CN116249768A - 通过重编程产生心肌细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种利用Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂的小分子组合，以及任选的心肌细胞诱导转录因子，与分化的细胞例如成纤维细胞接触，从而通过重编程产生心肌细胞的方法。

Description

通过重编程产生心肌细胞的方法 技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明涉及一种利用Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂，以及任选的心肌细胞诱导转录因子，从分化的细胞例如成纤维细胞通过重编程产生心肌细胞的方法。
发明背景
全世界2300万人患有心力衰竭，通常由心肌细胞损伤或心肌细胞功能障碍引起。心肌细胞丢失的一个常见原因是导致心肌梗死的缺血性心脏病，由于心脏再生能力有限，损伤是永久性和渐进性的。尽管在医学治疗方面取得了进展，但目前除了原位心脏移植外，还没有恢复肌肉质量的策略，而原位心脏移植受限于细胞来源数量和长期疗效。迄今为止，在人体试验中使用的细胞疗法已经证明移植的细胞不会大量变成心肌细胞，也不会在心脏中持续存在。多能干细胞来源的心肌细胞移植正在接受测试，如果在细胞存活、成熟和电生理整合等问题得到有效解决后，这可能是有价值的。利用细胞类型特异的转录因子(TF)将细胞原位重编程为在疾病中丢失的细胞类型，是一种很有希望的除细胞治疗以外的另一有效的组织再生方法。在心脏中，大量的非心肌细胞，主要是心脏成纤维细胞，可以通过转录因子转变为诱导的心肌细胞样细胞。
在啮齿类动物中，冠状动脉结扎后直接在心肌内注入3种心脏特异性TF：GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)，导致非心肌细胞转化为与现有心肌细胞电耦合的心肌细胞样细胞，从而改善心脏功能，减少瘢痕大小。然而，效率仍然有限，特别是在体外，大多数细胞并没有被彻底实现重编程。体内存在的导致重编程质量提高的信号尚不清楚，但表明改变培养条件或信号途径可在体外(也可能在体内)增强心脏重编程。
自第一代心肌细胞重编程成功问世以来，已经有很多关于增强心脏重编程效率的报道。通过改变GMT三个基因的计量学，在GMT基础上鉴定额外的基因，或者通过操纵信号通路，体外产生的心肌细胞样细胞的质量和效率都可以得到改善。在大多数情况下，效率的提高主要是在小鼠胚胎成纤维细胞中发现的；相反，对心脏成纤维细胞以及成体皮肤为起始的重编程却效果有限。尽管最近siRNA介导的bmi1基因敲除，以及通过SB431542联合XAV939的策略提高了体外心脏成纤维细胞重编程的效率，但仍有待于确定是否存在能进一步增强小鼠体内重编程或影响人心脏成纤维细胞重编程的方法。
因此，本领域仍然需要新的重编程方法，其能够在体内或体外通过重编程高效地产生功能性心肌细胞，从而治疗心脏疾病例如心力衰竭。
附图简述
图1.鉴定促进心肌细胞重编程的小分子。A.促进心肌细胞重编程小分子筛选策略；B.Myh6-mCherry阳性细胞荧光图像。C.Myh6-mCherry阳性细胞计数。结果显示两种小分子SB431542和Baricitinib(2C)协同促进成纤维细胞向心肌细胞(induced cardiomyocyte like cell，iCM)转分化。
图2.示出2C的最佳作用浓度和最佳作用时间。
图3.示出2C与SB431542+XAV939在促进iCM效率上的比较。
图4.示出GMT+2C显著改善重编程效率和质量。
图5.示出MT+2C能够诱导产生具有成熟的形态、典型心肌细胞特异基因的表达、自发的钙瞬变、以及与心室型心肌细胞相似的动作电位的细胞。
图6.示出在2C共同作用下才能有效替代Gata4。
图7.示出RNA-seq数据，表明2C在GMT或MT基础上，可以明显上调心肌相关基因，同时下调成纤维细胞相关基因。
图8.示出RNA-seq结果中差异最大的782个基因的主成分分析。加入2C使得GMT或MT诱导的心肌细胞获得了更加接近成体心肌细胞的整体细胞状态。
图9.示出GMT+2C和GMT相比显著上调和下调的基因做GO分析。
图10.示出SB431542能被相同信号通路的小分子代替。
图11.示出地塞米松(Dexamethasone)或萘丁美酮(Nabumetone)无法到达替代Baricitinib的效果。
图12.示出Baricitinib结构类似物有促进心肌细胞重编程的效果。
图13.示出2C可以在5个转录因子的基础上显著提高人类成纤维细胞向心肌细胞重编程的效率。
图14.2C可以在已报道的诱导hiCM的5种转录因子基础上减去一种转录因子。
图15.体内重编程的示意图，使用Postn示踪心梗后出现的心脏肌成纤维细胞。
图16.示出2C显著提高体内原位重编程效率，在小鼠心肌梗死模型心梗边缘区和梗区都有显著提升。
图17.示出小鼠心肌梗死模型Masson三色染色结果，显示2C显著降低心脏纤维化区域(红色为肌肉纤维，蓝色为胶原蛋白)。
图18.示出小鼠心梗模型中，仅2C处理相比EGFP对照组发生显著的重编程现象，并达到了仅MGT组相当的重编程效率。
图19.示出小鼠心梗模型中Masson三色染色结果，显示仅仅2C处理就可以显著降低纤维化面积。
图20.示出Ruxolitinib与SB43152的组合具有更优的体内心肌重编程效果。
图21.测试敲低Tyk2对心肌细胞重编程的影响的示意图。A：实验设计图，以新生鼠成纤维细胞为起始细胞，在感染转录因子MT组合和shRNA的情况下，仅在重编程培养基(加入C1)的条件下重编程为心肌细胞。B：重编程具体实验步骤。C：Tyk2的敲 低效果。
图22.示出在MT+SB的情况下，通过敲低Tyk2从成纤维细胞诱导出大量心脏特异性标志物cTnI和a-actinin阳性细胞。
图23.示出qPCR检测重编程的细胞心脏特异性标志物的表达水平。
图24.示出通过CRISPR敲除Tyk2可以促进转录因子MT以及小分子化合物C1诱导的心肌细胞重编程。
图25.示出Tyk2小分子抑制剂BMS-986165和/或PF-06826647可以从成纤维细胞诱导出大量心脏特异性标志物cTnI和a-actinin阳性细胞。
图26.示出Tyk2小分子抑制剂BMS-986165和/或PF-06826647可以从成纤维细胞诱导出跳动的心肌细胞。
图27.示出Tyk2抑制剂Ruxolitinib和TGFβ抑制剂TEW-7197提高心脏原位重编程效率。
图28.示出示出Tyk2抑制剂Ruxolitinib和TGFβ抑制剂TEW-7197改善MI后心脏纤维化。
图29.示出SB431542和Baricitinib(2C)与MYOCD组合获得改善的hiCM诱导效率。
图30.示出在MT+Baricitinib的情况下，通过敲低TGFβ的受体Alk5从成纤维细胞诱导出大量心脏特异性标志物cTnI和a-actinin阳性细胞。
图31.示出2C在体内能显著改善心脏功能。
具体实施方式
本发明人在小鼠心脏成纤维细胞上进行小分子筛选，并揭示出可以提高心肌细胞重编程的新方法。该方法通过Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂的组合，显著提高转录因子组合GMT介导的心肌细胞体内、体外直接重编程效率。本申请证明，通过这两类小分子联合，可以将GMT诱导的心肌细胞重编程效率提高100倍。该小分子组合可以加速重编程的进程，并提高获得的心肌样细胞的质量，尤其是缩短心肌细胞跳动的时间和增加跳动细胞的比例。该小分子组合还可以在不降低重编程效率和质量的前提下，减少重编程所需外源转录因子的数量。在人类细胞上的实验也证明，该小分子组合可以将转录因子介导的重编程效率提高20倍，并可以将重编程所需转录因子的数量从5个减少为4个。这些发现证明基因治疗和药物联合治疗在体内心脏再生的巨大潜力。
在一方面，本发明提供一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括使起始细胞与至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂接触。
如本文所用，“Tyk2”抑制剂是指抑制Tyk2信号通路的物质，例如抑制性抗体、小分子化合物等，其包括但不限于Baricitinib、Ruxolitinib、S-Ruxolitinib、Tofacitinib、Oclacitinib maleate、Itacitinib、Peficitinib、Gandotinib、FM-381、Filgotinib、PF-06826647、BMS-986165，或它们的结构类似物。在一些具体实施方案中，所述Tyk2抑制剂是 Baricitinib。在一些具体实施方案中，所述Tyk2抑制剂是Ruxolitinib。在一些具体实施方案中，所述Tyk2抑制剂是PF-06826647。在一些具体实施方案中，所述Tyk2抑制剂是BMS-986165。
值得注意的是，本文所提及的小分子化合物均涵盖其药学可接受的盐。例如，Ruxolitinib包括Ruxolitinib phosphate，而Tofacitinib也涵盖Tofacitinib citrate。本文所示例的部分Tyk2抑制剂的化学结构可见于附图12。
如本文所用，“TGFβ抑制剂”是指抑制TGFβ信号通路的物质，例如抑制性抗体、小分子化合物等，其包括但不限于SB43152、TEW-7197、RepSox、GW788388、SD-208、LY364947、Y-27632、LDN-193189、LY2109761和Galunisertib，或它们的结构类似物。在一些具体实施方案中，所述TGFβ抑制剂是SB43152。在一些具体实施方案中，所述TGFβ抑制剂是TEW-7197。
在一些实施方案中，所述方法包括使起始细胞与Tyk2抑制剂和TGFβ抑制剂接触。
在一些实施方案中，所述至少一种Tyk2抑制剂包括1种、2种、3种或更多种Tyk2抑制剂。在一些实施方案中，所述至少一种TGFβ抑制剂包括1种、2种、3种或更多种Tyk2抑制剂。
在一些具体实施方案中，所述方法包括使起始细胞与Baricitinib和SB43152接触。
在一些具体实施方案中，所述方法包括使起始细胞与Ruxolitinib和TEW-7197接触。在一些具体实施方案中，所述方法包括使起始细胞与Ruxolitinib和SB43152接触。在一些具体实施方案中，所述方法包括使起始细胞与PF-06826647和SB43152接触。在一些具体实施方案中，所述方法包括使起始细胞与BMS-986165和SB43152接触。在一些具体实施方案中，所述方法包括使起始细胞与PF-06826647、BMS-986165和SB43152接触。
在一些实施方案中，所述起始细胞为分化的细胞。在一些实施方案中，起始细胞是非心肌细胞。起始细胞可以为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来源细胞诸如神经细胞，或者内胚层来源细胞如结肠细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或体内几乎任何细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为皮肤成纤维细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为心脏成纤维细胞。
在一些实施方案中，所述起始细胞为分离的细胞(离体细胞)。
在本发明中，所述起始细胞可以来源于哺乳动物或非哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于人。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于非人哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于鼠如小鼠或大鼠或非人灵长类动物。
在一些实施方案中，所述重编程获得的心肌细胞是功能性心肌细胞。所述功能性心肌细胞例如具有以下特征中的一或多种：α-actinin阳性、cTnT阳性、具有排列整齐的肌 节结构、跳动(beating)、表达心室型心肌细胞标志物例如Myl2v、自发的钙瞬变、与心室型心肌细胞相似的动作电位等。
在本发明中，“使起始细胞与Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂接触”可以通过例如将起始细胞在包含Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂的培养基中培养而实现。
在一些实施方案中，Tyk2抑制剂例如Baricitinib的浓度为大约0.1μM-大约50μM，例如大约0.1μM、大约0.5μM、大约1μM、大约1.5μM、大约2μM、大约2.5μM、大约5μM、大约7.5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM。在一些优选实施方案中，Tyk2抑制剂例如Baricitinib的浓度为大约2μM。在一些优选实施方案中，Tyk2抑制剂例如PF-06826647或BMS-986165的浓度为大约5μM。
在一些实施方案中，TGFβ抑制剂例如SB43152的浓度为大约0.1μM-大约50μM，例如大约0.1μM、大约0.5μM、大约1μM、大约1.5μM、大约2μM、大约2.5μM、大约5μM、大约7.5μM、大约10μM、大约15μM、大约20μM、大约30μM、大约40μM、大约50μM。优选地，TGFβ抑制剂例如SB43152的浓度为大约2μM。
在一些实施方案中，本发明所述方法“使起始细胞与Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂接触”大约1天至大约21天或更长时间，例如大约3天至大约21天或更长时间，大约6天至大约21天或更长时间、大约9天至大约21天或更长时间、大约12天至大约21天或更长时间、大约15天至大约21天或更长时间、或大约18天至大约21天或更长时间。
在一些实施方案中，所述方法还包括向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA。
如本文所用，“心肌细胞诱导转录因子”是指在导入起始细胞后能够在合适条件下导致起始细胞重编程为心肌细胞的转录因子。本领域已知许多的可用于通过重编程产生心肌细胞的转录因子，包括但不限于：MEF2C、TBX5、GATA4、MESP1、MYOCD、HAND2、SRF、ESRRG、ZFPM2、Nkx2.5、VEGF、Baf60c，及它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子至少包括MEF2C。
在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子还包括TBX5。例如所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C和TBX5，或由其组成。
在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子还包括GATA4。例如所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C、TBX5和GATA4，或由其组成。
在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子还包括MYOCD。例如所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C、TBX5、GATA4和MYOCD，或由其组成。
在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子还包括MESP1。例如所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C、TBX5、GATA4、MYOCD和MESP1，或由其组成。
在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C、GATA4、 MYOCD和MESP1，或由其组成。
在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子是MYOCD。
如本文所用，“心肌细胞诱导microRNA”是指在导入起始细胞后能够在合适条件下导致起始细胞重编程为心肌细胞的microRNA。本领域已知多种可用于通过重编程产生心肌细胞的microRNA，包括但不限于：miR1、miR133、miR208和miR499，及它们的任意组合。在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导microRNA包括miR1、miR133，或由其组成。在一些实施方案中，所述至少一种心肌细胞诱导microRNA包括miR1、miR133、miR208和miR499，或由其组成。
所述至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA可以通过本领域已知的任何方法提供给所述起始细胞，即导入所述起始细胞。
例如，可以将包含编码所述转录因子和/或microRNA的核苷酸序列的表达载体导入所述起始细胞。将表达载体导入细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物、Biolistic颗粒传递法(基因枪粒子轰击法)、显微注射法、电穿孔法和病毒介导法。其中优选地所述表达载体是病毒表达载体，其可以通过病毒转染实现编码所述转录因子和/或microRNA的核苷酸序列的导入。所述病毒载体优选为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等。构建包含所需核苷酸序列的病毒载体例如慢病毒载体的方法是本领域已知的。
在本发明的方法的一些实施方案中，所述“向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA”的步骤可以在“使起始细胞与Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂接触”的步骤之前或之后或同时进行，优选在之前进行。例如，所述“向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA”的步骤可以在“使起始细胞与至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂接触”的步骤之前1天进行。
在一方面，本发明提供上文所述Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂在制备用于从起始细胞制备心肌细胞的试剂或试剂盒中的用途。所述Tyk2抑制剂以及TGFβ抑制剂如上文所定义。
在一方面，本发明提供一种通过本发明的方法制备的心肌细胞。
在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体。
在一方面，本发明还提供通过本发明的方法制备的心肌细胞或本发明的包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途。所述心脏疾病特别是心肌疾病，包括但不限于心力衰竭、心肌梗死等。
在一方面，本发明还提供一种在对象中治疗心脏疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用通过本发明的方法制备的心肌细胞或本发明的包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。
如本文所用，“对象”可以是哺乳动物或非哺乳动物。所述对象可以是人，或非人哺乳动物例如小鼠或大鼠或非人灵长类动物。
此外，本发明人还令人惊奇地发现在体内用GMT、TGFβ抑制剂例如SB43152以及Tyk2抑制剂例如Baricitinib对心梗后的小鼠进行处理，可以显著提高体内原位重编程效率，并有效减少瘢痕面积。更令人惊奇的是，单独用小分子TGFβ抑制剂例如SB431542和Tyk2抑制剂例如Baricitinib处理心梗小鼠，也能观察到原位重编程发生，并达到与单独用转录因子(GMT)相当的体内重编程效率。
因此，在一方面，本发明还提供一种在对象中治疗心脏疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂。所述心脏疾病特别是心肌疾病，包括但不限于心力衰竭、心肌梗死等。所述Tyk2抑制剂以及TGFβ抑制剂如上文所定义。
在一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象施用至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA。所述“至少一种心肌细胞诱导转录因子”和“至少一种心肌细胞诱导microRNA”如上文所定义。在一些实施方案中，所述“施用至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA”包括施用包含编码所述转录因子和/或microRNA的核苷酸序列的表达载体，例如病毒载体，优选慢病毒载体。
在一些实施方案中，所述施用是全身性施用。在一些实施方案中，所述施用是局部性施用，例如心脏内施用。
在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所定义的至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物还包括包含本文所定义的至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA，或者包含编码所述转录因子和/或microRNA的核苷酸序列的表达载体，例如病毒载体，优选慢病毒载体。
在一方面，本发明提供本发明所定义的至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途。所述心脏疾病特别是心肌疾病，包括但不限于心力衰竭、心肌梗死等。
在一方面，本发明提供本文所定义的至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂，以及本文所定义的至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA，或者包含编码所述转录因子和/或microRNA的核苷酸序列的表达载体在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途。所述表达载体例如病毒载体，优选慢病毒载体。所述心脏疾病特别是心肌疾病，包括但不限于心力衰竭、心肌梗死等。
在一方面，本发明提供一种重编程培养基，其包含本文所定义的至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂。在一些实施方案中，所述重编程培养基用于本发明的方法。
在一方面，本发明提供一种用于将起始细胞重编程为心肌细胞的试剂盒，所述试剂 盒包含本文所定义的至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂，和/或包含本发明的重编程培养基。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含本文所定义的至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA，或者包含编码所述转录因子和/或microRNA的核苷酸序列的表达载体。所述表达载体例如病毒载体，优选慢病毒载体。
在本发明各个方面的一些实施方案中，所述至少一种Tyk2抑制剂是Baricitinib，且所述至少一种TGFβ抑制剂是SB43152。在本发明各个方面的一些实施方案中，所述至少一种Tyk2抑制剂是Ruxolitinib，且所述至少一种TGFβ抑制剂是TEW-7197。在本发明各个方面的一些实施方案中，所述至少一种Tyk2抑制剂是Ruxolitinib，且所述至少一种TGFβ抑制剂是SB43152。在本发明各个方面的一些实施方案中，所述至少一种Tyk2抑制剂是PF-06826647，且所述至少一种TGFβ抑制剂是SB43152。在本发明各个方面的一些实施方案中，所述至少一种Tyk2抑制剂是BMS-986165，且所述至少一种TGFβ抑制剂是SB43152。在本发明各个方面的一些实施方案中，所述至少一种Tyk2抑制剂是BMS-986165和PF-06826647，且所述至少一种TGFβ抑制剂是SB43152。
实施例
为了便于理解本发明，下面将参照相关具体实施例及附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
材料和方法
慢病毒制备和感染
本实验采用的慢病毒载体制备是用基于慢病毒载体PLenti-Lox3.7(pLL3.7)及FU-tet-o-hOct4改造而来的pLL，表达囊膜蛋白水泡性口炎病毒G蛋白的质粒pVSVg，用于帮助出核进行外壳组装的表达蛋白质粒pRSV rev，和带有囊膜和基质的多蛋白表达基因Gag，蛋白酶、反转录酶和整合酶多蛋白表达基因Pol，以及Rev应答元件RRE的质粒pMDLg/pRRE共转染人胚胎肾上皮细胞系HEK293T进行包装。
小鼠心肌梗死造模及慢病毒于心梗区原位过表达基因
1.麻醉方法：使用异氟烷持续吸入诱导麻醉。诱导浓度为5％，维持浓度为1％。
2.气管插管：在进行插管之前，使用脱毛膏对小鼠手术部位进行脱毛。脱毛区域在其左上肢腋下，面积大约4平方厘米。使用细线挂住小鼠的上门齿，将小鼠悬吊于倾斜的纸板上。使用鹅颈灯照亮小鼠的咽喉部。此时轻轻拉出小鼠的舌，可见其气管。使用留置针进行气管插管。插管成功后，将小鼠从纸板上取下，使用医用胶带将其固定于手术台上，即可连接呼吸机，同时进行维持麻醉。维持麻醉时，潮气量设置为200μL/ min。
3.提前将病毒从-80℃冰箱取出，置于冰上融化。融化后，使用移液枪将病毒液体轻柔混匀。若使用FU-tet-o载体的慢病毒，则需要取同等体积的FUdeltaGW-rtTA进行预混匀(例如将FU-tet-o-EGFP 50μL及FUdeltaGW-rtTA 50μL混匀)。提前将浓缩病毒吸入微量注射器(使用27g针头)，至于冰上待用。
4.手术方法小鼠右侧卧位。在小鼠左腋下大约2mm处，竖直切开皮肤，切开后在创口处预置一个荷包结。钝性分离小鼠皮肤与肌肉，进一步钝性分离其胸大肌，暴露其左第4-5肋间，在此处进胸。轻柔置入开胸器，慢速扩张创口，即可观察到其左心室。因为小鼠膈神经非常纤细，所以勿刻意去游离整个心包。在肺动脉主干和左心耳交界下方轻轻撕开少许心包，此时可在体视显微镜下观察到冠状动脉左前降支。使用滑线结扎近端。结扎后可观察到心室前壁颜色变化，左室前壁会立即变苍白，并且伴有短暂的室性心律失常。此时即可进行浓缩病毒的注射。
5.在结扎冠状动脉左前降支后，立刻在缺血发白的区域边缘，进行浓缩病毒注射。注射2-3针，浓缩病毒总体积为60μL。注射时，可观察到注射位点心肌出现显著漂白。若心肌有出血，可使用医用脱脂棉轻轻按压，直到出血停止。
6.拉紧荷包结进行缝合关胸。关闭异氟烷麻醉罐。使用10ml注射器插入小鼠胸腔及肌肉之间。缓慢挤压小鼠胸腔，可将其中的气体排出到小鼠胸腔及肌肉间隙中。此时进行抽气，可将气体抽出，从而避免小鼠出现气胸并发症。
7.将小鼠置于42℃温床上，小鼠会在几分钟后苏醒。
8.若使用FU-tet-o载体的慢病毒，则需要在小鼠术后第二天将其饮水替换为含有1mg/mL Doxycycline hyclate，2mg/ml蔗糖溶液，诱导目的片段持续表达。
心管，吸去上清，可见套管底部有白色沉淀。使用预冷的PBS重悬，重悬比例为含毒培养基：PBS＝525：1。重悬后的浓缩病毒分装为50μL/管，冻存于-80℃冰箱中，随用随取。
小鼠小分子药物给药
将小分子SB431542及Baricitinib共同溶于DMSO，配制为储存液，两个小分子浓度均为100mg/ml，储存于-80度冰箱中。药物注射前，将小分子储存液溶于给药溶剂中，现用现配。2C给药剂量为5mg/kg/d，通过腹腔注射给药。溶剂配方：5％Tween-80，30％PEG300，65％去离子水。
冰冻切片及免疫荧光染色
1.引颈处死小鼠，取出心脏；沿结扎点将心脏进行冠状面切开，取心尖部位心梗区。在PBS中尽量挤出心脏中的血液。将心脏放入4％多聚甲醛中，4℃3.5小时；PBS润洗；再将心脏放入30％蔗糖中，4℃过夜脱水。
2.O.C.T.包埋组织，放入液氮中进行冷冻。
3.切片机箱温度和刀头温度均设置为-22℃，先对包埋块进行修片，再进行冰冻切片，切片厚度为10μm。切片使用4℃丙酮固定5分钟，切片在室温阴干，防止脱片。
4.对于脆弱抗原，可将切片浸泡于37℃柠檬酸盐缓冲液中20min。TBS-Tween20洗三遍，每遍10分钟。
5. 0.3％Triton-100 TBS-Tween20溶液37℃10min×3次(先配成30％的储存液：Triton x-100 28.2ml+TBS-Tween20 72.8ml，置于37度水浴中2-3小时，使其充分溶解，临用时再稀释)；TBS-Tween20漂洗5min×3次。
6. 10％NDS，2％BSA溶于0.3％Triton-100 TBS-Tween20溶液，封闭30min。
7.甩去封闭液，加入一抗(按照说明书推荐比例，稀释于10％NDS，2％BSA中)，4℃放置过夜。
8.用TBS-Tween20洗三遍，每遍5分钟。
9.加入二抗(1:1000稀释于2％BSA的TBS溶液中)，室温避光放置1小时。
10.用TBS-Tween20洗三遍，每遍5分钟。
11.使用含DAPI染色剂的防淬灭封片剂封片，在激光共聚焦显微镜下观察或避光保存。
12.激光共聚焦显微镜图像采集。
13.ImageJ软件(NIH)辅助分析。
Masson染色
切片常规脱蜡至水。用配制好的Weigert铁苏木素染色液染色5min-10min。酸性乙醇分化液分化5-15s，水洗。Masson蓝化液返蓝3-5min，水洗。蒸馏水洗1min。丽春红品红染色液染色5-10min。在上述操作过程中按蒸馏水:弱酸溶液＝2:1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1min。磷钼酸溶液洗1-2min。用配置好的弱酸工作液洗1min。直接放入苯胺蓝染色液中染色1-2min。用配置好的弱酸工作液洗1min。95％乙醇快速脱水。无水乙醇脱水3次，每次5-10s。二甲苯透明3次，每次1-2min。中性树胶封固。
小鼠心动超声分析
麻醉方法：使用异氟烷持续吸入诱导麻醉。诱导浓度为5％，维持浓度为1％。将小鼠胸部脱毛。使用Vevo 2100(VisualSonics)小动物超声系统进行图像采集。
重编程诱导心肌细胞方法：
NSF(neonatal mouse skin fibroblast)分离自出生1天的小鼠皮肤，胶原酶消化。P0冻存，复苏P1诱导。nCF(neonatal mouse cardiac fibroblast)分离自出生1天的小鼠心脏，胶原酶消化，铺于10cm培养皿。CD90.2 MACS，去除残余的心肌细胞，分选后的CF用于诱导。
人成纤维细胞，来自ATCC，～P8-10用于诱导。
重编程步骤：d-2，铺细胞。d-1，感染病毒。d0，移除含有病毒的培养基，更换为重编程培养基。大约3周进行跳动细胞(beating cell)计数以及免疫荧光测定。
MEF分离
MEF培养基：补充有10％胎牛血清(FBS)、1％GlutaMAX、1％非必需氨基酸(NEAA)和1％Pen Strep的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。
从ICR小鼠胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)。简言之，在去除头部、四肢和内脏后，用剪刀将E13.5胚胎切碎并在胰蛋白酶-EDTA中于37℃解离10分钟。加入MEF培养基并离心后，收集并培养MEF细胞。
NSF分离
NSF培养基：补充有10％胎牛血清(FBS)、1％GlutaMAX、1％非必需氨基酸(NEAA)和1％青霉素-链霉素的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。
从出生1天的ICR小鼠分离新生小鼠皮肤成纤维细胞(NSF，neonatal mouse skin fibroblast)。简言之，小鼠处死后，剥离皮肤，放置于含有0.25％Trypsin的PBS溶液，4℃消化过夜。次日，取出消化的皮肤组织，小心去除表皮。将真皮组织剪碎，放置于collagenase type I+DNase I(溶解于MEF培养基)消化～30分钟，离心取出毛囊细胞后，收集皮肤成纤维细胞。
nCF分离
nCF培养基：IMDM，补充有20％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素。
从出生1天的ICR小鼠分离新生小鼠心脏成纤维细胞(nCF，neonatal mouse cardiac fibroblast)。简言之，小鼠处死后，取出心脏，剪碎，放置于含有1mg/ml的collagenase type II+DNase I(溶解于nCF培养基)。每消化5分钟，收集消化液上清，离心收集消化得到的细胞，直至组织块消化完全，收集培养nCF。
nCF磁分选
MACS buffer：500ml PBS，添加2.5g BSA,2ml EDTA(0.5M),0.22μm滤器过滤，4℃保存。
nCF用Trypsin-EDTA消化，收集细胞，用MACS缓冲液重悬，加入Thy1.2磁珠，4℃孵育30分钟。MACS缓冲液漂洗孵育后的细胞，并用MACS缓冲液重悬，过平衡后的的LS柱。3-4次漂洗后，收集结合磁珠的细胞，计数，待用。
慢病毒包装
293T培养基：补充有10％胎牛血清(FBS)的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基 (DMEM)，4℃保存。
2xHBS：500ml HEPES缓冲液(50mM)+280mM NaCl+10mM KCl+1.5mM Na 2HPO 4+12mM Glucose,调节pH至7.05,0.22μm滤器过滤，-20℃冰箱保存。
2.5M CaCl 2：CaCl 2溶于ddH 2O，CaCl 2为2.5M，0.22μm滤器过滤，-20℃冰箱保存。
D-1，铺293T于10cm培养皿。D0，待细胞汇合度～70％时，更换新鲜培养基。同时预混转染目的质粒(15μg)和三种包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV/Rev以及pVSV-G(每种5μg)+50μl 2.5M CaCl 2，加ddH 2O补足至500μl，混匀后，缓慢滴加至500μl的2x HBS中，震荡混匀，滴加至培养皿，轻轻摇匀。转染后12小时，更换新鲜培养基，转染后48小时，收集含有病毒的培养基，0.45μm滤器过滤，分装，保存于-80℃冰箱。
从成纤维细胞产生iCM
iCM重编程培养基：DMEM/M199(4:1)，补充10％KnockOut血清替代(KSR)、10％FBS、1％GlutaMAX、1％MEM NEAA、1％Pen Strep，2μg/ml Dox和小分子混合物2C(2μM SB431542、2μM Baricitinib)。
D-2，24孔板先用0.1％gelatin包被，37℃细胞培养箱放置30分钟，吸去gelatin，24孔板中以每孔80,000个细胞接种。D-1，细胞更换含有6ng/μl polybrene的MEF培养基，感染FU-tet-o-Gata4、FU-tet-o-Mef2c、FU-tet-o-Tbx5、FUdeltaGW-rtTA，每孔每种病毒加200微升未经浓缩的病毒。D0，细胞更换为iCM重编程培养基，每3-4天换液。
试剂供应商及货号
试剂名称 供应商 货号
1 DMEM，high glucose HyClone SH30022.01
2 MEDIUM 199 Gibco 11150-059
3 KnockOut Serum Replacement(KSR) Thermo Fisher A3181502
4 Fetal Bovine Serum(FBS) VISTECH SE100-011
5 GlutaMAX Gibco 35050–061
6 MEM NEAA Gibco 11140-050
7 Pen Strep Gibco 15140-122
8 Doxycycline hyclate Sigma-Aldrich D9891
9 SB431542 selleck S1067
10 Baricitinib selleck S2851
11 IMDM Gibco 12440-053
12 Collagenase I Gibco 17018029
13 Collagenase II Gibco 17101015
14 Polybrene Sigma-Aldrich H9268
15 CaCl 2 Sigma-Aldrich C7902
16 HEPES Sigma-Aldrich H4034
17 NaCl Sigma-Aldrich BP358-212
18 KCl Sigma-Aldrich P5405
19 Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
20 Glucose Sigma-Aldrich G7021
21 Gelatin Sigma-Aldrich G9391
22 PBS Corning 21-040-CVR
23 Trypsin Gibco 15090-046
24 Trypsin-EDTA Gibco 25200-056
25 0.22μm filter Millipore SLGP033RB
26 0.45μm filter Millipore SLHP033RB
27 24-well plates Corning 353047
28 10cm Tissue culture dishes Corning 353003
实施例1、SB431542和Baricitinib促进GMT介导的小鼠重编程诱导心肌细胞
筛选是在Myh6-mCherry新生小鼠真皮成纤维细胞上进行的，在转染GMT(Gata4、Mef2c和Tbx5)三个基因的同时，对小分子库进行筛选，通过观察报告基因的比例和亮度来定量小分子对重编程的效果，如图1A所示。具体而言，在D-2(第-2天)，铺Myh6-mCherry新生小鼠皮肤成纤维细胞(neonatal mouse skin fibroblast，NSF)；在D-1(第-1天)，感染分别表达Gata4、Mef2c、Tbx5(GMT)的三种慢病毒；在D0(第0天)，更换为添加小分子的重编程培养基，每3-4天换液。诱导三周后，观察并统计Myh6-mCherry阳性细胞数目，从而筛选能够促进诱导心肌细胞样细胞(induced cardiomyocyte like cell，iCM)的小分子。
通过筛选，发现SB431542(本文也称为C1)和Baricitinib(本文也称为C2)两个小分子可以分别提高重编程诱导心肌细胞效率，并且这两种小分子具有协同作用(其组合称为2C)。见图1B和图1C。
然后进一步研究2C的最佳作用浓度和最佳作用时间。具体而言，对于最佳作用浓度，在D-2铺Myh6-mCherry新生小鼠真皮成纤维细胞；在D-1感染表达Gata4、Mef2c、Tbx5(GMT)的三种慢病毒；在D-0更换为包含不同浓度小分子组合的重编程培养基，每3-4天换液。先在Baricitinib为2μM的基础之上，依次添加不同浓度梯度的SB431542，经心肌细胞的标志物cTnT染色，确定SB431542的最优作用浓度。然后在SB431542为2μM的基础上，依次添加不同浓度的Baricitinib，经cTnT染色，确定Baricitinib的最优作用浓度。如图2A所示，SB431542的最佳作用浓度是2μM，Baricitinib的最佳作用浓度也是2μM。
对于最佳作用时间，在D-2铺野生型小鼠心脏成纤维细胞(neonatal mouse cardiac fibroblast，nCF)，用CD90.2 MACS去除残留心肌细胞；在D-1感染表达Gata4、Mef2c、Tbx5(GMT)三种慢病毒；在D0，更换为重编程培养基：Basal medium和2C medium(即Basal medium+2μM SB431542+2μM Baricitinib)，每3天换液。在D21统计跳动的(beating)iCM细胞数目以及α-actinin染色阳性的细胞数目。结果如图2B所示，两种小分子联合的最佳作用时间是D0-D21全程加入。
之前已经报道，小分子组合SB431542+XAV939(Circulation,2017)能够促进重编程诱导心肌细胞。因此，本发明人进一步比较了2C和SB431542+XAV939的效率。具体而言，在D-2铺Myh6-mCherry新生小鼠真皮成纤维细胞；在D-1感染表达Gata4、Mef2c、Tbx5(GMT)的三种慢病毒；在D-0更换为包含不同小分子组合的重编程培养基，每3-4天换液；在D21免疫荧光染色：cTnI、cTnT、α-actinin。其中使用的重编程培养基分别为：Basal medium、Basal medium+2μM SB431542(C1)、Basal medium+2μM Baricitinib (C2)、Basal medium+2μM SB431542+2μM Baricitinib(2C)、Basal medium+2.6μM SB431542+5μM XAV939(SB+XAV)、Basal medium+2μM SB431542+2μM Baricitinib+5μM XAV939(2C+XAV)。结果如图3所示，2C促进iCM，效率显著高于SB431542+XAV939。
此外，本发明人发现，2C不仅提高了重编程诱导心肌细胞的效率，还显著提高了诱导重编程的质量。具体而言，在D-2铺Myh6-mCherry新生小鼠真皮成纤维细胞；在D-1感染表达Gata4、Mef2c、Tbx5(GMT)的三种慢病毒；在D-0更换为包含2C的重编程培养基，每3-4天换液；在3周或4周检测心脏标志物表达或心肌细胞表型。结果如图4所示。图4A和B示出GMT+2C高效诱导获得的心肌细胞样细胞，cTnT阳性细胞达到70.1％(4周)，α-actinin阳性细胞达到82.6％(4周)，且都具有排列整齐的肌节结构。图4C显示在皮肤细胞上，绝大多数的GMT+2C诱导(4周)获得的心肌细胞样细胞都能够表达心室型心肌细胞的标志物，Myl2v(Myosin light chain 2)，证明诱导获得的iCM为心室亚型的心肌细胞。图4D显示GMT+2C(3周)非常高效的促进iCM的跳动，证明诱导获得的心肌细胞为功能成熟的iCM。
实施例2、2C与MT组合实现小鼠重编程诱导心肌细胞
本发明人令人惊奇地发现，2C可以在不降低重编程效率和质量的前提下，减去GMT三个转录因子中的Gata4。具体而言，在D-2，铺细胞，WT小鼠心脏成纤维细胞(neonatal mouse cardiac fibroblast,nCF)，用CD90.2 MACS去除残留心肌细胞；在D-1，分成三种处理：不感染病毒(Null)，感染表达Gata4+Mef2c+Tbx5(GMT)的病毒，或感染表达Mef2c+Tbx5(MT)的病毒；在D0更换为重编程培养基：Basal medium和2C medium(Basal medium+2μM SB431542+2μM Baricitinib)，每3天换液；在指定时间检查标志物表达、心肌相关基因表达、跳动的细胞计数、细胞钙瞬变、细胞动作电位等。结果如图5所示。
图5A通过在第3周的cTnT染色显示2C可以在GMT三个基因基础上减去Gata4。图5B显示MT+2C诱导(4周)获得的细胞具有排列整齐的肌节结构。图5C显示2C促进心肌细胞基因的表达(心肌细胞结构基因，心肌细胞功能相关基因，心肌细胞内源转录因子)。图5D显示MT+2C诱导(3周)获得能够跳动的功能性心肌细胞。图5E显示MT+2C诱导(4周)获得的功能性心肌细胞具有自发的钙瞬变。图5F显示MT+2C诱导(6周)获得的功能性心肌细胞具有与成熟的心室型心肌细胞相似的动作电位。
此外，发明人进一步发现在GMT三个基因的基础上减去GATA4，需要2C共同作用。具体而言，在D-2，铺细胞，WT小鼠心脏成纤维细胞(neonatal mouse cardiac fibroblast,nCF)，用CD90.2 MACS去除残留心肌细胞；在D-1，感染表达Mef2c+Tbx5(MT)的病毒；在D0更换为重编程培养基，每3天换液；3周后检查cTnT阳性细胞和跳动的细胞。重编程培养基依次是Basal medium、Basal medium+2μM SB431542(C1)、Basal medium+2μM Baricitinib(C2)、Basal medium+2μM SB431542+2μM Baricitinib(2C)、Basal medium+2.6μM SB431542+5μM XAV939(SB+XAV)、Basal medium+2μM SB431542+2μM Baricitinib+5μM XAV939(2C+XAV)。结果如图6所示，在仅转导MT基础上，只有同时加入2C才能诱导出跳动的细胞。
实施例3、2C促进重编程诱导心肌细胞的机制
发明人进一步通过RNA-seq研究使用MT+2C以及GMT+2C进行重编程诱导心肌细胞的表达谱。具体而言，在D-2，铺细胞，WT小鼠心脏成纤维细胞(neonatal mouse cardiac fibroblast,nCF)，用CD90.2 MACS去除残留心肌细胞；在D-1，分成三种处理：不感染病毒(Null)，感染表达Gata4+Mef2c+Tbx5(GMT)的病毒，或感染表达Mef2c+Tbx5(MT)的病毒；在D0更换为重编程培养基，每3天换液；6周后收集细胞，提取总RNA进行RNA-seq。所使用培养基分别为：Basal medium、Basal medium+2μM SB431542(SB)、Basal medium+2μM SB431542+2μM Baricitinib(2C)、Basal medium+2.6μM SB431542+5μM XAV939(SBXAV)。Neonatal CM为出生1天小鼠心肌细胞，Adult CM为8周龄的成年小鼠心室心肌细胞。
如图7所示，RNA-seq的数据表明，MT+2C以及GMT+2C可以与其他组合明显区分，并与成体心肌细胞具有更相近的表达谱；MT+2C以及GMT+2C与其他组合相比，可以在诱导心肌特异基因表达的同时，更好的抑制成纤维细胞相关基因的表达。
基于RNA-seq数据，将成体心肌细胞与小鼠心脏成纤维细胞差异最大的782个基因做主成分分析表明，MT+2C以及GMT+2C比已经发表的其他重编程方法更靠近成体心肌细胞，如图8所示。
此外，为了进一步研究2C的作用，用GMT+2C和GMT相比显著上调和下调的基因做GO分析，如图9所示，2C显著上调了和心肌发育以及肌肉跳动相关的基因，显著下调了和细胞激活以及粘附相关的基因。
实施例4、2C的替代物
本实施例旨在研究SB431542或Baricitinib能否被相同信号通路的小分子代替。
具体而言，在D-2(第-2天)，铺Myh6-mCherry新生小鼠皮肤成纤维细胞(NSF)；在D-1(第-1天)，感染分别表达Gata4、Mef2c、Tbx5(GMT)的三种慢病毒；在D0(第0天)，更换为添加小分子的重编程培养基，每3-4天换液；在D18计数跳动的细胞。此外，在D-2，铺细胞，WT小鼠心脏成纤维细胞(nCF)，用CD90.2 MACS去除残留心肌细胞；在D-1，感染表达Mef2c+Tbx5(MT)的病毒；在D0更换为添加小分子重编程培养基，每3天换液；在四周后计数cTnT阳性细胞。2C用作阳性对照。
SB431542属于TGFβ信号通路的抑制剂，本实施例分析了该信号通路的其他小分子能否与Baricitinib组合，包括RepSox、GW788388、SD-208、LY364947、Y-27632、LDN-193189、LY2109761和Galunisertib。Baricitinib属于Jak途径的抑制剂，本实施例分析了该信号通路的其他小分子能否与SB431542组合，包括Filgotinib、WP1066、Gandotinib、Ruxolitinib和AZD1480。结果如图10所示，无论是以跳动为标准还是以 cTnT阳性细胞数为标准，SB431542能够被同信号通路的小分子有效替代，Baricitinib同信号通路的小分子仅仅其结构类似物Ruxolitinib有替代效果。可见，证明TGFβ信号通路对重编程成心肌细胞非常重要；但与此同时，Baricitinib并不能被大多数Jak-Stat同靶点的其他化合物替代。
此外，已有报道一些抗炎小分子能够提高重编程诱导心肌细胞效率，例如地塞米松(Dexamethasone)或萘丁美酮(Nabumetone)。然而，如图11所示，在转导MT的基础上，这些抗炎小分子分别和SB431542组合诱导WT小鼠心脏成纤维细胞(nCF)三周，其无法替代Baricitinib的作用。
如上所述，Jak信号通路的小分子仅仅其结构类似物Ruxolitinib有替代效果。本发明人进一步考察其他Baricitinib结构类似物是否能够有效替代Baricitinib。如图12所示，在转导MT的基础上，Baricitinib结构类似物分别和SB431542组合诱导WT小鼠心脏成纤维细胞(nCF)三周，其可以替代Baricitinib的作用。
实施例5、2C促进重编程诱导人心肌细胞
本发明人进一步考察了2C在基于5种转录因子(GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1、MYOCD)的人成纤维细胞向人心肌细胞样细胞(human induced cardiomyocyte like cell，hiCM)的转分化中的作用。
具体而言，在D-2铺细胞，人心脏成纤维细胞；在D-1感染表达GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1、MYOCD(5F)的慢病毒；在D0更换为重编程培养基：basal/2C medium，每3天换液；在3周时计数cTnT阳性细胞数、表型检测和心肌相关基因表达检测。或者，在D-2铺细胞，BJ人表皮成纤维细胞；在D-1感染表达GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1、MYOCD(5F)的慢病毒；在D0更换为重编程培养基：basal/2C medium，每3天换液；在3周时检查自发钙瞬变。
结果如图13所示。图13A显示2C非常高效的促进人成纤维细胞向人心肌细胞样细胞的转分化。图13B显示诱导获得的hiCM具有良好的肌节结构。图13C显示2C显著提高心肌相关基因的表达。图13D显示诱导获得hiCM具有自发的钙瞬变。
据报道，5种转录因子(GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1、MYOCD)对于诱导hiCM是必需的。本发明人令人惊奇地发现，2C可以减少人类细胞重编程所需的转录因子的数量而不降低重编程效率。
具体而言，在D-2铺细胞，BJ人表皮成纤维细胞；在D-1感染表达GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1和MYOCD中的4种(4F)的慢病毒；在D0更换为重编程培养基：basal/2C medium，每3天换液；在3周时检查α-actinin阳性细胞数目。
结果见图14。在2C存在下，TBX5或MESP1不是必需的，特别是MESP1。2C与GATA4、MEF2C、TBX5、和MYOCD的组合的效率甚至高于2C+5F的效率。
实施例6、2C在体内原位重编程诱导心肌细胞
为了验证2C在体内原位重编程中的效果，使用成熟的慢病毒过表达体系，在小鼠心肌梗死区域原位过表达Gata4、Mef2c、Tbx5等转录因子，配合小分子化合物提高转分化的效率及心梗治疗效果。为了更好地评价细胞命运的转变效率，使用Postn-MerCreMer和Rosa-loxp-stop-loxp-tdTomato杂交的转基因小鼠模型，示踪心肌梗死区域的肌纤维细胞，通过组织切片免疫荧光配合激光共聚焦显微镜计数、心梗区细胞分离等方法，计算心肌细胞在红色荧光细胞(曾经为心脏肌纤维细胞)中的比例，从而判断肌成纤维细胞向心肌的转分化效率。并通过心动超声、心电监测、核磁共振和动物行为学检测等手段综合评价心脏修复的治疗效果。体内原位重编程如图15所示。
如图16所示，体内世系示踪实验表明GMT+2C相比GMT具有更好的体内原位重编程效率。相比GMT，GMT+2C在心梗的边缘区以及梗区都有显著提高的重编程效果。此外，通过马松染色，发现在心梗小鼠模型上，GMT+2C处理组相比GMT具有显著降低纤维化瘢痕面积，如图17所示。
然而，更令人惊奇的是，在没有任何转基因的条件下，纯2C处理组，就能观察到一定数量的体内原位重编程发生，并且其重编程效率已经达到了GMT处理组相当的水平，如图18所示。此外，马松染色表明(图19)，纯2C处理组与溶剂处理组相比，可以显著降低纤维化瘢痕面积。这样的结果提示2C具有单独用于治疗心梗的潜力。
图20示出Ruxolitinib与SB43152的组合具有更优的效果。
实施例7、抑制Tyk2信号通路促进重编程诱导人心肌细胞
1.通过shRNA敲低Tyk2影响心肌细胞重编程
如上所述，小分子Baricitinib(C2)和SB43152(C1)的组合(2C)可以显著提高转录因子组合GMT(Gata4、Mef2c和Tbx5)介导的心肌细胞重编程效率，并且该小分子组合还可以在不降低重编程效率和质量的前提下，减少重编程所需外源转录因子的数量，即在该小分子组合存在下，使用转录因子组合MT(Mef2c和Tbx5)即可实现高效的心肌细胞重编程。然而，如上所示，Jak信号通路的小分子大部分并不能替代Baricitinib在心肌重编程中的作用。因此，Baricitinib可能通过其他信号通路起作用。
本发明人现令人惊讶地发现，敲低细胞内Tyk2的表达，可以代替Baricitinib(C2)的作用。本实施例的实验设计如图21所示。简言之，通过设计靶向Tyk2基因的shRNA(shTyk2#1、shTyk2#2、shTyk2#3、shTyk2#4、shTyk2#5)，和转录因子组合MT一起导入新生小鼠成纤维细胞，然后在包含C1的重编程培养基中进行诱导，测试其重编程为心肌样细胞的效率。图21C显示五种shRNA均能敲低Tyk2的表达。
心脏特异性标志物cTnI和a-actinin的免疫荧光检测显示，shTyk2#1、shTyk2#2、shTyk2#3这三种shRNA分别和转录因子MT以及C1组合，可以实现与小分子组合2C类似的心肌细胞重编程效率。shNT为非靶向对照。结果示于图22。此外，qPCR也证实心脏特异性标志物在MT+C1且敲低Tyk2情况下表达显著提高(图23)。
能够敲低Tyk2并提高心肌重编程效率的Tyk2特异性shRNA的序列如下：
shTyk2#1：
CCCATCTTCATTAGCTGGGAACTCGAGTTCCCAGCTAATGAAGATGGG(SEQ ID NO:1)；
shTyk2#2：
CCCTTCATCAAGCTAAGTGATCTCGAGATCACTTAGCTTGATGAAGGG(SEQ ID NO:2)；
shTyk2#3：
CCACTTTAAGAATGAGAGCTTCTCGAGAAGCTCTCATTCTTAAAGTGG(SEQ ID NO:3)。
可见，特异性敲低Tyk2可以促进心肌细胞重编程。
2.通过基因编辑敲除Tyk2影响心肌细胞重编程
为了进一步证实特异性抑制Tyk2在心肌细胞重编程中的作用，本发明人进一步设计了5种不同的靶向Tyk2基因的sgRNA，利用CRISPR技术敲除新生小鼠成纤维细胞的Tyk2基因，并分别测试在转录因子MT以及C1存在下的心肌细胞重编程效率。sgNT为非靶向Tyk2的对照。
实验结果见图24，心脏特异性标志物cTnI和a-actinin的免疫荧光检测显示，敲除了Tyk2基因的成纤维细胞，在转录因子MT以及小分子化合物C1存在下，能实现高效的心肌细胞重编程。
3.Tyk2小分子抑制剂促进新生小鼠成纤维细胞向心肌细胞重编程
新生小鼠成纤维细胞分离：
从维通利华订购24h内新生乳鼠，于超净台中取心脏组织用灭菌手术器械剪碎后加入适量Type II Collagenase(1mg/mL)，于37°恒温消化，消化充分后，用IMDM(20％FBS+1％PS+1％NEAA+1％Glu-Max)培养基洗涤2次，并用该培养基重悬，铺于10cm培养皿中，24h后换液加入新鲜IMDM，并于第四天用CD90.2(anti-Thy1+)，进行MACS分选，将分选后的细胞铺于24孔板，(2-5×10^5/well),铺板之后24h感染Fu-tet-o-Mef2c-T2A-Tbx5病毒，和rtTA，24h后更换为重编程培养基，每隔3天换液，4周可以看到beating的细胞，免疫荧光染色可看到大量cTnI和a-actinin。
重编程培养基：
10％FBS，10％KSR，DMEM/M199[4:1]，1％PS+1％NEAA+1％Glu-Max，2uM SB431542，Tyk2抑制剂(BMS-986165或PF-06826647)每隔3天换液。其中Tyk2抑制剂1、2、5、10uM均可，最适浓度详见浓度梯度曲线。
结果见图25和图26。结果显示Tyk2小分子抑制剂有效促进心肌细胞重编程。
实施例8、替代Tyk2抑制剂和TGFβ抑制剂促进重编程诱导心肌细胞
本实施例用另一种Tyk2抑制剂Ruxolitinib替换Baricitinib，另一种TGFβ抑制剂TEW-7197替换SB43152，测试Ruxolitinib+TEW-7197组合对重编程诱导心肌细胞的作用。
小鼠MI手术及病毒注射
WT ICR雄性，8w，三溴乙醇麻醉，开胸腔，挤出心脏，结扎冠状动脉左前降支，注射10μl浓缩后的逆转录病毒载体pMX-MGT/pMX-MT,放回心脏，缝合皮肤。
体内给药
将小分子Tew-7197及Ruxolitinib溶于DMSO，两个小分子储液浓度均为200mM，储存于-20度冰箱中。药物注射前，将小分子储存液溶于给药溶剂中，现用现配。Tew-7197给药剂量为6mg/kg/d，Ruxolitinib给药剂量为60mg/kg/d，通过腹腔注射给药。溶剂配方：5％Tween-80，30％PEG300，65％去离子水。给药五周后检测结果。
实验结果如图27和28所示，Tyk2抑制剂Ruxolitinib和TGFβ抑制剂TEW-7197也可提高心脏原位重编程效率，改善MI后心脏纤维化。
实施例9、MYOCD和2C组合改善hiCM效率
正常人心脏成纤维细胞细胞培养
细胞购自Lonza,Cat.CC2904，传代扩增，培养基为补充有10％胎牛血清(FBS)的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。
慢病毒包装
293T培养基：补充有10％胎牛血清(FBS)的高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，4℃保存。
2x HBS：500ml HEPES buffer(50mM)+280mM NaCl+10mM KCl+1.5M Na 2HPO 4+12mM Glucose,调节pH至7.05,0.22μm滤器过滤,-20℃冰箱保存。
2.5M CaCl 2：CaCl 2溶于ddH2O，CaCl 2为2.5M，0.22μm滤器过滤，-20℃冰箱保存。
D-1,铺293T于10cm培养皿。D0,待细胞汇合度～70％时，更换新鲜培养基。同时预混转染目的质粒(15μg)和三个包装质粒pMDLg/pRRE,RSV/Rev以及VSV-G(每种5μg)+50μl 2.5M CaCl 2，加ddH 2O补足至500μl，混匀后，缓慢滴加至500μl的2x HBS中，震荡混匀，滴加至培养皿，轻轻摇匀。转染后12小时，更换新鲜培养基，转染后48小时，收集含有病毒的培养基，0.45μm滤器过滤，分装，保存于-80℃冰箱。
逆转录病毒包装
D-1,铺293T于10cm培养皿。D0,待细胞汇合度～70％时，更换新鲜培养基。同 时预混转染8μg:8μg:1μg(retroviral DNA:pUMVC:VSV-G)+50μl 2.5M CaCl2，加ddH2O补足至500μl，混匀后，缓慢滴加至500μl的2x HBS中，震荡混匀，滴加至培养皿，轻轻摇匀。转染后12小时，更换新鲜培养基，转染后48小时，收集含有病毒的培养基，0.45μm滤器过滤，加入1/5体积的TransLvTM Lentivirus Precipitation Solution(Transgen,FV101)，混匀后4℃静置40min,8000g 4℃离心，弃上清，用PBS重悬沉淀。
从成纤维细胞产生iCM
iCM重编程培养基：DMEM/M199(4:1),补充10％KnockOut血清替代(KSR)、10％FBS、1％GlutaMAX、1％MEM NEAA、1％Pen Strep，2μg/ml Dox和小分子混合物2C(2μM SB431542、2μM Baricitinib)。
D-2,24孔板先用0.1％gelatin包被，37℃细胞培养箱放置30分钟，吸去gelatin，24孔板中以每孔80,000个细胞接种。D-1,细胞更换含有6ng/μl polybrene的MEF培养基，感染FU-tet-o-MYOCD,FUdeltaGW-rtTA,每孔每种病毒加200微升未经浓缩的病毒。D0,细胞更换为iCM重编程培养基，每3-4天换液。处理4周后检测iCM的生成。
结果如图29所示，MYOCD和2C组合实现显著改善的hiCM诱导效率。
实施例10、敲低TGF受体Alk5
新生小鼠成纤维细胞分离：从维通利华订购24h内新生乳鼠，于超净台中取心脏组织用灭菌手术器械剪碎后加入适量Type II Collagenase(1mg/mL)，于37°恒温消化，消化充分后，用IMDM(20％FBS+1％PS+1％NEAA+1％Glu-Max)培养基洗涤2次，并用该培养基重悬，铺于10cm dish中，24h后换液加入新鲜IMDM，并于第四天用CD90.2(anti-Thy1+)，进行MACS分选，将分选后的细胞铺于24孔板，(2-5×10^5/well),铺板之后24h感染Fu-tet-o-Mef2c-T2A-Tbx5病毒，和rtTA，24h后更换为重编程培养基，每隔3天换液，4周可以看到beating的细胞，免疫荧光染色可看到大量cTnI和a-actinin。
重编程培养基：10％FBS,10％KSR,DMEM/M199[4:1],1％PS+1％NEAA+1％Glu-Max,2uM Baricitinib，每隔3天换液。其中2C medium中SB431542浓度为2uM。
Alk5#1和#2靶序列
#1:CCGGATAGCTGAAATTGACCTAATTCTCGAGAATTAGGTCAATTTCAGCTATTTTTTG
#2:CCGGGCTGACAGCTTTGCGAATTAACTCGAGTTAATTCGCAAAGCTGTCAGCTTTTTG
结果如图30所示，敲低Alk5后，MT和Baricitinib的组合在SB431542不存下也能产生大量cTnI和a-actinin阳性心肌细胞。
实施例11、2C改善心脏功能
逆转录病毒包装
D-1,铺293T于10cm培养皿。D0,待细胞汇合度～70％时，更换新鲜培养基。同时预混转染8μg:8μg:1μg(retroviral DNA:pUMVC:VSV-G)+50μl 2.5M CaCl2，加ddH2O补足至500μl，混匀后，缓慢滴加至500μl的2x HBS中，震荡混匀，滴加至培养皿，轻轻摇匀。转染后12小时，更换新鲜培养基，转染后48小时，收集含有病毒的培养基，0.45μm滤器过滤，加入1/5体积的TransLvTM Lentivirus Precipitation Solution(Transgen,FV101)，混匀后4℃静置40min,8000g 4℃离心，弃上清，用PBS重悬沉淀。
小鼠MI手术及病毒注射
WT ICR雄性，8w，三溴乙醇麻醉，开胸腔，挤出心脏，结扎冠状动脉左前降支，注射10μl浓缩后的pMX-MGT/pMX-MT,放回心脏，缝合皮肤。
体内给药
2C分别溶于DMSO，-20℃保存。每次给药前，溶于助溶剂(30％PEG+5％Tween80的ddH20)，C1 10mg/kg/d,C2 20mk/kg/d,腹腔注射。
实验结果如图31所示，2C可以在心脏改善心脏功能。

Claims (31)

  1. 一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括使起始细胞与至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂接触。
  2. 权利要求1的方法，其中所述Tyk2抑制剂选自Baricitinib、Ruxolitinib、S-Ruxolitinib、Tofacitinib、Oclacitinib maleate、Itacitinib、Peficitinib、Gandotinib、FM-381、Filgotinib、PF-06826647、BMS-986165，或它们的结构类似物。
  3. 权利要求1或2的方法，其中所述TGFβ抑制剂选自SB43152、TEW-7197、RepSox、GW788388、SD-208、LY364947、Y-27632、LDN-193189、LY2109761和Galunisertib，或它们的结构类似物。
  4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中所述Tyk2抑制剂的浓度为大约0.1μM-大约50μM，优选大约2μM。
  5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述TGFβ抑制剂的浓度为大约0.1μM-大约50μM，优选大约2μM。
  6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中使起始细胞与Tyk2抑制剂和/或TGFβ抑制剂接触大约1天至大约21天或更长时间。
  7. 权利要求1-6中任一项的方法，所述方法还包括向起始细胞提供至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA。
  8. 权利要求7的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子选自MEF2C、TBX5、GATA4、MESP1、MYOCD、HAND2、SRF、ESRRG、ZFPM2、Nkx2.5、VEGF、Baf60c，及它们的任意组合。
  9. 权利要求7或8的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C。
  10. 权利要求8或9的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括TBX5。
  11. 权利要求8-10中任一项的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括GATA4。
  12. 权利要求8-11中任一项的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MYOCD。
  13. 权利要求8-12中任一项的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MESP1。
  14. 权利要求7或8的方法，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C、GATA4、MYOCD和MESP1。
  15. 权利要求7-14中任一项的方法，其中通过包含编码至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA的核苷酸序列的表达载体提供所述转录因子和/或所述microRNA，优选地，所述表达载体是病毒载体，更优选地，所述病毒载体是慢病毒载体。
  16. 权利要求1-15中任一项的方法，所述起始细胞是成纤维细胞，例如皮肤成纤维 细胞或心脏成纤维细胞。
  17. 一种在对象中治疗心脏疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用至少一种Tyk2抑制剂和/或至少一种TGFβ抑制剂。
  18. 权利要求17的方法，其中所述心脏疾病是心力衰竭或心肌梗死。
  19. 权利要求17或18的方法，其中所述Tyk2抑制剂选自Baricitinib、Ruxolitinib、S-Ruxolitinib、Tofacitinib、Oclacitinib maleate、Itacitinib、Peficitinib、Gandotinib、FM-381、Filgotinib、PF-06826647、BMS-986165，或它们的结构类似物。
  20. 权利要求17-19中任一项的方法，其中所述TGFβ抑制剂选自SB43152、TEW-7197、RepSox、GW788388、SD-208、LY364947、Y-27632、LDN-193189、LY2109761和Galunisertib，或它们的结构类似物。
  21. 权利要求17-20中任一项的方法，所述方法还包括向所述对象施用至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA。
  22. 权利要求21的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子选自MEF2C、TBX5、GATA4、MESP1、MYOCD、HAND2、SRF、ESRRG、ZFPM2、Nkx2.5、VEGF、Baf60c，及它们的任意组合。
  23. 权利要求21或22的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C。
  24. 权利要求22或23的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括TBX5。
  25. 权利要求22-24中任一项的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括GATA4。
  26. 权利要求22-25中任一项的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MYOCD。
  27. 权利要求22-26中任一项的方法，其中所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MESP1。
  28. 权利要求21或22的方法，所述至少一种心肌细胞诱导转录因子包括MEF2C、GATA4、MYOCD和MESP1。
  29. 权利要求21-28中任一项的方法，其中施用包含编码至少一种心肌细胞诱导转录因子和/或至少一种心肌细胞诱导microRNA的核苷酸序列的表达载体，优选地，所述表达载体是病毒载体，更优选地，所述病毒载体是慢病毒载体。
  30. 权利要求17-29中任一项的方法，其中所述施用是局部施用，例如心脏内施用。
  31. 权利要求17-29中任一项的方法，其中所述施用是全身施用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008088882A2 (en) * 2007-01-19 2008-07-24 The J. David Gladstone Institutes Methods of generating cardiomyocytes
WO2011163531A2 (en) * 2010-06-23 2011-12-29 Vivoscript, Inc. Compositions and methods for re-programming cells without genetic modification for treatment of cardiovascular diseases
US10130637B2 (en) * 2012-11-02 2018-11-20 Duke University Inhibition of histone methyltransferase for cardiac reprogramming
EP3177302A4 (en) * 2014-08-07 2018-04-11 Duke University Compositions and methods for the reprogramming of cells into cardiomyocytes
WO2016134293A1 (en) * 2015-02-20 2016-08-25 Baylor College Of Medicine p63 INACTIVATION FOR THE TREATMENT OF HEART FAILURE
US9885018B1 (en) * 2015-03-16 2018-02-06 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate High efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes
CA3019570A1 (en) * 2016-03-30 2017-10-05 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Enhanced direct cardiac reprogramming
WO2018222503A1 (en) * 2017-05-31 2018-12-06 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus with variant capsid and methods of use thereof
CN108245678B (zh) * 2018-01-16 2020-01-07 北京大学 预防或延缓心脏衰老的方法和药物
CN113164556A (zh) * 2018-08-30 2021-07-23 特纳亚治疗股份有限公司 用心肌蛋白和ascl1进行的心脏细胞重编程

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