CN114763535A - 改进的心肌细胞重编程方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明涉及一种改进的心肌细胞重编程方法。

Description

改进的心肌细胞重编程方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是再生医学领域。具体而言，本发明涉及一种改进的心肌细胞重编程方法。

背景技术

全世界2300万人患有心力衰竭，通常由心肌细胞损伤或心肌细胞功能障碍引起。心肌细胞丢失的一个常见原因是导致心肌梗死的缺血性心脏病，由于心脏再生能力有限，损伤是永久性和渐进性的。尽管在医学治疗方面取得了进展，但目前除了原位心脏移植外，还没有恢复肌肉质量的策略，而原位心脏移植受限于细胞来源数量和长期疗效。迄今为止，在人体试验中使用的细胞疗法已经证明移植的细胞不会大量变成心肌细胞，也不会在心脏中持续存在。多能干细胞来源的心肌细胞移植正在接受测试，如果在细胞存活、成熟和电生理整合等问题得到有效解决后，这可能是有价值的。利用细胞类型特异的转录因子(TF)将细胞原位重编程为在疾病中丢失的细胞类型，是一种很有希望的除细胞治疗以外的另一有效的组织再生方法。在心脏中，大量的非心肌细胞，主要是心脏成纤维细胞，可以通过转录因子转变为诱导的心肌细胞样细胞。

自第一代通过3种心脏特异性TF：GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)的心肌细胞重编程成功问世以来，已经有很多关于增强心脏重编程效率的报道。然而，所能获得的效率仍然较低。因此，本领域仍然需要新的重编程方法，其能够通过重编程高效地产生功能性心肌细胞，从而治疗心脏疾病例如心力衰竭。

附图说明

图1：分离MICF和筛选候选转录因子的策略的示意图。

图2：由ACF和NCF诱导的iCM的免疫荧光表征。报道的组合“GMT”能够从新生和成年心脏成纤维细胞诱导大量的Cherry+表达cTnI的iCMs。比例尺：100μm。

图3：A：由GMT加上其他因子诱导的mCherry+细胞第14天的定量数据(n＝3)。B：Myocd或Sall4可以增加Myh6-mCherry阳性细胞的数量。诱导后两周拍照。

图4：示出GMT加Myocd和Sall4诱导后，FACS分析Myh6-mCherry表达(n＝4)的结果。GMT加Myocd和Sall4诱导后，mCherry+细胞的百分比显著增加。

图5：示出GMTMS+1策略诱导的mCherry+细胞第28天的定量数据(n＝3)。

图6：示出GMTMS-1策略诱导的细胞的统计和形态学分析结果。

图7：使用GMTMS从成肌纤维细胞生成的心肌样细胞的免疫荧光表征。(左)大量GMTMS诱导的iCM共表达cTnT和cTnI。在用GMT、GMTM、GMTS、GMTMS(GATA4、MEF2C、TBX5、Sall4、MYOCD)和GMTMM(GATA4、MEF2C、TBX5、MESP1、MYOCD) 转导MICF(来自8周龄的C57小鼠)后3周，对cTnT(红色)和cTnI(绿色)进行了免疫荧光。(右)cTnT和cTnI双阳性细胞定量。来自三个独立测定的数据，表示为平均值±SD， n＝3。比例尺：100μm.

图8：从成年心脏成纤维细胞诱导的心肌样细胞的免疫荧光表征。(左)在使用GMT、GMTM、GMTS、GMTMS和GMTMM转导ACF(来自C57小鼠，8周大)后3周进行了 cTnT(红色)和cTnI(绿色)的免疫荧光检测。注，ACF能够通过四个转录因子进行重新编程生成大量的iCM。(右)cTnT和cTnI双阳性细胞的定量。来自三个独立实验的数据表示为平均值±SD，n＝3。比例尺：100μm。

图9:示出与MICF相比，GMTMS诱导的心肌细胞中心脏基因的mRNA表达高度上调。诱导4周后进行定量PCR。

图10:示出与MICF相比，GMTMS诱导的心肌细胞中成纤维细胞基因的mRNA表达下调。诱导后4周进行定量PCR。

图11:GMTMS诱导的iCM被转录重编程，使其朝向心肌细胞的命运。(A)GMTMM 和GMTMS在MICF重编程方面的全基因组比较。用KPKM对基因谱进行归一化，然后对多个样品进行分位数归一化。3个样本中变异超过1个的基因用于以下层次聚类。 (B)MICF和GMTMS中基因表达的散点图(归一化为log 2(FPKM+1))。灰点，所有基因；红点，心肌细胞特异性基因；蓝点，成纤维细胞相关基因。(C)GMTMS上调基因的前 500名的GO类别分析。仅显示典型的与心肌细胞相关的GO类别。

发明内容

本发明人令人惊奇地发现，转录因子Myocd和/或Sall4可以显著促进转录因子组合 GATA4、MEF2C和TBX5(GMT)介导的心肌细胞重编程。

因此，在一方面，本发明提供一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括向起始细胞提供以下的转录因子：

i)GATA4、MEF2C和TBX5；和

ii)Myocd和/或Sall4。

在一些实施方案，所述方法包括向所述起始细胞提供以下转录因子：GATA4、MEF2C、TBX5、Myocd和Sall4。

所述转录因子可以通过本领域已知的任何方法提供给所述起始细胞，即导入所述起始细胞。例如，可以将包含编码所述转录因子的核苷酸序列的表达载体导入所述起始细胞。

所述转录因子可以是来自于哺乳动物例如小鼠或人的转录因子。所述转录因子的核苷酸序列和氨基酸序列是本领域公知的。

将表达载体导入细胞的方法是本领域已知的，包括但不限于DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物、Biolistic颗粒传递法(基因枪粒子轰击法)、显微注射法、电穿孔法和病毒介导法。

本发明各个方面中所述表达载体可以是本领域已知的任何表达载体。优选地，本发明各个方面中所述表达载体是病毒表达载体，其可以通过病毒转染实现编码所述转录因子的核苷酸序列的导入。所述病毒载体优选为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等。构建包含所需核苷酸序列的病毒载体例如慢病毒载体的方法是本领域已知的。

在一些实施方案中，本发明所述的向起始细胞提供转录因子还涵盖增加起始细胞中内源的所述转录因子的表达和/或活性。例如，可以通过修饰编码所述内源转录因子的调控区来增加所述转录因子在起始细胞中的表达。

在一些实施方案中，所述起始细胞为分化的细胞。在一些实施方案中，起始细胞是非心肌细胞。起始细胞可以为中胚层来源细胞诸如心脏细胞，外胚层来源细胞诸如神经细胞，或者内胚层来源细胞如结肠细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或体内几乎任何细胞。在一些实施方案中，所述起始细胞为心脏成纤维细胞。

在一些实施方案中，所述起始细胞选自胚胎成纤维细胞(EF embryonicfibroblasts)、新生儿心脏成纤维细胞(NCF，neonatal cardiac fibroblasts)、尾尖成纤维细胞(TTF，tail tip fibroblasts)、和成年心脏成纤维细胞(ACF:adult cardiacfibroblasts)。在一些优选实施方案中，所述起始细胞是来自心脏心梗区的成纤维细胞(MICF：myocardial infarction cardiac fibroblasts)。

在一些实施方案中，所述起始细胞为分离的细胞(离体细胞)。

在本发明中，所述起始细胞可以来源于哺乳动物或非哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于人。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于非人哺乳动物。在本发明的一些实施方案中，所述起始细胞来源于鼠如小鼠或大鼠或非人灵长类动物。

在一些实施方案中，所述方法还包括在心肌细胞诱导培养基中培养所述起始细胞。本领域已知多种心肌细胞诱导培养基，其可以应用于本发明。

在一些实施方案中，所述心肌细胞诱导培养基包含TGFβ抑制剂，例如SB43152。在一些实施方案中，所述心肌细胞诱导培养基含有DMEM/M199(4:1)，补充有10％FBS、 10％KSR、1％NEAA、1％Glutamax、1％PS和2μM SB431542。

在一些实施方案中，在向所述起始细胞提供所述转录因子之后，将所述起始细胞在心肌细胞诱导培养基中培养。

在一些实施方案中，所述重编程获得的心肌细胞是功能性心肌细胞。所述功能性心肌细胞例如具有以下特征中的一或多种：α-actinin阳性、cTnT阳性、具有排列整齐的肌节结构、跳动(beating)、表达心室型心肌细胞标志物例如Myl2v、自发的钙瞬变、与心室型心肌细胞相似的动作电位等。

在一方面，本发明提供一种通过本发明的方法制备的心肌细胞。

在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体。

在一方面，本发明还提供通过本发明的方法制备的心肌细胞或本发明的包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途。所述心脏疾病特别是心肌疾病，包括但不限于心力衰竭、心肌梗死等。

在一方面，本发明还提供一种在对象中治疗心脏疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用通过本发明的方法制备的心肌细胞或本发明的包含通过本发明的方法制备的心肌细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。

如本文所用，“对象”可以是哺乳动物或非哺乳动物。所述对象可以是人，或非人哺乳动物例如小鼠或大鼠或非人灵长类动物。

在一方面，本发明提供一种用于将起始细胞重编程为心肌细胞的试剂盒，所述试剂盒包含本文所定义的转录因子或者包含编码所述转录因子的核苷酸序列的表达载体，以及任选地包含本文所定义的心肌细胞诱导培养基。

在一方面，本发明提供包含编码以下的转录因子的核苷酸序列的表达载体：i)GATA4、MEF2C和TBX5；和ii)Myocd和/或Sall4。

在一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含包含编码以下的转录因子的核苷酸序列的表达载体：i)GATA4、MEF2C和TBX5；和ii)Myocd和/或Sall4，和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物用于治疗心脏疾病，特别是心肌疾病，包括但不限于心力衰竭、心肌梗死等。

在一方面，本发明提供包含编码以下的转录因子的核苷酸序列的表达载体在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途：i)GATA4、MEF2C和TBX5；和ii)Myocd和/或Sall4。所述心脏疾病特别是心肌疾病，包括但不限于心力衰竭、心肌梗死等。

实施例

材料和方法

动物与外科手术

用于外科手术的动物规程遵循机构指南，并已得到北大动物护理和使用委员会的批准。Myh6-mCherry小鼠由Kotlikoff博士惠赠(Jesty等，2012)。如文献所述(Virag和Lust， 2011年)，永久性结扎左前降支动脉(LAD)可诱发心肌梗死。简言之，用2.5％异氟烷/97.5％氧气麻醉小鼠(8周龄)，仰卧位放置。用24G树桩针向动物插管，并使用VentElite小鼠呼吸机(哈佛仪器)用1.5％异氟烷/98.5％氧气通气。每搏体积：220微升；呼吸频率：每分钟120次。通过6-0prolene缝线将LAD永久结扎来诱导MI。

原代细胞分离

包括NCF(新生儿心脏成纤维细胞)、ACF(成年心脏成纤维细胞)和MICF(心梗区成纤维细胞)在内的全部成纤维细胞分离自C57小鼠或Myh6-mCherry转基因小鼠，其中该转基因小鼠的心肌细胞特异性表达由小鼠Myh6启动子驱动的mCherry。按照Wang et al.，2015b的描述，通过酶消化方法分离Thy1⁺NCFs，然后进行MACS(磁激活细胞分选)。使用MariaPatapia Zafeiriou，2016描述的方法分离成年小鼠的心脏成纤维细胞。为了分离心肌成纤维细胞，在MI手术中将小鼠的心脏移出3、5、7、10和14天，然后在冷PBS中洗涤。从整个心脏切下梗塞的组织，然后切成小块(≤1mm3)。将每只心脏的样品用Dispase II(Sigma，2mg/ml)在2ml的胶原酶I/II/IV(Gibco，2mg/ml)中消化，并在细胞培养室中于37℃孵育2-3h。消化后，将细胞通过70-μM过滤器，以1100rpm 离心3分钟，然后在12孔板中加入培养基(DMEM，其中添加了10％FBS、1％NEAA、 1％GlutaMax和1％青霉素/链霉素)。

质粒

通过亚克隆产生慢病毒构建体。首先，通过PCR扩增来自pMX载体的Gata4、Mef2c和Tbx5的CDS序列或多顺反子盒MGT，然后根据制造商的说明书(TransGene)通过 Gibson连接将其克隆到Fu-tet-O载体(Addgene，#19778)中。在pMX载体中编码Gata4、 Mef2c和Tbx5的逆转录病毒载体如先前所述(Ieda等，2010)。多顺反子pMX-MGT由钱博士提供(Wang etal.，2015a)。慢病毒包装和包膜载体psPAX2(Addgene，#12260)和 pMD2.G(Addgene，#12259)来自Addgene。为了比较转导效率，将上述逆转录病毒或慢病毒感染成肌纤维细胞。使用Tet-On系统获得了更高的感染效率，该系统用于构建其他转录因子并用于后续实验。

病毒包装

在platE细胞中进行逆转录病毒包装，在293T细胞中进行慢病毒包装。将这两种细胞系都维持在含有10％FBS、1％GlutaMax和1％NEAA的高葡萄糖DMEM生长培养基(Hyclone)中。转染前一天，将platE和293T细胞接种在10cm培养皿中。第二天，根据制造商的说明，使用60μl PEI，用20μg基于pMX的逆转录病毒载体转染platE细胞，用于逆转录病毒包装。对于慢病毒包装，使用75μl PEI将10μg Fu-tet-O载体，10μg psPAX2和5μg pMD2.G引入293T细胞。转染后48小时收集上清液，并通过45μm过滤器过滤。将病毒冷冻在–80℃以便将来使用。

诱导心肌细胞(iCM)重编程

将分离的细胞接种到12孔板中。当细胞的密度为每孔约1.5×10⁵个细胞时，将病毒添加到培养基中。24小时后，病毒培养基替换为iCM诱导培养基，该培养基含有 DMEM/M199(4:1)，补充了10％FBS、10％KSR、1％NEAA、1％Glutamax、1％PS和2μM SB431542。将强力霉素(1μg/ml)添加到iCM诱导培养基中，每3天更换一次。

流式细胞术

病毒转导几周后，重编程的细胞通过在酶中孵育解离。首先，在37℃下用0.25％胰蛋白酶/EDTA处理5-7分钟，细胞与大量ECM一起从板上移出。然后，将胶原酶 I/II/IV(2mg/ml)加入孔中，并在37℃下孵育30-40分钟。通过40μm细胞过滤器，在CytoFlex(BeckmanCoulter)上分析分离的细胞，或通过Aria3(BD)分选。

免疫荧光

将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，用含0.2％Triton-X的PBS缓冲液透化30 分钟，并在室温下用3％正常驴血清封闭2h。然后，将细胞与抗Vimentin(Abcam，ab92547， 1：400)、Pdgfrα(R&D，AF1062，1:50)、αSMA(Abcam，ab7817，1：400)、Gata4(Santa Cruz，sc-25310，1：100)，Mef2c(CST，5030s，1：400)，Tbx5(Invitrogen，42-6500，1： 200)，RFP(ChromoTek，5F8-100，1：1000)，cTnT(Thermo Scientific，MA5-12960，1： 200)和cTnI(Abcam，ab56357，1：300)的一抗一起在4℃孵育过夜。第二天早晨，用PBS 洗涤后，用Alexa荧光二抗(Invitrogen，1：1000)在室温下孵育1小时以检测信号。DAPI(1： 10000)最终用于确定核位置。

qRT-PCR

根据制造商的协议(TransGene)从细胞和心室组织中提取总RNA。使用来自TransGene的逆转录试剂盒合成cDNA。根据制造商的说明，使用Real-Time PCR系统 (q225，Kubo Tech)和SYBR PCR Master Mix(Q311，Vazyme)进行定量RT-PCR。

全转录组分析

诱导4周后，通过FACS(BD Aria3)收集了来自GMTMS和GMTMM转导的MICF 的Myh6-mCherry+iCM。使用RNA分离试剂盒(TransGene)提取RNA。通过PE150对 RNA进行测序。对于数据分析，使用MatLab 2019a执行数据处理。使用“quantilenorm”函数对3个样本进行FPKM标准化，并转换为log2(FPKM+1)。在过滤掉3个样本中小于1的基因后，对基因和样本进行分层聚类。使用网站http://geneontology.org/分析GO 富集。

实施例1、筛选心肌细胞重编程的转录因子组合

本领域已经利用通过导入转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5的组合(GMT)来将例如成纤维细胞重编程为心肌细胞。心肌细胞重编程的常用的细胞来源包括：鼠胚胎成纤维细胞(MEF，murine embryonic fibroblasts)、新生儿心脏成纤维细胞(NCF，neonatal cardiacfibroblasts)、尾尖成纤维细胞(TTF，tail tip fibroblasts)、和成年心脏成纤维细胞(ACF:adult cardiac fibroblasts)。然而，使用这些细胞来源通过GMT获得心肌细胞的效率很低。此外，心梗区成纤维细胞(MICF)与疾病更相关，如果作为研究的起始细胞，将有更显著临床意义。因此，本发明人寻求筛选能够将MICF重编程心肌细胞的高效的转录因子组合。

分离MICF和筛选候选转录因子的策略的示意图如图1所示。左图：施行开胸手术结扎冠状动脉左前降支，制作Myh6-mCherry转基因成年小鼠的急性心肌梗死模型，手术5天后处死小鼠，分离心梗区的成纤维细胞(MICF)。右图：MICF体外培养，转染多个转录因子，筛选诱导心肌细胞的高效组合模式图。

首先，本发明人测试了现有技术GMT重编程心肌细胞的能力。结果如图2所示，已报道的转录因子组合GMT可以将新生小鼠心脏成纤维细胞(NCF)和成年小鼠心脏成纤维细胞(ACF)诱导成心肌样细胞(iCM)。

然后，发明人在GMT的基础上增加额外的一个转录因子进行重编程。结果如图3 所示，GMT在MICF上诱导效率很低，而转录因子Myocd或Sall4可显著提高其诱导效率。

进一步测试了GMT加上Myocd和Sall4的组合(GMTMS)的重编程诱导效果。结果如图4所示，Myocd和Sall4协同GMT可以进一步提高iCM的诱导效率。

还测试了增加额外的转录因子可以提高GMTMS的诱导效率。结果如图5所示，所筛选的转录因子均没能在GMTMS基础上进一步提高iCM的诱导效率。

还测试了再GMTMS基础上减去任一种转录因子对诱导效率的影响。如图6所示，从细胞数目和形态学分析可知，五种转录因子都是高效诱导必需的。缺少Gata4时，尽管mCherry+细胞数目较多，但是形态学发生了改变。

实施例2、GMTMS组合诱导的iCM的表征

GMTMS诱导4周后，观察到iCM强烈而充分的搏动(数据未显示)。如图7所示，免疫荧光鉴定发现大量iCM可共表达心肌细胞结构蛋白。

发明人还测试了从ACF诱导产生iCM并进行表征。结果如图8所示，相比MICF， ACF更容易被诱导成表达多个结构蛋白的心肌样细胞。四种转录因子即可高效诱导ACF 重编程为心肌细胞。

提取GMTMS诱导的iCM的RNA并检测心肌细胞特异性基因的表达。如图9所示，心肌细胞特异性基因mRNA水平显著提高。还检测了成纤维细胞相关基因的表达。结果如图10所示，GMTMS诱导的iCM中，成纤维细胞相关基因mRNA水平显著下调。

随后，进行了全转录组分析。如图11所示，GMTMS诱导的iCM趋向心肌细胞命运，远离成纤维细胞命运。

上述结果表明，本发明的GMTMS组合能够从成纤维细胞高效诱导心肌样细胞。

Claims (16)

1.一种将起始细胞重编程为心肌细胞的方法，所述方法包括向起始细胞提供以下的转录因子：

i)GATA4、MEF2C和TBX5；和

ii)Myocd和/或Sall4。

2.权利要求1的方法，其中所述方法包括向所述起始细胞提供以下转录因子：GATA4、MEF2C、TBX5、Myocd和Sall4。

3.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括将包含编码所述转录因子的核苷酸序列的表达载体导入所述起始细胞。

4.权利要求3的方法，其中所述表达载体是病毒表达载体，优选为慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体。

5.权利要求1或2的方法，其中所述提供转录因子包括增加起始细胞中内源的所述转录因子的表达和/或活性。

6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述起始细胞是成纤维细胞，例如所述成纤维细胞选自胚胎成纤维细胞、新生儿心脏成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、成年心脏成纤维细胞和来自心脏心梗区的成纤维细胞。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述起始细胞是分离的细胞。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述起始细胞来源于哺乳动物或非哺乳动物，例如来源于人、鼠或非人灵长类动物。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述方法还包括在心肌细胞诱导培养基中培养所述起始细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述心肌细胞诱导培养基包含TGFβ抑制剂，例如SB43152。

11.权利要求9或10的方法，其中所述心肌细胞诱导培养基含有DMEM/M199(4:1)，补充有10％FBS、10％KSR、1％NEAA、1％Glutamax、1％PS和2μM SB431542。

12.一种通过权利要求1-11中任一项的方法制备的心肌细胞。

13.一种药物组合物，其包含权利要求12的心肌细胞和药学上可接受的载体。

14.权利要求12的心肌细胞或权利要求13的药物组合物在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途。

15.权利要求14的用途，其中所述心脏疾病是心肌疾病，例如心力衰竭、心肌梗死。

16.一种在对象中治疗心脏疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用权利要求12的心肌细胞或权利要求13的药物组合物。

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