTGCACAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTCGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCAGACCCTCAACCAATCGGAGAACCTCCCGCAGCCCCCTCAGGTGTGGGATCTCTTACAATGGCTTCAGGTGGTGGCGCACCAGTGGCAGACAATAACGAAGGTGCCGATGGAGTGGGTAGTTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCCAATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAATCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACAGCACATCTGGAGGATCTTCAAATGACAACGCCTACTTCGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTCTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAACTGGGGATTCCGGCCTAAGCGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATTCAGGTCAAAGAGGTTACGGACAACAATGGAGTCAAGACCATCGCCAATAACCTTACCAGCACGGTCCAGGTCTTCACGGACTCAGACTATCAGCTCCCGTACGTGCTCGGGTCGGCTCACGAGGGCTGCCTCCCGCCGTTCCCAGCGGACGTTTTCATGATTCCTCAGTACGGGTATCTGACGCTTAATGATGGAAGCCAGGCCGTGGGTCGTTCGTCCTTTTACTGCCTGGAATATTTCCCGTCGCAAATGCTAAGAACGGGTAACAACTTCCAGTTCAGCTACGAGTTTGAGAACGTACCTTTCCATAGCAGCTACGCTCACAGCCAAAGCCTGGACCGACTAATGAATCCACTCATCGACCAATACTTGTACTATCTCTCAAAGACTATTAACGGTTCTGGACAGAATCAACAAACGCTAAAATTCAGTGTGGCCGGACCCAGCAACATGGCTGTCCAGGGAAGAAACTACATACCTGGACCCAGCTACCGACAACAACGTGTCTCAACCACTGTGACTCAAAACAACAACAGCGAATTTGCTTGGCCTGGAGCTTCTTCTTGGGCTCTCAATGGACGTAATAGCTTGATGAATCCTGGACCTGCTATGGCCAGCCACAAAGAAGGAGAGGACCGTTTCTTTCCTTTGTCTGGATCTTTAATTTTTGGCAAACAAGGAACTGGAAGAGACAACGTGGATGCGGACAAAGTCATGATAACCAACGAAGAAGAAATTAAAACTACTAACCCGGTAGCAACGGAGTCCTATGGACAAGTGGCCACAAACCACCAGAGTGCCCAAGCACAGGCGCAGACCGGCTGGGTTCAAAACCAAGGAATACTTCCGGGTATGGTTTGGCAGGACAGAGATGTGTACCTGCAAGGACCCATTTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCTTCTCCGCTGATGGGAGGGTTTGGAATGAAGCACCCGCCTCCTCAGATCCTCATCAAAAACACACCTGTACCTGCGGATCCTCCAACGGCCTTCAACAAGGACAAGCTGAACTCTTTCATCACCCAGTATTCTACTGGCCAAGTCAGCGTGGAGATCGAGTGGGAGCTGCAGAAGGAAAACAGCAAGCGCTGGAACCCGGAGATCCAGTACACTTCCAACTATTACAAGTCTAATAATGTTGAATTTGCTGTTAATACTGAAGGTGTATATAGTGAACCCCGCCCCATTGGCACCAGATACCTGACTCGTAATCTGTAA | 788 |
| PKP2蛋白 | MAAPGAPAEYGYIRTVLGQQILGQLDSSSLALPSEAKLKLAGSSGRGGQTVKSLRIQEQVQQTLARKGRSSVGNGNLHRTSSVPEYVYNLHLVENDFVGGRSPVPKTYDMLKAGTTATYEGRWGRGTAQYSSQKSVEERSLRHPLRRLEISPDSSPERAHYTHSDYQYSQRSQAGHTLHHQESRRAALLVPPRYARSEIVGVSRAGTTSRQRHFDTYHRQYQHGSVSDTVFDSIPANPALLTYPRPGTSRSMGNLLEKENYLTAGLTVGQVRPLVPLQPVTQNRASRSSWHQSSFHSTRTLREAGPSVAVDSSGRRAHLTVGQAAAGGSGNLLTERSTFTDSQLGNADMEMTLERAVSMLEADHMLPSRISAAATFIQHECFQKSEARKRVNQLRGILKLLQLLKVQNEDVQRAVCGALRNLVFEDNDNKLEVAELNGVPRLLQVLKQTRDLETKKQITGLLWNLSSNDKLKNLMITEALLTLTENIIIPFSGWPEGDYPKANGLLDFDIFYNVTGCLRNMSSAGADGRKAMRRCDGLIDSLVHYVRGTIADYQPDDKATENCVCILHNLSYQLEAELPEKYSQNIYIQNRNIQTDNNKSIGCFGSRSRKVKEQYQDVPMPEEKSNPKGVEWLWHSIVIRMYLSLIAKSVRNYTQEASLGALQNLTAGSGPMPTSVAQTVVQKESGLQHTRKMLHVGDPSVKKTAISLLRNLSRNLSLQNEIAKETLPDLVSIIPDTVPSTDLLIETTASACYTLNNIIQNSYQNARDLLNTGGIQKIMAISAGDAYASNKASKAASVLLYSLWAHTELHHAYKKAQFKKTDFVNSRTAKAYHSLKD | 789 |
| WPRE | TCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCG | 790 |
| hGH polyA信號 | CCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTGGGGA | 791 |
| WPRE - hGH polyA信號卡匣 | TCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGAGATCTGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGACTGGGGACTCGAGTTAAGGGCGAATTCCCGATAAGGATCTTCCTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA | 792 |
| AAV9蛋白殼胺基酸序列 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 713 |
在一個態樣中，本發明提供AAV9蛋白殼蛋白，其中相對於親本序列，該蛋白殼蛋白在親本序列的一或多個位點包含變異型多肽序列。在一些實施例中，親本序列的一或多個位點係選自由以下組成之群：VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點。如上述SEQ ID NO: 1中所標識，VR-IV位點介於親本序列中的殘基452與460之間(「NGSGQNQ」，SEQ ID NO: 2)；VR-V位點介於親本序列中的殘基497與502之間(「NNSEFA」，SEQ ID NO: 3)；VR-VII位點介於親本序列中的殘基549與553之間(「GRDNV」，SEQ ID NO: 4)；VR-VIII位點介於親本序列中的殘基581與594之間(「ATNHQSAQAQAQTG」，SEQ ID NO: 5)。在一些實施例中，AAV9蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性、排除VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及/或VR-VIII位點的序列。在一些實施例中，AAV9蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 1有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性、排除VR-VIII位點的序列。在一些實施例中，AAV9蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%99.5%或100%一致性、排除VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及/或VR-VIII位點的序列。在一些實施例中，AAV9蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487有共通的至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致性、排除VR-VIII位點的序列。在一些實施例中，AAV9蛋白殼蛋白在親本序列之VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點中的一或多者處包含變異型多肽序列，其中該親本序列包含與SEQ ID NO: 463至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致的序列。(在SEQ ID NO: 463中，標識為「X」的胺基酸殘基自序列一致性計算排除在外)。
在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白在VR-IV位點(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2序列中之殘基452與460之間(NGSGQNQ))中包含胺基酸取代或插入。在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白在VR-IV位點(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2序列中之殘基452與460之間(NGSGQNQ))中包含胺基酸取代。在一些實施例中，VR-IV位點中的胺基酸取代或插入係本文所述的任何胺基酸取代或插入。在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白包含SEQ ID NO: 1之位置452的胺基酸取代或VR-IV位點中之SEQ ID NO: 2 (NGSGQNQ)的第一胺基酸。在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白包含SEQ ID NO: 1中的胺基酸取代N452K或包含VR-IV位點中的序列KGSGQNQ。
在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白包含VR-V位點(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3序列中之殘基497與502之間(NNSEFA))中的胺基酸取代或插入。在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白包含VR-V位點(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3序列中之殘基497與502之間(NNSEFA))中的胺基酸取代。在一些實施例中，VR-V位點中的胺基酸取代或插入係本文所述的任何胺基酸取代或插入。
在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白包含VR-VII位點(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 4序列中之殘基549與553之間(GRDNV))中的胺基酸取代或插入。在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白包含VR-VII位點(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 4序列中之殘基549與553之間(GRDNV))中的胺基酸取代。在一些實施例中，VR-VII位點中的胺基酸取代或插入係本文所述的任何胺基酸取代或插入。
在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白包含VR-VIII位點(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5序列中之殘基581與594之間(ATNHQSAQAQAQTG))中的胺基酸取代或插入。在一些實施例中，本文所述的蛋白殼蛋白包含VR-VIII位點(SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5序列中之殘基581與594之間(ATNHQSAQAQAQTG))中的胺基酸取代。在一些實施例中，VR-VIII位點中的胺基酸取代或插入係本文所述的任何胺基酸取代或插入。
在一些實施例中，AAV9蛋白殼蛋白包含變異型多肽序列，該變異型多肽序列經合理地設計；藉由誘變而引入；或經由產生序列文庫、經由在一或多個位點使用隨機密碼子而隨機化。本發明之蛋白殼蛋白包括經鑑別可藉由定向演化、隨後定序而富集的任何變異型多肽序列，如但不限於實例中所示。不限於任何特定的取代位點，在一些實施例中，選自由VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點組成之群的一或多個位點具有如本文所述的胺基酸取代。
本文提供多種胺基酸取代、插入及缺失。此等修飾中之任一者可與其他修飾中之任一者組合，但在修飾重疊的情況下，必須選擇一種修飾或可利用插入使兩種修飾彼此鄰近或靠近。可使用本文所述之方法(例如個別地，iPSC-CM的活體外測試、生物體模型的活體內測試，及彙集之rAAV病毒粒子的活體內再篩選)或用於鑑別具有所需封裝效率、向性或其他所需特性之組合的其他已知方法測試修飾組合。類似地，可恰好在本文所需的位置達成修飾，或相同的修飾可位於靠近所述位置的任何位置。蛋白殼蛋白的結構模型化可用於選擇測試用的修飾。
在一些實施例中，本文提供的工程化蛋白殼係本文所述的任一種蛋白殼。在一些實施例中，本文提供的工程化蛋白殼係本文所述的任一種經VR-VIII修飾之蛋白殼。在一些實施例中，本文提供的工程化蛋白殼係本文所述的任一種經VR-IV修飾之蛋白殼。在一些實施例中，本文提供的工程化蛋白殼係本文所述的任一種經VR-VIII及VR-IV修飾之蛋白殼。在一些實施例中，本文提供的工程化蛋白殼係本文所提供之任一實例、表格或圖中所述的任一種蛋白殼。在一些實施例中，本文提供的工程化蛋白殼係圖45所述的任一種蛋白殼。
靈長類動物篩選時鑑別的修飾
在一個態樣中，本發明提供重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含本文所述的一或多種修飾。
本文所述的任一種修飾可單獨或與其他修飾組合使用(例如與本文所述的其他修飾組合)。
僅為清楚起見且不受限制，應注意，提及修飾發生的胺基酸位置編號係相對於SEQ ID NO: 1中之相應胺基酸位置。在一些實施例中，蛋白殼蛋白不包含對應於SEQ ID NO: 1的全長序列，而是包含此序列的較短變異體(例如僅包含SEQ ID NO: 487之變異體或SEQ ID NO: 486之變異體)。在此類實施例中，本文所述的修飾可以不發生於如SEQ ID NO: 1中的相同編號位置，而是發生於與參考序列SEQ ID NO: 1相同的位點或共有序列。在一些實施例中，蛋白殼蛋白係SEQ ID NO: 1之變異體，且本文所述的修飾發生於與SEQ ID NO: 1相同的編號位置。
蛋白殼蛋白可包含位置584之胺基酸插入，包含天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者。
蛋白殼蛋白可包含位置585之胺基酸插入，包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者。
蛋白殼蛋白可包含位置586之胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸中之一或多者。
蛋白殼蛋白可包含位置587之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者。
蛋白殼蛋白可包含位置588之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者。
蛋白殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代N452K。
蛋白殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582L、T582E、T582A、T582F、T582R、T582P、N583V、N583T、H584R、H584Q、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584T、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585C、Q585V、Q585L、Q585N、Q585S、Q585P、Q585A、Q585M、Q585E、Q585Y、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586T、S586G、S586K、S586M、S586N、S586I、S586Q、S586L、S586P、S586F、S586R、A587F、A587S、A587T、A587N、A587L、A587P、A587V、A587K、A587I、A587R、A587H、A587G、A587M、A587D、A587W、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588G、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588Y、Q588H、Q588M、Q588K、Q588D、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y、Q590L、A591I、G594Q及G594D。
蛋白殼蛋白可包含位置584之胺基酸插入，其由TY、FN或AT組成。
蛋白殼蛋白可包含位置585之胺基酸插入，其由MH組成。
蛋白殼蛋白可包含位置586之胺基酸插入，其由HY、VT、AI、WM或ML組成。
蛋白殼蛋白可包含位置587之胺基酸插入，其由PI組成。
蛋白殼蛋白可包含位置588之胺基酸插入，其由IT或PT組成。
蛋白殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582E、N583V、H584Q、S586K、A587P、A587S、Q588G、Q588M、A589S、A591I、G594Q及G594D。
蛋白殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582L、T582A、T582F、T582R、T582P、H584R、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584Q、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585N、Q585M、Q585E、Q585V、Q585H、S586T、S586G、S586Q、S586I、S586L、S586F、S586D、S586R、S586M、A587F、A587I、A587H、A587M、A587N、A587W、Q588Y、Q588S、Q588T及Q588R。
蛋白殼蛋白可包含選自由Q585C、Q585S及S586I組成之群的一或多個胺基酸取代。
蛋白殼蛋白可包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585V、Q585T、Q585L、Q585C、Q585N、Q585S、Q585M、Q585E、Q585P、Q585A、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586G、S586T、S586M、S586N、S586L、S586R、S586I、S586K、A587S、A587T、A587N、A587L、A587V、A587K、A587I、A587F、A587P、A587R、A587D、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588H、Q588Y、Q588M、Q588K、Q588D、Q588G、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y及Q590L。
蛋白殼蛋白可包含選自由A587V及A587G組成之群的一或多個胺基酸取代。
蛋白殼蛋白可包含選自SEQ ID NO: 599-692的胺基酸序列且其中蛋白殼蛋白與SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708及710有共通的至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%一致性。
蛋白殼蛋白可包含選自SEQ ID NO: 599-692的胺基酸序列且其中蛋白殼蛋白與SEQ ID NO: 496-589有共通的至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%一致性。
蛋白殼蛋白可包含位置586-589或大致位置586-589的胺基酸序列ANYG。
蛋白殼蛋白可包含選自由以下組成之群的兩個或更多個胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代N452K、N452A或N452V。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代N452K。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代G453A或G453N。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代S454T或S454D。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代G455N。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代Q456L或Q456K。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代N457L或N457V。
蛋白殼蛋白可包含胺基酸取代Q458I或Q458H。
蛋白殼蛋白可包含位置452-458或大致位置452-458的胺基酸序列，其選自KGSGQNQ (SEQ ID NO: 590)、NASGQNQ (SEQ ID NO: 591)、NGTGQNQ (SEQ ID NO: 592)、NGSGLNQ (SEQ ID NO: 593)、ANDNKLI (SEQ ID NO: 594)、VNDNKVI (SEQ ID NO: 595)、NGSGQNH (SEQ ID NO: 596)或ANDNKVI (SEQ ID NO: 597)，且其中蛋白殼蛋白與SEQ ID NO: 488-495有共通的至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或100%一致性。
相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可包含位置586-589或大致位置586-589的胺基酸序列，其選自NTVS (SEQ ID NO: 712)、TLFN (SEQ ID NO: 713)、STYL (SEQ ID NO: 714)、SILT (SEQ ID NO: 715)、MTTA (SEQ ID NO: 716)及STSI (SEQ ID NO: 717)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含N452K取代。
相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可包含位置586-589或大致位置586-589的胺基酸序列，其選自GAYA (SEQ ID NO: 741)、TKLA (SEQ ID NO: 742)、SSFT (SEQ ID NO: 743)、DNIR (SEQ ID NO: 744)、NVIS (SEQ ID NO: 745)、GTSI (SEQ ID NO: 746)、ANYG (SEQ ID NO: 305)及DARA (SEQ ID NO: 747)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含N452K取代。
相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可在位置586-589或大致位置586-589包含胺基酸序列SAQA (SEQ ID NO: 748)，或在相應位置包含與參考序列SEQ ID NO: 1相同的序列。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含N452K取代。
相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可在位置585-590或在大致位置585-590包含選自以下的胺基酸序列：ENTVSI (SEQ ID NO: 719)、QTLFNS (SEQ ID NO: 720)、NSTYLG (SEQ ID NO: 721)、GSILTH (SEQ ID NO: 722)、MMTTAR (SEQ ID NO: 723)及CSTSIR (SEQ ID NO: 724)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含N452K取代。
相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可在位置585-590或在大致位置585-590包含選自以下的胺基酸序列：QGAYAQ (SEQ ID NO: 749)、NTKLAI (SEQ ID NO: 750)、VSSFTS (SEQ ID NO: 751)、EDNIRS (SEQ ID NO: 725)、NNVISG (SEQ ID NO: 752)、TGTSII (SEQ ID NO: 753)、QANYGQ (SEQ ID NO: 754)及QDARAQ (SEQ ID NO: 755)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含N452K取代。
相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可在位置585-590或大致位置585-590包含胺基酸序列QSAQAQ (SEQ ID NO: 756)，或在相應位置包含與參考序列SEQ ID NO: 1相同的序列。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含N452K取代。
蛋白殼蛋白可在位置581-584 (亦即，ATNH)及/或位置591-594 (亦即，AQTG)包含AAV9野生型胺基酸序列。蛋白殼蛋白可在位置581-583 (亦即，ATN)及/或位置591-594 (亦即，AQTG)包含AAV9野生型胺基酸序列。
VR - IV 、 VR - V 及 VR - VII 位 點 的修飾
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-IV位點之變異型多肽序列。在一些實施例中，整個VR-IV位點(「NGSGQNQQT」，SEQ ID NO: 2)由下式之肽取代：
-(X)n- 其中n為7至11，且X表示20個標準胺基酸(SEQ ID NO: 478)中之任一者。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9- (SEQ ID NO: 478)。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9- 其中X1為G、S或V；X2為Y、Q或I；X3為H、W、V或I；X4為K或N；X5為S、G或I；X6為G或R；X7為A、P或V；X8為A或R；且/或X9為Q或D (SEQ ID NO: 477)。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9- 其中X1為K、G、S或V；X2為Y、Q或I；X3為H、W、V或I；X4為K或N；X5為S、G或I；X6為G或R；X7為A、P或V；X8為A或R；且/或X9為Q或D (SEQ ID NO: 729)。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9- 其中X1為K (SEQ ID NO: 730)。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列包含序列KGSGQNQQT (SEQ ID NO: 727)或由該序列組成。
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-IV位點具有N452K取代之變異型多肽序列。在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-IV位點具有N452K取代的變異型多肽序列(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)或包含序列KGSGQNQQT (SEQ ID NO: 727)。在一些實施例中，此類取代為AAV9蛋白殼蛋白中的唯一取代。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，此類取代為本發明之蛋白殼蛋白中的唯一取代。在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代N452K作為野生型AAV9蛋白殼蛋白(諸如SEQ ID NO: 487或SEQ ID NO: 1之親本序列)中的唯一取代。在一些實施例中，此類取代為AAV9蛋白殼蛋白VR-IV及/或VR-III位點中的唯一取代。在一些實施例中，除本文所述或此項技術中已知之任何其他取代或插入(包括但不限於VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及/或VR-VIII位點中的任何其他取代或插入)之外，本發明之蛋白殼蛋白(諸如AAV9蛋白殼蛋白)亦在VR-IV位點包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，本發明之蛋白殼蛋白在VR-IV位點包含胺基酸取代N452K，或除本文所述或此項技術中已知之任何其他取代、插入或嵌合修飾之外，亦包含序列KGSGQNQQT (SEQ ID NO: 727)。在一些實施例中，除本文所述或此項技術中已知之任何嵌合修飾之外，本發明之蛋白殼蛋白亦包含序列KGSGQNQQT (SEQ ID NO: 727)。在一些實施例中，N452K取代係與本文所述之任何其他取代或插入(例如在VR-IV位點及/或VR-VIII位點中)組合及/或與本文所述之任何嵌合修飾組合。在一些實施例中，此類取代係與本文所述或此項技術中已知之VR-IV位點中的任何取代或插入組合。在一些實施例中，此類取代係與本文所述或此項技術中已知之VR-V位點中的任何取代或插入組合。在一些實施例中，此類取代係與本文所述或此項技術中已知之VR-VII位點中的任何取代或插入組合。在一些實施例中，此類取代係與本文所述或此項技術中已知之VR-VIII位點中的任何取代或插入組合。在一些實施例中，除VR-VIII位點中之任一個、兩個、三個或更多個取代或插入之外，本發明之蛋白殼蛋白亦在VR-IV位點包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，除本文所述之VR-VIII位點中之一個、兩個、三個或更多個取代或插入之外，本發明之蛋白殼蛋白相對於參考序列SEQ ID NO: 1亦包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，蛋白殼蛋白，諸如相對於參考序列SEQ ID NO: 1而在VR-IV位點具有N452K取代的蛋白殼蛋白，提高轉導效率(例如任何組織的轉導效率，諸如肌肉、心臟、骨骼肌、腦等)。在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白，諸如相對於參考序列SEQ ID NO: 1而在VR-IV位點具有N452K取代的蛋白殼蛋白，提高心臟的轉導效率。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，本發明之蛋白殼蛋白在VR-IV位點之位置452包含野生型AAV9胺基酸(其為N)。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，本發明之工程化蛋白殼蛋白在VR-IV位點之位置452包含N或K。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列包含或由選自以下之序列組成：GYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 6)、VIIKSGAAQ (SEQ ID NO: 7)、GYHKIGAAQ (SEQ ID NO: 8)、GYHKSGVAQ (SEQ ID NO: 9)、VYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 10)、GYHKISAAQ (SEQ ID NO: 11)、TTVPSSSRY (SEQ ID NO: 12)、VIIRVVRLS (SEQ ID NO: 13)、TVLGQNQQT (SEQ ID NO: 14)、IYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 15)、TVLDKNQQT (SEQ ID NO: 16)、YSGTDVRYK (SEQ ID NO: 17)、VTASGKEHR (SEQ ID NO: 18)、GYRKSGAAQ (SEQ ID NO: 19)、NRTVSNGSE (SEQ ID NO: 20)、TVLDRINKT (SEQ ID NO: 21)、TGVGHLTSA (SEQ ID NO: 22)、GYHKGGAAQ (SEQ ID NO: 23)、VIAKSGAAQ (SEQ ID NO: 24)、GYHKSGAAH (SEQ ID NO: 25)、FIIKSGAAQ (SEQ ID NO: 26)、GYHKVVRLS (SEQ ID NO: 27)、GATRSAVES (SEQ ID NO: 28)、TVSGQNQQT (SEQ ID NO: 29)、LSHKSGAAQ (SEQ ID NO: 30)、SSSGQNQQT (SEQ ID NO: 31)、SGSGQNQQT (SEQ ID NO: 32)、SQVNGRPRD (SEQ ID NO: 33)、GYHKEWCGS (SEQ ID NO: 34)、VVSSKSLNS (SEQ ID NO: 35)、GYHKSGAAP (SEQ ID NO: 36)、DASSREKVR (SEQ ID NO: 37)、SYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 38)、TANGSQKYL (SEQ ID NO: 39)、VIIRVGAAQ (SEQ ID NO: 40)、SSTNKISTA (SEQ ID NO: 41)、TVLDRIQQT (SEQ ID NO: 42)、GYHKSGAVQ (SEQ ID NO: 43)、TVLDQNQQT (SEQ ID NO: 44)、VNMSSPIKT (SEQ ID NO: 45)、AAYNSNSAF (SEQ ID NO: 46)、GYHKSGAAR (SEQ ID NO: 47)、VIIRVVRLQ (SEQ ID NO: 48)、RFWTQNQQT (SEQ ID NO: 49)、SSPRASSAL (SEQ ID NO: 50)、IIIRVVRLS (SEQ ID NO: 51)、KSSNLTAMP (SEQ ID NO: 52)、NLNSDRHSA (SEQ ID NO: 53)、LSLKSGAAQ (SEQ ID NO: 54)、TVLDRNQQT (SEQ ID NO: 55)、GSERVSNSG (SEQ ID NO: 56)、VIAKIGAAQ (SEQ ID NO: 57)、VYHKIGAAQ (SEQ ID NO: 58)、LSYKSGAAQ (SEQ ID NO: 59)、STVSQPVRT (SEQ ID NO: 60)、GHHKSGAAQ (SEQ ID NO: 61)、YAGIDPRYH (SEQ ID NO: 62)、DRSRKSMCD (SEQ ID NO: 63)、VIIRSGAAQ (SEQ ID NO: 64)、GYHKSGGSA (SEQ ID NO: 65)、VIIKIGAAQ (SEQ ID NO: 66)、GYHKVVQLS (SEQ ID NO: 67)、VIIKLVAAQ (SEQ ID NO: 68)、KVSSHSVCD (SEQ ID NO: 69)、GYHKRVRLS (SEQ ID NO: 70)、GYHKSSAAQ (SEQ ID NO: 71)、GYRKIGAAQ (SEQ ID NO: 72)、GYHKSGAAC (SEQ ID NO: 73)、GYRQSGAAQ (SEQ ID NO: 74)、VIIKLIAAQ (SEQ ID NO: 75)、VIIRVVRAQ (SEQ ID NO: 76)、GYHKSGAAW (SEQ ID NO: 77)、GYHKSGAVS (SEQ ID NO: 78)、GYHKEWCSS (SEQ ID NO: 79)、SSSSNRLAD (SEQ ID NO: 80)、SNNSSSAKF (SEQ ID NO: 81)、VKLSSTSSS (SEQ ID NO: 82)、GYHKEWCAQ (SEQ ID NO: 83)、AGSGQNQQT (SEQ ID NO: 84)、NPHGTATYL (SEQ ID NO: 85)、NGSGQNQHT (SEQ ID NO: 86)、GYHKVGAAQ (SEQ ID NO: 87)、VIIRVVRLK (SEQ ID NO: 88)、NSIPSTSKW (SEQ ID NO: 89)、VIIRVVQLQ (SEQ ID NO: 90)、SQVNGRPQD (SEQ ID NO: 91)、NGSGQDQQT (SEQ ID NO: 92)、GLNSSDRRL (SEQ ID NO: 93)、IYHKIGAAQ (SEQ ID NO: 94)、YHKSGAAQL (SEQ ID NO: 95)、YSGTDVQYK (SEQ ID NO: 96)、LGSGQNQQT (SEQ ID NO: 97)、PVSSGADRR (SEQ ID NO: 98)、EHSTKLNAC (SEQ ID NO: 99)、NGSDRINKR (SEQ ID NO: 100)、VIIKGGAAQ (SEQ ID NO: 101)、GYHRVVRLS (SEQ ID NO: 102)、VIIRVVRLL (SEQ ID NO: 103)及VILKSGAAQ (SEQ ID NO: 104)。在一些此等實施例中之任一例中，第一胺基酸在此位置經K取代而非經任何其他胺基酸取代(或相對於參考序列SEQ ID NO: 1，具有N452K取代)。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列包含與SEQ ID NO: 6-104中之一者至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列包含與KGSGQNQQT (SEQ ID NO: 727)至少約60%、70%、77%、80%、88%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於KGSGQNQQT (SEQ ID NO: 727)，VR-IV位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於KGSGQNQQT (SEQ ID NO: 727)，VR-IV位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列為KGSGQNQQT (SEQ ID NO: 727)。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列包含與GYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 6)至少約60%、70%、77%、80%、88%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於GYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 6)，VR-IV位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於GYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 6)，VR-IV位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列為GYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 6)。在一些此等實施例中之任一例中，第一胺基酸經K取代(KYHKSGAAQ；SEQ ID NO: 757)。
在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列包含與SQVNGRPRD (SEQ ID NO: 33)至少約60%、70%、77%、80%、88%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於SQVNGRPRD (SEQ ID NO: 33)，VR-IV位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於SQVNGRPRD (SEQ ID NO: 33)，VR-IV位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-IV位點之變異型多肽序列為SQVNGRPRD (SEQ ID NO: 33)。在一些此等實施例中之任一例中，第一胺基酸經K取代(KQVNGRPRD；SEQ ID NO: 758)。
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-V位點之變異型多肽序列。在一些實施例中，整個VR-V位點(「NNSEFA」，SEQ ID NO: 3)由下式之肽取代：
-(X)n- 其中n為4至8，且X表示20個標準胺基酸(SEQ ID NO: 479)中之任一者。
在一些實施例中，VR-V位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4-X5-X6- (SEQ ID NO: 479)
在一些實施例中，VR-V位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4-X5-X6- 其中X1為S、L、H、N或A；X2為T、M、K、G或N；X3為S、T、M或I；X4為S、P、F、M或N；X5為F、S、P或L；且X6為I、V或T (SEQ ID NO: 474)。
在一些實施例中，VR-V位點之變異型多肽序列包含或由選自以下之序列組成：LNSMLI (SEQ ID NO: 105)、NGMSFT (SEQ ID NO: 106)、HKTFSI (SEQ ID NO: 107)、SMSNFV (SEQ ID NO: 108)、ATIPPI (SEQ ID NO: 109)、SSTHFD (SEQ ID NO: 110)、NNQFSY (SEQ ID NO: 111)、NMGHYS (SEQ ID NO: 112)、SKQMFQ (SEQ ID NO: 113)、WPSAGV (SEQ ID NO: 114)、NGGYQC (SEQ ID NO: 115)、STSPIV (SEQ ID NO: 116)、SQSGLW (SEQ ID NO: 117)、VNSQFS (SEQ ID NO: 118)、SGIEFR (SEQ ID NO: 119)、SASKFT (SEQ ID NO: 120)、QLNWTS (SEQ ID NO: 121)、SMGFPV (SEQ ID NO: 122)、SSFMGL (SEQ ID NO: 123)、GSNFHV (SEQ ID NO: 124)、DMTLYA (SEQ ID NO: 125)、MGCLFT (SEQ ID NO: 126)、ALAFNS (SEQ ID NO: 127)、SKFLFA (SEQ ID NO: 128)、QDAGLL (SEQ ID NO: 129)、QDASLL (SEQ ID NO: 130)、RDDMFS (SEQ ID NO: 131)、LSRCFQ (SEQ ID NO: 132)、LSRDFQ (SEQ ID NO: 133)、QGLTPV (SEQ ID NO: 134)、QWDVFT (SEQ ID NO: 135)、PRVSFA (SEQ ID NO: 136)、QSYYNP (SEQ ID NO: 137)、RASHLG (SEQ ID NO: 138)、IILFVP (SEQ ID NO: 139)、IISFSY (SEQ ID NO: 140)、LDSMLI (SEQ ID NO: 141)、NIGHYS (SEQ ID NO: 142)、NRMSFT (SEQ ID NO: 143)、NGMSFA (SEQ ID NO: 144)、IILLLP (SEQ ID NO: 145)、RMRSLL (SEQ ID NO: 146)、RRRCRF (SEQ ID NO: 147)、PKQMFQ (SEQ ID NO: 148)、LMSNFV (SEQ ID NO: 149)、GASHLG (SEQ ID NO: 150)、CASISW (SEQ ID NO: 151)、SMTTFR (SEQ ID NO: 152)、AAIPPI (SEQ ID NO: 153)、PGCESL (SEQ ID NO: 154)、SMGFAC (SEQ ID NO: 155)、FLPSLM (SEQ ID NO: 156)、NGISFT (SEQ ID NO: 157)、ESSRWA (SEQ ID NO: 158)、QLYFVP (SEQ ID NO: 159)、SSNFHV (SEQ ID NO: 160)、LEFMLI (SEQ ID NO: 161)、QFDSFD (SEQ ID NO: 162)、SPVFAC (SEQ ID NO: 163)、VRLIFD (SEQ ID NO: 164)、NGMSFI (SEQ ID NO: 165)、LLFPPI (SEQ ID NO: 166)、GAGVTG (SEQ ID NO: 167)、QWMSFT (SEQ ID NO: 168)、SIGFPV (SEQ ID NO: 169)、RMQSLL (SEQ ID NO: 170)、TSALQV (SEQ ID NO: 171)、SLTHFD (SEQ ID NO: 172)、QELPFL (SEQ ID NO: 173)、LYFLLP (SEQ ID NO: 174)、LSFFFA (SEQ ID NO: 175)、LSRIFQ (SEQ ID NO: 176)、DEVILF (SEQ ID NO: 177)、RAGVAG (SEQ ID NO: 178)、NGMSLP (SEQ ID NO: 179)、PFEDFQ (SEQ ID NO: 180)、QYGSLF (SEQ ID NO: 181)、NYTFVL (SEQ ID NO: 182)、MSGYQC (SEQ ID NO: 183)、NYAFVP (SEQ ID NO: 184)、RAGVTG (SEQ ID NO: 185)、WNSMLI (SEQ ID NO: 186)、IRRFSI (SEQ ID NO: 187)、NGMSFY (SEQ ID NO: 188)、IIQFSY (SEQ ID NO: 189)、NGCLFT (SEQ ID NO: 190)、RDASLL (SEQ ID NO: 191)、ADSMLI (SEQ ID NO: 192)、VDSQFS (SEQ ID NO: 193)、SIGNFV (SEQ ID NO: 194)、NGMSLL (SEQ ID NO: 195)、NYTFVP (SEQ ID NO: 196)、IRRLVF (SEQ ID NO: 197)、PMSNFV (SEQ ID NO: 198)、LWVFPV (SEQ ID NO: 199)、VRLHFD (SEQ ID NO: 200)、SMSNLF (SEQ ID NO: 201)、STSLIV (SEQ ID NO: 202)及HKTFGI (SEQ ID NO: 203)。
在一些實施例中，VR-V位點之變異型多肽序列包含與SEQ ID NO: 105-203中之一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成。
在一些實施例中，VR-V位點之變異型多肽序列包含與LNSMLI (SEQ ID NO: 105)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於LNSMLI (SEQ ID NO: 105)，VR-V位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於LNSMLI (SEQ ID NO: 105)，VR-V位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-V位點之變異型多肽序列為LNSMLI (SEQ ID NO: 105)。
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-VII位點之變異型多肽序列。在一些實施例中，整個VR-VII位點(「GRDNV」，SEQ ID NO: 4)由下式之肽取代：
-(X)n- 其中n為3至7，且X表示20個標準胺基酸(SEQ ID NO: 480)中之任一者。
在一些實施例中，VR-VII位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4-X5- (SEQ ID NO: 480)
在一些實施例中，VR-VII位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4-X5- 其中X1為V、L、Q、C或R；X2為S、H、G、C或D；X3為Y、S、L、G或N；X4為S、L、H、Q或N；且X5為V、I或R (SEQ ID NO: 475)。
在一些實施例中，VR-VII位點之變異型多肽序列包含或由選自以下之序列組成：RGNQV (SEQ ID NO: 204)、VSLNR (SEQ ID NO: 205)、CDYSV (SEQ ID NO: 206)、QHGHI (SEQ ID NO: 207)、LCSLV (SEQ ID NO: 208)、PTIYV (SEQ ID NO: 209)、DVIHI (SEQ ID NO: 210)、AEFYA (SEQ ID NO: 211)、NSVVC (SEQ ID NO: 212)、VRSNC (SEQ ID NO: 213)、LANNI (SEQ ID NO: 214)、NLQFM (SEQ ID NO: 215)、EFRDL (SEQ ID NO: 216)、DFGSL (SEQ ID NO: 217)、VTNYC (SEQ ID NO: 218)、WNTNA (SEQ ID NO: 219)、TESTC (SEQ ID NO: 220)、SGAAV (SEQ ID NO: 221)、GGCDI (SEQ ID NO: 222)、SGSVV (SEQ ID NO: 223)、SSNAC (SEQ ID NO: 224)、YNTTV (SEQ ID NO: 225)、SKCLA (SEQ ID NO: 226)、SAYTV (SEQ ID NO: 227)、VRDTV (SEQ ID NO: 228)、WRSMV (SEQ ID NO: 229)、AYHGV (SEQ ID NO: 230)、GMNTI (SEQ ID NO: 231)、AETSL (SEQ ID NO: 232)、TLVYV (SEQ ID NO: 233)、NHDWI (SEQ ID NO: 234)、TVGIV (SEQ ID NO: 235)、SLPTV (SEQ ID NO: 236)、TGILC (SEQ ID NO: 237)、TDTYI (SEQ ID NO: 238)、LPVTY (SEQ ID NO: 239)、GDVYI (SEQ ID NO: 240)、LYGTV (SEQ ID NO: 241)、GCEFI (SEQ ID NO: 242)、SAGLL (SEQ ID NO: 243)、IKSNI (SEQ ID NO: 244)、VTTSL (SEQ ID NO: 245)、AVTSV (SEQ ID NO: 246)、RDIHI (SEQ ID NO: 247)、SAISL (SEQ ID NO: 248)、VASTC (SEQ ID NO: 249)、IKGLL (SEQ ID NO: 250)、GSYHT (SEQ ID NO: 251)、RIGFV (SEQ ID NO: 252)、NDIYI (SEQ ID NO: 253)、AVSCV (SEQ ID NO: 254)、QHNLL (SEQ ID NO: 255)、VSSCV (SEQ ID NO: 256)、LNLDV (SEQ ID NO: 257)、LGATI (SEQ ID NO: 258)、PVLCV (SEQ ID NO: 259)、SARHI (SEQ ID NO: 260)、RATLI (SEQ ID NO: 261)、PYNHA (SEQ ID NO: 262)、IGDSI (SEQ ID NO: 263)、SPMLC (SEQ ID NO: 264)、YDSTL (SEQ ID NO: 265)、ALKHV (SEQ ID NO: 266)、ADLLT (SEQ ID NO: 267)、NNGHL (SEQ ID NO: 268)、INSEV (SEQ ID NO: 269)、SNKTT (SEQ ID NO: 270)、GSTGL (SEQ ID NO: 271)、DSDMI (SEQ ID NO: 272)、TSNFI (SEQ ID NO: 273)、RNFTT (SEQ ID NO: 274)、SHKYS (SEQ ID NO: 275)、VSDIV (SEQ ID NO: 276)、RVVQA (SEQ ID NO: 277)、AACAV (SEQ ID NO: 278)、RGRQI (SEQ ID NO: 279)、AVANI (SEQ ID NO: 280)、AGYDL (SEQ ID NO: 281)、LSEAA (SEQ ID NO: 282)、MSNYL (SEQ ID NO: 283)、NFSDN (SEQ ID NO: 284)、SCCDV (SEQ ID NO: 285)、LASSV (SEQ ID NO: 286)、PDHAV (SEQ ID NO: 287)、KFDII (SEQ ID NO: 288)、NSSSA (SEQ ID NO: 289)、HTMHV (SEQ ID NO: 290)、TLSYC (SEQ ID NO: 291)、ADTHR (SEQ ID NO: 292)、SMYSV (SEQ ID NO: 293)、SVNLV (SEQ ID NO: 294)、MSGHL (SEQ ID NO: 295)、KISDT (SEQ ID NO: 296)、TGLLA (SEQ ID NO: 297)、AWTTS (SEQ ID NO: 298)、GGALI (SEQ ID NO: 299)、SCIEV (SEQ ID NO: 300)、PPVIC (SEQ ID NO: 301)及GTYNL (SEQ ID NO: 302)。
在一些實施例中，VR-VII位點之變異型多肽序列包含與SEQ ID NO: 204-302中之一者至少約60%、70%、80%、90%、或100%一致的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成。
在一些實施例中，VR-VII位點之變異型多肽序列包含與RGNQV (SEQ ID NO: 204)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於RGNQV (SEQ ID NO: 204)，VR-VII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於RGNQV (SEQ ID NO: 204)，VR-VII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VII位點之變異型多肽序列為RGNQV (SEQ ID NO: 204)。
VR - VIII 位點之 修飾
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-VIII位點之變異型多肽序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之位置586至589 (相對於參考序列SEQ ID NO: 1)的胺基酸(「SAQA」)係由下式之肽取代：
-(X)n- 其中n為2至6，且X表示20個標準胺基酸(SEQ ID NO: 481)中之任一者。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4- (SEQ ID NO: 481)
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為：
-X1-X2-X3-X4- 其中X1為S、N或A；X2為V、M、N或A；X3為Y、V、S或G；且X4為Y、T、M、G或N (SEQ ID NO: 476)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含：
-X1-X2-X3-X4- 其中X1為S、N、T、M、G或D；X2為A、T、L、I、K、S、N或V；X3為Q、V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；且X4為A、S、N、L、T、I或R (SEQ ID NO: 731)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含：
-X1-X2-X3-X4- 其中X1為S、N、T、M、G或D；X2為T、L、I、K、S、N或V；X3為V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；且X4為A、S、N、L、T、I或R (SEQ ID NO: 732)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含：
-X1-X2-X3-X4- 其中X1為S、N、M或T；X2為A、T、L或I；X3為Q、V、F、Y、T、S或L；且X4為A、S、N、L、I或T (SEQ ID NO: 733)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含：
-X1-X2-X3-X4- 其中X1為S、N、M或T；X2為T、L或I；X3為V、F、Y、T、S或L；且X4為A、S、N、L、I或T (SEQ ID NO: 734)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含：
-X1-X2-X3-X4- 其中X1為S、M、D、N、G、A、T、R或I；X2為T、N、V、A、L、I、S、R或P；X3為Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G或Q；且X4為L、A、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E或Y (SEQ ID NO: 760)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含：
-X1-X2-X3-X4- 其中X1為S、M、D、N、G或A；X2為T、N、V或A；X3為Y、T、S、I或V；且X4為L、A、I、R、S或G (SEQ ID NO: 761)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含或由選自以下之序列組成：NVSY (SEQ ID NO: 303)、SMVN (SEQ ID NO: 304)、ANYG (SEQ ID NO: 305)、NVGT (SEQ ID NO: 306)、SAYM (SEQ ID NO: 307)、EKVT (SEQ ID NO: 308)、TTPG (SEQ ID NO: 309)、GVYS (SEQ ID NO: 310)、SYVG (SEQ ID NO: 311)、LQYN (SEQ ID NO: 312)、DPAK (SEQ ID NO: 313)、THFS (SEQ ID NO: 314)、IGGV (SEQ ID NO: 315)、SSWN (SEQ ID NO: 316)、SVYV (SEQ ID NO: 317)、TLNG (SEQ ID NO: 318)、NTSN (SEQ ID NO: 319)、VQYA (SEQ ID NO: 320)、DQYR (SEQ ID NO: 321)、MPVS (SEQ ID NO: 322)、SAQA (SEQ ID NO: 323)、MTVA (SEQ ID NO: 324)、TVMG (SEQ ID NO: 325)、FSSI (SEQ ID NO: 326)、SLRL (SEQ ID NO: 327)、SAMG (SEQ ID NO: 328)、YIKL (SEQ ID NO: 329)、LMTM (SEQ ID NO: 330)、QVHL (SEQ ID NO: 331)、YNSV (SEQ ID NO: 332)、CVIS (SEQ ID NO: 333)、RLDG (SEQ ID NO: 334)、AIMV (SEQ ID NO: 335)、GTTG (SEQ ID NO: 336)、ASYT (SEQ ID NO: 337)、LHVG (SEQ ID NO: 338)、LQFA (SEQ ID NO: 339)、VRGD (SEQ ID NO: 340)、NVMI (SEQ ID NO: 341)、SLYG (SEQ ID NO: 342)、GTVG (SEQ ID NO: 343)、FNSV (SEQ ID NO: 344)、TRLG (SEQ ID NO: 345)、LKVL (SEQ ID NO: 346)、SIRV (SEQ ID NO: 347)、KIQG (SEQ ID NO: 348)、QILG (SEQ ID NO: 349)、QRDA (SEQ ID NO: 350)、EAVR (SEQ ID NO: 351)、AITV (SEQ ID NO: 352)、KESI (SEQ ID NO: 353)、LMVN (SEQ ID NO: 354)、INLS (SEQ ID NO: 355)、GQVS (SEQ ID NO: 356)、TSLL (SEQ ID NO: 357)、SSTL (SEQ ID NO: 358)、YEKF (SEQ ID NO: 359)、DGKL (SEQ ID NO: 360)、QVYS (SEQ ID NO: 361)、QKEG (SEQ ID NO: 362)、ARDM (SEQ ID NO: 363)、DNFR (SEQ ID NO: 364)、SHGL (SEQ ID NO: 365)、VSVN (SEQ ID NO: 366)、GLKD (SEQ ID NO: 367)、QPVF (SEQ ID NO: 368)、VYSM (SEQ ID NO: 369)、VMAQ (SEQ ID NO: 370)、FVGM (SEQ ID NO: 371)、WSTP (SEQ ID NO: 372)、SYPV (SEQ ID NO: 373)、TTYS (SEQ ID NO: 374)、TVTT (SEQ ID NO: 375)、KDKT (SEQ ID NO: 376)、YREL (SEQ ID NO: 377)、LSHF (SEQ ID NO: 378)、SPGT (SEQ ID NO: 379)、LMGT (SEQ ID NO: 380)、AASL (SEQ ID NO: 381)、FSNN (SEQ ID NO: 382)、QARL (SEQ ID NO: 383)、YHIA (SEQ ID NO: 384)、ARQD (SEQ ID NO: 385)、VAYT (SEQ ID NO: 386)、TPSY (SEQ ID NO: 387)、MILH (SEQ ID NO: 388)、LGNV (SEQ ID NO: 389)、TSIS (SEQ ID NO: 390)、TMVY (SEQ ID NO: 391)、LVVG (SEQ ID NO: 392)、SPLY (SEQ ID NO: 393)、YKSE (SEQ ID NO: 394)、FTRL (SEQ ID NO: 395)、VSYN (SEQ ID NO: 396)、ERTP (SEQ ID NO: 397)、FRSE (SEQ ID NO: 398)、NYTE (SEQ ID NO: 399)、QTIN (SEQ ID NO: 400)及DVHR (SEQ ID NO: 401)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可進一步包含N452K取代(除本文所述之變異型多肽序列之外)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含或由選自以下之序列組成：NTVS (SEQ ID NO: 712)、TLFN (SEQ ID NO: 713)、STYL (SEQ ID NO: 714)、SILT (SEQ ID NO: 715)、MTTA (SEQ ID NO: 716)及STSI (SEQ ID NO: 717)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可進一步包含N452K取代(除本文所述之變異型多肽序列之外)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列STYL (SEQ ID NO: 714)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列STYL (SEQ ID NO: 714)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列STYL (SEQ ID NO: 714)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列STYL (SEQ ID NO: 714)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列NSTYLG (SEQ ID NO: 721)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列NSTYLG (SEQ ID NO: 721)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列MTTA (SEQ ID NO: 716)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列MTTA (SEQ ID NO: 716)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列MTTA (SEQ ID NO: 716)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列MMTTAR (SEQ ID NO: 723)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列MMTTAR (SEQ ID NO: 723)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列MMTTAR (SEQ ID NO: 723)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列STSI (SEQ ID NO: 717)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列STSI (SEQ ID NO: 717)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列STSI (SEQ ID NO: 717)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列NVIS (SEQ ID NO: 745)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列NVIS (SEQ ID NO: 745)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列NVIS (SEQ ID NO: 745)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列DNIR (SEQ ID NO: 744)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列DNIR (SEQ ID NO: 744)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列DNIR (SEQ ID NO: 744)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與SEQ ID NO: 303-401中之一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與ANYG (SEQ ID NO: 305)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於ANYG (SEQ ID NO: 305)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於ANYG (SEQ ID NO: 305)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為ANYG (SEQ ID NO: 305)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與NVSY (SEQ ID NO: 303)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於NVSY (SEQ ID NO: 303)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於NVSY (SEQ ID NO: 303)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為NVSY (SEQ ID NO: 303)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與SEQ ID NO: 712-717中之一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與NTVS (SEQ ID NO: 712)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於NTVS (SEQ ID NO: 712)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於NTVS (SEQ ID NO: 712)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為NTVS (SEQ ID NO: 712)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與TLFN (SEQ ID NO: 713)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於TLFN (SEQ ID NO: 713)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於TLFN (SEQ ID NO: 713)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為TLFN (SEQ ID NO: 713)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與STYL (SEQ ID NO: 714)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於STYL (SEQ ID NO: 714)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於STYL (SEQ ID NO: 714)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為STYL (SEQ ID NO: 714)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與SILT (SEQ ID NO: 715)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於SILT (SEQ ID NO: 715)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於SILT (SEQ ID NO: 715)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為SILT (SEQ ID NO: 715)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與MTTA (SEQ ID NO: 716)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於MTTA (SEQ ID NO: 716)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於MTTA (SEQ ID NO: 716)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為MTTA (SEQ ID NO: 716)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與STSI (SEQ ID NO: 717)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於STSI (SEQ ID NO: 717)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於STSI (SEQ ID NO: 717)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為STSI (SEQ ID NO: 717)。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 712-717中之一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 402-410及464-468中之一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段、基本上由其組成或由其組成。
| 表 1 . 蛋白殼蛋白序列 | |
| 名稱 / 替代名稱 | SEQ ID NO: |
| CR9-01 / TN1 | 402 |
| CR9-07 | 403 |
| CR9-07-A / TN5 | 482 |
| CR9-07-E / TN6 | 483 |
| CR9-08 | 464 |
| CR9-09 | 465 |
| CR9-10 / TN3 | 404 |
| CR9-11 | 466 |
| CR9-13 | 405 |
| CR9-14 / TN4 | 406 |
| CR9-15 | 467 |
| CR9-16 | 468 |
| CR9-17 | 407 |
| CR9-20 | 408 |
| CR9-21 | 409 |
| CR9-22 | 410 |
| HV1 / TN7 | 484 |
| HV2 / TN11 | 485 |
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-VIII位點之變異型多肽序列。在一些實施例中，整個VR-VIII位點包含或由胺基酸ATNHQSAQAQAQTG (SEQ ID NO: 5)組成，其中胺基酸QSAQAQ (SEQ ID NO: 756)由下式之肽取代：
-(X)
n -
其中
n為4至8，且X表示20個標準胺基酸(SEQ ID NO: 481)中之任一者。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6- (SEQ ID NO: 481)
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6其中X
1為N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L或Q；X
2為M、D、N、G、A、T、R、I或S；X
3為T、N、V、L、I、S、R、P或A；X
4為Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G或Q；X
5為L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y或A，且X
6為G、R、S、I、H、N、Y、L、M或Q (SEQ ID NO: 762)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6-X
7-
其中X
1係R或H；X
2係N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L或Q；X
3係M、D、N、G、A、T、R、I或S；X
4係T、N、V、L、I、S、R、P或A；X
5係Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G或Q；X
6係L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y或A，且X
7係G、R、S、I、H、N、Y、L、M或Q (SEQ ID NO: 781)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6其中X
1係N、M、C、E、G、S、V、A、T、H或L；X
2係M、D、N、G、A、T、R或I；X
3係T、N、V、L、I、S、R或P；X
4係Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D或G；X
5係L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E或Y，且X
6係G、R、S、I、H、N、Y、L或M (SEQ ID NO: 763)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6其中X
1係Q、E、N、G、M、C、V或T；X
2係S、N、T、M、G或D；X
3係A、T、L、I、K、S、N或V；X
4係Q、V、F、Y、L、T、S、I或R；X
5係A、S、N、L、T、I或R，且X
6係Q、I、S、G、H或R (SEQ ID NO: 735)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6其中X
1係Q、E、N、G、M、C、V或T；X
2係S、N、T、M、G或D；X
3係T、L、I、K、S、N或V；X
4係V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；X
5係A、S、N、L、T、I或R，且X
6係I、S、G、H或R (SEQ ID NO: 736)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6其中X
1係Q、E、N、M、C或G；X
2係S、N、M或T；X
3係A、T、L或I；X
4係Q、V、F、Y、T、S或L；X
5係A、S、N、L、I或T；且X
6係I、S、G、R或H (SEQ ID NO: 737)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6其中X
1係E、N、M、C或G；X
2係S、N、M或T；X
3係T、L或I；X
4係V、F、Y、T、S或L；X
5係A、S、N、L、I或T；且X
6係I、S、G、R或H (SEQ ID NO: 738)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4-X
5-X
6其中X
1係Q、E、N、G、M或C；X
2係S、N、T或M；X
3係A、T、L、I或S；X
4係Q、V、F、Y、L或I；X
5係A、S、N、L、T或I；且X
6係I、S、Q、G、H或R (SEQ ID NO: 718)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4- X
5-X
6其中X
1係E、N、G、M、C、V或T；X
2係N、T、M、G或D；X
3係T、L、I、K、S、N或V；X
4係V、F、Y、L、T、S、I、R；X
5係S、N、L、T、I或R，且X
6係I、S、G、H或R (SEQ ID NO: 764)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4-X
5-X
6其中X
1係E、N、M、C或Q；X
2係A、M、G、D、N或S；X
3係T、N、V或A；X
4係V、Y、T、S、I或Q；X
5係S、G、L、I、R或A；且X
6係I、S、G、R或Q (SEQ ID NO: 765)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列係或包含：
-X
1-X
2-X
3-X
4-X
5-X
6其中X
1係E、N、M或C；X
2係A、M、G、D或N；X
3係T、N或V；X
4係V、Y、T、S或I；X
5係S、G、L、I或R；且X
6係I、S、G或R (SEQ ID NO: 766)。
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-VIII位點之變異型多肽序列。在一些實施例中，整個VR-VIII位點包含下式之肽：
ATNH-(X)
n -AQTG
其中
n為4至8，且X表示20個標準胺基酸(SEQ ID NO: 740)中之任一者。
在一些實施例中，整個VR-VIII位點包含下式之肽：
ATNH-X
1-X
2-X
3-X
4-X
5-X
6-AQTG (SEQ ID NO: 740)。
在一些實施例中，X
1-X
2-X
3-X
4-X
5-X
6如上文所述。舉例而言，在一些實施例中，X
1係Q、E、N、G、M、C、V或T；X
2係S、N、T、M、G或D；X
3係A、T、L、I、K、S、N或V；X
4係Q、V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；X
5係A、S、N、L、T、I或R；且X
6係Q、I、S、G、H或R (SEQ ID NO: 728)。在一些實施例中，X
1係Q、E、N、G、M或C；X
2係S、N、T或M；X
3係A、T、L、I或S；X
4係Q、V、F、Y、L或I；X
5係A、S、N、L、T或I；且X
6係I、S、Q、G、H或R (SEQ ID NO: 739)。
在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在位置452包含N或K (除本文所述之變異型多肽序列之外)。
在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可進一步包含N452K取代(除本文所述之變異型多肽序列之外)。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含或由選自以下之序列組成：ENTVSI (SEQ ID NO: 719)、QTLFNS (SEQ ID NO: 720)、NSTYLG (SEQ ID NO: 721)、GSILTH (SEQ ID NO: 722)、MMTTAR (SEQ ID NO: 723)及CSTSIR (SEQ ID NO: 724)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可進一步包含N452K取代(除變異型多肽序列之外)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含或由選自以下之序列組成：NSTYLG (SEQ ID NO: 721)、MMTTAR (SEQ ID NO: 723)、CSTSIR (SEQ ID NO: 724)、EDNIRS (SEQ ID NO: 725)、NNVISG (SEQ ID NO: 752)、QGAYAQ (SEQ ID NO: 749)、VSSFTS (SEQ ID NO: 751)、TGTSII (SEQ ID NO: 753)及QHYSAQAQ (SEQ ID NO: 759)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可進一步包含N452K取代(除本文所述之變異型多肽序列之外)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含或由選自以下之序列組成：NSTYLG (SEQ ID NO: 721)、MMTTAR (SEQ ID NO: 723)、CSTSIR (SEQ ID NO: 724)、EDNIRS (SEQ ID NO: 725)及NNVISG (SEQ ID NO: 752)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可進一步包含N452K取代(除本文所述之變異型多肽序列之外)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列NSTYLG (SEQ ID NO: 721)。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與NSTYLG (SEQ ID NO: 721)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列NSTYLG (SEQ ID NO: 721)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列NSTYLG (SEQ ID NO: 721)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列MMTTAR (SEQ ID NO: 723)。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與MMTTAR (SEQ ID NO: 723)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列MMTTAR (SEQ ID NO: 723)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列MMTTAR (SEQ ID NO: 723)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列CSTSIR (SEQ ID NO: 724)。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與CSTSIR (SEQ ID NO: 724)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列CSTSIR (SEQ ID NO: 724)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列CSTSIR (SEQ ID NO: 724)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列NNVISG (SEQ ID NO: 752)。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與NNVISG (SEQ ID NO: 752)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列NNVISG (SEQ ID NO: 752)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列NNVISG (SEQ ID NO: 752)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含序列EDNIRS (SEQ ID NO: 725)。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與EDNIRS (SEQ ID NO: 725)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列EDNIRS (SEQ ID NO: 725)的變異型多肽序列且進一步在VR-IV位點包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些實施例中，本文所述之蛋白殼在VR-VIII位點包含含有序列EDNIRS (SEQ ID NO: 725)的變異型多肽序列且在VR-IV位點不包含N452K取代(相對於參考序列SEQ ID NO: 1)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與SEQ ID NO: 719-724中之一者至少約60%、70%、80%、90%、95%或100%一致的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與ENTVSI (SEQ ID NO: 719)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於ENTVSI (SEQ ID NO: 719)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代ENTVSI (SEQ ID NO: 719)組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為NTVS ENTVSI (SEQ ID NO: 719)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與QTLFNS (SEQ ID NO: 720)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於QTLFNS (SEQ ID NO: 720)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於QTLFNS (SEQ ID NO: 720)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為QTLFNS (SEQ ID NO: 720)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與NSTYLG (SEQ ID NO: 721)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於NSTYLG (SEQ ID NO: 721)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於NSTYLG (SEQ ID NO: 721)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為NSTYLG (SEQ ID NO: 721)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與GSILTH (SEQ ID NO: 722)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於GSILTH (SEQ ID NO: 722)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於GSILTH (SEQ ID NO: 722)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列為GSILTH (SEQ ID NO: 722)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與MMTTAR (SEQ ID NO: 723)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於MMTTAR (SEQ ID NO: 723)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於MMTTAR (SEQ ID NO: 723)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含MMTTAR (SEQ ID NO: 723)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含與CSTSIR (SEQ ID NO: 724)至少約60%、70%、80%、83%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於CSTSIR (SEQ ID NO: 724)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於CSTSIR (SEQ ID NO: 724)，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含由至多1、2或3個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含CSTSIR (SEQ ID NO: 724)。在一些此等實施例中，除本文所述之VR-VIII位點及視情況位置452之特定取代之外，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 487之VP3至少85%、90%、95%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 719-724中之一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列在位置584包含胺基酸R或H。在一些實施例中，VR-VIII位點之變異型多肽序列在位置584包含R。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含A587T取代(亦即，位置587之T)。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列在選自由584、585、586、588、589及590組成之群的一個、兩個、三個或更多個位置包含胺基酸N或R (在相對於位置587之-3至+3個位置內存在胺基酸N或R)。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列在選自由584、585、586、588、589及590組成之群的兩個、三個或更多個位置包含胺基酸N或R (或在相對於位置587的-3至+3位置內存在胺基酸N或R)。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列包含A587T取代(亦即，位置587之T)，且在選自由584、585、586、588、589及590組成之群的一個、兩個、三個或更多個位置包含胺基酸N或R (或在相對於位置587之-3至+3位置內存在胺基酸N或R)。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列在選自由585、586、587、588、589及590組成之群的兩個、三個或更多個位置包含胺基酸S (或區域585-590中之位置的兩個或更多個胺基酸S)。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列在區域585-590中之三個、四個或更多個位置包含選自由以下組成之群的一個、兩個或更多個胺基酸(任何組合)：N、S、T、R及I。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列在區域585-590中之三個、四個或更多個位置包含選自由以下組成之群的一個、兩個或更多個胺基酸(任何組合)：N、S、T及R。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列在區域585-590中之三個、四個或更多個位置(亦即，位置585、586、587、588、589及/或590)包含選自由以下組成之群的任一或多個胺基酸(例如任何2、3、4或更多個，任何組合)：N、S、T、R及I。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之變異型多肽序列在區域585-590中之三個、四個或更多個位置(亦即，位置585、586、587、588、589及590)包含選自由以下組成之群的任一或多個胺基酸(例如任何2、3、4個或更多個，任何組合)：N、S、T及R。舉例而言且不受限制，在區域585-590中，可存在三個或更多個N、三個或更多個S、三個或更多個T等，或N、S及T中之所有三者，或一個所提及胺基酸(例如N)存在兩個或三個，及任何其他所提及之胺基酸(例如T)存在一或多個，或此等胺基酸(亦即，N、S、T、R及I中之所有五者)中之每一者存在一個，諸如此類，以及任何組合。
在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在位置452包含N或K (除本文所述之變異型多肽序列之外)。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可包含N452K取代(單獨，或除具有本文所述之一或多個取代的變異型多肽之外，諸如本文所述之VR-VIII位點的任何取代或取代模式)。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含N452K取代(且視情況在除452之外的位置包含與SEQ ID NO: 487之VP3及/或SEQ ID NO: 1之VP1 80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%一致性)。
在一些實施例中，SEQ ID NO: 1之變異型VP1蛋白殼蛋白在下表所示之AAV9 VP1之VR-VIII位點的位置581-594或585-590及/或位置452包含取代模式之一。在一些實施例中，SEQ ID NO: 1之變異型VP1蛋白殼蛋白在AAV9 VP1之VR-VIII位點的位置581-594包含取代模式，與下表所示的位置具有至少約75%、78.5%、80%、85%、90%、93%或100%序列一致性。
| 位置452 | VR-VIII 比對(581-594) |
| N或K | ATNH ENTVSIAQTG |
| N或K | ATNH QTLFNSAQTG |
| N或K | ATNH NSTYLGAQTG |
| N或K | ATNH GSILTHAQTG |
| N或K | ATNH MMTTARAQTG |
| N或K | ATNH CSTSIRAQTG |
| N或K | ATNH QGAYAQAQTG |
| N或K | ATNH NTKLAIAQTG |
| N或K | ATNH VSSFTSAQTG |
| N或K | ATNH EDNIRSAQTG |
| K | ATNH QSAQAQAQTG |
| N或K | ATNH NNVISGAQTG |
| N或K | ATNH TGTSIIAQTG |
| N或K | ATNH QWMSAQAQAQTG |
| N或K | ATNH QDARAQAQTG |
| N或K | ATNH QHYSAQAQAQTG |
| N或K | ATNH QSAQAQAQTG |
| N或K | ATNH NIRTEMAQTG |
| N或K | ATNH STTNFRAQTG |
| 位置585 | 位置586 | 位置587 | 位置588 | 位置589 | 位置590 | 位置452 |
| Q585E | S586N | A587T | Q588V | A589S | Q590I | N或N452K |
| Q | S586T | A587L | Q588F | A589N | Q590S | N或N452K |
| Q585N | S | A587T | Q588Y | A589L | Q590G | N或N452K |
| Q585G | S | A587I | Q588L | A589T | Q590H | N或N452K |
| Q585E | S586N | A587T | Q588V | A589S | Q590I | N或N452K |
| Q | S586T | A587L | Q588F | A589N | Q590S | N或N452K |
| Q585N | S | A587T | Q588Y | A589L | Q590G | N或N452K |
| Q585G | S | A587I | Q588L | A589T | Q590H | N或N452K |
| Q585M | S586M | A587T | Q588T | A | Q590R | N或N452K |
| Q585C | S | A587T | Q588S | A589I | Q590R | N或N452K |
| Q | S586G | A | Q588Y | A | Q | N或N452K |
| Q585N | S586T | A587K | Q588L | A | Q590I | N或N452K |
| Q585V | S | A587S | Q588F | A589T | Q590S | N或N452K |
| Q585E | S586D | A587N | Q588I | A589R | Q590S | N或N452K |
| Q | S | A | Q | A | Q | N或N452K |
| Q585N | S586N | A587V | Q588I | A589S | Q590G | N或N452K |
| Q585T | S586G | A587T | Q588S | A589I | Q590I | N或N452K |
| Q | S586D | A | Q588R | A | Q | N或N452K |
| Q585N | S586I | A587R | Q588T | A589E | Q590M | N或N452K |
| Q585S | S586T | A587T | Q588N | A589F | Q590R | N或N452K |
| Q | S | A | Q | A | Q | N或N452K |
在一些實施例中，上表中的蛋白殼具有：(i)分別位於位置581、582、583及584的ATNH，及/或(ii)分別位於位置591、592、593及594的AQTG。
在一些實施例中，SEQ ID NO: 1之變異型VP1蛋白殼蛋白在VR-VIII位點的位置581-594或585-590包含以下胺基酸之一：
| 581 | 582 | 583 | 584 | 585 | 586 | 587 | 588 | 589 | 590 | 591 | 592 | 593 | 594 |
| A | T | N | H | E, N, G, M, C, V, T, Q, S | N, T, M, G, D, S, I | T, L, I, K, S, N, V, A, R | V, F, Y, L, T, S, I, R, Q, N | S, N, L, T, I, R, A, E, F | I, S, G, H, R, Q, M | A | Q | T | G |
在一些實施例中，SEQ ID NO: 1之變異型VP1蛋白殼蛋白在下表所示之AAV9 VP1之VR-VIII位點的位置581-594或585-590及/或位置452包含取代模式之一。在一些實施例中，SEQ ID NO: 1之變異型VP1蛋白殼蛋白在AAV9 VP1之VR-VIII位點的位置581-594包含取代模式，與下表所示的位置具有至少約75%、78.5%、80%、85%、90%、93%或100%序列一致性。
在一些實施例中，上表中的蛋白殼具有：(i)分別位於位置581、582、583及584的ATNH，及/或(ii)分別位於位置591、592、593及594的AQTG。
| 位置452 | VR-VIII 比對(581-594) |
| N或K | ATNH NSTYLGAQTG |
| N或K | ATNH MMTTARAQTG |
| N或K | ATNH CSTSIRAQTG |
| N或K | ATNH QGAYAQAQTG |
| N或K | ATNH VSSFTSAQTG |
| N或K | ATNH EDNIRSAQTG |
| N或K | ATNH NNVISGAQTG |
| N或K | ATNH TGTSIIAQTG |
| N或K | ATNH QHYSAQAQAQTG |
| 位置585 | 位置586 | 位置587 | 位置588 | 位置589 | 位置590 | 位置452 |
| Q585N | S | A587T | Q588Y | A589L | Q590G | N或N452K |
| Q585M | S586M | A587T | Q588T | A | Q590R | N或N452K |
| Q585C | S | A587T | Q588S | A589I | Q590R | N或N452K |
| Q | S586G | A | Q588Y | A | Q | N或N452K |
| Q585V | S | A587S | Q588F | A589T | Q590S | N或N452K |
| Q585E | S586D | A587N | Q588I | A589R | Q590S | N或N452K |
| Q585N | S586N | A587V | Q588I | A589S | Q590G | N或N452K |
| Q585T | S586G | A587T | Q588S | A589I | Q590I | N或N452K |
在一些實施例中，SEQ ID NO: 1之變異型VP1蛋白殼蛋白在VR-VIII位點的位置581-594或585-590包含以下胺基酸之一：
| 581 | 582 | 583 | 584 | 585 | 586 | 587 | 588 | 589 | 590 | 591 | 592 | 593 | 594 |
| A | T | N | H | E, N, M, C, V, T, Q | N, M, G, D, S | T, S, N, V, A | F, Y, T, S, I, | S, L, T, I, R, A | I, S, G, R, Q | A | Q | T | G |
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586N、A587T、Q588V、A589S、Q590I及N452K。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586T、A587L、Q588F、A589N、Q590S及N452K。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L、Q590G及N452K。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L及Q590G。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585G、A587I、Q588L、A589T、Q590H及N452K。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585M、S586M、A587T、Q588T、A589A及Q590R。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585C、A587T、Q588S、A589I及Q590R。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 488。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 499。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 504。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 505。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 506。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 510。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 512。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 513。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 516。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 518。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 521。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 522。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 533。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 536。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 539。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 558。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 562。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 566。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 571。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 576。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 578。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 579。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 580。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 581。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 585。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 588。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 589。
在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 707。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 708。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 710。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 767。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 768。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 769。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 770。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 771。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 772。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 773。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 774。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 775。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 776。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 777。在一些實施例中，本發明提供一種重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其中該蛋白殼蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 778。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708、710、772及774之一至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778中之一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段、基本上由其組成或由其組成。在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 705-708中之一者至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段、基本上由其組成或由其組成。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 705至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 706至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 707至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 708至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 710至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 772至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 774至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 488至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 512至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 513至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 539至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 589至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在胺基酸位置581-594包含SEQ ID NO: 618、684、642、630、615、692、616、668、726、608、603、657、675及622中之任一者的胺基酸序列，且最佳地，其中蛋白殼蛋白進一步包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在胺基酸位置581-594包含胺基酸序列SEQ ID NO: 618，且視情況其中蛋白殼蛋白進一步包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在胺基酸位置581-594包含胺基酸序列SEQ ID NO: 684，且視情況其中蛋白殼蛋白進一步包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在胺基酸位置581-594包含胺基酸序列SEQ ID NO: 642，且視情況其中蛋白殼蛋白進一步包含胺基酸取代N452K。在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在胺基酸位置581-594包含胺基酸序列SEQ ID NO: 630，且視情況其中蛋白殼蛋白進一步包含胺基酸取代N452K。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在胺基酸位置581-594包含SEQ ID NO: 598、602、607、608、609、613、615、616、618、619、621、624、625、630、636、639、642、661、665、669、674、679、681、682、683、684、688、691、692及726中之任一者的胺基酸序列。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼在胺基酸位置452包含胺基酸N或K。在一些此等實施例中，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代N452K。
在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白在胺基酸位置581-594包含SEQ ID NO: 598、608、615、616、618、642、692及726中之任一者的胺基酸序列。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼在胺基酸位置452包含胺基酸N或K。在一些此等實施例中，蛋白殼蛋白包含胺基酸取代N452K。
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-VIII位點之變異型多肽序列，其中VR-VIII位點(例如整個VR-VIII位點)包含與以下序列中之任一者具有至少約60%、65%、70%、71%、74%、75%、78%、78.5%、79%、80%、83%、85%、86%、90%、92%、93%或100%一致性的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成：
| VR-VIII 比對(581-594) |
| ATNH ENTVSIAQTG |
| ATNH QTLFNSAQTG |
| ATNH NSTYLGAQTG |
| ATNH GSILTHAQTG |
| ATNH MMTTARAQTG |
| ATNH CSTSIRAQTG |
| ATNH QGAYAQAQTG |
| ATNH NTKLAIAQTG |
| ATNH VSSFTSAQTG |
| ATNH EDNIRSAQTG |
| ATNH QSAQAQAQTG |
| ATNH NNVISGAQTG |
| ATNH TGTSIIAQTG |
| ATNH QWMSAQAQAQTG |
| ATNH QDARAQAQTG |
| ATNH QHYSAQAQAQTG |
| ATNH QSAQAQAQTG |
| ATNH NIRTEMAQTG |
| ATNH STTNFRAQTG |
| ATNHQ ANYGQAQTG |
| ATNH NMNRVNAQTG |
| ATNH SNSVQSAQTG |
| ATNH SSTFQGAQTG |
| ATNH STTNFRAQTG |
| ATNH SSIFNSAQTG |
| ATNH AGNYNNAQTG |
| ATNH TSVISIAQTG |
| ATNH HSRVEYAQTG |
| ATNH SSIIYSAQTG |
| ATNH SGRDSYAQTG |
| ATNH SSSYNNAQTG |
| ATNH HNPSINAQTG |
| ATNH NRNGLLAQTG |
| ATNH ESTSVRAQTG |
| ATNH LSVSSIAQTG |
| ATNH EDIIRSAQTG |
| ATN RQ TAQAQAQTG |
| ATN RQ IAQAQAQTG |
在一些實施例中，本發明之蛋白殼蛋白包含VR-VIII位點之變異型多肽序列，其中整個VR-VIII位點包含胺基酸ATNHQSAQAQAQTG (SEQ ID NO: 5)，且其中在此位點中存在一個、兩個或更多個胺基酸的插入。在一些實施例中，插入位於序列QSAQAQ (SEQ ID NO: 756)之變異型多肽內、SEQ ID NO: 5內。在一些實施例中，插入介於SEQ ID NO: 5之胺基酸ATNHQ與胺基酸SAQAQAQTG之間。換言之，在一些實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，VR-VIII位點之插入介於位置585與位置586之間。在一些實施例中，插入係胺基酸WM的插入(例如相對於參考序列SEQ ID NO: 1，介於位置585與586之間)。在一些實施例中，插入係胺基酸HY的插入(例如相對於參考序列SEQ ID NO: 1，介於位置585與586之間)。在一些此等實施例中，相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白可進一步包含N452K取代(除本文所述之VR-VIII位點的變異型多肽序列之外)。
AAV5 / AAV9 嵌合蛋白殼
本發明亦提供重組腺相關病毒(rAAV)蛋白殼蛋白，其包含與SEQ ID NO: 463至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致的序列。(在SEQ ID NO: 463中，標識為「X」的胺基酸殘基自序列一致性計算排除在外)。在一些實施例中，蛋白殼蛋白係AAV5/AAV9嵌合蛋白殼蛋白。在一些實施例中，AAV5/AAV9嵌合蛋白殼蛋白序列與AAV9蛋白殼蛋白序列(SEQ ID NO: 1)大於約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%一致。在一些實施例中，AAV5/AAV9嵌合蛋白殼蛋白序列的C端500個殘基與AAV9蛋白殼蛋白序列(SEQ ID NO: 1)之C端500個殘基至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致。在一些實施例中，與AAV9蛋白殼蛋白序列(SEQ ID NO: 1)之Q688等效之位置的殘基係嵌合蛋白殼蛋白中的離胺酸(K)。
在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白包含衍生自AAV5蛋白殼蛋白的至少1、2、3、4、5個或更多個多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白包含衍生自AAV9蛋白殼蛋白的至少1、2、3、4、5個或更多個多肽區段。在一些實施例中，至少一個多肽區段衍生自AAV5蛋白殼蛋白且至少一個多肽區段衍生自AAV9蛋白殼蛋白。
在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之N端的前250個殘基包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之N端的前225個殘基包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之N端的前200個殘基包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之N端的前150個殘基包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之N端的前100個殘基包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之N端的前50個殘基包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段中之每一者與相應AAV5蛋白殼序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性。
在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之殘基50-250包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之殘基50-200包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之殘基50-150包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之殘基100-250包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之殘基100-200包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之殘基150-250包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段中之每一者與相應AAV5蛋白殼序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性。
在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之C端的最後100個殘基包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白之C端的最後50個殘基包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段。在一些實施例中，一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段中之每一者與相應AAV5蛋白殼序列具有至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性。在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白在嵌合蛋白殼蛋白之N端處或附近包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段，如上文所述，且在嵌合蛋白殼蛋白之C端處或附近包含一或多個AAV5蛋白殼衍生多肽區段，如本段落中所述。
在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白依N端至C端次序包含：序列與SEQ ID NO: 411至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 412至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第一多肽區段；序列與SEQ ID NO: 413至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 414至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第二多肽區段；序列與SEQ ID NO: 415至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 416至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第三多肽區段；序列與SEQ ID NO: 417至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 418至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第四多肽區段；以及序列與SEQ ID NO: 419至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 420至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第五多肽區段。在一些實施例中，至少一個多肽區段衍生自AAV5蛋白殼蛋白且至少一個多肽區段衍生自AAV9蛋白殼蛋白。
AAV9衍生的多肽區段1：
AAV5衍生多肽區段1之序列：
AAV9衍生多肽區段2之序列：
AAV5衍生多肽區段2之序列：
AAV9衍生多肽區段3之序列：
AAV5衍生多肽區段3之序列：
AAV9衍生多肽區段4之序列：
AAV5衍生多肽區段4之序列：
AAV9衍生多肽區段5之序列：
具有Q688K突變之AAV9衍生多肽區段5之序列：
在一些實施例中，嵌合蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 421-444中之一者至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段、基本上由其組成或由其組成。
組合型蛋白殼蛋白
| 表 2 . 蛋白殼蛋白序列 | |
| 名稱 / 替代名稱 | SEQ ID NO: |
| ZC23 | 421 |
| ZC24 | 422 |
| ZC25 | 423 |
| ZC26 | 424 |
| ZC27 | 425 |
| ZC28 | 426 |
| ZC29 | 427 |
| ZC30 | 428 |
| ZC31 | 429 |
| ZC32 | 430 |
| ZC33 | 431 |
| ZC34 | 432 |
| ZC35 | 433 |
| ZC40 / TN8 | 434 |
| ZC41 | 435 |
| ZC42 | 436 |
| ZC43 | 437 |
| ZC44 / TN10 | 438 |
| ZC45 | 439 |
| ZC46 | 440 |
| ZC47 / TN14 | 441 |
| ZC48 | 442 |
| ZC49 | 443 |
| ZC50 | 444 |
在一個態樣中，本發明提供組合型蛋白殼蛋白。如本文所用，「組合型蛋白殼蛋白」係指如本發明中所述的AAV5/AAV9嵌合蛋白殼蛋白，相對於嵌合親本序列，其在一或多個位點進一步包含胺基酸變異體。在一些實施例中，嵌合親本序列的一或多個位點係選自與AAV9蛋白殼蛋白之VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點等效的位點。
本發明之組合型蛋白殼蛋白包括如(但不限於)實例所示鑑別的任何變異型多肽序列。不限於任何特定實例，在一些實施例中，組合型蛋白殼蛋白包含AAV5/AAV9嵌合蛋白殼蛋白骨架，且進一步在選自由以下組成之群的一或多個位點包含變異型多肽序列：與如本文所述之AAV9蛋白殼蛋白之VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點等效的位點。
在一些實施例中，組合型蛋白殼蛋白依N端至C端次序包含：序列與SEQ ID NO: 411至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 412至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第一多肽區段；序列與SEQ ID NO: 413至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 414至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第二多肽區段；序列與SEQ ID NO: 415至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 416至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第三多肽區段；序列與SEQ ID NO: 417至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 418至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第四多肽區段；以及序列與SEQ ID NO: 419至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致或與SEQ ID NO: 420至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的第五多肽區段(在此，與AAV9蛋白殼蛋白之VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點等效的區域自第五多肽區段之序列一致性計算中排除)。在一些實施例中，組合型蛋白殼蛋白在親本序列之VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點中之一或多者處包含變異型多肽序列，其中該親本序列包含與SEQ ID NO: 463至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%一致的序列。(在SEQ ID NO: 463中，標識為「X」的胺基酸殘基自序列一致性計算排除在外)。
在一些實施例中，至少一個多肽區段衍生自AAV5蛋白殼蛋白且至少一個多肽區段衍生自AAV9蛋白殼蛋白。
在一些實施例中，組合型蛋白殼蛋白進一步在選自與AAV9蛋白殼蛋白之VR-IV位點、VR-V位點、VR-VII位點及VR-VIII位點等效之位點的一或多個位點包含變異型多肽序列。
在一些實施例中，組合型蛋白殼蛋白在與AAV9蛋白殼蛋白之VR-IV位點等效的位點具有變異型多肽序列，該變異型多肽序列包含與GYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 6)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於GYHKSGAAQ (SEQ ID NO: 6)，與AAV9蛋白殼蛋白之VR-IV位點等效之位點的變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。
在一些實施例中，組合型蛋白殼蛋白在與AAV9蛋白殼蛋白之VR-V位點等效的位點具有變異型多肽序列，該變異型多肽序列包含與LNSMLI (SEQ ID NO: 105)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於LNSMLI (SEQ ID NO: 105)，與AAV9蛋白殼蛋白之VR-V位點等效之位點的變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。
在一些實施例中，組合型蛋白殼蛋白在與AAV9蛋白殼蛋白之VR-VIII位點等效的位點具有變異型多肽序列，該變異型多肽序列包含與ANYG (SEQ ID NO: 305)或NVSY (SEQ ID NO: 303)至少約60%、70%、80%、90%或100%一致的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。在一些實施例中，相對於ANYG (SEQ ID NO: 305)或NVSY (SEQ ID NO: 303)，與AAV9蛋白殼蛋白之VR-VIII位點等效之位點的變異型多肽序列包含由至多1、2、3或4個保守胺基酸取代組成的序列、基本上由該序列組成或由該序列組成。
在一些實施例中，與AAV9蛋白殼蛋白序列(SEQ ID NO: 1)之Q688等效之位置的殘基係組合型蛋白殼蛋白中的離胺酸(K)。
在一些實施例中，組合型蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 445-462中之一者至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致的多肽序列或其功能片段、基本上由其組成或由其組成。
其他突變
| 表 3 . 蛋白殼蛋白序列 | |
| 名稱 / 替代名稱 | SEQ ID NO: |
| TN47-07 | 445 |
| TN47-10 / TN12 | 446 |
| TN47-13 | 447 |
| TN47-14 | 448 |
| TN47-17 | 449 |
| TN47-22 | 450 |
| TN40-07 | 451 |
| TN40-10 | 452 |
| TN40-13 | 453 |
| TN40-14 | 454 |
| TN40-17 | 455 |
| TN40-22 | 456 |
| TN44-07 / TN13 | 457 |
| TN44-10 | 458 |
| TN44-13 | 459 |
| TN44-14 | 460 |
| TN44-17 | 461 |
| TN44-22 | 462 |
為了進一步改善轉導效率或組織選擇性，例如可併入其他胺基酸取代。在基於AAV5或AAV9之蛋白殼中，相對於AAV5之序列，例示性非限制性取代包括(但不限於) S651A、T578A或T582A。
在一些實施例中，在基於AAV5或AAV9之蛋白殼中，相對於AAV5之序列，蛋白殼蛋白包含選自S651A、T578A、T582A、K251R、Y709F、Y693F或S485A之突變。在一些實施例中，在基於AAV5或AAV9之蛋白殼中，相對於AAV5之序列，蛋白殼蛋白包含選自K251R、Y709F、Y693F或S485A之突變。
轉導效率、向性及NAb逃逸
可使用此項技術中已知之方法或實例中所述之方法測定轉導效率。在一些實施例中，相較於包含親本序列的AAV病毒粒子，含有工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子在心臟細胞中展現增加的轉導效率。本章節中提及的rAAV病毒粒子為含有本文所述之經修飾或工程化蛋白殼蛋白的任何rAAV病毒粒子。
在一些實施例中，該rAAV病毒粒子相較於包含親本序列的AAV病毒粒子，在人類心臟纖維母細胞(hCF)中展現增加的轉導效率。在一些實施例中，人類心臟纖維母細胞位於心臟的左心室中。
在一些實施例中，在100,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在hCF細胞中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，在100,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在hCF細胞中展現的轉導效率增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，在100,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在hCF細胞中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，在100,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在hCF細胞中展現的轉導效率增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，在1,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在hCF細胞中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，在1,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在hCF細胞中展現的轉導效率增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，在1,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在hCF細胞中展現的轉導效率增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，相較於包含親本序列的AAV病毒粒子，rAAV病毒粒子在誘導性多能幹細胞衍生的心肌細胞(iPS-CM)中展現增加的轉導效率。因此，本章節中論述的改善倍數係相較於包含親本序列的AAV病毒粒子(例如AAV9)。
在一些實施例中，在100,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，在100,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，在100,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，在75,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，在75,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，在75,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，在1,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，在1,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，在1,000的感染倍率(MOI)下，rAAV病毒粒子在iPS-CM細胞中展現的轉導效率增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，相較於包含親本序列的AAV病毒粒子，含有本發明之工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子在心臟中展現增加的轉導效率。在一些實施例中，藉由將本發明之工程化蛋白殼蛋白所囊封的AAV9:CAG-GFP或CAG-GFP注射至C57BL/6J小鼠中來監測心臟中的轉導效率。在一些實施例中，注射劑量為每隻小鼠2.5E+11 vg。在一些實施例中，注射劑量為每隻小鼠2E+11 vg。在一些實施例中，注射劑量為每隻小鼠1E+11 vg。在一些實施例中，rAAV病毒粒子在心臟中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，rAAV病毒粒子在心臟中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，rAAV病毒粒子在心臟中展現的轉導效率增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，rAAV病毒粒子在心臟中展現的轉導效率增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，rAAV病毒粒子在心臟中展現的轉導效率增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，rAAV病毒粒子在心臟中展現的轉導效率增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，相較於包含親本序列的AAV病毒粒子，含有本發明之工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子在肝臟細胞中展現降低的轉導效率。在一些實施例中，藉由將本發明之工程化蛋白殼蛋白所囊封的AAV9:CAG-GFP或CAG-GFP注射至C57BL/6J小鼠中來監測肝臟轉導效率。在一些實施例中，注射劑量為每隻小鼠2.5E+11 vg。在一些實施例中，注射劑量為每隻小鼠2E+11 vg。在一些實施例中，注射劑量為每隻小鼠1E+11 vg。在一些實施例中，rAAV病毒粒子在肝臟中展現的轉導效率降低至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在一些實施例中，注射劑量為每隻小鼠1E+11 vg。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，rAAV病毒粒子在肝臟中展現的轉導效率降低至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，rAAV病毒粒子在肝臟中展現的轉導效率降低約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，rAAV病毒粒子在肝臟中展現的轉導效率降低約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，rAAV病毒粒子在肝臟中展現的轉導效率降低約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、或約80%至100%。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，rAAV病毒粒子在肝臟中展現的轉導效率降低約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、或約80%至100%。
當包含本發明之工程化蛋白殼蛋白之rAAV病毒粒子於一種細胞/組織/器官類型之轉導效率相對於另一種類型的比率相較於包含親本序列之AAV病毒粒子增加時，對一種細胞類型及/或組織/器官類型的選擇性增加。在一些實施例中，相較於肝臟細胞，包含工程化蛋白殼蛋白之rAAV病毒粒子對iPS-CM細胞展現增加的選擇性。在一些實施例中，相較於肝臟，包含工程化蛋白殼蛋白之rAAV病毒粒子當活體內注射時對心臟展現增加的選擇性。在一些實施例中，相較於肝臟，包含工程化蛋白殼蛋白之rAAV病毒粒子當活體內注射時對心臟之左心室展現增加的選擇性。
在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子對iPS-CM細胞展現的選擇性相對於肝臟細胞增加且/或對心臟展現的選擇性相對於肝臟增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子對iPS-CM細胞展現的選擇性相對於肝臟細胞增加且/或對心臟展現的選擇性相對於肝臟增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子對iPS-CM細胞展現的選擇性相對於肝臟細胞增加且/或對心臟展現的選擇性相對於肝臟增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子對心臟組織展現的選擇性相對於肝臟細胞增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子對心臟組織展現的選擇性相對於肝臟組織增加約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子對心臟組織展現的選擇性相較於肝臟組織增加至少或超過30%、40%、50%、80%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%或1000%。在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子對心臟組織展現的選擇性相對於肝臟細胞增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，相較於包含親本序列的AAV病毒粒子，包含本發明之工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子展現改善的逃避人類NAb (中和抗體)之能力。在一些實施例中，逃避人類NAb之能力係經由NAb抑制分析加以量測。NAb抑制分析之非限制性實例描述於本發明之實例章節中。在一些實施例中，如下執行NAb抑制分析：將AAV病毒粒子與彙集的人類NAb (例如IgG)一起培育，隨後以預定的MOI處理目標細胞且相較於不與彙集之人類NAb一起培育的AAV病毒粒子，量測轉導效率的降低。較少的NAb抑制表示AAV病毒粒子逃避人類NAb的能力改善。在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子逃避人類NAb的能力改善至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子逃避人類NAb的能力改善約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，包含工程化蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子逃避人類NAb的能力改善約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
編碼蛋白殼蛋白的聚核苷酸可包含含有野生型
cap基因之原生密碼子或經選擇以編碼相同蛋白質之替代密碼子的序列。可改變插入序列的密碼子使用。選擇適當核苷酸序列及衍生替代性核苷酸序列以編碼本發明之任何蛋白殼蛋白在熟習此項技術者之技能範圍內。可使用宿主生物體之密碼子使用表(亦即，人類的真核密碼子使用)對蛋白質序列進行逆轉譯。
在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 402-410及464-468中之任一者至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，本發明提供編碼AAV5/AAV9嵌合蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該嵌合蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 421-444中之任一者至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，本發明提供編碼組合型蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該組合型蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 445-462中之任一者至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 705-708中之任一者具有至少或超過80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，本發明提供一種編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 515、581、539及527中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，本發明提供一種編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 707、512、539及589中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，本發明提供一種編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 707、512、539及589中之任一者具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 707具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 512具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 539具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 589具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列一致性的序列。
在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708及710中之任一者至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 488至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 499至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 504至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 505至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 506至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 510至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 512至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 513至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 516至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 518至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 521至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 522至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 533至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 536至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 539至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 558至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 562至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 566至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 571至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 576至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 578至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 579至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 580至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 581至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 585至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 588至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 589至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 705至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 706至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 707至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 708至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。在一些實施例中，本發明提供編碼AAV9衍生蛋白殼蛋白的聚核苷酸，該蛋白殼蛋白包含與SEQ ID NO: 710至少80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%一致的序列。
在一些實施例中，本發明提供AAV9、AAV5/AAV9嵌合蛋白殼蛋白或組合型蛋白殼蛋白，其包含與選自SEQ ID NO: 402-410、421-462、464-468之經修飾蛋白殼至少80%、85%、90%、95%、99%或100%一致的序列，其中具有指定之一致性百分比水平的胺基酸取代(視情況為保守取代)為容許的。
在一些實施例中，相對於野生型AAV9及/或相對於肝臟的轉導，如本文所述之包含N452K突變的任何rAAV在心臟中展現的轉導效率增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，相對於野生型AAV9且/或相對於肝臟的轉導，如本文所述之包含N452K突變的任何rAAV在心臟中展現的轉導效率增加約2倍至約16倍、約2至約14倍、約2至約12倍、約2至約10倍、約2至約8倍、約2至約6倍、約2至約4倍、或約2倍至約3倍。在一些實施例中，相對於野生型AAV9且/或相對於肝臟的轉導，如本文所述之包含N452K突變的任何rAAV病毒粒子在心臟中展現的轉導效率增加至少或超過30%、40%、50%、80%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%或1000%。在一些實施例中，相對於野生型AAV9且/或相對於肝臟的轉導，如本文所述之包含N452K突變的任何rAAV在心臟中展現的轉導效率增加約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、約80%至100%、約100%至125%、約125%至150%、約150%至175%、或約175%至200%。
在一些實施例中，相對於野生型AAV9，如本文所述之包含N452K突變的任何rAAV在肝臟中展現的轉導效率降低至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，如本文所述之包含N452K突變的任何rAAV在肝臟中展現的轉導效率降低約2倍至約16倍、約2倍至約14倍、約2倍至約12倍、約2倍至約10倍、約2倍至約8倍、約2倍至約6倍、約2倍至約4倍，或約2倍至約3倍。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，如本文所述之包含N452K突變的任何rAAV病毒粒子在肝臟中展現的轉導效率降低至少或超過30%、40%、50%、80%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%或1000%。在一些實施例中，相對於野生型AAV9，如本文所述之包含N452K突變的任何rAAV在肝臟中展現的轉導效率降低約20%至30%、約30%至40%、約40%至50%、約50%至80%、或約80%至100%。
基因產物/轉殖基因
本文所述之轉殖基因及基因產物不具有限制性。編碼任何基因產物的任何轉殖基因可用於本文所述之rAAV病毒粒子。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含含有轉殖基因之病毒載體。
轉殖基因可為編碼產物或其功能片段的基因或核苷酸序列。產物可為例如多肽或非編碼核苷酸。非編碼核苷酸意謂自轉殖基因或核苷酸序列轉錄的序列不轉譯成多肽。在一些實施例中，由可操作地連接至本文所述之增強子之轉殖基因或核苷酸編碼的產物為非編碼聚核苷酸。非編碼聚核苷酸可為RNA，諸如微小RNA (miRNA或mIR)、短髮夾RNA (shRNA)、長非編碼RNA (lnRNA)及/或短干擾RNA (siRNA)。在一些實施例中，轉殖基因編碼由心臟細胞(例如心肌細胞)原生表現的產物。
在一些實施例中，轉殖基因編碼多肽。在一些實施例中，轉殖基因編碼非編碼聚核苷酸，諸如微小RNA (miRNA或mIR)。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼人類蛋白質之核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含人類核苷酸序列(人類DNA序列)。在一些實施例中，轉殖基因包含已經密碼子優化的DNA序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼野生型蛋白質或其功能活性片段的核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼野生型蛋白質之變異型(諸如其功能活性變異體)的核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼選自以下之產物的序列：血管內皮生長因子(VEGF)、VEGF同功型、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-DdNdC、VEGF-A116A、VEGF-A165、VEGF-A121、VEGF-2、胎盤生長因子(PIGF)、纖維母細胞生長因子4 (FGF-4)、人類生長因子(HGF)、人類顆粒球群落刺激因子(hGCSF)及低氧可誘導因子1α (HIF-1α)。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼選自以下之產物的序列：SERCA2a、基質細胞衍生因子-1 (SDF-1)、6型腺苷酸環化酶、S100A1、miRNA-17-92、miR-302-367、抗miR-29a、抗miR-30a、抗miR-141、週期素A2、週期素依賴性激酶2、Tbx20、miRNA-590、miRNA-199、針對Lp(a)的反義寡核苷酸、針對PCSK9的干擾RNA、針對脂蛋白元C-III的反義寡核苷酸、脂蛋白脂酶S447X、針對脂蛋白元B的反義寡核苷酸、針對c-myc的反義寡核苷酸及E2F寡核苷酸誘餌。
在一些實施例中，轉殖基因編碼其表現彌補引起遺傳病症之基因缺陷的基因產物。在一些實施例中，本發明提供(不限於)編碼以下中之一或多者的聚核苷酸：例如用於(不限於)圓括號中所示的病症，或由以下各者引起的其他病症：TAZ (巴氏症候群(Barth syndrome))；FXN (弗雷德里奇共濟失調(Freidrich's Ataxia))；CASQ2 (CPVT)；FBN1 (Marfan)；RAF1及SOS1 (Noonan)；SCN5A (Brugada)；KCNQ1及KCNH2s (長QT症候群)；DMPK (肌緊張性營養不良1)；LMNA (肢帶型營養不良1B型)；JUP (Naxos)；TGFBR2 (Loeys-Dietz)；EMD (X性聯EDMD)；以及ELN (SV主動脈瓣狹窄)。在一些實施例中，聚核苷酸編碼以下中之一或多者：心肌鈣蛋白T (TNNT2)；BAG家族分子伴隨蛋白調節因子3 (BAG3)；肌凝蛋白重鏈(MYH7)；原肌凝蛋白1 (TPM1)；肌凝蛋白結合蛋白C (MYBPC3)；5'-AMP活化蛋白激酶亞單元γ-2 (PRKAG2)；3型肌鈣蛋白I (TNNI3)；肌聯蛋白(titin)(TTN)；肌凝蛋白輕鏈2 (MYL2)；肌動蛋白，α心肌1 (ACTC1)；鉀電壓設門通道，KQT樣亞家族成員1 (KCNQ1)；肌細胞增強因子2c (MEF2C)；以及心臟LIM蛋白(CSRP3)。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼選自以下之蛋白質的核苷酸序列：DWORF，連接蛋白(例如JPH2)；BAG家族分子伴隨蛋白調節因子3 (BAG3)；受磷蛋白(phospholamban)(PLN)；α-晶狀體球蛋白B鏈(CRYAB)；LMNA (諸如核纖層蛋白A及核纖層蛋白C同功型)；3型肌鈣蛋白I (TNNI3)；溶酶體相關膜蛋白2 (LAMP2，諸如LAMP2a、LAMP2b及LAMP2c同功型)；橋體斑蛋白(desmoplakin)(DSP，諸如DPI及DPII同功型)；橋體醣蛋白2 (DSG2)；連接斑珠蛋白(JUP)及斑菲素蛋白-2 (PKP2)。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼基質金屬肽酶11 (MMP11)蛋白、突觸極蛋白2樣(SYNPO2L)蛋白(例如SYNPO2LA或SYNPO2LA)或RNA結合模體蛋白20 (RBM20)的核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼靶向轉移抑制蛋白1 (MTSS1)之抑制性寡核苷酸的核苷酸序列。
在一些實施例中，病毒載體(諸如本發明之rAAV病毒粒子)中的轉殖基因係選自DWORF、JPH2、BAG3、CRYAB、LMNA (例如LMNA之核纖層蛋白A同功型，或LMNA之核纖層蛋白C同功型)、TNNI3、PLN、LAMP2 (例如LAMP2a、LAMP2b或LAMP2c)、DSP (例如DSP之DPI同功型或DSP之DPII同功型)、DSG2及JUP。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼MYBPC3多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DWORF多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼連接蛋白2 (JPH2)多肽的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼全長JPH2多肽的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼JPH2多肽之N端片段的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼JPH2多肽之N端片段的聚核苷酸序列，其保持JPH2活性。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼BAG3多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼BAG3多肽之C151R突變型的聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼CRYAB多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LMNA多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LMNA之核纖層蛋白A同功型的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LMNA之核纖層蛋白C同功型的聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼TNNI3多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼PLN多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LAMP2多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LAMP2a同功型的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LAMP2b同功型的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼LAMP2c同功型的聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DSP多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DSP之DPI同功型的聚核苷酸序列。在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DSP之DPII同功型的聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼DSG2多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含編碼JUP多肽之聚核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種基因產物的核苷酸序列，該等基因產物選自MYBPC3、KCNH2、TRPM4、DSG2、ATP2A2、CACNA1C、DMD、DMPK、EPG5、EVC、EVC2、FBN1、NF1、SCN5A、SOS1、NPR1、ERBB4、VIP、MYH6、MYH7或其突變體、變異體或片段。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種基因產物的核苷酸序列，該等基因產物選自TGFBR2、TGFBR1、EMD、KCNQ1、TAZ、COL3A1、JUP、CASQ2、MLRP44、DNAJC19、LMNA、TNNI3、DSP、DSG2、RAF1、SOS1、FBN1、LAMP2、FXN、RAF1、BAG3、KCNQ1、MYLK3、CRYAB、ALPK3及ACTN2。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種基因產物的核苷酸序列，該等基因產物選自MYBPC3、DWORF、JPH2、BAG3、CRYAB、LMNA之核纖層蛋白A同功型、LMNA之核纖層蛋白C同功型、TNNI3、PLN、LAMP2a、LAMP2b、LAMP2c、DSP之DPI同功型、DSP之DPII同功型、DSG2、MYH6、MYH7、RBM20及JUP。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼選自ASCL1、MYOCD、MEF2C及TBX5之一或多種基因產物的核苷酸序列。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種基因產物的核苷酸序列，該等基因產物選自ASCL1、MYOCD、MEF2C、AND TBX5、CCNB1、CCND1、CDK1、CDK4、AURKB、OCT4、BAF60C、ESRRG、GATA4、GATA6、HAND2、IRX4、ISLL、MESP1、MESP2、NKX2.5、SRF、TBX20、ZFPM2及MIR-133。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種基因產物的核苷酸序列，該等基因產物選自MYBPC3、DWORF、KCNH2、TRPM4、DSG2及ATP2A2。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種基因產物的核苷酸序列，該等基因產物選自TGFBR2、TGFBR1、EMD、KCNQ1、TAZ、COL3A1、JUP、CASQ2、MLRP44、DNAJC19、LMNA、TNNI3、DSP、DSG2、RAF1、SOS1、FBN1、LAMP2、FXN、RAF1、BAG3、KCNQ1、MYLK3、CRYAB、ALPK3及ACTN2。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種基因產物的核苷酸序列，該等基因產物選自CACNA1C、DMD、DMPK、EPG5、EVC、EVC2、FBN1、NF1、SCN5A、SOS1、NPR1、ERBB4、VIP、MYH6、MYH7及Cas9。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含含有編碼saCas9之核苷酸序列的異源核酸。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種基因產物的核苷酸序列，該等基因產物選自MYOCD、ASCL1、GATA4、MEF2C、TBX5、miR-133及MESP1。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子中的轉殖基因編碼上文鑑別的任一種基因產物。
在一些實施例中，本文所述之蛋白殼改善攜載本文所述之任一種轉殖基因(且編碼本文所述之任一種基因產物且引起本文所述之任一種基因產物表現)之rAAV病毒粒子的心臟轉導效率、肝臟病毒負荷及/或心臟/肝臟轉導比率。
組成物
鑑別具有適用於基因療法之特性之蛋白殼變異體的嘗試包括如美國專利第9,233,131號中所述對AAV2及AAV5 cap基因之DNA進行改組；以及如國際專利申請案第WO2012/145601A2及WO2018/222503A1號中所述進行的定向演化。此等文件的揭示內容併入本文中用於所有目的，尤其是用於製備及使用AAV病毒粒子的方法以及其中所揭示的聚核苷酸序列及基因產物，以及適用於治療心臟疾病或病症之轉錄因子組合。
AAV蛋白殼係由AAV之
cap基因編碼，該基因亦稱為右開放閱讀框架(ORF)(與左ORF
rep相比)。代表性AAV蛋白殼之結構描述於多個出版物中，包括Xie等人(2002)
Proc. Natl. Acad. Sci USA99:10405-1040 (AAV2); Govindasamy等人(2006)
J. Virol.80:11556-11570 (AAV4); Nam等人(2007)
J. Virol. 81:12260-12271 (AAV8)及Govindasamy等人(2013)
J. Virol.87:11187-11199 (AAV5)。
AAV蛋白殼以1:1:10之預測比率含有三種病毒蛋白(VP) VP1、VP2及VP3之60個複本(總計)，且以T=1二十面體對稱性佈置。三種VP係由同一mRNA轉譯，其中除C端區域之整個VP2序列之外，VP1含有唯一N端域。除C端之VP3之外，VP2亦含有額外N端序列。在大部分晶體結構中，僅觀測到所有蛋白殼蛋白共有的C端多肽序列(約530個胺基酸)。VP1的N端唯一區域、VP1-VP2重疊區域及VP3的前14至16個N端殘基被認為以無序為主。低溫電子顯微法及影像重建資料表明，在完整AAV蛋白殼中，VP1及VP2蛋白的N端區域位於蛋白殼內部且對於受體與抗體結合而言為不可及的。因此，受體附著及轉導表型通常由VP1、VP2及VP3之共有C端域內的胺基酸序列決定。
在一些實施例中，一或多個胺基酸插入、取代或缺失存在於AAV蛋白殼蛋白之GH環或環IV中，例如AAV蛋白殼蛋白之GH環或環IV的溶劑可及部分中。對於AAV蛋白殼之GH環/環IV而言，參見例如van Vliet等人(2006)
Mol. Ther.14:809；Padron等人(2005)
Virol.79:5047；及Shen等人(2007)
Mol. Ther.15: 1955。在一些實施例中，「親本」AAV蛋白殼蛋白為野生型AAV9蛋白殼蛋白。在一些實施例中，「親本」AAV蛋白殼蛋白為野生型AAV5蛋白殼蛋白。在一些實施例中，「親本」AAV蛋白殼蛋白為嵌合AAV蛋白殼蛋白。多種AAV蛋白殼蛋白的胺基酸序列已知於此項技術中。參見例如GenBank登錄號NP_049542 (AAV1)；GenBank登錄號NP_044927 (AAV4)；GenBank登錄號AAD13756 (AAV5)；GenBank登錄號AAB95450 (AAV6)；GenBank登錄號YP_077178 (AAV7)；GenBank登錄號YP_077180 (AAV 8)；GenBank登錄號AAS99264 (AAV9)及GenBank登錄號AAT46337 (AAV10)。關於預測的祖系AAV蛋白殼，參見例如Santiago-Ortiz等人(2015)
Gene Ther .22:934。
腺相關病毒(AAV)為複製缺乏型細小病毒，其單股DNA基因體具有約4.7 kb長度，包括兩種145核苷酸反向末端重複(ITR)。AAV存在多種血清型。已知AAV血清型之基因體的核苷酸序列。舉例而言，AAV5基因體係以GenBank登錄號AF085716提供。AAV之生命週期及遺傳學評述於Muzyczka,
Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)。假型化rAAV之產生揭示於例如WO 01/83692中。亦考慮了其他類型的rAAV變異體，例如具有蛋白殼突變的rAAV。參見例如Marsic等人,
Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014)。說明性AAV載體提供於US 7,105,345；US 15/782,980；US 7,259,151；US 6,962,815；US 7,718,424；US 6,984,517；US 7,718,424；US 6,156,303；US 8,524,446；US 7,790,449；US 7,906,111；US 9,737,618；US App 15/433,322；US 7,198,951中，該等文獻各自以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。
本發明之rAAV病毒粒子包含含有編碼一或多種基因產物之核苷酸序列的異源核酸。基因產物可為多肽或RNA，或兩者。當基因產物為多肽時，核苷酸序列編碼視情況含有一或多個內含子的信使RNA，該信使RNA被轉譯成基因產物多肽。核苷酸序列可編碼一種、兩種、三種或更多種基因產物(但數目受限於rAAV病毒粒子的封裝容量，典型地約5.2 kb)。基因產物可操作地連接至一個啟動子(對於單一轉錄單元而言)或超過一個啟動子。亦可使用內部核糖體進入信號(IRES)或自裂解肽(例如2A肽)產生多種基因產物。
在一些實施例中，基因產物係多肽。在一些實施例中，多肽基因產物係多肽，其誘導心臟纖維母細胞的再程式化，以產生經誘導的心肌細胞樣細胞(iCM)。在一些實施例中，多肽基因產物係增強心臟細胞功能的多肽。在一些實施例中，多肽基因產物係提供心臟細胞缺失或缺乏之功能的多肽。在一些實施例中，多肽基因產物係基因體編輯的核酸內切酶。
在一些實施例中，基因產物包含與異源多肽融合的融合蛋白。在一些實施例中，基因產物包含與達成亞細胞定域之胺基酸序列融合的基因體編輯核酸酶，亦即，融合搭配物為亞細胞定域序列(例如用於靶向細胞核的一或多個核定域信號(NLS)，、兩個或更多個NLS、三個或更多個NLS等)。
一般而言，藉由將病毒DNA或RNA構築體引入「生產細胞」或「封裝細胞」株系中來產生病毒載體。封裝細胞株包括但不限於容易轉染的任何細胞株。封裝細胞株可基於HEK291、293T細胞、NIH3T3、COS、HeLa或Sf9細胞株。封裝細胞株之實例包括但不限於：Sf9 (ATCC® CRL-1711™)。用於產生rAAV病毒粒子的例示性封裝細胞株及方法提供於國際專利公開案第WO2017075627號、第WO2015/031686號、第WO2013/063379號、第WO2011/020710號、第WO2009/104964號、第WO2008/024998號、第WO2003/042361號及第WO1995/013392號；美國專利第US9441206B2號、第US8679837號及第US7091029B2號。
在一些實施例中，基因產物係功能性心臟蛋白質。在一些實施例中，基因產物係基因體編輯的核酸內切酶(視情況使用嚮導RNA、單嚮導RNA及/或修復模板)，其將非功能性心臟蛋白質置換或修復成功能性心臟蛋白質。功能性心臟蛋白質包括(但不限於)心肌鈣蛋白T；心臟肌原纖維蛋白；β-肌凝蛋白重鏈；肌凝蛋白心室必需輕鏈1；肌凝蛋白心室調節性輕鏈2；心臟a-肌動蛋白；a-原肌凝蛋白；心肌鈣蛋白I；心臟肌凝蛋白結合蛋白C；四個半LIM蛋白質1；肌聯蛋白；5'-AMP-活化蛋白激酶亞單元γ-2；3型肌鈣蛋白I，肌凝蛋白輕鏈2，肌動蛋白α心肌1；心臟LIM蛋白質；小窩蛋白3 (CAV3)；半乳糖苷酶α (GLA)；溶酶體相關膜蛋白2 (LAMP2)；粒線體轉移RNA甘胺酸(MTTG)；粒線體轉移RNA異白胺酸(MTTI)；粒線體轉移RNA離胺酸(MTTK)；粒線體轉移RNA麩醯胺酸(MTTQ)；肌凝蛋白輕鏈3 (MYL3)；肌鈣蛋白C (TNNC1)；轉甲狀腺素蛋白(TTR)；肌漿網鈣-ATP酶2a (SERCA2a)；基質源因子-1 (SDF-1)；腺苷酸環化酶-6 (AC6)；β-ARKct (β-腎上腺素激導性受體激酶C端)；纖維母細胞生長因子(FGF)；血小板源生長因子(PDGF)；血管內皮生長因子(VEGF)；肝細胞生長因子；低氧誘導性生長因子；胸腺素β4 (TMSB4X)；氧化氮合酶-3 (NOS3)；優諾卡汀(unocartin) 3 (UCN3)；整聯蛋白(melusin)；載脂蛋白-E (ApoE)；超氧化物歧化酶(SOD)；以及S100A1 (小鈣結合蛋白；參見例如Ritterhoff及Most (2012)
Gene Ther .19:613；Kraus等人(2009)
Mol . Cell . Cardiol .47:445)。
在一些實施例中，基因產物為其表現彌補引起遺傳病症之基因缺陷的基因產物。本發明提供包含聚核苷酸的rAAV病毒粒子，該聚核苷酸編碼以下中之一或多者：例如用於(不限於)圓括號中所示的病症，或由以下各者引起的其他病症：TAZ (巴氏症候群)；FXN (弗雷德里奇共濟失調)；CASQ2 (CPVT)；FBN1 (Marfan)；RAF1及SOS1s (Noonan)；SCN5A (Brugada)；KCNQ1及KCNH2s (長QT症候群)；DMPK (肌緊張性營養不良1)；LMNA (肢帶型營養不良1B型)；JUP (Naxos)；TGFBR2 (Loeys-Dietz)；EMD (X性聯EDMD)；以及ELN (SV主動脈瓣狹窄)。在一些實施例中，rAAV病毒粒子包含編碼以下中之一或多者的聚核苷酸：心肌鈣蛋白T (TNNT2)；BAG家族分子伴隨蛋白調節因子3 (BAG3)；肌凝蛋白重鏈(MYH7)；原肌凝蛋白1 (TPM1)；肌凝蛋白結合蛋白C (MYBPC3)；5'-AMP活化蛋白激酶亞單元γ-2 (PRKAG2)；3型肌鈣蛋白I (TNNI3)；肌聯蛋白(TTN)；肌凝蛋白輕鏈2 (MYL2)；肌動蛋白，α心肌1 (ACTC1)；鉀電壓設門通道，KQT樣亞家族成員1 (KCNQ1)；斑菲素蛋白2 (PKP2)；肌細胞增強因子2c (MEF2C)；以及心臟LIM蛋白(CSRP3)。
在一些實施例中，本發明之基因產物為多肽再程式化因子。需要再程式化因子作為將一種細胞類型轉變為另一細胞類型的方式。可使用熟習此項技術者可獲得的任何方法活體外或活體內將非心肌細胞分化成心肌細胞。舉例而言，參見以下文獻中所述之方法：Ieda等人(2010)
Cell142:375-386；Christoforou等人(2013)
PLoS ONE8:e63577；Addis等人(2013)
J. Mol. Cell Cardiol.60:97-106；Jayawardena等人(2012)
Circ. Res.110: 1465-1473；Nam Y等人(2003)
PNAS USA110:5588-5593；Wada R等人(2013)
PNAS USA110: 12667-12672；及Fu J等人(2013)
Stem Cell Reports1:235-247。
在心臟背景下，再程式化因子能夠直接或經由中間細胞類型將心臟纖維母細胞轉變為心臟肌細胞。特定而言，可直接再程式化，或藉由首先將纖維母細胞轉變為多能或分化全能幹細胞來達成再程式化。此類多能幹細胞稱為誘導多能幹(iPS)細胞。隨後轉變成心臟肌細胞(CM)細胞的iPS細胞稱為iPS-CM細胞。在實例中，活體外衍生自心臟纖維母細胞的iPS-CM在活體內用於選擇所關注的蛋白殼蛋白。本發明亦設想使用本發明的蛋白殼蛋白，繼而在活體外產生iPS-CM細胞，但特別是在活體內作為治療性基因治療方案之一部分產生。誘導的心肌細胞樣(iCM)細胞係指直接再程式化成心肌細胞的細胞。
誘導的心肌細胞表現一或多種心肌細胞特異性標記物，其中心肌細胞特異性標記物包括(但不限於)心肌鈣蛋白I、心肌鈣蛋白-C、原肌凝蛋白、小窩蛋白-3、肌凝蛋白重鏈、肌凝蛋白輕鏈-2a、肌凝蛋白輕鏈-2v、蘭尼鹼受體、肌原纖維a-輔肌動蛋白、Nkx2.5、連結蛋白43及心房利尿鈉因子。誘導的心肌細胞亦可展現肌原纖維結構。誘導的心肌細胞對心肌細胞特異性基因ACTC1 (心臟a-肌動蛋白)、ACTN2 (輔肌動蛋白a2)、MYH6 (a-肌凝蛋白重鏈)、RYR2 (蘭尼鹼受體2)、MYL2 (肌凝蛋白調節性輕鏈2，心室同功型)、MYL7 (肌凝蛋白調節性輕鏈，心房同功型)、TNNT2 (心臟2型肌鈣蛋白T)及NPPA (A型利尿鈉肽前驅物)、PLN (受磷蛋白)展現增強的表現。相較於衍生iCM的纖維母細胞，纖維母細胞標記物(諸如Colla2 (膠原蛋白la2))於經誘導之心肌細胞中的表現下調。
涉及多肽再程式化因子(在一些情況下，補充小分子再程式化因子，該等小分子再程式化因子連同rAAV一起供應)的再程式化方法包括US2018/0112282A1、WO2018/005546、WO2017/173137、US2016/0186141、US2016/0251624、US2014/0301991及US2013/0216503A1中所述的彼等方法，該等文獻全文併入，尤其是所揭示的再程式化方法及因子。
在一些實施例中，使用一或多種再程式化因子將心臟細胞再程式化成經誘導的心肌細胞樣(iCM)細胞，該等再程式化因子調節所關注之一或多種聚核苷酸或蛋白質的表現，諸如Achaete-scute同源物1 (ASCL1)、心肌素(MYOCD)、肌細胞特異性增強因子2C (MEF2C)及/或T-box轉錄因子5 (TBX5)。在一些實施例中，一或多種再程式化因子作為編碼所關注之一或多種聚核苷酸或蛋白質的聚核苷酸(例如RNA、mRNA或DNA聚核苷酸)提供。在一些實施例中，一或多種再程式化因子作為蛋白質提供。
在一些實施例中，再程式化因子為能夠增強所關注之一或多種聚核苷酸或蛋白質表現的微小RNA或微小RNA拮抗劑、siRNA或小分子。在一些實施例中，藉由微小RNA或微小RNA拮抗劑的表現來增強所關注之聚核苷酸或蛋白質的表現。舉例而言，可藉由微小RNA-302 (miR-302)的引入或藉由增強的miR-302表現來增強Oct多肽的內源表現。參見例如Hu等人,
Stem Cells31(2): 259-68 (2013)，該文獻以全文引用的方式併入本文中。因此，miRNA-302可為Oct多肽內源表現的誘導因子。miRNA-302可單獨引入或與編碼Oct多肽的核酸一起引入。在一些實施例中，適合的核酸基因產物為微小RNA。適合的微小RNA包括例如mir-1、mir-133、mir-208、mir-143、mir-145及mir-499。
在一些實施例中，本發明方法包含在小分子再程式化因子投與之前、期間或之後投與本發明之rAAV病毒粒子。在一些實施例中，小分子再程式化因子為選自由以下組成之群的小分子：SB431542、LDN-193189、地塞米松(dexamethasone)、LY364947、D4476、楊梅皮黃素(myricetin)、IWR1、XAV939、二十二碳六烯酸(DHA)、S-亞硝基-TV-乙醯基青黴胺(SNAP)、Hh-Agl.5、前列地爾(alprostadil)、克羅卡林(cromakalim)、MNITMT、A769662、視黃酸對羥基苯胺、十甲烯胺二溴化物、硝苯地平(nifedipine)、吡羅昔康(piroxicam)、桿菌素(bacitracin)、安曲南(aztreonam)、鹽酸駱駝蓬酚(harmalol hydrochloride)、醯胺-C2(A7)、Ph-C12 (CIO)、mCF3-C-7 (J5)、G856-7272 (A473)、5475707或其任何組合。
在一些實施例中，基因產物包含調節所關注之一或多種蛋白質表現的再程式化因子，該等蛋白質選自ASCL1、MYOCD、MEF2C及TBX5。在一些實施例中，基因產物包含一或多種再程式化因子，該等再程式化因子選自ASCL1、MYOCD、MEF2C、AND TBX5、CCNB1、CCND1、CDK1、CDK4、AURKB、OCT4、BAF60C、ESRRG、GATA4、GATA6、HAND2、IRX4、ISLL、MESP1、MESP2、NKX2.5、SRF、TBX20、ZFPM2及miR-133。
在一些實施例中，基因產物包含GATA4、MEF2C及TBX5 (亦即，GMT)。在一些實施例中，基因產物包含MYOCD、MEF2C及TBX5 (亦即，MyMT)。在一些實施例中，基因產物包含MYOCD、ASCL1、MEF2C及TBX5 (亦即，MyAMT)。在一些實施例中，基因產物包含MYOCD及ASCL1 (亦即，MyA)。在一些實施例中，基因產物包含GATA4、MEF2C、TBX5及MYOCD (亦即，4F)。在其他實施例中，基因產物包含GATA4、MEF2C、TBX5、ESSRG、MYOCD、ZFPM2及MESP1 (亦即，7F)。在一些實施例中，基因產物包含ASCL1、MEF2C、GATA4、TBX5、MYOCD、ESRRG及MESPL中之一或多者。
在一些實施例中，rAAV病毒粒子在活體外或活體內產生心肌細胞。心肌細胞或心臟肌細胞為構成心肌的肌肉細胞。各心肌細胞含有肌原纖維，其為肌節(肌肉細胞的收縮單元)的長鏈。心肌細胞顯示的條紋類似於骨骼肌細胞的條紋，但不同於多核骨骼細胞，其僅含有一個細胞核。心肌細胞的粒線體密度高，從而允許其快速地產生ATP，使得其對疲乏的抗性高。成熟心肌細胞可表現以下心臟標記物中之一或多者：α-輔肌動蛋白、MLC2v、MY20、cMHC、NKX2-5、GATA4、cTNT、cTNI、MEF2C、MLC2a或其任何組合。在一些實施例中，成熟心肌細胞表現NKX2-5、MEF2C或其組合。在一些實施例中，心臟祖細胞表現早期心臟祖細胞標記物，諸如GATA4、ISL1或其組合。
在一些實施例中，基因產物係聚核苷酸。在如下文所述的一些實施例中，基因產物為能夠結合至RNA導引之核酸內切酶的嚮導RNA。在一些實施例中，基因產物為抑制性核酸，其能夠減小例如心臟細胞中之mRNA及/或多肽基因產物的含量。舉例而言，在一些實施例中，聚核苷酸基因產物為干擾RNA，其能夠選擇性地使引起心臟疾病或病症之對偶基因所編碼的轉錄本不活化。舉例而言，對偶基因為心肌肌凝蛋白重鏈7 β (MYH7)對偶基因，其包含引起肥厚性心肌病的突變。其他實例包括例如干擾RNA，其選擇性地使引起肥厚性心肌病(HCM)、擴張型心肌病(DCM)或左心室緻密化不全(LVNC)之對偶基因所編碼的轉錄本不活化，其中該對偶基因為MYL3 (肌凝蛋白輕鏈3，鹼性，心室，骨骼緩慢型)、MYH7、TNNI3 (3型肌鈣蛋白I (心臟))、TNNT2 (2型肌鈣蛋白T (心臟))、TPM1 (原肌凝蛋白1 (α))或包含引起HCM之突變、引起DCM之突變或引起LVNC之突變的ACTCl對偶基因。關於引起心臟疾病之突變的實例，參見例如美國專利公開案第2016/0237430號。
在一些實施例中，基因產物係編碼多肽的RNA。在一些實施例中，基因產物係干擾RNA。在一些實施例中，基因產物係適體。在一些實施例中，基因產物係多肽。在一些實施例中，基因產物係治療多肽，例如提供臨床效益的多肽。在一些實施例中，基因產物係位點特異性核酸酶，其使基因功能達成位點特異性減弱。在一些實施例中，基因產物為RNA導引的核酸內切酶，其對目標核酸提供修飾。在一些實施例中，基因產物為：i) RNA導引的核酸內切酶，其對目標核酸提供修飾；以及ii)嚮導RNA，其包含結合至目標核酸中之目標序列的第一區段及結合至RNA導引之核酸內切酶的第二區段。在一些實施例中，基因產物為：i) RNA導引的核酸內切酶，其對目標核酸提供修飾；ii)第一嚮導RNA，其包含結合至目標核酸中之第一目標序列的第一區段及結合至RNA導引之核酸內切酶的第二區段；以及iii)第一嚮導RNA，其包含結合至目標核酸中之第二目標序列的第一區段及結合至RNA導引之核酸內切酶的第二區段。
編碼本發明之rAAV病毒粒子中之異源基因產物的核苷酸序列可操作地連接至啟動子。舉例而言，編碼本發明之rAAV病毒粒子中之異源基因產物的核苷酸序列可操作地連接至組成型啟動子、可調節啟動子或心臟細胞特異性啟動子。適合的組成型啟動子包括人類延伸因子1 α亞單元(EFlα)啟動子、β-肌動蛋白啟動子、α-肌動蛋白啟動子、β-葡萄糖醛酸苷酶啟動子、CAG啟動子、超核心啟動子及泛素啟動子。在一些實施例中，編碼本發明之rAAV病毒粒子中之異源基因產物的核苷酸序列可操作地連接至心臟特異性轉錄調節因子元件(TRE)，其中心臟特異性TRE包括啟動子及增強子。適合的心臟特異性TRE包括(但不限於)衍生自以下基因的TRE：肌凝蛋白輕鏈-2 (MLC-2)、a-肌凝蛋白重鏈(a-MHC)、結蛋白、AE3、心肌鈣蛋白C (cTnC)及心臟肌動蛋白。Franz等人(1997)
Cardiovasc. Res.35:560-566；Robbins等人(1995)
Ann. NY. Acad. Sci.752:492-505；Linn等人(1995)
Circ. Res.76:584-591；Parmacek等人(1994)
Mol. Cell. Biol.14: 1870-1885；Hunter等人(1993)
Hypertension22:608-617；及Sartorelli等人(1992)
Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89:4047-4051。亦參見Pacak等人(2008)
Genet Vaccines Ther.6:13。在一些實施例中，啟動子為α-MHC啟動子、MLC-2啟動子或cTnT啟動子。
編碼基因產物的聚核苷酸可操作地連接至啟動子及/或增強子以促進基因產物表現。視所用宿主/載體系統而定，rAAV病毒粒子中可使用多種適合轉錄及轉譯控制元件中之任一者，包括組成型及誘導型啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止子等(例如Bitter等人(1987)
Methods in Enzymology, 153:516-544)。
各聚核苷酸可使用各別的啟動子及/或增強子。在一些實施例中，單一開放閱讀框中的兩種或更多種聚核苷酸使用相同啟動子及/或增強子。採用遺傳元件之此組態的載體稱為「多順反子」。多順反子載體之一說明性實例包含可操作地連接至單一開放閱讀框的增強子及啟動子，該單一開放閱讀框包含藉由2A區域連接的兩個或更多個聚核苷酸，其中開放閱讀框的表現使得多種多肽以共轉譯方式產生。咸信2A區域經由密碼子跳讀來介導多種多肽序列的產生；然而，本發明亦關於多順反子載體，其利用轉譯後裂解自同一聚核苷酸產生所關注之兩種或更多種蛋白質。說明性2A序列、載體及相關方法提供於US20040265955A1中，該文獻其以引用的方式併入本文中。
適合真核啟動子(在真核細胞中發揮功能之啟動子)之非限制性實例包括CMV、CMV即刻早期啟動子、HSV胸苷激酶、早期及晚期SV40、來自逆轉錄病毒之長末端重複(LTR)及小鼠金屬硫蛋白-I。在一些實施例中，使用能夠賦予心臟特異性表現的啟動子。適合心臟特異性啟動子之非限制性實例包括結蛋白(Des)、α-肌凝蛋白重鏈(a-MHC)、肌凝蛋白輕鏈2 (MLC-2)、心肌鈣蛋白T (cTnT)及心肌鈣蛋白C (cTnC)。適合神經元特異性啟動子之非限制性實例包括突觸蛋白I (SYN)、鈣/調鈣素依賴性蛋白激酶II、微管蛋白αI、神經元特異性烯醇酶及血小板源生長因子β鏈啟動子及藉由將細胞巨大病毒增強子(E)與彼等神經元特異性啟動子融合而獲得的雜交啟動子。
適用於驅動再程式化因子表現之啟動子的實例包括(但不限於)逆轉錄病毒長末端重複(LTR)元件；組成型啟動子，諸如CMV、HSV1-TK、SV40、EF-la、β-肌動蛋白、磷酸甘油激酶(PGK)；誘導型啟動子，諸如含有Tet操縱子元件的彼等啟動子；心臟特異性啟動子，諸如結蛋白(DES)、α-肌凝蛋白重鏈(a-MHC)、肌凝蛋白輕鏈2 (MLC-2)、心肌鈣蛋白T (cTnT)及心肌鈣蛋白C (cTnC)；神經特異性啟動子，諸如巢蛋白、神經元核(NeuN)、微管締合蛋白2 (MAP2)、βIII微管蛋白、神經元特異性烯醇酶(NSE)、寡樹突神經膠細胞譜系(Oligl/2)及膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)；以及胰臟特異性啟動子，諸如Pax4、Nkx2.2、Ngn3、胰島素、升糖素及生長抑素。
在一些實施例中，聚核苷酸可操作地連接至細胞類型特異性轉錄調節因子元件(TRE)，其中TRE包括啟動子及增強子。適合TRE包括(但不限於)衍生自以下基因之TRE：肌凝蛋白輕鏈-2、a-肌凝蛋白重鏈、AE3、心肌鈣蛋白C及心肌動蛋白。Franz等人(1997)
Cardiovasc. Res.35:560-566；Robbins等人(1995)
Ann. N. Y. Acad. Sci.752:492-505；Linn等人(1995)
Circ. Res.76:584-591；Parmacek等人(1994)
Cell. Biol.14:1870-1885；Hunter等人(1993)
Hypertension22:608-617；及Sartorelli等人(1992)
PNAS USA89:4047-4051。
啟動子可為與基因或核酸區段天然締合的啟動子。類似地，對於RNA (例如微小RNA)而言，啟動子可為與微小RNA基因(例如miRNA-302基因)天然締合的啟動子。此類天然締合的啟動子可稱為「天然啟動子」且可藉由將位於編碼區段及/或外顯子上游之5'非編碼序列分離而獲得。類似地，增強子可為與核酸序列天然締合的增強子。然而，增強子可定位於該序列之下游或上游。
或者，藉由將編碼核酸區段置於重組或異源啟動子控制下將獲得某些優勢，重組或異源啟動子係指在其天然環境中通常與核酸不締合之啟動子。重組或異源增強子亦指在其天然環境中通常與核酸序列不締合的增強子。此類啟動子或增強子可包括其他基因之啟動子或增強子，及自任何其他原核、病毒或真核細胞分離之啟動子或增強子，及非「天然存在」之啟動子或增強子，亦即含有不同轉錄調節區之不同元件及/或改變表現之突變的啟動子或增強子。除以合成方式產生啟動子及增強子之核酸序列之外，可結合本文所揭示之組成物、使用重組選殖及/或核酸擴增技術(包括PCR™)產生序列(參見美國專利第4,683,202號、美國專利第5,928,906號，各文獻以引用的方式併入本文中)。
所用啟動子可為組成性的、誘導性的、發育特異性的、組織特異性的且/或在適於導引核酸區段之高量表現的條件下適用。舉例而言，啟動子可為組成型啟動子，諸如CMV啟動子、CMV細胞巨大病毒即刻早期啟動子、CAG啟動子、EF-1α啟動子、HSV1-TK啟動子、SV40啟動子、β-肌動蛋白啟動子、PGK啟動子或其組合。可使用的真核啟動子之非限制性實例包括(但不限於)組成型啟動子，例如病毒啟動子，諸如CMV、SV40及RSV啟動子，以及可調節啟動子，例如誘導性或可抑制啟動子，諸如tet啟動子、hsp70啟動子及藉由CRE調節之合成啟動子。在某些實施例中，細胞類型特異性啟動子係用於驅動特定細胞類型中之再程式化因子的表現。適用於本文所述方法之細胞類型特異性啟動子的實例包括(但不限於)He等人(2006),
Human Gene Therapy17:949-959中所述的合成巨噬細胞特異性啟動子；顆粒球及巨噬細胞特異性溶菌酶M啟動子(參見例如Faust等人(2000),
Blood96(2):719-726)；以及骨髓特異性CD11b啟動子(參見例如Dziennis等人(1995),
Blood85(2):319-329)。可使用之啟動子之其他實例包括人類EF1α延伸因子啟動子、CMV細胞巨大病毒即刻早期啟動子、CAG雞白蛋白啟動子、與本文所述之任一種病毒載體締合的病毒啟動子，或與本文所述之任一種啟動子(例如來自另一物種)同源的啟動子。可使用之原核啟動子之實例包括(但不限於) SP6、T7、T5、
tac、
bla、
trp、
gal、
lac或麥芽糖啟動子。
在一些實施例中，內部核糖體進入位點(IRES)元件可用於產生多基因或多順反子訊息。IRES元件能夠繞過5'-甲基化帽依賴性轉譯之核糖體掃描模型且開始在內部位點轉譯(Pelletier及Sonenberg,
Nature334(6180):320-325 (1988))。來自小核糖核酸病毒家族之兩種成員(脊髓灰質炎及腦心肌炎)的IRES元件已有描述(Pelletier及Sonenberg,
Nature334 (6180):320-325 (1988))，且來自哺乳動物訊息的IRES已有描述(Macejak及Samow,
Nature353:90-94 (1991))。IRES元件可連接至異源開放閱讀框。多個開放閱讀框架可一起轉錄，其各自藉由IRES分隔，從而產生多順反子訊息。藉助於IRES元件，各開放閱讀框為核糖體可及的，以達成高效轉譯。可使用轉錄單一訊息的單一啟動子/增強子高效表現多種基因(參見美國專利第5,925,565號及第5,935,819號，該等文獻以引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，核苷酸序列可操作地連接至聚腺苷酸化序列。適合之聚腺苷酸化序列包括牛生長激素polyA信號(bGHpolyA)及短poly A信號。視情況，本發明之rAAV載體包含土撥鼠轉錄後調節元件(WPRE)。在一些實施例中，編碼基因產物的聚核苷酸藉由包括所謂自裂解肽(例如P2A肽)的序列連接。
在一些實施例中，基因產物包含使基因功能達成位點特異性減弱的位點特異性核酸內切酶，例如其中核酸內切酶將與心臟疾病或病症有關的對偶基因敲除。舉例而言，在主要對偶基因編碼基因之缺陷複本(當為野生型時，為心臟結構蛋白及/或提供正常心臟功能)的情況下，位點特異性核酸內切酶可靶向缺乏型對偶基因且敲除缺乏型對偶基因。在一些實施例中，位點特異性核酸內切酶為RNA導引的核酸內切酶。
除敲除缺乏型對偶基因外，位點特異性核酸酶亦可用於刺激與供體DNA同源重組，該供體DNA編碼由缺乏型對偶基因編碼之蛋白質的功能複本。舉例而言，本發明rAAV病毒粒子可用於遞送位點特異性核酸內切酶以敲除缺乏型對偶基因(或其片段)之缺乏型對偶基因a功能複本、從而修復缺乏型對偶基因，藉此產生功能性心臟蛋白質(例如功能性肌鈣蛋白等)。在一些實施例中，本發明rAAV病毒粒子包含編碼位點特異性核酸內切酶的異源核苷酸序列；及編碼缺乏型對偶基因之功能複本的異源核苷酸序列，其中該功能複本編碼功能性心臟蛋白質。功能性心臟蛋白質包括例如肌鈣蛋白、氯離子通道及其類似物。
適於使用之位點特異性核酸內切酶包括例如鋅指核酸酶(ZFN)；巨核酸酶；及轉錄活化因子樣效應子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease；TALEN)，其中此類位點特異性核酸內切酶為非天然存在的且經修飾以靶向特定基因。此類位點特異性核酸酶可經工程改造以切割基因體內之特定位置，且非同源末端接合接著可修復斷裂，同時插入或缺失若干核苷酸。此類位點特異性核酸內切酶(亦稱為「INDEL」)接著將蛋白質自框架擲出且有效地敲除基因。參見例如美國專利公開案第2011/0301073號。適合的位點特異性核酸內切酶包括工程化巨核酸酶、再工程化歸巢核酸內切酶。適合核酸內切酶包括I-Tevl核酸酶。適合的巨核酸酶包括I-Scel (參見例如Bellaiche等人(1999)
Genetics152:1037)；以及I-Crel (參見例如Heath等人(1997)
Nature Sructural Biology4:468)。適合使用的位點特異性核酸內切酶包括CRISPRi系統及基於Cas9之SAM系統。
在一些實施例中，基因產物為RNA導引的核酸內切酶。在一些實施例中，基因產物包含RNA，該RNA包含編碼RNA導引之核酸內切酶的核苷酸序列。在一些實施例中，基因產物為嚮導RNA，例如單嚮導RNA。在一些實施例中，基因產物為：1)嚮導RNA；及2) RNA導引的核酸內切酶。嚮導RNA可包含：a)結合至RNA導引之核酸內切酶的蛋白質結合區域；及b)結合至目標核酸的區域。RNA導引的核酸內切酶在本文中亦稱為「基因體編輯核酸酶」。
適合基因體編輯核酸酶之實例為CRISPR/Cas核酸內切酶(例如2類CRISPR/Cas核酸內切酶，諸如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸內切酶)。適合的基因體編輯核酸酶為CRISPR/Cas核酸內切酶(例如2類CRISPR/Cas核酸內切酶，諸如II型、V型或VI型CRISPR/Cas核酸內切酶)。在一些實施例中，基因產物包含2類CRISPR/Cas核酸內切酶。在一些實施例中，基因產物包含2類II型CRISPR/Cas核酸內切酶(例如Cas9蛋白)。在一些實施例中，基因產物包含2類V型CRISPR/Cas核酸內切酶(例如Cpfl蛋白、C2cl蛋白或C2c3蛋白)。在一些實施例中，基因產物包含2類VI型CRISPR/Cas核酸內切酶(例如C2c2蛋白；亦稱為「Cas13a」蛋白)。在一些實施例中，基因產物包含CasX蛋白。在一些實施例中，基因產物包含CasY蛋白。
核酸、載體、細胞及 rAAV 病毒粒子的產生
在一些實施例中，本發明提供編碼本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白的核酸(諸如包含本文所述之一或多種修飾的AAV蛋白殼蛋白)。
在一些實施例中，本發明提供包含編碼本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白之核酸的載體或質體。在一些實施例中，該載體或質體進一步包含可操作地連接至編碼AAV蛋白殼蛋白之核酸的啟動子。在一些實施例中，啟動子為在待用於表現蛋白殼蛋白之細胞(例如生產細胞或宿主細胞)中具有活性的任何啟動子。在一些實施例中，啟動子為P40啟動子。在一些實施例中，啟動子為多角體蛋白啟動子。
在一些實施例中，包含編碼本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白之核酸的載體或質體進一步包含編碼複製(Rep)蛋白的核酸。在一些實施例中，Rep蛋白為來自與反向末端重複序列(ITR)相同之AAV血清型的Rep蛋白，該等反向末端重複序列用於側接轉殖基因(使用本文所述之任一種AAV蛋白殼蛋白封裝於病毒粒子中)。在一些實施例中，Rep蛋白為AAV2 Rep蛋白。在一些實施例中，Rep蛋白為AAV8 Rep蛋白。在一些實施例中，包含編碼本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白之核酸的載體或質體進一步包含編碼Rep蛋白的核酸。
在一些實施例中，本發明提供一種細胞，其包含編碼任何本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白的核酸。在一些實施例中，本發明提供一種包含載體或質體的細胞，該載體或質體包含編碼本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白的核酸。在一些實施例中，細胞進一步包含載體或質體，該載體或質體包含編碼Rep蛋白之核酸，其中該Rep蛋白可由與本文所述之AAV蛋白殼蛋白相同或不同的載體或質體表現。
在一些實施例中，本發明提供一種宿主細胞，其包含編碼本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白的核酸。在一些實施例中，本發明提供一種包含載體或質體的宿主細胞，該載體或質體包含編碼本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白的核酸。
在一些實施例中，包含編碼本文所述之任何AAV蛋白殼蛋白之核酸的宿主細胞係用於產生本文所述之rAAV病毒粒子(諸如包含如本文所述之經修飾AAV蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子)。在一些實施例中，將編碼任何AAV蛋白殼蛋白的核酸短暫轉染至細胞中。在一些實施例中，將編碼任何AAV蛋白殼蛋白的核酸穩定地插入細胞基因體中。
在一些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：HEK293、HEK293T、HeLa、Vero、MDCK、MRC-5、PER.C6、BHK21及CHO。在一些實施例中，宿主細胞為HEK293細胞。
在一些實施例中，宿主細胞為昆蟲細胞。在一些實施例中，宿主細胞為Sf9昆蟲細胞。在昆蟲細胞用作宿主細胞的一些實施例中，首先將本文所述之載體或質體引入重組桿狀病毒中且接著藉由桿狀病毒感染而被帶入昆蟲細胞中。
在一些實施例中，宿主細胞進一步用一或多種載體或質體轉染，該等載體或質體包含為了使攜載轉殖基因之載體複製及/或蛋白殼化而必需的輔助功能及/或病毒結構蛋白。
在一些實施例中，宿主細胞進一步用攜載轉殖基因(諸如本文所述之任何轉殖基因)的病毒載體轉染。在一些實施例中，轉殖基因側接反向末端重複序列(ITR)。在一些實施例中，ITR係與宿主細胞中所表現的Rep蛋白相同的血清型。在一些實施例中，ITR為AAV2 ITR。在一些實施例中，ITR為AAV8 ITR。此項技術中已知的Rep蛋白與ITR之任何組合可用於本文所述之細胞及方法中。
在一些實施例中，宿主細胞(例如哺乳動物或昆蟲細胞)進一步包含輔助質體表現腺病毒輔助基因。
在一些實施例中，宿主細胞包含穩定整合至細胞基因體中的一或多種封裝因子。在一些實施例中，宿主細胞包含一種核酸，該核酸編碼穩定整合至其基因體中之本文所述之任一種AAV蛋白殼蛋白。在一些實施例中，宿主細胞包含一種核酸，該核酸編碼穩定整合至其基因體中之Rep蛋白。在一些實施例中，宿主細胞包含穩定整合至其基因體中的腺病毒輔助基因。在一些實施例中，宿主細胞包含編碼本文所述之AAV蛋白殼蛋白的核酸、編碼Rep蛋白的核酸，及穩定整合至其基因體中的腺病毒輔助基因。
rAAV病毒粒子的產生方法在此項技術中為已知的。在一些實施例中，可使用如本文所述的宿主細胞產生rAAV病毒粒子。
在一些實施例中，在細胞中產生rAAV病毒粒子的方法包含：
i. 將編碼本文所述之任一種AAV蛋白殼蛋白的核酸、編碼Rep蛋白(諸如此項技術中已知或本文所述之任何AAV Rep蛋白)的核酸、腺病毒輔助基因(諸如此項技術中已知的任何腺病毒輔助基因)及/或包含由ITR側接之轉殖基因(例如其中轉殖基因表現治療蛋白)的轉殖基因卡匣引入(例如藉由暫時轉染或穩定整合技術)細胞中(例如經由DNA轉染、病毒感染及/或穩定整合)，其中所引入之核酸或基因中之每一者可操作地連接至在細胞中具有活性的啟動子； ii 在適於產生rAAV病毒粒子的條件(例如適於封裝蛋白表現及/或適於病毒封裝的條件)下培養細胞(例如使用懸浮細胞培養或貼附細胞培養)，及 iii. 收集所產生的rAAV病毒粒子(例如自培養基上清液及/或自細胞溶解之後的細胞溶解物收集)，及 iv. 視情況進一步純化rAAV病毒粒子，例如藉由密度梯度超速離心及/或基於層析之方法純化。
在一些實施例中，載體、啟動子、封裝因子、封裝系統、宿主細胞及/或rAAV病毒粒子產生方法為此項技術中已知之彼等者中的任一者。
使用方法
在一些實施例中，本發明提供鑑別AAV蛋白殼蛋白的方法，該等AAV蛋白殼蛋白使得rAAV病毒粒子在目標細胞中的轉導效率增加。方法包含：提供rAAV基因體包含編碼變異型AAV蛋白殼蛋白之cap聚核苷酸文庫的rAAV病毒粒子群；視情況使該群體與非目標細胞接觸足以容許非所要rAAV病毒粒子附著至非目標細胞的時間；使該群體與目標細胞接觸足以容許
cap聚核苷酸藉由rAAV病毒粒子轉導至目標細胞中的時間；及對來自目標細胞的
cap聚核苷酸定序，從而鑑別出使目標細胞中之轉導效率增加的AAV蛋白殼蛋白。在一些實施例中，方法進一步包含藉由使該群體與非目標細胞接觸足以容許rAAV病毒粒子附著至非目標細胞的時間來耗竭rAAV病毒粒子群。此類鑑別方法之非限制性實例提供於實例中。
本發明提供在活體外使用rAAV病毒粒子產生心肌細胞及/或心肌細胞樣細胞的方法。所選起始細胞用rAAV轉導且視情況在足以跨越譜系及/或分化界限而轉化起始細胞的條件下暴露於小分子再程式化因子(轉導之前、期間或之後)一段時間以形成心臟祖細胞及/或心肌細胞。在一些實施例中，起始細胞為纖維母細胞。在一些實施例中，起始細胞表現一或多種指示分化表型的標記物。起始細胞轉化成心臟祖細胞及心肌細胞的時間可變化。舉例而言，用所關注之一或多種聚核苷酸或蛋白質處理之後，可培育起始細胞，直至心臟或心肌細胞的細胞標記物得到表現為止。此類心臟或心肌細胞的細胞標記物可包括以下標記物中之任一者：α-GATA4、TNNT2、MYH6、RYR2、NKX2-5、MEF2C、ANP、輔肌動蛋白、MLC2v、MY20、cMHC、ISL1、cTNT、cTNI及MLC2a或其任何組合。在一些實施例中，所誘導的心肌細胞就一或多種神經元細胞標記物而言呈陰性。此類神經元細胞標記物可包括以下標記物中之任一者：DCX、TUBB3、MAP2及ENO2。
可繼續進行培育，直至起始細胞表現心臟祖細胞標記物為止。此類心臟祖細胞標記物包括GATA4、TNNT2、MYH6、RYR2或其組合。細胞用本文所述之組成物初始培育之後，心臟祖細胞標記物(諸如GATA4、TNNT2、MYH6、RYR2或其組合)可表現約8天，或約9天，或約10天，或約11天，或約12天，或約14天，或約15天，或約16天，或約17天，或約18天，或約19天，或約20天。細胞可進行進一步培育，直至晚期心臟祖細胞標記物(諸如NKX2-5、MEF2C或其組合)發生表現為止。
量測依據心肌細胞標記物量測再程式化效率。此類多能標記物包括(但不限於)心肌細胞標記蛋白及mRNA的表現、心肌細胞形態及電生理學表型。心肌細胞標記物之非限制性實例包括a-肌聚糖、心房利尿鈉肽(ANP)、骨形態生成蛋白4 (BMP4)、連結蛋白37、連結蛋白40、密鑰蛋白(crypto)、結蛋白、GATA4、GATA6、MEF2C、MYH6、肌凝蛋白重鏈、NKX2.5、TBX5及肌鈣蛋白T。
心肌細胞特有之各種標記物的表現可藉由習知生物化學或免疫化學方法(例如酶聯免疫吸附分析、免疫組織化學分析及其類似方法)偵測。或者，可評估編碼心肌細胞特異性標記物之核酸的表現。編碼心肌細胞特異性標記物的核酸於細胞中的表現可藉由逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)或雜交分析、過去常用於擴增、偵測及分析編碼任何標記蛋白之mRNA的分子生物學方法證實。編碼心肌細胞特異性標記物的核酸序列已知且可經由公用資料庫(諸如GenBank)獲得。因此，容易測定需用作引子或探針的標記物特異性序列。
心肌細胞展現心臟特有的一些電生理學特性。一種電學特徵係作用電位，其為持續時間短的事件，其中各心臟細胞內部與外部之間的電位差沿著一致的軌跡升高及下降。心肌細胞的另一種電生理學特徵為胞溶質自由Ca
2 +濃度的循環變化，稱為Ca
2 +暫態，其用於調節心肌細胞的收縮及鬆弛。可偵測且評價此等特徵，以評估細胞群是否已再程式化成心肌細胞。
本發明提供一種將基因產物遞送至心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)的方法。該等方法一般涉及用rAAV病毒粒子感染心臟細胞(例如纖維母細胞)，其中由存在於rAAV病毒粒子中之異源核酸編碼的基因產物產生於心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)中。基因產物遞送至心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)可實現對心臟疾病或病症的治療。基因產物遞送至心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)可使得心臟纖維母細胞產生經誘導的心肌細胞樣(iCM)細胞。基因產物遞送至心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)可實現對心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)之基因體的編輯。
在一些實施例中，感染或轉導心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)係在活體外進行。在一些實施例中，感染或轉導心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)係在活體外進行；且將經感染/轉導的心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)引入(例如輸入或植入)有需要之個體中，例如直接引入有需要之個體的心臟組織中。對於活體外轉導而言，遞送至細胞之rAAV病毒粒子的有效量為約10
5至約10
13個rAAV病毒粒子。一般技術者經由確立劑量反應曲線的常規試驗可容易確立其他有效劑量。
在一些實施例中，感染心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)係在活體內進行。舉例而言，在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子的有效量直接投與有需要之個體的心臟組織。「有效量」落入相對較寬的範圍，該範圍可經由實驗及/或臨床試驗確定。舉例而言，活體內注射(亦即，直接注射至心臟組織中)時，治療有效劑量大致為約10
6至約10
15個本發明rAAV病毒粒子，例如約10
5至10
12個本發明rAAV病毒粒子。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由心肌內注射、經由心包膜投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由血管遞送、經由冠狀動脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由上腔靜脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由周邊靜脈投與。
舉例而言，將本發明之rAAV病毒粒子的約10
4至約10
5個、約10
5至約10
6個、約10
6至約10
7個、約10
6至約10
7個、約10
7至約10
8個、約10
8至約10
9個、約10
9至約10
10個、約10
10至約10
11個、至約10
11個、約10
11至約10
12個、約10
12至約10
13個、約10
13至約10
14個、約10
14至約10
15個基因體複本，或超過10
15個基因體複本投與個體，例如直接投與個體的心臟組織，或經由另一種途徑投與。投與個體之rAAV病毒粒子的數目可用每公斤(kg)個體體重之病毒基因體(vg)表示。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子的有效量為約10
2vg/kg至10
4vg/kg、約10
4vg/kg至約10
6vg/kg、約10
6vg/kg至約10
8vg/kg、約10
8vg/kg至約10
10vg/kg、約10
10vg/kg至約10
12vg/kg、約10
12vg/kg至約10
14vg/kg、約10
14vg/kg至約10
16vg/kg、約10
16vg/kg至約10
18vg/kg，或超過10
18vg/kg。在一些實施例中，rAAV病毒粒子投與至少或不大於10
2vg/kg、10
3vg/kg、10
4vg/kg、10
5vg/kg、10
6vg/kg、10
8vg/kg、10
9vg/kg、10
10vg/kg、10
11vg/kg、10
12vg/kg、10
13vg/kg、2x10
13vg/kg、3x10
13vg/kg、4x10
13vg/kg、5x10
13vg/kg、6x10
13vg/kg、7x10
13vg/kg、8x10
13vg/kg、9x10
13vg/kg、10
14vg/kg、2x10
14vg/kg、3x10
14vg/kg、4x10
14vg/kg、5x10
14vg/kg、6x10
14vg/kg、7x10
14vg/kg、8x10
14vg/kg、9x10
14vg/kg、10
15vg/kg、10
16vg/kg、10
17vg/kg或10
18vg/kg (或此等值之間之任何範圍的量)。在一些實施例中，rAAV病毒粒子係以2x10
13vg/kg投與。在一些實施例中，rAAV病毒粒子係以1.43x10
13vg/kg投與。在一些實施例中，rAAV病毒粒子係以1.2x10
14vg/kg投與。
在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子的有效量局部投與心臟。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由心肌內注射、經由心包膜投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由血管遞送、經由冠狀動脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送(例如靜脈內)投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由上腔靜脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由周邊靜脈投與。
在一些實施例中，超過一次投與(例如兩次、三次、四次或更多次投與)可用以達成所需的基因表現量。在一些實施例中，超過一次投與係依各種時間間隔投與，例如每日一次、每週一次、每月兩次、每月一次、每3個月一次、每6個月一次、每年一次等。在一些實施例中，多次投與係在1個月至2個月、2個月至4個月、4個月至8個月、8個月至12個月、1年至2年、2年至5年、或超過5年的時段內投與。
本發明提供一種使心臟纖維母細胞再程式化以產生經誘導之心肌細胞樣細胞(iCM)的方法。該方法一般涉及用本發明之rAAV病毒粒子感染心臟纖維母細胞，其中該rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼一或多種再程式化因子的核苷酸序列。
心肌細胞特有之各種標記物的表現係藉由習知生物化學或免疫化學方法(例如酶聯免疫吸附分析；免疫組織化學分析；及其類似方法)偵測。或者，可評估編碼心肌細胞特異性標記物之核酸的表現。編碼心肌細胞特異性標記物的核酸於細胞中的表現可藉由逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)或雜交分析、過去常用於擴增、偵測及分析編碼任何標記蛋白之mRNA的分子生物學方法證實。編碼心肌細胞特異性標記物的核酸序列已知且可經由公用資料庫(諸如GenBank)獲得；從而，容易測定需用作引子或探針的標記物特異性序列。
所誘導之心肌細胞亦可展現自發收縮。所誘導的心肌細胞是否展現自發收縮可利用標準電生理學方法(例如膜片箝)確定。
在一些實施例中，所誘導的心肌細胞可展現自發的Ca
2 +振盪。Ca
2 +振盪可利用標準方法偵測，例如利用多種鈣敏性染料(細胞內Ca
2 +離子偵測染料)中之任一者，包括(但不限於) fura-2、bis-fura 2、indo-1、Quin-2、Quin-2 AM、Benzothiaza-1、Benzothiaza-2、indo-5F、Fura-FF、BTC、Mag-Fura-2、Mag-Fura-5、Mag-Indo-1、fluo-3、rhod-2、rhod-3、fura-4F、fura-5F、fura-6F、fluo-4、fluo-5F、fluo-5N、俄勒岡綠(Oregon Green) 488 BAPTA、鈣綠(Calcium Green)、鈣黃綠素(Calcein)、Fura-C18、鈣綠-C18、鈣橙(Calcium Orange)、鈣深紅(Calcium Crimson)、鈣綠-5N、鎂綠、俄勒岡綠488 BAPTA-1、俄勒岡綠488 BAPTA-2、X-rhod-1、Fura Red、Rhod-5F、Rhod-5N、X-Rhod-5N、Mag-Rhod-2、Mag-X-Rhod-1、Fluo-5N、Fluo-5F、Fluo-4FF、Mag-Fluo-4、水母素、聚葡萄糖結合物或此等染料中之任一者的任何其他衍生物，及其他染料(參見例如Molecular Probes, Eugene之目錄或網際網路站點，另外參見Nuccitelli編, Methods in Cell Biology, 第40卷: A Practical Guide to the Study of Calcium in Living Cells, Academic Press (1994); Lambert編, Calcium Signaling Protocols (Methods in Molecular Biology第114卷), Humana Press (1999)；W. T. Mason編, Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. A Practical Guide to Technology for Quantitative Real-Time Analysis, 第二版, Academic Press (1999)；Calcium Signaling Protocols (Methods in Molecular Biology), 2005, D.G. Lamber編, Humana Press)。
在一些實施例中，iCM係活體外產生；且將iCM引入個體中，例如將iCM植入有需要之個體的心臟組織中。本發明之方法可包含在活體外感染心臟纖維母細胞群以產生iCM群體；且將iCM群體植入有需要之個體的心臟組織中。
在一些實施例中，iCM係活體內產生。舉例而言，在一些實施例中，將包含異源核酸的本發明rAAV病毒粒子投與個體，該異源核酸包含編碼一或多種再編程因子的核苷酸序列。在一些實施例中，rAAV病毒粒子直接投與有需要之個體的心臟組織。在一些實施例中，將包含異源核酸之本發明rAAV病毒粒子的約10
6至約10
5、約10
5至約10
9、約10
9至約10
10、約10
10至約10
11、約10
11至約10
12、約10
12至約10
13、約10
13至約10
14、約10
14至約10
15個基因體複本或超過10
15個基因體複本投與個體，例如直接投與個體之心臟組織或經由另一種投藥途徑投與，該異源核酸包含編碼一或多種再程式化因子的核苷酸序列。投與個體之rAAV病毒粒子的數目可用每公斤(kg)個體體重之病毒基因體(vg)表示。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子的有效量為約10
2vg/kg至10
4vg/kg、約10
4vg/kg至約10
6vg/kg、約10
6vg/kg至約10
8vg/kg、約10
8vg/kg至約10
10vg/kg、約10
10vg/kg至約10
12vg/kg、約10
12vg/kg至約10
14vg/kg、約10
14vg/kg至約10
14vg/kg、約10
14vg/kg至約10
16vg/kg，或超過10
16vg/kg。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由心肌內注射、經由心包膜投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由血管遞送、經由冠狀動脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由上腔靜脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由周邊靜脈投與。
本發明提供一種修飾(「編輯」)心臟細胞之基因體的方法。本發明提供一種修飾(「編輯」)心臟纖維母細胞之基因體的方法。本發明提供一種修飾(「編輯」)心肌細胞之基因體的方法。方法一般涉及用本發明之rAAV病毒粒子感染心臟細胞(例如心臟纖維母細胞或心肌細胞)，其中rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼基因體編輯核酸內切酶的核苷酸序列。在一些實施例中，方法包含用本發明之rAAV病毒粒子感染心臟纖維母細胞或心肌細胞，其中rAAV病毒粒子包含異源核酸，該異源核酸包含編碼RNA導引之基因體編輯核酸內切酶的核苷酸序列。在一些實施例中，方法包含用本發明之rAAV病毒粒子感染心臟纖維母細胞或心肌細胞，其中rAAV病毒粒子包含含有核苷酸序列的異源核酸，該核苷酸序列編碼：i) RNA導引的基因體編輯核酸內切酶；及ii)一或多種嚮導RNA。在一些實施例中，方法包含用本發明之rAAV病毒粒子感染心臟纖維母細胞或心肌細胞，其中rAAV病毒粒子包含含有核苷酸序列的異源核酸，該核苷酸序列編碼：i) RNA導引的基因體編輯核酸內切酶；ii)嚮導RNA；及iii)供體模板DNA。適合的RNA導引之基因體編輯核酸內切酶描述如上。
在一些實施例中，感染心臟細胞(例如心臟纖維母細胞；心肌細胞)係在活體外進行。在一些實施例中，感染心臟細胞(例如心臟纖維母細胞；心肌細胞)係在活體外進行；且將經感染的心臟細胞(例如心臟纖維母細胞)引入(例如植入)有需要之個體中，例如直接引入有需要之個體的心臟組織中。對於活體外轉導而言，遞送至細胞之rAAV病毒粒子的有效量大致為約10
s至約10
13個rAAV病毒粒子。一般技術者經由確立劑量反應曲線的常規試驗可容易確立其他有效劑量。
在一些實施例中，感染心臟細胞(例如心臟纖維母細胞；心肌細胞)係在活體內進行。舉例而言，在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子的有效量直接投與有需要之個體的心臟組織。「有效量」落入相對較寬的範圍，該範圍可經由實驗及/或臨床試驗確定。舉例而言，活體內注射(亦即，直接注射至心臟組織中)時，治療有效劑量大致為約10
6至約10
15個本發明rAAV病毒粒子，例如約10
11至10
12個本發明rAAV病毒粒子。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由心肌內注射、經由心包膜投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由血管遞送、經由冠狀動脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由上腔靜脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由周邊靜脈投與。
舉例而言，將本發明之rAAV病毒粒子的約10
6至約10
7、約10
7至約10
8、約10
8至約10
9、約10
9至約10
10、約10
10至約10
11、約l0
11至約10
12、約10
12至約10
13、約10
13至約10
14、約10
14至約10
15個基因體複本或超過10
15個基因體複本投與個體，例如直接投與個體的心臟組織。投與個體之rAAV病毒粒子的數目可用每公斤(kg)個體體重之病毒基因體(vg)表示。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子的有效量為約10
2vg/kg至10
4vg/kg、約10
4vg/kg至約10
6vg/kg、約10
6vg/kg至約10
8vg/kg、約10
8vg/kg至約10
10vg/kg、約10
10vg/kg至約10
12vg/kg、約10
12vg/kg至約10
14vg/kg、約10
14vg/kg至約10
16vg/kg、約10
16vg/kg至約10
18vg/kg，或超過10
18vg/kg。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由心肌內注射、經由心包膜投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由血管遞送、經由冠狀動脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由上腔靜脈投與。在一些實施例中，有效量的本發明rAAV病毒粒子經由全身遞送、經由周邊靜脈投與。
在一些實施例中，基因體編輯包含同源定向修復(HDR)。在一些實施例中，HDR校正心臟纖維母細胞或心肌細胞中之內源目標核酸的缺陷，其中該缺陷與心臟纖維母細胞或心肌細胞之結構及/或功能缺陷有關或導致心臟纖維母細胞或心肌細胞之結構及/或功能缺陷；或校正心臟纖維母細胞或心肌細胞之組分的缺陷。
在一些實施例中，基因體編輯包含非同源末端接合(NHEJ)。在一些實施例中，NHEJ將心臟纖維母細胞或心肌細胞中之內源目標核酸的缺陷刪除，其中該缺陷與心臟纖維母細胞或心肌細胞之結構及/或功能缺陷有關或導致心臟纖維母細胞或心肌細胞之結構及/或功能缺陷；或將心臟纖維母細胞或心肌細胞之組分的缺陷刪除。
用於編輯心臟細胞基因體的本發明方法可用於校正導致心臟疾病或病症之多種基因缺陷中的任一者。所關注之突變包括以下基因中之一或多者中的突變：心肌鈣蛋白T (TNNT2)；肌凝蛋白重鏈(MYH7)；原肌凝蛋白1 (TPM1)；肌凝蛋白結合蛋白C (MYBPC3)；5'-AMP活化蛋白激酶亞單元γ-2 (PRKAG2)；3型肌鈣蛋白I (TNNI3)；肌聯蛋白(TTN)；肌凝蛋白輕鏈2 (MYL2)；肌動蛋白，α心肌1 (ACTC1)；鉀電壓設門通道，KQT樣亞家族成員1 (KCNQ1)；斑菲素蛋白2 (PKP2)；肌細胞增強因子2c (MEF2C)；以及心臟LIM蛋白(CSRP3)。所關注的特定突變包括但不限於MYH7 R663H突變；TNNT2 R173W；PKP2 2013delC突變；PKP2 Q617X突變；及KCNQ1 G269S錯義突變。所關注的突變包括以下基因中之一或多者中的突變：MYH6、ACTN2、SERCA2、GATA4、TBX5、MYOCD、NKX2-5、NOTCH1、MEF2C、HAND2及HAND1。在一些實施例中，所關注的突變包括以下基因中的突變：MEF2C、TBX5及MYOCD。可用本發明之方法治療的心臟疾病及病症包括冠心病、心肌病、心內膜炎、先天性心血管缺陷及充血性心臟衰竭。可用本發明之方法治療的心臟疾病及病症包括肥厚性心肌病；心臟瓣膜病；心肌梗塞；充血性心臟衰竭；長QT症候群；心房心律不齊；心室心律不整；舒張性心臟衰竭；收縮性心臟衰竭；心臟瓣膜疾病；心臟瓣膜鈣化；左心室緻密化不全；心室中隔缺陷；及局部缺血。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法。在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞之方法，其包含使心臟細胞與本文所述之rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子轉導心臟細胞。在一些實施例中，心臟細胞係心肌細胞。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白為本文所述之任何蛋白殼蛋白。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，其包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：
位置584之胺基酸插入，包含天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者；
位置585之胺基酸插入，包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者；
位置586之胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸中之一或多者。
位置585與586之間的胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)及甲硫胺酸(M)中之一或兩者(例如WM或HY之插入)；
位置587之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者；
位置588之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者；
位置589之胺基酸插入，包含甘胺酸(G)及麩醯胺酸(Q)中之一或多者；
一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H；及/或
一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582L、T582E、T582A、T582F、T582R、T582P、N583V、N583T、H584R、H584Q、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584T、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585C、Q585V、Q585L、Q585N、Q585S、Q585P、Q585A、Q585M、Q585E、Q585Y、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586T、S586G、S586K、S586M、S586N、S586I、S586Q、S586L、S586P、S586F、S586R、A587F、A587S、A587T、A587N、A587L、A587P、A587V、A587K、A587I、A587R、A587H、A587G、A587M、A587D、A587W、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588G、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588Y、Q588H、Q588M、Q588K、Q588D、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y、Q590L、A591I、G594Q及G594D。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：胺基酸取代Q585E、S586N、A587T、Q588V、A589S、Q590I及N452K。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：胺基酸取代S586T、A587L、Q588F、A589N、Q590S及N452K。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L、Q590G及N452K。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：胺基酸取代Q585G、A587I、Q588L、A589T、Q590H及N452K。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：胺基酸取代Q585M、S586M、A587T、Q588T、A589A及Q590R。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：胺基酸取代Q585C、A587T、Q588S、A589I及Q590R。
在一些實施例中，本發明提供一種轉導心臟細胞的方法，包含使心臟細胞與rAAV病毒粒子接觸，其中rAAV病毒粒子包含蛋白殼蛋白，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L及Q590G。
在一些實施例中，本發明提供將一或多種基因產物遞送至心臟細胞之方法。在一些實施例中，將一或多種基因產物遞送至心臟細胞的方法包含使心臟細胞與本文所述之rAAV病毒粒子接觸。在一些實施例中，心臟細胞係心肌細胞。
在一些實施例中，本發明提供將一或多種基因產物經由包含蛋白殼蛋白之rAAV病毒粒子遞送至心臟細胞的方法，其中該蛋白殼蛋白為本文所述之任何蛋白殼蛋白。
在一些實施例中，本發明提供將一或多種基因產物經由包含蛋白殼蛋白之rAAV病毒粒子遞送至心臟細胞的方法，其中蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，蛋白殼蛋白包含：
(a)胺基酸取代Q585E、S586N、A587T、Q588V、A589S、Q590I及N452K；
(b)胺基酸取代S586T、A587L、Q588F、A589N、Q590S及N452K；
(c)胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L、Q590G及N452K；
(d)胺基酸取代Q585G、A587I、Q588L、A589T、Q590H及N452K；
(e)胺基酸取代Q585M、S586M、A587T、Q588T、A589A及Q590R；
(f)胺基酸取代Q585C、A587T、Q588S、A589I及Q590R，或
(g)胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L及Q590G。 治療方法
本發明提供一種治療有需要之個體之心臟病變的方法，包含將治療有效量之包含rAAV病毒粒子的醫藥組成物投與該個體，其中rAAV病毒粒子轉導心臟組織。
需要使用本發明之組成物及方法治療的個體包括(但不限於)患有先天性心臟缺陷的個體、罹患肌肉退化疾病的個體、罹患導致心臟組織局部缺血之病狀的個體(例如患有冠狀動脈疾病的個體)及其類似者。在一些實例中，方法適用於治療肌肉退化疾病或病狀(例如家族性心肌病、擴張型心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病，或冠狀動脈疾病伴所引起的缺血性心肌症)。在一些實例中，本發明方法適用於治療患有心臟或心血管疾病或病症之個體，例如心血管疾病、動脈瘤、絞痛症、心律不齊、動脈粥樣硬化、腦血管事故(中風)、腦血管疾病、先天性心臟病、充血性心臟衰竭、心肌炎、冠狀動脈瓣膜疾病、動脈擴張疾病、心舒功能障礙、心內膜炎、高血壓(high blood pressure)(高血壓(hypertension))、心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、冠狀動脈疾病伴所引起的缺血性心肌症、二尖瓣脫垂(mitral valve prolapse)、心肌梗塞(心臟病發作)或靜脈血管栓塞。
適於使用本發明之組成物、細胞及方法治療的個體包括個體(例如哺乳動物個體，諸如人類、非人類靈長類動物、馴養哺乳動物、實驗性非人類哺乳動物個體，諸如小鼠、大鼠等)，其患有心臟病狀，包括但不限於引起心臟組織局部缺血的病狀(例如患有冠狀動脈疾病的個體)及其類似病狀。
在一些實例中，適於治療的個體罹患心臟或心血管疾病或病狀，例如心血管疾病、動脈瘤、絞痛症、心律不齊、動脈粥樣硬化、腦血管事故(中風)、腦血管疾病、先天性心臟病、充血性心臟衰竭、心肌炎、冠狀動脈瓣膜疾病、動脈擴張疾病、心舒功能障礙、心內膜炎、高血壓(high blood pressure)(高血壓(hypertension))、心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病、冠狀動脈疾病伴所引起的缺血性心肌症、二尖瓣脫垂、心肌梗塞(心臟病發作)或靜脈血管栓塞。在一些實例中，適於用本發明方法治療的個體包括患有肌肉退化疾病的個體，例如家族性心肌病、擴張型心肌病、肥厚性心肌病、限制性心肌病，或冠狀動脈疾病伴所引起的缺血性心肌症。
舉例而言，心臟病變可選自由以下組成之群：充血性心臟衰竭、心肌梗塞、心臟局部缺血、心肌炎及心律不齊。在一些實施例中，個體患有糖尿病。在一些實施例中，個體無糖尿病。在一些實施例中，個體罹患糖尿病性心肌病。
治療時，本發明之rAAV病毒粒子及/或其醫藥組成物可局部或全身性投與。rAAV病毒粒子可藉由注射、導管、可植入裝置或類似物引入。rAAV病毒粒子可於生理學上可接受之對細胞無有害影響的任何賦形劑或載劑中投與。舉例而言，本發明之rAAV病毒粒子及/或其醫藥組成物可靜脈內投與或經由心內途徑(例如心包膜或心肌內)投與。本發明之rAAV病毒粒子及/或其醫藥組成物投與個體(尤其是人類個體)的方法包括注射或輸注醫藥組成物(例如包含rAAV病毒粒子的組成物)。注射可包括直接肌肉注射且輸注可包括血管內輸注。rAAV病毒粒子或醫藥組成物可插入遞送裝置中，藉由注射至個體來促進引入。此類遞送裝置包括用於將細胞及流體注射至接受者個體之身體內的管，例如導管。管另外可包括針，例如注射器，本發明細胞可經由其在所需位置引入個體中。
在一些實施例中，藉由皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內或心內注射或藉由心內導管插入術來投與rAAV病毒粒子。在一些實施例中，藉由直接心肌內注射或經血管投與來投與rAAV病毒粒子。在一些實施例中，藉由直接心肌內注射、順行冠狀動脈內注射、逆行注射、經心內膜心肌注射，或心臟分子手術並再循環遞送(MCARD)來投與rAAV病毒粒子。
rAAV病毒粒子可以不同形式插入此類遞送裝置(例如注射器)中。rAAV病毒粒子可以醫藥組成物形式供應。此類組成物可包括針對人類投與而在充分無菌條件下製備的等張賦形劑。關於醫藥調配物的一般原理，讀者參考
Cell Therapy: Stem Cell Transplantation,
Gene Therapy,
and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn及W. Sheridan編, Cambridge University Press, 1996; 及
Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister及P. Law, Churchill Livingstone, 2000。賦形劑及組成物中之任何伴隨成分的選擇可經調適以最佳化投藥途徑及/或所用裝置。
重組AAV可局部或全身性投與。藉由選擇本發明之適當蛋白殼蛋白，可對重組AAV進行工程改造以靶向特定細胞類型。為了確定AAV病毒粒子組成物之各種治療投藥方案及劑量的適合性，首先可在適合的動物模型中測試rAAV病毒粒子。在一個層面上評估重組AAV活體內感染目標細胞的能力。亦可評估重組AAV以確定其是否遷移至目標組織、其是否誘導宿主發生免疫反應，或確定rAAV病毒粒子投與的適當次數或劑量。視待治療之疾病而定，可能需要或不需要重組AAV產生免疫反應。一般而言，若需要重複投與病毒粒子，則病毒粒子無免疫原性為有利的。出於測試目的，可將rAAV病毒粒子組成物投與免疫缺乏動物(諸如裸小鼠，或因化學或輻射而導致免疫缺乏的動物)。在感染期之後，可收集目標組織或細胞且評估以確定組織或細胞是否已感染且是否已誘導目標組織或細胞出現所需表型(例如誘導的心肌細胞)。
重組AAV病毒粒子可藉由各種途徑投與，包括(但不限於)直接注射至心臟中或心臟導管插入術。或者，rAAV病毒粒子可全身性投與，諸如藉由靜脈內輸注。當使用直接注射時，其可藉由開心手術或藉由最低限度侵入性手術執行。在一些實施例中，重組病毒藉由注射或輸注遞送至心包空間。注射或輸注的重組病毒可藉由多種方法追蹤。舉例而言，經可偵測標記(諸如綠色螢光蛋白或β-半乳糖苷酶)標記或表現其的重組AAV可容易偵測。重組AAV可經工程改造以引起目標細胞表現標記蛋白，諸如表面表現之蛋白質或螢光蛋白。或者，重組AAV感染目標細胞可根據細胞標記物的表現來偵測，用於測試的動物不表現該細胞標記物(例如當細胞注射至實驗動物時的人類特異性抗原)。目標細胞的存在及表型可藉由以下評估：螢光顯微法(例如根據綠色螢光蛋白或β-半乳糖苷酶)、免疫組織化學(例如使用針對人類抗原的抗體)、ELISA (使用針對人類抗原的抗體)，或使用引起擴增的引子及雜交條件進行RT-PCR分析，該擴增對於指示心臟表型之RNA而言具特異性。
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之心臟病變的方法，其包含投與治療有效量的本文所述之rAAV病毒粒子。
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之心臟病變的方法，其包含投與治療有效量之含有蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，其中蛋白殼蛋白為本文所述之任何蛋白殼蛋白。
在一些實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體之心臟病變的方法，其包含投與治療有效量之含有蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，其中該蛋白殼蛋白與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%多肽序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含：
(a)胺基酸取代Q585E、S586N、A587T、Q588V、A589S、Q590I及N452K；
(b)胺基酸取代S586T、A587L、Q588F、A589N、Q590S及N452K；
(c)胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L、Q590G及N452K；
(d)胺基酸取代Q585G、A587I、Q588L、A589T、Q590H及N452K；
(e)胺基酸取代Q585M、S586M、A587T、Q588T、A589A及Q590R；
(f)胺基酸取代Q585C、A587T、Q588S、A589I及Q590R，或
(g)胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L及Q590G。 醫藥組成物
本發明提供包含本發明之rAAV病毒粒子的醫藥組成物。醫藥組成物可包括醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑及緩衝劑中之一或多者。在一些實施例中，醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或緩衝劑適用於人類。此類賦形劑、載劑、稀釋劑及緩衝劑包括可在無異常毒性的情況下投與的任何醫藥劑。醫藥學上可接受之賦形劑包括但不限於液體，諸如水、生理鹽水、甘油及乙醇。其中可包括醫藥學上可接受之鹽，例如無機酸鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及其類似鹽；及有機酸鹽，諸如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽及其類似鹽。另外，此類媒劑中可存在助劑，諸如pH緩衝物質。醫藥學上可接受之多種賦形劑在此項技術中已知且在本文中不一定詳細論述。醫藥學上可接受之賦形劑已充分描述於多個出版物中，包括例如A. Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel等人編，第7版, Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H. Kibbe等人編，第3版, Amer. Pharmaceutical Assoc。
為了製備組成物，產生rAAV病毒粒子且視需要或必要時加以純化。可將rAAV與醫藥學上可接受之載劑混合或懸浮於醫藥學上可接受之載劑中。此等rAAV可調節至適當濃度且視情況與其他藥劑組合。單位劑型中所包括之rAAV病毒粒子及/或其他藥劑的濃度可廣泛變化。投與的劑量及次數可由熟習此項技術者最佳化。舉例而言，可投與約10
2至10
10個載體基因體(vg)。在一些實施例中，劑量為至少約10
2vg、約10
3vg、約10
4vg、約10
5vg、約10
6vg、約10
7vg、約10
8vg、約10
9vg、約10
10vg或更多個載體基因體。化合物之日劑量亦可變化。此類日劑量的範圍可為例如至少約10
2vg/天、約10
3vg/天、約10
4vg/天至約10
5vg/天、約10
6vg/天、約10
7vg/天、約10
8vg/天、約10
9vg/天、約10
10vg/天或更多個載體基因體/天。
在某些實施例中，治療方法係藉由投與一或多種消炎劑(例如消炎類固醇或非類固醇消炎藥(NSAID))來增強。
用於本發明的消炎類固醇包括皮質類固醇，尤其是具有糖皮質激素活性的彼等物，例如地塞米松(dexamethasone)及普賴蘇(prednisone)。用於本發明之非類固醇消炎藥(NSAID)的作用一般為阻斷引起炎症及疼痛的前列腺素、環加氧酶-1 (COX-1)及/或環加氧酶-2 (COX-2)產生。傳統NSAID起著阻斷COX-1與COX-2的作用。COX-2選擇性抑制劑僅阻斷COX-2酶。在某些實施例中，NSAID為COX-2選擇性抑制劑，例如塞內昔布(celecoxib)(Celebrex
®)、羅非昔布(rofecoxib)(Vioxx)及伐地昔布(valdecoxib)(B extra)。在某些實施例中，消炎劑為NSAID前列腺素抑制劑，例如吡羅昔康(Piroxicam)。
用於治療之rAAV病毒粒子的量不僅將隨著所選擇之特定載劑而變化，而且隨著投與途徑、所治療之病狀之性質及患者之年齡及狀況而變化。最終，巡診的健康照護提供者可確定適當劑量。可依各化合物於單一單位劑型中之適當比率來調配醫藥組成物，以便在細胞存在或不存在下投與。可分別提供細胞或載體且與化合物組成物之液態溶液混合或分開投與。
重組AAV可經調配以便非經腸投與(例如注射，例如推注注射或連續輸注)且可以單位劑型提供於安瓿、預填充注射器、小體積輸注容器或額外存在防腐劑之多劑量容器中。醫藥組成物可採取油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。適合的載劑包括生理鹽水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水及此項技術中常用之其他物質。
組成物亦可含有其他成分，諸如適用於治療心臟疾病、病狀及損傷之藥劑，諸如抗凝血劑(例如達肝素(dalteparin)(法安明(fragmin))、達那肝素(danaparoid)(奧甲南(orgaran))、依諾肝素(enoxaparin)(洛維諾西(lovenox))、肝素、亭紮肝素(tinzaparin)(茵諾普(innohep))及/或華法林(warfarin)(可邁丁(coumadin)))；抗血小板劑(例如阿司匹林(aspirin)、噻氯匹定(ticlopidine)、克羅匹多(clopidogrel)或雙吡大莫(dipyridamole))；血管收縮素轉化酶抑制劑(例如貝那普利(Benazepril)(洛汀新(Lotensin))、卡托普利(Captopril)(開博通(Capoten))、依那普利(Enalapril)(Vasotec)、福辛普利(Fosinopril) (蒙諾普利(Monopril))、賴諾普利(Lisinopril)(Prinivil、Zestril)、莫西普利(Moexipril)(Univasc)、培哚普利(Perindopril)(Aceon)、喹那普利(Quinapril)(Accupril)、雷米普利(Ramipril)(Altace)及/或群多普利(Trandolapril)(Mavik))；血管收縮素II受體阻斷劑(例如坎地沙坦(Candesartan)(Atacand)、依普羅沙坦(Eprosartan)(Teveten)、依貝沙坦(Irbesartan)(Avapro)、洛沙坦(Losartan)(Cozaar)、替米沙坦(Telmisartan)(Micardis)及/或纈沙坦(Valsartan)(Diovan))；β阻斷劑(例如醋丁洛爾(Acebutolol)(Sectral)、阿替洛爾(Atenolol)(Tenormin)、倍他洛爾(Betaxolol)(Kerlone)、比索洛爾/氫氯噻嗪(Bisoprolol/hydrochlorothiazide)(Ziac)、比索洛爾(Bisoprolol)(Zebeta)、卡替洛爾(Carteolol)(Cartrol)、美托洛爾(Metoprolol)(Lopressor；Toprol XL)、納多洛爾(Nadolol)(Corgard)、普萘洛爾(Propranolol)(Inderal)、索他洛爾(Sotalol)(Betapace)及/或噻嗎洛爾(Timolol)(Blocadren))；鈣離子通道阻斷劑(例如胺氯地平(Amlodipine)(Norvasc；Lotrel)、苄普地爾(Bepridil)(Vascor)、地爾硫卓(Diltiazem)(Cardizem；Tiazac)、非洛地平(Felodipine)(Plendil)、硝苯地平(Nifedipine)(Adalat；Procardia)、尼莫地平(Nimodipine)(Nimotop)、尼索地平(Nisoldipine)(Sular)、維拉帕米(Verapamil)(Calan；Isoptin；Verelan)；利尿劑(例如胺氯吡脒(Amiloride)(Midamor)、布美他尼(Bumetanide)(Bumex)、氯噻嗪(Chlorothiazide)(Diuril)、氯噻酮(Chlorthalidone)(Hygroton)、呋喃苯胺酸(Furosemide)(Lasix)、氫氯噻嗪(Hydro-chlorothiazide)(Esidrix；Hydrodiuril)、吲達帕胺(Indapamide)(Lozol)及/或螺內酯(Spironolactone)(Aldactone))；血管擴張劑(例如二硝酸異山梨醇(Isordil)、奈西立肽(Nesiritide)(Natrecor)、聯胺肼(Hydralazine)(Apresoline)、硝酸鹽及/或敏樂定(Minoxidil))；抑制素(statins)；菸鹼酸、吉非羅齊(gemfibrozil)、氯貝特(clofibrate)、地高辛(Digoxin)、洋地黃毒苷(Digitoxin)、拉諾辛(Lanoxin)或其任何組合。
亦可包括其他藥劑，諸如抗細菌劑、抗微生物劑、抗病毒劑、生物反應調節劑、生長因子；免疫調節劑、單株抗體及/或防腐劑。本發明之組成物亦可結合其他治療形式使用。
本文所述之rAAV病毒粒子可投與個體以治療疾病或病症。此類組成物可以單次劑量、多次劑量、以連續或間歇方式投與，此視例如以下因素而定：接受者之生理學狀況、投藥目的是否對創傷性損傷有反應或是否用於更持久的治療目的，及熟練從業者已知的其他因素。本發明之化合物及組成物的投與可在預選的時段內基本上為連續的或可呈一系列間隔劑量形式。考慮了局部投藥與全身投藥。在一些實施例中，rAAV病毒粒子實現局部遞送。在一些實施例中，rAAV病毒粒子的局部遞送係用於在心臟內產生細胞群。在一些實施例中，此類局部群體充當心臟之「節律器細胞」。在一些實施例中，rAAV病毒粒子係用於產生、再生、修復、置換及/或復蘇竇房(SA)結、房室(AV)結、希氏束(bindle of His)及/或浦金耶氏纖維(Purkinje fibers)。
為了控制張力，水性醫藥組成物可包含生理鹽，諸如鈉鹽。較佳為氯化鈉(NaCl)，其可在1 mg/ml與20 mg/ml之間存在。可存在的其他鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉脫水物、氯化鎂及氯化鈣。
組成物可包括一或多種緩衝劑。典型的緩衝劑包括：磷酸鹽緩衝劑；Tris緩衝劑；硼酸鹽緩衝劑；丁二酸鹽緩衝劑；組胺酸緩衝劑或檸檬酸鹽緩衝劑。緩衝劑典型地以5至20 mM範圍內的濃度包括在內。組成物的pH一般介於5與8之間，且更典型地介於6與8之間，例如6.5與7.5之間或7.0與7.8之間。
組成物較佳為無菌的。組成物較佳不含麩質。組成物較佳不熱解。
在一些實施例中，包含細胞的組成物可包括低溫保護劑。低溫保護劑之非限制性實例包括二醇(例如乙二醇、丙二醇及丙三醇)、二甲亞碸(DMSO)、甲醯胺、蔗糖、海藻糖、右旋糖及其任何組合。
含有rAAV病毒粒子之組成物中亦可存在一或多種以下類型的化合物：WNT促效劑、GSK3抑制劑、TGF-β信號傳導抑制劑、表觀遺傳修飾劑、LSD1抑制劑、腺苷酸環化酶促效劑或其任何組合。
套組
本文描述包括本文所述之任一種組成物(例如rAAV病毒粒子)的多種套組。套組可包括本文所述之任一種組成物，其混合在一起或個別地封裝且呈乾燥或水合形式。本文所述之rAAV病毒粒子及/或其他藥劑可分開封裝於離散的小瓶、瓶子或其他容器中。或者，本文所述之rAAV病毒粒子及/或藥劑中的任一者可以單一組成物形式封裝在一起，或作為可一起使用或分開使用的兩種或更多種組成物封裝。本文所述之化合物及/或藥劑可以適當比率及/或量封裝，以促進跨越分化界限之所選細胞轉化，從而形成心臟祖細胞及/或心肌細胞。
套組可包括彼等組成物、化合物及/或藥劑之投與說明書。此類說明書可提供本申請案中所述的資訊。rAAV病毒粒子或醫藥組成物可提供於呈遞送裝置之形式的任何套組內。或者，遞送裝置可分開包括於套組中，且說明書可描述在投與個體之前如何組裝遞送裝置。
任何套組亦可包括注射器、導管、手術刀、用於收集樣本或細胞的無菌容器、稀釋劑、醫藥學上可接受之載劑及其類似物。套組可提供其他因子，諸如本文在申請案之以上章節或其他部分中關於組成物所述的任一種補充因子或藥物。
病毒載體
適用於本文所提供之方法及基因療法載體的病毒載體包括(但不限於)病毒載體(例如基於病毒載體的痘瘡病毒；脊髓灰白質炎病毒；腺病毒(例如Li等人(1994) Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543-2549; Borras等人(1999) Gene Ther 6:515-524; Li及Davidson, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7700-7704; Sakamoto等人(1999) Hum Gene Ther 5: 1088-1097; WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984及WO 95/00655)；腺相關病毒(例如Ali等人(1998) Hum Gene Ther 9(l):81-86, 1998, Flannery等人(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6916-6921; Bennett等人(1997) Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857-2863; Jomary等人(1997) Gene Ther 4:683-690; Rolling等人(1999), Hum Gene Ther 10:641-648; Ali等人(1996) Hum Mol Genet. 5:591-594; WO 93/09239, Samulski等人(1989) J. Vir. 63 :3822-3828; Mendelson等人(1988) Virol. 166: 154-165; 及Flotte等人(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10613-10617；SV40；單純疱疹病毒；人類免疫缺乏病毒(例如Miyoshi等人(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10319-10323; Takahashi等人(1999) J Virol 73 :7812-7816)；逆轉錄病毒載體(例如鼠類白血病病毒、脾臟壞死病毒，及來源於逆轉錄病毒的載體，諸如勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、慢病毒、人類免疫缺乏病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳房腫瘤病毒)；及其類似物。許多適合的表現載體為熟習此項技術者已知，且許多可市購。提供以下載體作為實例：對於真核細胞而言：pXTl、pSG5 (Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40 (Pharmacia)及pAd (Life Technologies)。然而，考慮使用任何其他載體，只要其與本發明之方法相容即可。
某些病毒經由受體介導之胞吞感染細胞或進入細胞及穩定且高效地表現病毒基因之能力使其成為用於將外來核酸轉移至細胞(例如哺乳動物細胞)中之有吸引力的候選物。考慮包括控制序列(諸如用於表現所關注多肽之啟動子)的病毒載體。儘管許多病毒載體整合至宿主細胞基因體中，但必要時，可移除或改變允許此類整合之區段以阻止此類整合。此外，在一些實施例中，載體不含哺乳動物複製起點。病毒載體之非限制性實例描述於下文中，考慮其用於將編碼PKP2之核酸遞送至所選細胞中。在一些實施例中，病毒載體來源於複製缺乏型病毒。
一般而言，其他適用病毒載體係基於非細胞病變真核病毒，其中非必需基因已經所關注的多肽置換。非細胞病變病毒包括某些逆轉錄病毒，其生命週期涉及將基因體病毒RNA逆轉錄成DNA，隨後將原病毒整合至宿主細胞DNA中。一般而言，逆轉錄病毒為複製缺乏型(例如能夠引導所需轉錄本合成，但不能製造感染性顆粒)。此類基因改變之逆轉錄病毒表現載體一般用於聚核苷酸的活體內高效轉導。
在一些實施例中，編碼PKP2之聚核苷酸容納於已經工程改造以表現特異性結合配位體之感染性病毒內。病毒顆粒從而特異性結合至目標細胞之同源受體且將內容物遞送至細胞。在一些實施例中，病毒經修飾以賦予特定病毒向性，例如病毒優先感染纖維母細胞、心臟細胞或更特定言之，心臟纖維母細胞(CF)。對於AAV而言，在一些情況下，使蛋白殼蛋白突變以改變病毒載體之向性。舉例而言，通常藉由使用不同包膜蛋白來調節慢病毒向性；此已知為「假型化」。
在一些實施例中，病毒載體係逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒通常將其基因整合至宿主基因體中，轉移大量外來遺傳物質，感染廣譜物種及細胞類型，且通常封裝於特殊細胞株中(Miller等人, Am. J. Clin. Oncol., 15(3):216-221, 1992)。在一些實施例中，改變逆轉錄病毒載體，使得其不整合至宿主細胞基因體中。
在一些實施例中，重組逆轉錄病毒包含病毒多肽(例如逆轉錄病毒env)以有助於進入目標細胞中。此類病毒多肽為此項技術中公認的，例如美國專利第5,449,614號。在一些實施例中，病毒多肽為雙嗜性病毒多肽，例如雙嗜性env，其有助於進入來源於多個物種之細胞中，包括原始宿主物種外之細胞。在一些實施例中，病毒多肽為嗜異性病毒多肽，其有助於進入原始宿主物種外之細胞中。在一些實施例中，病毒多肽為親嗜性病毒多肽，例如親嗜性env，其有助於進入原始宿主物種之細胞中。
能夠幫助逆轉錄病毒進入細胞中之病毒多肽之實例包括但不限於：MMLV雙嗜性env、MMLV親嗜性env、MMLV嗜異性env、水皰性口炎病毒-g蛋白(VSV-g)、HIV-1 env、長臂猿白血病病毒(GALV) env、RD114、FeLV-C、FeLV-B、MLV 10A1 env基因及其變異體，包括嵌合體。Yee等人(1994) Methods Cell Biol, Pt A:99-l 12 (VSV-G)；美國專利第5,449,614號。在一些情況下，病毒多肽經基因修飾以促進表現或增強對受體的結合。
在實施例中，逆轉錄病毒構築體來源於一系列逆轉錄病毒，例如MMLV、HIV-1、SIV、FIV或本文所述之其他逆轉錄病毒。在一些實施例中，逆轉錄病毒構築體編碼特定病毒超過一個複製週期所必需的所有病毒多肽。在一些情況下，藉由添加其他因子或其他病毒多肽來改善病毒進入效率。在其他情況下，由逆轉錄病毒構築體編碼的病毒多肽不支持超過一個複製週期，例如美國專利第6,872,528號。在此類情況下，添加其他因子或其他病毒多肽通常有助於促進病毒進入。在一個例示性實施例中，重組逆轉錄病毒為包含VSV-g多肽、但不包含HIV 1 env多肽之HIV-1病毒。
在一些實施例中，逆轉錄病毒構築體包含：啟動子、多選殖位點及/或抗性基因。啟動子之實例包括但不限於CMV、SV40、EFla、β-肌動蛋白；逆轉錄病毒LTR啟動子及誘導型啟動子。在一些實施例中，逆轉錄病毒構築體包含封裝信號(例如來源於MFG載體之封裝信號；psi封裝信號)。此項技術中已知之一些逆轉錄病毒構築體的實例包括但不限於：pMX、pBabeX或其衍生物。Onishi等人(1996) Experimental Hematology, 24:324-329。在一些情況下，逆轉錄病毒構築體為自不活化慢病毒載體(SIN)載體。Miyoshi等人(1998) J. Virol 72(10):8150- 8157。在一些情況下，逆轉錄病毒構築體為LL-CG、LS-CG、CL-CG、CS-CG、CLG或MFG。Miyoshi等人(1998) J. Virol 72(10):8150-8157；Onishi等人(1996) Experimental Hematology, 24:324-329；Riviere等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:6733-6737。
在一些實施例中，逆轉錄病毒載體係藉由將核酸(例如編碼所關注多肽或RNA之核酸)插入病毒基因體中以代替一些病毒序列產生複製缺乏型病毒來構築。為了產生病毒粒子，構築含有gag、pol及env基因、但不含有LTR及封裝組件的封裝細胞株(Mann等人, Cell 33:153-159, 1983)。當將含有cDNA以及逆轉錄病毒LTR及封裝序列的重組質體引入特殊細胞株中(例如藉由磷酸鈣沈澱或脂質轉染)時，封裝序列允許重組質體之RNA轉錄本封裝於病毒顆粒中，接著分泌於培養基中(Nicolas及Rubinstein, 於: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez及Denhardt編, Stoneham: Butterworth, 第494-513頁, 1988; Temin, 於: Gene Transfer, Kucherlapati (編), New York: Plenum Press, 第149-188頁, 1986; Mann等人, Cell, 33:153-159, 1983)。接著收集含有重組逆轉錄病毒的培養基，視情況濃縮且用於基因轉移。逆轉錄病毒載體能夠感染廣泛多種細胞類型。然而，整合及穩定表現典型地涉及宿主細胞的分裂(Paskind等人, Virology, 67:242-248, 1975)。
在一些實施例中，病毒載體係慢病毒載體。慢病毒為複雜的逆轉錄病毒，除共有的逆轉錄病毒基因gag、pol及env之外，其亦含有具有調節或結構功能之其他基因。關於慢病毒載體之資訊可獲得於例如Naldini等人, Science 272(5259):263-267, 1996；Zufferey等人, Nat Biotechnol 15(9):871-875, 1997；Blomer等人, J Virol. 71(9):6641-6649, 1997；美國專利第6,013,516號及第5,994,136號；該等文獻各自以全文引用之方式併入本文。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺乏病毒：HIV-1、HIV-2及猿猴免疫缺乏病毒：SIV。慢病毒載體已藉由使HIV毒力基因減毒而產生，例如使基因env、vif、vpr、vpu及nef缺失以使得載體在生物學上安全。所用慢病毒有時為複製及/或整合缺乏的。
重組慢病毒載體能夠感染非分裂細胞，且有時用於活體內與離體基因轉移及核酸序列之表現。舉例而言，能夠感染非分裂細胞(其中適合宿主細胞經兩個或更多個攜載封裝功能(亦即，gag、pol及env，以及rev及tat)之載體轉染)的重組慢病毒描述於美國專利第5,994,136號中，該專利以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，藉由將包膜蛋白與用於靶向特定細胞類型之受體的抗體或特定配位體連接來靶向重組病毒。舉例而言，有時藉由將所關注之核酸區段(包括調節區域)連同編碼特定目標細胞類型上之受體之配位體的另一基因一起插入病毒載體中來產生目標特異性載體。
慢病毒載體為此項技術中已知，參見Naldini等人(1996及1998)；Zufferey等人(1997)；Dull等人, 1998，美國專利第6,013,516號及第5,994,136號，該等文獻皆以引用的方式併入本文中。一般而言，此等載體為基於質體或基於病毒的載體且經組態以攜帶用於併入外來核酸、用於選擇核酸及將核酸轉移至宿主細胞中之必需序列。在一些情況下，將慢病毒載體與一或多種慢病毒封裝質體同時引入細胞中，該等質體包括但不限於pMD2.G、pRSV-rev、pMDLG-pRRE及pRRL-GOI。在一些實施例中，將慢病毒載體單獨或與慢病毒封裝質體組合引入細胞中促使慢病毒載體封裝於慢病毒顆粒中。在一些實施例中，慢病毒載體為非整合慢病毒(NIL)載體。US 8,119,119中提供用於產生NIL載體之說明方法，諸如整合酶基因中之D64V取代。
在一些實施例中，病毒載體係腺病毒載體。腺病毒之基因組織包括約36 kb線性雙股DNA病毒，此允許腺病毒DNA之大片段經至多7 kb之外來序列取代(Grunhaus等人, Seminar in Virology 200(2):535-546, 1992))。在一些情況下，PKP2係使用腺病毒輔助轉染引入細胞中。已報導，在使用腺病毒偶合系統的細胞系統中，轉染效率增加(Kelleher及Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994；Cotton等人, Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992；Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994.)。
在一些實施例中，病毒載體係腺相關病毒(AAV)載體。AAV為有吸引力的載體系統，因為其具有低整合頻率且其可感染非分裂細胞，從而使得其適用於將聚核苷酸遞送至哺乳動物細胞內，例如在組織培養物中(Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992)或在活體內遞送。關於rAAV載體之產生及使用的細節描述於美國專利第5,139,941號及第4,797,368號中，該等專利各自以全文引用之方式併入本文中。
AAV係複製缺乏型細小病毒，其單股DNA基因體具有約4.7 kb長度，包括兩個145核苷酸反向末端重複(ITR)。AAV存在多種血清型。已知AAV血清型之基因體的核苷酸序列。舉例而言，AAV-1的完整基因體提供於GenBank登錄號NC_002077中；AAV-2的完整基因體提供於GenBank登錄號NC_001401及Srivastava等人, J. Virol., 45: 555-564 (1983)中；AAV-3的完整基因體提供於GenBank登錄號NC_1829中；AAV-4的完整基因體提供於GenBank登錄號NC_001829中；AAV-5基因體提供於GenBank登錄號AF085716中；AAV-6的完整基因體提供於GenBank登錄號NC_00 1862中；AAV-7及AAV-8基因體的至少部分分別提供於GenBank登錄號AX753246及AX753249中；AAV-9基因體提供於Gao等人，J. Virol.，78: 6381-6388 (2004)中；AAV-10基因體提供於Mol. Ther.，13(1): 67-76 (2006)中；且AAV-11基因體提供於Virology，330(2): 375-383 (2004)中。AAV rh.74基因體序列提供於美國專利9,434,928中，該文獻以引用之方式併入本文中。引導病毒DNA複製、蛋白殼化/封裝及宿主細胞染色體整合的順式作用序列(rep)包含於AAV ITR內。三個AAV啟動子(因其相對圖譜位置而命名為p5、pl9及p40)驅動編碼rep及cap基因之兩個AAV內部開放閱讀框表現。兩個rep啟動子(p5及pi 9)聯合單個AAV內含子之差異性剪接(在核苷酸2107及2227)使得rep基因產生四種rep蛋白質(rep 78、rep 68、rep 52及rep 40)。Rep蛋白具有最終負責複製病毒基因體的多種酶特性。cap基因自p40啟動子表現，且其編碼三種蛋白殼蛋白VP1、VP2及VP3。替代性剪接及非共同轉譯起點負責三種相關蛋白殼蛋白產生。單一共同聚腺苷酸化位位於AAV基因體之圖譜位置95處。AAV之生命週期及遺傳學評述於Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)中。
AAV的獨特特徵使得其成為用於將外來DNA遞送至細胞的有吸引力之載體，例如在基因療法中。AAV感染培養中之細胞無細胞病變性，且對人類及其他動物之天然感染為靜默且無症狀的。此外，AAV感染多種哺乳動物細胞存在活體內靶向多種不同組織的可能性。另外，AAV緩慢地轉導分裂細胞及非分裂細胞，且在彼等細胞之生命期內通常基本上作為轉錄活性細胞核游離基因體(染色體外元件)持久存在。對本發明特別重要的是，AAV及AAV9尤其能夠感染心臟細胞，諸如心肌、心包膜或兩者(Prasad等人, 2011；Piras等人, 2016；Ambrosi等人, 2019)。AAV原病毒基因體作為選殖之DNA插入質體中，其使得構築重組基因體變得可行。此外，由於引導AAV複製及基因體蛋白殼化之信號包含於AAV基因體之ITR內，因此在一些情況下，基因體內部約4.3 kb (編碼複製及結構蛋白殼蛋白，rep-cap)的一些或全部經外來DNA置換。為了產生AAV載體，在一些情況下，rep及cap蛋白質以反式提供。AAV之另一個顯著特徵在於其係極其穩定且充滿活力之病毒。其容易耐受用於使腺病毒不活化的條件(56℃至65℃保持數小時)，使得AAV之冷藏並非關鍵。在一些情況下，甚至將AAV凍乾。最後，經AAV感染之細胞對重複感染不具抗性。本發明之AAV載體包括自互補、雙螺旋AAV載體、合成ITR及/或封裝緊湊度增加之AAV載體。說明方法提供於US 8,784,799；US 8,999,678；US 9,169,494；US 9,447,433；及US 9,783,824中，其各自以全文引用之方式併入本文中。
rAAV基因體中之AAV DNA考慮來自可衍生出重組病毒之任何AAV血清型，包括但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13及AAV rh74。假型化rAAV之產生揭示於例如WO 01/83692中。亦考慮了其他類型的rAAV變異體，例如具有蛋白殼突變的rAAV。參見例如Marsic等人, Mol. Therapy. 22):1900-09 (2014)。此項技術中已知各種AAV血清型之基因體的核苷酸序列。本發明之AAV載體包括血清型AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV39、AAV43、AAV.rh74及AAV.rh8之AAV載體。說明性AAV載體提供於US 63/012,703；US 7,105,345；US 15/782,980；US 7,259,151；US 6,962,815；US 7,718,424；US 6,984,517；US 7,718,424；US 6,156,303；US 8,524,446；US 7,790,449；US 7,906,111；US 9,737,618；US App 15/433,322；US 7,198,951中，該等文獻各自以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，AAV表現載體經假型化以增強靶向。為促進基因轉移及在心肌細胞中維持表現，考慮了使用AAV6、AAV8及AAV9。在一些情況下，將AAV2基因體封裝於蛋白殼中以分別產生假型化載體AAV2/5、AAV2/7及AAV2/8，如Balaji等人, J Surg Res. 184:691-98 (2013)中所述。在一些實施例中，AAV9用於靶向肌纖維母細胞樣譜系中之表現，如Piras等人, Gene Therapy 23:469-478 (2016)中所述。在一些實施例中，使用AAV1、AAV6或AAV9，且在一些實施例中，對AAV進行工程改造，如以下文獻中所述：Asokari等人, Hum Gene Ther. 24:906-13 (2013)；Pozsgai等人, Mol Ther. 25:855-69 (2017)；Kotterman等人, Nature Reviews Genetics 15:445-51 (2014)；及Schaffer等人的US20160340393A1。在一些實施例中，病毒載體經AAV工程改造以增加目標細胞感染性，如US20180066285A1中所述。
在一些實施例中，本發明之AAV載體包含經修飾之蛋白殼，尤其是經工程改造以增強或促進心臟細胞或更尤其心肌細胞之活體內或離體轉導；或逃避個體之免疫系統；或使生物分佈改善的蛋白殼。說明性AAV蛋白殼提供於US 7,867,484；US 9,233,131；US 10,046,016；WO 2016/133917；WO 2018/222503；及WO 20019/060454中，該等文獻各自以全文引用之方式併入本文中。在AAV蛋白殼(或尤其AAV9蛋白殼)中，考慮了一或多個取代會增強對心肌、心包膜或兩者中之細胞的感染性。更特定而言，在一些實施例中，本發明之AAV載體，視情況基於AAV9之載體，在其蛋白殼蛋白中包含一或多個取代。在一些實施例中，本發明之AAV載體包含AAV-A9蛋白殼及/或血清型。應瞭解，考慮了將此等取代及插入組合在一起以產生適用於本發明之各種蛋白殼蛋白。
產生病毒載體之方法
一般而言，藉由將病毒DNA或RNA構築體引入生產細胞中來產生病毒載體。在一些情況下，生產細胞不表現外源基因。在其他情況下，生產細胞為包含一或多種外源基因(例如編碼一或多種gag、pol或env多肽及/或一或多種逆轉錄病毒gag、pol或env多肽之基因)的「封裝細胞」。在一些實施例中，逆轉錄病毒封裝細胞包含編碼有助於進入目標細胞中之病毒多肽(例如VSV-g)的基因。在一些情況下，封裝細胞包含編碼一或多種慢病毒蛋白質(例如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev或nef)之基因。在一些情況下，封裝細胞包含編碼腺病毒蛋白質(諸如El A或El B或其他腺病毒蛋白質)之基因。舉例而言，在一些情況下，封裝細胞供應的蛋白質係逆轉錄病毒衍生之蛋白質，諸如gag、pol及env；慢病毒衍生之蛋白質，諸如gag、pol、env、vpr、vpu、vpx、vif、tat、rev及nef；及腺病毒衍生之蛋白質，諸如El A及E1 B。在許多實例中，封裝細胞供應的蛋白質來源於與衍生病毒載體之病毒不同的病毒。自封裝細胞產生重組病毒之方法及其用途為沿用已久的；參見例如美國專利第5,834,256號；第6,910,434號；第5,591,624號；第5,817,491號；第7,070,994號；及第6,995,009號。
封裝細胞株包括但不限於容易轉染的任何細胞株。封裝細胞株通常基於293T細胞、NIH3T3、COS或HeLa細胞株。封裝細胞通常用於封裝病毒載體質體，該等質體缺乏至少一種編碼為病毒封裝所需之蛋白質的基因。考慮了供應蛋白質或多肽、缺乏由此類病毒載體或質體編碼之蛋白質的任何細胞用作封裝細胞。封裝細胞株之實例包括但不限於：Platinum-E (Plat-E)、Platinum-A (Plat-A)、BOSC 23 (ATCC CRL 11554)及Bing (ATCC CRL 11270)。Morita等人(2000) Gene Therapy 7(12): 1063-1066；Onishi等人(1996) Experimental Hematology, 24:324-329；美國專利第6,995,009號。商業封裝株系亦適用，例如Ampho-Pak 293細胞株、Eco-Pak 2-293細胞株、RetroPack PT67細胞株及Retro-X通用封裝系統(皆可購自Clontech)。
病毒載體質體(或構築體)包括：pMXs、pMxs-IB、pMXs-puro、pMXs-neo (pMXs-IB為攜載抗殺稻瘟菌素基因而非pMXs-puro之抗嘌呤黴素基因的載體)，Kimatura等人(2003) Experimental Hematology 31 : 1007-1014；MFG Riviere等人(1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:6733-6737；pBabePuro；Morgenstern等人(1990) Nucleic Acids Research 18:3587-3596；LL-CG、CL-CG、CS-CG、CLG，Miyoshi等人(1998) J. Vir. 72:8150-8157及其類似者作為逆轉錄病毒系統，以及pAdexl，Kanegae等人(1995) Nucleic Acids Research 23:3816-3821及其類似物作為腺病毒系統。在例示性實施例中，逆轉錄病毒構築體包含殺稻瘟菌素(例如pMXs-IB)、嘌呤黴素(例如pMXs-puro、pBabePuro)或新黴素(例如pMXs-neo)。Morgenstern等人(1990) Nucleic Acids Research 18:3587-3596。
啟動子及增強子
在一些實施例中，編碼PKP2之核酸可操作地連接至啟動子及/或增強子以促進PKP2表現。視所用宿主/載體系統而定，多種適合轉錄及轉譯控制元件中之任一者，包括組成型、組織特異性及誘導型啟動子、轉錄增強子元件、轉錄終止子等，適用於表現載體中(例如Bitter等人(1987) Methods in Enzymology, 153 :516-544)。
適合真核啟動子(在真核細胞中發揮功能之啟動子)之非限制性實例包括CMV、CMV即刻早期啟動子、HSV胸苷激酶、早期及晚期SV40、來自逆轉錄病毒之長末端重複(LTR)及小鼠金屬硫蛋白-I。在一些實施例中，將使用能夠賦予心臟特異性表現之啟動子，包括(但不限於)賦予心肌、心包膜或兩者中表現之啟動子(Prasad等人, 2011)。適合心臟特異性啟動子之非限制性實例包括α-肌凝蛋白重鏈(a-MHC)、肌凝蛋白輕鏈2 (MLC-2)、心肌鈣蛋白T (cTnT)及心肌鈣蛋白C (cTnC)。在一些實施例中，使用PKP2或結蛋白啟動子。在一些情況下，使用心臟特異性表現之嵌合啟動子。在一些情況下，心臟特異性增強子與啟動子組合。
適用於驅動表現PKP2的啟動子實例包括(但不限於)逆轉錄病毒長末端重複(LTR)元件；組成型啟動子，諸如CMV、HSV1-TK、SV40、EF-la、β-肌動蛋白、磷酸甘油激酶(PGK)；誘導型啟動子，諸如含有Tet操縱子元件之啟動子；及心臟特異性啟動子，諸如α-肌凝蛋白重鏈(a-MHC)、肌凝蛋白輕鏈2 (MLC-2)、心肌鈣蛋白T (cTnT)及心肌鈣蛋白C (cTnC)。在一些實施例中，使用PKP2或結蛋白啟動子。在一些實施例中，使用心臟特異性表現之嵌合啟動子。在一些情況下，心臟特異性增強子與啟動子組合。
在一些實施例中，聚核苷酸可操作地連接至細胞類型特異性轉錄調節因子元件(TRE)，其中TRE包括啟動子及增強子。適合TRE包括(但不限於)來源於以下基因之TRE：肌凝蛋白輕鏈-2、a-肌凝蛋白重鏈、AE3、心肌鈣蛋白C及心肌動蛋白。Franz等人(1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566；Robbins等人(1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 752:492-505；Linn等人(1995) Circ. Res. 76:584-591；Parmacek等人(1994) Cell. Biol. 14: 1870-1885；Hunter等人(1993) Hypertension 22:608-617；及Sartorelli等人(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051。
或者，藉由將編碼核酸區段置於重組或異源啟動子控制下將獲得某些優勢，重組或異源啟動子係指在其天然環境中通常與核酸不締合之啟動子。重組或異源增強子亦指在其天然環境中通常與核酸序列不締合的增強子。此類啟動子或增強子通常包括其他基因之啟動子或增強子，及自任何其他原核、病毒或真核細胞分離之啟動子或增強子，及非「天然存在」之啟動子或增強子，亦即含有不同轉錄調節區之不同元件及/或改變表現之突變的啟動子或增強子。除以合成方式產生啟動子及增強子之核酸序列之外，序列有時亦結合本文所揭示之組成物、使用重組選殖及/或核酸擴增技術(包括PCR)產生(參見美國專利第4,683,202號、美國專利第5,928,906號，各文獻以引用的方式併入本文中)。
在一些實施例中，本發明之載體包括一或多個polyA信號。適用於本發明之載體中的說明性polyA信號包括短polyA信號及bGH polyA信號。在一些實施例中，本發明之載體包括一或多個3'元件。說明性3'元件包括土拔鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE)。
基因療法載體組成物
為了製備組成物，產生載體及/或細胞，且視需要或必要時純化載體或細胞。有時將載體及/或其他藥劑懸浮於醫藥學上可接受之載劑中。在一些實施例中，將組成物凍乾。此等化合物及細胞通常調節至適當濃度，且視情況與其他藥劑組合。單位劑量中所包括之指定化合物及/或其他藥劑的絕對重量廣泛變化。考慮了由熟習此項技術者最佳化的投與劑量及次數。
舉例而言，在一些實施例中，投與約10
2至10
10個載體基因體(vg)。在一些實施例中，劑量為至少約10
2vg、約10
3vg、約10
4vg、約10
5vg、約10
6vg、約10
7vg、約10
8vg、約10
9vg、約10
10vg或更多個載體基因體。在一些實施例中，劑量為約10
2vg、約10
3vg、約10
4vg、約10
5vg、約10
6vg、約10
7vg、約10
8vg、約10
9vg、約10
10vg或更多個載體基因體。
化合物之日劑量亦可變化。此類日劑量的範圍通常為例如至少約10
2vg/天、約10
3vg/天、約10
4vg/天、約10
5vg/天、約10
6vg/天、約10
7vg/天、約10
8vg/天、約10
9vg/天、約10
10vg/天或更多個載體基因體/天。
在一些實施例中，本發明方法包含藉由心內注射、心肌內注射、心內膜注射、心內導管插入術或全身投與來投與本發明之載體或載體系統(例如rAAV載體)。在一些實施例中，藉由心內注射、心肌內注射、心內膜注射、心內導管插入或全身投與來投與約1×10
8與約1×10
15GC之間的載體(例如AAV載體或慢病毒載體)治療個體(例如人類)。在一些實施例中，藉由投與約1×10
8與約1×10
15GC之間、約1×10
8與約1×10
15GC之間、約1×10
9與約1×10
14GC之間、約1×10
10與約1×10
13GC之間、約1×10
11與約1×10
12GC之間或約1×10
12與約1×10
13GC之間的載體來治療個體。在一些實施例中，藉由投與約1×10
8與約1×10
10GC之間、約1×10
9與約1×10
11GC之間、約1×10
10與約1×10
12GC之間、約1×10
11與約1×10
13GC之間、約1×10
12與約1×10
14GC之間或約1×10
13與約1×10
15GC之間的載體來治療個體。在一些實施例中，藉由投與至少1×10
8、至少約1×10
9、至少約1×10
10、至少約1×10
11、至少約1×10
12、至少約1×10
13或至少約1×10
15GC的載體來治療個體。在一些實施例中，藉由投與至多1×10
8、至多約1×10
9、至多約1×10
10、至多約1×10
11、至多約1×10
12、至多約1×10
13或至多約1×10
15GC的載體來治療個體。在一些實施例中，藉由心內注射或全身投與約1×10
8與約1×10
15GC/kg之間的載體(例如AAV載體或慢病毒載體)來治療個體(例如人類)。在一些實施例中，藉由投與約1×10
8與約1×10
15GC/kg之間、約1×10
8與約1×10
15GC/kg之間、約1×10
9與約1×10
14GC/kg之間、約1×10
10與約1×10
13GC/kg之間、約1×10
11與約1×10
12GC/kg之間或約1×10
12與約1×10
13GC/kg之間的載體來治療個體。在一些實施例中，藉由投與約1×10
8與約1×10
10GC/kg之間、約1×10
9與約1×10
11GC/kg之間、約1×10
10與約1×10
12GC/kg之間、約1×10
11與約1×10
13GC/kg之間、約1×10
12與約1×10
14GC/kg之間或約1×10
13與約1×10
15GC/kg之間的載體來治療個體。在一些實施例中，藉由投與至少1×10
8、至少約1×10
9、至少約1×10
10、至少約1×10
11、至少約1×10
12、至少約1×10
13或至少約1×10
15GC/kg的載體來治療個體。在一些實施例中，藉由投與至多1×10
8、至多約1×10
9、至多約1×10
10、至多約1×10
11、至多約1×10
12、至多約1×10
13或至多約1×10
15GC/kg的載體來治療個體。應瞭解，用於治療之載體的量不僅將隨著所選擇之特定載劑而變化，而且隨著投與途徑、所治療之病狀之性質及患者之年齡及狀況而變化。最終，在一些實施例中，巡診的健康照護提供者將確定適當劑量。考慮了依各化合物於單一單位劑型中之適當比率來調配用於投藥的醫藥組成物。
組成物有時調配成持續釋放(例如使用微膠囊化，參見WO 94/07529及/或美國專利第4,962,091號)。調配物適當時宜以離散單位劑型提供，且在一些實施例中，藉由醫藥技術熟知之任何方法製備。此類方法通常包括以下步驟：將治療劑與液體載劑、固體基質、半固體載劑、細粉狀固體載劑或其組合混合，且接著視需要將產物引入所需遞送系統或成形為所需遞送系統。
在一些實施例中，一或多種含有化合物之適合單位劑型藉由多種途徑投與，包括非經腸(包括皮下、靜脈內、肌肉內及腹膜內)、心臟內、心臟周圍、經口、直腸、真皮、經皮、胸內、肺內及鼻內(呼吸道)途徑。
本文所提供之基因療法載體製備成多種形式，包括水溶液、懸浮液、錠劑、硬明膠膠囊或軟明膠膠囊及脂質體及其他緩釋調配物，諸如成形聚合物凝膠。基因療法載體之投與通常涉及水溶液的非經腸或局部投與。類似地，含有基因療法載體之組成物有時在裝置、支架中或作為持續釋放調配物投與。不同類型的調配程序描述於美國專利第6,306,434號及其中所含之參考文獻中。
在一些實施例中，載體經調配以便非經腸投與(例如注射，例如推注注射或連續輸注)且通常以單位劑型提供於安瓿、預填充注射器、小體積輸注容器或額外存在防腐劑之多劑量容器中。醫藥組成物通常採取油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液形式，且有時含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。適合的載劑包括生理鹽水溶液、磷酸鹽緩衝鹽水及此項技術中常用之其他物質。
組成物有時亦含有其他成分，諸如適用於治療心臟疾病、病狀及損傷的藥劑，諸如抗凝血劑(例如達肝素(法安明)、達那肝素(奧甲南)、依諾肝素(洛維諾西)、肝素、亭紮肝素(茵諾普)及/或華法林(可邁丁))；抗血小板藥劑(例如阿司匹林、噻氯匹定、克羅匹多或雙吡大莫)；血管收縮素轉化酶抑制劑(例如貝那普利(洛汀新)、卡托普利(開博通)、依那普利(Vasotec)、福辛普利(蒙諾普利(Monopril)、賴諾普利(Prinivil、Zestril)、莫西普利(Univasc)、培哚普利(Aceon)、喹那普利(Accupril)、雷米普利(Altace)及/或群多普利(Mavik))；血管收縮素II受體阻斷劑(例如坎地沙坦(Atacand)、依普羅沙坦(Teveten)、依貝沙坦(Avapro)、洛沙坦(Cozaar)、替米沙坦(Micardis)及/或纈沙坦(Diovan))；β阻斷劑(例如醋丁洛爾(Sectral)、阿替洛爾(Tenormin)、倍他洛爾(Kerlone)、比索洛爾/氫氯噻嗪(Ziac)、比索洛爾(Zebeta)、卡替洛爾(Cartrol)、美托洛爾(Lopressor、Toprol XL)、納多洛爾(Corgard)、普萘洛爾(Inderal)、索他洛爾(Betapace)及/或噻嗎洛爾(Blocadren))；鈣離子通道阻斷劑(例如胺氯地平(Norvasc、Lotrel)、苄普地爾(Vascor)、地爾硫卓(Cardizem、Tiazac)、非洛地平(Plendil)、硝苯地平(Adalat、Procardia)、尼莫地平(Nimotop)、尼索地平(Sular)、維拉帕米(Calan、Isoptin、Verelan)、利尿劑(例如胺氯吡脒(Midamor)、布美他尼(Bumex)、氯噻嗪(Diuril)、氯噻酮(Hygroton)、呋喃苯胺酸(Lasix)、氫氯噻嗪(Esidrix、Hydrodiuril)、吲達帕胺(Lozol)及/或螺內酯(Aldactone))；血管擴張劑(例如二硝酸異山梨醇(Isordil)、奈西立肽(Natrecor)、聯胺肼(Apresoline)、硝酸鹽及/或敏樂定)；抑制素、菸鹼酸、吉非羅齊、氯貝特、地高辛、洋地黃毒苷、拉諾辛或其任何組合。
有時包括其他藥劑，諸如抗細菌劑、抗微生物劑、抗病毒劑、生物反應調節劑、生長因子；免疫調節劑、單株抗體及/或防腐劑。考慮了本文所提供之組成物亦與其他治療形式結合使用。
本文所述之病毒載體適於投與個體以治療疾病或病症。在一些實施例中，此類組成物以單次劑量、多次劑量、以連續或間歇方式投與，此視例如以下因素而定：接受者之生理學狀況、投藥目的是否對創傷性損傷有反應或是否用於更持久的治療目的，及熟練從業者已知的其他因素。在一些實施例中，在預選時段內連續投與本文所提供之化合物及組成物，或替代地以一系列間隔開之劑量投與。考慮了局部投藥與全身投藥。在一些實施例中，實現病毒或非病毒載體之局部遞送。在一些實施例中，細胞及/或載體的局部遞送係用於在心臟內產生細胞群。在一些實施例中，此類局部群體充當心臟之「節律器細胞」。
定義
如本文所用，術語「心肌病」係指心肌(心臟肌肉)之任何疾病或功能障礙，其中心臟異常增大、增厚及/或硬化。結果，心肌泵血之能力通常弱化。在一些情況下，疾病或病症的病因學係發炎、代謝、毒性、浸潤性、纖維形成、血液、遺傳或未知病因。心肌病存在兩種一般類型：局部缺血(由缺氧造成)及非局部缺血。在一些情況下，心肌病為致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌病(ACM)。
「心臟衰竭」(HF)係複雜臨床症候群，其通常起因於任何結構或功能性心血管病症，在左心室充盈壓力未過度增加的情況下，該病症使得全身灌注不足以滿足身體代謝需求。其特徵為特定症狀，諸如呼吸困難及疲勞，及諸如流體滯留之徵象。如本文所用，「慢性心臟衰竭」或「充血性心臟衰竭」或「CHF」可互換地指持續或持久的心臟衰竭形式。CHF之常見風險因素包括年齡較大、糖尿病、高血壓及超重。根據左心室之收縮功能將CHF大致分類為射出分率降低或保持的HF (HFrEF及HFpEF)。術語「心臟衰竭」不意謂心臟已停止跳動或完全衰竭，而是其比健康人之正常心臟弱。在一些情況下，病狀係輕度的，在運動時引起明顯症狀，在其他情況下，病狀較嚴重，導致在一些情況下，甚至在休息時危及生命的症狀。慢性心臟衰竭之最常見症狀包括呼吸短促、疲倦、腿及腳踝腫脹、胸痛及咳嗽。在一些實施例中，本發明之方法減少、預防或改善罹患CHF (例如HFrEF)或處於其風險下之個體的CHF (例如HFrEF)之一或多種症狀。在一些實施例中，本發明提供治療CHF及有時導致CHF之病狀的方法。
如本文所用，「急性心臟衰竭」或「失代償性心臟衰竭」可互換地指病徵及症狀惡化的症候群，其反映心臟不能在正常充盈壓力下以與身體需求相稱的速率泵血。AHF典型地在數天至數週的過程內逐漸發展且接著失去代償，因此等病徵或症狀嚴重而需要緊急或應急療法。在一些情況下，AHF為心臟收縮或舒張功能之原發性紊亂或者靜脈或動脈異常血管收縮之結果，但一般呈現出多種因素之相互作用，包括容量超負荷。患有AHF之大部分患者已對慢性心臟衰竭(CHF)失代償，且因此，對CHF之病理生理學、表現及診斷的大量論述與對AHF之理解直接相關。在其他情況下，AHF由對心臟之損傷或損害心臟功能之事件引起，諸如急性心肌梗塞、重度高血壓、對心瓣膜之損傷、心臟心律異常、心臟發炎或感染、毒素及藥物。在一些實施例中，本發明之方法減少、預防或改善罹患AHF或處於AHF風險下之個體的AHF之一或多種症狀。在一些實施例中，本發明提供治療AHF及有時引起AHF之病狀的方法。在一些情況下，AHF係與心肌梗塞相關之局部缺血的結果。
如本文所用，術語「個體(subject)」或「個體(individual)」係指任何動物，諸如馴養動物、動物園動物或人類。在一些情況下，「個體(subject)」或「個體(individual)」為哺乳動物，如犬、貓、馬、家畜、動物園動物或人類。替代地或組合地，「個體(subject)」或「個體(individual)」為馴養動物，諸如鳥、寵物或農畜。「個體(subject)」或「個體(individual)」之特定實例包括(但不限於)患有心臟病或病症之個體，及患有心臟病症相關特徵或症狀(諸如致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌症(ACM))之個體。
除非另外指明，否則將使用屬於此項技術之技能範圍內的習知組織培養、免疫學、分子生物學、細胞生物學及重組DNA技術實施本發明。參見例如Sambrook及Russell編(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版；Ausubel等人編的叢書(2007) Current Protocols in Molecular Biology；叢書Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson等人(1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson等人(1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow及Lane編(1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 第5版; Gait編(1984) Oligonucleotide Synthesis; 美國專利第4,683,195號; Hames及Higgins編(1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames及Higgins編(1984) Transcription and Translation; IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes; Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller及Calos編(1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides編(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer及Walker編(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg等人編(1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 第3版(2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press); Sell (2013) Stem Cells Handbook。
除非上下文另外指示，否則特別預期本文所述之本發明之各種特徵可以任何組合使用。此外，本發明亦考慮了在一些實施例中，可排除或省去本文所闡述之任何特徵或特徵組合。為了說明，若說明書敍述複合物包含組分A、B及C，則特別預期A、B或C中之任一者或其組合可以省去且不單個地或不以任何組合主張權利。
所有數值名稱，例如pH值、溫度、時間、濃度及分子量(包括範圍)均為近似值，該等近似值適當時以1.0或0.1之增量變化(+)或(-)，或替代地以+/-15%，或替代地10%，或替代地5%，或替代地2%之變化量變化。應理解，儘管未必總是明確陳述，但所有數值名稱前存在術語「約」。應理解，此類範圍格式出於便利及簡潔起見而使用，且應靈活地理解為不僅包括明確地指定為範圍限值之數值，而且包括涵蓋於彼範圍內之所有個別數值或子範圍，如同各數值及子範圍被明確地指定一般。舉例而言，約1至約200範圍內之比率應理解為不僅包括約1及約200之明確敍述的限值，而且包括諸如約2、約3及約4的個別比率以及諸如約10至約50、約20至約100的子範圍，諸如此類。亦應理解，儘管未始終明確陳述，但本文所述之試劑僅為例示性的，且此類試劑之等效物為此項技術中已知的。
亦須注意，除非上下文另有明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個提及物。因此，舉例而言，提及「心肌細胞」包括複數個心肌細胞。
亦如本文所用，「及/或」係指且涵蓋相關所列項中之任一項及一或多項的所有可能組合，以及組合的缺乏(以替代項(「或」)解釋時)。
當結合如本文所提供之基因療法載體或其組成物使用時，「投與(Administration)」、「投與(administering)」及其類似者係指直接投與及/或間接投與，在一些情況下，直接投與包括活體外投與非心肌細胞、活體內投與非心肌細胞、由醫療專業人士投與個體或由個體自投與；在一些情況下，間接投與為開具包含本文所提供之基因療法載體之組成物之處方的操作。當在本文中提及細胞使用時，其係指將組成物引入細胞。典型地，投與有效量，該量通常由熟習此項技術者確定。考慮使用任何適合之投與方法。在一些情況下，將基因療法載體投與細胞，例如藉由將基因療法載體添加至細胞培養基或活體內注射至心臟損傷部位來投與。在一些情況下，向個體投與係藉由例如血管內注射、心肌內遞送及其類似方式來達成。
如本文所用，術語「心臟細胞」係指存在於心臟中的任何細胞，其提供心臟功能，諸如心臟收縮或血液供應，或以其他方式用於維持心臟結構。如本文所用，心臟細胞涵蓋存在於心臟之心包膜、心肌或心內膜中之細胞。心臟細胞亦包括例如心臟肌肉細胞或心肌細胞，及心臟血管結構之細胞，諸如冠狀動脈或靜脈之細胞。心臟細胞之其他非限制性實例包括構成心肌、血管及心臟細胞支撐結構之上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、心臟幹細胞或祖細胞、心臟傳導細胞及心臟節律細胞。在一些情況下，心臟細胞來源於幹細胞，包括例如胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞。
如本文所用，術語「心肌細胞(cardiomyocyte)」或「心肌細胞(cardiomyocytes)」係指相較於骨胳肌細胞，天然存在於哺乳動物心臟中的含肌節之橫紋肌細胞。心肌細胞之特徵為特殊化分子(例如蛋白質，如肌凝蛋白重鏈、肌凝蛋白輕鏈、心臟α-輔肌動蛋白)的表現。如本文所用，術語「心肌細胞」為總括術語，其包含任何心肌細胞亞群或心肌細胞亞型，例如心房、心室及節律心肌細胞。
術語「培養」或「細胞培養」意謂在人工活體外環境中維持細胞。「細胞培養系統」在本文中用於指其中細胞群以單層形式或以懸浮形式培養的培養條件。「培養基」在本文中用於指細胞之培養、生長或增殖的營養液。在一些情況下，培養基之特徵在於功能特性，諸如(但不限於)將細胞維持在特定狀態(例如多能狀態、靜止狀態等)或使細胞成熟之能力，諸如在一些實施例中，促進祖細胞分化成特定譜系之細胞(例如心肌細胞)。
如本文所用，術語「表現(expression)」或「表現(express)」係指核酸或聚核苷酸轉錄成mRNA的過程及/或經轉錄之mRNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質的過程。若聚核苷酸或核酸來源於基因體DNA，則在一些情況下，表現包括真核細胞中之mRNA剪接。在一些情況下，基因表現量係藉由量測細胞或組織樣品中mRNA或蛋白質之量來測定。
如本文所用，「表現卡匣」為DNA聚核苷酸，其包含一或多種編碼蛋白質之聚核苷酸或核酸，或經組態以在宿主細胞中表現聚核苷酸之核酸。典型地，聚核苷酸之表現處於某些調節元件(包括組成型或誘導型啟動子、組織特異性調節元件及增強子)之控制下。此類聚核苷酸稱為「可操作地連接至」或「可操作連接至」調節元件(例如啟動子)。
片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內，適於與人類及動物之組織接觸使用而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、與合理益處/風險比相稱的彼等化合物、材料、組成物及/或劑型。
「治療(Treatment)」、「治療(treating)」及「治療(treat)」定義為藥劑作用於疾病、病症或病狀，以減輕或改善疾病、病症、病狀及/或其症狀之有害或任何其他非所需影響。
如本文所用，術語「有效量」及其類似者係指足以誘導所需生理學結果(例如治療疾病)之量。有效量有時以一或多次投與、施加或劑量投與。此類遞送視許多變數而定，包括使用個別劑量單位之時段、組成物之生物可用性、投與途徑等。然而，應理解，對於任何特定個體而言，組成物(例如基因療法載體)之特定量視多種因素而定，包括所用特定藥劑之活性、個體之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、投與時間、排泄率、組成物組合、所治療之特定疾病之嚴重度及投與形式。
如本文所用，關於多肽或核酸序列之術語「其等效物」係指與參考多肽或核酸序列不同，但保持基本特性(例如生物活性)的多肽或核酸。聚核苷酸之典型變異體與另一種參考聚核苷酸在核苷酸序列方面不同。在一些情況下，變異體之核苷酸序列之變化改變由參考聚核苷酸編碼之多肽的胺基酸序列。在一些情況下，核苷酸變化引起由參考序列編碼之多肽中的胺基酸取代、缺失、添加、融合及截斷。一般而言，差異有限以使得參考多肽之序列與變異體之序列總體上密切相似且在許多區域中一致。
如本文所用，術語「核酸」及「聚核苷酸」可互換使用且係指任何長度之呈聚合形式之核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物)。聚核苷酸之非限制性實例包括線性及環狀核酸、信使RNA (mRNA)、cDNA、重組聚核苷酸、載體、探針及引子。如本文所用，前面有基因名稱的「聚核苷酸」或「核酸」(例如「PKP2核酸」)係指編碼對應蛋白質(例如「PKP2蛋白質」)的聚核苷酸序列。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換地使用且指任何長度之呈聚合形式的胺基酸，其有時包括基因編碼及非基因編碼之胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生之胺基酸及具有經修飾之肽主鏈之多肽。該術語包括融合蛋白，包括(但不限於)具有異源胺基酸序列之融合蛋白；具有異源及同源前導序列、具有或不具有N端甲硫胺酸殘基之融合物；免疫標記蛋白；及其類似物。如本文所用，前面有基因名稱的詞語「蛋白質」(例如「PKP2蛋白質」)係指原生蛋白質或其功能變異體。「原生蛋白質」為由生物體(較佳為預期載體之生物體(例如人類、嚙齒動物、靈長類動物或獸醫學關注之動物))的基因功能性同功型或功能性對偶基因變異體中之任一者中之基因的基因體複本編碼之蛋白質。
如本文所用，蛋白質之「功能變異體」或「變異體」係具有任何數目個胺基酸取代、插入、截斷或內部缺失的變異體，其保留蛋白質之功能屬性，包括例如蛋白質與其他因子組合誘導橋粒組織化之能力。在一些情況下，以計算方式鑑別功能變異體，諸如僅具有保守取代之變異體，或使用活體外或活體內分析以實驗方式鑑別功能變異體。
如本文所用，聚核苷酸序列之「密碼子變異體」係編碼與具有一或多個同義密碼子取代之參考聚核苷酸序列相同的蛋白質的聚核苷酸序列。同義密碼子之選擇在熟習此項技術者之技能範圍內，編碼為已知的遺傳密碼。在一些情況下，使用多種計算工具(諸如GENSMART™密碼子優化工具，可在www.genscript.com上獲得)進行密碼子優化。一般而言，密碼子優化係用於增加異源系統中之蛋白質表現，例如當人類編碼序列表現於細菌系統中時。術語「密碼子變異體」意欲涵蓋以此方式最佳化之兩個序列及出於其他目的(諸如移除CpG島及/或隱性起點)而經最佳化之序列。
術語「載體」係指包含活體外或活體內遞送至宿主細胞之聚核苷酸或蛋白質的巨分子或分子複合物。載體有時為經修飾之RNA、脂質奈米顆粒(囊封DNA或RNA)、轉座子、腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒、逆轉錄病毒、整合慢病毒載體(LVV)或非整合LVV。因此，如本文所用，「載體」包括用於轉型之裸聚核苷酸(例如質體)以及用於將聚核苷酸遞送至細胞之任何其他組成物，包括能夠轉導細胞之載體及適用於轉染細胞之載體。
如本文所用，術語「病毒載體」係指包括病毒衍生核酸元件的核酸分子或介導核酸轉移之病毒顆粒，該等核酸元件典型地促進核酸分子轉移或整合至細胞之基因體中。除核酸之外，病毒顆粒典型地亦包括各種病毒組分且有時亦包括細胞組分。
術語「基因修飾」係指在引入新核酸(亦即，對於細胞而言為外源性核酸)之後，在細胞中誘導之永久性或短暫的基因變化。基因變化通常藉由將新核酸併入心臟細胞之基因體中來實現，或藉由將新核酸作為染色體外元件短暫或穩定維持來實現。在細胞係真核細胞的情況下，通常藉由將核酸引入細胞基因體中來實現永久基因變化。適合的基因修飾方法包括病毒感染、轉染、結合、原生質體融合、電穿孔、基因槍技術、磷酸鈣沈澱、直接顯微注射及其類似方法。
除非上下文另有說明，否則本發明之特徵可以任何組合使用。所述任何特徵或特徵組合可排除或省去。各別實施例中所述的本發明之某些特徵亦可在單個實施例中組合提供。單個實施例中所述的本發明特徵亦可分開提供或以任何適合的子組合提供。本文揭示實施例的所有組合，如同每一個組合個別地揭示一般。本文揭示實施例及元件的所有子組合，如同每個此類子組合個別地揭示一般。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所瞭解相同的含義。本實施方式僅為了閱讀方便而分成各章節，且任何章節中所發現之揭示內容可與另一章節中之揭示內容組合。雖然類似或等效於本文所述者之任何方法及材料可用於本發明之實施或測試中，但現描述例示性方法及材料。本文所提及之任何出版物以引用之方式併入本文中以結合所列舉的出版物來揭示且描述方法及/或材料。提及出版物並非承認該出版物為先前技術。
除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個提及物。舉例而言，提及「重組AAV病毒粒子」包括複數個此類病毒粒子且提及「心臟細胞」包括一或多個心臟細胞。
連接詞「及/或」意謂「及」與「或」，且藉由「及/或」連接的清單涵蓋一或多個所列項的所有可能組合。
術語「載體」係指包含待遞送至細胞之聚核苷酸或蛋白質的巨分子或分子複合物。
「AAV」為腺相關病毒之縮寫。該術語涵蓋AAV的所有亞型(除指定亞型之外)，以及天然存在之形式與重組形式。縮寫「rAAV」係指重組腺相關病毒。「AAV」包括AAV或任何亞型。「AAV5」係指AAV亞型5。「AAV9」係指AAV亞型9。AAV之各種血清型的基因體序列以及原生反向末端重複(ITR)、Rep蛋白及蛋白殼亞單元的序列可見於文獻或公用資料庫，諸如GenBank。參見例如GenBank登錄號NC_002077 (AAV1)、AF063497 (AAV1)、NC_001401 (AAV2)、AF043303 (AAV2)、NC_001729 (AAV3)、NC_001829 (AAV4)、U89790 (AAV4)、NC_006152 (AAV5)、AF513851 (AAV7)、AF513852 (AAV8)、NC_006261 (AAV8)及AY530579 (AAV9)。描述AAV的出版物包括Srivistava等人(1983)
J. Virol.45:555；Chiorini等人(1998)
J. Virol.71:6823；Chiorini等人(1999)
J. Virol.73:1309；Bantel-Schaal等人(1999)
J. Virol.73:939；Xiao等人(1999)
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Virol.221:208；Shade等人(1986)
J. Virol.58:921；Gao等人(2002)
Proc. Nat. Acad. Sci. USA99: 11854；Moris等人(2004)
Virology33:375-383；國際專利公開案第WO2018/222503A1號、第WO2012/145601A2號、第WO2000/028061A2號、第WO1999/61601A2號及第WO1998/11244A2號；美國專利申請第15/782,980號及第15/433,322號；及美國專利第10,036,016號、第9,790,472號、第9,737,618號、第9,434,928號、第9,233,131號、第8,906,675號、第7,790,449號、第7,906,111號、第7,718,424號、第7,259,151號、第7,198,951號、第7,105,345號、第6,962,815號、第6,984,517號及第6,156,303號。
如此項技術中所用，「AAV載體」或「rAAV載體」係指封裝於rAAV病毒粒子中的DNA或rAAV病毒粒子本身，此視上下文而定。如本文所用，除非另外自上下文顯而易見，否則rAAV載體係指包含能夠封裝於rAAV病毒粒子中之聚核苷酸序列、但具有rAAV病毒粒子之蛋白殼或其他蛋白質的核酸(典型地為質體)。一般而言，rAAV載體包含異源聚核苷酸序列(亦即，非AAV起源之聚核苷酸)及一或兩個側接異源聚核苷酸序列的AAV反向末端重複序列(ITR)。兩個ITR中僅一者可封裝於rAAV中且仍可維持所得rAAV病毒粒子的感染性。參見Wu等人(2010)
Mol Ther.18:80。rAAV載體可經設計以產生單股rAAV載體(ssAAV)或自互補rAAV載體(scAAV)。參見McCarty D. (2008)
Mo. Ther.16:1648-1656；WO2001/11034；WO2001/92551；WO2010/129021。
「rAAV病毒粒子」係指胞外病毒顆粒，其包括至少一種病毒蛋白殼蛋白(例如VP1)及蛋白殼化rAAV載體(或其片段)，包括蛋白殼蛋白。
為簡潔及清晰起見，本發明係指「一或多種蛋白殼蛋白」。熟習此項技術者理解，此類提及物係指VP1、VP2或VP3，或VP1、VP2與VP3之組合。如同野生型AAV及大部分重組表現系統，VP1、VP2及VP3係自同一開放閱讀框表現，對編碼VP3之序列進行工程改造不可避免地改變VP1及VP2之C端域序列。蛋白殼蛋白亦可自不同開放閱讀框表現，在此情況下，所得rAAV病毒粒子的蛋白殼可含有野生型蛋白殼蛋白與工程化蛋白殼蛋白之混合物，及不同工程化蛋白殼蛋白之混合物。
序列比對位置一般根據參考序列表示。除非另外說明，本文所揭示之工程化蛋白殼蛋白中的胺基酸位置係根據作為SEQ ID NO: 1提供之AAV9的VP1序列編號。可利用所關注之序列與參考序列的最佳擬合比對來測定位置。「位於」一位置的插入意謂在比對中，該胺基酸位置與先前位置之間的插入序列。術語「約」允許靠近參考位置之位置的取代或插入。熟習此項技術者可利用諸如結構模型化之技術確定適合的鄰近位置(例如藉由鑑別蛋白殼表面上所暴露之環區域中的殘基)。
如本文所用，術語「反向末端重複序列」或「ITR」係指由於其對稱性而如此命名之AAV病毒順式元件。此等元件係AAV基因體高效增殖必不可少的。不受理論束縛，咸信ITR功能不可缺少的最少元件為Rep結合位及末端解鏈位，以及允許形成髮夾的可變回文序列。本發明考慮了可存在或可有希望地開發出與本發明之蛋白殼蛋白相容的產生AAV基因體之替代方式。
「輔助病毒功能」係指輔助病毒基因體中所編碼的功能，其允許AAV複製及封裝。
「封裝」係指一系列細胞內事件，其引起rAAV病毒粒子的組裝，包括rAAV載體的蛋白殼化。AAV「
rep」及「
cap」基因係指編碼腺相關病毒之複製及蛋白殼化蛋白的聚核苷酸序列。AAV
rep及
cap在本文中稱為AAV「封裝基因」。封裝需要輔助病毒本身，或更通常存在於重組系統中的輔助病毒功能，該輔助病毒功能係由無輔助系統(亦即，一或多個輔助質體)供應。
AAV之「輔助病毒」係指允許AAV (例如野生型AAV)複製且被哺乳動物細胞封裝之病毒。輔助病毒可為腺病毒、疱疹病毒或痘病毒，諸如痘瘡。
「感染性」病毒粒子或病毒顆粒為包含勝任組裝之病毒蛋白殼且能夠將聚核苷酸組分遞送至該病毒粒子對其具向性之細胞中的病毒粒子或病毒顆粒。該術語不一定暗示病毒之任何複製能力。
「感染性」係指病毒粒子感染細胞之能力的量度。感染性可用感染性病毒顆粒相對於總病毒顆粒的比率表示。感染性一般係相對於特定細胞類型測定。其可在活體內或在活體外量測。測定感染性病毒顆粒相對於總病毒顆粒之比率的方法為此項技術中已知的。參見例如Grainger等人(2005)
Mol . Ther .11:S337 (描述TCID
50感染性效價分析)；及Zolotukhin等人(1999)
Gene Ther .6:973。
術語「親本蛋白殼」或「親本序列」係指衍生出顆粒蛋白殼或序列的參考序列。除非另外說明，否則親本序列係指血清型與工程化蛋白殼蛋白相同的野生型蛋白殼蛋白之序列。
「複製勝任型」病毒(例如複製勝任型AAV)係指具有感染性且亦能夠在感染細胞中(亦即，在輔助病毒或輔助病毒功能存在下)複製的病毒。在一些實施例中，本發明之rAAV病毒粒子包含缺乏
rep基因、或
rep與
cap基因且因此不勝任複製的基因體。
除非另外指明，否則將使用屬於此項技術之技能範圍內的習知組織培養、免疫學、分子生物學、細胞生物學及重組DNA技術實施本發明。參見例如Sambrook及Russell編(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版；Ausubel等人編(2007) Current Protocols in Molecular Biology; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson等人(1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson等人(1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow及Lane編(1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 第5版; Gait編(1984) Oligonucleotide Synthesis；美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編(1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編(1984) Transcription and Translation; IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller及Calos編(1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides編(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer及Walker編(1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；Herzenberg等人編(1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 第3版(2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)；及Sell (2013) Stem Cells Handbook。
術語「核酸」與「聚核苷酸」可互換使用且係指任何長度之呈聚合形式之核苷酸(去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其類似物)。聚核苷酸之非限制性實例包括線性及環狀核酸、信使RNA (mRNA)、cDNA、重組聚核苷酸、載體、探針及引子。除非另有說明或需要，否則本文所述的本發明聚核苷酸之任何實施例涵蓋雙股形式及已知或預測構成雙股形式之兩個互補單股形式中之每一者。
術語「多肽」與「蛋白質」在本文中可互換地使用且指任何長度之呈聚合形式的胺基酸，其可包括基因編碼及非基因編碼之胺基酸、經化學或生物化學修飾或衍生之胺基酸及具有經修飾之肽主鏈之多肽。術語亦涵蓋已經修飾之胺基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質化、磷酸化或與標記組分結合。
術語「肽」係指一種短多肽，例如具有約4與30個胺基酸殘基之間的肽。
術語「分離」意謂與病毒粒子、細胞、組織、聚核苷酸、肽、多肽或蛋白質通常天然締合之成分、細胞物質及其他物質分離。舉例而言，分離之細胞為與表型或基因型不相似之組織或細胞分離的細胞。
如本文所用，「序列一致性」或「一致性」係指所關注之序列與參考序列之間一致的胺基酸數目百分比。一般而言，如下測定一致性：將所關注的序列與參考序列對準；測定所比對序列之間一致的胺基酸數目；將該數目除以參考序列中之胺基酸總數目；且將結果乘以100以得到百分比。可使用多種電腦程式比對序列，諸如可從ncbi.nlm.nih.gov獲得的BLAST。其他比對技術描述於Methods in Enzymology, 第266卷: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996)；及
Meth. Mol. Biol.70: 173-187 (1997);
J. Mol. Biol.48: 44。熟習此項技術者能夠視多種因素(包括序列長度、發散度，及相對於參考序列存在或不存在的插入或缺失)而定，選擇適當的比對方法。
「重組」應用於聚核苷酸時意謂，該聚核苷酸為選殖、限制或接合步驟、及其他程序之各種組合的產物，從而產生與自然界中所發現之聚核苷酸不同的構築體，或該聚核苷酸由合成寡核苷酸組裝。「重組」蛋白質為由重組多肽產生的蛋白質。重組病毒粒子為包含重組聚核苷酸及/或重組蛋白(例如重組蛋白殼蛋白)的病毒粒子。
「基因」係指含有至少一個開放閱讀框之聚核苷酸，其在轉錄及轉譯後能夠編碼特定的蛋白質。「基因產物」為由特定基因之表現產生之分子。基因產物可包括(不限於)多肽、蛋白質、適體、干擾RNA或mRNA。基因編輯系統(例如CRISPR/Cas系統)可描述為製造該系統所必需的一種基因產物或若干基因產物(例如Cas蛋白及嚮導RNA)。
「短髮夾RNA」或shRNA為用於表現siRNA的聚核苷酸構築體。
「控制元件」或「控制序列」係參與分子相互作用之核苷酸序列，其對聚核苷酸的功能調節有貢獻，包括聚核苷酸之複製、倍增、轉錄、剪接、轉譯或降解。該調節可影響過程之頻率、速度或特異性，且可具有增強或抑制性質。控制元件包括轉錄調節序列，諸如啟動子及/或增強子。
「啟動子」為在某些條件下能夠結合RNA聚合酶且啟動通常位於啟動子下游(3'方向)之編碼區轉錄的DNA序列。如本文所用，術語「組織特異性啟動子」係指在特定器官或組織(諸如心臟組織)之細胞中可操作的啟動子。
「可操作地連接」或「可操作連接」係指遺傳元件之並接，其中元件呈允許其以預期方式操作之關係。舉例而言，若啟動子有助於起始編碼序列之轉錄，則該啟動子可操作地連接至編碼區。在啟動子與編碼區之間可存在中間殘基，只要維持此功能關係即可。
術語「聚核苷酸卡匣」係指反向末端重複序列(ITR)之間的載體基因體部分。聚核苷酸卡匣可包含編碼需要遞送至目標細胞之任何遺傳元件的聚核苷酸序列，包括但不限於基因之編碼序列、啟動子或用於基因編輯的修復模板。除非另外說明，否則AAV載體的表現卡匣僅包括ITR之間的聚核苷酸(而不包括ITR)。
「表現載體」為包含編碼序列的載體，該編碼序列編碼所關注之基因產物，用於實現基因產物於目標細胞中的表現。表現載體包含可操作地連接至編碼序列的控制元件以促進基因產物的表現。
術語「表現卡匣」係指包含編碼序列的聚核苷酸卡匣，該編碼序列編碼所關注的基因產物，用於實現基因產物於目標細胞中的表現。除非另外說明，否則AAV載體的表現卡匣僅包括ITR之間的聚核苷酸(而不包括ITR)。
如本文所用，術語「基因遞送」或「基因轉移」係指可靠地將外來核酸序列(例如DNA)插入宿主細胞中的方法或系統。此類方法可引起非整合式轉移之DNA的短暫表現、所轉移複製子(例如游離基因體)之染色體外複製及表現，或所轉移之遺傳物質整合至宿主細胞之基因體DNA中。
「異源」意謂來源於基因型與所比較之其餘實體之基因型不同的實體。舉例而言，藉由基因工程技術引入來源於不同物種之質體或載體中的聚核苷酸為異源聚核苷酸。自其原生編碼序列移除且可操作地連接至天然地發現不與其連接之編碼序列的啟動子為異源啟動子。因此，舉例而言，包括異源核酸的rAAV為包括通常不含於天然存在之AAV中之核酸的rAAV。
術語「基因變化」及「基因修飾」(及其文法變型)在本文中可互換地用於指除有絲分裂或減數分裂之外的將遺傳元件(例如聚核苷酸)引入細胞中之方法。元件對於細胞而言可為異源的，或其可為已存在於細胞中之元件的另一複本或改良形式。基因變化可如下實現：例如經由此項技術中已知的任何方法(諸如電穿孔、磷酸鈣沈澱，或與聚核苷酸-脂質體複合物接觸)，用重組質體或其他聚核苷酸轉染細胞。基因變化亦可例如藉由用載體轉導或感染來實現。
若一聚核苷酸序列在活體外、在延長的細胞培養期間可用於執行其功能，則稱該細胞「穩定地」被該序列改變、轉導、基因修飾或轉型。一般而言，此類細胞「可遺傳地」改變(經基因修飾)，因為所引入的基因變化亦可遺傳給所改變細胞的後代。
如本文所用，術語「轉染」係指外源核酸分子被細胞吸收。當外源DNA已引入細胞膜內部時，細胞已被「轉染」。此項技術中通常已知多種轉染技術。參見例如Graham等人(1973)
Virology, 52:456, Sambrook等人(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis等人(1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, 及Chu等人(1981)
Gene13:197。此類技術可用於將一或多個外源核酸分子引入適合宿主細胞中。
如本文所用，術語「轉導」係指與藉由野生型病毒粒子「感染」相比，藉由重組病毒粒子將外源核酸轉移至細胞中。當聯合重組病毒粒子使用感染時，術語「轉導」與「感染」同義，且因此，「感染性」與「轉導效率」等效且可使用類似方法測定。
片語「在靈長類動物中評估」係指藉由實例或其後之變型中所述的方法測試。可使用rAAV病毒粒子群進行評估，該病毒粒子群接受共同蛋白殼蛋白的篩選或藉由再篩選而彙集測試。
除非另外說明，否則所有醫學術語被賦予醫療專業人士所用術語的普通含義，例如
Harrison ' s Principles of Internal Medicine, 第15版，該文獻以全文引用的方式併入本文中用於所有目的，尤其是關於心臟或心血管疾病、病症、病狀及功能障礙的章節。
「治療(Treatment)」、「治療(treating)」及「治療(treat)」定義為藥劑作用於疾病、病症或病狀，以減輕或改善疾病、病症、病狀及/或其症狀之有害或任何其他非所需影響。
「投藥」、「投與」及其類似術語當結合本發明之組成物使用時，係指直接投藥(由醫療專業人士投與個體或由個體自投藥)及/或間接投藥(向患者指定組成物)。典型地，投與有效量，該量可由熟習此項技術者確定。可使用任何投與方法。可藉由例如靜脈內、動脈內、肌肉內、血管內或心肌內遞送來實現向個體的投與。
如本文所用，提及組成物之量時，術語「有效量」及其類似術語係指足以誘導所需生理學結果(例如細胞的再程式化或疾病的治療)的量。有效量可以一或多次投與、施加或劑量投與。此類遞送視許多變數而定，包括使用個別劑量單位之時段、組成物之生物可用性、投與途徑等。然而，應理解，對於任何特定個體而言，組成物(例如rAAV病毒粒子)之特定量視多種因素而定，包括所用特定藥劑之活性、個體之年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、投與時間、排泄率、組成物組合、所治療之特定疾病之嚴重度及投與形式。
術語「心臟病變」或「心臟功能障礙」可互換使用且係指心臟泵抽功能的任何障礙。此包括例如收縮性減弱、鬆弛的能力減弱(有時稱為心舒功能障礙)、心臟瓣膜的功能異常或不當、心臟肌肉的疾病(有時稱為心肌病)；諸如心絞痛、心肌缺血及/或梗塞之疾病，其特徵為供應至心臟肌肉之血液不足；浸潤性疾病，諸如澱粉樣變性及血色素沉著症；全域或局部肥大(諸如可能發生於一些類別的心肌病或全身高血壓中)，及心臟腔室之間的異常連通。
片語「醫藥學上可接受」在本文中用於指在合理醫學判斷範疇內，適於與人類及動物之組織接觸使用而無過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症、與合理益處/風險比相稱的彼等化合物、材料、組成物及/或劑型。
如本文所用，術語「純化」係指已在減少或排除不相關材料(亦即，雜質)存在之條件下分離的材料，包括製得該材料的原生材料。舉例而言，經純化之rAAV載體DNA較佳基本上不含細胞或培養組分，包括組織培養組分、污染物及其類似物。
如本文在心臟組織損傷之上下文中所用，術語「再生(regenerate)」、「再生(regeneration)」及其類似術語應被賦予其普通含義且亦應指在已損傷(例如因局部缺血、梗塞、再灌注或其他疾病而損傷)之心臟或心臟組織中生長及/或發展新心臟組織的過程。在一些實施例中，心臟組織再生包含心肌細胞的產生。
如本文所用，術語「治療性基因」係指一種基因，其當表現時對存在其之細胞或組織賦予有益作用，或對表現該基因之哺乳動物賦予有益作用。有益作用之實例包括病狀或疾病之徵象或症狀的改善、病狀或疾病的預防或抑制，或所需特徵的授予。治療性基因包括部分地或完全地校正細胞或哺乳動物之基因缺乏的基因。
如本文所用，術語「功能性心肌細胞」係指分化的心肌細胞，其能夠傳送或接收電信號。在一些實施例中，若心肌細胞展現電生理學特性，諸如動作電位及/或Ca
2 +暫態，則稱該心肌細胞為功能性心肌細胞。
如本文所用，「分化的非心臟細胞」可指一種細胞，其不能夠分化成成年生物體的所有細胞類型(亦即，不為多能細胞)，且係除心臟譜系之外的細胞譜系(例如神經元譜系或結締組織譜系)。分化細胞包括(但不限於)富能細胞、寡能細胞、單能細胞、祖細胞及終末分化細胞。在特定實施例中，相對於高能細胞，低能細胞被視為「分化的」。
「體細胞」為形成生物體之身體的細胞。體細胞包括構成生物體之器官、皮膚、血液、骨骼及結締組織的細胞，但不包括生殖細胞。
如本文所用，術語「分化全能」意謂細胞能夠形成生物體的所有細胞譜系。舉例而言，在哺乳動物中，僅接合子及第一分裂階段的分裂球為分化全能的。
如本文所用，術語「多能」意謂細胞能夠形成身體或軀體的所有譜系。舉例而言，胚胎幹細胞為多能幹細胞的一種類型，其能夠形成三種胚層(外胚層、中胚層及內胚層)中之每一者的細胞。多能細胞可根據其標記物(諸如Nanog及Rex1)的表現來識別。
如本文所用，術語「富能」係指成體幹細胞能夠形成一種譜系的多種細胞類型。舉例而言，造血幹細胞能夠形成血細胞譜系的所有細胞，例如淋巴及骨髓細胞。
如本文所用，術語「寡能」係指成體幹細胞僅能夠分化成幾種不同細胞類型。舉例而言，淋巴或骨髓幹細胞能夠分別形成淋巴或骨髓譜系的細胞。
如本文所用，術語「單能」意謂細胞能夠形成單一細胞類型。舉例而言，精原幹細胞僅能夠形成精子細胞。
如本文所用，術語「再程式化」或「轉分化」係指不經由細胞去分化成展現多能幹細胞特徵之細胞的中間過程，自不同類型的細胞(例如纖維母細胞)產生某種譜系的細胞(例如心臟細胞)。
如本文所用，術語「心臟細胞」係指存在於心臟中的任何細胞，其提供心臟功能，諸如心臟收縮或血液供應，或以其他方式用於維持心臟結構。如本文所用，心臟細胞涵蓋存在於心臟之心包膜、心肌或心內膜中之細胞。心臟細胞亦包括例如心臟肌肉細胞或心肌細胞，及心臟血管結構之細胞，諸如冠狀動脈或靜脈之細胞。心臟細胞之其他非限制性實例包括構成心肌、血管及心臟細胞支撐結構之上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、心臟幹細胞或祖細胞、心臟傳導細胞及心臟節律細胞。心臟細胞可來源於幹細胞，包括例如胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞。
如本文所用，術語「心肌細胞(cardiomyocyte)」或「心肌細胞(cardiomyocytes)」係指相較於骨胳肌細胞，天然存在於哺乳動物心臟中的含肌節之橫紋肌細胞。心肌細胞之特徵為特殊化分子(例如蛋白質，如肌凝蛋白重鏈、肌凝蛋白輕鏈、心臟α-輔肌動蛋白)的表現。如本文所用，術語「心肌細胞」為總括術語，其包含任何心肌細胞亞群或心肌細胞亞型，例如心房、心室及節律心肌細胞。
術語「心肌細胞樣細胞」意指與心肌細胞具有共同特徵，但不一定共通所有特徵的細胞。舉例而言，心肌細胞樣細胞與心肌細胞的不同之處可為某種心臟基因的表現。
術語「培養」或「細胞培養」意謂在人工活體外環境中維持細胞。「細胞培養系統」在本文中用於指其中細胞群可以單層形式或以懸浮形式培養的培養條件。「培養基」在本文中用於指細胞之培養、生長或增殖的營養液。培養基可藉由功能特性表徵，諸如(但不限於)將細胞維持在特定狀態(例如多能狀態、靜止狀態等)或使細胞成熟之能力；具體而言，在一些實施例中，促進祖細胞分化成特定譜系之細胞(例如心肌細胞)的能力。
如本文所用，術語「表現(expression)」或「表現(express)」係指藉以將聚核苷酸轉錄成mRNA的過程及/或藉以將所轉錄之mRNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質的過程。若聚核苷酸來源於基因體DNA，則表現可包括真核細胞中mRNA之剪接。基因表現量可藉由量測細胞或組織樣品中之mRNA或蛋白質之量來測定。
術語「誘導的心肌細胞」或縮寫「iCM」係指已轉型為心肌細胞(及/或心肌細胞樣細胞)的非心肌細胞(及其後代)。本發明之方法可結合現已知或後來發現的用於產生經誘導之心肌細胞之任何方法使用，例如以增強其他技術。
如本文所用，術語「誘導多能幹細胞衍生的心肌細胞」係指已分化成心肌細胞樣細胞的人類誘導多能幹細胞。用於製備iPS-CM細胞的例示性方法提供於Karakikes等人, Circ Res. 2015 Jun 19; 117(1): 80-88中。
如本文所用，術語「人類心臟纖維母細胞」及「小鼠心臟纖維母細胞」係指分別自人類或小鼠之成體心臟之心室分離且離體培養維持的原代細胞。
如本文所用，術語「非心肌細胞」係指不滿足如本文所定義及使用之「心肌細胞」準則之細胞製劑中的任何細胞或細胞群。非心肌細胞之非限制性實例包括體細胞、心臟纖維母細胞、非心臟纖維母細胞、心臟祖細胞及幹細胞。
如本文所用，「再程式化」包括轉分化、去分化及其類似者。
如本文所用，術語「再程式化效率」係指相對於樣本中的細胞總數目，樣本中之成功再程式化成心肌細胞之細胞的數目。
如本文所用，術語「再程式化因子」包括為了在細胞中表現而引入的因子，以有助於一種細胞類型的細胞再程式化成另一種細胞類型。舉例而言，再程式化因子可包括一種轉錄因子與其他轉錄因子及/或小分子的組合，其能夠將心臟纖維母細胞再程式化成經誘導的心肌細胞。除非上下文另有明確說明，否則再程式化因子係指可由AAV遞送之聚核苷酸編碼的多肽。再程式化因子亦可包括小分子。
術語「幹細胞」係指具有自我更新及產生分化後代之能力的細胞。術語「多能幹細胞」係指可產生所有三個胚層(內胚層、中胚層及外胚層)之細胞、但不具有產生完整生物體之能力的幹細胞。
如本文所用，關於多肽或核酸序列之術語「其等效物」係指與參考多肽或核酸序列不同，但保持基本特性(例如生物活性)的多肽或核酸。聚核苷酸之典型變異體與另一種參考聚核苷酸在核苷酸序列方面不同。變異體之核苷酸序列之變化可能會或可能不會改變由參考聚核苷酸編碼之多肽的胺基酸序列。核苷酸變化可引起由參考序列編碼之多肽中的胺基酸取代、缺失、添加、融合及截斷。一般而言，差異有限以使得參考多肽之序列與變異體之序列總體上密切相似且在許多區域中一致。
如本文所用，術語「祖細胞」係指以分化成特定細胞類型或形成特定組織類型為己任的細胞。祖細胞(如幹細胞)可進一步分化成一或多種類別的細胞，但比幹細胞更成熟，因此，其分化能力更有限/更受限制。
術語「基因修飾」係指在引入新核酸(亦即，對於細胞而言為外源性核酸)之後，在細胞中誘導之永久性或短暫的基因變化。基因變化可藉由將新核酸併入心臟細胞之基因體中來實現，或藉由將新核酸作為染色體外元件短暫或穩定維持來實現。在細胞係真核細胞的情況下，可藉由將核酸引入細胞基因體中來實現永久基因變化。適合的基因修飾方法包括病毒感染、轉染、結合、原生質體融合、電穿孔、基因槍技術、磷酸鈣沈澱、直接顯微注射及其類似方法。
術語「幹細胞」係指具有自我更新及產生分化後代之能力的細胞。術語「多能幹細胞」係指可產生所有三個胚層(內胚層、中胚層及外胚層)之細胞、但不具有產生完整生物體之能力的幹細胞。在一些實施例中，用於誘導心肌細胞表型的組成物可用於細胞群以誘導再程式化。在其他實施例中，組成物誘導心肌細胞表型。
術語「誘導性多能幹細胞」應被賦予其普通含義且亦應指分化的哺乳動物體細胞(例如成體體細胞，諸如皮膚)，其已再程式化以展現至少一種多能特徵。參見例如Takahashi等人(2007)
Cell131(5):861-872, Kim等人(2011)
Proc. Natl. Acad. Sci.108(19): 7838-7843, Sell (2013) Stem Cells Handbook。
術語「轉導效率」係指經至少一種AAV基因體轉導的細胞百分比。舉例而言，若1×10
6個細胞暴露於病毒且0.5×10
6個細胞經測定而含有AAV基因體之至少一個複本，則轉導效率為50%。用於測定轉導效率的說明性方法係流式細胞術。舉例而言，當AAV基因體包含編碼綠色螢光蛋白(GFP)的聚核苷酸時，GFP+細胞百分比為轉導效率的量度。
術語「選擇性」係指一種細胞類型之轉導效率相對於另一種細胞類型的比率，或相對於所有其他細胞類型的比率。
術語「感染性」係指AAV病毒粒子感染細胞(尤其是活體內細胞)的能力。因此，感染性至少與生物分佈及中和抗體逃避相關。
除非另有說明，否則通篇說明書中所用的縮寫具有以下含義：
AAV ：腺相關病毒，
rAAV ：重組腺相關病毒；
AHCF ：成人心臟纖維母細胞；
APCF ：成體豬心臟纖維母細胞，
a - MHC - GFP；α-肌凝蛋白重鏈綠色螢光蛋白；
CF ：心臟纖維母細胞；cm：公分；
CO ：心輸出量；
EF ：射出分率；
FΑCS ：螢光活化細胞分選；
GFP ：綠色螢光蛋白；
GMT ：Gata4、Mef2c及Tbx5；
GMTc ：Gata4、Mef2c、Tbx5、TGF-βi、WNTi；
GO ：基因本體論；
hCF ：人類心臟纖維母細胞；
iCM ：經誘導的心肌細胞；
kg ：公斤；
μg ：微克；
μl ：微升；
mg ：毫克；
ml ：毫升；
MI ：心肌梗塞；
msec ：毫秒；
min ：分鐘；
MyAMT ：心肌素、Ascl1、Mef2c及Tbx5；
MyA ：心肌素及Ascl1；
MyMT ：心肌素、Mef2c及Tbx5；
MyMTc ：心肌素、Mef2c、Tbx5、TGF-βi，
WNTi；MRI：磁共振成像；
PBS ：磷酸鹽緩衝生理鹽水；
PBST ：磷酸鹽緩衝生理鹽水，曲拉通(triton)；
PFA ：多聚甲醛；
qPCR ：定量聚合酶鏈反應；
qRT - PCR ：定量逆轉錄酶聚合酶鏈反應；
RNA ：核糖核酸；
RNA - seq ：RNA定序；
RT - PCR ：逆轉錄酶聚合酶鏈反應；
sec ：秒；
SV ：心搏出量；
TGF - β ：轉型生長因子β；
TGF - βi ：轉型生長因子β抑制劑；
WNT ：wingless-Int；
WNTi ：wingless-Int抑制劑；
YFP ：黃色螢光蛋白；
4F ：Gata4、Mef2c、TBX5及心肌素；
4Fc ：Gata4、Mef2c、TBX5及心肌素 + TGF-βi及WNTi；
7F ：Gata4、Mef2c及Tbx5、Essrg、心肌素、Zfpm2及Mesp1；
7Fc ：Gata4、Mef2c及Tbx5、Essrg、心肌素、Zfpm2及Mesp1 + TGF-β及WNTi。
本文中使用的胺基酸縮寫為此項技術中常用的縮寫，及如下(其中最後一個字母指示所用縮寫)：
丙胺酸 - Ala - A
精胺酸 - Arg - R
天冬醯胺酸 - Asn - N
天冬胺酸 - Asp - D
半胱胺酸 - Cys - C
麩胺酸 - Glu - E
麩醯胺酸 - Gln - Q
甘胺酸 - Gly - G
組胺酸 - His - H
異白胺酸 - Ile - I
白胺酸 - Leu - L
離胺酸 - Lys - K
甲硫胺酸 - Met - M
苯丙胺酸 - Phe - F
脯胺酸 - Pro - P
絲胺酸 - Ser - S
蘇胺酸 - Thr - T
色胺酸 - Trp - W
酪胺酸 - Tyr - Y
纈胺酸 - Val - V
提及胺基酸取代係採取此項技術中常用的形式。舉例而言，提及「N452K」取代表示在參考序列之第452號位置，該編號之前的野生型胺基酸(在此為「N」)已經後續編號之胺基酸(在此為「K」)取代。
術語「保守胺基酸取代」係指與經取代之殘基有共通的相似側鏈物理特性之胺基酸殘基的取代。保守取代包括極性殘基取代極性殘基、非極性殘基取代非極性殘基、疏水性殘基取代疏水性殘基、小殘基取代小殘基，及大殘基取代大殘基。保守取代進一步包含以下群組內的取代：{S, T}、{A, G}、{F, Y}、{R, H, K, N, E}、{S, T, N, Q}、{C, U, G, P, A}及{A, V, I, L, M, F, Y, W}。
序列 其他序列
實例
| 描述 | 序列 | SEQ ID NO |
| 重組AAV蛋白殼蛋白ZC373 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIKGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHENTVSIAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 705 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白ZC374 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIKGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQTLFNSAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 706 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白ZC375 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIKGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHNSTYLGAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 707 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白ZC376 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIKGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHGSILTHAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 708 |
| AAV蛋白殼蛋白ACE5 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIIGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQANYGQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 709 |
| AAV蛋白殼蛋白ACE10 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHEDNIRSAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 710 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | X 1-X 2-X 3-X 4- 其中X 1為S、T或N；X 2為T、L或I；X 3為V、F、Y或L；且X 4為A、N、L或T | 711 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC373 VR-VIII | NTVS | 712 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC374 VR-VIII | TLFN | 713 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC375 VR-VIII | STYL | 714 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC376 VR-VIII | SILT | 715 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC531 VR-VIII | MTTA | 716 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC533 VR-VIII | STSI | 717 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6其中X 1為Q、E、N、G、M或C；X 2為S、N、T或M；X 3為A、T、L、I或S；X 4為Q、V、F、Y、L或I；X 5為A、S、N、L、T或I；且X 6為I、S、Q、G、H或R | 718 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC373 VR-VIII | ENTVSI | 719 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC374 VR-VIII | QTLFNS | 720 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC375 VR-VIII | NSTYLG | 721 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC376 VR-VIII | GSILTH | 722 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC531 VR-VIII | MMTTAR | 723 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC532 VR-VIII | CSTSIR | 724 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分ZC536 VR-VIII | EDNIRS | 725 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白ZC536 VR-VIII | ATNHEDNIRSAQTG | 726 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白VR-IV | KGSGQNQQT | 727 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | ATNH-X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-AQTG X 1為Q、E、N、G、M、C、V或T；X 2為S、N、T、M、G或D；X 3為A、T、L、I、K、S、N或V；X 4為Q、V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；X 5為A、S、N、L、T、I或R，且X 6為Q、I、S、G、H或R | 728 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白VR-IV | -X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8-X 9- 其中X 1為K、G、S或V；X 2為Y、Q或I；X 3為H、W、V或I；X 4為K或N；X 5為S、G或I；X 6為G或R；X 7為A、P或V；X 8為A或R；且/或X 9為Q或D | 729 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白VR-IV | -X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-X 7-X 8-X 9- 其中X 1為K且X 2-X 9為任何胺基酸 | 730 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- 其中X 1為S、N、T、M、G或D；X 2為A、T、L、I、K、S、N或V；X 3為Q、V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；且X 4為A、S、N、L、T、I或R | 731 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- 其中X 1為S、N、T、M、G或D；X 2為T、L、I、K、S、N或V；X 3為V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；且X 4為A、S、N、L、T、I或R | 732 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- 其中X 1為S、N、M或T；X 2為A、T、L或I；X 3為Q、V、F、Y、T、S或L；且X 4為A、S、N、L、I或T (SEQ ID NO: 733) | 733 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- 其中X 1為S、N、M或T；X 2為T、L或I；X 3為V、F、Y、T、S或L；且X 4為A、S、N、L、I或T | 734 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6其中X 1為Q、E、N、G、M、C、V或T；X 2為S、N、T、M、G或D；X 3為A、T、L、I、K、S、N或V；X 4為V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；X 5為A、S、N、L、T、I或R，且X 6為Q、I、S、G、H或R | 735 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6其中X 1為Q、E、N、G、M、C、V或T；X 2為S、N、T、M、G或D；X 3為T、L、I、K、S、N或V；X 4為V、F、Y、L、T、S、I、R或Q；X 5為A、S、N、L、T、I或R，且X 6為I、S、G、H或R | 736 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6其中X 1為Q、E、N、M、C或G；X 2為S、N、M或T；X 3為A、T、L或I；X 4為Q、V、F、Y、T、S或L；X 5為A、S、N、L、I或T；且X 6為I、S、G、R或H | 737 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6其中X 1為E、N、M、C或G；X 2為S、N、M或T；X 3為T、L或I；X 4為V、F、Y、T、S或L；X 5為A、S、N、L、I或T；且X 6為I、S、G、R或H | 738 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白VR-VIII | ATNH-X 1-X 2-X 3-X 4-X 5-X 6-AQTG 其中X 1為Q、E、N、G、M或C；X 2為S、N、T或M；X 3為A、T、L、I或S；X 4為Q、V、F、Y、L或I；X 5為A、S、N、L、T或I；且X 6為I、S、Q、G、H或R | 739 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白VR-VIII | ATNH-(X) n -AQTG 其中 n為4-8，且X表示20個標準胺基酸中之任一者 | 740 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | GAYA | 741 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | TKLA | 742 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | SSFT | 743 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | DNIR | 744 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | NVIS | 745 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | GTSI | 746 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | DARA | 747 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | SAQA | 748 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | QGAYAQ | 749 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | NTKLAI | 750 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | VSSFTS | 751 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | NNVISG | 752 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | TGTSII | 753 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | QANYGQ | 754 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | QDARAQ | 755 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | QSAQAQ | 756 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | KYHKSGAAQ | 757 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | KQVNGRPRD | 758 |
| AAV蛋白殼部分蛋白質 | QHYSAQAQ | 759 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- 其中X 1為S、M、D、N、G、A、T、R或I；X 2為T、N、V、A、L、I、S、R或P；X 3為Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G或Q；且X 4為L、A、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E或Y | 760 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- 其中X 1為S、M、D、N、G或A；X 2為T、N、V或A；X 3為Y、T、S、I或V；且X 4為L、A、I、R、S或G | 761 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6- 其中X 1為N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L或Q；X 2為M、D、N、G、A、T、R、I或S；X 3為T、N、V、L、I、S、R、P或A；X 4為Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G或Q；X 5為L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y或A，且X 6為G、R、S、I、H、N、Y、L、M或Q | 762 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6- 其中X 1為N、M、C、E、G、S、V、A、T、H或L；X 2為M、D、N、G、A、T、R或I；X 3為T、N、V、L、I、S、R或P；X 4為Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D或G；X 5為L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E或Y，且X 6為G、R、S、I、H、N、Y、L或M | 763 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6- 其中X 1為E、N、G、M、C、V或T；X 2為N、T、M、G或D；X 3為T、L、I、K、S、N或V；X 4為V、F、Y、L、T、S、I、R；X 5為S、N、L、T、I或R，且X 6為I、S、G、H或R | 764 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6- 其中X 1為E、N、M、C或Q；X 2為A、M、G、D、N或S；X 3為T、N、V或A；X 4為V、Y、T、S、I或Q；X 5為S、G、L、I、R或A；且X 6為I、S、G、R或Q | 765 |
| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6- 其中X 1為E、N、M或C；X 2為A、M、G、D或N；X 3為T、N或V；X 4為V、Y、T、S或I；X 5為S、G、L、I或R；且X 6為I、S、G或R | 766 |
| ZC531 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIKGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHMMTTARAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 767 |
| ZC532 | MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTIKGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHCSTSIRAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL | 768 |
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| 重組AAV蛋白殼蛋白部分VR-VIII | -X 1-X 2-X 3-X 4- X 5-X 6-X 7- 其中X 1為R或H；X 2為N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L或Q；X 3為M、D、N、G、A、T、R、I或S；X 4為T、N、V、L、I、S、R、P或A；X 5為Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G或Q；X 6為L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y或A，且X 7為G、R、S、I、H、N、Y、L、M或Q | 781 |
以下實例係為了說明本發明之各種實施例之目的而給出且不意欲以任何方式限制本發明。本發明實例以及當前代表較佳實施例的本文所述方法具例示性且不希望限制申請專利範圍之範疇。熟習此項技術者將想到其中變化及其他用途，該等變化及用途涵蓋於如申請專利範圍之範疇所限定之本發明精神內。
實例 1 ： 細胞 PKP2 耗竭模型
作為初始的概念驗證，使用siRNA建立細胞PKP2耗竭模型。使誘導多能幹細胞衍生之心肌細胞(iPSCM)中的PKP2耗竭。使用購自Invitrogen的siRNA，包括siPKP2與陰性對照siRNA (4390843 Silencer所選陰性對照第1號siRNA；4392420分析Id s531202 Silencer所選預設計siRNA #1；4392420分析Id s531203 Silencer所選預設計siRNA #2；4392420分析Id s531204 Silencer所選預設計siRNA #3；及4392420分析Id s10585 Silencer所選預設計siRNA #4)，執行siRNA對PKP2的急性靜默。第8天，此靜默引起細胞膜中的DSP消失，如圖3A藉由免疫螢光所示。定量地量測DSP膜定域(圖4)，其繪示DSP-PKG共定域顯著減少。藉由免疫螢光亦觀測到肌節密度降低(圖3B)。另外，藉由免疫螢光發現iPSCM圖案中之細胞緊密度混亂無序(圖3C)。
對siPKP2 iPSCM溶解物執行免疫墨點法，其顯示在PKP2靜默的情況下，主要在細胞之不溶性部分中偵測到橋粒之DSP蛋白質總量減少(圖5)。
實例 2 ： AAV9 - PKP2 拯救 PKP2 耗竭表型
藉由遞送AAV9變異體CR9-01 (flag標記之PKP2表現藉由600 nt心肌鈣蛋白(TnT)啟動子驅動，其含有GFP以鑑別經轉導的細胞)(圖6A)，觀測到DSP再定域回至PKP2靜默之iPSCM之膜中(圖6B)，從而恢復橋粒結構。PKP2轉殖基因經密碼子優化以抵抗siRNA介導之靜默。由於技術困難，因此不可能準確地定量有多少DSP特異性地定域於發生細胞連接且存在橋粒的膜中。因此，定量總細胞DSP強度，而非定域於膜中之DSP之量。
為了證明PKP2轉殖基因可在功能上恢復心肌細胞的收縮性，藉由SONY影像來記錄基於明視野的iPSCM收縮且藉由DANA Solutions脈衝分析軟體來分析視訊。實驗時間軸顯示於圖7A中。在此實驗中，第1天使用siRNA耗竭iPSCM細胞中的內源PKP2表現。siRNA陰性對照或siPKP2使用兩種siRNA濃度：5及1.25 nM。將兩個siPKP2 #3與#4合併以使轉錄本靜默。第3天，使用AAV PKP2轉導所耗竭的細胞，從而拯救iPSCM中所觀測之收縮速度，此為對PKP2轉殖基因表現的反應(圖7B)。AAV轉導後的第3、4、5、6、7及8天，記錄收縮性。對得自以下的收縮速度取平均值：三個96孔盤，及在5 nM與1.25 nM siRNA下分別經AAV 300K MOI或100K MOI轉導的細胞。速度值進一步相對於分別對應於300K或100K MOI的平均核計數標準化。
實例 3 ： 用第二代 PKP2αAAV9 處理
開發用於表現人類或小鼠PKP2α的第二代AAV表現卡匣。第二代卡匣包括土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)及牛生長激素聚腺苷酸化信號(bGH poly(A))。第二代載體繪示於圖8中。
對PKP2靜默的iPSC心肌細胞進行轉殖基因拯救研究。初步結果表明，第二代AAV-hPKP2α部分地拯救iPSC心肌細胞中之PKP2靜默後的收縮速度。圖9A顯示在不同MOI (感染倍率，感染各細胞的病毒顆粒之平均數目)下，人類PKP2α轉殖基因以劑量依賴性方式表現於iPSC心肌細胞中的結果。AAV轉導後第3天，評價可溶性細胞部分與不溶性細胞部分中的PKP2及DSP (橋體斑蛋白)表現。圖9B顯示，在30K MOI下，在PKP2靜默後，人類PKP2α轉殖基因顯示收縮速度得到部分拯救，如司徒頓t檢驗(Student t test)所指示，其p值為0.0103，相比之下，在無AAV PKP2轉殖基因的情況下，p值＜0.0001。
進行實驗以研究12週齡C57BL/6動物中第二代AAV9人類及小鼠PKP2α之表現分析。此實驗之結果顯示於圖10中。動物眼窩後靜脈內分別投與1E13及5E13 vg/kg劑量的AAV9-PKP2α。注射後第3.5週收集心臟LV組織。在此利用西方墨點法分析LV組織的可溶性部分。上圖顯示內源小鼠PKP2α於HBSS對照小鼠中的表現以及內源小鼠PKP2α與經轉導之小鼠PKP2α分別在兩種AAV9注射劑量(1E13及5E13)下的表現。下圖顯示經轉導之人類PKP2α (稍微更大的同源物)的相應表現分析。此人類同源物經密碼子優化。AAV注射後第3.5週，藉由心臟超音波檢查未觀測到不良心臟事件。
圖11A至圖11G顯示，對12週齡C57BL/6動物中之第二代AAV9人類及小鼠PKP2α的實驗性表現安全研究顯示AAV注射後第3週，藉由心臟超音波檢查未出現任何不良心臟事件。動物眼窩後靜脈內分別投與1E13及5E13 vg/kg劑量的AAV9-PKP2α。圖11A顯示AAV9注射之前的體重及AAV9注射後第3週時的體重。圖11B顯示小鼠或人類PKP2α之AAV9注射後第3週時，根據射出分率百分比所量測的心臟功能。圖11C及圖11D顯示根據心舒末期與心縮末期之內部直徑所量測的LV結構。圖11E至圖11F顯示根據QRS、QT間期及P/R波幅所量測的電生理學活性。
實例 4 ： PKP2 - cKO ARVC 小鼠模型表徵
四隻野生型及七隻
PKP2 - cKOARVC小鼠(
αMYHC - Cre - ER ( T2 )、
PKP2
fl / fl )在約3月齡時連續四天腹膜內注射他莫昔芬(20 mg/ml，於玉米油中，每隻小鼠100 μl (約75 mg/kg))。他莫昔芬誘導之前，收集體重、超音波心動描記術及EKG的基線讀數。每週記錄他莫昔芬誘導後的所有讀數，包括B模式、M模式(RV、LV)的超音波心動描記術，以及結構(LV內部直徑)及30分鐘ECG用於定量心律失常及評價電生理學參數。研究結束時收集終末組織，包括心臟及肺。
對小鼠執行存活分析(圖12)。卡普蘭-梅耶存活率曲線顯示，他莫昔芬誘導後的第三週，
PKP2 - cKO小鼠存活率急劇下降，其中僅一個動物活到他莫昔芬誘導後的第六週。誘導後第三週，動物顯示重度臨床症狀，包括猝死、水腫、活動性降低、對異氟醚的耐受性較弱。
PKP2 - cKO小鼠早在他莫昔芬誘導後的第一週時，出現RV擴張型心肌病。圖13A的左圖顯示，他莫昔芬誘導後的第三週，
PKP2 - cKO小鼠在心舒末期出現增加的RV內部尺寸(RVIDd)。圖13A的右圖概括了在他莫昔芬誘導四週期間，相對於體重標準化之RVIDd連續增加。圖13B的左圖顯示RV面積每週增加的影像，其表明RV擴張。圖13B的右圖概括了相對於體重標準化的RV面積增加。P值：司圖頓t檢驗。誤差條：s.e.m. *P＜0.05，**P＜0.01相對於對照。
PKP2 - cKO小鼠在他莫昔芬誘導後出現LV擴張型心肌病。圖14A左圖顯示，他莫昔芬誘導後的第三週，
PKP2 - cKO在心縮末期(LVIDs)和心舒末期(LVIDd)出現增加的LV內部尺寸。圖14A的右圖概括了在他莫昔芬誘導四週期間，相對於體重標準化之LVIDs及RVIDd連續增加。圖14B顯示藉由射出分率%所量測的LV效能，其在他莫昔芬誘導後的第二週之後急劇下降。P值：司圖頓t檢驗。誤差條：s.e.m. *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001相對於對照。
PKP2 - cKO小鼠出現延長的QRS間期及增加的P/R幅比，表明心室傳導紊亂及心室內阻滯。圖15上圖顯示，他莫昔芬誘導後的第三週，
PKP2 - cKO小鼠出現增加的P波幅及降低的R波幅。圖15的左下圖顯示QRS間期連續增加且右下圖顯示他莫昔芬誘導四週期間，P/R幅比增加。P值：司圖頓t檢驗。誤差條：s.e.m. *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001相對於對照。
PKP2 - cKO小鼠出現自發心室性早期收縮(PVC)。表5顯示連續記錄30分鐘期間所得的資料，PVC在第一週時幾乎不存在，而在第二週時，在所有
PKP2 - cKO動物中偵測到偶發性額外心縮期。在稍後的時間，PVC的發生進一步增加，大部分動物顯示逾100 PVC。自第三週開始，在
PKP2 - cKO動物中觀測到心因性猝死。
| 表 5 ： PKP2 - cKO ARVC 小鼠模型 PVC | ||||
| 動物ID | 他莫昔芬誘導後的週數 | |||
| 第1週 | 第2週 | 第3週 | 第4週 | |
| 121 | 0 | 5 | ＞100 | 死亡 |
| 125 | 0 | 12 | 12 | 死亡 |
| 130 | 0 | 2 | 死亡 | 死亡 |
| 137 | 0 | 66 | ＞100 | N/A |
| 138 | 0 | 20 | ＞100 | 死亡 |
| 150 | 0 | 1 | 11 | ＞100 |
| 152 | 4 | 5 | ＞100 | ＞100 |
PKP2 - cKO小鼠顯示纖維化、組織重塑基因及心臟衰竭標記物的表現增強。圖16A上圖顯示野生型小鼠與
PKP2 - cKO小鼠之RV與LV中的PKP2 mRNA表現。紅色及藍色圓點表示各個別小鼠。圖16A的下圖顯示橋粒中之PKP2、DSP及PKG以及間隙連接中之Cx43的LV蛋白質含量降低的代表性免疫墨點。圖16B顯示，
PKP2 - cKO小鼠顯示纖維化基因TGFβ1、Col1a1及Col3a1以及組織重塑基因Timp1及Mmp2的表現增強。圖16C顯示，
PKP2 - cKO小鼠顯示心臟衰竭標記物NPPA及NPPB的表現增強。
實例 5 ： PKP2 基因療法在 PKP2 - cKO ARVC 小鼠模型中的功效
圖17顯示使用
PKP2 - cKOARVC小鼠模型的實驗設計，其用於評價作為基因治療目標的PKP2功效。研究中包括總共六個個別處理組且所有群組皆用他莫昔芬處理連續三天。處理組如下：六隻野生型小鼠用HBSS緩衝液處理；十隻
PKP2 - cKOARVC小鼠用HBSS緩衝液處理；十隻
PKP2 - cKOARVC小鼠在他莫昔芬誘導之前的三週用3E13 vg/kg的AAV9:人類PKP2處理；十隻
PKP2 - cKOARVC小鼠在他莫昔芬誘導之前的三週用5E13 vg/kg的AAV9:小鼠PKP2處理；十隻
PKP2 - cKOARVC小鼠在他莫昔芬誘導之後立即用5E13 vg/kg的AAV9:小鼠PKP2處理；且十隻
PKP2 - cKOARVC小鼠在他莫昔芬誘導之後的第一週時用5E13 vg/kg的AAV9:小鼠PKP2處理。
他莫昔芬誘導之前，收集體重、超音波心動描記術及EKG的基線記錄。每週記錄他莫昔芬誘導後的所有讀數，包括B模式、M模式(RV、LV)的超音波心動描記術，以及結構(LV內部直徑)及30分鐘ECG用於定量心律失常及評價電生理學參數。研究結束時收集終末組織(心臟及肺)。
在野生型小鼠LV心臟組織中偵測到AAV9:PKP2蛋白質表現。圖18A顯示人類及小鼠PKP2α之第二代AAV表現卡匣的示意圖。圖18B顯示所執行的代表性免疫墨點，其顯示眼窩後注射AAV9:PKP2後第三週時的小鼠及人類PKP2表現(全部墨點顯示於圖10中)。總共五隻C57BL6野生型小鼠在八週齡時注射各種治療劑：HBSS、1E13 vg/kg或5E13 vg/kg。
卡普蘭-梅耶存活率曲線顯示，他莫昔芬誘導後的6週之後，AAV9:PKP2使所有AAV9:PKP2處理組中之
PKP2 - cKO小鼠的壽命延長。人類與小鼠PKP2均證明具有使經處理之
PKP2 - cKO小鼠之壽命延長的功效。在圖19中，紅線為經HBSS緩衝液處理的
PKP2 - cKO小鼠，其在他莫昔芬誘導後的三週之後顯示急劇下降。相比之下，所有經AAV9-PKP2處理的小鼠均存活至他莫昔芬誘導後的第20週。
AAV9:PKP2處理
PKP2 - cKO小鼠顯示具有減少RV及LV擴張及維持心臟功能的功效。圖20A顯示，相較於HBSS處理的小鼠(紅線所示)，AAV9:PKP2處理阻止了射出分率百分比下降。圖20B顯示，AAV9:PKP2處理顯示RV擴張減少(基於每週)，如根據相對於體重標準化的RV面積所估計。圖20C顯示，在他莫昔芬誘導後的第四週，AAV9:PKP2處理顯著減少
PKP2 - cKO小鼠的LV擴張，如根據心舒末期的LV內部尺寸(LVIDd)(上圖)與心縮末期的LV內部尺寸(LVIDs)(下圖)(兩者均相對於體重標準化)所量度。誤差條：s.e.m. *P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001相對於對照。
AAV9:PKP2處理亦顯著改善
PKP2 - cKO小鼠的ECG參數。圖21A顯示原始ECG跡線之實例，其顯示AAV9:PKP2處理之
PKP2 - cKO小鼠心臟的電生理學行為顯著改善。圖21B顯示，相較於經HBSS處理之
PKP2 - cKO小鼠(紅線所示)，AAV9:PKP2處理顯示P/R比率(上圖)、QT間期(中圖)及QRS間期(下圖)顯著改善。
AAV9:PKP2處理亦顯著減少
PKP2 - cKO小鼠的心律不齊。圖22A (上圖)顯示一表格，其為分級表以將麻醉之
PKP2 - cKO小鼠之30分鐘記錄期間的自發心律不齊嚴重度分類。心室性早期收縮(IPVC)、早期連接複合體(PJC)、AV阻滯(房室阻滯)、非持久心室性心搏過速(NSVT)、室上性心搏過速(S-VT)及心室纖顫。圖22A (下圖)基於分級表概括了平均評分，其顯示AAV9:PKP2處理之
PKP2 - cKO小鼠之心律不齊改善。圖22B顯示在他莫昔芬誘導後的第四週，各處理組中之個別小鼠的分佈。相較於經HBSS緩衝液處理的
PKP2 - cKO小鼠(紅色條柱所示)，AAV9:PKP2處理顯示心律不齊事件頻率與嚴重度均降低，如改善的心律不齊評分所指示。
實例 6 ： 在 PKP2 - cKO ARVC 小鼠模型中使用 AAV9 : hPKP2 的 PKP2 基因治療功效研究
人類PKP2作為基因治療目標的功效係使用
PKP2 - cKOARVC小鼠模型測定。研究中包括總共五個個別處理組。所有群組用他莫昔芬處理連續三天。群組包括：四隻經HBSS緩衝液處理的野生型小鼠；四隻經HBSS緩衝液處理的
PKP2 - cKOARVC小鼠；在他莫昔芬誘導之後的第一週經1E13 vg/kg之AAV9:人類PKP2處理之四隻
PKP2 - cKOARVC小鼠；經3E13 vg/kg之AAV9:人類PKP2處理之三隻
PKP2 - cKOARVC小鼠，在他莫昔芬誘導之後的第一週處理；及經1E14 vg/kg之AAV9:人類PKP2處理的三隻
PKP2 - cKOARVC小鼠，在他莫昔芬誘導之後的第一週處理。他莫昔芬誘導之前，收集體重、超音波心動描記術及EKG的基線記錄。每週記錄他莫昔芬誘導後的所有讀數，包括B模式、M模式(RV、LV)的超音波心動描記術，以及結構(LV內部直徑)及30分鐘ECG用於定量心律失常及評價電生理學參數。他莫昔芬誘導後的第四週收集終末心臟組織。圖23繪示實驗設計。
他莫昔芬誘導後的第四週，AAV9:hPKP2處理
PKP2 - cKO小鼠顯示減少右心室(RV)及左心室(LV)擴張及維持心臟功能的功效。圖24A至圖24D顯示此分析的結果。相較於HBSS處理的小鼠，AAV9:hPKP2處理阻止射出分率百分比下降(圖24A)。AAV9:hPKP2處理顯示RV擴張減少，如根據相對於體重標準化的RV面積所估計(圖24B)。AAV9:hPKP2處理顯著減少
PKP2 - cKO小鼠的LV擴張，如根據心舒末期的LV內部尺寸(LVIDd)(圖24C)與心縮末期的LV內部尺寸(LVIDs)(圖24D)(均相對於體重標準化)所量度。P值係藉由司圖頓t檢驗來測定，誤差條：s.e.m. *P＜0.05，**P＜0.01，相較於對照。
相較於經HBSS處理的
PKP2 - cKO小鼠，AAV9:hPKP2處理的
PKP2 - cKO小鼠顯示他莫昔芬誘導後第四週QT間期顯著縮減(圖25上圖)、P/R比率有降低傾向(圖25中圖)及心律不齊有減少傾向(圖25下圖)。P值係藉由司圖頓t檢驗來測定，誤差條為s.e.m。*P＜0.05，相較於對照。由於此研究中包括的動物數目少，因此P/R比率及心律不齊評分未達到統計顯著性。另外，HBSS處理組中之一隻動物在他莫昔芬誘導後的約第4週、在ECG記錄之後達到人道終點。在超音波心動描記術之前發現1e13劑量組中之一隻動物死亡。總體而言，此研究的結果表明最佳有效劑量為3e13 vg/kg。
他莫昔芬誘導後的第四週，AAV9:hPKP2處理
PKP2 - cKO小鼠顯示減少右心室(圖26A)與左心室(圖26B)中之心臟衰竭標記物、纖維化及組織重塑基因表現的功效。分別估算野生型對照、
PKP2 - cKO及AAV9:hPKP2轉導之心臟中之PKP2的內源及轉殖基因mRNA含量。心臟衰竭標記物為NPAA及NPPB。纖維化基因為Col1a1及Col3a1。組織重塑基因為Timp1。
他莫昔芬誘導後的第四週，AAV9:hPKP2處理
PKP2 - cKO小鼠顯示減少右心室與左心室中之纖維化發展的功效(圖27A)。肌肉染色以紅色顯示且纖維化的三色染色法染色呈藍色。箭頭突顯
PKP2 - cKO小鼠心臟中有顯著纖維化的區域。圖27B中定量膠原蛋白，其顯示AAV9:hPKP2處理使膠原蛋白幾乎降低至對照含量。
AAV9:hPKP2處理
PKP2 - cKO小鼠顯示人類PKP2轉殖基因出現劑量依賴性表現。他莫昔芬誘導後的第四週時，估算LV組織之可溶性(圖28A)及不溶性(圖28B)部分中之PKP2及其他橋粒蛋白質DSP及PKG的總表現量。在可溶性部分中未偵測到DSP。注意*：在超音波心動描記術之前發現此動物死亡。**PKP2蛋白質強度在相同的西方墨點圖上相對於微管蛋白強度標準化。為簡單起見，圖28A-B中顯示兩個微管蛋白墨點中之僅一者。PKP2顯示兩個色帶：內源小鼠PKP2及較大的人類PKP2。
實例 7 ： 經由 NHP 的 定向演化進行 AAV 蛋白殼 工程改造
此實例揭示AAV9蛋白殼的定向演化，以鑑別心臟轉導率較高及/或心臟/肝臟遷移比率高(「肝臟脫靶」)的變異體。在臨床使用中，較高的心臟轉導率可使得治療性基因遞送更高效，且從而在相同劑量下產生更佳功效或使得達到所需功效的劑量要求更低。較高的心臟/肝臟比率可以減少與肝臟病毒負荷高有關的毒性及副作用，同時使心臟基因遞送不受影響或改善。
文庫產生及 AAV 選擇
AAV9蛋白殼上的可變區(VR-IV及VR-VIII位點)顯示於圖29中。利用文庫篩選策略(
圖 30)鑑別出新穎AAV蛋白殼變異體以便經由全身投與達成更佳的心臟基因遞送。經由合成編碼隨機胺基酸殘基的寡核苷酸池或在AAV9蛋白殼之病毒蛋白(VP)中的所選位置設計插入及取代來產生超過2億種蛋白殼變異體的文庫。將寡核苷酸池選殖入
圖 31所描繪之重組載體基因體的蛋白殼(
cap)基因中，從而將蛋白殼(
cap)基因置放於P40啟動子的控制下以在活體外表現蛋白殼蛋白VP1、VP2及VP3，藉此產生含有經修飾之VP蛋白質的感染性病毒粒子。P40啟動子的上游包括US 2022/0031866 A1中所述的短心肌鈣蛋白(TNNT2)啟動子，以在活體內驅動心肌細胞中之蛋白殼mRNA轉錄本表現，從而能夠偵測到心臟中的病毒mRNA。此設計有助於選擇僅遷移至所需器官(心臟)且在細胞中表現轉殖基因的彼等AAV病毒粒子。當注射至個體中時，若囊封的AAV病毒粒子遷移至心臟、進入細胞且將轉殖基因遞送至細胞核，則
cap基因表現於心臟中。因此，心臟中表現的mRNA應為與具有所需向性之AAV病毒粒子對應的mRNA。可藉由DNA偵測脫靶遷移。AAV病毒粒子遷移至目標使得載體基因體DNA存在於該組織中。
藉由彙集
表 6中所列出之七個子文庫來形成文庫。在子文庫1中，將變異型AAV9蛋白殼之蛋白殼序列中之VR-IV位點的位置隨機化；變異型AAV9蛋白殼在其VR-VIII位點中具有人工序列ANYG (置換原生SAQA序列)。在子文庫2至7中，將AAV9蛋白殼之VR-VIII位點的位置隨機化。
| 表6 . 變異體文庫 | |
| 子文庫編號 | 描述 |
| 1 | 位置586-589 (VR-VIII位點)之SAQA序列經ANYG置換 位置452-458 (VR-IV位點)經NNNNNNN置換，其中N表示隨機胺基酸 |
| 2 | 在位置582-588中之每一者插入的雙胺基酸 所有2800種可能的變異體 (七個位置×400種可能的雙胺基酸插入) |
| 3 | 藉由機器學習算法預測到位置581-594經序列置換 200種變異體 |
| 4 | 位置582-584、583-585、584-586、585-587、586-588 或587-589經NXN置換，其中N表示隨機胺基酸，且X表示參考序列中的胺基酸 所有2394種可能變異體 |
| 5 | 位置581-594中之每一者處的單個胺基酸取代 所有266種可能變異體 |
| 6 | 位置585-590經六殘基隨機序列置換 |
| 7 | 位置587之單個胺基酸取代及位置589之單個胺基酸插入 |
如
圖 29及
圖 30中所示，使用習知HEK293T AAV產生系統封裝理論上包括超過2億cap基因序列的此等初始文庫，其中將腺病毒輔助質體、AAV2 REP質體及CAP文庫質體轉染至HEK293T細胞中。72小時之後收集細胞溶解物且藉由碘克沙醇(iodixanol)梯度超速離心來純化AAV病毒粒子。將所得AAV病毒粒子池以每公斤體重5E+12個病毒基因體靜脈內注射至三隻食蟹獼猴中。注射後的第4週處死動物，且自心臟及肝臟獲取切片。自心臟樣本中分離出RNA且擴增病毒轉錄本且藉由下一代定序進行定序，以偵測轉導心臟的新穎變異體。自肝臟樣本中分離出DNA且擴增病毒基因體序列且藉由下一代定序(NGS)進行定序，以偵測感染肝臟的變異體。對定序結果使用計算分析，選出約7800種具有高心臟轉導率、高心臟/肝臟比率或兩者的變異體。
如下執行第二輪篩選：再合成且選殖編碼所選7800種變異體的DNA序列、表現AAV病毒粒子且將所得AAV池以每公斤體重1E+13個病毒基因體靜脈內注射至兩隻食蟹獼猴中。注射後的第4週處死動物，且自心臟及肝臟獲取切片。自心臟樣本中分離出RNA且擴增病毒轉錄本且藉由下一代定序進行定序，以偵測轉導心臟的新穎變異體。自肝臟樣本中分離出DNA且擴增病毒基因體序列且藉由下一代定序(NGS)進行定序，以偵測感染肝臟的變異體。NGS之後，對第二輪篩選進行計算分析，鑑別出102種新穎AAV蛋白殼在心臟轉導、心臟/肝臟比率方面或兩者優於AAV9。
篩選結果
圖 32標繪得自第二輪篩選的資料。將所有可偵測變異體(包括各種變異體的兩個或更多個同義密碼子複本)作圖。如下獲得心臟轉導及肝臟感染量測結果：對自心臟切片回收的病毒轉錄本或自肝臟切片回收的病毒基因體序列進行深度定序；基於下一代定序的各讀段鑑別變異體編碼序列；對各種獨特變異體的出現計數且將各種獨特變異體的讀段計數相對於該切片的讀段總數目標準化。吾等亦將各種獨特變異體的頻率相對於其在輸入病毒文庫中的豐度標準化。吾等報導各種獨特變異體之頻率(相對於存在於樣本輸入病毒文庫中之AAV9對照之頻率)且計算所得比率的log2值。將心臟mRNA豐度(心肌細胞之感染量度)相對於肝臟DNA豐度(遷移至肝臟的量度)作圖。
圖 33A 至 圖 33C標繪因具有所需特性(相對於AAV9的高心臟轉導率、相對於AAV9的高心臟/肝臟比率，或兩者)而被選擇的102種變異體。
圖 33A在x軸上標繪102種所選變異體的心臟轉導率量測值且在y軸上標繪心臟/肝臟比率。藉由將各種變異體之心臟轉導率量測值除以肝臟感染量測值來計算心臟/肝臟比率。所有值均以相對於AAV9的變化倍數顯示。心臟轉導率改善的變異體以空心圓顯示。心臟/肝臟比率改善的變異體(「肝臟脫靶」)以空心三角形顯示。心臟轉導率改善與心臟/肝臟比率改善的變異體以實心圓顯示。
圖 33B顯示
表 6中之1號子文庫的變異體子集，其具有隨機化VR-IV (AAV9 VP1的胺基酸452至458)與經取代的VR-VIII (AAV9 VP1的胺基酸586至589)。量測值與
圖 33A中的量測值相同。
圖 33C顯示具有經修飾之VR-VIII (AAV9 VP1的胺基酸581至594)的新穎變異體。量測值與
圖 33A中的量測值相同。
在小鼠模型中再測試
在小鼠中測試所選AAV變異體以證實相對於AAV9的效能。
如
圖 34中所示，使用五種所選蛋白殼序列ZC377、ZC399、ZC407、ZC425及ZC469以及參考AAV9蛋白殼序列產生具有載體基因體的AAV病毒粒子，該載體基因體編碼EGFP且由TNNT2啟動子驅動。所得AAV病毒粒子各自經由眼窩後投與、以每個動物一種蛋白殼、以每公斤體重6E+12個病毒基因體注射至6週齡小鼠中。第三週處死動物，且收集心臟及肝臟。藉由ELISA偵測心臟溶解物中之EGFP蛋白質來量測心臟轉導率且藉由qPCR、以自肝臟樣本回收之DNA中的EGFP編碼序列為目標來量測肝臟病毒負荷。
圖 35A 至 圖 35C顯示所選變異體及AAV9參考物的心臟轉導率(
圖 35A)、肝臟病毒負荷(
圖 35B)及心臟/肝臟比率(
圖 35C)量測值。所有數值均以相對於AAV9對照的變化倍數顯示。各點表示一隻動物的資料。ZC399顯示平均心臟轉導率為AAV9的約1.8倍。ZC399及ZC407顯示肝臟病毒負荷低於AAV9且心臟/肝臟比率為AAV9的約20倍。
所選蛋白殼變異體之序列分析
所選變異體的序列提供於
表 7及
表 8中。
| 表7 ：VR-IV 變異體 | |||||
| 標識符編號 | VP1 SEQ ID NO: | VR-IV (452-458) | VR-IV SEQ ID NO: | VR-VIII (581-594) | VR-VIII SEQ ID NO: |
| ZC377 | 488 | KGSGQNQ | 590 | ATNHQ ANYG QAQTG | 598 |
| ZC378 | 489 | NASGQNQ | 591 | ATNHQ ANYG QAQTG | 598 |
| ZC379 | 490 | NGTGQNQ | 592 | ATNHQ ANYG QAQTG | 598 |
| ZC380 | 491 | NGSGLNQ | 593 | ATNHQ ANYG QAQTG | 598 |
| ZC381 | 492 | ANDNKLI | 594 | ATNHQ ANYG QAQTG | 598 |
| ZC382 | 493 | VNDNKVI | 595 | ATNHQ ANYG QAQTG | 598 |
| ZC383 | 494 | NGSGQNH | 596 | ATNHQ ANYG QAQTG | 598 |
| ZC384 | 495 | ANDNKVI | 597 | ATNHQ ANYG QAQTG | 598 |
| 表8 ：VI-VIII 變異體 | |||
| 標識符編號 | VP1 SEQ ID NO: | VR-VIII (581-594) | VR- VII SEQ ID NO: |
| ZC385 | 496 | ATNHTSFQAQAQTG | 599 |
| ZC386 | 497 | ATNHCSAQAQAQTG | 600 |
| ZC387 | 498 | ATNHVDSLRIAQTG | 601 |
| ZC388 | 499 | ATNRQTAQAQAQTG | 602 |
| ZC389 | 500 | ATNHTGTSIIAQTG | 603 |
| ZC390 | 501 | ATNHLSNFNSAQTG | 604 |
| ZC391 | 502 | ATNHCTLNSIAQTG | 605 |
| ZC392 | 503 | ADVQQKPGSQIQTQ | 606 |
| ZC393 | 504 | ATNHNMNRVNAQTG | 607 |
| ZC394 | 505 | ATNHNNVISGAQTG | 608 |
| ZC395 | 506 | ATNHSNSVQSAQTG | 609 |
| ZC396 | 507 | ATNHQSPIAQAQAQTG | 610 |
| ZC397 | 508 | ATNHLSKVFDAQTG | 611 |
| ZC398 | 509 | ATNHQSAITQAQAQTG | 612 |
| ZC399 | 510 | ATNHSSTFQGAQTG | 613 |
| ZC400 | 511 | ATNHNSIQAQAQTG | 614 |
| ZC401 | 512 | ATNHMMTTARAQTG | 615 |
| ZC402 | 513 | ATNHQGAYAQAQTG | 616 |
| ZC403 | 514 | ALNKQSAQAQAQTG | 617 |
| ZC404 | 515 | ATNHENTVSIAQTG | 618 |
| ZC405 | 516 | ATNHVSSFTSAQTG | 619 |
| ZC406 | 517 | ATNHPSIHQGAQTG | 620 |
| ZC407 | 518 | ATNHSTTNFRAQTG | 621 |
| ZC408 | 519 | ATNHQHYSAQAQAQTG | 622 |
| ZC409 | 520 | ATNKQTAQAQAQTG | 623 |
| ZC410 | 521 | ATNHSSIFNSAQTG | 624 |
| ZC411 | 522 | ATNHAGNYNNAQTG | 625 |
| ZC412 | 523 | AEVQQSSMSQAQTD | 626 |
| ZC413 | 524 | AANVQSAQAQAQTG | 627 |
| ZC414 | 525 | ATNYQQAQAQAQTG | 628 |
| ZC415 | 526 | ATNHQSVQGAQAQTG | 629 |
| ZC416 | 527 | ATNHGSILTHAQTG | 630 |
| ZC417 | 528 | ATNHQLFSKNAQTG | 631 |
| ZC418 | 529 | AANMQSAQAQAQTG | 632 |
| ZC419 | 530 | ATNQQIAQAQAQTG | 633 |
| ZC420 | 531 | ATNTYHQSAQAQAQTG | 634 |
| ZC421 | 532 | ATNHCDPLHIAQTG | 635 |
| ZC422 | 533 | ATNHTSVISIAQTG | 636 |
| ZC423 | 534 | ATNHQLASAQAQTG | 637 |
| ZC424 | 535 | ATNHQVTSAQAQAQTG | 638 |
| ZC425 | 536 | ATNHHSRVEIAQTG | 639 |
| ZC426 | 537 | ATNHTSFTWTAQTG | 640 |
| ZC427 | 538 | ATNHQSAPTQAQAQTG | 641 |
| ZC428 | 539 | ATNHNSTYLGAQTG | 642 |
| ZC429 | 540 | ATNHQIAQAQAQTG | 643 |
| ZC430 | 541 | ATNHQAISAQAQAQTG | 644 |
| ZC431 | 542 | ATNHLSVVYNAQTG | 645 |
| ZC432 | 543 | ATNHMHQSAQAQAQTG | 646 |
| ZC433 | 544 | ATNHETSRLNAQTG | 647 |
| ZC434 | 545 | AFNWQSAQAQAQTG | 648 |
| ZC435 | 546 | ATNHNTVMLGAQTG | 649 |
| ZC436 | 547 | ATNHESSMLNAQTG | 650 |
| ZC437 | 548 | ATNHASITSSAQTG | 651 |
| ZC438 | 549 | ARNEQSAQAQAQTG | 652 |
| ZC439 | 550 | ATNHANLYQMAQTG | 653 |
| ZC440 | 551 | ATNHQFATAQAQTG | 654 |
| ZC441 | 552 | ATNFNHQSAQAQAQTG | 655 |
| ZC442 | 553 | ATNHMSHQAQAQTG | 656 |
| ZC443 | 554 | ATNHQWMSAQAQAQTG | 657 |
| ZC444 | 555 | ATNHQSGQQAQAQTG | 658 |
| ZC445 | 556 | ATNHSSAQAQAQTG | 659 |
| ZC446 | 557 | ATNHTTKTMFAQTG | 660 |
| ZC447 | 558 | ATNHSSIIYSAQTG | 661 |
| ZC448 | 559 | ATNHMLLKSNAQTG | 662 |
| ZC449 | 560 | ATNHESMQAQAQTG | 663 |
| ZC450 | 561 | ATNHQMLSAQAQAQTG | 664 |
| ZC451 | 562 | ATNHSGRDSYAQTG | 665 |
| ZC452 | 563 | ATNHINVISGAQTG | 666 |
| ZC453 | 564 | ATNHVSNQAQAQTG | 667 |
| ZC454 | 565 | ATNHNTKLAIAQTG | 668 |
| ZC455 | 566 | ATNHSSSYNNAQTG | 669 |
| ZC456 | 567 | ATNATHQSAQAQAQTG | 670 |
| ZC457 | 568 | ATNHLRDNISAQTG | 671 |
| ZC458 | 569 | ATNHSSFSVGAQTG | 672 |
| ZC459 | 570 | ATNHVNRNLSAQTG | 673 |
| ZC460 | 571 | ATNHHNPSINAQTG | 674 |
| ZC461 | 572 | ATNHQDARAQAQTG | 675 |
| ZC462 | 573 | ATNDQRAQAQAQTG | 676 |
| ZC463 | 574 | ATNVQTAQAQAQTG | 677 |
| ZC464 | 575 | APNRQSAQAQAQTG | 678 |
| ZC465 | 576 | ATNRQIAQAQAQTG | 679 |
| ZC466 | 577 | ATNHEDNIRRAQTG | 680 |
| ZC467 | 578 | ATNHNRNGLLAQTG | 681 |
| ZC468 | 579 | ATNHESTSVRAQTG | 682 |
| ZC469 | 580 | ATNHNIRTEMAQTG | 683 |
| ZC470 | 581 | ATNHQTLFNSAQTG | 684 |
| ZC471 | 582 | ATNHHSWQAQAQTG | 685 |
| ZC472 | 583 | ATNHSTKSLIAQTG | 686 |
| ZC473 | 584 | ATNHQKLLVNAQTG | 687 |
| ZC474 | 585 | ATNHLSVSSIAQTG | 688 |
| ZC475 | 586 | ATNHVSNLYGAQTG | 689 |
| ZC476 | 587 | ATNRQMAQAQAQTG | 690 |
| ZC477 | 588 | ATNHEDIIRSAQTG | 691 |
| ZC478 | 589 | ATNHCSTSIRAQTG | 692 |
對VR-VIII位點中具有插入的變異體進行人工比對以顯示插入。結果顯示於
表 9中。
| 表9 | ||||
| 標識符編號 | 比對 | SEQ ID NO: | 插入位置( 後面) | 插入 |
| ZC396 | N--H--Q--SPIA--Q | 693 | 586 | PI |
| ZC398 | N--H--Q--S--AITQ | 694 | 587 | IT |
| ZC408 | N--H--QHYS--A--Q | 695 | 585 | HY |
| ZC420 | NTYH--Q--S--A--Q | 696 | 583 | TY |
| ZC424 | N--H--QVTS--A--Q | 697 | 585 | VT |
| ZC427 | N--H--Q--S--APTQ | 698 | 587 | PT |
| ZC430 | N--H--QAIS--A--Q | 699 | 585 | AI |
| ZC432 | N--HMHQ--S--A--Q | 700 | 584 | MH |
| ZC441 | NFNH--Q--S--A--Q | 701 | 583 | FN |
| ZC443 | N--H--QWMS--A--Q | 702 | 585 | WM |
| ZC450 | N--H--QMLS--A--Q | 703 | 585 | ML |
| ZC456 | NATH--Q--S--A--Q | 704 | 583 | AT |
如下文所述進一步測試所選變異體序列。
預示性實例 8 ： 在靈長類動物中進行的驗證型再篩選
在靈長類動物中測試所選AAV變異體以證實相對於AAV9的效能。為了使用其他動物執行實驗，使用類似於原始篩選方案的池注射及篩選策略。
使用攜載由TNNT2啟動子驅動之條碼化EGFP報導體的轉殖基因卡匣個別地封裝所有102種新穎蛋白殼。彙集所得AAV病毒粒子且經由靜脈內投與注射至食蟹獼猴中。注射後的第4週，處死動物，且自心臟及肝臟以及其他組織獲得切片。自心臟樣本中分離出RNA。擴增病毒轉錄本上的條碼化區域且下一代定序進行定序。利用相應條碼的標準化讀段計數來定量各種變異體的心臟轉導能力。自肝臟樣本中分離出DNA。病毒轉殖基因上的條碼化區域以與心臟RNA樣本相同的方式處理。利用相應條碼的標準化讀段計數來定量各種變異體的肝臟向性。
在小鼠中並行執行類似研究。
實例 9 ： 中和抗體流行率研究
針對所彙集的人類IgG樣本以及個別人類血清樣本分析所選蛋白殼。逃避所彙集之IgG中和的能力及血清陰性人類個體的百分比增加表示患者覆蓋率潛在地比AAV9寬。
實例 10 ： 在靈長類動物中進行的生物分佈研究
在食蟹獼猴的生物分佈研究中，測試所選蛋白殼及AAV9對照。各動物接受一種測試物且各種測試物用三隻動物測試。檢查不同器官及組織中的轉導及病毒基因體分佈。
實例 11 ： 轉導特性改善的新穎 AAV 蛋白殼
此研究之目的係鑑別具有優異特性(諸如改善的轉導)的新穎AAV蛋白殼變異體。具有經修飾之VR-VIII (胺基酸585至590，AAV9 VP1編號)的蛋白殼進一步在胺基酸452 (AAV9 VP1編號，天冬醯胺酸/Asn/N452)經修飾(
圖 36A；
表 8 及 9中的突變)。所得蛋白殼變異體個別地使用條碼化轉殖基因卡匣封裝，彙集在一起且在非人類靈長類動物(食蟹獼猴/食蟹獼猴/獼猴)、CD-1小鼠及人類iPSC衍生之心肌細胞(iPSC-CM)中加以測試。本文所提供之劑量表示池中之病毒之總量。經由靜脈內推注投與向食蟹獼猴及豬投與1E+13 vg/kg的病毒且在注射之後的第4週收集組織。經由眼窩後投與向兩組小鼠投與病毒：以1E+13 vg/kg投與三隻小鼠且以5E+13 vg/kg投與三隻小鼠，且在注射後的第18天收集組織。對於iPSC-CM來說，向兩個細胞群投與不同劑量(1.6E+4 vg/細胞及1.6E+5 vg/細胞)的病毒且在隨後第4天收集樣本。藉由下一代定序(NGS)定量條碼來量測蛋白殼變異體於不同器官(諸如心臟、肝臟、腦、骨骼肌)及iPSC-CM中的轉導/病毒負荷量(
圖 36B)。顯示小鼠及iPSC之兩種劑量水平組的平均值。
使用篩選之一些經鑑別突變蛋白殼的實驗顯示於
圖 37中。特定而言，ZC404 (SEQ ID NO: 618)、ZC470 (SEQ ID NO: 684)、ZC428 (SEQ ID NO: 642)及ZC416 (SEQ ID NO: 630)為具有VR-VIII修飾的變異體。其在獼猴心臟、獼猴肝臟、小鼠心臟、小鼠肝臟及人類iPSC-CM中的轉導及病毒負荷水平以白色條杠顯示於
圖 37中。將N452K突變引入此等蛋白殼中(
表 8 及 9)產生四種組合型蛋白殼：ZC373 (SEQ ID NO: 705)、ZC374 (SEQ ID NO: 706)、ZC375 (SEQ ID NO: 707)及ZC376 (SEQ ID NO: 708)，且量測其在獼猴心臟、獼猴肝臟、小鼠心臟、小鼠肝臟及人類iPSC-CM中的轉導/病毒負荷水平，結果以深色/陰影條杠顯示於
圖 37中。相較於原始VR-VIII變異體，所有此等組合型蛋白殼顯示改善的轉導/病毒負荷(尤其在心臟中)，顯示N452K可增強基於AAV9之蛋白殼的轉導，不論已在蛋白殼之其他區域中產生何種修飾。
亦產生以N452K突變作為唯一修飾的蛋白殼(ZC537)。另外，產生蛋白殼ZC531、ZC532、ZC533、ZC534、ZC535、ZC536、ZC538、ZC539、ZC540、ZC541、ZC542，其中VR-VIII中除其他突變之外亦含有N452K突變。
表 8 .新穎VP1蛋白殼
VP1蛋白殼序列包含在581至594之間的位置修飾的SEQ ID NO: 1，如此表中所指示
表 9 .某種新穎VP1蛋白殼中的VR-VIII及N452取代*
*表中無輸入 = 無取代
注意：表9中的所有蛋白殼(i)分別在位置581、582、583及584具有ATNH；以及(ii)分別在位置591、592、593及594具有AQTG。
| 蛋白殼標識符編號 | 位置452 | VR-VIII 比對(581-594) | VR-VIII SEQ ID NO: | VP1 蛋白殼SEQ ID NO: |
| ZC373 | K | ATNH ENTVSIAQTG | 618 | 705 |
| ZC374 | K | ATNH QTLFNSAQTG | 684 | 706 |
| ZC375 | K | ATNH NSTYLGAQTG | 642 | 707 |
| ZC376 | K | ATNH GSILTHAQTG | 630 | 708 |
| ZC404 | N | ATNH ENTVSIAQTG | 618 | 515 |
| ZC470 | N | ATNH QTLFNSAQTG | 684 | 581 |
| ZC428 | N | ATNH NSTYLGAQTG | 642 | 539 |
| ZC416 | N | ATNH GSILTHAQTG | 630 | 527 |
| ZC531 | K | ATNH MMTTARAQTG | 615 | 767 |
| ZC532 | K | ATNH CSTSIRAQTG | 692 | 768 |
| ZC533 | K | ATNH QGAYAQAQTG | 616 | 769 |
| ZC534 | K | ATNH NTKLAIAQTG | 668 | 770 |
| ZC535 | K | ATNH VSSFTSAQTG | 619 | 771 |
| ZC536 | K | ATNH EDNIRSAQTG | 726 | 772 |
| ZC537 | K | ATNH QSAQAQAQTG | 5 | 773 |
| ZC538 | K | ATNH NNVISGAQTG | 608 | 774 |
| ZC539 | K | ATNH TGTSIIAQTG | 603 | 775 |
| ZC540 | K | ATNH QWMSAQAQAQTG | 657 | 776 |
| ZC541 | K | ATNH QDARAQAQTG | 675 | 777 |
| ZC542 | K | ATNH QHYSAQAQAQTG | 622 | 778 |
| AAV9 | ATNH QSAQAQAQTG | 5 | 1 |
| 蛋白殼標識符編號 | 位置585 | 位置586 | 位置587 | 位置588 | 位置589 | 位置590 | 位置452 |
| ZC373 | Q585E | S586N | A587T | Q588V | A589S | Q590I | N452K |
| ZC374 | S586T | A587L | Q588F | A589N | Q590S | N452K | |
| ZC375 | Q585N | A587T | Q588Y | A589L | Q590G | N452K | |
| ZC376 | Q585G | A587I | Q588L | A589T | Q590H | N452K | |
| ZC404 | Q585E | S586N | A587T | Q588V | A589S | Q590I | |
| ZC470 | S586T | A587L | Q588F | A589N | Q590S | ||
| ZC428 | Q585N | A587T | Q588Y | A589L | Q590G | ||
| ZC416 | Q585G | A587I | Q588L | A589T | Q590H | ||
| ZC531 | Q585M | S586M | A587T | Q588T | Q590R | N452K | |
| ZC532 | Q585C | A587T | Q588S | A589I | Q590R | N452K | |
| ZC533 | S586G | Q588Y | N452K | ||||
| ZC534 | Q585N | S586T | A587K | Q588L | Q590I | N452K | |
| ZC535 | Q585V | A587S | Q588F | A589T | Q590S | N452K | |
| ZC536 | Q585E | S586D | A587N | Q588I | A589R | Q590S | N452K |
| ZC537 | N452K | ||||||
| ZC538 | Q585N | S586N | A587V | Q588I | A589S | Q590G | N452K |
| ZC539 | Q585T | S586G | A587T | Q588S | A589I | Q590I | N452K |
| ZC541 | S586D | Q588R | N452K | ||||
| ZC369 | Q585N | S586I | A587R | Q588T | A589E | Q590M | N452K |
| ZC370 | Q585S | S586T | A587T | Q588N | A589F | Q590R | N452K |
| AAV9 |
因此，經鑑別的蛋白殼在VR-VIII的指定位置包含指定的胺基酸(其中唯一胺基酸或最後一個胺基酸對應於未修飾的AAV9胺基酸)：
表 11 .某種新穎VP1蛋白殼中的VR-VIII插入
實例 12 ： 利用多種哺乳動物模型表徵新穎 AAV 蛋白殼
| 581 | 582 | 583 | 584 | 585 | 586 | 587 | 588 | 589 | 590 | 591 | 592 | 593 | 594 |
| A | T | N | H | E, N, G, M, C, V, T, Q | N, T, M, G, D, S | T, L, I, K, S, N, V, A | V, F, Y, L, T, S, I, R, Q | S, N, L, T, I, R, A | I, S, G, H, R, Q | A | Q | T | G |
| 蛋白殼標識符編號 | 位置452 | VR-VIII 比對(581-594) | VR-VIII SEQ ID NO: | 註釋 |
| ZC540 | K | ATNHQ WMSAQAQAQTG | 657 | WM插入位置586之前(SEQ ID NO: 1之位置585與586之間) |
| ZC542 | K | ATNHQ HYSAQAQAQTG | 622 | HY插入位置586之前(SEQ ID NO: 1之位置585與586之間) |
| AAV9 | N | ATNHQ SAQAQAQTG | 5 |
此研究之目的係比較上述新穎AAV蛋白殼在多種模型(包括非人類靈長類動物、小鼠、豬及活體外人類iPSC-CM)中的效能。個別地封裝新穎AAV蛋白殼及對照蛋白殼，且使用條碼化轉殖基因卡匣，基於蛋白殼轉導分析能夠實現彙集式下一代定序(
圖 38)。以均等的病毒基因體比率為目標將病毒彙集在一起且活體內在食蟹獼猴、CD-1小鼠及豬中以及活體外對人類iPSC衍生之心肌細胞測試病毒池。向動物及細胞投與病毒，且收集組織，如
實例 11中所述。為了量測轉導效率及/或病毒負荷，收集心臟組織、肝臟組織及iPSC-CM，隨後進行RNA及DNA萃取。自RNA及DNA樣本擴增條碼化區域且藉由下一代定序進行定序。各條碼之RNA或DNA原始讀段計數相對於定序操作中的總讀段數標準化且相對於初始病毒池中的豐度標準化。計算屬於相同蛋白殼之多個條碼的平均量測值，以測定蛋白殼的轉導效率或病毒負荷。
根據心臟組織中的RNA信號量測心臟轉導。根據肝臟組織中的DNA信號量測肝臟病毒負荷。藉由將心臟轉導率除以肝臟病毒負荷來測定心臟/肝臟比率。根據RNA信號來測定對iPSC-CM的轉導效率。根據HEK293T產生系統中的病毒產量來測定封裝評分。分別顯示食蟹獼猴、小鼠、豬及iPSC-CM之4隻動物、3隻動物、6隻動物或感染倍率2的平均量測值(
圖 39A 及圖 39B)。
圖 39A 及圖 39B表示整個資料集熱圖。熱圖上的各行表示一種蛋白殼且各列表示一種樣本類型。白色意謂較高值且深色意謂較低值，其中中值灰階代表野生型AAV9對照。蛋白殼依據其在食蟹獼猴中的心臟/肝臟比率自左向右排序。AAV9-1、AAV9-2及AAV9-3皆為野生型AAV9蛋白殼，其充當對照複本。CR9-10、TN47-10及TN44-07揭示於WO 2021/216456 A2中(藉由提及相同蛋白殼名稱)，其揭示內容以引用的方式特定併入本文中。本文揭示其他蛋白殼之序列。
例示性新穎蛋白殼選自
圖 39A及
圖 39B中的篩選
( 表 10)以評價跨越不同物種的轉導效率。相對於野生型AAV9對照的效能，評價四種新穎蛋白殼及AAV9對照於食蟹獼猴(淺灰色條杠)、小鼠(白色條杠)及豬(深色條杠)中的心臟/肝臟比率、心臟轉導率及肝臟病毒負荷量測值(
圖 40)。如上文所述向動物投與病毒且收集組織。
圖 41中具體地顯示非人類靈長類動物(NHP)的此等比率(食蟹獼猴)。新穎蛋白殼顯示所有三個物種的心臟/肝臟比率改善，證明物種一致性。另外，在NHP中，相對於AAV9，新穎蛋白殼顯示改善的心臟/肝臟比率、至少類似的心臟轉導率及較小的肝臟病毒負荷。
表 10 .研究中使用的蛋白殼
實例 13 ： 排序靠前的新穎蛋白殼當個別地投與時顯示優異的效能
| 標識符編號 | VP1 蛋白殼 SEQ ID NO |
| ZC373 | 705 |
| ZC374 | 706 |
| ZC375 | 707 |
| ZC376 | 708 |
| ACE5 | 709 |
| ACE10 | 710 |
| AAV9-1/2/3 | 1 |
| CR9-10 | 404 |
| TN44-07 | 457 |
| TN47-10 | 458 |
| ZC377 | 488 |
| ZC378 | 489 |
| ZC379 | 490 |
| ZC380 | 491 |
| ZC381 | 492 |
| ZC382 | 493 |
| ZC383 | 494 |
| ZC384 | 495 |
| ZC385 | 496 |
| ZC386 | 497 |
| ZC387 | 498 |
| ZC388 | 499 |
| ZC389 | 500 |
| ZC390 | 501 |
| ZC391 | 502 |
| ZC392 | 503 |
| ZC393 | 504 |
| ZC394 | 505 |
| ZC395 | 506 |
| ZC396 | 507 |
| ZC397 | 508 |
| ZC398 | 509 |
| ZC399 | 510 |
| ZC400 | 511 |
| ZC401 | 512 |
| ZC402 | 513 |
| ZC403 | 514 |
| ZC404 | 515 |
| ZC405 | 516 |
| ZC406 | 517 |
| ZC407 | 518 |
| ZC408 | 519 |
| ZC409 | 520 |
| ZC410 | 521 |
| ZC411 | 522 |
| ZC412 | 523 |
| ZC413 | 524 |
| ZC414 | 525 |
| ZC415 | 526 |
| ZC416 | 527 |
| ZC417 | 528 |
| ZC418 | 529 |
| ZC419 | 530 |
| ZC420 | 531 |
| ZC421 | 532 |
| ZC422 | 533 |
| ZC423 | 534 |
| ZC424 | 535 |
| ZC425 | 536 |
| ZC427 | 538 |
| ZC428 | 539 |
| ZC429 | 540 |
| ZC431 | 542 |
| ZC432 | 543 |
| ZC433 | 544 |
| ZC434 | 545 |
| ZC435 | 546 |
| ZC436 | 547 |
| ZC438 | 549 |
| ZC439 | 550 |
| ZC440 | 551 |
| ZC441 | 552 |
| ZC442 | 553 |
| ZC443 | 554 |
| ZC444 | 555 |
| ZC445 | 556 |
| ZC446 | 557 |
| ZC447 | 558 |
| ZC448 | 559 |
| ZC449 | 560 |
| ZC450 | 561 |
| ZC451 | 562 |
| ZC452 | 563 |
| ZC453 | 564 |
| ZC454 | 565 |
| ZC455 | 566 |
| ZC456 | 567 |
| ZC457 | 568 |
| ZC458 | 569 |
| ZC459 | 570 |
| ZC460 | 571 |
| ZC461 | 572 |
| ZC462 | 573 |
| ZC463 | 574 |
| ZC464 | 575 |
| ZC465 | 576 |
| ZC466 | 577 |
| ZC467 | 578 |
| ZC468 | 579 |
| ZC469 | 580 |
| ZC470 | 581 |
| ZC471 | 582 |
| ZC472 | 583 |
| ZC473 | 584 |
| ZC474 | 585 |
| ZC475 | 586 |
| ZC476 | 587 |
| ZC477 | 588 |
| ZC478 | 589 |
為了研究所彙集的蛋白殼比較結果是否可預測個別動物注射(每個動物一種測試物)的效能，在CD-1小鼠中利用眼窩後注射測試排序靠前的四種新穎蛋白殼及AAV9。ZC375、ZC401及ZC428病毒以2E+13 vg/kg投與，且ZC478病毒以1.45E+13 vg/kg投與。包括劑量匹配的AAV9對照。注射後第18天處死動物。基於RT-qPCR定量心臟中之轉殖基因mRNA表現來量測心臟轉導。基於qPCR定量肝臟中之轉殖基因DNA複本來量測肝臟病毒負荷。藉由將心臟轉導率除以肝臟病毒負荷來測定心臟/肝臟比率。所有四種新穎蛋白殼在此個別測試中顯示改善的心臟/肝臟比率，與所彙集的測試結果一致(
圖 42 )。
為了測試新穎蛋白殼之優異效能是否具有CD-1小鼠品系特異性，利用得自Charles River Laboratories的第二種小鼠品系C57BL/6NCrl評價ZC401及AAV9。藉由眼窩後注射投與2E+13 vg/kg的病毒。注射後第18天處死動物。如上文所述量測轉導。新穎蛋白殼ZC401證明心臟/肝臟比率改善，與CD-1品系結果一致(圖
43)。
實例 14 ： 新穎蛋白殼 ZC401 達成增加的心臟轉導率而不出現肝臟超負荷
| 標識符編號 | VR-VIII 比對(581-594) | VR-VIII SEQ ID NO: | 蛋白殼SEQ ID NO: |
| ZC375 | ATNH NSTYLGAQTG | 642 | 707 |
| ZC401 | ATNH MMTTARAQTG | 615 | 512 |
| ZC428 | ATNH NSTYLGAQTG | 642 | 539 |
| ZC478 | ATNH CSTSIRAQTG | 692 | 589 |
儘管心臟/肝臟比率改善的新穎蛋白殼可減少肝臟負荷同時無損於心臟轉導，但其亦可在心臟轉導改善時實現較高安全劑量且肝臟病毒負荷仍然低於常規劑量的AAV9。為了測試後一種應用，執行概念驗證研究，利用CD-1小鼠比較ZC401與AAV9。藉由眼窩後注射投與2E+13 vg/kg (AAV9及ZC401)或1.2E+14 vg/kg (ZC401)的病毒。注射後第18天處死動物。基於RT-qPCR定量心臟中之轉殖基因mRNA表現來量測心臟轉導。基於qPCR定量肝臟中之轉殖基因DNA複本來量測肝臟病毒負荷。藉由將心臟轉導率除以肝臟病毒負荷來測定心臟/肝臟比率。量測值為相對於AAV9的變化倍數。1.2E+14 vg/kg劑量的新穎蛋白殼ZC401顯示的心臟轉導水平為2E+13 vg/kg之AAV9的8倍，同時肝臟病毒負荷僅為其21% (
圖 44 )。
本文所述之資料利用NHP、小鼠、豬及人類iPSC衍生之心肌細胞(hiPSC-CM)表徵102種蛋白殼且鑑別出多種新穎AAV蛋白殼具有優異的特性，包括改善的心臟/肝臟比率、改善的心肌細胞轉導率及極佳的不同物種間一致性。總之，此等新穎AAV蛋白殼使得心臟病症的基因療法更有效且更安全。
實例 15 ： 利用多種哺乳動物模型表徵具有 N452K 取代的 AAV9 蛋白殼
為了測試N452K取代與基於AAV9之蛋白殼變異體的相容性及表徵N452K如何影響轉導效率，產生14種含有N452K的其他變異體且藉由將其與野生型親本AAV9或基於AAV9之VR-VIII取代變異體比較進行測試。此研究之目的係比較具有N452K取代之AAV蛋白殼(其中一些描述於上述
實例 11中，且進一步描述於
圖 45中)與親本AAV9蛋白殼(包括野生型AAV9及具有VR-VIII取代之AAV9蛋白殼)在多種模型(包括非人類靈長類動物、小鼠及活體外人類iPSC-CM)中的效能。
如
實例 11及
12中所述，活體內在食蟹獼猴及C57BL/6NCrl小鼠中以及活體外對人類iPSC衍生之心肌細胞投與且測試蛋白殼，但其中使用以下劑量：食蟹獼猴給與1.6E+13 vg/kg；小鼠給與3E+13 vg/kg，且iPSC-CM給與10E+4 vg/細胞及10E+5 vg/細胞。
如
實例 12中所述量測心臟或肝臟轉導。分別顯示食蟹獼猴、小鼠及iPSC-CM之2隻動物、4隻動物或感染倍率2的平均量測值。投藥途徑、所收集之組織類型及組織收集時序與實例11及12相同。
圖 46表示熱圖資料，其顯示不同組織樣品的轉導效率。熱圖上的各行表示一種蛋白殼且各列表示一種樣本類型。較淺顏色意謂較高值且較深顏色意謂較低值，其中中值灰階代表野生型AAV9對照。AAV9為充當對照之野生型蛋白殼。總之，此資料展現新穎蛋白殼之活體外及活體內存活率及轉導效率。
接著評價對iPSC-CM之轉導效率，以將不具有N452K突變之對照與具有N452K突變之其對應蛋白殼的轉導進行比較。
圖 47顯示相較於對照，具有N452K突變之每種蛋白殼的轉導增加，表明心肌細胞的總體轉導效率改善。
相對於野生型AAV9對照的效能，評價新產生之四種蛋白殼在食蟹獼猴中的心臟/肝臟比率、心臟轉導率及肝臟病毒負荷量測值(
圖 48)。如上文所述向動物投與病毒且收集組織。ZC536及ZC538蛋白殼顯示改善的心臟/肝臟比率且觀測到各種蛋白殼的心臟轉導相對於AAV9增加。
實例 16 ： 新產生之 AAV9 蛋白殼在非人類靈長類動物中的生物分佈及轉導
為了個別地表徵
實例 13中所述之蛋白殼在NHP中的效能(每個動物一種測試物)，經由單次注射6E+13 vg/kg的AAV9、ZC375或ZC428全身性投與NHP。將研究分成兩個階段(根據
圖 49中所描繪之實驗設計)且在各階段中測試一種新穎蛋白殼及AAV9對照，每種測試物4隻食蟹獼猴。注射後第28天處死動物。自心臟及肝臟組織提取RNA及DNA，隨後基於RT-qPCR定量病毒轉殖基因mRNA表現且基於qPCR定量病毒DNA基因體負荷。
藉由對RNA樣本進行RT-qPCR分析來量測心臟中的病毒轉殖基因表現量且相對於所有AAV9資料點的平均值標準化。ZC375與ZC428在心臟中均顯示類似於其匹配AAV9對照的轉殖基因表現(
圖 50)。量測的各樣本表示一隻個別動物，分析其4個心臟切片樣本且取平均值。
藉由對RNA樣本進行RT-qPCR分析來量測NHP肝臟中的病毒轉殖基因表現量且相對於所有AAV9資料點的平均值標準化。藉由對DNA樣本進行qPCR分析來量測病毒基因體負荷量且相對於所有AAV9資料點的平均值標準化。ZC375及ZC428顯示在RNA與DNA層面上，肝臟中的轉導相較於其匹配的AAV9對照減少(
圖 51A 及圖 51B)。量測的各樣本表示一隻個別動物，分析其2個肝臟切片樣本且取平均值。
利用上述NHP生物分佈及轉導研究來計算心臟轉導/肝臟轉導比率之間的比較。利用基於心臟RNA的量測值及基於肝臟RNA的量測值(
圖 52A)或基於心臟RNA的量測值及基於肝臟DNA的量測值(
圖 52B)，證明ZC375及ZC428相較於其匹配的AAV9對照具有改善的心臟/肝臟比率。總之，此資料證明ZC375與ZC428蛋白殼在NHP中的轉導效率及心臟/肝臟比率相較於野生型AAV9均得到改善。
雖然本文中已顯示且描述本發明之較佳實施例，但對於熟習此項技術者顯而易見的是，此類實施例僅為了舉例而提供。熟習此項技術者現將想到不背離本發明的諸多變化、變更及取代。應瞭解，本文所述之實施例可以採用不同替代方案。希望以下申請專利範圍限定本發明之範疇，且從而涵蓋此申請專利範圍及其等效物之範疇內的方法及結構。
專利或申請案檔案含有至少一幅彩製圖。在申請且支付必要費用後，專利局將提供附有彩圖之此專利或專利申請公開案之複本。
參考闡明說明性實施例及附圖的以下詳細描述將瞭解本發明之特徵及優勢，該等說明性實施例採用本發明之原理，且在附圖中：
圖 1繪示心臟橋粒如何將細胞結合在一起。
圖 2顯示ARVC疾病適應症及可能疾病機制的概述。
圖 3A 至 圖 3C顯示使iPSCM中之PKP2在第8天急性靜默的結果。
圖 3A顯示細胞膜中的DSP消失。
圖 3B顯示的圖繪示肌節密度降低。
圖 3C顯示iPSCM圖案中之細胞緊密度混亂無序。
圖 4顯示對DSP膜定域的定量分析，如根據與PKG的共定域所測定。
圖 5顯示免疫墨點，其繪示其中PKP2靜默之細胞中的DSP蛋白之總量減少，此主要在不溶性部分中偵測到。
圖 6A 至圖 6B顯示PKP2藉由AAV轉導的結果。
圖 6A顯示AAV構築體的載體圖譜。
圖 6B顯示DSP膜定域恢復的免疫螢光影像。
圖 6C顯示PKP2靜默及AAV-PKP2轉殖基因拯救後之總DSP強度的定量。
圖 7A 至 圖 7B顯示PKP2藉由AAV轉導的結果對收縮速度。
圖 7A顯示實驗時間軸。
圖 7B顯示兩項收縮性分析，其證明PKP2靜默後，減小的速度得到功能上的拯救。
圖 8顯示人類及小鼠PKP2α之第二代AAV表現卡匣的示意圖。左圖顯示表現卡匣中之所有元件。右圖顯示表現卡匣中之元件佈置。
圖 9A及
圖 9B顯示iPSC心肌細胞中之PKP2靜默後，第二代AAV-hPKP2α拯救收縮速度的結果。
圖 9A顯示在多重不同感染中經轉導之細胞之可溶性及不溶性部分中的表現。
圖 9B顯示PKP2靜默後，細胞收縮速度的拯救。
圖 10顯示野生型小鼠中之第二代AAV-PKP2α表現。
圖 11A 至 圖 11G顯示第二代AAV9人類及小鼠PKP2α在野生型小鼠中之實驗性表現安全研究結果。
圖 11A顯示AAV9注射之前及之後的體重。
圖 11B顯示經AAV9人類或小鼠PKP2α處理之小鼠的射出分率。
圖 11C及
圖 11D顯示根據心舒末期及心縮末期之內部直徑所量測的LV結構。
圖 11E、
圖 11F及
圖 11G顯示根據QRS (
11E)、QT間期(
11F)及P/R波幅(
11G)的電生理學活動性。
圖 12顯示
PKP2 - cKO小鼠的卡普蘭-梅耶(Kaplan-Meier)存活率曲線。
圖 13A 至 圖 13B顯示
PKP2 - cKO小鼠的右心室(RV)擴張型心肌病。
圖 13A(左圖)顯示的影像繪示
PKP2 - cKO小鼠在心舒末期時的RV內部尺寸(RVIDd)增加。
圖 13A(右圖)顯示
PKP2 - cKO小鼠之RVIDd隨時間變化的圖。
圖 13B(左圖)顯示的影像繪示
PKP2 - cKO小鼠之RV面積增加。
圖 13B(右圖)顯示
PKP2 - cKO小鼠之RV面積隨時間變化的圖。
圖 14A 至 圖 14B顯示與對照相比，
PKP2 - cKO小鼠之左心室(LV)擴張型心肌病的發展。
圖 14A(左圖)顯示
PKP2 - cKO小鼠在心縮末期時之LV內部尺寸(LVIDs)及心舒末期時之LV內部尺寸(LVIDd)增加的影像。
圖 14A(右圖)顯示的圖顯示
PKP2 - cKO小鼠之LVIDs及LVIDd隨時間增加。
圖 14B顯示LV效能的圖，如根據隨時間變化的射出分率百分比所量測。
圖 15顯示與對照相比，
PKP2 - cKO小鼠之重度電生理學表型的發展，尤其是
PKP2 - cKO小鼠的QRS間期延長及P/R幅比增加。上圖顯示對照小鼠及
PKP2 - cKO小鼠的例示性心電圖。下圖顯示與對照相比，
PKP2 - cKO小鼠之QRS間期增加及P/R波幅增加的圖。
圖 16A 至 圖 16C顯示纖維化、組織重塑基因及心臟衰竭標記物的表現增強。
圖 16A顯示與對照相比，
PKP2 - cKO小鼠之RV及LV中的PKP2 RNA表現(上圖)及橋粒及Cx43蛋白表現(下圖)。
圖 16B顯示與對照相比，
PKP2 - cKO小鼠中之纖維化基因：TGFβ1、Col1a1及Col3a1；以及組織重塑基因：Timp1及Mmp2的表現增強。
圖 16C顯示與對照小鼠相比，
PKP2 - cKO小鼠中之心臟衰竭標記物NPPA及NPPB的表現增強。
圖 17顯示評價基因療法對
PKP2 - cKOARVC小鼠模型之PKP2功效的實驗設計。
圖 18A顯示用於人類及小鼠PKP2α之AAV表現卡匣的示意圖。
圖 18B顯示經AAV9:PKP2處理之小鼠中之小鼠及人類PKP2α蛋白質表現的免疫墨點。
圖 19顯示經AAV9:PKP2處理之
PKP2 - cKO小鼠的卡普蘭-梅耶存活率曲線。
圖 20A 至 圖 20C顯示AAV9:PKP2處理
PKP2 - cKO小鼠在減少RV及LV擴張及維持心臟功能方面的功效。
圖 20A顯示的圖繪示經AAV9:PKP2處理之小鼠的射出分率改善。
圖 20B顯示的圖繪示經AAV9:PKP2處理之小鼠的RV擴張減少。
圖 20C顯示的圖繪示LVIDd (上圖)及LVIDs (下圖)改善。
圖 21A 至 圖 21B顯示經AAV:PKP2處理之
PKP2 - cKO小鼠的ECG參數改善。
圖 21A顯示經AAV9:mPKP2及緩衝液處理之對照小鼠及
PKP2 - cKO小鼠的例示性原始ECG跡線。
圖 21B顯示的圖繪示與緩衝液處理相比，經AAV9:PKP2處理之
PKP2 - cKO小鼠的P/R比率、QT間期及QRS間期改善。
圖 22A 至 圖 22B顯示AAV9:PKP2處理使
PKP2 - cKO小鼠的心律不齊改善。
圖 22A(上圖)顯示心律不齊嚴重度分級表。
圖 22A(下圖)顯示的圖概述了與對照相比，經AAV9:PKP2處理之
PKP2 - cKO小鼠之心律不齊評分改善。
圖 22B顯示分佈圖，其顯示與對照相比，經AAV9:PKP2處理之
PKP2 - cKO小鼠的心律不齊嚴重度改善。各點表示動物。
圖 23顯示使用
PKP2 - cKOARVC小鼠模型的實驗設計，其用於評價基因療法之人類PKP2功效。
圖 24A 至 圖 24D顯示AAV9:hPKP2基因療法處理
PKP2 - cKO小鼠的結果。
圖 24A顯示射出分率的結果。
圖 24B顯示右心室尺寸的結果。
圖 24C顯示根據LVIDd量測的LV擴張。
圖 24D顯示根據LVIDs量測的LV擴張。
圖 25顯示經AAV9:hPKP2基因療法處理之
PKP2 - cKO小鼠之QT間期(上圖)、P/R比率(中圖)及心律不齊評分(下圖)的結果。
圖 26A 至 圖 26B顯示AAV9:hPKP2處理
PKP2 - cKO小鼠在減少心臟衰竭標記物、纖維化及組織重塑標記物在右心室(
圖 26A)及左心室(
圖 26B)中之表現方面的結果。
圖 27A 至 圖 27B顯示AAV9:hPKP2處理
PKP2 - cKO小鼠在減輕纖維化發展方面的結果。
圖 27A顯示經AAV9:hPKP2處理及未經AAV9:hPKP2處理之對照小鼠及
PKP2 - cKO小鼠的肌肉組織學影像。
圖 27B顯示經AAV9:hPKP2處理及未經AAV9:hPKP2處理之對照小鼠及
PKP2 - cKO小鼠的膠原蛋白陽性組織圖。
圖 28A 至 圖 28B顯示可溶性部分(
圖 28A)及不溶性部分(
圖 28B)中之PKP2及其他橋粒蛋白質的表現。
圖 29描繪AAV9蛋白殼，其中所選AAV9可變區(VR-IV及VR-VIII位點)中的胺基酸突出顯示。
圖 30顯示定向演化選擇策略及變異體表徵的示意圖。產生文庫之後，在靈長類動物中對各文庫進行兩輪的選擇。
圖 31顯示用於篩選蛋白殼蛋白變異體的載體基因體之載體圖譜。
圖 32顯示得自第二輪篩選之資料圖。按照log
2尺度，將肝臟病毒基因體豐度相對於心臟mRNA轉錄本豐度作圖(「心臟轉導率」)。將各種情況下的值相對於參考AAV9病毒粒子的值標準化。
圖 33A 至 圖 33C標繪因具有所需細胞特性(相對於AAV9的高心臟轉導率、相對於AAV9的高心臟/肝臟比率，或兩者)而被選擇的102種變異體。
圖 33A在x軸上標繪102種所選變異體的心臟轉導率量測值且在y軸上標繪心臟/肝臟比率。
圖 33B顯示
表 6中之1號子文庫的變異體子集，其具有隨機化VR-IV (AAV9 VP1的胺基酸452至458)與經取代的VR-VIII (AAV9 VP1的胺基酸586至589)。
圖 33C顯示具有經修飾之VR-VIII (AAV9 VP1的胺基酸581至594)的新穎變異體。
圖 34顯示具有工程化蛋白殼蛋白之rAAV病毒粒子於小鼠模型中再測試的示意圖。
圖 35A 至 圖 35C顯示所選變異體及AAV9參考物的心臟轉導率(
圖 35A)、肝臟病毒負荷(
圖 35B)及心臟/肝臟比率(
圖 35C)量測值。
圖 36A 至 圖 36B顯示經修飾之病毒蛋白殼的示意圖(
圖 36A)及用於評價經修飾之條碼化病毒蛋白殼轉導之動物模型之多種器官及組織中之轉導效率的篩選策略示意圖(
圖 36B)。
圖 37顯示的圖量測不具有N452K突變之新穎蛋白殼(ZC404、ZC470、ZC428及ZC416)及具有N452K突變之新穎蛋白殼(ZC373、ZC374、ZC375及ZC376)於食蟹獼猴心臟及肝臟、小鼠心臟及肝臟以及人類iPSC中的轉導/病毒負荷量。
圖 38顯示用於評價經修飾之病毒蛋白殼轉導之動物模型之多種器官及組織中之轉導效率的篩選策略示意圖。
圖 39A 至 圖 39B顯示經修飾之AAV蛋白殼之轉導效率的熱圖。各行表示一種蛋白殼，且各列為一種樣本類型。分別顯示食蟹獼猴、小鼠、豬及iPSC-CM之4隻動物、3隻動物、6隻動物或感染倍率2的平均量測值。蛋白殼依序排成行，依據其在食蟹獼猴中的心臟/肝臟比率自左向右排序。AAV9-1、AAV9-2及AAV9-3皆為野生型AAV9蛋白殼，其充當對照複本。
圖 40提供的圖顯示使用四種新穎AAV蛋白殼之食蟹獼猴、小鼠及豬的心臟轉導率、肝臟病毒負荷及心臟/肝臟轉導比率。結果顯示相對於野生型AAV9對照的變化倍數。
圖 41提供的圖顯示與AAV9野生型對照相比，四種新穎蛋白殼於食蟹獼猴中的心臟/肝臟比率、心臟轉導率及肝臟病毒負荷。經由靜脈內推注投與而向動物投與1E+13 vg/kg。注射後第4週收集組織。該圖顯示相對於野生型AAV9對照的變化倍數。
圖 42提供的圖顯示與AAV9野生型對照相比，ZC375、ZC401、ZC428及ZC478蛋白殼於CD-1小鼠中的心臟/肝臟比率、心臟轉導率及肝臟病毒負荷。經由眼窩後注射投與2E+13 vg/kg的ZC375、ZC401及ZC428病毒，且投與1.45E+13 vg/kg的ZC478病毒。包括劑量匹配的AAV9對照。注射後第18天收集組織。結果顯示相對於AAV9對照的變化倍數。
圖 43提供的圖顯示與AAV9野生型對照相比，ZC401蛋白殼於C57BL/6NCrl小鼠中的心臟/肝臟比率、心臟轉導率及肝臟病毒負荷。經由眼窩後注射投與2E+13 vg/kg的病毒。注射後第18天收集組織。結果顯示相對於AAV9之變化倍數。
圖 44提供的圖顯示與AAV9野生型對照相比，ZC401蛋白殼於CD-1小鼠中的心臟及肝臟轉導率。經由眼窩後注射投與2E+13 vg/kg (AAV9及ZC401)或1.2E+14 vg/kg (ZC401)的病毒。注射後第18天收集組織。結果顯示相對於AAV9之變化倍數。
圖 45顯示N452K取代併入基於AAV9之蛋白殼變異體中。該圖提供蛋白殼結構的影像及表格，該影像繪示VR-VIII區域及N452 (Asn452)在野生型AAV9蛋白殼上的位置，且該等表格顯示基於AAV9之VR-VIII取代變異體之親本蛋白殼(左側)及新穎N452K蛋白殼(右側)的序列名稱。
圖 46顯示在多種模型中對N452K變異體的測試。該圖顯示來自圖45之經修飾AAV蛋白殼的轉導效率熱圖。各行表示一種蛋白殼，且各列為一種樣本類型。使用基於彙集之條碼的方法，在食蟹獼猴、小鼠及人類iPSC-CM中測試N452K變異體。藉由對RNA樣本進行基於NGS之定量來量測心臟轉導率及iPSC-CM轉導率。藉由對DNA樣本進行基於NGS之定量來量測肝臟病毒負荷。藉由將心臟轉導率除以肝臟病毒負荷來計算心臟/肝臟比率。所有量測值皆相對於AAV9對照標準化。
圖 47圖示N452K變異體之iPSC-CM轉導效率相較於不具有N452取代之匹配親本蛋白殼改善(變化倍數)。N452K取代始終增強轉導效率。
圖 48提供的圖顯示與AAV9野生型對照相比，來自圖46之所選蛋白殼於食蟹獼猴(非人類靈長類動物或「NHP」)中的心臟/肝臟比率、心臟轉導率及肝臟病毒負荷。所有值皆相對於野生型AAV9對照的效能。相對於AAV9，ZC533、ZC536及ZC538在NHP中顯示改善的心臟/肝臟比率及/或改善的心臟轉導率。
圖 49顯示對新穎蛋白殼及AAV9於NHP中之生物分佈及轉導進行比較的實驗示意圖。在此實驗中，量測排序靠前的蛋白殼在以治療相關劑量個別注射之NHP (每隻動物注射一種測試物)中的效能。全身性投與6E+13 vg/kg的AAV9、ZC375及ZC428。此研究分成兩個階段且在各階段中，測試一種新穎蛋白殼及AAV9對照，每種測試物使用4隻食蟹獼猴。注射後第28天處死動物。從心臟及肝臟組織中提取出RNA及DNA，隨後對病毒進行基於RT-qPCR的定量。
圖 50圖示心臟中之病毒轉殖基因表現(「心臟RNA」)量，其得自圖49中所描繪之NHP生物分佈及轉導研究。藉由對RNA樣本進行RT-qPCR分析來量測病毒轉殖基因表現量且相對於所有AAV9資料點的平均值標準化。圖上的各點表示一隻個別動物，分析其4個心臟切片樣本且取平均值。ZC375與ZC428在心臟中均顯示類似於其匹配AAV9對照的轉殖基因表現。
圖 51A 至 圖 51B圖示肝臟向性相較於AAV9減少。該圖顯示肝臟中之病毒轉殖基因表現量(「肝臟RNA」；
圖 51A)及病毒基因體負荷量(「肝臟DNA」；
圖 51B)，其得自
圖 49的NHP生物分佈及轉導研究(其中動物全身性投與6E+13 vg/kg的ZC375、ZC428或野生型對照AAV9)。藉由對RNA樣本進行RT-qPCR分析來量測病毒轉殖基因表現量且相對於所有AAV9資料點的平均值標準化。藉由對DNA樣本進行qPCR分析來量測病毒基因體負荷量且相對於所有AAV9資料點的平均值標準化。該圖上的各點表示一隻個別動物，其2個心臟切片樣本已分析且取平均值。ZC375及ZC428顯示在RNA與DNA層面上，肝臟中的轉導相較於其匹配的AAV9對照減少。
圖 52A 至 圖 52B圖示得自
圖 49中所描繪之NHP生物分佈及轉導研究的心臟轉導/肝臟轉導比率，其利用基於心臟RNA及基於肝臟RNA之量測值計算
( 圖 52A)，或利用基於心臟RNA及基於肝臟DNA之量測值計算(
圖 52B)。個別地計算各動物的比率。ZC375及ZC428顯示心臟/肝臟比率相較於其匹配的AAV9對照改善。
Claims (100)
- 一種重組腺相關病毒(rAAV)病毒粒子，其包含蛋白殼蛋白及斑菲素蛋白-2 (plakophilin-2)(PKP2)表現卡匣，其中該蛋白殼蛋白或所含序列與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3參考序列有共通的至少80%胺基酸序列一致性，且其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置584、或位置583與584之間的胺基酸插入，包含天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者； 位置585、或位置584與585之間的胺基酸插入，包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者； 位置586、或位置585與586之間的胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸(L)中之一或多者； 位置587、或位置586與位置587之間的胺基酸插入，包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者； 位置588、或位置587與位置588之間的胺基酸插入，包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者； 位置589、或位置588與位置589之間的胺基酸插入，包含甘胺酸(G)及麩醯胺酸(Q)中之一或多者； 一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、N452I、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H；及/或 一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582L、T582E、T582A、T582F、T582R、T582P、N583V、N583T、H584R、H584Q、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584T、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585C、Q585V、Q585L、Q585N、Q585S、Q585P、Q585A、Q585M、Q585E、Q585Y、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586T、S586G、S586K、S586M、S586N、S586I、S586Q、S586L、S586P、S586F、S586R、A587F、A587S、A587T、A587N、A587L、A587P、A587V、A587K、A587I、A587R、A587H、A587G、A587M、A587D、A587W、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588G、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588Y、Q588H、Q588M、Q588K、Q588D、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y、Q590L、A591I、G594Q及G594D。
- 如請求項1之rAAV病毒粒子，其中該蛋白殼蛋白在VR-VIII位點中包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入。
- 如請求項2之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白在該VR-VIII位點中的位置584至590包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入，或在該VR-VIII位點中的位置585至590包含一個、兩個、三個、四個或更多個取代或插入。
- 如請求項1至3中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： (i)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582D、T582E、N583V、H584Q、S586K、A587P、A587S、Q588G、Q588M、A589S、A591I、G594Q及G594D； (ii)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：T582L、T582A、T582F、T582R、T582P、H584R、H584K、H584V、H584Y、H584M、H584Q、H584W、H584E、H584D、Q585T、Q585N、Q585M、Q585E、Q585V、Q585H、S586T、S586G、S586Q、S586I、S586L、S586F、S586D、S586R、S586M、A587F、A587I、A587H、A587M、A587N、A587W、Q588Y、Q588S、Q588T及Q588R； (iii)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585C、Q585S、S586I、A587V及A587G；或 (iv)一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：Q585V、Q585T、Q585L、Q585C、Q585N、Q585S、Q585M、Q585E、Q585P、Q585A、Q585G、Q585H、Q585I、S586D、S586G、S586T、S586M、S586N、S586L、S586R、S586I、S586K、A587S、A587T、A587N、A587L、A587V、A587K、A587I、A587F、A587P、A587R、A587D、Q588L、Q588S、Q588F、Q588N、Q588R、Q588I、Q588V、Q588T、Q588H、Q588Y、Q588M、Q588K、Q588D、Q588G、A589R、A589I、A589N、A589S、A589V、A589Q、A589F、A589T、A589K、A589H、A589E、A589W、A589L、A589Y、A589M、Q590I、Q590S、Q590N、Q590G、Q590D、Q590R、Q590H、Q590T、Q590M、Q590F、Q590Y及Q590L。
- 如請求項1至4中任一項之rAAV病毒粒子，其中該蛋白殼蛋白：(i)具有心臟向性(cardiotrophic)；(ii)相較於親本序列，在心臟細胞中展現增加的轉導效率；(iii)相較於該親本序列，在肝臟細胞中展現降低的轉導效率；及/或(iv)相較於該親本序列，對心臟細胞而非對肝臟細胞展現增加的選擇性。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含一或多個選自由以下組成之群的胺基酸取代：N452K、N452A、N452V、N452I、G453A、G453N、S454T、S454D、G455N、Q456L、Q456K、N457L、N457V、Q458I及Q458H。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白在位置452包含選自由K及N組成之群的胺基酸。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代N452K。
- 如請求項1至8中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置584之選自由以下組成之群的胺基酸：R及H； 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L及Q； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R、I及S； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R、P及A； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G及Q； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y及A；及/或 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L、M及Q。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N； 位置584之選自由以下組成之群的胺基酸：R及H； 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H、L及Q； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R、I及S； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R、P及A； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D、G及Q； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E、Y及A；及 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L、M及Q。
- 如請求項1至8中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置584之胺基酸R； 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H及L； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R及I； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R及P； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D及G； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E及Y；及/或 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L及M。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者、七者或所有八者： (i)位置452之胺基酸K； (ii)位置584之胺基酸R； (iii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：N、M、C、E、G、S、V、A、T、H及L； (iv)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：M、D、N、G、A、T、R及I； (v)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V、L、I、S、R及P； (vi)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：Y、T、S、I、V、F、L、R、N、D及G； (vii)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：L、I、R、S、G、N、T、V、Q、F、E及Y；及 (viii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：G、R、S、I、H、N、Y、L及M。
- 如請求項1至8中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V、T及Q； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G、D及S； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N、V及A； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I、R及Q； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I、R及A；及/或 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H、R及Q。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N； 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V、T及Q； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G、D及S； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N、V及A； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I、R及Q； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I、R及A；及 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H、R及Q。
- 如請求項1至8中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V及T； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G及D； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N及V； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I及R； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I及R；及/或 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H及R。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者或所有七者： (i)位置452之胺基酸K； (ii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、G、M、C、V及T； (iii)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：N、T、M、G及D； (iv)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、L、I、K、S、N及V； (v)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、F、Y、L、T、S、I及R； (vi)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、N、L、T、I及R；及 (vii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、H及R。
- 如請求項1至8中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M、C及Q； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D、N及S； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V及A； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S、I及Q； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I、R及A；及/或 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、R及Q。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N； 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M、C及Q； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D、N及S； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N、V及A； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S、I及Q； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I、R及A；及 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G、R及Q。
- 如請求項1至8中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M及C； 位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D及N； 位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N及V； 位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S及I； 位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I及R；及/或 位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G及R。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含以下中之任意至少兩者、三者、四者、五者、六者或所有七者： (i)位置452之胺基酸K； (ii)位置585之選自由以下組成之群的胺基酸：E、N、M及C； (iii)位置586之選自由以下組成之群的胺基酸：A、M、G、D及N； (iv)位置587之選自由以下組成之群的胺基酸：T、N及V； (v)位置588之選自由以下組成之群的胺基酸：V、Y、T、S及I； (vi)位置589之選自由以下組成之群的胺基酸：S、G、L、I及R；及 (vii)位置590之選自由以下組成之群的胺基酸：I、S、G及R。
- 如請求項1至20中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；及 位置587之胺基酸取代A587T；並且視情況在選自由以下組成之群的一個、兩個或更多個位置包含胺基酸N或R：584、585、586、588、589及590。
- 如請求項1至21中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；及 一個、兩個或更多個選自由以下組成之群之位置處的胺基酸N或R：584、585、586、588、589及590。
- 如請求項1至22中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；及 兩個或更多個選自由以下組成之群之位置處的胺基酸S：585、586、587、588、589及590。
- 如請求項1至23中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 位置452之選自由以下組成之群的胺基酸：K及N；及 該VR-VIII位點之區域585-590中之三個、四個、五個或六個位置處的選自由以下組成之群之胺基酸：N、S、T、R及I。
- 如請求項24之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： 該VR-VIII位點之區域585-590中之三個、四個、五個或六個位置處的選自由以下組成之群之胺基酸：N、S、T及R。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586N、A587T、Q588V、A589S、Q590I及N452K。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586T、A587L、Q588F、A589N、Q590S及N452K。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L、Q590G及N452K。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585G、A587I、Q588L、A589T、Q590H及N452K。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585M、S586M、A587T、Q588T及Q590R；以及位置452之胺基酸N。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、A587T、Q588Y、A589L及Q590G；以及位置452之胺基酸N。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585C、A587T、Q588S、A589I及Q590R；以及位置452之胺基酸N。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586D、A587N、Q588I、A589R及Q590S；以及位置452之胺基酸N。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585E、S586D、A587N、Q588I、A589R、Q590S及N452K。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代Q585N、S586N、A587V、Q588I、A589S、Q590G及N452K。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586G及Q588Y；以及位置452之胺基酸N。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含胺基酸取代S586A、A587N、Q588Y、A589G及N452K。
- 如請求項1至37中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含位置581至583之胺基酸ATN及位置591至594之胺基酸AQTG。
- 如請求項1至37中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含位置581至584之胺基酸ATNH及位置591至594之胺基酸AQTG。
- 如請求項1至5中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： (i) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHENTVSIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K； (ii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHQTLFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K； (iii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHNSTYLGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K； (iv) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHGSILTHAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K； (v) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHMMTTARAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (vi) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHNSTYLGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (vii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHCSTSIRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (viii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHEDNIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (ix) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHEDNIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K； (x) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHNNVISGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K； (xi) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHQGAYAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHQANYGQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸K； (xiii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHNMNRVNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xiv) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHNNVISGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xv) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHSNSVQSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xvi) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHSSTFQGAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xvii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHVSSFTSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xviii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHSTTNFRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xix) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHSSIFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xx) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHAGNYNNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxi) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHTSVISIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHHSRVEIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxiii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHSSIIYSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxiv) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHSGRDSYAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxv) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHSSSYNNAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxvi) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHHNPSINAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxvii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHNRNGLLAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxviii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHESTSVRAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxix) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHNIRTEMAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxx) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHQTLFNSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxxi) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHLSVSSIAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxxii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNHEDIIRSAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N； (xxxiii) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNRQTAQAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N；或 (xxxiv) VR-VIII位置581至594之胺基酸序列ATNRQIAQAQAQTG，及VR-IV位置452之胺基酸N。
- 如請求項1至8中任一項之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： (i)位置584之胺基酸插入，包含天冬醯胺酸(N)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、苯丙胺酸(F)及丙胺酸(A)中之一或多者； (ii)位置585之胺基酸插入，包含組胺酸(H)及甲硫胺酸(M)中之一或多者； (iii)位置586之胺基酸插入，包含組胺酸(H)、酪胺酸(Y)、纈胺酸(V)、蘇胺酸(T)、丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)及白胺酸中之一或多者； (iv)位置587之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)及脯胺酸(P)中之一或多者； (v)位置588之胺基酸插入，包含異白胺酸(I)、蘇胺酸(T)及脯胺酸(P)中之一或多者；及/或 (vi)位置589之胺基酸插入，包含甘胺酸(G)及麩醯胺酸(Q)中之一或多者。
- 如請求項41之rAAV病毒粒子，其中相對於參考序列SEQ ID NO: 1，該蛋白殼蛋白包含： (i)位置584之胺基酸插入，其由TY、FN或AT組成； (ii)位置585之胺基酸插入，其由MH組成； (iii)位置586之胺基酸插入，其由HY、VT、AI、WM或ML組成； (iv)位置587之胺基酸插入，其由PI組成；及/或 (v)位置588之胺基酸插入，其由IT或PT組成。
- 如請求項1至42中任一項之rAAV病毒粒子，其中除指定的修飾之外，該蛋白殼蛋白或所含序列與根據SEQ ID NO: 487之AAV9 VP3序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。
- 如請求項1至43中任一項之rAAV病毒粒子，其中除指定的修飾之外，該蛋白殼蛋白或所含序列與根據SEQ ID NO: 486之AAV9 VP2序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。
- 如請求項1至44中任一項之rAAV病毒粒子，其中除指定的修飾之外，該蛋白殼蛋白或所含序列與根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1序列有共通的至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%胺基酸序列一致性。
- 如請求項1至45中任一項之rAAV病毒粒子，其中該蛋白殼蛋白包含與由以下組成之群中之任一者至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列、基本上由該胺基酸序列組成或由該胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708、710、772及774，或其功能片段。
- 如請求項1中任一項之rAAV病毒粒子，其中該蛋白殼蛋白包含由以下組成之群中之任一者的多肽序列、基本上由該多肽序列組成或由該多肽序列組成：SEQ ID NO: 488、499、504、505、506、510、512、513、516、518、521、522、533、536、539、558、562、566、571、576、578、579、580、581、585、588、589、705、706、707、708、710、772及774。
- 如請求項1至47中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子轉導心臟細胞。
- 如請求項1至48中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子轉導心肌細胞。
- 如請求項1至49中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子遷移至除肝臟之外的至少一種器官。
- 如請求項1至50中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子遷移至心臟。
- 如請求項1至51中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子展現的心臟轉導效率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子。
- 如請求項1至52中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子展現的心臟/肝臟轉導比率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，視情況高至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
- 如請求項1至53中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子投與個體使得肝臟病毒負荷低於投與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，視情況低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
- 如請求項1至54中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子展現的轉導效率、視情況心臟轉導效率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，其係在靈長類動物中所評估。
- 如請求項1至55中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子展現的心臟/肝臟轉導比率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，視情況高至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，其係在靈長類動物中所評估。
- 如請求項1至56中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子投與個體使得肝臟病毒負荷低於投與具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子，視情況低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍，其係在靈長類動物中所評估。
- 如請求項1至57中任一項之rAAV病毒粒子，其中該PKP2表現卡匣包含與SEQ ID NO: 782或SEQ ID NO: 783具有至少95%一致性的序列。
- 如請求項1至58中任一項之rAAV病毒粒子，其中該PKP2表現卡匣包含與SEQ ID NO: 786具有至少95%一致性的核酸序列。
- 如請求項1至59中任一項之rAAV病毒粒子，其中該PKP2表現卡匣包含心臟特異性啟動子。
- 如請求項60之rAAV病毒粒子，其中該心臟特異性啟動子引導心肌、心包膜或兩者中的基因表現。
- 如請求項60或請求項61之rAAV病毒粒子，其中該心臟特異性啟動子係肌鈣蛋白啟動子或α-肌凝蛋白重鏈啟動子。
- 如請求項62之rAAV病毒粒子，其中該肌鈣蛋白啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 784具有至少95%一致性。
- 如請求項1至59中任一項之rAAV病毒粒子，其中該PKP2表現卡匣包含PKP2啟動子。
- 如請求項64之rAAV病毒粒子，其中該PKP2啟動子的核酸序列與SEQ ID NO: 785具有至少95%一致性。
- 如請求項1至59中任一項之rAAV病毒粒子，其中該PKP2表現卡匣包含組成型啟動子。
- 如請求項66之rAAV病毒粒子，其中該組成型啟動子係β-肌動蛋白啟動子。
- 如請求項1至67中任一項之rAAV病毒粒子，其中該PKP2表現卡匣包含心臟特異性增強子。
- 如請求項1至68中任一項之rAAV病毒粒子，其中該PKP2表現卡匣包含3'元件。
- 如請求項69之rAAV病毒粒子，其中該3'元件包含土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)、牛生長激素聚腺苷酸化(bGH polyA)序列或其組合。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至70中任一項之rAAV病毒粒子及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種轉導心臟細胞之方法，其包含使該心臟細胞與如請求項1至70中任一項之rAAV病毒粒子接觸，其中該rAAV病毒粒子轉導該心臟細胞。
- 如請求項72之方法，其中該心臟細胞係心肌細胞。
- 如請求項72或請求項73之方法，其中該rAAV病毒粒子對該細胞展現的轉導效率高於具有根據SEQ ID NO: 1之AAV9 VP1蛋白殼蛋白的rAAV病毒粒子。
- 一種向心臟細胞遞送一或多種基因產物的方法，其包含使該心臟細胞與如請求項1至70中任一項之rAAV病毒粒子接觸。
- 如請求項75之方法，其中該心臟細胞係心肌細胞。
- 一種治療有需要個體之心臟疾病或病症的方法，其包含向該個體投與治療有效量的如請求項1至70中任一項之rAAV病毒粒子，其中該rAAV病毒粒子轉導心臟組織。
- 如請求項77之方法，其中該心臟疾病或病症係致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌病(ACM)。
- 如請求項77或請求項78之方法，其中該AAV病毒粒子係靜脈內、心臟內、心臟周圍或動脈內投與。
- 如請求項77至79中任一項之方法，其中該方法逆轉、減輕或預防以下中的至少一者：纖維脂肪組織置換、心肌萎縮、主導性右心室擴張、心室心律不齊、心因性猝死或運動觸發的心臟事件。
- 如請求項80之方法，其中該方法逆轉、減輕或預防心肌、心包膜或兩者中的纖維脂肪組織置換。
- 如請求項77至81中任一項之方法，其中該方法恢復橋粒(desmosome)結構及/或功能。
- 如請求項77至82中任一項之方法，其中該方法恢復PKP2蛋白及活性程度。
- 如請求項77至83中任一項之方法，其中該方法恢復PKP2誘導的基因表現。
- 如請求項77至85中任一項之方法，其中該方法恢復蘭尼鹼(Ryanodine)受體2 (Ryanodine Receptor 2，Ryr2)、錨蛋白-B (Ankyrin-B，Ank2)、Cacna1c (CaV1.2)、三聯蛋白(triadin，Trdn)或隱鈣素-2 (calsequestrin-2，Casq2)中之一或多者的表現。
- 如請求項77至85中任一項之方法，其中該個體經鑑別在橋粒蛋白質中具有至少一種變異。
- 如請求項86之方法，其中該橋粒蛋白質係PKP2。
- 如請求項86或請求項87之方法，其中該變異包含缺失、插入、單核苷酸變異或複本數變異。
- 如請求項1至70中任一項之rAAV病毒粒子，其用於治療有需要之個體之心臟疾病或病症的方法中，其中該rAAV病毒粒子轉導心臟組織。
- 如請求項89之方法，其中該心臟疾病或病症係致心律失常右心室心肌病(ARVC)或致心律失常心肌病(ACM)。
- 如請求項89或請求項90之方法，其中該AAV病毒粒子係靜脈內、心臟內、心臟周圍或動脈內投與。
- 如請求項89至91中任一項之方法，其中該方法逆轉、減輕或預防以下中的至少一者：纖維脂肪組織置換、心肌萎縮、主導性右心室擴張、心室心律不齊、心因性猝死或運動觸發的心臟事件。
- 如請求項92之方法，其中該方法逆轉、減輕或預防心肌、心包膜或兩者中的纖維脂肪組織置換。
- 如請求項89至93中任一項之方法，其中該方法恢復橋粒結構及/或功能。
- 如請求項89至94中任一項之方法，其中該方法恢復PKP2蛋白及活性程度。
- 如請求項89至95中任一項之方法，其中該方法恢復PKP2誘導的基因表現。
- 如請求項89至96中任一項之方法，其中該方法恢復蘭尼鹼受體2 (Ryr2)、錨蛋白-B (Ank2)、Cacna1c (CaV1.2)、三聯蛋白(Trdn)或隱鈣素-2 (Casq2)中之一或多者的表現。
- 如請求項89至97中任一項之方法，其中該個體經鑑別在橋粒蛋白質中具有至少一種變異。
- 如請求項98之方法，其中該橋粒蛋白質係PKP2。
- 如請求項98或請求項99之方法，其中該變異包含缺失、插入、單核苷酸變異或複本數變異。
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