JP2024001344A - ミオカルディンおよびａｓｃｌ１を用いた心細胞リプログラミング - Google Patents

ミオカルディンおよびａｓｃｌ１を用いた心細胞リプログラミング Download PDF

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Abstract

【課題】ミオカルディンおよびＡＳＣＬ１を用いた心細胞リプログラミングの提供。【解決手段】本開示は、例えばＡＳＣＬ１またはＭＹＦ６およびＭＹＯＣＤの発現によって、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞において、誘導心筋細胞を生成するための、および／または心筋細胞表現型を誘導するための方法を提供する。本開示はさらに、ＡＳＣＬ１、ＭＹＦ６、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５から選択される１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む遺伝子送達ベクターを提供する。本開示はさらに、誘導心筋細胞を含む組成物を提供し、心臓の状態、例えば心筋梗塞を処置する方法を提供する。本開示はまた、内部の欠失を有する操作されたミオカルディンタンパク質、このような操作されたミオカルディンをコードするベクター、およびその使用方法も提供する。【選択図】なし

Description

本発明の開示は、一般的に、心臓の疾患または障害のための遺伝子治療、細胞リプログラミング、および細胞療法の分野に関する。
関連出願
本出願は、２０１９年５月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８５２，７４６号；２０１９年１月４日に出願された米国仮特許出願第６２／７８８，４７９号；および２０１８年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７２５，１６８号の優先権を主張し、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表への参照
本出願は、ＥＦＳ－ウェブを介して電子出願されたものであり、．ｔｘｔフォーマットで電子的に提出された配列表を含む。．ｔｘｔファイルは、２０１９年８月３０日に作成された、約２７７キロバイトのサイズを有する「ＴＥＮＡ＿００７＿０２ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルの配列表を含む。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は、明細書の一部であり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
心不全は、世界的に主な死亡原因である。Braunwald's Heart Disease, 11th ed.
(2015)。心不全の推測罹患率は、世界的に３８００万人の患者であり、その数は、人口の高齢化につれて増加しつつある。Braunwald, E. The War against Heart Failure. Lancet 385:812-824 (2015)。心不全の予後は、ほとんどのがんの予後より悪い。
心不全のための様々な処置が提唱されており、例えば、（１）筋フィラメントのＣａ２＋に対する感受性の強化、例えばＳＥＲＣＡ２ａ（カルシウムを心筋細胞の筋小胞体にポンプ輸送するタンパク質）の遺伝子の導入の強化；（２）異常なカルシウムを取り扱うタンパク質を修正するための遺伝子治療；（３）選択されたマイクロＲＮＡの機能をブロックするためのアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）での処置；（４）細胞療法、例えば、骨髄由来の単核細胞または間葉細胞での細胞療法；および（５）一部の場合において心筋回復およびデバイスの外植に至る、長期心室補助デバイスなどである。
代替のアプローチは、誘導心筋細胞（ｉＣＭ）を用いた細胞ベースの療法である。心筋細胞は、細胞分裂に関する極めて限定的な能力を有し、したがって、新しい筋肉を再生し、それ自体を修復する心臓の能力を限定する。心筋細胞を生成するための１つの戦略は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の形成、次いでそれに続くｉＰＳＣのｉＣＭへの分化のための、線維芽細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの誘導である。例えば、因子ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、およびｃ－ＭＹＣはｉＰＳＣを生成し（Takahasi et al. Cell. 2006;126:663-76）、これは、様々なサイトカインおよび小分子阻害剤を使用するＴＧＦ－ベータ
シグナル伝達およびＷｎｔシグナル伝達の改変された一時的なモジュレーションなどの様々な方法で、ｉＣＭに分化できる（Lian et al. Nat. Protoc. 8:162-75 (2013)；Fonoudi et al. Stem Cells Transl. Med. 4:1482-94 (2015)）。
直接心臓リプログラミングは、例えば心筋梗塞（ＭＩ）による心臓への傷害後の心臓機能の改善をもたらす新しい心筋細胞を作り出す戦略として出現したものである。Srivastava and DeWitt. Cell 166:1386-96 (2016)。直接心臓リプログラミングは、多能性
表現型の誘導を行うことなく細胞を心筋細胞に変換することを含む。直接心臓リプログラミングの１つの用途において、ダメージを受けた臓器内の常在の支持細胞は、その場で所望の細胞型に変換される。例えば、３つの心臓発達の転写因子の組合せ、すなわちＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（ＧＭＴ）は、マウスにおいて皮膚または心臓線維芽細胞をｉＣＭ様細胞にリプログラミングするのに使用することができる。Ieda et al.
Cell. 142:375-86 (2010)。
線維芽細胞を心臓の前駆細胞または心筋細胞の状態に変換するための、遺伝学的アプローチに加えて化学的アプローチの様々な他の組合せが提唱されている。ＨＡＮＤ２、ＮＫＸ２．５、ＪＡＫまたはＴＧＦ－βは、このようなリプログラミングを強化する。ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＭＥＳＰ１、およびＭＹＯＣＤ（ＧＭＴＭＭ）は、因子のカクテルとして一緒に発現される場合、紡錘様の形状からロッド様の形状に細胞の形態を変化させ、細胞が自発的なＣａ２＋振動を示すようにする。ヒトにおいて、ＧＭＴにおけるＥＴＳ２およびＭＥＳＰ１の補充は、心臓特異的遺伝子の発現およびサルコメア形成を誘導する。直接リプログラミングのための因子の他の組合せは、公知である。
Braunwald, E. The War against Heart Failure. Lancet 385:812-824 (2015) Takahasi et al. Cell. 2006;126:663-76 Lian et al. Nat. Protoc. 8:162-75 (2013) Fonoudi et al. Stem Cells Transl. Med. 4:1482-94 (2015) Srivastava and DeWitt. Cell 166:1386-96 (2016) Ieda et al. Cell. 142:375-86 (2010)
誘導心筋細胞を生成するための、および、心臓の状態（心臓の傷害、例えばＭＩ、類遺伝子性の心疾患、老化に関連する心疾患、および他の心不全など）の処置のための、組成物および方法への長い間切実な未だ満たされていない必要性が残っている。本開示は、このような組成物および方法などを提供する。心筋細胞を生成するためのリプログラミング因子カクテルは、一般的に、少なくとも３つのリプログラミング因子の使用を必要とする。本発明者らは、驚くべきことに、ＭＹＯＣＤならびに因子ＡＳＣＬ１およびＭＹＦ６のいずれか１つが、ヒト細胞において、非心筋細胞の心筋細胞への直接リプログラミングを達成することを見出した。本開示の実施形態は、非心筋細胞（例えば、ヒト心臓線維芽細胞）を心筋細胞に直接リプログラミングするための、ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１および／またはＭＹＦ６を使用し、必要に応じて他の因子を伴う、組成物および方法を含む。有利には、５種より少ない因子が、ヒト心臓線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするために使用される。より一層有利には、２つのみの因子が、ヒト心臓線維芽細胞を心筋細胞にリプログラミングするために使用される。
本開示は、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド；ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドおよび／またはＭＹＦ６ポリヌクレオチド；ならびに必要に応じて、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチドおよび／またはＴＢＸ５ポリヌクレオチドの組合せを含むベクターを提供する。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ベクター中において、いずれかの５’から３’の順に、ベクター内の同一または異なるポリヌクレオチド鎖に配列されていてもよい。本開示はさらに、１つより多くのベクターで構成されるベクター系を提供する。一部のベクターは、ポリシストロン性ベクターであり、例えば、これらに限定されないが、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤ、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６、またはＭＹＦ６－２Ａ－ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含むベクターなどの２Ａ連結ポリシストロン性ベクターである。一部の場合において、ベクター系は、前述のものから選択される第１のポリシストロン性ベクター、ならびにＭＥＦ２ＣおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを提供する相補的な第２のポリシストロン性ベクターを含む。
ベクターとしては、ウイルスおよび非ウイルスベクター、例えば、これらに限定されないが、脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および非組み込み型ＬＶＶなどが挙げられる。ポリヌクレオチドのそれぞれは、必要に応じて、対応する遺伝子に関して天然のヒトポリヌクレオチド配列に対する配列同一性を有するか、または対応する天然のヒトタンパク質と同一の、もしくはそれに対する配列同一性を有するタンパク質をコードする異種配列を有する。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドによってコードされたＭＹＯＣＤは、操作されたミオカルディンである。例えば、ミオカルディンは、そのサイズを低減させるがその機能を保存する内部の欠失を含むように操作されていてもよい。
本開示はさらに、前述のベクターおよびベクター系を使用する方法を提供する。使用方法は、分化した細胞において心筋細胞表現型を誘導する方法（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ
ｖｉｔｒｏ）、および心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法を含む。一部の実施形態において、心筋細胞表現型を誘導する方法は、非心筋細胞を誘導心筋細胞に変換する。本開示の方法はさらに、非心筋細胞を誘導心筋細胞に変換する方法を含む。一部の実施形態において、非心筋細胞は、分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、非心筋細胞は、非心筋（non-cardiomycocyte）の心細胞、または心臓線維芽細胞（fibrolast cell）である。心筋細胞表現型は、ｃＴ
ｎＴおよび／もしくはα－アクチニンの発現の増加によって、または当業界において公知の、もしくは将来的に同定される心筋細胞（cardiomycote）表現型に関する他のマーカーの発現によって定義することができる。本開示はさらに、ベクターおよびベクター系を、心臓の状態の処置で使用するための説明書と共に含むキットを提供する。
一態様において、本開示は、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むベクターであって、各ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されている、ベクターを提供する。一部の実施形態において、ベクターは、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド；ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方；ならびにＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドおよびＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。一部の実施形態において、ベクターは、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤは、操作されたミオカルディンである。一部の実施形態において、ベクターは、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、またはＴＢＸ５ポリヌクレオチド以外のリプログラミング因子ポリヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、ベクターは、他のタンパク質をコードする遺伝子を含まない。一部の実施形態において、ベクターは、ポリシストロン性ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態において、存在する場合、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、または存在する場合、ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、およびＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、同じプロモーターに作動可能に連結されており、共に翻訳されることによって発現される。一部の実施形態において、ベクターは、単一のプロモーターに作動可能に連結した、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ベクターは、単一のプロモーターに作動可能に連結した、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号４）のヌクレオチド配列またはそのコドンバリアントを含む。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号４）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号３）またはその機能的なバリアントをコードする。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号３）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭｙΔ３（配列番号７２）のヌクレオチド配列またはそのコドンバリアントを含む。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭｙΔ３（配列番号７２）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭｙΔ３（配列番号１６）またはその機能的なバリアントをコードする。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭｙΔ３（配列番号１６）またはそのコドンバリアントに対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列またはそのコドンバリアントを含む。一部の実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列またはそのコドンバリアントに対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号１）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号１）をコードする。一部の実施形態において、ＭＹＦ６ポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＦ６（配列番号５６）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。
一部の実施形態において、ベクターは、発現カセットを含み、発現カセットは、ＭｙΔ３（配列番号７２）もしくはそのコドンバリアントを含み、および／またはＭｙΔ３（配列番号１６）もしくはその機能的なバリアントをコードし、第１のプロモーターに作動可能に連結されている、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド；ならびにＡＳＣＬ１（配列番号２）もしくはそのコドンバリアントを含み、および／またはＡＳＣＬ１（配列番号１）もしくはその機能的なバリアントをコードし、第２のプロモーターに作動可能に連結されている、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、第１のプロモーターは、ＣＡＧプロモーター（配列番号６７）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有し、および／または第２のプロモーターは、ＳＣＰプロモーター（配列番号６８）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。
一部の実施形態において、ベクターは、発現カセットを含み、発現カセットは、単一のプロモーターに作動可能に連結したＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、配列番号３７またはそのコドンバリアントを含む。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、配列番号３７に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。
一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、配列番号５９またはその機能的なバリアントをコードする。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、配列番号５９に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態において、発現カセットは、ＳＶ４０イントロン（配列番号７３）、短鎖ポリＡシグナル（配列番号７４）およびＷＰＲＥ（配列番号７５）の１つまたは複数を含む。
一部の実施形態において、発現カセットは、逆方向末端反復、必要に応じてＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号７６）によって挟まれている。一部の実施形態において、ベクターは、必要に応じて配列番号７１またはその機能的なバリアントを含む、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態において、ベクターは、分化した細胞を誘導心筋（ｉＣＭ）細胞にリプログラミングすることが可能である。一部の実施形態において、ｉＣＭ細胞の少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％が、α－アクチニン陽性である。一部の実施形態において、ｉＣＭ細胞の少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも８％が、ｃＴｎＴ陽性である。
別の態様において、本開示は、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方をコードする第１のベクター；ならびにＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含むベクター系を提供する。一部の実施形態において、第１のベクターは、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、第１のベクターは、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ベクター系は、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドをコードする第１のベクターおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＭＹＦ６ポリヌクレオチドをコードする第２のベクターを含む。
一部の実施形態において、第１のベクターおよび第２のベクターは、それぞれ独立して、脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および非組み込み型ＬＶＶから選択される。
一部の実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号３）もしくはその機能的なバリアントまたはＭｙΔ３（配列番号１６）もしくはその機能的なバリアントをコードする、請求項４３から４８のいずれか一項に記載のベクター系。
別の態様において、本開示は、分化した細胞において心筋細胞表現型を誘導する方法であって、分化した細胞を、本開示のベクターまたはベクター系と接触させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、分化した細胞は、心臓線維芽細胞である。一部の実施形態において、分化した細胞は、接触させるステップの間、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞である。一部の実施形態において、分化した細胞は、心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象におけるｉｎ ｖｉｖｏの細胞である。
別の態様において、本開示は、心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、分化した細胞を、ベクターまたはベクター系と接触させて、ｉＣＭ細胞を生成するステップ、およびｉＣＭ細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、心臓の状態は、拡張型心筋症である。
別の態様において、本開示は、心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、本開示のベクターまたはベクター系を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、心臓の状態は、心筋梗塞である。一部の実施形態において、心臓の状態は、急性心筋梗塞である。
一部の実施形態において、心臓の状態は、心不全である。一部の実施形態において、心臓の状態は、慢性虚血性心不全である。
別の態様において、本開示は、本開示のベクターまたはベクター系、および心臓の状態の処置で使用するための説明書を含むキットを提供する。
別の態様において、本開示は、分化した非心筋細胞（cardiomycyte）を心筋細胞に変換する方法であって、分化した細胞を、本開示のベクターまたはベクター系と接触させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、ヒトの分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏの分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、心細胞である。
さらに、誘導心筋細胞を生成するための、およびＭＩなどの心臓の傷害の処置のための組成物および方法への長い間切実な未だ満たされていない必要性が残っている。本開示は、このような組成物および方法などを提供する。
ミオカルディンは、図９Ａに描写されたドメイン構成を有する。本発明者らは、ミオカルディンタンパク質が、内部の欠失、例えばＳＡＰドメインとＴＡＤドメインとの間の内部の欠失が生じた場合、その機能を保持することを発見した。第２のＧａｔａ４相互作用ドメインは、一部の場合における機能にとって必ずしも必要ではない。一部の実施形態において、第２のＧａｔａ４相互作用（internation）ドメイン内のロイシンジッパー（Ｌ
Ｚ）ドメインは欠失しているが、一部の実施形態は、このＬＺドメインを保持する。さらに、本発明者らは、内部の欠失を有するミオカルディン（mycocardin）の一部の実施形態が、全長ミオカルディンと比較して増加した効力を有することを発見した。
図９Ｂ～９Ｄに、機能的な操作されたミオカルディンタンパク質の様々な実施形態を描写する。この開示は、これらの操作されたミオカルディンタンパク質など、このような操作されたミオカルディンタンパク質などをコードする単離されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを、単独で、または他の核酸と組み合わせて送達するためのベクター、ならびに遺伝子治療、細胞リプログラミング、および他の使用のためにこのようなポリヌクレオチドおよびベクターを使用する方法を提供する。また、キット、医薬組成物、使用のための組成物、および本発明の他の有用な実施形態も提供される。
一態様において、本開示は、最大で８５０アミノ酸の長さを有する操作されたミオカルディンタンパク質をコードする操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、操作されたミオカルディンタンパク質が、ＳＲＦ相互作用ドメイン、ＳＡＰドメイン、およびＴＡＤドメインを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインを含む。一部の実施形態において、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインは、配列番号１７に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、ＳＲＦドメインは、配列番号１８に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、ＳＡＰドメインは、配列番号１９に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、ＴＡＤドメインは、配列番号１１に対して、少なくとも８５％の同一性を有する。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、ＬＺドメインを含む。一部の実施形態において、ＬＺドメインは、配列番号２０に対して、少なくとも８５％の同一性を有する。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、ヒトミオカルディン（配列番号１０）の残基５～４１３に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、およびヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９８６に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、ヒトミオカルディン（配列番号１２）の残基５～４３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、およびヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、ヒトミオカルディン（配列番号１３）の残基５～５５９に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、およびヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている。
一部の実施形態において、リンカーは、ペプチド結合からなる。一部の実施形態において、リンカーは、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＳＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＳＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３４）から選択されるポリペプチドである。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、配列番号１４～１６から選択される配列を含む。
別の態様において、本開示は、操作されたミオカルディンタンパク質をコードする操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、操作されたミオカルディンタンパク質が、天然のミオカルディン（配列番号３）のアミノ酸４１４～７６４に対応する領域に、少なくとも５０アミノ酸の欠失を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、天然のミオカルディン（配列番号３）の約４１４から約７６３アミノ酸の欠失を含む。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、配列番号１４と少なくとも８５％同一の配列を含む。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、配列番号１４と同一の配列からなる。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、天然のミオカルディン（配列番号３）の約４３９から約７６３アミノ酸の欠失を含む。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、配列番号１５と少なくとも８５％同一の配列を含む。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、配列番号１５と同一の配列からなる。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、天然のミオカルディン（配列番号３）の約５６０から約７６３アミノ酸の欠失を含む。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、配列番号１６と少なくとも８５％同一の配列を含む。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、配列番号１６と同一の配列からなる。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、機能的な操作されたミオカルディンタンパク質である。
一部の実施形態において、機能的な操作されたミオカルディンタンパク質は、同じ発現系における天然のＭＹＯＣＤのレベルの少なくとも１０％で発現される。一部の実施形態において、機能的な操作されたミオカルディンタンパク質は、（ａ）ヒト心臓線維芽細胞において、ＴＧＦβ阻害剤、必要に応じてＳＢ４３１５４２、およびＷｎｔ阻害剤、必要に応じてＸＡＶ９３９の存在下で、ＭＥＦ２ＣおよびＴＢＸ５またはＴＢＸ５と共に発現される場合、または（ｂ）ヒト心臓線維芽細胞において、ＡＳＣＬ１と共に発現される場合のいずれかで、少なくとも１つの心筋細胞表現型のマーカーの発現増加を誘導することが可能である。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって挟まれているか、またはポリヌクレオチドは、長い末端反復（ＬＴＲ）によって挟まれている。
別の態様において、本開示は、本開示のポリヌクレオチドのいずれかを含む組換えウイルスを提供する。一実施形態において、組換えウイルスは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。一部の実施形態において、組換えウイルスは、レンチウイルスである。
別の態様において、本開示は、本開示のポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞の集団を提供する。
一部の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＣａＴアッセイにおいて、カルシウムトランジェント（ＣａＴ）を呈する集団中の細胞のパーセンテージは、同じｉｎ ｖｉｔｒｏのＣａＴアッセイにおけるポリヌクレオチドを含まない細胞の対照集団における細胞のパーセンテージの少なくとも２倍である。
別の態様において、本開示は、本開示のポリヌクレオチドのいずれかを含む誘導心筋細胞（ｉＣＭ）を提供する。
別の態様において、本開示は、本開示のポリヌクレオチドのいずれかおよび非ウイルス送達系を含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本開示は、本開示の組換えウイルスのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本開示は、誘導心筋細胞（ｉＣＭ）を生成する方法であって、哺乳動物線維芽細胞を、本開示のポリヌクレオチド、本開示の組換えウイルス、または本開示の医薬組成物と接触させるステップを含む、方法を提供する。
別の態様において、本開示は、対象における心臓の状態を処置する方法であって、本開示の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
一部の実施形態において、組換えウイルスは、心臓カテーテル法を介して投与される。一部の実施形態において、組換えウイルスは、心腔内注射を介して投与される。別の態様において、本開示は、発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）（図１３Ｂまたは図１３Ｃに描写した通り）であって、発現カセットが、５’から３’の順番で、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０イントロン、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、短鎖ポリアデニル化シグナル、および３’ＩＴＲを含み、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、５’から３’の順番で、ＭｙΔ３をコードするポリヌクレオチド、Ｐ２Ａリンカーをコードするポリヌクレオチド、およびＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチドを含む、ｒＡＡＶを提供する。
一部の実施形態において、発現カセットは、ＷＰＲＥを含む。一部の実施形態において、ＭｙΔ３は、配列番号１６を含む。一部の実施形態において、２Ａリンカーは、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２３）を含む。一部の実施形態において、ＡＳＣＬ１は、配列番号１を含む。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３５（ＭｙΔ３Ａ ＡＡＶ）と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む。
別の態様において、本開示は、本開示のｒＡＡＶを含む医薬組成物を提供する。
別の態様において、本開示は、本開示の医薬組成物を投与するステップを含む、対象における心臓の状態を処置する方法を提供する。
本発明のこれらの態様ならびに他の特色および利点は、より詳細に後述される。当業者は、慣例的な実験の使用だけで、本明細書に記載される発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することが可能であると予想される。このような均等物は、以下の開示および特許請求の範囲に包含されることが意図される。
図１Ａ～図１Ｃは、ヒトＯＲＦ ｃＤＮＡスクリーニングによるヒト心臓リプログラミングのエンハンサーの同定を例示する。図１Ａは、ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）細胞系におけるＭｙＭＴ－またはＭｙＭＴ＋ＳＢ／ＸＡＶ媒介ヒト心臓リプログラミングの活性化剤のスクリーニング戦略の概略図を示す。Ｍｙ：ＭＹＯＣＤ、Ｍ：ＭＥＦ２Ｃ、Ｔ：ＴＢＸ５、ＳＢ：ＳＢ４３１５４２、ＸＡＶ：ＸＡＶ－９３９。図１Ｂは、スクリーニングにより同定されたヒト心臓リプログラミングの６つのエンハンサー（ＡＳＣＬ１、ＤＬＸ３、ＤＬＸ６、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ５およびＭＹＦ６）を示す。グラフは、ＭｙＭＴ＋ＳＢ／ＸＡＶの活性に対する、各リプログラミングの組合せによるα－アクチニン陽性細胞の変化倍数を示す。図１Ｃは、リプログラミングされた細胞のための心臓遺伝子発現分析を示す。成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）を、グラフに示された通りの異なるリプログラミング因子をコードしたレトロウイルスに感染させた。リプログラミングされた細胞を３週間培養した。心臓マーカー遺伝子（ＭＹＨ６、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＣ１、ＮＰＰＡ、ＴＮＮＩ３およびＲＹＲ２）の転写レベルを、ｑ－ＰＣＲによって決定した。 同上。 同上。 同上。
図２Ａ～図２Ｄは、ＡＳＣＬ１およびＭＹＦ６が成体ヒトおよびブタ心臓線維芽細胞の両方において心臓リプログラミングを強化することを例示する。図２Ａおよび図２Ｂは、示されたレトロウイルスでの感染後の３週間におけるリプログラミングされた成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＰＣＦ）の代表的な免疫細胞化学の画像（図２Ａ）および分析（図２Ｂ）を示す。２つの心臓タンパク質であるα－アクチニン（上の列）およびｃＴｎＴ（下の列）を、リプログラミング効率を定量化するためのマーカーとして使用した。両方の場合において、赤色の蛍光シグナルは、タンパク質発現の指標である。ＤＡＰＩを使用して、核を染色した（青色）。図２Ｃおよび図２Ｄは、示されたレトロウイルスでの感染後の３週間におけるリプログラミングされた成体ブタ心臓線維芽細胞（ＡＨＰＦ）の代表的な免疫細胞化学の画像（図２Ｃ）および分析（図２Ｄ）を示す。２つの心臓タンパク質であるα－アクチニン（上の列、赤色）およびｃＴｎＴ（下の列、赤色）を、リプログラミング効率を定性化するためのマーカーとして使用した。核染色のＤＡＰＩを示す（青色）。 同上。
図３Ａ～図３Ｅは、ＡＨＣＦにおけるリプログラミング因子の用量応答を例示する。図３Ａ～図３Ｄは、リプログラミング因子の用量応答を示すための代表的な免疫細胞化学の画像（図３Ａ～３Ｄ）および分析（図３Ｅ）を示す。ＡＨＣＦを、示されたレトロウイルスに感染させ、免疫染色の前に３週間培養した。２つの心臓タンパク質であるα－アクチニン（上の列、赤色）およびｃＴｎＴ（下の列、赤色）を、リプログラミング効率を定性化するためのマーカーとして使用した。ＤＡＰＩ（青色）。 同上。 同上。
図４Ａ～図４Ｃは、ツーインワン（ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ）のポリシストロン性ベクターによるヒト心臓リプログラミングを例示する。図４Ａ～図４Ｂは、心臓リプログラミングのためのツーインワンのポリシストロン性ベクターの最適な組合せを決定するための代表的な免疫細胞化学の画像（図４Ａ）および分析（図４Ｂ）を示す。ＡＨＣＦを、示されたレトロウイルスに感染させ、免疫染色の前に３週間培養した。２つの心臓タンパク質であるα－アクチニン（上、赤色）およびｃＴｎＴ（下、赤色）を、リプログラミング効率を定性化するためのマーカーとして使用した。ＤＡＰＩ（青色）。図４Ｃは、ツーインワンのポリシストロン性ベクターの異なる組合せによるリプログラミングされた細胞のための心臓遺伝子発現分析を示す。ＡＨＣＦを、示されたレトロウイルスに感染させ、ＲＮＡ抽出の前に３週間培養した。心臓マーカーの転写レベルを、ｑ－ＰＣＲによって決定した。 同上。
図５Ａ～図５Ｄは、単一のポリシストロン性ベクターによるヒト心臓リプログラミングを例示する。図５Ａ～図５Ｂは、Ｍｙ＋Ａが、ヒト線維芽細胞において心臓リプログラミングを誘導するのに十分であることを示すための、ＧＦＰ、Ｍｙ＋Ａ＋Ｍ＋ＴまたはＭｙ＋Ａレトロウイルスでの感染後の３週間におけるＡＨＣＦの代表的な免疫細胞化学の画像（図５Ａ）および分析（図５Ｂ）を示す。α－アクチニン（上、赤色）、ｃＴｎＴ（下、赤色）、ＤＡＰＩ（青色）。図５Ｃ～図５Ｄは、単一のポリシストロン性ベクターが、ヒト線維芽細胞において心臓リプログラミングを誘導するのに十分であることを示すための、ＧＦＰ、Ｍｙ＋Ａ＋Ｍ＋Ｔ、Ｍｙ－Ｐ２Ａ－ＡおよびＡ－Ｐ２Ａ－Ｍｙレトロウイルスでの感染後の３週間におけるＡＨＣＦの代表的な免疫細胞化学の画像（図５Ｃ）および分析（図５Ｄ）を示す。α－アクチニン（上、赤色）、ｃＴｎＴ（下、赤色）、ＤＡＰＩ（青色）。 同上。
図６Ａ～図６Ｃは、４つの遺伝子を発現するポリシストロン性ベクターによるヒト心臓リプログラミングを例示する。図６Ａ～図６Ｂは、ＧＦＰおよび２４種の異なるフォーインワン（ｆｏｕｒ－ｉｎ－ｏｎｅ）のポリシストロン性レトロウイルスでの感染後の３週間におけるＡＨＣＦの代表的な免疫細胞化学の分析（図６Ａ）および画像（図６Ｂ）を示す。α－アクチニン（上、赤色）、ｃＴｎＴ（下、赤色）、ＤＡＰＩ（青色）。図６Ｃは、異なるリプログラミング因子を示す因子の位置のスコアマトリックスが、フォーインワンのポリシストロン性ベクターにおける異なる位置を好むことを示す。 同上。
図７Ａ～図７Ｄは、リプログラミングカクテルのｉｎ ｖｉｖｏの送達が心筋梗塞の後の心臓の修復を促進することを例示する。図７Ａは、心筋梗塞の後にマウス心臓を修復するための異なるリプログラミングカクテルのｉｎ ｖｉｖｏの研究の概略図を示す。マウスを、心筋梗塞（ＭＩ）結紮とそれに続くＧＦＰ、ＡＳＣＬ１、ＭｙＭＴ、ＭｙＭＴＡまたはＭｙＡレトロウイルスの心筋内注射に供した。リプログラミング因子を別個のウイルスに入れた。心機能を様々なタイムポイントで心エコー検査によって評価した。図７Ｂ～図７Ｄは、示される様々なタイムポイントで心エコー検査によって定量化した左心室の駆出率（図７Ｂ）、収縮終期容量（図７Ｃ）、および拡張終期容量（図７Ｄ）を示す。ＭｙＭＴ、ＭｙＭＴＡまたはＭｙＡは、ＭＩ後の心機能を改善した。（各群につきｎ＝１１～１３。ｎ．ｓ．ｐ＞０．０５；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 同上。 同上。
図８Ａ～図８Ｅは、バイシストロン性発現ＭｙＡベクターの設計および比較試験を示す。図８Ａは、天然のミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）およびＡｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ相同体１（ＡＳＣＬ１）タンパク質をコードする非組み込み型レンチウイルス（ＮＩＬ）構築物の設計を示す。図８Ｂは、天然のＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１タンパク質をコードするＡＡＶ構築物の設計を示す。図８Ｃは、ＭＹＯＣＤ単独をコードするモノシストロン性ＮＩＬ構築物からの発現と比較したＮＩＬ構築物からのＭＹＯＣＤの発現を示す。図８Ｄは、ＭＹＯＣＤ単独をコードするモノシストロン性ＡＡＶ構築物からの発現と比較したＡＡＶ構築物からのＭＹＯＣＤの発現を示す。図８Ｅは、バイシストロン性のＡＡＶまたはＮＩＬでの形質導入後におけるα－アクチニン陽性細胞のパーセンテージを示す。 同上。 同上。
図９Ａ～図９Ｄは、天然のヒトミオカルディン（図１Ａ）ならびに内部の欠失を有する操作されたミオカルディンタンパク質の３つの実施形態：ＭｙΔ１（図１Ｂ）、ＭｙΔ２（図１Ｃ）、およびＭｙΔ３（図１Ｄ）のドメインの概略図を示す。 同上。
図１０Ａおよび図１０Ｂは、ＭｙΔ１、ＭｙΔ２、およびＭｙΔ３のタンパク質の発現（図１０Ａ）および局在化（図１０Ｂ）を示す。
図１１は、小分子ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の存在下における、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５および天然の、または操作されたミオカルディンで形質導入された細胞のカルシウムトランジェントを示す。
図１２Ａおよび図１２Ｂは、小分子ＳＢ４３１５４２およびＸＡＶ９３９の存在下で、ＴＢＸ５および天然の、または操作されたミオカルディンで形質導入された細胞の、ｑ－ＰＣＲによる遺伝子発現（図１２Ａ）、および形態学（図１２Ｂ）を示す。 同上。
図１３Ａ～図１３Ｃは、ＡＳＣＬ１を用いた天然の、または操作されたミオカルディンタンパク質の発現のためのＡＡＶベクターの設計を示す。図１３Ａは、ＭｙＡΔＷＰＲＥ短鎖Ａを示す。図１３Ｂは、ＭｙΔ３ＡΔＷＰＲＥ短鎖Ａを示す。図１３Ｃは、ＭｙΔ３Ａ ＷＰＲＥ短鎖Ａを示す。
図１４Ａ～図１４Ｄは、ＭｙΔ３およびＡＳＣＬ１をコードするバイシストロン性ＡＡＶ発現ベクターの試験を示す。ミオカルディン（図１４Ａ）およびＡＳＣＬ１（図１４Ｂ）のタンパク質発現レベルが示される。心臓表現型のマーカーであるα－アクチニン（図１４Ｃ）およびｃＴＮＴ（図１４Ｄ）を発現する細胞のパーセンテージが示される。 同上。
図１５は、バイシストロン性ＮＩＬまたはＡＡＶベクターでの形質導入後における心臓表現型のマーカーであるα－アクチニンおよびｃＴＮＴを発現する細胞のパーセンテージを示す。
図１６Ａ～図１６Ｂは、ヒト心臓線維芽細胞を心筋細胞に直接リプログラミングするためのＡＳＣＬ１およびＭＹＦ６と組み合わせたＭＹＯＣＤの試験を示す。ＡＳＣＬ１またはＭＹＦ６のいずれかと組み合わせたＭＹＯＣＤは、ｃＴｎＴ＋、α－アクチニン＋、または二重陽性細胞のパーセンテージによって測定した場合、ロバストなリプログラミングを実証した（図１６Ａ）。１６種の他の因子は、いくらかの、ただしそれより低いリプログラミング効率を示した。図１６Ｂに、代表的な免疫蛍光法顕微鏡写真を示す。 同上。
図１７Ａ～図１７Ｂは、バイシストロン性の様式（ＡＡＶ５：ＭｙΔ３／Ａ）でＡＡＶによって送達されたミオカルディンおよびＡＳＣＬ１のｉｎ ｖｉｖｏの試験を示す。図１７Ａは、バイシストロン性ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａの構築物設計の概略図を示す。図１７Ｂは、バイシストロン性ＡＡＶ５：ＭｙΔ３／Ａが心筋梗塞（ＭＩ）のマウスモデルにおいて駆出率を改善することを示す。マウスＭＩモデルを左前下行枝（ＬＡＤ）動脈の結紮によって作成した。結紮処置の数分後に、１．２×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量でのＡＡＶ５：ＧＦＰまたはＡＡＶ５：ＭｙΔ３／Ａ（ＭｙΔ３およびＡＳＣＬ１転写物が別個のプロモーター（ＣＡＧおよびＳＣＰ）から駆動される単一のウイルスベクターで送達された）を動物に心筋内注射した。ＭＩ後の２、４および７週間に、心機能（駆出率）を心エコー検査によって評価した。イメージングから、ＭＩ後の４および７週間に、ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａを注射したマウスが、ＡＡＶ５：ＧＦＰを注射したマウスと比較して駆出率における統計学的に有意な改善を示したことが解明された。（各群につきｎ＝６～１３。＊＊ｐ＜０．０１）。
図１８Ａ～図１８Ｂは、モノシストロン性の様式（ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ）でＡＡＶによって送達されたミオカルディンおよびＡＳＣＬ１のｉｎ ｖｉｖｏの試験を示す。図１８Ａは、モノシストロン性ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａの構築物設計の概略図を示す。ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａは、心筋梗塞（ＭＩ）のラットモデルにおける駆出率を改善する。ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）または１．２×１０１１ＧＣの用量でのＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ（ＭｙΔ３およびＡＳＣＬ１を、Ｐ２Ａペプチドによって隔てられたコード配列を有するＣＡＧプロモーターによって駆動される単一の転写物から発現させた）を、永続的な冠動脈結紮の直後に心筋内注射によって送達した。心臓の機能を、ＭＩ後８週間まで２週毎に心エコー検査によって経過観察した。イメージングにより、ＭＩの後、媒体（ＨＢＳＳ）を注射したラットの心機能（駆出率）が低下し続けたことが解明された。ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａを注射したラットは、ＭＩ後の４～８週間の駆出率において統計学的に有意な改善を示した。（各群につきｎ＝８。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
図１９Ａ～図１９Ｂは、モノシストロン性の様式（ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ）でＡＡＶによって送達されたミオカルディンおよびＡＳＣＬ１のｉｎ ｖｉｖｏの試験を示す。ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａは、心筋梗塞（ＭＩ）に起因する慢性心不全のラットモデルにおける駆出率を改善する。永続的な冠動脈結紮後の２週間に、ＨＢＳＳまたは５×１０１１ＧＣの用量でのＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ（ＭｙΔ３およびＡＳＣＬ１転写物を、２Ａペプチドを含む単一の転写物から発現させた）を心筋内注射によって送達した。図１９Ａは、ＭＩ後１０週間まで２週毎に、心エコー検査によって評価された、処置された（ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ）および媒体対照（ＨＢＳＳ）群における心臓の機能を示す。心エコー検査により、ＭＩの後、媒体（ＨＢＳＳ）を注射したラットにおける心機能が低下し続けたことが解明された。ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａは、この心臓の機能の低下を止めた。図１９Ｂは、ＭＩ後の６～１０週間に、ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ処置が、媒体での動物と比較して駆出率における統計学的に有意な改善をもたらしたことを示す。（各群につきｎ＝１０。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
これらに限定されないが、誘導心筋細胞を生成すること；好ましくはｉｎ ｖｉｖｏで、心臓線維芽細胞を心筋細胞に直接リプログラミングすること；心不全の様々な形態、好ましくは拡張型心筋症の処置；およびＭＩなどの心臓の傷害の処置に適した組成物および方法への長い間切実な未だ満たされていない必要性が残っている。本開示は、このような組成物および方法などを提供する。
本開示は、他の細胞型をリプログラミングすることによる誘導心筋（ｉＣＭ）細胞の生成（ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでの）に関連する方法および組成物を提供する。特定には、本発明者らは、分化した細胞、例えば線維芽細胞は、Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ相同体１（ＡＳＣＬ１）および／または筋原性因子６（ＭＹＦ６）の発現によって、心筋細胞にリプログラミングすることができることを発見した。ＡＳＣＬ１は、主として神経系、神経単位、および神経内分泌の発達におけるその役割について公知である。Mao et al. Functional and Physical Interactions between
Mammalian Achaete-Scute Homolog 1 and Myocyte Enhancer Factor 2A. J.
Bio. Chem. 271:14371-75 (1996)；Borges et al. An achaete-scute homologue essential for neuroendocrine differentiation in the lung. Nature. 386 (6627):852-55 (1997)。細胞リプログラミングに関して、ＡＳＣＬ１は、当業界では非神経細胞の機能的なニューロンへの変換に関連する因子として公知である。Chanda et
al. Generation of Induced Neuronal Cells by the Single Reprogramming
Factor ASCL1. Stem Cell Report 3:282-96 (2014)；Wapinski et al. Rapid
Chromatin Switch in the Direct Reprogramming of Fibroblasts to Neurons. Cell Reports 20:3236-47 (2017)；Wapinski et al. Hierarchical mechanisms for transcription factor-mediated reprogramming of fibroblasts to neurons. Cell 155:621-35 (2013)。実際に、他のリプログラミング因子と同時のＡＳＣ
Ｌ１の発現は、当業界において、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を、心筋細胞表現型から神経単位（Ｔｕｊ１＋ｃＴｎＴ－）または神経単位様の表現型（Ｔｕｊ１＋ｃＴｎＴ＋）に変換することに、すなわち心筋細胞のリプログラミングと反対の作用に使用されてきた。Chuang et al. Partial Reprogramming of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes into Neurons. Sci Rep. 7:44840 (2017)。対照的に、本開示は、ＡＳＣＬ１を使用して線維芽細胞から誘導心筋（ｉＣＭ）細胞を生成するための組成物および方法を提供する。
ＭＹＦ６は、筋肉の分化に関連する筋原性因子である。これは、線維芽細胞を筋原細胞に分化するように誘導し、ＭＹＦ６における突然変異は、先天性の筋肉疾患と関連する。ＭＹＦ６が心筋細胞の分化に関与するという示唆はない。対照的に、本開示は、ＭＹＦ６を使用して誘導心筋（ｉＣＭ）細胞を生成するための組成物および方法を提供する。
さらに、本開示は、内部の欠失を有する操作されたミオカルディンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、内部の欠失を有する操作されたミオカルディンタンパク質、およびその使用方法を提供する。本開示は、このようなポリヌクレオチドを含むベクター、および一部の実施形態において、他のタンパク質をコードする１つまたは複数の追加の核酸を提供する。開示されたポリヌクレオチドは、例えば、誘導心筋細胞を生成するためのポリシストロン性アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターでの哺乳動物線維芽細胞の形質導入にとって有用である。本開示はさらに、他の細胞型のリプログラミングによる誘導心筋（ｉＣＭ）細胞の生成に関連する方法および組成物を提供する。特定には、本発明者らは、分化した細胞、例えば線維芽細胞は、Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ相同体１（ＡＳＣＬ１）の発現によって誘導心筋細胞にリプログラミングされ得ること；ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）とＡＳＣＬ１の共発現は、このようなリプログラミングに効果的であること；一部の実施形態において、内部の欠失を有する操作されたミオカルディンタンパク質は、遺伝子発現、リプログラミング、もしくは他の機能におけるベクターの機能を強化し、または少なくとも天然のミオカルディンタンパク質を有するベクターと同じレベルの機能を保持することを発見した。このような操作されたミオカルディンおよびＡＳＣＬ１をコードするＡＡＶベクターの一部の実施形態は、驚くべきことに、天然のミオカルディンおよびＡＳＣＬ１をコードするＡＡＶベクターと比較して、改善される。他の開示された実施形態は、これらに限定されないが、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクター、ＡＳＣＬ１に加えて、またはその代わりに、他の因子との、操作されたミオカルディンの共発現のためのベクター、本開示のポリヌクレオチドの非ウイルス送達、これらの実施形態を適用するｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの方法、ならびに心疾患を処置するための組成物および方法、例えば１つまたは複数のベクター、および、一部の実施形態において、１つまたは複数の小分子の投与を含む方法を含む。本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定され、以下の詳細な説明は、この段落に記載したものを超える多様な実施形態を提供する。
一態様において、本開示は、ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）の操作されたバリアントに関する。ＭＹＯＣＤは、大きい多機能性の転写因子である。本発明者らは、ＭＹＯＣＤと組み合わせたＡＳＣＬ１の発現が、他のリプログラミング因子があってもなくても哺乳動物線維芽細胞において心筋細胞表現型を誘導するのに十分であることを示すことに加えて、ＡＳＣＬ１およびＭＹＯＣＤをコードするウイルスベクターが、誘導心筋細胞を生成することを認識した。本開示は、ＭＹＯＣＤとＡＳＣＬ１の両方をコードするウイルスベクター、例えば、レンチウイルスおよびＡＡＶベクターなどを提供する。本発明者らはさらに、開示のレンチウイルスベクターは、一部の実施形態において、本開示のＡＡＶベクターより効果的に心筋細胞を誘導したことを認識した。
本発明者らはまた、驚くべきことに、内部の欠失を含むＭＹＯＣＤは、ミオカルディンの発現および機能を保持すること、内部の欠失を含むＭＹＯＣＤは、単独で、または他のリプログラミング因子（例えば、線維芽細胞から心筋細胞を生成するための）と組み合わせて使用することができること；およびさらに、このような操作されたＭＹＯＣＤを含むウイルスベクターは、一部の実施形態において、天然のＭＹＯＣＤを含むウイルスベクターと同等に有効であるか、またはそれより有効であったことも見出している。それゆえに本開示はまた、様々な操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ウイルスベクター、遺伝子送達系、およびその使用方法も提供する。
Ｉ．定義
用語「機能的な心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、電気シグナルを送るかまたは受けることができる分化した心筋細胞を指す。一部の実施形態において、心筋細胞は、活動電位および／またはＣａ２＋トランジェントなどの電気生理学的特性を呈する場合、機能的な心筋細胞と言われる。
「分化した非心臓細胞」は、本明細書で使用される場合、成体生物のいずれの細胞型にも分化することができない（すなわち、多能性細胞ではない）細胞であって、心臓系統以外の細胞系統（例えば、神経単位系統または結合組織系統）に属するものを指す場合がある。分化した細胞としては、これらに限定されないが、複能性細胞、少能性細胞（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）、単能性細胞、前駆細胞、および最終的に分化した細胞が挙げられる。特定の実施形態において、分化能が低い細胞は、より分化能が高い細胞に対して「分化した」とみなされる。
「タンパク質をコードする遺伝子」は、本明細書で使用される場合、ベクターの成分を指す場合、ベクターの機能に関連する遺伝子以外のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。例えば、タンパク質をコードする遺伝子という用語は、リプログラミング活性を有する、ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的なバリアントを包含すると予想される。ベクターへの言及における語句「他のタンパク質をコードする遺伝子を含まないベクター」は、ベクターが、列挙された目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むが、リプログラミング活性を有する別のタンパク質、例えば当業界において多能性または心筋細胞表現型のいずれかを促進することが公知の他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まないことを意味することが意図される。語句「他のタンパク質をコードする遺伝子を含まないベクター」は、必要に応じて存在する可能性があるベクターの機能に必要なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを除外しないし、その語句は、タンパク質をコードしないポリヌクレオチドも除外しない。このようなベクターは、非コードポリヌクレオチド配列を含み、ＲＮＡ分子（例えばマイクロＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを含む場合がある。逆に、ある特定のタンパク質をコードする遺伝子のみが列挙される場合、他のタンパク質をコードする遺伝子が、追加で存在する可能性があることを暗に示し、例えば、リプログラミング活性を有するタンパク質をコードするタンパク質をコードする遺伝子は、リプログラミングをさらに促進する。
「体細胞」は、生物の体を形成する細胞である。体細胞は、生物における臓器、皮膚、血液、骨および結合組織を構成する細胞を含むが、生殖細胞は含まない。
用語「心臓の異常」または「心機能障害」は、同義的に使用され、心臓のポンプ機能におけるあらゆる欠陥を指す。このようなものとしては、例えば、収縮性の欠陥、弛緩する能力の欠陥（時には拡張機能障害と称される）、心臓弁の異常な、または不適切な機能化、心筋の疾患（時には心筋症と称される）、心筋への不十分な血液供給によって特徴付けられる狭心症、心筋虚血および／または梗塞などの疾患、アミロイドーシスおよびヘモクロマトーシスなどの浸潤性疾患、全体的または局部的な肥大（例えばある種の心筋症または全身性高血圧で起こる可能性があるもの）、ならびに心室間の異常な連通が挙げられる。
用語「心筋症」は、本明細書で使用される場合、心臓が異常に拡大する、厚くなる、および／または硬くなる心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）（心筋（ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ））のあらゆる疾患または機能障害を指す。結果として、血液をポンプ輸送する心筋の能力が通常弱くなる。この疾患または障害の病因は、例えば、炎症性、代謝性、毒性、浸潤性、線維形成性、血液学的、遺伝学的、または起源不明であり得る。心筋症の２つの一般的なタイプがあり、すなわち虚血性（酸欠の結果起こる）および非虚血性である。
「心不全（ＨＦ）」は、左心室の充満圧を過度に増加させることなく体の代謝の要求を満たすには不十分な全身性灌流を引き起こす、あらゆる構造的または機能的な心臓血管障害に起因する可能性がある複雑な臨床症候群である。これは、呼吸困難および疲労などの具体的な症状、ならびに体液貯留などの徴候によって特徴付けられる。「慢性心不全」または「うっ血性心不全」または「ＣＨＦ」は、本明細書で使用される場合、同義的に、心不全の継続的または持続的な形態を指す。ＣＨＦの一般的なリスク因子としては、老齢、糖尿病、高血圧および過体重になることが挙げられる。ＣＨＦは、概して、左心室の収縮機能に従って、駆出率が低減または保持されたＨＦ（ＨＦｒＥＦおよびＨＦｐＥＦ）として分類される。用語「心不全」は、心臓が止まっているか、またはまったく機能しないことを意味しないが、健康な人における正常な状態より弱いことを意味する。一部の場合において、状態は、運動するときだけ顕著になる可能性がある症状を引き起こす、軽度の場合もあり、他の場合において、その状態は、安静時でさえも生命を脅かす可能性がある症状を引き起こす、より重度の場合もある。慢性心不全の最も一般的な症状としては、息切れ、疲れ、脚および足首の腫れ、胸痛ならびに咳が挙げられる。一部の実施形態において、本開示の方法は、ＣＨＦ（例えば、ＨＦｒＥＦ）を患っているまたはそのリスクがある対象においてＣＨＦ（例えば、ＨＦｒＥＦ）の１つまたは複数の症状を減少させる、防止する、または緩和する。一部の実施形態において、本開示は、ＣＨＦおよびＣＨＦに至る可能性がある状態を処置する方法を提供する。
「急性心不全」または「非代償性心不全」は、本明細書で使用される場合、同義的に、心臓が正常な充満圧で体の要求に見合った速度で血液をポンプ輸送することができないことを反映する徴候および症状の悪化の症候群を指す。ＡＨＦは、典型的には、数日から数週間の期間にわたり徐々に発症し、次いで代償不全になり、これらの徴候または症状の重症度により至急または緊急の療法を必要とする。ＡＨＦは、心臓の収縮もしくは拡張機能における一次的な障害、または異常な静脈もしくは動脈の血管収縮の結果であり得るが、一般的には、容量過負荷を含む複数の要因の相互作用を表す。ＡＨＦを有する患者の大部分は、慢性心不全（ＣＨＦ）の代償不全を有し、結果として、ＣＨＦの病態生理学、症候、および診断の議論の多くは、ＡＨＦの理解に直接関連する。他の場合において、ＡＨＦは、心臓の発作または心臓の機能を損なう事象、例えば急性心筋梗塞、重度の高血圧、心臓弁へのダメージ、異常な心臓リズム、心臓の炎症または感染、毒素および薬物療法に起因する。一部の実施形態において、本開示の方法は、ＡＨＦを患っているまたはそのリスクがある対象におけるＡＨＦの１つまたは複数の症状を減少させる、防止する、または緩和する。一部の実施形態において、本開示は、ＡＨＦおよびＡＨＦに至る可能性がある状態を処置する方法を提供する。ＡＨＦは、心筋梗塞に関連する虚血の結果であり得る。
一部の実施形態において、本開示の方法（例えば、リプログラミング療法）は、１つまたは複数の心臓の状態（例えば、一部の対象において急性および慢性心不全に至る可能性がある心臓の状態）を処置する。本開示の方法および組成物に従って処置可能な例示的な状態としては、急性心筋梗塞（ＭＩ）、虚血性心疾患または虚血性心筋症（ＣＭ）（慢性ＭＩの形態）、拡張型ＣＭ、高血圧性ＣＭ、家族性ＣＭ、遺伝性ＣＭ、特発性ＣＭ、弁膜性心疾患に起因するＣＭ、薬物療法および毒素によって誘導されたＣＭ、心筋炎によるＣＭ、ならびに周産期ＣＭが挙げられる。一部の実施形態において、本明細書で開示された組成物および方法は、先天性心疾患を処置する。一部の実施形態において、本開示の方法は、心不全を有する、心不全の症状を呈する、または心不全のリスクがある、すでに心不全に進行している状態またはまだ心不全に進行していない状態を有する対象に、組成物（例えばウイルスベクター）を投与するステップを含む。リプログラミングは、これらの状態を有する患者における心不全を処置するかまたは防止するかのいずれかに使用することができる。これらの状態の全てによる慢性心不全が、一般用語「駆出率が低減された心不全」（ＨＦｒＥＦ）に含まれる。
用語「目的の遺伝子」は、本明細書で使用される場合、リプログラミング因子またはリプログラミング因子をコードする核酸を指す。例えば、リプログラミング因子がタンパク質である場合、目的の遺伝子は、文脈から明らかなように、タンパク質または対応するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のいずれかである。目的の遺伝子の導入、投与、または他の使用は、遺伝子の発現を増加させる、または遺伝子、遺伝子産物、もしくは遺伝子産物の機能的なバリアントの活性を増加させるあらゆる手段を指すものとして理解されるべきである。したがって、一部の実施形態において、本開示は、ｉＣＭ細胞を生成する方法であって、核酸（例えばデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ））としての目的のポリヌクレオチド、例えばＡＳＣＬ１および／またはＭＹＦ６を、ポリヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ））として標的細胞に導入するステップを含む、方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当業界において公知の様々な手段のいずれかで、例えば、これらに限定されないが、ウイルス、非ウイルスベクター中で、細胞を、裸のポリヌクレオチドまたはトランスフェクション試薬と複合体化したポリヌクレオチドと接触させることによって、または電気穿孔によって細胞に導入することができる。目的の遺伝子の核酸としての使用としてはまた、目的の遺伝子の発現または活性の間接的な変更、例えば、内因性遺伝子をコードする遺伝子座の遺伝子編集、転写もしくは調節因子の発現、細胞を目的の遺伝子の小分子活性化剤と接触させること、または核酸としての目的の遺伝子の発現もしくは活性を変更するためのＤＮＡもしくはＲＮＡベースの方法を含む遺伝子編集方法の使用も挙げることができる。一部の実施形態において、本開示の方法は、調節領域（例えばエンハンサーまたはプロモーター）を編集すること、スプライス部位を変更すること、マイクロＲＮＡ認識部位を除去もしくは挿入すること、アンタゴミアを投与してマイクロＲＮＡを抑制すること、マイクロＲＮＡ模倣剤を投与すること、または目的の遺伝子の発現もしくは活性をモジュレートする他のあらゆる様々な手段によって、目的の遺伝子の転写を脱抑制するステップを含む。
「遺伝子産物」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列発現の生成物を意味する。例えば、タンパク質をコードする配列は、配列のタンパク質遺伝子産物への翻訳によって発現され、またはＲＮＡをコードする配列は、ＤＮＡ配列の対応するＲＮＡへの転写によって発現される。
用語「全能性」は、本明細書で使用される場合、生物の全ての細胞系統を形成する細胞の能力を意味する。例えば、哺乳動物では、接合体および最初の卵割期の割球のみが全能性を有する。
用語「多能性」は、本明細書で使用される場合、体または体細胞の全ての系統を形成する細胞の能力を意味する。例えば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、すなわち外胚葉、中胚葉、および内胚葉のそれぞれから細胞を形成することができるタイプの多能性幹細胞である。多能性細胞は、そのマーカー発現、例えばＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１によって認識することができる。
用語「複能性」は、本明細書で使用される場合、１つの系統の複数の細胞型を形成する成体幹細胞の能力を指す。例えば、造血幹細胞は、血液細胞系統の全ての細胞、例えばリンパ球および骨髄性細胞を形成することが可能である。
用語「少能性」は、本明細書で使用される場合、ほんのわずかな異なる細胞型に分化する成体幹細胞の能力を指す。例えば、リンパ球または骨髄幹細胞は、それぞれリンパ球または骨髄系統のいずれかの細胞を形成することが可能である。
用語「単分化能」は、本明細書で使用される場合、単一の細胞型を形成する細胞の能力を意味する。例えば、精原幹細胞は、精細胞を形成する能力しかない。
用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、家畜化された動物、動物園の動物、またはヒトなどのあらゆる動物を指す。「対象」または「患者」は、イヌ、ネコ、ウマ、獣畜、動物園の動物、またはヒトのような哺乳動物であってもよい。対象または患者はまた、トリ、ペット、または農場の動物などのあらゆる家畜化された動物であってもよい。「対象」および「患者」の具体的な例としては、これらに限定されないが、心臓の疾患または障害を有する個体、および心臓障害に関連する特徴または症状を有する個体が挙げられる。
本開示の実施は、別段の指定がない限り、当業界の技術の範囲内である、組織培養、免疫学、分子生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を採用すると予想される。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyのシリーズ；Methods in Enzymologyのシリーズ(Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach
(IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al. (1995) PCR
2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of
Basic Technique, 5thedition；Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；米国特許第４，６８３，１９５号；Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid
Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation；IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology；Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition
(2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)；Sell (2013) Stem Cells Handbookを参照されたい。
文脈上別段の指定がない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特色は、あらゆる組合せで使用できることが具体的に意図される。さらに、本開示はまた、一部の実施形態において、本明細書に記載のいずれの特色または特色の組合せを除外または省略してもよいことも予期する。例示すれば、明細書で複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと述べられる場合、Ａ、ＢもしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを省略し、単独で、またはあらゆる組合せで権利放棄することができることが具体的に意図される。
全ての数値の表示、例えばｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲も含めて、１．０または０．１の増分の（＋）または（－）で変化する、必要に応じて、または代替として、±１５％、または代替として１０％、または代替として５％、または代替として２％の変化量で変化するおよその値である。必ずしも明示的に述べられるとは限らないが、全ての数値の表示は、用語「約」が前に付くことが理解されるものとする。このような範囲の様式は、便宜上および簡潔さのために使用され、範囲の限定として明示的に特定された数値を含むが、その範囲内に包含される全ての個々の数値または部分範囲も、各数値および部分範囲が明示的に特定されているかのように含むことが柔軟に理解されるべきであることが理解されると予想される。例えば、約１から約２００の範囲での比率は、約１および約２００の明示的に列挙された限定を含むが、約２、約３、および約４などの個々の比率、ならびに例えば約１０から約５０、約２０から約１００などの部分範囲も含むと理解されるべきである。また、必ずしも明示的に述べられるとは限らないが、本明細書に記載される試薬は単なる例示であり、このようなものの均等物が当業界において公知であることも理解されるべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「心筋細胞（ａ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」への言及は、複数の心筋細胞を含む。
「および／または」はまた、本明細書で使用される場合、関連する列挙された項目の１つまたは複数のありとあらゆる可能な組合せ、加えて、選択肢（「または」）として解釈される場合、組合せの除外も指し、それらを包含する。
「投与」、「投与すること」などは、本発明の組成物と関連して使用される場合、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける非心筋細胞への投与、ｉｎ ｖｉｖｏにおける非心筋細胞への投与、医療従事者による対象への投与、もしくは対象による自己投与による投与であり得る直接投与、および／または本発明の組成物を処方する動作であり得る間接投与の両方を指す。本明細書において細胞への言及で使用される場合、これは、組成物を細胞に導入することを指す。典型的には、有効量が投与され、この量は、当業者によって決定することができる。あらゆる投与方法を使用することができる。小分子は、例えば、細胞培養培地への小分子の添加によって、または心臓の傷害の部位へのｉｎ ｖｉｖｏでの注射によって、細胞に投与してもよい。対象への投与は、例えば、血管内注射、心筋内送達などによって達成することができる。
用語「心細胞」は、本明細書で使用される場合、心臓収縮もしくは血液供給などの心機能をもたらす、またはそれ以外の方法で心臓の構造を維持するのに役立つ、心臓中に存在するあらゆる細胞を指す。心細胞は、本明細書で使用される場合、心臓の心外膜、心筋または心内膜中に存在する細胞を包含する。心細胞としてはまた、例えば、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）または心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）、および心臓の血管系の細胞、例えば冠動脈または静脈の細胞も挙げられる。心細胞の他の非限定的な例としては、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、心筋を構成する心臓伝導細胞および心臓ペースメーカー細胞、血管および心細胞を支持する構造が挙げられる。心細胞は、幹細胞から、例えば胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞などから得ることができる。
用語「心筋細胞（単数）」または「心筋細胞（複数）」は、本明細書で使用される場合、骨格筋細胞とは対照的に、哺乳動物の心臓に天然に見出されるサルコメアを含有する横紋筋細胞を指す。心筋細胞は、特殊化した分子、例えば、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、心臓α－アクチニンのようなタンパク質の発現によって特徴付けられる。用語「心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、あらゆる心筋細胞の部分集団または心筋細胞のサブタイプ、例えば、心房、心室およびペースメーカー心筋細胞を含む包括的な用語である。
用語「心筋細胞様細胞」は、心筋細胞と特色を共有するが、全ての特色を共有していなくてもよい細胞を意味することが意図される。例えば、心筋細胞様細胞は、ある特定の心臓の遺伝子の発現において心筋細胞と異なっていてもよい。
用語「培養」または「細胞培養」は、人工的なｉｎ ｖｉｔｒｏの環境中での細胞の維持を意味する。「細胞培養系」は、本明細書において、細胞の集団を、単分子層として、または懸濁液中で成長させることができる培養条件を指すものとして使用される。「培養培地」は、本明細書において、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養素溶液を指すために使用される。培養培地は、これらに限定されないが、特定の状態（例えば、多能性の状態、休止状態の状態など）で細胞を維持する能力、または細胞を成熟させる能力、例えば、一部の実施形態において、前駆細胞の特定の系統の細胞（例えば、心筋細胞）への分化を促進する能力などの機能特性によって、特徴付けることができる。
用語「発現」または「発現する」は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来の場合、発現は、真核細胞において、ｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定することができる。
「発現カセット」は、本明細書で使用される場合、宿主細胞中でポリヌクレオチドを発現するように構成される、タンパク質または核酸をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むＤＮＡポリヌクレオチドである。典型的には、ポリヌクレオチドの発現は、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーなどのある特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このようなポリヌクレオチドは、調節エレメント（例えば、プロモーター）に「作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」と言われる。
用語「誘導心筋細胞」または略語「ｉＣＭ」は、心筋細胞（および／または心筋細胞様細胞）に形質転換した非心筋細胞（およびその後代）を指す。本開示の方法は、例えば他の技術を強化するために、誘導心筋細胞を生成するための、現在公知の、または後に発見されるあらゆる方法と併せて使用することができる。
用語「非心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、本明細書において定義および使用されるような「心筋細胞」の基準を満たさない細胞調製物中のあらゆる細胞または細胞の集団を指す。非心筋細胞の非限定的な例としては、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓性の線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。
語句「薬学的に許容される」は、本明細書において、確実な医療的判断の範囲内であり、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に好適であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー性応答、または他の問題もしくは合併症をもたらすことなく、適度なベネフィット／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために用いられる。
用語「再生する」、「再生」などは、傷害を受けた心臓組織に関して本明細書で使用される場合、その通常の意味が与えられるものとし、傷害を受けた、例えば、虚血、梗塞、再灌流、または他の疾患による傷害を受けた心臓または心臓組織中で、新しい心臓組織を成長および／または発達させるプロセスも指すものとする。一部の実施形態において、心臓組織再生は、心筋細胞の生成を含む。
用語「リプログラミング」または「分化転換」は、本明細書で使用される場合、多能性幹細胞の特徴を呈する細胞に細胞を脱分化させる中間プロセスを経ずに、異なるタイプの細胞（例えば、線維芽細胞）からある特定の系統の細胞（例えば、心細胞）を生成することを指す。「リプログラミング」は、本明細書で使用される場合、分化転換、脱分化などを含む。
「リプログラミング活性」は、本明細書で使用される場合、タンパク質またはポリヌクレオチドが、単独で、またはリプログラミング活性を有する他のタンパク質もしくはポリヌクレオチドと組み合わせて細胞に導入されるかまたは細胞によって発現されると、心筋細胞または心筋細胞様細胞への細胞のリプログラミングを誘導または促進するリプログラミング活性を有するタンパク質またはポリヌクレオチドの能力を指す。例えば、第１のタンパク質は、他の因子を有さない細胞中での第１のタンパク質の発現が細胞のリプログラミングを誘導または促進する場合、リプログラミング活性を有するが、この用語が本明細書において使用される場合、第１のタンパク質が、第２のタンパク質と組み合わされて、すなわち第１のタンパク質と第２のタンパク質の両方が一緒に発現されるとき、リプログラミングを促進する場合も、第１のタンパク質はリプログラミング活性を有する。
用語「リプログラミング効率」は、本明細書で使用される場合、試料中の細胞の総数に対する、心筋細胞にうまくリプログラミングされる試料中の細胞の数を指す。
用語「リプログラミング因子」は、本明細書で使用される場合、細胞の誘導心筋細胞へのリプログラミングを助けるように細胞で発現させるために導入される因子を含む。リプログラミング因子としては、タンパク質および核酸（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡなどのＲＮＡ）が挙げられる。
用語「幹細胞」は、自己再生する、および分化した後代を生成する能力を有する細胞を指す。用語「多能性幹細胞」は、３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞を生じさせることができるが、完全な生物を生じさせる能力を有さない幹細胞を指す。
「処置」、「処置すること」、および「処置する」は、疾患、障害、状態および／またはそれらの症状の有害な、または他のあらゆる望ましくない作用を低減または緩和するための薬剤で、疾患、障害、または状態に作用することとして定義される。
用語「有効量」などは、本明細書で使用される場合、所望の生理学的な結果（例えば、細胞のリプログラミングまたは疾患の処置）を誘導するのに十分な量を指す。有効量は、１つまたは複数の投与、適用または投薬量で投与することができる。このような送達は、個々の投薬量単位が使用されると予想される期間、組成物の生物学的利用率、投与経路などを含むいくつかの変数に依存する。しかしながら、いずれか特定の対象のための組成物（例えば、リプログラミング因子）の具体的な量は、採用される具体的な薬剤の活性、対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事、投与の時間、排泄率、組成物の組合せ、処置されている特定の疾患の重症度、ならびに投与の形態などの様々な因子に依存することが理解される。
ポリペプチドまたは核酸配列への言及における用語「その均等物」は、本明細書で使用される場合、参照ポリペプチドまたは核酸配列とは異なるが、必須の特性（例えば、生物学的活性）を保持するポリペプチドまたは核酸を指す。ポリヌクレオチドの典型的なバリアントは、別の参照ポリヌクレオチドと、ヌクレオチド配列の点で異なる。バリアントのヌクレオチド配列における変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更してもよいし、または変更しなくてもよい。ヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされたポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、欠失、付加、融合および短縮化をもたらし得る。一般的に、差は、参照ポリペプチドおよびバリアントの配列が全体として厳密に類似し、多くの領域において同一になるように限定される。
用語「単離された」は、自然状態で細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片が通常付随する、細胞性およびそれ以外の成分から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、非類似の表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。当業者には明白であるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または細胞は、それをその天然に存在するカウンターパートから区別するために、「単離」を必要としない。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはその類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、直鎖状および環状の核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、およびプライマーが挙げられる。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用され、あらゆる長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、それは、遺伝学的にコードされた、および遺伝学的にコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に改変された、または誘導体化されたアミノ酸、および改変されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含み得る。この用語は、融合タンパク質、これらに限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基含有または非含有の、異種のおよび相同なリーダー配列との融合体、免疫学的にタグ付けされたタンパク質などを含む。
遺伝子名が前に付く「ポリヌクレオチド」という単語（例えば、「ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド」）は、本明細書で使用される場合、対応するタンパク質（例えば、「ＭＹＯＣＤタンパク質」）をコードするポリヌクレオチド配列を指す。
遺伝子名が前に付く「タンパク質」という単語（例えば、「ＭＹＯＣＤタンパク質」）は、本明細書で使用される場合、天然のタンパク質またはその機能的なバリアントのいずれかを指す。「天然のタンパク質」は、遺伝子の機能的なアイソフォームまたは機能的な対立遺伝子変異のいずれかで、生物、好ましくは、ベクターが目的とする生物（例えば、ヒト、げっ歯類、霊長類、または獣医学的対象の動物）の遺伝子のゲノムコピーによってコードされたタンパク質である。
タンパク質の「機能的なバリアント」または「バリアント」は、本明細書で使用される場合、タンパク質の機能的な特性、例えば、他の因子と組み合わせて細胞の心筋細胞へのリプログラミングを誘導するタンパク質の能力などを保持する、あらゆる数のアミノ酸の置換、挿入、短縮化、または内部の欠失を有するバリアントである。機能的なバリアント、例えば保存的置換のみを有するバリアントなどは、コンピューターにより同定してもよいし、または実験的にｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏのアッセイを使用して同定してもよい。
ポリヌクレオチド配列の「コドンバリアント」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の同義コドン置換を有する参照ポリヌクレオチド配列と同じタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列である。同義コドンの選択は、当業者の能力の範囲内であり、そのコードは遺伝子コードとして公知である。コドン最適化は、様々なコンピューターによるツール（例えばｗｗｗ．ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍで入手可能なＧＥＮＳＭＡＲＴ（商標）コドン最適化ツール）を使用して実行することができる公知の技術である。一般的に、コドン最適化は、異種の系におけるタンパク質の発現を増加させるのに使用され、例えばヒトコード配列を細菌系で発現させる場合に使用される。用語「コドンバリアント」は、この方式で最適化されている配列と、他の目的で、例えばＣｐＧアイランドおよび／または隠れた開始部位の除去の目的で、最適化されている配列の両方を包含することが意図される。
用語「前駆細胞」は、本明細書で使用される場合、特定のタイプの細胞に分化する、または特定のタイプの組織を形成することが決まっている細胞を指す。前駆細胞は、幹細胞のように、さらに１つまたは複数の種類の細胞に分化することができるが、それがより限定的な／制限された分化能力を有するように、幹細胞より成熟した状態である。
用語「ベクター」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達しようとするポリヌクレオチドまたはタンパク質を含む巨大分子または分子の複合体を指す。ベクターは、改変されたＲＮＡ、脂質ナノ粒子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを封入する）、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、または非組み込み型ＬＶＶであり得る。したがって、「ベクター」は、本明細書で使用される場合、形質転換に使用される裸のポリヌクレオチド（例えばプラスミド）、加えて、細胞にポリヌクレオチドを送達するのに使用される他のあらゆる組成物を含み、例えば、細胞を形質導入することが可能なベクターおよび細胞のトランスフェクションに有用なベクターが挙げられる。「ベクター系」は、１、２、３つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを送達するのに使用される１、２、３つまたはそれより多くのベクターの組合せを指す。例えば、一部の実施形態において、２つのポリヌクレオチドを送達するのに、２つのウイルスベクター（例えば２つのＡＡＶベクター）を使用してもよいし、または３つのポリヌクレオチドを送達するのに、３つのウイルスベクター（例えば２つのＡＡＶベクター）を使用してもよい。例えば、１つのＡＡＶは、ＭＹＯＣＤまたはそのバリアントをコードしていてもよく、別のＡＡＶは、ＡＳＣＬ１またはそのバリアントをコードしていてもよい。代替として、複数のベクターが、トランスフェクション後組換えを介して、単一のポリヌクレオチドを送達するのに使用されてもよい。大きい遺伝子の送達のための二重のベクター系は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるMcClements et al. Yale J.
Biol. Med. 90:611-23 (2017)に記載されている。
用語「ウイルスベクター」は、本明細書で使用される場合、典型的には核酸分子の移行もしくは細胞のゲノムへの組み込みを容易にするウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子か、または核酸の移行を媒介するウイルス粒子のいずれかを指す。ウイルス粒子は、典型的には、様々なウイルス成分を含み、時には核酸に加えて細胞成分も含むと予想される。
用語「遺伝子改変」は、新しい核酸（すなわち、細胞にとって外因性の核酸）の導入後に細胞中で誘導された永続的または一時的な遺伝子変化を指す。遺伝子変化は、心細胞のゲノムに新しい核酸を取り込むことによって、または新しい核酸の染色体外エレメントとしての一時的もしくは安定な維持によって達成することができる。細胞が真核細胞である場合、永続的な遺伝子変化は、細胞のゲノムへの核酸の導入によって達成することができる。遺伝子改変の好適な方法としては、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、電気穿孔、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接のマイクロインジェクションなどが挙げられる。
用語「幹細胞」は、自己再生する、および分化した後代を生成する能力を有する細胞を指す。用語「多能性幹細胞」は、３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の細胞を生じさせることができるが、完全な生物を生じさせる能力を有さない幹細胞を指す。一部の実施形態において、心筋細胞表現型を誘導するための組成物は、細胞の集団に使用してリプログラミングを誘導することができる。他の実施形態において、組成物は、心筋細胞表現型を誘導する。
用語「誘導多能性幹細胞」は、その通常の意味を与えられるものとし、少なくとも１つの多能性の特徴を呈するようにリプログラミングされた分化した哺乳動物体細胞（例えば、成体体細胞、例えば皮膚）も指すものとする。例えば、Takahashi et al. (2007) Cell 131(5):861-872、Kim et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108(19):7838-7843、Sell (2013) Stem Cells Handbookを参照されたい。
別段の指定がない限り、明細書中で使用される略語は、以下の意味を有する：ＡＨＣＦ、成体ヒト心臓線維芽細胞、ＡＰＣＦ、成体ブタ心臓線維芽細胞、ａ－ＭＨＣ－ＧＦＰ、アルファ－ミオシン重鎖緑色蛍光タンパク質；ＣＡＧ、ＣＭＶ初期エンハンサー／ニワトリベータアクチン（プロモーター）；ＣＦ、心臓線維芽細胞；ｃｍ、センチメートル；ＣＯ、心拍出量；ＥＦ、駆出率；ＦΑＣＳ、蛍光活性化セルソーティング；ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＧＭＴ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５；ＧＭＴｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦ－βｉ、ＷＮＴｉ；ＧＯ、遺伝子オントロジー；ＨＣＦ、ヒト心臓線維芽細胞；ｉＣＭ、誘導心筋細胞；ＬＡＤ、左前下行枝（動脈）；ｋｇ、キログラム；μｇ、マイクログラム；μｌ、マイクロリットル；ｍｇ、ミリグラム；ｍｌ、ミリリットル；ＭＩ、心筋梗塞；ｍｓｅｃ、ミリ秒；ｍｉｎ、分；ＭｙＡＭＴ、ミオカルディン、Ａｓｃｌ１、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５；ＭｙＡ、ミオカルディンおよびＡｓｃｌ１；ＭｙＭＴ、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃおよびＴｂｘ５；ＭｙＭＴｃ、ミオカルディン、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、ＴＧＦ－βｉ、ＷＮＴｉ；ＭＲＩ、磁気共鳴画像法；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＰＢＳＴ、リン酸緩衝食塩水、トリトン（triton）；ＰＦＡ、パラホルムアルデヒド；ｑＰＣＲ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ｑＲＴ－ＰＣＲ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；ＲＮＡ、リボ核酸；ＲＮＡ－ｓｅｑ、ＲＮＡシーケンシング；ＲＴ－ＰＣＲ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応；ｓｅｃ、秒；ＳＶ、一回拍出量；ＴＧＦ－β、トランスフォーミング増殖因子ベータ；ＴＧＦ－βｉ、トランスフォーミング増殖因子ベータ阻害剤；ＷＮＴ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ；ＷＮＴｉ、ｗｉｎｇｌｅｓｓ－Ｉｎｔ阻害剤；ＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質；ＳＣＰ、スーパーコアプロモーター；４Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、およびミオカルディン；４Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、ＴＢＸ５、ならびにミオカルディン＋ＴＧＦ－βｉおよびＷＮＴｉ；７Ｆ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｒｒｇ、ミオカルディン、Ｚｆｐｍ２、およびＭｅｓｐ１；７Ｆｃ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、およびＴｂｘ５、Ｅｓｒｒｇ、ミオカルディン、Ｚｆｐｍ２、ならびにＭｅｓｐ１＋ＴＧＦ－βｉおよびＷＮＴｉ。
本開示の詳細な説明は、単に読み手の便宜上様々なセクションに分けられ、いずれのセクションに見出される開示も、別のセクションでの開示と組み合わせることができる。別段の指定がない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似した、またはそれと同等ないずれの方法および材料も本発明の実施または試験で使用できるが、好ましい方法および材料をここに記載する。本明細書で述べられた全ての出版物は、それらの出版物が引用されるものに関連する方法および／または材料を開示および記載するために参照により組み込まれる。
ＩＩ．リプログラミング因子
一部の実施形態において、本開示は、１つまたは複数の遺伝子、例えば目的のポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現をモジュレートすることが可能な、リプログラミング因子およびその組成物を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、分化した細胞が、１つまたは複数の遺伝子、例えば目的のポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現をモジュレートする１つまたは複数のリプログラミング因子、例えば、Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ相同体１（ＡＳＣＬ１）、筋原性因子６（ＭＹＦ６）、ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）、筋細胞特異的エンハンサー因子２Ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）、および／またはＴボックス転写因子５（ＴＢＸ５）を使用して、誘導心筋（ｉＣＭ）細胞にリプログラミングされ得ることを発見した。一部の実施形態において、１つまたは複数のリプログラミング因子は、１つまたは複数の遺伝子、例えば目的のポリヌクレオチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡポリヌクレオチド）として提供される。一部の実施形態において、１つまたは複数のリプログラミング因子は、タンパク質として提供される。
一部の実施形態において、リプログラミング因子は、１つまたは複数の遺伝子、例えば目的のポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を増加させることが可能な、マイクロＲＮＡもしくはマイクロＲＮＡアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、または小分子である。一部の実施形態において、目的の遺伝子の発現は、目的の遺伝子が発現される転写物中のマイクロＲＮＡ標的部位を標的化するマイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡアンタゴニストの発現によって減少する。代替として、一部の実施形態において、目的の遺伝子の発現は、マイクロＲＮＡまたはマイクロＲＮＡアンタゴニストの発現によって増加する。例えば、Ｏｃｔ４ポリペプチドの内因性発現は、マイクロＲＮＡ－３０２（ｍｉＲ－３０２）の導入によって、またはＯｃｔ４の負の調節因子を標的化するｍｉＲ－３０２の発現増加によって、間接的に増加させることができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるHu et al., Stem Cells 31(2):259-68 (2013)を参照されたい。したがって
、ｍｉＲＮＡ－３０２は、内因性Ｏｃｔポリペプチド発現の間接的な誘導物質であり得る。ｍｉＲＮＡ－３０２は、単独で導入してもよいし、またはＯｃｔポリペプチドをコードする核酸と共に導入してもよい。
一部の実施形態において、リプログラミング因子は、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、デキサメタゾン、ＬＹ３６４９４７、Ｄ４４７６、ミリセチン、ＩＷＲ１、ＸＡＶ９３９、ドコサヘキサ塩酸（ＤＨＡ）、Ｓ－ニトロソ－ＴＶ－アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｈｈ－Ａｇｌ．５、アルプロスタジル、クロマカリム、ＭＮＩＴＭＴ、Ａ７６９６６２、レチノイン酸ｐ－ヒドロキシアニリド（hydoxyanlide）、二臭化デカメトニウム（decamethonium dibromide）、ニフェジピン、ピロキシカム、バシトラシン、アズトレオナム、ハルマロール塩酸塩、アミド－Ｃ２（Ａ７）、Ｐｈ－Ｃ１２（ＣＩＯ）、ｍＣＦ３－Ｃ－７（Ｊ５）、Ｇ８５６－７２７２（Ａ４７３）、５４７５７０７、またはそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される小分子である。
Ａ．目的の遺伝子（目的のポリヌクレオチドおよびタンパク質）
一部の実施形態において、本明細書で提供される１つまたは複数のリプログラミング因子は、１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートする（例えば、増加または減少させる）。一部の実施形態において、１つまたは複数の標的遺伝子は、心筋細胞の分化、増殖、および／または機能に関与することがわかっている。一部の実施形態において、１つまたは複数の標的遺伝子は、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５からなる群から選択される。一部の実施形態において、１つまたは複数の標的遺伝子は、心筋細胞の分化、増殖、および／もしくは機能に関与することがこれまでに記載されていないか、または非心臓細胞系統、例えばＡＳＣＬ１の分化、増殖、および／もしくは機能に関与することがこれまでに記載されている。本開示の組成物および方法において有用な例示的な遺伝子配列は、表１に提供される。所与の目的の遺伝子の１つより多くのアイソフォームが公知である場合、本開示の実施形態は、各目的の遺伝子の代替のアイソフォームを含む組成物および方法を含むことが理解されるであろう。本開示の組成物および方法は、開示された配列に限定されず、これらは例および例示のために提供され、非限定的である。
一部の実施形態において、本開示は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートするリプログラミング因子を提供する。一部の実施形態において、本明細書で開示されたリプログラミング因子は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５、ＣＣＮＢ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＡＵＲＫＢ、ＯＣＴ４、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、およびＺＦＰＭ２から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートする。
一部の実施形態において、本明細書で開示されたリプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（すなわち、ＧＭＴ）から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートする。一部の実施形態において、本明細書で開示されたリプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＭＴ）から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートする。一部の実施形態において、本明細書で開示されたリプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＡＭＴ）から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートする。一部の実施形態において、本明細書で開示されたリプログラミング因子は、ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１（すなわち、ＭｙＡ）から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートする。一部の実施形態において、本明細書で開示されたリプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、およびＭＹＯＣＤ（すなわち、４Ｆ）から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートする。他の実施形態において、本明細書で開示されたリプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＥＳＲＲＧ、ＭＹＯＣＤ、ＺＦＰＭ２、およびＭＥＳＰ１（すなわち、７Ｆ）から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートする。
一部の実施形態において、本開示は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＤＬＸ３、ＤＬＸ６、ＧＡＴＡ２、およびＧＡＴＡ５から選択される１つまたは複数の目的の遺伝子の発現をモジュレートするリプログラミング因子を提供する。
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 操作されたミオカルディン
別の態様において、本開示は、ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）の操作されたバリアント、例えば米国仮特許出願第６２／７８８，４７９号に記載されたような、より小さいオープンリーディングフレームから発現された操作されたＭＹＯＣＤに関する。出願人は、内部の欠失を含むＭＹＯＣＤは、ミオカルディンの発現および機能を保持し、内部の欠失を含むＭＹＯＣＤは、単独で、または他のリプログラミング因子（例えば、線維芽細胞から心筋細胞を生成するための）と組み合わせて使用できることを見出した。本開示の一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、天然のミオカルディン（図９Ａ；配列番号３）のアミノ酸４１４～７６４に対応する領域に、少なくとも５０アミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤは、内部の欠失を有する１または３つのミオカルディンバリアント：残基４１４～７６３の欠失を有するＭｙΔ１（図９Ｂ；配列番号１４）；残基４３９～７６３の欠失を有するＭｙΔ２（図９Ｃ；配列番号１５）；および好ましくは残基５６０～７６３の欠失を有するＭｙΔ３（図９Ｄ；配列番号１６）から選択される。
一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドである。「ＭＹＯＣＤ」または「ミオカルディン」は、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質または好ましくは天然のＭＹＯＣＤのいずれかを指す。一部の実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、最大で５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０個またはそれらの間のあらゆる数のアミノ酸の長さを有する操作されたミオカルディンタンパク質をコードする。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、ＳＲＦ相互作用ドメイン、ＳＡＰドメイン、およびＴＡＤドメインを含む。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、Ｍｅｆ２Ｃ相互作用ドメインをさらに含む。一部の実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、天然のミオカルディン（配列番号３）のアミノ酸４１４～７６４に対応する領域に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、または３５０アミノ酸の欠失を有する、操作されたミオカルディンタンパク質をコードする。表２に、ミオカルディンの操作で使用される様々な配列を提供する。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤの種間保存は残基５から始まるため、ＭＹＯＣＤの約４個のＮ末端残基は、省略されているかまたは変更されている。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤのＮ末端からのさらなる残基が、省略されているかまたは変更されている。
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一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメイン、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、ＬＺドメイン、およびＴＡＤドメインの１つまたは複数を含む。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメイン、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、ＬＺドメイン、およびＴＡＤドメインを含む。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメイン、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、およびＴＡＤドメインを含む。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、ＬＺドメイン、およびＴＡＤドメインを含む。一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、およびＴＡＤドメインを含む。
一部の実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤは、操作されたＭＹＯＣＤ、および必要に応じて１つまたは複数の他の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして提供される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭＹＯＣＤのアイソフォームのいずれかとの同一性を有する。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭｙΔ１（配列番号１４）、ＭｙΔ２（配列番号１５）、およびＭｙΔ３（配列番号１６）から選択される配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。一部の実施形態において、操作されたＭＹＯＣＤタンパク質は、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメイン、ＳＲＦドメイン、ＳＡＰドメイン、ＬＺドメイン、およびＴＡＤドメインのうち、少なくとも２、３、４、５つを含む。一部の実施形態において、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインは、配列番号１７に、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。一部の実施形態において、ＳＲＦドメインは、配列番号１８に、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。一部の実施形態において、ＳＡＰドメインは、配列番号１９に、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。一部の実施形態において、ＬＺドメインは、配列番号２０に、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。一部の実施形態において、ＴＡＤドメインは、配列番号１１に、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、リンカーによって連結された天然のＭＹＯＣＤの２つまたはそれより多くの断片を含む。一般的に、リンカーは、ペプチド結合またはポリペプチド配列のいずれかを指す。一部の実施形態において、他のリンカーが使用され、例えば、当業界において公知のペプチド化学で使用される様々な化学的リンカーのいずれかが使用される。「ペプチド結合」への言及は、２つの配列が一体化して、いかなる介在アミノ酸残基も含まない複合配列を生成することを意味する。例えば、ＭｙΔ３（配列番号１６）は、ペプチド結合によってＭＹＯＣＤ７６４～９８６（配列番号１１）に合体したＭＹＯＣＤ１～５５９（配列番号１３）を含む。一部の実施形態において、リンカーは、当業界においてリンカーとして使用される様々なポリペプチドのいずれかであり、例えば、これらに限定されないが、グリシン－セリンリンカー、例えばＧ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＳＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＳＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３４）などである。一部の実施形態において、リンカーは、ＭＹＯＣＤ以外のタンパク質のドメインである。
本開示にわたり、ポリヌクレオチドの発現は、目的の遺伝子の発現を増加させることが当業界において公知のあらゆる手段を指す場合がある。一部の実施形態において、目的の遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）中にコードされている。ｍＲＮＡは、合成であってもよいし、または天然に存在していてもよい。一部の実施形態において、ｍＲＮＡは、当業界において公知の様々な方法で化学的に改変されている。例えば、例えばWarren, L. et al. Cell Stem Cell 7:618-30 (2010)；ＷＯ２０１４０８１５０７Ａ１；ＷＯ２０１２０１９１６８；ＷＯ２０１２０４５０８２；ＷＯ２０１２０４５０７５；ＷＯ２０１３０５２５２３；ＷＯ２０１３０９０６４８；ＵＳ９５７２８９６Ｂ２に記載されるように、改変されたＲＮＡが使用されてもよい。一部の実施形態において、目的の遺伝子の発現は、ポリヌクレオチドの細胞への送達によって増加する。一部の実施形態において、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスまたは非ウイルスベクターによって送達される。一部の実施形態において、目的の遺伝子は、ＤＮＡポリヌクレオチド中にコードされ、必要に応じて、当業界において公知のあらゆるウイルスまたは非ウイルス方法によって送達される。一部の実施形態において、本開示は、細胞を、目的の遺伝子をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本開示の方法は、細胞を、目的の遺伝子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ＤＮＡゲノム、ネガティブセンスＲＮＡゲノム、ポジティブセンスＲＮＡゲノム、または二本鎖ＲＮＡゲノム）を含むウイルスと接触させるステップを含む。一部の実施形態において、ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、非組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および組み込み型ＬＶＶから選択される。一部の実施形態において、細胞は、プラスミドでトランスフェクトされる。一部の実施形態において、プラスミドは、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、プラスミドは、リプログラミング因子を含むトランスポゾンを含む。
Ｂ．目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
一部の実施形態において、リプログラミング因子は、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして提供される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドにわたり、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ＡＳＣＬ１のアイソフォームのいずれかとの同一性を有する。一部の実施形態において、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドは、ヒトＡＳＣＬ１の配列（配列番号１）と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＡＳＣＬ１タンパク質をコードする。
一部の実施形態において、リプログラミング因子は、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして提供される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはｍＲＮＡポリヌクレオチドである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドにわたり、ヒトＭＹＦ６（配列番号５６）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＭＹＦ６ポリヌクレオチドは、ＭＹＦ６のアイソフォームのいずれかとの同一性を有する。一部の実施形態において、ＭＹＦ６ポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＦ６（配列番号５５）の配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＭＹＦ６タンパク質をコードする。
一部の実施形態において、本開示の組成物および方法は、ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）ポリヌクレオチド、筋細胞特異的エンハンサー因子２Ｃ（ＭＥＦ２Ｃ）ポリヌクレオチド、およびＴボックス転写因子（ＴＢＸ５）ポリヌクレオチドの１つまたは複数を含むｉＣＭ細胞、またはそれを投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態において、本開示の組成物および方法は、ミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）ポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む組換えウイルス、またはそれを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、本開示の組成物および方法は、操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む組換えウイルス、またはそれを投与するステップを含む方法を提供する。
一部の実施形態において、本開示の組成物および方法は、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含むｉＣＭ細胞もしくは組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター、またはＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号３）の配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドにわたり、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号４）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、ＭＹＯＣＤのアイソフォームのいずれかとの同一性を有する。
一部の実施形態において、操作されたミオカルディンタンパク質は、操作されたミオカルディンタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして提供される。
一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、操作されたＭＹＯＣＤ（例えば、配列番号１４）の配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。
一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、操作されたＭＹＯＣＤ（例えば、配列番号１５）の配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。
一部の実施形態において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドは、操作されたＭＹＯＣＤ（例えば、配列番号１６）の配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＭＹＯＣＤタンパク質をコードする。
一部の実施形態において、本開示の組成物および方法は、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチドを含むｉＣＭ細胞もしくは組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター、またはそれを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチドは、ヒトＭＥＦ２Ｃ（配列番号５）の配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＭＥＦ２Ｃタンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチドは、少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドにわたり、ヒトＭＥＦ２Ｃ（配列番号６）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチドは、ＭＥＦ２Ｃのアイソフォームのいずれかとの同一性を有する。
一部の実施形態において、本開示の組成物および方法は、ＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含むｉＣＭ細胞もしくは組換えウイルスもしくは非ウイルスベクター、またはそれを投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、ＴＢＸ５ポリヌクレオチドは、ヒトＴＢＸ５（配列番号７）の配列と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のＴＢＸ５タンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＴＢＸ５ポリヌクレオチドは、少なくとも１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチドにわたり、ヒトＴＢＸ５（配列番号８）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する。一部の実施形態において、ＴＢＸ５ポリヌクレオチドは、ＴＢＸ５のアイソフォームのいずれかとの同一性を有する。ＴＢＸ５ポリペプチドは、予測された核局在化配列（ＮＬＳ）、ＫＲＫＥＥＥＣＳＴＴＤＨＰＹＫＫＰＹＭＥ（配列番号９）を含有する。一部の実施形態において、ＴＢＸ５ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドのＮＬＳは、機能的なＮＬＳである。
一部の実施形態において、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。合成ｍＲＮＡは、目的のタンパク質を作製するための遺伝情報を提供し、免疫応答の誘発を回避するように化学的に改変されていてもよい。Zangi et al. (2013) Nature Biotech 31 :898-907。ｍＲＮＡは宿主細胞ゲ
ノムに組み込まれないため、合成ｍＲＮＡは所定期間作用し、次いで細胞分裂に伴い消失する。一部の実施形態において、合成ｍＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡに対する生来の抗ウイルス性応答を低減させるために、例えば、プソイドウリジンおよび／または５－メチル－シチジンで改変されている。
一部の実施形態において、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コードされた遺伝子の機能的な活性が保存される限り、コドン最適化されていてもよいし、またはそれ以外の方法で変更されていてもよい。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コードされた遺伝子の機能的な活性が保存される限り、短縮化、挿入、欠失、または断片を含む改変された１つまたは複数の目的の遺伝子またはそのバリアントをコードする。
一部の実施形態において、１つまたは複数の目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、発現カセット中に含まれる。一部の実施形態において、発現カセットは、１つまたは複数の目的の遺伝子をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む。例えば、一部の実施形態において、発現カセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の目的の遺伝子をコードする、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のポリヌクレオチドを含む。
細胞中で２つまたはそれより多くの目的のタンパク質を発現させようとする場合、１つまたはポリヌクレオチドまたは発現カセットを使用することができることが理解されるであろう。例えば、ポリシストロン性発現カセットを使用することができ、この場合、１つの発現カセットが、複数のタンパク質を発現する複数のポリヌクレオチドを含むことができる。一部の実施形態において、ポリシストロン性発現カセットは、単一のオープンリーディングフレーム中に２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、例えばDonnelly et al. J. Gen. Virol. 82:1013-15 (2001)などに記載
されるようなアフトウイルス口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ポリタンパク質の２Ａ領域およびそれらの当業界において公知の改良形によって一緒に連結されている。２Ａ領域は、ペプチド結合の形成を伴わない、１つのコドンから次のコドンへのリボソームの「スキップ」を生じる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、２つまたはそれより多くのペプチドが翻訳後切断によって生成するように、内部切断部位を含む。
一部の実施形態において、本開示のマルチシストロン性ベクターは、リボソームスキッピングまたは自己切断を誘導することが可能なペプチドを含むリンカーによって合体した、複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、リンカーは、２Ａペプチドを含む。用語「２Ａペプチド」は、本明細書で使用される場合、単一のオープンリーディングフレームから２つまたはそれより多くのタンパク質を生成するように構成されたリボソームスキッピングまたは自己切断ペプチドのクラスを指す。２Ａペプチドは、真核細胞において、翻訳中にポリペプチドの「切断」を媒介する１８～２２残基の長さのウイルスオリゴペプチドである。「２Ａペプチド」は、様々なアミノ酸配列を有するペプチドを指す場合がある。本開示において、レンチウイルスベクターが２つまたはそれより多くの２Ａペプチドを含む場合、２Ａペプチドは、互いに同一でもよいし、または異なっていてもよいことが理解されるであろう。２Ａペプチドの設計および使用ための詳細な手法は、Szymczak-Workman et al. Design and Construction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors. Cold Spring Harb. Protoc. 2012 Feb 1; 2012(2):199-204によって提供される。文献において、２Ａペプチドは、自己切断ペプチドと称されることが多いが、機構の研究から、観察された「自己切断」は、実際には、２ＡペプチドのＣ末端におけるグリシル－プロリルペプチド結合の形成をリボソームスキッピングした結果であることが示されている。Donnelly et al. J Gen
Virol. 2001 May; 82(Pt 5):1027-41。本発明は、理論に縛られず、２Ａペプチド
の機能のいずれの特定の機構的な理解にも限定されない。
例示的な２Ａペプチドとしては、これらに限定されないが、表３に列挙したものが挙げられる。
Figure 2024001344000013
Figure 2024001344000014
必要に応じて、リンカーの１つまたは複数は、一部の実施形態において２Ａペプチドに対してＮ末端である残基Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙをコードする配列をさらに含む。２Ａペプチドに対してＮ末端とは、残基をコードする配列が、２Ａペプチドをコードする配列の上流であることを意味する。一般的に、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙモチーフは、２Ａペプチドに対してすぐＮ末端にあると予想され、または１から１０個の他のアミノ酸残基が、モチーフと２Ａペプチドとの間に挿入されている。一部の実施形態において、このモチーフをコードするポリヌクレオチド配列は、ＧＧＡ ＡＧＣ ＧＧＡである。任意のペプチドをコードするポリヌクレオチドと同様に、ヌクレオチド配列は、コードされたペプチド配列を変化させることなく変更することができる。アミノ酸残基の置換は当業者の能力の範囲内であり、２Ａペプチドという用語は、所望のスキッピング／自己切断活性を保持するが、必要に応じて、参照２Ａペプチド配列と比べて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多くの置換を有する前述のもののバリアントを指すことが理解されるであろう。例示的な２Ａペプチドは、Kim et al. PLOS ONE 6(4): e18556に記載されている。一部の実施形態において、２つまたはそれより多くの異なる２Ａペプチドが、同じ構築物中で使用される。様々な２Ａペプチドが改善した発現をもたらすと報告されている。Liu et al. Sci Rep. 2017; 7:2193を参照されたい。一部の実施形態において、ポリペプチドは、２Ａペプチド（例えばＰ２Ａペプチド）に対してＮおよび／またはＣ末端に、１から５個の間の、または５個より多くのＧｌｙまたはＳｅｒ残基を含む。一部の実施形態において、ポリペプチドは、２Ａペプチド（例えばＰ２Ａペプチド）に対してＮおよび／またはＣ末端に、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ残基を含む。一部の実施形態において、Ｐ２ＡペプチドおよびＮ末端リンカーは、配列番号８４を含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’から３’の順番で、プロモーター、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号３５と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３５と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含む組換えレンチウイルス（ｒＬＶ）、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＬＶは、配列番号３５と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’から３’の順番で、プロモーター、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号３６と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３６と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＬＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＬＶは、配列番号３６と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’から３’の順番で、プロモーター、ＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号３７と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３７と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＬＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＬＶは、配列番号３７と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’から３’の順番で、プロモーター、ＭｙΔ３－２Ａ－ＭＹＦ６をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号３８と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３８と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＬＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＬＶは、配列番号３８と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’から３’の順番で、プロモーター、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤをコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号３９と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号３９と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＬＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＬＶは、配列番号３９と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’から３’の順番で、プロモーター、ＭＹＦ６－２Ａ－ＭＹＯＣＤをコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号４０と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号４０と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＬＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＬＶは、配列番号４０と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’から３’の順番で、プロモーター、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭｙΔ３をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号４１と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号４１と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＬＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＬＶは、配列番号４１と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本開示は、５’から３’の順番で、プロモーター、ＭＹＦ６－２Ａ－ＭｙΔ３をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む発現カセットを提供する。一部の実施形態において、発現カセットは、配列番号４２と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＡＡＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号４２と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、本開示は、発現カセットを含むｒＬＶ、発現カセットを含むトランスファープラスミド、または発現カセットを含むｒＬＶ粒子を提供する。一部の実施形態において、ｒＬＶは、配列番号４２と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、本開示は、配列番号５７～６４のいずれか１つ（すなわち、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６、ＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１、ＭｙΔ３－２Ａ－ＭＹＦ６、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤ、ＭＹＦ６－２Ａ－ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭｙΔ３、およびＭＹＦ６－２Ａ－ＭｙΔ３のいずれか１つ）と、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のタンパク質配列をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供する。
ＩＩＩ．ベクター
一部の実施形態において、細胞を心臓系統にリプログラミングするのに採用されたリプログラミング因子は、ベクターによって、選択された細胞または選択された細胞の集団に導入することができる。一部の実施形態において、ベクターは、核酸ベクター、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌もしくは酵母人工染色体、またはウイルスベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、非核酸ベクター、例えばナノ粒子である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるベクターは、ペプチド、例えば細胞透過化ペプチドまたは細胞内在化配列を含む。細胞透過化ペプチドは、原形質膜を通過して移動が可能な小さいペプチドである。例示的な細胞透過化ペプチドとしては、これらに限定されないが、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ－Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ－３Ａ（Ａｎｔｐ突然変異体）、ブフォリン（Ｂｕｆｏｒｉｎ）ＩＩ、トランスポータン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ－ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ－１、ＳｙｎＢ１、Ｐｅｐ－７、Ｉ－ＩＮ－１、ＢＧＳＣ（ビス－グアニジニウム－スペルミジン－コレステロール、およびＢＧＴＣ（ビス－グアニジニウム－Ｔｒｅｎ－コレステロール）が挙げられる。
組換え遺伝学の分野における技術は、このような組換え発現のために使用することができる。組換え遺伝学の一般的な方法を開示する基礎的な教本としては、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))が挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物複製起点を含有しない。一部の実施形態において、発現ベクターは、ゲノムに組み込まれないか、および／または哺乳動物複製起点を含有しないベクターを介して導入される。
一部の場合において、発現ベクターは、１つまたは複数のリプログラミング因子に加えて、トランスフェクトされた、形質導入された、または感染した細胞の同定または選択を容易にするマーカー遺伝子をコードするかまたはそれを含む。マーカー遺伝子の例としては、これらに限定されないが、蛍光タンパク質、例えば、強化緑色蛍光タンパク質、Ｄｓ－Ｒｅｄ（ＤｓＲｅｄ：Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．の赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）；Bevis et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20(11):83-87）、黄色蛍光タンパク質、
ｍＣｈｅｒｒｙ、およびシアン蛍光タンパク質（cyanofluorescent protein）をコード
する遺伝子；ならびに選択薬剤に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジン耐性遺伝子などが挙げられる。
一実施形態において、発現ベクターは、自殺遺伝子をさらに含む。自殺遺伝子の発現は、少なくとも１つの増殖および／または細胞周期再進入因子であるポリペプチドをコードするヌクレオチドを発現する同一または異なるプロモーターによって調節され得る。自殺遺伝子は、細胞の陰性選択を可能にするものである。本明細書に記載される方法において、自殺遺伝子は、遺伝子を発現する細胞を選択的な薬剤の導入によって殺滅することを可能にする安全系として使用される。これは、組換え遺伝子が制御不能な細胞成長に至る突然変異を引き起こす場合において望ましい。いくつかの自殺遺伝子系が、同定されており、そのようなものとしては、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋまたはＴＫ）遺伝子、シトシンデアミナーゼ遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、ニトロレダクターゼ遺伝子、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｇｐｔ遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉのＤｅｏ遺伝子が挙げられる（例えば、Yazawa K, Fisher W E, Brunicardi F C: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. (2002) 26(7):783-9も参照されたい）。一実施形態において、自殺遺伝子は、ＴＫ遺伝子である。一態様において、ＴＫ遺伝子は、野生型ＴＫ遺伝子である。他の態様において、ＴＫ遺伝子は、遺伝子の突然変異した形態、例えばｓｒ２３ｔｋである。ＴＫタンパク質を発現する細胞は、ガンシクロビルを使用して殺滅することができる。別の実施形態において、テトラサイクリン活性化タンパク質をコードする核酸および自殺遺伝子は、１つのプロモーターによって調節される。
Ａ．核酸ベクター
１．ウイルスベクター
好適なウイルスベクターとしては、これらに限定されないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Li et al. (1994) Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543-2549；Borras et al. (1999) Gene Ther 6:515-524；Li and Davidson, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7700-7704；Sakamoto et al. (1999) Hum Gene Ther 5: 1088-1097；ＷＯ９４／１２６４９；ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ali et al. (1998) Hum Gene Ther 9(l):81-86, 1998、Flannery et al. (1997) Proc.
Natl. Acad. Sci. 94:6916-6921；Bennett et al. (1997) Invest Opthalmol
Vis Sci 38:2857-2863；Jomary et al. (1997) Gene Ther 4:683-690；Rolling et al. (1999), Hum Gene Ther 10:641-648；Ali et al. (1996) Hum Mol
Genet. 5:591-594；ＷＯ９３／０９２３９、Samulski et al. (1989) J. Vir. 63 :3822-3828；Mendelson et al. (1988) Virol. 166:154-165；およびFlotte et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 10613-10617；ＳＶ４０；単純疱疹
ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshi et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 10319-10323；Takahashi et al. (1999) J Virol 73 :7812-7816）ベースのウイルスベクター；レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイ
ルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳がんウイルスなどのレトロウイルス由来のベクター）などが挙げられる。多数の好適な発現ベクターが当業者に公知であり、多くは商業的に入手可能である。一例として、真核細胞のために、以下のベクター；ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、およびｐＡｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が提供される。しかしながら、本開示の細胞に適合する限り、他のあらゆるベクターを使用することができる。
受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に感染するかまたは細胞に進入し、ウイルス遺伝子を安定して効率的に発現するある特定のウイルスの能力が、それらを外来核酸の細胞（例えば、哺乳動物細胞）への移行ための魅力的な候補としてきた。ウイルスベクターは、制御配列、例えば目的のポリペプチドの発現ためのプロモーターを含んでいてもよい。多くのウイルスベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれるが、必要に応じて、このような組み込みを可能にするセグメントが、このような組み込みを防止するために除去または変更されていてもよい。さらに、一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物複製起点を含有しない。転写因子をコードする核酸を選択された細胞に送達するのに使用することができるウイルスベクターの非限定的な例は後述される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、複製欠損ウイルス由来である。
一般的に、他の有用なウイルスベクターは、非必須の遺伝子が目的のポリペプチドで置き換えられた非細胞変性真核生物ウイルスをベースとする。非細胞変性ウイルスは、その生活環がゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とそれに続くプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを含む、ある特定のレトロウイルスを含む。一般的に、レトロウイルスは、複製欠陥である（例えば、所望の転写物の合成を指示できるが感染粒子を製造できない）。このような遺伝学的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるポリヌクレオチドの高効率の形質導入ための一般的な有用性を有する。
一部の実施形態において、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、特異的な結合リガンドを発現するように操作された感染性のウイルス内に格納されていてもよい。したがって、ウイルス粒子は、標的細胞の同起源の受容体に特異性によって結合して、内容物を細胞に送達することになる。一部の実施形態において、ウイルスは、特定のウイルス親和性を付与するように改変され、例えばそのようなウイルスは、線維芽細胞、心臓細胞、またはより特定には心臓線維芽細胞（ＣＦ）に優先的に感染する。ＡＡＶの場合、キャプシドタンパク質は、ウイルスベクターの親和性を変更するように突然変異されていてもよい。レンチウイルスの場合、親和性は、異なるエンベロープタンパク質を使用することによって改変することができ、これは、「シュードタイピング」として公知である。
ａ．レトロウイルスベクター
一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を移行させ、様々な種および細胞型に感染することができ、特殊な細胞系にパッケージングすることができる（Miller et al., Am. J. Clin. Oncol., 15(3):216-221, 1992）。一部の
実施形態において、レトロウイルスベクターは、宿主細胞ゲノムに組み込まれないように変更される。
組換えレトロウイルスは、標的細胞への進入を助けるためにウイルスポリペプチド（例えば、レトロウイルスｅｎｖ）を含んでいてもよい。このようなウイルスポリペプチドは、当業界において、例えば、米国特許第５，４４９，６１４号において十分に確立されている。ウイルスポリペプチドは、元の宿主種とは異なる細胞を含む複数の種由来の細胞への進入を助ける、アンホトロピックウイルスポリペプチド、例えばアンホトロピックｅｎｖであってもよい。ウイルスポリペプチドは、元の宿主種とは異なる細胞への進入を助けるゼノトロピックウイルスポリペプチドであってもよい。一部の実施形態において、ウイルスポリペプチドは、元の宿主種の細胞への進入を助ける、エコトロピックウイルスポリペプチド、例えば、エコトロピックｅｎｖである。
細胞へのレトロウイルスの進入を助けることが可能なウイルスポリペプチドの例としては、これらに限定されないが、ＭＭＬＶアンホトロピックｅｎｖ、ＭＭＬＶエコトロピックｅｎｖ、ＭＭＬＶゼノトロピックｅｎｖ、水疱性口内炎ウイルス－ｇタンパク質（ＶＳＶ－ｇ）、ＨＩＶ－１ｅｎｖ、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｅｎｖ、ＲＤ１１４、ＦｅＬＶ－Ｃ、ＦｅＬＶ－Ｂ、ＭＬＶ１０Ａ１ ｅｎｖ遺伝子、およびキメラを含むそれらのバリアントが挙げられる。Yee et al. (1994) Methods Cell Biol, Pt A:99-l 12 (VSV-G)；米国特許第５，４４９，６１４号。一部の場合において、ウイル
スポリペプチドは、発現を促進するかまたは受容体への結合が強化されるように遺伝子改変されている。
レトロウイルス構築物は、様々なレトロウイルス由来であってもよく、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ－１、ＳＩＶ、ＦＩＶ、または本明細書に記載される他のレトロウイルス由来であってもよい。レトロウイルス構築物は、具体的なウイルスの１つより多くの複製サイクルに必要な全てのウイルスポリペプチドをコードしていてもよい。一部の場合において、ウイルス進入の効率は、他の因子または他のウイルスポリペプチドの付加によって改善される。他の場合において、レトロウイルス構築物によってコードされたウイルスポリペプチドは、１回より多くの複製サイクルを支持しない。例えば、米国特許第６，８７２，５２８号。このような環境において、他の因子または他のウイルスポリペプチドの付加は、ウイルス進入を容易にすることを助けることができる。例示的な実施形態において、組換えレトロウイルスは、ＶＳＶ－ｇポリペプチドを含むが、ＨＩＶ－１ ｅｎｖポリペプチドを含まないＨＩＶ－１ウイルスである。
レトロウイルス構築物は、プロモーター、マルチクローニング部位、および／または耐性遺伝子を含んでいてもよい。プロモーターの例としては、これらに限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦｌａ、β－アクチン；レトロウイルスのＬＴＲプロモーター、および誘導性プロモーターが挙げられる。レトロウイルス構築物はまた、パッケージングシグナル（例えば、ＭＦＧベクター由来のパッケージングシグナル；ｐｓｉパッケージングシグナル）を含んでいてもよい。当業界において公知の一部のレトロウイルス構築物の例としては、これらに限定されないが、ｐＭＸ、ｐＢａｂｅＸまたはそれらの誘導体が挙げられる。Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329。一部の場合において、レトロウイルス構築物は、自己不活性化レンチウイルスベクター（ＳＩＮ）ベクターである。Miyoshi et al. (1998) J. Virol 72(10):8150-8157。一部の場合
において、レトロウイルス構築物は、ＬＬ－ＣＧ、ＬＳ－ＣＧ、ＣＬ－ＣＧ、ＣＳ－ＣＧ、ＣＬＧまたはＭＦＧである。Miyoshi et al. (1998) J. Virol 72(10):8150-8157；Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329；Riviere et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:6733-6737。
レトロウイルスベクターは、一部のウイルス配列の代わりに、核酸（例えば、目的のポリペプチドまたはＲＮＡをコードする核酸）をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損のウイルスを生産することによって構築することができる。ビリオンを生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系が構築される（Mann et al., Cell 33:153-159, 1983）
。レトロウイルスのＬＴＲおよびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドが特殊な細胞系に導入される場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドの転写物がウイルス粒子にパッケージングされて培養培地に分泌されることを可能にする（Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and
Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988；Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188,
1986；Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983）。次いで組換えレトロウイルスを含有する培地は、収集され、必要に応じて濃縮され、遺伝子移入に使用される。レトロウイルスベクターは、広範な種類の細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定な発現は、典型的には、宿主細胞の分裂を含む（Paskind et al., Virology, 67:242-248, 1975）。
ｂ．アデノウイルスベクター
一部の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスの遺伝学的構成は、約３６ｋｂの、直鎖状の、二本鎖ＤＮＡウイルスを含み、これは、アデノウイルスＤＮＡの大きい断片を７ｋｂまでの外来配列で置換することを可能にする（Grunhaus et al., Seminar in Virology 200(2):535-546, 1992)）。
リプログラミング因子は、アデノウイルスによって助けられるトランスフェクションを使用して、細胞に導入することができる。アデノウイルスがカップリングされた系を使用する細胞系で、増加したトランスフェクション効率が報告されている（Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-7, 1994；Cotten et al., Proc Natl Acad Sci
USA, 89(13):6094-6098, 1992；Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64, 1994.）
。
ｃ．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶは、組み込みが低頻度であり、非分裂細胞に感染できることにより、例えば、組織培養中（Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992）またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への送達にとって有用なものであることから、ＡＡＶは魅力的なベクター系である。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３９，９４１号および４，７９７，３６８号に記載されている。
ＡＡＶは、複製欠陥パルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは、２つの１４５ヌクレオチドの逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む約４．７ｋｂの長さである。ＡＡＶには複数の血清型がある。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、公知である。例えば、ＡＡＶ－１の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７に提供され；ＡＡＶ－２の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびSrivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983)に提供され；ＡＡＶ－３の完全
なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿１８２９に提供され；ＡＡＶ－４の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９に提供され；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６に提供され；ＡＡＶ－６の完全なゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２に提供され；ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９に提供され；ＡＡＶ－９ゲノムは、Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)に提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006)に提供され；ＡＡＶ－１１ゲノムは、Virology, 330(2): 375-383 (2004)に提供される。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，４３４，９２８号に提供される。ＡＡＶ ＩＴＲ内には、ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド化／パッケージング、および宿主細胞染色体の組み込みを指示するシス作用性配列が含有されている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ配置のためにｐ５、ｐｌ９、およびｐ４０と命名される）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動させる。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐｉ９）、それと組み合わされた単一のＡＡＶイントロンの差次的スプライシング（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の生産をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、最終的にウイルスゲノムの複製に関与する複数の酵素的な特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。オルタナティブスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するキャプシドタンパク質の生産に関与する。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップの９５位に配置されている。ＡＡＶの生活環および遺伝学は、Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992)に総論されている。
ＡＡＶは、例えば遺伝子治療において外来ＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的なものにしている固有な特色を有する。培養における細胞のＡＡＶ感染は、非細胞変性性であり、ヒトおよび他の動物の天然感染は、無症候および無症状である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染して、ｉｎ ｖｉｖｏで多くの様々な組織を標的化することを可能にする。さらに、ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞をゆっくり形質導入し、本質的にその細胞の寿命にわたり、転写活性を有する核エピソーム（染色体外エレメント）として持続することができる。ＡＡＶプロウイルスゲノムは、プラスミド中のクローニングされたＤＮＡとして挿入され、それが組換えゲノムの構築を実現可能にしている。さらに、ＡＡＶ複製およびゲノムキャプシド化を指示するシグナルが、ＡＡＶゲノムのＩＴＲ内に含有されていることから、ゲノムの内部のおよそ４．３ｋｂ（複製および構造的なキャプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）の一部または全部は、外来ＤＮＡで置き換えられていてもよい。ＡＡＶベクターを生成するために、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質は、トランスで提供することができる。ＡＡＶの別の重要な特色は、極めて安定で豊富なウイルスであることである。ＡＡＶは、アデノウイルスを不活性化するのに使用される条件（数時間にわたり５６℃から６５℃）に容易に耐えることから、ＡＡＶの低温保存の重要性がより少なくなる。ＡＡＶは、凍結乾燥することさえも可能である。最後に、ＡＡＶ感染細胞は、重複感染に対して耐性ではない。本開示のＡＡＶベクターとしては、自己相補的な二重鎖ＡＡＶベクター、合成ＩＴＲ、および／またはパッケージングのコンパクトさ（ｃｏｍｐａｃｉｔｙ）が増加したＡＡＶベクターが挙げられる。例示的な方法は、それぞれ参照によりそれらの全体が組み込まれる、ＵＳ８，７８４，７９９；ＵＳ８，９９９，６７８；ＵＳ９，１６９，４９４；ＵＳ９，４４７，４３３；およびＵＳ９，７８３，８２４に提供される。
ｒＡＡＶゲノム中のＡＡＶのＤＮＡは、組換えウイルスの由来となり得るあらゆるＡＡＶ血清型由来であってもよく、それには、これらに限定されないが、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３およびＡＡＶ ｒｈ７４などが挙げられる。シュードタイプ化ｒＡＡＶの生産は、例えば、ＷＯ０１／８３６９２に開示されている。他のタイプのｒＡＡＶバリアント、例えばキャプシドの突然変異を有するｒＡＡＶも予期される。例えば、Marsic et al., Mol. Therapy. 22):1900-09 (2014)を参照されたい。様々なＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチ
ド配列は、当業界において公知である。本開示のＡＡＶベクターとしては、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ３９、ＡＡＶ４３、ＡＡＶ．ｒｈ７４、およびＡＡＶ．ｒｈ８のＡＡＶベクターが挙げられる。例示的なＡＡＶベクターは、それぞれが参照によりその全体が組み込まれる、ＵＳ７，１０５，３４５；ＵＳ１５／７８２，９８０；ＵＳ７，２５９，１５１；ＵＳ６，９６２，８１５；ＵＳ７，７１８，４２４；ＵＳ６，９８４，５１７；ＵＳ７，７１８，４２４；ＵＳ６，１５６，３０３；ＵＳ８，５２４，４４６；ＵＳ７，７９０，４４９；ＵＳ７，９０６，１１１；ＵＳ９，７３７，６１８；米国特許出願第１５／４３３，３２２号；ＵＳ７，１９８，９５１に提供される。
一部の実施形態において、ＡＡＶ発現ベクターは、標的化を強化するためにシュードタイプ化されている。線維芽細胞中での遺伝子移入を促進し、発現を維持するために、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、およびＡＡＶ８を使用することができる。一部の場合において、ＡＡＶ２ゲノムは、Balaji et al. J Surg Res. 184:691-98 (2013)に記載されるように、それぞれシュードタイプ化された生産ベクターＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７、およびＡＡＶ２／８のキャプシドにパッケージングされる。一部の実施形態において、ＡＡＶ９は、Piras et al. Gene Therapy 23:469-478 (2016)に記載されるように、筋線維芽
細胞様系統における発現を標的化するのに使用することができる。一部の実施形態において、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９が使用され、一部の実施形態において、ＡＡＶは、Asokari et al. Hum Gene Ther. 24:906-13 (2013)；Pozsgai et al. Mol
Ther. 25:855-69 (2017)；Kotterman et al. Nature Reviews Genetics 15:445-51 (2014)；およびＳｃｈａｆｆｅｒらのＵＳ２０１６０３４０３９３Ａ１に記載されるように操作される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＵＳ２０１８００６６２８５Ａ１に記載されるように、標的細胞の感染力を増加させるように操作されたＡＡＶである。
一部の実施形態において、本開示のＡＡＶベクターは、改変されたキャプシドを含み、特定には、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏにおける心細胞、またはより特定には心臓線維芽細胞の形質導入を強化もしくは促進するように操作された；または対象の免疫系を回避する；または体内分布が改善されたキャプシドとして改変されたキャプシドを含む。例示的なＡＡＶキャプシドは、それぞれが参照によりその全体が組み込まれる、ＵＳ７，８６７，４８４；ＵＳ９，２３３，１３１；ＵＳ１０，０４６，０１６；ＷＯ２０１６／１３３９１７；ＷＯ２０１８／２２２５０３；およびＷＯ２００１９／０６０４５４に提供される。ＡＡＶキャプシド（または特定にはＡＡＶ２キャプシド）において、Ｅ６７、Ｓ２０７、Ｎ５５１、およびＩ６９８における１つまたは複数の置換は、心臓線維芽細胞への感染力を増加させるために使用することができる。より特定には、本開示のＡＡＶベクター、必要に応じてＡＡＶ２ベースのベクターは、そのキャプシドタンパク質中に、Ｅ６７Ａ、Ｓ２０７Ｇ、Ｖ２２９Ｉ、Ａ４９０Ｔ、Ｎ５５１Ｓ、Ａ５８１Ｔ、およびＩ６９８Ｖから選択される１つまたは複数の置換を含んでいてもよい。一部の実施形態において、本開示のＡＡＶベクターは、ＷＯ２０１８／２２２５０３に記載のＡＡＶ－Ａ２キャプシドおよび／または血清型を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶキャプシドは、キャプシドタンパク質のＧＨループにおける挿入を含み、例えばＮＫＩＱＲＴＤ（配列番号６５）またはＮＫＴＴＮＫＤ（配列番号６６）を含む。これらの置換および挿入を一緒に組み合わせて、本開示において有用な様々なキャプシドタンパク質を生成することができることが理解されるであろう。
ｄ．レンチウイルスベクター
一部の実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖに加えて、調節または構造的な機能を有する他の遺伝子を含有する複合レトロウイルスである。レンチウイルスベクターに関する情報は、例えば、Naldini et al., Science 272(5259):263-267, 1996；Zufferey et al., Nat Biotechnol 15(9):871-875, 1997；Blomer
et al., J Virol. 71(9):6641-6649, 1997；米国特許第６，０１３，５１６号お
よび５，９９４，１３６号で入手可能であり、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。レンチウイルスの一部の例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２およびサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ毒性遺伝子を弱毒化することによって生成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆを欠失させて、ベクターを生物学的に安全にしている。採用されるレンチウイルスはまた、複製および／または組み込み欠損であってもよい。
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することが可能であり、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子移入と核酸配列の発現の両方のために使用することができる。例えば、好適な宿主細胞がパッケージング機能、すなわちｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、加えてｒｅｖおよびｔａｔを有する２つまたはそれより多くのベクターでトランスフェクトされている、非分裂細胞に感染することが可能な組換えレンチウイルスは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載されている。当業者は、エンベロープタンパク質を特定の細胞型の受容体に標的化するための抗体または特定のリガンドと連結することによって、組換えウイルスを標的化することができる。例えば、標的特異的なベクターは、ウイルスベクターに目的の核酸セグメント（調節領域を含む）を、特異的な標的細胞型上の受容体ためのリガンドをコードする別の遺伝子と共に挿入することによって生成することができる。
レンチウイルスベクターは、当業界において公知である。全て参照により本明細書に組み込まれる、Naldini et al., (1996 and 1998)；Zufferey et al., (1997)；Dull et al., 1998、米国特許第６，０１３，５１６号；および５，９９４，１３６号を参照されたい。一般的に、これらのベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸を取り込むための、選択のための、および宿主細胞への核酸の移行ための必須の配列が搭載されるように構成される。一部の場合において、レンチウイルスベクターは、１つまたは複数のレンチウイルスのパッケージングプラスミドと同時に細胞に導入され、パッケージングプラスミドとしては、これらに限定されないが、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＲＳＶ－ｒｅｖ、ｐＭＤＬＧ－ｐＲＲＥ、およびｐＲＲＬ－ＧＯＩを挙げることができる。レンチウイルスベクターを、単独で、またはレンチウイルスのパッケージングプラスミドと組み合わせて細胞に導入することは、レンチウイルスベクターをレンチウイルス粒子にパッケージングすることを可能にする。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターは、非組み込み型レンチウイルス（ＮＩＬ）ベクターである。ＮＩＬベクターを生成するための例示的な方法、例えばインテグラーゼ遺伝子におけるＤ６４Ｖ置換は、ＵＳ８，１１９，１１９に提供される。
２．ウイルスベクターを生産する方法
一般的に、ウイルスベクターは、プロデューサー細胞にウイルスＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を導入することによって生産される。一部の場合において、プロデューサー細胞は、外因性遺伝子を発現しない。他の場合において、プロデューサー細胞は、１つまたは複数の外因性遺伝子、例えば、１つもしくは複数のｇａｇ、ｐｏｌ、もしくはｅｎｖポリペプチドおよび／または１つもしくは複数のレトロウイルスｇａｇ、ｐｏｌ、もしくはｅｎｖポリペプチドをコードする遺伝子を含む「パッケージング細胞」である。レトロウイルスのパッケージング細胞は、標的細胞への進入を助けるウイルスポリペプチド、例えば、ＶＳＶ－ｇをコードする遺伝子を含んでいてもよい。一部の場合において、パッケージング細胞は、１つまたは複数のレンチウイルスタンパク質、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、またはｎｅｆをコードする遺伝子を含む。一部の場合において、パッケージング細胞は、アデノウイルスタンパク質、例えばＥｌ ＡまたはＥｌ Ｂまたは他のアデノウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。例えば、パッケージング細胞によって供給されるタンパク質は、レトロウイルス由来のタンパク質、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ；レンチウイルス由来のタンパク質、例えばｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｖｉｆ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｎｅｆ；ならびにアデノウイルス由来のタンパク質、例えばＥｌ ＡおよびＥ１ Ｂであってもよい。多くの例において、パッケージング細胞は、ウイルスベクターの由来となるウイルスとは異なるウイルス由来のタンパク質を供給する。パッケージング細胞から組換えウイルスを生産する方法およびその使用は、十分に確立されている；例えば、米国特許第５，８３４，２５６号；６，９１０，４３４号；５，５９１，６２４号；５，８１７，４９１号；７，０７０，９９４号；および６，９９５，００９号を参照されたい。
パッケージング細胞系としては、これらに限定されないが、容易にトランスフェクション可能なあらゆる細胞系が挙げられる。パッケージング細胞系は、２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳまたはＨｅＬａ細胞系をベースとしていてもよい。パッケージング細胞はしばしば、ウイルスパッケージングに必要なタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子が欠損したウイルスベクタープラスミドをパッケージングするのに使用される。このようなウイルスベクターまたはプラスミドによってコードされたタンパク質から欠如したタンパク質またはポリペプチドを供給できるあらゆる細胞が、パッケージング細胞として使用することができる。パッケージング細胞系の例としては、これらに限定されないが、Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ｅ（Ｐｌａｔ－Ｅ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ａ（Ｐｌａｔ－Ａ）、ＢＯＳＣ２３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１１５５４）およびＢｉｎｇ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１１２７０）が挙げられる。Morita et al. (2000) Gene Therapy 7(12): 1063-1066；Onishi et al. (1996) Experimental Hematology, 24:324-329；米国特許第６，９９５
，００９号。商業的なパッケージング系も有用であり、例えば、Ａｍｐｈｏ－Ｐａｋ２９３細胞系、Ｅｃｏ－Ｐａｋ２－２９３細胞系、ＲｅｔｒｏＰａｃｋ ＰＴ６７細胞系、およびＲｅｔｒｏ－Ｘユニバーサルパッケージングシステム（全てＣｌｏｎｔｅｃｈより入手可能）である。
３．プラスミド
ウイルスベクタープラスミド（または構築物）としては、ｐＭＸｓ、ｐＭｘｓ－ＩＢ、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＭＸｓ－ｎｅｏ（ｐＭＸｓ－ＩＢは、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏのピューロマイシン耐性遺伝子の代わりに、ブラスチシジン耐性遺伝子を搭載するベクターである）、Kimatura et al. (2003) Experimental Hematology 31: 1007-1014；MFG Riviere et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci., 92:6733-6737；pBabePuro；Morgenstern et al. (1990) Nucleic Acids Research 18:3587-3596；レトロウイ
ルス系として、ＬＬ－ＣＧ、ＣＬ－ＣＧ、ＣＳ－ＣＧ、ＣＬＧ、Miyoshi et al. (1998) J. Vir. 72:8150-8157など、およびアデノウイルス系として、ｐＡｄｅｘｌ、Kanegae et al. (1995) Nucleic Acids Research 23 :3816-3821などが挙げられる。例示的な実施形態において、レトロウイルス構築物は、ブラスチシジン（例えば、ｐＭＸｓ－ＩＢ）、ピューロマイシン（例えば、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏ、ｐＢａｂｅＰｕｒｏ）、またはネオマイシン（例えば、ｐＭＸｓ－ｎｅｏ）を含む。Morgenstern et al. (1990) Nucleic Acids Research 18:3587-3596。
一部の実施形態において、ウイルスベクターまたはプラスミドは、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むトランスポゾンまたは転移エレメントを含む。ＤＮＡトランスポゾン、例えばｐｉｇｇｙＢａｃおよびスリーピングビューティー（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）を介したポリヌクレオチドの送達は、使いやすさ、より大きいカーゴを送達する能力、診療に至るスピード、および生産コストにおいて利点をもたらす。ｐｉｇｇｙＢａｃ ＤＮＡトランスポゾンは、特定には、長期にわたる、高レベルの安定なポリヌクレオチドの発現をもたらすこと、および突然変異誘発性がより著しく低いこと、非腫瘍形成性であること、および完全に可逆的であることにおいて、潜在的な利点をもたらす。
４．導入されたＲＮＡからの直接の翻訳
選択された細胞中で１つまたは複数の目的の遺伝子が一時的に発現される場合、目的の遺伝子は、ＲＮＡ分子として導入することができ、これが、細胞の細胞質内でタンパク質に翻訳される。例えば、目的のタンパク質は、翻訳開始シグナル（例えば、強いコザック翻訳開始シグナル）を含有する５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と、鋳型化されたポリＡテールの付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列で終わっている３’非翻訳領域とによって挟まれたポリペプチドためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する導入されたＲＮＡ分子から翻訳されてもよい。このようなＲＮＡ分子は、ほとんどの発現ベクターおよび発現カセットで採用されるプロモーター配列を有さない。ＲＮＡ分子は、電気穿孔などの様々な技術によって、またはカチオン性媒体と複合体化したＲＮＡのエンドサイトーシスによって、選択された細胞に導入することができる。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWarren et al., Cell Stem Cell 7: 618-30 (2010)を参照されたい。
特に、ＲＮＡ分子が、改変されたリボヌクレオチドを取り込むことによって安定化される場合、タンパク質翻訳は、数日間持続することができる。例えば、シチジンのために５－メチルシチジン（５ｍＣ）および／またはウリジンのためにプソイドウリジン（ｐｓｉ）を取り込むことは、ｉｎ ｖｉｖｏでの導入されたＲＮＡの半減期を改善し、タンパク質翻訳の増加をもたらすことができる。高いレベルの発現が求められる場合、または数日より長い日数の発現が求められる場合、選択された細胞にＲＮＡを繰り返して導入してもよい。
タンパク質をコードするＲＮＡはまた、５’ｃａｐ、核局在化シグナル、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。例えば、Warren et al., Cell Stem Cell 7: 618-30 (2010)を参照されたい。
このようなＲＮＡ分子は、例えば、３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ
ＡＲＣＡ ｃａｐアナログ、アデノシン三リン酸およびグアノシン三リン酸、５－メチルシチジン三リン酸およびプソイドウリジン三リン酸を含むリボヌクレオシドブレンドを使用する、目的のポリヌクレオチドための鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける転写によって作製することができる。ＲＮＡ分子はまた、ホスファターゼで処理して細胞傷害性を低減させてもよい。
ＲＮＡは、単独で、またはマイクロＲＮＡ（例えば、Ｏｃｔ４発現の場合、ｍｉＲＮＡ－３０２）と共に導入されてもよく、マイクロＲＮＡは、内因性ポリペプチド発現の誘導物質であってもよい。マイクロＲＮＡ（micoRNA）は、タンパク質をコードしない構造的
なＲＮＡとして機能する。したがって、マイクロＲＮＡにとって、その機能を発揮するために翻訳は必要ではない。マイクロＲＮＡは、例えば、リポソーム、微小胞、またはエキソゾームなどの送達媒体で、細胞に直接導入することができる。代替として、マイクロＲＮＡは、細胞または細胞集団に導入された発現カセットまたは発現ベクターから発現させることができる。
Ｂ．非核酸ベクター
ある特定の実施形態において、ベクターは、参照により本明細書に組み込まれるKanasty R, Delivery materials for siRNA therapeutics Nat Mater. 12(11):967-77
(2013)に記載されるような脂質粒子を含む。一部の実施形態において、脂質ベースのベクターは、脂質ナノ粒子であり、これは、サイズが約１から約１００ナノメートルの間の脂質粒子である。
一部の実施形態において、脂質ベースのベクターは、脂質またはリポソームである。リポソームは、脂質二重層を含む人工の球状の小胞である。
一部の実施形態において、脂質ベースのベクターは、小さい核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）である。ＳＮＡＬＰは、核酸を封入する小さい（直径２００ｎｍ未満の）脂質ベースのナノ粒子を含む。一部の実施形態において、ＳＮＡＬＰは、ＲＮＡ分子、例えばｓｉＲＮＡの送達に有用である。一部の実施形態において、ＳＮＡＬＰ製剤は、対象の特定の組織、例えば心臓に核酸を送達する。
一部の実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、ポリマーベクターを介して送達される。一部の実施形態において、ポリマーベクターは、ポリマーまたはポリマーソーム（polymerosome）である。ポリマーは、あらゆる長さの単量体の繰り返しの鎖を包含し、そのようなものとしては、例えば、線状ポリマー、分岐状ポリマー、デンドリマー、および多糖類が挙げられる。線状ポリマーは、単一ライン状の単量体を含み、それに対して分岐状ポリマーは、単量体の側鎖を含む。デンドリマーも分岐した分子であり、これは、分子のコアの周りに分岐が対称的に配列されたものである。多糖は、ポリマーの炭水化物分子であり、一緒に連結された長い単糖単位で構成されている。ポリマーソームは、小胞膜を形成する合成の両親媒性コポリマーで構成される人工の小胞であり、小胞膜内に中空または水性のコアを有していてもよい。
様々なポリマーベースの系を、１つまたは複数のリプログラミング因子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを投与するための媒体として適合させることができる。例示的な高分子材料としては、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ＰＬＧＡ－ｂ－ポリ（エチレングリコール）－ＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ－ｂＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、ＰＬＬＡ－ｂＰＥＧ－ＰＬＬＡ、ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－マレイミド（ＰＬＧＡ－ＰＥＧ－ｍａｌ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＥＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＰＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート（cyanoacralate）、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リシン（ＰＬＬ）、メタクリル酸ヒドロキシプ
ロピル（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリアルキレン、例えばポリエチレンおよびポリプロピレン、ポリアルキレングリコール、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリアルキレンテレフタレート、例えばポリ（エチレンテレフタレート）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、例えばポリ（酢酸ビニル）、ハロゲン化ポリビニル、例えばポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリウレタン、誘導体化セルロース、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリル酸のポリマー、例えばポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、ポリ（オクタデシルアクリレート）（ポリアクリル酸）、ならびにコポリマーおよびそれらの混合物、ポリジオキサノンおよびそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート）、ポルオキシメチレン、ポロキサマー、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ポリビニルピロリドン、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、ポリ（［ベータ］－アミノエステル（ＰＢＡＥ）、およびポリホスホエステル、ならびに２種またはそれより多くのこのようなポリマーのブレンドおよび／またはブロックコポリマーが挙げられる。ポリマーベースの系としては、シクロデキストリンポリマー（ＣＤＰ）ベースのナノ粒子、例えば、ＣＤＰ－アダマンタン（admantane）（ＡＤ）－ＰＥ
ＧコンジュゲートおよびＣＤＰ－ＡＤ－ＰＥＧ－トランスフェリンコンジュゲートなども挙げることができる。
核酸などの薬物送達のための例示的なポリマー粒子系としては、ＵＳ５，５４３，１５８、ＵＳ６，００７，８４５、ＵＳ６，２５４，８９０、ＵＳ６，９９８，１１５、ＵＳ７，７２７，９６９、ＵＳ７，４２７，３９４、ＵＳ８，３２３，６９８、ＵＳ８，０７１，０８２、ＵＳ８，１０５，６５２、ＵＳ２００８／０２６８０６３、ＵＳ２００９／０２９８７１０、ＵＳ２０１０／０３０３７２３、ＵＳ２０１１／００２７１７２、ＵＳ２０１１／００６５８０７、ＵＳ２０１２／０１５６１３５、ＵＳ２０１４／００９３５７５、ＷＯ２０１３／０９０８６１に記載されるものが挙げられ、これらのそれぞれは、これによりその全体が参照により組み込まれる。
一部の実施形態において、脂質ベースのベクターは、脂質封入系を含む。脂質封入系は、所望の組織分布および細胞進入特性を促進するように、加えて、必要な循環時間および生物分解性の特徴を提供するように設計することができる。脂質封入体は、例えばこれにより参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，１９３，３３４に記載されるように、逆ミセルを含んでいてもよいし、および／またはポリマーマトリックスをさらに含んでいてもよい。一部の実施形態において、粒子は、例えば優先的な方式での送達など、組織への粒子の送達を強化するために、親油性送達化合物を含む。このような化合物は、これによりその全体が参照により組み込まれるＵＳ２０１３／０１５８０２１に開示されている。このような化合物は、一般的に、親油性基、およびコンジュゲートしたアミノ酸またはペプチド、例えば直鎖状または環状ペプチドなど、ならびにそれらの異性体などを含んでいてもよい。一部の実施形態において、脂質封入体は、リン脂質、コレステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質、および親油性化合物の１つまたは複数を含む。
粒子は、脂質粒子か、もしくはポリマー粒子か、またはその両方かにかかわらず、ｉｎ
ｖｉｖｏでの核酸送達に関する特性を強化するのに有用な追加の成分を含んでいてもよい（それぞれこれにより参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，４５０，２９８およびＵＳ２０１２／０２５１５６０で開示された化合物などが挙げられる）。送達媒体は、ある特定の組織中で優先的に蓄積することによって組織を標的化する作用をもたらすが、一部の実施形態において、送達媒体は、少なくとも１つの細胞を標的化する、または組織を標的化するリガンドをさらに含む。機能化した粒子、例えば例示的な標的化リガンドなどは、これによりそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１０／０３０３７２３および２０１２／０１５６１３５に開示されている。
送達媒体は、本明細書で開示された送達系の所望の組織分布および細胞進入特性を促進するように、加えて、必要な循環時間および生物分解性の特徴を提供するように設計することができる。例えば、脂質粒子は、これにより参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０００９６４１で開示されたようなアミノ脂質を採用することができる。
脂質またはポリマー粒子は、約５０ｎｍから約５μｍの範囲のサイズ（例えば、平均サイズ）を有していてもよい。一部の実施形態において、粒子は、約１０ｎｍから約１００μｍ、または約２０ｎｍから約５０μｍ、または約５０ｎｍから約５μｍ、または約７０ｎｍから約５００ｎｍ、または約７０ｎｍから約２００ｎｍ、または約５０ｎｍから約１００ｎｍの範囲内である。粒子は、免疫系による迅速なクリアランスを回避するように選択してもよい。粒子は、球状であってもよいし、またはある特定の実施形態では球状でなくてもよい。
Ｃ．プロモーターおよびエンハンサー
一部の実施形態において、リプログラミング因子をコードする核酸は、リプログラミング因子の発現を容易にするために、プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結されていてもよい。利用される宿主／ベクター系に応じて、発現ベクターには、構成的および誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどのいくつかの好適な転写および翻訳制御エレメントのいずれを使用してもよい（例えば、Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153 :516-544）。
ポリヌクレオチドのそれぞれにつき、別個のプロモーターおよび／またはエンハンサーを採用してもよい。一部の実施形態において、単一のオープンリーディングフレーム中の２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドに、同じプロモーターおよび／またはエンハンサーが使用される。この遺伝学的エレメントの構成を採用するベクターは、「ポリシストロン性」と呼ばれる。ポリシストロン性ベクターの例は、２Ａ領域によって連結された２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドを含む単一のオープンリーディングフレームに作動可能に連結したエンハンサーおよびプロモーターを含み、それによってオープンリーディングフレームを発現させると、複数のポリペプチドが共に翻訳されることによって生成される。２Ａ領域は、コドンスキッピングを介して複数のポリペプチド配列の生成を媒介すると考えられているが、本開示はまた、同じポリヌクレオチドから２つまたはそれより多くの目的の遺伝子に関するポリペプチドを生成するために翻訳後切断を採用するポリシストロン性ベクターにも関する。例示的な２Ａ配列、ベクター、および関連する方法は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００４０２６５９５５Ａ１に提供される。本開示の他のポリシストロン性ベクターは、内部プロモーター、スプライシング、再開、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、タンパク質分解的切断可能部位（例えばｆｕｓａｇｅｎ）および遺伝子の融合を採用する。
好適な真核生物プロモーター（真核細胞において機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、およびマウスメタロチオネイン－Ｉが挙げられる。一部の実施形態において、心臓特異的な発現を付与することが可能なプロモーターが使用されると予想される。好適な心臓特異的プロモーターの非限定的な例としては、デスミン（Ｄｅｓ）、アルファ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）および心臓トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）が挙げられる。好適なニューロン特異的プロモーターの非限定的な例としては、シナプシンＩ（ＳＹＮ）、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ、チューブリンアルファＩ、ニューロン特異的エノラーゼおよび血小板由来増殖因子ベータ鎖プロモーター、ならびにこのようなニューロン特異的プロモーターにサイトメガロウイルスエンハンサー（Ｅ）を融合させることによるハイブリッドプロモーターが挙げられる。
発現リプログラミング因子を駆動させるための好適なプロモーターの例としては、これらに限定されないが、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）エレメント；構成的プロモーター、例えばＣＭＶ、ＨＳＶ１－ＴＫ、ＳＶ４０、ＥＦ－ｌａ、β－アクチン、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）；誘導性プロモーター、例えばＴｅｔ－オペレーターエレメントを含有するもの；心臓特異的プロモーター、例えばデスミン（Ｄｅｓ）、アルファ－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ－２）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）および心臓トロポニンＣ（ｃＴｎＣ）；神経特異的プロモーター、例えばネスチン、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）、ベータＩＩＩチューブリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、希突起膠細胞系統（Ｏｌｉｇｌ／２）、およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；ならびに膵臓特異的プロモーター、例えばＰａｘ４、Ｎｋｘ２．２、Ｎｇｎ３、インスリン、グルカゴン、およびソマトスタチンが挙げられる。
一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞型特異的な転写調節因子エレメント（ＴＲＥ）に作動可能に連結されており、その場合、ＴＲＥとしては、プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。好適なＴＲＥとしては、これらに限定されないが、以下の遺伝子由来のＴＲＥが挙げられる：ミオシン軽鎖－２、α－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、および心臓アクチン。Franz et al. (1997) Cardiovasc. Res. 35:560-566；Robbins et al. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 752:492-505；Linn et al. (1995) Circ. Res. 76:584-591；Parmacek et al. (1994) Cell. Biol. 14: 1870-1885；Hunter et al. (1993) Hypertension 22:608-617；およびSartorelli et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4047-4051。
プロモーターは、遺伝子または核酸セグメントと天然に会合しているものであってもよい。同様に、ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ）の場合、プロモーターは、マイクロＲＮＡ遺伝子（例えば、ｍｉＲＮＡ－３０２遺伝子）と天然に会合しているものであってもよい。このような天然に会合しているプロモーターは、「天然プロモーター」と称することができ、コーディングセグメントおよび／またはエクソンの上流に配置される５’非コード配列を単離することにより得ることができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列と天然に会合しているものであってもよい。しかしながら、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれに配置されていてもよい。
代替として、組換えまたは異種プロモーターの制御下にコーディング核酸セグメントを配置することによって一定の利点が得られると予想され、組換えまたは異種プロモーターは、通常、その天然環境で核酸と会合していないプロモーターを指す。組換えまたは異種エンハンサーも、通常、その天然環境で核酸配列に会合していないエンハンサーを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、ならびに他のあらゆる原核、ウイルス、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然に存在」しない、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または発現を変更する突然変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを挙げることができる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、本明細書で開示された組成物と共に、ＰＣＲ（商標）を含む組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して、配列を生産してもよい（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照）。
採用されるプロモーターは、構成的、誘導性、発生特異的、組織特異的であってもよいし、および／または核酸セグメントの高レベルの発現を指示するための適切な条件下で有用であってもよい。例えば、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＨＳＶ１－ＴＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、β－アクチンプロモーター、ＰＧＫプロモーター、またはそれらの組合せであってもよい。使用することが可能な真核生物プロモーターの例としては、これらに限定されないが、構成的プロモーター、例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣＭＶ、ＳＶ４０およびＲＳＶプロモーター、加えて、調節プロモーター、例えば、誘導性または抑制性プロモーター、例えばｔｅｔプロモーター、ｈｓｐ７０プロモーター、ならびにＣＲＥによって調節される合成プロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（すなわちＣＭＶ初期エンハンサーエレメントおよびニワトリベータ－アクチンプロモーター）（配列番号６７）を含む。一部の実施形態において、発現カセットは、ＳＶ４０イントロン（配列番号８３）を含む。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、ニワトリベータ－アクチンプロモーターおよびＣＭＶイントロン（配列番号６９）を含む。一部の実施形態において、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数は、ＣＡＧプロモーター（配列番号６７）に作動可能に連結されている。一部の実施形態において、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つまたは複数は、スーパーコアプロモーター（ＳＣＰ）（配列番号６８）に作動可能に連結されている。ＵＳ７，９６８，６９８を参照されたい。採用することが可能なプロモーターの他の例としては、ヒトＥＦ１α伸長因子プロモーター、ＣＭＶサイトメガロウイルス前初期プロモーター、ＣＡＧニワトリアルブミンプロモーター、本明細書に記載されるウイルスベクターのいずれかに会合したウイルスプロモーター、または本明細書に記載されるプロモーターのいずれかに相同な（例えば、別の種由来の）プロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターは、遍在性プロモーターであり、必要に応じて、ＣＭＶ、ＥＦ１Ａ、ＥＦＳ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＳＶ４０、ｍＰＧＫ、ｈＰＧＫ、およびＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、線維芽細胞特異的プロモーターであり、必要に応じて、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ６Ａ１、ＦＮ１ ＰＯＳＴＮ、ＣＯＬ１Ａ２、ＭＡＰ２Ｋ３、およびＰＰＡＲγプロモーターからなる群から選択される。
一部の実施形態において、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントは、多重遺伝子、またはポリシストロン性伝令を作り出すのに使用することができる。ＩＲＥＳエレメントは、５’－メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルをバイパスし、内部の部位で翻訳を開始させることができる（Pelletier and Sonenberg, Nature
334(6180):320-325 (1988)）。ピコルナウイルスファミリーのうち２つのメンバー（
ポリオおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（Pelletier and Sonenberg, Nature 334(6180):320-325 (1988)）、加えて、哺乳動物伝令由来のＩＲＥＳ（Macejak &
Samow, Nature 353:90-94 (1991)）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異
種オープンリーディングフレームに連結されていてもよい。それぞれＩＲＥＳによって隔てられた複数のオープンリーディングフレームが一緒に転写されてもよく、ポリシストロン性伝令が作り出される。ＩＲＥＳエレメントのために、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子は、単一の伝令を転写するために、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現させることができる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９２５，５６５号および５，９３５，８１９号を参照）。
一部の実施形態において、本開示のベクターは、１つまたは複数のポリＡシグナルを含む。本開示のベクターにおいて有用な例示的なポリＡシグナルとしては、短鎖ポリＡシグナル（配列番号７４）およびｂＧＨポリＡシグナル（配列番号８５）が挙げられる。
Ｄ．細胞へのベクター送達
ウイルスベクターは、当業界において公知のあらゆる方法によって宿主線維芽細胞に導入することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウム方法、リポフェクション方法（例えば、Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:7413-7417）、電気穿孔方法、マイクロインジェクション、Ｆｕｇｅｎｅ
トランスフェクション、ヌクレオフェクションなど、および本明細書に記載されるあらゆる方法が挙げられる。
手順の例としては、例えば、Stadtfeld and Hochedlinger, Nature Methods 6(5):329-330 (2009)；Yusa et al., Nat. Methods 6:363-369 (2009)；Woltjen, et
al., Nature 458, 766-770 (9 Apr. 2009))により記載されたものが挙げられる。このような方法としては、これらに限定されないが、例えば、必要に応じてＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた、ｅｘ ｖｉｖｏのトランスフェクションによる（例えば、Wilson et al., Science, 244:1344-1346, 1989, Nabel & Baltimore, Nature 326:711-713, 1987）；
注射による（例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９９４，６２４号、５，９８１，２７４号、５，９４５，１００号、５，７８０，４４８号、５，７３６，５２４号、５，７０２，９３２号、５，６５６，６１０号、５，５８９，４６６号および５，５８０，８５９号）、例えばマイクロインジェクションなどによる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるHarland and Weintraub, J. Cell
Biol., 101:1094-1099, 1985；米国特許第５，７８９，２１５号）；電気穿孔による（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，３８４，２５３号、Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986；Potter et al.,
Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:7161-7165, 1984）；リン酸カルシウム沈殿による（例えば、Graham & Van Der Eb, Virology, 52:456-467, 1973；Chen and
Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8):2745-2752, 1987;Rippe et al., Mol. Cell Biol., 10:689-695, 1990）；ＤＥＡＥ－デキストランとそれに続くポリエチレングリコールの使用による（例えば、Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190, 1985）；直接のソニックローディングによる（例えば、Fechheimer et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987）；リポソーム媒介トランスフェクションによる（例えば、Nicolau & Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982、Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 76 : 3348-3352, 1979；Nicolau
et al., Methods Enzymol., 149:157-176, 1987、Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980、Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989、Kato et al., Biol. Chem., 266:3361-3364, 1991）、受容体媒介トランスフェクションによる（例えば
、Wu and Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988；Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987）；カチオン性媒体と複合体化したＲＮＡのエンドサイトーシ
スによる（Warren et al., Cell Stem Cell 7:618-30 (2010)）；およびこのような方法のあらゆる組合せによるＤＮＡの直接送達が挙げられる。前述の参考文献のそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
核酸分子が宿主にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入されるか、またはｉｎ ｖｉｖｏで導入されるかに応じて、細胞に本開示の核酸分子を導入するための様々な技術を採用することができる。このような技術としては、核酸分子－リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと会合した核酸分子のトランスフェクション、目的の核酸分子を含む前述のウイルスでのトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクションなどが挙げられる。他の例としては、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈによるＮ－ＴＥＲ（商標）ナノ粒子トランスフェクションシステム、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによる昆虫細胞ためのＦＥＣＴＯＦＬＹ（商標）トランスフェクション試薬、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によるポリエチレンイミン「Ｍａｘ」、Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．による固有な非ウイルストランスフェクションツール、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）ＬＴＸトランスフェクション試薬、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによるＳＡＴＩＳＦＥＣＴＩＯＮ（商標）トランスフェクション試薬、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによるＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）トランスフェクション試薬、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ ＳｃｉｅｎｃｅによるＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎによるＧＭＰ規格に準拠したＩＮ ＶＩＶＯ－ＪＥＴＰＥＩ（商標）トランスフェクション試薬、およびＮｏｖａｇｅｎによるＩｎｓｅｃｔ ＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（登録商標）トランスフェクション試薬が挙げられる。
ＩＶ．リプログラミング因子組成物
ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５の１つまたは複数を用いたリプログラミングは、改善された結果を伴う一部の場合において、他のリプログラミング戦略と組み合わせることができる。一部の実施形態において、標的組織または初発の細胞は、Ｏｃｔ４ポリペプチドを発現するか、またはそれを発現するように誘導される。標的組織または初発の細胞は、それぞれ、１つまたは複数のＷＮＴアゴニスト、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－ベータ阻害剤、エピジェネティックな調節剤、アデニリルシクラーゼアゴニスト、Ｏｃｔ－４発現活性化剤、およびそれらのあらゆる組合せを含有するリプログラミング組成物で処理してもよいし、またはそれと共にインキュベートしてもよい。組成物は、このような薬剤のうち少なくとも２つ、またはこのような薬剤のうち少なくとも３つ、またはこのような薬剤のうち少なくとも４つ、またはこのような薬剤のうち少なくとも５つ、またはこのような薬剤のうち少なくとも６つを含有していてもよい。例えば、組成物は、ＳＢ４３１５４２（ＡＬＫ４／５／７阻害剤）、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３阻害剤）、パルネート（ｐａｒｎａｔｅ）（ＬＳＤ１／ＫＤＭ１阻害剤、トラニルシプロミンとも称される）およびフォルスコリン（アデニリルシクラーゼ活性化剤）を含んでいてもよい。
ある特定の実施形態において、リプログラミングは、１つまたは複数の抗炎症剤、例えば、抗炎症性ステロイドまたは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）の投与によって強化される。
本発明において使用するための抗炎症性ステロイドとしては、コルチコステロイド、特定には、グルココルチコイド活性を有するもの、例えば、デキサメタゾンおよびプレドニゾンが挙げられる。本発明において使用するための非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、一般的に、炎症および痛みを引き起こすプロスタグランジン、シクロオキシゲナーゼ－１（ＣＯＸ－１）および／またはシクロオキシゲナーゼ－２（ＣＯＸ－２）の生産をブロックすることによって作用する。従来のＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ－１とＣＯＸ－２の両方をブロックすることによって機能する。ＣＯＸ－２選択的阻害剤は、ＣＯＸ－２酵素のみをブロックする。ある特定の実施形態において、ＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ－２選択的阻害剤、例えば、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標））、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）、およびバルデコキシブ（Ｂ ｅｘｔｒａ）である。ある特定の実施形態において、抗炎症剤は、ＮＳＡＩＤプロスタグランジン阻害剤、例えば、ピロキシカムである。
組成物を調製するために、ベクターおよび／または細胞が生成され、必要に応じて、または所望であれば、ベクターまたは細胞は精製される。ベクター、細胞、および／または他の薬剤は、薬学的に許容される担体中に懸濁してもよい。組成物が化合物のみを含有し細胞を含まない場合、組成物は凍結乾燥することができる。これらの化合物および細胞は、適切な濃度に調整することができ、必要に応じて他の薬剤と組み合わせてもよい。単位用量中に含まれる所与の化合物および／または他の薬剤の絶対重量は、広く変更することができる。用量および投与回数は、当業者によって最適化することができる。
例えば、約１０２～１０１０ベクターゲノム（ｖｇ）が投与されてもよい。一部の実施形態において、用量は、少なくとも約１０２ｖｇ、約１０３ｖｇ、約１０４ｖｇ、約１０５ｖｇ、約１０６ｖｇ、約１０７ｖｇ、約１０８ｖｇ、約１０９ｖｇ、約１０１０ｖｇ、またはそれより多くのベクターゲノムである。一部の実施形態において、用量は、約１０２ｖｇ、約１０３ｖｇ、約１０４ｖｇ、約１０５ｖｇ、約１０６ｖｇ、約１０７ｖｇ、約１０８ｖｇ、約１０９ｖｇ、約１０１０ｖｇ、またはそれより多くのベクターゲノムである。
化合物の１日用量は、同様に変更することができる。このような１日用量は、例えば、少なくとも約１０２ｖｇ／日、約１０３ｖｇ／日、約１０４ｖｇ／日、約１０５ｖｇ／日、約１０６ｖｇ／日、約１０７ｖｇ／日、約１０８ｖｇ／日、約１０９ｖｇ／日、約１０１０ｖｇ／日、または１日当たりそれより多くのベクターゲノムからの範囲であってもよい。
一部の実施形態において、本開示の方法は、本開示のベクターまたはベクター系（例えばｒＡＡＶベクター）を、心腔内注射、心筋内注射、心臓カテーテル法、または全身投与によって投与するステップを含む。一部の実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、心腔内注射、心筋内注射、心臓カテーテル法、または全身投与によって、約１×１０８から約１×１０１５ＧＣの間のベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター）を投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象は、約１×１０８から約１×１０１５ＧＣの間、約１×１０８から約１×１０１５ＧＣの間、約１×１０９から約１×１０１４ＧＣの間、約１×１０１０から約１×１０１３ＧＣの間、約１×１０１１から約１×１０１２ＧＣの間、または約１×１０１２から約１×１０１３ＧＣの間のベクターを投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象は、約１×１０８から約１×１０１０ＧＣの間、約１×１０９から約１×１０１１ＧＣの間、約１×１０１０から約１×１０１２ＧＣの間、約１×１０１１から約１×１０１３ＧＣの間、約１×１０１２から約１×１０１４ＧＣの間、または約１×１０１３から約１×１０１５ＧＣの間のベクターを投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象は、少なくとも１×１０８、少なくとも約１×１０９、少なくとも約１×１０１０、少なくとも約１×１０１１、少なくとも約１×１０１２、少なくとも約１×１０１３、または少なくとも約１×１０１５ＧＣのベクターを投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象は、最大で１×１０８、最大で約１×１０９、最大で約１×１０１０、最大で約１×１０１１、最大で約１×１０１２、最大で約１×１０１３、または最大で約１×１０１５ＧＣのベクターを投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象（例えば、ヒト）は、心腔内注射によってまたは全身的に、約１×１０８から約１×１０１５ＧＣ／ｋｇの間のベクター（例えば、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクター）を投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象は、約１×１０８から約１×１０１５ＧＣ／ｋｇの間、約１×１０８から約１×１０１５ＧＣ／ｋｇの間、約１×１０９から約１×１０１４ＧＣ／ｋｇの間、約１×１０１０から約１×１０１３ＧＣ／ｋｇの間、約１×１０１１から約１×１０１２ＧＣ／ｋｇの間、または約１×１０１２から約１×１０１３ＧＣ／ｋｇの間のベクターを投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象は、約１×１０８から約１×１０１０ＧＣ／ｋｇの間、約１×１０９から約１×１０１１ＧＣ／ｋｇの間、約１×１０１０から約１×１０１２ＧＣ／ｋｇの間、約１×１０１１から約１×１０１３ＧＣ／ｋｇの間、約１×１０１２から約１×１０１４ＧＣ／ｋｇの間、または約１×１０１３から約１×１０１５ＧＣ／ｋｇの間のベクターを投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象は、少なくとも１×１０８、少なくとも約１×１０９、少なくとも約１×１０１０、少なくとも約１×１０１１、少なくとも約１×１０１２、少なくとも約１×１０１３、または少なくとも約１×１０１５ＧＣ／ｋｇのベクターを投与することによって処置される。一部の実施形態において、対象は、最大で１×１０８、最大で約１×１０９、最大で約１×１０１０、最大で約１×１０１１、最大で約１×１０１２、最大で約１×１０１３、または最大で約１×１０１５ＧＣ／ｋｇのベクターを投与することによって処置される。処置において使用するためのベクターおよび細胞の量は、選択される特定の担体だけでなく、投与経路、処置されている状態の性質、ならびに患者の年齢および状態によっても変更されると予想されることが理解されるであろう。最終的には、担当の医療提供者が適した投薬量を決定してもよい。医薬組成物は、細胞有りまたは無しでの投与ための単一の単位剤形で、各化合物の適切な比率で製剤化することができる。細胞またはベクターは、別々に提供してもよく、化合物組成物の液状溶液と混合されるか、または別々に投与されるかのいずれであってもよい。
組成物はまた、持続放出のために製剤化することもできる（例えば、マイクロカプセル化を使用、ＷＯ９４／０７５２９、および／または米国特許第４，９６２，０９１号を参照）。この製剤は、必要に応じて、都合よく別々の単位剤形で提供することができ、薬学分野において周知の方法のいずれかによって調製することができる。このような方法は、治療剤を、液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微粉化した固体担体またはそれらの組合せと混合するステップ、次いで、必要に応じて、生成物を所望の送達系に導入または成形するステップを含み得る。
化合物および／またはリプログラミングされた細胞を含有する１つまたは複数の好適な単位剤形は、非経口（皮下、静脈内、筋肉内および腹膜内など）、頭蓋内、脊髄内、経口、直腸、表皮、経皮、胸腔内、肺内および経鼻（呼吸器）経路などの様々な経路によって投与することができる。
本発明のベクターまたは細胞は、水溶液剤、懸濁剤、錠剤、ハードまたはソフトゼラチンカプセル剤、およびリポソーム剤ならびに他の低速放出製剤、例えば成形ポリマーゲル剤を含む多くの形態で調製することができる。細胞の投与はしばしば、水溶液剤での非経口または局所投与を含む。同様に、細胞および／または化合物を含有する組成物は、デバイス、足場中で、または持続放出製剤として投与することができる。様々なタイプの製剤化手順が、米国特許第６，３０６，４３４号およびそこに含まれる参考文献に記載されている。
液体医薬組成物は、例えば、水性または油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤、使用前に水または他の好適な媒体で再構成するための乾燥粉末剤の形態であってもよい。このような液体医薬組成物は、従来の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性媒体（その例としては、食用油を挙げることができる）、または保存剤を含有していてもよい。
ベクターおよび／または細胞は、非経口投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または持続点滴による）のために製剤化することができ、保存剤が添加された、アンプル、プレフィルドシリンジ、小体積の輸注容器または複数回投与容器中の単位剤形で提供することができる。医薬組成物は、油性または水性媒体中の懸濁剤、液剤、または乳剤の形態をとっていてもよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化物質を含有していてもよい。好適な担体としては、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、および当業界において一般的に使用される他の材料が挙げられる。
組成物はまた、他の成分、例えば心臓の疾患、状態および傷害を処置するのに有用な薬剤、例えば、抗凝血剤（例えば、ダルテパリン（フラグミン）、ダナパロイド（オルガラン）、エノキサパリン（ラブノックス）、ヘパリン、チンザパリン（イノヘップ）、および／またはワルファリン（クマジン））、抗血小板剤（例えば、アスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、またはジピリダモール）、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、ベナゼプリル（ロテンシン）、カプトプリル（キャポテン（Ｃａｐｏｔｅｎ））、エナラプリル（バソテック（Ｖａｓｏｔｅｃ））、フォシノプリル（モノプリル（Ｍｏｎｏｐｒｉｌ））、リシノプリル（プリニビル（Ｐｒｉｎｉｖｉｌ）、ゼストリル）、モエキシプリル（ユニバスク（Ｕｎｉｖａｓｃ））、ペリンドプリル（アセオン）、キナプリル（アキュプリル（Ａｃｃｕｐｒｉｌ））、ラミプリル（アルターセ（Ａｌｔａｃｅ））、および／またはトランドラプリル（マビック（Ｍａｖｉｋ）））、アンジオテンシンＩＩ受容体ブロッカー（例えば、カンデサルタン（アタカンド（Ａｔａｃａｎｄ））、エプロサルタン（テベテン（Ｔｅｖｅｔｅｎ））、イルベサルタン（アバプロ）、ロサルタン（コザール（Ｃｏｚａａｒ））、テルミサルタン（ミカルディス）、および／またはバルサルタン（ディオバン））、ベータブロッカー（例えば、アセブトロール（セクトラール）、アテノロール（テノーミン）、ベタキソロール（ケルロン（Ｋｅｒｌｏｎｅ））、ビソプロロール／ヒドロクロロチアジド（ジアック）、ビソプロロール（ゼベータ（Ｚｅｂｅｔａ））、カルテオロール（カルトロル（Ｃａｒｔｒｏｌ））、メトプロロール（ロプレッサー（Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ）、トプロール（Ｔｏｐｒｏｌ）ＸＬ）、ナドロール（コルガード）、プロプラノロール（インデラル）、ソタロール（ベタペース（Ｂｅｔａｐａｃｅ））、および／またはチモロール（ブロカドレン（Ｂｌｏｃａｄｒｅｎ）））、カルシウムチャンネルブロッカー（例えば、アムロジピン（ノルバスク、ロトレル）、ベプリジル（バスコール（Ｖａｓｃｏｒ））、ジルチアゼム（カルジゼム、チアザック）、フェロジピン（プレンジル（Ｐｌｅｎｄｉｌ））、ニフェジピン（アダラート、プロカルディア）、ニモジピン（ニモトップ（Ｎｉｍｏｔｏｐ））、ニソルジピン（スラー（Ｓｕｌａｒ））、ベラパミル（カラン、イソプチン、ベレラン）、利尿薬（例えば、アミロライド（ミダモール（Ｍｉｄａｍｏｒ））、ブメタニド（ブメックス（Ｂｕｍｅｘ））、クロロチアジド（ダイユリル）、クロルタリドン（ハイグロトン）、フロセミド（ラシックス）、ヒドロクロロチアジド（エシドリックス、ヒドロジウリル）、インダパミド（ロゾール（Ｌｏｚｏｌ））および／またはスピロノラクトン（アルダクトン））、血管拡張薬（例えば、二硝酸イソソルビド（イソルジル）、ネシリチド（ナトレコル（Ｎａｔｒｅｃｏｒ））、ヒドララジン（アプレゾリン）、ニトレートおよび／またはミノキシジル）、スタチン、ニコチン酸、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ジゴキシン、ジギトキシン、ラノキシン、またはそれらのあらゆる組合せなどを含有していてもよい。
追加の薬剤、例えば抗菌剤、抗微生物剤、抗ウイルス剤、生体応答調整物質、増殖因子；免疫モジュレーター、モノクローナル抗体および／または保存剤などが含まれていてもよい。本発明の組成物はまた、療法の他の形態と併せて使用してもよい。
本明細書に記載されるウイルスベクターおよび非ウイルスベクターは、疾患または障害を処置するために、対象に投与することができる。このような組成物は、例えばレシピエントの生理学的条件、投与目的が外傷性傷害に応答するものかまたはより持続的な治療目的のためであるかどうか、および熟練した施術者に公知の他の要因に応じて、単一の用量の形態であってもよいし、連続的または間欠的な方式での複数の用量の形態であってもよい。本発明の化合物および組成物の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的であってもよいし、または一連の間隔を開けた投与の形態であってもよい。局所投与と全身投与の両方が予期される。一部の実施形態において、ウイルスまたは非ウイルスベクターの局所送達が達成される。一部の実施形態において、細胞および／またはベクターの局所送達は、心臓内に細胞の集団を生成するために使用される。一部の実施形態において、このような局所的な集団は、心臓ための「ペースメーカー細胞」として機能する。
本明細書に記載される細胞、組成物、化合物または薬剤のいずれかを含有する組成物および／または細胞培養培地中に、補充因子が含まれていてもよい。このような補充因子の例としては、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）－１、骨形態形成タンパク質－２、骨形態形成タンパク質－３、骨形態形成タンパク質－４、骨形態形成タンパク質－５、骨形態形成タンパク質－６、骨形態形成タンパク質－７、骨形態形成タンパク質－８、骨形態形成タンパク質－９、骨形態形成タンパク質－１０、骨形態形成タンパク質－１１、骨形態形成タンパク質－１２、骨形態形成タンパク質－１３、骨形態形成タンパク質－１４、骨形態形成タンパク質－１５、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、サイトカイン誘導好中球走化性因子１、サイトカイン誘導好中球走化性因子２α、サイトカイン誘導好中球走化性因子２β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮増殖因子、上皮由来の好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）４、線維芽細胞増殖因子５、線維芽細胞増殖因子６、線維芽細胞増殖因子７、線維芽細胞増殖因子８、線維芽細胞増殖因子８ｂ、線維芽細胞増殖因子８ｃ、線維芽細胞増殖因子９、線維芽細胞増殖因子１０、線維芽細胞増殖因子（酸性）、線維芽細胞増殖因子（塩基性）、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合性上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩ、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、プレＢ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、トランスフォーミング増殖因子ａ、トランスフォーミング増殖因子β、トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子０１．２、トランスフォーミング増殖因子１３２、トランスフォーミング増殖因子β３、潜在型トランスフォーミング増殖因子β１、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質Ｉ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩ、トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質ＩＩＩ、および血管内皮増殖因子が挙げられる。
例示的なサイトカインとしては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ－γ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、ＴＮＦ－α、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ－ＣＳＦ）－トロンボポエチン、幹細胞因子、およびエリスロポイエチンを挙げることができる。ケモカインとしてはまた、例えばＩＰ－１０および間質細胞由来因子１αも挙げることができる。
本明細書に記載される組成物および／または細胞培養培地中に含めることが予期される例示的なホルモンとしては、これらに限定されないが、ステロイドホルモンおよびペプチドホルモン、例えばインスリン、ソマトスタチン、成長ホルモン、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、３，３’，５－トリヨード－Ｌ－チロニン、およびＬ－チロキシンを挙げることができる。
Ｖ．リプログラミング方法
標的細胞（例えば、非心筋細胞）は、本明細書に記載される場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、標的細胞を本明細書に記載される組成物と共にインキュベートすることによって、またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ウイルスもしくは非ウイルスベクターを標的組織もしくは細胞に投与することによって、心臓系統（例えば、心筋細胞系統）にリプログラミングすることができる。一部の実施形態において、標的細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態において、標的細胞は、心臓線維芽細胞（ＣＦ）の細胞である。非心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、当業者が利用可能なあらゆる方法を使用して心筋細胞に分化することができる。例えば、Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386；Christoforou et al. (2013) PLoS ONE 8: e63577；Addis et al. (2013) J. Mol. Cell Cardiol. 60:97-106；Jayawardena et al. (2012) Circ. Res. 110: 1465-1473；Nam Y et al., PNAS USA. 2013; 110:5588-5593；Wada R et
al. PNAS USA. 2013; 110: 12667-12672；およびFu J et al., Stem Cell Reports. 2013; 1:235-247に記載される方法を参照されたい。それゆえに、このような方法は、対象に移植できる、または実験に使用できる心臓前駆細胞または心筋細胞の集団を生成するために使用することができる。
Ａ．細胞
心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）または心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅ）は、心筋を構成する筋肉細胞である。各心筋細胞は、筋原線維を含有し、筋原線維は、筋肉細胞の収縮性単位であるサルコメアの長鎖である。心筋細胞は、骨格筋細胞上のものと類似した横紋を示すが、多核化された骨格細胞とは異なり、それらは１つのみの核を含有する。心筋細胞は、高いミトコンドリア密度を有し、それにより心筋細胞は迅速なＡＴＰ生産が可能であることから、それらを疲労に対して高度に耐性にしている。成熟心筋細胞は、以下の心臓マーカー：α－アクチニン、ＭＬＣ２ｖ、ｃＭＨＣ、ＮＫＸ２－５、ＧＡＴＡ４、ｃＴＮＴ、ｃＴＮＩ、ＭＥＦ２ｃ、ＭＬＣ２ａのうち１つもしくは複数、またはそれらのあらゆる組合せを発現することができる。一部の実施形態において、成熟心筋細胞は、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２ｃまたはそれらの組合せを発現する。一部の実施形態において、心臓前駆細胞は、早期心臓前駆体マーカー、例えばＧＡＴＡ４、ＩＳＬ１またはそれらの組合せを発現する。
心筋細胞に誘導される非心筋細胞は、様々な源のいずれに由来するものでもよい。細胞は、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に由来するものでもよい。例示的な非ヒト哺乳動物としては、これらに限定されないが、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、および非ヒト霊長類が挙げられる。一部の実施形態において、細胞は、成体ヒトまたは非ヒト哺乳動物由来である。一部の実施形態において、細胞は、新生児ヒト、成体ヒト、または非ヒト哺乳動物由来である。一部の実施形態において、細胞の種および発現させようとするタンパク質の種は、同じである。例えば、マウス細胞が使用される場合、マウスオーソログが細胞に導入される。ヒト細胞が使用される場合、ヒトオーソログが細胞に導入される。
哺乳動物非心筋細胞（例えば、ヒトまたはマウスの）を使用することができる。一部の実施形態において、心筋細胞は、哺乳動物心筋細胞であり、具体的な実施形態において、非心筋細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態において、非心筋細胞は、幹細胞（例えば、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、リプログラミングされた心細胞または心臓幹細胞）または前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞）から誘導することができる。心筋細胞は、心臓細胞または非心臓細胞から誘導することができる。心筋細胞は、様々な組織源のいずれかに由来するものでもよいし、またはそれらから誘導してもよい。例えば、心臓線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞など。非心筋細胞は、胚性、胎児、または出生後（例えば、成体）細胞であってもよい。好ましい実施形態において、非心筋細胞は、成体細胞である。
本発明で使用するための非心筋細胞は、当業者公知のあらゆる非心筋細胞型であってもよい。非心筋細胞の非限定的な例としては、例えば、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。非心筋細胞は、心臓の心外膜、心筋または心内膜由来の心細胞であってもよい。心筋細胞ではない心細胞としては、例えば、平滑筋および内皮細胞が挙げられる。心細胞の他の非限定的な例としては、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または心臓前駆細胞、心臓伝導細胞、ならびに心筋、血管および心細胞を支持する構造を構成する心臓のペースメーカー細胞が挙げられる。非心筋細胞は、例えば、肝細胞、線維芽細胞、内皮細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心細胞、食道細胞、骨格筋細胞、骨格筋サテライトメラニン細胞、造血細胞、骨細胞、マクロファージ、単球、単核細胞または幹細胞、例えば、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、成体脳幹細胞、表皮幹細胞、皮膚幹細胞、膵臓幹細胞、腎臓幹細胞、肝臓幹細胞、乳房幹細胞、肺幹細胞、筋肉幹細胞、心臓幹細胞、眼幹細胞、骨幹細胞、脾臓幹細胞、免疫系幹細胞、臍帯血幹細胞、骨髄幹細胞および末梢血幹細胞などのうち１つまたは複数から選択することができる。
リプログラミングための細胞が非心筋細胞の集団である場合、細胞の集団は、少なくとも約３０％の非心筋細胞、少なくとも約３５％の非心筋細胞、少なくとも約４０％の非心筋細胞、少なくとも約４５％の非心筋細胞、少なくとも約５０％の非心筋細胞、少なくとも約５５％の非心筋細胞、少なくとも約６０％の非心筋細胞、少なくとも約６５％の非心筋細胞、少なくとも約７０％の非心筋細胞、少なくとも約７５％の非心筋細胞、少なくとも約８０％の非心筋細胞、少なくとも約８５％の非心筋細胞、少なくとも約９０％の非心筋細胞、少なくとも約９５％の非心筋細胞、少なくとも約９８％の非心筋細胞、少なくとも約９９％の非心筋細胞、または９９％より多くの非心筋細胞で構成される。
一部の実施形態において、初発の細胞は、成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）または成体ブタ心臓線維芽細胞（ＡＰＣＦ）である。ＡＨＣＦまたはＡＰＣＦは、例えば、ドナー対象の左心室からの組織断片の消化によって得ることができる。消化は、当業界において公知の様々な方法を用いて、例えば、細胞を、１０μｇ／ｍｌのリベラーゼＴＨ、１０μｇ／ｍｌのリベラーゼＴＭ、１単位／ｍｌのＤＮアーゼＩ、および０．０１％のＰｏｌａｘｏｍｅｒに３７℃で１時間供することによって、実行することができる。様々な代替の酵素および消化手順が当業界において公知である。本開示の組成物および方法は、ｉｎ
ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏ）の適用の両方に関する。リプログラミングしようとする細胞は、「標的細胞」または「初発の細胞」と称される。標的細胞は、本明細書に記載される組成物と接触またはインキュベートすることができる。このような標的細胞はまた、初発の細胞とも称され、または集合的に、初発の細胞の集団とも称される。初発の細胞の集団は、様々な源から誘導することができ、不均質であってもよいし、または均質であってもよい。ある特定の実施形態において、本明細書に記載されるように処置される細胞は、あらゆる入手可能な成体細胞型を含む成体細胞である。他の実施形態において、本発明に従って使用される細胞は、成体幹細胞、前駆細胞、または体細胞である。さらに他の実施形態において、本明細書に記載される組成物および／または方法のいずれかで処置される細胞としては、新生児由来のあらゆる種類の細胞、これらに限定されないが、新生児臍帯血、新生児幹細胞、前駆細胞、および組織由来の細胞（例えば、体細胞）などが挙げられる。したがって、本明細書に記載される組成物および／または方法によってリプログラミングされる初発の細胞の集団は、あらゆる生きた体細胞型であり得る。
線維芽細胞は、本明細書で例示されるように、系統の境界を越えるように、さらに、別の細胞型に、例えば心臓前駆細胞または心筋細胞型に直接変換されるようにリプログラミングされ得る。３つ全ての胚葉由来の様々な細胞型が、遺伝子操作による体細胞リプログラミングに好適であることが示されており、そのような細胞型の例としては、これらに限定されないが、肝臓および胃（Aoi et al., Science 321(5889):699-702 (2008)；
膵臓β細胞（Stadtfeld et al., Cell Stem Cell 2:230-40 (2008)；成熟Ｂリン
パ球（Hanna et al., Cell 133: 250-264 (2008)；ヒト皮膚線維芽細胞（Takahashi et al., Cell 131, 861-72 (2007)；Yu et al., Science 318(5854) (2007)；Lowry et al., Proc Natl Acad Sci USA 105, 2883-2888 (2008)；Aasen et al., Nat Biotechnol 26(11): 1276-84 (2008)；髄膜由来の細胞（ｍｅｎｉｎ
ｇｉｏｃｙｔｅ）（Qin et al., J Biol Chem 283(48):33730-5 (2008)；神経幹
細胞（DiSteffano et al., Stem Cells Devel. 18(5): (2009)；および神経前駆
細胞（Eminli et al., Stem Cells 26(10): 2467-74 (2008)などが挙げられる。
このような細胞はいずれも、本明細書に記載される組成物および方法の使用によって、リプログラミングおよび／またはプログラミングすることができる。
細胞は、自己または同種細胞であってもよい（処置しようとする対象または細胞を受ける可能性がある対象にとって）。細胞は、対象中に存在していてもよいし、または対象から単離されていてもよい。細胞療法の前、その間、またはその後に、免疫抑制薬が一般的に使用される。免疫抑制薬はまた、ウイルスまたは非ウイルスベクターの前、その間、またはその後に使用される場合もある。一部の場合において、免疫抑制薬の使用は、処置の結果を改善することができる。一部の場合において、免疫抑制薬の使用は、処置の副作用、例えば、これらに限定されないが、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、および移植後リンパ増殖性疾患などを減らすことができる。本開示は、本開示の疾患または状態を処置または防止する方法のいずれか、例えば、これらに限定されないが、レンチウイルスベクターが形質導入された細胞に免疫抑制薬に対する耐性を付与する本開示の方法などと共に、免疫抑制薬を使用することを予期する。
一部の実施形態において、非心筋細胞は、対象内の内因性細胞であり、誘導心筋細胞を生成する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでの誘導による。他の実施形態において、非心筋細胞は、外因性であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで改変される。
非心筋細胞は、生きた対象から得ることができる。細胞は、生きた対象から採取した組織から得ることができる。細胞は、近日中に死亡した、好適な組織ドナーと考えられる対象から得ることができる。一部の実施形態において、対象が細胞の好適な源であるかどうかを決定するために、対象は、様々な遺伝子障害、ウイルス感染などに関してスクリーニングされる。一般的に、本発明で使用するのに好適な細胞は、形質転換されておらず（例えば、正常な細胞増殖を呈し）、それ以外の観点で正常である（例えば、正常な核型を呈する）。
細胞は、非胚性の対象、新生児、子供または成体の組織から誘導することができる。細胞は、新生児組織、または帝王切開分娩を含む生後から死亡までの期間内に対象から収集される出生後の組織から誘導することができる。例えば、非心筋細胞は、約１０分齢より高齢、約１時齢より高齢、約１日齢より高齢、約１か月齢より高齢、約２か月齢より高齢、約６か月齢より高齢、約１歳より高齢、約２歳より高齢、約５歳より高齢、約１０歳より高齢、約１５歳より高齢、約１８歳より高齢、約２５歳より高齢、約３５歳より高齢、＞４５歳、＞５５歳、＞６５歳、＞８０歳、＜８０歳、＜７０歳、＜６０歳、＜５０歳、＜４０歳、＜３０歳、＜２０歳または＜１０歳の対象に由来するものでもよい。
組織から非心筋細胞を単離する方法は、当業界において公知であり、あらゆる公知の方法を使用することができる。非限定的な例として、成体心細胞は、心臓手術を受けた患者から得られた、ヒト心臓の心房生検検体から得ることができる。心臓組織を細かく切り刻み、コラゲナーゼで消化し、Choi et al. (2013) Transplantation Proceedings 45:420-426の方法を使用して、心臓幹細胞／前駆細胞をｃ－ｋｉｔ＋前駆細胞拡大培地中
で拡大してもよい。加えて、心臓線維芽細胞は、Ieda et al. (2009) Dev. Cell 16(2):233-244の方法を使用して得ることができる。包皮線維芽細胞は、雄個体の包皮組織から得ることができる。線維芽細胞は、包皮組織を細かく切り刻み、次いで組織を単一の細胞に解離させることにより得ることができる。包皮細胞の凝集塊は、物理的な脱凝集または例えばトリプシンを使用した酵素による消化などの当業界において公知のあらゆる手段によって解離させることができる。
Ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるリプログラミング方法
本開示は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞および／または心筋細胞様細胞を生成するための方法を提供する。選択された初発の細胞は、系統および／または分化の境界を越えて初発の細胞を変換して、心臓前駆細胞および／または心筋細胞を形成するのに十分な時間および条件下で処置される。一部の実施形態において、初発の細胞中での目的の遺伝子の発現は、本明細書に記載される誘導心筋細胞（ｉＣＭ細胞）での処置の前の、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日の間に開始される。細胞のリプログラミング効率は、対象へのｉＣＭ細胞または組換えウイルスまたは非ウイルスベクターの投与の前の、少なくとも２日間、または少なくとも３日間、または少なくとも４日間、または少なくとも５日間の目的の遺伝子の発現によって改善することができる。一部の実施形態において、初発の細胞は、線維芽細胞である。一部の実施形態において、初発の細胞は、分化した表現型の指標である１つまたは複数のマーカーを発現する。
初発の細胞は、細胞の拡大を許容する密度で、リプログラミング組成物を含有する細胞培養培地中に分散されていてもよい。選択された細胞培養培地中で、特に、細胞が、１ミリリットル当たり約１から約１０８個の細胞の細胞密度で、または１ミリリットル当たり約１００から約１０７個の細胞の密度で、または１ミリリットル当たり約１０００から約１０６個の細胞の密度で維持される場合、例えば約１から１０１２個の細胞をウイルスまたは非ウイルスベクターと接触させることができる。一部の実施形態において、本開示の方法は、少なくとも１０３個の細胞、１０４個の細胞、１０５個の細胞、１０６個の細胞、１０７個の細胞、１０８個の細胞、１０９個の細胞、１０１０個の細胞、１０１１個の細胞、１０１２個の細胞、１０１３個の細胞、１０１４個の細胞、１０１５個の細胞、またはそれらの間のあらゆる数の細胞を、ウイルスまたは非ウイルスベクターと接触させ、それによって、１つまたは複数の目的の遺伝子の発現を誘導するステップを含む。
心臓前駆体および心筋細胞への初発の細胞の変換ための時間は、変化する可能性がある。例えば、初発の細胞は、１つまたは複数の目的の遺伝子での処置の後に、心細胞または心筋細胞マーカーが発現されるまでインキュベートしてもよい。このような心細胞または心筋細胞マーカーとしては、以下のマーカー：α－ＧＡＴＡ４、ＴＮＮＴ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２ｃ、ＡＮＰ、アクチニン、ＭＬＣ２ｖ、ｃＭＨＣ、ＩＳＬ１、ｃＴＮＴ、ｃＴＮＩ、ＭＬＣ２ａのいずれか、およびそれらのあらゆる組合せを挙げることができる。
一部の実施形態において、誘導心筋細胞は、１つまたは複数の神経細胞マーカーに関して陰性である。このような神経細胞マーカーとしては、以下のマーカー：ＤＣＸ、ＴＵＢＢ３、ＭＡＰ２、およびＥＮＯ２のいずれかを挙げることができる。
インキュベーションは、本明細書に記載される組成物のいずれかにおいて、例えば、心臓前駆体マーカーが初発の細胞によって発現されるまで、進行させることができる。このような心臓前駆体マーカーとしては、Ｇａｔａ４、Ｔｎｎｔ２、Ｍｙｈ６、Ｒｙｒ２、またはそれらの組合せが挙げられる。心臓前駆体マーカー、例えばＧａｔａ４、Ｔｎｎｔ２、Ｍｙｈ６、Ｒｙｒ２、またはそれらの組合せは、本明細書に記載される組成物中の細胞のインキュベーションを開始させてから、約８日まで、または約９日まで、または約１０日まで、または約１１日まで、または約１２日まで、または約１４日まで、または約１５日まで、または約１６日まで、または約１７日まで、または約１８日まで、または約１９日まで、または約２０日までに発現され得る。
細胞のさらなるインキュベーションは、後期心臓前駆体マーカー、例えばＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２Ｃまたはそれらの組合せの発現が起こるまで実行してもよい。後期心臓前駆体マーカー、例えばＮＫＸ２－５および／またはＭＥＦ２Ｃは、本明細書に記載される組成物および方法を使用する細胞のインキュベーションの、約１５日まで、または約１６日まで、または約１７日まで、または約１８日まで、約１９日まで、または約２０日まで、または約２１日まで、または約２２日まで、または約２３日まで、または約２４日まで、または約２５日までに発現され得る。
リプログラミング効率は、心筋細胞マーカーの関数として測定することができる。このような多能性マーカーとしては、これらに限定されないが、心筋細胞マーカータンパク質およびｍＲＮＡの発現、心筋細胞の形態および電気生理学的な表現型が挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定的な例としては、ａ－サルコグリカン、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、コネクシン３７、コネクシン４０、クリプト（ｃｒｙｐｔｏ）、デスミン、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨ６、ミオシン重鎖、ＮＫＸ２－５、ＴＢＸ５、およびトロポニンＴが挙げられる。一部の態様において、リプログラミング効率は、対照に対して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれより多く増加する。適切な対照の非限定的な例としては、リプログラミング因子に曝露されていない試料が挙げられる。
心筋細胞に特異的な様々なマーカーの発現は、従来の生化学的または免疫化学的な方法（例えば、酵素結合免疫吸着検定法、免疫組織化学的アッセイなど）によって検出することができる。代替として、心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸の発現を評価してもよい。細胞中の心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸の発現は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）またはハイブリダイゼーション分析、あらゆるマーカータンパク質をコードするｍＲＮＡを増幅する、検出する、および分析するためにこれまでに一般的に使用されてきた分子生物学的な方法によって確認することができる。心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸配列は公知であり、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースを介して利用可能である。したがって、プライマーまたはプローブとして使用するために必要なマーカー特異的な配列は、容易に決定される。
心筋細胞は、いくつかの心臓特異的な電気生理学的特性を呈する。１つの電気的特徴は、活動電位であり、これは、各心細胞の内部と外部との間の電位差が生じ、一貫した軌道に従って落ちる短期間の事象である。心筋細胞の別の電気生理学的特徴は、Ｃａ２＋トランジェントと名付けられたサイトゾルの遊離Ｃａ２＋濃度の周期変動であり、これは、心筋細胞の収縮および弛緩の調節で用いられるものである。これらの特徴は、細胞の集団が心筋細胞にリプログラミングされているかどうかを査定するために、検出および評価することができる。
一部の実施形態において、初発の細胞は、細胞培養条件下で、約１日から約３０日、または約２日から約２７日、または約３日から約２５日、または約４日から約２３日、または約５日から約２０日、または約６日から約２０日、または約１０日から約２０日にわたり、リプログラミング培地と共にインキュベートすることができる。
培養培地中の細胞は、特定にはリプログラミング中に、目的の遺伝子を発現することができる。例えば、培養培地中の細胞は、ＡＳＣＬ１ポリペプチドを一時的に発現することができる。リプログラミングのために選択された細胞は、異種Ｋｌｆ、Ｓｏｘ２、またはＭｙｃの発現を必要とせず、Ｋｌｆ、ＭｙｃまたはＳｏｘ２ポリペプチドと接触していなくてもよい。一部の実施形態において、Ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４などの他の転写因子の発現は、培養培地によって直接的または間接的に誘導されなくてもよい。
しかしながら、他の実施形態において、細胞培養培地は、内因性Ｋｌｆ４ポリペプチド、Ｍｙｃポリペプチド、Ｓｏｘ２ポリペプチドまたはそれらの組合せの発現を誘導することができる。例えば、内因性Ｋｌｆ４ポリペプチド、Ｍｙｃポリペプチド、および／またはＳｏｘ２ポリペプチドの発現は、たとえ外因性Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、および／またはＳｏｘ２核酸が導入されていなくても、本明細書に記載される組成物に曝露されると起こり得る。
１．培養条件
本開示の細胞は、当業者公知のあらゆる条件下での培養することができる。一部の実施形態において、細胞（例えば、非心筋細胞、心筋細胞、およびそれらの組合せ）は、１～２０％の酸素（Ｏ２）および５％の二酸化炭素（ＣＯ２）の条件で培養される。一部の実施形態において、本開示の細胞は、低酸素条件下で（例えば、１０％未満のＯ２の存在下で）培養される。一部の実施形態において、本開示の細胞は、約３７℃で培養される。一部の実施形態において、本開示の細胞は、約３７℃、５％のＣ０２および１０～２０％のＯ２で培養することができる。一部の実施形態において、細胞は、所定期間にわたり低酸素条件で培養される。例えば、細胞を所定期間にわたり酸素正常条件下（－２０％のＯ２）で培養し、次いで、低酸素条件、例えば約５％のＯ２に切り替えてもよい。
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで非心筋細胞を心筋細胞に分化させる利点は、埋め込みに好適な細胞を容易に同定する、またはダメージを受けた、もしくは分化していない細胞を識別する能力である。ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける分化は、分化していない非心筋細胞から誘導心筋細胞を精製または単離することを可能にする。
リプログラミング培地中での初発の細胞のインキュベーション後、細胞は次いで、別の培地中で、例えば、維持培地、拡大培地、または細胞のさらなる成熟を誘導できる心臓誘導培地中でインキュベートすることができる。
リプログラミング剤または誘導剤が添加された採用される基礎培地は、便利な細胞培養培地であってもよい。本明細書で言及される用語「細胞培養培地」（本明細書では「培養培地」または「培地」とも称される）は、細胞の生存を維持し増殖を支持する栄養素を含有する、細胞を培養するための培地である。細胞培養培地は、以下のいずれか：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、および他の成分、例えばペプチド増殖因子などを適切な組合せで含有していてもよい。特定の細胞型に通常使用される細胞培養培地が、当業者に利用可能である。
採用できる細胞培養培地の例としては、ＭＴＥＳＲ－１（登録商標）培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣＡ）、またはマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）基材（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＪ）上もしくはＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ表面上のＥＳＳＥＮＴＩＡＬ８（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の代用としてインスリン、トランスフェリン、脂質およびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が補充されたＪｏｈａｎｓｓｏｎおよびＷｉｌｅｓの既知組成培地（ＣＤＭ）中で、が挙げられる。商業的に入手可能な培地の例としてはまた、これらに限定されないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭ１１６４０、ハム（Ｈａｍ）Ｆ－１０、ハムＦ－１２、ａ－最小必須培地（ａＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地、または多能性細胞と共に使用するために改変された汎用培地、例えばＸ－ＶＩＶＯ（Ｌｏｎｚａ）または造血基礎培地も挙げられる。一部の実施形態において、２つまたはそれより多くの細胞培養培地の混合物が使用され、例えば、１部のＧＩＢＣＯ（登録商標）培地１９９に対して４部のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の混合物が使用される。培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、アミノ酸、および／または抗生物質が補充されていてもよい。一部の実施形態において、培地は、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＲＰＭＩ１６４０（ＲＰＭＩ）＋ＧＩＢＣＯ（登録商標）Ｂ－２７サプリメント（Ｂ２７）と混合される。細胞の成長は、ｒｈＦＧＦ、ｒｈＦＧＦ－１０、およびｒｈＶＥＧＦ（ＦＦＶ）の添加によって強化することができる。
組成物および／または培養培地は、本明細書に記載される薬剤または化合物のいずれかを、細胞の心細胞または心筋細胞マーカーの発現を誘導するのに十分な量で含有していてもよい。このような心細胞または心筋細胞マーカーとしては、以下のマーカーのいずれか：α－アクチニン、ＭＬＣ２ｖ、ｃＭＨＣ、ＮＫＸ２－５、ＭＥＦ２ｃ、ＧＡＴＡ４、ＩＳＬ１、ｃＴＮＴ、ｃＴＮＩ、ＭＬＣ２ａおよびそれらのあらゆる組合せを挙げることができる。例えば、培養培地は、ＴＧＦ－β阻害剤、例えばＳＢ４３１５４２（例えば、約０．１～１０μＭで）、ＷＮＴシグナル伝達活性化剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１（例えば、約３～２０μＭで）、ＬＳＤ１／ＫＤＭ１阻害剤、例えばパルネート（例えば、約０．１～１０μＭで）、およびアデニリルシクラーゼ活性化剤、例えばフォルスコリン（例えば、約３～２０μＭで）を含んでいてもよい。
インキュベーションは、本明細書に記載される組成物のいずれかにおいて、例えば、早期心臓前駆体マーカーが初発の細胞によって発現されるまで進行させることができる。このような早期心臓前駆体マーカーとしては、ＧＡＴＡ４、ＩＳＬ１またはそれらの組合せが挙げられる。早期心臓前駆体マーカー、例えばＧＡＴＡ４および／またはＩＳＬ１は、本明細書に記載される組成物および方法を使用する細胞のインキュベーションの、約６日まで、または約８日まで、または約９日まで、または約１０日まで、または約１１日まで、または約１２日まで発現され得る。
培養培地は、本明細書に記載される薬剤または化合物のいずれかを、細胞の集団中の細胞の、少なくとも０．００１％、または約０．００５％、または約０．０１％、または約０．０２％、または約０．０３％を心細胞型にリプログラミングするのに十分な量で含有していてもよい。
Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏでのリプログラミング方法
一部の実施形態において、少なくとも１つのリプログラミング因子、例えば、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＢＡＦ６０Ｃ、ＥＳＲＲＧ、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＡＮＤ２、ＩＲＸ４、ＩＳＬＬ、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＳＰ１、ＭＥＳＰ２、ＮＫＸ２．５、ＳＲＦ、ＴＢＸ２０、およびＺＦＰＭ２、またはそれらのあらゆる組合せが、対象に投与されている。例えば、対象に、少なくとも１つのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスまたは非ウイルスベクターを投与してもよい。好ましい実施形態において、リプログラミング因子の２つまたはそれより多く、より好ましくは３つまたはそれより多くの組合せが対象に投与される。一部の実施形態において、上記の列挙したリプログラミング因子のうち１つまたは複数が、明示的に除外される。他の実施形態において、リプログラミング因子は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、またはそれらのあらゆる組合せの群から選択される。他の実施形態において、リプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、ＭＹＯＣＤ、またはそれらのあらゆる組合せの群から選択される。具体的な実施形態において、リプログラミング因子は、Ａｓｃｌ１およびＭｙｏｃｄ（ＭｙＡ）である。具体的な実施形態において、リプログラミング因子は、ＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２ＣおよびＴＢＸ５（ＭｙＡＭＴ）である。他の一部の実施形態において、リプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（ＧＭＴ）である。他の具体的な実施形態において、リプログラミング因子は、ミオカルディン、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（すなわち、ＭｙＭＴ）である。他の具体的な実施形態において、リプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、およびミオカルディン（すなわち、４Ｆ）である。他の実施形態において、リプログラミング因子は、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５、ＥＳＲＲＧ、ミオカルディン、ＺＦＰＭ２、およびＭＥＳＰ１（すなわち、７Ｆ）である。
ＶＩ．組成物：細胞およびベクター
本開示は、ウイルスおよび非ウイルスベクターを提供する。本開示はまた、本発明の方法に従って生成した単離された誘導心筋細胞も提供する。誘導心筋細胞は、少なくとも１つの心臓の遺伝子を、天然に存在する心筋細胞で見出されるレベルより高いレベルまたはより低いレベルで発現することができる。誘導心筋細胞は、単離されたｉＣＭ、または対象への組成物の投与によってｉｎ ｖｉｖｏで生産されたｉＣＭであり得る。
一部の実施形態において、天然に存在する心筋細胞で見出されるものより高いレベルで発現される心臓の遺伝子は、ＴＮＮＴ２、ＡＣＴＮ２、ＡＴＰ２Ａ２、ＭＹＨ６、ＲＹＲ２、ＭＹＨ７、およびＡＣＴＣＬからなる群から選択される。一部の実施形態において、天然に存在する心筋細胞で見出されるものより低いレベルで発現される心臓の遺伝子は、ＭＹＢＰＣ３、ＰＩＮ、ＭＢ、ＬＭＯＤ２、ＭＹＬ２、ＭＹＬ３、ＣＯＸ６Ａ２、ＡＴＰ５ＡＬ、ＴＴＮ、ＴＮＮＩ３、ＰＤＫ４、ＭＹＣＺ２、ＣＡＣＮＡＬＣ、ＳＣＮ５Ａ、ＭＹＯＣＤ、およびＮＰＰＡからなる群から選択される。
別の態様において、本発明の方法に従って生成した誘導心筋細胞の実質的に同質な集団が提供される。一部の実施形態において、実質的に同質な集団の誘導心筋細胞は、少なくとも１つの心臓の遺伝子を、天然に存在する心筋細胞で見出されるものより高いレベルまたはより低いレベルで発現する。
一部の実施形態において、組成物は、本明細書に記載される単離された誘導心筋細胞の集団および担体、必要に応じて薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の実施形態において、組成物は、安定剤および／または保存剤をさらに含む。
一部の実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるウイルスまたは非ウイルスベクターおよび担体、必要に応じて薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の実施形態において、組成物は、安定剤および／または保存剤をさらに含む。
組成物は、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される塩、希釈剤、担体、媒体および当業者に周知のそのような他の不活性物質を含んでいてもよい。医薬調製物において一般的に採用される媒体および賦形剤としては、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、カカオバター、水性または非水性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコールなどが挙げられる。溶液は、水または生理学的に適合する有機溶媒、例えばエタノール、１，２－プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪族アルコール、トリグリセリド、グリセリンの部分エステルなどを使用して調製することができる。
非経口組成物は、従来の技術を使用して調製することができ、このような組成物は、滅菌等張生理食塩水、水、１，３－ブタンジオール、エタノール、１，２－プロピレングリコール、水と混合されたポリグリコール、リンゲル液などを含み得る。一態様において、組成物を意図した処置部位に配置すること、および適切に位置決めすることを容易にするために、着色剤が添加される。
組成物は、埋め込み可能なデバイスを使用して投与される薬剤を含んでいてもよい。この開示によって予期される好適な埋め込み可能なデバイスとしては、血管内ステント（例えば、自己拡張型ステント、バルーン拡張型ステント、およびステントグラフト）、足場、グラフトなどが挙げられる。このような埋め込み可能なデバイスは、誘導心筋細胞を生成することが可能な組成物で、少なくとも１つの表面上がコーティングされていてもよいし、またはそれで含浸されていてもよい。組成物はまた、埋め込み可能なデバイス中のリザーバー内に含有されている薬剤を含んでいてもよい。薬剤が埋め込み可能なデバイス中のリザーバー内に含有されている場合、リザーバーは、デバイスからの薬剤の溶出を可能にするように構造化されている。埋め込み可能なデバイスから投与される組成物の薬剤は、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤またはその両方を含んでいてもよい。
医薬組成物は、投与に対応したあらゆる形態で提供することができる。組成物は、保存剤および／または安定剤を含んでいてもよい。保存剤の非限定的な例としては、メチル－、エチル－、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、チメロサール、フェニル第二水銀塩（ｐｈｅｎｙｌｍｅｒｃｕｒａｔｅ ｓａｌｔ）、クロルヘキシジン、フェノール、３－クレゾール、第四アンモニウム化合物（ＱＡＣ）、クロロブタノール、２－エトキシエタノール、およびイミド尿素が挙げられる。
張性を制御するために、水性医薬組成物は、生理学的な塩、例えばナトリウム塩を含んでいてもよい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１から２０ｍｇ／ｍｌの間で存在していてもよい。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムが挙げられる。
組成物は、１つまたは複数の緩衝液を含んでいてもよい。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；またはクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、５～２０ｍＭの範囲内の濃度で含まれると予想される。組成物のｐＨは、一般的に、５から８の間、より典型的には、６から８の間、例えば６．５から７．５の間、または７．０から７．８の間と予想される。
組成物は、好ましくは滅菌されている。組成物は、好ましくはグルテンフリーである。組成物は、好ましくは非発熱性である。
医薬組成物は、あらゆる適切な経路によって投与でき、これらは、処置しようとする疾患または状態に応じて当業者に明らかであると予想される。典型的な投与経路としては、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内、経鼻または腹膜内が挙げられる。
一部の実施形態において、細胞を含む組成物は、凍結防止剤を含んでいてもよい。凍結防止剤の非限定的な例としては、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびグリセロール）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、スクロース、トレハロース、デキストロース、およびそれらのあらゆる組合せが挙げられる。
一部の実施形態において、本発明の方法で使用される１つまたは複数の薬剤は、放出制御製剤の形態で提供される。用語「放出制御製剤」は、持続放出および徐放性製剤を含む。放出制御製剤は当業界において周知である。これらは、組成物の持続放出、定期的な放出、パルス放出、または遅延放出を可能にする賦形剤を含む。放出制御製剤としては、これらに限定されないが、組成物（ＷＮＴ阻害剤および／またはＴＧＦ－β阻害剤）のマトリックスへの埋め込み；腸溶コーティング；マイクロカプセル化；ゲルおよびヒドロゲル；インプラント；ならびに組成物の制御放出を可能にする他のあらゆる製剤が挙げられる。
一部の実施形態において、リプログラミングされた細胞の集団（リプログラミングの様々な段階における）は、液体窒素温度で凍結し、所定期間にわたり貯蔵し、次いで後日使用するために融解させてもよい。凍結させる場合、リプログラミングされた細胞の集団は、あらゆる好適な低温保存培地中で、例えば、４０％ＲＰＭＩ１６４０培地中の１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ中で、貯蔵することができる。融解させたら、細胞は、選択された増殖因子、ビタミン、フィーダー細胞、および当業者によって選択された他の成分を含有し得る適切な培地中で細胞を培養することによって拡大することができる。ウイルスおよび非ウイルスベクターはまた、液体窒素温度で、またはしばしばそれより高温で凍結し、所定期間にわたり貯蔵し、次いで後日使用するために融解させてもよい。
一部の実施形態において、ｉＣＭ細胞の、少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％が、α－アクチニン陽性である。一部の実施形態において、ｉＣＭ細胞の、少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％が、ｃＴｎＴ陽性である。一部の実施形態において、ｉＣＭ細胞の、少なくとも３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％が、α－アクチニンおよびｃＴｎＴ二重陽性である。
本明細書に記載される方法によって生成したリプログラミングされた細胞の集団は、低いパーセンテージの非心臓細胞（例えば、線維芽細胞）を含んでいてもよい。例えば、組成物中で使用するための、および対象への投与のためのリプログラミングされた細胞の集団は、細胞集団中の全細胞の、約９０％未満の非心臓細胞、約８５％未満の非心臓細胞、約８０％未満の非心臓細胞、約７５％未満の非心臓細胞、約７０％未満の非心臓細胞、約６５％未満の非心臓細胞、約６０％未満の非心臓細胞、約５５％未満の非心臓細胞、約５０％未満の非心臓細胞、約４５％未満の非心臓細胞、約４０％未満の非心臓細胞、約３５％未満の非心臓細胞、約３０％未満の非心臓細胞、約２５％未満の非心臓細胞、約２０％未満の非心臓細胞、約１５％未満の非心臓細胞、約１２％未満の非心臓細胞、約１０％未満の非心臓細胞、約８％未満の非心臓細胞、約６％未満の非心臓細胞、約５％未満の非心臓細胞、約４％未満の非心臓細胞、約３％未満の非心臓細胞、約２％未満の非心臓細胞、または約１％未満の非心臓細胞を有していてもよい。
リプログラミングされた細胞は、処置しようとする疾患または傷害に応じて様々な量で組成物中に含まれていてもよい。例えば、組成物は、約１０３から約１０１２個のリプログラミングされた細胞、または約１０４から約１０１０個のリプログラミングされた細胞、または約１０５から約１０８個のリプログラミングされた細胞を含有する、局所または全身投与のための液体の形態で調製することができる。
以下のタイプの化合物の１つまたは複数：ＷＮＴアゴニスト、ＧＳＫ３阻害剤、ＴＧＦ－ベータシグナル伝達阻害剤、エピジェネティックな調節剤、ＬＳＤ１阻害剤、アデニリルシクラーゼアゴニスト、またはそれらのあらゆる組合せが、組成物中に細胞と共に存在していてもよい。本明細書に記載される化合物はいずれも、細胞と共に投与することができる。
本開示はまた、上述の薬剤、組成物または製剤を含むパーツのキットも提供する。
ＶＩＩ．処置方法
本明細書に記載されるリプログラミングされた細胞および組成物はまた、心臓の疾患または状態を有する対象を処置する方法でも採用することができる。「処置すること」または「状態またはそれを必要とする対象の処置」は、（１）症状の低減などの臨床結果を含む有益な、もしくは所望の結果を得るためのステップをとること；（２）疾患を防止すること、例えば、疾患に罹りやすい可能性があるが、その疾患の症状を経験しておらず、呈示してもいない患者において、その疾患の臨床症状が発生しないようにすること；（３）疾患を抑制すること、例えば、疾患もしくはその臨床症状の発生を停止もしくは低減させること；（４）疾患を緩和すること、例えば、疾患もしくはその臨床症状を寛解させること；または（５）疾患を遅延させることを指す。この発明の目的のために、有益な、または所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、誘導心筋細胞を生成すること、および／または心筋の再生を促進することが挙げられる。
本開示の組成物、細胞および方法を使用する処置が必要な対象としては、これらに限定されないが、先天性心臓欠陥を有する個体、変性性筋疾患を患っている個体、虚血性の心臓組織に至る状態を患っている個体（例えば、冠動脈疾患を有する個体）などが挙げられる。一部の例において、方法は、変性性筋疾患または状態（例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患）を処置するのに有用である。一部の例において、本方法は、心臓または心臓血管の疾患または障害、例えば、心臓血管疾患、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作（卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患、拡張型冠動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症を有する個体を処置するのに有用である。
本開示の組成物、細胞および方法を使用する処置に好適な対象としては、これらに限定されないが、虚血性の心臓組織に至る状態などの心臓の状態を有する個体（例えば、哺乳動物対象、例えばヒト、非ヒト霊長類、飼いならされた哺乳動物、実験用非ヒト哺乳動物対象、例えばマウス、ラットなど）（例えば、冠動脈疾患を有する個体）などが挙げられる。
一部の例において、処置に好適な個体は、心臓または心臓血管の疾患または状態、例えば、心臓血管疾患、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作（卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患、拡張型冠動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症を患っている。一部の例において、本方法での処置に好適な個体としては、変性性筋疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患を有する個体が挙げられる。
本開示の組成物、細胞および方法を使用する処置が必要な対象としては、これらに限定されないが、先天性心臓欠陥を有する個体、変性性筋疾患を患っている個体、虚血性の心臓組織に至る状態を患っている個体（例えば、冠動脈疾患を有する個体）などが挙げられる。一部の例において、方法は、変性性筋疾患または状態（例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患）を処置するのに有用である。一部の例において、本方法は、心臓または心臓血管の疾患または障害、例えば、心臓血管疾患、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作（卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患、拡張型冠動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症を有する個体を処置するのに有用である。
本開示の組成物、細胞および方法を使用する処置に好適な対象としては、これらに限定されないが、虚血性の心臓組織に至る状態などの心臓の状態を有する個体（例えば、哺乳動物対象、例えばヒト、非ヒト霊長類、実験用非ヒト哺乳動物対象、例えばマウス、ラットなど）（例えば、冠動脈疾患を有する個体）などが挙げられる。一部の例において、処置に好適な個体は、心臓または心臓血管の疾患または状態、例えば、心臓血管疾患、動脈瘤、アンギナ、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作（卒中）、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、弁疾患、拡張型冠動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧（高血圧症）、心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞（心臓発作）、または静脈血栓塞栓症を患っている。一部の例において、本方法での処置に好適な個体としては、変性性筋疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大性心筋症、拘束型心筋症、または虚血性心筋症の原因となる冠動脈疾患を有する個体が挙げられる。
リプログラミングされた細胞および／または組成物（リプログラミングされた細胞を含んで、または含まずに、本明細書に記載される化合物のいずれかを含有する）を使用して処置することができる疾患および状態の例としては、あらゆる心臓の異常または心機能障害が挙げられる。処置することができる疾患および状態としては、遺伝学的な欠陥、物理的な傷害、環境からの攻撃または調節、不健康、肥満症および他の疾患のリスクの結果として生じるものが挙げられる。
虚血性心筋症は、冠動脈疾患によって引き起こされる慢性障害（心臓表面上に冠動脈のアテローム硬化性の狭窄または閉塞がある疾患）である。冠動脈疾患はしばしば、心筋に十分な酸素豊富な血液が供給されない心臓虚血のエピソードを引き起こす。
非虚血性心筋症は、一般的に、主に臨床的および病理学的な特徴に基づいて３つの群：拡張型心筋症、肥大性心筋症ならびに拘束型および浸潤性心筋症に分類される。
別の実施形態において、心臓の異常は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびエメリー－ドライフス（Ｅｍｅｒｙ Ｄｒｅｉｆｆｕｓｓ）拡張型心筋症などの遺伝病である。
例えば、心臓の異常は、うっ血性心不全、心筋梗塞、心臓虚血、心筋炎および不整脈からなる群から選択され得る。一部の実施形態において、対象は、糖尿病である。一部の実施形態において、対象は、非糖尿病である。一部の実施形態において、対象は、糖尿病性心筋症を患っている。
本明細書に記載される通りに生成したリプログラミングされた細胞は、このような処置が必要なヒト患者または他の対象における組織の再構成または再生のために採用してもよい。細胞は、罹患したまたは傷害を受けた組織部位へのそれらのグラフトまたは移動、および機能欠損領域の再構成または再生が可能な方式で投与される。例えば心臓の組織への細胞の投与に適合させることができるデバイスが利用可能である。
療法の場合、組換えウイルス、非ウイルスベクター、心臓前駆細胞、心筋細胞および／または医薬組成物は、局所的に、または全身に投与することができる。リプログラミングされた細胞の集団は、注射、カテーテル、埋め込み可能なデバイスなどによって導入することができる。組換えウイルスまたはリプログラミングされた細胞の集団は、細胞に有害作用を与えないあらゆる生理学的に許容される賦形剤または担体中で投与することができる。例えば、組換えウイルス、非ウイルスベクター、心臓前駆細胞、心筋細胞および／または医薬組成物は、静脈内投与してもよいし、または心臓内経路を介して（例えば、心外膜に、または心筋内に）投与してもよい。本開示の組換えウイルス、非ウイルスベクター、心筋細胞および医薬組成物（例えば、ベクターを含む組成物）を対象に、特定にはヒト対象に投与する方法としては、対象中の標的部位への医薬組成物（例えば、ウイルスベクターを含む組成物）または細胞の注射、埋め込み、または輸注が挙げられる。注射としては、直接の筋肉注射を挙げることができ、輸注としては、血管内輸注を挙げることができる。ベクター、医薬組成物、または細胞は、医薬組成物または細胞の注射または埋め込みによる対象への導入を容易にする送達デバイスに挿入されていてもよい。このような送達デバイスとしては、レシピエント対象の体に細胞および流体を注射するためのチューブ、例えばカテーテルが挙げられる。チューブは、加えて、本発明の細胞を所望の場所で対象に導入することができる針、例えばシリンジを含む。一部の実施形態において、医薬組成物または細胞は、例えば、Tang et al. Cardiac cell-integrated microneedle patch for treating myocardial infarction. Science Advances 28 Nov 2018: Vol. 4, no. 11, eaat9365に記載されるようなマイクロニードルパッチによって送達される。
組換えウイルス、非ウイルスベクター、心臓前駆細胞および心筋細胞は、このような送達デバイス、例えばシリンジに、様々な形態で挿入することができる。組換えウイルス、非ウイルスベクター、リプログラミングされた細胞の集団は、医薬組成物の形態で供給されてもよい。このような組成物は、ヒト投与のための十分に滅菌された条件下で調製された等張賦形剤を含んでいてもよい。医薬製剤における一般原則については、G. Morstyn
& W. Sheridan編のCell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, Cambridge University Press, 1996；およびHematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000が読者により参照される。採用された経路および／またはデバ
イスによる投与を最適化するために、リプログラミングされた細胞の集団を含む組成物の細胞用の賦形剤およびあらゆる付随する成分の選択は、適合させることができる。
用語「溶液」は、本明細書で使用される場合、本発明の心筋細胞および心細胞が生存し続けることができるか、またはウイルスベクターが生物学的に活性なままでいる担体または希釈剤を含む。使用することができる担体および希釈剤としては、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒および／または分散媒が挙げられる。このような担体および希釈剤の使用は当業界において周知である。溶液は、好ましくは、滅菌されており、簡単なシリンジ通過性（syringability）が存在する程度に流体である。移植の場合、心筋細胞および／また
は心細胞は、シリンジに引き込まれ、麻酔した移植レシピエントに投与される。直接注射の場合、針、シリンジ、またはカテーテルは、理想的には最小侵襲性の設定で、外科的に心臓に挿入される。この手順を使用して、複数回の注射が行われてもよい。
心臓前駆細胞、心細胞、および／または心筋細胞はまた、支持マトリックス中に埋め込まれていてもよい。リプログラミングされた細胞の集団を含む組成物はまた、リプログラミングされた細胞の生着または機能的な動員を容易にする１つまたは複数の他の成分を含んでいてもよいし、またはそれらが付随していてもよい。好適な成分としては、リプログラミングされた細胞、または補足的な細胞型、例えば心臓ペースメーカー細胞、または異なる成熟段階の心細胞の接着を支持または促進するマトリックスタンパク質が挙げられる。別の実施形態において、組成物は、生理学的に許容されるマトリックス足場を含んでいてもよい。このような生理学的に許容されるマトリックス足場は、吸収性および／または生分解性であってもよい。
Ａ．組換えウイルスを使用する処置方法
一部の態様において、本開示のウイルス粒子は、それを必要とする対象を処置するために使用することができる。一部の実施形態において、組換えウイルスは、それを必要とする対象に投与することができ、その場合、組換えウイルスの対象への投与は、対象における心臓血管疾患を処置する。
組換えウイルスは、局所的に、または全身に投与されてもよい。組換えウイルスは、適切なキャプシドタンパク質を選択することによって、または別のウイルス型由来のタンパク質を有するウイルスをシュードタイピングすることによって、特異的な細胞型を標的化するように操作されていてもよい。様々な治療のための投与レジメンの適性およびウイルス粒子組成物の投薬量を決定するために、組換えウイルスは、まず好適な動物モデルで試験することができる。１つのレベルで、組換えウイルスは、ｉｎ ｖｉｖｏで標的細胞に感染するその能力について評価される。組換えウイルスはまた、それが標的組織に移動するかどうか、それが宿主における免疫応答を誘導するかどうかを確認するために、または投与される組換えウイルスの適切な数、もしくは投薬量を決定するために評価される。処置しようとする疾患に応じて、免疫応答を生じさせることは、組換えウイルスにとって望ましい場合もあるし、または望ましくない場合もある。一般的に、ウイルス粒子の繰り返しの投与が必要な場合、ウイルス粒子が免疫原性ではない場合が有利であると予想される。試験目的の場合、ウイルス粒子組成物は、免疫不全動物（例えばヌードマウス、または化学的に、もしくは放射線照射によって免疫不全にされた動物）に投与することができる。標的組織または細胞は、感染期間の後に回収され、組織または細胞が感染したかどうか、および標的組織または細胞中で所望の表現型（例えば誘導心筋細胞）が誘導されたかどうかを決定するために評価することができる。
組換えウイルスは、様々な経路によって投与することができ、このような経路としては、これらに限定されないが、心臓への直接注射、または心臓カテーテル法が挙げられる。代替として、組換えウイルスは、例えば静脈内輸注によって、全身投与することができる。直接注射が使用される場合、それは、心臓切開手術または低侵襲手術のいずれかによって実行されてもよい。一部の場合において、組換えウイルスは、注射または輸注によって心膜腔に送達される。注射または輸注された組換えウイルスは、様々な方法によって追跡することができる。例えば、検出可能な標識（例えば緑色蛍光タンパク質、またはベータ－ガラクトシダーゼ）で標識された、またはそれを発現する組換えウイルスは、容易に検出することができる。組換えウイルスは、標的細胞に、マーカータンパク質、例えば表面で発現されるタンパク質または蛍光タンパク質を発現させるように操作されていてもよい。代替として、組換えウイルスでの標的細胞の感染は、標的細胞が、試験のために採用された動物によって発現されない細胞マーカー（例えば、実験動物に細胞を注射する場合、ヒト特異的な抗原）を発現することによって検出することができる。標的細胞の存在および表現型は、蛍光顕微鏡法によって（例えば、緑色蛍光タンパク質、またはベータ－ガラクトシダーゼの場合）、免疫組織化学によって（例えば、ヒト抗原に対する抗体を使用して）、ＥＬＩＳＡによって（ヒト抗原に対する抗体を使用して）、または心臓表現型を示すＲＮＡに特異的になるように増幅を引き起こすプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を使用するＲＴ－ＰＣＲ分析によって評価することができる。
一部の実施形態において、本開示は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）における心筋梗塞を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、ＭｙΔ３およびＡＳＣＬ１をコードするＡＡＶベクターを投与するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、本方法は、ＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭｙΔ３をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを対象に投与するステップを含む。一部の実施形態において、本開示は、それを必要とする対象（例えば、ヒト）における心筋梗塞を処置する方法であって、ＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１（ＡＡＶ：ＭｙΔ３Ａ）をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを対象に投与するステップを含み、対象における、心不全の部分的な、実質的な、もしくは完全な回復、および／または心不全の進行の部分的な、実質的な、もしくは完全な停止、および／または心不全の部分的な、実質的な、もしくは完全な防止をもたらす、方法を提供する。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５ベクターであり得る。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ５のバリアントであり得る。ＡＡＶベクターは、別のＡＡＶベクターであり得る。ＡＡＶベクターは、非心筋細胞（例えば、心臓線維芽細胞）の感染または形質導入（例えば、優先的な感染または形質導入）が可能であり得る。一部の実施形態において、本開示の処置方法は、対象における左心室駆出率（ＬＶＥＦ）の増加および／またはＬＶＥＦの維持をもたらす。一部の実施形態において、対象は、心筋梗塞（ＭＩ）を患っているかまたはそのリスクがある。一部の実施形態において、対象は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を患っているかまたはそのリスクがある。一部の実施形態において、対象は、急性心筋梗塞（ＣＭＩ）を患っているかまたはそのリスクがある。一部の実施形態において、対象は、慢性心不全（例えば、ＭＩまたはＡＭＩまたはＣＭＩに起因する）を患っているかまたはそのリスクがある。一部の実施形態において、対象は、うっ血性心不全（例えば、ＭＩまたはＡＭＩまたはＣＭＩに起因する）を患っているかまたはそのリスクがある。様々な実施形態において、投与するステップは、心臓内または心筋内注射、冠動脈内のカテーテル処置（ｃａｔｈｅｒｉｔｉｚａｔｉｏｎ）、または全身投与（例えば、静脈内投与）を含む。一部の実施形態において、ＭｙΔ３ＡのＡＡＶ送達は、急性心筋梗塞（mycordial infarction）（ＡＭ
Ｉ）および慢性心筋梗塞（ＣＭＩ）のいずれかまたは両方におけるｉｎ ｖｉｖｏでの機能的な利益を提供する。一部の実施形態において、ＡＭＩに起因する心不全は、部分的に、実質的に、または完全に回復する。一部の実施形態において、ＣＭＩに起因する心不全の進行は、部分的に、実質的に、または完全に停止する。
一部の実施形態において、投与するステップは、心臓発作の、約１時間以内、約２時間以内、約３時間以内、約４時間以内、約５時間以内、約１２時間以内、約１８時間以内、または約２４時間以内に、ＡＡＶベクターを投与することを含む。一部の実施形態において、投与するステップは、心臓発作の、約１日以内、約２日以内、約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、または約２４時間以内に、ＡＡＶベクターを投与することを含む。一部の実施形態において、投与するステップは、心臓発作の、約１週間以内、約２週間以内、約３週間以内、または約４週間以内に、ＡＡＶベクターを投与することを含む。
一態様において、本開示は、心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、本開示のベクターまたはベクター系を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。ベクターは、モノシストロン性、バイシストロン性、またはポリシストロン性ベクターであり得る。一実施形態において、本開示は、心臓の機能における改善を促進する、増加させる、改善する、または維持する方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、心臓における筋細胞の数を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、または少なくとも約２０％増加させる。一部の実施形態において、心臓の状態は、心筋梗塞である。一部の実施形態において、心臓の状態は、急性心筋梗塞である。一部の実施形態において、心臓の状態は、心不全である。一部の実施形態において、心臓の状態は、慢性虚血性心不全である。別の態様において、本開示は、本開示のベクターまたはベクター系、および必要に応じて心臓の状態の処置で使用するための説明書を含むキットを提供する。
別の態様において、本開示は、分化した非心筋細胞を心筋細胞に変換する方法であって、分化した細胞を、本開示のベクターまたはベクター系と接触させるステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、ヒトの分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏの分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの分化した非心筋細胞である。一部の実施形態において、分化した非心筋細胞は、心細胞である。
一部の実施形態において、本開示の方法は、心臓の駆出率を改善するかまたは回復させる。一部の実施形態において、改善は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％の改善を含む。一部の実施形態において、本方法は、対象の心臓の駆出率を、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％まで増加させるステップを含む。一部の実施形態において、駆出率の改善または回復は、最大で約２、約３、約４、約５、または約６週間以内に起こる。一部の実施形態において、駆出率の改善または回復は、２、３、４、５、または６週間以内に起こる。一部の実施形態において、本開示の方法は、心臓の駆出率を改善するかまたは回復させる。一部の実施形態において、改善は、約１０％、約２０％、約３０％、または約４０％の改善を含む。一部の実施形態において、本方法は、対象の心臓の駆出率を、約３０％、約４０％、約５０％、または約６０％まで増加させるステップを含む。一部の実施形態において、本開示の方法は、心臓の駆出率を改善するかまたは回復させる。一部の実施形態において、改善は、約５％から約１０％、約１０％から約２０％、約２０％から約３０％、または約３０％から約４０％の改善を含む。一部の実施形態において、本方法は、対象の心臓の駆出率を、約３０％、約４０％、約５０％、または約６０％まで増加させるステップを含む。一部の実施形態において、駆出率の改善または回復は、約２、約３、約４、約５、または約６週間以内に起こる。一部の実施形態において、駆出率の改善または回復は、２、３、４、５、または６週間以内に起こる。
Ｂ．誘導心筋細胞を使用する処置方法
一部の態様において、本開示の誘導心筋細胞は、それを必要とする対象を処置するために使用することができる。一部の実施形態において、誘導心筋細胞は、それを必要とする対象に投与することができ、その場合、誘導心筋細胞の対象への投与は、対象における心臓血管疾患を処置する。
多くの細胞型は、対象内の再生および分化のための適切な部位に移動することが可能である。様々な治療のための投与レジメンの適性および細胞組成物の投薬量を決定するために、細胞は、まず好適な動物モデルで試験することができる。１つのレベルで、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで生存し、その表現型を維持するその能力について評価される。細胞はまた、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞が罹患したもしくは傷害を受けた部位に移動するかどうかを確認するために、または投与される細胞の適切な数もしくは投薬量を決定するために評価することもできる。細胞組成物は、免疫不全動物（例えばヌードマウス、または化学的に、もしくは放射線照射によって免疫不全にされた動物）に投与することができる。組織は、再成長の期間後に回収し、投与された細胞またはその後代が、それでもなお存在するか、生存しているか、および／または望ましいもしくは望ましくない場所に移動したかどうかに関して評価することができる。
注射された細胞は、様々な方法によって追跡することができる。例えば、検出可能な標識（例えば緑色蛍光タンパク質、またはベータ－ガラクトシダーゼ）を含有するかまたは発現する細胞は、容易に検出することができる。細胞は、例えば、ＢｒｄＵもしくは［３Ｈ］－チミジンで、または緑色蛍光タンパク質、もしくはベータ－ガラクトシダーゼを発現できる発現カセットの導入によって、事前に標識されていてもよい。代替として、リプログラミングされた細胞は、それが、試験のために採用された動物によって発現されない細胞マーカー（例えば、実験動物に細胞を注射する場合、ヒト特異的な抗原）を発現することによって検出することができる。投与されたリプログラミングされた細胞の集団の存在および表現型は、蛍光顕微鏡法によって（例えば、緑色蛍光タンパク質、またはベータ－ガラクトシダーゼの場合）、免疫組織化学によって（例えば、ヒト抗原に対する抗体を使用して）、ＥＬＩＳＡによって（ヒト抗原に対する抗体を使用して）、または心臓表現型を示すＲＮＡに特異的になるように増幅を引き起こすプライマーおよびハイブリダイゼーション条件を使用するＲＴ－ＰＣＲ分析によって評価することができる。
Ｃ．リプログラミング因子および組成物を使用する処置方法
他の実施形態において、心臓血管疾患を処置する方法は、有効量のＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、またはそれらの組合せの発現を増加させることが可能なリプログラミング組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。他の実施形態において、心臓血管疾患を処置する方法は、有効量のＡＳＣＬ１、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５、またはそれらの組合せの発現を増加させることが可能なリプログラミング組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。
本発明は、心臓血管疾患を処置する方法であって、有効量の本明細書に記載される方法によって生産された誘導心筋細胞をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、方法を提供する。
一部の態様において、本開示の誘導心筋細胞は、それを必要とする対象を処置するために使用することができる。一部の実施形態において、誘導心筋細胞は、それを必要とする対象に投与することができ、その場合、誘導心筋細胞の対象への投与は、対象における心臓血管疾患を処置する。したがって、一部の実施形態において、心臓血管疾患を処置する方法は、誘導心筋細胞の集団をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。他の実施形態において、心臓血管疾患を処置する方法は、有効量の、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦ－β阻害剤またはその両方を含む組成物をそれを必要とする対象に投与するステップを含む。
一部の実施形態において、非心筋細胞は、ＴＧＦ－β阻害剤の存在下で、ＷＮＴ阻害剤の添加の前に、約６時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、または約４８時間培養される。好ましい一実施形態において、非心筋細胞は、ＴＧＦ－β阻害剤の存在下で、ＷＮＴ阻害剤の添加の前に、約２４時間培養される。
ＶＩＩＩ．キット
本明細書に記載される組成物、化合物および／または薬剤のいずれかを含む様々なキットが本明細書に記載される。キットは、例えば、培養培地を、濃縮された、または濃縮されていない形態で含んでいてもよい。キットは、一緒に混合された、または個々にパッケージングされたかのいずれかの本明細書に記載される化合物のいずれかを、乾燥した、または水和物の形態で含んでいてもよい。本明細書に記載される化合物および／または薬剤は、別々のバイアル、ボトルまたは他の容器に別々にパッケージングすることができる。代替として、本明細書に記載される化合物および／または薬剤のいずれかは、単一の組成物として一緒にパッケージングされてもよいし、または一緒に、もしくは別々に使用できる２つもしくはそれより多くの組成物としてパッケージングされてもよい。本明細書に記載される化合物および／または薬剤は、分化の境界を越えて選択された細胞を変換して、心臓前駆細胞および／または心筋細胞を形成することを容易にするのに適切な比率および／または量でパッケージングすることができる。
キットはまた、プロモーターおよび他の必要に応じた調節エレメントに作動可能に連結した目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む、発現カセット、発現ベクター、またはそれらの組合せを含んでいてもよい。発現カセットまたはベクターは、脱水した形態で、またはすぐ使用できる溶液で提供することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の培養のためのキットが本明細書に記載され、本キットは、本明細書に記載される組成物、化合物、発現カセット、発現ベクター、および／または薬剤のいずれか、加えてこれらの組成物、化合物、発現カセット、発現ベクター、および／または薬剤を使用するための説明書を含んでいてもよい。
一部のキットは、本明細書に記載される組成物、化合物および／または薬剤のいずれかを含む細胞培養または細胞培地を含んでいてもよい。キットは、１つまたは複数の滅菌細胞収集デバイス、例えばスワブ、皮膚スクラッピングデバイス、針、シリンジ、および／またはメスを含んでいてもよい。キットはまた、心臓前駆体および／または心筋細胞マーカーの検出ための抗体、例えば、以下のマーカーのいずれか：α－アクチニン、ＭＬＣ２ｖ、ｃＭＨＣ、ＮＫＸ２－５、ＧＡＴＡ４、ＩＳＬ１、ＭＥＦ２Ｃ、ｃＴＮＴ、ｃＴＮＩ、ＭＬＣ２ａ、およびそれらのあらゆる組合せに対する抗体を含んでいてもよい。抗体は、抗体が心臓前駆細胞および／または心筋細胞マーカーとの複合体を形成するとき検出可能なシグナルが観察できるように、標識することができる。
説明書は、選択された細胞（例えば、選択された初発の細胞または選択された細胞）に核酸を導入するための指針を含んでいてもよい。このような核酸は、目的のポリヌクレオチドまたはタンパク質をコードする、ＲＮＡ、発現カセット、または発現ベクターであってもよく、目的のポリヌクレオチドまたはタンパク質を発現するのに十分な時間と条件下で細胞を培養する。説明書はまた、本明細書で開示された組成物および方法のいずれかを使用して、分化の境界を越えて心臓の系統に細胞を変換するための説明書を含んでいてもよい。例えば、説明書は、細胞培養培地に添加するための本明細書に記載される組成物、化合物および／または薬剤の量、細胞を心臓系統に変換するのに十分な回数、最適な変換ための適切な細胞密度の維持などを記載していてもよい。例えば、説明書は、本明細書に記載される組成物、化合物および／または薬剤の再水和または希釈のための手順を記載していてもよい。キットが本明細書に記載される組成物、化合物および／または薬剤のうち一部を含有する細胞培養培地を提供する場合、説明書は、どのように他の化合物および／薬剤を添加するかを記載していてもよい。説明書はまた、どのように選択された細胞を心臓前駆細胞または心筋細胞に変換するかを記載していてもよい。
説明書はまた、変換および／または分化の程度を評価できるように、心臓前駆体および／または心筋細胞マーカーを、そのようなマーカーに対する抗体の使用によって検出するための手順を記載していてもよい。
対象の治療的処置のための、本明細書に記載される組成物、化合物および／または薬剤のいずれかを含む別のキットも本明細書に記載される。キットは、本明細書に記載される組成物、化合物および／または薬剤のいずれか、加えてこれらの組成物、化合物および／または薬剤を投与するための説明書を含んでいてもよい。このような説明書は、本出願にわたり記載された情報を提供することができる。
キットはまた、細胞を含んでいてもよい。例えば、キットは、本明細書に記載される組成物および／または方法によって処置された、すぐ投与できる状態の化学的に誘導された心臓前駆細胞および／または心筋細胞を含んでいてもよい。
組換えウイルス、非ウイルスベクター、細胞、組成物および／または化合物は、送達デバイスの形態で、キットのいずれかの中に提供することができる。代替として、送達デバイスは、キット中に別々に含まれていてもよく、説明書は、対象への投与の前にどのように送達デバイスを組み立てるかを記載していてもよい。送達デバイスは、細胞成長のための足場、および／または本明細書に記載される組成物、化合物もしくは薬剤のいずれかの制御放出のためのマトリックスを提供することができる。
キットのいずれかはまた、シリンジ、カテーテル、メス、試料または細胞収集のための滅菌容器、希釈剤、薬学的に許容される担体などを含んでいてもよい。
キットは、他の因子、例えば、本出願の前述のセクションまたは他の部分における組成物のための、本明細書に記載される補充因子または薬物のいずれかを提供することができる。
実施形態の列挙
本発明は、以下の実施形態の列挙を参照することにより定義することができる：
実施形態のセット１：
項１－１．ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む誘導心筋（ｉＣＭ）細胞。
項１－２．ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項１－１に記載のｉＣＭ細胞。
項１－３．ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドおよびＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、第１のポリシストロン性ベクターから発現され、ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドが、第２のポリシストロン性ベクターから発現される、項１－２に記載のｉＣＭ細胞。
項１－４．第１のポリシストロン性ベクターおよび第２のポリシストロン性ベクターが、それぞれ独立して、脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および非組み込み型ＬＶＶから選択される、項１－３に記載のｉＣＭ細胞。
項１－５．ｉＣＭ細胞の少なくとも２５％が、α－アクチニン陽性である、項１－２から４のいずれかに記載のｉＣＭ細胞。
項１－６．ｉＣＭ細胞の少なくとも２％が、ｃＴｎＴ陽性である、項１－２から５のいずれかに記載のｉＣＭ細胞。
項１－７．ＭＹＯＣＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、項１－１に記載のｉＣＭ細胞。
項１－８．ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドおよびＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ポリシストロン性ベクターから、共に翻訳されることによって発現される、項１－２に記載のｉＣＭ細胞。
項１－９．ポリシストロン性ベクターが、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含むベクターであり、ベクターが、脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および非組み込み型ＬＶＶから選択される、項１－８に記載のｉＣＭ細胞。
項１－１０．ｉＣＭ細胞の少なくとも２５％が、α－アクチニン陽性である、項１－７から９のいずれかに記載のｉＣＭ細胞。
項１－１１．ｉＣＭ細胞の少なくとも５％が、ｃＴｎＴ陽性である、項１－７から１０のいずれかに記載のｉＣＭ細胞。
項１－１２．初代成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）から生成される、項１－１に記載のｉＣＭ細胞。
項１－１３．分化した細胞において心筋細胞表現型を誘導する方法であって、分化した細胞を、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含むレトロウイルス発現ベクターと接触させるステップを含み、それによって誘導心筋（ｉＣＭ）細胞の集団を生成する、方法。
項１－１４．レトロウイルス発現ベクターが、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む、項１－１に記載の方法。
項１－１５．ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドおよびＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドから発現される、項１－１４に記載の方法。
項１－１６．源となる細胞を、ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドの一方または両方を含む第２のレトロウイルス発現ベクターと接触させるステップを含む、項１－１に記載の方法。
項１－１７．ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドが、ＭＥＦ２Ｃ－２Ａ－ＴＢＸ５ポリヌクレオチドまたはＴＢＸ５－２Ａ－ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチドから発現される、項１－１６に記載の方法。
項１－１８．ｉＣＭ細胞の少なくとも２５％が、α－アクチニン陽性である項１－１３から１７のいずれかに記載の方法。
項１－１９．ｉＣＭ細胞の少なくとも５％が、ｃＴｎＴ陽性である、項１－１３から１８のいずれかに記載の方法。
項１－２０．分化した細胞が、初代成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）を含む、項１－１３に記載の方法。
項１－２１．対象における心臓の状態を処置する方法であって、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、ならびに必要に応じてＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドの１つまたは複数をコードする、１つまたは複数の核酸を対象に投与するステップを含み、それによって、ｉｎ ｖｉｖｏで、対象において線維芽細胞の誘導心筋（ｉＣＭ）細胞への分化転換を誘導し、それによって対象を処置する、方法。
項１－２２．投与するステップが、対象の心臓への直接注射、静脈内注射、およびカテーテルによる対象への送達から選択される投与経路を含む、項１－２１に記載の方法。
項１－２３．１つまたは複数の核酸が、１つまたは複数のレトロウイルスベクター中に提供される、項１－２１に記載の方法。
項１－２４．１つまたは複数の核酸が、１つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に提供される、項１－２１に記載の方法。
項１－２５．対象における心臓の状態を処置する方法であって、細胞培養で、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、ならびに必要に応じてＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドの１つまたは複数をコードする、１つまたは複数の核酸を、分化した細胞に導入するステップであって、それによってｅｘ ｖｉｖｏで誘導心筋（ｉＣＭ）細胞を生成する、ステップ；およびｉＣＭ細胞を対象に投与し、それによって対象を処置するステップを含む、方法。
項１－２６．１つまたは複数の核酸が、１つまたは複数のレトロウイルスベクター中に提供される、項１－２５に記載の方法。
項１－２７．１つまたは複数の核酸が、１つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に提供される、項１－２５に記載の方法。
項１－２８．ｉＣＭ細胞が、生体適合性の足場上で投与される、項１－２５に記載の方法。
項１－２９．分化した細胞が、初代成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）を含む、項１－２５に記載の方法。
項１－３０．ＡＨＣＦが、対象から誘導された自己細胞である、項１－２９に記載の方法。
項１－３１．ＡＨＣＦが、対象以外のドナーから誘導された同種細胞である、項１－２９に記載の方法。
項１－３２．ＭＥＦ２Ｃ－２Ａ－ＴＢＸ５ポリヌクレオチド、ＴＢＸ５－２Ａ－ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドを含むベクターであって、ベクターが、脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および非組み込み型ＬＶＶから選択される、ベクター。
実施形態のセット２：
項２－１．任意の５’から３’の順番で、同一または異なるポリヌクレオチド鎖において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むベクターであって、各ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結している、ベクター。
項２－２．任意の５’から３’の順番で、同一または異なるポリヌクレオチド鎖において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む、項２－１に記載のベクター。
項２－３．任意の５’から３’の順番で、同一または異なるポリヌクレオチド鎖において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む、項２－１に記載のベクター。
項２－４．任意の５’から３’の順番で、同一または異なるポリヌクレオチド鎖において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド；ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方；ならびにＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドおよびＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む、項２－１に記載のベクター。
項２－５．任意の５’から３’の順番で、同一または異なるポリヌクレオチド鎖において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項２－４に記載のベクター。
項２－６．任意の５’から３’の順番で、同一または異なるポリヌクレオチド鎖において、ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項２－４に記載のベクター。
項２－７．ＭＹＯＣＤが、操作されたミオカルディンである、項２－１から７のいずれか一項に記載のベクター。
項２－８．ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、またはＴＢＸ５ポリヌクレオチド以外のリプログラミング因子ポリヌクレオチドを含まない、項２－１から７のいずれか一項に記載のベクター。
項２－９．他のタンパク質をコードする遺伝子を含まない、項２－１から７のいずれか一項に記載のベクター。
項２－１０．ポリシストロン性ベクターである、項２－１から９のいずれか一項に記載のベクター。
項２－１１．脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および非組み込み型ＬＶＶから選択される、項２－１から１０のいずれか一項に記載のベクター。
項２－１２．ＡＡＶベクターである、項２－１から１０のいずれか一項に記載のベクター。
項２－１３．組み込み型ＬＶＶまたは非組み込み型ＬＶＶである、項２－１から１０のいずれか一項に記載のベクター。
項２－１４．分化した細胞を誘導心筋（ｉＣＭ）細胞にリプログラミングすることが可能である、項２－１から１３のいずれか一項に記載のベクター。
項２－１５．ｉＣＭ細胞の少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％が、α－アクチニン陽性である、項２－１４に記載のベクター。
項２－１６．ｉＣＭ細胞の少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも８％が、ｃＴｎＴ陽性である、項２－１４または１５に記載のベクター。
項２－１７．存在する場合、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、または存在する場合、ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、および前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、同じプロモーターに作動可能に連結されており、共に翻訳されることによって発現される、項２－１から１６のいずれか一項に記載のベクター。
項２－１８．同じプロモーターに作動可能に連結した、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む、項２－２に記載のベクター。
項２－１９．同じプロモーターに作動可能に連結した、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む、項２－３に記載のベクター。
項２－２０．ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項２－１から１９のいずれか一項に記載のベクター。
項２－２１．ＭＹＦ６ポリヌクレオチドが、ヒトＭＹＦ６（配列番号５６）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項２－１から１９のいずれか一項に記載のベクター。
項２－２２．ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方をコードする第１のポリシストロン性ベクター；ならびにＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む第２のポリシストロン性ベクターを含むベクター系。
項２－２３．第１のポリシストロン性ベクターが、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む、項２－２２に記載のベクター系。
項２－２４．第１のポリシストロン性ベクターが、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む、項２－２２に記載のベクター系。
項２－２５．第１のポリシストロン性ベクターおよび第２のポリシストロン性ベクターが、それぞれ独立して、脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および非組み込み型ＬＶＶから選択される、項２－２２から２４のいずれか一項に記載のベクター系。
項２－２６．ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項２－２２から２５のいずれか一項に記載のベクター系。
項２－２７．ＭＹＦ６ポリヌクレオチドが、ヒトＭＹＦ６（配列番号５６）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項２－２２から２５のいずれか一項に記載のベクター系。
項２－２８．分化した細胞において心筋細胞表現型を誘導する方法であって、分化した細胞を、項２－１から２１のいずれか一項に記載のベクターと接触させるステップを含む、方法。
項２－２９．分化した細胞において心筋細胞表現型を誘導する方法であって、分化した細胞を、項２－２２から２７のいずれか一項に記載のベクター系と接触させるステップを含む、方法。
項２－３０．分化した細胞が、接触させるステップの間、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞である、項２－２８または２９に記載の方法。
項２－３１．分化した細胞が、心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象におけるｉｎ ｖｉｖｏの細胞である、項２－２８または２９に記載の方法。
項２－３２．心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、分化した細胞を、項２－１から２１のいずれか一項に記載のベクターと接触させて、ｉＣＭ細胞を生成するステップ、およびｉＣＭ細胞を対象に投与するステップを含む、方法。
項２－３３．心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、分化した細胞を、項２－２２から２７のいずれか一項に記載のベクター系と接触させて、ｉＣＭ細胞を生成するステップ、およびｉＣＭ細胞を対象に投与するステップを含む、方法。
項２－３４．心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、項２－１から２１のいずれか一項に記載のベクターを対象に投与するステップを含む、方法。
項２－３５．心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、項２－２２から２７のいずれか一項に記載のベクター系を対象に投与するステップを含む、方法。
項２－３６．項２－１から２１のいずれか一項に記載のベクター、および心臓の状態の処置で使用するための説明書を含むキット。
項２－３７．項２－２２から２７のいずれか一項に記載のベクター系、および心臓の状態の処置で使用するための説明書を含むキット。
実施形態のセット３：
項３－１．最大で８５０アミノ酸の長さを有する操作されたミオカルディンタンパク質をコードする操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、操作されたミオカルディンタンパク質が、ＳＲＦ相互作用ドメイン、ＳＡＰドメイン、およびＴＡＤドメインを含む、ポリヌクレオチド。
項３－２．操作されたミオカルディンタンパク質が、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインを含む、項３－１に記載のポリヌクレオチド。
項３－３．
項３－４．Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインが、配列番号１７に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、
項３－５．ＳＲＦドメインが、配列番号１８に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、
項３－６．ＳＡＰドメインが、配列番号１９に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、
項３－７．ＴＡＤドメインが、配列番号１１に対して、少なくとも８５％の同一性を有する、項３－２に記載のポリヌクレオチド。
項３－８．操作されたミオカルディンタンパク質が、ＬＺドメインを含む、項３－１または２に記載のポリヌクレオチド。
項３－９．ＬＺドメインが、配列番号２０に対して、少なくとも８５％の同一性を有する、項３－４に記載のポリヌクレオチド。
項３－１０．操作されたミオカルディンタンパク質が、
項３－１１．ヒトミオカルディン（配列番号１０）の残基５～４１３に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、および
項３－１２．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９８６に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチド
を含み、
項３－１３．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、項３－１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－１４．操作されたミオカルディンタンパク質が、
項３－１５．ヒトミオカルディン（配列番号１２）の残基５～４３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、および
項３－１６．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチド
を含み、
項３－１７．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、項３－１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－１８．操作されたミオカルディンタンパク質が、
項３－１９．ヒトミオカルディン（配列番号１３）の残基５～５５９に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、および
項３－２０．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチド
を含み、
項３－２１．第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、項３－１から５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－２２．リンカーが、ペプチド結合からなる、項３－６から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－２３．リンカーが、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＳＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＳＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３４）から選択されるポリペプチドである、項３－６から８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－２４．操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１４～１６から選択される配列を含む、項３－９に記載のポリヌクレオチド。
項３－２５．操作されたミオカルディンタンパク質をコードする操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、操作されたミオカルディンタンパク質が、天然のミオカルディン（配列番号３）のアミノ酸４１４～７６４に対応する領域に、少なくとも５０アミノ酸の欠失を含む、ポリヌクレオチド。
項３－２６．操作されたミオカルディンタンパク質が、天然のミオカルディン（配列番号３）の約４１４から約７６３アミノ酸の欠失を含む、項３－１２に記載のポリヌクレオチド。
項３－２７．操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１４と少なくとも８５％同一の配列を含む、項３－１３に記載のポリヌクレオチド。
項３－２８．操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１４と同一の配列からなる、項３－１４に記載のポリヌクレオチド。
項３－２９．操作されたミオカルディンタンパク質が、天然のミオカルディン（配列番号３）の約４３９から約７６３アミノ酸の欠失を含む、項３－１２に記載のポリヌクレオチド。
項３－３０．操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１５と少なくとも８５％同一の配列を含む、項３－１６に記載のポリヌクレオチド。
項３－３１．操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１５と同一の配列からなる、項３－１７に記載のポリヌクレオチド。
項３－３２．操作されたミオカルディンタンパク質が、天然のミオカルディン（配列番号３）の約５６０から約７６３アミノ酸の欠失を含む、項３－１２に記載のポリヌクレオチド。
項３－３３．操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１６と少なくとも８５％同一の配列を含む、項３－１９に記載のポリヌクレオチド。
項３－３４．操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１６と同一の配列からなる、項３－２０に記載のポリヌクレオチド。
項３－３５．操作されたミオカルディンタンパク質が、機能的な操作されたミオカルディンタンパク質である、項３－１から２１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－３６．機能的な操作されたミオカルディンタンパク質が、同じ発現系における天然のＭＹＯＣＤのレベルの少なくとも１０％で発現される、項３－２２に記載のポリヌクレオチド。
項３－３７．機能的な操作されたミオカルディンタンパク質が、（ａ）ヒト心臓線維芽細胞において、ＴＧＦβ阻害剤、必要に応じてＳＢ４３１５４２、およびＷｎｔ阻害剤、必要に応じてＸＡＶ９３９の存在下で、ＭＥＦ２ＣおよびＴＢＸ５もしくはＴＢＸ５と共に発現される場合、または（ｂ）ヒト心臓線維芽細胞において、ＡＳＣＬ１と共に発現される場合のいずれかで、少なくとも１つの心筋細胞表現型のマーカーの発現増加を誘導することが可能である、項３－２２または２３に記載のポリヌクレオチド。
項３－３８．プロモーターに作動可能に連結されている、項３－１から２４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－３９．ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項３－１から２５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－４０．ＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項３－１から２５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－４１．ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む、項３－１から２５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－４２．逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって挟まれているか、または長い末端反復（ＬＴＲ）によって挟まれている、項３－１から２８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
項３－４３．項３－１から４２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組換えウイルス。
項３－４４．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、項３－３０に記載の組換えウイルス。
項３－４５．レンチウイルスである、項３－３０に記載の組換えウイルス。
項３－４６．項３－１から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む細胞の集団。
項３－４７．ｉｎ ｖｉｔｒｏのＣａＴアッセイにおいて、カルシウムトランジェント（ＣａＴ）を呈する集団中の細胞のパーセンテージが、同じｉｎ ｖｉｔｒｏのＣａＴアッセイにおけるポリヌクレオチドを含まない細胞の対照集団における細胞のパーセンテージの少なくとも２倍である、項３－４６に記載の細胞の集団。
項３－４８．項３－１から４２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む誘導心筋細胞（ｉＣＭ）。
項３－４９．項３－１から４２のいずれかに記載のポリヌクレオチドおよび非ウイルス送達系を含む医薬組成物。
項３－５０．項３－４３から４５のいずれかに記載の組換えウイルスを含む医薬組成物。
項３－５１．誘導心筋細胞（ｉＣＭ）を生成する方法であって、哺乳動物線維芽細胞を、項３－１から４２のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項３－４３から４５のいずれかに記載の組換えウイルス、または項３－４９もしくは項３－３７に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、方法。
項３－５２．対象における心臓の状態を処置する方法であって、項３－５０に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
項３－５３．組換えウイルスが、心臓カテーテル法を介して投与される、項３－５２に記載の方法。
項３－５４．組換えウイルスが、心腔内注射を介して投与される、項３－５２に記載の方法。
項３－５５．発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）（図１３Ｂまたは図１３Ｃに描写した通り）であって、発現カセットが、５’から３’の順番で、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０イントロン、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、短鎖ポリアデニル化シグナル、および３’ＩＴＲを含み、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、５’から３’の順番で、ＭｙΔ３をコードするポリヌクレオチド、Ｐ２Ａリンカーをコードするポリヌクレオチド、およびＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチドを含む、ｒＡＡＶ。
項３－５６．発現カセットが、ＷＰＲＥを含む、項３－５５に記載のｒＡＡＶ。
項３－５７．ＭｙΔ３が、配列番号１６を含む、項３－５５または５６に記載のｒＡＡＶ。
項３－５８．２Ａリンカーが、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２３）を含む、項３－５５から５７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
項３－５９．ＡＳＣＬ１が、配列番号１を含む、項３－５５から５７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
項３－６０．配列番号３５（ＭｙΔ３Ａ ＡＡＶ）と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む、項３－５９に記載のｒＡＡＶ。
項３－６１．項３－５５から６０のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。
項３－６２．対象における心臓の状態を処置する方法であって、項３－６１に記載の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
以下の非限定的な実施例は、本発明の開発に含まれる実験的研究の一部を例示する。
（実施例１）
ヒト心臓リプログラミングのエンハンサーの同定
本発明者らは、ヒト心臓リプログラミングを誘導できる因子を、心臓マーカー発現を定量的に分析することによって同定するスクリーニングシステムを開発した。リプログラミング因子添加の３週間後、ハイスループット細胞アナライザーシステムを使用して、心臓マーカーであるα－アクチニンの発現に基づいて心臓リプログラミング効率をイメージングし、定量化した。本発明者らは、このスクリーニングシステムを使用して、ヒト転写因子（核内受容体を含む）、サイトカイン、およびエピジェネティックなレギュレーターをコードする１，０５２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ｃＤＮＡからなるレトロウイルス発現ライブラリーをスクリーニングした。（Zhou et al., 2017）。本発明者らは、ＭｙＭＴと共に個々のヒトＯＲＦをコードするレトロウイルスをＨＣＦに添加した。陽性ヒットを、ＭｙＭＴまたはＭｙＭＴ＋ＳＢ／ＸＡＶのいずれかと組み合わせてα－アクチニン陽性（α－アクチニン＋）細胞（図１Ａ）のパーセンテージを２倍またはそれより大きく増加させる遺伝子と定義した。一次スクリーニングにより、ヒト心臓リプログラミングのエンハンサーとしてＡＳＣＬ１、ＭＹＦ６、ＤＬＸ３、ＤＬＸ６、ＧＡＴＡ２およびＧＡＴＡ５が同定された（図１Ｂ）。これら６つの因子の活性をさらに、追加の心臓マーカー（ＭＹＨ６、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＣ１、ＮＰＰＡ、ＴＮＮＩ３およびＲＹＲ２）を検査した二次スクリーニングによって確認した。二次スクリーニングにより、ＡＳＣＬ１およびＭＹＦ６が、心臓リプログラミングの強化に関して最も強い２つのヒットとして同定された（図１Ｃ）。
（実施例２）
ＡＳＣＬ１およびＭＹＦ６はヒトおよびブタ心臓リプログラミングを強化する
ＡＳＣＬ１およびＭＹＦ６が心臓リプログラミングの強化に関して最も強い２つのヒットであったため（図１Ｃ）、本発明者らは、以下の研究で、本発明者らの注意力をＡＳＣＬ１およびＭＹＦ６に集めた。本発明者らは、初代成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）を使用して、様々なリプログラミング因子と組み合わせてＡＳＣＬ１またはＭＹＦ６を添加することのリプログラミング効率を評価した。免疫細胞化学は、ＭｙＭＴの上部へのＡＳＣＬ１またはＭＹＦ６の添加が、３週間のリプログラミング後に、約１５％のα－アクチニン＋、約５０％のｃＴｎＴ＋誘導心筋細胞（ｉＣＭ）を生成したことを示した（図２Ａ～２Ｂ）。このリプログラミング効率は、ＭｙＭＴ単独の効率と比べて非常に有意的である。初代成体ブタ心臓線維芽細胞（ＡＰＣＦ）にＭｙＭＴに加えてＡＳＣＬ１またはＭＹＦ６を使用することによっても、類似のリプログラミング効率が達成された（図２ＣおよびＤ）。
（実施例３）
リプログラミング因子の最適な化学量論がリプログラミング効率を強化する
リプログラミング因子の相対的な比率（または化学量論）は、心臓リプログラミングの効率および品質に影響を与えることが示されている。（Wang et al., 2015）。リプログラミング因子の最適な比率は、より高いリプログラミング効率およびより多くの成熟ｉＣＭと相関していた。リプログラミングためのＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１、ＭＥＦ２ＣおよびＴＢＸ５（ＭｙＡＭＴ）の最適な比率を決定するために、本発明者らは、４つのリプログラミング因子のうち１つを発現する様々な量のレトロウイルスを混合し、残りの３つのリプログラミング因子の比率を固定することによって、Ｍｙ、Ａ、ＭおよびＴタンパク質発現の相対レベルを操作した（図３Ａ～３Ｅ）。本発明者らは、そのようなレトロウイルスカクテルでＡＨＣＦを形質導入し、３週間にわたり細胞をリプログラミングした。リプログラミング効率を示すために、心臓マーカーであるα－アクチニンおよびｃＴｎＴを使用した。α－アクチニンおよびｃＴｎＴに対する抗体でのリプログラミングされたＡＨＣＦの免疫細胞化学の分析は、心臓リプログラミング効率が、ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１の発現レベルに対して最も感受性であったことを示した。データから、ＭＹＯＣＤまたはＡＳＣＬ１の発現が高いほど、リプログラミング効率のより高いレベルがもたらされたことが示された。ＭＹＯＣＤまたはＡＳＣＬ１が存在しなかった場合、リプログラミング効率はほぼゼロに落ちた（図３Ａ、３Ｂ、３Ｅ）。ＭＥＦ２Ｃの投与は、ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１と類似したリプログラミング効率のパターンを示した。しかしながら、ＭＥＦ２Ｃが添加されなくても、有意な量のα－アクチニン＋およびｃＴｎＴ＋ｉＣＭがそれでもなお検出され得ることから、心臓リプログラミングはＭＥＦ２Ｃの発現レベルにそれほど感受性ではないことが示される（図３Ｃ、３Ｅ）。ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１およびＭＥＦ２Ｃとは異なり、ＴＢＸ５の投与は、ＴＢＸ５発現のより低いレベルでリプログラミング効率が最大化された別個のリプログラミング効率のパターンを示した（図３ＤおよびＥ）。まとめると、本発明者らの結果は、最適なＭｙ、Ａ、ＭおよびＴの化学量論が、ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１の高いタンパク質レベル、ＭＥＦ２Ｃの中程度のレベル、ならびにＴＢＸ５の低いレベルによって定義され、心臓リプログラミング効率を有意に増加させることを実証した。
（実施例４）
ツーインワンのポリシストロン性ベクター中のリプログラミング因子による心臓リプログラミング
多くの様々な遺伝子を発現させるために別個のベクターを使用する遺伝子治療は、臨床開発にとって実用的ではない。ＡＡＶは、これまでに多くの臨床治験で使用されてきた最も一般的な遺伝子治療用ベクターである［Dunbar, 2018］。しかしながら、ＡＡＶのパ
ッケージング能力は約４．７ｋｂしかなく、したがって、最も少数のＡＡＶベクターに複数のリプログラミング因子を適合させることが、ＡＡＶを使用する心臓リプログラミングにとって大きな問題である。本発明者らは、ＭｙＡＭＴリプログラミングカクテルを２つのＡＡＶベクターに入れるために、２Ａペプチドのポリシストロン系を利用した。プロモーターおよび他の調節エレメントに必要なＡＡＶおよびスペースのサイズが限定されるため、ＭＹＯＣＤ（３．０ｋｂ）は、１つのＡＡＶベクターに適合させるためにはＡＳＣＬ１（０．７ｋｂ）とだけ対にできるが、それに対して、ＭＥＦ２Ｃ（１．４ｋｂ）およびＴＢＸ５（１．５ｋｂ）は、ＭＹＯＣＤと対にするには大きすぎるが、一緒に別のＡＡＶベクターに適合させることができる。２Ａポリシストロン性ポリヌクレオチド中の因子の順番が遺伝子の発現レベルを決定したことが実証された（Wang et al., 2015）。本発明者らは、最適なＭｙ、Ａ、ＭおよびＴの化学量論が心臓リプログラミング効率を有意に増加させたことを実証した（図３Ａ～３Ｅ）。２Ａポリシストロン性ベクターにおいて最適な化学量論を達成するために、本発明者らは、単一のオープンリーディングフレーム中に同じ２Ａ配列を有するＭｙ＋ＡおよびＭ＋Ｔの全ての可能性のある組合せ（Ｍｙ－Ｐ２Ａ－Ａ、Ａ－Ｐ２Ａ－Ｍｙ、Ｍ－Ｐ２Ａ－ＴおよびＴ－Ｐ２Ａ－Ｍ）を生成した。本発明者らは、Ｍｙ－Ｐ２Ａ－Ａ＋Ｍ－Ｐ２Ａ－Ｔ、Ｍｙ－Ｐ２Ａ－Ａ＋Ｔ－Ｐ２Ａ－Ｍ、Ａ－Ｐ２Ａ－Ｍｙ＋Ｍ－Ｐ２Ａ－ＴおよびＡ－Ｐ２Ａ－Ｍｙ＋Ｔ－Ｐ２Ａ－Ｍを含むポリシストロン性ベクターの４つ全ての可能性のある組合せからなるレトロウイルスの組合せでＡＨＣＦを形質導入した。本発明者らは、３週間のリプログラミング後に、免疫細胞化学によって心臓マーカーであるα－アクチニンおよびｃＴｎＴの発現を分析した。本発明者らは、Ｍｙ－Ｐ２Ａ－Ａ＋Ｍ－Ｐ２Ａ－Ｔが最適な組合せであり、約３５％のα－アクチニン＋ｉＣＭおよび約４％のｃＴｎＴ＋ｉＣＭを生成したことを見出した（図４Ａ～４Ｂ）。また２１種の心臓マーカーのパネルのＱ－ＰＣＲ分析からも、Ｍｙ－Ｐ２Ａ－Ａ＋Ｍ－Ｐ２Ａ－Ｔが、ほとんどの心臓の遺伝子の最高レベルの発現を誘導するその能力に基づいて最適なポリシストロン性ベクターの組合せであることが実証された（図４Ｃ）。
（実施例５）
単一のポリシストロン性ベクターによる心臓リプログラミング
本発明者らは、全てのリプログラミング因子を単一のポリシストロン性転写単位に入れることによってリプログラミングベクターをさらに簡単にすることを試みた。本発明者らの化学量論実験（図３Ａ～３Ｅ）から、ＭｙＡＭＴカクテルにおいてＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１が最も重要なリプログラミング因子であること、ならびにリプログラミング効率はより低いものの、ＭＥＦ２ＣまたはＴＢＸ５を添加しなくてもｉＣＭが生成されたことが示されたため、本発明者らは、ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１（ＭｙＡ）だけでＡＨＣＦをｉＣＭにリプログラミングできるという仮説を立てた。この仮説を試験するために、本発明者らは、ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１レトロウイルスをＡＨＣＦに形質導入した。興味深いことに、３週間リプログラミング後に、ＭｙＡカクテルによって、約１０％のα－アクチニン＋ｉＣＭおよび約３０％のｃＴｎＴ＋ｉＣＭが生成された（図５Ａ～５Ｂ）。さらに、本発明者らは、異なる順番でＭｙおよびＡをコードするポリシストロン性ベクター（Ｍｙ－Ｐ２Ａ－ＡおよびＡ－Ｐ２Ａ－Ｍｙ）を試験したところ、Ｍｙ－Ｐ２Ａ－Ａが、Ａ－Ｐ２Ａ－Ｍｙより一層優れたリプログラミング効率を示した（図５Ｃ～５Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＭｙＡの組合せは、高い効率でヒト心臓線維芽細胞をｉＣＭにリプログラミングできることを示唆する。
（実施例６）
４つの遺伝子を発現するポリシストロン性ベクターによる心臓リプログラミング
本発明者らのデータは、２つの因子を有するポリシストロン性ベクター中のリプログラミング因子の順番が、心臓リプログラミング効率に有意に影響を与える可能性があることを示す（図３Ａ～３Ｅ、図４Ａ～４Ｃ）。ＭｙＡＭＴは、ＭｙＡより優れたリプログラミング能力を示したことから（図４Ａ～４Ｃ、図５Ａ～５Ｄ）、本発明者らは、単一のポリシストロン性ポリヌクレオチド中の４つの因子、ＭｙＡＭＴの最適な順番をさらに決定することを試みた。本発明者らは、単一のポリヌクレオチド中の異なる翻訳スキッピング配列（Ｐ２Ａ、Ｔ２ＡおよびＥ２Ａ）を有するＭｙ、Ａ、Ｍ、Ｔの全ての可能性のある２４個の組合せを生成した。本発明者らは、ＧＦＰまたはＭｙ、Ａ、Ｍ、Ｔポリシストロン性レトロウイルスの２４個の組合せのうち１つのいずれかでＡＨＣＦを形質導入し、３週間のリプログラミング後に、心臓マーカーであるα－アクチニンおよびｃＴｎＴの発現を免疫細胞化学によって分析した。本発明者らは、２４個のポリシストロン性ベクターのうち３つ、Ａ－Ｐ２Ａ－Ｔ－Ｔ２Ａ－Ｍｙ－Ｅ２Ａ－Ｍ、Ｔ－Ｐ２Ａ－Ａ－Ｔ２Ａ－Ｍｙ－Ｅ２Ａ－ＭおよびＭ－Ｐ２Ａ－Ａ－Ｔ２Ａ－Ｍｙ－Ｅ２Ａ－Ｔが、約１５％のα－アクチニン＋ｉＣＭおよび約１５％のｃＴｎＴ＋ｉＣＭを生成した最良の組合せであることを見出した（図６Ａ～６Ｂ）。最適化されていないポリシストロン性ベクター、例えばＭｙ－Ｐ２Ａ－Ｍ－Ｔ２Ａ－Ｔ－Ｅ２Ａ－Ａはほとんど、線維芽細胞をｉＣＭにリプログラミングしなかったことから（図６Ａ～６Ｂ）、心臓リプログラミングのためのリプログラミング因子の化学量論の重要性が強調される。１つの特定の位置における１つの特定のリプログラミング因子毎の平均リプログラミング効率を反映する因子の位置のスコアマトリックスを使用することによって、本発明者らは、ＭＹＯＣＤが３位にあることが好ましく、ＡＳＣＬ１が２位にあることが好ましく、ＭＥＦ２ＣとＴＢＸ５の両方が１位または４位にあることが好ましいことを見出した。
（実施例７）
リプログラミングカクテルのｉｎ ｖｉｖｏの送達が心臓の修復を促進する
本発明者らは、非心筋細胞中の上記で本発明者らが最適化したリプログラミングカクテルの強制的な発現が傷害を受けた心臓の機能に測定可能な改善をもたらすことができるかどうかを検査した（図７Ａ）。マウスを、左前下行枝動脈（ＬＡＤ）結紮、それに続いて、それぞれ単一の因子をコードするＧＦＰ、ＡＳＣＬ１、ＭｙＭＴ、ＭｙＭＴＡまたはＭｙＡレトロウイルスの心筋内注射に供した。ＭＩ後の心機能を、心エコー検査を使用して、盲検様式で、駆出率（ＥＦ）、収縮終期容量（ＥＳＶ）および拡張終期容量（ＥＤＶ）によって評価した。ＭＩ外科処置の前に、心エコー検査でＥＦ、ＥＳＶおよびＥＤＶを評価したところ、マウスの各コホートの心機能は同等であった。ＭＩ外科処置の後に、ＧＦＰを注射したマウスの心機能は低下し、ＭＩの２週間後に安定な値に達した。対照的に、傷害を受けた心臓のＭｙＭＴ、ＭｙＡＭＴまたはＭｙＡレトロウイルスでの感染は、ＭＩの２週間後、心機能の悪化が鈍化した。（図７Ｂ～Ｄ）。ＭｙＭＴを用いた場合、ＭＩの５週間後、心臓の機能的な改善は遅く、それほど完全ではなかった（図７Ｂ～７Ｄ）。これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるこの転写因子の組合せのリプログラミングにおける効率の低減と一致する（図２Ａ～２Ｄ）。ＡＳＣＬ１を発現するベクター単独での傷害を受けた心臓の注射は、ＧＦＰと比較して、心機能に対してまったく作用を有さなかった（図７Ｂ～７Ｄ）。これらのデータは、ＭｙＭＴ、ＭｙＭＴＡおよびＭｙＡリプログラミングカクテルが、心臓の修復を促進すること、およびＡＳＣＬ１をミオカルディンと組み合わせて添加することは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける心臓の機能的な改善に関して利益を提供することを示唆する。
材料および方法
初代成体ヒトおよびブタ心臓線維芽細胞の単離。成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）または成体ブタ心臓線維芽細胞（ＡＰＣＦ）の単離のために、成体ヒトまたはブタ左心室を細かく切り刻み、心臓線維芽細胞消化培地（１０μｇ／ｍｌのリベラーゼＴＨ、１０μｇ／ｍｌのリベラーゼＴＭ、１ユニット／ｍｌのＤＮアーゼＩ、０．０１％のＰｏｌａｘｏｍｅｒ）中で３７℃で１時間消化した。消化の後、細胞を７０μＭのストレーナーに通過させて５０ｍＬファルコンチューブにろ過した。細胞を１２００×ｇで５分間スピンダウンすることによってペレット化し、線維芽細胞増殖培地中に置いた。２日毎に培地を交換した。４日後、ＡＨＣＦまたはＡＰＣＦを凍結するか、またはウイルス形質導入のために再びプレーティングした。
レトロウイルスの生産。レトロウイルスの生産のために、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からのＰＬＡＴＩＮＵＭ－Ａ（商標）（ＰＬＡＴ－Ａ（商標））細胞を、１０％ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中でのトランスフェクションの１日前に培養皿（細胞５×１０４個／ｃｍ２）にシーディングした。トランスフェクションの日に、細胞は約６０％の密集度に達した。ＤＮＡプラスミド（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．からのｐＭＸｓ－ＯＲＦベクターをベースとする）を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬を使用して、Ｐｌａｔｉｎｕｍ－Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ウイルス培地を０．４５μｍのフィルターに通過させてろ過し、ポリブレンを８μｇ／ｍｌの濃度で添加した。
細胞リプログラミング。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける心臓リプログラミングのために、ＡＨＣＦまたはＡＰＣＦを、線維芽細胞増殖培地中５×１０３／ｃｍ２の密度で、培養皿またはプレートにシーディングした（－１日目）。細胞のプレーティングの１日後（０日目）、線維芽細胞増殖培地を除去し、ウイルス培地を添加した。ウイルス形質導入の１日後（１日目）、ウイルス培地を、４部のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１部のＧＩＢＣＯ（登録商標）培地１９９、１０％のＦＢＳ、１％の非必須アミノ酸、１％のペニシリン／ストレプトマイシンで構成されるｉＣＭ培地で、４日目まで２日毎に交換した。４日目に、培地を７５％のｉＣＭ培地および２５％のＲＰＭＩ＋Ｂ２７に変更した。７日目に、培地を５０％のｉＣＭおよび５０％のＲＰＭＩ＋Ｂ２７に変更した。１１日目に、培地を２５％のｉＣＭおよび７５％のＲＰＭＩ＋Ｂ２７に変更した。１４日目に、培地をＲＰＭＩ＋Ｂ２７＋ＦＦＶ（１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ、１５ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ－１０、および５ｎｇ／ｍｌのｒｈＶＥＧＦ）に、２１日目まで毎日変更した。
免疫細胞化学。免疫細胞化学のために、細胞を４％のパラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で、室温で３０分間透過化した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、続いて１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックした。次いで細胞を、マウスモノクローナル抗心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ５－１２９６０）と共に、１％のＢＳＡ中、１：２００の希釈率で、またはマウス抗α－アクチニン抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ７８１１）と共に、１：２００の希釈率で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、次いで細胞を、ロバ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２１２０３）と共に、１％のＢＳＡ中、１：２００の希釈率で１時間インキュベートした。次いで、細胞イメージングマルチモードリーダー、ＣＹＴＡＴＩＯＮ（商標）５（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、細胞をイメージングし、定量化した。
定量的ｍＲＮＡ測定。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を販売元のプロトコールに従って使用して抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ ＳＵＰＥＲＭＩＸ（商標）（ＢＩＯ－ＲＡＤ（登録商標））を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡにレトロ転写した。ｑＰＣＲを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）遺伝子発現マスターミックス（ＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（登録商標））を使用して実行し、ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡとの比較によって正規化した。
定量化および統計的分析。全てのデータは、標準誤差（ＳＥＭ）と共に平均として提示され、ｎ＝２～３／群を有する。Ｐ値を、対応のない／二元配置ｔ検定または一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）のいずれかで計算した。統計分析を、ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７ソフトウェアパッケージ（ＧＲＡＰＨＰＡＤ ＳＯＦＴＷＡＲＥ（商標））を使用して実行した。複数のペアワイズ比較のために補正した後の全てのケースにおいて、＜０．０５のＰ値を有意とみなした。
ＭＩ外科処置、レトロウイルスの心筋内注射および心エコー検査。９～１０週齢のＣＨＡＲＬＥＳ ＲＩＶＥＲ（登録商標）ＣＤ－１ ＩＧＳ雄マウスに外科処置を実行した。マウスを２．４％のイソフルラン／９７．６％の酸素で麻酔し、加熱パッド（３７℃）上で仰臥位にした。動物に２０ゲージの静脈内カテーテルを挿管し、マウス用人工呼吸器（ＭＩＮＩＶＥＮＴ（商標）、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｉｎｃ．）で換気した。ＭＩを、７－０プロレン縫合糸を用いた左前下行枝動脈（ＬＡＤ）の永続的な結紮により誘導した。２０μｌのＰＢＳ中の濃縮した１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）のレトロウイルス（濃度＝５×１０１１ＧＣ／ｍｌ）（ＧＦＰ、ＡＳＣＬ１、ＭｙＭＴ、ＭｙＡＭＴ、またはＭｙＡ）を、２９ゲージの針（ＢＤ）が組み込まれたインスリンシリンジを介して心筋に注射した。冠動脈閉塞の後に青白くなった梗塞領域をベースとして梗塞ゾーン（ＩＺ）から境界ゾーン（ＢＺ）の間の境界に沿って、全投薬量を用いた注射を行った。注射の後、胸部を縫合糸で閉じ、マウス用人工呼吸器および加熱パッドを用いてマウスを回復させた。全ての外科処置を無菌条件下で実行した。意識のあるマウスへの、ＶＩＳＵＡＬＳＯＮＩＣＳ（商標）ＶＥＶＯ（登録商標）３１００イメージングシステムを使用した２次元経胸壁心エコー検査によって、心機能を評価した。駆出率（ＥＦ）、収縮終期容量（ＥＳＶ）および拡張終期容量（ＥＤＶ）を、心臓の収縮機能の指標として使用した。
（実施例８）
ＭｙＡを発現するレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスの比較
本発明者らは、ＭＹＯＣＤおよび第２のタンパク質をコードするレンチウイルスまたはＡＡＶベクターからのＭＹＯＣＤ発現を比較した。ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１を有するポリシストロン性ベクターを、図８Ａに描写された発現カセットを使用して、非組み込み型レンチウイルス（ＮＩＬ）の様式で生成した。形質導入される細胞のゲノムへの遺伝子構築物の組み込みを防ぐために、プラスミドベースのパッケージング系に含まれるインテグラーゼが突然変異を含んでいたため、レンチウイルスは非組み込み型である。一部の実施形態において、図８Ａに描写された同じ発現構築物が、組み込み型レンチウイルスを作製するのに使用される。このレンチウイルス構築物において、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１は、５’および３’長い末端反復（ＬＴＲ）によって挟まれたＷＰＲＥを有するＣＡＧプロモーターの制御下で、ＳＶ４０イントロン（「ＳＶ４０Ｉｎｔ」）の後に設置された。この構築物において、３’ＬＴＲは、ポリアデニル化シグナルとして作動する。
発現カセットが５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって挟まれたＡＡＶベクターに同じＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを入れることによって、類似のＡＡＶ構築物（図８Ｂ）を生成した。ＡＡＶベクターのパッケージングの限界のためにＷＰＲＥを除去し、選択されたポリアデニル化配列は短鎖ポリＡシグナル（「Ａ」）（配列番号７５）であった。ＭＹＯＣＤのみを有する（さらにＡＳＣＬ１ではない）対照モノシストロン性構築物も作製した（示されていない）。対照ＡＡＶはＷＰＲＥを含み、ポリシストロン性ＡＡＶの短鎖ポリＡの代わりにｂＧＨポリＡ（配列番号８５）を使用した。
細胞をＮＩＬ（図８Ｃ）またはＡＡＶベクター（図８Ｄ）でトランスフェクトし、ＭＹＯＣＤ、ＡＳＣＬ１に対する抗体、またはローディング対照ＧＡＰＤＨを使用する免疫ブロッティングによって分析した。モノシストロン性（Ｍｙ）およびポリシストロン性（ＭｙＡ）ＮＩＬベクターは、ＭＹＯＣＤを同じレベルで発現した（図８Ｃ）。モノシストロン性（Ｍ）およびポリシストロン性（ＭｙＡ）ＡＡＶで形質導入された細胞によってＭＹＯＣＤタンパク質を発現させたが、ポリシストロン性ＭｙＡ ＡＡＶベクターによるＭＹＯＣＤタンパク質の発現は、ポリシストロン性レンチウイルスＭｙＡ ＮＩＬ（図８Ｃ）による、モノシストロン性レンチウイルスＭｙ ＮＩＬ（図８Ｃ）による、またはモノシストロン性アデノ随伴ウイルスＭｙ ＡＡＶ（図８Ｄ）によるＭＹＯＣＤタンパク質の発現より低かった。切断されなかったＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１が原因の高分子量のバンドが観察された（図８Ｄにおける黒色の矢印）。
ＡＡＶ ＭｙＡまたはＮＩＬ ＭｙＡの、形質導入された細胞において心筋細胞表現型を誘導する能力を、ＢＩＯＴＥＫ ＣＹＴＡＴＩＯＮ（商標）５イメージングリーダーでの、示された一次抗体およびＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）５９４二次抗体を使用したα－アクチニンの定量的免疫蛍光顕微鏡的検出（図８Ｅ）によって評価し、ｍＲＮＡを、ＴＮＮＣ１、ＴＮＮＴ２、ＰＬＮ、ＮＰＰＡ、またはＭＹＨ６の遺伝子特異的プライマーを使用した定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって定量化した（表４）。
Figure 2024001344000015
対照試料は感染させなかった（情報なし）。細胞３０，０００個（１ウェル）当たり１．５×１０９、５×１０９、または２．５×１０１０ゲノムコピー（ＧＣ）を用いて、形質導入を実行した。図８Ｅは、ＮＩＬ ＭｙＡ（２．５×１０１０ＧＣ、試験されなかった）が、ＡＡＶ ＭｙＡより大きい割合の細胞（１．５×１０９ＧＣ、試験されなかった）でα－アクチニン発現を誘導したことを示す。表４は、ＮＩＬ ＭｙＡが、心筋細胞表現型に関連するマーカーの、ＡＡＶ ＭｙＡより多くの発現を誘導したことを示す。
（実施例９）
内部の欠失を有する操作されたミオカルディンタンパク質の設計および試験
図９Ａは、野生型ヒトＭＹＯＣＤのドメインの概略図を示す。Ｎ末端ＲＰＥＬドメイン（ＲＰｘｘｘＥＬ）は、ＭＥＦ２Ｃ結合を媒介する。塩基性（＋＋）およびポリグルタミン（Ｑ）モチーフは、ＳＲＦ相互作用にとって重要であり、それに対してＧＡＴＡ４は、ＳＡＰ（ＳＡＦ－Ａ／Ｂ、ＡｃｉｎｕｓおよびＰＩＡＳ）ドメインを含む標識されたドメイン「Ｇａｔａ４相互作用Ｉ」を介してＭＹＯＣＤと相互作用し、さらにロイシンジッパー（ＬＺ）を含有する第２の標識された相互作用ドメイン「Ｇａｔａ４相互作用ＩＩ」とも相互作用する。Ｃ末端は、転写促進ドメイン（ＴＡＤ）を含有する。ヒト心臓組織で発現される天然のタンパク質のアイソフォームは、９８６アミノ酸の長さである。
ＭｙＡ ＡＡＶの効力を増加させるために、内部の欠失を有する３つのミオカルディンバリアントを設計し、ＡＡＶで試験した。ＭｙΔ１は、残基４１４～７６３の欠失を有し（図９Ｂ）、これは、第２のＧＡＴＡ４相互作用ドメイン全体のほとんどを欠失している。ＭｙΔ２は、残基４３９～７６３の欠失を有し（図９Ｃ）、これもまた、第２のＧＡＴＡ４相互作用ドメイン全体のほとんどを欠失している。ＭｙΔ３は、残基５６０～７６３の欠失を有し（図９Ｄ）、これもまた、第２のＧＡＴＡ４相互作用ドメイン全体のほとんどを欠失しているが、ＬＺドメインを保持する。
図１０Ａは、コード配列の多様な部分を一緒に融合させているにもかかわらず、３つの内部の欠失を有する突然変異体が安定なミオカルディンタンパク質を生成することを免疫ブロットによって示す。一時的に４８時間トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から溶解産物を作製した。図１０Ｂは、天然および操作されたミオカルディンタンパク質の免疫蛍光顕微鏡法を示す。ＭｙΔ１、ＭｙΔ２、およびＭｙΔ３はそれぞれ、天然のミオカルディンタンパク質と同様に細胞の核に適切に局在されている。
天然のミオカルディン（ＭＹＯＣＤ）または３つの内部の欠失を有する操作されたミオカルディンタンパク質（ＭｙΔ１、ＭｙΔ２、またはＭｙΔ３）のうち１つをコードするレトロウイルスベクターを生成した。ヒト心臓線維芽細胞（ＨＣＦ）細胞系の重感染を使用して、ＭＹＯＣＤ、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（ＭｙＭＴ）；ＭｙΔ１、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（ＭｙΔ１ＭＴ）；ＭｙΔ２、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（ＭｙΔ２ＭＴ）；またはＭｙΔ３、ＭＥＦ２Ｃ、およびＴＢＸ５（ＭｙΔ３ＭＴ）の発現を誘導した。マウスおよびヒト細胞（ＭｙＭＴ＋ＳＢ／ＸＡＶ）において心臓リプログラミングを強化することが示されている２つの小分子、ＴＧＦ－ベータ阻害剤ＳＢ４３１５４２およびＷｎｔ阻害剤ＸＡＶ９３９の存在下で、重感染を実行した（Mohamed et al., Circulation. 135:978-95 (2017)；国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２５１３２号）
。
カルシウムトランジェントを、これまでに記載されたようにして評価した。Qian, L.,
et al. (2012) Nature 485:593-598。簡単に言えば、単離された筋細胞に、Ｆｌｕｏ－４を室温で３０分間ローディングし、その後、超融合（ｓｕｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）チャンバーに移した。ローディング溶液は、無水ＤＭＳＯ中の５ｍＭのＦｌｕｏ－４ ＡＭおよびＰｏｗｅｒｌｏａｄ（商標）濃縮物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：１０の混合物を含有しており、これを懸濁した筋細胞を含有する細胞外のタイロード溶液に１００倍希釈した。目的の細胞の両側に設置され、フィールド刺激装置（ｆｉｅｌｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）（ＩｏｎＯｐｔｉｘ、Ｍｙｏｐａｃｅｒ）に接続された白金線の間で１Ｈｚの電圧パルスを印加することによって、カルシウムトランジェントを誘発した。標準的なフィルターセット（＃４９０１１ＥＴ、Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を介してＦｌｕｏ－４蛍光トランジェントを記録した。各複製につき、８つの細胞のフィールドを２０秒間イメージングした。
図１１は、ＭＥＦ２Ｃ、ＴＢＸ５および天然の、または操作されたミオカルディンで形質導入されたヒト心臓線維芽細胞は全て、１週間または３週間のリプログラミング後にロバストなカルシウムトランジェントを呈することを示す。本発明者らは、ＭｙＭＴ＋ＳＢ／ＸＡＶは、天然のＭＹＯＣＤがＭｙΔ１、ＭｙΔ２、またはＭｙΔ３で置き換えられていたとしても、誘導心筋細胞（ｉＣＭ）を生成したという結論に至った。
類似の実験を、ＳＢ４３１５４２およびＷｎｔ阻害剤ＸＡＶ９３９の存在下で、ただしＭＥＦ２Ｃなしで、天然の、または操作されたミオカルディンおよびＴＢＸ５を用いて実行した。重感染を使用して、小分子（＋ＳＢ／ＸＡＶ）の存在下で、ＭＹＯＣＤおよびＴＢＸ５（ＭｙＴ）、ＭｙΔ１およびＴＢＸ５（ＭｙΔ１Ｔ）、ＭｙΔ２およびＴＢＸ５（ＭｙΔ２Ｔ）、またはＭｙΔ３およびＴＢＸ５（ＭｙΔ３Ｔ）の発現を誘導した。実施例７に記載される通りにｑＰＣＲによって発現プロファイルを測定した。図１２Ａは、ＴＢＸ５およびＭｙΔ３をコードするポリヌクレオチドで形質導入されたヒト心臓線維芽細胞が、ＴＢＸ５および天然のＭＹＯＣＤで形質導入されたものに匹敵する転写プロファイルを呈したことを実証する。図１２Ｂは、同じ実験からの小分子の存在下におけるＭｙＴまたはＭｙΔ３Ｔで形質導入された細胞の免疫蛍光顕微鏡法を示す。ＴＢＸ５および天然のＭＹＯＣＤ、ＴＢＸ５およびＭｙΔ２、またはＴＢＸ５およびＭｙΔ３で形質導入された心臓線維芽細胞は、同等のα－アクチニン構造を呈する。
（実施例１０）
ＡＡＶベースのＭｙΔ３Ａでのヒト心臓線維芽細胞のリプログラミング
図８Ｂに示されるＡＡＶベクターは、図１３Ａ（ＭｙＡΔＷＰＲＥ短鎖Ａ）として再現されており、これを、残基５６０～７６３の内部の欠失を有する操作されたミオカルディンをコードするポリヌクレオチド（ＭｙΔ３ＡΔＷＰＲＥ短鎖Ａ；図１３Ｂ）での天然のＭＹＯＣＤの置換、またはＷＰＲＥ（ＭｙΔ３ＡＷＰＲＥ短鎖Ａ；図１３Ｃ）でのその置換および付加によって改変した。天然のＭＹＯＣＤ、ＷＰＲＥ、およびｂＧＨポリＡシグナル（Ｍｙ；示されていない）を有する；または天然のＭＹＯＣＤおよび短鎖ポリＡを有するが、ＷＰＲＥを有さない（ＭｙΔＷＰＲＥ短鎖Ａ；示されていない）を有する対照ベクターも生成した。
ＭＹＯＣＤまたはＡＳＣＬ１特異的抗体での免疫ブロッティングに基づいて、ＡＡＶカセット中のＭｙΔ３での野生型ＭＹＯＣＤの置き換えは、ミオカルディン（図１４Ａ）およびＡＳＣＬ１（図１４Ｂ）タンパク質発現をブーストした。ＷＰＲＥが欠如したＡＡＶベクターは、ＷＰＲＥを有する対照ベクター（ＭｙΔＷＰＲＥ短鎖Ａと比較して、Ｍｙ）より低いレベルであるものの、ミオカルディンタンパク質を発現した。内部の欠失を有する操作されたミオカルディン（ＭｙΔ３ＡΔＷＰＲＥ短鎖Ａ）は、ＷＰＲＥが欠如したベクター中で、天然のＭＹＯＣＤと比較してより高いレベルで発現される。小型のＷＰＲＥ（ＷＰＲＥ３）のＭｙΔ３Ａ ＡＡＶ構築物への付加（ＭｙΔ３ＡＷＰＲＥ３短鎖Ａ）は、ロバストな追加の作用を有さなかった。切断されていないＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１に対応するより高い分子量のバンドも観察される（図１４Ａにおいて、黒色の矢印）。天然のＭＹＯＣＤをＭｙΔ３で置き換えることも同様に、ＡＳＣＬ１の発現を増加させる（図１４Ｂ）。免疫ブロットにおいても、ＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１に関するより高い分子量のバンドが観察される（図１４Ｂにおいて、黒色の矢印）。
天然のＭＹＯＣＤプラスＡＳＣＬ１ベクター（ＭｙＡΔＷＰＲＥ短鎖Ａ；ここでは標識されたＡＡＶ ＭｙＡ）および操作されたミオカルディンプラスＡＳＣＬ１ベクター（ＭｙΔ３ＡΔＷＰＲＥ短鎖Ａ；ここでは標識されたＭｙΔ３Ａ）をさらに、ＨＣＦ細胞系においてα－アクチニン＋ｃＴｎＴ＋誘導心筋細胞（ｉＣＭ）表現型を誘導するそれらの能力に関して、実施例７に記載される通り免疫細胞化学により試験した。表５は、ＭｙΔ３Ａが、様々な感染多重度（ＭＯＩ）でＭｙＡと比較して様々なリプログラミング因子の発現を増加させたことを実証する。
Figure 2024001344000016
この増加したリプログラミング因子発現は、α－アクチニン＋細胞（図１４Ｃ）またはｃＴｎＴ＋細胞（図１４Ｄ）の定量的免疫蛍光測定に基づいて、ＭｙＡと比較したＭｙΔ３Ａの心臓線維芽細胞リプログラミング能力の増加との相関を示した。
ＭｙΔ３Ａを用いたＡＡＶベースのリプログラミングの強化されたリプログラミング能力を、ＡＡＶをＮＩＬと突き合わせて比較することによってさらに検証した。ＭｙΔ３ＡのＡＡＶベースの発現は、α－アクチニン＋細胞のパーセンテージまたはｃＴｎＴ＋細胞のパーセンテージの免疫蛍光分析に基づいて、ＮＩＬベースのリプログラミングより優れていた（図１５）。これは、天然のＭＹＯＣＤを用いて観察されたＮＩＬと比較してより低いＡＡＶの性能とは対照的である（図８Ｅ）。
（実施例１１）
ＡＡＶベースのＭｙＭｙｆ６でのヒト心臓線維芽細胞のリプログラミング
およそ１，０００種のヒトタンパク質をコードする遺伝子のライブラリーを、ＭＹＯＣＤをコードするレトロウイルスおよび約１，０００種の遺伝子のそれぞれの心臓線維芽細胞への形質導入によって、ＭＹＯＣＤ単独と組み合わせたリプログラミング活性に関してスクリーニングした。約１，０００種のヒトタンパク質をコードする遺伝子を、ｃＴｎＴおよびα－アクチニンの発現によってアッセイされたヒト心臓線維芽細胞をリプログラミングするそれらの能力に関して試験した。最良の１８種の因子に関する結果を示す（図１６Ａ）。ＡＳＣＬ１およびＭＹＦ６の両方は、ＭＹＯＣＤと組み合わせて、他の異種タンパク質をコードする遺伝子なしで、ロバストな活性を示す。ｃＴｎＴおよびα－アクチニンの発現をそれぞれＺ－スコアによって定量化した。図１６Ｂは、ＭＹＯＣＤ（Ｍｙ）；ＡＳＣＬ１単独（Ａ）；ＭＹＯＣＤおよびＡＳＣＬ１（Ｍｙ／Ａ）；またはＭＹＯＣＤおよびＭＹＦ６（Ｍｙ／Ｍｙｆ６）を発現するレトロウイルスでの感染後の２週間における、リプログラミングされた成体ヒト心臓線維芽細胞（ＡＨＣＦ）の代表的な免疫細胞化学の画像を示す。表６は、それぞれ単一のレトロウイルスベクターから発現されたＭｙ／ＡまたはＭｙ／Ｍｙｆ６を使用したリプログラミングされた細胞における心臓遺伝子発現分析を示す。
Figure 2024001344000017
Figure 2024001344000018
ＡＨＣＦを、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１（ＭｙＡ）またはＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６（ＭｙＭｙｆ）をコードしたレトロウイルスに感染させた。リプログラミングされた細胞を３週間培養した。心臓マーカー遺伝子（ＮＰＰＡ、ＡＣＴＣ１、ＰＬＮ、ＴＮＮＴ２、ＣＡＱ２、ＴＮＮＣ１、ＭＹＨ６、ＭＹＨ７、ＳＣＮ５Ａ、ＮＰＰＢ）の転写レベルをｑ－ＰＣＲによって決定した。
（実施例１２）
心筋梗塞の処置
ミオカルディンおよびＡＳＣＬ１の発現のためのウイルスベクターを、ｉｎ ｖｉｖｏで心筋梗塞（ＭＩ）のための処置として試験した。ＡＡＶ２のｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ５のｃａｐ遺伝子をコードするＰＡＣＧ５プラスミド、ならびに個々にＡＡＶ２の逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって挟まれた試験発現カセットを有する３つのプラスミドのそれぞれと共にアデノウイルス遺伝子Ｅ４、Ｅ２ａおよびＶＡをコードするｐＨｅｌｐｅｒでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクションによって、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを構築した。このコトランスフェクションは、３つの発現カセットのそれぞれを送達することが可能なＡＡＶ５ウイルス粒子を生成した。陰性対照発現カセットは、ＣＡＧプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしていた。ミオカルディンおよびＡＳＣＬ１に関する２つの発現カセットを試験した。試験した発現カセットの両方において、発現カセットのサイズを低減させるために、操作されたミオカルディンＭｙΔ３を使用した。
第１の試験した発現カセットは、ＳＶ４０イントロン（配列番号７３）およびｂＧＨポリＡシグナル（配列番号８５）が介在する、ＣＡＧプロモーター（配列番号６７）の転写制御下にＭｙΔ３（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７２）を配置したバイシストロン性発現カセット（図１７Ａ）であった。この第１の発現カセットはさらに、３’から、ＭｙΔ３ポリＡシグナル、ＳＣＰプロモーター（配列番号６８）の転写制御下のＡＳＣＬ１（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、および短鎖ポリＡシグナル（配列番号７４）を含んでいた。この構築物において、ＷＰＲＥ配列は使用されなかった。
試験された第２の発現カセットは、実施例１０のものに類似した、ＭｙΔ３（配列番号１６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７２）、それに続いて２Ａペプチド（配列番号２３）をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号２２）、次いでＡＳＣＬ１（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を配置したモノシストロン性発現カセット（図１８Ａ）であった。このオープンリーディングフレームの完全なポリヌクレオチド配列は、配列番号３５であり、これは、配列番号５７のポリペプチド配列をコードする。この第２の発現カセットは、ＳＶ４０イントロン（配列番号７３）および３’短鎖ポリＡシグナル（配列番号７４）が介在する、ＣＡＧプロモーター（配列番号６７）の転写制御下にこのＭｙΔ３－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド配列が配置された。ＷＰＲＥ配列は使用されなかった。
ＭＩのためのモデルとして、Gao et al. Cardiovasc Res.45:330-38 (2000)（マ
ウス）；Litwin et al. Circulation.89:345-54 (1994)（ラット）；およびHood et
al. Cardiovasc Drugs Ther.6:233-37 (1992)（イヌ）に記載されるように、ＣＤ
－１マウスを左前下行枝（ＬＡＤ）動脈の結紮によって作製した。結紮は、心臓の酸素を欠乏させて、心臓への即時のダメージを引き起こす。このダメージは、ＭＩ中にヒト心臓が受けるダメージを正確に反映することが示されている。（同じ引用）加えて、この実験モデルは、心不全（例えば慢性虚血性心不全）のための処置に対する応答の予測となることが当業界において公知である。
心臓結紮の後、陰性対照ベクター（ＡＡＶ５：ＧＦＰ）またはバイシストロン性ベクター（標識されたＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ）を１．２×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量でマウスに心筋内注射した。ベクター、特定にはトランスサイトーシスが可能なベクター（例えば、これらに限定されないが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０など、またはあらゆる公知のＡＡＶ血清型の選択されたバリアント）の全身投与は、調整された用量（例えば、心腔内注射のための用量にキログラムでの対象の体重を掛けることによって、または投薬量範囲の研究によって決定された用量を使用することによって）で心腔内注射と同じ結果を達成することが予想された。ＭＩ後の２、４および７週間に、心機能（駆出率）を心エコー検査によって評価した。イメージングから、ＭＩ後の４および７週間に、ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａを注射したマウスが、ＡＡＶ５：ＧＦＰを注射したマウスと比較して駆出率における統計学的に有意な改善を示したことが解明された。（各群につきｎ＝６～１３。＊＊ｐ＜０．０１）。図１７Ｂに、結果を示す。
結紮処置を、マウスの第２のコホートに繰り返した。結紮の後、即座に、心臓に、媒体対照ベクター（ハンクス平衡塩溶液、ＨＢＳＳ）またはモノシストロン性ベクター（標識されたＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ）を再び１．２×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）の用量で心筋内注射した。心臓の機能を、ＭＩ後８週間まで２週毎に心エコー検査によって経過観察した。イメージングにより、ＭＩの後、媒体（ＨＢＳＳ）を注射したラットの心機能（駆出率）が低下し続けたことが解明された。ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａを注射したラットは、ＭＩ後の４～８週間の駆出率において統計学的に有意な改善を示した。（各群につきｎ＝８。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１８Ｂに、結果を示す。マウスまたはラットのヒトに対する心臓の重量比が約１，０００であることを考慮すれば、ヒトでの効率に関して約１０１３ＧＣから約１０１４ＧＣの間の用量が試験される。
慢性心筋梗塞（ＣＭＩ）のラットモデルで追加の試験を実行した。ＬＡＤ結紮後の２週間のタイムポイントは、ＭＩ後の線維芽細胞増殖期の後であるため、このタイムポイントをウイルスベクターの注射のために選択した（Fu et al. J. Clin. Invest. 128:2127-43 (2018)）。図１９Ａ～図１９Ｂは、モノシストロン性の様式（ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ）でＡＡＶによって送達されたミオカルディンおよびＡＳＣＬ１のｉｎ ｖｉｖｏの試験を示す。ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａは、心筋梗塞（ＭＩ）に起因する慢性心不全のラットモデルにおける駆出率を改善する。永続的な冠動脈結紮後の２週間に、ＨＢＳＳまたは５×１０１１ＧＣの用量でのＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ（ＭｙΔ３およびＡＳＣＬ１転写物を、２Ａペプチドを含む単一の転写物から発現させた）を心筋内注射によって送達した。図１９Ａは、ＭＩ後１０週間まで２週毎に、心エコー検査によって評価された、処置された（ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ）および媒体対照（ＨＢＳＳ）群における心臓の機能を示す。心エコー検査により、ＭＩの後、媒体（ＨＢＳＳ）を注射したラットにおける心機能が低下し続けたことが解明された。ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａは、この心臓の機能の低下を止めた。図１９Ｂは、ＭＩ後の６～１０週間に、ＡＡＶ５：ＭｙΔ３Ａ処置が、媒体での動物と比較して駆出率における統計学的に有意な改善をもたらしたことを示す。（各群につきｎ＝１０。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
これらのマウスおよびラットからのデータは、ＭｙΔ３ＡのＡＡＶ送達が、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）と慢性心筋梗塞（ＣＭＩ）の両方においてｉｎ ｖｉｖｏで機能的な利益をもたらすことができることを実証する。ＡＭＩに起因する心不全は実質的に回復する。ＣＭＩに起因する心不全の進行は止まる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含むベクターであって、各ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されている、ベクター。
（項目２）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む、項目１に記載のベクター。
（項目３）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む、項目１または項目２に記載のベクター。
（項目４）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド；ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方；ならびにＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドおよびＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む、項目１に記載のベクター。
（項目５）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項目４に記載のベクター。
（項目６）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、およびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項目４に記載のベクター。
（項目７）
前記ＭＹＯＣＤが、操作されたミオカルディンである、項目１から６のいずれか一項に記載のベクター。
（項目８）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド、ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、ＭＥＦ２Ｃポリヌクレオチド、またはＴＢＸ５ポリヌクレオチド以外のリプログラミング因子ポリヌクレオチドを含まない、項目１から７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目９）
他のタンパク質をコードする遺伝子を含まない、項目１から８のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１０）
ポリシストロン性ベクターである、項目１から９のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１１）
ウイルスベクターである、項目１から１０のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１２）
ＡＡＶベクターである、項目１１に記載のベクター。
（項目１３）
レンチウイルスベクターである、項目１１に記載のベクター。
（項目１４）
存在する場合、前記ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド、または存在する場合、前記ＭＹＦ６ポリヌクレオチド、および前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、同じプロモーターに作動可能に連結されており、共に翻訳されることによって発現される、項目１から１３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１５）
単一のプロモーターに作動可能に連結した、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む、項目２または項目７から１３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１６）
単一のプロモーターに作動可能に連結した、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む、項目３または項目７から１３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１７）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号４）のヌクレオチド配列またはそのコドンバリアントを含む、項目１から１６のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１８）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、前記ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号４）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項目１から１７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目１９）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号３）またはその機能的なバリアントをコードする、項目１から１８のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２０）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号３）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、項目１から１９のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２１）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ＭｙΔ３（配列番号７２）のヌクレオチド配列またはそのコドンバリアントを含む、項目１から１６のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２２）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、前記ＭｙΔ３（配列番号７２）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項目１から１６または２１のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２３）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ＭｙΔ３（配列番号１６）またはその機能的なバリアントをコードする、項目１から１６または２１から２２のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２４）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ＭｙΔ３（配列番号１６）またはそのコドンバリアントに対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、項目１から１６または２１から２３のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２５）
前記ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列またはそのコドンバリアントを含む、項目１から２４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２６）
前記ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、前記ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列またはそのコドンバリアントに対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項目１から２５のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２７）
前記ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号１）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、項目１から２５のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２８）
前記ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号１）をコードする、項目１から２５のいずれか一項に記載のベクター。
（項目２９）
前記ＭＹＦ６ポリヌクレオチドが、ヒトＭＹＦ６（配列番号５６）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項目１から２４のいずれか一項に記載のベクター。
（項目３０）
発現カセットを含み、前記発現カセットが、
ａ．ＭｙΔ３（配列番号７２）もしくはそのコドンバリアントを含み、および／またはＭｙΔ３（配列番号１６）もしくはその機能的なバリアントをコードし、第１のプロモーターに作動可能に連結されている、前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチド；ならびに
ｂ．ＡＳＣＬ１（配列番号２）もしくはそのコドンバリアントを含み、および／またはＡＳＣＬ１（配列番号１）もしくはその機能的なバリアントをコードし、第２のプロモーターに作動可能に連結されている、前記ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチド
を含む、項目１１に記載のベクター。
（項目３１）
前記第１のプロモーターが、ＣＡＧプロモーター（配列番号６７）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有し、および／または前記第２のプロモーターが、ＳＣＰプロモーター（配列番号６８）に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する、項目３０に記載のベクター。
（項目３２）
発現カセットを含み、前記発現カセットが、単一のプロモーターに作動可能に連結したＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む、項目１１に記載のベクター。
（項目３３）
前記ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、配列番号３７またはそのコドンバリアントを含む、項目３２に記載のベクター。
（項目３４）
前記ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、配列番号３７に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項目３２または項目３３に記載のベクター。
（項目３５）
前記ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、配列番号５９またはその機能的なバリアントをコードする、項目３２に記載のベクター。
（項目３６）
前記ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、配列番号５９に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする、項目３２に記載のベクター。
（項目３７）
前記発現カセットが、ＳＶ４０イントロン（配列番号７３）、短鎖ポリＡシグナル（配列番号７４）およびＷＰＲＥ（配列番号７５）の１つまたは複数を含む、項目３２から３６のいずれか一項に記載のベクター。
（項目３８）
前記発現カセットが、逆方向末端反復、必要に応じてＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号７６）によって挟まれている、項目３２から３７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目３９）
必要に応じて配列番号７１またはその機能的なバリアントを含む、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含む、項目３２から３８のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４０）
分化した細胞を誘導心筋（ｉＣＭ）細胞にリプログラミングすることが可能である、項目１から３９のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４１）
ｉＣＭ細胞の少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％が、α－アクチニン陽性である、項目４０に記載のベクター。
（項目４２）
ｉＣＭ細胞の少なくとも２％、少なくとも５％、または少なくとも８％が、ｃＴｎＴ陽性である、項目４１に記載のベクター。
（項目４３）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＭＹＦ６ポリヌクレオチドのいずれかまたは両方をコードする第１のベクター；ならびにＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含むベクター系。
（項目４４）
前記第１のベクターが、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む、項目２２に記載のベクター系。
（項目４５）
前記第１のベクターが、ＭＹＯＣＤ－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドまたはＡＳＣＬ１－２Ａ－ＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含む、項目２２に記載のベクター系。
（項目４６）
ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドをコードする第１のベクターおよびＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドまたはＭＹＦ６ポリヌクレオチドをコードする第２のベクターを含むベクター系。
（項目４７）
前記第１のベクターおよび前記第２のベクターが、それぞれ独立して、脂質ナノ粒子、トランスポゾン、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス、レトロウイルス、組み込み型レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）、および非組み込み型ＬＶＶから選択される、項目４３から４６のいずれか一項に記載のベクター系。
（項目４８）
前記ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドが、ヒトＡＳＣＬ１（配列番号２）のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、項目４３から４７のいずれか一項に記載のベクター系。
（項目４９）
前記ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドが、ヒトＭＹＯＣＤ（配列番号３）もしくはその機能的なバリアントまたはＭｙΔ３（配列番号１６）もしくはその機能的なバリアントをコードする、項目４３から４８のいずれか一項に記載のベクター系。
（項目５０）
分化した細胞において心筋細胞表現型を誘導する方法であって、前記分化した細胞を、項目１から４２のいずれか一項に記載のベクターまたは項目４３から４９のいずれか一項に記載のベクター系と接触させるステップを含む、方法。
（項目５１）
前記分化した細胞が、心臓線維芽細胞である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記分化した細胞が、前記接触させるステップの間、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞である、項目５０または項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記分化した細胞が、心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象におけるｉｎ ｖｉｖｏの細胞である、項目５０から５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化した細胞を、項目１から４２のいずれか一項に記載のベクターまたは項目４３から４９のいずれか一項に記載のベクター系と接触させて、ｉＣＭ細胞を生成するステップ、および前記ｉＣＭ細胞を前記対象に投与するステップを含む、方法。
（項目５５）
前記心臓の状態が、拡張型心筋症である、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法であって、項目１から４２のいずれか一項に記載のベクターまたは項目４３から４９のいずれか一項に記載のベクター系を前記対象に投与するステップを含む、方法。
（項目５７）
前記心臓の状態が、心筋梗塞である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記心臓の状態が、急性心筋梗塞である、項目５６に記載の方法。
（項目５９）
前記心臓の状態が、心不全である、項目５６に記載の方法。
（項目６０）
前記心臓の状態が、慢性虚血性心不全である、項目５６に記載の方法。
（項目６１）
項目１から４２のいずれか一項に記載のベクターまたは項目４３から４９のいずれか一項に記載のベクター系、および心臓の状態の処置で使用するための説明書を含むキット。
（項目６２）
分化した非心筋細胞を心筋細胞に変換する方法であって、分化した細胞を、項目１から４２のいずれか一項に記載のベクターまたは項目４３から４９のいずれか一項に記載のベクター系と接触させるステップを含む、方法。
（項目６３）
前記分化した非心筋細胞が、分化した非心筋細胞である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
前記分化した非心筋細胞が、ヒトの分化した非心筋細胞である、項目６２または項目６３に記載の方法。
（項目６５）
前記分化した非心筋細胞が、ｉｎ ｖｉｖｏの分化した非心筋細胞である、項目６２から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記分化した非心筋細胞が、ｉｎ ｖｉｔｒｏの分化した非心筋細胞である、項目６２から６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記分化した非心筋細胞が、心細胞である、項目６１から６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
最大で８５０アミノ酸の長さを有する操作されたミオカルディンタンパク質をコードする操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記操作されたミオカルディンタンパク質が、ＳＲＦ相互作用ドメイン、ＳＡＰドメイン、およびＴＡＤドメインを含む、ポリヌクレオチド。
（項目６９）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインを含む、項目６８に記載のポリヌクレオチド。
（項目７０）
ａ．前記Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインが、配列番号１７に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、
ｂ．前記ＳＲＦドメインが、配列番号１８に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、
ｃ．前記ＳＡＰドメインが、配列番号１９に対して、少なくとも８５％の同一性を有し、
ｄ．前記ＴＡＤドメインが、配列番号１１に対して、少なくとも８５％の同一性を有する、項目６９に記載のポリヌクレオチド。
（項目７１）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、ＬＺドメインを含む、項目６８または７０に記載のポリヌクレオチド。
（項目７２）
前記ＬＺドメインが、配列番号２０に対して、少なくとも８５％の同一性を有する、項目７１に記載のポリヌクレオチド。
（項目７３）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、
ａ．ヒトミオカルディン（配列番号１０）の残基５～４１３に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、および
ｂ．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９８６に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチド
を含み、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、項目６８から７２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目７４）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、
ａ．ヒトミオカルディン（配列番号１２）の残基５～４３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、および
ｂ．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチド
を含み、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、項目６８から７２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目７５）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、
ａ．ヒトミオカルディン（配列番号１３）の残基５～５５９に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第１のポリペプチド、および
ｂ．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９３８に対して、少なくとも８５％の同一性を有する第２のポリペプチド
を含み、
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、項目６８から７２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目７６）
前記リンカーが、ペプチド結合からなる、項目７３から７５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目７７）
前記リンカーが、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＳＳ、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号３０）、ＧＳＳＧＧＳ（配列番号３１）、ＧＧＳＧＳＳ（配列番号３２）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号３４）から選択されるポリペプチドである、項目７３から７５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目７８）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１４～１６から選択される配列を含む、項目７６に記載のポリヌクレオチド。
（項目７９）
操作されたミオカルディンタンパク質をコードする操作されたＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記操作されたミオカルディンタンパク質が、天然のミオカルディン（配列番号３）のアミノ酸４１４～７６４に対応する領域に、少なくとも５０アミノ酸の欠失を含む、ポリヌクレオチド。
（項目８０）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、前記天然のミオカルディン（配列番号３）の約４１４から約７６３アミノ酸の欠失を含む、項目７９に記載のポリヌクレオチド。
（項目８１）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１４と少なくとも８５％同一の配列を含む、項目８０に記載のポリヌクレオチド。
（項目８２）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１４と同一の配列からなる、項目８１に記載のポリヌクレオチド。
（項目８３）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、前記天然のミオカルディン（配列番号３）の約４３９から約７６３アミノ酸の欠失を含む、項目７９に記載のポリヌクレオチド。
（項目８４）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１５と少なくとも８５％同一の配列を含む、項目８３に記載のポリヌクレオチド。
（項目８５）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１５と同一の配列からなる、項目７４に記載のポリヌクレオチド。
（項目８６）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、前記天然のミオカルディン（配列番号３）の約５６０から約７６３アミノ酸の欠失を含む、項目７９に記載のポリヌクレオチド。
（項目８７）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１６と少なくとも８５％同一の配列を含む、項目８６に記載のポリヌクレオチド。
（項目８８）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号１６と同一の配列からなる、項目８７に記載のポリヌクレオチド。
（項目８９）
前記操作されたミオカルディンタンパク質が、機能的な操作されたミオカルディンタンパク質である、項目６８から８８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目９０）
前記機能的な操作されたミオカルディンタンパク質が、同じ発現系における天然のＭＹＯＣＤのレベルの少なくとも１０％で発現される、項目８９に記載のポリヌクレオチド。
（項目９１）
前記機能的な操作されたミオカルディンタンパク質が、（ａ）ヒト心臓線維芽細胞において、ＴＧＦβ阻害剤、必要に応じてＳＢ４３１５４２、およびＷｎｔ阻害剤、必要に応じてＸＡＶ９３９の存在下で、ＭＥＦ２ＣおよびＴＢＸ５もしくはＴＢＸ５と共に発現される場合、または（ｂ）ヒト心臓線維芽細胞において、ＡＳＣＬ１と共に発現される場合のいずれかで、少なくとも１つの心筋細胞表現型のマーカーの発現増加を誘導することが可能である、項目８９または９０に記載のポリヌクレオチド。
（項目９２）
プロモーターに作動可能に連結されている、項目６８から９１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目９３）
ＭＥＦ２ＣポリヌクレオチドおよびＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項目６８から９２のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目９４）
ＴＢＸ５ポリヌクレオチドを含む、項目６８から９３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目９５）
ＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドを含む、項目６８から９３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目９６）
逆方向末端反復（ＩＴＲ）によって挟まれているか、または長い末端反復（ＬＴＲ）によって挟まれている、項目６８から９５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（項目９７）
項目６８から９６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む組換えウイルス。
（項目９８）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、項目９７に記載の組換えウイルス。
（項目９９）
レンチウイルスである、項目９７に記載の組換えウイルス。
（項目１００）
項目６８から９６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む細胞の集団。
（項目１０１）
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＣａＴアッセイにおいて、カルシウムトランジェント（ＣａＴ）を呈する前記集団中の細胞のパーセンテージが、同じｉｎ ｖｉｔｒｏのＣａＴアッセイにおける前記ポリヌクレオチドを含まない細胞の対照集団における前記細胞のパーセンテージの少なくとも２倍である、項目１００に記載の細胞の集団。
（項目１０２）
項目６８から９６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む誘導心筋細胞（ｉＣＭ）。
（項目１０３）
項目６８から９６のいずれかに記載のポリヌクレオチドおよび非ウイルス送達系を含む医薬組成物。
（項目１０４）
項目９７から９９のいずれかに記載の組換えウイルスを含む医薬組成物。
（項目１０５）
誘導心筋細胞（ｉＣＭ）を生成する方法であって、哺乳動物線維芽細胞を、項目６８から９６のいずれかに記載のポリヌクレオチド、項目９７から９９のいずれかに記載の組換えウイルス、または項目１０３もしくは項目１０４に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む、方法。
（項目１０６）
対象における心臓の状態を処置する方法であって、項目１０５に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。
（項目１０７）
前記組換えウイルスが、心臓カテーテル法を介して投与される、項目１０６に記載の方法。
（項目１０８）
前記組換えウイルスが、心腔内注射を介して投与される、項目１０６に記載の方法。
（項目１０９）
発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記発現カセットが、５’から３’の順で、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０イントロン、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、短鎖ポリアデニル化シグナル、および３’ＩＴＲを含み、前記１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、５’から３’の順で、ＭｙΔ３をコードするポリヌクレオチド、Ｐ２Ａリンカーをコードするポリヌクレオチド、およびＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチドを含む、ｒＡＡＶ。
（項目１１０）
前記発現カセットが、ＷＰＲＥを含む、項目１０９に記載のｒＡＡＶ。
（項目１１１）
前記ＭｙΔ３が、配列番号１６を含む、項目１０９または１１０に記載のｒＡＡＶ。
（項目１１２）
前記２Ａリンカーが、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２３）を含む、項目１０９から１１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目１１３）
前記ＡＳＣＬ１が、配列番号１を含む、項目１０９から１１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
（項目１１４）
配列番号３５（ＭｙΔ３Ａ ＡＡＶ）と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドを含む、項目１１３に記載のｒＡＡＶ。
（項目１１５）
項目１０９から１１４のいずれかに記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物。
（項目１１６）
対象における心臓の状態を処置する方法であって、項目１１５に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

Claims (35)

  1. 操作されたミオカルディンタンパク質をコードする、操作されたヒトＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号３のヒトミオカルディンのアミノ酸４１４～７６４に対応する領域に、少なくとも１００アミノ酸の欠失を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  2. 前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号３のヒトミオカルディンの約５６０から約７６３アミノ酸の欠失を含み、前記操作されたミオカルディンタンパク質が、必要に応じて配列番号１６に対して少なくとも８５％または９５％同一である配列を含む、または配列番号１６と同一の配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  3. 前記操作されたミオカルディンタンパク質が、配列番号３のヒトミオカルディンの約４３９から約７６３アミノ酸の欠失を含み、前記操作されたミオカルディンタンパク質が、必要に応じて配列番号１５に対して少なくとも８５％または９５％同一である配列を含む、または配列番号１５と同一の配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  4. 前記操作されたミオカルディンタンパク質が、必要に応じて配列番号３のヒトミオカルディンの約４１４から約７６３アミノ酸の欠失を含み、前記操作されたミオカルディンタンパク質が、必要に応じて配列番号１４に対して少なくとも８５％または９５％同一である配列を含む、または配列番号１４と同一の配列からなる、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  5. ヒトミオカルディンタンパク質の最大で８５０アミノ酸の長さを有する操作されたミオカルディンタンパク質をコードする、操作されたヒトＭＹＯＣＤポリヌクレオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記操作されたミオカルディンタンパク質が、前記ヒトミオカルディンタンパク質のＳＲＦ相互作用ドメイン、ＳＡＰドメイン、およびＴＡＤドメインを含み、前記操作されたミオカルディンタンパク質が、前記ヒトミオカルディンタンパク質のＧＡＴＡ４相互作用ＩＩドメインにおける欠失を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  6. 前記操作されたミオカルディンタンパク質が、必要に応じてＭｅｆ２ｃ相互作用ドメインを含み、必要に応じて、
    ａ．前記Ｍｅｆ２ｃ相互作用ドメインが、配列番号１７に対して少なくとも８５％の同一性を有し、
    ｂ．前記ＳＲＦドメインが、配列番号１８に対して少なくとも８５％の同一性を有し、
    ｃ．前記ＳＡＰドメインが、配列番号１９に対して少なくとも８５％の同一性を有し、かつ／または
    ｄ．前記ＴＡＤドメインが、配列番号１１に対して少なくとも８５％の同一性を有する、
    請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  7. 前記操作されたミオカルディンタンパク質がＬＺドメインを含み、前記ＬＺドメインが、必要に応じて配列番号２０に対して少なくとも８５％の同一性を有する、請求項５または請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  8. 前記操作されたミオカルディンタンパク質が、
    ａ．ヒトミオカルディン（配列番号１３）の残基５～５５９に対して少なくとも８５％の同一性を有する、第１のポリペプチド、および
    ｂ．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９３８に対して少なくとも８５％の同一性を有する、第２のポリペプチド
    を含み、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、請求項５から７のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  9. 前記操作されたミオカルディンタンパク質が、
    ａ．ヒトミオカルディン（配列番号１０）の残基５～４１３に対して少なくとも８５％の同一性を有する、第１のポリペプチド、および
    ｂ．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９８６に対して少なくとも８５％の同一性を有する、第２のポリペプチド
    を含み、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、または
    前記操作されたミオカルディンタンパク質が、
    ａ．ヒトミオカルディン（配列番号１２）の残基５～４３８に対して少なくとも８５％の同一性を有する、第１のポリペプチド、および
    ｂ．ヒトミオカルディン（配列番号１１）の残基７６４～９３８に対して少なくとも８５％の同一性を有する、第２のポリペプチド
    を含み、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドが、ペプチド結合を含むリンカーまたは１～５０アミノ酸残基のポリペプチドリンカーによって連結されている、請求項５から７のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  10. 前記ポリヌクレオチドが、ＡＳＣＬ１ポリペプチドをコードするＡＳＣＬ１ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  12. ウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
  13. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、必要に応じて前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ５キャプシドを含む、請求項１２に記載のベクター。
  14. 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１２に記載のベクター。
  15. ＣＡＧプロモーターを含み、必要に応じて前記ＣＡＧプロモーターが、配列番号６７を含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のベクター。
  16. ＳＶ４０イントロンを含み、必要に応じて前記ＳＶ４０イントロンが、配列番号７３を含む、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のベクター。
  17. ポリアデニル化シグナルを含み、必要に応じて前記ポリアデニル化シグナルが、配列番号７４を含む、請求項１１から１６のいずれか一項に記載のベクター。
  18. 分化した細胞を誘導心筋（ｉＣＭ）細胞にリプログラミングすることが可能であり、必要に応じてｉＣＭ細胞の少なくとも２．５％、１０％、１５％、または２０％が、α－アクチニン陽性であり、かつ／またはｉＣＭ細胞の少なくとも２％、５％、または８％が、ｃＴｎＴ陽性である、請求項１１から１７のいずれか一項に記載のベクター。
  19. 急性心筋梗塞（ＡＭＩ）または慢性心筋梗塞（ＣＭＩ）を有する対象に前記ベクターを投与することが、前記対象の心臓の駆出率の減少を予防する、請求項１１から１８のいずれか一項に記載のベクター。
  20. 請求項１１から１９のいずれか一項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
  21. 請求項１１から１９のいずれか一項に記載のベクター、または請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組換えウイルスであって、必要に応じて組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）またはレンチウイルスである、組換えウイルス。
  22. 発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルスであって、前記発現カセットが、５’から３’の順番で、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０イントロン、１つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、短鎖ポリアデニル化シグナル、および３’ＩＴＲを含み、前記１つまたは複数のタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、５’から３’の順番で、
    ａ）請求項７から１６のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、
    ｂ）Ｐ２Ａリンカーをコードするポリヌクレオチド、および
    ｃ）ＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチド
    を含む、組換えアデノ随伴ウイルス。
  23. 前記単離されたポリヌクレオチドが、配列番号１６のＭＹＯＣＤポリペプチドをコードし、前記Ｐ２Ａリンカーが、アミノ酸配列ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２３）をコードし、および前記ＡＳＣＬ１をコードするポリヌクレオチドが、配列番号１のＡＳＣＬ１ポリペプチドをコードする、請求項２２に記載の組換えウイルス。
  24. 必要に応じて配列番号７１またはその機能的なバリアントを含む、ＡＡＶ５キャプシドを含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組換えウイルス。
  25. 請求項２１から２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む、医薬組成物。
  26. 分化した細胞において心筋細胞表現型を誘導する方法において使用するための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１１から１９のいずれか一項に記載のベクター、または請求項２１から２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む組成物であって、前記方法は、分化した細胞を、前記単離されたポリヌクレオチド、前記ベクター、または前記組換えウイルスと接触させるステップを含み、必要に応じて前記分化した細胞が哺乳動物線維芽細胞であり、前記接触させるステップがｉｎ ｖｉｔｒｏである、組成物。
  27. 分化した非心筋細胞を、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１１から１９のいずれか一項に記載のベクター、または請求項２１から２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスと接触させるステップを含む、分化した非心筋細胞を心筋細胞に変換するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、前記分化した非心筋細胞が、必要に応じてヒトの分化した非心筋細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏの分化した非心筋細胞、または心細胞である、方法。
  28. 誘導心筋（ｉＣＭ）細胞集団であって、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１１から１９のいずれか一項に記載のベクター、または請求項２１から２４のいずれか一項に記載の組換えウイルスを含む、ｉＣＭ細胞集団。
  29. 心臓の状態を患っているまたはそのリスクがある対象における心臓の状態を処置する方法において使用するための、請求項１１から１９のいずれか一項に記載のベクター、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の組換えウイルス、または請求項２８に記載のｉＣＭを含む組成物。
  30. 前記心臓の状態が、心筋梗塞、心不全または心筋症である、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記心筋梗塞が慢性心筋梗塞であり、前記心不全が慢性虚血性心不全であり、前記心筋症が拡張型心筋症である、請求項３０に記載の組成物。
  32. 前記方法が、心筋内注射または心臓カテーテル法によって前記組成物を投与するステップを含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記方法が、１つまたは複数の症状を処置し、前記１つまたは複数の症状が、前記対象の前記心臓の駆出率の減少を含む、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. ＭＹＯＣＤポリヌクレオチドおよびＭＹＦ６ポリヌクレオチドを含むベクターであって、各ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結しており、前記ＭＹＦ６ポリヌクレオチドが、配列番号５６のヒトＭＹＦ６のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する、ベクター。
  35. ウイルスベクターであり、必要に応じてＡＡＶベクターである、または必要に応じてレンチウイルスベクターである、請求項３４に記載のベクター。
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