KR20140035967A - 세포 및 유전자에 기반한 심장 기능을 개선하는 방법 - Google Patents

세포 및 유전자에 기반한 심장 기능을 개선하는 방법 Download PDF

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Abstract

[0464] 포유 동물 중에서의 심장 기능, 심근 수축 및 이완을 개선하는 조성물 및 방법이 제공된다. 프로모터에 작동가능하게 연결된 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1-인코딩 핵산 서열 및 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2-인코딩 핵산 서열을 포함하는 1 이상의 발현 벡터로 감염시킨 심근 세포를 포유 동물의 심근에 이식한다. 또는 R1 및 R2-인코딩 컨스트럭트를 가지는 바이러스 벡터를 포유 동물에 직접적으로 투여한다. R1 및 R2 서브 유닛의 과발현은 RR 복합체의 형성과 그에 따른 dATP 생성을 일으킨다. 또한, L48Q-치환된, I61Q-치환된, 또는 L57Q-치환된 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 투여하는 것에 의하여, 심장 기능의 개선이 수행될 수 있다. 또한, R1 및 R2를 과발현하는 기증자 세포를 이식하는 것을 통하여 심근에 dATP를 전달하는 조성물 및 방법이 제공된다. 그에 따라 dATP가 인 시투 생산되고, 기증자 세포 및 숙주 심근 세포간에 형성된 갭 결합을 통하여 전달된다.

Description

세포 및 유전자에 기반한 심장 기능을 개선하는 방법{CELL AND GENE BASED METHODS TO IMPROVE CARDIAC FUNCTION}
연방 지원의 연구 및 개발 하에서 이루어진 발명에 대한 권리의 언급
[0001] 본 발명은 국립 건강 협회에 의하여 부여된 승인번호 HL61683, R21　HL091368, HL07828, HL65497, R01 HL64387, R01 HL084642 및 P01 HL004374 하에서 연방 정부 지원을 받아 이루어졌다. 연방 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
관련 출원에 대한 상호 언급
[0002] 본 출원은 언급에 의하여 전체로서 본 명세서에 통합되는 2011년 5월 26일에 출원된 미국 임시 출원번호 제61/490,450호에 대하여 35 U.S.C. §19(e)에 따른 이익을 주장한다.
[0003] 심장병은 미국내 치사율 및 이환율의 선도 원인이고, 전 세계적으로 드라마틱하게 증가하고 있다8. HCM 및 DCM와 같은 근절의 심장병은 수개의 근필라멘트 단백질 중 하나의 아미노산 변이와 관련되는데, 이는 흔하게 심부전 및 몇몇 경우는 갑작스러운 심장 사망을 일으킨다1 ,2,9. 기능적 특징과 함께 동정된 변이의 수가 증가함에 따라, 변경된 수축 특성에 있어 잠재적 유사성을 보여주는 몇 가지 패턴이 나타났다. 예를 들어, 대부분의 HCM 변이는 막 제거된 심장 근육 내 수축 힘의 증가된 Ca2 + 민감성을 야기하는 반면에1 ,10-17, 대부분의 DCM 변이는 힘의 감소된 Ca2+ 민감성을 야기한다1 ,18-23. 그러나, 질병의 진행과 관련되는 근섬유 Ca2 + 민감성에 있어 이러한 변화의 정도는 알려져 있지 않다. 변화된 근섬유 Ca2 + 결합 및 SR 기능 사이의 잠재적이고 중요한 상호작용은 전체적으로 연구되지 않았으며, 다른 세포 내 Ca2 + 완충물(예컨대, 미토콘드리아) 또는 유전자 조절과의 상호작용도 연구되지 않았다.
[0004] 허혈-재관류 손상 및 심근 경색뿐만 아니라, 많은 심장병들이 심장 기능을 현저하게 절충하는 심근 부분의 손상 및/또는 사멸로 인하여 수축성 기능의 감소를 일으킨다. 종종 경색된 심장은 몸의 심혈관 요구를 충족시키지 못하며, β-아드레날린 활성을 증가시키는 것으로 이를 보상하려한다. 그러나, 만성적인 β-아드레날린 자극은 수축 저장을 고갈시키고, 심장 확장 Ca2 + 레벨을 증가시킬 수 있으며, 궁극적으로 아드레날린 반응성의 하향 조절을 야기하여 마지막 단계인 심부전을 일으킨다8 -10*. 중요하게도, 동물 모델 및 환자에 대한 다수의 연구에서, 근섬유1 1 -16* 및 근소포체(SR)와 경색에 따른 근섬유막17 ,18* 단백질 함량과 인산화 둘 모두에서의 변화가 관찰되었는데, 이는 힘의 근섬유 Ca2 + 민감성과 Ca2 + 일시적 방출/섭취를 변화시킬 것이다. DCM 및 HCM와 관련된 심장 발현 변이에서 유사한 변화가 관찰되었다35. 비록 호르몬 레벨(예컨대 β-아드레날린 길항제)이 종종 이러한 적응과 연루되어 왔다고 하더라도, 그 기전은 아마도 SR 및 근섬유 단백질 사이의 세포 내 상호작용(적어도 부분적이나마) 때문일 것이다.
[0005] 심장 기능은 심근 경색, 허혈/재관류 손상, 당뇨병, 고혈압 및 비대성 및 확장성 심근증을 포함하는 심혈관계 질환 다수 중에서 위태롭게 된다. 이러한 병리 생리학적 조건은 종종 Ca2 + 사이클 1 , β-아드레날린 반응성 2 , 및/또는 심근 세포의 수축 장치 3 ,4 를 변화시킨다. 지금까지 약학적인 노력은 주로 [Ca2 +]를 증가시키는 것에 초점을 맞추어왔는데, 이는 호-부정맥 발생(pro-arrhythmogenic) 효과를 일으키는 경향이 있고, 심장확장 이완을 늦추는 것에 의하여 심실 충진을 손상시키고 5 , SR Ca2 + 과충전 개시되는 유발된 활성19*을 야기한다. 아드레날린 제제와 관련된 다른 접근들은, 에컨대 비-표적 영역에서의 현저한 약물 반응, 호-부정맥 발생 유발된 활성 및 심부전으로 가속화되어 진행될 가능성과 같은 바람직하지 않은 장기간의 부작용을 가질 수 있다 2 . 따라서, 심장 기능 장애와 싸울 수 있는 새로운 접근법이 바람직하다.
[0006] 대안적인 접근법은 심장 트로포닌 C(cTnC)에의 Ca2 + 결합을 증진시키고 수축성 힘을 증가시키는 Ca2 + 민감화 화합물의 사용과 관련된다4. cTnC의 N-말단 (사이트 II, "방아쇠 부위")에 Ca2 + 결합을 증가시키고, 수축성 활성을 증진시키는, 칼미다졸리움(calmidazolium), 베프리딜(bepridil) 및 레보시멘덴(levosimenden)과 같은 약학적 제제의 개발을 위하여 상당한 노력을 기울여왔다. 이와 같은 화합물과 관련된 몇 가지 단점은 cTnC에 대한 그들의 비특이성 및 Ca2 + 핸들링과 관련된 단백질에 대한 유해한 효과21 ,22 및 흥분-수축 커플링 경로의 다른 관점5을 포함한다.
[0007] 기능의 회복과는 대조적으로, 심부전의 진행을 느리게 하는 것을 일반적인 목표로 하는 다양한 통상적인 약물학적 및 외과적 접근과 관련된 단점을 고려할 때, 심장 기능을 개선하는 신규한 방법이 요구된다. 본 발명은 EC 커플링6에 영향을 주지 않고, 증진된 심장 수축을 위하여 보다 표적화된 접근, 즉 변경된 Ca2 + 결합 특성을 갖는 신규한 재조합 cTnC 변이체의 발생 또는 심장 수축 중 대체 기질로서 사용하기 위한 리보뉴클레오타이드 리덕타제에 의한 dATP의 인 시투 생산 또는 투여를 제공한다.
[0008] 본 발명의 일 관점은 dATP의 전체 세포 레벨 중의 심지어 완만한 증가(전체 아데닌 뉴클레오타이드 풀의 1.0%-2% 정도로 적은)가 심장 수축성에 실질적인 개선을 가져온다는 놀라운 발견에 기반한 것이다. dATP 레벨의 증가는, 개체에게 투여되는 프로모터-유도된 Rrm1(리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브유닛 1) 또는 Rrm2(리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브유닛 2)를 발현하는 벡터를 사용한 본 발명의 방법에 의하여 달성되거나 또는 벡터가 형질 도입된 기증자 세포를 숙주 심근에 이식하는 것을 통하여 달성된다. 또한, 심장 이완 또는 Ca2 + 전이에 상응하는 부작용없이, 수축성을 개선하고, 칼슘 민감성을 일견 증가시키는 본원에서 개시되는 방법의 능력은 예측 불가능한 것이었다. 반면에, 심장 이완은 증가된 dATP 레벨의 결과로 인하여 눈에 띄게 빨라졌다. 심장 기능의 개선은, 심장 초음파 검사 및 IonOptix 시스템 비디오 현미경을 통하여 관찰되는 바와 같은, 좌심실 단편적 수축의 증가 및 분리된 심근 세포의 수축 및 이완의 증가된 범위 및 비율에 의하여 입증되었다. 본 발명의 이점은 정상 및 경색된 심장을 가지는 마우스 및 래트 연구 중에서 확인되었다. 증가된 dATP 레벨은 란겐도르프(Langendorf) 워킹 심장 연구에서 프리 로드 반응을 증가시키고, 심부전으로부터 구해내는 효과를 가졌다. 또한, 리보뉴클레오타이드 리덕타제의 자동 조절적 기전, 즉 ATP에 의한 알로스테릭 활성화 및 dATP에 의한 억제는, RR의 과발현과 함께 dATP가 독성 레벨에 도달하는 것을 방지하는 또 다른 현저한 이점을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 예컨대 부정맥발생(arrhythmogenesis), 느려진 심장 확장 이완에 의한 심실 채움의 손상, 비 표적 영역에 대한 부작용 및 잠재적으로 가속화된 심부전으로의 진행과 같은 다양한 단점이 없는 신규한 약학적 접근을 제공하고, Ca2 + 레벨 또는 아드레날린 신호를 조작하는 통상적인 약학적 접근과 관련된다.
[0009] 본 발명의 다른 관점은, 변경된 근섬유 Ca2+ 결합(및 수축 특성에 대한 관련된 변화)이 1) 심장 근소포체(SR) 기능 및 2) 정상 및 질병이 있는 심장 근육에서 심장의 수행에 대하여 가지는 효과에 대한 발견에 기초한 것이다. 이 연구에 대하여, 본 발명자들은 증가되거나 감소된 Ca2+ 결합 친화력을 가진 수개의 cTnC 변이체를 생산하였다. 화학적으로 막을 제거한 심장 근육 또는 심장 근섬유 속으로 교환될 때, 이러한 cTnC 변이체들은 힘의 Ca2+ 민감도를 각각 증가시키고 감소시켰다6. 자극된 수축 연구를 위하여, 이러한 cTnC 변이체(C-말단 His-태그를 가진 것) + GFP를 인코딩하는 cDNA를 함유하는 아데노바이러스 벡터와 감염되어 배양된 성체 래트 심근 세포를 생산하였고, 증가된 Ca2+ 결합 친화력(vs. WT cTnC)을 나타내는 L48Q cTnC 변이체와 함께, 수축의 크기 및 비율이 크게 증가하였으며7, Ca2+ 전이(비율척도 fura-2 형광에 의하여 측정)에 대해서는 거의 영향이 없거나 아예 영향이 없었다. 중요하게는 L48Q cTnC 발현은 경색된 심장으로부터 세포의 수축성 및 Ca2+ 전이 진폭 특성 둘 모두의 손실을 구출하였다. 반면에, I61Q cTnC 변이체는 감소된 Ca2+ 결합 친화도, 감소된 수축 규모(>60%) 및 비율을 나타내었고, 또한 놀랍게도 감소된 진폭(>20%) 및 상승된 Ca2+ 전이율을 나타내었다. 이러한 데이터는 근섬유 Ca2+ 결합 및 SR Ca2+ 방출 사이의 상호 작용을 나타낸다. 놀랍게도, AAV6-L48Q cTnC의 전신 주입이 정상 마우스의 심장 배출 일부를 2주에 20% 및 3주에 30-40%로 증가시켰다는 것이 본 명세서에서 확인된다.
[0010] 본 발명의 일 관점에서, 포유 동물, 예컨대 인간 중에서 심장 기능, 심근 수축성 및 심근 이완을 개선하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터와, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 함유하는 심근세포를 치료가 필요한 포유 동물, 예컨대 경색된 심근을 가지는 포유 동물의 심근에 이식시킨다. 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 R1 및 R2의 과발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 몇몇 구현예에서, R1 및 R2-인코딩 컨스트럭트는 동일한 발현 벡터의 부분이거나 또는 다른 발현 벡터 상에 있다. 프로모터는 몇몇 구현예에서, 심장에서의 선택적인 발현을 위하여, 예컨대 cTnT455와 같은 심장 특이적 프로모터로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서 숙련된 자는, 진핵세포, 예컨대 포유동물 세포 중에서 발현을 유도하기 위하여 적합한 다른 프로모터가 채택될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특정 규현예에서, 과발현은 CK7 프로모터 또는 CMV 프로모터에 의하여 유도된다.
[0011] dATP의 세포적 생산은 리보뉴클레오타이드 리덕타제(R1R2) 효소의 작용에 의하여, 포유 동물 세포 중에서 정상적으로 진행되는데, 이는 리보스 고리의 2-위치로부터 하이드록시 모이어티를 제거하여 dADP를생산한다. 그 다음, dADP는 빠르게 dATP로 변환된다. 본 발명의 장점은 R1 및 R2의 과다 발현에 의하여 얻어질 수 있는데, 이는 궁극적으로 dATP의 인 시투 생산을 야기하면서, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 복합체를 형성한다.
[0012] 몇몇 구현예에서, 발현 벡터는 AAV(adeno-associated viral) 벡터와 같은 바이러스 벡터인데, 예컨대, AAV6, AAV2, rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/3, rAAV2/4, rAAV2/5, rAAV2/6, rAAV2/7 rAAV2/8, rAAV2/9, rAAV2/10, rAAVM41, dsAAV, 등이 있다. 다양한 구현예에서, 발현 벡터는 형질 도입 리포터를 더 포함한다. 심근세포는 포유 동물 근원을 갖는 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)로부터 유래된 것일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 방법은 인간 줄기 세포로 부터 유래된 심근 세포를 채택한다. iPSCs는 처리될 포유 동물로부터 수확된 세포, 예컨대 섬유아세포로부터 유도될 수도 있다.
[0013] 몇몇 구현예에서, 본 방법은 심근 세포를 이식하기에 앞서, R1 및 R2-인코딩 제1 및 제2 발현 벡터를 상기 심근 세포에 엑스 비보(ex vivo) 형질도입시키는 것과 관련된다. 경색된 심근을 치료하는 것과 관련된 구현예에서, 심근 세포는 살아있는 세포를 함유하는 심근의 영역, 예컨대 심근의 경색되지 않은 영역에 도입될 수도 있다.
[0014] 대체적으로는 포유 동물, 예컨대 인간 중의 심장 기능의 개선 및 심근 수축성 및 이완의 개선은, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터와, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 투여하는 것에 의하여 실행될 수 있는데, 상기 1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터, 예컨대 cTnT455에 작동가능하게 연결된 것이다. R1 및 R2-인코딩 컨스트럭트는 동일한 바이러스 벡터의 부분이거나 또는 다른 바이러스 벡터 상에 있을 수 있다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 박테는 AAV(adeno-associated viral) 벡터이다. 바이러스 벡터(들)은 전신적으로, 예컨대 정맥 안으로, 또는 부분적으로 예컨대, 심근 내 주입을 경유하여 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 심장 특이적 마커에 특이적으로 결합하는 표적제를 더 인코딩할 수도 있다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 백터는 형질 도입 리포터를 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 L48Q cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 투여하는 것을 더 포함하는데, 여기서 cTnC 변이체는 Ca2 +에 대한 증가된 결합 친화도를 나타내며, 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 것이다.
[0015] 본 발명의 다른 관점은 숙주 포유 동물, 예컨대 숙주 인간의 심근으로 dATP를 전달하는 방법을 제공하는 것이다. 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브유닛 R1 및 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브유닛 R2를 과발현하는 기증자(수여자) 세포를 심근에 이식한다. 특정 구현예에서, 기증자 세포는 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터와, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 함유하는데, 상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 R1 및 R2의 과발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 당업계에서 숙련된 자는 R1 및 R2-인코딩 컨스트럭트가 동일한 발현 벡터의 부분일 수 있다는 것을 이해할 것이다.
[0016] dATP는 리보뉴클레오타이드 리덕타제 복합체에 의하여 인 시투 생산되고, 기증자 세포와 숙주 심근 세포간에 형성되는 갭 결합을 통하여 숙주 포유 동물의 심근 세포로 이전된다. 몇몇 구현예에서, dATP는 경색된 심근으로 전달된다. 바람직한 구현예에서, dATP는 살아 있는 세포를 함유하는 심근의 영역, 예컨대 비 경색 영역으로 전달된다. 기증자 세포, 예컨대 심근세포, 섬유아세포의 이식은 카테터에 의한 전달을 경유하여 실행될 수 있다. 당업계에서 숙련된 자는 숙주 생물체와 친화력이 있는 근원으로부터 선택되는 줄기 세포, 예컨대 다분화성 ESC, iPSC, 중간엽 줄기세포로부터 유래된 것일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, iPSCs는 숙주 포유 동물로부터 수확된 세포, 예컨대 섬유아세포로부터 유래된다.
[0017] 본 발명의 또 다른 관점에서, L48Q cTnC 변이체-인코딩 바이러스 벡터의 투여에 의한, 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법이 제공되는데, 여기서 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. L48Q cTnC 변이체는 증가된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 개체는 감소된 수축을 나타내는 심장 질환을 갖는다. 이러한 방법들은 심근증, 예컨대 허혈성 심장 질환, 심근증 또는 심근 경색을 진단받거나, 또는 감소된 심장 수축을 특징으로 하는 개체에게 적용될 수 있다. 심장 병리의 예로는, 원발성 심근증, 유전적 심근증 및 확장성 심근병증을 제한 없이 포함한다. 몇몇 구현예에서, 치료법을 필요로 하는 개체는 근섬유 수축의 감소된 Ca2+ 민감성과 관련된 1 이상의 유전적 변이 또는 확장성 심근병증의 표현형을 가진다. 그와 같은 유전적 변이의 예로는 미스센스 변이 Ser532Pro 및 Phe764Leu, cTnT에서의 삭제(deltaLys210) 또는 유전자 MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2, MYL3에서의 변이, 또는 문헌에 기재된 바와 같은 그들의 조합을 제한 없이 포함한다.
[0018] 대체적으로는, 베타-심장 미오신 중쇄(beta-cardiac myosin heavy chain), 심장 액틴(cardiac actin), 심장 트로포닌 T(cardiac troponin T), 알파-트로포미오신(alpha-tropomyosin), 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I), 심장 미오신-결합 단백질 C(cardiac myosin-binding protein C) 및 미오신 경쇄(myosin light chain)로부터 선택되는 근절(sarcomeric) 단백질에 1 이상의 유전적 변이를 갖는 개체 중의 심장 기능이 개선될 수 있는데, 이는 근섬유 수축의 증가된 Ca2 + 민감도 및/또는 비후형 심장근육병증 표현형과 관련된다. 그와 같은 유전적 변이의 예로는 cTnT의 잔기 92에서의 변이, 예컨대 R92W, R92Q 및 R92L cTnT, 또는 MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2, MYL3에서의 변이 및 문헌에 기재된 바와 같은 이들의 조합을 제한없이 포함한다. 심장 기능을 개선하는 방법은 상기 Ca2 + 민감화된 유전적 변이를 가지는 개체에게 L57Q 또는 I61Q cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 투여하는 것과 관련되는데, 상기 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이다. L57Q 및 I61Q cTnC 변이체는 감소된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 나타내며, 비후형 심장근육병증을 진단받은 개체를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, L48Q, L57Q 또는 I61Q cTnC 변이체-인코딩 바이러스 벡터는, 예컨대, 리포펙틴, 스텐트 상의 코팅, 카테터 경유와 같은 직접적 주입에 의하여 투여될 수 있다. 바이러스 벡터는 AAV(adeno-associated viral) 벡터로부터 선택될 수 있다.
[0019] 본 발명의 또 다른 관점에서, 심장 기능, 및/또는 심근 수축성 및/또는 심장 완화의 개선을 위한 약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터 및 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 포함할 수 있는데, 상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이다. 몇몇 구현예에서, R1 및 R2-인코딩 컨스트럭트는 동일한 바이러스 벡터 사에 있거나 또는 다른 바이러스 벡터 상에 있다. 대체적으로는, 약학적 조성물은 R1 및 R2-인코딩 바이러스 벡터가 형질 도입된 심근 세포를 함유한다. 본 명세서에 기술되는 다른 약학적 조성물은 L48Q cTnC 변이체-인코딩, 및/또는 I61Q cTnC 변이체-인코딩, 및/또는 L57Q cTnC 변이체-인코딩 핵산 서열을 갖는 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 AAV(adeno-associated viral) 벡터로부터 선택될 수 있는데, 예컨대 AAV6, AAV2, rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/3, rAAV2/4, rAAV2/5, rAAV2/6, rAAV2/7 rAAV2/8, rAAV2/9, rAAV2/10, rAAVM41, dsAAV, 등이 있다. 몇몇 구현예에서, 바이러스 벡터는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터를 더 포함한다. 벡터는 당업계에서 숙련된 자에게 적절하게 여겨지는 바와 같은 표적제를 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다는 것이 예상된다.
[0020] 도 1. 비처리(흑색), WT cTnC+GFP(청색) 및 L48Q cTnC+GFP(적색) 형질 도입된 심근 세포의 대표적인 세포 길이 흔적(A) 및 Ca2 + 전이(B, Fura-2 형광). 비처리된 근세포와 비교하여, 0.5 Hz에서 자극된, WT cTnC+GFP 및 L48Q cTnC+GFP 형질 도입된 근세포의 수축(C) 및 Ca2 + 전이(D)에서의 퍼센트 변화. Vshort = 수축 속도(velocity of shortening); FS = 단편적 수축(fractional shortening); Vrel = 최대 이완율(maximal relaxation velocity); RT50 ,90 = 50% 및 90% 이완까지 시간 각각; FL = 형광(fluorescence); DT50,90 = 50% 및 90% Ca2+ 쇠퇴까지 시간 각각 *비처리와 비교하여 p<0.05, †= WT cTnC와 비교하여 p<0.05.
[0021] 도 2. 수축 특성에 대한 자극 주파수의 효과. L48Q cTnC 형질 도입된 근세포(닫힌 삼각형)은 자극 주파수에 대하여 WT cTnC 형질 도입된(열린 원) 및 비처리 근세포(닫힌 원)과 유사하게 반응하지만, 모든 주파수에 대하여 상승된 단편적 수축(A) 및 수축 속도(B)를 나타낸다. 자극 주파수가 증가함에 따라, 이완 수축에 대한 시간과 함께, 이완 속도(C) 및 90% 이완까지 시간(D) 또한 그룹 간에 유사하다. * = 비처리와 비교하여 p<0.05, †= WT cTnC와 비교하여 p<0.05, ‡= 모든 그룹에 대하여 0.5 Hz에서와 비교하여 p<0.05.
[0022] 도 3. Ca2 + 핸들링 특성에 대한 자극 주파수의 영향. 최소(A) 및 최대 (B)형광에서, L48Q cTnC 형질 도입된 근세포(닫힌 삼각형)는 자극 주파수에 대하여, WT cTnC 형질 도입된 근세포(열린 원) 및 비처리된 근세포(닫힌 원)와 유사하게 반응한다. 심근 세포 이완과 같이, 50% (C) 및 90% (D)까지 Ca2 + 전이 쇠퇴 시간은 자극 주파수 중가와 함께 단축된다. * = 비처리와 비교하여 p<0.05, †= WT cTnC와 비교하여 p<0.05, ‡= 모든 그룹에 대하여 0.5 Hz에서와 비교하여 p<0.05.
[0023] 도 4. 최대 fura 형광(피크 Ca2 +)에 의하여 나눠진 단편적 수축에서 평가된 바와 같이, 수축 효율은 L48Q cTnC 형질 도입된 심근 세포(닫힌 삼각형)이 모든 자극 주파수에서 Ca2 +에 대하여 현저하게 더 민감한 반면에, WT cTnC 형질 도입된 심근 세포(열린 원)은 비처리 심근 세포(닫힌 원)과 비교하여 Ca2+에 덜 민감하다는 것을 나타낸다. * = 비처리와 비교하여 p<0.05, †= WT cTnC와 비교하여 p<0.05.
[0024] 도 5. 항-cTnC (A)로 탐지된 WT 및 L48Q cTnC-His 형질 도입된 신생아 심근 세포의 웨스턴 블롯은 전체 cTnC 근섬유 함량을 보여주는 반면에, 항-His (B)로 탐지된 것들은 가는 섬유 속으로의 L48Q cTnC 혼입을 보여준다. 밀도계측계는 L48Q cTnC가 천연 cTnC의 58 ± 7%를 치환하였음을 나타내었다.
[0025] 도 6. 비처리(흑색), 오직 GFP(녹색) 및 Rrm1+Rrm2+GFP(적색) 형질 도입된 심근세포의 대표적인 세포 길이 흔적(a) 및 Ca2 + 전이(b, Fura-2 형광). 비처리 근세포와 비교하여, 0.5 Hz에서 자극된 오직 GFP 형질도입된 것과 Rrm1+Rrm2+GFP 형질도입된 근세포의 수축(c) 및 Ca2 + 전이(d) 특성에서의 퍼센트 변화. Vshort = 수축 속도(velocity of shortening); FS = 단편적 수축(fractional shortening); Vrel = 최대 이완 속도(maximal relaxation velocity); RT50 ,90 = 50% 및 90% 이완까지의 시간 각각; FL = 형광(fluorescence); DT50 ,90 = 50% 및 90% Ca2+ 쇠퇴까지의 시간 각각. *비처리와 비교하여 p<0.05.
[0026] 도 7. 수축 특성에 대한 자극 주파수의 영향. Rrm1+Rrm2 형질 도입된 근세포(열린 삼각형)은 오직 GFP 형질도입된 것(열린 원) 및 비처리 근세포(닫힌 원)와 유사하게 자극 주파수에 반응하지만, 모든 주파수에 있어서 상승된 단편적 수축(A) 및 수축 속도(B)를 보인다. 자극 주파수가 증가함에 따른 이완 수축에 대한 시간과 함께, 이완 속도(C) 및 90% 이완까지 시간(D) 또한 그룹 간에 유사하게 나타났다. * = 비처리와 비교하여 p<0.05, †= GFP와 비교하여 p<0.05, ‡= 모든 그룹에 대하여 0.5 Hz에서와 비교하여 p<0.05.
[0027] 도 8. Ca2+ 핸들링 특성에 대한 자극 특성의 효과. Rrm1+Rrm2 형질 도입된 근세포(열린 삼각형)은, 최소(A) 및 최대(B) 형광에서, 비처리 근세포(닫힌 원)과 유사하게 자극 주파수에 반응하는 반면에, GFP-만이 형질 도입된 근세포(닫힌 원)은 주파수가 증가함에 따라, 둘 모두에서 더 큰 증가를 나타내었다. 심근 세포와 같이, 50%(C) 및 90% (D)까지의 Ca2+ 전이 쇠퇴 시간(DT)은 증가된 자극 주파수와 함께 단축되었지만, R1R2 형질 도입된 심근 세포에서는 둘 모두 드라마틱하게 단축된다. * = 비처리와 비교하여 p<0.05, †= GFP와 비교하여 p<0.05, ‡= 모든 그룹에 대하여 0.5 Hz에서와 비교하여 p<0.05.
[0028] 도 9. 최대 fura 형광(피크 Ca2+)에 의하여 나눠지는 단편적 수축에서 산정된 바와 같이, 수축 효율은 Rrm1+Rrm2 형질 도입된 심근 세포(열린 삼각형)가, 모든 자극 주파수에서 Ca2+에 대하여 현저하게 더욱 반응성임을 나타내는 반면에, 오직 GFP만이 형질 도입된 심근 세포(열린 원)은 비처리 심근 세포(닫힌 원)과 비교하여, 오직 2Hz 자극 주파수에서 Ca2+에 대하여 덜 반응한다. * = 비처리와 비교하여 p<0.05, †= GFP와 비교하여 p<0.05.
[0029] 도 10. (A) 항-Rrm1 항체로 탐지된 Rrm1 감염된 신생아 래트 심근 세포의 웨스턴 블롯은 Rrm1에서 >24-배 증가를 나타낸다. (B) 항 -Rrm2 항체로 탐지된 Rrm2 감염된 신생아 래트 심근 세포의 웨스턴 블롯은 Rrm2에서 > 46-배 증가를 나타낸다. Rrm1+Rrm2 과발현은 HPLC 분석에 의하여 산정된 바와 같이, 신생아 래트 심근 세포 중에서 세포 내 [dATP]를 >10-배로 현저하게 증가시켰다. * = GFP 형질도입된 심근 세포와 비교하여 p<0.05.
[0030] 도 11. AV-cTnC 감염된 근세포로부터 유래한 수축(A) 및 Ca2 +(B) 흔적: 경색되지 않은(WT cTnC, 흑색), 경색된 대조군(WT cTnC, 적색), 및 경색된(L48Q cTnC, 녹색).
[0031] 도 12. 비처리(UN; n=5) vs. AAV6-L48Q의 낮은(L; n=3) 또는 높은(H; n=3) 복용량(dose)에 대한 2 주(좌측) 및 3 주(우측)에서 LV 배출 단편.
[0032] 도 13. AAV6 L48Q cTnC 주입된 마우스 심장 조직(좌측) 및 주입되지 않은 대조군(우측)에 대한 항-cTnC 웨스턴 블롯.
[0033] 도 14. AV 감염된 세포의 브라이트필드(좌측) 및 형광(우측) 이미지
[0034] 도 15. 트랜스제닉 동물(표지된 바와 같은)로부터 유래한 심근 조직의 웨스턴 블롯 분석. 플래그 태그된 cTnC는 더 큰 분자량을 보여주고, 플래그 태근된 것 vs. 태그되지 않은 cTnC의 밀도 계측 분석은, Tg 동물 중의 천연 cTnC의 40-50%가 치환되었음을 나타낸다.
[0035] 도 16. 경색 이후 기능 손실을 보여주는, LV 기능의 초음파 심장 검진(A-C) 및 작동중인(working) 심장(D) 측정.
[0036] 도 17. 1 Hz(30 시간) vs. 비자극에서, 세포의 증가된 수축 및 Ca2+ 전이 특성의 퍼센트.
[0037] 도 18. Ca2+ 전이(rhod-2)는 L48Q(청색) vs. WT(흑색) cTnC와 함께 더 빠른 쇠퇴를 나타낸다.
[0038] 도 19. (A) WT, I61Q(청색) 또는 L48Q(적색) cTnC를 사용한 교환 이후에, pCa 8 내지 3.5 내지 8로부터 신속한 용액 교환과 함께, 심장 근섬유 활성 및 이완의 동력학. (B) L48Q vs. WT cTnC에 대한 더 높은 해상도 이완 흔적.
[0039] 도 20. (A) 가는 섬유 단백질 화학양론의 유지를 나타내는, 비처리 및 L48Q cTnC-His 형질 도입된 심근세포 금섬유의 은 염색. (B) 항-cTnC(좌측 패널)을 사용한 웨스턴 블롯은 총 cTnC 근섬유 함량을 보여주는데, 항-His(우측 패널)을 사용한 것들은 밀도 계측에 의할 때, 가는 섬유 속으로 58 ± 7% L48Q cTnC 혼입을 보여준다.
[0040] 도 21. WT vs. I61Q cTnC 감염된 심근 세포에 대한 근섬유 인산화 프로파일. (A) 항-포스포세린 웨스턴 블롯. (B) 총 단백질을 보여주는 SDS 쿠마시 블루 염색. (C) 인산화를 보여주는 Pro-Q 다이아몬드. 아무런 차이가 관찰되지 않았다.
[0041] 도 22. 작은 반점 트래킹 초음파 심장 검진을 사용한 방사상 스트레인 및 스트레인 비율. (a) 방사상 스트레인 분석을 위한 전측, 옆측, 후측, 하측 및 중격 심장 부분(위쪽 좌측, 화살표는 수축 피크를 나타낸다(S); 각각의 선은 색상 코드된 부분에 대응한다)을 나타내는, 색상 코드된 영역을 가진 중간-심실 짧은 축 뷰. (b) 수축 및 2개의 확장기-초기(E) 및 후기(A) 확장에서의 방사상 스트레인 비율.
[0042] 도 23. 로딩 대조군으로서 GAPDH를 사용한, R1(A) 및 R2(B)에 대한 웨스턴 블롯. 감염된 심근 세포 [dATP]의 HPLC (C).
[0043] 도 24. 길이(A) 및 Ca2 +(B) 전이는, R1R2 감염된 세포 vs. GFP 및 비처리 대조군에 대하여 Ca2 + 에 있어 아무런 변화가 없는 증가된 수축을 나타낸다.
[0044] 도 25 수축의 정도(A) 및 비율(B), 50% 이완까지 시간(C) 및 최대 Ca2+ 방출(D)은 모두 경색된 심장으로부터의 심근 세포에서 하강되었지만, AV-R1R2 감염에 의하여, 대조군 보다 개선되거나 또는 구출되었다.
[0045] 도 26. (A)는 주입 후 4일째에, 대조군과 비교하여, AV-R1R2 꼬리 정맥 및 심장에 직접 주입된 마우스에 대하여, 좌심실 단편적 수축에서의 증가를 보여준다. (B) 국소화된 감염 영역을 나타내는, 주입된 LV는 밝은 녹색 형광(GFP로부터 유래)에 의하여 지시된다.
[0046] 도 27. R1R2 과발현 마우스 vs. 대조군 한배 새끼에서, 단편적 수축 증가 퍼센트(A) 및 좌심실 내부 직경에서의 변화(B). d-확장기, s-수축기.
[0047] 도 28. LV 압력-부피 관계(A) 및 높은 [Ca2 +] 도전에 대한 LV 압력 반응(B).
[0048] 도 29. WT(A) 및 TG-R1R2(B) 심장에 대한 NMR 스펙트럼, 및 베이스라인 및 높은 [Ca2+] 도전 이후의 PCr/ATP 비율(C). 베이스라인에서의 ATP/HW 비율(인셋).
[0049] 도 30. ATP 및 dATP (A)를 사용한 마우스 대동맥 평활근 수축 흔적과 요약한 데이터(B).
[0050] 도 31. AAV6 L48Q cTnC 주입된 마우스 심장 조직(좌측) 및 비주입된 대조군(우측)에 대한 항-cTnC 웨스턴 블롯.
[0051] 도 32. (A) R1 및 R2를 위한 웨스턴 블롯 및 (B) 로딩 대조군으로서 α-튜블린.
[0052] 도 33. 샘플 심장 근섬유 활성화 및 이완 흔적(좌측). 이완의 확대된 느린 위상(우측). 긴장 상승율(kACT). 이완의 느린 위상(kREL , slow). 이완의 빠른 위상(kREL , fast). 느린 위상 지속(tREL , slow).
[0053] 도 34. 경색 이후 기능 상실을 보여주는, LV 기능의 심장 초음파 검진(A-C) 및 작동중인 심장(D) 측정
[0054] 도 35. 10초(A) 및 4분(B)에서 배양된 hESC 심근 세포 속으로의 표지된 dATP의 세포 주입. R1R2-과발현 심근 세포와의 공동 배양은 야생형(수령자) 근세포의 수축 특성을 증진시킨다(C). hESC-CMs에 AV-R1R2 또는 AV-GFP가 도입되었고, 이들 도입된 근 세포들은 야생형(WT), 형질 도입되지 않은 Hesc-cmS와 공동 배양되었다. AV-R1R2+GFP-transduced myocytes ("dATP 기증자(수여자) 세포" 청색 흔적) 및 형질 도입되지 않은 근세포(WT dATP 수령자, 적색)의 공동 배양의 두 파트너 모두, 그들의 상응하는 대조군, 즉 AV-GFP 형질되입된("대조군 기증자(수여자)" 세포 녹색) 또는 후자의 WT 수령자(흑색)보다 더 큰 수축성을 보여주었다. *p<0.05 vs 대조군.
[0055] 도 36. 도 36A는 AAV6-R1R2cTnT455 주입된(4.5 e13) 마우스 및 대조군 마우스의, 골격근, 폐 및 심장 내의 R1 및 R2 서브 유닛의 발현 레벨에 대한 예비적 웨스턴 블롯 증거를 보여준다. 도 36은 또한 20 개월 후의 주입되지 않은 마우스(B) vs. AAV6-알칼린 포스파타제(보라색; C) 주입된 마우스36로 부터 유래한 심장 조직에 대한 데이터를 제공하는데, 이는 AAV6-R1R2cTnT455가 안정된, 장기간의 R1R2 과발현을 제공함을 제시한다.
[0056] 도 37은 3개월령의 마우스(그룹당 n = 6) 속으로 대략 10배 범위에 걸쳐 전신으로 주입된, 1.5 e13, 4.5 e13, 1.35 e14 AAV6-R1R2cTnT455 벡터 게놈 또는 염수(대조군)의 LV 기능에 대한 영향을 나타낸다.
[0057] 도 38은 비처리된 경색된 마우스 및 비처리된 샴-조작된 마우스와 비교하여, 심장 초음파 검진에 의하여 측정된, 경색 후 3일째 되는 날, AAV6-R1R2을 심장에 직접 주입받은 래트 중의 단편적 수축의 변화를 보여준다.
[0058] 도 39는 도 38에서 측정된 래트 심장의 인 비트로 닐리(Neely) 워킹 심장 측정을 보여준다. y-축 상의 힘은 gㆍcm/분의 단위로 주어졌다. 경색된(비처리) 심장(심부전)의 프리로드 반응성의 손실 및 대조군, 경색되지 않은 심장의 레벨까지 벡터를 받은 경색된 심장의 프리로드 반응성의 회복을 관찰하였고, 그 결과 심장 기능의 회복을 나타내었다.
[0059] 도 40은 본 발명의 예시적 구현예에서 사용된 cTnT455 심장 특이적 프로모터의 핵산 서열을 제공한다.
I. 서론
[0060] 심부전을 위한 많은 현존하는 약학적 치료법은 세포 내 [Ca2 +] ([Ca2+]i) 를 표적으로 하는데, 이는 부정맥 발생(arrhythmogenesis) 또는 심장 확장 기능에 대한 부작용과 같은 심각한 부작용을 갖는다. 본 발명의 일 관점은 [Ca2 +]i에 독립적인 온전한 심근 세포 수축을 증진하기 위하여, 심장 가는 섬유(thin filaments)를 직접적으로 타겟으로 하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 단일 아미노산 치환(L48Q)에 의하여 수여되는, 증가된 Ca2 + 결합 친화도를 갖도록 설계된 심장 트로포닌 C(cTnC) 변이체의 아데노바이러스 매개된 과다 발현을 통하여, 심장 가는 섬유의 활성화가 증진되는 것이 본 명세서에 의하여 보여진다. 박피된 심장 섬유주(trabeculae) 및 근 섬유 중에서, 본 발명자들 및 다른 실험자들은, 천연의 cTnC에서 cTnC L48Q의 치환이 힘의 Ca2 + 민감도와 힘 발전의 최대 비율을 증진시킨다는 것을 보였다. 따라서, 일 구현예에서, 직접적으로 심장의 가는 섬유를 표적화하는 것에 의하여, 온전한 심장 수축을 증진시키는 방법이 제공된다.
[0061] 일 관점에서, 본 발명은 세포- 및 유전자 치료법을 결합하는 신규한 치료적 접근법을 제공하고, 예컨대 심부전 환자 중에서 심장 성능의 개선을 의도한다. 현존하는 심부전 치료법인 부족한 전체 기관 이식은, 일반적으로 세포 내 칼슘 신호의 약학적 조작을 통하여, 부작용 심실 리모델링을 약하게 하거나 또는 남아있는 심근 세포의 힘 발생을 증진하는 것을 목표로 한다. 전자의 접근법은 전형적으로 질병 발생의 초기 환자에게만 도움이 되는 반면에, 후자의 접근은 표적 벗어남 효과에 의한 부작용이 있다(예컨대, 증가되는 부정맥). 최근에, 심장 회복을 얻기 위한 대안적인 수단으로서 세포 이식에 대하여 괄목할 만한 관심이 있지만, 현재까지 그와 같은 노력은, 채택된 세포의 낮은 심장 잠재력 및/또는 형성된 이식 심근의 상대적으로 적은양에 의하여 제한되고 있다. 다분화성 인간 배아 줄기 세포(ESCs)로부터 유래한 심근 세포 또는 관련된 유도 만능 줄기 세포(iPSC)가 전임상 연구에서 괄목할 만한 가능성을 보였으며, 그들은 숙주 근육과 적어도 부분적으로 통합되는 인간 심근의 이식을 형성한다. 그러나, 여기서 다시 형성된 이식물이 일반적으로 꽤 소량이고, 현저한 심장 배출을 개선하기 위한 충분한 힘 발생 단위에 기여하지 못할 것이다.
[0062] 일 구현예에서, 본 발명은 이러한 단점들의 많은 부분을 극복할 수 있는 심부전에 대한 새로운 접근법을 제공한다. 본 명세서에서 보여지는 바와 같이, 상승된 2 디옥시-ATP (dATP)의 세포질 레벨의 증가는, 세포 내 칼슘에 있어서 섭동(perturbations) 없이 현저하게 증가하는 수축 특성을 야기하면서, 크로스브리지 결합 및 사이클링 동역학을 증가시킨다. 유전자 치료적 접근법을 사용하여, 그 생산에 있어 비율-제한적 효소인 리보뉴클레오타이드 리덕타제(RR)의 강제된 과발현에 의하여 부전된 심근 세포에서 dATP 농도를 증가시킬 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 좌심실(LV) 벽의 적은 영역에 국한된 감염(직접적인 바이러스 벡터 주입에 의함)은 LV 기능에 있어 실질적인 증가를 야기한다.
[0063] 다른 구현예에서, dATP가 용이하게 갭 결합을 통과하여 지나가고, 오직 적은 농도 (세포 아데닌 뉴클레오타이드 풀의 <1%)만이 증가된 힘을 위하여 요구되기 때문에, 본 발명은 RR을 과발현하도록 유전학적으로 수정되고 표적 숙주 심근과 갭 결합을 형성할 수 있는 제2의 세포 형을 이식하는 것에 의하여 부전된 심근에 dATP를 전달하는 방법을 제공한다. 그와 같은 유전적 변형에 대한 그들의 순종성, 엄청난 확장의 가능성 및 적절한 코넥신(connexin) 이소 형태를 발현하는 심장 내 안정한 이식물을 형성할 수 있는 능력으로 인하여, 인간 ESCs 또는 iPSCs으로부터 유래된 심근 세포는 이상적인 dATP 기증자를 대표한다. 예를 들어, 일 구현예에서, 심부전 환자로부터 얻어진 피부 섬유아세포는 iPSCs로 재프로그램되고, 그 다음 심장 특이적 프로모터가 RR의 발현을 이끌어내는 컨스트럭트를 삽입하는 것에 의하여 이를 변형시킨다. 일 구현예에서, 이 방법은 컨스트럭트를 삽입하기 위하여, 징크 핑거 뉴클레아제-매개된 트랜스제네시스(이는 게놈 내에 잘 특성화된 "세이프-하버(safe-harbor)" 장소를 표적화하는 것을 허용함)를 사용한다. 적절하게 표적화된 iPSC 클론의 스크리닝 및 확장 이후에, 이들 세포는 심근 세포로 분화되고, 그 다음 부전된 심장 속으로 이식된다(예컨대, 카테터 사용에 의함). 유익하게도, 이러한 전략은 큰 심장 이식의 형성 또는 경색 상흔의 적대적인 환경 내에 이식물을 이식하는 것을 필요로 하지 않는다. 대신에, 이식의 목적이 dATP를 전달하는 것이고, 힘을 생산하는 것이 아니기 때문에, 혈관이 잘 생성된 원경 심근 중으로의 완만한 이식으로 충분할 것이다. 이는 잠재성 있는 많은 접근법 중 단지 하나일 뿐이고, 본 발명의 범위를 결코 제한하는 것이 아니다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 다른 기증자 세포 형(예컨대, 중간엽 줄기 세포)이 또한 본 명세서에서 제공되는 방법에 사용될 수 있다. 유사하게, 특정 구현예에서, 트랜스제네시스를 위한 다른 방법들(에컨대, 트랜스포슨, 플라스미드 또는 바이러스 전달)이 사용될 수도 있다.
[0064] 다른 구현예에서, 본 발명은 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터 유도된 Rrm1 또는 Rrm2를 발현하는 아데노 바이러스 벡터를 제공한다. 일 구현예에서, 벡터는 형질 도입 리포터로서, 녹색 형광 단백질(GFP)를 더 인코딩한다. 배양된 성체 래트 심근세포에 이 벡터를 형질 도입하고, 48시간의 바이러스 배양 기간 후에 비디오 현미경에 의하여 근세포 수축 및 완화의 비율 및 범위와 Ca2+ 전이 상승 및 쇠퇴(Fura2 형광)를 모니터링하였다. 이러한 처리는, 0.5 Hz, 1 Hz 및 2 Hz 자극에서, Ca2+ 전이에 최소한의 영향만 가지면서, 세포 내 [dATP], 수축율과 범위 및 완화율을 현저하게 증가시키는 것으로 본 연구에서 나타났다. 이에 따라, 일 구현예에서, 본 발명은 액틴-마이오신 크로스브리지 사이클을 현저히 변화시킬 수 있는, 심장 세포 내 RR 및/또는 dATP 풀을 변화시키는 것에 의한 심실 기능을 손상시킴이 없이, 심장 수축성을 증진시키는 방법을 제공한다.
[0065] 다른 관점에서, 본 발명은 인 비보 수축성을 개선하기 위하여 뉴클레오타이드 조작의 첫 번째 사용을 제공한다. 수축 기질로서의 dATP의 사용은, 근섬유 화학-기계적 형질 도입을 연구하기 위한 방법으로서, 15년 전에 레그니에르(Regnier) 박사에 의하여 최초로 연구되었다. 그러나, 심근 세포 기능을 개선하기 위한 dATP의 적용은, Ca2+ 핸들링에 대한 영향, 대사적 경로 및 심장 질환 완화를 제한 없이 포함하는, 많은 새로은 연구 분야를 여는 잠재력을 갖는다. 또한, 최소한도로 침습적이고, 더 큰 동물 모델 및 인간에게까지 확장 될 수 있는 표적화된 전달 방법이 또한 제공된다.
[0066] dATP의 영향에 대한 초기 연구는 막이 제거된 골격 근에 대하여 수행되었는데, 이는 Ca2+ 민감도에 있어 현저한 증가를 야기하였지만, 최대 Ca2+ 활성화된 힘에 대해서는 아무런 변화를 야기하지 않았다. 심장 근육에 대한 후속 연구는 보다 더욱 드라마틱했는데, 여기서 dATP는 오직 힘의 Ca2+ 민감도를 증가시켰을 뿐만 아니라, 최대 Ca2+ 활성화된 힘의 크기 또한 ~40% 증가시켰다. 이러한 결과는, 근섬유 표적화된 접근법에 대한 심장 특이적으로 분화된 이점을 제공하면서, 심장 근육 세포 수축의 조절이 액토-마이오신 활성의 변화에 더 민감하다는 것을 제안하였다. 이에 따라, 본 발명자들은 심근 세포 중의 dATP 생산의 상향 조절을 추구하였다. 온전한 세포에 대한 도전 및 인 시투 연구는 증가된 수축을 생산하기에 충분한 세포 내 [dATP]를 증가시키기 위한 것이었다. 이러한 도전은 ADP를 dADP(그 다음, 포스포크레아틴 키나아제에 의하여 dATP로 신속하게 인산화됨)로 변환시키는 자연 발생 효소(리보뉴클레오타이드 리덕타제: R1R2)를 과발현 시키는 것에 의하여 극복되었다. 문헌(Schoffstall et al . (2006))에 따르면, 10% 정도로 적은 [dATP] (90% [ATP])가 막이 제거된 심장 조직의 수축 및 분리된 수축 단백질 23*을 증가시켰는데, 이는 dATP의 완만한 레벨이 온전한 심금 세포 중의 수축을 증가시킬 수 있다는 것을 제시하는 것이었다. 예상치 못하게, 현저하게 적은 dATP가 심근 세포 및 심장에 있어 기능적 잠재력을 위하여 필요하다는 것이 본 명세서에 의하여 밝혀진다.
II . 실험적 발견
A. L48Q cTnC 의 발현은 심장 수축성을 증진시킨다.
[0067] 세포 길이(CL) 및 Ca2 +(Fura2 전이)를 모니터링하기 위하여 비디오-현미경을 사용하여, L48Q cTnC(GFP와의 공동 발현으로 동정됨)의 발현이, 형질이 도입되지 않은 성체 래트 심근 세포와 비교하여, Ca2 + 전이를 변경시키지 아니하고, 수축의 비율 및 범위를 현저하게 증가시켰다(각각 33% 및 48%). 이러한 차이는 WT cTnC 형질 도입된 심근 세포와 비교할 때 더욱 더 드라마틱하였다. 중요하게는, 모든 다른 그룹과 비교하여, L48Q cTnC의 존재에 의하여 완화율은 영향받지 않았다. 가는 섬유 속으로 L48Q cTnC의 발현 및 통합은 형질 도입된 심근 세포로부터의 근 섬유에 대한 웨스턴 블롯에 의하여 확인하였는데, 이는 천연 cTnC의 ~58%가 L48Q cTnC에 의하여 화학양론적으로 치환되었음을 나타내었다.
[0068] 이 실험은, 손상된 이완을 변경시키지 않고, 심장 수축성을 증진시키가 위하여, 심장의 가는 섬유 단백질을 직접적으로 표적화하는 것의 실행 가능성을 나타낸다.
[0069] 이 연구의 하나의 목적은, L48Q cTnC가 온전한 심근 세포 중에서 발현되고 근 섬유 속으로 통합되어, 심근 세포 이완 또는 Ca2 + 전이 특성에 나쁜 영향을 주지 않고 수축성을 증가시킬 수 있는지를 결정하기 위한 것이었다. 실시예 1 내지 6에서 보여지는 바와 같아, 과발현 L48Q cTnC는 천연 cTnC 58 ±7%의 L48Q cTnC로의 치환을 야기하였고, 이는 Ca2+ 전이 특성에 뚜렷한 영향을 가지지 않으면서, 근 세포 완화율과 근 세포 수축율 및 범위를 드라마틱하게 증가시켰다. 본 발명자들은 42%의 낮은 치환 및 70%의 높은 치환을 관찰하였지만, 이들 통합 레벨 사이에 기능에 있어서 현저한 차이를 관찰하지 못하였다.
[0070] 박피된 심장 섬유주를 사용한 종전의 실험은, L48Q cTnC를 사용한 천연 cTnC의 수동적인 교환이, 힘 발전의 크기 및 비율과 포화 [Ca2 +] (pCa 4.0)를 빼고는 Ca2 + 활성화의 모든 레벨에서의 수축을 증가시키었다는 것을 보여주었지만, 이들 연구들은 근육 표본에서 천연 cTnC의 100% 치환에 의하여 수행되었다. 온전한 심근 세포를 사용한 현재 연구에서, 본 발명자들은 L48Q cTnC의 발현이 천연 cTnC의 100% 치환을 가져올 것이라고 기대하지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 기능 획득을 보기 위해서 천연 cTnC의 ~15-25% 치환에 접근하기 위하여 L48Q cTnC 레벨을 증가시킬 필요성을 예측하였는데, 이는 그것이 본 발명자들이 래빗 요근 섬유16 중에서 힘의 Ca2 + 민감도에 있어 현저한 증가를 관찰하기 위하여 필수적인 것으로 종전에 결정한 TnC (M80Q sTnCF27W)의 비율이었기 때문이었다. 본 발명자들이 이러한 최소량을 현저하게 능가하였다는 사실은 예측 불가능한 것이었고, 그것이 현저하게 증가된 기능을 얻기 위하여 필요한 바이러스의 양이 이 연구에서 적용된 것 보다 더 적을 수 있다는 것을 제시한다는 점에서 매우 흥미롭다. 렌티바이러스(lentivirus) 또는 AAV6와 같은 다른 바이러스 컨스트럭트를 사용한 덜 강건한 유전자 전달도 여전히 현저한 기능적 개선을 얻을 수 있을 것으로 보인다. 조직 염증과 같은 부정적인 부작용의 잠재성을 피하는 것이 바람직할 것이다. 장래의 연구는 현저한 기능적 개선을 생산하기 위하여 요구되는 L48Q cTnC의 최소량 및 이 최소량을 맞추기 위하여 요구되는 바이러스 입자의 로드가 얼마인지에 초점을 맞출 것이다. 추가적으로, 다른 cTnC 변이체가 Ca2 + 결합 친화도를 변경시키고, 힘의 Ca2 + 민감도 및 서브 최대 [Ca2 +]에서 힘 발전의 비율을 증가시키는 것으로 나타났는바17, 따라서, 다양한 병리학적 증상들을 위한 치료적 잠재력을 또한 가질 것이다.
[0071] 특히, 단백질18 또는 약학적19 ,20 수단을 통한 근섬유 Ca2 + 민감도가 변경된 작용 잠재적 행동 및 부정맥 발생의 증가된 위험을 야기하였다는 것이 다른 연구에서 밝혀졌다는 점을 고려할 때, Ca2 + 전이적 행동 (또는 autorythmicity)에 대한 현저한 영향이 없다는 점에서, 치료적 도구로서 L48Q cTnC에 대한 잠재력은 고무적이다. WT cTnC + GFP 형질 도입된 심근 세포 중에서 최소 및 최대 Ca2 +에 있어 적은 차이(1Hz에서 현저하게)의 관점에서 이는 예측할 수 없는 것이었다. 이러한 효과가 WT cTnC 또는 GFP로 인한 것인지 여부는 본 연구에서 특이적으로 연구되지 않았지만, 별개 연구로부터 얻은 결과는 성체 래트 심근 세포의 GFP만으로 감염이, 특히 더 높은 자극 주파수에서21, 최소 및 최대 Ca2 +를 현저하게 증가시킨다는 것을 보여주었다. 따라서, 이러한 효과는 주로 GFP로부터 기인한 것일 것이며, 이는 cTnC 과발현에 의하여 부분적으로 폐지될 것이다. 어느 한 경우에서, L48Q cTnC의 발현은 형질 도입되지 않은 심근 세포에서 차이가 없는 최소 및 최대 [Ca2 +] 를 야기하였다. 그러므로, L48Q cTnC 발현의 효과는 적게 평가된 것일 수 있다. 만일 그렇다면, GFP 부재 하에서 L48Q cTnC 발현은 1) 증가된 완화를 이끌면서 낮은 최소 [Ca2 +], 및 2) 낮은 최대 [Ca2 +]를 의도할 것이다. 이는 주어진 Ca2 + 방출 양에 대하여, 수축에 의한 수축 효율의 수단을 더욱 증가시킬 것이다. 흥미롭게도 문헌(Lim et al.)은 특발병 확장성 심근증(idiopathic dilated cardiomyopathy)과 관련된 변이된 TnC(E59D, D75Y)를 과발현하는 성체 래트 심근 세포가 세포 내 Ca2 + 항상성22에 대하여 아무런 영향을 가지지 않으면서 수축성을 감소시킨다는 것을 보여주었는데, 이는 Ca2 + 전이 행동에 영향을 주지 않고, 가는 섬유 Ca2+ 결합 친화도를 조작하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
[0072] L48Q cTnC 변이체 사용의 명백한 이점은, 수축이 개선되는 동안에 근세포 이완은 영향받지 않고, 더 높은 자극 주파수에서는 심지어 향상된다는 점이다. 증가된 Ca2 + 결합이 연장된 가는-섬유 활성화를 야기할 수 있고, 따라서 완화를 방해하는 연장된 크로스 브리지 부착을 야기할 수 있다는 것이 밝혀졌다23. 연장하는 수축기 및 늦어지는 확장기 이완은, 확장기 채움 및 그 결과 심장 배출을 감소시키면서, 심각한 인 비보 기능적 결과를 가질 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 심장 근섬유 이완율이 L48Q cTnC의 100% 교환 (WT cTnC 교환과 비교하여) 이후에 약간 증가되었다는 것을 보고하였다. 이는 크로스 브리지 박리9에 의존적인 것으로 여겨지는 느린 위상의 약간 연장된 기간으로 인한 것이었다. 그러나, 이 연구는 정적 조건하에서 수행된 것인 반면에, 본 연구에서 온전한 근 세포는 자유롭게 수축하는 것이 허용되었다. 이러한 조건 하에서, 완화율은 또한 티틴(titin)에 의하여 공급되는 회복 힘에 의하여 영향받을 수 있는데, 이는 근절이 수축됨에 따라 선형의 방식으로 증가한다24. 본 연구에서 관찰된 완화율은 세포 기능적 수축과 대략 상응한다. 또한 이는, L48Q cTnC와의 이완율이 증가된 수축과 함께 기대된 것과 같이 빨랐기 때문에, L48Q cTnC가 크로스 브리지 부착을 연장하고 있지 않다는 것을 나타내는 것으로 보인다. 내생적 cTnC의 L48Q cTnC로의 42-70% 치환이 완화에 영향을 주지 않고 개선된 수축을 위하여 충분한 반면에, 더 큰 치환은 완화에 부작용을 미치기 시작할 수 있다는 것이 또한 가능하다. 또한, 완화에 대한 L48Q cTnC 의 그 어떠한 효과도 온전한 심근 중에서 발생하는 서브 최대 [Ca2 +] 레벨에서 감소되거나 제거될 수 있으며, 효과는 또한 인 비보 중에서 마주칠 수 있는 것들과 같은 로드 조건(스트레인) 하에서 달라질 수 있다.
[0073] 결론적으로, 이들 실험들은 심장 확장 기능 또는 Ca2 + 전이 행동을 변경함이 없이 심장 수축성을 증진시키기 위하여, 심장의 가는 섬유 단백질을 직접적으로 표적화하는 것의 잠재력을 기술한다. 일 관점에서, 상기에서 개요된 전략은 기능적으로 부족하거나 질병이 있는 심근으로부터 심근 세포를 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
B. 외인성 RR 복합체의 발현은 심장 수축성을 증진시킨다.
[0074] 본 명세서에서, R1 및 R2를 과발현하는 아데노 바이러스 벡터(AV-R1R2)의 마우스 꼬리 정맥 주입 또는 직접적인 심장 주입은 3-4일 이내에 죄측 심실(LV) 단편적 수축 및 배출 단편(도 27)을 현저하게 증가(40-50%) 시키는 것으로 밝혀진다. 흥미롭게도, R1R2를 과다 발현하는 3개월령의 트랜스제닉 마우스의 심장 초음파 검진은, 현저한 심장 병리 없이, WT 한배 새끼들과 비교하여 유사한 LV 기능적 잠재력을 보여주었는데, 이는 이러한 접근법의 관용성을 제시한다. 이러한 잠재력은 일차적 혈류역학(Millar) 및 랑겐도르프 분산된 심장 실험에 의하여 추가로 뒷받침되었다. 중요하게는 일차적 NMR 측정은, 심지어 높은 [Ca2+] 또는 도부타민(Dobutamine) 도전이 있는 경우에도, 증가된 성능이 에너지적 보존의 비용에서 온 것이 아니라는 것을 제안한다. 마지막으로 dATP는 마우스 대동맥 평활근의 수축성을 변화시키지 않았는데(ATP와 비교하여) (도 30), 이는 혈관 톤(tone)의 변경이 혈류역학 파라미터에 있어 그 어떠한 잠재적인 변화의 기초가 되지 않을 것임을 제시한다.
[0075] 비디오 현미경에 의하여 세포 길이 및 비율 척도(fura2) Ca2+ 형광을 관찰하였다. 0.5 Hz 자극에서, 비처리 심근 세포와 비교하여 Rrm1+Rrm2를 과발현하는 심근 세포 중에서, 수축 범위는 ~40%로 증가되었고, 최대 수축율은 ~80%로 증가되었다. 최대 이완율 또한 비처리된 심근 세포 보다 50% 이완까지의 시간의 감소를 야기하면서, Rrm1+Rrm2 (+GFP) 과다 발현과 함께 ~150% 증가하였다. 이러한 차이는 GFP 만이 형질 도입된 심근 세포와 비교할 때, 더욱 더 드라마틱하였다. 흥미롭게도, Rrm1+Rrm2 과다 발현은 최소 또는 최대 세포 내 [Ca2+] (Fura2 fluorescence)에 아무런 영향을 갖지 않았는데, 이는 증가된 수축성이 근소포체(sarcoplasmic reticulum)로부터의 Ca2+ 방출을 변경시키지 않고, 주로 증가된 근섬유 활성에서 기인한 것이라는 것을 나타낸다. 또한, 기능적 잠재력은 자극 주파수가 증가됨에 따라(1 Hz 및 2 Hz), Rrm1+Rrm2 과발현과 함께 유지되었다. HPLC 분석은 세포 내 [dATP]가 감염 후에 아데닌 뉴클레오타이드 풀의 1% 보다 약간 높으면서, 대략 10-배 증가되었음을 나타내었다.
[0076] 본 실험들은 최소 및 최대 Ca2 +.에 영향을 미치지 않고, 심장 수축성 및 이완을 증진시키기 위하여, 액틴-마이오신 크로스브리지를 직접적으로 표적화하는 것의 실행 가능성을 나타낸다.
[0077] 본 연구의 하나의 목적은 리보뉴클레오타이드 리덕타제(Rrm1+Rrm2)의 과발현이 세포 내 [dATP]를 증가시키어, 그 결과 심근 세포 이완에 부정적인 영향 없이 온전한 심근 세포 중에서 수축성을 증가시키는지를 결정하는 것이었다. Rrm1+Rrm2의 과발현은 총 아데닌 뉴클레오타이드 풀의 ~1.0-1.5% 까지 증가된 세포 내 [dATP]를 야기하였는데, 이는 Ca2 + 전이 특성에 그 어떠한 명백한 효과도 갖지 아니하면서, 근 세포 수축의 범위 및 비율과 근 세포 이완의 비율을 드라마틱하게 증가시켰다.
[0078] 박피된 심장 섬유주를 사용한 종전의 연구는 dATP가 포화 [Ca2 +] (pCa 4.0)를 포함하는 Ca2 + 활성화의 모든 레벨에서, 정적 수축힘과 힘 발전 및 수축의 비율을 증가시켰음을 보였지만, 이들 연구는 욕조 용액 중의 5 mM dATP로 5 mM ATP를 100% 치환하여 수행된 것이었다 7 ,8,20 . 온전한 심근 세포에 대한 현재 연구에 대하여, Rrm1+Rrm2 과발현은 dATP의 높은 (mM) 레벨을 야기할 것으로 기대되지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 기능의 획득을 보기 위해서는 dATP의 레벨을 [ATP]의 ~10%에 접근하도록 증가시킬 필요성을 예상하였는데, 이는 그것이 막을 제거한 심근에서 기능적 차이를 보기 위하여 필요한 dATP 대 ATP의 비율이었기 때문이다 21 . 사실, 닭 배아 심근 세포에 대한 종전 연구는 ATP의 ~1/3의 dATP로의 치환이 현저한 수축 증진을 얻기 위하여 필요할 수 있다는 것을 제시하였다 2 2 . 놀랍게도, 수축성에 대하여 관찰된 큰 증가는 심근 세포 [dATP] 중의 상대적으로 적은 증가와 함께 발생하였다. 이는 현저하게 증가된 기능을 얻기 위하여 요구되는 바이러스의 양이 본 연구에 적용된 것 보다 더 적을 수 있다는 것을 제시한다. 이것의 이점은 더 적은 Rrm1+Rrm2의 발현이 부정적인 부작용에 대한 잠재력을 감소시킬 수 있다는 것이다 2 2 ,23 . 더 쉽게 감염되지 않거나 또는 더 적은 Rrm1+Rrm2를 과발현하는 오염된 세포(예컨대 섬유 아세포)의 적은 군집이 있을 가능성이 있는데, 이는 HPLC 분석으로부터 심근 세포 [dATP] 의 과소 평가를 야기하였을 것이다. 그러나, 심근 세포가 아닌 세포가 배양 내에 상대적으로 희귀하다는 것을 고려할 때, 이러한 혼란 효과는 최소화 되어야 한다.
[0079] 이론에 의하여 묶이지 않고, 총 dATP의 상대적으로 적은 양이 어떻게 심근 세포 기능에 그와 같이 드라마틱한 효과를 가질 수 있는지를 고찰하는 것은 흥미롭다. 수축 효율 평가(도 9)는 Rrm1+Rrm2 형질 도입된 근 세포 중의 증가된 수축성이 주로 근섬유 기반이고, 따라서 dATP는 크로스 브리지 사이클링을 개선하는 것에 의하여 주로 그 효과를 가질 것으로 보인다. 이는 Ca2 + 전이 진폭에 영향을 미치지 않고 기능적 잠재력을 야기하면서, 더 빠른 (알파) 미오신이 더 느린 (베타) 미오신을 정상적으로 발현하는 심근 세포 중에서 발현되었던 실험과 유사하다. ATP와 비교하여 농도는 여전히 오직 ~1% 이었으므로, 이 연구 중에서 발생한 증가된 [dATP] 와 함께 증가된 근섬유 뒤에 있는 기전은 당혹스럽다.
[0080] 골격 미오신을 사용한 연구에서, 본 발명자들은 미오신에 의한 γ-포스페이트 절단 평형이 ATP 및 dATP에 대한 것과 유사하지만, 가수분해 후 크로스 브리지 결합 및 크로스 브리지 탈착의 비율은 dATP와 함께 증가한다는 것을 밝혀내었다 24 . 이는 장력 발전의 Ca2 + 민감도에서의 증가와, 박피된 골격근에서의 장력 발전 및 수축 속도의 더 빠른 비율을 설명할 수 있다 24 -26 . 본 발명자들이 심장 근육에서 dATP를 사용하여 상세한 화학-기계적 분석을 수행하지는 않았지만, 본 발병자들은 증가하는 k tr 및 언로드된 속도에 더하여, 그것이 최대 크로스 브리지 결합(강도 측정으로부터 지시된 바와 같은) 및 정적 수축 힘을 >40%로 증가시킨다는 것을 보였다 20 . 또한 본 발명자들은 모든 Ca2 +,레벨에서의 심장 근육 중의 dATP 현저한 정적 수축 힘 및 k tr 를 보였고, 막이 제거된 심장 근육이 주로 α- 또는 β-미노신 중쇄를 발현하였는지를 보였다 8 . 골격 근과는 달리, 심장 근육 경련 중에 세포 내 [Ca2 +] 는 오직 대략 절반-최대로 활성화된 범위 내인 레벨에 도달하기 때문에, 이는 중요하다. 배양된 심근 세포를 사용한 현재 실험에 대하여, dADP.Pi를 함유하는 미오신 S1 헤드 결합의 적은 증가가, 증가된 수축의 크기 및 비율을 야기하면서, 가는 섬유 활성화를 협조하여 증가시키기에 충분할 수 있다.
[0081] Rrm1+Rrm2의 과발현(및 뒤이은 [dATP]에서의 증가)과 함께 이완에 대한 부작용이 없었고, 사실상 근세포 이완은 증진되었다. 이는 적어도 부분적으로라도 Ca2 + 전이의 더 빠른 쇠퇴에서 비롯된 것일 가능성이 있다. dATP는 근소포체 Ca2 + ATPase (SERCA), 세포막 Ca2 + ATPase (PMCA) 및 나트륨/칼슘 교환자 (NCX)와 같은 다른 ATPase들(미오신 이외에)에 의하여 사용될 수도 있었다. SERCA 활성에서의 증가는, 특히 0.5 및 1.0 Hz 자극에서 Ca2 + 전이 비율의 증가된 쇠퇴를 설명할 수 있었다. 그러나, 증가된 SERCA 활성은 활성화 동안 방출에 대하여 더 많은 Ca2 +를 이용가능하게 만들면서, SR Ca2 + 저장을 증가시키는 것으로 알려져 있는데 27 , 이는 Rrm1+Rrm2 형질 도입된 심근 세포에서는 관찰되지 않았다(도 6d). 게다가 증가된 PMCA 및 NCX 활성은, 세포 밖으로 Ca2 + 를 배출함에 의하여 시간에 걸쳐 Ca2 + 전이 쇠퇴를 야기하여야 한다. 활성화된 Ca2 +의 ~95%가 래트의 심근 세포 중의 SR로부터 방출되기 때문에 28 ,29 , 세포로부터의 Ca2 + 방출은 진행적으로 감소하는 Ca2+ 전이 진폭 및 수축을 야기할 것인데, 이는 본 실험의 기간에 걸쳐 관찰되지 않았다. 그러나, 증가된 Ca2 + 전이 쇠퇴율의 뒤의 특이적 기전은 추가의 조사를 보증한다.
[0082] dATP가 크로스 브리지 탈착을 증가시키기 때문에 20 ,25 , 이는 또한 배양된 심근 세포를 사용한 현재의 실험에서 더 빠른 이완율을 설명할 수도 있다. 온전한 심장 근육 중에서 이완을 지배하는 특이적인 기전이 비록 알려져 있지는 않지만, 심장 및 골격 근 섬유 중에서 이완의 초기 위상은 크로스 브리지 해리의 비율에 의하여 통제되는 것으로 나타났다 30 -33 . 또한 이것은, 로드되지 않은 세포(배양에서와 같은) 중의 수축율이 주로 크로스 브리지 분리율에 의하여 주로 결정되기 때문에 34 ,35 . , 심근 세포 수축성이 Rrm1+Rrm2와 함께 증가한다는 본 발명의 발견과 일치할 것이다. 이완 동안에 가는 섬유 Ca2 + 결합이 감소됨에 따라 결합 크로스 브리지 군집을 더욱 신속하게 감소시키는 것에 의하여, dATP와 함께 증가된 크로스 브리지 분리율은 가는 섬유의 협동적인 불활성화를 가속화하는 것 또한 가능하다.
[0083] 이에 따라, 본 발명의 하나의 관점에서, Ca2 + 전이 특성을 거의 변화시키지 않고, dATP가 양성적인 근육 수축(inotropy) 및 근육 완화(lusitropy)의 이중 이점을 제공하여, 현재 약학적 치료적 접근법에 대한 대안으로서의 잠재성을 제공하는 방법이 제공된다.
[0084] 본 발명이 더 기술되기에 앞서, 특정 구현예의 변형이 만들어질 수 있고 여전히 부수된 청구항의 범위에 속하기 때문에, 본 발명은 아래에서 기술된 발명의 특정 구현예에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 채택된 용어들은 특정 구현예를 기술할 목적을 갖는 것이고, 제한을 의도한 것이 아니라는 것이 이해될 것이다. 대신에, 본 발명의 범위는 부수된 청구항에 의하여 확립될 것이다. 본 명세서 및 부수된 청구항에서, 단일 형태 하나("a," "an" 및 "the")는 문맥에서 명확히 다르게 지시하지 않은 한 복수 언급을 포함하는 것이다.
[0085] 값의 범위가 제공되는 곳에서, 각각의 사이 값은 그 범위의 상한 및 하한의 사이에서, 문맥에서 명확히 다르게 지시하지 않은 한, 하한 단위의 10번째까지, 그리고 다르게 언급된 또는 언급된 범위 중의 사이 값은 본 발명에 의하여 포섭된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 적은 범위 내에 포함되고, 또한 본 발명에 의하여 포섭되며, 언급된 범위 내에서 특별히 배척된 범위에 속한다. 언급된 범위가 제한의 하나 또는 둘을 포함하는 곳에서, 포함된 범위의 어느 하나 또는 둘을 배척하는 범위 또한 본 발명에 포함된다.
[0086] 달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 바와 유사한 또는 동등한 그 어떠한 방법, 장치 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있다고 하더라도, 바람직한 방법, 장치 및 물질은 지금 기술된다.
III . 약어
[0087] cTnC 심장 트로포닌 C(cardiac troponin C)
[0088] cTnT 심장 트로포닌 T(cardiac troponin T)
[0089] k off 칼슘 해리율
[0090] NRC 신생아 래트 심근 세포
[0091] ARC 성체 래트 심근 세포
[0092] GFP 녹색 형광 단백질
[0093] RT50, RT90 50% 및 90% 이완까지 시간
[0094] DT50, DT90 50% 및 90% Ca2 + 쇠퇴까지 시간
[0095] WT 야생형
[0096] Rrm1 또는 R1 근육 리보뉴클레오타이드 리덕타제 1
[0097] Rrm2 또는 R1 근육 리보뉴클레오타이드 리덕타제 2
IV . 정의
[0098] 본 발명의 문맥에서 "심장 기능"은 일 이상의 측정가능한 파라미터에 의하여 반영되는 심장의 기능을 의미하는데, 예컨대 심근 수축성, 단편적 수축에서의 변화, 최대 수축율, 심근 이완, 심근 최대 이완율, 이완 시간, Ca2 + 전이에 대한 효과, 심장 속도, 종말- 수축압, 종말-확장압, 종말-수축 부피, 종말-확장 부피, 심장 배출, 스트로크 워크, 스트로크 부피, 심장 인덱스 등이 있다. 상기 파라미터들은 혈동역학 및/또는 심장 초음파 검진저거 측정 및/또는 당업계에서 숙련된 자에게 알려진 다른 방법들에 의하여 측정될 수 있다. 심장 기능에 있어 개선이 발생하는지 여부는 개별 기초에 의하여 측정된다. 예를 들어, 양성적인 근육 수축 효과를 필요로 하는 개체에 대하여, 심근 수축성의 개선은 심근 수축성의 증가를 암시한다. 대안적으로는, 양성적인 심장 이완 효과를 필요로 하는 개체에 대하여, 심근 이완의 개선은 예컨대 증가된 이완율에 의하여 반영되는 것과 같은 심근 이완에서의 증가를 의미한다.
[0099] 본 명세서에서 용어 "심장 수축(Inotropy)"과 교환적으로 사용되는 "심근 수축성"은 혈액이 심장으로부터 배출되는 심실의 수축의 힘을 일컫는다. 심근 수축성의 개선은 1 이상의 측정 가능한 심장 수축 파라미터를 사용하여 개별적 기반에 의하여 측정된다. 양성적인 심장 수축 효과를 필요로 하는 개체 또는 환자에 대하여, 심근 수축성의 개선은 심장 초음파 검진의 사용에 의하여 측정되는 바와 같은 심근 수축성에서의 증가를 수반한다. 음성적인 심장 수축 효과를 필요로 하는 개체에 대하여, 심장 수축성의 개선은 심장 수축성에 있어 감소를 수반한다. 심장 수축을 측정할 수 있는 파라미터의 예로는 OP/Ot, 퍼센트 비대(percent thickening), 퍼센트 수축(percent shortening), 단편적 수축(fractional shortening) 및 배출 단편(ejection fraction)이 포함된다.
[0100] 본 명세서에서 용어 "심장 이완(Rusitropy)와 교환적으로 사용되는 "심근 이완"은 흥분 수축 커플링 이후에 이완할 수 있는 심장의 능력을 일컫는다. 심근 이완의 개선은 1 이상의 측정 가능한 심장 이완 파라미터를 사용하여 개체에 근거하여 측정된다. 양성적인 심장 이완 효과를 필요로 하는 개체 또는 환자에 대하여, 심근 이완의 개선은 이완율에서의 증가를 수반한다. 음성적인 심장 이완 효과를 필요로 하는 개체 또는 환자에 대하여, 심근 수축력의 개선이란 이완율의 감소를 수반한다. 측정 가능한 심장 이완 파라미터의 예로는 압력 센서 측정으로부터 측정되는 바와 같은 확장기 동안의 압력 감소율(-dP/dtmin), 힘 센서 측정으로부터 측정되는 바와 같은 힘/스트레인 감소율(-dF/dt) 및 심장 임피던스 측정 또는 탐지된 심장 소리로부터 측정되는 바와 같은 등용성 이완 시간(IVRT)이 포함된다. 예를 들어 측정 장치는 심장 완화가 손상되었는지를 측정하기 위하여, 심장 이완 파라미터를 특정 임계치와 비교하도록 프로그램화 될 수 있으며, 반응 중인 심장에 교감 자극을 전달하는 신경 자극 회로망을 작동하도록 프로그램화 될 수 있다.
[0101] 본 명세서에 사용되는 용어 "이식"은 대상체 속으로 세포를 위치시키는 것을 의미한다. 세포는 자가 유래(즉, 치료받고자 하는 대상체로부터의 것), 동종 유래(즉, 일란성 쌍둥이와 같이, 유전적으로는 동일하나 상이한 개체로부터의 것), 동종 이계 유래(즉, 동종의 유전적으로 동일하지 않은 구성원으로부터 유래) 및/또는 이종 유래(즉, 다른 종의 구성원으로부터 유래)일 수 있다. 세포는 기증자(살아있거나 또는 사망한 것)로부터 취득될 수 있으며 또는 확립된 세포주로부터 유래된 것일 수 있다. 세포를 기증자(예컨대, 생 스캐폴드 이식의 잠재적 수령자)로부터 세포를 취득하기 위하여, 당업계에 알려진 표준 생검 기술이 채택될 수 있다. 대표적인 기술은 예를 들어 미국 특허 제6,536,567호에 기술되어 있다.
[0102] 용어 "처치", "치료" 및 "완화"는 증상의 심각성, 아밀로이드 축적량의 감소 또는 인지적 기능의 개선을 언급한다. 본 명세서에서 사용되는 "치료" 및 "예방"은 절대적인 용어로서 의도된 것이 아니다. 치료는 그 어떠한 발병의 지연, 증상의 완화, 환자 생존의 개선, 생존 시간 또는 생존율의 증가 등을 의미한다. 치료의 효과는 치료를 받지 않은 개인의 개별 개체 또는 풀과 비교될 수 있다.
[0103] "심근 세포"는 심장 수축 세포를 의미하는데, 이는 심장 근육의 세포이다. 심근 세포는 분리되고 인 비트로 또는 숙주 심근의 일부로서 배양될 수 있다.
[0104] 용어 "배아 줄기 세포"(ES cells)는 세포주로서 일련으로 계대 배양된 배반포 또는 상실배의 내부 세포 덩어리로부터 유래한 세포를 일컫는다. ES 세포는 정자 또는 DNA, 핵 전달, 처녀 생식 또는 MHC 영역 중에 동형 접합성을 갖는 hES 세포를 발생시키는 수단에 의하여 난자를 수정한 것으로부터 유래될 수 있다. 용어 "인간 배아 줄기 세포"(hES cells)는 세포주로서 일련으로 계대 배양된 인간 배반포 또는 상실배의 내부 세포 덩어리로부터 유래한 세포를 일컫는다. hES 세포는 정자 또는 DNA, 핵 전달, 처녀 생식 또는 HLA 영역 중에 동형 접합성을 갖는 hES 세포를 발생시키는 수단에 의하여 난자를 수정한 것으로부터 유래될 수 있다.
[0105] 본 명세서에 사용되는 용어 "유도 만능 줄기 세포" 또는 "iPSC"는, 리프로그래밍 인자들 단독의 강제된 발현의 임의의 조합, 또는 1 이상의 재프로그래밍 제제와의 조합에 의하여 출생 후 체세포(postnatal somatic cell)로부터 유래된 만능 줄기 세포를 의미한다.
[0106] 본 명세서에서 사용되는 용어 "중간엽 줄기 세포"는 다양한 간엽성 계통 내 분화된 세포, 특히 골아세포, 지방세포, 근아세포 및 조연골 세포로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 일반적으로, 중간엽 줄기 세포는 다음의 특성 중 1 이상을 또한 갖는다: 비동기(asynchronous) 또는 대칭적 복제를 일으킬 수 있는 능력, 즉 여기서 분열 이후 2개의 딸 세포가 다른 표현형으로 분화할 수 있음; 강한 자가-재생 능력; 및 그들이 존재한 조직, 예컨대 골수의 비-조혈성 세포의 클론 재생.
[0107] 본 명세서에서 사용되는 용어 "환자", "숙주" 및 "개체"는 진단 또는 치료가 요구되는 임의의 포유 동물 대상체를 의미하는데, 예컨대 인간 및 침팬지와 같은 영장류 종; 소, 개, 고양이, 기니아 피그, 래빗, 래트, 마우스, 말 등이 있다. 바람직한 구현예에서, 종은 인간이다. 특정 관심은, 리보뉴클레오타이드 리덕타제(즉, R1, R2)의 두 서브 유닛을 모두 발현하는 세포(예컨대, 심근 세포, 섬유 아세포 등)를 이식함에 의하여, 치료에 유순한(예컨대, 질환과 관련된 증상을 완화시키는), 심근 관련 질환을 가진 대상체이다. 많은 구현예에서, 숙주는 인간이다.
[0108] 본 발명의 문맥에서 사용되는 용어 "기증자 세포"는 숙주 심근으로 이식된 때에 숙주의 심근 세포와 갭 결합을 형성하거나 확립할 수 있는 능력을 갖는, 포유류 근원, 예컨대 인간 및 침팬지와 같은 영장류 종; 소, 개, 고양이, 기니아 피그, 래빗, 래트, 마우스, 말 등으로부터 유래한 세포를 일컫는다. 기증자 세포의 예로는, 섬유 아세포 및 심근 세포를 제한없이 포함한다. 기증자 세포는 자가 유래(즉, 치료받고자 하는 숙주로부터의 것), 동종 유래(즉, 일란성 쌍둥이와 같이, 유전적으로는 동일하나 상이한 대상체로부터의 것), 동종 이계 유래(즉, 동종의 유전적으로 동일하지 않은 구성원으로부터 유래) 및/또는 이종 유래(즉, 다른 종의 구성원으로부터 유래)일 수 있다. 세포는 기증자 세포(살아있거나 죽은)로부터 얻을 수 있거나 또는 확립된 세포주로부터 유래될 수도 있다. 기증자로부터 세포를 얻기 위하여, 당업계에 알려진 표준 생검 기술이 채택될 수 있다.
[0109] 용어 "발현 벡터" 또는 "벡터"는 형질 도입, 형질 전환 또는 숙주 미생물을 감염시키어 그에 따라 세포가 세포에 천연의 것이 아닌 핵산 및/또는 단백질을 발현 또는 세포에 대하여 천연이 아닌 방식으로 발현하도록 하는 화합물 및/또는 조성물을 의미한다. "발현 벡터"는 숙주 미생물에 의하여 발현되고자 하는 핵산(본래 RNA 또는 DNA)의 서열을 포함한다. 선택적으로는 발현 벡터는 핵산의 숙주 미생물로의 도입을 취득하는 것을 돕는 물질을 또한 포함하는데, 예컨대 바이러스, 리포좀, 단백질 코팅 등이 있다. 본 발명에 사용되도록 의도된 발현 벡터는 임의의 바람직한 또는 요구되는 작동 요소와 함께, 핵산 서열이 삽입되는 부분을 포함한다. 추가적으로, 발현 벡터는 숙주 미생물 속으로 이전되어 그곳에서 복제할 수 있는 것이어야만 한다. 바람직한 발현 벡터는 플라스미드, 특히 잘 문서화된 제한 영역을 가지고, 핵산 서열의 전사를 위하여 바람직하거나 요구되는 작동 요소를 포함하는 것들이다. 다른 발현 벡터뿐만 아니라, 그와 같은 플라스미드는 당업계에서 통상의 지식을 가진자에게 잘 알려져 있다. 몇몇 구현예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예컨대 AAV(adeno-associated viral) 벡터이다.
[0110] 본 명세서에서 사용되는 용어 "AAV(adeno-associated viral) 벡터"는 야생형 및 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터를 포괄하는데, 이는 바이러스 복제를 위하여 헬퍼 바이러스로의 감염을 필요로 하는 약 4.6 내지 4.8 kb의 선형의 단일 가닥 게놈을 포함하는 비병원균성이고, 포장되지 않은(nonenveloped) DNA 바이러스이다. 본 발명에 유용한 AAV(adeno-associated viral) 벡터의 예로는 AAV6, AAV2, rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/3, rAAV2/4, rAAV2/5, rAAV2/6, rAAV2/7 rAAV2/8, rAAV2/9, rAAV2/10, rAAVM41, dsAAV 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. AAV 벡터 및 유전자 전달 응용에 있어 그들의 사용은 다음의 문헌(Pacak et al. (2011) Molecular Therapy 19(9): 1582-1590; Hansruedi Biieler, Biol. Chem. (June 1999) 380:612 622; Robbins et al., TIBTECH (January 1998) 16:35 40; 및 Patjin & Kay, Semin. Liver. Dis. (1999) 19: 61 69)에 잘 검토되어 있다. 다른 관심대상 문헌들(Burton, et al., Proc Natl Acad Sci USA (1999) 96: 12725 12730; Fan, et al., Hum. Gene Ther. (1998) 9: 2527 2535; Miao et al., Nat. Genet. (May 1998) 19: 13 15; Nakai et al., J. Virol. (July 1999) 73: 5438 5447; 및 Rendahl, et al., Nat Biotechnol (1998) 16, 757 761; Gregorevic et al. (2004) AAV 벡터를 사용한 가로무늬근으로의 유전자 전신 전달. Nature Med 10:828-834; Blankinship et al. (2004) 아데노 관련 바이러스 세로타입 6에 기반한 벡터를 사용한 골격근의 효과적인 형질 도입. Mol Ther 10:671-678; Blankinship et al (2006) 재조합 AAV 벡터를 사용한 듀첸 근육 영향 실조 장애를 위한 유전자 치료 전략. Mol Ther 13:241-249. 및 Salva et al. (2007) 골격근 및 심장근에서의 고레벨 rAAV-매개된 발현을 위한 조직 특이적 조절 카세트의 디자인. Mol Ther 15:320-329)도 포함된다.
[0111] 예시로서, AAV6에 기반한 유전자 치료 벡터는, 아데노 관련 바이러스(AAV) 역 말단 반복(ITR)의 2개의 복제 사이에, DNA 발현 카세트(예컨대, 폴리 아데닐화 서열과 같은 전사 종료 신호가 뒤따르는, 치료적 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 상보적 DNA(cDNA) 서열과 연결된 프로모터/인헨서 조절 유전자 발현; 몇몇 경우에서, cDNA 및 프로모터는 인트론에 의하여 분리됨)를 클로닝하는 것에 의하여 발생될 수 있다. 이러한 ITR-발현 카세트-ITR 게놈은 재조합 AAV (rAAV) 게놈으로서 언급된다. AAV ITR 서열은 재조합 AAV 입자 속으로의 단백질막으로 둘러쌈(encapsidation)을 위한 포장 신호를 제공한다. ITR은 또한 재조합 AAV 게놈의 다수 카피를 생산하기 위한 레플리케이션 오리진을 제공한다. 그 다음, DNA를 함유하는 이러한 재조합 게놈은, 추가적인 아데노 바이러스 헬퍼 기능뿐만 아니라 야생형 AAV 게놈으로부터 유래한 Rep/Cap 유전자를 함유하는 플라스미드와 함께, 다양한 아데노 바이러스 헬퍼 단백질을 발현하는 포장 세포주(흔히 HEK293 세포) 속으로 공동 감염될 수 있다. AAV는 자체적으로 복제하지 않고, 트랜스 중에 중요한 헬퍼 기능을 제공하는 아데노 바이러스와 같은 제2의 바이러스와의 공동 감염을 필요로 한다. AAV ITRs는 다수의 다양한 야생형 AAVs의 세포타입(serotype)으로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 흔히 사용되는 ITRs는 AAV 세포타입 2로부터 유래한다. 재조합 AAV6 벡터(rAAV6)를 발생시킬 때, AAV 세포타입 6로부터 유래한 캡을 공동 감염 단계에 사용한다. 따라서, "AAV6"는 AAV2 ITRs 측면(flanking) 발현 벡터를 운반하는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터이고, AAV 캡시드 단백질에 의하여 싸여있다.
[0112] 용어 "프로모터"는 재조합 세포 중에서 전사를 이끌기 위하여 충분한 최소 서열을 의미한다. 또한 "프로모터"는 세포형 특이적, 조직-특이적 통제가능한 또는 외부 신호 또는 제제에 의하여 유도가능한, 프로모터-의존성 유전자 발현을 위하여 충분한 요소들을 포괄한다: 이와 같은 요소는 천연 유전자(예컨대, 인헨서 요소)의 5' 또는 3' 영역에 위치하는 것일 수 있다. 프로모터의 예로는 CK7 프로모터 및 CMV 프로모터를 제한 없이 포함한다.
[0113] 본 발명의 문맥에 사용되는 용어 "심장 특이적 프로모터"는 심장 세포 내 통제 하에서 유전자의 발현을 선택적으로 이끌어 내는 야생형 또는 재조합 프로모터를 의미한다. 심장 특이적 프로모터의 예로는, 본 명세서에 기술된 α-MHC5 .5 프로모터, α-MHC86 프로모터, 인간 심장 액틴 프로모터, 및 cTnT455 프로모터를 포함한다.
[0114] "작동가능하게 연결" 또는 "작동되게 연결"은 적절한 분자(예컨대 전사 활성화 단백질)이 조절 서열에 결합한 때에, 발현을 허용하는 방식으로 DNA 서열 및 조절 서열이 연결되어 있음을 의미한다.
[0115] 2개의 아미노산, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 유전자 서열(적절하게)에 대하여 "퍼센트 서열 동일성", "퍼센트 아미노산 서열 동일성", "퍼센트 유전자 서열 동일성" 및/또는 "퍼센트 핵산/폴리뉴클레오타이드 서열 동일성"은, 서열을 적절하게 배열한 때에 두개의 서열 중에서 동일한 잔기의 퍼센트를 의미한다. 따라서, 80% 아미노산 서열 동일성은, 적절하게 배열된 2개의 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산의 80%가 동일하다는 것을 의미한다.
[0116] "변형", "형질 도입" 또는 "형질 감염"은 영구적 또는 일시적 유전적 변화를 의미하는데, 좋기로는 신규한 핵산(에컨대 세포에 대하여 외래인 DNA 또는 RNA)의 통합을 따르는 세포 중에 유도된 영구적 유전적 변화이다. 유전적 변화는 신규한 핵산을 숙주 세포의 게놈 속으로 통합시키는 것에 의하여, 또는 에피솜 요소로서 새로운 DNA의 일시적인 또는 안정한 유지에 의하여 달성될 수 있다.
[0117] 용어 "변형된 세포", "감염된 세포"는 재조합 DNA 기술에 의하여, 관심 대상 단백질을 인코딩하는 DNA 분자가 세포 속으로 도입된(또는 그 선조 속으로 도입된) 세포를 의미한다.
[0118] 용어 유전자 산물(예컨대 R1 또는 R2)의 "과발현하는" 또는 "과발현"이란 특정 세포 또는 세포 형에 대하여, 예를 들어 특정 발달 단계 또는 분화 단계에서, 단백질 발현의 정상 레벨을 넘어 증가된 단백질 발현 레벨을 의미한다. 특정 예에서, 과발현은 내생적 및 재조합 유전자로부터의 단백질 발현 또는 재조합 유전자로부터의 필수적인 단백질 발현의 축적적 효과일 수 있다. R1 또는 R2의 과발현은 특정 세포 내에 각각의 리보뉴클레오타이드 리덕타제 단백질 서브 유닛의 발현을 일컫는데, 여기서 상기 발현 레벨은 일반적으로 분화의 특정 단계에서 보통의 또는 야생형 세포와 관련된다. 특정 구현예에서, 유전자 산물의 과발현은 인자에 의하여 발현이 적어도 약 2배, 다른 구현예에서는 적어도 약 5배 및 또 다른 구현예에서는 적어도 약 10배의 증가를 의미한다.
[0119] 용어 "컨스트럭트"는 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 목적으로 발생되거나 또는 다른 재조합 뉴클레오타이드 서열의 컨스트럭션 내에 사용되기 위한 것인, 재조합 핵산, 일반적으로 재조합 DNA를 의미한다.
[0120] 본 명세서에 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 i) 천연의 폴리펩타이드, ii) 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 단편, iii) 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 폴리펩타이드 유사체 또는 iv) 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성인 변이체의 아미노산 서열을 갖는 재조합 또는 비재조합 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에 유용한 폴리펩타이드는 천연의, 합성의, 반합성의 또는 재조합이던 간에 임의의 원천으로부터 유래한, 임의의 종, 예컨대 포유 동물 또는 비 포유 동물(예를 들어, 파충류, 양서류, 조류(예컨대 닭)), 특히 인간, 설치류(예컨대, 뮤린 또는 래트), 소, 양, 돼지, 뮤린, 말, 좋기로는 래트 또는 인간을 포함하는 포유 동물로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어 "R1 폴리펩타이드"는 인간으로부터 얻어진 분리된 인간 R1 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 의미하고, 모든 자연적으로 발생한 대립(allelic) 변이체를 포함하는 것으로 의도되며, 언급된 단백질 분자와 관련된 완전하고도 천연인 아미노산 서열의 아미노산 서열로 제한되는 것을 의도하지 않는다.
[0121] "변이체"는 1 이상의 아미노산 서열에 의하여 변경(예컨대, 삭제, 부가, 삽입, 및/또는 치환)되는 아미노산 서열로서 정의된다. 일반적으로 "부가"는 분자의 말단에 부가되는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 의미하는 반면에, "삽입"은 자연적으로 발생한 분자의 잔기 사이의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 의미한다. 변이체는 "보존적" 변화를 가질 수 있는데, 여기서 치환된 아미노산은 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는데, 예컨대 루이신을 이소루이신으로 치환한 것이 있다. 보다 희귀하게는, 변이체는 "비보존적" 변화를 가질 수 있는데, 예컨대 글라이신을 트립토판으로 치환하는 것이 있다. 유사한 최소 변이는 또한 아미노산 삭제 또는 삽입 또는 이 둘 모두를 포함할 수 있다. 생물학적 또는 면역학적 활성을 폐지하지 아니하고, 어떠한 몇개의 아미노산 잔기를 치환, 부가, 삽입 또는 삭제할 수 있는가를 결정할 수 있는 가이드는 당업계에 잘 알려진 컴퓨터 프로그램, 예컨대 DNAStar 소프트웨어를 사용하여 알아낼 수 있다.
[0122] 용어 "표적화 제제"는 특정 표적 기관, 조직 또는 세포형에 대하여 선택성을 나타내는 화합물을 의미한다. 표적화 제제는 조성물을 방향을 이끌 능력이 있는데, 그것과 함께 이는 특정 표적 기관 또는 조직과 작동적으로 연결된다. 표적화 제제는 적어도 하나의 양이온성 폴리머 담체 및/또는 다른 제제와 작동적으로 연결될 수 있다.
[0123] 본 명세서에 사용되는 용어 "심근 경색"은 허혈성 질환이 심근의 영역이 상처 조직으로 치환됨을 야기하는 하는 과정을 의미한다.
[0124] 본 명세서에 사용되는 용어 "허혈성 심장 질환"은 산소를 필요로 하는 심근과 산소 공급의 적합성 사이의 불균형에서 초래되는 임의의 질환을 의미한다. 허혈성 심장 질환의 대부분의 경우는 아테롬성 동맥 경화증 또는 다른 혈관성 질환에서 발생하는 것과 같이, 좁아진 관상동맥으로부터 유래한다.
[0125] 본 명세서에 사용되는 용어 "심부전"은 심장이 휴지 또는 운동시에 정상 혈액 배출을 유지하거나 또는 정상적인 심장 채움 압력의 세팅 중의 정상적인 심장 배출을 유지할 수 없도록 하는 손상된 심장 기능을 의미한다. 약 40% 또는 그 미만의 좌심살 배출 단편은 심부전을 나타낸다(비교의 방법에 의하여, 약 55% 내지 60% 퍼센트의 배출 단편은 정상이다). 심부전 환자는 빈호흡, 늑막 유출, 휴지 또는 운동시 피곤, 수축 기능 장애 및 부종과 같은, 잘 알려진 임상적 증상 및 징후를 나타낸다. 상대적인 심각도 및 질병의 진행은, 물리적 검사, 심장 초음파 검진, 방사성 핵종 영상화, 침습적 혈동역학 모니터링, 자기 공명 혈관 조영술 및 산소 섭취 연구와 결합된 운동 트레드밀 시험과 같은, 잘 알려진 방법에 의하여 평가된다.
[0126] 본 명세서에 사용되는 용어 "심근증"은 심혈관 질환을 의미한다. 몇몇 구현예에서, 심근증은 원발성 심근증(primary cardiopathology) 또는 이차성 심근증(secondary cardiopathology)으로부터 선택된다. 심근증은, 유전적 심근증, 비후성 심근증, 허혈성 심근증, 제한적 심근증 및 확장성 심근증으로부터 선택될 수 있다. 비후성 심근증을 가진 개체 중의 심장 기능의 개선과 관련된 구현예에서, 심근증은 (a) 사후-심근 경색 리모델링, (b) 심장 밸브 질환; (c) 유지되는 심장 후부하; (d) 심근염; 또는 (e) 가족력 비후성 심근증으로부터 야기된 것일 수 있다.
[0127] 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "심장 트로포닌 C" 또는 "cTnC"는 다수의 칼슘 결합 부위를 갖는 트로포닌 복합체의 폴리펩타이드를 의미한다. 바람직한 구현예에서, cTnC는 TNNC1 유전자(Entrez Ref: NM_003280.2)에 의하여 인코딩되는 인간 cTnC(Entrez Ref: NP_003271), 또는 그의 보존적 변이체, 스플라이스 변이체 또는 태그된 변이체를 의미한다.
[0128] 본 명세서에 사용되는 용어 "리보뉴클레오타이드 리덕타제 복합체", "RR" 또는 "RNR"은, RNR1( 또는 "R1") 및 RNR2(또는 "R2") 서브 유닛을 함유하는 헤테로다이머 테트라머 폴리펩타이드 복합체를 의미한다. 바람직한 구현예에서, R1 서브 유닛은, RRM1 유전자(Entrez Ref: AF107045.1)에 의하여 인코딩되는 인간 리보뉴클레오타이드 리덕타제 M1 서브 유닛(Entrez Ref: AAD37491.1), 또는 그의 보존적 변이체, 스플라이스 변이체 또는 태그된 변이체를 의미한다. R2 서브 유닛은 리보뉴클레오타이드 리덕타제 M2 서브 유닛 또는 리보뉴클레오타이드 리덕타제 M2 B 서브 유닛을 의미할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, R2는 RRM2 유전자(Entrez Ref: AY032750.1)에 의하여 인코딩되는 인간 리보뉴클레오타이드 리덕타제 M2 서브 유닛(Entrez Ref: AAK51163)을 의미한다. 다른 바람직한 구현예에서, R2는 RRM2B 유전자(Entrez Ref: NM_015713.4)에 의하여 인코딩되는 인간 리보뉴클레오타이드 리덕타제 M2 B 서브 유닛 이소형태 1(Entrez Ref: NP_056528.2); RRM2B 유전자(Entrez Ref: NM_001172477)에 의하여 인코딩되는 인간 리보뉴클레오타이드 리덕타제 M2 B 서브 유닛 이소형태 2(Entrez Ref: NP_001165948.1); 또는 RRM2B 유전자(Entrez Ref: NM_001172478.1)에 의하여 인코딩되는 인간 리보뉴클레오타이드 리덕타제 M2 B 서브 유닛 이소형태 3(Entrez Ref: NP001165949); 또는 그의 보존적 변이체, 스플라이스 변이체 또는 태그된 변이체를 의미한다.
V. 구현예
[0129] 일 관점에서, 본 발명은 임상적으로 HCM/DCM 변이로 동정되었지만, 수축의 Ca2+ 민감도에 있어 유사한 증가 또는 감소를 생산하는, 가공된 cTnC 변이체의 투여를 포함하는, 심장 기능을 치료하는 방법을 제공한다.
[0130] 일 관점에서, 본 발명은 개체의 심장 조직에 대한 증가된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, cTnC 변이체는 L48Q 아미노산 치환을 포함한다.
[0131] 특정 구현예에서, 개체는 감소된 수축을 야기하는 심장 질환을 갖는다. 특정 구현예에서, 개체는 경색된 심장을 갖는다.
[0132] 일 관점에서, 본 발명은 개체의 심장 조직에 대한 감소된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 가지는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, cTnC 변이체는 L57Q 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, cTnC 변이체는 I61Q 아미노산 치환을 포함한다.
[0133] 특정 구현예에서, 심장 질환에 대한 유전적 소인을 가지는 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법이 제공된다. 보다 특이적으로는, 유전적 소인은 베타-심장 미오신 중쇄(beta-cardiac myosin heavy chain), 심장 액틴(cardiac actin), 심장 트로포닌 T(cardiac troponin T), 알파-트로포미오신(alpha-tropomyosin), 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I), 심장 미오신-결합 단백질 C(cardiac myosin-binding protein C) 및 미오신 경쇄(myosin light chain)로부터 선택되는 근절 단백질 중의 1 이상의 유전적 변이로 인한 것이다. 몇몇 구현예에서, 유전적 변이는 근섬유 수축의 증가된 Ca2 + 민감도 및/또는 비후형 심근증 표현형과 관련된다. 그와 같은 유전적 변이의 예로는 cTnT의 92 잔기의 변이, 예컨대 R92W, R92Q 및 R92L cTnT, 또는 MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2, MYL3 에서의 변이 또는 이들의 조합을 제한없이 포함한다. 이러한 개체 중에서 심장 기능을 개선시키는 방법은, L57Q 또는 I61Q cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 베터를 그와 같은 개체에게 투여하는 것과 관련되는데, 상기 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터와 작동가능하게 연결된 것이다. 다른 구현예에서, 유전적 변이는 근섬유 수축의 감소된 Ca2 + 민감도 및/또는 확장성 심근증 표현형과 관련된다. 그와 같은 유전적 변이의 예로는, 미스센스 변이 Ser532Pro 및 Phe764Leu, cTnT에서의 삭제(deltaLys210), 또는 유전자 MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2, MYL3에서의 변이, 또는 그들의 조합을 제한 없이 포함한다. 그와 같은 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법은 L48Q cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는바이러스 벡터를, Ca2+ 둔감화 유전적 변이가 있는 상기 개체에게 투여하는 것과 관련되는데, 상기 핵산 서열은 심장-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것이다.
[0134] 본 명세서에서 제공되는 특정 방법에 있어서, 벡터는 리포펙틴, 스텐트 상의 코팅 또는 직접 주입(즉, 카테터를 통하여)에 의하여 투여된다. 일 구현예에서, 벡터는 트랜스포슨, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 벡터는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산을 품는 아데노 바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산은 cTnC 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터를 더 포함한다.
[0135] 특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 세포로의 cTnC 유전자의 전달을 수행하기 위하여 비 바이러스 벡터를 채택하는데, 예컨대 리포좀 융합, 칼슘 포스페이트, 미세주입(microinjection), 전기천공법(electroporation), 다가 양이온, 입자 폭격 및 수용체 매개된 방법에 의한다. 특정 구현예에서, 벡터는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산과 관련된 나노 입자를 포함한다. 특정 구현예에서, 나노입자는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산을 둘러싼 리포좀을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 벡터는 심장 조직 특이적 마커에 대하여 친화도를 갖는 표적화 제제를 더 인코드한다. 일 구현예에서, 표적화 제제는 항체, 항체 단편 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0136] 다른 관점에서 본 발명은, 개체의 심장 조직에 리보뉴클레오타이드 리덕타제 (RR) 복합체를 인코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 개체는 감소된 수축을 야기하는 심장 질환을 갖는다. 특정 구현예에서, 개체는 경색된 심장을 갖는다.
[0137] 본 명세서에서 제공되는 특정 방법에서, 벡터는 리포펙틴, 스텐트 상의 코팅, 또는 직접 주입(즉, 카테터를 경유하는)에 의하여 투여된다. 일 구현예에서, 벡터는 트랜스포슨, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다.
[0138] 특정 구현예에서, 벡터는 RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산을 품는 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 심근 세포이다. 특정 구현예에서, 심근 세포는 다분화성 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)로부터 유래된 것이다. 일 구현예에서, iPSC는 개체로부터 수확된 세포로부터 유래된 것이다. 특정 구현예에서, 개체로부터 수확된 세포는 피부 섬유 아세포이다. 본 명세서에서 제공되는 방법의 특정 구현예에서, RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산은 R1 및/또는 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결된 심장 특이적 프로모터를 더 포함한다.
[0139] 특정 구현예에서, 벡터는 RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산과 관련되는 나노 입자를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 심장 조직 특이적 마커에 대한 친화도를 갖는 표적화 제제를 인코딩하는 서열을 더 포함한다. 특정 구현예에서, 표적화 제제는 항체, 항체 단편 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더 특이적인 구현예에서, 나노 입자는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산을 둘러싸는 리포좀을 포함한다.
[0140] 다른 관점에서, 본 발명은 (i) 개체의 심장 조직에 대한 증가된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터; 및 (ii) 개체의 심장 조직에 대한 리보뉴클레오타이드 리덕타제(RR) 복합체를 인코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법을 제공한다.
[0141] 또 다른 관점에서, 본 발명은 개선을 필요로 하는 개체 중의 심장 기능을 개선하기 위한 약학적 조성물로서, 증가된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, cTnC 변이체는 L48Q 아미노산 치환을 포함한다.
[0142] 또 다른 관점에서, 본 발명은 개선을 필요로 하는 개체 중의 심장 기능을 개선하기 위한 약학적 조성물로서, 감소된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, cTnC 변이체는 L57Q 및/또는 I61Q 아미노산 치환을 포함한다.
[0143] 본 명세서에서 제공되는 약학적 조성물의 특정 구현예에서, 벡터는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산을 품는 아데노 바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산은 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터를 더 포함한다.
[0144] 하나의 관점에 있어서, 본 발명은 리보뉴클레오타이드 리덕타제 (RR) 복합체를 인코딩하는 벡터를 포함하는, 개선을 필요로 하는 개체 중의 심장 기능을 개선하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 벡터는 RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산을 품는 세포를 포함한다.
[0145] 본 명세서에서 제공되는 약학적 조성물의 특정 구현예에서, 세포는 심근 세포이다. 특정 구현예에서, 심근 세포는 다분화성 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)로부터 유래된 것이다. 더 특이적인 구현예에서, iPSC는 개체로부터 수확된 세포, 예컨대 피부 섬유 아세포로부터 유래된 것이다.
[0146] 본 명세서에서 제공되는 약학적 조성물의 특정 구현예에서, RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산은, R1 및/또는 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 심장 특이적 프로모터를 더 포함한다.
[0147] 일 관점에서, 본 발명은 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법으로서, 개체의 심장 조직에 대하여 증가된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 가지는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, cTnC 변이체는 L48Q 아미노산 치환을 포함한다.
[0148] 상기 제공되는 방법의 특정 구현예에서, 개체는 감소된 수축을 야기하는 심장 질환을 갖는다. 일 구현예에서, 개체는 허혈성 심장 질환, 심근증, 또는 심근 경색을 진단받은 것이다. 일 구현예에서, 심근증은 원발성 심근증, 유전적 심근증, 확장성 심근병증 또는 비후성 심근증이다. 일 구현예에서, 개체는 감소된 수축 기능을 진단받은 것이다.
[0149] 일 관점에서, 본 발명은 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 개체는 1 베타-심장 미오신 중쇄(beta-cardiac myosin heavy chain), 심장 액틴(cardiac actin), 심장 트로포닌 T(cardiac troponin T), 알파-트로포미오신(alpha-tropomyosin), 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I), 심장 미오신-결합 단백질 C(cardiac myosin-binding protein C) 및 미오신 경쇄(myosin light chain)로부터 선택되는 근절(sarcomeric) 단백질에 있는 1 이상의 유전적 변이로 인하여, Ca2+ 민감화 또는 비후성 심근증을 갖는다. 그와 같은 유전적 변이의 예로는 cTnT의 92 잔기에의 변이, 예컨대 R92W, R92Q 및 R92L cTnT, 또는 MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2, MYL3에의 변이, 또는 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그와 같은 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법은 , L57Q 또는 I61Q cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를, Ca2+ 민감화 유전적 변이를 가지는 상기 개체에게 투여하는 것과 관련되는데, 상기 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터와 작동가능하게 연결된 것이다.
[0150] 다른 관점에서, 본 발명은 베타-심장 미오신 중쇄(beta-cardiac myosin heavy chain), 심장 액틴(cardiac actin), 심장 트로포닌 T(cardiac troponin T), 알파-트로포미오신(alpha-tropomyosin), 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I), 심장 미오신-결합 단백질 C(cardiac myosin-binding protein C) 및 미오신 경쇄(myosin light chain)로부터 선택되는 근절(sarcomeric) 단백질에 1 이상의 유전적 변이와 관련되는 Ca2+ 탈민감화 또는 확장성 심근병증을 갖는 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법을 제공한다. 그와 같은 유전적 변이의 예로는 미스센스 변이 Ser532Pro 및 Phe764Leu, cTnT 중의 삭제(deltaLys210) 또는 유전자 MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, ACTC, MYL2, MYL3에의 변이, 또는 이들의 조합이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 심장 기능을 개선하는 방법은 L48Q cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를, Ca2+ 탈민감화 유전적 변이를 갖는 상기 개체에게 투여하는 것과 관련되는데, 상기 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터와 작동가능하게 연결된 것이다.
[0151] 상기에서 제공되는 방법의 특정 구현예에서, 벡터는 리포펙틴, 스텐트 상의 코팅 또는 직접 주입(즉, 카테터를 경유한)에 의하여 투여된다. 일 구현예에서, 벡터는 트랜스포슨, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 벡터는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산을 품는 아데노 바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산은 CMV 프로모터, CK7 프로모터, α-MHC5 .5 프로모터, α-MHC86 프로모터, 심장 액틴 프로모터, cTnT455 프로모터 또는 cTnC 변이치ㅔ를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동가능하게 연결된 다른 심장 특이적 프로모터를 더 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산와 관련된 나노 입자를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 심장 조직 특이적 마커에 대하여 친화도를 가지는 표적화 제제르 더 인코딩한다. 일 구현예에서, 표적화 제제는 항체, 항체 단편 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 나노 입자는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산을 둘러싼 리포좀을 포함한다.
[0152] 일 관점에서, 본 발명은 개체의 심장 조직에 리보뉴클레오타이드 리덕타제(RR) 복합체를 인코딩하는 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법을 제공한다.
[0153] 상기에서 제공되는 방법의 특정 구현예에서, 개체는 감소된 수축을 야기하는 심장 질환을 갖는다. 일 구현예에서, 개체는 경색된 심장을 갖는다.
[0154] 상기에서 제공되는 방법의 특정 구현예에서, 벡터는 리포펙틴, 스텐트 상의 코팅 또는 직접 주입(즉, 카테터를 경유한)에 의하여 투여된다. 일 구현예에서, 벡터는 트랜스포슨, 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산을 품는 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 세포는 심근 세포이다. 일 구현예에서, 심근 세포는 다분화성 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)로부터 유래된 것이다. 일 구현예에서, iPSC는 개체로부터 수확한 세포로부터 유래된 것이다. 일 구현예에서, 개체로부터 수확한 세포는 피부 섬유 아세포이다.
[0155] 상기에서 제공되는 방법의 특정 구현예에서, RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산은 R1 및/또는 R2 서브 유닛을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동가능하게 연결된 심장 특이적 프로모터를 더 포함한다.
[0156] 상기에서 제공되는 방법의 특정 구현예에서, 벡터는 RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산과 관련된 나노 입자를 포함한다. 일 구현예에서, 벡터는 심장 조직 특이적 마커에 대한 친화도를 갖는 표적화 제제를 더 인코딩한다. 일 구현예에서, 표적화 제제는 항체, 항체의 단편 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 나노 입자는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산을 둘러싸는 리포좀을 포함한다.
[0157] 일 관점에서, 본 발명은 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법으로서, (i) 개체의 심장 조직에 대한 증가된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터; 및 (ii) 리보뉴클레오타이드 리덕타제(RR) 복합체를 인코딩하는 벡터를 개체의 심장 조직에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
[0158] 일 관점에서, 본 발명은 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하기 위한 약학적 조성물로서, 증가된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, cTnC 변이체는 L48Q 아미노산 치환을 포함한다.
[0159] 일 관점에서, 본 발명은 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하기 위한 약학적 조성물로서, 감소된 장소 II Ca2+ 결합 친화도를 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, cTnC 변이체는 L57Q 및/또는 I61Q 아미노산 치환을 포함한다.
[0160] 상기 제공된 조성물의 특정 구현예에서, 벡터는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산을 품는 아데노 바이러스 벡터를 포함한다. 일 구현예에서, cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산은, cTnC 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열과 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터를 더 포함한다.
[0161] 일 관점에서, 본 발명은 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하기 위한 약학적 조성물로서, 리보뉴클레오타이드 리덕타제(RR) 복합체를 인코딩하는 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 벡터는 RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산을 품는 세포를 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 심근 세포이다. 일 구현예에서, 심근 세포는 다분화성 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)로부터 유래된 것이다. 일 구현예에서, iPSC는 개체로부터 수확된 세포로부터 유래된 것이다. 일 구현예에서, 개체로부터 수확된 세포는 피부 섬유 아세포이다. 일 구현예에서, RR 복합체의 R1 및 R2 서브 유닛을 인코딩하는 핵산은 R1 및/또는 R2 서브 유닛을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 작동가능하게 연결된 심장 특이적 프로모터를 더 포함한다.
VI . 실시예
실시예 1
[0162] 성체 및 신생아 세포 분리 및 배양. 이 연구는 워싱톤 대학 동물 보호 위원회의 승인을 받아 연방 가이드라인에 따라 수행되었다. 워싱톤 대학의 비교 의학부에서, 실험 동물의 인도적 보호 및 사용에 관한 US NIH 방침에 따라 동물을 보호하였다. 세포의 효소적(콜라게나제/프로테아제) 분산을 위한 대동맥 역행 관류를 사용하여, 성체 래트(Fischer 344)의 심근 세포(ARCs)를 심장으로부터 분리하였다10. 신생아 래트 심근 세포(NRCs)는 종전에 기술된 바와 같이11, 1-3일령의 새로 태어난 피셔 344 래트로부터 효소적 분산에 의하여 분리하였다.
실시예 2
[0163] 플라스미드 디자인 및 바이러스 생산. 본 발명자들은 CMV 프로모터로부터 히스타민 태그된(N-말단 6-His) L48Q cTnC 또는 WT cTnC를 발현하는 HEK293 발생된 아데노바이러스 벡터를 생산하였다. 두 벡터 모두 전달 리포터 단백질로서 녹색 형광 단백질(GFP)에 대한 제2차 발현 카세트를 포함하였으며, 본 발명자들은 또한 오직 GFP만을 위하여 벡터를 발현시켰다. 세포당 ~250 입자에서 심근 세포에 바이러스를 도입하였다.
[0164] CMV 프로모터에 의하여 유도된 적절한 cDNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합아데노바이러스를 사용하여 트랜스펙션된 배양된 성체 및 신생아 래트 심근 세포 중에서 L48Q 및 WT cTnC의 발현을 유도하였다. 성공적인 형질 도입을 위하여 리포터 단백질로서 녹색 형광 단백질(GFP)을 위한 제2의 발현 카세트를 각각의 아데노바이러스에 포함시켰다. [L48Q cTnC + GFP] 또는 [WT cTnC + GFP]를 위한 유전자를 포함하는 아데노바이러스로 심근 세포를 2일 동안 감염시켰다. 본 발명자들은 현미경으로 녹색 형광에 의하여 과장되게 지시되는 바와 같이, 거의 100%의 감염 효율 및 유전자 전달을 달성하였다. 이는 심근 세포를 사용한 종전의 연구와 일치하는 것이다13. 이 기간 동안에 세포의 생존은 형질 도입되지 않은 대조군 세포를 포함하는 모든 그룹에 대하여 유사하였는데, 이는 이러한 바이러스 벡터가 심근 세포의 생존능력을 절충하지 않는다는 것을 암시한다. 심근 세포의 수 및 근절의 길이는 표 1에 요약하였다. 그룹 간에 남아있는 근절 길이에 있어 차이가 없었는데, 이는 L48Q 또는 WT cTnC 발현 (+ GFP)의 과다 발현이 칼슘 의존적 활성을 증가시키지 않는다는 것을 나타낸다.
표 1: 세포 특성
Figure pct00001
실시예 3
[0165] 수축 산정. 주변 온도에서 수정된 타이로드(Tyrodes) 완충액 중에서, 자극된 심근 세포 중에서 임의로 선택된 것의 세포 수축 및 이완을 IonOptix 시스템 비디오 현미경(IonOptix, Milton, MA, USA)를 사용하여 기록하였다. 전기적 자극에 의하여 유도된 칼슘 전이를 Fura2 탑재된 세포 중에서 기술한 바와 같은12 IonOptix 장치를 사용하여 측정하였다. 형광 현미경에 부착된 IonOptix 스펙트로포토미터(Stepper Switch)를 사용하여 Fura2 형광을 측정하였다. 40X 대물렌즈에 의하여 발광된 Fura2 형광을 수집하고, 510nm 필터를 통과시키고, 포토멀티플라이어 튜브에 의하여 수집하였다.
[0166] 각각 비디오 길이-탐지 및 형광 포토메트리(IonOptix)를 사용하여, 성체 래트 심근 세포의 자극받은 수축-재늘림(shortening-relengthening) 및 Ca2 + 방출-재섭취의 정도 및 비율에 대한 L48Q cTnC 발현의 효과를 측정하였다. 비처리(흑색), WT cTnC + GFP (청색), 및 L48Q cTnC + GFP (녹색) 변환된 심근 세포에 대하여, 도 1A는 대표적인 수축 흔적을 나타내고, 도 1B는 대표적인 Ca2 + 전이(Fura2 형광)를 나타낸다. 0.5 Hz 자극에서 모든 측정에 대한 데이터는 표 2에 요약하였다. 비처리된 심근 세포와 비교하여, WT cTnC + GFP 과다발현은 수축 속도를 현저하게 늦추었지만, 단편적 수축(FS)에는 현저한 효과를 갖지 않았다. 비록 GFP가 GFP 수축성에 대하여 해로운 영향14을 갖거나 또는 아무런 영향을 갖지 않는 것으로 보고되어왔음에도 불구하고, 이러한 늦춤이 GFP 또는 cTnC의 과다발현에 의한 것인지 여부는 평가하지 않았다. 각각의 경우에, WT cTnC 형질 도입된 것과 형질 도입되지 않은 심근 세포와 비교하여, L48Q의 발현이 현저하게 증가된 속도 및 수축의 범위를 가지면서 잠재적인 억제를 극복할 수 있는 것 이상이었다. 0.5 Hz 자극 주파수에서 그룹 사이에, 최대 이완율(relaxation rate) 또는 50% 및 90% 이완으로의 시간에 있어 차이가 없었다. Ca2 + 전이 또한 WT cTnC 형질도입된 심근 세포가 최소 Ca2 +에 있어서 약하고, 중요하지 않은(p=0.55) 상승을 가졌던 것을 제외하고는, WT 또는 cTnC 과다 발현에 의하여 거의 영향받지 않았다. 이는 휴식 중인 SL 또는 최대 Ca2 + 방출에 대하여 그 어떠한 효과도 갖지 않았다. 도 1C는 수축율(shortening rate)과 수축 범위, 이완율과 50% 및 90% 이완에 대한 시간에 있어서 % 차이를 나타내고, 도 1D는 최소 및 최대 Ca2 +와 50% 및 90% Ca2 + 쇠퇴로의 시간을 포함하는 Ca2 + 전이 특성에 있어서 % 차이를 나타낸다. 최대 Ca2 +에 대하여 WT cTnC + GFP 또는 L48Q cTnC + GFP 그 어느 것도 현저한 효과를 나타내지 않았는데, 이는 L48Q cTnC에 의한 증진된 수축성은 주로 Ca2 + 활성화에 대한 근섬유의 증가된 반응성에서 기인한 것이라는 것을 나타낸다.
표 2: 0.5 Hz 자극에 대한 수축성 및 Ca2 + 전이값
Figure pct00002
실시예 4
[0167] 심장 속도의 변화는 전신 요구에 대한 정상적인 생리학적 적응이기 때문에, L48Q cTnC의 과다발현이 증가된 자극 주파수에 대한 정상 세포 반응에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것은 중요하다. 도 2는 증가된 자극 주파수(0.5 내지 1 내지 2 Hz)의 단편적 수축(2A), 수축 속도(2B), 이완 속도(2C), 및 90% 이완에 대한 시간(2D)에 대한 영향을 요약한 것이다. 자극 주파수에 대한 수축 반응은 그룹간에 유사하였고, L48Q cTnC 형질 도입된 심근 세포는 모든 주파수에서 기능적 강화를 유지하였다. 중요하게는, 증가된 페이싱 주파수가 모든 그룹에 있어서 90% 이완에 대한 시간을 단축하면서, 양성적인 루시트로픽 효과와 관련된다. 형질 도입되지 않은 근세포 vs. WT cTnC 형질 도입된 근세포에 있어 거의 차이가 없었지만, 이완 속도는 1 Hz 및 2 Hz 자극에서 L48Q cTnC 근세포 중에서 실질적으로 증가하였다. Ca2 + 전이에 대한 자극 주파수의 효과 또한 평가되었는데, 이는 최소 Ca2+(3A), 최대 Ca2 +(3B) 및 50%(3C)와 90%(3D) Ca2 + 쇠퇴에 대한 시간에 관하여, 도 3에 요약해놓았다. 수축에서와 같이, 형질 도입되지 않은 것과 L48Q cTnC 형질 도입된 근세포 사이에, 증가된 자극 주파수에 의한 Ca2 + 전이 행동에는 차이가 없었다. WT cTnC 형질 도입된 심근 세포는, 형질 도입되지 않은 것 및 L48Q cTnC 형질 도입된 근세포와 비교하여, 1 Hz에서 최소 및 최대 Ca2 +에 있어서 약간의 증가를 가졌지만, 50% 및 90% 이완에 대한 시간은 모든 자극 주파수에서 그룹간에 유사하였다.
[0168] 그룹 간에 최소 및 최대 Ca2 +에 차이가 거의 없었기 때문에, 수축성에서의 변화는 활성화 Ca2 +에 대한 근섬유 반응성의 변화에 의하여 가장 잘 설명될 수 있다. 이는 수축 효능으로서 도 4에 나타나 있는데, 이는 여기서 최대 fura2 형광 (peak Ca2 +)에 의하여 나누어지는 심근 세포의 단편적 수축으로서 정의된다. L48Q cTnC를 발현하는 심근 세포는 모든 자극 주파수에서, 형질 도입되지 않은 것 또는 GFP 형질 도입된 심근 세포보다 현저하게 높은 수축 효능을 가졌다. 흥미롭게도, WT cTnC 및 형질 도입되지 않은 근세포 사이에 모든 주파수에서 수축 효능에 있어 현저한 차이가 있었는데, 이는 L48Q cTnC-유도된 수축 강화가 적게 평가되었음을 나타내는 것일 수 있다. 1 Hz 및 2 Hz 자극에 대한 결과를 표 3 및 표 4에 각각 요약하였다.
표 3: 1 Hz 자극에 대한 수축 및 Ca2 + 전이값.
Figure pct00003
표 4: 2 Hz 자극에 대한 수축 및 Ca2 + 전이값.
Figure pct00004
실시예 5
[0169] 근섬유 세포로의 L48Q cTnC 혼입 레벨을 측정하기 위하여, [L48Q cTnC + GFP] 또는 [WT cTnC + GFP] 에 대한 유전자를 포함하는 아데노바이러스 컨스트럭트로 배양된 신생아 심근 세포를 48시간 동안 감염시키거나 또는 처리하지 않은 채로 두었다. 성체 심근 세포에서와 같이, 이 기간 동인의 세포 생존은 모든 그룹에 대하여 정량적으로 유사하였는데, 이는 바이러스 벡터가 인 비트로 심근 세포 생존 능력을 절충하지 않는다는 것을 제시하는 것이다. 성공적인 유전자 전달은 현미경을 이용하여, 감염된 심근 세포의 녹색 형광(GFP)에 의하여 과장되게 나타내었다. 총 cTnC 함량에 대하여 항-cTnC(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 사용하거나 또는 형질 도입된 단백질 함량에 대하여 항-His(Novagen, Gibbstown, NJ)를 사용하여 탐지되는 형질 도입된 근세포로부터 유래한 정제된 근섬유의 웨스턴 블롯에 의하여 WT 또는 L48Q cTnC의 과다 발현 및 얇은 섬유 속으로의 혼입을 나타내었다. 형질 도입된 cTnC의 근섬유 혼입의 대략적 레벨을 평가하기 위하여, 형질 도입된 근세포 근섬유로부터 유래한 웨스턴 블롯 밴드를 밀도계측계로 정량화하여 총 cTnC 함량 vs. His-태그 cTnC(형질 도입된 단백질) 함량을 비교하였다. cTnC 및 cTnC-His의 알려진 양으로부터 웨스턴 블롯 밀도 계측 커브를 발생시켰다. 도 5는 천연 cTnC(도 5A)의 ~70%(중간 레인) 및 56%(우측 레인)를 지시된 형질 도입된 cTnC-His (Fig. 5B)로 대체하고, 알려진 농도의 정제된 cTnC-His(좌측 레인)에 대하여 비교한, 2개의 배치에 대한 이 실험의 대표적인 실시예를 보여준다. 근세포의 3개 배치를 2회 수행하였고, 평균화된 결과는 천연 cTnC 58±7%의 L48Q cTnC로의 치환을 나타내었다.
실시예 6
[0170] 데이터 처리 및 통계적 분석. 등식: y=y0+ae- bX를 사용하는 단일의 3개 파라미터 쇠퇴 지수에 맞춘 비선형 회귀 분석을 사용하여, 수축 속도를 시험하였다. 50%, 90% 및 100% 이완(각각 RT50, RT90, 및 RT100)에 대한 시간을 측정하고, 등식: y=y0+a(1-e-bX)를 사용하는 단일의 3개 파라미터 지수에 맞추는 것에 의하여 이완을 산정하였다. ANOVA에 의하여 통계적 차이를 측정하였다. p-값 < 0.05에서의 차이는 통계적으로 중요하게 고려되었다. 데이터는 평균 S.E.M.으로 나타내었다.
실시예 7
[0171] 성체 및 신생아 세포 분리 및 배양. 이 연구는 워싱톤 대학(UW) 동물 보호 위원회의 승인을 받았으며, 연방 가이드라인에 따라 수행되었다. 워싱톤 대학의 비교 의학부 중에서, 실험 동물의 인도적 보살핌 및 사용에 관한 US NIH 방침에 따라 동물을 보살폈다. 세포의 효소적(콜라게나제/프로테아제) 분산을 위하여 대동맥 역행 관류를 사용하여, 성체 래트(Fischer 344) 심근 세포(ARCs)를 심장으로부터 분리하였다13. 신생아 래트 심근 세포(NRCs)는 종전에 기술된 바와 같이14, 1-3일령의 새로 태어난 피셔 344 래트로부터 효소적 분산에 의하여 분리하였다.
실시예 8
[0172] 플라스미드 디자인 및 바이러스 생산. HEK293 세포를 사용하여 CMV 프로모터로부터 Rrm1 또는 Rrm2를 발현하는 아데노바이러스 벡터15를 발생시켰다. 두 벡터 모두는 형질 도입 리포터 단백질로서 녹색 형광 단백질(GFP)를 위한 제2의 발현 카세트를 포함하였고, 본 발명자들은 또한 오직 GFP만을 위한 벡터를 발현시켰다. 세포 당 ~250 입자로 심근 세포에 바이러스를 도입하였다.
[0173] CMV 프로모터에 의하여 이끌어낸 적절한 cDNA 컨스트럭트를 포함하는 재조합 아데노바이러스를 사용한 감염을 사용하여, 배양된 성체 및 신생아 래트 심근 세포 중에 근육 리보뉴클레오타이드 리덕타제 1(Rrm1) 및 2 (Rrm2)의 과발현을 유도하였다. 각각의 아데노바이러스는 성공적인 형질 도입을 동정하는 리포터 단백질로서 사용되는 녹색 형광 단백질(GFP)를 위한 제2의 발현 카세트를 또한 포함하였다. [Rrm1 + GFP 및 Rrm2 + GFP] 또는 [GFP] 를 위한 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 사용하여, 심근 세포를 2일 동안 감염시켰다. 현미경으로 녹색 형광에 의하여 과장되게 나타난 바와 같이, 성공적인 유전자 전달은 거의 100%의 감염 효율을 나타내었다. 이는 심근 세포를 사용한 종전의 연구와 일치하는 것이다17. 이 기간 중 세포 생존은 형질 도입되지 않은 대조군 세포를 포함하여 모든 그룹에 대하여 유사하였는데, 이는 이러한 바이러스 벡터가 심근 세포 생존능력을 절충하지 않음을 제시하는 것이다. 심근 세포 수 및 근절 길이를 표 5에 요약해놓았다. 그룹 간에 휴지 중인 근절 길이에 있어 차이가 없었는데, 이는 Rrm1+Rrm2(또는 GFP)의 과다발현이 칼슘 의존적 활성을 증가시키지 않음을 나타내는 것이다.
표 5: 세포 특성
Figure pct00005
실시예 9
[0174] 수축 산정. 주변 온도에서 수정된 타이로드(Tyrodes) 완충액 중에서, 자극된 심근 세포 중에서 임의로 선택된 것의 세포 수축 및 이완을 IonOptix 시스템 비디오 현미경(IonOptix, Milton, MA, USA)를 사용하여 기록하였다. 전기적 자극에 의하여 유도된 칼슘 전이를 Fura2 탑재된 세포 중에서 기술한 바와 같은16 IonOptix 장치를 사용하여 측정하였다. 형광 현미경에 부착된 IonOptix 스펙트로포토미터(Stepper Switch)를 사용하여 Fura2 형광을 측정하였다. 40X 대물렌즈에 의하여 발광된 Fura2 형광을 수집하고, 510nm 필터를 통과시키고, 포토멀티플라이어 튜브에 의하여 수집하였다.
[0175] 성체 래트 심근세포의 자극된 수축-재신장의 범위 및 비율에 대한 Rrm1+Rrm2 과발현의 효과를 비디오 길이-탐지기(IonOptix)를 사용하여 측정하였다. 도 6a는 대표적인 수축 흔적을 나타내고, 도 6b는 비처리(흑색), 오직 GFP(녹색), 및 Rrm1+Rrm2(적색) 형질 도입된 심근 세포에 대하여 대표적인 Ca2+ 전이(Fura2 fluorescence)를 나타낸다. 0.5 Hz에서의 모든 측정에 대한 데이터는 표 6에 요약하였다. 수축성에 대한 GFP의 해로운 효과가 종전에 보고된 반면에18, 다른 곳에서는 아무런 효과가 없다고 관찰되었다16 ,19. 본 연구에서 GFP가 수축 억제제로서 작용하는 것으로 보이지 않은 반면에, 느린 90% 이완 시간을 보였는데, 이는 Ca2+의 더 느린 50% 및 90% 쇠퇴를 수반하는 것이었다(도 6c, 표 5). 이러한 효과가 증가된 SERCA 활성으로 인한 것인지, 아니면 유도된 얇은 필라멘트 불활성화를 수축시키고 트로포닌 C로부터의 Ca2+의 방출을 야기하는 더 빠른 사이클링 크로스브리지로 인한 것인지는 장래 연구의 대상이다. 이와 관계없이, Rrm1+Rrm2 (+GFP)로 유도된 심근 세포는 수축 vs. 형질 유도되지 않은 심근세포 및 오직 GFP로 형질 유도된 대조군의 현저하게 더 큰 규모 및 비율을 가지었다. 이를 도 6c에 나타내었는데, 이는 수축율 및 수축 범위, 이완율과 50% 및 90% 이완으로의 시간에 있어 % 차이를 보여준다. Rrm1+Rrm2 과다발현은 이완율을 증가시켰고, 50% 이완으로의 시간을 감소시켰으며, 이러한 효과는 GFP의 존재로 인하여 다소 적게 평가되었을 수 있다. 도 6d는 최소 및 최대 Ca2+를 포함하는 Ca2+ 전이 특성과 50% 및 90% Ca2+ 쇠퇴 시간에 있어 % 차이를 나타낸다. GFP 또는 Rrm1+Rrm2 + GFP로부터 유래하는 최소 및 최대 Ca2+에 대한 현저한 효과가 없었는데, 이는 Rrm1+Rrm2와 함께 증진된 수축성이 주로 활성화 Ca2+에 대한 근섬유의 증가된 반응성으로 인한 것이었다는 점을 나타낸다. 흥미롭게도, Rrm1+Rrm2 과다발현은, 50% 및 90% 쇠퇴까지의 시간 감축에 의하여 지시되는 바와 같이, Ca2+ 부골재형성(resequestration)을 촉진하였는데, 이는 증가된 심근 세포의 최대 이완율을 부분적으로 설명할 수 있다.
표 6: 0.5 Hz 자극에 대한 수축 및 Ca2+ 전이값.
Figure pct00006
실시예 10
[0176] 심장율에 있어서의 변화가 전신 요구에 대한 정상적인 생리학적 적응이기 때문에, Rrm1+Rrm2 과다발현이 증가된 자극 주파수에 대한 정상 세포 반응에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것은 중요하다. 도 7은 단편적 수축(7a), 수축 속도(7b), 이완 속도(7c), 및 90% 이완까지 시간(7c)에 대한 증가된 자극 주파수(0.5 내지 1 내지 2 Hz)의 효과를 요약한 것이다. 자극 주파수에 대한 수축성 반응은 그룹간에 유사하였고, Rrm1+Rrm2 형질 도입된 심근세포는 모든 주파수에서 기능적 잠재성을 유지하였다. 중요하게는, 증가된 페이싱 주파수가 모든 그룹에서 90% 이완까지의 시간을 단축시키면서 양성적 루시트로픽 효과와 관련된다. 오직 GFP-형질도입된 근세포 중에서 90% 이완까지의 시간이 0.5 Hz에서 더 긴 것을 제외하고는, 형질 도입되지 않은 근세포 vs. 오직 GFP-형질도입된 근세포 간에 차이가 거의 없었다. Ca2+ 전이에 대한 자극 주파수의 효과를 또한 평가하였는데, 최소 Ca2+(8a) 및 최대 Ca2+(8b)와, 50%(8c) 및 90%(8d) Ca2+ 쇠퇴까지의 시간(DT50, DT90)에 대하여 이를 표 3에 요약하였다. 수축에서처럼, 형질 도입되지 않은 것과 Rrm1+Rrm2 형질 도입된 근 세포 간에, 증가된 자극 주파수를 사용시, Ca2+ 전이 생동에 있어 차이점이 없었다. 형질 도입되지 않은 근세포와 비교하여, 오직 GFP-형질 도입된 심근세포의 경우, 2 Hz에서 최소 Ca2+에 대한 근소한 증가와, 1 Hz 및 2 Hz에서 최대 Ca2+에 대한 증가를 가졌지만, 50% 및 90% 쇠퇴까지의 시간은 유사하였다. 0.5 Hz에서처럼, 1 및 2 Hz 모두에서 Rrm1+Rrm2 형질 도입된 근세포 중에서 50% 및 90% 쇠퇴까지의 시간은 감소하였다(더 빠른 쇠퇴).
[0177] 최소 및 최대 Ca2+에 있어 그룹 간에 차이가 거의 없었기 때문에, 수축성에서의 변화는 활성화 Ca2+에 대한 근섬유 반응성에서의 변화에 의하여 가장 잘 설명될 수 있다. 이는 본 명세서에서 최대 fura2 형광(Ca2+ 피크)에 의하여 분리되는 심근 세포 단편적 수축으로서 정의되는 수축 효율로서 도 9에 나타내었다. Rrm1+Rrm2를 발현하는 심근 세포는 모든 자극 주파수에서, 형질 도입되지 않은 것, 또는 GFP 형질 도입된 심근 세포보다 현저하게 더 높은 수축 효율을 나타내었다. 2 Hz에서를 제외하고는, GFP 단독 형질 도입된 것 또는 형질 도입되지 않은 심근 세포 간에 수축 효율에 있어 차이가 없었는데, 이는 효율을 감소시키면서 단편적 수축의 증가 없이 GFP 단독 근세포 중에서 증가된 최대 Ca2+에 주로 기인한 것일 수 있다. 1 Hz 및 2 Hz 자극에 대한 결과를 표 7 및 표 8에 각각 요약하였다.
표 7: 1 Hz 자극에 대한 수축 및 Ca2+ 전이값.
Figure pct00007
표 8: 2 Hz 자극에 대한 수축 및 Ca2+ 전이값.
Figure pct00008
실시예 11
[0178] Rrm1+Rrm2 형질 도입된 세포 중에서 증가된 RR mRNA, RR 단백질 및 dATP 생산을 확인하기 위하여, 신생아 래트 심근 세포를 수집하고, RT-PCR, 웨스턴 블롯 및 세포 내 [ATP] 및 [dATP]의 HPLC 분석을 위하여 처리하였다. 세포 내 [dATP]가 pM 범위로 존재하는 것으로 알려져 있기 때문에, 정확한 뉴클레오타이드 함량 분석을 위한 고도로 충분한 세포 밀도를 얻기 위하여 신생아 심근 세포를 사용하였다. 성체 심근 세포와 유사하게, 신생아 심근 세포 수축성은 R1R2 과다발현과 함께 현저하게 증가하였다. 흥미롭게도, 심근 경색14에 따른 세포 접목의 효과를 연구하기 위하여 신생아 심근 세포를 사용하였기 때문에, 이들 세포 중의 개선된 수축성은 경색에 뒤따라오는 심장 기능을 개선하는 또 다른 기전일 수도 있다. Rrm1 및 Rrm2 mRNA는 아데노바이러스 감염에 따라 크게 증가하였다. 이와 수반하여, 도 10a 및 10b는 Rrm1 및 Rrm2 형질 도입된 심근 세포가 각각 24-배 및 46-배보다 더 크게 증가된 Rrm1 및 Rrm2 단백질 함량을 갖는다는 것을 보여준다. 로딩 대조군으로서 GAPDH를 사용하였다. 도 10c는 Rrm1+Rrm2 형질 도입된 심근 세포가, GFP 형질 도입된 심근 세포(0.35 nmol/mg 단백질로의 증가)와 비교하여, ~10-배 증가된 세포 내 [dATP]를 갖는다는 것을 나타낸다. 이것이 강건한 반면에, [dATP]는 보통 총 아데닌 트리포스페이트 뉴클레오타이드의 0.2% 미만을 포함하기 때문에, [dATP] 중의 이러한 증가는 총 아데닌 뉴클레오타이드 풀의 단지 ~1-1.5%를 나타낸다. 이는 심근 세포 수축성을 현저하게 증가시키는데, 오직 소량의 dATP가 요구된다는 것을 제안한다.
실시예 12
[0179] 데이터 처리 및 통계적 분석. 등식 y=y0+ae- bx를 사용하는 단일, 3개 파라미터 지수에 적합한 비선형 회귀 분석을 사용하여, 수축 및 Ca2+ 쇠퇴 속도를 측정하였다. 등식 y=y0+a(1-e- bx)를 사용하는 단일, 3개 파라미터 지수에 맞추는 것에 의하여, 이완 속도 및 Ca2+ 상승을 평가하였다. 또한, 50%(RT50) 및 90%(RT90) 이완까지의 시간을 측정하는 것에 의하여, 이완 및 Ca2+ 쇠퇴를 측정하였다. 사후 쌍 검정(post-hoc pairwise test)으로서 스튜던트-뉴만-쿨즈(Student-Newman-Keuls)를 이용하여(SigmaPlot 11), ANOVA에 의하여 통계적 차이를 측정하였다. p-값 < 0.05에서의 차이가 통계적으로 중요하게 고려되었다. 데이터는 평균 s.e.m.으로 표시하였다.
실시예 13
[0180] 수축 및 이완의 심장근 가는 세사(cardiac thin filament) 조절의 분자적 기전을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 수개의 cTnC 변이체를 개발하고 특성화하였다. 표 9에 요약된 바와 같이, 1) 전체 cTn 복합체 중에 포함된 때에, 이들은 L48Q>WT>L57Q>I61Q [KA = kon/koff](정상상태 분광법에 의하여 측정)의 순서로 친화도(KA)를 가지고 Ca2+ (in solution)에 결합하고, 2) 전체 cTn Ca2+ 해리율(koff)(measured with stopped-flow spectroscopy)은 KA와 동일한 순서로 증가하였으며, 3) 이는 변이체가 박피 심근 섬유주(skinned cardiac trabeculae) 속으로 교환될 때, 힘의 감소하는 Ca2+ 민감성(pCa50)과 잘 대응된다.
표 9: 용액 내 Ca2+ 결합 친화도(KA) 및 해리율(koff), cTnC 변이체를 가진 섬유주 힘의 pCa50.
Figure pct00009
[0181] 각각의 변이체에 대하여 아데노바이러스 벡터(AV)를 생성시키고, 배양한 성체 래트 심근 세포(~250 바이러스 입자/세포)를 감염시키고, GFP의 공동 발현으로 동정하였다. 수축 및 세포 내 Ca2+ 전이 데이터를 표 10에 요약하였다. 데이터(0.5 Hz 자극)는 L48Q>WT>L57Q>I61Q의 순서로 감소된 크기 및 수출율을 보여주며, 이는 용액에 대하여 박피 심장 근육의 Ca2+ 친화도 및 Ca2+ 민감도와 동일한 순서이다. AV 컨스트럭트 중의 모든 cTnC 변이체는 C-말단 히스티딘 태그를 포함하는데, 이는 근필라멘트 속으로 혼입된 양의 정량적 산정을 위한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석을 가능하게 한다. 이 레벨은 본 발명자들이 전형적으로 사용한 AV 로드와 함께, 40-60%의 범위이다. 흥미롭게도, L48Q cTnC는 Ca2+ 전이 진폭에 대하여 아무런 효과를 갖지 않았는데, 이는 증가된 수축이 오직 증가된 근섬유의 Ca2+ 민감성으로부터 야기된 것임을 제시한다. 이와 대조적으로 L57Q 및 I61Q cTnC는 수축/이완 성능을 감소시켰고, Ca2+ 전이 베이스라인 및 진폭을 감소시켰다. 수축, Ca2+ 전이 진폭 및 +kFL에서의 동시 감소는 근섬유-SR이 배양 중 오직 48시간 후에 상호작용한다는 것을 제시한다.
표 10: AV-c TnC 변이체로 감염시킨 세포에 대한 수축 및 Ca2+ 전이 데이터(48 hrs).
Figure pct00010
[0182] 표 9 및 표 10에 제공된 데이터로부터, 본 발명자들은 박피 심장 근육 중의 힘의 Ca2+ 민감성을 증가/감소시키는 cTnC 변이체가, 배양된 심근 세포 중의 수축의 크기 및 비율을 또한 증가/감소시킨다는 것을 결정하였다. 흥미롭게도, L57Q 및 I61Q cTnC 둘 모두가 Ca2+ 전이에 있어 수반하는 감소와 함께 수축성을 감소시켰는데, 여기서 L48Q cTnC는 Ca2+ 전이 진폭을 변경하거나 완화를 늦추지 아니하고 수축성을 증가시킨다(표 10). 이는 변이체가 심근 세포 가는 섬유 중에서 오직 부분적으로 천연의 단백질을 대체할지라도 발생하였는데, 이는 cTnC 변이체가 천연의 cTnC를 완전히 치환하지 않고, 근섬유 수축에 실질적인 영향을 미치며, SR 기능에 영향을 줄 수 있다는 것을 기술하는 것이다. 이러한 천연 및 변이체 종의 이종 군집 또한 동물 모델 및 인간 질병에 있어 다양한 변이의 침투를 모방하며, 인 비보 심장 연구에 있어 혼입 프로파일과 유사할 것이다.
[0183] 좌측 하강 관상 동맥의 영구적 결찰에 의하여 경색시킨(4주) 심장으로부터 유래한 심근 세포 중에서, 수축 및 Ca2+ 전이가 감소되었다(도 11). 손상된 수축 행동은 감소된 Ca2+ 전이로부터 주로 야기된 것일 수 있다(표 11). 중요하게는, 오직 수축만이 증진된 정상의 심근 세포와는 대조적으로, L48Q cTnC 발현은 이러한 심근 세포의 수축 및 Ca2+ 진폭 둘 모두를 구출하였다(도 11, 표 11). 이는 L48Q cTnC 발현이 단지 수축의 근필라멘트 Ca2+ 민감성에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 결함이 있는 심근 내 SR 기능에도 영향을 미칠 수 있다는 것을 제시한다. 이는 V-WT cTnC로의 감염은 수축성 또는 Ca2+ 전이 특성을 변경시키지 않았기 때문에(데이터 미제시), cTnC의 세포질 풀 때문이 아니라 근필라멘트 혼입된 cTnC 때문일 것이다.
표 11: 경색된 심장으로부터 유래한 심근 세포의 수축 및 CA2+ 전이에 대한 L48Q의 효과.
Figure pct00011
[0184] 성체 심근 세포는 평가할 때까지(48-72 시간) 휴지기였기 때문에, 수축성 및 Ca2+ 전이에 대한 변화는 자극 히스토리 없는 배양 중에 발생하였는데, 이는 변경된 단백질 함량과는 대조적으로, 변경된 Ca2+ 전이가 SR 및/또는 근형질막 단백질의 번역 후 변형(인산화) 중의 변화로부터 야기되었을 것을 제시한다. 자극 히스토리의 중요성을 기술하기 위하여, 본 발명자들은 비자극된(휴지된) vs. 만성적으로 자극된(1 Hz) 심근 세포의 수축 및 Ca2+ 전이 진폭을 비교하였으며(도 17), 플레이팅 30 시간 후에 자극된 세포에 대하여, 45% 더 큰 수축, 28% 더 큰 Ca2+ 전이 진폭 및 >50% 더 빠른 Ca2+ 전이 상승(+kFL) 및 쇠퇴(kDecay)를 발견하였다.
실시예 14
[0185] AAV6 + 심장-특이적 프로모터를 통한 유전자 전달. rAAV6 벡터의 생산은 종전에 기술된 바와 같을 것이다39. WT 및 L48Q cTnC(각각, AAV6-WT cTnC 및 AAV6-L48Q cTnC)를 위한 벡터는 벌써 생산되었고, I61Q 및 L57Q cTnC를 위한 벡터는 생산 중이다. 간단하게, 플라스미드는 심장 특이적 프로모터(cTnT455, 워싱톤 대학의 스티븐 호치카 박사 제공) 및 C-말단 c-Myc 태그를 포함하는 재조합 AAV 게놈을 가지고 생산될 것이다. cTnC 변이체 이식 유전자 발현(mCherry 형광 리포터 구비) 카세트를 패키징/헬퍼 플라스미드 pDGM6와 함께, CaPO4 침전 기법에 의하여 HEK293 세포 속으로 공동 감염시킨다. 벡터를 배양으로부터 수집하고, 동결 융해하고, 상청액을 수집한다. 친화도 정제는 HiTrap 헤파린 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용한다. 수크로스 구배(40%) 상으로 바이러스를 농축하고, 27,000 rpm에서 회전시키고(18 hours, 4oC), 행크(Hanks) 밸런스 용액 중으로 재용해한다. 벡터 게놈은 사우던 블롯 혼성화를 구비한 SV40 폴리아데닐레이션 영역 올리고뉴클레오타이드 32P 말단-표지된 프로브를 사용하여, 플라스미드 표준에 대하여 상대적으로 측정하고, qPCR에 의하여 확인한다.
[0186] 도 12는 낮은(L; 0.6 x 1012) 및 높은(H; 1.2 x 1012) 바이러스 입자 용량 각각에 대하여 3마리 마우스 내로 전신 주입한(intraocular; 안 내) AAV6-L48Q cTnC의 제1의 사용을 보여준다. 초음파 심장 검진 결과는 주입 2주 후에, 비주입(UN) 대조군과 비교하여, 좌심실(LV) 배출 부분에서의 ~20% 증가를 나타내었고, 3주에는 30-40% 증가를 나타내었다. 이 결과를 확인하기 위하여, 샴 및 AAV6 대조군 주입이 수행될 필요가 있는 반면에, 대조군 AV 벡터의 전신 주입은 LV 기능을 변화시키지 않았다. 하나의 AAV6 L48Q cTnC-myc 감염된 마우스(및 비주입된 대조군)으로부터 유래한 근원섬유(Myofibrils)를 SDS-PAGE으로 분리하고, 항-cTnC를 사용하여 웨스턴 블롯을 탐지하였다. myc-태그의 존재는 cTnC의 더 늦은 이동을 야기하였고(도 13), 천연의 cTnC에 대한 cTnC-myc의 비율은 ~40%로 농도계적으로 측정되었다(아데노바이러스 및 트랜스제닉 동물에 대하여 관찰된 것과 유사함, 아래).
실시예 15
[0187] 아데노바이러스(AV)를 통한 유전자 전달. AV 벡터는 배양 중에 더욱 효과적이어서, 몇몇 실험에 대하여, 본 발명자들은 심근 세포 중의 cTnC 변이체 감염에 대하여 그들을 사용하는 것을 계속할 것이다. AV 벡터는, 형질 도입된 세포를 동정하기 위하여 동일한 바이러스 중의 분리된 카세트로서 발현되는 리포터 단백질 GFP과 함께, HEK293 세포에 의하여 생산된다(도 14). 이러한 벡터는 배양된 심근 세포의 근원 섬유 중의 천연 cTnC의 40-60% 치환을 규칙적으로 야기한다. 이 레벨은 몰켄틴(Molkentin) 그룹(아래)으로부터 유래한, L48Q 및 I61Q cTnC 유발 마우스에 대하여 얻어진 것과 유사하다.
실시예 16
[0188] 트랜스제닉 L48Q 및 I61Q cTnC 마우스의 사용. 야생형(WT), L48Q 또는 I61Q cTnC를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 개발하였다. 모든 컨스트럭트는 유도성 심장 특이적 α-마이오신 중쇄(α-MHC) 프로모터40를 활용하고, 근 세포의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 종전에 알려진 단일 3' 플래그 에피토프 태그를 포함한다4 1. cTnC 특이적 단일클론 항체(Abcam, 1A2 클론) 및 항-플래그 항체(Sigma) 둘 모두를 사용하는 전 심장 용출물의 웨스텐 블롯에 의하여, 플래그 태그된 cTnC로 천연 cTnC를 치환하는 퍼센트를 각각의 라인에 대하여 산정하였다.
[0189] 플래그 에피토프가 더 느린 운동성 cTnC 밴드(도 15)를 야기하므로, 천연 cTnC에 대한 트랜스제닉 cTnC의 비율을 밀도측정계로 측정하였다. 총 cTnC에 대한 플래그 태그된 cTnC의 비율은 % 치환을 나타낸다. 각각의 컨스트럭트에 대한 가장 높은 발현 라인은 ~40-50% 치환을 가졌는데, 이는 유전된 심근증 환자에 대하여 기대되는 치환과 유사한 것이다. 또한, 본 발명자들은 변형체 cTnC에 의한 천연 cTnC의 이러한 % 치환이, 박피된 표본 내 증가된 Ca2+ 민감성 및 온전한 근 세포 중에서의 증가된 수축을 생산하기에 충분하다는 것을 보였다. 본 발명자들은 동물 모델과 비교하기 위하여, 박피된 섬유주 중의 적정(titration) 비율(WT:변이체) 및 배양된 심근세포를 사용하여 이를 확인할 것이다. 또한 플래그 항체는 더블 트랜스제닉 마우스(DTG, TTA+ 및 cTnC+) 중의 이식 유전자의 강건한 발현의 증거를 제공하지만, 또한 이식 유전자 단독에 대하여 양성적인 마우스 중의 유도가능한 α-MHC 프로모터의 작은 누출도 보여준다.
실시예 17
[0190] 트랜스제닉 R92W/L cTnT 마우스의 사용. 변이는 인간 심근증 환자 중에서 발견되는 것과 유사한 것이다. 이형접합체 마우스는 cTnT 변이체의 ~50%(35-70% 범위)를 근섬유속으로 통합하고, 온화한 심비대를 경험한다. 이러한 마우스로부터 유래한 박피된 심장 조직은 짧은(1.9 ㎛) 및 긴(2.3 ㎛) 근절 길이(SL)15 둘 모두에서 증가된 Ca2+ 민감성(0.3-0.4 pCa 단위)을 갖는다. 배양된 심근 세포는 2달에, 더 짧은 휴지 SL, 감소된 수축율 및 이완율 및 상승/하강의 감소된 Ca2+ 전이 진폭 및 비율을 갖는다. 이는 6개월 제안 적응에 의하여 다소 개선시킨다. 변경된 Ca2+ 동태는 증가된 SR 로드 및 포스포람반(PLB)의 Ser16, 17의 인산화와 관련된다.
실시예 18
[0191] 경색된 심장의 제조. 좌측 하강 관상 동맥의 영구적 결착에 의하여 심근 경색을 얻는다. 이는 전형적으로 초음파 심장 검진(도 16A-C)을 통한 감소된 단편적 수축 및 증가된 공동 팽창과, 운동하는 심장 측정(도 6D)을 통한 증가된 프리로드에 대한 반응성의 손실과 함께, 좌심실 자유벽 절단 영역(총 LV 영역의 10-15%)의 ~30-35%으로 측정되는 경색된 영역을 야기한다.
실시예 19
[0192] 본 발명자들은 농도에 대한 cTnC 변이체의 영향과 SR 기능을 연구하기 위하여, 배양된 성체 심근 세포, 배양된 섬유주 및 근섬유 표본을 사용할 것이다. 배양된 심근 세포가 수축/이완 사이클 동안에 SR 기능에 대한 자세한 정보를 제공하는 동안에, 세포는 심장 내에서 처럼 외부 스트레인을 경험하지 않는다. 배양된 섬유주는 Ca2+ 전이를 모니터링하는 것과 함께, 로드 아래에서 정적(isometric) 힘 및 수축의 측정을 허여한다. 본 발명자들은 확산을 최대화하고, 표본 내 형광 프로브 침투 및 확산 구배로 인한 신호 변화를 피하기 위하여, 세포층이 거의 없는(깊이에서) 작고, 얇은 섬유주를 사용할 것이다. 분리된 근섬유 기전 측정은, 최대 및 서브-최대 Ca2+ 활성화 동안에, 그리고 근섬유 가는 섬유 속으로 통합된 cTnC 변이체의 변화하고(통제가능한) 정량가능한 레벨과 함께, 수축 및 이완 동역학의 자세한 연구를 가능하게 할 것이다. 표 12는 표본, 변화하는 자극 히스토리(AV 벡터로 감염, 24-48 시간), 시험되는 조건 및 자극 히스토리의 말단에 이루어지는 측정을 포함하여, 이 목적을 위한 실험을 요약한 것이다.
표 12: 실험적 표본 및 절차의 요약.
Figure pct00012
[0193] 표 12에 개요된 바와 같이, WT, L48Q, L57Q 또는 I61Q cTnC에 대하여 AV 벡터로 배양된 성체 래트 심근 세포의 감염을 수행한 다음에, 본 발명자들은 자극받지 않은 세포 vs. 자극 히스토리를 갖는 세포의 수축성 및 Ca2+ 전이를 측정할 것이다. 단기간 1 Hz 자극 히스토리(0-30 분)은 신속한 아드레날린 반응과 관련되는 근섬유 및 SR 기능의 급속한 적응 반응에 대한 정보를 제공할 것인 반면에, 더 긴 자극(1-24 hrs)은, 근섬유, SR, 근섬유성 단백질(sarcolemmal proteins) 및 관련 키나아제의 전사성 조절(실시간 PCR(RT-PCR)로부터 측정됨)을 포함하는 장기간의 적응 반응에 관한 정보를 산출한다. 초기 실험은 본 발명자들이 자극 히스토리가 수축, Ca2+ 사이클링 행동 및 아드레날린 반응성을 변경시키는지 여부를 결정할 수 있도록 할 것이다. 본 발명자들은 그 다음 독립적으로, 다음의 실험 조건하에서 이러한 효과를 연구할 것이다.
[0194] 본 발명자들은 Ca2+ 유도된 Ca2+ 방출(CICR)에 대한 잠재적 효과를 측정하기 위하여 세포 외 [Ca2+]([Ca2+]ext)를 변경시키고, SR 기능에 대한 수축성 기전의 영향을 측정하기 위하여, 근섬유 크로스브리지(CB) 억제제(BDM, blebbistatin)를 사용할 것이다. 본 발명자들은 반응이 cTnC 변이체에 의존한지 여부 및 그의 cTnI와의 상호작용을 측정하기 위하여, α-(페닐에프린) 또는 β-아드레날린(이소프로테레놀) 도전을 사용할 것이다. CB 억제제 및 아드레날린 길항제는 수축 및 Ca2+ 전이 측정에 앞서 제거될 것이다.
[0195] 수축 및 Ca2+ 전이 측정을 위하여, 심근 세포는 fura-2 AM으로 탑재될 것이며, 비디오 현미경(IonOptix, Milton, MA)을 사용하여, 0.5, 1, 2 및 3 Hz에서 수축/이완을 관찰할 것이다. SR 기능의 측정을 위하여, 종전에 기술된 바와 같이42, 니콘 x60 렌즈(NA = 1.4)와 결합된 니콘 스웹 필드 공초점 시스템을 사용하여, rhod-2 또는 fluo-4의 멤브레인-영구 아세트옥시메틸-에스테르 형태가 탑재된 분리된 심근 세포 중에서 (Co-I), 전반의 [Ca2+]i가 영상화될 것이다. 측정은 리아노딘 수용체(RyR), 육안으로 보이는 Ca2+ 방출 및 섭취 행동 및 카페인-유도된 SR Ca2+ 고갈을 사용한 SR Ca2+ 로드(load)로부터 유래한 국소화된 Ca2+ 방출 이벤트(스파크)의 진폭 및 빈도를 포함할 것이며, 모든 작업은 산타나 실험실에서 통상적으로 행해진다4 2 -46. 도 18은 WT cTnC와 비교하여, L48Q cTnC가 RT90 및 쇠퇴율(τ)을 약간 촉진함을 나타내는 예시적 Ca2+ 전이 흔적(rhod-2)을 보여준다. 상응하는 데이터는 표 13에 요약하였다.
표 13: 비감염(NA) vs WT 및 L48Q cTnC를 사용한 AV 감염에 대한, Ca2+ 전이 (rhod-2 형광) 진폭 및 동역학(1 Hz 자극).
Figure pct00013
실시예 20
[0196] 배양되고 박피된 섬유주(Trabeculae)를 사용한 실험: 본 발명자들은 인 비보에서 발생하는 때에, 외부 로드 아래 및 다양한 근절 길이에서 cTnC 변이체가 어떻게 수축에 영향을 미치는지를 결정할 것이다. 모든 cTnC 변이체에 대하여 AV 벡터를 사용한 감염 이후에, 얇은(직경 <120 ㎛, 깊이 ~50 ㎛) 심장 섬유주를 문헌(Adler et al.47 및 Janssen et al.48)에 의하여 보고된 바에 따라 배양할 것이다.
[0197] 초기 실험은 가는 섬유 속으로의 최적의 cTnC 변이체 혼입을 야기하는 감염 기간을 결정할 것이다. GFP 신호에 의하여 지시되는 바와 같이, 배양된 심근 세포 중에서 AV 감염의 24 시간 이내에 현저한 단백질 생산이 발생하며, 본 발명자들은 섬유주에 대해서도 유사한 결과를 기대한다. 수축 및 Ca2+ 전이는 1 Hz 자극 히스토리 후에 측정될 것이다(표 12). 표본에 fura-2를 로딩시키고, 자극 전극49 -51을 포함하는 산화된 관류 챔버 중의 힘 유도기와 선형 모터 사이에 위치시킬 것이다. < 60분의 자극 기간을 위하여, 자극 프로토콜의 개시 이전에 fura-2 로딩을 수행할 것이다. 배양된 심근 세포에 대한 바와 같은(위 참조) 동일한 프로토콜 하에서, 정적 수축(twitch) 힘 및 Ca2+ 전이와 그들의 SL 의존성(Frank-Starling 관계, SL = 1.9 vs. 2.2 ㎛)을 측정할 것이다. 본 발명자들은 표준 크렙스 헨셀레이트 용액, 95/5% O2/CO2 및 37℃48를 사용할 것이다. 종전에, 정적 수축 특성은 0.2-0.5 Hz 자극에서 24-36 시간52 동안 유지되었고, 본 발명자들은 이를 48+ 시간까지 연장시키는데 어려움이 없다고 기대한다.
[0198] Ca2+의 조절된 서브-최대 레벨에서, cTnC 변이체에 의하여 어떻게 근섬유 수축이 영향받는지에 대한 세부 사항을 얻기 위하여, 본 발명자들은 자극 프로토콜에 따라 형질 도입된 섬유주(trabeculae)를 화학적으로 박피(스킨)할 것이다. 본 발명자들은 pCa vs. 힘(force)과, 길고 짧은 SL에서 힘 재발전율(rate of force redevelopment; kTR)과 탑재된 수축을 측정할 것이다. 보충적 실험에서, 수축에 영향을 주는 변이체 혼입(얇은 섬유 속으로)의 중대한 레벨을 결정하기 위하여, 박피된 섬유주는 cTnC 변이체 및 WT cTnC의 혼합물로 교환될 것이다. 근섬유 속으로의 cTnC 변이체 혼합은 정량화될 것이다(아래 참조).
실시예 21
[0199] 근원섬유를 이용한 실험: 근원 섬유 이완은 정상적인 심장 기능의 중요한 요소이다; 심실은 충분한 확장기 채움을 가능하게 하기 위하여 수축기 이후에 신속하게 이완하여야 한다. 이는 병리학적 질환에서 종종 변경되는 중요한 과정이다. 큰 확산 거리를 갖는 박피된 섬유주 중에서 이완을 산정하기는 어렵다. 그러나, 근원 섬유 표본은, 온전한 세포 Ca2+ 전이와 독립적으로, 근원 섬유 활성 및 이완에 대한 cTnC 변이체의 평가를 가능하게 하면서, ms 시간 스케일로 신속한 용액 교환 및 힘 측정을 가능하게 하는 작은 확산 거리를 갖는다. 별도의 실험에서, 자극 프로토콜 이후에 근원 섬유 표본은, 힘 발전(kact) 및 kTR의 비율의 Ca2+ 의존성 및 느린(kREL,slow) 및 빠른(kREL,fast) 완화율을 측정하기 위하여, cTnC 변이체로 감염시킨, 저민 심장 근육으로부터 만들어질 것이다. 래트 심장 근원 섬유 속으로 교환된 재조합 WT, L48Q 및 I61Q cTnC가 어떻게 이러한 파라미터들에 영향을 주는지에 관한 예시가 도 19에 표시되어 있다. 패널 B는 kREL에 있어 작지만 현저한 증가, L48Q cTnC의 경우 느린 50% 이완 시간을 보여준다. 이는 배양된 심근 세포 중의 데이터와 함께 이상하게 보인다(표 10). 명백한 차이는 1) 정적 vs. 탑재되지 않은 조건, 2) 활성화 Ca2+의 다른 양 및 시간 코스, 3) 근원 섬유 속으로 혼입된 % cTnC에 있어서의 차이, 4) 근섬유 인산화에서의 차이, 또는 5) 완화 동역학에 영향을 주는 것으로 알려져 있는 ADP, Pi 또는 pH에서의 차이에 의하여 설명될 수 있을 것이다. 근원 섬유 연구에 있어서, 본 발명자들은 독립적으로 근섬유 단백질(PKA, PKC, 포스파타제 등)의 [ATP], [ADP], [Pi], [Ca2+], pH 및 인산화를 독립적으로 변화시켰는데, 도느 조건들은 심장에서 변화함, 온전한 심장 표본 중에서 조절하기가 어려운 것이다. 이 기술의 현저한 힘은, 힘 발전과 이완이 심장 수축기(kact) 및 이완기(kREL)의 등용성(isometric) 위상에 대하여 관련성을 갖는 수단을 제공하면서, 동일한 프로토콜 중에서 연구된다는 것에 있다.
실시예 22
[0200] 단백질 프로파일링: 모든 조건 하에서 수축 기능, Ca2+ 전이, SR 스파크 활성 및/또는 Ca2+ 로드의 변화는, 표 12의 프로토콜 조건과 일치하면서, 고밀도 세포 배양으로부터 유래한 근섬유 단백질(cTnI, cTnT, MLC-2, cMyBP-C 및 Tm), SR 단백질(PLB, RyR), 및 근형질막 단백질(PMCA, L-type Ca2+ 채널)의 풍부함 및 인산화와 상관 관계를 가질 것이다. 단백질 발현에서의 변화는 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 결정될 것이다. SR 단백질 단편은 출간된 방법53 -56에 따라 준비될 것이다. cTnC 변이체 혼입의 분석은 감염된 세포로부터 유래한 근원 섬유 표본의 웨스턴 블롯을 통하여 이루어질 것이다. 형질 도입된 단백질의 동정은, AV 벡터를 위한 cDNA 상에 있는 c-말단의 히스티딘 태그(His-tag)로 인하여 가능하다; AAV6 벡터도 동일한 목적을 위하여 C-말단 c-myc 태그를 포함한다. SDS-PAGE는 단백질 화학양론을 제공하고, 웨스턴 블롯은 비율 척도 분석(도 20과 같은 예시)을 위한 cTnC vs. His-태그 또는 c-myc 항체를 사용하여 탐지된다. 인산화에서의 변화는 Pro-Q 다이아몬드(단백질 함량을 위한 Sypro Ruby 스트레인을 사용함) 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 측정될 것이다. 도 21은 근섬유 단백질의 인산화가 WT vs. I61Q cTnC 감염된 심근 세포에 대하여 차이가 없다는 것을 보여주는데, 이는 I61Q cTnC를 사용한 감소된 수축(표 10)이 트로포닌 Ca2+ 결합 및 SR Ca2+ 방출의 변화에서 비롯된 것임을 제시한다. 장소 특이적 세린 및 트레오닌 잔기 인산화에 대하여, 질량 분광 분석을 위하여 시료를 보낼 수 있다.
실시예 23
[0201] 실시예 19 내지 22에 개요된 연구의 전체 세트는, 변경된 심장 가는 필라멘트 Ca2+ 결합이 다양한 조건 하에서 어떻게 수축 및 Ca2+ 항상성에 영향을 미치는지와, 반응이 단백질의 번역 후 변형(인산화)를 통하여 어떻게 매개되는지에 관한 자세한 정보를 생산할 것이다. 본 발명자들은 심근 세포 중에서 근섬유 Ca2+ 결합 및 Ca2+ 항상성의 조절에서의 변경 사이에 직접적인 관계가 있음을 기대한다. 몇 가지 기대되는 결과 및 잠재적인 가설은 다음과 같다:
[0202] L48Q cTnC: L48Q cTnC는 휴지기 심근 세포의 Ca2+ 전이에 거의 영향을 미치지 않으면서(표 10) 수축 및 근섬유 Ca2+ 민감성(표 9)을 증가시킨 반면에, 24 시간의 1 Hz 자극은 둘 다를 증가시켰고, 또한 Ca2+ 전이 쇠퇴를 촉진하였다(도 17). 이는 자극이 인 비트로 근형질막(sarcolemmal) 및 SR Ca2+ 행동에 주로 영향을 미칠 수 있는 반면에, L48Q cTnC는 근섬유 행동에 주로 영향을 미치는 것을 제시한다. 따라서, 본 발명자들은 자극 히스토리가 아마도 SR/근형질막 단백질 인산화를 경유하여, 힘 및 수축 내에 수반하는 증가를 가지고 SR 기능(Ca2+ 로딩, CICR 등)에 영향을 미칠 것을 기대한다. 예를 들어, 자극 히스토리를 따르는 증가된 Ca2+ 전이 진폭 및 재-격리는 각각 RyR 및 PLB의 증가된 인산화에 기인하는 것일 수 있다5 7 ,58. 따라서, 본 발명자들은 β-아드레날린 자극이 자극 히스토리를 가진 것들 보다 비자극된 세포에 더 영향을 줄 것을 기대한다. 본 발명자들은, 크로스브리지(CB) 억제가 SR 기능을, I61Q cTnC와 함께 관찰되었던 것과 유사하게 감소시킬 것을 기대하는데, 이는 수축성을 또한 감소시킨다(도 11; 표 10). 조합하면, 이는 SR Ca2+ 방출 자체의 전기적 자극과는 대조적으로, 근섬유의 기계적 행동(또는 Ca2+ 버퍼링 용량)이 자극된 수축 동안에 SR 기능에 영향을 미친다는 가설을 제안한다. 만일 그렇다면, 로드와 함께 CB 수가 증가함에 따라, CB 억제는 비탑재된 심근 세포보다 온전한 섬유주(trabeculae)의 탑재된 농도에 더 영향을 미쳐야 한다. L48Q cTnC가 Ca2+ 전이에 거의 영향을 미치지 않기 때문에, 본 발명자들은 SR 기능, 근섬유 또는 SR 단백질 함량 또는 비자극된 세포의 인산화에서의 변화를 거의 또는 전혀 기대하지 않는다. 이는 더 큰 근섬유 Ca2+ 민감성 및 더 큰 CB 활성으로 인하여, 자극 히스토리와 함께, 그리고 온전한 섬유주 내에서 다를 수 있다.
[0203] I61Q & L57Q cTnC: L57Q 및 I61Q cTnC는 휴지기 심근 세포의 근섬유 Ca2+ 민감도, 수축 및 Ca2+ 전이 진폭을 감소시켰다(표 10). 이는 근섬유 활성이 SR 기능에서의 변화를 이끌 수 있다는(자극 히스토리가 있는 경우에서 또한 관찰된 바와 같은), 앞서 언급한 가설을 뒷받침한다. 결과는 감소된 Ca2+ 전이 중에서 야기된 특이적인 기계론적인 변화를 측정하는데 도움이 될 것이다. 예를 들어, L57Q 또는 I61Q cTnC와 함께 감소된 SR Ca2+ 방출은, 감소된 키나아제 활성 및 증진된 포스파타제 활성으로부터 야기되는, 감소된 RyR 인산화를 제안할 것이다. 대안적으로, 이러한 cTnC 변이체는 SR Ca2+ 로딩(감소된 PLB 인산화를 통한) 내에 변화를 일으킬 수 있는데, 이는 또한 Ca2+ 전이 진폭을 감소시킬 것이다. 만일 그렇다면, β-아드레날린 자극은, WT 또는 L48Q cTnC와 비교하여, I61Q 또는 L57Q cTnC 감염된 세포 중에서 증가하는 SR 기능 및 Ca2+ 전이에 더 큰 영향을 가질 것이다. 본 발명자들은 가는 필라멘트에 CICR 및 Ca2+ 결합을 증진시키는 것에 의하여 수축성을 증가시키기 위하여, 더 높은 자극 주파수(측정 중에 2-3 Hz vs. 0.5 Hz)를 기대하는데, 이는 차례로 SR 로딩 및 기능을 변경시킬 수 있다. 자극 히스토리(1 Hz)가 유사한 효과를 제공할 지 관찰하는 것은 흥미로울 것이다. 본 발명자들은 증가하는 [Ca2+]ext가 CICR 메카니즘을 강화하는 것에 의하여 Ca2+ 전이 및 SR 기능에 대하여, L57Q 또는 I61Q cTnC의 완화 효과를 행사할 것을 기대한다.
[0204] 이완: 본 발명자들은, 비록 이완이 배양된 심근 세포에 대해 거의 영향을 미치지 않았음에도 불구하고, 온전한 섬유주의 이완이 cTnC 변이체에 의하여 영향 받을 것을 기대한다. 이는 섬유주가 정적 수축을 겪을 동안에, 배양된 심근 세포 중에서 수축이 언로드(unload) 되기 때문이다. 따라서, cTnC Ca2+ 결합 특성은 로드된 수축 동안에 더 현저한 영향을 가질 수 있는데, 여기서 이완 동역학은 주로 크로스브리지 사이클링 비율 및 허혈59 -64 중에 변화하는 ATP 가수분해 기질/산물 조건에 의하여 주로 측정된다. 만일 경련 이완이 cTnC 변이체에 의하여 영향 받는다면, 본 발명자들은 서브 최대 (Ca2+) 활성화된 근섬유의 이완율(특히 kREL, 느린)이 유사하게 영향받을 것을 기대한다. 또한 근섬유 실험은, 이완 변화가 SR 기능이 아니라 근섬유 행동 때문인지를 본 발명자들이 결정할 수 있게 할 것이다.
실시예 24
[0205] 본 발명자들은 AAV6-cTnC 벡터 및 트랜스제닉 마우스를 이용하여 심장 기능에 미치는 cTnC 변이체의 급성 및 만성 효과를 연구할 것이다. 근섬유 세포 기능에 있어서 급성 변화에 대한 반응을 탐지하기 위해 본 발명자들은 심장 특이 프로모터 (cTnT455)가 있는 AAV6-cTnC 변이체 (WT, L48Q, L57Q, 또는 I61Q)를 꼬리 정맥 또는 안와 주사를 통해 성체 마우스에게 형질감염시킬 것이다. 또한 성체기가 될 때까지 MHC 프로모터를 억제함으로써 L48Q cTnC 및 I61Q cTnC 트랜스제닉 마우스에 대해서도 실험을 병행한다. 정상적인 심장 발달 및 기능에 대한 이들 cTnC 변이체의 효과를 탐지하기 위해 프로모터 억제가 없는 마우스들에 대하여도 부가적인 연구를 수행할 것이다. 이 목표 범위를 제한하기 위해, 본 발명자들은 성체 마우스에 대해 중점적으로 연구의 초점을 맞추기로 한다. 그러나, 기능상 변화의 개시 및 진전을 모두 탐지하기 위해 제1개월, 2개월, 3개월 및 6개월령에서의 심장 초음파 평가도 수행할 것이다. 몇몇 동물들에 대하여는 이소프로테레놀을 이용한 β-아드레날린 자극을 통해 스트레스를 가하게 할 것이다. 심장초음파 검사 후 몇몇 동물들에 대하여는 Millar 카테터 프로토콜을 이용하여 혈류 역학적 검사를 수행하고 다른 동물의 경우 작동 심장 프로토콜을 위해 또는 온전하거나 박피된 심장근육기둥 표본, 배양된 심근 세포 또는 근원섬유 표본을 만들기 위해 안락사시킬 것이다.
실시예 25
[0206] 심장초음파(심장초음파). 심장초음파 기술을 이용하여 비침습적으로 생체내 심장 기능 평가를 수행하고자 한다. 흉골연장축단면 영상을 이용하여 좌심실 유출로 및 유출로 단면(CSA: cross sectional area)을 통한 유속을 측정하여 일회 박출량 (stroke volume) (SV = CSA x 시간속도 정수 (대동맥 유속 면적)) 및 심장박출량(cardiac output) (CO = SV x 심박수)65을 측정한다. 좌심실 수축말기 내경(LVESD) 및 좌심실 확장말기 내경(LVEDD), 전벽 및 후벽 크기의 M-모드 측정값을 산출하기 위해 심실중앙(유두근)에서의 단축면상 2-D 검사방법을 이용한다. 이들 검사법을 이용하여 분획 단축 백분율 [(LVEDD-LVESD)/LVEDD x 100%] 및 좌심실벽 무게[1.05(IVS 두께 + LVEDD+PW 두께)]66, 67를 산정한다. 서로 다른 2 세션 동안 한 명의 판독자가 제공하는 인트라-관찰자 및 인터-관찰자 변이값 및 2명의 맹검 판독자들이 수개 영상을 판독한 측정값들을 이용하여 품질 관리를 한다.
실시예 26
[0207] 생체내 생리학(in vivo Physiology). 미니어쳐 교류저항/마이크로압력계 카테터(Millar Instruments)를 이용하여 Frank-Starling & 압력-용적 관계에 있어서의 변화 및 심수축성의 실시간 평가를 실시한다. 혈류 역학 변수들로는 심박수, 확장말기 및 수축말기, +dP/dt, -dP/dt, 박출작업량(stroke work (SW)) 기울기 vs. 확장말기 용적(EDV), 및 심실압력 감퇴의 시간 상수를 들 수 있다. 이들 작업-수행 변수들은 유사한 프리-로드 및 애프터-로드 하에 마우스 심장의 수축/이완 변수들의 동력학 연구시 시험관내 작동 심장 (후술 내용 참조), 섬유주 및 근원섬유 측정치와 비교하는 것이 더 좋다.
실시예 27
[0208] 시험관내 작동 심장 (In vitro Working Heart). 심장초음파 검사 후, 동물 실험 말기에, 몇몇 심장들을 절제하여, 생체내에서는 평가하기가 더 어려운 시험들인, 펌프 성능과 다양한 프리-로드 및 애프터-로드(±이소프로테레놀)에 대한 반응 능력으르 평가하기 위해 작동 심장 기구 (Experimetria) 상에 절제된 심장을 장착한다. 이어서 이 심장들에 대하여 형태학적 및 조직학적 분석을 수행한다. 도 16D는 정상 심장에 비해 경색된 래트 심장에서 프리로드에 대한 반응(출력:power output)이 감소됨을 보여준다.
실시예 28
[0209] 섬유주, 심근세포 및 근원섬유. 종점 심장초음파 검사 후, 몇몇 심장들을 절제하여 1) 온전하거나 박피된 섬유주의 절제, 2) 배양 중 심근세포, 또는 3) 근원세포 표본을 위해 , 심실을 준비한다. 전술한 바와 같이 실험 측정을 수행한다.
실시예 29
[0210] 형태학 및 조직학적 분석: 시험관내 작동 심장 측정에 사용된 심장들을 포함하여 몇몇 절개된 심장들을 중량 분석을 위해 잘 확립된 공정27 ,68에 따라, 고정, 포매 및 염색시킨다 (H&E, Masson's Trichrome, Picrosirius Red). 심장 비대 (세포 및 심실) 및 확장 징후에 대해 표본들을 평가한다. 잠재적인 섬유화의 평가를 위해, 총 픽셀에 대한 피크로시리우스 적색-포지티브 픽셀 갯수의 %로서, 원형 편광 하 이미지로부터 % 콜라겐 면적을 정량한다. 형질도입된 심장들의 시리즈 섹션들을 mCherry (또는 myc-tag) 포지티브 세포 백분율의 정량을 위한 ImageJ를 이용하여 분석하여, AAV6-cTnC 변이체 처리에 이은 생체내 및 시험관내 기능에 있어서의 변화들과 연관시킨다.
실시예 30
[0211] 실시예 24 내지 29에 개략된 체계적인 일련의 연구에 의해, 내재적 순응이 끊임없는 측분비 및 호르몬 요동을 겪게 되는 생체내 수축의 근섬유 세포 Ca2+ 감수성에 영향을 미치는 변이에 대한 단기간 및 장기간 심장 순응에 관한 상세한 정보가 제공될 것이다. 본 발명자들은 근섬유 세포들의 Ca2+ 감수성을 변경시키는 cTnC 변이체들이 심장 기능, SR 기능 및 근섬유 세포/SR 단백질 프로파일에 대한 급성 vs. 만성 효과를 달리할 것으로 예상한다. 심부전은 β-아드레날린 응답성의 하향 조절 (및 PKC 발현과 표적 인산화의 상향 조절69 -71)과 연관이 있는 반면, 본 발명자들은 심장 펌프 기능을 증가시키려는 시도에서 단기간 동안 161QcTnC가 β-아드레날린 매개형 효과를 증가시킬 수 있을 것으로 기대한다. 마찬가지로, L48Q cTnC에 의한 증가된 심장 수축성 (도 12)에 의해 β-아드레날린 응답성은 감소될 수도 있을 것이다. 이에 더해, 본 발명자들은 수축 활성이 현저히 개선됨에 따라, 얇은 필라멘트 활성화에 대한 CB기여 요구도가 낮아지게 되어, L48Q cTnC에 의한 단기간의 심장 조직 수축 (시험관내) 및 증가된 펌프 (생체내)의 Frank-Starling 메카니즘의 블런팅을 발견할 수도 있다72. I61Q cTnC의 경우, Frank-Starling 메카니즘은 온전하게 유지될 수 있으나, 전체적인 펌프 기능은 저하하기 쉽다. 트랜스제닉 동물에 있어서, 이러한 영향은 근섬유 세포 수축성의 변화를 보상하는 인산화 및/또는 SR 단백질 함량의 장기간 순응을 통해 없어질 수 있다.
[0212] 본 발명자들은 또한 변경된 근섬유 세포 Ca2+ 감수성 자체가 비대성 또는 확장형 심실 기능 및 형태학적 표현형을 생성할 수 있을지에 대하여도 직접 시험하고자 한다. 본 발명자들은 AAV6-cTnC 형질도입에 비교적 단기간 노출되는 경우에는 이것이 일어나지 않을 것으로 가정하지만, L48Q cTnC (비대성) 및 I61Q (확장) 트랜스제닉 마우스가 나이가 들어감에 따라, 어느 정도 이러한 것이 일어날 수도 있을 것이다. 본 발명자들은 이들 cTnC 변이체 노출 이력 각각에 있어서 SR/횡문근형질막 및 근섬유세포 단백질 인산화 프로파일이 차이가 있을 것으로 기대한다.
실시예 31
[0213] 본 발명자들은 경색된 심장에 대한 L48Q cTnC의 효과 및 R92W/L cTnT 돌연변이된 어린 마우스와 성체 마우스에 대한 I61Q (또는 L57Q) cTnC의 효과에 대하여도 연구한다. 경색된 심장(Infarcted Hearts). L48Q cTnC가 심근경색 후 심장 기능을 개선시킬 수 있을지를 알아보기 위해, 본 발명자들은 경색-수술 3-7일 후 마우스들을 AAV6-L48Q cTnC로 형질감염시킨 다음, 심장초음파를 찍어서 기능 결손의 정도를 특징화할 것이다. 기능 증가 연구에 최적 시점을 찾기 위해 형질감염 1, 2, 4 및 8주일 후에 초기 심장초음파 평가를 실시한다. 본 발명자들은 또한 최적 치료 스케쥴 결정 및 이를 근원섬유 내로의 L48Q cTnC 혼입과 연관짓기 위해 벡터 선량 연구도 실시한다 (상기 내용 참조). 정상 마우스(도 12)에 주입된 낮은 선량(0.6 x 1012)은 증가하는 박출률에서 상당히 효과적이었다. 본 발명자들은 이어서 몇몇 동물에 대하여 Millar 카테터 실험 (전술한 바와 같음)을 통해 현장(in situ) 혈류역학 특성을 측정한다. 부가적인 동물들을 이용하여 작동 심장, 온전한 섬유주 및 박피 섬유주, 배양된 심근세포 및 단리된 근원섬유들에 대한 시험관내 연구를 실시한다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 어떤 표본이 가장 효과적으로 교시하는지를 결정하여 그 표본들에 초점을 맞춰서 대부분의 측정을 수행함으로써, 이들 연구에 필요한 동물의 수를 제한하고자 한다. L48Q cTnC가 좌심실 기능의 손실을 예방하는지를 알아보기 위해, 또 다른 세트의 동물들을 심근경색 수술에 앞서, AAV6-L48Q cTnC로 형질감염시킨다. 시험관내 작동 심장 측정에 사용된 것들을 비롯하여 몇몇 절개 심장들을 중량 분석을 위해 채취, 고정, 포매 및 염색하여 심장 비대 및 섬유화 징후를 평가한다 (전술한 바와 같음). 경색 부위 크기 및 % mCherry 포지티브 세포의 정량을 위해 ImageJ를 이용하여 경색된 심장들의 시리즈 절편들을 분석하여, AAV6-L48Q cTnC 형질감염 후 생체내 및 시험관내 기능의 변경 간의 연관성을 분석한다.
실시예 32
[0214] R92W/L cTnT 트랜스제닉 마우스. R92W/L cTnT 마우스들을 1개월령 째에 AAV6-I61Q (또는 L57Q) cTnC로 형질감염시켜, 이들 변이체들이 저하된 심장 기능, 증가된 근섬유 세포 Ca2+ 감수성 및 저하된 SR 기능 (PLB ser16, 17 인산화58 , 73와 연관됨)을 비롯하여, 2개월째 보고되는 기능적 표현형들을 감소 또는 제거시키는지를 탐지한다. R92W 심장들은 심근병증 마커 (심방나트륨이뇨인자, α-골격 액틴)의 유도를 조기에 (2개월) 수행하는데 이는 R92L에 의한 유도가 늦게 일어나는 것과 (10개월) 대조되는 것이므로, 본 발명자들은 이러한 후기 치료가 R92L 마우스에 있어서 후기 마일드 비대증을 감소 또는 제거하는지를 알아보기 위해, 5-6개월령의 R92L 마우스 역시도 형질감염시킨다.
안정한 발현 및 근섬유 세포 내로의 I61Q (또는 L57Q) cTnC의 혼입이 일어난 확립된 시점(도 12)에서 심장초음파검사 결과를 분석한다. 몇몇 마우스들에 대하여는 심장 기능에 미치는 AAV6 처리 효과가 지속되는지를 알아보기 위해, 생후 1년이 될 때까지 2개월마다 추적 검사한다. 측정 말기에, 몇몇 동물들을 혈류역학 측정에 이용하고 (전술한 바와 같음) 다른 동물들은 전술한 바와 같이 작동 심장, 온전한 섬유주 및 박피 섬유주, 배양된 심근세포 및 단리된 근원섬유에 대한 시험관내 연구에 이용하였다.
실시예 33
[0215] 심장초음파에 의한 변형(strain) 분석. M-모드 측정에 더해, 커런트 심장초음파 트랜스듀서는 고급형 기능 측정에 충분한 해상도를 제공한다. 이것은 시험관내 측정결과와 생체내 측정결과의 연관성을 제공하는 변형률(strain rate) 및 수축 및 확장 세그먼트 스트레인의 측정을 포함하여, 심실벽 탄성 및 (적절한) 심실벽 운동에 대한 부가적인 기능 변수를 제공한다. 이것은 정상 심장, 경색된 심장 및 R92W/L HCM 심장에 대한 cTnC 변이체들의 영향을 연구하는데 중요한 지침이 될 것이다. 변형이라 함은, 스트레스되지 않은 심근의 본래 크기로부터, 연장(lengthening), 압축(compression), 또는 단축(shortening)77 ,78에 의한 길이 변화를 나타내는 것으로 변형률은 관심 대상의 2개 시점 간의 경시적인 크기 변화의 측정값이다. 반점 추적(speckle tracking)에 의해 초음파 빔에 의해 생성되는 독특한 그레이스케일 반점이 어사인되며, 그의 독특한 형태를 소프트웨어로 추적하여 1회 심장 사이클 동안 반점의 이동 속도에 기초하여 변형 및 변형률이 산정된다 79, 80. 하나의 예시적인 반점 추적 연구(도 22)로부터 고혈당 마우스에 있어서 수축 및 이완 심장 기능을 알 수 있다. 반점 추적은 전통적인 심장초음파 검사에서와 같이 단축면 상을 이용하여 얻어지므로, 부가적인 연구는 필요하지 않다.
[0216] 본 발명자들은 근섬유 세포 (L48Q cTnC) 의 Ca2+ 감수성을 증가시키면 경색된 심장의 심장 성능이 증대되고 심장발작의 진행이 둔화될 것으로 예상한다. 이것은 만성적인 β-아드레날린 자극의 저하에 의해 일어날 수도 있다. 만일 그렇다면, 본 발명자들은 L48Q cTnC 형질도입 심장 vs. 미처리된 경색 심장 간의 α- 및 β-아드레날린 매개형 단백질 인산화에서 반영된 부교감 및 교감 긴장도 균형에 있어서 시간 의존차를 보게 될 것이다.
[0217] R92W cTnT 마우스의 경우, 본 발명자들은 1개월에서의 I61Q cTnC 형질도입이 적어도 부분적으로 2개월령째 관찰되는 R92W cTnT의 해로운 효과를 없애서, 궁극적으로 심장 기능의 향상을 결과시킬 것으로 예상한다. 이것은 이들 마우스들이 나이가 들어감에 따라 이들의 순응적 반응에서 일어나는 것으로 관찰된 SR 단백질 (예컨대 PLB) 및 SR Ca2+ 로드의 변경된 인산화로부터 야기된 것일 수 있다 (58). 마찬가지로, 본 발명자들은 R92L cTnT 마우스들의 나중의(later) I61Q cTnC 형질도입 (5-6개월령에서의 형질도입) 역시 SR 단백질의 인산화를 변경시켜, 심장 비대 반응을 둔화시키고 심장 기능을 향상시킬 것으로 기대한다.
실시예 34
[0218] 배양된 성체 래트 심근세포의 의 자극된 수축에 미치는, 향상된 R1R2 및 [dATP] 의 효과를 특징화하였다. 아데노바이러스 (AV) 벡터. R1 또는 R2 서브유닛 중 어느 하나를 발현하고 녹색 형광 단백질 (GFP)에 대한 2차 발현 카세트를 발현하는 CMV 프로모터에 의해 추진되는 AV 벡터 (~250 입자/세포)를 이용하여 ~ 48 시간 동안 심근세포의 형질도입에 의해, R1R2 과다 발현을 유도하였다. 본 발명자들은 또한 형질도입/리포터 대조군으로서 GFP-온리(only) AV 벡터도 생성하였다. R1R2 과다 발현 정도를 측정하기 위해, 동일 조건 하에서 신생아 래트 심근세포들을 AV 벡터로 형질도입하고 웨스턴 블롯 분석에 의해 단백질 레벨을 측정하였다. R1 (도 23A) 및 R2 (도 23B)는 로딩 대조군으로서 GAPDH에 대해 각각 24배 및 46배 증가되었다. HPLC 분석 결과 이것은 GFP 형질도입된 심근세포 (도 23C)에 비해 세포 [dATP]를 ~10배 증가시킴을 나타내는 것이다 (0.35 nmol/mg 단백질). 이것은 AV 입자 로드에 대한 복수 세포 뱃치 전반에 걸쳐 일관되었다 (8-12배 범위). 이 효과는 뚜렷한 반면, [dATP]가 일반적으로 총 아데닌 트리포스페이트 뉴클레오타이드의 >0.2%를 포함함으로 해서, 상승된 [dATP]는 여전히 아데닌 뉴클레오타이드 풀의 경우 ~1-1.5%에 지나지 않는다. 이것은 심근세포 수축성을 유의적으로 증가시키는데 오직 소량의 dATP만이 필요함을 시사하는 것이다.
실시예 35
[0219] R1R2 과다 발현은 심근세포 수축을 향상시킨다. 예시적인 트레이스들 (도 24)은 비디오 길이 탐지 및 형광 조영 (IonOptix)을 이용하자, AV-R1R2 형질도입이 훨씬 큰 심근세포 단축 (A)와 함께 최대 세포내 Ca2+(B; Fura-2)에 있어서 아무런 증가를 나타내지 않음을 보여주고 있다. 0.5 Hz (25℃)에서 자극된 > 50 세포 (각각의 조건)에 대한 데이터를 표 14에 요약하였는데, 이로부터 AV-R1R2 형질도입이 Ca2+ 전이 진폭(transient amplitude) 또는 기초 수준에 영향을 미침이 없이 단축을 ~ 50% 증가시키고 단축률과 이완율을 ~100%까지 증가시키는 것으로 나타났다. 이것은 증강된 수축이 주로 근섬유 세포들에 기인하는 것임을 시사하는 것이다. R1R2 과다 발현이 Ca2+ 전이 강도(transient magnitude)는 변경시키지 않은 반면, 50% (DT50) 및 90% (DT90) 감퇴시간은 단축되었는데, 이는 개선된 SR Ca2+ 재흡수 또는 Na+/Ca2+ 익스체인저 (NCX)-매개된 유출이 있음을 시사하는 것이다. 이러한 결과들은 1Hz 및 2 Hz 자극의 경우에도 일관되었다.
표 14: R1R2 과다 발현은 심근세포 수축을 증강시킨다.
Figure pct00014
실시예 36
[0220] R1R2 과다 발현은 경색이 일어난 심장으로부터 심근세포들을 '구조(rescues)'한다. 좌하방 대동맥을 접합시킴으로써 성체 래트에서 심근경색증을 유발시켰다. 4주일 후, 성체 래트의 심근세포를 배양한 다음 AV-R1R2 또는 AV-GFP를 이용하여 48 시간 동안 형질감염시켰다. 세포 분리에 앞서 생체내 심장초음파에 의해 기능 상실을 확인하였다 (도 34). 도 25는 대조군 세포(경색 없음)에 비해 경색된 심장으로부터의 심근세포들에서 단축 강도 (A) 및 속도 (B)가 감소되고, 이완 시간 (C)이 증가하고 Ca2+ 전이 진폭(D)은 감소하였음을 보여준다.
[0221] 이러한 효과는 AV-R1R2 형질도입 (Infarct + R1R2)에 의해 구제되었다. 흥미롭게도, R1R2-과다 발현은 정상적인 심근세포에 있어서는 Ca2+ 전이 강도에 영향을 미치지 않았으나, 경색된 세포에 있어서는 대조군 수준까지 강도를 증가시켰다. 이는 R1R2 과다 발현이 경색된 세포에 있어서 SR Ca2+ 저장 및/또는 방출에 유의적인 효과를 미친다는 것과, 이러한 작용의 배후 메카니즘이 후술하는 바와 같이 보다 상세한 연구 조사를 보증함을 시사하는 것이다.
실시예 37
[0222] 생체내 연구. R1R2 과다 발현이 심장 기능에 어떻게 영향을 미치는가를 측정하기 위해, 본 발명자들은 아데노바이러스 - AV-R1R2(+GFP) 또는 AV-GFP(단독; 대조군) (각 그룹 당 4-6)을 C57/Bl6 마우스의 꼬리 정맥에 또는 심장에 직접 주입하여 형질감염시켰다. 도 26A는 이들 두 가지 방법 모두, 주사 후 제4일에 대조군과 비교할 때 좌심실(LV)의 단편적 수축(FS)을 증가시켰음을 보여준다. 이러한 증가는 이완기 동안에는 아무 변화 없이 수축기 동안 LV 내경이 감소되었기 때문으로, 이는 더 큰 심실 수축을 시사하는 것이다 (심실 확장이 아니라). 도 26B는 주사된 LV를 도시한 것으로 우측에 확대도가 포함되어 있는데, 녹색 형광 (GFP로부터)에 의해 표시되는 국소화된 형질도입 부분(화살표)이 나타나있다. 중요한 것은, 심장의 적은 부분만이 직접 주사에 의해 형질도입된 경우에 조차, 전체적인 커다란 기능 증가가 나타났다는 것이다 (도 26A, 우측 막대).
[0223] 본 발명자들은 부가적인 연구를 통해 심박률 및/또는 일회박출량이 영향을 받는지를 알아보고자 한다. 이러한 연구를 위해, 본 발명자들은 TG-R1R2 마우스의 백그라운드 동물종인 FVB/N 마우스들을 이용한다. 본 발명자들은 또한 장기간 구조 순응성이 존재하는지 역시도 조사할 것이다. 초기 연구 결과 전반적인 형태학적 차이는 없는 반면 (심장 중량:체중 비 및 심실 두께 및 무게는 유사함), 세포 비대성, 근원섬유 밀도 등은 측정할 필요가 있는 것으로 나타났다.
실시예 38
[0224] 심근을 통한 dATP 확산은 AAV6-R1R2 형질도입의 효과를 증가시킨다. AV-R1R2 직접 주사의 경우, AV-R1R2 형질도입 면적이 적은데도 불구하고 놀랍게도 FS가 크게 증가한 것으로 관찰되었다 (<1% LV 부피는 GFP+였음). 이것은 소수의 심근세포들이 R1R2을 과다 발현시켜, 결과적인 dATP가 형질도입되지 않은 세포 내로의 갭 정션을 통해 확산되어, 수축성을 보다 전체적으로 증가시키는 결과를 초래하였음을 시사하는 것이다. 갭 정션을 통한 ATP의 확산은 다른 사람들에 의하여도 보고된 바 있다33 ,34. 이러한 이론을 시험하기 위해, 본 발명자들은 형광-태그된 dATP를 배양된 hESC 심근세포 내로 주입하고 주변 세포로의 경시적인 확산을 관찰하였다 (도 35A, B). 고정 후(Post-fix) 세포 염색은 코넥신43 양성이었으며, 이는 갭 정션 커플링의 증거가 된다. 본 발명자들은 이 연구를 계속하여 확산의 정량적 분석 결과를 제공하고 갭 정션 차단 역시 dATP의 전달을 차단함을 입증하였다. 본 발명자들은 또한 AV-R1R2 형질도입된 (dATP 공여자) 인간 배아 줄기 세포 유래된 심근세포 (hESC-CMs) 및 형질도입되지 않은(수혜자) hESC-CMs를 공동 배양하였다. 형질도입되지 않은 세포(비형질도입 세포)들을 탈착시켜 바이러스 형질도입된 코호트(cohorts) 중 하나와 공동 배양하였다. 형질도입한지 48 시간 후에 이들 공동-배양체들의 영상을 찍고 비디오 현미경(IonOptix,)에 의해 수축 변수들을 평가하였다. 도 35C는 이들과 공동 배양된 GFP-null 근육세포 및 AV-R1R2-형질도입된 근육세포("dATP 공여자 세포", 청색 트레이스) 두가지 모두가 이들의 GFP-null 파트너 ("대조군 공여자 세포, 녹색 트레이스) 또는 AV-GFP-형질도입된 근육세포(대조군 공여자 세포", 녹색 트레이스)들에 있어서보다 유의적으로 더 큰 세포 수축을 일으켰음을 보여준다. 이것은 R1R2-과다 발현 dATP 공여자 세포들이 커플링된 수혜자 심근세포의 수축 특성을 개선시킬 수 있음을 증명하는 것이다. 따라서 이제까지의 데이터는, 심장 기능의 유의적인 개선이, 심장을 통한 세포/조직의 고도의 R1R2 형질도입을 요구하지 않을 수도 있음을 시사하는데 충분한 것이다.
실시예 39
[0225] 예비적인 생체외(ex vivo) 심장 기능. 하나의 WT 및 하나의 TG-R1R2 마우스 심장에 대해 랑겐도르프(Langendorff) 관류 동안 등적 수축 기능을 기록하였다. WT 및 TG-R1R2 심장 두가지 모두에 있어서, LV 압력 발달은 LV 용적이 증가함에 따라 증가하였는데, 이는 정상적인 Frank-Starling 반응성을 가리키는 것이다. 그러나, LV 압력 발달은 모든 LV 용적에서 TG-R1R2 심장에서 상승하였는데 (도 28A), 이는 TG-R1R2 동물들에 있어서 증가된 FS가 가리키는 바와 같이 증가된 펌프 기능을 확인하는 것이다 (도 27). LV 압력 발달은 [Ca2+]가 2 mM에서 4 mM로 증가함에 따라 TG-R1R2 심장에서 약간 둔화되었으나(도 28B) 관측 기간 내내 WT 심장보다는 높게 유지되었다.
실시예 40
[0226] 31P NMR 데이터. 기능 측정과 동시에, 베이스라인 관류 동안 높은 [Ca2+] 챌린지와 함께, 심근 고에너지 포스페이트 함량 (포스포크레아티닌, ATP, 및 Pi)을 31P NMR 분광광도계로 측정하였다. WT (A) 및 TG-R1R2 (B) 심장에 대한 NMR 스펙트럼(도 29)을 나타내었다. 이들 스펙트럼에서, 최하부 바닥 트레이스는 베이스라인, 중간 트레이스는 높은 [Ca2+] 챌린지 개시로부터 10분 후, 최상부의 톱 트레이스는 20분 후의 스펙트럼이다. 중요한 것은, 베이스라인에서의 ATP:심장 중량비가 WT 심장과 TG-R1R2 심장에서 동일하며 (도 29C, 내부도) 높은 [Ca2+] 챌린지가 이루어지는 내내 변화하지 않았다는 것이다. 포스포크레아틴 대 ATP 비(도 29C)는 TG-R1R2 마우스의 경우 베이스라인에서 약간 낮은 반면, 높은 [Ca2+] 챌린지 후에는 아무 변화가 없었다. 이것의 가장 큰 이유는 WT 마우스에서 PCr/ATP 비가 감소한 반면, TG-R1R2 마우스에서는 PCr/ATP 비가 유지되었기 때문이다. 이것은 TG-R1R2 심장이, PCr/ATP 비가 맷치되는 때인 높은 [Ca2+] 챌린지로부터 20분 후에조차, WT 심장보다 훨씬 높은 LV 압력을 발생시킨다는 점에서 특히 흥미롭다. 본 발명자들은 급성 및 만성 R1R2 과다 발현, 및 후속되는 심근경색 +/- R1R2 과다발현에 있어서 이러한 관찰결과를 확인 및 확장하고자 한다.
실시예 41
[0227] AAV6 컨스트럭트를 이용한 조직 특이적 표적화. AAV6 컨스트럭트들에서 다양한 유전자 프로모터에 의해 구동되는 알칼라인 포스파타제를 이용하여 조직 특이성을 평가하였다. 표 15에 비특이적 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 대하여 2개의 심장 특이 프로모터(크레아틴 키나아제 (CK7) 및 심장 트로포닌 T (cTnT455))를 비교하여 나타내었으며, 전경골(TA:tibialis anterior)에서의 CK7에 대해 값들을 정규화시켰다. 가장 중요한 것은, cTnT455가 심장에서 높게 발현된 반면 다른 조직에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않았다는 것이다. 이러한 특이성은 심장이 아닌 조직에서 R1R2 과다 발현이 미치는 잠재적인 영향을 크게 감소시켜 주는 것이다.
[0228] dATP는 마우스의 대동맥 평활근력 발달에 아무런 영향을 미치지 않는다. 상승된 dATP의 잠재적인 전신 효과에 대한 연구를 개시하기 위해, 본 발명자들은 프랭크 브로조비치 박사(Dr. Frank Brozovich: Mayo Clinic)와 협업하여, dATP가 마우스의 대동맥 평활근 수축에 영향을 미치는지를 탐지하였다. 도 30A는 박피된 근육 스트립들에 있어서 백 투 백 수축률은 수축 기질로서 dATP vs. ATP 간에 차이가 없음을 나타내며, 이에 관한 복수회의 실험 데이터를 도 30B에 정리하였다. 이에 더해, 대조군 측정 결과, dATP는 평활근 미오신의 액틴에 대한 결합을 조절하는, 미오신 경쇄 인산화 수준을 변화시키지 않는 것으로 입증되었다 (데이터 표시하지 않음).
표 15: R1R2 과다 발현은 심근세포 수축률을 향상시킨다.
Figure pct00015
실시예 42
[0229] 심장-특이적 표적화를 위한 AAV6-R1R2. 본 발명자들은 R1R2 (및 [dATP])의 심장 수준을 급성적으로 증가시키기 위해 rAAV6 벡터를 이용하였다. rAAV6 벡터는 앞서 설명한 바와 같이 제조하였다24*. 간단히 설명하면, 심장 특이적 프로모터(cTnT455)를 함유하는 재조합 AAV 게놈을 이용하여 플라스미드를 만든다. CaPO4 침전법에 의해, 패키징/헬퍼 플라스미드 pDGM6 를 이용하여 HEK293 세포 내로 R1R2 이식유전자(transgene) 발현 카세트를 공동-형질감염시킨다. 배양체로부터 벡터들을 수집하여 냉동-해동시키고 상등액을 모은다. 친화성 정제에는 HiTrap 헤파린 컬럼(GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 이용하였다. 이 바이러스를 수크로스 구배(40%) 상에 농축시키고, 27,000 rpm (18 시간, 4℃)에서 스핀 처리한 다음 Hanks 밸런스 용액에 재용해시켰다. 서던 블롯 혼성화에 의해 SV40 폴리 아데닐화 영역 올리고뉴클레오타이드 32P 말단-표지 프로브를 이용하여 표준 플라스미드에 대하여 상대적으로 벡터 게놈을 평가한 다음 qPCR로 확인하였다.
[0230] AAV6 컨스트럭트에서 다양한 유전자 프로모터에 의해 구동되는 알칼라인 포스파타제를 이용하여 심장 표적화 컨스트럭트의 선택을 평가하였다. 표 16에 비특이적 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 대하여 2개의 횡문근 특이 프로모터(크레아틴 키나아제 (CK7) 및 심장 트로포닌 T (cTnT455))를 비교하여 나타내었으며, 전경골(TA:tibialis anterior)에서의 CK7에 대해 값들을 정규화시켰다. 가장 중요한 것은, cTnT455가 심장에서는 높게 발현된 반면, 심장이 아닌 다른 조직, 즉 비심장 조직에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않았다는 것이다.
표 16: CK7, CMV, 및 cTnT455 프로모터의 비교
Figure pct00016
도 36A는 이것의 예비적인 웨스턴 블롯 증거를 나타내는 것으로서, 여기서 AAV6-R1R2cTnT455 주사된 (4.5 e13) 마우스로부터의 심장 조직은 대조군 마우스 심장에 비해 R1 & R2 서브유닛을 고도로 발현하였다. 위쪽의 밴드들은 비특이적인 염색의 것이고 화살표가 R1 및 R2 단백질을 가리키는 것이다 (분자량 마커에 의해 동정됨 (표시하지 않음)). 중요한 것은 폐에서의 R1 & R2 발현은 심장에 비해 극히 낮았으며 골격근에서는 변하지 않았다는 것이다. 이것은 AAV6-알칼라인 포스파타제 (퍼플; C)가 주입되지 않은 심장 조직 (B) vs. 주입된 마우스36의 심장 조직에 관한 도 36에 잘 입증되어 있는데, 이는 AAV6-R1R2cTnT455가 안정하고도 장기간의 R1R2 과다발현을 제공함을 시사하는 것이다. 안정한 AAV6 유전자이식 발현은 래트37에 있어서는 12주일이상t 그리고 개 38 에 있어서는 적어도 6개월 이상 지속된 것으로 나타났다.
[0231] 따라서, 본 발명자들은 AAV6-R1R2cTnT455 주사량, 증가된 LV 펌프 기능의 시간 경과 및 안정성, 심장 조직 R1R2 수준 및 [dATP] 간의 관계에 대하여 연구하였다. 도 37은 3개월령 마우스에 주사된 3 가지 벡터 투여량, 즉 1.5 e13, 4.5 e13, 및 1.35 e14 AAV6-R1R2cTnT455 벡터 게놈 또는 식염수 (대조군)이 LV 기능에 미치는 효과를 나타낸다. (n=6/그룹). LV 단편적 수축(FS)은 1주일 후 고용량에서 유의적으로 증가하였고 2주 후에는 모든 투여량에서 증가하였으며, 6주까지는 효과가 동등하다. FS의 강도 증가는 ~25-50%인데, 이는 비교적 낮은 벡터 투여량으로도 효과를 얻을 수 있음을 가리킨다.
실시예 43
[0232] 유전자이식 R1R2 과다-발현 마우스 (TG-R1R2). 본 발명자들은 RR의 2개 서브유닛 (Rrm1 & Rrm2) 모두를 과다 발현하는 바이-유전자이식(bi-transgenic) 마우스를 이용한다. 도 32는 심장근에 있어서 두 가지 서브유닛 모두의 과다 발현을 입증하는데, 대응하는 야생형(WT) 마우스25 ,26*의 대응 값에 비해 33.7 ± 7.6 (Rrm1)배 및 23.7 ±3.4 (Rrm2)배 더 큰, 이들 TG-R1R2 마우스에 대한 밀도계 산출값을 나타낸다. Rrm2의 경우 상부 밴드(*)는 비특이적임을 주의할 것. 내인성 Rrm2 단백질은 WT 조직에서는 검출되지 않지만, TG-R1R2 마우스에서는 백그라운드 밴드 아래의 밴드로서 나타낸다. 심장 조직의 dATP 수준은 아직 평가되지 않았으나 [dATP]는 골격근에서 ~10배 증가하는데 이것은 효소 서브유닛에 있어서 3.3 ±2.1배 (Rrm1) 및 35.7 ±11.1배 (Rrm2) 증가에 상응하는 것이다. 흥미롭게도, dATP의 이러한 강도 증가는 본 발명자들이 배양체 중의 AV-R1R2로 형질감염시킨 심근세포에서 측정된 것과 유사하다 (도 23). 이들 TG-R1R2 마우스들의 6-8개월령에서의 예비 심장초음파 검사 결과 단편적 수축 (FS)에 있어서 평균 > 50% 증가나타났고 이완성 LV 내경(LVIDd)에서는 15% 감소가 일어난 것으로 나타났다. 도 27에 나타난 바와 같이, 이러한 차이 (WT 대조군과의 차이)는 예비적인 AV-R1R2 주사 실험에 대한 값과 강도면에서 유사하다.
실시예 44
[0233] 본 발명자들은 심장 기능에 미치는 상승된 세포 R1R2 및 [dATP]의 급성 효과를 탐지하려 한다. 본 발명자들은 급성 R1R2 과다 발현 (AAV6-R1R2 벡터를 경유)이 마우스 심장에서 [dATP]를 증가시켜, 수축 기능 및 확장 기능을 증가시킬 것으로 예상한다. 이것은 1) 더 신속한 이완과 함께 증가된 심근세포 및 근원섬유 수축 (부분적으로는 증가된 크로스브릿지 사이클링 키네틱스에 기인한다), 2) 에너지 저장을 약화시킴이 없이 기저 심장 대사의 증가, 및 3) 활동 잠재 기간 동안 변화 또는 감소 없음 (증가된 Ca2+ 분리(sequestration)에 기인함)에 반영될 것이다.
[0234] 본 발명자들은 정상적인 성체 FVB/N 마우스의 꼬리 정맥 또는 안내 안와에 거짓 주사 (sham injections)로 심장 특이 프로모터 cTnT455를 갖는 AAV6-R1R2 벡터 (전술한 바와 같음) 및 대조군으로서 cTnT455만을 함유하는 AAV6을 이용하여 형질감염시킨다. 주사 후, 심장초음파 검사를 매주 (6주일간) 실시하여 추가 평가를 위한 최적 (최대 효과) 시점을 결정한다. 초기 연구에 의해 심장초음파에 의한 생체내 심장 기능을 특지오하한 다음 현장 혈류역학 측정 또는 에너지 연구를 위한 랑겐도르프 관류된 심장을 이용한 생체외 연구 및 펌프 기능 평가를 위한 작동 심장 장치를 이용한다. 선택된 시점에서, 다른 마우스들을 안락사시켜 온전하거나 박피된 섬유주(skinned trabeculae) 표본, 분리된 심근세포, 근원섬유 표본, 단백질 분석 및 (면역)조직학을 위해 심장을 절제한다. 이들 측정 결과는 급성 R1R2 과다 발현이 있는 심장 기능에서 대안적인 상세한 분자 수준의 메카니즘을 제공할 것이다.
실시예 45
[0235] 전 장기(whole organ)의 다중 스케일 기계적 측정. 모든 동물에 대해 심장초음파 (GE Vivid7) 검사를 실시한다. 흉골연장축단면 영상을 이용하여 좌심실 유출로 및 유출로 단면(CSA: cross sectional area)을 통한 유속을 측정하여 일회 박출량 (stroke volume) (SV = CSA x 시간속도 정수 (대동맥 유속 면적)) 및 심장박출량(cardiac output) (CO = SV x 심박수)31을 측정한다. 좌심실 수축말기 내경(LVESD) 및 좌심실 확장말기 내경(LVEDD), 전벽 및 후벽 크기의 M-모드 측정값을 산출하기 위해 심실중앙(유두근)에서의 단축면상 2-D 검사방법을 이용한다. 이들 검사법을 이용하여 분획 단축 백분율 [(LVEDD-LVESD)/LVEDD x 100%] 및 좌심실벽 무게[1.05(IVS 두께 + LVEDD+PW 두께)]32,33*를 산정한다. 몇몇 동물들에 대해 미니어쳐 교류저항/마이크로압력계 카테터(Millar Instruments)를 이용하여 심수축성(Frank-Starling & 압력-용적 관계)의 실시간 평가를 실시한다. 측정 대상으로는 심박수, 확장말기 및 수축말기, +dP/dt, -dP/dt, 박출작업량(stroke work (SW)) 기울기 vs. 확장말기 용적(EDV)), 수축말기 압력-용적 관계 및 심실압력 감퇴의 시간 상수(Tau)를 들 수 있다. 이들 변수들을 시험관내 작동 심장 측정치, 로딩된 심장 수축/이완의 동력학 연구에 있어서 섬유주(trabeculae) 및 근원섬유 측정치와 비교할 수 있다. 급성 R1R2 과다 발현에 따른 아드레날린 반응성의 잠재적 변화를 평가하기 위해 도부타민 부재/존재 하에 두 가지 프로토콜을 모두 실시한다. 다른 동물들에 대해, 잠재적으로 혼동되는 호르몬 요동 없이 시험관내 Neely 작동 심장 측정 (Experimentria)를 실시하여, 프리로드/애프터로드, 및 아드레날린, 반응성에 관한 추가 정보를 제공한다. 이어서 심장에 대해 중량 분석을 실시하고, 잘 확립된 공정에 따라 고정, 포매 및 염색한다 (H&E, Masson's Trichrome, Picrosirius Red)27,68*. 절편들을 심장 비대, 확장 및 섬유화에 대하여 평가한다11 ,34*. 심장의 시리즈 절편들에 대하여 면역조직화학 검사를 실시하여 R1R2 발현 및 형질도입된 심근세포 백분율을 평가함으로써
실시예 46
[0236] 섬유주, 심근세포 및 근원섬유의 다중 스케일 기계적 측정. 서로 다른 여러 그룹의 마우스들에 대해, 말기 심장초음파 검사에 이어, 1) 온전하거나 박피된 섬유주 절개, 2) 배양체 심근세포 또는 3) 근원섬유 표본을 위해, 심장을 절개하여 심실을 준비한다.
[0237] 섬유주(Trabeculae). 본 발명자들은 R1R2 과다 발현이 다양한 근섬유분절 길이 (SL)에서 외부 로드 하에 생체내에서 일어나는 온전한 섬유주의 수축에 어떻게 영향을 미칠지에 대해 탐지하였다. 자극 전극이 들어있는 산소첨가된 관류 챔버 내의 선형 모터와 강제 변환기 사이에 얇은 (<120㎛ 직경, ~50㎛ 깊이) 섬유주를 장착한다35 -37*. 등척 연축 지속력(Isometric twitch force), 연축 지속 운동학 및 Ca2+ 전이(fura-2), 및 이들의 SL 의존성 (Frank-Starling 관계, SL = 1.9 vs. 2.2 ㎛)을, 단리된 심근세포에 대한 것과 동일한 프로토콜을 이용하여, 37℃ 38에서 표준 Krebs-Henseleit 용액, 95/5% O2/CO2 하에 측정한다. 급성 R1R2 과다 발현이 단백질 이소형태 또는 포스포릴 변화를 경유하여, [dATP]와 독립적으로 근섬유세포 수축성을 변경시키는지를 알아보기 위해, [Ca2+], [dATP], 및 [ATP]를 미세하게 제어하면서, 정상 상태의 근섬유세포 수축성을 평가하기 위해, 탈막(Demembranated) 섬유주를 이용한다.
[0238] 단리된 성체 심실 심근세포. 단리된 마우스의 심근세포를 이용하면 다양한 자극 주파수에서 SR 기능과 수축 사이클을 동시에 고처리량으로 평가하는 것이 가능하다7*. 따라서, 심근세포 Ca2+ 전이 (fura-2) 및 단축/이완 (길이 및 근섬유분절 길이)을 비디오 현미경(IonOptix, Milton, MA)을 이용하여 0.5, 1, 2 및 3 Hz에서 모니터링한다. 본 발명자들은 전후의 1) 변화하는 세포외 [Ca2+] ([Ca2+]ext)를 측정하여 Ca2+ 유도된 Ca2+ 방출량 (CICR), 2) 근섬유 세포 가교 억제제(BDM, 블레비스타틴 등)를 측정하여 SR 기능에 미치는 수축 활성의 영향을 탐지하고 3) 아드레날린 챌린지(α-(페닐레프린)) 또는 β(이소프로테레놀))을 측정하여 반응성( 단축, Ca2+ 방출/재흡수)이 변경되는지를 탐지한다. 작동 잠재력(action potential: AP) 특성, CICR, SR Ca2+ ATPase (SERCA), NCX, 및 플라즈마레말(plasmalemmal) Ca2+ ATPase 기능을 측정하기 위한 상세한 방법들을 이하에 후술한다.
[0239] 근원섬유. 정상적인 심장 기능을 탐지하는데 있어서 수축 활성 및 이완 운동학은 매우 중요하다. 수축기 동안에는 효과적인 혈액 박출 (작동 박출)을 위해 신속한 심실 압력의 발달이 중요하고, 이완기 동안에는 충분한 심실 충전을 위해, 심실이 신속하게 이완될 것이 중요하다. 이러한 특성들은 종종 심장 질환을 변경시킨다. 근육섬유의 수축 및 이완의 ms 시간단위 운동학은 용액 변화 동안 커다란 확산 거리가 [Ca2+] 평형을 둔화시키는, 박피된 섬유주에서는 평가하기 어렵다. 근육섬유 표본은 확산 거리가 짧아, 온전한 세포 Ca2+ 전이와 무관하게 신속한 용액 스윗칭 및 힘 측정이 가능하다. 이러한 접근법은 이전부터 이용되어 왔으며39 ,40* 새로운 장비의 발달에 힘입어 단일 프로토콜로, 단일 근원섬유 힘 발달 및 이완을 측정할 수 있다 (도 33). 이러한 측정값은 수축기(kact) 및 확장기 (kREL)의 등적(등척) 페이즈에 있어서도 타당하다. 본 발명자들은 중요하게도 이완기의 느린 (kREL, 느린) 및 신속한 (kREL, 빠른) 페이즈의 두 가지 모두를 모니터링할 수 있다. kREL, 슬로우 및 기간 (tREL,slow)은 이전의 연구에 의해 dATP1,5와 함께 더 빠른 것으로 나타난 가교 탈착률41 *을 반영하는 것으로 여겨진다41 *. 따라서, 본 발명자들은 ATP 또는 dATP (또는 가변형 ATP:dATP 비)를 이용하여 AAV6-R1R2 형질감염된 심장과 대조군 심장 간의 활성 및 이완 운동학을 비교하고자 한다. ATP-단독 근원섬유 실험에 의해 본 발명자들은 R1R2 과다 발현이 근섬유 세포 수축 특성 자체를 변경하는지를 평가할 수 있는 한편, dATP를 이용한 측정은 심근세포 대 대조군 세포에서 R1R2 과다 발현의 경우 관찰되는 보다 신속한 이완의 가교 성분을 탐지하는 것이 가능하다. 또한 근원섬유를 연구함으로써 [ADP], [Pi], [Ca2+], pH 및 근섬유 세포 단백질 인산화(키나아제, 포스파타제)를 독립적으로 제어하는 것 역시도 가능한데, 심장에서 변하는 이 모든 조건들은 대사적 거동과 상관관계가 있으나 온전한 심장 표본에서는 제어하기가 어려운 것들이다.
실시예 47
[0240] 전기생리학적 측정 및 Ca2+ 핸들링. 일반적인 기술34 ,42-48*을 이용하여 37℃에서 유지되고 1-5 Hz에서 자극된 세포에서 전기생리학을 평가한다. 전술한 바와 같이, 전류-클램프 모드에서 작동되는 HEKA EPC-10 증폭기를 이용하여 Aps를 기록한다 (EPC-10은 전통적인 미세전극 증폭기와 유사한 참 전압-팔로우어 회로를 갖는다49 ,50*). 세포내 뉴클레오타이드의 투석을 방지하기 위해, 본 발명자들은 관통형 팻치-기술 (1가 이온은 통과시키지만 ~ 200 달톤을 초과하는 분자들은 통과시키지 않음51*)을 이용하며 전세포의 파열이 일어날 경우 (Strauss 등에 이어52*) 이를 알 수 있도록 하기 위해 피펫 용액 중에 염료를 포함시킬 것이다. 측정하고자 하는 AP 변수에는 업스트로크 속도(upstroke velocity), APD (50, 70, 및 90% 재분극에서의), AP 진폭, 최대 이완 전위 및 재분극후의 주파수가 포함된다. [Ca2+]i 영상화 실험을 위해, 세포들을 fura-2 또는 fluo-4-AM으로 로딩한 다음 라인-스캔 모드로 작동하는 Ionoptix CCD-기반 시스템 또는 Zeiss LSM510 META 공초점 시스템을 이용하여 영상을 찍었다. "슈도-비(psudo-ration)"53* 또는 Fmax54 * 방법을 이용하여 형광 시그널의 보정을 실시한다. 전세포[Ca2+]i 전이는 Ca2+ 인플럭스, SR Ca2+ 방출 (즉, Ca2+ 스파크), 및 Ca2+ 소거 메카니즘 (주로 NCX 및 SERCA)로 이루어짐을 주목한다. 따라서, [Ca2+]i 전이의 변화를 기저를 이루는 메카니즘을 이해하기 위해서는, 이들 플럭스들을 개별적으로 시험하여야 한다. L-형 Ca2+ 전류 (ICa)를 통한 Ca2+ 인플럭스를 무Na+-용액(NA+-free solution)을 이용하여 전압-클램프 하에 측정함으로써 NCX 기능55 *.을 제거한다. SR Ca2+ 방출에 미치는 영향을 알아보기 위해, 본 발명자들은 다음의 2가지 표준 방법을 사용한다: 1) EC-커플링 증가 인자의 측정을 위한 전압-의존성 ICa 및 [Ca2+]i 전이의 동시 측정56 ,57 및 2) 국소화된 방출 이벤트의 신속한 공초점 영상화 (즉, Ca2+ 스파크)57*. 카페인 기술58 ,59*을 이용하여 SR Ca2+ 로드를 측정한다. NCX 또는 SR Ca2+ ATPase 기능에 미치는 효과를 스크리닝하기 위해, 본 발명자들은 각각의 플럭스를 분리하기 위한 조건 및 표준 저해제를 이용하여 AP- 및 카페인-유도형 [Ca2+]i 전이, 및 NCX 전류를 시험한다 57,60-62*
실시예 48
[0241] 심근 에너지 대사. 전술한 바와 같이63 ,64* 분리된 관류 심장에서 다핵 NMR 분광법을 이용하여 대사와 수축을 동시에 평가한다.
[0242] NMR 분광법. 절제한 마우스 심장을 전술한 바와 같이 일정 압력 (80 mm Hg)하, 37℃에서 관류시킨다63*. 물로 채워진 풍선을 LV에 삽입하고 확장말기 압력을 5-10 mm Hg에 육박하게 하여, LV 압력과 심박수를 기록하는데 이용한다. 등적 수축 기능(Isovolumic contractile function)을 LV 발달 압력 곱하기 심박수(심근부담도: rate-pressure product; RPP)로서 계산한다. 관류액과 폐 유출로 유출액 간의 PO2 차이 및 MVO2 관상 유속(coronary flow rate)을 측정함으로써 MVO2를 측정한다. 높은 수축 성능을 이끌어내기 위해, 관류액 [CaCl2]를 2mM에서 4 mM로 증가시킨다. 베이스라인 및 25분간의 고작업량 챌린지 동안 31P NMR 스펙트럼을 수집한 다음, 액체 질소로 냉각된 볼렌버거 집게(Wollenberger tongs)를 이용하여 냉동 클램프시킨다.13C-표지된 기질을 이용하여 관류시킨 다음 냉동-클램프시킴으로써 미토콘드리아에 있어서 탄소 기질의 상대적 산화도를 측정한다. 전술한 바와 같이63 ,64* 조직 추출물을 이용하여 13C NMR 분광법 및 동위원소이성질체(isotopomer) 분석을 실시한다.
[0243] 31P NMR 스펙트럼의 HPLC 보정. 냉동-클램프된 조직을 이용하여 전술한 바와 같이65* HPLC에 의해 ATP의 심근 함량을 측정한다. 블랏시킨 습조직 (blotted wet tiggue) 1 그램 당 세포내 수분 함량을 0.48 mL/g , 그리고 단백질 함량을 0.15g/g로 추정하여, HPLC에 의해 얻은 심근 ATP 함량을 [ATP]로 변환시킨다. 이 값들을 이용하여 각각의 그룹에 대한 베이스라인 31P NMR 스펙트럼에 있어서의 ATP 피크 면적을 교정한다. 베이스라인 조건 하에서 수득된 γ-ATP 피크의 면적을 100%로 설정하고 모든 31P NMR 스펙트럼의 모든 피크에 대해 레퍼런스 값으로서 사용한다.
[0244] 미토콘드리아 생물발생성(Mitochondrial Biogenesis) 및 기능. ADP, 호흡 짝풀게(respiratory uncoupler: FCCP) 및 다양한 억제제의 존재 또는 부재 하에, 피루베이트/말레이트(복합체 I), 숙시네이트 (복합체 II) 및 팔미토일-카르니틴을 이용하여 분리된 미토콘드리아 및 관통가능하게된(permeablized) 근섬유 또는 근세포를 이용하여 미토콘드리아 호흡 분석을 실시한다66 ,67*. 박동 중인 심장에서의 ATP 합성 속도를 31P NMR 자화전달을 이용하여 평가한 다음 MVO2 63*에 의한 평가와 비교한다. EM 영상에 의해 미토콘드리아 밀도를 평가하고, 핵심(key) 미토콘드리아 효소/단백질 (시트레이트 합성효소, COX, 아코니타제 및 VDAC)의 활성 또는 발현을 측정한다. 미토콘드리아 생물발생설과 연관이 있는 전사 메카니즘 뿐만 아니라 mtDNA 함량 및 그의 복제에 관하여 설명된 바와 같이68* 탐지한다.
[0245] 근섬유 세포 및 SR 단백질의 프로파일링. 모든 조건 하에서의 수축 기능, Ca2+ 전이, SR 스파크 활성 및/또는 Ca2+ 로드의 변화를 근섬유 세포 단백질 (cTnI, cTnT, MLC-2, cMyBP-C 및 Tm), SR 단백질 (PLB, RyR), 및 근형질막 단백질 (NCX, PMCA, L-형 Ca2+ 채널)의 이소형태, 과다 및 인산화와 연관짓는다. mRNA 및 단백질 발현의 변화를 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정한다. SR 단백질 단편들을 간행된 방법53 -56에 따라 준비한다. 만일 전기생리학적 측정치가 변화를 가리키면, 특정 항체에 대한 이온 채널을 평가할 수 있다. 웨스턴 블롯 (도 23) 또는 면역조직화학법을 이용하여 R1R2 발현을 분석하고 이를 실험 결과와 연관시킨다. cTnT455 프로모터의 특이성은 골격근 및 폐와 같은 심장이 아닌 조직에서 R1R2 발현을 측정함으로써 평가한다. Pro-Q 다이아몬드 (Sypro Ruby 단백질 염색) 및 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 인산화를 프로파일링한다. 위치 특이적 세린 및 쓰레오닌 잔기 인산화르르 위해, 질량 분광법을 수행할 수 있다.
실시예 49
[0246] 실시예 43 내지 48에 개략된 이들 전신 연구에 의해 어떻게 단기간 R1R2 과다 발현 및 증가된 [dATP]가 수축 특성, 및 Ca2+ 및 에너지 항상성에 영향을 미치는지에 관한 상세한 다중 스케일 정보가 제공될 것이다. 본 발명자들은 비교적 소량 투여량의 AAV6-R1R2로도 모든 레벨의 기계적 평가에서 기능을 강화하는데 충분할 것으로 예상한다. 본 발명자들은 이 마우스들에 있어서 심장의 β-아드레날린 반응성이 유지되거나 또는 더 증강될 것으로 예상한다. 이것은 만일 개선된 심근 기능 ([dATP]를 경유하는)이 β-아드레날린 구동에 대한 필요성을 감소시킬 경우 일어날 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 이러한 순응이 R1R2 과다 발현 피크 후 보다 늦은 시점 (3-4주일)에서 보다 뚜렷하다가 형질도입이 감퇴함에 따라 수그러들 것으로 기대한다. 이 피크 순응(peak adaptation)은 TG-R1R2 동물에서 기대되는 장기간 변화에 근접할 것이다. 증가된 [dATP]에 기인하는, 번역후 단백질 변형의 기능적 효과를 기질로서 ATP를 이용하여 세포/서브세포 분석을 통해 평가한다. 이것은 증가된 근섬유 세포 Ca2+ 감수성 (탈막 섬유주), 증가된 활성화 및 이완 동력학(근원섬유), 및 Ca2+ 재흡수의 증가된 재흡수 (온전한 섬유주/심근세포)를 결과시킬 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 이전의 결과가 나타내는 바와 같이 (도 28), R1R2 과다 발현에 의해서는 Frank-Starling 관계가 생체내에서나 시험관내에서 둔화(blunted)되리라고 기대하지는 않는다. 본 발명자들은 R1R2 과다 발현이 온전한 심장 섬유주에서 단수축력을 증가시킬 것으로 예상하는데, 이는 분리된 심근세포에서 관찰되는 단편적 단축의 증가와 유사하게, 증가된 Ca2_ 감수성을 가리키는 것이다. 마찬가지로, 본 발명자들은 Ca2+ 전이가 미처리 섬유주와 유사한 강도의 것이나, R1R2 과다 발현 섬유주에 있어서 보다 빠른 Ca2+ 감퇴가 있을 수 있고 강제 이완의 동시적 증가가 일어날 수 있을 것으로 예상한다. R1R2 과다 발현 심근으로부터의 탈막화된 섬유주는 ATP가 수축 기질인 경우에조차 Ca2+ 감수성을 약간 증가시킬 수 있는데, 이는 교감신경긴장의 감소 및 이어서 심장 트로포닌 I 및 미오신 결합 단백질-C의 보다 낮은 인산화를 반영하는 것이다. 본 발명자들은 시험관내 AV-R1R2 형질도입된 심근세포들에서 관찰되는 것과 유사하게, 보다 빠른 Ca2+ 전이 감퇴 이외에 Ca2+ 핸들링에 있어서 다른 명시적인 변화는 예상하지 않는다. 보다 빠른 Ca2+ 전이는 1) 보다 빠른 가교 탈착과 커플링된 증가된 근절 단축으로부터 발생하여, 점진적으로 증가된 얇은 필라멘트 Ca2+ 해리를 야기하여, 대조군 근육세포에서보다, 재격리(resequestration)에 Ca2+를 더 빨리 이용할 수 있도록 하고 2) Ca2+ 핸들링 단백질 (SERCA: 포스포람반 비, 포르포람반 및/또는 플라즈마막 Ca2+ ATPase 인산화) 또는 에너지 기질로서 dATP를 이용하는 Ca2+ ATPase 펌프의 변화에 기인하여, Ca2+ 격리를 증가시킬 수 있을 것이다. 증가된 수축 기능에도 불구하고 TG-R1R2 심장에서 정상상태의 고에너지 포스페이트 함량이 최소한도로 영향을 받은 이전 데이터(도 29)에 부분적으로 기초할 때, 본 발명자들은 급성 R1R2 과다 발현에 의해 대사 거동이 큰 변화를 일으킬 것으로 기대하지 않는다.
실시예 50
[0247] 본 발명자들은 증가된 세포 R1R2 및 [dATP]가 심장 기능에 미치는 만성 효과를 탐지하고자 한다. TG-R1R2 마우스들은 β-아드레날린 구동력 감소에 따라 증가된 수축 기능에 순응할 것이고, 이완 기능은 Ca2+ 핸들링 메카니즘의 순응에 의해 유지될 것으로 예상된다. 이것은 1) 이완의 최소한의 변화와 함께 증가된 심근세포 수축, 2) 심장 대사의 순응에 따라 야생형 대조군에서는 상승하지 않을 것, 3) 여기-수축 커플링에서의 무변화 및 4) β-아드레날린 자극에 대한 증가된 반응성에 반영될 것이다.
[0248] 만성 R1R2 과다 발현을 연구하기 위해, 일생에 걸쳐 리보뉴클레오타이드 환원효소 서브유닛 두개 모두를 높은 수준으로 발현하는 바이-유전자이식(bi-transgenic) 마우스 모델(TG-R1R2)을 이용한다. 본 발명자들은 6 개월령의 성체 마우스를 이용하여 이 연구를 개시하고자 한다. 변경된 기능의 진행 및/또는 경시적인 순응성을 탐지하기 위해, 최대 6개월령까지 심장초음파를 이용하여 어린 마우스들을 모니터링한다. 이들 측정값으로부터 조기 연구 시점을 결정한다. 이들 연구 시점에서, 본 발명자들은 위에서 개략된 바와 같이, 모든 실험들을 평가한다. 이들 다중 스케일 측정치들은 전술한 실험들과의 비교 뿐 아니라, 만성 R1R2 과다 발현된 심장 기능에의 순응에 있어서 상세한 분자 수준의 메카니즘을 제공한다.
[0249] 이러한 연구에 의해, 내재적 순응이 일정한 측분비 및 호르몬 요동을 겪게 되는 생체내에서의 R1R2 과다 발현에 대한 장기간의 심장 순응에 관한 상세한 정보가 제공된다. 본 발명자들은 R1R2 과다 발현이 단기간 R1R2 과다 발현에 의해서는 일어나지 않는, 보다 커다란 베이스라인 수축에 대한 순응을 통해, β-아드레날린 반응성을 증가시킬 수 있을 것으로 예상한다. 예비 조사 결과 (도 28)가 나타내는 바와 같이, 그리고 수축 활성화의 SL 의존성이 dATP3 *의 경우 유지되기 때문에, Frank-Starling 관계의 약화(blunting)는 R1R2 과다 발현이 있다해도 생체내 또는 시험관내에서 일어나지 않을 것으로 기대된다. 일회박출 용적의 보상을 위해 감소된 심박수 (낮은 β-아드레날린 구동)에 의해 심장박출량이 유지될 수 있을 것이다 (dATP에 기인함). 본 발명자들은 또한 TG-R1R2 마우스에서는 심실 비대 또는 확장된 심실 기능 및 형태학적 표현형이 발견될 것으로 기대하지 않으며, 이전의 연구에 따른 증거들은 이것이 일어나지 않을 것을 시사하고 있다. 본 발명자들은 SR Ca2+ 로딩이 유지되어, 증가된 LV 기능이 주로 향상된 근섬유세포에 기인할 것으로 예상한다. 만이 SR Ca2+ 펌프 활성이 만성적으로 증가하여, 보다 신속한 Ca2+ 전이 감쇠를 야기할 경우, 보다 짧은 APD가 일어나야 한다. 본 발명자들은 에너지 보유량 (PCr, ATP)이 유지될 것으로 예상하며, 높은 Ca2+ 챌린지에 대한 반응성이 유사한 그러나 상승할 것으로 예상하며, 미토콘드리아 기능이 ATP 및 dATP의 증가된 미오신 이용에 의해 약간 상승할 것으로 기대한다. 정리하면, 베이스라인 기능은 증가하되, Ca2+ 핸들링의 최소한도의 순응 및 에너지 항상성에 따라, 증가된 요구도에 대한 반응 능력은 유지될 것으로 예상된다.
실시예 51
[0250] 경색된 심장의 심장 기능에 미치는 증가된 세포 R1R2 및 [dATP]의 효과에 관하여 조사한다. 급성 R1R2 과다 발현 및 증가된 [dATP]는 심장 성능을 개선시킬 것으로 예상되며, 경색된 심장에서 심부전에 이르는 경과를 적어도 일시적으로 중단시킬 것으로 예상된다. AV-R1R2 형질도입이 경색된 래트 심장으로부터 배양된 심근세포의 Ca2+ 전이 거동 및 저하된 수축성을 구제한 것(도 25)에 관한 이전의 유망한 연구 증거들은 이것이 가능할 수 있음을 시사한다. 근섬유 세포들의 수축능 증가는 심장 기능을 개선시키고 그에 따라 심부전 유발과 연관이 있는 PKC- 매개형 인산화 및 만성 β-아드레날린 시그널링을 감소시킬 것이다. 일시적인 기능 증진 (AAV6-R1R2의 일회 투여를 통한)이 지속적인 개선을 가능케하는 순응으로 이어질 것인지를 관찰하는 것은 흥미로운 일이다. 심장기능 상실은 곧 "에너지 고갈(energy-starved)"69*인 것으로 알려져 있다. 수많은 임상 연구에 의해 심장기능 상실은 아드레날린 수용체 작용제와 같이 에너지 소비가 많은 치료법에 의해 더 악화되고 ACEI 및 베타-차단제와 같은 에너지 절약형 치료에 의해 개선되는 것으로 나타났다. dATP의 증가가 심근 에너지학에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것은 매우 중요하다. 따라서, 이전의 연구 데이터가 보다 높은 수축 기능에서 높은 에너지 포스페이트 함량 변화를 나타내지 않았다는 것은 매우 흥미로운 일이다. 본 발명자들은 이것이 손상된 에너지 대사가 반복적으로 관찰되는 경색된 심장의 경우에도 그러한지를 알아보고자 한다.
[0251] 본 발명자들은 AAV6-R1R2를 이용하여 경색된 심장에 미치는 급성 R1R2 과다 발현의 효과를 연구한다. 좌하방 관상동맥을 영구적으로 접합시킴으로써 심근경색을 일으킨다. 래트에 있어서, 이에 따라 일반적으로 LV 자유벽 단면적 (LV 총면적의 10-15%)의 ~20-35%에 이르는 면적이 경색되고, 단편적 수축, 수축 및 확장성 심실 팽창의 감소 (도 34A-C) 및 증가된 프리-로드에 대한 작업중인 심장의 반응성 손실이 야기된다 (도 34D).
[0252] 생체내 연구로부터 얻어진 데이터들은 배양된 심근세포들을 이용한 앞서의 연구를 뒷받침해준다. 이 연구에서, 심장경색 5일 경과 후, 래트의 심장에 AAV6-R1R2 (전술한 바와 같음)를 직접 주사하였다. 형질도입 후 심장초음파 검사를 실시하고 (최대 8주일) 결과를 도 38에 나타내었다. 주사 1주일 후, FS는 이미 개선되었고, 2주일에 이르러서는 FS가 거짓 작업된(sham operated: 경색 없음) 심장에서와 같이, 경색+벡터에 있어서 동일하였다. 이러한 회복은 본 발명자들이 실험을 중단한 시점인 8주일까지 지속되었는데, 이는, AAV6-R1R2가 투여된 경색된 심장에서, 심장 기능이 개선되었음을 입증하는 것이다.
[0253] 급성 R1R2 과다 발현이 LV 기능 손상을 방지하는데 도움이 되는지를 알아보기 위해, 다른 동물들을 심장경색 수술하기 1-2주일 전에 AAV6-R1R2로 형질감염시킨다. 두 가지 모두의 프로토콜에서, 마우스와 래트의 일부에 대하여 Millar 카테터 실험을 통해 현장(in situ) 혈류역학 특성을 검사한다 (전술 내용 참조). 심장 작동, 온전한 섬유주 및 박피 섬유주, 배양된 심근세포 및 분리된 근원섬유에 관한 시험관내 연구를 위하여 또 다른 동물들을 이용한다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 어떤 표본이 가장 효과적으로 교시하는지를 결정하여 그 표본들에 초점을 맞춰서 대부분의 측정을 수행함으로써, 이들 연구에 필요한 동물의 수를 제한하고자 한다. 몇몇 절개된 심장들을 칭량, 고정, 포매 및 염색하여 비대 및 섬유화를 평가한다 (전술한 바와 같음). 시리즈 섹션을 수행하여 R1R2 발현 평가를 위한 면역조직화학 및 생체내 및 시험관내 기능 변화를 연관시키기 위한 발현 연구를 수행한다.
[0254] 본 발명자들은 R1R2 과다 발현 및 증가된 [dATP]가 선택된 분석 시점에서 경색된 심장의 성능을 개선시킬 것으로 예상한다. 높은 Ca2+ 챌린지, β-아드레날린 자극 및 프리-로드 증가에 대한 반응이 개선될 것이다. 도 38에서 평가된 심장의 Neely 심장 작동 측정결과 경색된 (미처리) 심장의 프리-로드 반응성 상실 (심장기능상실)이 관찰되었으나, 벡터가 투여된 경색된 심장의 프리-로드 반응성은 경색되지 않은 심장, 즉 대조군 수준으로 회복됨으로 해서, 심장 기능이 복구된 것으로 입증되었다. 힘(power)이 g·cm/분 단위로 주어진 도 39를 참조할 것. 이 효과는 만성 β-아드레날린 자극의 감소에 의해 (플라즈마 호르몬을 모니터링함으로써 평가할 수 있음) 일어난 것일 수도 있다. 이것은 1) Ca2+ 전이, 2) 근섬유 세포 수축 및 이완 강도 및 동력학, 및 3) 에너지학 프로파일의 개선이 나타내는 바와 같이 다중-스케일 분석으로 반영된다. 본 발명자들은 또한 α-및 β-아드레날린 매개형 심근세포 단백질 인산화에 있어서 처리된 심장과 미처리 심장 간에 차이가 있을 것으로 예상한다.
[0255] 본 발명의 명확한 이해를 돕기 위하여 이제까지 특정 구체예를 들어 상세히 설명하였으나, 당업자라면 첨부된 본 발명의 특허청구범위 내에서 얼마든지 특정한 변형과 변화가 가해질 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 명세서에서 제공되는 각각의 참고문헌들은 각 참고문헌이 개별적으로 참고 통합되는 것처럼, 그 내용 전체가 본 발명에 참고 병합된다. 본 발명과 본 명세서에 제공되는 참고문헌들 사이에 내용상 불일치가 있을 경우에는, 본 발명의 내용에 따른다.
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Claims (88)

  1. 포유 동물의 심근(myocardium)에 심근 세포(cardiomyocytes)를 이식하는 단계를 포함하는, 포유 동물 중의 심장 기능을 개선하는 방법으로서,
    여기서, 상기 심근 세포는 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터와, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 함유하는 것이고,
    상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 R1 및 R2의 과발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결되어, 포유 동물 중의 심장 기능을 개선하기 위하여 dATP를 발생시키는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스 벡터인 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 발현 벡터는 AAV(adeno-associated viral) 벡터인 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 형질 도입 리포터를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 심근 세포는 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 심근 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)로부터 유래된 것이 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 iPSC는 포유 동물로부터 수확된 세포로부터 유래된 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 포유 동물로부터 수확된 세포는 섬유아세포(fibroblast)인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 이식하는 단계에 앞서,
    제1 발현 벡터 및 제2 발현 벡터를 제공하는 단계; 및
    상기 제1 및 제2 발현 벡터로 심근 세포를 엑스 비보(ex vivo) 형질 변환시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 심근은 경색된 심근인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 이식은 카테터에 의하여 심근 세포를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 이식은 경색된 심근의 경색되지 않은 영역에 심근 세포를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 포유 동물은 인간인 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 심장 특이적 프로모터인 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 프로모터는 CK7 프로모터 및 CMV 프로모터로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 벡터는 동일한 것인 방법.
  17. 심근에 기증자 세포를 이식하는 단계를 포함하는, 숙주 포유 동물의 심근에 dATP를 전달하는 방법으로서,
    여기서 상기 기증자 세포는 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1과 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 과발현하고, dATP를 인 시투(in situ) 생산하는 것이며,
    상기 기증자 세포는 숙주 포유 동물의 심근 세포와 갭 결합(gap junction)을 형성하여, 숙주 포유 동물의 심근에 dATP를 전달하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 숙주 포유 동물은 인간인 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 심근은 경색된 심근인 것인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 이식은 카테터에 의하여 기증자 세포를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 이식은 경색된 심근의 경색되지 않은 영역에 심근 세포를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 기증자 세포는 심근 세포 및 섬유아세포로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 심근 세포는 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 심근 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)로부터 유래된 것이 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 iPSC는 숙주 포유 동물로부터 수확된 세포로부터 유래된 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 숙주 포유 동물로부터 수확된 세포는 섬유아세포(fibroblast)인 것인 방법.
  27. 제22항에 있어서, 상기 기증자 세포는 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터와, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 것이고,
    상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 R1 및 R2의 과발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 벡터는 동일한 벡터인 것인 방법.
  29. 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터와, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물 중의 심장 기능을 개선하는 방법으로서,
    상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 AAV(adeno-associated viral) 벡터인 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 상기 포유 동물은 인간인 것인 방법.
  32. 제29항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 전신으로 투여되는 것인 방법.
  33. 제29항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 정맥 안으로 투여되는 것인 방법.
  34. 제29항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 심근 내 주입으로 투여되는 것인 방법.
  35. 제29항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터 중 적어도 하나는 형질 도입 리포터를 더 포함하는 것인 방법.
  36. 제29항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 동일한 벡터인 것인 방법.
  37. 포유 동물의 심근에 심근 세포를 이식하는 단계를 포함하는, 포유 동물 중의 심근 수축 및 심근 이완을 개선하는 방법으로서,
    여기서 상기 심근 세포는 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터와, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 함유하는 것이고,
    상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 R1 및 R2의 과발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결되어, 포유 동물 중의 심근 수축 및 심근 이완을 개선하기 위하여 dATP를 발생시키는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 벡터는 바이러스 벡터인 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 벡터는 아데노 바이러스 벡터인 것인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 벡터의 적어도 하나는 형질 도입 리포터를 더 포함하는 것인 방법.
  41. 제37항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 벡터는 동일한 벡터인 것인 방법.
  42. 제37항에 있어서, 상기 심근 세포는 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 것인 방법.
  43. 제37항에 있어서, 상기 심근 세포는 배아 줄기 세포(ESC), 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cells)로부터 유래된 것이 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 iPSC는 포유 동물로부터 수확된 세포로부터 유래된 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 포유 동물로부터 수확된 세포는 섬유아세포인 것인 방법.
  46. 제37항에 있어서, 상기 이식하는 단계에 앞서,
    제1 발현 벡터 및 제2 발현 벡터를 제공하는 단계; 및
    상기 제1 및 제2 발현 벡터로 심근 세포를 엑스 비보(ex vivo) 형질 변환시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  47. 제37항에 있어서, 상기 심근은 경색된 심근인 것인 방법.
  48. 제37항에 있어서, 상기 이식은 카테터에 의하여 심근 세포를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 이식은 경색된 심근의 경색되지 않은 영역에 심근 세포를 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  50. 제37항에 있어서, 상기 포유 동물은 인간인 것인 방법.
  51. 제37항에 있어서, 상기 프로모터는 심장 특이적 프로모터인 것인 방법.
  52. 제37항에 있어서, 상기 프로모터는 CK7 프로모터 및 CMV 프로모터로부터 선택되는 것인 방법.
  53. 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터와, 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물 중에서 심근 수축 및 심근 이완을 개선하는 방법으로서,
    상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터인 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 포유 동물은 인간인 것인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 전신으로 투여되는 것인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 정맥 안으로 투여되는 것인 방법.
  58. 제53항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 심근 내 주입으로 투여되는 것인 방법.
  59. 제53항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 동일한 것인 방법.
  60. 제53항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터 중 적어도 하나는 형질 도입 리포터를 더 포함하는 것인 방법.
  61. 제53항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 심장 특이적 마커에 특이적으로 결합하는 표적제(targeting agent)를 인코딩하는 서열을 더 포함하는 것인 방법.
  62. 제53항에 있어서, 상기 방법은 L48Q 아미노산 치환을 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 발현 벡터를 투여하는 단계를 더 포함하고,
    여기서 상기 cTnC 변이체는 Ca2 +에 대하여 증가된 결합 친화도를 가지며,
    상기 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  63. 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터 및 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 약학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 동일한 것인 약학적 조성물.
  65. L48Q 아미노산 치환을 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물로서,
    여기서 상기 cTnC 변이체는 Ca2 +에 대하여 증가된 결합 친화도를 가지는 것인 약학적 조성물.
  66. I61Q 및 L57Q로부터 선택되는 아미노산 치환을 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물로서,
    여기서 상기 cTnC 변이체는 Ca2 +에 대하여 증가된 결합 친화도를 가지는 것인 약학적 조성물.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV(adeno-associated viral) 벡터인 것인 약학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 상기 벡터는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 CMV 프로모터를 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  69. 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R1을 인코딩하는 제1 핵산 서열을 포함하는 제1 발현 벡터 및 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 R2를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 벡터를 함유하는 심근 세포를 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열은 R1 및 R2의 과발현을 유도하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 약학적 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 제1 및 제2 발현 벡터는 동일한 것인 약학적 조성물.
  71. L48Q 아미노산 치환을 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 개선이 필요한 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법으로서,
    여기서 상기 cTnC 변이체는 Ca2 +에 대하여 증가된 결합 친화도를 가지고,
    상기 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 개체는 감소된 수축을 일으키는 심장 질환을 가진 것인 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 개체는 허혈성 심장 질환, 심근증 또는 심근 경색을 진단받은 것인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 심근증은 원발성 심근증, 유전적 심근증 및 확장성 심근병증으로부터 선택되는 것인 방법.
  75. 제71항에 있어서, 상기 개체는 감소된 심장 수축 기능을 진단받은 것인 방법.
  76. 제71항에 있어서, 상기 개체는 비대(hyper) 유전적 변이를 가지는 것인 방법.
  77. 베타-심장 미오신 중쇄(beta-cardiac myosin heavy chain), 심장 액틴(cardiac actin), 심장 트로포닌 T(cardiac troponin T), 알파-트로포미오신(alpha-tropomyosin), 심장 트로포닌 I(cardiac troponin I), 심장 미오신-결합 단백질 C(cardiac myosin-binding protein C) 및 미오신 경쇄(myosin light chain)로부터 선택되는 근절(sarcomeric) 단백질에 유전적 변이를 갖는 개체 중의 심장 기능을 개선하는 방법으로서,
    상기 방법은 L57Q 또는 I61Q 아미노산 치환을 갖는 cTnC 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 핵산 서열은 심장 특이적 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인 방법.
  78. 제71항 또는 제77항에 있어서, 상기 벡터는 리포펙틴, 스텐트 상의 코팅 또는 직접 주입에 의하여 투여되는 것인 방법.
  79. 제71항 또는 제77항에 있어서, 상기 벡터는 카테터를 경유하여 투여되는 것인 방법.
  80. 제71항 또는 제77항에 있어서, 상기 벡터는 AAV(adeno-associated viral) 벡터인 것인 방법.
  81. 제77항에 있어서, 상기 개체는 심근증을 진단받은 것인 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 심근증은 비후형 심장근육병증(hypertrophic cardiomyopathy)인 것인 방법.
  83. 도 40의 핵산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트로서,
    여기서 상기 폴리뉴클레오타이드는 약학적 단백질을 인코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결된 것인 발현 카세트.
  84. 제83항에 있어서, 상기 약학적 단백질은 리보뉴클레오타이드 리덕타제 서브 유닛 및 cTnC 변이체로부터 선택되는 것인 발현 카세트.
  85. 제83항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 도 40의 핵산 서열을 갖는 것인 발현 카세트.
  86. 제83항의 발현 카세트를 포함하는 AAV(adeno-associated viral) 바이러스 벡터로서,
    상기 바이러스 벡터는 AAV6 아데노 관련 바이러스 벡터인 것인 벡터.
  87. 제83항 내지 제85항 중 어느 하나의 항의 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물 중의 약학적 단백질의 심장 특이적 발현을 증진시키는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV6 아데노 관련 바이러스 벡터인 것인 방법.
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