BR112021003897A2

BR112021003897A2 - reprogramação de células cardíacas com miocarina e asci1

Info

Publication number: BR112021003897A2
Application number: BR112021003897-3A
Authority: BR
Inventors: Huanyu Zhou; Laura Lombardi
Original assignee: Tenaya Therapeutics, Inc.
Priority date: 2018-08-30
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2021-05-25
Also published as: EP3843774A4; US20210207170A1; CA3111076A1; JP2024001344A; AU2022231649A1; WO2020047467A3; WO2020047467A2; AU2019333315B2; US20240052369A1; SG11202102058UA; JP2022513308A; JP7450945B2; IL281145A; US20210032659A1; EP3843774A2; US11913012B2; KR20210102870A; CN113164556A; AU2019333315A1; US11015211B2

Abstract

REPROGRAMAÇÃO DE CÉLULAS CARDÍACAS COM MIOCARDINA E ASCL1. A presente invenção fornece métodos para a geração de cardiomiócitos induzidos e/ou indução de um fenótipo de cardiomicito em células in vivo ou in vitro, tal como pela expressão de ASCL1 ou MYF6 e MYOCD. A presente descrição provê ainda vetores de distribuição de genes que compreendem um ou mais polinucleotídeos selecionados dentre ASL1, MYF6, MYOCD, MEF2C e TBX5Fornece ainda composições compreendendo cardiomiócitos induzidos e fornece métodos de tratamento de uma condição cardíaca, tal como infarto do miocárdio. A descrição também fornece proteínas de miocarina engenheiradas com deleção interna, vetores que codificam tais micocardins engenheirados, e métodos de utilização dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "REPROGRAMAÇÃO DE CÉLULAS CARDÍACAS COM MIOCARDINA E ASCL1".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se de uma forma geral aos campos da terapia gênica, reprogramação celular e terapia celular para doenças ou distúrbios do coração.

PEDIDOS RELACIONADOS

[002] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/852.746, depositado em 24 de maio de 2019; Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/788.479, depositado em 4 de janeiro de 2019; e Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/725.168, depositado em 30 de agosto de 2018, cada um dos quais é incorporado nesta invenção por referência na sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] Este pedido está sendo depositado de forma eletrônica por meio de EFS-Web e inclui uma listagem de sequência eletronicamente encaminhada no formato .txt. O arquivo .txt contém uma listagem de sequência intitulada “TENA_007_02US_SeqList_ST25.txt” criada em 30 de agosto de 2019 e que possui um tamanho de aproximadamente 277 kilobytes. A listagem de sequência contida neste arquivo .txt é parte do relatório descritivo e é incorporada nesta invenção por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES

[004] A insuficiência cardíaca é uma das principais causas de morte em todo o mundo. Braunwald’s Heart Disease, 11th ed. (2015). Tem uma prevalência estimada de 38 milhões de pacientes em todo o mundo, número que vem aumentando com o envelhecimento da população. Braunwald, E. The War against Heart Failure. Lancet 385:812-824 (2015). O prognóstico da insuficiência cardíaca é pior do que o da maioria dos cânceres. Vários tratamentos para a insuficiência cardíaca Têm sido propostos, incluindo: (1) aumento da sensibilidade do miofilamento ao Ca2+, Por exemplo, transferência do gene para SERCA2a (a proteína que bombeia cálcio para dentro do retículo sarcoplasmático do cardiomiócito); (2) terapia gênica para corrigir proteínas anormais de manipulação de cálcio; (3) tratamento com antagomir para bloquear a função de microRNAs selecionados; (4) terapia celular, por exemplo, com células mononucleares derivadas da medula óssea ou células mesenquimais; e (5) dispositivos de assistência ventricular de longo prazo, em alguns casos levando à recuperação do miocárdio e explantação do dispositivo.

[005] Uma abordagem alternativa é a terapia baseada em células com cardiomiócitos induzidos (iCM). Os cardiomiócitos possuem uma capacidade extremamente limitada de divisão celular, limitando assim a capacidade do coração de regenerar novos músculos e se reparar. Uma estratégia para gerar cardiomiócitos é a indução ex vivo de células de fibroblastos para formar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e, em seguida, a diferenciação subsequente de iPSCs em iCMs. Por exemplo, os fatores OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC geram iPSCs (Takahasi et al. Cell. 2006;126:663–76), que podem ser diferenciados em iCMs com vários métodos incluindo modulação temporal modificada de sinalização TGF-beta e sinalização Wnt utilizando várias citocinas e inibidores de pequenas moléculas (Lian et al. Nat. Protoc. 8:162-75 (2013); Fonoudi et al. Stem Cells Transl. Med. 4:1482-94 (2015)).

[006] A reprogramação cardíaca direta surgiu como uma estratégia para criar novos cardiomiócitos, levando à melhora da função cardíaca após a lesão do coração, tal como por infarto do miocárdio (MI). Srivastava e DeWitt. Cell 166:1386-96 (2016). A reprogramação cardíaca direta envolve a conversão de células em cardiomiócitos sem indução de um fenótipo pluripotente. Em uma aplicação de reprogramação cardíaca direta, as células de suporte residentes nos órgãos danificados são convertidas no tipo de célula desejado in situ. Por exemplo, uma combinação de três fatores de transcrição do desenvolvimento cardíaco - GATA4, MEF2C e TBX5 (GMT) - pode ser utilizada para reprogramar fibroblastos dérmicos ou cardíacos em células semelhantes a iCM em camundongos. Ieda et al. Cell. 142:375-86 (2010).

[007] Várias outras combinações de abordagens genéticas, assim como químicas, para converter fibroblastos em progenitor cardíaco ou estado de cardiomiócito foram propostas. HAND2, NKX2.5, JAK ou TGF-β aumentam essa reprogramação. GATA4, MEF2C, TBX5, MESP1 e MYOCD (GMTMM) quando expressos juntos como um coquetel de fatores alteram a morfologia celular de um formato de fuso para um formato de bastonete e faz com que as células apresentem oscilação espontânea de Ca2+. Em seres humanos, a suplementação de GMT com ETS2 e MESP1 induz a expressão gênica específica cardíaca e a formação de sarcômeros. Outras combinações de fatores para reprogramação direta são conhecidas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] Permanece uma necessidade há muito sentida e não atendida de composições e métodos para gerar células com cardiomiócitos induzidos e para o tratamento de doenças cardíacas (incluindo lesão cardíaca, tal como MI, doença cardíaca congênica, doença cardíaca associada ao envelhecimento e outras insuficiências cardíacas). A presente invenção fornece tais composições e métodos, e muito mais. Os coquetéis de fator de reprogramação para a geração de cardiomiócitos geralmente requerem o uso de pelo menos três fatores de reprogramação. Os inventores descobriram surpreendentemente que MYOCD e qualquer um dos fatores ASCL1 e MYF6 alcançam, em células humanas, a reprogramação direta de não cardiomiócitos em cardiomiócitos. As modalidades da divulgação incluem composições e métodos que utilizam MYOCD e ASCL1 e/ou MYF6, opcionalmente com outros fatores, para reprogramar diretamente não cardiomiócitos (por exemplo, fibroblastos cardíacos humanos) em cardiomiócitos. Vantajosamente, menos de cinco fatores são utilizados para reprogramar os fibroblastos cardíacos humanos em cardiomiócitos. Ainda mais vantajosamente, apenas dois fatores são utilizados para reprogramar os fibroblastos cardíacos humanos em cardiomiócitos.

[009] A divulgação fornece vetores que compreendem combinações de um polinucleotídeo MYOCD; um polinucleotídeo ASCL1 e/ou um polinucleotídeo MYF6; e, opcionalmente, um polinucleotídeo MEF2C e/ou um polinucleotídeo TBX5. Estes polinucleotídeos codificadores de proteínas podem ser dispostos no vetor em qualquer ordem de 5' a 3' e nas mesmas ou em fitas de polinucleotídeos diferentes dentro do vetor. A invenção fornece ainda sistemas de vetor compostos por mais de um vetor. Alguns vetores são vetores policistrônicos - por exemplo, vetores policistrônicos ligados a 2A, tais como, sem limitação, vetores que compreendem polinucleotídeos MYOCD-2A-ASCL1, ASCL1-2A-MYOCD, MYOCD- 2A-MYF6 ou MYF6-2A-MYOCD. Em alguns casos, os sistemas de vetor incluem um primeiro vetor policistrônico selecionado a partir dos anteriores e um segundo vetor policistrônico complementar que fornece polinucleotídeos MEF2C e TBX5.

[0010] Os vetores incluem vetores virais e não virais, tais como, sem limitação, uma nanopartícula lipídica, um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral de integração (LVV), e um LVV não integrado. Cada um dos polinucleotídeos compartilha opcionalmente a identidade de sequência com uma sequência de polinucleotídeo humana nativa para o gene correspondente, ou possui uma sequência heteróloga que codifica uma proteína idêntica ou compartilha identidade de sequência com a proteína humana nativa correspondente. Em algumas modalidades, o MYOCD codificado pelo polinucleotídeo MYOCD é uma miocardina projetada. Por exemplo, a miocardina pode ser projetada para incluir uma deleção interna que reduz seu tamanho, mas preserva sua função.

[0011] A invenção fornece ainda métodos de uso dos vetores e sistemas de vetores anteriores. Os métodos de uso incluem métodos de indução de um fenótipo de cardiomiócito em células diferenciadas (in vivo ou in vitro) e métodos de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia. Em algumas modalidades, o método de induzir um fenótipo de cardiomiócito converte uma célula não-cardiomiócitos em uma célula com cardiomiócitos induzidos. Os métodos da invenção incluem ainda métodos de conversão de uma célula não-cardiomiócitos em uma célula com cardiomiócitos induzidos. Em algumas modalidades, a célula não-cardiomiócitos é uma célula não-cardiomiócitos diferenciada. Em algumas modalidades, a célula não-cardiomiócitos é uma célula cardíaca sem cardiomiócitos ou célula fibroblástica cardíaca. O fenótipo de cardiomiócito pode ser definido através da expressão aumentada de cTnT e/ou α-actinina, ou através da expressão de outros marcadores para o fenótipo de cardiomiócito conhecido na técnica ou identificado prospectivamente. A invenção fornece ainda kits que compreendem vetores e sistemas de vetores com instruções para uso no tratamento de uma cardiopatia.

[0012] Em um aspecto, a invenção fornece um vetor, compreendendo um polinucleotídeo MYOCD e um ou ambos de um polinucleotídeo ASCL1 ou um polinucleotídeo MYF6; cada polinucleotídeo ligado de maneira operável a pelo menos um promotor.

Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD e um polinucleotídeo ASCL1. Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD e um polinucleotídeo MYF6. Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD; um ou ambos de um polinucleotídeo MEF2C e um polinucleotídeo TBX5; e um ou ambos de um polinucleotídeo ASCL1 e um polinucleotídeo MYF6. Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD, um polinucleotídeo ASCL1, um polinucleotídeo MEF2C e um polinucleotídeo TBX5. Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD, um polinucleotídeo MYF6, um polinucleotídeo MEF2C e um polinucleotídeo TBX5. Em algumas modalidades, o MYOCD é uma miocardina projetada.

Em algumas modalidades, o vetor não compreende nenhum polinucleotídeo de fator de reprogramação diferente de um polinucleotídeo MYOCD, um polinucleotídeo ASCL1, um polinucleotídeo MYF6, um polinucleotídeo MEF2C ou um polinucleotídeo TBX5. Em algumas modalidades, o vetor não compreende nenhum outro gene codificador de proteína.

Em algumas modalidades, o vetor é um vetor policistrônico.

Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral.

Em algumas modalidades, o vetor é um vetor AAV.

Em algumas modalidades, o vetor é um vetor lentiviral.

Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ASCL1, se presente, ou o polinucleotídeo MYF6, se presente, e o polinucleotídeo MYOCD estão ligados de maneira operável ao mesmo promotor e são expressos em co-translação.

Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 ou um polinucleotídeo ASCL1-2A-MYOCD, ligado de maneira operável a um único promotor.

Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD-2A-MYF6 ou um polinucleotídeo ASCL1-2A- MYF6, ligado de maneira operável a um único promotor.

[0013] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD compreende a sequência de nucleotídeos de MYOCD humano (SEQ ID NO: 4) ou um códon variante do mesmo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo do MYOCD humano (SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD codifica o MYOCD humano (SEQ ID NO: 3) ou uma variante funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD codifica um polipeptídeo que compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com MYOCD humano (SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD compreende a sequência de nucleotídeo de MyΔ3 (SEQ ID NO: 72) ou um códon variante do mesmo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MyΔ3 (SEQ ID NO: 72). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD codifica MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) ou uma variante funcional do mesmo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD codifica um polipeptídeo que compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) ou um códon variante do mesmo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ASCL1 compreende a sequência de nucleotídeos do ASCL1 humano (SEQ ID NO: 2) ou um códon variante do mesmo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ASCL1 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de ASCL1 humano (SEQ ID NO: 2) ou uma variante de códon do mesmo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ASCL1 codifica um polipeptídeo que compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com ASCL1 humano (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ASCL1 codifica ASCL1 humano (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYF6 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MYF6 humano (SEQ ID NO: 56).

[0014] Em algumas modalidades, o vetor compreende um cassete de expressão, o cassete de expressão compreendendo: o polinucleotídeo MYOCD, em que o polinucleotídeo MYOCD compreende MyΔ3 (SEQ ID NO: 72) ou um códon variante do mesmo e/ou codifica MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) ou uma variante funcional do mesmo, o polinucleotídeo MYOCD ligado de maneira operável a um primeiro promotor; e o polinucleotídeo ASCL1, em que o polinucleotídeo ASCL1 compreende ASCL1 (SEQ ID NO: 2) ou um códon variante do mesmo e/ou codifica ASCL1 (SEQ ID NO: 1) ou uma variante funcional do mesmo, o polinucleotídeo ASCL1 ligado de maneira operável a um segundo promotor.

[0015] Em algumas modalidades, o primeiro promotor compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com um promotor CAG (SEQ ID NO: 67) e/ou o segundo promotor compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com um promotor SCP (SEQ ID NO: 68).

[0016] Em algumas modalidades, o vetor compreende um cassete de expressão, o cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1, ligado de maneira operável a um único promotor.

[0017] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD-2A- ASCL1 compreende a SEQ ID NO: 37 ou uma variante de códon da mesma. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD-2A-

ASCL1 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 37.

[0018] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD-2A- ASCL1 codifica a SEQ ID NO: 59 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo MYOCD-2A- ASCL1 codifica um polipeptídeo que compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO:

59. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um ou mais de um íntron SV40 (SEQ ID NO: 73), um sinal poliA curto (SEQ ID NO: 74) e um WPRE (SEQ ID NO: 75).

[0019] Em algumas modalidades, o cassete de expressão é flanqueado por repetições terminais invertidas, opcionalmente ITRs de AAV2 (SEQ ID NO: 76). Em algumas modalidades, o vetor compreende uma proteína do capsídeo do AAV5, opcionalmente compreendendo a SEQ ID NO: 71 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, o vetor é capaz de reprogramar células diferenciadas em células com cardiomiócitos induzidos (iCM). Em algumas modalidades, pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20% das células de iCM são α-actinina positivas. Em algumas modalidades, pelo menos 2%, pelo menos 5% ou pelo menos 8% das células com iCM são cTnT positivas.

[0020] Em outro aspecto, a invenção fornece um sistema de vetor compreendendo um primeiro vetor que codifica um polinucleotídeo MYOCD e um ou ambos de um polinucleotídeo ASCL1 ou um polinucleotídeo MYF6; e um segundo vetor compreendendo um polinucleotídeo MEF2C e um polinucleotídeo TBX5. Em algumas modalidades, o primeiro vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 ou um polinucleotídeo ASCL1-2A-MYOCD. Em algumas modalidades, o primeiro vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD-2A-MYF6 ou um polinucleotídeo ASCL1-2A- MYF6. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor que codifica um polinucleotídeo MYOCD e um segundo vetor que codifica um polinucleotídeo ASCL1 ou um polinucleotídeo MYF6.

[0021] Em algumas modalidades, o primeiro vetor e o segundo vetor são, cada um, independentemente selecionados de uma nanopartícula lipídica, um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral de integração (LVV), e um LVV não integrado.

[0022] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo ASCL1 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de ASCL1 humano (SEQ ID NO: 2).

[0023] O sistema de vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 48, em que o polinucleotídeo MYOCD codifica o MYOCD humano (SEQ ID NO: 3) ou uma variante funcional do mesmo ou MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) ou uma variante funcional do mesmo.

[0024] Em outro aspecto, a invenção fornece método de indução de um fenótipo de cardiomiócito em células diferenciadas, compreendendo o contato das células diferenciadas com um vetor ou sistema de vetor da invenção. Em algumas modalidades, as células diferenciadas são células de fibroblastos cardíacos. Em algumas modalidades, as células diferenciadas são células in vitro durante a etapa de contato. Em algumas modalidades, as células diferenciadas são células in vivo em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia.

[0025] Em outro aspecto, a divulgação fornece um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de cardiopatia, compreendendo o contato das células diferenciadas in vitro com um vetor ou sistema de vetor para gerar células com iCM e administrar as células com iCM ao indivíduo. Em algumas modalidades, a cardiopatia é um infarto do miocárdio.

[0026] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia, compreendendo a administração de um vetor ou sistema de vetor da invenção ao indivíduo. Em algumas modalidades, a cardiopatia é um infarto do miocárdio. Em algumas modalidades, a cardiopatia é um infarto agudo do miocárdio.

[0027] Em algumas modalidades, a cardiopatia é uma insuficiência cardíaca. Em algumas modalidades, a cardiopatia é uma insuficiência cardíaca isquêmica crônica.

[0028] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit que compreende um vetor ou sistema de vetor da invenção e instruções para uso no tratamento de uma cardiopatia.

[0029] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para converter uma célula não-cardiomiócito diferenciada em um cardiomiócito, compreendendo o contato das células diferenciadas com um vetor ou sistema de vetor da invenção. Em algumas modalidades, a célula não-cardiomiócito diferenciada é uma célula diferenciada sem cardiomiócito. Em algumas modalidades, a célula diferenciada sem cardiomiócito é uma célula humana diferenciada sem cardiomiócito. Em algumas modalidades, a célula não-cardiomiócito diferenciada é uma célula não-cardiomiócito diferenciada in vivo. Em algumas modalidades, a célula não-cardiomiócito diferenciada é uma célula não-cardiomiócito diferenciada in vitro. Em algumas modalidades, a célula não-cardiomiócito diferenciada é uma célula cardíaca.

[0030] Além disso, também permanece uma necessidade há muito sentida e não atendida de composições e métodos para gerar células com cardiomiócitos induzidos e para o tratamento de lesão cardíaca, tal como MI. A presente invenção fornece tais composições e métodos, e muito mais.

[0031] A miocardina possui a arquitetura de domínio representada na FIGURA 9A. Os presentes inventores descobriram que a proteína miocardina retém sua função quando uma deleção interna é feita, tal como uma deleção interna entre o domínio SAP e o domínio TAD. O segundo domínio de interação Gata4 é dispensável para função em alguns casos. O domínio zíper de leucina (LZ) dentro do segundo domínio interação Gata4 é excluído em algumas modalidades, embora algumas modalidades mantenham este domínio LZ. Além do mais, os presentes inventores descobriram que algumas modalidades de miocardina com uma deleção interna aumentaram a potência em comparação com a miocardina de comprimento total.

[0032] Várias modalidades das proteínas miocardina projetadas funcionais são representadas nas Figuras 9B a 9D. Esta invenção fornece essas proteínas miocardina projetadas e outras, polinucleotídeos isolados que codificam tais proteínas miocardina projetadas e outras, vetores para a liberação de tais polinucleotídeos isoladamente ou em combinação com outros ácidos nucleicos, e métodos de uso de tais polinucleotídeos e vetores para terapia gênica, reprogramação celular e outros usos. Também são fornecidos kits, composições farmacêuticas, composições para uso e outras modalidades úteis da presente invenção.

[0033] Em um aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo um polinucleotídeo MYOCD projetado que codifica uma proteína miocardina projetada com um comprimento de no máximo 850 aminoácidos, em que a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação SRF, um domínio SAP e um domínio TAD.

[0034] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação Mef2c. Em algumas modalidades, o domínio de interação Mef2c compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 17, o domínio SRF compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 18, o domínio SAP compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 19 e o domínio TAD compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um domínio LZ. Em algumas modalidades, o domínio LZ compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 20.

[0035] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-413 da miocardina humana (SEQ ID NO: 10) e o segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 764-986 de miocardina humana (SEQ ID NO: 11), em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão ligados por um ligante compreendendo uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1-50 resíduos de aminoácidos.

[0036] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-438 da miocardina humana (SEQ ID NO: 12) e o segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 764-938 de miocardina humana (SEQ ID NO: 11), em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão ligados por um ligante compreendendo uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1-50 resíduos de aminoácidos.

[0037] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-559 da miocardina humana (SEQ ID NO: 13) e o segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 764-938 de miocardina humana (SEQ ID NO: 11), em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão ligados por um ligante compreendendo uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1-50 resíduos de aminoácidos.

[0038] Em algumas modalidades, o ligante consiste em uma ligação peptídica. Em algumas modalidades, o ligante é um polipeptídeo selecionado de G, GG, GGG, GSG, GSS, GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 30), GSSGGS (SEQ ID NO: 31), GGSGSS (SEQ ID NO: 32), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 33), GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 34).

[0039] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 14 a 16.

[0040] Em outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado, compreendendo um polinucleotídeo MYOCD projetado que codifica uma proteína miocardina projetada, em que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de pelo menos 50 aminoácidos na região correspondente aos aminoácidos 414 a 764 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

[0041] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 414 a cerca de 763 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

[0042] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO:

14. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada consiste na sequência idêntica à SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 439 a cerca de 763 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

[0043] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO:

15. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada consiste na sequência idêntica à SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 560 a cerca de 763 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

[0044] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO:

16. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada consiste na sequência idêntica à SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada é uma proteína miocardina projetada funcional.

[0045] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada funcional é expressa em pelo menos 10% do nível de MYOCD nativo no mesmo sistema de expressão. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada funcional é capaz de induzir expressão aumentada de pelo menos um marcador do fenótipo de cardiomiócito (a) quando expresso em fibroblastos cardíacos humanos com MEF2C e TBX5 ou TBX5 na presença de um inibidor de TGFβ, opcionalmente SB431542, e um inibidor de Wnt, opcionalmente XAV939, ou (b) quando expresso em fibroblastos cardíacos humanos com ASCL1.

[0046] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo está ligado de maneira operável a um promotor. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo MEF2C e um polinucleotídeo TBX5. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo TBX5. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo ASCL1. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo é flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) ou o polinucleotídeo é flanqueado por repetições terminais longas (LTRs).

[0047] Em outro aspecto, a divulgação fornece um vírus recombinante compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos da invenção. Em uma modalidade, o vírus recombinante é um vírus adenoassociado recombinante (rAAV). Em algumas modalidades, o vírus recombinante é um lentivírus.

[0048] Em outro aspecto, a invenção fornece uma população de células compreendendo qualquer um dos polinucleotídeos da invenção.

[0049] Em algumas modalidades, a porcentagem de células na população que apresenta transientes de cálcio (CaT) em um ensaio de CaT in vitro é pelo menos 2 vezes maior do que a porcentagem de células em uma população de controle de células que não compreendem o polinucleotídeo no mesmo ensaio de CaT in vitro.

[0050] Em outro aspecto, a invenção fornece um cardiomiócito induzido (iCM), em que o iCM compreende qualquer um dos polinucleotídeos da invenção.

[0051] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos polinucleotídeos da invenção e um sistema de liberação não viral.

[0052] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos vírus recombinantes da invenção.

[0053] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para gerar um cardiomiócito induzido (iCM), compreendendo o contato de um fibroblasto de mamífero com um polinucleotídeo da invenção, um vírus recombinante da invenção ou composição farmacêutica da invenção.

[0054] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica da invenção.

[0055] Em algumas modalidades, o vírus recombinante é administrado por meio de cateterismo intracardíaco. Em algumas modalidades, o vírus recombinante é administrado por meio de injeção intracardíaca. Em outro aspecto, a invenção fornece um vírus adenoassociado recombinante (rAAV), que compreende um cassete de expressão (como representado na FIGURA 13B ou FIGURA 13C), em que o cassete de expressão compreende na ordem de 5' para 3' uma repetição terminal invrtida 5' (ITR), um promotor CAG, um íntron SV40, um polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas, um sinal de poliadenilação curto e uma ITR 3', e em que o polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas compreende na ordem de 5' para 3' um polinucleotídeo que codifica MyΔ3, um polinucleotídeo que codifica um ligante P2A e um polinucleotídeo que codifica ASCL1.

[0056] Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um WPRE. Em algumas modalidades, a MyΔ3 compreende a SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, o ligante 2A compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 23). Em algumas modalidades, o ASCL1 compreende a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO: 35 (MyΔ3A AAV).

[0057] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um rAAV da invenção.

[0058] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica da invenção.

[0059] Estes aspectos e outras características e vantagens da invenção são descritos abaixo com maiores detalhes. Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar utilizando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes destinam-se a serem incluídos pelas seguintes divulgação e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0060] A FIGURA 1A a FIGURA 1C ilustra a identificação de intensificadores de reprogramação cardíaca humana a partir de uma classificação de cDNA de ORF humano. A FIGURA 1A mostra um esquema da estratégia de varredura para ativadores de reprogramação cardíaca humana mediada por MyMT– ou MyMT+SB/XAV em uma linhagem celular de fibroblastos cardíacos humanos (HCF). My: MYOCD, M: MEF2C, T: TBX5, SB: SB431542, XAV: XAV-939. A FIGURA 1B mostra seis intensificadores (ASCL1, DLX3, DLX6, GATA2. GATA5 e MYF6) da reprogramação cardíaca humana identificada na classificação. O gráfico mostra a alteração dobrada de células positivas para α-actinina de cada combinação de reprogramação em relação à atividade de MyMT+SB/XAV. A FIGURA 1C mostra a análise da expressão do gene cardíaco para células reprogramadas. Fibroblastos cardíacos humanos adultos (AHCFs) foram infectados com retrovírus que codificavam diferentes fatores de reprogramação, conforme indicado no gráfico. As células reprogramadas foram cultivadas durante 3 semanas. Os níveis de transcrição de genes marcadores cardíacos (MYH6, TNNT2, TNNC1, NPPA, TNNI3 e RYR2) foram determinados por q-PCR.

[0061] A FIGURA 2A a FIGURA 2D ilustram a reprogramação cardíaca com aumento de ASCL1 e MYF6 nos fibroblastos cardíacos humanos adultos e de porco. A FIGURA 2A e a FIGURA 2B mostram imagens de imunocitoquímica representativas (FIGURA 2A) e análises (FIGURA 2B) de fibroblastos cardíacos humanos adultos reprogramados (APCFs) 3 semanas após a infecção com retrovírus indicados. Duas proteínas cardíacas α-actinina (linha superior) e cTnT (linha inferior) foram utilizadas como marcadores para quantificar a eficiência da reprogramação. O sinal fluorescente vermelho é indicativo da expressão da proteína em ambos os casos. DAPI foi utilizado para colorir os núcleos (azul). A FIGURA 2C e a FIGURA 2D mostram imagens representativas de imunocitoquímica (FIGURA 2C) e análises (FIGURA 2D) de fibroblastos cardíacos de porco adulto reprogramados (AHPFs) 3 semanas após a infecção com retrovírus indicados. Duas proteínas cardíacas α-actinina (linha superior, vermelha) e cTnT (linha inferior, vermelha) foram utilizadas como marcadores para qualificar a eficiência da reprogramação. DAPI da coloração de núcleos é mostrado (azul).

[0062] A FIGURA 3A a FIGURA 3E ilustram a dose-resposta de fatores de reprogramação em AHCFs. A FIGURA 3A a FIGURA 3D mostram imagens de imunocitoquímica representativas (FIGURA 3A- 3D) e análises (FIGURA 3E) para mostrar dose-respostas de fatores de reprogramação. Os AHCFs foram infectados com retrovírus indicados e foram cultivados durante 3 semanas antes da imunocoloração. Duas proteínas cardíacas α-actinina (linha superior, vermelha) e cTnT (linha inferior, vermelha) foram utilizadas como marcadores para qualificar a eficiência da reprogramação. DAPI (azul).

[0063] A FIGURA 4A a FIGURA 4C ilustram a reprogramação cardíaca humana por vetores policistrônicos dois em um. A FIGURA 4A a FIGURA 4B mostram imagens representativas de imunocitoquímica (FIGURA 4A) e análises (FIGURA 4B) para determinar a combinação ideal de vetores policistrônicos dois em um para reprogramação cardíaca. Os AHCFs foram infectados com retrovírus indicados e foram cultivados durante 3 semanas antes da imunocoloração. Duas proteínas cardíacas α-actinina (acima, vermelho) e cTnT (abaixo, vermelho) foram utilizadas como marcadores para qualificar a eficiência da reprogramação. DAPI (azul). A FIGURA 4C mostra a análise da expressão do gene cardíaco para células reprogramadas por diferentes combinações de vetores policistrônicos dois em um. AHCFs foram infectados com retrovírus indicados e foram cultivados durante 3 semanas antes da extração de RNA. Os níveis de transcrição dos marcadores cardíacos foram determinados por q-PCR.

[0064] A FIGURA 5A a FIGURA 5D ilustram a reprogramação cardíaca humana por um único vetor policistrônico. A FIGURA 5A a FIGURA 5B mostram imagens representativas de imunocitoquímica (FIGURA 5A) e análises (FIGURA 5B) de AHCFs 3 semanas após a infecção com GFP, retrovírus My+A+M+T ou My+A para mostrar que My+A são suficientes para induzir a reprogramação cardíaca em fibroblastos humanos. α-actinina (acima, vermelho), cTnT (abaixo, vermelho), DAPI (azul). A FIGURA 5C a FIGURA 5D mostram imagens representativas de imunocitoquímica (FIGURA 5C) e análises (FIGURA 5D) de AHCFs 3 semanas após a infecção com retrovírus GFP, My+A+M+T, My-P2A-A e A-P2A-My para mostrar que um único vetor policistrônico é suficiente para induzir a reprogramação cardíaca em fibroblastos humanos. α-actinina (acima, vermelho), cTnT (abaixo, vermelho), DAPI (azul).

[0065] A FIGURA 6A a FIGURA 6C ilustram a reprogramação cardíaca humana por um vetor policistrônico que expressa quatro genes. A FIGURA 6A a FIGURA 6B mostram análises de imunocitoquímica representativas (FIGURA 6A) e imagens (FIGURA 6B) de AHCFs 3 semanas após a infecção com GFP e 24 retrovírus policistrônicos quatro em um diferentes. α-actinina (acima, vermelho), cTnT (abaixo, vermelho), DAPI (azul). A FIGURA 6C mostra uma matriz de pontuação da posição do fator que mostra que diferentes fatores de reprogramação preferem posições diferentes no vetor policistrônico quatro em um.

[0066] A FIGURA 7A a FIGURA 7D ilustram a liberação in vivo de coquetéis de reprogramação que promovem o reparo do coração após o infarto do miocárdio. A FIGURA 7A mostra um esquema de um estudo in vivo de diferentes coquetéis de reprogramação para reparar o coração de camundongo após infarto do miocárdio. Os camundongos foram submetidos à ligação de infarto do miocárdio (MI) seguida por injeção intramiocárdica de retrovírus GFP, ASCL1, MyMT, MyMTA ou MyA. Fatores de reprogramação estavam em um vírus separado. A função cardíaca foi avaliada em vários momentos por ecocardiografia. A FIGURA 7B a FIGURA 7D mostram a fração de ejeção (FIGURA 7B), o volume sistólico final (FIGURA 7C) e o volume diastólico final (FIGURA 7D), do ventrículo esquerdo, conforme quantificado por ecocardiografia em vários pontos de tempo mostrados. MyMT, MyMTA ou MyA melhoraram a função cardíaca após o MI. (n = 11 a 13 para cada grupo. n.s. p > 0,05; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001).

[0067] A FIGURA 8A a FIGURA 8E mostram projeto e teste comparativo de vetores MyA de expressão bicistrônica. A FIGURA 8A mostra o projeto de um construto de lentivírus não integrante (NIL) que codifica a miocardina nativa (MYOCD) e proteínas homólogas de Achaete-scute (ASCL1). A FIGURA 8B mostra o projeto de um construto de AAV que codifica as proteínas MYOCD e ASCL1 nativas. A FIGURA 8C mostra a expressão de MYOCD a partir do construto de NIL em comparação com a expressão de um construto de NIL monocistrônico que codifica MYOCD isoladamente. A FIGURA 8D mostra a expressão de MYOCD a partir do construto de AAV em comparação com a expressão de um construto de AAV monocistrônico que codifica a MYOCD isoladamente. A FIGURA 8E mostra a porcentagem de células positivas para α-actinina após transdução com AAV ou NIL bicistrônico.

[0068] A FIGURA 9A a FIGURA 9D mostram esquemas de domínio da miocardina humana nativa (FIGURA 1A) e três modalidades de proteínas miocardina projetadas com deleções internas: MyΔ1 (FIGURA 1B), MyΔ2 (FIGURA 1C) e MyΔ3 (FIGURA 1D).

[0069] A FIGURA 10A e FIGURA 10B mostram a expressão da proteína (FIGURA 10A) e a localização (FIGURA 10B) de MyΔ1, MyΔ2 e MyΔ3.

[0070] A FIGURA 11 mostra transientes de cálcio para células transduzidas com MEF2C, TBX5 e miocardina nativa ou projetada na presença de pequenas moléculas SB431542 e XAV939.

[0071] A FIGURA 12A e FIGURA 12B mostram a expressão gênica por q-PCR (FIGURA 12A) e morfologia (FIGURA 12B) para células transduzidas com TBX5 e miocardina nativa ou projetada na presença de pequenas moléculas SB431542 e XAV939.

[0072] As Figuras 13A - FIGURA 13C mostram o projeto de vetores AAV para a expressão de proteínas miocardina nativas ou projetadas com ASCL1. A FIGURA 13A mostra MyA ΔWPRE curta A. A FIGURA 13B mostra MyΔ3A ΔWPRE curta A. A FIGURA 13C mostra MyΔ3A WPRE curta A.

[0073] A FIGURA 14A a FIGURA 14D mostram testes de vetores de expressão de AAV bicistrônicos que codificam MyΔ3 e ASCL1. Os níveis de expressão de proteína para miocardina (FIGURA 14A) e ASCL1 (FIGURA 14B) são mostrados. A porcentagem de células que expressam marcadores de fenótipo cardíaco α-actinina (FIGURA 14C) e cTNT (FIGURA 14D) é mostrada.

[0074] A FIGURA 15 mostra a porcentagem de células que expressam marcadores de fenótipo cardíaco α-actinina e cTNT após a transdução com vetores NIL ou AAV bicistrônicos.

[0075] A FIGURA 16A a FIGURA 16B mostram testes de MYOCD em combinação com ASCL1 e MYF6 para reprogramação direta de fibroblastos cardíacos humanos em cardiomiócitos. MYOCD em combinação com ASCL1 ou MYF6 demonstrou reprogramação robusta medida pela porcentagem de cTnT+, α-actinina+ ou células duplamente positivas (FIGURA 16A). Dezesseis outros fatores mostraram alguma eficiência de reprogramação, mas inferior. Micrografias de imunofluorescência representativas são mostradas na FIGURA 16B.

[0076] A Figura 17A a FIGURA 17B mostram testes in vivo de uma miocardina liberada por AAV e ASCL1 em um formato bicistrônico (AAV5:MyΔ3/A). A FIGURA 17A mostra um esquema do projeto de construto para AAV5 bicistrônico:MyΔ3A. A FIGURA 17B mostra que AAV5 bicistrônico:MyΔ3/A melhora a fração de ejeção em um modelo de infarto do miocárdio (MI) de camundongo. O modelo de MI de camundongos foi gerado através da ligação da artéria descendente anterior esquerda (LAD). AAV5:GFP ou AAV5:MyΔ3/A (liberado em um único vetor viral em que os transcritos de MyΔ3 e ASCL1 foram direcionados de promotores separados (CAG e SCP)) em uma dose de 1,2 x 1011 cópias do genoma (GC) foi de forma intramiocárdica injetado nos animais minutos após o procedimento de ligação. A função cardíaca (fração de ejeção) foi avaliada por ecocardiografia em 2, 4 e 7 semanas após o MI. A imagem revelou que os camundongos injetados com AAV5:MyΔ3A apresentaram uma melhora estatisticamente significativa na fração de ejeção em comparação com os camundongos injetados com AAV5:GFP em 4 e 7 semanas após o MI. (n = 6 a 13 para cada grupo. ** p < 0,01).

[0077] A FIGURA 18A a FIGURA 18B mostram testes in vivo de uma miocardina liberada por AAV e ASCL1 em um formato monocistrônico (AAV5:MyΔ3A). A FIGURA 18A mostra um esquema do projeto de construto para AAV5:MyΔ3A monocistrônico. AAV5:MyΔ3A melhora a fração de ejeção em um modelo de infarto do miocárdio (MI) em ratos. Solução salina balanceada de Hank (HBSS)

ou AAV5:MyΔ3A na dose 1,2 x 1011 GC (MyΔ3 e ASCL1 foram expressas a partir de um único transcrito conduzido pelo promotor CAG com as sequências de codificação separadas por um peptídeo P2A) foi liberada por injeção intramiocárdica imediatamente após a ligação coronária permanente. A função cardíaca foi acompanhada por ecocardiografia a cada duas semanas até 8 semanas após o MI. A imagem revelou que a função cardíaca (fração de ejeção) em ratos injetados com o veículo (HBSS) continuou a diminuir após o MI. Ratos injetados com AAV5:MyΔ3A apresentaram uma melhora estatisticamente significativa na fração de ejeção 4 a 8 semanas após o MI. (n = 8 para cada grupo. * p < 0,05 *** p < 0,001).

[0078] A FIGURA 19A a FIGURA 19B mostram testes in vivo de uma miocardina liberada por AAV e ASCL1 em um formato monocistrônico (AAV5:MyΔ3A). AAV5:MyΔ3A melhora a fração de ejeção em um modelo de rato com insuficiência cardíaca crônica devido a infarto do miocárdio (MI). HBSS ou AAV5:MyΔ3A na dose 5 x 1011 GC (os transcritos de MyΔ3 e ASCL1 foram expressos a partir de um único transcrito incluindo um peptídeo 2A) foi liberada por injeção intramiocárdica 2 semanas após a ligação coronária permanente. A FIGURA 19A mostra a função cardíaca em grupos tratados (AAV5:MyΔ3A) e controle de veículo (HBSS) avaliados por ecocardiografia a cada duas semanas até 10 semanas após o MI. A ecocardiografia revelou que a função cardíaca em ratos injetados com veículo (HBSS) continuou a diminuir após o MI. AAV5:MyΔ3A interrompeu este declínio na função cardíaca. A FIGURA 19B mostra que o tratamento com AAV5:MyΔ3A provocou uma melhora estatisticamente significativa na fração de ejeção 6 a 10 semanas após o MI em comparação com animais com veículo. (n = 10 para cada grupo. * p < 0,05 ** p < 0,01).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0079] Permanece uma necessidade sentida por muito tempo e não atendida de composições e métodos adequados para, sem limitação, gerar células com cardiomiócitos induzidos; reprogramação direta de fibroblastos cardíacos em cardiomiócitos, de preferência in vivo; tratamento de várias formas de insuficiência cardíaca, de preferência cardiomiopatia dilatada; e tratamento de lesões cardíacas, tais como MI. A presente invenção fornece tais composições e métodos, e mais.

[0080] A presente invenção fornece métodos e composições em relação à geração de células com cardiomiócitos induzidos (iCM) (in vivo, in vitro ou ex vivo) por meio da reprogramação de outros tipos de células. Em particular, os presentes inventores descobriram que células diferenciadas, por exemplo, fibroblastos, podem ser reprogramadas em cardiomiócitos através da expressão de Achaete- scute homólogo 1 (ASCL1) e/ou Fator Miogênico 6 (MYF6). ASCL1 é conhecido principalmente por seu papel no sistema nervoso, desenvolvimento neuronal e neuroendócrino. Mao et al. Functional and Physical Interactions between Mammalian Achaete-Scute Homolog 1 and Myocyte Enhancer Factor 2A. J. Bio. Chem. 271:14371-75 (1996); Borges et al. An achaete-scute homologue essential for neuroendocrine differentiation in the lung. Nature. 386 (6627):852-55 (1997). No contexto da reprogramação celular, ASCL1 é conhecido na técnica como um fator associado à conversão de células não neuronais em neurônios funcionais. Chanda et al. Generation of Induced Neuronal Cells by the Single Reprogramming Factor ASCL1. Stem Cell Report 3:282-96 (2014); Wapinski et al. Rapid Chromatin Switch in the Direct Reprogramming of Fibroblasts to Neurons. Cell Reports 20:3236-47 (2017); Wapinski et al. Hierarchical mechanisms for transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to neurons. Cell 155:621-35 (2013). De fato, a expressão de ASCL1 em conjunto com outros fatores de reprogramação tem sido utilizada na técnica para converter células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) de um fenótipo de cardiomiócito para um fenótipo neuronal (Tuj1+cTnT−) ou semelhante a neuronal (Tuj1+cTnT+)- um efeito contrário da reprogramação de cardiomiócitos. Chuang et al. Partial Reprogramming of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes into Neurons. Sci Rep. 7:44840 (2017). Em contraste, a presente invenção fornece composições e métodos de geração de células com cardiomiócitos induzidos (iCM) a partir de fibroblastos utilizando ASCL1.

[0081] MYF6 é um fator miogênico associado à diferenciação muscular. Ele induz os fibroblastos a se diferenciarem em mioblastos, e as mutações no MYF6 estão associadas à doença muscular congênita. Não há sugestão de que MYF6 esteja envolvido na diferenciação de cardiomiócitos. Em contraste, a presente invenção fornece composições e métodos de geração de células com cardiomiócitos induzidos (iCM) utilizando MYF6.

[0082] Além disso, a presente invenção fornece polinucleotídeos que codificam proteínas miocardina projetadas com uma deleção interna, proteínas miocardina projetadas com uma deleção interna e métodos de uso dos mesmos. A presente invenção fornece vetores compreendendo tais polinucleotídeos e, em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos adicionais que codificam outras proteínas. Os polinucleotídeos divulgados são úteis, por exemplo, para a transdução de fibroblastos de mamíferos com vetores virais adenoassociados policistrônicos (AAV) para gerar cardiomiócitos induzidos. A presente invenção fornece ainda métodos e composições em relação à geração de células com cardiomiócitos induzidos (iCM) através da reprogramação de outros tipos de células. Em particular, os presentes inventores descobriram que células diferenciadas, por exemplo, fibroblastos, podem ser reprogramadas com cardiomiócitos induzidos através da expressão de Achaete-scute homólogo 1 (ASCL1); em que a co-expressão de miocardina (MYOCD) com ASCL1 é eficaz para tal reprogramação; em que as proteínas miocardina projetadas com uma deleção interna em algumas modalidades aumentam a função do vetor na expressão do gene, reprogramação ou outras funções, ou pelo menos retêm o mesmo nível de função que os vetores com a proteína miocardina nativa. Algumas modalidades de vetores AAV que codificam essa miocardina projetada e ASCL1 são surpreendentemente melhoradas em comparação com o vetor AAV que codifica miocardina nativa e ASCL1. Outras modalidades divulgadas incluem, sem limitação, vetores retrovirais (por exemplo, lentivirais), vetores para coexpressão de miocardina manipulada com outros fatores além ou em vez de ASCL1, liberação não viral dos polinucleotídeos da divulgação, métodos in vivo e ex vivo de aplicação dessas modalidades e composições e métodos para o tratamento de doenças cardíacas, incluindo métodos que envolvem a administração de um ou mais vetores e, em algumas modalidades, uma ou mais moléculas pequenas. A invenção é limitada apenas pelas reivindicações, e a seguinte descrição detalhada fornece diversas modalidades além daquelas descritas neste parágrafo.

[0083] Em um aspecto, a invenção refere-se às variantes projetadas de miocardina (MYOCD). A MYOCD é um grande fator de transcrição polifuncional. Além de mostrar que a expressão de ASCL1 em combinação com MYOCD foi suficiente para induzir um fenótipo de cardiomiócitos em fibroblastos de mamíferos com ou sem outros fatores de reprogramação, os presentes inventores reconheceram que um vetor viral que codifica ASCL1 e MYOCD gera cardiomiócitos induzidos. A invenção fornece vetores virais que codificam MYOCD e ASCL1, incluindo, por exemplo, vetores lentivirais e AAV. Os presentes inventores reconheceram ainda que os vetores lentivirais da invenção, em algumas modalidades, induziram cardiomiócitos de forma mais eficaz do que os vetores AAV da invenção.

[0084] Os presentes inventores também descobriram surpreendentemente que MYOCD compreendendo uma deleção interna retém a expressão e função da miocardina e MYOCD compreendendo uma deleção interna pode ser utilizada isoladamente ou em combinação com outros fatores de reprogramação (por exemplo, para gerar cardiomiócitos de fibroblastos); e, além disso, os vetores virais que compreendem essa MYOCD modificada foram, em algumas modalidades, tão eficazes ou mais eficazes do que os vetores virais que compreendem a MYOCD nativa. A presente invenção, portanto, também fornece vários polinucleotídeos de MYOCD projetados, vetores virais, sistemas de liberação de genes e método de uso dos mesmos. I. Definições

[0085] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "cardiomiócito funcional" refere-se a um cardiomiócito diferenciado que é capaz de enviar ou receber sinais elétricos. Em algumas modalidades, um cardiomiócito é considerado um cardiomiócito funcional se apresentar propriedades eletrofisiológicas, tais como potenciais de ação e/ou transitórios de Ca2+.

[0086] Conforme aqui utilizado, uma "célula não cardíaca diferenciada" pode se referir a uma célula que não é capaz de se diferenciar em todos os tipos de células de um organismo adulto (isto é, não é uma célula pluripotente) e que é de uma linhagem celular diferente de uma linhagem cardíaca (por exemplo, uma linhagem neuronal ou uma linhagem de tecido conjuntivo). As células diferenciadas incluem, mas não são limitadas a estas, células multipotentes, células oligopotentes, células unipotentes, células progenitoras e células terminalmente diferenciadas. Nas modalidades particulares, uma célula menos potente é considerada "diferenciada" em referência a uma célula mais potente.

[0087] Conforme aqui utilizado, "gene codificador de proteína" significa, quando se refere a um componente de um vetor, um polinucleotídeo que codifica uma proteína, diferente de um gene associado à função do vetor. Por exemplo, o termo gene codificador de proteína deve abranger um polinucleotídeo que codifica uma proteína humana, ou variante funcional desta, com atividade de reprogramação. Pretende-se que a frase "o vetor que não compreende nenhum outro gene codificador de proteína" em referência a um vetor significa que o vetor compreende um polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse que está listada, mas nenhum polinucleotídeo que codifica outra proteína que possui atividade de reprogramação - tal como outras proteínas conhecidas na técnica para promover um fenótipo pluripotente ou cardiomiócito. A frase "o vetor que não compreende nenhum outro gene codificador de proteína" não exclui polinucleotídeos que codificam proteínas necessárias para a função do vetor, que opcionalmente podem estar presentes, nem a frase exclui polinucleotídeos que não codificam proteínas. Esses vetores incluirão sequências de polinucleotídeo não codificantes e podem incluir polinucleotídeos que codificam moléculas de RNA (tais como microRNAs). Por outro lado, quando apenas certos genes codificadores de proteínas são listados, fica implícito que outros genes codificadores de proteínas podem estar adicionalmente presentes, tais como genes codificadores de proteínas que codificam proteínas que possuem atividade de reprogramação. Além disso, promovem a reprogramação.

[0088] Uma "célula somática" é uma célula que forma o corpo de um organismo. As células somáticas incluem células que constituem os órgãos, pele, sangue, ossos e tecido conjuntivo de um organismo, mas não células germinativas.

[0089] Os termos "patologia cardíaca" ou "disfunção cardíaca" são utilizados de modo trocável e referem-se a qualquer prejuízo na função de bombeamento do coração. Isso inclui, por exemplo, deficiências na contratilidade, deficiências na capacidade de relaxar (às vezes referida como disfunção diastólica), funcionamento anormal ou impróprio das válvulas cardíacas, doenças do músculo cardíaco (às vezes referidas como cardiomiopatias), doenças como angina de peito, isquemia do miocárdio e/ou infarto caracterizado por suprimento inadequado de sangue ao músculo cardíaco, doenças infiltrativas tais como amiloidose e hemocromatose, hipertrofia global ou regional (tal como pode ocorrer em alguns tipos de cardiomiopatia ou hipertensão sistêmica) e comunicações anormais entre as câmaras do coração.

[0090] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "cardiomiopatia" refere-se a qualquer doença ou disfunção do miocárdio (músculo cardíaco) em que o coração está anormalmente aumentado, espessado e/ou enrijecido. Como um resultado, a capacidade do músculo cardíaco de bombear sangue geralmente é enfraquecida. A etiologia da doença ou distúrbio pode ser, por exemplo, inflamatória, metabólica, tóxica, infiltrativa, fibroplástica, hematológica, genética ou de origem desconhecida. Existem dois tipos gerais de cardiomiopatias: isquêmica (resultante da falta de oxigênio) e não isquêmica.

[0091] “A insuficiência cardíaca (HF) é uma síndrome clínica complexa que pode resultar de qualquer distúrbio cardiovascular estrutural ou funcional que provoca perfusão sistêmica inadequada para atender às demandas metabólicas do corpo sem aumentar excessivamente as pressões de enchimento do ventrículo esquerdo. É caracterizada por sintomas específicos, tais como dispnéia e fadiga, e sinais, tais como retenção de líquidos. Como aqui utilizado, "insuficiência cardíaca crônica" ou "insuficiência cardíaca congestiva" ou "CHF" referem-se, indistintamente, a formas contínuas ou persistentes de insuficiência cardíaca. Os fatores de risco comuns para CHF incluem idade avançada, diabetes, hipertensão e excesso de peso. A CHF é amplamente classificada de acordo com a função sistólica do ventrículo esquerdo como HF com fração de ejeção reduzida ou preservada (HFrEF e HFpEF). O termo “insuficiência cardíaca” não significa que o coração parou ou está falhando completamente, mas que está mais fraco do que o normal em uma pessoa saudável. Em alguns casos, a condição pode ser leve, causando sintomas que só podem ser perceptíveis durante a prática de exercícios, em outros, a condição pode ser mais grave, causando sintomas que podem ser fatais, mesmo em repouso. Os sintomas mais comuns de insuficiência cardíaca crônica incluem falta de ar, cansaço, inchaço das pernas e tornozelos, dor no peito e tosse. Em algumas modalidades, os métodos da invenção diminuem, previnem ou melhoram um ou mais sintomas de CHF (por exemplo, HFrEF) em um indivíduo que sofre ou está em risco de CHF (por exemplo, HFrEF). Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de CHF e condições que podem levar à CHF.

[0092] Como aqui utilizado, "insuficiência cardíaca aguda" ou "insuficiência cardíaca descompensada" referem-se, indistintamente, a uma síndrome de agravamento dos sinais e sintomas que refletem uma incapacidade do coração de bombear sangue em uma taxa compatível com as necessidades do corpo com pressão de enchimento normal. A AHF normalmente se desenvolve gradualmente ao longo de dias a semanas e, em seguida, se descompensa exigindo terapia urgente ou emergente devido à gravidade desses sinais ou sintomas. A AHF pode ser o resultado de um distúrbio primário na função sistólica ou diastólica do coração ou de vasoconstrição venosa ou arterial anormal, mas geralmente representa uma interação de múltiplos fatores, incluindo sobrecarga de volume. A maioria dos pacientes com AHF apresenta descompensação da insuficiência cardíaca crônica (CHF) e, consequentemente, grande parte da discussão sobre a fisiopatologia, apresentação e diagnóstico da CHF é diretamente relevante para o entendimento da AHF. Em outros casos, a AHF resulta de um insulto ao coração ou um evento que prejudica a função cardíaca, tal como um infarto agudo do miocárdio, hipertensão grave, dano a uma válvula cardíaca, ritmos cardíacos anormais, inflamação ou infecção do coração, toxinas e medicamentos. Em algumas modalidades, os métodos da invenção diminuem, previnem ou melhoram um ou mais sintomas de AHF em um indivíduo que sofre ou está em risco de AHF. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de AHF e condições que podem levar à AHF. A AHF pode ser o resultado de isquemia associada a infarto do miocárdio.

[0093] Em algumas modalidades, os métodos da divulgação (por exemplo, terapia de reprogramação) tratam uma ou mais cardiopatias (por exemplo, cardiopatias que podem levar à insuficiência cardíaca aguda e crônica em alguns indivíduos). Condições ilustrativas tratáveis de acordo com os métodos e composições da invenção incluem infarto agudo do miocárdio (MI), cardiopatia isquêmica ou cardiomiopatia isquêmica (CM) (formas de MI crônico), CM dilatado, CM hipertenso, CM familiar, CM genético, CM idiopático, CM resultante de cardiopatia valvar, MCs induzidos por medicamentos e toxinas, MC devido à miocardite e MC periparto. Em algumas modalidades, as composições e métodos divulgados nesta invenção tratam doenças cardíacas congênitas. Em algumas modalidades, os métodos da invenção compreendem a administração de uma composição (por exemplo, um vetor viral) a um indivíduo tendo, apresentando sintomas ou está em risco de uma condição ter progredido para insuficiência cardíaca ou ainda não ter progredido para insuficiência cardíaca. A reprogramação pode ser utilizada para tratar ou prevenir a insuficiência cardíaca em pacientes com essas condições. A insuficiência cardíaca crônica devido a todas essas condições se enquadra no termo geral “insuficiência cardíaca com fração de ejeção reduzida” (HFrEF).

[0094] Conforme aqui utilizado, o termo "gene de interesse" refere- se a um fator de reprogramação ou a um ácido nucleico que codifica o fator de reprogramação. Por exemplo, quando o fator de reprogramação é uma proteína, o gene de interesse é - como evidente do contexto - uma proteína ou a sequência polinucleotídica codificadora da proteína correspondente. Introdução, administração ou outro uso de gene de interesse deve ser entendido como se referindo a qualquer meio de aumentar a expressão ou aumentar a atividade de um gene, produto gênico ou variante funcional de um produto gênico. Assim, em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de geração de células com iCM compreendendo a introdução de um polinucleotídeo de interesse, por exemplo, ASCL1 e/ou MYF6, como um ácido nucleico (por exemplo, desoxirribonucleotídeo (DNA) ou ribonucleotídeo (RNA)) em uma célula alvo como um polinucleotídeo (por exemplo, desoxirribonucleotídeo (DNA) ou ribonucleotídeo (RNA)). O polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula em qualquer um dos vários meios conhecidos na técnica, incluindo, sem limitação, em um vetor viral, não viral, mediante o contato da célula com polinucleotídeo nu ou polinucleotídeo em complexo com um reagente de transfecção, ou por eletroporação. O uso de um gene de interesse como um ácido nucleico também pode incluir alteração indireta da expressão ou atividade do gene de interesse, como edição de genes do lócus que codifica o gene endógeno, expressão de fatores de transcrição ou reguladores, contato de células com um ativador de molécula pequena do gene de interesse, ou uso de métodos de edição de genes, incluindo métodos baseados em DNA ou RNA, para alterar a expressão ou atividade do gene de interesse como um ácido nucleico. Em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem ativar a transcrição de um gene de interesse através da edição das regiões reguladoras (por exemplo, intensificadores ou promotores), alteração dos sítios de junção, remoção ou inserção de sítios de reconhecimento de microRNA, administração de um antagomir para reprimir um microRNA, administrando um microRNA mimético, ou qualquer outro meio de modular a expressão ou atividade do gene de interesse.

[0095] Como aqui utilizado, "produto gênico" significa o produto da expressão de uma sequência polinucleotídica. Por exemplo, uma sequência de codificação de proteína é expressa através da translação da sequência em um produto gênico de proteína, ou uma sequência de codificação de RNA é a expressão através da transcrição da sequência de DNA no RNA correspondente.

[0096] Conforme aqui utilizado, o termo "totipotente" significa a capacidade de uma célula de formar todas as linhagens celulares de um organismo. Por exemplo, em mamíferos, apenas o zigoto e os blastômeros do primeiro estágio de clivagem são totipotentes.

[0097] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "pluripotente" significa a capacidade de uma célula de formar todas as linhagens do corpo ou soma. Por exemplo, as células-tronco embrionárias são um tipo de células-tronco pluripotentes que são capazes de formar células de cada uma das três camadas germinativas, a ectoderme, a mesoderme e a endoderme. As células pluripotentes podem ser reconhecidas pela expressão de marcadores tais como Nanog e Rex1.

[0098] Como aqui utilizado, o termo "multipotente" refere-se à capacidade de uma célula-tronco adulta de formar vários tipos de células de uma linhagem. Por exemplo, as células-tronco hematopoiéticas são capazes de formar todas as células da linhagem celular do sangue, por exemplo, células linfóides e mielóides.

[0099] Como utilizado nesta invenção, o termo "oligopotente" refere-se à capacidade de uma célula-tronco adulta se diferenciar em apenas alguns tipos de células diferentes. Por exemplo, as células- tronco linfóides ou mielóides são capazes de formar células das linhagens linfóides ou mielóides, respectivamente.

[00100] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "unipotente" significa a capacidade de uma célula de formar um único tipo de célula. Por exemplo, as células-tronco espermatogoniais são capazes apenas de formar células de esperma.

[00101] Conforme aqui utilizado, os termos "indivíduo" ou "paciente" referem-se a qualquer animal, tal como um animal domesticado, um animal de zoológico ou um ser humano. O "indivíduo" ou "paciente" pode ser um mamífero tal como um cão, gato, cavalo, gado, um animal do zoológico ou um ser humano. O indivíduo ou paciente também pode ser qualquer animal domesticado, tal como um pássaro, um animal de estimação ou um animal de fazenda. Exemplos específicos de "indivíduos" e "pacientes" incluem, mas não são limitados a estes, indivíduos com uma doença ou distúrbio cardíaco e indivíduos com características ou sintomas relacionados ao distúrbio cardíaco.

[00102] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de cultura de tecidos, imunologia, biologia molecular, biologia celular e DNA recombinante, que estão dentro da habilidade na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology

(Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5thedition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Pat. U.S. No. 4.683.195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes; Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press); Sell (2013) Stem Cells Handbook.

[00103] A menos que o contexto indique o contrário, pretende-se especificamente que as várias características da invenção aqui descritas possam ser utilizadas em qualquer combinação. Além disso, a divulgação também contempla que, em algumas modalidades, qualquer característica ou combinação de características aqui estabelecidas pode ser excluída ou omitida. Para ilustrar, se o relatório descritivo afirma que um complexo compreende os componentes A, B e C, pretende-se especificamente que qualquer um de A, B ou C, ou uma combinação dos mesmos, possa ser omitido e recusado individualmente ou em qualquer combinação.

[00104] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH,

temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 1,0 ou 0,1, conforme apropriado, ou alternativamente por um variação de +/- 15%, ou alternativamente 10%, ou alternativamente 5%, ou alternativamente 2%. Deve ficar entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que todas as designações numéricas são precedidas do termo “cerca de”. Deve ficar entendido que tal formato de faixa é utilizado por conveniência e brevidade e deve ficar entendido de forma flexível para incluir valores numéricos explicitamente especificados como limites de uma faixa, mas também para incluir todos os valores numéricos individuais ou subfaixas englobados dentro dessa faixa como se cada valor numérico e subfaixa fossem especificados explicitamente. Por exemplo, uma relação na faixa de cerca de 1 a cerca de 200 deve ser entendida como incluindo os limites explicitamente citados de cerca de 1 e cerca de 200, mas também para incluir relações individuais, tais como cerca de 2, cerca de 3 e cerca de 4, e subfaixas tais como cerca de 10 a cerca de 50, cerca de 20 a cerca de 100 e assim por diante. Também deve ficar entendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que os reagentes descritos nesta invenção são meramente exemplares e que seus equivalentes são conhecidos na técnica.

[00105] Deve-se observar que conforme aqui utilizado e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "um cardiomiócito" inclui uma pluralidade de cardiomiócitos.

[00106] Também como aqui utilizado, "e/ou" refere-se a e abrange todas e quaisquer combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, assim como a falta de combinações quando interpretado na alternativa ("ou").

[00107] "Administração", "administrando" e semelhantes, quando utilizados em conexão com uma composição da invenção referem-se a administração direta, que pode ser administração de não cardiomiócitos in vitro, administração de não cardiomiócitos in vivo, administração a um indivíduo por um profissional médico ou por auto- administração pelo indivíduo e/ou por administração indireta, que pode ser o ato de prescrever uma composição da invenção. Quando utilizado nesta invenção em referência a uma célula, refere-se à introdução de uma composição na célula. Tipicamente, uma quantidade eficaz é administrada, quantidade essa que pode ser determinada por uma pessoa de habilidade na técnica. Qualquer método de administração pode ser utilizado. As moléculas pequenas podem ser administradas às células, por exemplo, através da adição das moléculas pequenas ao meio de cultura de células ou injeção in vivo no local da lesão cardíaca. A administração a um indivíduo pode ser alcançada, por exemplo, através da injeção intravascular, liberação intramiocárdica, e semelhantes.

[00108] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "célula cardíaca" refere-se a qualquer célula presente no coração que fornece uma função cardíaca, tal como a contração do coração ou fornecimento de sangue, ou de outra forma serve para manter a estrutura do coração. As células cardíacas, como aqui utilizadas, abrangem células que existem no epicárdio, miocárdio ou endocárdio do coração. As células cardíacas também incluem, por exemplo, células do músculo cardíaco ou cardiomiócitos e células das vasculaturas cardíacas, tais como células de uma artéria ou veia coronária. Outros exemplos não limitativos de células cardíacas incluem células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos, células- tronco cardíacas ou células progenitoras, células cardíacas condutoras e células cardíacas de marcapasso que constituem o músculo cardíaco, vasos sanguíneos e estrutura de suporte da célula cardíaca. As células cardíacas podem ser derivadas de células-tronco, incluindo, por exemplo, células-tronco embrionárias ou células-tronco pluripotentes induzidas.

[00109] O termo "cardiomiócito" ou "cardiomiócitos" como aqui utilizado refere-se às células musculares estriadas contendo sarcômeros, encontradas naturalmente no coração de mamíferos, em oposição às células do músculo esquelético. Os cardiomiócitos são caracterizados pela expressão de moléculas especializadas, por exemplo, proteínas como a cadeia pesada da miosina, cadeia leve da miosina, α-actinina cardíaca. O termo "cardiomiócito" como aqui utilizado, é um termo genérico que compreende qualquer subpopulação de cardiomiócitos ou subtipo de cardiomiócitos, por exemplo, cardiomiócitos atriais, ventriculares e marcapassos.

[00110] O termo "células semelhantes a cardiomiócitos" se destina a significar células que compartilham características com cardiomiócitos, mas que podem não compartilhar todas as características. Por exemplo, uma célula semelhante a cardiomiócito pode diferir de um cardiomiócito na expressão de certos genes cardíacos.

[00111] O termo "cultura" ou "cultura celular" significa a manutenção de células em um ambiente artificial in vitro. Um "sistema de cultura de células" é utilizado nesta invenção para se referir às condições de cultura nas quais uma população de células pode ser cultivada como monocamadas ou em suspensão. "Meio de cultura" é aqui utilizado para se referir a uma solução nutritiva para o cultivo, crescimento ou proliferação de células. O meio de cultura pode ser caracterizado por propriedades funcionais, tais como, mas não limitado à capacidade de manter as células em um estado particular (por exemplo, um estado pluripotente, um estado quiescente, etc.), ou para células maduras, tais como, em algumas modalidades, para promover a diferenciação de células progenitoras em células de uma linhagem particular (por exemplo, um cardiomiócito).

[00112] Como aqui utilizado, o termo "expressão" ou "expresso" refere-se ao processo pelo qual os polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é subsequentemente trasladado em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariótica. O nível de expressão de um gene pode ser determinado através da medição da quantidade de mRNA ou proteína em uma amostra de célula ou tecido.

[00113] Como aqui utilizado, um "cassete de expressão" é um polinucleotídeo de DNA que compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam as proteínas ou ácidos nucleicos que está configurado para expressar o polinucleotídeo em uma célula hospedeira. Tipicamente, a expressão dos polinucleotídeos é colocada sob o controle de certos elementos reguladores, incluindo promotores constitutivos ou induzíveis, elementos reguladores específicos de tecido, e intensificadores. Tais polinucleotídeos são considerados "ligados de maneira operável" ou "operativamente ligados" aos elementos reguladores (por exemplo, um promotor).

[00114] O termo "cardiomiócito induzido" ou a abreviatura "iCM" refere-se a um não cardiomiócito (e sua progênie) que foi transformado em um cardiomiócito (e/ou célula semelhante a cardiomiócito). Os métodos da presente invenção podem ser utilizados em conjunto com quaisquer métodos agora conhecidos ou descobertos posteriormente para gerar cardiomiócitos induzidos, por exemplo, para melhorar outras técnicas.

[00115] O termo "sem cardiomiócito", tal como aqui utilizado, refere-

se a qualquer célula ou população de células em uma preparação celular que não preenche os critérios de um "cardiomiócito" conforme definido e utilizado nesta invenção. Exemplos não limitativos de sem cardiomiócitos incluem células somáticas, fibroblastos cardíacos, fibroblastos não cardíacos, células progenitoras cardíacas e células- tronco.

[00116] A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregada nesta invenção para se referir aos compostos, materiais, composições e/ou formas de dosagem que são, dentro do escopo da perfeita avaliação médica, adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, compatível com uma relação de risco/benefício razoável.

[00117] Os termos "regenerar", "regeneração" e semelhantes, conforme utilizados nesta invenção no contexto de tecido cardíaco lesionado devem ter seus significados comuns e também devem se referir ao processo de crescimento e/ou desenvolvimento de novo tecido cardíaco em um coração ou tecido cardíaco que foi lesado, por exemplo, lesado devido a isquemia, infarto, reperfusão ou outra doença. Em algumas modalidades, a regeneração do tecido cardíaco compreende a geração de cardiomiócitos.

[00118] Como aqui utilizado, o termo "reprogramação" ou "transdiferenciação" refere-se à geração de uma célula de uma determinada linhagem (por exemplo, uma célula cardíaca) a partir de um tipo diferente de célula (por exemplo, uma célula de fibroblasto) sem um processo intermediário de desdiferenciação da célula em uma célula que apresenta características de células-tronco pluripotentes. Como aqui utilizado, "reprogramação" inclui transdiferenciação, desdiferenciação e semelhantes.

[00119] Como aqui utilizado, "atividade de repogramação" refere-se à capacidade de uma proteína ou polinucleotídeo com atividade de reprogramação de induzir ou promover a reprogramação de uma célula em um cardiomiócito ou célula semelhante a cardiomiócito quando é introduzido ou expresso pela célula, isoladamente ou em combinação com outras proteínas ou polinucleotídeos tendo atividade de reprogramação. Por exemplo, uma primeira proteína possui atividade de reprogramação se a expressão da primeira proteína em uma célula sem outros fatores induzir ou promover a reprogramação da célula; mas a primeira proteína também possui atividade de reprogramação, como o termo é utilizado nesta invenção, se a primeira proteína promover a reprogramação em combinação com uma segunda proteína - isto é, quando a primeira proteína e a segunda proteína são expressas entre si.

[00120] Como aqui utilizado, o termo "eficiência de reprogramação" se refere ao número de células em uma amostra que são reprogramadas com sucesso em cardiomiócitos em relação ao número total de células na amostra.

[00121] O termo "fator de reprogramação", tal como aqui utilizado, inclui um fator que é introduzido para expressão em uma célula para auxiliar na reprogramação da célula em um cardiomiócito induzido. Fatores de reprogramação incluem proteínas e ácidos nucleicos (por exemplo, RNAs, tais como microRNAs, siRNA ou shRNAs).

[00122] O termo "células-tronco" refere-se a células que possuem a capacidade de se autorrenovar e gerar progênie diferenciada. O termo "células-tronco pluripotentes" refere-se a células-tronco que podem dar origem a células de todas as três camadas germinativas (endoderme, mesoderme e ectoderme), mas não possuem a capacidade de dar origem a um organismo completo.

[00123] "Tratamento", "tratando" e "tratar" são definidos como agindo sobre uma doença, distúrbio ou condição com um agente para reduzir ou melhorar quaisquer outros efeitos indesejáveis ou prejudiciais da doença, distúrbio, condição e/ou seus sintomas.

[00124] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "quantidade eficaz" e semelhante refere-se a uma quantidade que é suficiente para induzir um resultado fisiológico desejado (por exemplo, reprogramação de uma célula ou tratamento de uma doença). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Tal liberação depende de uma série de variáveis, incluindo o período de tempo em que a unidade de dosagem individual deve ser utilizada, a biodisponibilidade da composição, a via de administração, etc. Fica entendido, no entanto, que quantidades específicas das composições (por exemplo, fatores de reprogramação) para qualquer indivíduo particular depende de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do agente específico empregado, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo, o tempo de administração, a taxa de excreção, a combinação da composição, gravidade da doença particular a ser tratada e a forma de administração.

[00125] Como aqui utilizado, o termo "seus equivalentes" em referência a um polipeptídeo ou sequência de ácido nucleico refere-se a um polipeptídeo ou ácido nucleico que difere de um polipeptídeo de referência ou sequência de ácido nucleico, mas retém propriedades essenciais (por exemplo, atividade biológica). Uma variante típica de um polinucleotídeo difere na sequência de nucleotídeo de outro polinucleotídeo de referência. Mudanças na sequência de nucleotídeo da variante podem ou não alterar a sequência de aminoácido de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. As alterações de nucleotídeos podem resultar em substituições, deleções, adições, fusões e truncamento de aminoácidos no polipeptídeo codificado pela sequência de referência. Geralmente, as diferenças são limitadas de modo que as sequências do polipeptídeo de referência e da variante sejam muito semelhantes em geral e, em muitas regiões, idênticas.

[00126] O termo "isolado" significa separado dos constituintes, células e outros, nos quais a célula, tecido, polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmentos do mesmo, que são normalmente associados na natureza. Por exemplo, uma célula isolada é uma célula que é separada de tecido ou células de fenótipo ou genótipo diferente. Como é evidente para aqueles de habilidade na técnica, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína ou célula de ocorrência não natural não requer "isolamento" para distingui-lo de sua contraparte de ocorrência natural.

[00127] Como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" e "polinucleotídeo" são utilizados de modo trocável e referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou seus análogos. Exemplos não limitativos de polinucleotídeos incluem ácidos nucleicos lineares e circulares, RNA mensageiro (mRNA), cDNA, polinucleotídeos recombinantes, vetores, sondas e iniciadores.

[00128] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são utilizados de modo trocável nesta invenção e referem-se a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos geneticamente codificados e não geneticamente codificados, aminoácidos química ou bioquimicamente modificados ou derivatizados e polipeptídeos tendo esqueletos peptídicos modificados. O termo inclui proteínas de fusão, incluindo, mas não limitado a proteínas de fusão com uma sequência de aminoácido heteróloga, fusões com sequências líderes heterólogas e homólogas, com ou sem resíduos de metionina N-terminal, proteínas imunologicamente marcadas e semelhantes.

[00129] Como aqui utilizado, a palavra "polinucleotídeo" precedida por um nome de gene (por exemplo, "polinucleotídeo MYOCD") refere- se a uma sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína correspondente (por exemplo, uma "proteína MYOCD").

[00130] Como utilizado nesta invenção, a palavra "proteína" precedida por um nome de gene (por exemplo, "proteína MYOCD") refere-se à proteína nativa ou a uma variante funcional da mesma. Uma "proteína nativa" é uma proteína codificada por uma cópia genômica de um gene de um organismo, de preferência o organismo para o qual o vetor se destina (por exemplo, um ser humano, um roedor, um primata ou um animal de interesse veterinário), em qualquer uma das isoformas funcionais do gene ou variações alélicas funcionais.

[00131] Conforme utilizado nesta invenção, uma "variante funcional" ou "variante" de uma proteína é uma variante com qualquer número de substituições, inserções, truncamentos ou deleções internas de aminoácidos que retêm os atributos funcionais da proteína, incluindo, por exemplo, a capacidade da proteína de induzir, em combinação com outros fatores, a reprogramação de células em cardiomiócitos. As variantes funcionais podem ser identificadas computacionalmente, tais como variantes tendo apenas substituições conservativas, ou experimentalmente utilizando ensaios in vitro ou in vivo.

[00132] Como aqui utilizado, uma "variante de códon" de uma sequência de polinucleotídeo é uma sequência de polinucleotídeo que codifica a mesma proteína como uma sequência de polinucleotídeo de referência tendo uma ou mais substituições de códon sinônimo. A seleção de códons sinônimos está dentro da habilidade daqueles na técnica, a codificação como o código genético sendo conhecida. A otimização de códons é uma técnica conhecida que pode ser executada utilizando uma variedade de ferramentas computacionais (tais como a ferramenta GENSMART™ Codon Optimization disponível em www.genscript.com). Geralmente, a otimização de códons é utilizada para aumentar a expressão da proteína em um sistema heterólogo, por exemplo, quando uma sequência de codificação humana é expressa em um sistema bacteriano. O termo "variante de códon" se destina a abranger as sequências que são otimizadas desta maneira e as sequências que são otimizadas para outros propósitos, tais como a remoção de ilhas CpG e/ou sítios de início crípticos.

[00133] Como utilizado nesta invenção, o termo "célula progenitora" refere-se a uma célula que está comprometida em se diferenciar em um tipo específico de célula ou formar um tipo específico de tecido. Uma célula progenitora, como uma célula-tronco, pode se diferenciar ainda mais em um ou mais tipos de células, mas é mais madura do que uma célula-tronco, de modo que possui uma capacidade de diferenciação mais limitada/restrita.

[00134] O termo "vetor" refere-se a uma macromolécula ou complexo de moléculas compreendendo um polinucleotídeo ou proteína a ser liberado a uma célula hospedeira, in vitro ou in vivo. Um vetor pode ser um RNA modificado, uma nanopartícula de lipídeo (encapsulando DNA ou RNA), um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral de integração (LVV) ou um vetor integrando LVV. Assim, como aqui utilizado, "vetores" incluem polinucleotídeos nus utilizados para transformação (por exemplo, plasmídeos), assim como qualquer outra composição utilizada para liberar um polinucleotídeo a uma célula, vetores incluídos capazes de transduzir células e vetores úteis para transfecção de células. "Sistemas de vetor" referem-se a combinações de um, dois, três ou mais vetores utilizados para liberar um, dois, três ou mais polinucleotídeos. Por exemplo, em algumas modalidades, dois vetores virais (por exemplo, dois vetores AAV) podem ser utilizados para liberar dois polinucleotídeos ou três vetores virais (por exemplo, dois vetores AAV) podem ser utilizados para liberar três polinucleotídeos. Por exemplo, um AAV pode codificar a MYOCD ou uma variante da mesma e outro AAV pode codificar ASCL1 ou uma variante da mesma. Alternativamente, vários vetores podem ser utilizados para liberar um único polinucleotídeo por meio de recombinação pós-transfecção. Sistemas de vetor duplo para liberação de genes grandes são descritos, por exemplo, em McClements et al. Yale J. Biol. Med. 90:611-23 (2017), que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[00135] Como aqui utilizado, o termo "vetor viral" se refere a uma molécula de ácido nucleico que inclui elementos de ácido nucleico derivados de vírus que normalmente facilitam a transferência da molécula de ácido nucleico ou a integração no genoma de uma célula ou a uma partícula viral que atua como mediador a transferência de ácido nucleico. As partículas virais incluirão tipicamente vários componentes virais e, às vezes, também componentes celulares, além dos ácidos nucleicos.

[00136] O termo "modificação genética" refere-se a uma mudança genética permanente ou transitória induzida em uma célula após a introdução de um novo ácido nucleico (isto é, ácido nucleico exógeno na célula). A mudança genética pode ser executada pela incorporação do novo ácido nucleico no genoma da célula cardíaca ou pela manutenção transitória ou estável do novo ácido nucleico como um elemento extracromossômico. Quando a célula é uma célula eucariótica, uma mudança genética permanente pode ser alcançada pela introdução do ácido nucleico no genoma da célula. Métodos adequados de modificação genética incluem infecção viral, transfecção, conjugação, fusão de protoplastos, eletroporação, tecnologia de pistola de partículas, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, e semelhantes.

[00137] O termo "células-tronco" refere-se a células que possuem a capacidade de se auto-renovar e gerar progênie diferenciada. O termo "células-tronco pluripotentes" refere-se a células-tronco que podem dar origem a células de todas as três camadas germinativas (endoderme, mesoderme e ectoderme), mas não possuem a capacidade de dar origem a um organismo completo. Em algumas modalidades, as composições para induzir o fenótipo de cardiomicócitos podem ser utilizadas em uma população de células para induzir a reprogramação. Em outras modalidades, as composições induzem um fenótipo de cardiomiócito.

[00138] O termo "células-tronco pluripotentes induzidas" deve receber seu significado comum e também deve se referir a células somáticas diferenciadas de mamíferos (por exemplo, células somáticas adultas, tais como a pele) que foram reprogramadas para apresentar pelo menos uma característica de pluripotência. Ver, por exemplo, Takahashi et al. (2007) Cell 131(5):861-872, Kim et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108(19): 7838-7843, Sell (2013) Stem Cells Handbook.

[00139] A não ser que de outra maneira mencionada, as abreviações utilizadas ao longo do relatório descritivo possuem os seguintes significados: AHCF, fibroblasto cardíaco humano adulto, APCF, fibroblasto cardíaco de porco adulto, a-MHC-GFP, proteína fluorescente verde de cadeia pesada alfa-miosina; CAG, intensificador precoce de CMV/beta actina de galinha (promotor); CF, fibroblasto cardíaco; cm, centímetro; CO, débito cardíaco; EF, fração de ejeção; FΑCS, classificação de células ativadas por fluorescência; GFP, proteína fluorescente verde; GMT, Gata4, Mef2c e Tbx5; GMTc, Gata4, Mef2c, Tbx5, TGF-βi, WNTi; GO, ontologia genética; HCF, fibroblasto cardíaco humano; iCM, cardiomiócito induzido; LAD, descendente anterior esquerdo (artéria); kg, quilograma; μg,

micrograma; μl, microlitro; mg, miligrama; ml, mililitro; MI, infarto do miocárdio; msec, milissegundo; min, minuto; MyAMT, Miocardina, Ascl1, Mef2c e Tbx5; MyA, Miocardina e Ascl1; MyMT, Miocardina, Mef2c e Tbx5; MyMTc, Miocardina, Mef2c, Tbx5, TGF-βi, WNTi; MRI, imagem por ressonância magnética; PBS, solução salina tamponada com fosfato; PBST, solução salina tamponada com fosfato, triton; PFA, paraformaldeído; qPCR, reação em cadeia da polimerase quantitativa; qRT-PCR, reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa quantitativa; RNA, ácido ribonucleico; RNA-seq, sequenciamento de RNA; RT-PCR, reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa; seg, segundo; SV, volume sistólico; TGF-β, fator de crescimento transformador beta; TGF-βi, inibidor do fator de crescimento transformador beta; WNT, wingless-Int; WNTi, inibidor de wingless-Int; YFP, proteína de fluorescência amarela; SCP, promotor do super core; 4F, Gata4, Mef2c, TBX5 e Miocardina; 4Fc, Gata4, Mef2c, TBX5 e Miocardina + TGF-βi e WNTi; 7F, Gata4, Mef2c e Tbx5, Esrrg, Miocardina, Zfpm2 e Mesp1; 7Fc, Gata4, Mef2c e Tbx5, Esrrg, Miocardina, Zfpm2 e Mesp1 + TGF-βi e WNTi.

[00140] A descrição detalhada da invenção é dividida em várias seções apenas por conveniência do leitor e a divulgação encontrada em qualquer seção pode ser combinada com aquela em outra seção. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados nesta invenção possuem o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles descritos nesta invenção também possam ser utilizados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações aqui mencionadas são incorporadas por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas. II. Fatores de Reprogramação

[00141] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece fatores de reprogramação e composições dos mesmos que são capazes de modular a expressão de um ou mais genes, tais como polinucleotídeos ou proteínas de interesse. Os presentes inventores descobriram surpreendentemente que as células diferenciadas podem ser reprogramadas em células com cardiomiócitos induzidos (iCM) utilizando um ou mais fatores de reprogramação que modulam a expressão de um ou mais genes, tais como polinucleotídeos ou proteínas de interesse, tais como Achaete-scute homólogo 1 (ASCL1), Fator Miogênico 6 (MYF6), Miocardina (MYOCD), fator potenciador específico de miócitos 2C (MEF2C) e/ou fator de transcrição T-box 5 (TBX5). Em algumas modalidades, um ou mais fatores de reprogramação são fornecidos como um polinucleotídeo (por exemplo, um RNA, um mRNA ou um polinucleotídeo de DNA) que codifica um ou mais genes, tais como polinucleotídeos ou proteínas de interesse. Em algumas modalidades, o um ou mais fatores de reprogramação são fornecidos como uma proteína.

[00142] Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação são microRNAs ou antagonistas de microRNA, siRNAs ou moléculas pequenas que são capazes de aumentar a expressão de um ou mais genes tais como polinucleotídeos ou proteínas de interesse. Em algumas modalidades, a expressão de um gene de interesse é diminuída pela expressão de um microRNA ou um antagonista de microRNA que tem como alvo um sítio alvo de microRNA no transcrito do qual um gene de interesse é expresso. Alternativamente, em algumas modalidades, a expressão de um gene de interesse é aumentada pela expressão de um microRNA ou um antagonista de microRNA. Por exemplo, a expressão endógena de um polipeptídeo

Oct4 pode ser aumentada indiretamente pela introdução de microRNA- 302 (miR-302), ou através da expressão aumentada de miR-302, que tem como alvo uma regulação negativa de Oct4. Ver, por exemplo, Hu et al., Stem Cells 31(2): 259-68 (2013), que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Portanto, o miRNA-302 pode ser um indutor indireto da expressão do polipeptídeo Oct endógeno. O miRNA-302 pode ser introduzido isoladamente ou com um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo Oct.

[00143] Em algumas modalidades, o fator de reprogramação é uma pequena molécula selecionada do grupo que consiste em SB431542, LDN-193189, dexametasona, LY364947, D4476, miricetina, IWR1, XAV939, ácido docosaexaenóico (DHA), S-nitroso-TV- acetilpenicilamina (SNAP), Hh-Agl.5, alprostadil, cromakalim, MNITMT, A769662, ácido retinóico p-hidroxianilida, dibrometo de decametônio, nifedipina, piroxicam, bacitracina, aztreonam, cloridrato de harmalol, amida-C2 (A7), Ph-C12 (CIO), mCF3-C-7 (J5), G856-7272 (A473), 5475707, ou qualquer combinação dos mesmos. A. Genes de Interesse (Polinucleotídeos e Proteínas de Interesse)

[00144] Em algumas modalidades, o um ou mais fatores de reprogramação aqui fornecidos modulam (por exemplo, aumentam ou diminuem) a expressão de um ou mais genes de interesse. Em algumas modalidades, um ou mais genes alvo são conhecidos por estarem envolvidos na diferenciação, proliferação e/ou função de cardiomiócitos. Em algumas modalidades, um ou mais genes alvo são selecionados do grupo que consiste em MYOCD, MEF2C e TBX5. Em algumas modalidades, um ou mais genes alvo não foram descritos anteriormente de estarem envolvidos na diferenciação, proliferação e/ou função de cardiomiócitos, ou foram descritos anteriormente de estarem envolvidos na diferenciação, proliferação e/ou função de uma linhagem celular não cardíaca, tal como ASCL1. Sequências ilustrativas de genes úteis nas composições e métodos da presente invenção são fornecidas na Tabela 1. Onde mais do que uma isoforma de um determinado gene de interesse é conhecida, ficará entendido que as modalidades da presente invenção incluem composições e métodos que compreendem as isoformas alternativas de cada gene de interesse. As composições e métodos da invenção não estão limitados às sequências divulgadas, que são fornecidas para exemplo e ilustração e não são limitativas.

[00145] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um fator de reprogramação que modula a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de ASCL1, MYOCD, MEF2C e TBX5. Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação aqui divulgados modulam a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de ASCL1, MYOCD, MEF2C e TBX5, CCNB1, CCND1, CDK1, CDK4, AURKB, OCT4, BAF60C, ESRRG, GATA4, GATA6, HAND2, IRX4, ISLL, MESP1, MESP2, NKX2.5, SRF, TBX20 e ZFPM2.

[00146] Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação aqui divulgados modulam a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de GATA4, MEF2C e TBX5 (isto é, GMT). Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação aqui divulgados modulam a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de MYOCD, MEF2C e TBX5 (isto é, MyMT). Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação aqui divulgados modulam a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de MYOCD, ASCL1, MEF2C e TBX5 (isto é, MyAMT). Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação aqui divulgados modulam a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de MYOCD e ASCL1 (ou seja, MyA). Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação aqui divulgados modulam a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de GATA4, MEF2C, TBX5 e MYOCD (isto é, 4F). Em outras modalidades, os fatores de reprogramação aqui divulgados modulam a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de GATA4, MEF2C, TBX5, ESRRG, MYOCD, ZFPM2 e MESP1 (isto é, 7F).

[00147] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um fator de reprogramação que modula a expressão de um ou mais genes de interesse selecionados de ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5, DLX3, DLX6, GATA2 e GATA5. Tabela 1: Sequências Representativas Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto) ASCL1 MESSAKMESGGAGQQPQPQPQQPF ATGGAAAGCTCTGCCAAGATGGAGAGCGGCG

LPPAACFFATAAAAAAAAAAAAAQSA GCGCCGGCCAGCAGCCCCAGCCGCAGCCCCA QQQQQQQQQQQQAPQLRPAADGQ GCAGCCCTTCCTGCCGCCCGCAGCCTGTTTCT PSGGGHKSAPKQVKRQRSSSPELMR TTGCCACGGCCGCAGCCGCGGCGGCCGCAGC CKRRLNFSGFGYSLPQQQPAAVARR CGCCGCAGCGGCAGCGCAGAGCGCGCAGCAG NERERNRVKLVNLGFATLREHVPNG CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGG AANKKMSKVETLRSAVEYIRALQQLL CGCCGCAGCTGAGACCGGCGGCCGACGGCCA DEHDAVSAAFQAGVLSPTISPNYSND GCCCTCAGGGGGCGGTCACAAGTCAGCGCCC LNSMAGSPVSSYSSDEGSYDPLSPE AAGCAAGTCAAGCGACAGCGCTCGTCTTCGCC

EQELLDFTNWF CGAACTGATGCGCTGCAAACGCCGGCTCAACT (SEQ ID NO: 1) TCAGCGGCTTTGGCTACAGCCTGCCGCAGCAG

CAGCCGGCCGCCGTGGCGCGCCGCAACGAGC GCGAGCGCAACCGCGTCAAGTTGGTCAACCTG GGCTTTGCCACCCTTCGGGAGCACGTCCCCAA CGGCGCGGCCAACAAGAAGATGAGTAAGGTG GAGACACTGCGCTCGGCGGTCGAGTACATCCG CGCGCTGCAGCAGCTGCTGGACGAGCATGAC GCGGTGAGCGCCGCCTTCCAGGCAGGCGTCC TGTCGCCCACCATCTCCCCCAACTACTCCAAC GACTTGAACTCCATGGCCGGCTCGCCGGTCTC ATCCTACTCGTCGGACGAGGGCTCTTACGACC CGCTCAGCCCCGAGGAGCAGGAGCTTCTCGA

CTTCACCAACTGGTTCTGA (SEQ ID NO: 2)

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto) DLX3 MSGSFDRKLSSILTDISSSLSCHAGSK ATGAGTGGCTCCTTCGATCGCAAGCTCAGCAG

DSPTLPESSVTDLGYYSAPQHDYYSG CATCCTCACCGACATCTCCAGCTCCCTTAGCTG QPYGQTVNPYTYHHQFNLNGLAGTG CCATGCGGGCTCCAAGGACTCGCCTACCCTGC AYSPKSEYTYGASYRQYGAYREQPL CCGAGTCTTCTGTCACTGACCTGGGCTACTAC PAQDPVSVKEEPEAEVRMVNGKPKK AGCGCTCCCCAGCACGATTACTACTCGGGCCA VRKPRTIYSSYQLAALQRRFQKAQYL GCCCTATGGCCAGACGGTGAACCCCTACACCT ALPERAELAAQLGLTQTQVKIWFQNR ACCACCACCAATTCAATCTCAATGGGCTTGCAG RSKFKKLYKNGEVPLEHSPNNSDSM GCACGGGCGCTTACTCGCCCAAGTCGGAATAT ACNSPPSPALWDTSSHSTPAPARSQ ACCTACGGAGCCTCCTACCGGCAATACGGGGC LPPPLPYSASPSYLDDPTNSWYHAQ GTATCGGGAGCAGCCGCTGCCAGCCCAGGAC NLSGPHLQQQPPQPATLHHASPGPP CCAGTGTCGGTGAAGGAGGAGCCGGAAGCAG

PNPGAVY AGGTGCGCATGGTGAATGGGAAGCCCAAGAAG (SEQ ID NO: 43) GTCCGAAAGCCGCGTACGATCTACTCCAGCTA

CCAGCTGGCCGCCCTGCAGCGCCGCTTCCAG AAGGCCCAGTACCTGGCGCTGCCCGAGCGCG CCGAGCTGGCCGCGCAGCTGGGCCTCACGCA GACACAGGTGAAAATCTGGTTCCAGAACCGCC GTTCCAAGTTCAAGAAACTCTACAAGAACGGG GAGGTGCCGCTGGAGCACAGTCCCAATAACAG TGATTCCATGGCCTGCAACTCACCACCATCACC CGCCCTCTGGGACACCTCTTCCCACTCCACTC CGGCCCCTGCCCGCAGTCAGCTGCCCCCGCC GCTCCCATACAGTGCCTCCCCCAGCTACCTGG ACGACCCCACCAACTCCTGGTATCACGCACAG AACCTGAGTGGACCCCACTTACAGCAGCAGCC GCCTCAGCCAGCCACCCTGCACCATGCCTCTC CCGGGCCCCCGCCCAACCCTGGGGCTGTGTA

CTGA (SEQ ID NO: 44) DLX6 MMTMTTMADGLEGQDSSKSAFMEF ATGATGACCATGACTACGATGGCTGACGGCTT

GQQQQQQQQQQQQQQQQQQQPP GGAAGGCCAGGACTCGTCCAAATCCGCCTTCA PPPPPPPQPHSQQSSPAMAGAHYPL TGGAGTTCGGGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA HCLHSAAAAAAAGSHHHHHHQHHHH GCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAG GSPYASGGGNSYNHRSLAAYPYMSH CAACAGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC SQHSPYLQSYHNSSAAAQTRGDDTD CGCAGCCGCACTCGCAGCAGAGCTCCCCGGC QQKTTVIENGEIRFNGKGKKIRKPRTI CATGGCAGGCGCGCACTACCCTCTGCACTGCC YSSLQLQALNHRFQQTQYLALPERAE TGCACTCGGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCCG LAASLGLTQTQVKIWFQNKRSKFKKL GCTCGCACCACCACCACCACCACCAGCACCAC

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

LKQGSNPHESDPLQGSAALSPRSPA CACCACGGCTCGCCCTACGCGTCGGGCGGAG LPPVWDVSASAKGVSMPPNSYMPGY GGAACTCCTACAACCACCGCTCGCTCGCCGCC

SHWYSSPHQDTMQRPQMM TACCCCTACATGAGCCACTCGCAGCACAGCCC (SEQ ID NO: 45) TTACCTCCAGTCCTACCACAACAGCAGCGCAG

CCGCCCAGACGCGAGGGGACGACACAGATCA ACAAAAAACTACAGTGATTGAAAACGGGGAAAT CAGGTTCAATGGAAAAGGGAAAAAGATTCGGA AGCCTCGGACCATTTATTCCAGCCTGCAGCTC CAGGCTTTAAACCATCGCTTTCAGCAGACACAG TATCTGGCCCTTCCAGAGAGAGCCGAACTGGC AGCTTCCTTAGGACTGACACAAACACAGGTGA AGATATGGTTTCAGAACAAACGCTCTAAGTTTA AGAAACTGCTGAAGCAGGGCAGTAATCCTCAT GAGAGCGACCCCCTCCAGGGCTCGGCGGCCC TGTCGCCACGCTCGCCAGCGCTGCCTCCAGTC TGGGACGTTTCTGCCTCGGCCAAGGGTGTCAG TATGCCCCCCAACAGCTACATGCCTGGCTATTC TCACTGGTACTCCTCTCCACACCAGGACACGA

TGCAGAGACCACAGATGATGTGA (SEQ ID NO: 46)

ESRRG MDSVELCLPESFSLHYEEELLCRMSN ATGGATTCGGTAGAACTTTGCCTTCCTGAATCT KDRHIDSSCSSFIKTEPSSPASLTDSV TTTTCCCTGCACTACGAGGAAGAGCTTCTCTGC NHHSPGGSSDASGSYSSTMNGHQN AGAATGTCAAACAAAGATCGACACATTGATTCC GLDSPPLYPSAPILGGSGPVRKLYDD AGCTGTTCGTCCTTCATCAAGACGGAACCTTCC CSSTIVEDPQTKCEYMLNSMPKRLCL AGCCCAGCCTCCCTGACGGACAGCGTCAACCA VCGDIASGYHYGVASCEACKAFFKRT CCACAGCCCTGGTGGCTCTTCAGACGCCAGTG IQGNIEYSCPATNECEITKRRRKSCQA GGAGCTACAGTTCAACCATGAATGGCCATCAG CRFMKCLKVGMLKEGVRLDRVRGGR AACGGACTTGACTCGCCACCTCTCTACCCTTCT QKYKRRIDAENSPYLNPQLVQPAKKP GCTCCTATCCTGGGAGGTAGTGGGCCTGTCAG YNKIVSHLLVAEPEKIYAMPDPTVPDS GAAACTGTATGATGACTGCTCCAGCACCATTGT DIKALTTLCDLADRELVVIIGWAKHIPG TGAAGATCCCCAGACCAAGTGTGAATACATGCT FSTLSLADQMSLLQSAWMEILILGVVY CAACTCGATGCCCAAGAGACTGTGTTTAGTGT RSLSFEDELVYADDYIMDEDQSKLAG GTGGTGACATCGCTTCTGGGTACCACTATGGG LLDLNNAILQLVKKYKSMKLEKEEFVT GTAGCATCATGTGAAGCCTGCAAGGCATTCTTC LKAIALANSDSMHIEDVEAVQKLQDVL AAGAGGACAATTCAAGGCAATATAGAATACAGC HEALQDYEAGQHMEDPRRAGKMLM TGCCCTGCCACGAATGAATGTGAAATCACAAA TLPLLRQTSTKAVQHFYNIKLEGKVP GCGCAGACGTAAATCCTGCCAGGCTTGCCGCT MHKLFLEMLEAKV TCATGAAGTGTTTAAAAGTGGGCATGCTGAAAG

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto) (SEQ ID NO: 47) AAGGGGTGCGTCTTGACAGAGTACGTGGAGGT

CGGCAGAAGTACAAGCGCAGGATAGATGCGGA GAACAGCCCATACCTGAACCCTCAGCTGGTTC AGCCAGCCAAAAAGCCATATAACAAGATTGTCT CACATTTGTTGGTGGCTGAACCGGAGAAGATC TATGCCATGCCTGACCCTACTGTCCCCGACAG TGACATCAAAGCCCTCACTACACTGTGTGACTT GGCCGACCGAGAGTTGGTGGTTATCATTGGAT GGGCGAAGCATATTCCAGGCTTCTCCACGCTG TCCCTGGCGGACCAGATGAGCCTTCTGCAGAG TGCTTGGATGGAAATTTTGATCCTTGGTGTCGT ATACCGGTCTCTTTCGTTTGAGGATGAACTTGT CTATGCAGACGATTATATAATGGACGAAGACCA GTCCAAATTAGCAGGCCTTCTTGATCTAAATAA TGCTATCCTGCAGCTGGTAAAGAAATACAAGAG CATGAAGCTGGAAAAAGAAGAATTTGTCACCCT CAAAGCTATAGCTCTTGCTAATTCAGACTCCAT GCACATAGAAGATGTTGAAGCCGTTCAGAAGC TTCAGGATGTCTTACATGAAGCGCTGCAGGATT ATGAAGCTGGCCAGCACATGGAAGACCCTCGT CGAGCTGGCAAGATGCTGATGACACTGCCACT CCTGAGGCAGACCTCTACCAAGGCCGTGCAGC ATTTCTACAACATCAAACTAGAAGGCAAAGTCC CAATGCACAAACTTTTTTTGGAAATGTTGGAGG

CCAAGGTCTGA (SEQ ID NO: 48) GATA2 MEVAPEQPRWMAHPAVLNAQHPDS ATGGAGGTGGCGCCCGAGCAGCCGCGCTGGA

HHPGLAHNYMEPAQLLPPDEVDVFF TGGCGCACCCGGCCGTGCTGAATGCGCAGCA NHLDSQGNPYYANPAHARARVSYSP CCCCGACTCACACCACCCGGGCCTGGCGCAC AHARLTGGQMCRPHLLHSPGLPWLD AACTACATGGAACCCGCGCAGCTGCTGCCTCC GGKAALSAAAAHHHNPWTVSPFSKT AGACGAGGTGGACGTCTTCTTCAATCACCTCG PLHPSAAGGPGGPLSVYPGAGGGSG ACTCGCAGGGCAACCCCTACTATGCCAACCCC GGSGSSVASLTPTAAHSGSHLFGFPP GCTCACGCGCGGGCGCGCGTCTCCTACAGCC TPPKEVSPDPSTTGAASPASSSAGGS CCGCGCACGCCCGCCTGACCGGAGGCCAGAT AARGEDKDGVKYQVSLTESMKMESG GTGCCGCCCACACTTGTTGCACAGCCCGGGTT SPLRPGLATMGTQPATHHPIPTYPSY TGCCCTGGCTGGACGGGGGCAAAGCAGCCCT VPAAAHDYSSGLFHPGGFLGGPASS CTCTGCCGCTGCGGCCCACCACCACAACCCCT FTPKQRSKARSCSEGRECVNCGATA GGACCGTGAGCCCCTTCTCCAAGACGCCACTG

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

TPLWRRDGTGHYLCNACGLYHKMN CACCCCTCAGCTGCTGGAGGCCCTGGAGGCC GQNRPLIKPKRRLSAARRAGTCCANC CACTCTCTGTGTACCCAGGGGCTGGGGGTGG QTTTTTLWRRNANGDPVCNACGLYY GAGCGGGGGAGGCAGCGGGAGCTCAGTGGCC KLHNVNRPLTMKKEGIQTRNRKMSN TCCCTCACCCCTACAGCAGCCCACTCTGGCTC KSKKSKKGAECFEELSKCMQEKSSP CCACCTTTTCGGCTTCCCACCCACGCCACCCA FSAAALAGHMAPVGHLPPFSHSGHIL AAGAAGTGTCTCCTGACCCTAGCACCACGGGG PTPTPIHPSSSLSFGHPHPSSMVTAM GCTGCGTCTCCAGCCTCATCTTCCGCGGGGGG

G TAGTGCAGCCCGAGGAGAGGACAAGGACGGC (SEQ ID NO: 49) GTCAAGTACCAGGTGTCACTGACGGAGAGCAT

GAAGATGGAAAGTGGCAGTCCCCTGCGCCCAG GCCTAGCTACTATGGGCACCCAGCCTGCTACA CACCACCCCATCCCCACCTACCCCTCCTATGT GCCGGCGGCTGCCCACGACTACAGCAGCGGA CTCTTCCACCCCGGAGGCTTCCTGGGGGGACC GGCCTCCAGCTTCACCCCTAAGCAGCGCAGCA AGGCTCGTTCCTGTTCAGAAGGCCGGGAGTGT GTCAACTGTGGGGCCACAGCCACCCCTCTCTG GCGGCGGGACGGCACCGGCCACTACCTGTGC AATGCCTGTGGCCTCTACCACAAGATGAATGG GCAGAACCGACCACTCATCAAGCCCAAGCGAA GACTGTCGGCCGCCAGAAGAGCCGGCACCTG TTGTGCAAATTGTCAGACGACAACCACCACCTT ATGGCGCCGAAACGCCAACGGGGACCCTGTCT GCAACGCCTGTGGCCTCTACTACAAGCTGCAC AATGTTAACAGGCCACTGACCATGAAGAAGGA AGGGATCCAGACTCGGAACCGGAAGATGTCCA ACAAGTCCAAGAAGAGCAAGAAAGGGGCGGA GTGCTTCGAGGAGCTGTCAAAGTGCATGCAGG AGAAGTCATCCCCCTTCAGTGCAGCTGCCCTG GCTGGACACATGGCACCTGTGGGCCACCTCCC GCCCTTCAGCCACTCCGGACACATCCTGCCCA CTCCGACGCCCATCCACCCCTCCTCCAGCCTC TCCTTCGGCCACCCCCACCCGTCCAGCATGGT

GACCGCCATGGGCTAG (SEQ ID NO: 50) GATA4 MYQSLAMAANHGPPPGAYEAGGPG ATGTATCAGAGCTTGGCCATGGCCGCCAACCA

AFMHGAGAASSPVYVPTPRVPSSVL CGGGCCGCCCCCCGGTGCCTACGAGGCGGGC GLSYLQGGGAGSASGGASGGSSGG GGCCCCGGCGCCTTCATGCACGGCGCGGGCG

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

AASGAGPGTQQGSPGWSQAGADGA CCGCGTCCTCGCCAGTCTACGTGCCCACACCG AYTPPPVSPRFSFPGTTGSLAAAAAA CGGGTGCCCTCCTCCGTGCTGGGCCTGTCCTA AAAREAAAYSSGGGAAGAGLAGREQ CCTCCAGGGCGGAGGCGCGGGCTCTGCGTCC YGRAGFAGSYSSPYPAYMADVGAS GGAGGCGCCTCGGGCGGCAGCTCCGGTGGG WAAAAAASAGPFDSPVLHSLPGRAN GCCGCGTCTGGTGCGGGGCCCGGGACCCAGC PAARHPNLVDMFDDFSEGRECVNCG AGGGCAGCCCGGGATGGAGCCAGGCGGGAGC AMSTPLWRRDGTGHYLCNACGLYHK CGACGGAGCCGCTTACACCCCGCCGCCGGTG MNGINRPLIKPQRRLSASRRVGLSCA TCGCCGCGCTTCTCCTTCCCGGGGACCACCGG NCQTTTTTLWRRNAEGEPVCNACGL GTCCCTGGCGGCCGCCGCCGCCGCTGCCGCG YMKLHGVPRPLAMRKEGIQTRKRKP GCCCGGGAAGCTGCGGCCTACAGCAGTGGCG KNLNKSKTPAAPSGSESLPPASGASS GCGGAGCGGCGGGTGCGGGCCTGGCGGGCC NSSNATTSSSEEMRPIKTEPGLSSHY GCGAGCAGTACGGGCGCGCCGGCTTCGCGGG GHSSSVSQTFSVSAMSGHGPSIHPVL CTCCTACTCCAGCCCCTACCCGGCTTACATGG SALKLSPQGYASPVSQSPQTSSKQD CCGACGTGGGCGCGTCCTGGGCCGCAGCCGC

SWNSLVLADSHGDIITA CGCCGCCTCCGCCGGCCCCTTCGACAGCCCG (SEQ ID NO: 51) GTCCTGCACAGCCTGCCCGGCCGGGCCAACC

CGGCCGCCCGACACCCCAATCTCGTAGATATG TTTGACGACTTCTCAGAAGGCAGAGAGTGTGT CAACTGTGGGGCTATGTCCACCCCGCTCTGGA GGCGAGATGGGACGGGTCACTATCTGTGCAAC GCCTGCGGCCTCTACCACAAGATGAACGGCAT CAACCGGCCGCTCATCAAGCCTCAGCGCCGG CTGTCCGCCTCCCGCCGAGTGGGCCTCTCCTG TGCCAACTGCCAGACCACCACCACCACGCTGT GGCGCCGCAATGCGGAGGGCGAGCCTGTGTG CAATGCCTGCGGCCTCTACATGAAGCTCCACG GGGTCCCCAGGCCTCTTGCAATGCGGAAAGAG GGGATCCAAACCAGAAAACGGAAGCCCAAGAA CCTGAATAAATCTAAGACACCAGCAGCTCCTTC AGGCAGTGAGAGCCTTCCTCCCGCCAGCGGT GCTTCCAGCAACTCCAGCAACGCCACCACCAG CAGCAGCGAGGAGATGCGTCCCATCAAGACG GAGCCTGGCCTGTCATCTCACTACGGGCACAG CAGCTCCGTGTCCCAGACGTTCTCAGTCAGTG CGATGTCTGGCCATGGGCCCTCCATCCACCCT GTCCTCTCGGCCCTGAAGCTCTCCCCACAAGG CTATGCGTCTCCCGTCAGCCAGTCTCCACAGA CCAGCTCCAAGCAGGACTCTTGGAACAGCCTG

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

GTCTTGGCCGACAGTCACGGGGACATAATCAC

TGCGTAA (SEQ ID NO: 52) MESP1 MAQPLCPPLSESWMLSAAWGPTRRP ATGGCCCAGCCCCTGTGCCCGCCGCTCTCCGA

PPSDKDCGRSLVSSPDSWGSTPADS GTCCTGGATGCTCTCTGCGGCCTGGGGCCCAA PVASPARPGTLRDPRAPSVGRRGAR CTCGGCGGCCGCCGCCCTCCGACAAGGACTG SSRLGSGQRQSASEREKLRMRTLAR CGGCCGCTCCCTCGTCTCGTCCCCAGACTCAT ALHELRRFLPPSVAPAGQSLTKIETLR GGGGCAGCACCCCAGCCGACAGCCCCGTGGC LAIRYIGHLSAVLGLSEESLQRRCRQR GAGCCCCGCGCGGCCAGGCACCCTCCGGGAC GDAGSPRGCPLCPDDCPAQMQTRT CCCCGCGCCCCCTCCGTAGGTAGGCGCGGCG QAEGQGQGRGLGLVSAVRAGASWG CGCGCAGCAGCCGCCTGGGCAGCGGGCAGAG SPPACPGARAAPEPRDPPALFAEAAC GCAGAGCGCCAGTGAGCGGGAGAAACTGCGC PEGQAMEPSPPSPLLPGDVLALLET ATGCGCACGCTGGCCCGCGCCCTGCACGAGC

WMPLSPLEWLPEEPK TGCGCCGCTTTCTACCGCCGTCCGTGGCGCCC (SEQ ID NO: 53) GCGGGCCAGAGCCTGACCAAGATCGAGACGC

TGCGCCTGGCTATCCGCTATATCGGCCACCTG TCGGCCGTGCTAGGCCTCAGCGAGGAGAGTCT CCAGCGCCGGTGCCGGCAGCGCGGTGACGCG GGGTCCCCTCGGGGCTGCCCGCTGTGCCCCG ACGACTGCCCCGCGCAGATGCAGACACGGAC GCAGGCTGAGGGGCAGGGGCAGGGGCGCGG GCTGGGCCTGGTATCCGCCGTCCGCGCCGGG GCGTCCTGGGGATCCCCGCCTGCCTGCCCCG GAGCCCGAGCTGCACCCGAGCCGCGCGACCC GCCTGCGCTGTTCGCCGAGGCGGCGTGCCCT GAAGGGCAGGCGATGGAGCCAAGCCCACCGT CCCCGCTCCTTCCGGGCGACGTGCTGGCTCTG TTGGAGACCTGGATGCCCCTCTCGCCTCTGGA

GTGGCTGCCTGAGGAGCCCAAGTGA (SEQ ID NO: 54) MYF6 MMMDLFETGSYFFYLDGENVTLQPL ATGATGATGGACCTTTTTGAAACTGGCTCCTAT

EVAEGSPLYPGSDGTLSPCQDQMPP TTCTTCTACTTGGATGGGGAAAATGTTACTCTG EAGSDSSGEEHVLAPPGLQPPHCPG CAGCCATTAGAAGTGGCAGAAGGCTCTCCTTT QCLIWACKTCKRKSAPTDRRKAATLR GTATCCAGGGAGTGATGGTACCTTGTCCCCCT ERRRLKKINEAFEALKRRTVANPNQR GCCAGGACCAAATGCCCCCGGAAGCGGGGAG LPKVEILRSAISYIERLQDLLHRLDQQE CGACAGCAGCGGAGAGGAACATGTCCTGGCG KMQELGVDPFSYRPKQENLEGADFL CCCCCGGGCCTGCAGCCTCCACACTGCCCCG RTCSSQWPSVSDHSRGLVITAKEGG GCCAGTGTCTGATCTGGGCTTGCAAGACCTGC

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

ASIDSSASSSLRCLSSIVDSISSEERKL AAGAGAAAATCTGCCCCCACTGACCGGCGAAA

PCVEEVVEK AGCCGCCACCCTGCGCGAAAGGAGGAGGCTA (SEQ ID NO: 55) AAGAAAATCAACGAGGCCTTCGAGGCACTGAA

GCGGCGAACTGTGGCCAACCCCAACCAGAGG CTGCCCAAGGTGGAGATTCTGCGGAGCGCCAT CAGCTATATTGAGCGGCTGCAGGACCTGCTGC ACCGGCTGGATCAGCAGGAGAAGATGCAGGA GCTGGGGGTGGACCCCTTCAGCTACAGACCCA AACAAGAAAATCTTGAGGGTGCGGATTTCCTG CGCACCTGCAGCTCCCAGTGGCCAAGTGTTTC CGATCATTCCAGGGGGCTCGTGATAACGGCTA AGGAAGGAGGAGCAAGTATTGATTCGTCAGCC TCGAGTAGCCTTCGATGCCTTTCTTCCATCGTG GACAGTATTTCCTCGGAGGAACGCAAACTCCC

CTGCGTGGAGGAAGTGGTGGAGAAGTAA (SEQ ID NO: 56)

MYOCD MTLLGSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQ ATGACACTCCTGGGGTCTGAGCATTCCTTGCT RRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQR GATTAGGAGCAAGTTCAGATCAGTTTTACAGTT KHLDSDKAKNSLKRKARNRCNSADL AAGACTTCAACAAAGAAGGACCCAGGAACAAC VNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRAR TGGCTAACCAAGGCATAATACCACCACTGAAAC LADDLNEKIALRPGPLELVEKNILPVD GTCCAGCTGAATTCCATGAGCAAAGAAAACATT SAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEED TGGATAGTGACAAGGCTAAAAATTCCCTGAAGC SSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPD GCAAAGCCAGAAACAGGTGCAACAGTGCCGAC AKASDTPSTGSLGTNQDLASGSEND TTGGTTAATATGCACATACTCCAAGCTTCCACT RNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTP GCAGAGAGGTCCATTCCAACTGCTCAGATGAA IAVHAAVKSKSLGDSKNRHKKPKDPK GCTGAAAAGAGCCCGACTCGCCGATGATCTCA PKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMD ATGAAAAAATTGCTCTACGACCAGGGCCACTG SAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQ GAGCTGGTGGAAAAAAACATTCTTCCTGTGGAT QQHRFSYLGMHQAQLKEPNEQMVR TCTGCTGTGAAAGAGGCCATAAAAGGTAACCA NPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTG GGTGAGTTTCTCCAAATCCACGGATGCTTTTGC VSSFKPGPLPPNLDDLKVSELRQQLR CTTTGAAGAGGACAGCAGCAGCGATGGGCTTT IRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGN CTCCGGATCAGACTCGAAGTGAAGACCCCCAA PVPNFGDITTVTFPVTPNTLPNYQSSS AACTCAGCGGGATCCCCGCCAGACGCTAAAGC STSALSNGFYHFGSTSSSPPISPASS CTCAGATACCCCTTCGACAGGTTCTCTGGGGA DLSVAGSLPDTFNDASPSFGLHPSPV CAAACCAGGATCTTGCTTCTGGCTCAGAAAATG HVCTEESLMSSLNGGSVPSELDGLD ACAGAAATGACTCAGCCTCACAGCCCAGCCAC SEKDKMLVEKQKVINELTWKLQQEQ CAGTCAGATGCGGGGAAGCAGGGGCTTGGCC RQVEELRMQLQKQKRNNCSEKKPLP CCCCCAGCACCCCCATAGCCGTGCATGCTGCT

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

FLAASIKQEEAVSSCPFASQVPVKRQ GTAAAGTCCAAATCCTTGGGTGACAGTAAGAAC SSSSECHPPACEAAQLQPLGNAHCV CGCCACAAAAAGCCCAAGGACCCCAAGCCAAA ESSDQTNVLSSTFLSPQCSPQHSPLG GGTGAAGAAGCTTAAATATCACCAGTACATTCC AVKSPQHISLPPSPNNPHFLPSSSGA CCCAGACCAGAAGGCAGAGAAGTCCCCTCCAC QGEGHRVSSPISSQVCTAQNSGAHD CTATGGACTCAGCCTACGCTCGGCTGCTCCAG GHPPSFSPHSSSLHPPFSGAQADSS CAACAGCAGCTGTTCCTGCAGCTCCAAATCCT HGAGGNPCPKSPCVQQKMAGLHSS CAGCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACACCGAT DKVGPKFSIPSPTFSKSSSAISEVTQP TCAGCTACCTAGGGATGCACCAAGCTCAGCTT PSYEDAVKQQMTRSQQMDELLDVLIE AAGGAACCAAATGAACAGATGGTCAGAAATCC SGEMPADAREDHSCLQKVPKIPRSS AAACTCTTCTTCAACGCCACTGAGCAATACCCC RSPTAVLTKPSASFEQASSGSQIPFD CTTGTCTCCTGTCAAAAACAGTTTTTCTGGACA PYATDSDEHLEVLLNSQSPLGKMSDV AACTGGTGTCTCTTCTTTCAAACCAGGCCCACT TLLKIGSEEPHFDGIMDGFSGKAAEDL CCCACCTAACCTGGATGATCTGAAGGTCTCTG FNAHEILPGPLSPMQTQFSPSSVDSN AATTAAGACAACAGCTTCGAATTCGGGGCTTGC GLQLSFTESPWETMEWLDLTPPNST CTGTGTCAGGCACCAAAACGGCTCTCATGGAC PGFSALTTSSPSIFNIDFLDVTDLNLNS CGGCTTCGACCCTTCCAGGACTGCTCTGGCAA

SMDLHLQQW CCCAGTGCCGAACTTTGGGGATATAACGACTG (SEQ ID NO: 3) TCACTTTTCCTGTCACACCCAACACGCTGCCCA

ATTACCAGTCTTCCTCTTCTACCAGTGCCCTGT CCAACGGCTTCTACCACTTTGGCAGCACCAGC TCCAGCCCCCCGATCTCCCCAGCCTCCTCTGA CCTGTCAGTCGCTGGGTCCCTGCCGGACACCT TCAATGATGCCTCCCCCTCCTTCGGCCTGCAC CCGTCCCCAGTCCACGTGTGCACGGAGGAAAG TCTCATGAGCAGCCTGAATGGGGGCTCTGTTC CTTCTGAGCTGGATGGGCTGGACTCCGAGAAG GACAAGATGCTGGTGGAGAAGCAGAAGGTGAT CAATGAACTCACCTGGAAACTCCAGCAAGAGC AGAGGCAGGTGGAGGAGCTGAGGATGCAGCT TCAGAAGCAGAAAAGGAATAACTGTTCAGAGAA GAAGCCGCTGCCTTTCCTGGCTGCCTCCATCA AGCAGGAAGAGGCTGTCTCCAGCTGTCCTTTT GCATCCCAAGTACCTGTGAAAAGACAAAGCAG CAGCTCAGAGTGTCACCCACCGGCTTGTGAAG CTGCTCAACTCCAGCCTCTTGGAAATGCTCATT GTGTGGAGTCCTCAGATCAAACCAATGTACTTT CTTCCACATTTCTCAGCCCCCAGTGTTCCCCTC AGCATTCACCGCTGGGGGCTGTGAAAAGCCCA

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

CAGCACATCAGTTTGCCCCCATCACCCAACAA CCCTCACTTTCTGCCCTCATCCTCCGGGGCCC AGGGAGAAGGGCACAGGGTCTCCTCGCCCAT CAGCAGCCAGGTGTGCACTGCACAGAACTCAG GAGCACACGATGGCCATCCTCCAAGCTTCTCT CCCCATTCTTCCAGCCTCCACCCGCCCTTCTCT GGAGCCCAAGCAGACAGCAGTCATGGTGCCG GGGGAAACCCTTGTCCCAAAAGCCCATGTGTA CAGCAAAAGATGGCTGGTTTACACTCTTCTGAT AAGGTGGGGCCAAAGTTTTCAATTCCATCCCCA ACTTTTTCTAAGTCAAGTTCAGCAATTTCAGAG GTAACACAGCCTCCATCCTATGAAGATGCCGTA AAGCAGCAAATGACCCGGAGTCAGCAGATGGA TGAACTCCTGGACGTGCTTATTGAAAGCGGAG AAATGCCAGCAGACGCTAGAGAGGATCACTCA TGTCTTCAAAAAGTCCCAAAGATACCCAGATCT TCCCGAAGTCCAACTGCTGTCCTCACCAAGCC CTCGGCTTCCTTTGAACAAGCCTCTTCAGGCA GCCAGATCCCCTTTGATCCCTATGCCACCGAC AGTGATGAGCATCTTGAAGTCTTATTAAATTCC CAGAGCCCCCTAGGAAAGATGAGTGATGTCAC CCTTCTAAAAATTGGGAGCGAAGAGCCTCACTT TGATGGGATAATGGATGGATTCTCTGGGAAGG CTGCAGAAGACCTCTTCAATGCACATGAGATCT TGCCAGGCCCCCTCTCTCCAATGCAGACACAG TTTTCACCCTCTTCTGTGGACAGCAATGGGCTG CAGTTAAGCTTCACTGAATCTCCCTGGGAAACC ATGGAGTGGCTGGACCTCACTCCGCCAAATTC CACACCAGGCTTTAGCGCCCTCACCACCAGCA GCCCCAGCATCTTCAACATCGATTTCCTGGATG TCACTGATCTCAATTTGAATTCTTCCATGGACC

TTCACTTGCAGCAGTGGTAG (SEQ ID NO: 4) MEF2C MGRKKIQITRIMDERNRQVTFTKRKF ATGGGGAGAAAAAAGATTCAGATTACGAGGATT

GLMKKAYELSVLCDCEIALIIFNSTNKL ATGGATGAACGTAACAGACAGGTGACATTTACA FQYASTDMDKVLLKYTEYNEPHESRT AAGAGGAAATTTGGGTTGATGAAGAAGGCTTAT NSDIVEALNKKENKGCESPDPDSSYA GAGCTGAGCGTGCTGTGTGACTGTGAGATTGC LTPRTEEKYKKINEEFDNMIKSHKIPA GCTGATCATCTTCAACAGCACCAACAAGCTGTT

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

VPPPNFEMPVSIPVSSHNSLVYSNPV CCAGTATGCCAGCACCGACATGGACAAAGTGC SSLGNPNLLPLAHPSLQRNSMSPGVT TTCTCAAGTACACGGAGTACAACGAGCCGCAT HRPPSAGNTGGLMGGDLTSGAGTSA GAGAGCCGGACAAACTCAGACATCGTGGAGGC GNGYGNPRNSPGLLVSPGNLNKNMQ ATTGAACAAGAAAGAAAACAAAGGCTGTGAAAG AKSPPPMNLGMNNRKPDLRVLIPPGS CCCCGATCCCGACTCCTCTTATGCACTCACCC KNTMPSVNQRINNSQSAQSLATPVVS CACGCACTGAAGAAAAATACAAAAAAATTAATG VATPTLPGQGMGGYPSAISTTYGTEY AAGAATTTGATAATATGATCAAGAGTCATAAAAT SLSSADLSSLSGFNTASALHLGSVTG TCCTGCTGTTCCACCTCCCAACTTCGAGATGCC WQQQHLHNMPPSALSQLGACTSTHL AGTCTCCATCCCAGTGTCCAGCCACAACAGTTT SQSSNLSLPSTQSLNIKSEPVSPPRD GGTGTACAGCAACCCTGTCAGCTCACTGGGAA RTTTPSRYPQHTRHEAGRSPVDSLS ACCCCAACCTATTGCCACTGGCTCACCCTTCTC SCSSSYDGSDREDHRNEFHSPIGLTR TGCAGAGGAATAGTATGTCTCCTGGTGTAACAC

PSPDERESPSVKRMRLSEGWAT ATCGACCTCCAAGTGCAGGTAACACAGGTGGT (SEQ ID NO: 5) CTGATGGGTGGAGACCTCACGTCTGGTGCAGG

CACCAGTGCAGGGAACGGGTATGGCAATCCCC GAAACTCACCAGGTCTGCTGGTCTCACCTGGT AACTTGAACAAGAATATGCAAGCAAAATCTCCT CCCCCAATGAATTTAGGAATGAATAACCGTAAA CCAGATCTCCGAGTTCTTATTCCACCAGGCAG CAAGAATACGATGCCATCAGTGAATCAAAGGAT AAATAACTCCCAGTCGGCTCAGTCATTGGCTAC CCCAGTGGTTTCCGTAGCAACTCCTACTTTACC AGGACAAGGAATGGGAGGATATCCATCAGCCA TTTCAACAACATATGGTACCGAGTACTCTCTGA GTAGTGCAGACCTGTCATCTCTGTCTGGGTTTA ACACCGCCAGCGCTCTTCACCTTGGTTCAGTA ACTGGCTGGCAACAGCAACACCTACATAACAT GCCACCATCTGCCCTCAGTCAGTTGGGAGCTT GCACTAGCACTCATTTATCTCAGAGTTCAAATC TCTCCCTGCCTTCTACTCAAAGCCTCAACATCA AGTCAGAACCTGTTTCTCCTCCTAGAGACCGTA CCACCACCCCTTCGAGATACCCACAACACACG CGCCACGAGGCGGGGAGATCTCCTGTTGACA GCTTGAGCAGCTGTAGCAGTTCGTACGACGGG AGCGACCGAGAGGATCACCGGAACGAATTCCA CTCCCCCATTGGACTCACCAGACCTTCGCCGG ACGAAAGGGAAAGTCCCTCAGTCAAGCGCATG CGACTTTCTGAAGGATGGGCAACATGA

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto) (SEQ ID NO: 6) TBX5 MADADEGFGLAHTPLEPDAKDLPCD ATGGCCGACGCAGACGAGGGCTTTGGCCTGG

SKPESALGAPSKSPSSPQAAFTQQG CGCACACGCCTCTGGAGCCTGACGCAAAAGAC MEGIKVFLHERELWLKFHEVGTEMIIT CTGCCCTGCGATTCGAAACCCGAGAGCGCGCT KAGRRMFPSYKVKVTGLNPKTKYILL CGGGGCCCCCAGCAAGTCCCCGTCGTCCCCG MDIVPADDHRYKFADNKWSVTGKAE CAGGCCGCCTTCACCCAGCAGGGCATGGAGG PAMPGRLYVHPDSPATGAHWMRQL GAATCAAAGTGTTTCTCCATGAAAGAGAACTGT VSFQKLKLTNNHLDPFGHIILNSMHKY GGCTAAAATTCCACGAAGTGGGCACGGAAATG QPRLHIVKADENNGFGSKNTAFCTHV ATCATAACCAAGGCTGGAAGGCGGATGTTTCC FPETAFIAVTSYQNHKITQLKIENNPFA CAGTTACAAAGTGAAGGTGACGGGCCTTAATC KGFRGSDDMELHRMSRMQSKEYPV CCAAAACGAAGTACATTCTTCTCATGGACATTG VPRSTVRQKVASNHSPFSSESRALST TACCTGCCGACGATCACAGATACAAATTCGCA SSNLGSQYQCENGVSGPSQDLLPPP GATAATAAATGGTCTGTGACGGGCAAAGCTGA NPYPLPQEHSQIYHCTKRKEEECSTT GCCCGCCATGCCTGGCCGCCTGTACGTGCAC DHPYKKPYMETSPSEEDSFYRSSYP CCAGACTCCCCCGCCACCGGGGCGCATTGGA QQQGLGASYRTESAQRQACMYASS TGAGGCAGCTCGTCTCCTTCCAGAAACTCAAG APPSEPVPSLEDISCNTWPSMPSYSS CTCACCAACAACCACCTGGACCCATTTGGGCA CTVTTVQPMDRLPYQHFSAHFTSGPL TATTATTCTAAATTCCATGCACAAATACCAGCCT VPRLAGMANHGSPQLGEGMFQHQT AGATTACACATCGTGAAAGCGGATGAAAATAAT SVAHQPVVRQCGPQTGLQSPGTLQP GGATTTGGCTCAAAAAATACAGCGTTCTGCACT PEFLYSHGVPRTLSPHQYHSVHGVG CACGTCTTTCCTGAGACTGCGTTTATAGCAGTG

MVPEWSDNS ACTTCCTACCAGAACCACAAGATCACGCAATTA (SEQ ID NO: 7) AAGATTGAGAATAATCCCTTTGCCAAAGGATTT

CGGGGCAGTGATGACATGGAGCTGCACAGAAT GTCAAGAATGCAAAGTAAAGAATATCCCGTGGT CCCCAGGAGCACCGTGAGGCAAAAAGTGGCCT CCAACCACAGTCCTTTCAGCAGCGAGTCTCGA GCTCTCTCCACCTCATCCAATTTGGGGTCCCAA TACCAGTGTGAGAATGGTGTTTCCGGCCCCTC CCAGGACCTCCTGCCTCCACCCAACCCATACC CACTGCCCCAGGAGCATAGCCAAATTTACCATT GTACCAAGAGGAAAGAGGAAGAATGTTCCACC ACAGACCATCCCTATAAGAAGCCCTACATGGA GACATCACCCAGTGAAGAAGATTCCTTCTACCG CTCTAGCTATCCACAGCAGCAGGGCCTGGGTG CCTCCTACAGGACAGAGTCGGCACAGCGGCAA GCTTGCATGTATGCCAGCTCTGCGCCCCCCAG CGAGCCTGTGCCCAGCCTAGAGGACATCAGCT

Proteína Nucleotídeo (Quadro de Leitura Aberto)

GCAACACGTGGCCAAGCATGCCTTCCTACAGC AGCTGCACCGTCACCACCGTGCAGCCCATGGA CAGGCTACCCTACCAGCACTTCTCCGCTCACTT CACCTCGGGGCCCCTGGTCCCTCGGCTGGCT GGCATGGCCAACCATGGCTCCCCACAGCTGG GAGAGGGAATGTTCCAGCACCAGACCTCCGTG GCCCACCAGCCTGTGGTCAGGCAGTGTGGGC CTCAGACTGGCCTGCAGTCCCCTGGCACCCTT CAGCCCCCTGAGTTCCTCTACTCTCATGGCGT GCCAAGGACTCTATCCCCTCATCAGTACCACTC TGTGCACGGAGTTGGCATGGTGCCAGAGTGGA

GCGACAATAGCTAA (SEQ ID NO: 8) Miocardinas Projetadas

[00148] Em outro aspecto, a invenção se refere a variantes projetadas de miocardina (MYOCD), tal como uma MYOCD projetada expressa a partir de um quadro de leitura aberto menor, conforme descrito no Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/788.479. O requerente descobriu que MYOCD compreendendo uma deleção interna retém a expressão e função da micocardina e MYOCD compreendendo uma deleção interna pode ser utilizada isoladamente ou em combinação com outros fatores de reprogramação (por exemplo, para gerar cardiomiócitos a partir de fibroblastos). Em algumas modalidades da presente invenção, a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de pelo menos 50 aminoácidos na região correspondente aos aminoácidos 414 a 764 da micocardina nativa (FIGURA 9A; SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, a MYOCD projetada é selecionada de uma ou três variantes de miocardina com deleções internas: MyΔ1 tendo uma exclusão dos resíduos 414 a 763 (FIGURA 9B; SEQ ID NO: 14); MyΔ2 tendo uma deleção dos resíduos 439 a 763 (FIGURA 9C; SEQ ID NO: 15); e de preferência MyΔ3 tendo uma deleção dos resíduos 560 a 763

(FIGURA 9D; SEQ ID NO: 16).

[00149] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD é um polinucleotídeo de MYOCD projetado. "MYOCD" ou "miocardina" refere-se a uma proteína MYOCD projetada ou, de preferência, a uma MYOCD nativa. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD projetado codifica uma proteína miocardina projetada tendo um comprimento de no máximo 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 ou qualquer número entre estes de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação SRF, um domínio SAP e um domínio TAD. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende ainda um domínio de interação Mef2C. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD projetado codifica uma proteína miocardina projetada, com uma deleção de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 ou 350 aminoácidos na região correspondente aos aminoácidos 414 a 764 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3). Várias sequências utilizadas na engenharia de miocardina são fornecidas na Tabela 2. Em algumas modalidades, cerca de quatro resíduos N-terminais de MYOCD são omitidos ou alterados, visto que a conservação interespécies de MYOCD começa no resíduo 5. Em algumas modalidades, outros resíduos do N-terminal de MYOCD são omitidos ou alterados. Tabela 2: Sequências Utilizadas na Engenharia de Miocardina

MYOCD MTLLGSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKN Nativa SLKRKARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKN

ILPVDSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDT PSTGSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSK NRHKKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQ QQHRFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLP PNLDDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVPNFGDITTVTFPVTPNTL PNYQSSSSTSALSNGFYHFGSTSSSPPISPASSDLSVAGSLPDTFNDASPSFGLHPSPVHVC TEESLMSSLNGGSVPSELDGLDSEKDKMLVEKQKVINELTWKLQQEQRQVEELRMQLQKQ KRNNCSEKKPLPFLAASIKQEEAVSSCPFASQVPVKRQSSSSECHPPACEAAQLQPLGNAH CVESSDQTNVLSSTFLSPQCSPQHSPLGAVKSPQHISLPPSPNNPHFLPSSSGAQGEGHRV SSPISSQVCTAQNSGAHDGHPPSFSPHSSSLHPPFSGAQADSSHGAGGNPCPKSPCVQQK MAGLHSSDKVGPKFSIPSPTFSKSSSAISEVTQPPSYEDAVKQQMTRSQQMDELLDVLIESG EMPADAREDHSCLQKVPKIPRSSRSPTAVLTKPSASFEQASSGSQIPFDPYATDSDEHLEVL LNSQSPLGKMSDVTLLKIGSEEPHFDGIMDGFSGKAAEDLFNAHEILPGPLSPMQTQFSPSS VDSNGLQLSFTESPWETMEWLDLTPPNSTPGFSALTTSSPSIFNIDFLDVTDLNLNSSMDLH

LQQW (SEQ ID NO: 3) MYOCD 5- GSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKNSLKR 413 KARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKNILPV

DSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDTPST GSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSKNRH KKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQQQH RFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLPPNL

DDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVP (SEQ ID NO: 10)

MYOCD EVTQPPSYEDAVKQQMTRSQQMDELLDVLIESGEMPADAREDHSCLQKVPKIPRSSRSPTA 764-986 VLTKPSASFEQASSGSQIPFDPYATDSDEHLEVLLNSQSPLGKMSDVTLLKIGSEEPHFDGIM

DGFSGKAAEDLFNAHEILPGPLSPMQTQFSPSSVDSNGLQLSFTESPWETMEWLDLTPPNS

TPGFSALTTSSPSIFNIDFLDVTDLNLNSSMDLHLQQW (SEQ ID NO: 11) MYOCD 5- GSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKNSLKR 438 KARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKNILPV

DSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDTPST GSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSKNRH KKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQQQH RFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLPPNL DDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVPNFGDITTVTFPVTPNTLPNY

QSSSS (SEQ ID NO: 12) MYOCD 1- GSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKNSLKR 559 KARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKNILPV

DSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDTPST GSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSKNRH KKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQQQH RFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLPPNL DDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVPNFGDITTVTFPVTPNTLPNY QSSSSTSALSNGFYHFGSTSSSPPISPASSDLSVAGSLPDTFNDASPSFGLHPSPVHVCTEE SLMSSLNGGSVPSELDGLDSEKDKMLVEKQKVINELTWKLQQEQRQVEELRMQLQKQKRN

NCSE (SEQ ID NO: 13) MYOCD 1- MTLLGSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKN 413, 764-986 SLKRKARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKN (My∆1) ILPVDSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDT

PSTGSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSK NRHKKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQ QQHRFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLP PNLDDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVPEVTQPPSYEDAVKQQM TRSQQMDELLDVLIESGEMPADAREDHSCLQKVPKIPRSSRSPTAVLTKPSASFEQASSGS QIPFDPYATDSDEHLEVLLNSQSPLGKMSDVTLLKIGSEEPHFDGIMDGFSGKAAEDLFNAH EILPGPLSPMQTQFSPSSVDSNGLQLSFTESPWETMEWLDLTPPNSTPGFSALTTSSPSIFNI

DFLDVTDLNLNSSMDLHLQQW (SEQ ID NO: 14) MYOCD 1- MTLLGSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKN 438, 764-986 SLKRKARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKN (My∆2) ILPVDSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDT

PSTGSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSK NRHKKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQ QQHRFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLP PNLDDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVPNFGDITTVTFPVTPNTL PNYQSSSSEVTQPPSYEDAVKQQMTRSQQMDELLDVLIESGEMPADAREDHSCLQKVPKIP RSSRSPTAVLTKPSASFEQASSGSQIPFDPYATDSDEHLEVLLNSQSPLGKMSDVTLLKIGS EEPHFDGIMDGFSGKAAEDLFNAHEILPGPLSPMQTQFSPSSVDSNGLQLSFTESPWETME

WLDLTPPNSTPGFSALTTSSPSIFNIDFLDVTDLNLNSSMDLHLQQW (SEQ ID NO: 15) MYOCD 1- MTLLGSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKN 559, 764-986 SLKRKARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKN (My∆3) ILPVDSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDT

PSTGSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSK NRHKKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQ QQHRFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLP PNLDDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVPNFGDITTVTFPVTPNTL PNYQSSSSTSALSNGFYHFGSTSSSPPISPASSDLSVAGSLPDTFNDASPSFGLHPSPVHVC TEESLMSSLNGGSVPSELDGLDSEKDKMLVEKQKVINELTWKLQQEQRQVEELRMQLQKQ KRNNCSEEVTQPPSYEDAVKQQMTRSQQMDELLDVLIESGEMPADAREDHSCLQKVPKIP RSSRSPTAVLTKPSASFEQASSGSQIPFDPYATDSDEHLEVLLNSQSPLGKMSDVTLLKIGS EEPHFDGIMDGFSGKAAEDLFNAHEILPGPLSPMQTQFSPSSVDSNGLQLSFTESPWETME

WLDLTPPNSTPGFSALTTSSPSIFNIDFLDVTDLNLNSSMDLHLQQW (SEQ ID NO: 16) Domínio de GSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKNSLKR interação KARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLE Mef2c (5- (SEQ ID NO: 17) 120) Domínio SASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSKNRHKKPKDPKPKVKKLKYHQYIP SRF (210- PDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQQQHRFSYLGMHQ 320) (SEQ ID NO: 18) Domínio SSFKPGPLPPNLDDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVP SAP (360- (SEQ ID NO: 19) 413) Domínio LZ LDGLDSEKDKMLVEKQKVINELTWKLQQEQRQVEELRMQLQ (510-550) (SEQ ID NO: 20) Domínio EVTQPPSYEDAVKQQMTRSQQMDELLDVLIESGEMPADAREDHSCLQKVPKIPRSSRSPTA

TAD VLTKPSASFEQASSGSQIPFDPYATDSDEHLEVLLNSQSPLGKMSDVTLLKIGSEEPHFDGIM (764-986) DGFSGKAAEDLFNAHEILPGPLSPMQTQFSPSSVDSNGLQLSFTESPWETMEWLDLTPPNS

TPGFSALTTSSPSIFNIDFLDVTDLNLNSSMDLHLQQW (SEQ ID NO: 11)

[00150] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um ou mais de um domínio de interação Mef2c, um domínio SRF, um domínio SAP, um domínio LZ e um domínio TAD. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação Mef2c, um domínio SRF, um domínio SAP, um domínio LZ e um domínio TAD. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação Mef2c, um domínio SRF, um domínio SAP e um domínio TAD. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um domínio SRF, um domínio SAP, um domínio LZ e um domínio TAD. Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende um domínio SRF, um domínio SAP e um domínio TAD.

[00151] Em algumas modalidades, a MYOCD projetada é fornecida como um polinucleotídeo que codifica a MYOCD projetada e, opcionalmente, uma ou mais outras proteínas de interesse.

Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são polinucleotídeos de RNA, DNA ou mRNA.

Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD compartilha identidade com qualquer uma das isoformas de MYOCD.

Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD codifica uma proteína MYOCD projetada que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a uma sequência selecionada de MyΔ1 (SEQ ID NO: 14), MyΔ2 (SEQ ID NO: 15) e MyΔ3 (SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, a proteína MYOCD projetada compreende pelo menos 2, 3, 4, 5 de um domínio de interação Mef2c, um domínio SRF, um domínio SAP, um domínio LZ e um domínio TAD.

Em algumas modalidades, o domínio de interação Mef2c é de pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, o domínio SRF é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio SAP é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, o domínio LZ é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,

97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o domínio TAD é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 11.

[00152] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada compreende dois ou mais fragmentos da MYOCD nativa ligados por ligantes. Em geral, um ligante refere-se a uma ligação peptídica ou a uma sequência de polipeptídeo. Em algumas modalidades, outros ligantes são utilizados, tais como qualquer um dos vários ligantes químicos utilizados na química de peptídeos conhecidos na técnica. A referência a uma "ligação peptídica" significa que duas sequências são unidas para gerar uma sequência composta sem quaisquer resíduos de aminoácidos intervenientes. Por exemplo, MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) compreende MYOCD 1-559 (SEQ ID NO: 13) unida por uma ligação peptídica a MYOCD 764-986 (SEQ ID NO: 11). Em algumas modalidades, o ligante é qualquer um dos vários polipeptídeos utilizados como ligantes na técnica; por exemplo, sem limitação, ligantes glicina-serina, tais como G, GG, GGG, GSS, GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 30), GSSGGS (SEQ ID NO: 31), GGSGSS (SEQ ID NO: 32), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 33), GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 34). Em algumas modalidades, o ligante é um domínio de uma proteína diferente de MYOCD.

[00153] Ao longo da invenção, a expressão de um polinucleotídeo pode referir-se a qualquer meio conhecido na técnica para aumentar a expressão de um gene de interesse. Em algumas modalidades, o gene de interesse é codificado no RNA mensageiro (mRNA). O mRNA pode ser sintético ou de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o mRNA é quimicamente modificado de várias maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo, RNAs modificados podem ser utilizados, tal como descrito em Warren, L. et al. Cell Stem Cell 7:618–30 (2010); WO2014081507A1; WO2012019168; WO2012045082; WO2012045075; WO2013052523; WO2013090648; US9572896B2. Em algumas modalidades, a expressão do gene de interesse é aumentada pela liberação de um polinucleotídeo a uma célula. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica o gene de interesse é liberado por um vetor viral ou não viral. Em algumas modalidades, o gene de interesse é codificado no polinucleotídeo de DNA, opcionalmente liberado por qualquer método viral ou não viral conhecido na técnica. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos que compreendem o contato das células com uma nanopartícula de lipídeo que compreende um DNA ou mRNA que codifica um gene de interesse. Em algumas modalidades, os métodos da invenção compreendem o contato das células com um vírus compreendendo um DNA ou RNA (por exemplo, um genoma de DNA, um genoma de RNA de sentido negativo, um genoma de RNA de sentido positivo ou um genoma de RNA de fita dupla) que codifica um gene de interesse. Em algumas modalidades, o vírus é selecionado de um retrovírus, adenovírus, AAV, vetor lentiviral não integrante (LVV) e um LVV integrante. Em algumas modalidades, as células são transfectadas com um plasmídeo. Em algumas modalidades, o plasmídeo compreende um polinucleotídeo que codifica um fator de reprogramação. Em algumas modalidades, o plasmídeo compreende um transpóson que compreende um fator de reprogramação. B. Polinucleotídeos que Codificam Proteínas de Interesse

[00154] Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação são fornecidos como um polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas de interesse. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são polinucleotídeos de RNA, DNA ou mRNA. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos compreendem uma sequência de ácido nucleico que compreende pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de ASCL1 humana (SEQ ID NO: 2) em pelo menos 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de ASCL1 compartilha identidade com qualquer uma das isoformas de ASCL1. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de ASCL1 codifica uma proteína ASCL1 que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de ASCL1 humana (SEQ ID NO: 1).

[00155] Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação são fornecidos como um polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas de interesse. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos são polinucleotídeos de RNA, DNA ou mRNA. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos compreendem uma sequência de ácido nucleico que compreende pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MYF6 humano (SEQ ID NO: 56) em pelo menos 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYF6 compartilha identidade com qualquer uma das isoformas de MYF6. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYF6 codifica uma proteína MYF6 que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de MYF6 humano (SEQ ID NO: 55).

[00156] Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção fornecem células com iCM compreendendo ou métodos compreendendo a administração de um ou mais de um polinucleotídeo de miocardina (MYOCD), um polinucleotídeo de fator intensificador específico de miócito 2C (MEF2C) e um polinucleotídeo do fator de transcrição T-box (TBX5).

[00157] Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção fornecem vírus recombinantes compreendendo ou métodos compreendendo a administração de um polinucleotídeo de miocardina (MYOCD) e um polinucleotídeo de ASCL1. Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção fornecem vírus recombinantes compreendendo ou métodos compreendendo a administração de um polinucleotídeo de MYOCD projetado e um polinucleotídeo de ASCL1.

[00158] Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção fornecem células com iCM ou vírus recombinantes ou vetores não virais que compreendem ou métodos que compreendem a administração de um polinucleotídeo de MYOCD. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD codifica uma proteína MYOCD que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de MYOCD humana (SEQ ID NO: 3). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD compartilha pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MYOCD humana (SEQ ID NO: 4) em pelo menos 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD compartilha identidade com qualquer uma das isoformas de MYOCD.

[00159] Em algumas modalidades, a proteína miocardina projetada é fornecida como um polinucleotídeo que codifica a proteína miocardina projetada.

[00160] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD codifica uma proteína MYOCD que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de uma MYOCD projetada (por exemplo, SEQ ID NO: 14).

[00161] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD codifica uma proteína MYOCD que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de uma MYOCD projetada (por exemplo, SEQ ID NO: 15).

[00162] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MYOCD codifica uma proteína MYOCD que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de uma MYOCD projetada (por exemplo, SEQ ID NO: 16).

[00163] Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção fornecem células com iCM ou vírus recombinantes ou vetores não virais compreendendo ou métodos compreendendo a administração de um polinucleotídeo de MEF2C. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MEF2C codifica uma proteína MEF2C que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de MEF2C humano (SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MEF2C compartilha pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MEF2C humano (SEQ ID NO: 6) em pelo menos 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de MEF2C compartilha identidade com qualquer uma das isoformas de MEF2C.

[00164] Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção fornecem células com iCM ou vírus recombinantes ou vetores não virais compreendendo ou métodos compreendendo a administração de um polinucleotídeo de TBX5. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de TBX5 codifica uma proteína TBX5 que é pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência de TBX5 humano (SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de TBX5 compartilha pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de TBX5 humano (SEQ ID NO: 8) em pelo menos 100, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de TBX5 compartilha identidade com qualquer uma das isoformas de TBX5. O polipeptídeo de TBX5 contém uma sequência de localização nuclear prevista (NLS), KRKEEECSTTDHPYKKPYME (SEQ ID NO: 9). Em algumas modalidades, a NLS do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de TBX5 é uma NLS funcional.

[00165] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse é um RNA mensageiro sintético (mRNA). Os mRNAs sintéticos fornecem a informação genética para a produção de proteínas de interesse e podem ser modificados quimicamente para evitar o desencadeamento de uma resposta imune. Zangi et al. (2013) Nature Biotech 31:898-907. Visto que os mRNAs não se integram no genoma da célula hospedeira, o mRNA sintético atua durante um período de tempo e depois desaparece quando a célula se divide. Em algumas modalidades, os mRNAs sintéticos são modificados, por exemplo, com pseudouridina e/ou 5-metil-citidina, para reduzir a resposta antiviral inata ao RNA de fita simples.

[00166] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam uma ou mais proteínas de interesse podem ser otimizados por códons ou de outra forma alterados, contanto que a atividade funcional do gene codificado seja preservada. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos codificam um modificado ou variante de um ou mais genes de interesse, incluindo truncamentos, inserções, deleções ou fragmentos, contanto que a atividade funcional do gene codificado seja preservada.

[00167] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam a uma ou mais proteínas de interesse estão compreendidos em um cassete de expressão. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um ou mais polinucleotídeos que codificam um ou mais genes de interesse. Por exemplo, em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 polinucleotídeos que codificam 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 genes de interesse.

[00168] Será observado que quando duas ou mais proteínas de interesse devem ser expressas em uma célula, um ou mais polinucleotídeos ou cassetes de expressão podem ser utilizados. Por exemplo, um cassete de expressão policistrônico pode ser utilizado,

em que um cassete de expressão pode compreender vários polinucleotídeos que expressam várias proteínas. Em algumas modalidades, o cassete de expressão policistrônica compreende dois ou mais polinucleotídeos em um único quadro de leitura aberto, os polinucleotídeos ligados entre si pela região 2A da poliproteína do vírus da febre aftosa por aftovírus (FMDV), tal como descrito em Donnelly et al. J. Gen. Virol. 82:1013-15 (2001) e seus aprimoramentos conhecidos na técnica. A região 2A produz um "salto" ribossômico de um códon para o próximo sem a formação de uma ligação peptídica. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende um sítio de clivagem interno, de tal modo que dois ou mais peptídeos sejam gerados através da clivagem pós-translação.

[00169] Em algumas modalidades, os vetores multicistrônicos da presente invenção compreendem uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma pluralidade de polipeptídeos unidos por ligantes compreendendo peptídeos capazes de induzir o salto ribossômico ou autoclivagem. Em algumas modalidades, o ligante compreende um peptídeo 2A. O termo "peptídeo 2A", tal como aqui utilizado, refere-se a uma classe de peptídeos de salto ribossômico ou autoclivagem configurados para gerar duas ou mais proteínas a partir de um único quadro de leitura aberto. Os peptídeos 2A são oligopeptídeos virais longos de 18 a 22 resíduos que atuam como mediador da "clivagem" de polipeptídeos durante a translação em células eucarióticas. "Peptídeo 2A" pode se referir a peptídeos com várias sequências de aminoácido. Na presente invenção, ficará entendido que, quando um vetor lentiviral compreende dois ou mais peptídeos 2A, os peptídeos 2A podem ser idênticos entre si ou diferentes. Metodologia detalhada para projeto e uso de peptídeos 2A é fornecida por Szymczak- Workman et al. Design and Construction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 Feb 1;

2012(2):199-204. Na literatura, os peptídeos 2A são frequentemente referidos como peptídeos autocliváveis, mas estudos mecanísticos mostraram que a "autoclivagem" observada é, na verdade, uma consequência do pulo ribossômico da formação da ligação de peptídeo glicil-prolila no C-terminal do peptídeo 2A. Donnelly et al. J Gen Virol. 2001 May; 82(Pt 5):1027-41. A presente invenção não é ligada pela teoria ou limitada a qualquer compreensão mecanística particular da função do peptídeo 2A.

[00170] Peptídeos 2A exemplares incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 3. Tabela 3: Peptídeos 2A Exemplares Fonte Nucleotídeo Peptídeo P2A Teschovírus-1 GCC ACG AAC TTC TCT CTG ATNFSLLKQAGDVEEN de porco TTA AAG CAA GCA GGA GAC PGP GTG GAA GAA AAC CCC GGT (SEQ ID NO: 23)

CCT (SEQ ID NO: 21) - ou -

GCT ACT AAC TTC AGC CTG CTG AAG CAG GCT GGA GAC GTG GAG GAG AAC CCT GGA

CCT (SEQ ID NO: 22) T2A vírus GAG GGC AGA GGA AGT CTG EGRGSLLTCGDVEENP Thoseaasigna CTA ACA TGC GGT GAC GTC GP GAG GAG AAT CCT GGA CCT (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 24) E2A Vírus da rinite CAG TGT ACT AAT TAT GCT QCTNYALLKLAGDCES equina A CTC TTG AAA TTG GCT GGA NPGP (ERAV) GAT GTT GAG AGC AAC CCT (SEQ ID NO: 27)

GGA CCT (SEQ ID NO: 26) F2A Vírus da febre GTG AAA CAG ACT TTG AAT VKQTLNFDLLKLAGDVE aftosa (FMDV) TTT GAC CTT CTC AAG TTG SNPGP GCG GGA GAC GTG GAG TCC (SEQ ID NO: 29)

AAC CCT GGA CCT (SEQ ID NO: 28)

[00171] Opcionalmente, um ou mais dos ligantes ainda compreendem uma sequência que codifica os resíduos Gly-Ser-Gly, que é em algumas modalidades N-terminal para o peptídeo 2A. O N- terminal do peptídeo 2A significa que a sequência que codifica os resíduos está a montante da sequência que codifica o peptídeo 2A. Geralmente, o motivo Gly-Ser-Gly será imediatamente N-terminal do petídeo 2A ou 1 a 10 outros resíduos de aminoácido são inseridos entre o motivo e o petídeo 2A. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeo que codifica este motivo é GGA AGC GGA. Tal como acontece com qualquer polinucleotídeo que codifica o peptídeo, a sequência de nucleotídeo pode ser alterada sem alterar a sequência do peptídeo codificado. A substituição de resíduos de aminoácido está dentro da habilidade daqueles da técnica, e ficará entendido que o termo peptídeo 2A se refere a variantes do anterior que retêm a atividade de salto/autoclivagem desejada, mas, opcionalmente, possuem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições em relação à sequência de peptídeo 2A de referência. Peptídeos 2A exemplares são descritos em Kim et al. PLOS ONE 6(4): e18556. Em algumas modalidades, dois ou mais peptídeos 2A diferentes são utilizados no mesmo construto. Vários peptídeos 2A foram relatados de resultar em expressão melhorada. Ver Liu et al. Sci Rep. 2017; 7:2193. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende um entre 1 e 5, ou mais de 5, resíduos Gly ou Ser N- e/ou C-terminal para o peptídeo 2A (por exemplo, o peptídeo P2A). Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende resíduos de Gly-Ser-Gly N e/ou C-terminal para o peptídeo 2A (por exemplo, o peptídeo P2A). Em algumas modalidades, o peptídeo P2A e o ligante N-terminal compreendem a SEQ ID NO: 84.

[00172] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo, na ordem 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo que codifica MYOCD-2A-ASCL1 e uma sequência de poliadenilação. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, a invenção fornece um AAV recombinante (rAAV) compreendendo o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência compreendendo o cassete de expressão ou uma partícula de rAAV compreendendo o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 35. Em algumas modalidades, a invenção fornece um lentivírus recombinante (rLV) que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rLV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rLV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 35.

[00173] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo, na ordem 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo que codifica MYOCD-2A-MYF6 e uma sequência de poliadenilação. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rAAV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rAAV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 36. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rLV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rLV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rLV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 36.

[00174] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo, na ordem de 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo que codifica MyΔ3-2A-ASCL1 e uma sequência de poliadenilação. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rAAV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rAAV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,

76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rLV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rLV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rLV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 37.

[00175] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo, na ordem 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo que codifica MyΔ3-2A-MYF6 e uma sequência de poliadenilação. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rAAV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rAAV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 38. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rLV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rLV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rLV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 38.

[00176] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo, na ordem de 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo que codifica ASCL1-2A-MYOCD e uma sequência de poliadenilação. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rAAV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rAAV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 39. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rLV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rLV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rLV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 39.

[00177] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo, na ordem 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo que codifica MYF6-2A-MYOCD e uma sequência de poliadenilação. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rAAV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rAAV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rLV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rLV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rLV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 40.

[00178] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo, na ordem 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo que codifica ASCL1-2A-MyΔ3 e uma sequência de poliadenilação. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rAAV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rAAV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rLV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rLV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rLV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 41.

[00179] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão compreendendo, na ordem 5' para 3', um promotor, um polinucleotídeo que codifica MYF6-2A-MyΔ3 e uma sequência de poliadenilação. Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rAAV compreendendo o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência compreendendo o cassete de expressão ou uma partícula de rAAV compreendendo o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,

76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, a invenção fornece um rLV que compreende o cassete de expressão, um plasmídeo de transferência que compreende o cassete de expressão ou uma partícula de rLV que compreende o cassete de expressão. Em algumas modalidades, o rLV compreende um polinucleotídeo pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico à SEQ ID NO: 42.

[00180] Em algumas modalidades, a invenção fornece um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica uma sequência de proteína pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOs: 57 a 64 (isto é, qualquer um de MYOCD-2A-ASCL1, MYOCD-2A-MYF6, MyΔ3-2A- ASCL1, MyΔ3-2A-MYF6, ASCL1-2A-MYOCD, MYF6-2A-MYOCD, ASCL1-2A-MyΔ3 e MYF6-2A-MyΔ3). III. Vetores

[00181] Em algumas modalidades, os fatores de reprogramação empregados para reprogramar células para a linhagem cardíaca podem ser introduzidos em uma célula selecionada ou em uma população de células selecionada por um vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de ácido nucleico, tal como um plasmídeo (por exemplo, plasmídeos de DNA ou plasmídeos de RNA), transpósons, cosmídeos, cromossomos artificiais de bactérias ou leveduras ou vetores virais. Em algumas modalidades, o vetor não é vetor de ácido nucleico, tal como uma nanopartícula. Em algumas modalidades, os vetores aqui descritos compreendem um peptídeo, tal como peptídeos de penetração celular ou sequências de internalização celular. Os peptídeos de penetração celular são pequenos peptídeos capazes de translocar através das membranas plasmáticas. Peptídeos de penetração celular exemplares incluem, mas não são limitados a estes, sequências de Antennapedia, TAT, HIV-Tat, Penetratina, Antp- 3A (mutante de Antp), Buforin II, Transportan, MAP (peptídeo anfipático modelo), K-FGF, Ku70, Prion, pVEC, Pep-1, SynB1, Pep-7, I-IN-1, BGSC (Bis-Guanidínio-Espermidina-Colesterol e BGTC (Bis- Guanidínio-Tren-Colesterol).

[00182] As técnicas no campo da genética recombinante podem ser utilizadas para tal expressão recombinante. Textos básicos que revelam métodos gerais de genética recombinante incluem Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)). Em algumas modalidades, os vetores não contêm uma origem de replicação de mamífero. Em algumas modalidades, o vetor de expressão não é integrado ao genoma e/ou é introduzido por meio de um vetor que não contém uma origem de replicação de mamífero.

[00183] Em alguns casos, os vetores de expressão codificam ou compreendem, além de um ou mais fatores de reprogramação, um gene marcador que facilita a identificação ou seleção de células que foram transfectadas, transduzidas ou infectadas. Exemplos de genes marcadores incluem, mas não são limitados a estes, genes que codificam proteínas fluorescentes, por exemplo, proteína fluorescente verde intensificada, Ds-Red (DsRed: proteína fluorescente vermelha (RFP) de Discosoma sp.; Bevis et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20(11):83-87), proteína fluorescente amarela, mCherry e proteína cianofluorescente; e genes que codificam proteínas que conferem resistência a um agente de seleção, por exemplo, um gene de resistência à neomicina, um gene de resistência à puromicina, um gene de resistência à blasticidina, e semelhantes.

[00184] Em uma modalidade, o vetor de expressão ainda compreende um gene suicida. A expressão do gene suicida pode ser regulada pelo mesmo ou por diferentes promotores que expressam pelo menos um nucleotídeo que codifica o polipeptídeo do fator de proliferação e/ou reentrada do ciclo celular. Um gene suicida é aquele que permite a seleção negativa das células. Nos métodos aqui descritos, um gene suicida é utilizado como um sistema de segurança, permitindo que as células que expressam o gene sejam mortas pela introdução de um agente seletivo. Isto é desejável no caso do gene recombinante provocar uma mutação que conduza ao crescimento celular descontrolado. Vários sistemas de genes suicidas foram identificados, incluindo o gene da timidina cinase do vírus herpes simples (tk ou TK), o gene da citosina desaminase, o gene da timidina cinase do vírus varicela-zoster, o gene da nitroredutase, a gene gpt de Escherichia coli (E. coli) e o gene Deo de E. coli (ver também, por exemplo, Yazawa K, Fisher W E, Brunicardi F C: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. (2002) 26(7):783-9). Em uma modalidade, o gene suicida é o gene TK. Em um aspecto, o gene TK é um gene TK do tipo selvagem. Em outros aspectos, o gene TK é uma forma mutada do gene, por exemplo, sr23tk. As células que expressam a proteína TK podem ser mortas utilizando ganciclovir. Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica a proteína ativadora de tetraciclina e o gene suicida são regulados por um promotor. A. Vetores de Ácido Nucleico

[00185] Os vetores virais adequados incluem, mas não são limitados a estes, vetores virais (por exemplo, vetores virais baseados em vírus da varíola; poliovírus; adenovírus (por exemplo, Li et al.

(1994) Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543-2549; Borras et al. (1999) Gene Ther 6:515-524; Li and Davidson, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7700-7704; Sakamoto et al. (1999) Hum Gene Ther 5: 1088-1097; WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655); vírus adenoassociado (por exemplo, Ali et al. (1998) Hum Gene Ther 9(l):81-86, 1998, Flannery et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:6916-6921; Bennett et al. (1997) Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857-2863; Jomary et al. (1997) Gene Ther 4:683-690; Rolling et al. (1999), Hum Gene Ther 10:641-648; Ali et al. (1996) Hum Mol Genet. 5:591-594; WO 93/09239, Samulski et al. (1989) J. Vir. 63 :3822-3828; Mendelson et al. (1988) Virol. 166: 154- 165; e Flotte et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10613-10617; SV40; vírus do herpes simples; vírus da imunodeficiência humana (por exemplo, Miyoshi et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10319-10323; Takahashi et al. (1999) J Virol 73 :7812-7816); um vetor retroviral (por exemplo, vírus da leucemia murina, vírus da necrose do baço e vetores derivados de retrovírus, tais como vírus do sarcoma de Rous, vírus do sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, um lentivírus, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário); e similares. Numerosos vetores de expressão adequados são conhecidos daqueles de habilidade na técnica, e muitos estão disponíveis comercialmente. Os seguintes vetores são fornecidos a título de exemplo; para células eucarióticas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40 (Pharmacia) e pAd (Life Technologies). No entanto, qualquer outro vetor pode ser utilizado contanto que seja compatível com as células da presente invenção.

[00186] A capacidade de certos vírus de infectar células ou entrar em células por meio de endocitose mediada por receptor e expressar genes virais de forma estável e eficiente os tornou candidatos atraentes para a transferência de ácidos nucleicos estranhos para dentro das células (por exemplo, células de mamíferos). Os vetores virais podem incluir sequências de controle, tais como promotores para a expressão do polipeptídeo de interesse. Embora muitos vetores virais se integrem ao genoma da célula hospedeira, se desejado, os segmentos que permitem tal integração podem ser removidos ou alterados para evitar tal integração. Além do mais, em algumas modalidades, os vetores não contêm uma origem de replicação de mamífero. Exemplos não limitativos de vetores virais são descritos abaixo que podem ser utilizados para liberar ácidos nucleicos que codificam um fator de transcrição em uma célula selecionada. Em algumas modalidades, o vetor viral é derivado de um vírus com deficiência de replicação.

[00187] Em geral, outros vetores virais úteis são baseados em vírus eucarióticos não citopáticos nos quais genes não essenciais foram substituídos pelo polipeptídeo de interesse. Os vírus não citopáticos incluem certos retrovírus, cujo ciclo de vida envolve a transcrição reversa do RNA viral genômico em DNA com subsequente integração proviral no DNA celular do hospedeiro. Em geral, os retrovírus são deficientes na replicação (por exemplo, capazes de direcionar a síntese dos transcritos desejados, mas incapazes de fabricar uma partícula infecciosa). Esses vetores de expressão retroviral geneticamente alterados possuem utilidade geral para a transdução de alta eficiência de polinucleotídeo in vivo.

[00188] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um fator de reprogramação pode ser alojado dentro de um vírus infeccioso que foi projetado para expressar um ligante de ligação específico. A partícula de vírus irá, assim, ligar-se com especificidade aos receptores cognatos da célula alvo e liberar o conteúdo à célula. Em algumas modalidades, o vírus é modificado para transmitir tropismo viral específico, por exemplo, o vírus infecta de preferência fibroblastos, células cardíacas ou, mais particularmente, fibroblastos cardíacos (CFs). Para o AAV, as proteínas do cápsídeo podem ser mutadas para alterar o tropismo do vetor viral. Para lentivírus, o tropismo pode ser modificado utilizando diferentes proteínas do envoltório; isso é conhecido como "pseudotipagem". a. Vetores Retrovirais

[00189] Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor retroviral. Os retrovírus podem integrar seus genes no genoma do hospedeiro, transferir uma grande quantidade de material genético estranho, infectar um amplo espectro de espécies e tipos de células e podem ser acondicionados em linhagens celulares especiais (Miller et al., Am. J. Clin. Oncol., 15(3):216-221, 1992). Em algumas modalidades, um vetor retroviral é alterado de modo que não se integre no genoma da célula hospedeira.

[00190] O retrovírus recombinante pode compreender um polipeptídeo viral (por exemplo, env retroviral) para auxiliar a entrada na célula alvo. Esses polipeptídeos virais estão bem estabelecidos na técnica, por exemplo, Pat. U.S. No. 5.449.614. O polipeptídeo viral pode ser um polipeptídeo viral anfotrópico, por exemplo, env anfotrópico, que auxilia a entrada em células derivadas de várias espécies, incluindo células fora da espécie hospedeira original. O polipeptídeo viral pode ser um polipeptídeo viral xenotrópico que auxilia a entrada nas células fora da espécie hospedeira original. Em algumas modalidades, o polipeptídeo viral é um polipeptídeo viral ecotrópico, por exemplo, env ecotrópico, que auxilia a entrada nas células da espécie hospedeira original.

[00191] Exemplos de polipeptídeos virais capazes de auxiliar a entrada de retrovírus nas células incluem, mas não são limitados a estes: env anfotrópico MMLV, env ecotrópico MMLV, env xenotrópico

MMLV, proteína g do vírus da estomatite vesicular (VSV-g), HIV-1 env, Gibbon Ape Leukemia Virus (GALV) env, RD114, FeLV-C, FeLV-B, gene env MLV 10A1 e suas variantes, incluindo quimeras. Yee et al. (1994) Methods Cell Biol, Pt A:99-1 12 (VSV-G); Patente U.S. No.

5.449.614. Em alguns casos, o polipeptídeo viral é geneticamente modificado para promover a expressão ou ligação aumentada a um receptor.

[00192] A construção retroviral pode ser derivada de uma variedade de retrovírus, por exemplo, MMLV, HIV-1, SIV, FIV ou outro retrovírus aqui descrito. A construção retroviral pode codificar todos os polipeptídeos virais necessários para mais de um ciclo de replicação de um vírus específico. Em alguns casos, a eficiência da entrada viral é melhorada pela adição de outros fatores ou outros polipeptídeos virais. Em outros casos, os polipeptídeos virais codificados pelo construto retroviral não sustentam mais do que um ciclo de replicação, por exemplo, Pat. U.S. No. 6.872.528. Em tais circunstâncias, a adição de outros fatores ou outros polipeptídeos virais pode ajudar a facilitar a entrada viral. Em uma modalidade exemplar, o retrovírus recombinante é o vírus HIV-1 compreendendo um polipeptídeo VSV-g, mas não compreendendo um polipeptídeo de HIV 1 env.

[00193] A construção retroviral pode compreender: um promotor, um sítio de múltiplas clonagens e/ou um gene de resistência. Exemplos de promotores incluem, mas não são limitados a estes, CMV, SV40, EFla, β-actina; promotores retrovirais LTR e promotores induzíveis. O construto retroviral também pode compreender um sinal de acondicionamento (por exemplo, um sinal de acondicionamento derivado do vetor MFG; um sinal de acondicionamento psi). Exemplos de alguns construtos retrovirais conhecidos na técnica incluem, mas não são limitados a estes: pMX, pBabeX ou seus derivados. Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329. Em alguns casos, o construto retroviral é um vetor lentiviral autoinativador (SIN). Miyoshi et al. (1998) J. Virol 72(10):8150-8157. Em alguns casos, o construto retroviral é LL-CG, LS-CG, CL-CG, CS-CG, CLG ou MFG. Miyoshi et al. (1998) J. Virol 72(10):8150-8157; Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329; Riviere et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:6733-6737.

[00194] Um vetor retroviral pode ser construído através da inserção de um ácido nucleico (por exemplo, aquele que codifica um polipeptídeo de interesse ou um RNA) no genoma viral no lugar de algumas sequências virais para produzir um vírus que é deficiente para replicação. Para produzir vírions, uma linhagem celular de acondicionamento contendo os genes gag, pol e env, mas sem o LTR e os componentes de acondicionamento, é construída (Mann et al., Cell 33:153-159, 1983). Quando um plasmídeo recombinante contendo um cDNA, juntamente com o LTR retroviral e sequências de acondicionamento é introduzido em uma linhagem celular especial (por exemplo, através da precipitação de fosfato de cálcio), a sequência de acondicionamento permite que o transcrito de RNA do plasmídeo recombinante seja condicionado em partículas virais, que são então secretadas no meio de cultura (Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149- 188, 1986; Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983). O meio contendo os retrovírus recombinantes é então coletado, opcionalmente concentrado e utilizado para transferência de genes. Os vetores retrovirais são capazes de infectar uma ampla variedade de tipos de células. No entanto, a integração e a expressão estável envolvem tipicamente a divisão das células hospedeiras (Paskind et al., Virology, 67:242-248, 1975).

b. Vetores Adenovirais

[00195] Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor adenoviral. A organização genética do adenovírus inclui um vírus de DNA linear de cadeia dupla de aproximadamente 36 kb, que permite a substituição de grandes pedaços de DNA adenoviral com sequências estranhas de até 7 kb (Grunhaus et al., Seminar in Virology 200(2): 535 -546, 1992)). Fatores de reprogramação podem ser introduzidos na célula utilizando transfecção assistida por adenovírus. As eficiências de transfecção aumentadas foram relatadas em sistemas celulares utilizando sistemas acoplados a adenovírus (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64,

1994.). c. Vetores virais adenoassociados (AAV)

[00196] Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor AAV. AAV é um sistema de vetor atraente, pois tem uma baixa frequência de integração e pode infectar células que não se dividem, tornando-o útil para a liberação de polinucleotídeos em células de mamíferos, por exemplo, em cultura de tecidos (Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992) ou in vivo. Os detalhes relativos à geração e uso de vetores rAAV são descritos nas Patentes U.S. Nos.

5.139.941 e 4.797.368, cada uma aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00197] O AAV é um parvovírus com deficiência de replicação, cujo genoma de DNA de fita simples possui cerca de 4,7 kb de comprimento, incluindo duas repetições terminais invertidas de 145 nucleotídeos (ITRs). Existem vários sorotipos de AAV. As sequências de nucleotídeo dos genomas dos sorotipos de AAV são conhecidas. Por exemplo, o genoma completo de AAV-1 é fornecido no GenBank Accession No. NC_002077; o genoma completo de AAV-2 é fornecido no GenBank Accession No.

NC_001401 e Srivastava et al., J.

Virol., 45: 555-564 (1983); o genoma completo de AAV-3 é fornecido no GenBank Accession No.

NC_1829; o genoma completo de AAV-4 é fornecido no GenBank Accession No.

NC_001829; o genoma AAV-5 é fornecido no GenBank Accession No.

AF085716; o genoma completo de AAV-6 é fornecido no GenBank Accession No.

NC_00 1862; pelo menos partes dos genomas de AAV-7 e AAV-8 são fornecidas nos GenBank Accession Nos.

AX753246 e AX753249, respectivamente; o genoma de AAV-9 é fornecido em Gao et al., J.

Virol., 78: 6381-6388 (2004); o genoma de AAV-10 é fornecido em Mol.

Ther., 13(1): 67-76 (2006); e o genoma de AAV-11 é fornecido em Virology, 330(2): 375- 383 (2004). A sequência do genoma rh.74 de AAV é fornecida na Patente U.S. 9.434.928, aqui incorporada por referência.

As sequências de ação cis que direcionam a replicação do DNA viral (rep), encapsidação/acondicionamento e integração cromossômica da célula hospedeira estão contidas nas ITRs de AAV.

Três promotores de AAV (denominados p5, pl9 e p40 por suas localizações relativas no mapa) conduzem a expressão dos dois quadros de leitura abertos internos de AAV que codificam os genes rep e cap.

Os dois promotores rep (p5 e pi 9), juntamente com o splicing diferencial do único íntron de AAV (nos nucleotídeos 2107 e 2227), resultam na produção de quatro proteínas rep (rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40) do gene rep.

As proteínas rep possuem múltiplas propriedades enzimáticas que são, em última análise, responsáveis pela replicação do genoma viral.

O gene cap é expresso a partir do promotor p40 e codifica as três proteínas do capsídeo VP1, VP2 e VP3. O splicing alternativo e os locais de início da translação sem consenso são responsáveis pela produção das três proteínas do capsídeo relacionadas.

Um único sítio de poliadenilação de consenso está localizado na posição 95 do mapa do genoma de AAV.

O ciclo de vida e a genética de AAV são revistos em Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

[00198] O AAV possui características únicas que o tornam atraente como um vetor para a liberação de DNA estranho às células, por exemplo, na terapia gênica. A infecção de células em cultura por AAV é não citopática e a infecção natural de seres humanos e outros animais é silenciosa e assintomática. Além do mais, o AAV infecta muitas células de mamíferos, permitindo a possibilidade de atingir muitos tecidos diferentes in vivo. Além do mais, o AAV converte células que se dividem e não se dividem lentamente e pode persistir essencialmente durante a vida dessas células como um epissoma nuclear transcricionalmente ativo (elemento extracromossômico). O genoma proviral de AAV é inserido como DNA clonado em plasmídeos, o que torna viável a construção de genomas recombinantes. Além disso, como os sinais que direcionam a replicação de AAV e a encapsidação do genoma estão contidos nas ITRs do genoma de AAV, alguns ou todos os internos de aproximadamente 4,3 kb do genoma (codificação de replicação e proteínas estruturais do capsídeo, rep-cap) podem ser substituídos por DNA estranho. Para gerar vetores AAV, as proteínas rep e cap podem ser fornecidas em trans. Outra característica significativa do AAV é que ele é um vírus extremamente estável e robusto. Ele resiste facilmente às condições utilizadas para inativar o adenovírus (56 oC a 65 oC durante várias horas), tornando a preservação do AAV a frio menos crítica. O AAV pode até ser liofilizado. Finalmente, as células infectadas com AAV não são resistentes à superinfecção. Os vetores AAV da divulgação incluem vetores AAV duplex, autocomplementares, ITRs sintéticas e/ou vetores AAV com compactação de acondicionamento aumentada. Métodos ilustrativos são fornecidos nas US 8.784.799; US 8.999.678; US 9.169.494; US 9.447.433; e US

9.783.824, cada um das quais é incorporada por referência na sua totalidade.

[00199] O DNA de AAV nos genomas de rAAV pode ser de qualquer sorotipo de AAV para o qual um vírus recombinante pode ser derivado incluindo, mas não limitado a sorotipos de AAV AAV-1, AAV- 2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV- 11, AAV-12, AAV-13 e AAV rh74. A produção de rAAV pseudotipado é divulgada, por exemplo, na WO 01/83692. Outros tipos de variantes de rAAV, por exemplo rAAV com mutações do capsídeo, também são contemplados. Ver, por exemplo, Marsic et al., Mol. Terapia. 22:1900- 09 (2014). As sequências de nucleotídeo dos genomas de vários sorotipos de AAV são conhecidas na técnica. Os vetores AAV da presente invenção incluem vetores AAV dos sorotipos AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV39, AAV43, AAV.rh74 e AAV.rh8. Vetores AAV ilustrativos são fornecidos nas US

7.105.345; US 15/782.980; US 7.259.151; US 6.962.815; US

7.718.424; US 6.984.517; US 7.718.424; US 6.156.303; US 8.524.446; US 7.790.449; US 7.906.111; US 9.737.618; Ped. US 15/433.322; US

7.198.951, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade.

[00200] Em algumas modalidades, o vetor de expressão de AAV é pseudotipado para aumentar o direcionamento. Para promover a transferência de genes e sustentar a expressão em fibroblastos, AAV5, AAV7 e AAV8 podem ser utilizados. Em alguns casos, o geneoma de AAV2 é acondicionado no capsídeo de produção de vetores pseudotipados AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8 respectivamente, conforme descrito em Balaji et al. J Surg Res. 184:691-98 (2013). Em algumas modalidades, um AAV9 pode ser utilizado para direcionar a expressão em linhagens semelhantes a miofibroblastos, conforme descrito em Piras et al. Gene Therapy 23:469–478 (2016). Em algumas modalidades, AAV1, AAV6 ou AAV9 é utilizado, e em algumas modalidades, o AAV é projetado, conforme descrito em Asokari et al. Hum Gene Ther. 24:906-13 (2013); Pozsgai et al. Mol Ther. 25:855-69 (2017); Kotterman et al. Nature Reviews Genetics 15:445-51 (2014); e US20160340393A1 para Schaffer et al. Em algumas modalidades, o vetor viral é AAV projetado para aumentar a possibilidade de infecção da célula alvo, conforme descrito na US20180066285A1.

[00201] Em algumas modalidades, os vetores AAV da divulgação compreendem um capsídeo modificado, em particular como um capsídeo projetado para aumentar ou promover a transdução in vivo ou ex vivo de células cardíacas, ou mais particularmente fibroblastos cardíacos; ou que escapam do sistema imunológico do indivíduo; ou que melhoraram a biodistribruição. Os capsídeos de AAV ilustrativos são fornecidos na US 7.867.484; US 9.233.131; US 10.046.016; WO 2016/133917; WO 2018/222503; e WO 20019/060454, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade. Em um capsíde AAV (ou em particular um capsídeo AAV2), uma ou mais substituições em E67, S207, N551 e I698 podem ser utilizadas para aumentar a possibilidade de infecção para fibroblastos cardíacos. Mais particularmente, os vetores AAV da divulgação, opcionalmente vetores baseados em AAV2, podem compreender em suas proteínas do capsídeo uma ou mais substituições selecionadas de E67A, S207G, V229I, A490T, N551S, A581T e I698V. Em algumas modalidades, os vetores AAV da divulgação compreendem o capsídeo AAV-A2 e/ou sorotipo, que é descrito na WO 2018/222503. Em algumas modalidades, o capsídeo de AAV compreende uma inserção na alça calibrada de GH da proteína do capsídeo, tal como NKIQRTD (SEQ ID NO: 65) ou NKTTNKD (SEQ ID NO: 66). Será observado que essas substituições e inserções podem ser combinadas para gerar várias proteínas do capsídeo úteis na presente invenção.

d. Vetores Lentivirais

[00202] Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor lentiviral. Lentivírus são retrovírus complexos que, além dos genes retrovirais comuns gag, pol e env, contêm outros genes com função reguladora ou estrutural. A informação sobre os vetores lentivirais está disponível, por exemplo, em Naldini et al., Science 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol. 71(9):6641-6649, 1997; Patentes U.S. Nos. 6.013.516 e

5.994.136, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Alguns exemplos de lentivírus incluem os vírus da imunodeficiência humana: HIV-1, HIV-2 e o vírus da imunodeficiência símia: SIV. Os vetores lentivirais foram gerados pela atenuação dos genes de virulência do HIV, por exemplo, os genes env, vif, vpr, vpu e nef são deletados para tornar o vetor biologicamente seguro. O lentivírus empregado também pode ser de replicação e/ou integração com defeito.

[00203] Os vetores lentivirais recombinantes são capazes de infectar células que não se dividem e podem ser utilizados para transferência de genes in vivo e ex vivo e expressão de sequências de ácido nucleico. Por exemplo, o lentivírus recombinante capaz de infectar uma célula sem divisão em que uma célula hospedeira adequada é transfectada com dois ou mais vetores que transportam as funções de acondicionamento, nomeadamente gag, pol e env, assim como rev e tat, é descrito na Patente US No. 5.994.136, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Aqueles de habilidade na técnica podem ter como alvo o vírus recombinante pela ligação da proteína do envoltório com um anticorpo ou um ligante particular para direcionar a um receptor de um tipo de célula particular. Por exemplo, um vetor específico para o alvo pode ser gerado através da inserção de um segmento de ácido nucleico (incluindo uma região reguladora)

de interesse no vetor viral, juntamente com outro gene que codifica um ligante para um receptor em um tipo de célula alvo específico.

[00204] Os vetores lentivirais são conhecidos na técnica, ver Naldini et al., (1996 e 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, Pat. U.S. Nos. 6.013.516; e 5.994.136, todos aqui incorporados por referência. Em geral, esses vetores são baseados em plasmídeo ou vírus e são configurados para transportar as sequências essenciais para incorporar ácido nucleico estranho, para seleção e para transferência do ácido nucleico a uma célula hospedeira. Em alguns casos, um vetor lentiviral é introduzido em uma célula simultaneamente com um ou mais plasmídeos de acondicionamento lentiviral, que podem incluir, sem limitação, pMD2.G, pRSV-rev, pMDLG-pRRE e pRRL-GOI. A introdução de um vetor lentiviral isoladamente ou em combinação com plasmídeos de acondicionamento lentiviral em uma célula pode fazer com que o vetor lentiviral seja acondicionado em uma partícula lentiviral. Em algumas modalidades, o vetor lentiviral é um vetor lentiviral não integrativo (NIL). Métodos ilustrativos para gerar vetores NIL, tais como a substituição D64V no gene da integrase, são fornecidos na US 8.119.119.

2. Métodos de Produção de Vetores Virais

[00205] Em geral, um vetor viral é produzido pela introdução de um DNA viral ou construto de RNA em uma célula produtora. Em alguns casos, a célula produtora não expressa genes exógenos. Em outros casos, a célula produtora é uma "célula de acondicionamento" que compreende um ou mais genes exógenos, por exemplo, genes que codificam um ou mais polipeptídeos gag, pol ou env e/ou um ou mais polipeptídeos retrovirais gag, pol ou env. A célula de acondicionamento retroviral pode compreender um gene que codifica um polipeptídeo viral, por exemplo, VSV-g, que auxilia a entrada nas células alvo. Em alguns casos, a célula de acondicionamento compreende genes que codificam uma ou mais proteínas lentivirais, por exemplo, gag, pol, env, vpr, vpu, vpx, vif, tat, rev ou nef. Em alguns casos, a célula de acondicionamento compreende genes que codificam proteínas de adenovírus, tais como El A ou El B ou outras proteínas adenovirais. Por exemplo, as proteínas fornecidas por células de acondicionamento podem ser proteínas derivadas de retrovírus, tais como gag, pol e env; proteínas derivadas de lentivírus, tais como gag, pol, env, vpr, vpu, vpx, vif, tat, rev e nef; e proteínas derivadas de adenovírus, tais como El A e E1 B. Em muitos exemplos, as células de acondicionamento fornecem proteínas derivadas de um vírus que difere do vírus do qual o vetor viral é derivado. Os métodos de produção de vírus recombinantes a partir de células de acondicionamento e seus usos estão bem estabelecidos; ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 5.834.256; 6.910.434; 5.591.624;

5.817.491; 7.070.994; e 6.995.009.

[00206] As linhagens celulares de acondicionamento incluem, mas não são limitadas a estas, qualquer linhagem celular facilmente transfectável. As linhagens celulares de acondicionamento podem ser baseadas em células 293T, linhagens celulares NIH3T3, COS ou HeLa. As células de acondicionamento são frequentemente utilizadas para acondicionar plasmídeos de vetores virais deficientes em pelo menos um gene que codifica uma proteína necessária para o acondicionamento de vírus. Quaisquer células que podem fornecer uma proteína ou polipeptídeo ausente das proteínas codificadas por tais vetores virais ou plasmídeos podem ser utilizadas como células de acondicionamento. Exemplos de linhagens celulares de acondicionamento incluem, mas não são limitados a estes: Platinum-E (Plat-E), Platinum-A (Plat- A), BOSC 23 (ATCC CRL 11554) e Bing (ATCC CRL 11270). Morita et al. (2000) Gene Therapy 7(12): 1063- 1066; Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329; Pat.

U.S. No. 6.995.009. As linhagens de acondicionamento comerciais também são úteis, por exemplo, linhagem celular Ampho-Pak 293, linhagem celular Eco-Pak 2-293, linhagem celular RetroPack PT67 e Retro-X Universal Packaging System (todos disponíveis na Clontech).

3. Plasmídeos

[00207] Plasmídeos de vetor viral (ou construtos), incluem: pMXs, pMxs-IB, pMXs-puro, pMXs-neo (pMXs-IB é um vetor que transporta o gene resistente à blasticidina em vez do gene resistente à puromicina de pMXs-puro) Kimatura et al. (2003) Experimental Hematology 31 : 1007-1014; MFG Riviere et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:6733- 6737; pBabePuro; Morgenstern et al. (1990) Nucleic Acids Research 18:3587-3596; LL-CG, CL-CG, CS-CG, CLG Miyoshi et al. (1998) J. Vir. 72:8150-8157 e semelhantes como o sistema de retrovírus e pAdexl Kanegae et al. (1995) Nucleic Acids Research 23: 3816-3821 e semelhantes como o sistema de adenovírus. Nas modalidades exemplares, o construto retroviral compreende blasticidina (por exemplo, pMXs-IB), puromicina (por exemplo, pMXs-puro, pBabePuro) ou neomicina (por exemplo, pMXs-neo). Morgenstern et al. (1990) Nucleic Acids Research 18:3587-3596.

[00208] Em algumas modalidades, o vetor viral ou plasmídeo compreende um transpóson ou um elemento transponível compreendendo um polinucleotídeo que codifica um fator de reprogramação. A liberação de polnucleotídeos por meio de transpósons de DNA, tais como piggyBac e Sleeping Beauty, oferece vantagens em facilidade de uso, capacidade de liberação de carga maior, velocidade para a clínica e custo de produção. O transpóson de DNA piggyBac, em particular, oferece vantagens potenciais em fornecer a expressão de polinucleotídeos de longo prazo, alto nível e estável, e em ser significativamente menos mutagênico, não oncogênico e totalmente reversível.

4. Translação Direta do RNA Introduzido

[00209] Quando o um ou mais genes de interesse são expressos transitoriamente nas células selecionadas, os genes de interesse podem ser introduzidos como uma molécula de RNA, que é trasladada em proteína dentro do citoplasma da célula. Por exemplo, a proteína de interesse pode ser trasladada a partir de moléculas de RNA introduzidas que possuem o quadro de leitura aberto (ORF) para o polipeptídeo flanqueado por uma região 5' não trasladada (UTR) contendo um sinal de iniciação de translação (por exemplo, um sinal de iniciação de translação Kozak forte) e uma região 3' não trasladada que termina com uma sequência de oligo (dT) para adição modelada de uma cauda poliA. Tais moléculas de RNA não possuem as sequências promotoras empregadas na maioria dos vetores de expressão e cassetes de expressão. As moléculas de RNA podem ser introduzidas nas células selecionadas por uma variedade de técnicas, incluindo eletroporação ou por endocitose do RNA complexado com um veículo catiônico. Ver, por exemplo, Warren et al., Cell Stem Cell 7: 618-30 (2010), aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[00210] A translação de proteína pode persistir durante vários dias, especialmente quando as moléculas de RNA são estabilizadas através da incorporação de ribonucleotídeos modificados. Por exemplo, a incorporação de 5-metilcitidina (5mC) para citidina e/ou pseudouridina (psi) para uridina pode melhorar a meia-vida do RNA introduzido in vivo e levar ao aumento da translação da proteína. Se níveis elevados de expressão forem desejados, ou a expressão por mais de alguns dias for desejada, o RNA pode ser introduzido repetidamente nas células selecionadas.

[00211] O RNA que codifica a proteína também pode incluir um cap 5', um sinal de localização nuclear ou uma combinação dos mesmos. Ver, por exemplo, Warren et al., Cell Stem Cell 7: 618-30 (2010).

[00212] Essas moléculas de RNA podem ser produzidas, por exemplo, através da transcrição in vitro de um modelo para o polinucleotídeo de interesse utilizando uma mistura de ribonucleosídeos que inclui um análogo 3’-O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G ARCA cap, trifosfato de adenosina e trifosfato de guanosina, trifosfato de 5-metilcitidina e trifosfato de pseudouridina. As moléculas de RNA também podem ser tratadas com fosfatase para reduzir a citotoxicidade.

[00213] O RNA pode ser introduzido isoladamente ou com um microRNA (por exemplo, para a expressão de Oct4, miRNA-302), que pode ser um indutor da expressão de polipeptídeo endógeno. O micoRNA funciona como um RNA estrutural que não codifica uma proteína. Em consequência, nenhuma translação é necessária para que o microRNA execute sua função. O microRNA pode ser introduzido diretamente nas células, por exemplo, em um veículo de liberação, tal como um lipossoma, microvesícula ou exossomo. Alternativamente, o microRNA pode ser expresso a partir de um cassete de expressão ou vetor de expressão que foi introduzido em uma célula ou população de células. B. Vetores de Ácido não Nucleico

[00214] Em certas modalidades, o vetor compreende partículas lipídicas conforme descrito em Kanasty R, Delivery materials for siRNA therapeutics Nat Mater. 12 (11):967-77 (2013), que é aqui incorporado por referência. Em algumas modalidades, o vetor à base de lipídios é uma nanopartícula de lipídio, que é uma partícula de lipídio entre cerca de 1 e cerca de 100 nanômetros de tamanho.

[00215] Em algumas modalidades, o vetor à base de lipídios é um lipídio ou lipossoma. Os lipossomas são vesículas esféricas artificiais que compreendem uma bicamada lipídica.

[00216] Em algumas modalidades, o vetor à base de lipídios é uma pequena partícula lipídica de ácido nucleico (SNALP). SNALPs compreendem pequenas (menos de 200 nm de diâmetro) nanopartículas à base de lipídios que encapsulam um ácido nucleico. Em algumas modalidades, a SNALP é útil para a liberação de uma molécula de RNA, tal como siRNA. Em algumas modalidades, as formulações de SNALP liberam ácidos nucleicos a um tecido específico em um indivíduo, tal como o coração.

[00217] Em algumas modalidades, um ou mais polinucleotídeos são liberados por meio de vetores poliméricos. Em algumas modalidades, o vetor polimérico é um polímero ou polimerossomo. Os polímeros abrangem qualquer cadeia de repetição longa de monômeros e incluem, por exemplo, polímeros lineares, polímeros ramificados, dendrímeros e polissacarídeos. Os polímeros lineares compreendem uma única linhagem de monômeros, enquanto que os polímeros ramificados incluem cadeias laterais de monômeros. Os dendrímeros também são moléculas ramificadas, dispostas simetricamente em torno do núcleo da molécula. Os polissacarídeos são moléculas de carboidratos poliméricos e são constituídos por longas unidades de monossacarídeos ligadas entre si. Polimerssomos são vesículas artificiais feitas de copolímeros anfifílicos sintéticos que formam uma membrana vesicular e podem ter um núcleo oco ou aquoso dentro da membrana vesicular.

[00218] Vários sistemas baseados em polímero podem ser adaptados como um veículo para a administração de DNA ou RNA que codifica um ou mais fatores de reprogramação. Os materiais poliméricos exemplares incluem poli(D,L-ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA), poli(caprolactona) (PCL), polímero de etileno vinil acetato (EVA), poli(ácido lático) (PLA), poli(L-ácido láctico) (PLLA), poli(ácido glicólico) (PGA), poli(L-ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLLGA), poli(D,L-lactídeo) (PDLA), poli(L-lactídeo) (PLLA), PLGA-b-poli(etileno glicol)-PLGA (PLGA-bPEG-PLGA), PLLA-bPEG-PLLA, PLGA-PEG- maleimida (PLGA-PEG-mal), poli(D,L-lactídeo-co-caprolactona), poli(D,L-lactídeo-co-caprolactona-co-glicolídeo), poli(D,L-lactídeo-co- PEO-co-D,L-lactídeo), poli(D,L-lactídeo-co-PPO-co-D,L-lactídeo), cianoacralato de polialquila, poliuretano, poli-L-lisina (PLL), metacrilato de hidroxipropila (HPMA), polietilenoglicol, ácido poli-L-glutâmico, poli(hidroxiácidos), polianidridos, poliortoésteres, poli(éster amidas), poliamidas, poli(éster éteres), policarbonatos, polialquilenos, tais como polietileno e polipropileno, polialquileno glicóis, tais como poli(etileno glicol) (PEG), óxidos de polialquileno (PEO), tereftalatos de polialquileno, tais como poli(tereftalato de etileno), álcoois polivinílicos (PVA), éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos tais como poli(acetato de vinila), haletos de polivinila tais como poli(cloreto de vinila) (PVC), polivinilpirrolidona, polissiloxanos, poliestireno (PS), poliuretanos, celuloses derivatizadas tais como alquil celuloses, hidroxialquil celuloses, éteres de celulose, ésteres de celulose, nitro celuloses, hidroxipropilcelulose, carboximetilcelulose, polímeros de ácidos acrílicos, tais como poli(metil(met)acrilato) (PMMA), poli(etil(met)acrilato), poli (butil(met)acrilato), poli(isobutil(met)acrilato), poli(hexil(met)acrilato), poli(isodecil(met)acrilato), poli(lauril(met)acrilato), poli(fenil(met)acrilato), poli(metil acrilato), poli(isopropil acrilato), poli(isobutil acrilato), poli(octadecil acrilato) (ácidos poliacrílicos) e copolímeros e suas misturas, polidioxanona e seus copolímeros, poliidroxialcanoatos, fumarato de polipropileno), polioximetileno, poloxâmeros, poli(orto)ésteres, poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactídeo-co-caprolactona), carbonato de trimetileno, polivinilpirrolidona, poliortoésteres, polifosfazenos, poli([beta]-aminoésteres (PBAE) e polifosfoésteres, e misturas e/ou copolímeros em bloco de dois ou mais de tais polímeros.

Sistemas à base de polímero também podem incluir nanopartículas baseadas em polímero de ciclodextrina (CDP), tais como, por exemplo, conjugados CDP-admantano (AD)-PEG e conjugados CDP-AD-PEG-transferrina.

[00219] Sistemas de partículas poliméricas exemplares para liberação de fármacos, incluindo ácidos nucleicos, incluem aqueles descritos nas US 5.543.158, US 6.007.845, US 6.254.890, US

6.998.115, US 7.727.969, US 7.427.394, US 8.323.698, US 8.071.082, US 8.105.652, US 2008/0268063, US 2009/0298710, US 2010/0303723, US 2011/0027172, US 2011/0065807, US 2012/0156135, US 2014/0093575, WO 2013/090861, cada um dos quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[00220] Em algumas modalidades, o vetor à base de lipídios compreende um sistema de encapsulamento de lipídios. O sistema de encapsulamento de lipídios pode ser projetado para conduzir a distribuição de tecido desejada e as propriedades de entrada celular, assim como para fornecer o tempo de circulação necessário e o caráter de biodegradação. O encapsulamento lipídico pode envolver micelas reversas e/ou compreender ainda matrizes poliméricas, por exemplo, conforme descrito na US 8.193.334, que é aqui incorporada por referência. Em algumas modalidades, a partícula inclui um composto de liberação lipofílico para aumentar a liberação da partícula aos tecidos, incluindo de uma maneira preferencial. Tais compostos são divulgados na US 2013/0158021, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Tais compostos podem geralmente incluir grupos lipofílicos e aminoácidos ou peptídeos conjugados, incluindo peptídeos lineares ou cíclicos e incluindo seus isômeros. Em algumas modalidades, o encapsulamento de lipídios compreende um ou mais de um fosfolipídio, colesterol, polietileno glicol (PEG)-lipídio e um composto lipofílico.

[00221] As partículas, sejam lipídicas ou poliméricas ou ambas, podem incluir componentes adicionais úteis para aumentar as propriedades para a liberação de ácido nucleico in vivo (incluindo compostos divulgados nas US 8.450.298 e US 2012/0251560, que são cada uma aqui incorporada por referência). O veículo de liberação pode se acumular de preferência em certos tecidos, fornecendo assim um efeito de direcionamento de tecido, mas em algumas modalidades, o veículo de liberação ainda compreende pelo menos um ligante de direcionamento de célula ou tecido. Partículas funcionalizadas, incluindo ligantes de direcionamento exemplares, são divulgadas nas US 2010/0303723 e 2012/0156135, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[00222] Um veículo de liberação pode ser projetado para conduzir a distribuição de tecido desejada e propriedades de entrada celular dos sistemas de liberação aqui divulgados, assim como para fornecer o tempo de circulação necessário e o caráter de biodegradação. Por exemplo, as partículas lipídicas podem empregar amino lipídeos conforme divulgado na US 2011/0009641, que é aqui incorporada por referência.

[00223] O lipídio ou partículas poliméricas podem ter um tamanho (por exemplo, um tamanho médio) na faixa de cerca de 50 nm a cerca de 5 µm. Em algumas modalidades, as partículas estão na faixa de cerca de 10 nm a cerca de 100 µm, ou cerca de 20 nm a cerca de 50 µm, ou cerca de 50 nm a cerca de 5 µm, ou cerca de 70 nm a cerca de 500 nm, ou cerca de 70 nm a cerca de 200 nm, ou cerca de 50 nm a cerca de 100 nm. As partículas podem ser selecionadas de modo a evitar a eliminação rápida pelo sistema imunológico. As partículas podem ser esféricas ou não esféricas em certas modalidades. C. Promotores e Intensificadores

[00224] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um fator de reprogramação pode ser ligado de maneira operável a um promotor e/ou intensificador para facilitar a expressão do fator de reprogramação. Dependendo do sistema hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de uma série de elementos de controle de transcrição e translação adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc. podem ser utilizados no vetor de expressão (por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153: 516-544).

[00225] Promotores e/ou intensificadores separados podem ser empregados para cada um dos polinucleotídeos. Em algumas modalidades, o mesmo promotor e/ou intensificador é utilizado para dois ou mais polinucleotídeos em um único quadro de leitura aberto. Os vetores que empregam esta configuração de elementos genéticos são denominados "policistrônicos". Um exemplo de um vetor policistrônico compreende um intensificador e um promotor ligado de maneira operável a um único quadro de leitura aberto compreendendo dois ou mais polinucleotídeos ligados por regiões 2A, em que a expressão do quadro de leitura aberto resulta em múltiplos polipeptídeos sendo gerados cotranslacionalmente. Acredita-se que a região 2A atua como mediador da geração de múltiplas sequências polipeptídicas através do salto de códon; no entanto, a presente invenção refere-se também a vetores policistrônicos que empregam clivagem pós-translação para gerar polipeptídeos para dois ou mais genes de interesse do mesmo polinucleotídeo. Sequências 2A, vetores e métodos associados ilustrativas são fornecidos na US20040265955A1, que é incorporada nesta invenção por referência. Outros vetores policistrônicos da invenção empregam promotores internos, splicing, reinicialização, sítios de entrada do ribossomo interno (IRES), sítios cliváveis proteolíticos (por exemplo, fuságeno) e fusão de genes.

[00226] Exemplos não limitativos de promotores eucarióticos adequados (promotores funcionais em uma célula eucariótica) incluem

CMV, CMV imediato precoce, HSV timidina cinase, SV40 precoce e tardio, repetições terminais longas (LTRs) de retrovírus e metalotioneína-I de camundongo. Em algumas modalidades, promotores que são capazes de conferir expressão cardíaca específica serão utilizados. Exemplos não limitativos de promotores cardíacos específicos adequados incluem desmina (Des), cadeia pesada de alfa-miosina (a-MHC), cadeia leve de miosina 2 (MLC-2), troponina T cardíaca (cTnT) e troponina C cardíaca (cTnC). Exemplos não limitativos de promotores específicos de neurônios adequados incluem sinapsina I (SYN), proteína cinase dependente de cálcio/calmodulina II, tubulina alfa I, enolase específica de neurônio e promotores de cadeia beta do fator de crescimento derivado de plaquetas e promotores híbridos através da fusão de intensificador de citomegalovírus (E) para aqueles promotores específicos de neurônios.

[00227] Exemplos de promotores adequados para acionar os fatores de reprogramação de expressão incluem, mas não são limitados a estes, elementos de repetição terminal longa retroviral (LTR); promotores constitutivos, tais como CMV, HSV1-TK, SV40, EF- la, β-actina, fosfoglicerol cinase (PGK); promotores induzíveis, tais como aqueles contendo elementos do operador Tet; promotores específicos cardíacos, tais como desmina (Des), cadeia pesada de alfa-miosina (a-MHC), cadeia leve de miosina 2 (MLC-2), troponina T cardíaca (cTnT) e troponina C cardíaca (cTnC); promotores neurais específicos, tais como nestina, núcleos neuronais (NeuN), proteína associada ao microtúbulo 2 (MAP2), tubulina beta III, enolase específica do neurônio (NSE), linhagem de oligodendrócitos (Oligl/2) e proteína glial fibrilar acídica (GFAP); e promotores específicos do pâncreas, tais como Pax4, Nkx2.2, Ngn3, insulina, glucagon e somatostatina.

[00228] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo está ligado de maneira operável a um elemento regulador da transcrição específico do tipo de célula (TRE), onde os TREs incluem promotores e intensificadores. Os TREs adequados incluem, mas não são limitados a estes, TREs derivados dos seguintes genes: cadeia leve de miosina-2, cadeia pesada de α-miosina, AE3, troponina C cardíaca e actina cardíaca. Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566; Robbins et al. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 752:492-505; Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591; Parmacek et al. (1994) Cell. Biol. 14: 1870-1885; Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617; e Sartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051.

[00229] O promotor pode ser naturalmente associado a um gene ou segmento de ácido nucleico. Da mesma forma, para RNAs (por exemplo, microRNAs), o promotor pode ser um naturalmente associado a um gene de microRNA (por exemplo, um gene miRNA- 302). Tal promotor naturalmente associado pode ser referido como o "promotor natural" e pode ser obtido pelo isolamento das sequências não codificantes 5' localizadas a montante do segmento de codificação e/ou éxon. Da mesma forma, um intensificador pode ser aquele naturalmente associado a uma sequência de ácido nucleico. No entanto, o intensificador pode estar localizado a jusante ou a montante dessa sequência.

[00230] Alternativamente, certas vantagens serão obtidas através do posicionamento do segmento de ácido nucleico codificador sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo, que se refere a um promotor que não está normalmente associado a um ácido nucleico em seu ambiente natural. Um intensificador recombinante ou heterólogo também se refere a um intensificador normalmente não associado a uma sequência de ácido nucleico em seu ambiente natural. Esses promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes e promotores ou intensificadores isolados de qualquer outra célula procariótica, viral ou eucariótica e promotores ou intensificadores que não "ocorrem naturalmente", isto é, contendo diferentes elementos de diferentes regiões reguladoras da transcrição, e/ou mutações que alteram a expressão. Além de produzir sequências de ácido nucleico de promotores e intensificadores sinteticamente, as sequências podem ser produzidas utilizando clonagem recombinante e/ou tecnologia de amplificação de ácido nucleico, incluindo PCR™, em conexão com as composições aqui divulgadas (ver a Pat. U.S. No. 4.683.202, a Pat. U.S. No. 5.928.906, cada uma aqui incorporada por referência).

[00231] Os promotores empregados podem ser constitutivos, induzíveis, específicos para o desenvolvimento, específicos para tecidos e/ou úteis nas condições apropriadas para direcionar a expressão de alto nível do segmento de ácido nucleico. Por exemplo, o promotor pode ser um promotor constitutivo, tal como um promotor CMV, um promotor precoce imediato de citomegalovírus CMV, um promotor CAG, um promotor EF-1α, um promotor HSV1-TK, um promotor SV40, um promotor β-actina, um promotor PGK ou uma combinação dos mesmos. Exemplos de promotores eucarióticos que podem ser utilizados incluem, mas não são limitados a estes, promotores constitutivos, por exemplo, promotores virais, tais como promotores CMV, SV40 e RSV, assim como promotores reguláveis, por exemplo, um promotor induzível ou reprimível, tal como o promotor tet, o promotor hsp70 e um promotor sintético regulado por CRE. Em algumas modalidades, o promotor compreende um promotor CAG (ou seja, um elemento intensificador precoce de CMV e um promotor de beta-actina de galinha) (SEQ ID NO: 67). Em algumas modalidades, o cassete de expressão compreende um íntron SV40 (SEQ ID NO: 83). Em algumas modalidades, o promotor compreende um elemento intensificador precoce de CMV, promotor de beta-actina de galinha e um íntron de CMV (SEQ ID NO: 69). Em algumas modalidades, um ou mais dos polinucleotídeos que codificam uma proteína de interesse estão ligados de maneira operável a um promotor CAG (SEQ ID NO: 67). Em algumas modalidades, um ou mais dos polinucleotídeos que codificam uma proteína de interesse estão ligados de maneira operável a um promotor super core (SCP) (SEQ ID NO: 68), ver a US

7.968.698. Outros exemplos de promotores que podem ser empregados incluem um promotor de fator de alongamento EF1α humano, um promotor precoce imediato de citomegalovírus de CMV, um promotor de albumina de galinha CAG, um promotor viral associado a qualquer um dos vetores virais aqui descritos, ou um promotor que é homólogo a qualquer um dos promotores aqui descritos (por exemplo, de outra espécie). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor ubíquo, opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em promotores CMV, EF1A, EFS, CAG, CBh, SV40, mPGK, hPGK e UBC. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor induzível. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor específico de fibroblasto, opcionalmente selecionado do grupo que consiste em promotores COL1A1, COL6A1, FN1 POSTN, COL1A2, MAP2K3 e PPARγ.

[00232] Em algumas modalidades, um elemento de sítios de entrada do ribossomo interno (IRES) pode ser utilizado para criar mensagens multigênicas ou policistrônicas. Os elementos IRES são capazes de contornar o modelo de varredura de ribossomo da translação dependente de Cap 5'-metilado e iniciar a translação em locais internos (Pelletier and Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988)). Elementos IRES de dois membros da família dos picornavírus (poliomielite e encefalomiocardite) foram descritos (Pelletier and Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988)), assim como um IRES de uma mensagem de mamífero (Macejak & Samow, Nature 353:90- 94 (1991)). Os elementos IRES podem ser ligados a quadros de leitura abertos heterólogos. Vários quadros de leitura abertos podem ser transcritos juntos, cada um separado por um IRES, criando mensagens policistrônicas. Em virtude do elemento IRES, cada quadro de leitura aberto é acessível aos ribossomos para translação eficiente. Múltiplos genes podem ser eficientemente expressos utilizando um único promotor/intensificador para transcrever uma única mensagem (ver Patentes U.S. Nos. 5.925.565 e 5.935.819, aqui incorporadas por referência).

[00233] Em algumas modalidades, os vetores da invenção incluem um ou mais sinais poliA. Sinais poliA ilustrativos úteis nos vetores da invenção incluem o sinal poliA curto (SEQ ID NO: 74) e o sinal poliA bGH (SEQ ID NO: 85). D. Liberação de Vetor nas Células

[00234] O vetor viral pode ser introduzido em um fibroblasto hospedeiro por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não limitando a: um método de fosfato de cálcio, um método de lipofecção (por exemplo, Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7413-7417), um método de eletroporação, microinjeção, transfecção de Fugene, nucleofecção e semelhantes, e qualquer método aqui descrito.

[00235] Exemplos de procedimentos incluem, por exemplo, aqueles descritos por Stadtfeld and Hochedlinger, Nature Methods 6(5):329- 330 (2009); Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369 (2009); Woltjen, et al., Nature 458, 766-770 (9 Apr. 2009)). Tais métodos incluem, mas não são limitados a estes, liberação direta de DNA tal como por transfecção ex vivo (por exemplo, Wilson et al., Science, 244:1344- 1346, 1989, Nabel & Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente com Fugene6 (Roche) ou Lipofectamina (Invitrogen);

por injeção (por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.994.624, 5.981.274,

5.945.100, 5.780.448, 5.736.524, 5.702.932, 5.656.610, 5.589.466 e

5.580.859, cada uma aqui incorporada por referência), incluindo microinjeção (por exemplo, Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101:1094-1099, 1985; Patente U.S. No. 5.789.215, aqui incorporado por referência na sua totalidade); por eletroporação (por exemplo, Patente U.S. No. 5.384.253, incorporada aqui por referência na sua totalidade, Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984); através da precipitação com fosfato de cálcio (por exemplo, Graham & Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990); pelo uso de DEAE-dextrano seguido de polietileno glicol (por exemplo, Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985); através da carga sônica direta (por exemplo, Fechheimer et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); por transfecção mediada por lipossomas (por exemplo, Nicolau & Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982, Fraley et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987, Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980, Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989, Kato et al., Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991), transfecção mediada por receptor (por exemplo, Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); por endocitose do RNA complexado com um veículo catiônico (Warren et al., Cell Stem Cell 7: 618-30 (2010)); e qualquer combinação de tais métodos. Cada uma das referências anteriores é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[00236] Várias técnicas podem ser empregadas para a introdução de moléculas de ácido nucleico da invenção em células, dependendo se as moléculas de ácido nucleico são introduzidas in vitro ou in vivo em um hospedeiro. Tais técnicas incluem transfecção de precipitados de molécula de ácido nucleico-fosfato de cálcio, transfecção de moléculas de ácido nucleico associadas com DEAE, transfecção ou infecção com os vírus anteriores, incluindo a molécula de ácido nucleico de interesse, transfecção mediada por lipossoma e semelhantes. Outros exemplos incluem: N-TER™ Nanoparticle Transfection System da Sigma-Aldrich, reagentes de transfecção FECTOFLY™ para céllas de inseto da Polyplus Transfection, Polyethylenimine “Max” da Polysciences, Inc., Unique, Non-Viral Transfection Tool da Cosmo Bio Co., Ltd., LIPOFECTAMINE™ LTX Transfection Reagent da Invitrogen, SATISFECTION™ Transfection Reagent da Stratagene, LIPOFECTAMINE™ Transfection Reagent da Invitrogen, FUGENE® HD Transfection Reagent da Roche Applied Science, GMP compatível com reagente de transfecção IN VIVO- JETPEI™ da Polyplus Transfection e Insect GENEJUICE® Transfection Reagent da Novagen.

4. Composições do Fator de Reprogramação

[00237] A reprogramação com um ou mais de ASCL1, MYOCD, MEF2C e TBX5 pode ser combinada com outras estratégias de reprogramação em alguns casos com resultados melhorados. Em algumas modalidades, os tecidos alvo ou células iniciais expressam ou são induzidos a expressar o polipeptídeo Oct4. Tecidos alvo ou células iniciais podem ser tratados ou incubados, respectivamente, com uma composição de reprogramação que contém um ou mais agonistas WNT, inibidores GSK3, inibidores TGF-beta, modificadores epigenéticos, agonistas de adenilil ciclase, ativadores de expressão Oct-4 e qualquer combinação dos mesmos. A composição pode conter pelo menos dois desses agentes, ou pelo menos três desses agentes, ou pelo menos quatro desses agentes, ou pelo menos cinco desses agentes, ou pelo menos seis desses agentes. Por exemplo, a composição pode incluir SB431542 (um inibidor ALK4/5/7), CHIR99021 (um inibidor GSK3), parnato (um inibidor LSD1/KDM1, também chamado de tranilcipromina) e forscolina (um ativador de adenilil ciclase).

[00238] Em certas modalidades, a reprogramação é aumentada pela administração de um ou mais agentes anti-inflamatórios, por exemplo, um esteróide anti-inflamatório ou um fármaco anti- inflamatório não esteróide (NSAID).

[00239] Os esteróides anti-inflamatórios para uso na invenção incluem corticosteróides e, em particular, aqueles com atividade glucocorticóide, por exemplo, dexametasona e prednisona. Os anti- inflamatórios não esteróides (NSAIDs) para uso na invenção geralmente agem bloqueando a produção de prostaglandinas que provocam inflamação e dor, ciclooxigenase-1 (COX-1) e/ou ciclooxigenase-2 (COX-2). Os NSAIDs tradicionais funcionam bloqueando COX-1 e COX-2. Os inibidores seletivos da COX-2 bloqueiam apenas a enzima COX-2. Em certas modalidades, o NSAID é um inibidor seletivo de COX-2, por exemplo, celecoxib (CELEBREX®), rofecoxib (Vioxx) e valdecoxib (B extra). Em certas modalidades, o anti-inflamatório é um inibidor de prostaglandina NSAID, por exemplo, Piroxicam.

[00240] Para preparar a composição, os vetores e/ou as células são gerados, e os vetores ou células são purificados conforme necessário ou desejado. Os vetores, células e/ou outros agentes podem ser colocados em suspensão em um veículo farmaceuticamente aceitável. Se a composição contiver apenas compostos, sem células, a composição pode ser liofilizada. Esses compostos e células podem ser ajustados a uma concentração apropriada e, opcionalmente, combinados com outros agentes. O peso absoluto de um determinado composto e/ou outro agente incluído em uma dose unitária pode variar amplamente. A dose e o número de administrações podem ser otimizados por aqueles versados na técnica.

[00241] Por exemplo, cerca de 102 a 1010 genomas de vetor (vg) podem ser administrados. Em algumas modalidades, a dose é de pelo menos cerca de 102 vg, cerca de 103 vg, cerca de 104 vg, cerca de 105 vg, cerca de 106 vg, cerca de 107 vg, cerca de 108 vg, cerca de 109 vg, cerca de 1010 vg ou mais genomas de vetor. Em algumas modalidades, a dose é de cerca de 102 vg, cerca de 103 vg, cerca de 104 vg, cerca de 105 vg, cerca de 106 vg, cerca de 107 vg, cerca de 108 vg, cerca de 109 vg, cerca de 1010 vg ou mais genomas de vetor.

[00242] As doses diárias dos compostos também podem variar. Tais doses diárias podem variar, por exemplo, de pelo menos cerca de 102 vg/dia, cerca de 103 vg/dia, cerca de 104 vg/dia, cerca de 105 vg/dia, cerca de 106 vg/dia, cerca de 107 vg/dia, cerca de 108 vg/dia, cerca de 109 vg/dia, cerca de 1010 vg/dia ou mais genomas de vetor por dia.

[00243] Em algumas modalidades, o método da invenção compreende a administração de um vetor ou sistema de vetor da invenção (por exemplo, um vetor rAAV) por injeção intracardíaca, injeção intramiocardíaca, cateterismo intracardíaco ou administração sistêmica. Em algumas modalidades, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) é tratado pela administração entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1015 GC de um vetor (por exemplo, um vetor AAV ou vetor lentiviral) por injeção intracardíaca, injeção intramiocardíaca, cateterismo intracardíaco ou administração sistêmica. Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado pela administração entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1015 GC, entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1015 GC, entre cerca de 1 x 109 e cerca de 1 x 1014 GC, entre cerca de 1 x 1010 e cerca de 1 x 1013 GC, entre cerca de 1 x 1011 e cerca de 1 x 1012 GC ou entre cerca de 1 x 1012 e cerca de 1 x 1013 GC do vetor. Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado pela administração entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1010 GC, entre cerca de 1 x 109 e cerca de 1 x 1011 GC, entre cerca de 1 x 1010 e cerca de 1 x 1012 GC, entre cerca de 1 x 1011 e cerca de 1 x 1013 GC, entre cerca de 1 x 1012 e cerca de 1 x 1014 GC ou entre cerca de 1 x 1013 e cerca de 1 x 1015 GC do vetor.

Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado pela administração de pelo menos 1 x 108, pelo menos ao redor de 1 x 109, pelo menos ao redor de 1 x 1010, pelo menos ao redor de 1 x 1011, pelo menos ao redor de 1 x 1012, pelo menos ao redor de 1 x 1013 ou pelo menos ao redor de 1 x 1015 GC do vetor.

Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado pela administração de no máximo 1 x 108, no máximo cerca de 1 x 109, no máximo cerca de 1 x 1010, no máximo cerca de 1 x 1011, no máximo cerca de 1 x 1012, no máximo cerca de 1 x 1013 ou no máximo cerca de 1 x 1015 GC do vetor.

Em algumas modalidades, o indivíduo (por exemplo, um ser humano) é tratado pela administração entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1015 GC/kg de um vetor (por exemplo, um vetor AAV ou vetor lentiviral) através da injeção intracardíaca ou sistemicamente.

Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado pela administração entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1015 GC/kg, entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1015 GC/kg, entre cerca de 1 x 109 e cerca de 1 x 1014 GC/kg, entre cerca de 1 x 1010 e cerca de 1 x 1013 GC/kg, entre cerca de 1 x 1011 e cerca de 1 x 1012 GC/kg ou entre cerca de 1 x 1012 e cerca de 1 x 1013 GC/kg de vetor.

Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado pela administração entre cerca de 1 x 108 e cerca de 1 x 1010 GC/kg, entre cerca de 1 x 109 e cerca de 1 x 1011 GC/kg, entre cerca de 1 x 1010 e cerca de 1 x 1012 GC/kg, entre cerca de 1 x 1011 e cerca de 1 x 1013 GC/kg, entre cerca de 1 x 1012 e cerca de 1 x 1014 GC/kg ou entre cerca de 1 x 1013 e cerca de 1 x 1015 GC/kg de vetor.

Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado pela administração de pelo menos

1 x 108, pelo menos ao redor de 1 x 109, pelo menos ao redor de 1 x 1010, pelo menos ao redor de 1 x 1011, pelo menos ao redor de 1 x 1012, pelo menos ao redor de 1 x 1013, ou pelo menos ao redor de 1 x 1015 GC/kg de vetor. Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado pela administração de no máximo 1 x 108, no máximo cerca de 1 x 109, no máximo cerca de 1 x 1010, no máximo cerca de 1 x 1011, no máximo cerca de 1 x 1012, no máximo cerca de 1 x 1013, ou no máximo cerca de 1 x 1015 GC/kg de vetor. Será observado que a quantidade de vetores e células para uso no tratamento irá variar não apenas com o veículo específico selecionado, mas também com a via de administração, a natureza da condição a ser tratada e a idade e condição do paciente. Em última análise, o médico assistente pode determinar a dosagem adequada. Uma composição farmacêutica pode ser formulada com a relação apropriada de cada composto em uma forma de dosagem de unidade única para administração com ou sem células. As células ou vetores podem ser fornecidos separadamente e misturados com uma solução líquida da composição do composto ou administrados separadamente.

[00244] As composições também podem ser formuladas para liberação sustentada (por exemplo, utilizando microencapsulação, ver a WO 94/07529 e/ou a Patente U.S. No. 4.962.091). As formulações podem, quando apropriado, ser convenientemente apresentadas em formas de dosagem unitárias discretas e podem ser preparadas por qualquer um dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Tais métodos podem incluir a etapa de misturar o agente terapêutico com veículos líquidos, matrizes sólidas, veículos semissólidos, veículos sólidos finamente divididos ou combinações dos mesmos, e depois, se necessário, introduzir ou moldar o produto no sistema de liberação desejado.

[00245] Uma ou mais formas de dosagem unitária adequadas contendo os compostos e/ou as células reprogramadas podem ser administradas por uma variedade de vias, incluindo vias parenteral (incluindo subcutânea, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal), intracraniana, intraespinhal, oral, retal, dérmica, transdérmica, intratorácica, intrapulmonar e intranasal (respiratória).

[00246] Os vetores ou células da invenção podem ser preparados em muitas formas que incluem soluções aquosas, suspensões, comprimidos, cápsulas de gelatina sólidas ou macias e lipossomas e outras formulações de liberação lenta, tais como géis poliméricos moldados. A administração de células frequentemente envolve a administração parenteral ou local em uma solução aquosa. Da mesma forma, as composições contendo células e/ou compostos podem ser administradas em um dispositivo, matriz ou como uma formulação de liberação sustentada. Diferentes tipos de procedimentos de formulação são descritos na Patente U.S. No. 6.306.434 e nas referências nela contidas.

[00247] As composições farmacêuticas líquidas podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes ou elixires, pós secos para reconstituição com água ou outros veículos adequados antes do uso. Essas composições farmacêuticas líquidas podem conter aditivos convencionais, tais como agentes de suspensão, agentes emulsificantes, veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestíveis) ou conservantes.

[00248] Vetores e/ou células podem ser formuladas para administração parenteral (por exemplo, por injeção, por exemplo, injeção em bolus ou infusão contínua) e podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária em ampolas, seringas pré-carregadas, recipientes de infusão de pequeno volume ou recipientes de múltiplas doses com um conservante adicionado. As composições farmacêuticas podem assumir a forma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Os veículos adequados incluem solução salina, solução salina tamponada com fosfato e outros materiais comumente utilizados na técnica.

[00249] As composições também podem conter outros ingredientes tais como agentes úteis para o tratamento de doenças, condições e lesões cardíacas, tais como, por exemplo, um anticoagulante (por exemplo, dalteparina (fragmin), danaparóide (orgaran), enoxaparina (lovenox), heparina, tinzaparina (innohep) e/ou varfarina (coumadina)), um agente antiplaquetário (por exemplo, aspirina, ticlopidina, clopidogrel ou dipiridamol), um inibidor da enzima conversora da angiotensina (por exemplo, Benazepril (Lotensin), Captopril (Capoten), Enalapril (Vasotec), Fosinopril (Monopril), Lisinopril (Prinivil, Zestril), Moexipril (Univasc), Perindopril (Aceon), Quinapril (Accupril), Ramipril (Altace), e/ou Trandolapril (Mavik)), bloqueadores do receptor da angiotensina II (por exemplo, Candesartan (Atacand), Eprosartan (Teveten), Irbesartan (Avapro), Losartan (Cozaar), Telmisartan (Micardis), e/ou Valsartan (Diovan)), um beta bloqueador (por exemplo, Acebutolol (Sectral), Atenolol (Tenormin), Betaxolol (Kerlone), Bisoprolol/hydrochlorothiazide (Ziac), Bisoprolol (Zebeta), Carteolol (Cartrol), Metoprolol (Lopressor, Toprol XL), Nadolol (Corgard), Propranolol (Inderal), Sotalol (Betapace), e/ou Timolol (Blocadren)), Bloqueadores do Canal de Cálcio (por exemplo, Amlodipine (Norvasc, Lotrel), Bepridil (Vascor), Diltiazem (Cardizem, Tiazac), Felodipine (Plendil), Nifedipine (Adalat, Procardia), Nimodipine (Nimotop), Nisoldipine (Sular), Verapamil (Calan, Isoptin, Verelan), diuréticos (por exemplo, Amiloride (Midamor), Bumetanide (Bumex), Chlorothiazide (Diuril), Chlorthalidone (Hygroton), Furosemide (Lasix), Hidroclorotiazida (Esidrix, Hydrodiuril), Indapamide (Lozol) e/ou

Spironolactone (Aldactone)), vasodilatadores (por exemplo, dinitrato de isossorbida (Isordil), Nesiritide (Natrecor), Hidralazina (Apresoline), Nitratos e/ou Minoxidil), estatinas, ácido nicotínico, gemfibrozil, clofibrate, Digoxin, Digitoxin, Lanoxin, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00250] Agentes adicionais também podem ser incluídos, tais como agentes antibacterianos, agentes antimicrobianos, agentes antivirais, modificadores de resposta biológica, fatores de crescimento; moduladores imunológicos, anticorpos monoclonais e/ou conservantes. As composições da invenção também podem ser utilizadas em conjunto com outras formas de terapia.

[00251] Os vetores virais e não virais aqui descritos podem ser administrados a um indivíduo para tratar uma doença ou distúrbio. Uma tal composição pode estar em uma dose única, em múltiplas doses, em uma forma contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do receptor, se o propósito da administração for em resposta à lesão traumática ou para propósitos terapêuticos mais sustentados, e outros fatores conhecidos por profissionais qualificados. A administração dos compostos e composições da invenção pode ser essencialmente contínua ao longo de um período de tempo pré-selecionado ou pode ser em uma série de doses espaçadas. A administração tanto local quanto sistêmica é contemplada. Em algumas modalidades, a liberação localizada de um vetor viral ou não viral é alcançada. Em algumas modalidades, a liberação localizada de células e/ou vetores é utilizada para gerar uma população de células dentro do coração. Em algumas modalidades, essa população localizada opera como "células marcapasso" para o coração.

[00252] Fatores suplementares podem ser incluídos nas composições e/ou em um meio de cultura de células contendo qualquer uma das células, composições, compostos ou agentes aqui descritos.

Exemplos de tais fatores suplementares incluem proteína morfogênica óssea-1 (BMP), proteína morfogênica óssea-2, proteína morfogênica óssea-3, proteína morfogênica óssea-4, proteína morfogênica óssea-5, proteína morfogênica óssea-6, proteína morfogênica óssea-7, proteína morfogênica óssea-8, proteína morfogênica óssea-9, proteína morfogênica óssea-10, proteína morfogênica óssea-11, proteína morfogênica óssea-12, proteína morfogênica óssea-13, proteína morfogênica óssea-14, proteína morfogênica óssea-15, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator neurotrófico ciliar, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas 1, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas 2α, fator quimiotático de neutrófilos induzido por citocinas 2β, fator de crescimento de células endoteliais β, endotelina 1, fator de crescimento epidérmico, neutrófilos atraentes derivados de citocinas, fator de crescimento de fibroblastos (FGF) 4, fator de crescimento de fibroblastos 5, fator de crescimento de fibroblastos 6, fator de crescimento de fibroblastos 7, fator de crescimento de fibroblastos 8, fator de crescimento de fibroblastos 8b, fator de crescimento de fibroblastos 8c, fator de crescimento de fibroblastos 9, fator de crescimento de fibroblastos 10, fator de crescimento de fibroblastos (acídico), fator de crescimento de fibroblastos (básico), proteína relacionada ao crescimento, proteína relacionada ao crescimento α, proteína relacionada ao crescimento β, proteína relacionada ao crescimento γ, fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina, fator de crescimento de hepatócitos, fator de crescimento semelhante à insulina I, fator de crescimento semelhante à insulina II, proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina, fator de crescimento de queratinócitos, fator inibidor de leucemia, neurotrofina- 3, neurotrofina-4, fator de crescimento da placenta, fator de crescimento da placenta 2, fator de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento derivado de plaquetas A de cadeia, fator de crescimento derivado de plaquetas AA, fator de crescimento derivado de plaquetas AB, fator de crescimento derivado de plaquetas B de cadeia, fator de crescimento derivado de plaquetas BB, fator de estimulação de crescimento de células pré-B, fator de célula-tronco, fator de crescimento transformante a, fator de crescimento transformante β, fator crescimento transformante β1, fator de crescimento transformante 01.2, fator de crescimento transformante 132, fator de crescimento transformante β3, fator de crescimento transformante latente β1, proteína I de ligação ao fator de crescimento transformante β, proteína II de ligação ao fator de crescimento transformante β, proteína III de ligação ao fator de crescimento transformante β e fator de crescimento endotelial vascular.

[00253] Citocinas exemplares podem ser incluídas, tais como interleucina (IL)-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, interferon (IFN), IFN-γ, fator de necrose tumoral (TNF), TNF1, TNF2, TNF-α, fator estimulante da colônia de macrófagos (M-CSF), fator estimulante da colônia de granulócitos-monócitos (GM-CSF), fator estimulante da colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulante da colônia de megacariócitos (Meg-CSF)-trombopoietina, fator de células-tronco e eritropoietina. As quimiocinas também podem ser incluídas tais como IP-10 e Fator Derivado de Células Estromais 1α.

[00254] Hormônios exemplares contemplados para inclusão nas composições e/ou meios de cultura de células aqui descritos podem incluir, mas não são limitados a estes, hormônios esteróides e hormônios peptídicos, tais como insulina, somatostatina, hormônio do crescimento, hidrocortisona, dexametasona, 3,3′,5-Triiodo-L-tironina e

L-Tiroxina. V. Métodos de Reprogramação

[00255] Como aqui descrito, as células alvo (por exemplo, células não-cardiomiócitos) podem ser reprogramadas para a linhagem cardíaca (por exemplo, linhagem de cardiomiócitos) in vitro através da incubação das células alvo com as composições aqui descritas ou in vivo através da administração de um vetor viral ou não viral para atingir tecidos ou células. Em algumas modalidades, as células alvo são células de fibroblastos. Em algumas modalidades, as células alvo são células de fibroblasto cardíaco (CF). As células não-cardiomiócitos podem ser diferenciadas em células com cardiomiócitos in vitro ou in vivo utilizando qualquer método disponível para uma pessoa de habilidade na técnica. Por exemplo, ver os métodos descritos em Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386; Christoforou et al. (2013) PLoS ONE 8:e63577; Addis et al. (2013) J. Mol. Cell Cardiol. 60:97-106; Jayawardena et al. (2012) Circ. Res. 110: 1465-1473; Nam Y et al., PNAS USA. 2013; 110:5588-5593; Wada R et al. PNAS USA. 2013; 110: 12667-12672; e Fu J et al., Stem Cell Reports. 2013; 1:235-247. Tais métodos podem, portanto, ser utilizados para gerar uma população de células progenitoras cardíacas ou cardiomiócitos que podem ser transplantados em um indivíduo ou utilizados para experimentação. A. Células

[00256] Os cardiomiócitos ou miócitos cardíacos são as células musculares que constituem o músculo cardíaco. Cada célula do miocárdio contém miofibrilas, que são longas cadeias de sarcômeros, as unidades contráteis das células musculares. Os cardiomiócitos apresentam estriações semelhantes às das células do músculo esquelético, mas, ao contrário das células esqueléticas multinucleadas, eles contêm apenas um núcleo. Os cardiomiócitos possuem alta densidade mitocondrial, o que lhes permite produzir ATP rapidamente, tornando-os altamente resistentes à fadiga. Os cardiomiócitos maduros podem expressar um ou mais dos seguintes marcadores cardíacos: α-actinina, MLC2v, cMHC, NKX2-5, GATA4, cTNT, cTNI, MEF2c, MLC2a, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os cardiomiócitos maduros expressam NKX2-5, MEF2c ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, as células progenitoras cardíacas expressam marcadores progenitores cardíacos de estágio inicial tais como GATA4, ISL1 ou uma combinação dos mesmos.

[00257] Os sem cardiomiócitos que são induzidos a cardiomiócitos podem ser de qualquer uma de uma variedade de fontes. As células podem ser de, por exemplo, mamíferos humanos ou não humanos. Mamíferos não humanos exemplares incluem, mas não são limitados a estes, camundongos, ratos, gatos, cães, coelhos, porquinhos da índia, hamsters, ovelhas, porcos, cavalos, bovinos e primatas não humanos. Em algumas modalidades, uma célula é de um mamífero humano ou não humano adulto. Em algumas modalidades, uma célula é de um humano neonatal, um ser humano adulto ou mamífero não humano. Em algumas modalidades, as espécies de células e as espécies da proteína a serem expressas são as mesmas. Por exemplo, se uma célula de camundongo for utilizada, um ortólogo de camundongo é introduzido na célula. Se uma célula humana for utilizada, um ortólogo humano é introduzido na célula.

[00258] Os sem cardiomiócitos de mamíferos (por exemplo, ser humano ou murino) podem ser usados. Em algumas modalidades, os cardiomiócitos são cardiomiócitos de mamíferos e, em modalidades específicas, os sem cardiomiócitos são células humanas. Em algumas modalidades, os sem cardiomiócitos podem ser derivados de células- tronco (por exemplo, células-tronco pluripotentes, células-tronco pluripotentes induzidas, células cardíacas reprogramadas ou células- tronco cardíacas) ou células progenitoras (por exemplo, células progenitoras cardíacas). Os cardiomiócitos podem ser derivados de células cardíacas ou não cardíacas. Os cardiomiócitos podem ser derivados de qualquer uma de uma variedade de fontes de tecido. Por exemplo, fibroblastos cardíacos, fibroblastos de prepúcio, fibroblastos dérmicos, fibroblastos pulmonares, etc. Os sem cardiomiócitos podem ser células embrionárias, fetais ou pós-natais (por exemplo, adultas). Em modalidades preferidas, os sem cardiomiócitos são células adultas.

[00259] O sem cardiomiócito para uso na presente invenção pode ser qualquer tipo de célula não-cardiomiócito conhecido por uma pessoa de habilidade na técnica. Exemplos não limitativos de um sem cardiomiócito incluem, por exemplo, uma célula somática, um fibroblasto cardíaco, um fibroblasto não cardíaco, uma célula progenitora cardíaca e uma célula-tronco. Os sem cardiomiócitos podem ser células cardíacas do epicárdio, miocárdio ou endocárdio do coração. As células cardíacas sem cardiomiócitos incluem, por exemplo, músculo liso e células endoteliais. Outros exemplos não limitativos de células cardíacas incluem células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos, células-tronco cardíacas ou células progenitoras, células cardíacas condutoras e células cardíacas de marcapasso que constituem o músculo cardíaco, vasos sanguíneos e estrutura de suporte da célula cardíaca. O sem cardiomiócito pode, por exemplo, ser selecionado de um ou mais hepatócitos, fibroblastos, células endoteliais, células B, células T, células dendríticas, queratinócitos, células adiposas, células epiteliais, células epidérmicas, condrócitos, células do cumulus, células neurais, células gliais, astrócitos, células cardíacas, células esofágicas, células do músculo esquelético, melanócitos satélite do músculo esquelético,

células hematopoiéticas, osteócitos, macrófagos, monócitos, células mononucleares ou células-tronco, incluindo células-tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, células-tronco do cérebro adulto, células-tronco epidérmicas, células-tronco da pele, células-tronco pancreáticas, células-tronco renais, células-tronco do fígado, células-tronco da mama, células-tronco do pulmão, células- tronco musculares, células-tronco do coração, células-tronco do olho, células-tronco ósseas, células-tronco do baço, células-tronco do sistema imunológico, células-tronco do cordão umbilical, células-tronco da medula óssea e células-tronco do sangue periférico.

[00260] Quando as células para reprogramação são uma população de sem cardiomiócitos, a população de células é composta de pelo menos cerca de 30% de sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 35% de sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 40% de sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 45% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 50% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 55% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 60% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 65% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 70% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 75% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 80% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 85% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 90% sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 95% sem cardiomiócitos, em pelo menos cerca de 98% de sem cardiomiócitos, pelo menos cerca de 99% de sem cardiomiócitos ou mais de 99% de sem cardiomiócitos.

[00261] Em algumas modalidades, as células iniciais são fibroblastos cardíacos humanos adultos (AHCFs) ou fibroblastos cardíacos de porco adulto (APCFs). AHCFs ou APCFs podem ser obtidos, por exemplo, através da digestão de fragmentos de tecido do ventrículo esquerdo de um indivíduo doador. A digestão pode ser executada com vários métodos conhecidos na técnica - por exemplo,

submetendo as células a 10 µg/ml de Liberase TH, 10 µg/ml de Liberase TM, 1 unidade/ml de DNase I e 0,01% de Polaxômero durante 1 h a 37 oC. Várias enzimas alternativas e procedimentos de digestão são conhecidos na técnica. As composições e métodos da invenção se referem a aplicações in vivo e in vitro (ex vivo). As células a serem reprogramadas são chamadas de "células-alvo" ou "células iniciais". As células alvo podem ser colocadas em contato ou incubadas com as composições aqui descritas. Essas células alvo também são referidas como células iniciais ou coletivamente como uma população inicial de células. Uma população inicial de células pode ser derivada de várias fontes e pode ser heterogênea ou homogênea. Em certas modalidades, as células a serem tratadas conforme descrito nesta invenção são células adultas, incluindo qualquer tipo de célula adulta acessível. Em outras modalidades, as células utilizadas de acordo com a invenção são células-tronco adultas, células progenitoras ou células somáticas. Em ainda outras modalidades, as células tratadas com qualquer uma das composições e/ou métodos aqui descritos incluem qualquer tipo de célula de um recém-nascido, incluindo, mas não limitado a sangue do cordão umbilical do recém-nascido, células-tronco do recém-nascidas, células progenitoras e células derivadas de tecido (por exemplo, células somáticas). Consequentemente, uma população inicial de células que é reprogramada pelas composições e/ou métodos aqui descritos pode ser qualquer tipo de célula somática viva.

[00262] Conforme ilustrado nesta invenção, os fibroblastos podem ser reprogramados para cruzar os limites da linhagem e para serem convertidos diretamente em outro tipo de célula - por exemplo, uma célula progenitora cardíaca ou um tipo de célula com cardiomiócito. Vários tipos de células de todas as três camadas germinativas mostraram ser adequados para reprogramação de células somáticas por manipulação genética, incluindo, mas não limitado a fígado e estômago (Aoi et al., Science 321(5889):699-702 (2008); células pancreáticas β (Stadtfeld et al., Cell Stem Cell 2: 230-40 (2008); linfócitos maduros B (Hanna et al., Cell 133: 250-264 (2008); fibroblastos dérmicos humanos (Takahashi et al., Cell 131, 861-72 (2007); Yu et al., Science 318(5854) (2007); Lowry et al., Proc Natl Acad Sci USA 105, 2883-2888 (2008); Aasen et al., Nat Biotechnol 26(11): 1276-84 (2008); meningiócitos (Qin et al., J Biol Chem 283(48):33730-5 (2008); células-tronco neurais (DiSteffano et al., Stem Cells Devel. 18(5): (2009); e células progenitoras neurais (Eminli et al., Stem Cells 26(10): 2467-74 (2008). Qualquer uma de tais células pode ser reprogramada e/ou programada pelo uso das composições e métodos aqui descritos.

[00263] As células podem ser células autólogas ou alogênicas (em relação a um indivíduo a ser tratado ou que pode receber as células). As células podem estar presentes no indivíduo ou isoladas do indivíduo. Os medicamentos imunossupressores são comumente utilizados antes, durante ou após a terapia celular. Fármacos imunossupressores também podem ser utilizados antes, durante ou após o vetor viral ou não viral. Em alguns casos, o uso de fármacos imunossupressores pode melhorar os resultados do tratamento. Em alguns casos, o uso de fármacos imunossupressores pode diminuir os efeitos colaterais do tratamento, tais como, sem limitação, doença do enxerto contra o hospedeiro aguda, doença do enxerto contra o hospedeiro crônica e doença linfoproliferativa pós-transplante. A presente invenção contempla o uso de fármacos imunossupressores com qualquer um dos métodos de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição da presente invenção, incluindo, sem limitação, métodos da presente invenção em que o vetor lentiviral confere resistência a um fármaco imunossupressor às células transduzidas.

[00264] Em algumas modalidades, os sem cardiomiócitos são células endógenas dentro do indivíduo e os métodos de geração de cardiomiócitos induzidos são por indução in vivo. Em outras modalidades, os sem cardiomiócitos são exógenos e são modificados in vitro.

[00265] Os sem cardiomiócitos podem ser obtidos de um indivíduo vivo. As células podem ser obtidas de tecido retirado de um indivíduo vivo. As células podem ser obtidas de um indivíduo falecido recentemente que é considerado um doador de tecido adequado. Em algumas modalidades, o indivíduo é rastreado com relação a vários distúrbios genéticos, infecções virais, etc. para determinar se o indivíduo é uma fonte adequada de células. Em geral, uma célula que é adequada para uso na presente invenção é não transformada (por exemplo, apresenta proliferação celular normal) e é de outra maneira normal (por exemplo, apresenta cariótipo normal).

[00266] As células podem ser derivadas do tecido de um indivíduo não embrionário, um bebê neonatal, uma criança ou um adulto. As células podem ser derivadas de tecido neonatal ou pós-natal coletado de um indivíduo no período desde o nascimento, incluindo parto cesáreo, até a morte. Por exemplo, os sem cardiomiócitos podem ser de um indivíduo que possui mais do que cerca de 10 minutos de idade, maior do que cerca de 1 hora, maior do que cerca de 1 dia, maior do que cerca de 1 mês, maior do que cerca de 2 meses, maior do que cerca de 6 meses de idade, maior do que cerca de 1 ano de idade, maior do que cerca de 2 anos de idade, maior do que cerca de 5 anos de idade, maior do que cerca de 10 anos de idade, maior do que cerca de 15 anos de idade, maior do que cerca de 18 anos de idade, maior do que cerca de 25 anos de idade, mais de 35 anos de idade, > 45 anos de idade, > 55 anos de idade, > 65 anos de idade, > 80 anos de idade, < 80 anos de idade, < 70 anos de idade, < 60 anos de idade, <

50 anos de idade, < 40 anos de idade, < 30 anos de idade, < 20 anos de idade ou < 10 anos de idade.

[00267] Métodos de isolamento de células não-cardiomiócitos de tecidos são conhecidos na técnica, e qualquer método conhecido pode ser utilizado. Como um exemplo não limitativo, células cardíacas adultas podem ser obtidas a partir de amostras de biópsia atrial do coração humano obtidas de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca. O tecido cardíaco pode ser picado e digerido com colagenase e células-tronco/progenitoras cardíacas expandidas em meio de expansão de células progenitoras c-kit+ utilizando os métodos de Choi et al. (2013) Transplantation Proceedings 45:420-426. Além disso, os fibroblastos cardíacos podem ser obtidos utilizando os métodos de Ieda et al. (2009) Dev. Cell 16(2):233-244. Os fibroblastos do prepúcio podem ser obtidos do tecido do prepúcio de um indivíduo do sexo masculino. Os fibroblastos podem ser obtidos cortando o tecido do prepúcio e, em seguida, dissociando o tecido em células individuais. Aglomerados de células de prepúcio podem ser dissociados por qualquer meio conhecido na técnica, incluindo descolamento físico ou digestão enzimática utilizando, por exemplo, tripsina. B. Métodos de Reprogramação In vitro

[00268] A invenção fornece métodos para gerar cardiomiócitos e/ou células semelhantes a cardiomiócitos in vitro. As células iniciais selecionadas são tratadas por um tempo e sob condições suficientes para converter as células iniciais através da linhagem e/ou limites de diferenciação para formar células progenitoras cardíacas e/ou cardiomiócitos. Em algumas modalidades, a expressão dos genes de interesse nas células iniciais é iniciada durante pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dias antes do tratamento com as células com cardiomicócitos induzidas (células com iCM) aqui descritas. A eficiência de reprogramação das células pode ser melhorada pela expressão dos genes de interesse durante pelo menos dois dias, ou pelo menos três dias, ou pelo menos quatro dias, ou pelo menos cinco dias antes da administração de células com iCM ou vírus recombinantes ou não vetores virais ao indivíduo. Em algumas modalidades, as células iniciais são células de fibroblastos. Em algumas modalidades, as células iniciais expressam um ou mais marcadores indicativos de um fenótipo diferenciado.

[00269] As células iniciais podem ser dispersas em um meio de cultura de células que contém a composição de reprogramação em uma densidade que permite a expansão celular. Por exemplo, cerca de 1 a 1012 células podem ser colocadas em contato com um vetor viral ou não viral em um meio de cultura de células selecionado, especialmente quando as células são mantidas em uma densidade celular de cerca de 1 a cerca de 108 células por mililitro, ou em uma densidade de cerca de 100 a cerca de 107 células por mililitro, ou em uma densidade de cerca de 1000 a cerca de 106 células por mililitro. Em algumas modalidades, os métodos da invenção compreendem o contato de pelo menos 103 células, 104 células, 105 células, 106 células, 107 células, 108 células, 109 células, 1010 células, 1011 células, 1012 células, 1013 células, 1014 células, 1015 células, ou qualquer número de células entre estas com vetores virais ou não virais, induzindo assim a expressão de um ou mais genes de interesse.

[00270] O tempo para a conversão de células iniciais em células progenitoras cardíacas e células com cardiomiócitos pode variar. Por exemplo, as células de partida podem ser incubadas após o tratamento com um ou mais genes de interesse até que os marcadores de células cardíacas ou de cardiomiócitos sejam expressos. Esses marcadores de células cardíacas ou de cardiomiócitos podem incluir qualquer um dos seguintes marcadores: α-GATA4, TNNT2, MYH6, RYR2, NKX2-5, MEF2c, ANP, Actinina,

MLC2v, cMHC, ISL1, cTNT, cTNI, MLC2a e qualquer combinação dos mesmos.

[00271] Em algumas modalidades, as células com cardiomicócitos induzidas são negativas para um ou mais marcadores de células neuronais. Esses marcadores de células neuronais podem incluir qualquer um dos seguintes marcadores: DCX, TUBB3, MAP2 e ENO2.

[00272] A incubação pode prosseguir em qualquer uma das composições aqui descritas, por exemplo, até que os marcadores progenitores cardíacos sejam expressos pelas células iniciais. Esses marcadores progenitores cardíacos incluem Gata4, Tnnt2, Myh6, Ryr2 ou uma combinação dos mesmos. Os marcadores progenitores cardíacos, tais como Gata4, Tnnt2, Myh6, Ryr2 ou uma combinação dos mesmos, podem ser expressos por cerca de 8 dias, ou por cerca de 9 dias, ou por cerca de 10 dias, ou por cerca de 11 dias, ou por cerca de 12 dias, ou por cerca de 14 dias, ou por cerca de 15 dias, ou por cerca de 16 dias, ou por cerca de 17 dias, ou por cerca de 18 dias, ou por cerca de 19 dias, ou por cerca de 20 dias após o início da incubação de células nas composições aqui descritas.

[00273] A incubação adicional das células pode ser executada até que ocorra a expressão de marcadores progenitores cardíacos de estágio avançado tais como NKX2-5, MEF2C ou uma combinação dos mesmos. O marcador progenitor cardíaco de estágio avançado tal como NKX2-5 e/ou MEF2C, pode ser expresso por cerca de 15 dias, ou por cerca de 16 dias, ou por cerca de 17 dias, ou por cerca de 18 dias, por cerca de 19 dias, ou por cerca de 20 dias, ou por cerca de 21 dias, ou por cerca de 22 dias, ou por cerca de 23 dias, ou por cerca de 24 dias, ou por cerca de 25 dias de incubação de células utilizando as composições e métodos aqui descritos.

[00274] A eficiência da reprogramação pode ser medida em função dos marcadores de cardiomiócitos. Esses marcadores de pluripotência incluem, mas não são limitados a estes, a expressão de proteínas marcadoras de cardiomiócitos e mRNA, morfologia de cardiomiócitos e fenótipo eletrofisiológico. Exemplos não limitativos de marcadores de cardiomiócitos incluem, a-sarcoglicano, peptídeo natriurético atrial (ANP), proteína morfogenética óssea 4 (BMP4), conexina 37, conexina 40, cripto, desmina, GATA4, GATA6, MEF2C, MYH6, cadeia pesada de miosina, NKX2-5, TBX5 e Troponin T. Em alguns aspectos, a eficiência da reprogramação é aumentada ao redor de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1 vez, 1,1 vez, 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais em relação a um controle. Exemplos não limitativos de controles apropriados incluem uma amostra que não foi exposta a fatores de reprogramação.

[00275] A expressão de vários marcadores específicos para cardiomiócitos pode ser detectada por métodos bioquímicos ou imunoquímicos convencionais (por exemplo, ensaio imunossorvente ligado a enzima, ensaio imunohistoquímico e semelhantes). Alternativamente, a expressão de um ácido nucleico que codifica um marcador específico de cardiomiócitos pode ser avaliada. A expressão de ácidos nucleicos que codificam marcadores específicos de cardiomiócitos em uma célula pode ser confirmada através da reação em cadeia da polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR) ou análise de hibridização, métodos biológicos moleculares que foram comumente utilizados no passado para amplificar, detectar e analisar a codificação de mRNA para quaisquer proteínas marcadoras. As sequências de ácido nucleico que codificam para marcadores específicos para cardiomiócitos são conhecidas e estão disponíveis em bancos de dados públicos como o GenBank. Assim, as sequências específicas do marcador necessárias para uso como iniciadores ou sondas são facilmente determinadas.

[00276] Os cardiomiócitos apresentam algumas propriedades eletrofisiológicas específicas do coração. Uma característica elétrica é um potencial de ação, que é um evento de curta duração em que a diferença de potencial entre o interior e o exterior de cada célula cardíaca aumenta e diminui seguindo uma trajetória consistente. Outra característica eletrofisiológica dos cardiomiócitos são as variações cíclicas na concentração de Ca2+ livre citosólico, denominadas transientes de Ca2+, que são empregadas na regulação da contração e relaxamento dos cardiomiócitos. Essas características podem ser detectadas e avaliadas para avaliar se uma população de células foi reprogramada em cardiomiócitos.

[00277] Em algumas modalidades, as células iniciais podem ser incubadas com o meio de reprogramação sob condições de cultura de células durante cerca de 1 dia a cerca de 30 dias, ou cerca de 2 dias a cerca de 27 dias, ou cerca de 3 dias a cerca de 25 dias, ou cerca de 4 dias a cerca de 23 dias, ou cerca de 5 dias a cerca de 20 dias, ou cerca de 6 dias a cerca de 20 dias, ou cerca de 10 dias a cerca de 20 dias.

[00278] As células nos meios de cultura podem expressar um gene de interesse, particularmente durante a reprogramação. Por exemplo, as células no meio de cultura podem expressar transitoriamente o polipeptídeo de ASCL1. As células selecionadas para reprogramação não requerem expressão de Klf, Sox2 ou Myc heterólogo e podem não estar em contato com um polipeptídeo Klf, Myc ou Sox2. Em algumas modalidades, a expressão de outros fatores de transcrição tais como Myc, Sox2, Klf4, pode não ser induzida direta ou indiretamente pelo meio de cultura.

[00279] No entanto, em outras modalidades, o meio de cultura de células pode induzir a expressão de polipeptídeos endógenos Klf4, polipeptídeos Myc, polipeptídeos Sox2 ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, a expressão de polipeptídeos Klf4, polipeptídeos Myc e/ou polipeptídeos Sox2 endógenos pode ocorrer após a exposição a uma composição aqui descrita, mesmo quando nenhum ácido nucleico exógeno Klf4, Myc e/ou Sox2 foi introduzido.

1. Condições de Cultura

[00280] As células da presente invenção podem ser cultivadas sob quaisquer condições conhecidas por uma pessoa de habilidade na técnica. Em algumas modalidades, as células (por exemplo, sem cardiomiócitos, com cardiomiócitos e combinações dos mesmos) são cultivadas em condições de 1 a 20% de oxigênio (O2) e 5% de dióxido de carbono (CO2). Em algumas modalidades, as células da presente invenção são cultivadas em condições de hipóxia (por exemplo, na presença de menos de 10% de O2). Em algumas modalidades, as células da presente invenção são cultivadas ao redor de 37 oC. Em algumas modalidades, as células da presente invenção podem ser cultivadas ao redor de 37 oC, 5% de CO2 e 10 a 20% de O2. Em algumas modalidades, as células são cultivadas em condições de hipoxia durante um período de tempo. Por exemplo, as células podem ser cultivadas em condições normóxicas (-20% de O2) durante um período de tempo e, em seguida, mudadas para condições hipóxicas, por exemplo, ~5% de O2.

[00281] A vantagem da diferenciação in vitro ou ex vivo de sem cardiomiócitos para com cardiomiócitos é a capacidade de identificar facilmente células adequadas para implantação ou para discriminação de células que estão danificadas ou não foram diferenciadas. A diferenciação in vitro ou ex vivo permite que os cardiomiócitos induzidos sejam purificados ou isolados de sem cardiomiócitos que não se diferenciaram.

[00282] Após a incubação das células iniciais em um meio de reprogramação, as células podem então ser incubadas em outro meio,

por exemplo, um meio de manutenção, um meio de expansão ou um meio de indução cardíaca que pode induzir a maturação adicional das células.

[00283] O meio de base empregado ao qual os agentes de reprogramação ou agentes de indução são adicionados pode ser um meio de cultura de células conveniente. O termo "meio de cultura de células" (também referido nesta invenção como um "meio de cultura" ou "meio") conforme aqui referido, é um meio para o cultivo de células contendo nutrientes que mantêm a viabilidade celular e sustentam a proliferação. O meio de cultura de células pode conter qualquer um dos seguintes em uma combinação apropriada: sais, tampões, aminoácidos, glicose ou outros açúcares, antibióticos, soro ou reposição de soro e outros componentes tais como fatores de crescimento de peptídeo, etc. Os meios de cultura de células normalmente utilizados para tipos de células particulares estão disponíveis para aqueles versados na técnica.

[00284] Exemplos de meios de cultura de células que podem ser empregados incluem meio MTESR-1® (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, CA), ou meio ESSENTIAL 8® (Life Technologies, Inc.) em um substrato Matrigel (BD Biosciences, NJ) ou em uma superfície CORNING® Synthemax, ou em meio quimicamente definido Johansson and Wiles (CDM) suplementado com insulina, transferrina, lipídios e álcool polivinílico (PVA) como substituto para albumina de soro bovino (BSA). Exemplos de meios comercialmente disponíveis também incluem, mas não são limitados a estes, Meio de Eagle Modificado por Dubelcco (DMEM), Meio Essencial Mínimo (MEM), Meio Basal de Eagle (BME), RPM1 1640, F-10 de Ham, F-12 de Ham, a-Meio essencial mínimo (aMEM), meio essencial mínimo de Glasgow (G-MEM), meio de Dulbecco modificado por Iscove ou um meio de uso geral modificado para uso com células pluripotentes, tal como X-VIVO

(Lonza) ou um meio de base hematopoiética. Em algumas modalidades, misturas de dois ou mais meios de cultura de células são utilizadas, tais como 4 partes de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) para 1 parte de GIBCO® Media 199. Os meios podem ser suplementares com soro bovino fetal (FBS), aminoácidos e/ou antibióticos. Em algumas modalidades, o meio é misturado com GIBCO® RPMI 1640 (RPMI) + GIBCO® B-27 Supplement (B27). O crescimento das células pode ser intensificado por rhFGF, rhFGF-10 e rhVEGF (FFV) adicionais.

[00285] As composições e/ou meios de cultura podem conter qualquer um dos agentes ou compostos aqui descritos em uma quantidade suficiente para induzir uma célula a expressar marcadores de células cardíacas ou com cardiomiócitos. Esses marcadores de células cardíacas ou com cardiomiócitos podem incluir qualquer um dos seguintes marcadores: α-actinina, MLC2v, cMHC, NKX2-5, MEF2c, GATA4, ISL1, cTNT, cTNI, MLC2a e qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, o meio de cultura pode incluir um inibidor de TGF-β tal como SB431542 (por exemplo, ao redor de 0,1 a 10 μM), um ativador de sinalização WNT tal como CHIR99021 (por exemplo, ao redor de 3 a 20 μM), um inibidor de LSD1/KDM1 tal como parnate (por exemplo, ao redor de 0,1 a 10 μM) e um ativador de adenilil ciclase tal como forscolina (por exemplo, ao redor de 3 a 20 μM).

[00286] A incubação pode prosseguir em qualquer uma das composições aqui descritas, por exemplo, até que os marcadores progenitores cardíacos de estágio inicial sejam expressos pelas células iniciais. Esses marcadores progenitores cardíacos de estágio inicial incluem GATA4, ISL1 ou uma combinação dos mesmos. Os marcadores progenitores cardíacos de estágio inicial tais como GATA4 e/ou ISL1, podem ser expressos por cerca de 6 dias, ou por cerca de 8 dias, ou por cerca de 9 dias, ou por cerca de 10 dias, ou por cerca de

11 dias, ou por cerca de 12 dias de incubação de células utilizando as composições e métodos aqui descritos.

[00287] O meio de cultura pode conter qualquer um dos agentes ou compostos descritos nesta invenção em uma quantidade suficiente para reprogramar pelo menos 0,001%, ou ao redor de 0,005%, ou ao redor de 0,01%, ou ao redor de 0,02%, ou ao redor de 0,03% das células em uma população de células em um tipo de célula cardíaca. C. Métodos de Reprogramação In vivo

[00288] Em algumas modalidades, pelo menos um fator de reprogramação foi administrado ao indivíduo, por exemplo, ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5, BAF60C, ESRRG, GATA4, GATA6, HAND2, IRX4, ISLL, MEF2C, MESP1, MESP2, NKX2.5, SRF, TBX20 e ZFPM2, ou qualquer combinação dos mesmos. Por exemplo, pode ser administrado ao indivíduo um vetor viral ou não viral compreendendo um polinucleotídeo que codifica pelo menos um fator de reprogramação. Nas modalidades preferidas, uma combinação de dois ou mais, e mais preferivelmente três ou mais, dos fatores de reprogramação, é administrada ao indivíduo. Em algumas modalidades, um ou mais dos fatores de reprogramação listados acima são expressamente excluídos. Em outras modalidades, os fatores de reprogramação são selecionados do grupo de ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5 ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, os fatores de reprogramação são selecionados do grupo de GATA4, MEF2C, TBX5, MYOCD ou qualquer combinação dos mesmos. Nas modalidades específicas, os fatores de reprogramação são Ascl1 e Myocd (MyA). Nas modalidades específicas, os fatores de reprogramação são ASCL1, MYOCD, MEF2C e TBX5 (MyAMT). Em outras modalidades, os fatores de reprogramação são GATA4, MEF2C e TBX5 (GMT). Em outras modalidades específicas, os fatores de reprogramação são

Miocardina, MEF2C e TBX5 (isto é, MyMT). Em outras modalidades específicas, os fatores de reprogramação são GATA4, MEF2C, TBX5 e Miocardina (isto é, 4F). Em outras modalidades, os fatores de reprogramação são GATA4, MEF2C e TBX5, ESRRG, Miocardina, ZFPM2 e MESP1 (isto é, 7F). VI. Composições: Células e Vetores

[00289] A presente invenção fornece vetores virais e não virais. A presente invenção também fornece cardiomiócitos induzidos isolados gerados de acordo com os métodos da invenção. Os cardiomiócitos induzidos podem expressar pelo menos um gene cardíaco em um nível superior ou inferior do que aquele encontrado em um cardiomiócito de ocorrência natural. O cardiomiócito induzido pode ser um iCM isolado ou um iCM produzido in vivo através da administração de uma composição ao indivíduo.

[00290] Em algumas modalidades, o gene cardíaco expresso em um nível mais elevado do que aquele encontrado no cardiomiócito de ocorrência natural é selecionado a partir do grupo que consiste em TNNT2, ACTN2, ATP2A2, MYH6, RYR2, MYH7 e ACTCL. Em algumas modalidades, o gene cardíaco expresso em um nível mais baixo do que aquele encontrado no cardiomiócito de ocorrência natural é selecionado do grupo que consiste em MYBPC3, PIN, MB, LMOD2, MYL2, MYL3, COX6A2, ATP5AL, TTN, TNNI3, PDK4, MYCZ2, CACNALC, SCN5A, MYOCD e NPPA.

[00291] Em outro aspecto, uma população substancialmente homogênea de cardiomiócitos induzidos gerados de acordo com os métodos da invenção é fornecida. Em algumas modalidades, os cardiomiócitos induzidos da população substancialmente homogênea expressam pelo menos um gene cardíaco em um nível superior ou inferior do que aquele encontrado em um cardiomiócito de ocorrência natural.

[00292] Em algumas modalidades, a composição compreende uma população de cardiomiócitos induzidos isolados aqui descritos e um veículo, opcionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composições compreendem ainda um estabilizante e/ou um conservante.

[00293] Em algumas modalidades, a composição compreende um vetor viral ou não viral aqui descrito e um veículo, opcionalmente, um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, as composições compreendem ainda um estabilizante e/ou um conservante.

[00294] A composição pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, um sal farmaceuticamente aceitável, diluentes, carreadores, veículos e outros agentes inativos bem conhecidos do especialista versado. Os veículos e excipientes comumente empregados em preparações farmacêuticas incluem, por exemplo, talco, goma arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, manteiga de cacau, solventes aquosos ou não aquosos, óleos, derivados de parafina, glicóis, etc. As soluções podem ser preparadas utilizando água ou solventes orgânicos fisiologicamente compatíveis, tais como etanol, 1,2-propileno glicol, poliglicóis, dimetilsulfóxido, álcoois gordos, triglicerídeos, ésteres parciais de glicerina e semelhantes.

[00295] As composições parenterais podem ser preparadas utilizando técnicas convencionais que podem incluir solução salina isotônica estéril, água, 1,3-butanodiol, etanol, 1,2-propileno glicol, poliglicóis misturados com água, solução de Ringer, etc. Em um aspecto, um agente de coloração é adicionado para facilitar a localização e colocação adequada da composição no local de tratamento pretendido.

[00296] A composição pode incluir agentes que são administrados usando um dispositivo implantável. Dispositivos implantáveis adequados contemplados por esta divulgação incluem stents intravasculares (por exemplo, stents autoexpansíveis, stents expansíveis por balão e enxertos de stent), matrizes, enxertos e semelhantes. Esses dispositivos implantáveis podem ser revestidos em pelo menos uma superfície, ou impregnados, com uma composição capaz de gerar um cardiomiócito induzido. A composição também pode incluir agentes que estão contidos dentro de um reservatório no dispositivo implantável. Onde os agentes estão contidos dentro de um reservatório no dispositivo implantável, o reservatório é estruturado de modo a permitir que os agentes provoquem eluição do dispositivo. Os agentes da composição administrada a partir do dispositivo implantável podem compreender um inibidor de WNT, o inibidor de TGF-β ou ambos.

[00297] As composições farmacêuticas podem ser fornecidas em qualquer forma passível de administração. As composições podem incluir um conservante e/ou um estabilizante. Exemplos não limitativos de conservantes incluem metil-, etil-, propil-parabenos, benzoato de sódio, ácido benzóico, ácido sórbico, sorbato de potássio, ácido propiônico, cloreto de benzalcônio, álcool benzílico, timerosal, sais de fenilmercurato, clorexidina, fenol, 3-cresol, compostos de amônio quaternário (QACs), clorbutanol, 2-etoxietanol e imiduréia.

[00298] Para controlar a tonicidade, uma composição farmacêutica aquosa pode compreender um soro fisiológico, tal como um sal de sódio. O cloreto de sódio (NaCl) é o preferido, que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml. Outros sais que podem estar presentes incluem cloreto de potássio, diidrogenofosfato de potássio, fosfato dissódico desidratado, cloreto de magnésio e cloreto de cálcio.

[00299] As composições podem incluir um ou mais tampões. Os tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; um tampão Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato; um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Os tampões serão tipicamente incluídos em uma concentração na faixa de 5 a 20 mM. O pH de uma composição será geralmente entre 5 e 8, e mais tipicamente entre 6 e 8, por exemplo, entre 6,5 e 7,5, ou entre 7,0 e 7,8.

[00300] A composição é de preferência estéril. A composição é de preferência sem glúten. A composição é preferivelmente não pirogênica.

[00301] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via apropriada, que será evidente para a pessoa versada, dependendo da doença ou condição a ser tratada. As vias de administração típicas incluem oral, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, subcutânea, intracraniana, intranasal ou intraperitoneal.

[00302] Em algumas modalidades, uma composição compreendendo células pode incluir um agente crioprotetor. Exemplos não limitativos de agentes crioprotetores incluem um glicol (por exemplo, etileno glicol, propileno glicol e glicerol), sulfóxido de dimetila (DMSO), formamida, sacarose, trealose, dextrose, e quaisquer combinações dos mesmos.

[00303] Em algumas modalidades, um ou mais agentes utilizados nos métodos da invenção são fornecidos em uma formulação de liberação controlada. O termo "formulação de liberação controlada" inclui formulações de liberação sustentada e liberação temporizada. As formulações de liberação controlada são bem conhecidas na técnica. Estas incluem excipientes que permitem a liberação sustentada, periódica, pulsada ou retardada da composição. As formulações de liberação controlada incluem, sem limitação, a incorporação da composição (um inibidor de WNT e/ou inibidor de TGF-β) em uma matriz; revestimentos entéricos; micro-encapsulamento; géis e hidrogéis; implantes; e qualquer outra formulação que leve em conta a liberação controlada de uma composição.

[00304] Em algumas modalidades, uma população reprogramada de células (em vários estágios de reprogramação) pode ser congelada em temperaturas de nitrogênio líquido, armazenada por períodos de tempo e, em seguida, descongelada para uso em uma data posterior. Se congelada, uma população de células reprogramadas pode ser armazenada em qualquer meio de criopreservação adequado, por exemplo, DMSO 10%, FCS 50%, dentro de meio RPMI 1640 40%. Uma vez descongeladas, as células podem ser expandidas através do cultivo das células em um meio apropriado que pode conter fatores de crescimento selecionados, vitaminas, células de alimentação e outros componentes selecionados por uma pessoa de habilidade na técnica. Os vetores virais e não virais também podem ser congelados em temperaturas de nitrogênio líquido, ou frequentemente em temperaturas mais elevadas, armazenados por períodos de tempo e depois descongelados para uso em uma data posterior.

[00305] Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% de células com iCM são positivas para α-actinina. Em algumas modalidades, pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% das células com iCM são cTnT positivas. Em algumas modalidades, pelo menos 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% das células com iCM são α-actinina e cTnT duplamente positivas.

[00306] A população de células reprogramadas geradas pelos métodos aqui descritos pode incluir baixas porcentagens de células não cardíacas (por exemplo, fibroblastos). Por exemplo, uma população de células reprogramadas para uso em composições e para administração a indivíduos pode ter menos de cerca de 90% de células não cardíacas, menos de cerca de 85% de células não cardíacas, menos de cerca de 80% de células não cardíacas, menos de cerca de 75% das células não cardíacas, menos de cerca de 70% das células não cardíacas, menos de cerca de 65% das células não cardíacas, menos de cerca de 60% das células não cardíacas, menos de cerca de 55% das células não cardíacas, menos de cerca de 50% das células não cardíacas, menos de cerca de 45% das células não cardíacas, menos de cerca de 40% das células não cardíacas, menos de cerca de 35% das células não cardíacas, menos de cerca de 30% das células não cardíacas, menos de cerca de 25% das células não cardíacas, menos de cerca de 20% das células não cardíacas, menos de cerca de 15% das células não cardíacas, menos de cerca de 12% das células não cardíacas, menos de cerca de 10% das células não cardíacas, menos de cerca de 8% das células não cardíacas, menos de cerca de 6% das células não cardíacas, menos de cerca de 5% das células não cardíacas, menos de cerca de 4% das células não cardíacas, menos de cerca de 3% das células não cardíacas, menos de cerca de 2% das células não cardíacas ou menos de cerca de 1% das células não cardíacas do total de células na população de células.

[00307] As células reprogramadas podem ser incluídas nas composições em quantidades variáveis dependendo da doença ou lesão a ser tratada. Por exemplo, as composições podem ser preparadas na forma líquida para administração local ou sistêmica contendo cerca de 103 a cerca de 1012 células reprogramadas, ou cerca de 104 a cerca de 1010 células reprogramadas, ou cerca de 105 a cerca de 108 células reprogramadas.

[00308] Um ou mais dos seguintes tipos de compostos também podem estar presentes na composição com as células: um agonista de

WNT, um inibidor de GSK3, um inibidor de sinalização de TGF-beta, um modificador epigenético, inibidor de LSD1, um agonista de adenilil ciclase, ou qualquer combinação dos mesmos. Qualquer um dos compostos aqui descritos pode ser administrado com as células.

[00309] A invenção também fornece um kit de partes compreendendo os agentes, composições ou formulações mencionadas acima. VII. Métodos de Tratamento

[00310] As células reprogramadas e composições que são aqui descritas também podem ser empregadas em um método de tratamento de um indivíduo com uma doença cardíaca ou cardiopatia. “Tratar” ou “tratamento de uma condição ou indivíduo com sua necessidade” refere-se a (1) tomar medidas para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos tais como a redução dos sintomas; (2) prevenir a doença, por exemplo, fazer com que os sintomas clínicos da doença não se desenvolvam em um paciente que pode ser predisposto à doença, mas ainda não experimenta ou apresenta sintomas da doença; (3) inibir a doença, por exemplo, interrompendo ou reduzindo o desenvolvimento da doença ou seus sintomas clínicos; (4) aliviar a doença, por exemplo, provocando a regressão da doença ou de seus sintomas clínicos; ou (5) retardar a doença. Para os propósitos desta invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a estes, gerar um cardiomiócito induzido e/ou promover a regeneração do miocárdio.

[00311] Indivíduos com necessidade de tratamento utilizando as composições, células e métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a estes, indivíduos com um defeito cardíaco congênito, indivíduos que sofrem de uma doença muscular degenerativa, indivíduos que sofrem de uma condição que resulta em tecido isquêmico do coração (por exemplo, indivíduos com doença arterial coronariana), e semelhantes. Em alguns exemplos, um método é útil para tratar uma doença ou condição muscular degenerativa (por exemplo, cardiomiopatia familiar, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva ou doença da artéria coronária com cardiomiopatia isquêmica resultante). Em alguns exemplos, um método objeto é útil para tratar indivíduos com uma doença ou distúrbio cardíaco ou cardiovascular, por exemplo, doença cardiovascular, aneurisma, angina, arritmia, aterosclerose, acidente cerebrovascular (acidente vascular cerebral), doença cerebrovascular, cardiopatia congênita, insuficiência cardíaca congestiva, miocardite, doença valvar coronária, doença arterial dilatada, disfunção diastólica, endocardite, hipertensão (hipertensão), cardiomiopatia, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva, doença arterial coronariana com cardiomiopatia isquêmica resultante, prolapso da válvula mitral, infarto do miocárdio (ataque cardíaco) ou tromboembolismo venoso.

[00312] Os indivíduos que são adequados para o tratamento utilizando as composições, células e métodos da presente invenção incluem indivíduos (por exemplo, indivíduos mamíferos, tais como seres humanos, primatas não humanos, mamíferos domésticos, indivíduos mamíferos experimentais não humanos tais como camundongos, ratos, etc.) tendo uma cardiopatia incluindo, mas limitada a uma condição que resulta em tecido isquêmico cardíaco (por exemplo, indivíduos com doença arterial coronariana) e semelhantes.

[00313] Em alguns exemplos, um indivíduo adequado para tratamento sofre de uma doença ou condição cardíaca ou cardiovascular, por exemplo, doença cardiovascular, aneurisma, angina, arritmia, aterosclerose, acidente vascular cerebral (isquemia neurológica), doença cerebrovascular, cardiopatia congênita, insuficiência cardíaca congestiva, miocardite, doença valvar coronária,

doença arterial dilatada, disfunção diastólica, endocardite, hipertensão (hipertensão), cardiomiopatia, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva, doença arterial coronariana com cardiomiopatia isquêmica resultante, prolapso da válvula mitral, infarto do miocárdio (ataque cardíaco), ou tromboembolismo venoso. Em alguns exemplos, os indivíduos adequados para o tratamento com um método objeto incluem indivíduos que possuem uma doença muscular degenerativa, por exemplo, cardiomiopatia familiar, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva ou doença arterial coronariana com cardiomiopatia isquêmica resultante.

[00314] Indivíduos com necessidade de tratamento utilizando as composições, células e métodos da presente invenção incluem, mas não são limitados a estes, indivíduos tendo um defeito cardíaco congênito, indivíduos que sofrem de uma doença muscular degenerativa, indivíduos que sofrem de uma condição que resulta em tecido isquêmico do coração (por exemplo, indivíduos com doença arterial coronariana), e semelhantes. Em alguns exemplos, um método é útil para tratar uma doença ou condição muscular degenerativa (por exemplo, cardiomiopatia familiar, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva ou doença da artéria coronária com cardiomiopatia isquêmica resultante). Em alguns exemplos, um método objeto é útil para tratar indivíduos tendo uma doença ou distúrbio cardíaco ou cardiovascular, por exemplo, doença cardiovascular, aneurisma, angina, arritmia, aterosclerose, acidente vascular cerebral (isquemia neurológica), doença cerebrovascular, cardiopatia congênita, insuficiência cardíaca congestivq, miocardite, doença valvar coronária, doença arterial dilatada, disfunção diastólica, endocardite, hipertensão (hipertensão), cardiomiopatia, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva, doença arterial coronariana com cardiomiopatia isquêmica resultante, prolapso da válvula mitral, infarto do miocárdio (ataque cardíaco) ou tromboembolismo venoso.

[00315] Os indivíduos que são adequados para o tratamento utilizando as composições, células e métodos da presente invenção incluem indivíduos (por exemplo, indivíduos mamíferos tais como seres humanos, primatas não humanos, indivíduos mamíferos experimentais não humanos tais como camundongos, ratos, etc.) tendo uma cardiopatia incluindo, mas limitada a uma condição que resulta em tecido cardíaco isquêmico (por exemplo, indivíduos com doença arterial coronariana) e semelhantes. Em alguns exemplos, um indivíduo adequado para tratamento sofre de uma doença ou condição cardíaca ou cardiovascular, por exemplo, doença cardiovascular, aneurisma, angina, arritmia, aterosclerose, acidente vascular cerebral (isquemia neurológica), doença cerebrovascular, cardiopatia congênita, insuficiência cardíaca congestiva, miocardite, doença valvar coronariana, doença arterial dilatada, disfunção diastólica, endocardite, hipertensão arterial (hipertensão), cardiomiopatia, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva, doença arterial coronariana com cardiomiopatia isquêmica resultante, prolapso da válvula mitral, infarto do miocárdio (ataque cardíaco) ou tromboembolismo venoso. Em alguns exemplos, os indivíduos adequados para o tratamento com um método objeto incluem indivíduos que possuem uma doença muscular degenerativa, por exemplo, cardiomiopatia familiar, cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia restritiva ou doença arterial coronariana com cardiomiopatia isquêmica resultante.

[00316] Exemplos de doenças e condições que podem ser tratadas utilizando as células reprogramadas e/ou composições (contendo qualquer um dos compostos aqui descritos com ou sem células reprogramadas) incluem qualquer patologia cardíaca ou disfunção cardíaca. Doenças e condições que podem ser tratadas incluem aquelas que ocorrem como uma conseqüência de defeito genético,

lesão física, insulto ou condicionamento ambiental, problemas de saúde, obesidade e outros riscos de doenças.

[00317] A cardiomiopatia isquêmica é um distúrbio crônico provocado por doença arterial coronariana (uma doença em que há estreitamento ou oclusão aterosclerótica das artérias coronárias na superfície do coração). A doença arterial coronariana frequentemente leva a episódios de isquemia cardíaca, em que o músculo cardíaco não recebe sangue rico em oxigênio em quantidade suficiente.

[00318] A cardiomiopatia não isquêmica é geralmente classificada em três grupos com base principalmente nas características clínicas e patológicas: cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia hipertrófica e cardiomiopatia restritiva e infiltrativa.

[00319] Em outra modalidade, a patologia cardíaca é uma doença genética tal como distrofia muscular de Duchenne e cardiomiopatia dilatada de Emery Dreiffuss.

[00320] Por exemplo, a patologia cardíaca pode ser selecionada do grupo que consiste em insuficiência cardíaca congestiva, infarto do miocárdio, isquemia cardíaca, miocardite e arritmia. Em algumas modalidades, o indivíduo é diabético. Em algumas modalidades, o indivíduo não é diabético. Em algumas modalidades, o indivíduo sofre de cardiomiopatia diabética.

[00321] Células reprogramadas geradas conforme descrito nesta invenção podem ser empregadas para reconstituição ou regeneração de tecido em um paciente humano ou outros indivíduos que necessitem de tal tratamento. As células são administradas de uma maneira que lhes permite enxertar ou migrar para um local de tecido enfermo ou lesionado e reconstituir ou regenerar a área funcionalmente deficiente. Estão disponíveis dispositivos que podem ser adaptados para a administração de células, por exemplo, em tecidos cardíacos.

[00322] Para terapia, vírus recombinantes, vetores não virais, células progenitoras cardíacas, cardiomiócitos e/ou composições farmacêuticas podem ser administrados local ou sistemicamente.

Uma população reprogramada de células pode ser introduzida por injeção, cateter, dispositivo implantável, ou semelhante.

Uma população de vírus recombinantes ou células reprogramadas pode ser administrada em qualquer excipiente ou veículo fisiologicamente aceitável que não afete adversamente as células.

Por exemplo, os vírus recombinantes, vetores não virais, células progenitoras cardíacas, cardiomiócitos e/ou composições farmacêuticas podem ser administrados por via intravenosa ou por uma via intracardíaca (por exemplo, epicárdica ou intramiocárdica). Métodos de administração dos vírus recombinantes, vetores não virais, cardiomiócitos e composições farmacêuticas (por exemplo, composições compreendendo vetores) da invenção aos indivíduos, particularmente indivíduos humanos, inclui injeção, implantação ou infusão das composições farmacêuticas (por exemplo, composições compreendendo vetores virais) ou células em sítios alvo nos indivíduos.

A injeção pode incluir injeção direta no músculo e a infusão pode incluir infusão intravascular.

Os vetores, composições farmacêuticas ou células podem ser inseridas em um dispositivo de liberação que facilita a introdução por injeção ou implantação das composições farmacêuticas ou células nos indivíduos.

Tais dispositivos de liberação incluem tubos, por exemplo, cateteres, para a injeção de células e fluidos no corpo de um indivíduo receptor.

Os tubos podem incluir adicionalmente uma agulha, por exemplo, uma seringa, através da qual as células da invenção podem ser introduzidas no indivíduo em um local desejado.

Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas ou células são liberadas por adesivo de microagulha conforme descrito em, por exemplo, Tang et al.

Cardiac cell–integrated microneedle patch for treating myocardial infarction. Science Advances 28 Nov 2018: Vol. 4, no. 11, eaat9365.

[00323] Os vírus recombinantes, vetores não virais, células progenitoras cardíacas e cardiomiócitos podem ser inseridos em um tal dispositivo de liberação, por exemplo, uma seringa, em diferentes formas. Uma população de vírus recombinantes, vetores não virais, células reprogramadas pode ser fornecida na forma de uma composição farmacêutica. Uma tal composição pode incluir um excipiente isotônico preparado sob condições suficientemente estéreis para administração humana. Para princípios gerais na formulação de medicamentos, o leitor deve consultar Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996; e Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000. A escolha do excipiente celular e quaisquer constituintes acompanhantes da composição que inclui uma população de células reprogramadas pode ser adaptada para otimizar a administração pela via e/ou dispositivo empregado.

[00324] Conforme utilizado nesta invenção, o termo "solução" inclui um veículo ou diluente no qual os cardiomiócitos e células cardíacas da invenção permanecem viáveis ou os vetores virais permanecem biologicamente ativos. Os veículos e diluentes que podem ser utilizados incluem solução salina, soluções tamponantes aquosas, solventes e/ou meios de dispersão. O uso de tais veículos e diluentes é bem conhecido na técnica. A solução é de preferência estéril e fluida na medida em que exista fácil seringabilidade. Para o transplante, os cardiomiócitos e/ou células cardíacas são puxados para dentro de uma seringa e administrados a receptores de transplante anestesiados. Para injeção direta, uma agulha, seringa ou cateter é inserido no coração cirurgicamente, de modo ideal em um ambiente minimamente invasivo. Várias injeções podem ser feitas utilizando este procedimento.

[00325] As células progenitoras cardíacas, células cardíacas e/ou cardiomiócitos também podem ser incorporadas em uma matriz de suporte. Uma composição que inclui uma população de células reprogramadas também pode incluir ou ser acompanhada por um ou mais outros ingredientes que facilitam o enxerto ou a mobilização funcional das células reprogramadas. Ingredientes adequados incluem proteínas de matriz que suportam ou promovem a aderência das células reprogramadas, ou tipos de células complementares, tais como células de marcapasso cardíaco ou células cardíacas em diferentes estágios de maturação. Em outra modalidade, a composição pode incluir scaffolds de matriz fisiologicamente aceitáveis. Esses scaffolds de matriz fisiologicamente aceitáveis podem ser reabsorvíveis e/ou biodegradáveis. A. Métodos de Tratamento utilizando Vírus Rrecombinantes

[00326] Em alguns aspectos, uma partícula viral da presente invenção pode ser utilizada para tratar um indivíduo com sua necessidade. Em algumas modalidades, os vírus recombinantes podem ser administrados ao indivíduo com sua necessidade, em que a administração ao indivíduo dos vírus recombinantes trata uma doença cardiovascular no indivíduo.

[00327] Os vírus recombinantes podem ser administrados local ou sistemicamente. Os vírus recombinantes podem ser projetados para atingir tipos de células específicos através da seleção de uma proteína de capsídeo apropriada ou pseudotipagem do vírus com uma proteína de outro tipo de vírus. Para determinar a adequação de vários regimes de administração terapêutica e dosagens de composições de partículas virais, os vírus recombinantes podem em primeiro lugar ser testados em um modelo animal adequado. Em um nível, os vírus recombinantes são avaliados quanto à sua capacidade de infectar células alvo in vivo. Os vírus recombinantes também podem ser avaliados para determinar se eles migram para os tecidos alvo, se induzem uma resposta imune no hospedeiro ou para determinar um número apropriado ou dosagem de vírus recombinantes a serem administrados. Pode ser desejável ou indesejável que os vírus recombinantes gerem uma resposta imune, dependendo da doença a ser tratada. Geralmente, se a administração repetida de uma partícula viral for necessária, será vantajoso se a partícula viral não for imunogênica. Para fins de teste, as composições de partículas virais podem ser administradas a animais imunodeficientes (tais como camundongos nus ou animais que se tornam imunodeficientes quimicamente ou por irradiação). Os tecidos ou células alvo podem ser colhidos após um período de infecção e avaliados para determinar se os tecidos ou células foram infectados e se o fenótipo desejado (por exemplo, cardiomiócito induzido) foi induzido no tecido ou células alvo.

[00328] Os vírus recombinantes podem ser administrados por várias vias, incluindo, sem limitação, injeção direta no coração ou cateterismo cardíaco. Alternativamente, os vírus recombinantes podem ser administrados sistemicamente, tal como por infusão intravenosa. Quando a injeção direta é utilizada, ela pode ser executada por cirurgia de coração aberto ou por cirurgia minimamente invasiva. Em alguns casos, os vírus recombinantes são liberados ao espaço pericárdico por injeção ou infusão. Os vírus recombinantes injetados ou infundidos podem ser rastreados por uma variedade de métodos. Por exemplo, vírus recombinantes marcados com ou expressando um marcador detectável (tal como proteína fluorescente verde ou beta- galactosidase) podem ser facilmente detectados. Os vírus recombinantes podem ser projetados para fazer com que a célula alvo expresse uma proteína marcadora, tal como uma proteína expressa na superfície ou uma proteína fluorescente. Alternativamente, a infecção de células alvo com vírus recombinantes pode ser detectada por sua expressão de um marcador de célula que não é expresso pelo animal empregado para o teste (por exemplo, um antígeno específico de ser humano ao injetar células em um animal experimental). A presença e o fenótipo das células-alvo podem ser avaliados por microscopia de fluorescência (por exemplo, para proteína fluorescente verde ou beta- galactosidase), por imunohistoquímica (por exemplo, utilizando um anticorpo contra um antígeno humano), por ELISA (utilizando um anticorpo contra um antígeno humano), ou através da análise de RT- PCR utilizando inciadores e condições de hibridização que fazem com que a amplificação seja específica para RNA indicativo de um fenótipo cardíaco.

[00329] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de infarto do miocárdio em um indivíduo (por exemplo, um ser humano) com sua necessidade. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de um vetor AAV que codifica MyΔ3 e ASCL1. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração ao indivíduo de um vetor AAV compreendendo um polinucleotídeo que codifica MyΔ3-2A-ASCL1. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração ao indivíduo de um vetor AAV compreendendo um polinucleotídeo que codifica ASCL1-2A-MyΔ3. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de infarto do miocárdio em indivíduo (por exemplo, um ser humano) com sua necessidade, compreendendo a administração ao indivíduo de um vetor AAV que compreende um polinucleotídeo que codifica MyΔ3-2A-ASCL1 (AAV:MyΔ3A), em que o método resulta na reversão parcial, substancial ou completa da insuficiência cardíaca e/ou parada parcial, substancial ou completa da progressão de insuficiência cardíaca e/ou prevenção parcial, substancial ou completa da insuficiência cardíaca no indivíduo. O vetor

AAV pode ser um vetor AAV5. O vetor AAV pode ser uma variante de AAV5. O vetor AAV pode ser outro vetor AAV. O vetor AAV pode ser capaz de infecção ou transdução (por exemplo, infecção ou transdução preferencial) de células não-cardiomiócitos (por exemplo, células de fibroblastos cardíacos). Em algumas modalidades, os métodos de tratamento da invenção resultam no aumento da fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF) e/ou na manutenção da LVEF no indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo sofre ou está em risco de infarto do miocárdio (MI). Em algumas modalidades, o indivíduo sofre ou está em risco de infarto agudo do miocárdio (AMI). Em algumas modalidades, o indivíduo sofre ou está em risco de infarto agudo do miocárdio (CMI). Em algumas modalidades, o indivíduo sofre ou está em risco de insuficiência cardíaca crônica (por exemplo, devido a MI ou AMI ou CMI). Em algumas modalidades, o indivíduo sofre ou está em risco de insuficiência cardíaca congestiva (por exemplo, devido a MI ou AMI ou CMI). Em várias modalidades, a etapa de administração compreende injeção intracardíaca ou intramiocárdica, cateterização intracoronária ou administração sistêmica (por exemplo, administração intravenosa). Em algumas modalidades, a liberação de AAV de MyΔ3A fornece benefício funcional in vivo em um ou ambos de infarto do miocárdio agudo (AMI) e infarto do miocárdio crônico (CMI). Em algumas modalidades, a insuficiência cardíaca devido ao AMI é parcial, substancial ou completamente revertida. Em algumas modalidades, a progressão da insuficiência cardíaca devido ao CMI é parcial, substancial ou completamente interrompida.

[00330] Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende a administração do vetor AAV em cerca de uma hora, em cerca de duas horas, em cerca de três horas, em cerca de quatro horas, em cerca de cinco horas, em cerca de 12 horas, em cerca de

18 horas, ou dentro de cerca de 24 horas após um ataque cardíaco. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende a administração do vetor AAV em cerca de um dia, em cerca de dois dias, em cerca de três dias, em cerca de quatro dias, em cerca de cinco dias, em cerca de seis dias, em cerca de sete dias ou em cerca de 24 horas após um ataque cardíaco. Em algumas modalidades, a etapa de administração compreende a administração do vetor AAV em cerca de uma semana, em cerca de duas semanas, em cerca de três semanas ou em cerca de quatro semanas após um ataque cardíaco.

[00331] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia, compreendendo a administração de um vetor ou sistema de vetor da invenção ao indivíduo. O vetor pode ser um vetor monocistrônico, bicistrônico ou policistrônico. Em uma modalidade, a invenção fornece um método para promover, aumentar, melhorar ou sustentar a melhora na função cardíaca. Em algumas modalidades, o método aumenta o número de miócitos no coração em pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15% ou pelo menos cerca de 20%. Em algumas modalidades, a cardiopatia é um infarto do miocárdio. Em algumas modalidades, a cardiopatia é um infarto agudo do miocárdio. Em algumas modalidades, a cardiopatia é uma insuficiência cardíaca. Em algumas modalidades, a cardiopatia é uma insuficiência cardíaca isquêmica crônica. Em outro aspecto, a invenção fornece um kit que compreende um vetor ou sistema de vetor da invenção e, opcionalmente, instruções para uso no tratamento de uma cardiopatia.

[00332] Em outro aspecto, a invenção fornece método de conversão de uma célula diferenciada sem cardiomiócito em um cardiomiócito, compreendendo o contato das células diferenciadas com um vetor ou sistema de vetor da invenção. Em algumas modalidades, a célula diferenciada sem cardiomiócito é uma célula diferenciada sem cardiomiócito. Em algumas modalidades, a célula diferenciada sem cardiomiócito é uma célula humana diferenciada sem cardiomiócito. Em algumas modalidades, a célula não-cardiomiócito diferenciada é uma célula não-cardiomiócito diferenciada in vivo. Em algumas modalidades, a célula diferenciada sem cardiomiócito é uma célula diferenciada sem cardiomiócito in vitro. Em algumas modalidades, a célula diferenciada sem cardiomiócito é uma célula cardíaca.

[00333] Em algumas modalidades, os métodos da invenção melhoram ou restauram a fração de ejeção do coração. Em algumas modalidades, a melhora compreende pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30% ou pelo menos cerca de 40% de melhora. Em algumas modalidades, o método compreende aumentar a fração de ejeção do coração do indivíduo em pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60%. Em algumas modalidades, a melhora ou restauração da fração de ejeção ocorre dentro de no máximo cerca de duas, cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco ou cerca de seis semanas. Em algumas modalidades, a melhora ou restauração da fração de ejeção ocorre dentro de duas, três, quatro, cinco ou seis semanas. Em algumas modalidades, os métodos da invenção melhoram ou restauram a fração de ejeção do coração. Em algumas modalidades, a melhora compreende cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30% ou cerca de 40% de melhora. Em algumas modalidades, o método compreende aumentar a fração de ejeção do coração do indivíduo para cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50% ou cerca de 60%. Em algumas modalidades, os métodos da divulgação melhoram ou restauram a fração de ejeção do coração. Em algumas modalidades, a melhora compreende cerca de 5% a cerca de 10%, cerca de 10% a cerca de 20%, cerca de 20% a cerca de 30% ou cerca de 30% a cerca de 40% de melhora. Em algumas modalidades, o método compreende aumentar a fração de ejeção do coração do indivíduo para cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50% ou cerca de 60%. Em algumas modalidades, a melhora ou restauração da fração de ejeção ocorre dentro de cerca de duas, cerca de três, cerca de quatro, cerca de cinco ou cerca de seis semanas. Em algumas modalidades, a melhora ou restauração da fração de ejeção ocorre dentro de duas, três, quatro, cinco ou seis semanas. B. Métodos de Tratamento utilizando Cardiomiócitos Induzidos

[00334] Em alguns aspectos, um cardiomiócito induzido da presente invenção pode ser utilizado para tratar um indivíduo com sua necessidade. Em algumas modalidades, os cardiomiócitos induzidos podem ser administrados ao indivíduo com sua necessidade, onde a administração ao indivíduo dos cardiomiócitos induzidos trata uma doença cardiovascular no indivíduo.

[00335] Muitos tipos de células são capazes de migrar para um local apropriado para regeneração e diferenciação dentro de um indivíduo. Para determinar a adequação de vários regimes de administração terapêutica e dosagens de composições de células, as células podem ser testadas em primeiro lugar em um modelo animal adequado. Em um nível, as células são avaliadas quanto à sua capacidade de sobreviver e manter seu fenótipo in vivo. As células também podem ser avaliadas para verificar se elas migram para locais doentes ou lesionados in vivo, ou para determinar um número apropriado, ou dosagem, de células a serem administradas. As composições celulares podem ser administradas a animais imunodeficientes (tais como camundongos nus ou animais que se tornam imunodeficientes quimicamente ou por irradiação). Os tecidos podem ser colhidos após um período de crescimento renovado e avaliados quanto ao fato de que as células administradas ou sua progênie ainda estão presentes, estão vivas e/ou migraram para locais desejados ou indesejados.

[00336] As células injetadas podem ser rastreadas por uma variedade de métodos. Por exemplo, células contendo ou expressando um marcador detectável (tal como proteína fluorescente verde ou beta- galactosidase) podem ser facilmente detectadas. As células podem ser pré-marcadas, por exemplo, com BrdU ou [3H]-timidina, ou pela introdução de um cassete de expressão que pode expressar proteína fluorescente verde ou beta-galactosidase. Alternativamente, as células reprogramadas podem ser detectadas por sua expressão de um marcador de célula que não é expresso pelo animal empregado para o teste (por exemplo, um antígeno específico para seres humanos ao injetar células em um animal experimental). A presença e o fenótipo da população administrada de células reprogramadas podem ser avaliados por microscopia de fluorescência (por exemplo, para proteína fluorescente verde ou beta-galactosidase), por imunohistoquímica (por exemplo, utilizando um anticorpo contra um antígeno humano), por ELISA (utilizando um anticorpo contra um antígeno humano), ou pela análise de RT-PCR utilizando iniciadores e condições de hibridização que fazem com que a amplificação seja específica para o RNA indicativo de um fenótipo cardíaco. C. Métodos de Tratamento utilizando Fatores e Composições de Reprogramação

[00337] Em outras modalidades, um método de tratamento de doenças cardiovasculares envolve a administração ao indivíduo com sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição de reprogramação capaz de aumentar a expressão de ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5 ou combinações das mesmas. Em outras modalidades,

um método de tratamento de doenças cardiovasculares envolve a administração ao indivíduo com sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição de reprogramação capaz de aumentar a expressão de ASCL1, MYOCD, MEF2C, TBX5 ou combinações das mesmas.

[00338] A invenção fornece métodos de tratamento de uma doença cardiovascular compreendendo a administração a um indivíduo com sua necessidade de uma quantidade eficaz de um cardiomiócito induzido produzido pelos métodos aqui descritos.

[00339] Em alguns aspectos, um cardiomiócito induzido da presente invenção pode ser utilizado para tratar um indivíduo com sua necessidade. Em algumas modalidades, o cardiomiócito induzido pode ser administrado ao indivíduo com sua necessidade, em que a administração ao indivíduo do cardiomiócito induzido trata uma doença cardiovascular no indivíduo. Assim, em algumas modalidades, um método de tratamento de doenças cardiovasculares envolve a administração a um indivíduo com sua necessidade de uma população de cardiomiócitos induzidos. Em outras modalidades, um método de tratamento de doenças cardiovasculares envolve a administração ao indivíduo com sua necessidade de uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo um inibidor de WNT, um inibidor de TGF- β ou ambos.

[00340] Em algumas modalidades, o sem cardiomiócito é cultivado na presença do inibidor de TGF-β durante cerca de 6 horas, cerca de 12 horas, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 30 horas, cerca de 36 horas, cerca de 42 horas ou cerca de 48 horas antes da adição do inibidor de WNT. Em uma modalidade preferida, o sem cardiomiócito é cultivado na presença do inibidor de TGF-β durante cerca de 24 horas antes da adição do inibidor de WNT. VIII. Kits

[00341] Uma variedade de kits é descrita nesta invenção que inclui qualquer uma das composições, compostos e/ou agentes aqui descritos. O kit pode incluir, por exemplo, um meio de cultura na forma concentrada ou não concentrada. O kit pode incluir qualquer um dos compostos aqui descritos, misturados entre si ou acondicionados individualmente, e na forma seca ou hidratada. Os compostos e/ou agentes aqui descritos podem ser acondicionados separadamente em frascos, garrafas ou outros recipientes discretos. Alternativamente, qualquer um dos compostos e/ou agentes aqui descritos pode ser acondicionado ao mesmo tempo como uma composição única, ou como duas ou mais composições que podem ser utilizadas juntas ou separadamente. Os compostos e/ou agentes aqui descritos podem ser acondicionados em relações e/ou quantidades apropriadas para facilitar a conversão de células selecionadas através dos limites de diferenciação para formar células progenitoras cardíacas e/ou cardiomiócitos.

[00342] O kit também pode incluir um cassete de expressão, um vetor de expressão ou uma combinação dos mesmos que inclui um segmento polinucleotídico que codifica uma proteína de interesse ligada de maneira operável a um promotor e outros elementos reguladores opcionais. O cassete de expressão ou vetor pode ser fornecido na forma desidratada ou em uma solução pronta para uso.

[00343] Um kit é descrito nesta invenção para o cultivo de células in vitro que pode incluir qualquer uma das composições, compostos, cassetes de expressão, vetores de expressão e/ou agentes aqui descritos, assim como instruções para o uso dessas composições, compostos, cassetes de expressão, vetores de expressão e/ou agentes.

[00344] Alguns kits podem incluir uma cultura de células ou meio de células que inclui qualquer uma das composições, compostos e/ou agentes aqui descritos. Os kits podem incluir um ou mais dispositivos de coleta de células estéreis, tal como um cotonete, dispositivo de raspagem de pele, uma agulha, uma seringa e/ou um bisturi. Os kits também podem incluir anticorpos para detecção de progenitores cardíacos e/ou marcadores de células com cardiomiócitos tais como anticorpos contra qualquer um dos seguintes marcadores: α-actinina, MLC2v, cMHC, NKX2-5, GATA4, ISL1, MEF2C, cTNT, cTNI, MLC2a, e qualquer combinação dos mesmos. Os anticorpos podem ser marcados de modo que um sinal detectável possa ser observado quando os anticorpos formam um complexo com a célula progenitora cardíaca e/ou marcadores de células com cardiomiócitos.

[00345] As instruções podem incluir orientações para a introdução de um ácido nucleico em células selecionadas (por exemplo, uma célula inicial selecionada ou células selecionadas). Um tal ácido nucleico pode ser um RNA, um cassete de expressão ou um vetor de expressão que codifica um polinucleotídeo ou proteína de interesse, e o cultivo das células por um tempo e sob condições suficientes para expressar o polinucleotídeo ou proteína de interesse. As instruções também podem incluir instruções para converter as células através dos limites de diferenciação e na linhagem cardíaca utilizando qualquer uma das composições e métodos aqui divulgados. Por exemplo, as instruções podem descrever quantidades das composições, compostos e/ou agentes aqui descritos para adicionar ao meio de cultura de células, tempos suficientes para converter células para a linhagem cardíaca, manutenção de densidades celulares adequadas para conversão ideal e semelhantes. Por exemplo, as instruções podem descrever procedimentos para reidratação ou diluição das composições, compostos e/ou agentes aqui descritos. Quando um kit fornece um meio de cultura de células contendo algumas das composições, compostos e/ou agentes aqui descritos, as instruções podem descrever como adicionar outros compostos e/ou agentes. As instruções também podem descrever como converter as células selecionadas em células progenitoras cardíacas ou em cardiomiócitos.

[00346] As instruções também podem descrever procedimentos para detectar progenitores cardíacos e/ou marcadores de células com cardiomiócitos pelo uso de anticorpos contra esses marcadores de modo que a extensão da conversão e/ou diferenciação possa ser avaliada.

[00347] Outro kit também é descrito nesta invenção que inclui qualquer uma das composições, compostos e/ou agentes aqui descritos para o tratamento terapêutico de um indivíduo. O kit pode incluir qualquer uma das composições, compostos e/ou agentes aqui descritos, assim como instruções para a administração dessas composições, compostos e/ou agentes. Essas instruções podem fornecer as informações descritas em todo este pedido.

[00348] O kit também pode incluir células. Por exemplo, o kit pode incluir células progenitoras cardíacas quimicamente induzidas e/ou cardiomiócitos que foram tratados pelas composições e/ou métodos aqui descritos e que estão prontos para administração.

[00349] Os vírus recombinantes, vetores não virais, células, composições e/ou compostos podem ser fornecidos em qualquer um dos kits na forma de um dispositivo de distribuição. Alternativamente, um dispositivo de distribuição pode ser incluído separadamente nos kits e as instruções podem descrever como montar o dispositivo de distribuição antes da administração a um indivíduo. O dispositivo de liberação pode fornecer uma matriz para o crescimento celular e/ou uma matriz para a liberação controlada de qualquer uma das composições, compostos ou agentes aqui descritos.

[00350] Qualquer um dos kits também pode incluir seringas, cateteres, bisturis, recipientes estéreis para coleta de amostras ou células, diluentes, veículos farmaceuticamente aceitáveis, e semelhantes.

[00351] Os kits podem fornecer outros fatores tais como qualquer um dos fatores suplementares ou fármacos aqui descritos para as composições na seção precedente ou outras partes do pedido.

MODALIDADES ENUMERADAS

[00352] A invenção pode ser definida por referência às seguintes modalidades enumeradas: Conjunto de Modalidades 1:

[00353] Cláusula 1-1. Células com cardiomiócitos induzidos (iCM), em que as células compreendem um polinucleotídeo de ASCL1.

[00354] Cláusula 1-2. As células iCM de acordo com a cláusula 1-1, em que as células compreendem um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

[00355] Cláusula 1-3. As células com iCM de acordo com a cláusula 1-2, em que o polinucleotídeo de ASCL1 e o polinucleotídeo de MYOCD são expressos a partir de um primeiro vetor policistrônico; e em que o polinucleotídeo de MEF2C e o polinucleotídeo de TBX5 são expressos a partir de um segundo vetor policistrônico.

[00356] Cláusula 1-4. As células com iCM de acordo com a cláusula 1-3, em que o primeiro vetor policistrônico e o segundo vetor policistrônico são, cada um, independentemente selecionados de uma nanopartícula lipídica, um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral integrante (LVV) e um LVV não integrante.

[00357] Cláusula 1-5. As células com iCM de acordo com qualquer uma das cláusulas de 1-2 a 4, em que pelo menos 25% das células com iCM são positivas para α-actinina.

[00358] Cláusula 1-6. As células com iCM de acordo com qualquer uma das cláusulas de 1-2 a 5, em que pelo menos 2% das células com iCM são cTnT positivas.

[00359] Cláusula 1-7. As células com iCM de acordo com a cláusula 1-1, em que as células compreendem um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de MYOCD.

[00360] Cláusula 1-8. As células com iCM de acordo com a cláusula 1-2, em que o polinucleotídeo de ASCL1 e o polinucleotídeo de MYOCD são expressos em cotranslação a partir de um vetor policistrônico.

[00361] Cláusula 1-9. As células com iCM de acordo com a cláusula 1-8, em que o vetor policistrônico é um vetor que compreende um polinucleotídeo de MYOCD-2A-ASCL1 e em que o vetor é selecionado de uma nanopartícula lipídica, um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral integrante (LVV) e um LVV não integrante.

[00362] Cláusula 1-10. As células com iCM de acordo com qualquer uma das cláusulas de 1-7 a 9, em que pelo menos 25% das células com iCM são α-actinina positivas.

[00363] Cláusula 1-11. As células com iCM de acordo com qualquer uma das cláusulas de 1-7 a 10, em que pelo menos 5% das células com iCM são cTnT positivas.

[00364] Cláusula 1-12. As células com iCM de acordo com a cláusula 1-1, em que as células são geradas de fibroblastos cardíacos humanos adultos primários (AHCFs).

[00365] Cláusula 1-13. Um método para induzir um fenótipo de cardiomiócito em células diferenciadas, compreendendo o contato das células diferenciadas com um vetor de expressão retroviral que compreende um polinucleotídeo de ASCL1, gerando assim uma população de células com cardiomiócitos induzidos (iCM).

[00366] Cláusula 1-14. O método de acordo com a cláusula 1-1, em que o vetor de expressão retroviral compreende um polinucleotídeo de

MYOCD.

[00367] Cláusula 1-15. O método de acordo com a cláusula 1-14, em que o polinucleotídeo de ASCL1 e o polinucleotídeo de MYOCD são expressos a partir de um polinucleotídeo de MYOCD-2A-ASCL1.

[00368] Cláusula 1-16. O método de acordo com a cláusula 1-1, em que o método compreende o contato das células de origem com um segundo vetor de expressão retroviral compreendendo um ou ambos de um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

[00369] Cláusula 1-17. O método de acordo com a cláusula 1-16, em que o polinucleotídeo de MEF2C e o polinucleotídeo de TBX5 são expressos a partir de um polinucleotídeo de MEF2C-2A-TBX5 ou um polinucleotídeo de TBX5-2A-MEF2C.

[00370] Cláusula 1-18. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas de 1-13 a 17, em que pelo menos 25% das células com iCM são α-actinina positivas.

[00371] Cláusula 1-19. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas de 1-13 a 18, em que pelo menos 5% das células com iCM são cTnT positivas.

[00372] Cláusula 1-20. O método de acordo com a cláusula 1-13, em que as células diferenciadas compreendem fibroblastos cardíacos humanos adultos primários (AHCFs).

[00373] Cláusula 1-21. Um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo, compreendendo a administração de um ou mais ácidos nucleicos que codificam um polinucleotídeo de ASCL1 e, opcionalmente, um ou mais de um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5 no indivíduo, induzindo assim a transdiferenciação de células de fibroblasto em células com cardiomiócitos induzidos (iCM) no indivíduo in vivo, tratando assim o indivíduo.

[00374] Cláusula 1-22. O método de acordo com a cláusula 1-21,

em que a etapa de administração compreende uma via de administração selecionada de injeção direta no coração do indivíduo, injeção intravenosa e liberação ao indivíduo por cateter.

[00375] Cláusula 1-23. O método de acordo com a cláusula 1-21, em que um ou mais ácidos nucleicos são fornecidos em um ou mais vetores retrovirais.

[00376] Cláusula 1-24. O método de acordo com a cláusula 1-21, em que um ou mais ácidos nucleicos são fornecidos em um ou mais vetores virais adenoassociados (AAV).

[00377] Cláusula 1-25. Um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo, compreendendo a introdução em células diferenciadas de um ou mais ácidos nucleicos que codificam um polinucleotídeo de ASCL1 e, opcionalmente, um ou mais de um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5 na cultura de células, gerando assim células com cardiomiócitos induzidos (iCM) ex vivo; e administração das células com iCM ao indivíduo, tratando assim o indivíduo.

[00378] Cláusula 1-26. O método de acordo com as cláusulas 1-25, em que um ou mais ácidos nucleicos são fornecidos em um ou mais vetores retrovirais.

[00379] Cláusula 1-27. O método de acordo com as cláusulas 1-25, em que o um ou mais ácidos nucleicos são fornecidos em um ou mais vetores virais adenoassociados (AAV).

[00380] Cláusula 1-28. O método de acordo com a cláusula 1-25, em que as células com iCM são administradas em uma matriz biocompatível.

[00381] Cláusula 1-29. O método de acordo com a cláusula 1-25, em que as células diferenciadas compreendem fibroblastos cardíacos humanos adultos primários (AHCFs).

[00382] Cláusula 1-30. O método de acordo com a cláusula 1-29,

em que os AHCFs são células autólogas derivadas do indivíduo.

[00383] Cláusula 1-31. O método de acordo com a cláusula 1-29, em que os AHCFs são células alogênicas derivadas de um doador diferente do indivíduo. Cláusula 1-32. Um vetor, compreendendo um polinucleotídeo selecionado de um polinucleotídeo de MEF2C-2A-TBX5, um polinucleotídeo de TBX5-2A-MEF2C e um polinucleotídeo de MYOCD- 2A-ASCL1, em que o vetor é selecionado de uma nanopartícula lipídica, um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral integrante (LVV) e um LVV não integrante. Conjunto de Modalidades 2:

[00384] Cláusula 2-1. Um vetor, compreendendo, em qualquer ordem 5' para 3' e nas mesmas ou diferentes fitas polinucleotídicas, um polinucleotídeo de MYOCD e um ou ambos de um polinucleotídeo de ASCL1 ou um polinucleotídeo de MYF6; cada polinucleotídeo ligado de maneira operável a pelo menos um promotor.

[00385] Cláusula 2-2. O vetor de acordo com a cláusula 2-1, em que o vetor compreende, em qualquer ordem 5' para 3' e nas mesmas ou diferentes fitas polinucleotídicas, um polinucleotídeo de MYOCD e um polinucleotídeo de ASCL1.

[00386] Cláusula 2-3. O vetor de acordo com a cláusula 2-1, em que o vetor compreende, em qualquer ordem 5' para 3' e nas mesmas ou diferentes fitas polinucleotídicas, um polinucleotídeo de MYOCD e um polinucleotídeo de MYF6.

[00387] Cláusula 2-4. O vetor de acordo com a cláusula 2-1, em que o vetor compreende, em qualquer ordem de 5' para 3' e nas mesmas ou diferentes fitas polinucleotídicas, um polinucleotídeo de MYOCD; um ou ambos de um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5; e um ou ambos de um polinucleotídeo de

ASCL1 e um polinucleotídeo de MYF6.

[00388] Cláusula 2-5. O vetor de acordo com a cláusula 2-4, em que o vetor compreende, em qualquer ordem 5' para 3' e nas mesmas ou diferentes fitas polinucleotídicas, um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de ASCL1, um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

[00389] Cláusula 2-6. O vetor de acordo com a cláusula 2-4, em que o vetor compreende, em qualquer ordem 5' para 3' e nas mesmas ou diferentes fitas polinucleotídicas, um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de MYF6, um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

[00390] Cláusula 2-7. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 7, em que a MYOCD é uma miocardina projetada.

[00391] Cláusula 2-8. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 7, em que o vetor não compreende nenhum polinucleotídeo de fator de reprogramação diferente de um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de ASCL1, um polinucleotídeo de MYF6, um polinucleotídeo de MEF2C ou um polinucleotídeo de TBX5.

[00392] Cláusula 2-9. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 7, em que o vetor não compreende nenhum outro gene codificador de proteína.

[00393] Cláusula 2-10. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 9, em que o vetor é um vetor policistrônico.

[00394] Cláusula 2-11. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 10, em que o vetor é selecionado de uma nanopartícula lipídica, um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral integrane (LVV), e um LVV não integrante.

[00395] Cláusula 2-12. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 10, em que o vetor é um vetor AAV.

[00396] Cláusula 2-13. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 10, em que o vetor é um LVV integrante ou um LVV não integrante.

[00397] Cláusula 2-14. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 13, em que o vetor é capaz de reprogramar células diferenciadas em células com cardiomiócitos induzidos (iCM).

[00398] Cláusula 2-15. O vetor de acordo com a cláusula 2-14, em que pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20% das células com iCM são α-actinina positivas.

[00399] Cláusula 2-16. O vetor de acordo com a cláusula 2-14 ou 15, em que pelo menos 2%, pelo menos 5% ou pelo menos 8% das células com iCM são cTnT positivas.

[00400] Cláusula 2-17. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 16, em que o polinucleotídeo de ASCL1, se presente, ou o polinucleotídeo de MYF6, se presente, e o polinucleotídeo de MYOCD estão ligados de maneira operável ao mesmo promotor e são expressos em cotranslação.

[00401] Cláusula 2-18. O vetor de acordo com a cláusula 2-2, em que o vetor compreende um polinucleotídeo de MYOCD-2A-ASCL1 ou um polinucleotídeo de ASCL1-2A-MYOCD, ligado de maneira operável ao mesmo promotor.

[00402] Cláusula 2-19. O vetor de acordo com a cláusula 2-3, em que o vetor compreende um polinucleotídeo de MYOCD-2A-MYF6 ou um polinucleotídeo de ASCL1-2A-MYF6, ligado de maneira operável ao mesmo promotor.

[00403] Cláusula 2-20. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 19, em que o polinucleotídeo de ASCL1 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de ASCL1 humano (SEQ ID NO: 2).

[00404] Cláusula 2-21. O vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 19, em que o polinucleotídeo de MYF6 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MYF6 humano (SEQ ID NO: 56).

[00405] Cláusula 2-22. Um sistema de vetor, compreendendo um primeiro vetor policistrônico que codifica um polinucleotídeo de MYOCD e um ou ambos de um polinucleotídeo de ASCL1 ou um polinucleotídeo de MYF6; e um segundo vetor policistrônico compreendendo um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

[00406] Cláusula 2-23. O sistema de vetor de acordo com a cláusula 2-22, em que o primeiro vetor policistrônico compreende um polinucleotídeo de MYOCD-2A-ASCL1 ou um polinucleotídeo de ASCL1-2A-MYOCD.

[00407] Cláusula 2-24. O sistema de vetor de acordo com a cláusula 2-22, em que o primeiro vetor policistrônico compreende um polinucleotídeo de MYOCD-2A-MYF6 ou um polinucleotídeo de ASCL1-2A-MYF6.

[00408] Cláusula 2-25. O sistema de vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-22 a 24, em que o primeiro vetor policistrônico e o segundo vetor policistrônico são, cada um, independentemente selecionados a partir de uma nanopartícula lipídica, um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral integrante (LVV) e um LVV não integrante.

[00409] Cláusula 2-26. O sistema de vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-22 a 25, em que o polinucleotídeo de ASCL1 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de ASCL1 humano (SEQ ID NO: 2).

[00410] Cláusula 2-27. O sistema de vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-22 a 25, em que o polinucleotídeo de MYF6 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MYF6 humano (SEQ ID NO: 56).

[00411] Cláusula 2-28. Um método de indução de um fenótipo de cardiomiócito em células diferenciadas, compreendendo o contato das células diferenciadas com o vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 21.

[00412] Cláusula 2-29. Um método de indução de um fenótipo de cardiomiócito em células diferenciadas, compreendendo o contato das células diferenciadas com o sistema de vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-22 a 27.

[00413] Cláusula 2-30. O método de acordo com a cláusula 2-28 ou 29, em que as células diferenciadas são células in vitro durante a etapa de contato.

[00414] Cláusula 2-31. O método de acordo com a cláusula 2-28 ou 29, em que as células diferenciadas são células in vivo em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia.

[00415] Cláusula 2-32. Um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia, compreendendo o contato das células diferenciadas in vitro com o vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 21 para gerar células com iCM e administrar as células com iCM ao indivíduo.

[00416] Cláusula 2-33. Um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia, compreendendo o contato das células diferenciadas in vitro com o sistema de vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-22 a 27 para gerar células com iCM e administrar as células com ICM ao indivíduo.

[00417] Cláusula 2-34. Um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia, compreendendo a administração do vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 21 ao indivíduo.

[00418] Cláusula 2-35. Um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia, compreendendo a administração do sistema de vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-22 a 27 ao indivíduo.

[00419] Cláusula 2-36. Um kit que compreende o vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-1 a 21 e instruções para uso no tratamento de uma cardiopatia. Cláusula 2-37. Um kit que compreende o sistema de vetor de acordo com qualquer uma das cláusulas de 2-22 a 27 e instruções para uso no tratamento de uma cardiopatia. Conjunto de Modalidades 3:

[00420] Cláusula 3-1. Um polinucleotídeo isolado, compreendendo um polinucleotídeo de MYOCD projetado que codifica uma proteína miocardina projetada tendo um comprimento de no máximo 850 aminoácidos, em que a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação SRF, um domínio SAP e um domínio TAD.

[00421] Cláusula 3-2. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-1, em que a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação Mef2c.

[00422] Cláusula 3-3. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-2, em que:

[00423] Cláusula 3-4. o domínio de interação Mef2c compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 17,

[00424] Cláusula 3-5. o domínio SRF compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 18,

[00425] Cláusula 3-6. o domínio SAP compartilha pelo menos 85%

de identidade com a SEQ ID NO: 19, e

[00426] Cláusula 3-7. o domínio TAD compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 11.

[00427] Cláusula 3-8. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-1 ou 2, em que a proteína miocardina projetada compreende um domínio LZ.

[00428] Cláusula 3-9. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-4, em que o domínio LZ compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 20.

[00429] Cláusula 3-10. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 5, em que a proteína miocardina projetada compreende:

[00430] Cláusula 3-11. um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-413 da miocardina humana (SEQ ID NO: 10), e

[00431] Cláusula 3-12. segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 764-986 da miocardina humana (SEQ ID NO: 11),

[00432] Cláusula 3-13. em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo estão ligados por um ligante compreendendo uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1 a 50 resíduos de aminoácidos.

[00433] Cláusula 3-14. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 5, em que a proteína miocardina projetada compreende:

[00434] Cláusula 3-15. um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-438 da miocardina humana (SEQ ID NO: 12), e

[00435] Cláusula 3-16. segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 764-938 da miocardina humana (SEQ ID NO: 11),

[00436] Cláusula 3-17. em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são ligados por um ligante compreendendo uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1 a 50 resíduos de aminoácidos.

[00437] Cláusula 3-18. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 5, em que a proteína miocardina projetada compreende:

[00438] Cláusula 3-19. um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-559 da miocardina humana (SEQ ID NO: 13), e

[00439] Cláusula 3-20. segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 764-938 da miocardina humana (SEQ ID NO: 11),

[00440] Cláusula 3-21. em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são ligados por um ligante que compreende uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1 a 50 resíduos de aminoácidos.

[00441] Cláusula 3-22. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-6 a 8, em que o ligante consiste em uma ligação peptídica.

[00442] Cláusula 3-23. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-6 a 8, em que o ligante é um polipeptídeo selecionado de G, GG, GGG, GSG, GSS, GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 30), GSSGGS (SEQ ID NO: 31), GGSGSS (SEQ ID NO: 32), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 33), GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 34).

[00443] Cláusula 3-24. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-9, em que a proteína miocardina projetada compreende uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 14 a 16.

[00444] Cláusula 3-25. Um polinucleotídeo isolado, compreendendo um polinucleotídeo de MYOCD projetado que codifica uma proteína miocardina projetada, em que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de pelo menos 50 aminoácidos na região correspondente aos aminoácidos 414-764 da miocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

[00445] Cláusula 3-26. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-12, em que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 414 a cerca de 763 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

[00446] Cláusula 3-27. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-13, em que a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14.

[00447] Cláusula 3-28. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-14, em que a proteína miocardina projetada consiste em uma sequência idêntica à SEQ ID NO: 14.

[00448] Cláusula 3-29. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-12, em que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 439 a cerca de 763 da miocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

[00449] Cláusula 3-30. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-16, em que a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 15.

[00450] Cláusula 3-31. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-17, em que a proteína miocardina projetada consiste em uma sequência idêntica à SEQ ID NO: 15.

[00451] Cláusula 3-32. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-12, em que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 560 a cerca de 763 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

[00452] Cláusula 3-33. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula

3-19, em que a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 16.

[00453] Cláusula 3-34. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-20, em que a proteína miocardina projetada consiste em uma sequência idêntica à SEQ ID NO: 16.

[00454] Cláusula 3-35. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 21, em que a proteína miocardina projetada é uma proteína miocardina projetada funcional.

[00455] Cláusula 3-36. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-22, em que a proteína miocardina projetada funcional é expressa em pelo menos 10% do nível de MYOCD nativs no mesmo sistema de expressão.

[00456] Cláusula 3-37. O polinucleotídeo de acordo com a cláusula 3-22 ou 23, em que a proteína miocardina projetada funcional é capaz de induzir expressão aumentada de pelo menos um marcador do fenótipo de cardiomiócito (a) quando expresso em fibroblastos cardíacos humanos com MEF2C e TBX5 ou TBX5 na presença de um inibidor de TGFβ, opcionalmente SB431542, e um inibidor de Wnt, opcionalmente XAV939, ou (b) quando expresso em fibroblastos cardíacos humanos com ASCL1.

[00457] Cláusula 3-38. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 24, em que o polinucleotídeo está ligado de maneira operável a um promotor.

[00458] Cláusula 3-39. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas 3-1 a 25, em que o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

[00459] Cláusula 3-40. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 25, em que o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo de TBX5.

[00460] Cláusula 3-41. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 25, em que o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo de ASCL1.

[00461] Cláusula 3-42. O polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 28, em que o polinucleotídeo é flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) ou o polinucleotídeo é flanqueado por repetições terminais longas (LTRs).

[00462] Cláusula 3-43. Um vírus recombinante compreendendo o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 42.

[00463] Cláusula 3-44. O vírus recombinante de acordo com a cláusula 3-30, em que o vírus recombinante é um vírus adenoassociado recombinante (rAAV).

[00464] Cláusula 3-45. O vírus recombinante de acordo com a cláusula 3-30, em que o vírus recombinante é um lentivírus.

[00465] Cláusula 3-46. Uma população de células compreendendo o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 29.

[00466] Cláusula 3-47. A população de células de acordo com a cláusula 3-46, em que a porcentagem de células na população que apresenta transientes de cálcio (CaT) em um ensaio de CaT in vitro é pelo menos 2 vezes maior do que a porcentagem de células em uma população de controle de células não compreendendo o polinucleotídeo no mesmo ensaio de CaT in vitro.

[00467] Cláusula 3-48. Um cardiomiócito induzido (iCM), em que o iCM compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 42.

[00468] Cláusula 3-49. Uma composição farmacêutica que compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 42 e um sistema de liberação não viral.

[00469] Cláusula 3-50. Uma composição farmacêutica que compreende o vírus recombinante de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-43 a 45.

[00470] Cláusula 3-51. Um método para gerar um cardiomiócito induzido (iCM), compreendendo o contato de um fibroblasto de mamífero com o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-1 a 42, o vírus recombinante de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-43 a 45 ou a composição farmacêutica de acordo com a cláusula 3-49 ou cláusula 3-37.

[00471] Cláusula 3-52. Um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo, compreendendo a administração da composição farmacêutica de acordo com a cláusula 3-50 ao indivíduo.

[00472] Cláusula 3-53. O método de acordo com a cláusula 3-52, em que o vírus recombinante é administrado por meio de cateterismo intracardíaco.

[00473] Cláusula 3-54. O método de acordo com a cláusula 3-52, em que o vírus recombinante é administrado por meio de injeção intracardíaca.

[00474] Cláusula 3-55. Um vírus adenoassociado recombinante (rAAV), compreendendo um cassete de expressão (conforme representado na FIGURA 13B ou FIGURA 13C), em que o cassete de expressão compreende na ordem de 5' para 3' uma repetição terminal invertida 5' (ITR), um promotor CAG, um íntron SV40, um polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas, um sinal de poliadenilação curto e uma ITR 3', e em que o polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas compreende na ordem 5' para 3' um polinucleotídeo que codifica MyΔ3, um polinucleotídeo que codifica um ligante P2A e um polinucleotídeo que codifica ASCL1.

[00475] Cláusula 3-56. O rAAV de acordo com a cláusula 3-55, em que o cassete de expressão compreende um WPRE.

[00476] Cláusula 3-57. O rAAV de acordo com a cláusula 3-55 ou 56, em que o MyΔ3 compreende a SEQ ID NO: 16.

[00477] Cláusula 3-58. O rAAV de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-55 a 57, em que o ligante 2A compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 23).

[00478] Cláusula 3-59. O rAAV de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-55 a 57, em que o ASCL1 compreende a SEQ ID NO: 1.

[00479] Cláusula 3-60. O rAAV de acordo com a cláusula 3-59, em que o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO: 35 (MyΔ3A AAV).

[00480] Cláusula 3-61. Uma composição farmacêutica compreende o rAAV de acordo com qualquer uma das cláusulas de 3-55 a 60.

[00481] Cláusula 3-62. Um método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo, compreendendo a administração da composição farmacêutica de acordo com a cláusula 3-61 ao indivíduo.

[00482] Os seguintes Exemplos não limitativos ilustram alguns dos trabalhos experimentais envolvidos no desenvolvimento da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação de intensificadores de reprogramação cardíaca humana

[00483] Foi desenvolvido um sistema de rastreamento no qual os fatores que são capazes de induzir a reprogramação cardíaca humana foram identificados por meio da análise quantitativa da expressão do marcador cardíaco. Após três semanas de adição de fatores de reprogramação, um sistema analisador de células de alto rendimento foi utilizado para obter imagens e quantificar a eficiência da reprogramação cardíaca com base na expressão de α-actinina do marcador cardíaco. Foi utilizado este sistema de rastreamento para rastrear uma biblioteca de expressão retroviral que consiste em 1052 cDNAs de quadro de leitura aberto (ORF) que codificam fatores de transcrição humanos (incluindo receptores nucleares), citocinas e reguladores epigenéticos. (Zhou et al., 2017). Foi adicionado retrovírus que codificam os ORFs humanos individuais juntamente com MyMT nos HCFs. Resultados positivos foram definidos como genes que aumentam a porcentagem de células positivas para α-actinina (α- actinina+) em combinação com MyMT ou MyMT+SB/XAV (FIGURA 1A) por um fator de duas vezes ou mais. A classificação primária identificou ASCL1, MYF6, DLX3, DLX6, GATA2 e GATA5 como intensificadores da reprogramação cardíaca humana (FIGURA 1B). A atividade desses seis fatores foi posteriormente confirmada por uma classificação secundária em que marcadores cardíacos adicionais (MYH6, TNNT2, TNNC1, NPPA, TNNI3 e RYR2) foram examinados. ASCL1 e MYF6 foram identificados como os dois resultados mais fortes para intensificar a reprogramação cardíaca da classificação secundária (FIGURA 1C). Exemplo 2: ASCL1 e MYF6 intensificam a reprogramação cardíaca humana e suína

[00484] Visto que ASCL1 e MYF6 foram os dois maiores sucessos para melhorar a reprogramação cardíaca (FIGURA 1C), concentrou-se a atenção em ASCL1 e MYF6 nos estudos a seguir. Foram utilizados fibroblastos cardíacos humanos adultos primários (AHCFs) para avaliar a eficiência de reprogramação da adição de ASCL1 ou MYF6 em combinação com diferentes fatores de reprogramação. A imunocitoquímica mostrou que a adição de ASCL1 ou MYF6 em cima de MyMT gerou ~15% α-actinina+, ~50% cTnT+ cardiomiócitos induzidos (iCMs) após três semanas de reprogramação (FIGURA 2A- 2B). Esta eficiência de reprogramação é muito significativa em relação ao MyMT isoladamente. Eficiência de reprogramação semelhante também foi alcançada utilizando MyMT mais ASCL1 ou MYF6 em fibroblastos cardíacos primários de porco adulto (APCFs) (FIGURA 2C e D). Exemplo 3: Estequiometria ideal de fatores de reprogramação aumenta a eficiência da reprogramação

[00485] Foi demonstrado que a relação relativa (ou estequiometria) dos fatores de reprogramação influencia a eficiência e a qualidade da reprogramação cardíaca. (Wang et al., 2015). Uma relação ideal de fatores de reprogramação correlacionada com maior eficiência de reprogramação e iCMs mais maduros.

Para determinar a relação ideal de MYOCD, ASCL1, MEF2C e TBX5 (MyAMT) para reprogramação, foram manipulados os níveis relativos de expressão da proteína My, A, M e T através da mistura de várias quantidades de retrovírus que expressam um dos quatro fatores de reprogramação e fixação da relação do resto dos três fatores de reprogramação (FIGURA 3A-3E). Foram transduzidos AHCFs com os coquetéis de retrovírus e foram reprogramadas as células durante três semanas.

Os marcadores cardíacos α-actinina e cTnT foram utilizados para indicar a eficiência da reprogramação.

A análise de imunocitoquímica de AHCFs reprogramados com anticorpos contra α-actinina e cTnT mostrou que a eficiência da reprogramação cardíaca foi mais sensível para o nível de expressão de MYOCD e ASCL1. Os dados indicaram que mais expressão de MYOCD ou ASCL1 levou a níveis mais elevados de eficiência de reprogramação.

A eficiência de reprogramação caiu para quase zero quando não havia MYOCD ou ASCL1 (FIGURA 3A, 3B, 3E). A dosagem de MEF2C mostrou um padrão semelhante de eficiência de reprogramação como MYOCD e ASCL1. No entanto, uma quantidade significativa de α-actinina+ e cTnT+ iCMs ainda pode ser detectada, mesmo sem adicionar MEF2C, indicando que a reprogramação cardíaca é menos sensível no nível de expressão de MEF2C (FIGURA 3C, 3E). Ao contrário de MYOCD, ASCL1 e MEF2C, a dosagem de TBX5 mostrou um padrão distinto de eficiência de reprogramação, em que a eficiência de reprogramação foi maximizada em um nível inferior de expressão de TBX5 (FIGURA 3D e E). Coletivamente, os resultados demonstraram que uma estequiometria ideal de My, A, M e T, definida por alto nível de proteína de MYOCD e ASCL1, níveis médios de MEF2C e um baixo nível de TBX5, aumenta significativamente a eficiência da reprogramação cardíaca. Exemplo 4: Reprogramação cardíaca por fatores de reprogramação em vetores policistrônicos dois em um

[00486] A terapia gênica utilizando vetores separados para expressar muitos genes diferentes não é prática para o desenvolvimento clínico. Os AAVs são os vetores de terapia gênica mais populares que foram utilizados em muitas pesquisas clínicas até o momento [Dunbar, 2018]. No entanto, a capacidade de acondicionamento de AAVs é de apenas ~4,7 kb, portanto, ajustar vários fatores de reprogramação nos poucos vetores AAV é um grande desafio para a reprogramação cardíaca utilizando AAV. Aproveitou-se o sistema policistrônico de peptídeo 2A para colocar coquetéis de reprogramação MyAMT em dois vetores AAV. Devido à limitação de tamanho do AAV e espaço necessário para o promotor e outros elementos reguladores, MYOCD (3,0 kb) só pode ser emparelhado com ASCL1 (0,7 kb) para se ajustar a um vetor AAV, enquanto MEF2C (1,4 kb) e TBX5 (1,5 kb) são muito grandes para emparelhar com MYOCD, mas juntos podem caber em outro vetor AAV. Foi demonstrado que a ordem dos fatores nos polinucleotídeos policistrônicos 2A determinou o nível de expressão do gene (Wang et al., 2015). Demonstrou-se que a estequiometria ideal de My, A, M e T aumenta significativamente a eficiência da reprogramação cardíaca (FIGURA 3A-3E). Para alcançar a estequiometria ideal nos vetores policistrônicos 2A, foram geradas todas as combinações possíveis de My+A e M+T com as mesmas sequências 2A em um único quadro de leitura aberto (My-P2A-A, A-P2A-My, M-P2A-T e T-P2A-M). Transduziram-se AHCFs com combinações retrovirais que consistem em todas as quatro combinações possíveis de vetores policistrônicos,

incluindo My-P2A-A + M-P2A-T, My-P2A-A + T-P2A-M, A-P2A-My + M- P2A-T e A-P2A-My + T-P2A-M. Foi analisada a expressão dos marcadores cardíacos α-actinina e cTnT por imunocitoquímica após três semanas de reprogramação. Descobriu-se que o My-P2A-A + M- P2A-T foi a combinação ideal e gerou ~35% de α-actinina+ iCMs e ~4% de cTnT+ iCMs (FIGURA 4A-4B). A análise de Q-PCR de um painel de 21 marcadores cardíacos também demonstrou que My-P2A- A + M-P2A-T é a combinação de vetor policistrônico ideal com base em sua capacidade de induzir os níveis mais altos de expressão da maioria dos genes cardíacos (FIGURA 4C). Exemplo 5: Reprogramação cardíaca por um único vetor policistrônico

[00487] Procurou-se simplificar ainda mais os vetores de reprogramação através da colocação de todos os fatores de reprogramação em uma única unidade de transcrição policistrônica. Como o experimento de estequiometria (FIGURA 3A-3E) mostrou que MYOCD e ASCL1 são os fatores de reprogramação mais importantes nos coquetéis MyAMT, e iCMs foram gerados mesmo sem adicionar MEF2C ou TBX5, embora com menor eficiência de reprogramação, especulou-se que apenas MYOCD e ASCL1 (MyA) são capazes de reprogramar AHCFs em iCMs. Para testar essa hipótese, foi transduzido retrovírus MYOCD e ASCL1 em AHCFs. Curiosamente, ~10% de α-actinina+ iCMs e ~30% de cTnT+ iCMs foram gerados por coquetéis MyA após três semanas de reprogramação (FIGURA 5A- 5B). Além disso, testaram-se os vetores policistrônicos que codificam My e A com ordens diferentes (My-P2A-A e A-P2A-My), e My-P2A-A mostrou uma eficiência de reprogramação muito melhor do que A- P2A-My (FIGURA 5C-5D). Coletivamente, esses dados sugerem que a combinação MyA é capaz de reprogramar fibroblastos cardíacos humanos em iCMs com alta eficiência.

Exemplo 6: Reprogramação cardíaca por um vetor policistrônico que expressa quatro genes

[00488] Os dados mostram que a ordem dos fatores de reprogramação significativamente em um vetor policistrônico com dois fatores pode influenciar a eficiência da reprogramação cardíaca (FIGURA 3A-3E, FIGURA 4A-4C). Uma vez que MyAMT mostrou melhor capacidade de reprogramação do que MyA (FIGURA 4A-4C, FIGURA 5A-5D), procurou-se determinar ainda a ordem ideal de quatro fatores, MyAMT, em um único polinucleotídeo policistrônico. Geraram-se todas as 24 combinações possíveis de My, A, M, T com diferentes sequências de salto de translação (P2A, T2A e E2A) em um único polinucleotídeo. Transduziram-se AHCFs com GFP ou uma das 24 combinações de retrovírus policistrônicos My, A, M, T e analisou-se a expressão de marcadores cardíacos α-actinina e cTnT por imunocitoquímica após três semanas de reprogramação. Descobriu-se que três dos 24 vetores policistrônicos, A-P2A-T-T2A-My-E2A-M, T- P2A-A-T2A-My-E2A-M e M-P2A-A-T2A-My-E2A-T, são as melhores combinações que geraram ~15% de α-actinina+ iCMs e ~15% de cTnT+ iCMs (FIGURA 6A-6B). Os vetores policistrônicos não otimizados, tais como My-P2A-M-T2A-T-E2A-A, quase não reprogramaram fibroblastos em iCMs (FIGURA 6A-6B), destacando a importância da estequiometria de fatores de reprogramação para reprogramação cardíaca. Ao utilizar a matriz de pontuação da posição de fator que reflete a eficiência de reprogramação média para um fator de reprogramação particular em uma posição particular, descobriu-se que MYOCD prefere estar na posição 3, ASCL1 prefere estar na posição 2 e ambos MEF2C e TBX5 preferem estar na posição 1 ou posição 4. Exemplo 7: Liberação in vivo de coquetéis de reprogramação promove o reparo do coração

[00489] Foi examinado se a expressão forçada de coquetéis de reprogramação que foi otimizada acima em sem cardiomiócitos poderia levar a uma melhora mensurável na função de corações lesados (FIGURA 7A). Os camundongos foram submetidos à ligação da artéria descendente anterior esquerda (LAD) seguida por injeção intramiocárdica de retrovírus GFP, ASCL1, MyMT, MyMTA ou MyA, cada um codificando um único fator. A função cardíaca após MI foi avaliada de forma cega pela fração de ejeção (EF), volume sistólico final (ESV) e volume diastólico final (EDV) utilizando ecocardiografia. Antes da cirurgia de MI, a função cardíaca de cada coorte de camundongos era igual através da avaliação de EF, ESV e EDV por ecocardiografia. Após a cirurgia de MI, a função cardíaca de camundongos injetados com GFP diminuiu e atingiu um valor estável duas semanas após o MI. Em contraste, a infecção do coração lesado com retrovírus MyMT, MyAMT ou MyA abrandou a piora da função cardíaca duas semanas após o MI. (FIGURA 7B-D). A melhora funcional cardíaca foi atrasada e menos completa com MyMT cinco semanas após o MI (FIGURA 7B-7D), consistente com a eficiência reduzida desta combinação de fator de transcrição na reprogramação in vitro (FIGURA 2A-2D). A injeção de coração lesado com vetor que expressa ASCL1 isoladamente não teve nenhum efeito na função cardíaca em comparação com GFP (FIGURA 7B-7D). Esses dados sugerem que os coquetéis de reprogramação MyMT, MyMTA e MyA promovem o reparo cardíaco e a adição de ASCL1 em combinação com a Miocardina fornece benefícios para a melhora funcional cardíaca in vivo.

MATERIAIS E MÉTODOS

[00490] Isolamento de fibroblastos cardíacos primários de humanos adultos e de porco. Para o isolamento de fibroblastos cardíacos humanos adultos (AHCFs) ou fibroblastos cardíacos de porco adulto (APCFs), os ventrículos esquerdos de seres humanos ou de porco foram picados em pequenos pedaços e digeridos em meio de digestão de fibroblastos cardíacos (10 µg/ml Liberase TH, 10 µg/ml Liberase TM, 1 unidade/ml DNase I, 0,01% Polaxômero) durante 1 h a 37 oC. Após a digestão, as células foram filtradas através de uma peneira de 70 µM para dentro de um tubo falcon de 50 ml. As células foram peletizadas por rotação durante 5 min em 1200 × g e colocadas em meio de crescimento de fibroblastos. O meio foi substituído a cada dois dias. Quatro dias depois, AHCFs ou APCFs foram congelados ou plaqueados novamente para transdução viral.

[00491] Produção de retrovírus. Para a produção de retrovírus, células PLATINUM-A™ (PLAT-A™) da Cell Biolabs, Inc. foram semeadas em placas de cultura (5 × 104 células/cm2) um dia antes da transfecção em DMEM suplementado com FBS a 10%. As células alcançaram ~60% de confluência no dia da transfecção. Os plasmídeos de DNA (com base no vetor pMXs-ORF da Cell Biolabs, Inc.) foram transfectados em células Platinum-A utilizando o reagente de transfecção Promega Corp. FUGENE® HD. Quarenta e oito horas após a transfecção, meio viral que foi filtrado através de um filtro de 0,45 µm e polibreno foram adicionados na concentração de 8 µg/ml.

[00492] Reprogramação celular. Para a reprogramação cardíaca in vitro, AHCFs ou APCFs foram semeados em placas ou pratos de cultura em uma densidade de 5 × 103/cm2 em meio de crescimento de fibroblastos (dia -1). Um dia após o plaqueamento das células (dia 0), o meio de crescimento de fibroblastos foi removido e o meio de vírus foi adicionado. Um dia após a transdução viral (dia 1), o meio de vírus foi substituído por meio de iCM composto por 4 partes de meio de eagle modificado por Dubelcco (DMEM) e 1 parte de GIBCO® Media 199, 10% de FBS, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de penicilina/estreptomicina, a cada dois dias até o dia 4. No dia 4, o meio foi alterado para 75% de meio de iCM e 25% de RPMI + B27. No dia 7, o meio foi alterado para 50% de iCM e 50% de RPMI + B27. No dia 11, o meio foi alterado para 25% de iCM e 75% de RPMI + B27. No dia 14, o meio foi alterado para RPMI + B27 + FFV (10ng/ml de rhFGF, 15 ng/ml de rhFGF-10 e 5 ng/ml de rhVEGF) para todos os dias até o dia 21.

[00493] Imunocitoquímica. Para imunocitoquímica, as células foram fixadas em paraformaldeído 4% durante 20 min e permeabilizadas com Triton-X100 0,1% na temperatura ambiente durante 30 min. As células foram lavadas com PBS três vezes seguido de bloqueio com albumina de soro bovino a 1% (BSA) durante 1 h. As células foram então incubadas com anticorpo monoclonal de camundongo anti-troponina T cardíaca (cTnT) (Thermo Scientific, MA5-12960) em diluições de 1:200 ou anticorpo anti-α-actinina de camundongo (Sigma, A7811) em diluições de 1:200 com BSA 1% durante 1 h. Após lavagem com PBS três vezes, as células foram incubadas com Alexa Fluor 594 de burro anti-camundongo (Invitrogen, A21203) em diluições de 1:200 em BSA 1% durante 1 h. As células foram então fotografadas e quantificadas utilizando uma leitora multimodal de formação de imagem de células, CYTATION™ 5 (BioTek).

[00494] Medição quantitativa de mRNA. O RNA total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (QIAGEN®) de acordo com o protocolo do vendedor. Os RNAs foram retrotranscritos para cDNA utilizando iScript SUPERMIX™ (BIO-RAD®). A qPCR foi executada utilizando TAQMAN® Gene Expression Master Mix (THERMO SCIENTIFIC®), os níveis de mRNA foram normalizados em comparação com GAPDH mRNA.

[00495] Quantificação e análise estatística. Todos os dados são apresentados como média com erro padrão da média (SEM) e têm n = 2 a 3 por grupo. Os valores de P foram calculados com teste t não pareado/bidirecional ou análise de variância unilateral (ANOVA). As análises estatísticas foram executadas no pacote de software GRAPHPAD PRISM® 7 (GRAPHPAD SOFTWARE™). Um valor de P < 0,05 foi considerado significativo em todos os casos após as correções terem sido feitas para múltiplas comparações de pares.

[00496] Cirurgia de MI, injeção intramiocárdica de retrovírus e ecocardiografia. As cirurgias foram executadas em camundongos machos CHARLES RIVER® CD-1 IGS machos de 9 a 10 semanas de idade. Os camundongos foram anestesiados com 2,4% de isoflurano/97,6% de oxigênio e colocados em posição supina em uma almofada aquecida (37 oC). Os animais foram intubados com um cateter intravenoso de calibre 20 e ventilados com um ventilador de camundongo (MINIVENT™, Harvard Apparatus, Inc.). O MI foi induzido por ligadura permanente da artéria descendente anterior esquerda (LAD) com sutura de prolene 7-0. Cópias do genoma (GC) concentrado 1010 de retrovírus em 20 µl de PBS (concentração = 5 × 1011 GC/ml) (GFP, ASCL1, MyMT, MyAMT ou MyA) foram injetadas no miocárdio através de uma seringa de insulina com uma agulha calibre 29 incorporada (BD). A injeção com uma dosagem completa foi realizada ao longo do limite entre a zona de infarto (IZ) e a zona de fronteira (BZ) com base na área de infarto branqueada após a oclusão da artéria coronária. Após a injeção, o tórax foi fechado com suturas e o camundongo foi deixado se recuperar com o ventilador de camundongo e almofada de aquecimento. Todos os procedimentos cirúrgicos foram executados sob condições assépticas. A função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia transtorácica bidimensional em camundongos conscientes utilizando um sistema de formação de imagem VISUALSONICS™ VEVO® 3100. A fração de ejeção (EF), o volume sistólico final (ESV) e o volume diastólico final (EDV) foram utilizados como índices da função contrátil cardíaca.

Exemplo 8: Comparação de vírus lentivirais e adenoassociados que expressam MyA

[00497] Comparou-se a expressão de MYOCD de vetores lentivirais ou AAV que codificam MYOCD e uma segunda proteína. Os vetores policistrônicos com MYOCD e ASCL1 foram gerados em um formato de lentivírus não integrante (NIL) utilizando o cassete de expressão representado na FIGURA 8A. O lentivírus é não integrante porque a integrase incluída no sistema de acondicionamento baseado em plasmídeo incluiu uma mutação para evitar a integração do construto do gene no genoma das células transduzidas. O mesmo construto de expressão representado na FIGURA 8A é, em algumas modalidades, utilizado para produzir um lentivírus integrante. Neste construto lentiviral, MYOCD-2A-ASCL1 foi colocado após um íntron SV40 ("SV40 Int") sob o controle de um promotor CAG com um WPRE flanqueado por repetições de terminal longo 5' e 3' (LTRs). A LTR 3' opera como um sinal de poliadenilação neste construto.

[00498] Um construto de AAV análogo (FIGURA 8B) foi gerado através da colocação do mesmo polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 em um vetor AAV, no qual o cassete de expressão é flanqueado por repetições terminais invertidas 5' e 3' (ITR). Devido ao limite de acondicionamento do vetor AAV, o WPRE foi removido e a sequência de poliadenilação selecionada foi um sinal poliA curto ("A") (SEQ ID NO: 75). Construtos monocistrônicos de controle com apenas MYOCD (e não ASCL1) também foram produzidos (não mostrados). O AAV de controle incluiu um WPRE e usou o bGH poliA (SEQ ID NO: 85) no lugar do poliA curto do AAV policistrônico.

[00499] As células foram transfectadas com o vetor NIL (FIGURA 8C) ou AAV (FIGURA 8D) e analisadas por immunoblottiing utilizando anticorpos contra MYOCD, ASCL1 ou o controle de carga GAPDH. Os vetores NIL monocistrônicos (My) e policistrônicos (MyA) expressaram

MYOCD no mesmo nível (FIGURA 8C). A proteína MYOCD foi expressa por células transduzidas com AAVs monocistrônicos (M) e policistrônicos (MyA), mas a expressão da proteína MYOCD pelo vetor MyA AAV policistrônico foi menor do que a expressão da proteína MYOCD pelo MyA NIL policistrônico lentiviral (FIGURA 8C), pelo My NIL monocistrônico lentiviral (FIGURA 8C), ou pelo vírus monocistrônico adenoassociado My AAV (FIGURA 8D). Uma faixa de alto peso molecular atribuída a MYOCD-2A-ASCL1 não clivado foi observada (seta preta na FIGURA 8D).

[00500] A capacidade de AAV MyA ou NIL MyA para induzir um fenótipo de cardiomiócito em células transduzidas foi avaliada por detecção microscópica de imunofluorescência quantitativa de α- actinina (FIGURA 8E), utilizando o anticorpo primário indicado e um anticorpo secundário ALEXA FLUOR® 594 em uma leitora de formação de imagem BIOTEK CYTATION™ 5, e o mRNA foi quantificado através da reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) utilizando iniciadores específicos de gene para TNNC1, TNNT2, PLN, NPPA ou MYH6 (Tabela 4). Tabela 4. Expressão de Marcadores Genéticos TNNC1 TNNT2 PLN NPPA MYH6 No Inf 1,1 0,9 0,8 0,3 1,4 No Inf 0,9 1,1 1,2 3,8 0,7 NIL MyA - 1,5 × 109 GC 12,3 26,8 12,1 1114,7 47,8 NIL MyA - 1,5 × 109 GC 11,7 23,0 9,0 963,8 16,3 NIL MyA - 5 × 109 GC 80,0 102,6 30,0 4405,6 64,9 NIL MyA - 5 × 109 GC 74,3 120,2 30,1 5436,8 64,5 AAV MyA - 5 × 109 GC 5,1 11,7 4,4 322,6 16,1 AAV MyA - 5 × 109 GC 2,4 8,9 4,2 327,4 8,4 AAV MyA - 2,5 × 1010 GC 8,0 20,0 7,2 524,4 8,6 AAV MyA – 2,5 × 1010 GC 8,2 23,3 8,8 672,5 1,6

[00501] As amostras de controle foram não infectadas (No Inf). A transdução foi executada com 1,5 × 109, 5 × 109 ou 2,5 × 1010 cópias do genoma (GC) por 30.000 células (uma cavidade). A FIGURA 8E mostra que NIL MyA (2,5 × 1010 GC não testadas) induziu a expressão de α-actinina em uma fração maior de células do que AAV MyA (1,5 × 109 GC não testadas). A Tabela 4 mostra que NIL MyA induziu maior expressão de marcadores associados ao fenótipo de cardiomiócitos do que AAV MyA. Exemplo 9: Projeto e teste de proteínas miocardina projetadas com deleções internas

[00502] A FIGURA 9A mostra um esquema de domínio de MYOCD humana do tipo selvagem. Os domínios RPEL N-terminal (RPxxxEL) atuam como mediador da ligação MEF2C. Os motivos básicos (++) e poliglutamina (Q) são críticos para a interação de SRF, enquanto GATA4 interage com MYOCD por meio de um domínio marcado "Gata4 Interact I" que inclui o domínio SAP (SAF-A/B, Acinus e PIAS) e também com um segundo domínio de interação marcado “Gata4 Interact II” contendo o zíper de leucina (LZ). O C-terminal contém um domínio de transativação (TAD). A isoforma da proteína nativa expressa no tecido cardíaco humano possui 986 aminoácidos de comprimento.

[00503] Para aumentar a potência de MyA AAV, três variantes de miocardina com deleções internas foram projetadas e testadas em AAV. MyΔ1 possui uma deleção dos resíduos 414 a 763 (FIGURA 9B), que deleta a maior parte de todo o segundo domínio de interação GATA4. MyΔ2 possui uma deleção dos resíduos 439 a 763 (FIGURA 9C), que também deleta a maior parte de todo o segundo domínio de interação GATA4. MyΔ3 possui uma deleção dos resíduos 560 a 763 (FIGURA 9D), que também deleta a maior parte de todo o segundo domínio de interação GATA4, mas retém o domínio LZ.

[00504] A FIGURA 10A mostra por imunomarcação que, apesar de fundir diversas partes da sequência de codificação, os três mutantes de deleção interna geram a proteína miocardina estável. Os lisados foram produzidos a partir de células HEK293T transfectadas transitoriamente durante 48 horas. A FIGURA 10B mostra microscopia de imunofluorescência de proteínas miocardina nativas e projetadas. MyΔ1, MyΔ2 e MyΔ3 estão localizados no núcleo da célula de maneira adequada, assim como a proteína miocardina nativa.

[00505] Vetores retrovirais que codificam a miocardina nativa (MYOCD) ou uma das três proteínas miocardina projetadas com uma deleção interna (MyΔ1, MyΔ2 ou MyΔ3) foram gerados. A coinfecção de uma linhagem celular de fibroblasto cardíaco humano (HCF) foi utilizada para induzir a expressão de MYOCD, MEF2C e TBX5 (MyMT); MyΔ1, MEF2C e TBX5 (MyΔ1MT); MyΔ2, MEF2C e TBX5 (MyΔ2MT); ou MyΔ3, MEF2C e TBX5 (MyΔ3MT). A coinfecção foi executada na presença de duas moléculas pequenas, o inibidor de TGF-beta SB431542 e o inibidor de Wnt XAV939, que mostraram intensificar a reprogramação cardíaca em células de camundongo e humanas (MyMT+SB/XAV) (Mohamed et al., Circulation. 135:978-95 (2017); Int’l Patent Appl. No. PCT/US2017/025132).

[00506] Os transientes de cálcio foram avaliados conforme descrito anteriormente. Qian, L., et al. (2012) Nature 485:593-598. Resumidamente, miócitos isolados foram carregados com Fluo-4 durante 30 min na temperatura ambiente antes de serem transferidos para a câmara de superfusão. A solução de carga continha uma mistura 1:10 de Fluo-4 AM 5 mM em DMSO seco e concentrado Powerload™ (Invitrogen), que foi diluído 100 vezes em solução extracelular de Tyrode contendo miócitos suspensos. Os transientes de cálcio foram evocados pela aplicação de pulsos de voltagem em 1 Hz entre fios de platina colocados em cada lado da célula de interesse e conectados a um estimulador de campo (IonOptix, Myopacer). Os transientes de fluorescência Fluo-4 foram registrados por meio de um conjunto de filtros padrão (#49011 ET, Chroma Technology). Para cada replicação, oito campos de células foram fotografados durante vinte segundos.

[00507] A FIGURA 11 indica que fibroblastos cardíacos humanos transduzidos com MEF2C, TBX5 e miocardina nativa ou projetada apresentam transientes de cálcio robustos após 1 semana ou 3 semanas de reprogramação. Concluímos que MyMT+SB/XAV gerou cardiomiócitos induzidos (iCM) mesmo quando MYOCD nativa é substituída por MyΔ1, MyΔ2 ou MyΔ3.

[00508] Experimentos semelhantes foram executados com miocardina nativa ou projetada e TBX5 na presença de SB431542 e inibidor de Wnt XAV939, mas sem MEF2C. A coinfecção foi utilizada para induzir a expressão de MYOCD e TBX5 (MyT), MyΔ1 e TBX5 (MyΔ1T), MyΔ2 e TBX5 (MyΔ2T) ou MyΔ3 e TBX5 (MyΔ3T) na presença de pequenas moléculas (+ SB/XAV). Os perfis de expressão foram medidos por qPCR conforme descrito no Exemplo 7. A FIGURA 12A demonstra que fibroblastos cardíacos humanos transduzidos com polinucleotídeos que codificam TBX5 e MyΔ3 apresentaram um perfil transcricional comparável aos transduzidos com TBX5 e MYOCD nativa. A FIGURA 12B mostra microscopia de imunofluorescência de células transduzidas com MyT ou MyΔ3T na presença de pequenas moléculas do mesmo experimento. Fibroblastos cardíacos transduzidos com TBX5 e MYOCD nativa, TBX5 e MyΔ2, ou TBX5 e MyΔ3 apresentam estruturas de α-actinina comparáveis. Exemplo 10: Reprogramação de Fibroblastos Cardíacos Humanos com MyΔ3A baseado em AAV

[00509] O vetor AAV mostrado na FIGURA 8B, que é reproduzido na FIGURA 13A (MyA ΔWPRE curto A) foi modificado pela substituição de MYOCD nativq por um polinucleotídeo que codifica uma miocardina manipulada com uma deleção interna dos resíduos

560 a 763 (MyΔ3A ΔWPRE curto A; FIGURA 13B), ou esta substituição e adição de um WPRE (MyΔ3A WPRE curto A; FIGURA 13C). Vetores de controle com MYOCD nativa, WPRE e sinal bGH poliA (My; não mostrado); ou MYOCD nativa e poliA curto, mas nenhum WPRE (My ΔWPRE A curto; não mostrado) também foram gerados.

[00510] Substituição de MYOCD do tipo selvagem por MyΔ3 na miocardina reforçada com cassete de AAV (FIGURA 14A) e expressão de proteína ASCL1 (FIGURA 14B) com base em immunoblotting com anticorpos específicos de MYOCD ou ASCL1. O vetor AAV sem proteína miocardina expressa WPRE, embora em um nível inferior do que o vetor de controle com WPRE (My em comparação com My ΔWPRE curto A). A). A micocardina projetada com deleção interna (MyΔ3A ΔWPRE curto A) é expressa em um nível mais alto em comparação com MYOCD nativa em vetores sem WPRE. A adição de uma miniatura WPRE (WPRE3) à construção MyΔ3A AAV (MyΔ3A WPRE3 curto A) não teve um efeito adicional robusto. Uma faixa de maior peso molecular correspondente a MyΔ3-2A-ASCL1 não clivada também é observada (seta preta na FIGURA 14A). Substituir MYOCD nativa por MyΔ3 aumenta de forma semelhante a expressão de ASCL1 (FIGURA 14B). A faixa de maior peso molecular para MyΔ3- 2A-ASCL1 também é observada na imunomarcação (seta preta na FIGURA 14B).

[00511] O vetor de MYOCD nativa acrescido de ASCL1 (MyA ΔWPRE curto A; agora rotulado AAV MyA) e o vetor de miocardina projetada acrescido de ASCL1 (MyΔ3A ΔWPRE curto A; agora rotulado MyΔ3A) foram ainda testados quanto à sua capacidade de induzir um fenótipo de cardiomiócito induzido por α-actina+ cTnT+ (iCM) na linhagem celular HCF por imunocitoquímica, conforme descrito no Exemplo 7. A Tabela 5 demonstra que MyΔ3A aumentou a expressão de vários fatores de reprogramação em comparação com MyA em várias multiplicidades de infecção (MOI). Tabela 5: Expressão de Fatores de Reprogramação Vetor (MOI) TNNT2 MYH6 NPPA PLN TNNC1 ACTC1 CASQ2 CSPR3 MYH7 Nenhuma infecção 1,0 1,0 2,2 0,9 0,9 1,2 1,4 1,7 0,2 Nenhuma infecção 1,0 1,0 0,6 1,2 1,2 0,9 0,8 2,5 1,7 Nenhuma infecção 0,8 0,9 1,8 1,0 0,9 1,0 0,9 0,2 2,7 AAV MyA 10k 12,5 2,6 987,0 4,6 7,0 32,0 55,2 6,1 2,3 AAV MyA 10k 14,0 15,7 1257,6 5,5 13,3 29,3 98,3 3,2 1,7 AAV MyA 10k 15,7 8,4 1085,4 6,1 13,6 41,5 66,2 1,7 0,1 AAV MyA 40k 21,9 13,1 4135,0 7,2 28,4 47,4 96,9 3,7 2,5 AAV MyA 40k 15,8 23,7 1237,6 4,7 16,5 35,7 74,1 4,4 2,8 AAV MyA 40k 19,9 21,5 2996,0 6,1 14,7 42,6 105,1 4,1 - AAV MyA 160k 50,0 25,1 5979,8 12,4 45,6 132,8 206,9 4,4 4,3 AAV MyA 160k 46,6 19,1 7650,1 8,6 45,3 110,7 263,8 7,0 0,2 AAV MyA 160k 43,6 41,9 4964,5 12,1 27,5 106,9 239,4 7,5 3,2 AAV My∆3A 10k 94,5 147,9 14423,4 16,7 125,0 163,9 488,8 8,2 9,2 AAV My∆3A 10k 51,1 60,9 5759,0 10,5 56,3 101,5 277,1 8,0 7,0 AAV My∆3A 10k 55,0 74,4 11600,2 9,7 70,9 110,1 335,7 9,1 6,0 AAV My∆3A 40k 112,0 164,7 26318,9 18,9 210,4 244,7 642,5 10,5 17,3 AAV My∆3A 40k 114,1 171,1 23530,4 20,8 153,3 241,2 658,9 13,9 8,4 AAV My∆3A 40k 92,0 114,2 14123,5 17,9 136,8 152,8 573,1 7,8 12,8 AAV My∆3A 160k 236,3 330,2 47673,8 31,1 308,8 380,9 1147,3 17,4 25,7 AAV My∆3A 160k 150,8 408,3 32839,6 27,4 254,1 457,1 1082,5 17,8 9,4 AAV My∆3A 160k 333,0 438,6 77995,5 48,8 523,2 785,8 1641,8 14,1 22,2

[00512] Esta expressão aumentada do fator de reprogramação se correlacionou com o aumento da capacidade de reprogramação de fibroblastos cardíacos de MyΔ3A em comparação com MyA com base na medição de imunofluorescência quantitativa de células α-actinina+ (FIGURA 14C) ou células cTnT+ (FIGURA 14D).

[00513] A capacidade de reprogramação intensificada da reprogramação baseada em AAV com MyΔ3A foi ainda validada por comparação direta de AAV com NIL. A expressão baseada em AAV de

MyΔ3A superou a reprogramação baseada em NIL com base na análise imunofluorescente da porcentagem de células α-actinina+ ou porcentagem de células cTnT+ (FIGURA 15). Isto contrasta com o desempenho inferior de AAV em comparação com NIL observado com MYOCD nativa (FIGURA 8E). Exemplo 11: Reprogramação de Fibroblastos Cardíacos Humanos com MyMyf6 baseado em AAV

[00514] Uma biblioteca de aproximadamente 1.000 genes codificadores de proteínas humanas foi rastreada quanto à atividade de reprogramação em combinação com MYOCD isoladamente por transdução de retrovírus que codificam MYOCD e cada um dos ~1.000 genes em fibroblastos cardíacos. Os ~1.000 genes codificadores de proteínas humanas foram testados quanto à sua capacidade de reprogramar fibroblastos cardíacos humanos testados pela expressão de cTnT e α-actinina. Os resultados para os dezoito melhores fatores são mostrados (FIG 16A). ASCL1 e MYF6 mostram atividade robusta em combinação com MYOCD e nenhum outro gene codificador de proteína heteróloga. A expressão de cTnT e de α-actinina foram cada uma quantificada por Z-Score. A FIGURA 16B mostra imagens de imunocitoquímica representativas de fibroblastos cardíacos humanos adultos reprogramados (AHCFs) duas semanas após a infecção com retrovírus que expressam MYOCD (My); ASCL1 isoladamente (A); MYOCD e ASCL1 (My/A); ou MYOCD e MYF6 (My/Myf6). A Tabela 6 mostra a análise da expressão do gene cardíaco em células reprogramadas utilizando My/A ou My/Myf6, cada uma expressa a partir de um único vetor retroviral. Tabela 6: Expressão de Marcadores Genéticos MyA MyMyf6 NPPA 21000 29 ACTC1 15000 8000 PLN 1000 380

MyA MyMyf6 TNNT2 160 49 CASQ2 77 30 TNNC1 49 23 MYH7 42 96 MYH6 26 2,3 SCN5A 24 4,0 NPPB 9,7 2,0 ACTN2 6,2 13

[00515] Os AHCFs foram infectados com retrovírus que codificavam MYOCD-2A-ASCL1 (MyA) ou MYOCD-2A-MYF6 (MyMyf). As células reprogramadas foram cultivadas durante três semanas. Os níveis de transcrição de genes marcadores cardíacos (NPPA, ACTC1, PLN, TNNT2, CAQ2, TNNC1, MYH6, MYH7, SCN5A, NPPB) foram determinados por q-PCR.

[00516] Exemplo 12: Tratamento de Infarto do miocárdio

[00517] Os vetores virais para expressão de miocardina e ASCL1 foram testados in vivo como um tratamento para infarto do miocárdio (MI). Os vetores virais adenoassociados (AAV) foram construídos por cotransfecção de células HEK293T com um plasmídeo PACG5 que codifica o gene rep de AAV2 e o gene cap de AAV5 e pHelper que codifica o gene de adenovírus E4, E2a e VA junto de, individualmente, cada um dos os três plasmídeos tendo um cassete de expressão de teste flanqueado pelas repetições terminais invertidas (ITRs) de AAV2. Esta cotransfecção gerou partículas virais AAV5 capazes de liberar cada um dos três cassetes de expressão. O cassete de expressão de controle negativo codificou a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controle de um promotor CAG. Dois cassetes de expressão para miocardina e ASCL1 foram testadas. Em ambos os cassetes de expressão testados, a miocardina projetada MyΔ3 foi utilizada para reduzir o tamanho do cassete de expressão.

[00518] O primeiro cassete de expressão testado foi um cassete de expressão bicistrônico (FIGURA 17A), que colocou um polinucleotídeo (SEQ ID NO: 72) que codifica MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) sob o controle transcricional de um promotor CAG (SEQ ID NO: 67) com um íntron SV40 interveniente (SEQ ID NO: 73) e um sinal bGH polyA (SEQ ID NO: 85). Este primeiro cassete de expressão incluiu ainda 3′ para o sinal de poliA MyΔ3, um polinucleotídeo (SEQ ID NO: 2) que codifica ASCL1 (SEQ ID NO: 1) sob o controle transcricional de um promotor SCP (SEQ ID NO: 68) e um sinal poliA curto (SEQ ID NO: 74). Nenhuma sequência WPRE foi utilizada neste construto.

[00519] O segundo cassete de expressão testado foi um cassete de expressão monocistrônico (FIGURA 18A) semelhante àquele do Exemplo 10, que colocou um polinucleotídeo (SEQ ID NO: 72) que codifica MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) seguido por uma sequência de polinucleotídeo (SEQ ID NO: 22) que codifica um peptídeo 2A (SEQ ID NO: 23) e, em seguida, um polinucleotídeo (SEQ ID NO: 2) que codifica ASCL1 (SEQ ID NO: 1). A sequência de polinucleotídeo completa deste quadro de leitura aberto é SEQ ID NO: 35, que codifica a sequência de polipeptídeo SEQ ID NO: 57. Este segundo cassete de expressão colocou esta sequência de polinucleotídeo MyΔ3-2A- ASCL1 sob o controle transcricional de um promotor CAG (SEQ ID NO: 67) com um íntron SV40 interveniente (SEQ ID NO: 73) e um sinal poliA curto 3' (SEQ ID NO: 74). Nenhuma sequência WPRE foi utilizada.

[00520] Como um modelo para o MI, os camundongos CD-1 foram gerados através da ligação da artéria descendente anterior esquerda (LAD), conforme descrito em Gao et al. Cardiovasc Res. 45:330-38 (2000) (camundongos); Litwin et al. Circulation. 89:345-54 (1994) (ratos); e Hood et al. Cardiovasc Drugs Ther. 6:233-37 (1992) (cães). A ligação desproveu o coração de oxigênio, provocando danos imediatos ao coração. Foi demonstrado que esse dano reflete com precisão o dano sofrido por um coração humano durante o MI. (mesmas citações) Além disso, este modelo experimental é conhecido na técnica por ser uma previsão da resposta ao tratamento para insuficiência cardíaca (por exemplo, insuficiência cardíaca isquêmica crônica).

[00521] Após a ligação do coração, os camundongos foram injetados por meio intramiocárdico com o vetor de controle negativo (AAV5:GFP) ou o vetor bicistrônico (rotulado AAV5:MyΔ3A) em uma dose de 1,2 x 1011 cópias do genoma (GC). A administração sistêmica de um vetor, em particular um vetor capaz de transcitose (tal como, sem limitação, AAV8, AAV9, AAVrh10 ou variantes selecionadas de qualquer sorotipo AAV conhecido) seria esperada para alcançar o mesmo resultado que a injeção intracardíaca, em uma dose ajustada (tal como multiplicando a dose para injeção intracardíaca pelo peso do indivíduo em quilogramas, ou utilizando uma dose determinada por estudos de variação de dosagem). A função cardíaca (fração de ejeção) foi avaliada por ecocardiografia 2, 4 e 7 semanas após o MI. A formação de imagem revelou que os camundongos injetados com AAV5:MyΔ3A mostraram uma melhora estatisticamente significativa na fração de ejeção em comparação com os camundongos injetados com AAV5:GFP em 4 e 7 semanas após o MI. (n = 6 a 13 para cada grupo. ** p < 0,01). Os resultados são mostrados na FIGURA 17B.

[00522] O procedimento de ligação foi repetido em uma segunda coorte de camundongos. Após a ligação, o coração foi imediatamente submetido a injeção, por via intramiocárdica, com o vetor de controle do veículo (Hank’s Balanced Salt Solution, HBSS) ou o vetor monocistrônico (rotulado AAV5:MyΔ3A) novamente a uma dose de 1,2 x 1011 cópias do genoma (GC). A função cardíaca foi acompanhada por ecocardiografia a cada duas semanas até 8 semanas após o MI. A formação de imagem revelou que a função cardíaca (fração de ejeção) em ratos injetados com o veículo (HBSS) continuou a diminuir após o MI. Ratos injetados com AAV5:MyΔ3A mostraram uma melhora estatisticamente significativa na fração de ejeção 4 a 8 semanas após o MI. (n = 8 para cada grupo. * p < 0,05 *** p < 0,001). Os resultados são mostrados na FIGURA 18B. Dado que a relação do peso do coração de camundongos ou ratos para seres humanos é de cerca de 1000, uma dose entre cerca de 1013 GC a cerca de 1014 GC é testada quanto à eficácia em seres humanos.

[00523] Testes adicionais foram executados em um modelo de rato de infarto do miocárdio crônico (CMI). O ponto de tempo de duas semanas após a ligação LAD para injeção de vetores virais foi escolhido porque isso ocorre após a fase de proliferação de fibroblastos após o MI (Fu et al. J. Clin. Invest. 128:2127–43 (2018)). A FIGURA 19A a FIGURA 19B mostram testes in vivo de uma miocardina liberada por AAV e ASCL1 em um formato monocistrônico (AAV5:MyΔ3A). AAV5:MyΔ3A melhora a fração de ejeção em um modelo de rato com insuficiência cardíaca crônica devido ao infarto do miocárdio (MI). HBSS ou AAV5:MyΔ3A na dose 5 x 1011 GC (os transcritos de MyΔ3 e ASCL1 foram expressos a partir de um único transcrito incluindo um peptídeo 2A) foi liberado por injeção intramiocárdica 2 semanas após a ligação coronária permanente. A FIGURA 19A mostra a função cardíaca em grupos tratados (AAV5: MyΔ3A) e controle de veículo (HBSS) avaliado por ecocardiografia a cada duas semanas até 10 semanas após o MI. A ecocardiografia revelou que a função cardíaca em ratos injetados com veículo (HBSS) continuou a diminuir após o MI. AAV5:MyΔ3A interrompeu este declínio na função cardíaca. A FIGURA 19B mostra que o tratamento com AAV5:MyΔ3A provocou uma melhora estatisticamente significativa na fração de ejeção 6 a 10 semanas após o MI em comparação aos animais com veículo. (n = 10 para cada grupo. * p < 0,05 ** p < 0,01).

[00524] Estes dados de camundongos e ratos demonstram que a liberação de AAV de MyΔ3A pode fornecer benefício funcional in vivo tanto no infarto agudo do miocárdio (AMI) quanto no infarto do miocárdio crônico (CMI). A insuficiência cardíaca devido ao AMI é substancialmente revertida. A progressão da insuficiência cardíaca devido ao CMI é interrompida.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo de MYOCD e um ou ambos de um polinucleotídeo de ASCL1 ou um polinucleotídeo de MYF6; cada polinucleotídeo ligado de maneira operável a pelo menos um promotor.

2. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo de MYOCD e um polinucleotídeo de ASCL1.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo de MYOCD e um polinucleotídeo de MYF6.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo de MYOCD; um ou ambos de um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5; e um ou ambos de um polinucleotídeo de ASCL1 e um polinucleotídeo de MYF6.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de ASCL1, um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

6. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de MYF6, um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

7. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a MYOCD é uma miocardina projetada.

8. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o vetor não compreende nenhum polinucleotídeo do fator de reprogramação diferente de um polinucleotídeo de MYOCD, um polinucleotídeo de ASCL1, um polinucleotídeo de MYF6, um polinucleotídeo de MEF2C ou um polinucleotídeo de TBX5.

9. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o vetor não compreende nenhum outro gene codificador de proteína.

10. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor policistrônico.

11. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.

12. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor AAV.

13. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor lentiviral.

14. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de ASCL1, se presente, ou o polinucleotídeo de MYF6, se presente, e o polinucleotídeo de MYOCD estão ligados de maneira operável ao mesmo promotor e são expressos em co-translação.

15. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 7 a 13, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 ou um polinucleotídeo ASCL1-2A- MYOCD, ligado de maneira operável a um único promotor.

16. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 7 a 13, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD-2A-MYF6 ou um polinucleotídeo ASCL1-2A- MYF6, ligado de maneira operável a um único promotor.

17. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYOCD compreende a sequência de nucleotídeo de MYOCD humana (SEQ ID

NO: 4) ou um códon variante da mesma.

18. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYOCD compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo da MYOCD humana (SEQ ID NO: 4).

19. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYOCD codifica a MYOCD humana (SEQ ID NO: 3) ou uma variante funcional da mesma.

20. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYOCD codifica um polipeptídeo que compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a MYOCD humana (SEQ ID NO: 3).

21. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYOCD compreende a sequência de nucleotídeo de MyΔ3 (SEQ ID NO: 72) ou um códon variante do mesmo.

22. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou 21, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYOCD compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MyΔ3 (SEQ ID NO: 72).

23. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou 21 a 22, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYOCD codifica MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) ou uma variante funcional do mesmo.

24. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 ou 21 a 23, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de

MYOCD codifica um polipeptídeo que compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) ou um códon variante do mesmo.

25. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de ASCL1 compreende a sequência de nucleotídeo de ASCL1 humana (SEQ ID NO: 2) ou um códon variante da mesma.

26. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de ASCL1 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de ASCL1 humana (SEQ ID NO: 2) ou uma variante de códon da mesma.

27. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de ASCL1 codifica um polipeptídeo que compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a ASCL1 humana (SEQ ID NO: 1).

28. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de ASCL1 codifica a ASCL1 humana (SEQ ID NO: 1).

29. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYF6 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de MYF6 humano (SEQ ID NO: 56).

30. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um cassete de expressão, o cassete de expressão compreendendo: a. o polinucleotídeo de MYOCD, em que o polinucleotídeo de MYOCD compreende MyΔ3 (SEQ ID NO: 72) ou um códon variante deste e/ou codifica MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) ou uma variante funcional deste, o polinucleotídeo de MYOCD ligado de maneira operável a um primeiro promotor; e b. o polinucleotídeo de ASCL1, em que o polinucleotídeo de ASCL1 compreende ASCL1 (SEQ ID NO: 2) ou um códon variante da mesma e/ou codifica ASCL1 (SEQ ID NO: 1) ou uma variante funcional da mesma, o polinucleotídeo de ASCL1 ligado de maneira operável a um segundo promotor.

31. Vetor de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o primeiro promotor compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com um promotor CAG (SEQ ID NO: 67) e/ou o segundo promotor compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com um promotor SCP (SEQ ID NO: 68).

32. Vetor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um cassete de expressão, o cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo MYOCD- 2A-ASCL1, ligado de maneira operável a um único promotor.

33. Vetor de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 compreende a SEQ ID NO: 37 ou um códon variante da mesma.

34. Vetor de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 37.

35. Vetor de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 codifica a SEQ ID NO: 59 ou uma variante funcional da mesma.

36. Vetor de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 codifica um polipeptídeo que compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a SEQ ID NO: 59.

37. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 36, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende um ou mais de um íntron SV40 (SEQ ID NO: 73), um sinal poliA curto (SEQ ID NO: 74) e um WPRE (SEQ ID NÃO: 75).

38. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 37, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão é flanqueado por repetições terminais invertidas, opcionalmente ITRs de AAV2 (SEQ ID NO: 76).

39. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 38, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende uma proteína de capsídeo do AAV5, opcionalmente compreendendo a SEQ ID NO: 71 ou uma variante funcional da mesma.

40. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que o vetor é capaz de reprogramar células diferenciadas em células com cardiomiócitos induzidos (iCM).

41. Vetor de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que pelo menos 2,5%, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20% das células com iCM são α- actinina positivas.

42. Vetor de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que pelo menos 2%, pelo menos 5% ou pelo menos 8% das células com iCM são cTnT positivas.

43. Sistema de vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro vetor que codifica um polinucleotídeo de MYOCD e um ou ambos de um polinucleotídeo de ASCL1 ou um polinucleotídeo de MYF6; e um segundo vetor compreendendo um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

44. Sistema de vetor como definido na reivindicação 22,

caracterizado pelo fato de que o primeiro vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD-2A-ASCL1 ou um polinucleotídeo ASCL1-2A- MYOCD.

45. Sistema de vetor como definido na reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o primeiro vetor compreende um polinucleotídeo MYOCD-2A-MYF6 ou um polinucleotídeo ASCL1-2A- MYF6.

46. Sistema de vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro vetor que codifica um polinucleotídeo de MYOCD e um segundo vetor que codifica um polinucleotídeo de ASCL1 ou um polinucleotídeo de MYF6.

47. Sistema de vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 46, caracterizado pelo fato de que o primeiro vetor e o segundo vetor são, cada um, independentemente selecionados de uma nanopartícula lipídica, um transpóson, um vetor viral adenoassociado (AAV), um adenovírus, um retrovírus, um vetor lentiviral integrante (LVV) e um LVV não integrante.

48. Sistema de vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de ASCL1 compartilha pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de nucleotídeo de ASCL1 humana (SEQ ID NO: 2).

49. Sistema de vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 48, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de MYOCD codifica MYOCD humana (SEQ ID NO: 3) ou uma variante funcional desta ou MyΔ3 (SEQ ID NO: 16) ou uma variante funcional deste.

50. Método de indução de um fenótipo de cardiomiócito em células diferenciadas, caracterizado pelo fato de que compreende o contato das células diferenciadas com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou o sistema de vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 43 a 49.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que as células diferenciadas são células de fibroblastos cardíacos.

52. Método de acordo com a reivindicação 50 ou 51, caracterizado pelo fato de que as células diferenciadas são células in vitro durante a etapa de contato.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 52, caracterizado pelo fato de que as células diferenciadas são células in vivo em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia.

54. Método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de cardiopatia, caracterizado pelo fato de que compreende o contato das células diferenciadas in vitro com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou o sistema de vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 43 a 49 para gerar células com iCM e administração das células com iCM ao indivíduo.

55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo fato de que a cardiopatia é cardiomiopatia dilatada.

56. Método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo que sofre ou está em risco de uma cardiopatia, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou o sistema de vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 43 a 49 ao indivíduo.

57. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a cardiopatia é um infarto do miocárdio.

58. Método de acordo com a reivindicação 56,

caracterizado pelo fato de que a cardiopatia é um infarto agudo do miocárdio.

59. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a cardiopatia é uma insuficiência cardíaca.

60. Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que a cardiopatia é uma insuficiência cardíaca isquêmica crônica.

61. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou o sistema de vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 43 a 49, e instruções para uso no tratamento de uma cardiopatia.

62. Método de conversão de uma célula não-cardiomiócito diferenciada em um cardiomiócito, caracterizado pelo fato de que compreende o contato das células diferenciadas com o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 42 ou o sistema de vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 43 a 49.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que a célula diferenciada não-cardiomiócito é uma célula diferenciada não-cardiomiócito.

64. Método de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizado pelo fato de que a célula diferenciada não-cardiomiócito é uma célula humana diferenciada não-cardiomiócito.

65. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizado pelo fato de que a célula diferenciada não-cardiomiócito é uma célula diferenciada não- cardiomiócito in vivo.

66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizado pelo fato de que a célula diferenciada sem cardiomiócito é uma célula diferenciada sem cardiomiócito in vitro.

67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 61 a 66, caracterizado pelo fato de que a célula diferenciada sem cardiomiócito é uma célula cardíaca.

68. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo de MYOCD projetado que codifica uma proteína miocardina projetada tendo um comprimento de no máximo 850 aminoácidos, em que a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação SRF, um domínio SAP e um domínio TAD.

69. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende um domínio de interação Mef2c.

70. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que: a. o domínio de interação Mef2c compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 17, b. o domínio SRF compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 18, c. o domínio SAP compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 19, e d. o domínio TAD compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 11.

71. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 68 ou 70, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende um domínio LZ.

72. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o domínio LZ compartilha pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 20.

73. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 72, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende: a. um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-413 da miocardina humana (SEQ ID NO: 10), e b. um segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 764-986 da miocardina humana (SEQ ID NO: 11), em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são ligados por um ligante compreendendo uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1 a 50 resíduos de aminoácido.

74. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 72, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende: a. um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-438 da miocardina humana (SEQ ID NO: 12), e b. um segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 764-938 da miocardina humana (SEQ ID NO: 11), em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são ligados por um ligante compreendendo uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1 a 50 resíduos de aminoácido.

75. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 72, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende: a. um primeiro polipeptídeo que compartilha pelo menos 85% de identidade com os resíduos 5-559 da miocardina humana (SEQ ID NO: 13), e b. um segundo polipeptídeo que compartilha pelo menos

85% de identidade com os resíduos 764-938 da miocardina humana (SEQ ID NO: 11), em que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são ligados por um ligante compreendendo uma ligação peptídica ou um ligante polipeptídico de 1 a 50 resíduos de aminoácido.

76. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 75, caracterizado pelo fato de que o ligante consiste em uma ligação peptídica.

77. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 73 a 75, caracterizado pelo fato de que o ligante é um polipeptídeo selecionado de G, GG, GGG, GSS, GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 30), GSSGGS (SEQ ID NO: 31), GGSGSS (SEQ ID NO: 32), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 33), GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 34).

78. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende uma sequência selecionada das SEQ ID NOs: 14 a 16.

79. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo de MYOCD projetado que codifica uma proteína miocardina projetada, em que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de pelo menos 50 aminoácidos na região que corresponde aos aminoácidos 414 a 764 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

80. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 414 a cerca de 763 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

81. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO: 14.

82. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada consiste em uma sequência idêntica à SEQ ID NO: 14.

83. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 439 a cerca de 763 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

84. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO:

15.

85. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada consiste em uma sequência idêntica à SEQ ID NO: 15.

86. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende uma deleção de aminoácidos de cerca de 560 a cerca de 763 da micocardina nativa (SEQ ID NO: 3).

87. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada compreende uma sequência pelo menos 85% idêntica à SEQ ID NO:

16.

88. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada consiste em uma sequência idêntica à SEQ ID NO: 16.

89. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 88, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada é uma proteína miocardina projetada funcional.

90. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada funcional é expressa em pelo menos 10% do nível de MYOCD nativa no mesmo sistema de expressão.

91. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracterizado pelo fato de que a proteína miocardina projetada funcional é capaz de induzir o aumento da expressão de pelo menos um marcador do fenótipo de cardiomiócito (a) quando expressa em fibroblastos cardíacos humanos com MEF2C e TBX5 ou TBX5 na presença de um inibidor de TGFβ, opcionalmente SB431542, e um inibidor de Wnt, opcionalmente XAV939, ou (b) quando expresso em fibroblastos cardíacos humanos com ASCL1.

92. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 91, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está ligado de maneira operável a um promotor.

93. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 92, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo de MEF2C e um polinucleotídeo de TBX5.

94. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 93, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo de TBX5.

95. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 93, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende um polinucleotídeo de ASCL1.

96. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 68 a 95, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é flanqueado por repetições terminais invertidas (ITRs) ou o polinucleotídeo é flanqueado por repetições terminais longas (LTRs).

97. Vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 68 a 96.

98. Vírus recombinante de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante é um vírus adenoassociado recombinante (rAAV).

99. Vírus recombinante de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante é um lentivírus.

100. População de células, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 68 a 96.

101. População de células de acordo com a reivindicação 100, caracterizada pelo fato de que a porcentagem de células na população que apresenta transientes de cálcio (CaT) em um ensaio de CaT in vitro é pelo menos 2 vezes maior do que a porcentagem de células em uma população de controle de células não compreendendo o polinucleotídeo no mesmo ensaio de CaT in vitro.

102. Cardiomiócito induzido (iCM), caracterizado pelo fato de que o iCM compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 68 a 96.

103. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 68 a 96 e um sistema de liberação não viral.

104. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vírus recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 97 a 99.

105. Método para gerar um cardiomiócito induzido (iCM), caracterizado pelo fato de que compreende o contato de um fibroblasto de mamífero com o polinucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 68 a 96, o vírus recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 97 a 99, ou a composição farmacêutica como definida na reivindicação 103 ou 104.

106. Método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da composição farmacêutica como definida na reivindicação 105 ao indivíduo.

107. Método de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante é administrado por meio de cateterismo intracardíaco.

108. Método de acordo com a reivindicação 106, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante é administrado por meio de injeção intracardíaca.

109. Vírus adenoassociado recombinante (rAAV), caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de expressão, em que o cassete de expressão compreende na ordem de 5' para 3' uma repetição terminal invertida 5' (ITR), um promotor CAG, um íntron SV40, um polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas, um sinal de poliadenilação curto e uma ITR 3', e em que o polinucleotídeo que codifica uma ou mais proteínas compreende na ordem 5' para 3' um polinucleotídeo que codifica MyΔ3, um polinucleotídeo que codifica um ligante P2A e um polinucleotídeo que codifica ASCL1.

110. rAAV de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão compreende um WPRE.

111. rAAV de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizado pelo fato de que o MyΔ3 compreende a SEQ ID NO: 16.

112. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 111, caracterizado pelo fato de que o ligante 2A compreende ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 23).

113. rAAV de acordo com qualquer uma das reivindicações 109 a 111, caracterizado pelo fato de que a ASCL1 compreende a SEQ ID NO: 1.

114. rAAV de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que o rAAV compreende um polinucleotídeo pelo menos 95% idêntico à SEQ ID NO: 35 (MyΔ3A AAV).

115. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o rAAV como definido em qualquer uma das reivindicações 109 a 114.

116. Método de tratamento de uma cardiopatia em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da composição farmacêutica como definida na reivindicação 115 ao indivíduo.