KR102181526B1 - 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법 - Google Patents

사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102181526B1
KR102181526B1 KR1020190048023A KR20190048023A KR102181526B1 KR 102181526 B1 KR102181526 B1 KR 102181526B1 KR 1020190048023 A KR1020190048023 A KR 1020190048023A KR 20190048023 A KR20190048023 A KR 20190048023A KR 102181526 B1 KR102181526 B1 KR 102181526B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
stem cells
cells
mesenchymal stem
dedifferentiated
human
Prior art date
Application number
KR1020190048023A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200124553A (ko
Inventor
김성원
임정연
박정아
주지현
임예리
김도현
황세환
박선화
임미현
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020190048023A priority Critical patent/KR102181526B1/ko
Publication of KR20200124553A publication Critical patent/KR20200124553A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102181526B1 publication Critical patent/KR102181526B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 역분화 줄기세포를 대량 배양하는 방법, 및 상기 역분화 줄기세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 역분화 줄기세포를 제조함에 있어 배아줄기세포를 사용하지 아니하므로 배아의 파괴로 인한 윤리적 문제가 없고, 기존의 중간엽 줄기세포는 획득 과정에서 극심한 통증을 동반하고, 획득 시기에 제한이 있거나, 충분한 양을 배양하는 과정에서 많은 시간과 비용이 소모되며 감염 등의 위험성이 높으나, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 획득 과정에서 수술의 위험성이 낮고, 언제든지 충분한 양의 중간엽 줄기세포를 획득할 수 있으므로 용이하게 역분화 줄기세포를 제조할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명의 방법으로 제조된 역분화 줄기세포는 사용된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 그 유전적 기원이 동일하므로 각 개체에 맞추어진 면역적합성 세포 치료제의 제공을 가능하게 한다.

Description

사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법 {Method for preparing induced pluripotent stem cells from human turbinate mesenchymal stem cells}
본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(human turbinate mesenchymal stem cells, hT-MSCs)로부터 역분화에 의해 유도된 만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC, 이하 '역분화 줄기세포'라 한다)를 제조하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 역분화 줄기세포를 대량 배양하는 방법, 및 상기 방법에 의해 제조된 역분화 줄기세포를 기도 상피세포(airway epithelial cell)로 재분화 시키는 방법 등에 관한 것이다.
의학이 발달함에 따라, 질병이나 외상에 의해 기능이 소실된 조직이나 장기를 유사한 자가 조직이나 기능이 동일한 장기로 대체하는 수술법이 개발되어 왔지만 이는 공여부 결손을 일으킨다는 문제가 존재한다. 최근에는 이러한 문제를 해결하기 위해 공여부에서 소량의 세포를 얻은 후 세포배양기술을 이용, 이를 증식시켜 이식하는 조직공학기법이 장기이식이나 조직이식을 대신할 수 있는 방법으로 시도되고 있으며, 이러한 방법의 하나로써 줄기세포의 특성을 갖는 중간엽기질세포를 세포 공급원으로 이용하여 다양한 조직으로 분화시켜 조직 결손을 대체하기 위한 연구가 시도되고 있다(KR10-1327076).
중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 성체조직인 골수, 흡입된 지방조직, 제대혈, 탯줄 등에서 얻을 수 있으며 섬유모세포의 형태를 갖는다. 상기 세포는 시험관에서 무한정 증식이 가능하며, 혈액줄기세포와 달리 지방, 골세포, 연골세포, 심근세포, 신경세포 등 다양한 종류의 중요한 세포계열로 분화할 수 있어 조직공학과 재생의학의 영역에서 많은 연구가 이루어지고 있다.
한편, 상기 중간엽 줄기세포를 획득하기 위한 수술은 극심한 통증을 동반하거나 전신마취나 척추마취가 필요할 수 있으며, 획득되는 중간엽 줄기세포의 양이 매우 적고 임상적으로 충분한 양을 배양하는 과정에서 많은 시간과 비용이 소모되며, 감염과 세포 손실의 위험성이 높다는 문제점이 제기되고 있다.
이에, 본 발명자들은 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로, 기존의 중간엽 줄기세포 공여부보다 접근성이 높은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포로의 분화가능성이 있음을 실험적으로 확인함으로써 이를 기초로 in vitro에서 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 이용해 역분화 줄기세포(hT-iPSC)를 제작할 수 있는 방법을 개발하고자 하였다.
KR 10-1327076 A1
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 재프로그램화하여 유도된 만능줄기세포(역분화 줄기세포)를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 역분화 줄기세포를 대량으로 배양하는 방법, 및 상기 제조된 역분화 줄기세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법을 제공한 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포(hT-iPSC)를 제조하는 방법을 제공한다.
(a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(b) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 (a)단계의 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 사람 하비갑개 절제술 시행과정에서 채취한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 역분화인자는 Oct-4, Sox2, Klf4, c-Myc, 및 polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계의 바이러스는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 센다이바이러스(sendai virus)일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조된 역분화 줄기세포를 대량 배양하는 방법을 제공한다.
(a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(b) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계;
(d) 유도된 상기 역분화 줄기세포의 콜로니로부터 수확한 세포를 배양하여 계대하는 단계; 및
(e) 계대한 상기 역분화 줄기세포에, 미분화 줄기세포만 선택적으로 분리시키는 세포분리용액(cell dissociation reagent)을 처리하여 2차 계대하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조된 역분화 줄기세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
(a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(b) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계; 및
(d) 유도된 상기 역분화 줄기세포를 기도 상피세포 분화용 배지에서 배양하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(human turbinate mesenchymal stem cells)로부터 제조된 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 성체세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
(a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(b) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계;
(d) 유도된 상기 역분화 줄기세포를 Vitronectin, Matrigel, Geltrex, Laminin, 및 Collagen 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기질(matrix)에서 배양하는 단계; 및
(e) 기질에서 배양된 상기 역분화 줄기세포를 성체세포 분화용 배지에서 배양하는 단계.
본 발명은 역분화 줄기세포를 제조함에 있어 배아줄기세포를 사용하지 아니하므로 배아의 파괴로 인한 윤리적 문제가 없고, 기존의 중간엽 줄기세포는 획득 과정에서 극심한 통증을 동반하고, 획득 시기에 제한이 있거나, 충분한 양을 배양하는 과정에서 많은 시간과 비용이 소모되며 감염 등의 위험성이 높은 반면, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 획득 과정에서 수술의 위험성이 낮고, 언제든지 충분한 양의 중간엽 줄기세포를 획득할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 상기의 장점으로 인해 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 용이하게 제조할 수 있으므로 세포 치료제의 실용화를 앞당기는데 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 더하여, 본 발명의 방법으로 제조된 역분화 줄기세포는 사용된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포와 그 유전적 기원이 동일하므로 각 개체에 맞추어진 면역적합성 세포 치료제의 제공을 가능하게 한다.
도 1a 내지 1b는 두 가지 배양방법으로 분리 및 배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 광학현미경으로 관찰한 형태를 나타낸 도면이다. (도 1a) 조직절편배양(Explant culture) 방법으로 분리 및 배양하여 얻은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 현미경 사진이다. (도 1b) 콜라겐분해효소를 처리하는 방법(collagenase treatment culture)으로 분리 및 배양하여 얻은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 현미경 사진이다.
도 2는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 바이러스를 도입(transduction)한 후 각각 2일, 5일, 7일, 16일 및 18일 경과되었을 때 형성된 콜로니(colony)의 모습을 나타낸 도면이다.
도 3은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 재프로그램화 하여 제조된 역분화 줄기세포의 단백질 특성을 면역형광염색법을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 CytoTune™ 2.0 Sendai mix를 처리함으로써 역분화 유도인자를 도입한 후 각각 1일 및 2일이 경과되었을 때 세포의 모습을 나타낸 도면이다(상단). 그 이후 상기 세포를 계대배양하여 10일 및 32일이 경과되었을 때 세포의 모습을 나타낸 도면이다(하단).
도 5는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 재프로그램화하여 제조된 역분화 줄기세포의 단백질 특성을 면역형광염색법을 통해 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 각각 iPSC 미분화 마커인 Oct-4, SSEA-4, Sox2 및 NANOG를 사용하여 정상적으로 역분화 줄기세포가 유도되었는지 확인하였다.
도 6은 상기 도 5의 역분화 줄기세포 콜로니를 계대배양하여 새로이 형성된 콜로니의 모습을 나타낸 도면이다.
도 7은 상기 도6에서 계대배양한 제 1계대 세포를 ReLeSR™ 시약을 사용하여 다시 계대배양 한 모습을 나타낸 도면이다.
도 8은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 재프로그램화 하여 제조된 역분화 줄기세포를 기도 상피세포(airway epithelial cell)로의 분화를 유도한 후 18일째 되는 날 기도 상피세포 특이적 단백질인 ZO-1의 발현을 확인한 도면이다.
본 발명자들은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 배아줄기세포와 같이 SSEA-4(stage-specific embryonic antigen-4), TRA-1-60, TRA-1-81, NANOG 등이 발현되는 역분화 줄기세포를 제조하는 방법을 발견하였고, 이에 본 발명은 상기 방법, 상기 방법에 의해 제조된 역분화 줄기세포를 대량 배양하는 방법, 및 상기 역분화 줄기세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "줄기세포(stem cell)"란, 개체를 구성하는 세포나 조직의 근간이 되는 세포로서 그 특징은 반복 분열하여 자가 재생(self-renewal)할 수 있고, 환경에 따라 특정한 기능을 지닌 세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 갖는 세포로서, 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견된다. 줄기세포는 분화 가능한 세포의 종류에 따라 수정란이 첫 분열을 시작할 때 형성되는 전능성 줄기세포(totipotent stem cells)와, 이 세포들이 계속 분열해 만들어진 포배 내막에 있는 만능성 줄기세포(pluripotent stem cells), 그리고 성숙한 조직과 기관 속에 존재하는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류된다. 이때, 다능성 줄기세포는, 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 세포로써 태아기, 신생아기, 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직 손상 시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있다. 이러한 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 성체 줄기세포라고도 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "배아줄기세포"는 수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyst)의 내부세포덩어리(세포 내괴, inner cell mass)에서 분리하여 배양한 세포로 만능성(pluripotency)을 지니는 세포를 지칭한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "역분화"는 부분 또는 최종 분화된 세포를 만능성(pluripotent) 또는 다능성(multipotent)과 같은 미분화 상태로 되돌려서, 새로운 분화 조직의 형성이 가능하도록 하는 후성학적(epigenetic)인 역행 과정을 의미한다. 이러한 역분화 현상은 세포 유전체의 후성학적인 변형들이 고정되어 있는 것이 아니라 지워지고 다시 형성될 수 있는 가역적인 과정이기 때문에 가능하다. 역분화는 "재프로그램화 (reprogramming)"라고도 불리우며, 부분 또는 최종 분화된 세포의 유전적 및 표현적 프로필을 배아줄기세포의 그것과 비슷하도록 변화시키는 과정에 관한 것이다. 예를 들면, 상기 변화는 메틸화 패턴의 변화, 줄기세포성 유전자의 발현율 변화 등을 포함한다. 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스과(retroviridae)에 속하는 렌티바이러스, 파라믹소바이러스과(paramyxoviridae)에 속하는 센다이바이러스 등을 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함하나, 본 발명에서는 렌티바이러스 또는 센다이바이러스를 이용하는 것이 바람직하다.
Sox 패밀리 유전자들은 Oct-4와 유사하게 만능성 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 그러나 Oct-4 유전자가 만능성 줄기세포에만 관여하고 있는 반면 Sox 패밀리 유전자들은 다능성 줄기세포나 단능성 줄기세포와도 관련되어 있다. Sox2(SRY-type high mobility group box 2) 전사인자는 Sox 패밀리 단백질 중 유일하게 배아줄기세포의 만능성 유지에 중요한 역할을 한다(Avilion et al., Genes Dev, 17:126-140, 2003). Oct-4와 마찬가지로 생쥐의 배아줄기세포에서 Sox-2의 발현을 저해하면 분화가 유도된다(Ivanova et al., Nature, 442:533-538, 2006). 또한 여러 Sox2 하위 유전자의 프로모터 영역에서 발견되는 Sox-2 결합부위는 종종 Oct-4와 Nanog 결합부위와 인접하게 존재한다(Boyer et al., Cell, 122:947-956, 2005). 그러므로 Sox2 전사인자와 Oct-4 전사인자 사이의 상호작용이 역분화 줄기세포가 미분화 상태를 유지하고 배아줄기세포의 특성을 나타나게 하는데 기본적인 틀을 제공할 것으로 예상된다(Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).
c-Myc는 세포 성장, 분화, 증식, 세포 예정사 및 암세포로의 형질 전환 등의 다양한 세포 내 기능을 수행하는 발암 유전자이다. 또한 만능성을 유지하는 주요 기작인 LIF(Leukemia Inhibitory Factor)/STAT3와 Wnt 신호전달 메커니즘의 하위 유전자로 밝혀졌다(Sears et al., Genes Dev, 14:2501-2514, 2000). c-Myc 전사인자는 역분화된 만능줄기세포 내에서 세포의 증식을 저해하는 것을 막아주는 역할을 하는 것으로 예상되고 있다. 또한 c-Myc은 게놈(genome) 상에 존재하는 Myc 인식부위에 결합하는 것뿐만 아니라 염색질 구조를 변화시켜 Oct-4와 Sox2 가 표적 유전자에 잘 결합할 수 있도록 도와주는 기능을 수행한다(Lewitzky and Yamanaka, Current Opinion in Biotechnology, 18:467-473, 2007).
Klf4는 성장 억제에 관여하여 세포주기를 조절하는 역할을 한다. 최근 연구에 따르면 c-Myc과 유사하게 배아줄기세포에서 STAT3의 하위 유전자로 작용하며, 과발현시 Oct-4 발현을 유지시켜 생쥐 배아줄기세포의 분화를 억제한다고 밝혀졌다(Li et al., Blood, 105:635-637, 2005).
Nanog는 배아 특이적인 유전인자로 Oct-4나 Sox2와 마찬가지로 배아줄기세포의 만능성을 유지하는데 필요한 유전자이다.
상기와 같이 Oct-4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 Nanog 유전자를 "역분화 유도인자 (reprogramming-inducing gene)"라고 하며, 역분화 유도인자는 분화가 끝난 세포를 재프로그램화 시킬 수 있는 유전자들을 의미한다. 특히 Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 Yamanaka 인자라고 부른다.
본 발명에서, 역분화 유도인자는 Oct-4, Sox2, Klf4, c-Myc, 및 polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하며, 바람직하게는 상기 군에서 선택된 어느 넷 이상의 역분화 유도인자를 포함하고, 더욱 바람직하게는 Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 포함하거나, polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2, c-Myc 및 Klf4를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 재프로그램화를 통해 역분화 만능줄기세포를 형성하기 위해서는, 상기 역분화 유도인자를 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 내에 전달하는 단계를 필수적으로 거치게 되며, 구체적으로는, 렌티바이러스를 수송체로 사용하여 Oct-4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자들을 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 전달하거나, 또는 센다이바이러스들을 수송체로 사용하여 polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2, c-Myc 및 Klf4의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 전달할 수 있으나, 수송체에 따라서 전달되는 역분화 인자의 조합은 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "역분화 줄기세포(iPSC)"는 이미 분화가 완성된 성체세포들에 대하여 인위적으로 역분화과정(재프로그램화)을 수행하여 유도된 세포들로 만능분화능(pluripotency)을 가진다. 상기 역분화 줄기세포는 뇌, 심장 등의 다양한 장기 세포로 분화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "성체세포(somatic cell)"는 배아세포와 반대되는 용어로, 태어나서 생존하는 성체로부터 유래한 세포를 지칭한다.
본 발명은,
(a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(b) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계; 및
(c) 상기 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 사람 하비갑개 절제술 시행과정에서 얻어지는 하비갑개 조직으로부터 분리되는 것일 수 있다(실시예 1 참조).
성체 줄기세포로 분류되는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 재생의학의 재료로 각광받고 있는 세포로, 골수, 제대혈, 탯줄 혈액 등의 조직에서 채취될 수 있으며, 혈액 줄기세포와 달리 지방조직세포, 골세포, 연골세포, 신경세포, 심근세포 등 다양한 인체 조직을 구성하는 세포로의 분화능을 가진다. 본 발명에서는 사람 하비갑개 조직으로부터 분리한 중간엽 줄기세포를 이용하였다.
성체 중간엽 줄기세포 중 골수 유래 중간엽 줄기세포 및 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포는 획득하기 위한 수술에 극심한 통증을 동반하고 시간이 많이 소요되며, 획득되는 중간엽 줄기세포의 양이 매우 적고 임상적으로 충분한 양을 배양하는 과정에서 많은 시간과 비용이 소모되며 감염과 세포 손실의 위험성이 높다는 단점이 있다. 또한, 탯줄 혈액 유래 중간엽 줄기세포는 필요로 하는 시기에 얻기 어려우며 장기간 보관해야 하는 문제점을 갖고 있다. 반면, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 경우 획득하기 위한 수술에 출혈 및 통증이 매우 적고 시간이 적게 소요되며, 이비인후과 영역에서 최다빈도로 시행되는 하비갑개 수술(비염 수술) 과정의 폐기 하비갑개 조직에서 분리한 중간엽 줄기세포의 재활용을 통해 중간엽 줄기세포를 지속적으로 확보할 수 있는 장점이 있다. 하기의 표 1은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 및 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포에 대하여 줄기세포 분리를 위한 수술의 위험성, 줄기세포 분리가 가능한 수술의 빈도 등을 비교하여 분석한 자료이다.
사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 골수유래 중간엽 줄기세포 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포
줄기세포 분리를 위한
수술의 위험성		 매우 낮음 높음 높음
줄기세포 분리가 가능한
수술의 빈도		 매우 높음 낮음 높음
줄기세포 분리 외의 목적으로 폐기 조직의 수술 후 재활용도 매우 높음 낮음 높음
수술 시 소요시간 5 분 ~ 10 분 1 시간 3 ~ 4 시간
수술 후 회복기간
(일상 활동 가능 정도)		 수 시간이내 3 주 1 주 이내
수술 시 출혈 10 cc 이내 500 cc ~ 1000 cc 100 cc ~ 500 cc
수술 과정에서 획득되는
조직의 부피		 적음 많음 많음
단위 조직 당 분리되는
줄기세포의 수 		6.55 × 103
cells/mg		 0.2 ~ 0.29 × 103 cells/mg
(골수와 지방 유래 줄기세포는 유사함)
줄기세포의 증식능
(P 1 -> P 2)		 약 10 배 약 2 배
(골수와 지방 유래 줄기세포는 유사함)
c-Myc 및 polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다(실시예 2 및 4 참조).
본 발명의 또 다른 일실시예에서, 상기 바이러스는 렌티바이러스(lentivirus) 또는 센다이바이러스(sendai virus) 일 수 있다(실시예 2 및 4 참조).
본 발명에서 사용되는 용어 "렌티바이러스"는 레트로바이러스(retrovirus)의 일종으로 핵공(nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체(바이러스 "쉘(shell)")의 친핵성으로인해 분열세포뿐만 아니라 미분열세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다. 일반적인 레트로바이러스는 세포가 분열할 때 세포의 핵막을 파괴하며 핵으로 진입하기 때문에, 분열하는 세포에만 감염이 가능하지만, 렌티바이러스는 렌티바이러스의 캡시드가 핵공을 통해 세포의 핵으로 진입하기 때문에 분열하지 않는 세포에도 감염이 가능하므로 증식하지 않는 다수의 인간세포를 감염시킬 수 있는 장점을 가진다.
본 발명의 또 다른 일실시예에서, 본 발명에 따라 제조된 역분화 줄기세포에서 배아줄기세포의 특이 단백질인 SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 및 NANOG로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 단백질이 발현됨을 확인하였다(실시예　3 및 4 참조).
또한, 본 발명은
(a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(b) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계;
(d) 유도된 상기 역분화 줄기세포의 콜로니로부터 수확한 세포를 배양하여 계대하는 단계; 및
(e) 계대한 상기 역분화 줄기세포에, 미분화 줄기세포만 선택적으로 분리시키는 세포분리용액(cell dissociation reagent)을 처리하여 2차 계대하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 유도된 역분화 줄기세포 대량으로 배양하는 방법을 제공한다(실시예 5 참조).
본 발명의 일실시예에서, 상기 세포분리용액(cell dissociation reagent)은 역분화 줄기세포만을 선택적으로 분리할 수 있도록 해 주는 시약으로서, 상기 제조된 역분화 줄기세포와 섞여서 함께 존재하는 역분화 되지 않은 세포 및 자발적으로 분화가 진행된 세포 등을 역분화 줄기세포와 분리하여 역분화 줄기세포만을 선택적으로 얻기 위해 사용하였다. 상기 세포분리용액을 처리함으로써 순도 높은 역분화 줄기세포를 효율적으로 얻을 수 있으므로, 배양 플라스크(culture flask) 및 기타 밀폐된 용기에서 대량으로 배양할 수 있는 가능성을 제공한다. 상기 세포분리용액으로는, 예컨대 Accutase, Dispase, 또는 TrypLE 등이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 ReLeSR™ 시약이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 세포분리용액으로서 ReLeSR™ 시약(STEMCELL Technologies사 제조)을 사용하였으나, 상기 세포분리용액은 역분화 줄기세포만을 선택적으로 분리하는 목적의 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
(a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(b) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계; 및
(d) 유도된 상기 역분화 줄기세포를 기도 상피세포 분화용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 제조방법에 의한 역분화 줄기세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법을 제공한다(실시예 6 참조).
본 발명의 일실시예에서, 상기 기도 상피세포 분화용 배지는 미분화된 줄기세포를 기도 상피세포로 분화되도록 촉진하는 배지로서, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이 이용 가능한 공지된 모는 분화용 배지를 포함한다. 상기 기도 상피세포 분화용 배지는, 바람직하게는 PneumaCult™-EX Plus 배지(STEMCELL Technologies사 제조), RPMI-1640 배지(Gibco사 제조), 또는 DMFM/F12 배지(Life Technologies사 제조) 등 일 수 있으며(Konishi et al., Stem Cell Reports, 6(1):18-25, 2016), 더욱 바람직하게는 E8 배지와 PneumaCult™-EX Plus 배지를 1:1 비율로 혼합한 것일 수 있으나, 역분화 줄기세포를 기도 상피세포로 분화시킬 수 있는 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
(a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
(b) 역분화 유도인자를 포함하는 바이러스를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계;
(c) 상기 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계;
(d) 유도된 상기 역분화 줄기세포를 Vitronectin, Matrigel, Geltrex, Laminin, 및 Collagen 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기질(matrix)에서 배양하는 단계; 및
(e) 기질에서 배양된 상기 역분화 줄기세포를 성체세포 분화용 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조한 역분화 줄기세포를 다시 원하는 성체세포로 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 역분화된 줄기세포(hT-iPSC)를 다시 원하는 성체세포로 분화시키기 위해 배양하는 단계에서 사용할 수 있는 상기 기질(matrix)로는, 예컨대 Vitronectin, Matrigel, Geltrex, Laminin, 또는 Collagen 등 일 수 있다. 상기 기질은 역분화 줄기세포를 성체세포로 분화시키기 위해 배양하는 목적의 것이라면 상기 예시에 제한되지 않으며, 실험 방법 또는 실험 목적에 따라 상기 열거한 기질 외에도 다른 기질을 선택하여 배양할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
본 연구에 이용한 하비갑개 조직은 하비갑개 절제술 시행과정에서 얻어진 조직으로서 수술 전 환자의 동의 하에 이용하였다. 하비갑개 조직을 채취한 직후 겐타마이신(국제약품공업, 성남, 대한민국)이 포함된 생리식염수로 3~5회 세척하여 섬유모세포를 분리하였다.
사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포의 분리를 위해 수술과정에서 제거된 하비갑개 조직을 4℃에서 냉장 보관하였고, 이 조직을 실온에서 항생-항진균 용액(Gibco, Gaithersberg, MD)으로 3회 세척하였다. 이를 다시 중성 phosphate buffered saline(PBS)으로 2회 세척한 뒤 작은 수술용 가위를 이용하여 1mm3 크기로 잘게 절단하였다.
상기 1mm3 크기 하비갑개 조직을 100mm 배양용 접시에 놓고 소독된 슬라이드 글라스로 덮어 배양용 접시에 유착시켰고 10% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지를 넣어 37℃, 5% CO2환경의 배양기에서 배양하였다. 2-3주간의 배양 후 슬라이드 글라스를 제거하고 배양액에 부유하는 세포를 세척하여 버리고 배양용 접시 바닥에 붙은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 트립신을 사용해서 바닥으로부터 떼어내어 3대까지 계대 배양된 세포를 사용하였다(Explant culture, 도 1a 참조).
다른 방법으로는 상기 1mm3 크기 하비갑개 조직에 0.1% 콜라게나제 효소를 처리하고 원심분리 과정을 통해 배양접시에 부착되어 자라는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하여 사용하였다(Collagenase treatment culture, 도 1b 참조).
상기 두 가지 배양방법을 통해서 얻어진 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 트립신-EDTA를 이용하여 계대배양 한 후 배양접시의 80% 정도 찼을 때 광학현미경(배율 ×100)을 이용하여 세포의 형태를 관찰하였다.
그 결과, 도 1a 및 도 2a에 나타난 바와 같이, 광학현미경학적 소견에서는 상기 두 가지 배양방법을 통해 얻은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 모두 방추형의 섬유모세포 형태로서 형태학적으로 차이가 나지 않음을 확인하였다.
실시예 2: 렌티바이러스를 이용한 iPSC (induced pluripotent stem cell) 재프로그램화(Reprogramming)
2.1. 렌티바이러스 생산용 세포(HEK293T)의 준비
0.1mg/ml PDL의 PBS 2ml를 60mm dish에 균등하게 도포하여 1시간동안 실온에서 코팅한 후 용액을 제거하고 2ml의 증류수로 2번 세척하여 실온에서 2시간 이상 건조하였다. PDL이 코팅된 dish에 5% FBS의™ Gibco™ Opti-MEM™(with GlutaMax™) 5㎖와 5×106의 HEK293T(invitrogen사 제조) 세포를 시딩하였다.
2.2. 트랜스펙션(transfection)
상기의 Opti-MEM™(with GlutaMax™) 배지는 실온, Opti-MEM™(w/o GlutaMax™) 배지는 37℃로 예열하여 준비하였다. HEK293T 세포(invitrogen사 제조)의 배지는 25 μM 클로로퀸(Chloroquine)이 함유된 Opti-MEM™(w/o GlutaMa™)로 교체하였다. 트랜스펙션 배지는 Opti-MEM™(with GlutaMax™), DNA (12㎍의 4-in-1 재프로그램화 플라스미드(Oct-4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc), 9㎍ 패키징 pPAX2 플라스미드, 및 3㎍ 패키징 pMD2G 플라스미드) 및 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000, invitrogen사 제조)을 섞은 혼합물을 실온에서 20분 동안 반응시킨 후 사용하였다. HEK293T 세포 dish에 첨가하여, 4시간 내지 6시간동안 37℃에서 배양한 뒤 5ml의 10 μM 부티르산 나트륨(sodium butyrate)이 포함된 Opti-MEM™(w/o GlutaMax™)로 교체하여 37℃에서 24시간 배양하였다.
그 결과, 렌티바이러스 벡터(lentivirus vector)에 Oct-4, Sox2, Klf4, 및 c-Myc의 4가지 유전자, pPAX2, 및 pMD2G가 서브클로닝(subcloning)되었다.
2.3. 렌티바이러스(lentivirus) 생산 및 확립
상기 실시예 2-2에서 24시간 배양한 배지를 Opti-MEM™(w/o GlutaMax™)로 교체하고, 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 배양한 후 50ml 튜브에 렌티바이러스 상등액(supernatant)을 모아 냉장 보관하였다.
렌티바이러스 상등액을 4℃에서 3000 xG로 15분 동안 원심분리하여 얻어진 상등액을 PEG-it solution과 Conditioned media를 1:4의 비율로 섞은 4℃의 혼합배지에서 밤새(overnight) 배양하였다. 다음날 상등액과 혼합배지를 4℃에서 1500 xG로 30분 동안 원심분리하여 소량을 남긴 나머지 상등액을 제거한 후 한 번 더 같은 조건으로 원심분리하고 펠릿(pellet)에 충격이 가지 않도록 조심스럽게 상등액을 전부 제거한다. 펠렛에 4℃의 PBS를 배지 볼륨의 1/100만큼 넣고 EP(eppendorf) 튜브에 30μl씩 생산된 렌티바이러스를 분주 한 후 -80℃에 보관하였다.
2.4. 렌티바이러스를 이용한 트랜스덕션(transduction)
6-웰(well) 플레이트에 3×104 개/well의 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 시딩하였다. 다음날, 세포를 10ng/ml polybrene 및 50ng/ml 비타민 C가 포함된 MEF(mouse embryonic fibroblast) 배지로 교체하였다. 바이러스를 얼음에서 천천히 녹인 후 세포에 넣어주고, 37℃, 1800 rpm에서 40분 동안 가라앉힌 뒤, 37℃ 배양기에 보관하였다.
5일 동안, 매일 0.1mM 부티르산 나트륨 및 50ng/ml 비타민 C가 첨가된 MEF 배양액으로 바꿔준 후 6일째에 MEF와 E8(essential 8)을 1:1로 섞고 50ng/ml 비타민 C를 첨가한 배양액으로 교체하였다. 7일째에 바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 상기 배지에서 떼어낸 후 전체 세포 수에 대하여 1:3, 1:6, 또는 1:9의 비율로 마트리겔(matrigel)이 코팅된 플레이트에 시딩하여 안정화 시킨 후 다음날 0.1mM 부티르산 나트륨 및 50ng/ml 비타민 C를 첨가한 E8 배지로 교체하였다.
2.5. 역분화 줄기세포주 확립
8일 후 콜로니가 잘 나타나면 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)를 처리하여 세포를 떼어낸다. 상온에서 1100 rpm에서 2분간 원심분리를 통해 세포를 모으고 0.1mM 부티르산 나트륨 및 50ng/ml 비타민 C가 첨가된 MEF와 E8 배양액을 1:1 비율로 하여 마트리겔이 코팅된 플레이트에 분주하였다. 매일 소듐 부틸레이트 (0.1mM) 및 50ng/ml 비타민 C가 첨가된 E8 배양액을 이용하여 세포를 갈아주며 콜로니 형성을 관찰하였다. Bright field는 광학현미경을 이용해 세포의 콜로니 형성, 형태를 관찰한 것이고, Td tomato는 줄기세포에 빨간색 형광이 발현되는 바이러스를 도입 후 형광현미경을 이용해 유전자 발현 확인한 것이다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, 20일 정도 경과하면 콜로니가 확실하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 렌티바이러스를 이용하여 제조된 역분화 줄기세포의 단백질 특성 분석
사람 하비갑개 중간엽 줄기세포로부터 제작된 역분화 줄기세포에 대하여 배아줄기세포의 특이 단백질인 SSEA-4와 Oct-4 등의 발현여부를 면역염색법을 통해 확인하였다. 염색 과정은 우선 4% 파라포름알데히드를 이용하여 세포를 고정한 후, PBS로 세정을 하고 1% BSA 용액으로 블로킹(blocking)을 하였다. SSEA-4와 Oct-4, Sox2 등에 대한 1차 항체 (각각 Santa Cruz Biotechnology사 제조)를 처리하여 4℃에서 18시간 동안 반응시킨 후, PBS로 세정 하고, 1차 항체인 SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct-4, Sox2, Klf4에 대한 형광이 붙은 2차 항체 (Alexa Fluor 594-conjugates, Santa Cruz Biotechnology사 제조)를 처리하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세정을 하고, 마운팅 (mounting) 용액으로 마운팅을 한 후 공초점현미경(confocal microscopy)을 사용하여 발현 여부를 분석하였다. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)는 DNA 염색을 통한 세포 내 핵의 시각화를 위해 사용되었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 방법으로 제작된 역분화 줄기세포는 배아줄기세포의 특이 단백질인 SSEA-4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81이 발현됨을 확인하였다.
상기 결과는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조된 역분화 줄기세포가 배아줄기세포와 단백질 발현 측면에서 유의한 차이가 없음을 시사한다.
실시예 4: 센다이바이러스(Sendai virus)를 이용한 iPSC (induced pluripotent stem cell) 재프로그램화(Reprogramming)
4.1. 센다이바이러스를 이용한 트랜스덕션(transduction)
상기 렌티바이러스를 이용한 실시예 2의 방법과는 또 다른 방법인 센다이바이러스를 이용하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 재프로그램화 하였다.
트랜스덕션에 적합한 상태로 배양하기 위해 상기 실시예 1에서 얻은 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 37℃ 워터배스(water bath)에 넣고 세포를 약 70% 정도 녹인 후, 녹인 세포를 15ml 튜브에 넣고 10% FBS 및 1% AA(antibiotic-antimycotic, 항생제-항균제) 용액이 첨가된 Alpha-MEM(Minimum Essential Medium, Alpha Modification, WELGENE사 제조) 용액을 7ml 넣어준 뒤 원심분리 하였다. 상등액(supernatant)을 제거한 후 다시 상기 Alpha-MEM(w/ 10% FBS, 1% AA) 용액을 넣어 뭉친 세포를 풀어준 다음 이를 Alpha-MEM(w/ 10% FBS, 1% AA) 배지가 담긴 세포배양접시(cell culture dish)에 접종하였다. 이틀 후 세포가 70~80% 정도 자랐을 때 세포가 자란 상기 세포배양접시에서 배지를 제거하고, PBS를 이용하여 세척한 다음 트립신-EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)를 처리한 후 37℃ 인큐베이터에서 배양하여 세포의 분리를 유도하였다. 상기 분리된 세포를 Alpha-MEM(w/ 10% FBS, 1% AA) 용액을 이용하여 모아준 후 원심분리하였다. 이렇게 수확한 세포를 6-웰 플레이트에 웰 당 약 2×105 개/ml의 세포를 시딩하였다.
상기 6-웰 플레이트에 시딩한 세포가 70 ~ 80% 정도 자라면 그 중 한 웰에 있는 세포를 PBS로 세척한 후 트립신-EDTA를 처리하여 세포의 분리를 유도한 후, MEF 배지로 세포를 모아준 다음 1500 rpm에서 15분 간 원심분리하였다. 그 후 상등액을 제거하고 세포를 MEF 배지에 현탁하였다. 새로운 6-웰 플레이트를 준비하여 MEF 배지 1ml에 Cytotune™ 2.0 Sendai mix(Invitrogen사 제조)를 넣어준 후 이를 6-웰 플레이트에 넣어주고, 여기에 상기 MEF 배지에 현탁한 세포를 약 2×105 개/ml이 되도록 시딩하였다. 24시간 후 새 MEF 배지로 교체해주고, 이후 매일 MEF 배지를 교체해 주었다. 세포에 Cytotune™ 2.0 Sendai mix를 처리하면 세포가 길쭉한 모양을 나타내다가(도 4의 day 1 참조), 2일째 되는날부터 세포끼리 모이면서 둥글게 변하는 것을 확인하였다(도 4의 day 2 참조).
상기 Cytotune™ 2.0 Sendai mix를 이용하여 트랜스덕션을 수행한지 7일째 되는 날 계대배양을 하였다. 상기 계대배양을 하는 시점은 세포의 증식 속도에 따라 유동적일 수 있으며, Sendai mix 처리 후 플레이트 내의 세포 밀도(density)가 약 70% 에서 80%가 되면 계대배양 할 수 있다. 상기 세포가 자란 웰에서 MEF 배지를 제거한 다음 PBS로 세척 후 TrypLE로 세포를 떼어내었다. 떨어진 세포를 MEF로 모아준 다음 200xG에서 4분 동안 원심분리하였다. 상등액은 제거하고 트리판 블루로 세포 수를 계수한 다음 미리 준비한 세포배양플레이트(cell culture plate)에 약 2×105 개/ml의 세포를 시딩하였다. 상기 세포배양플레이트는 PBS에 1/100 비율로 희석한 비트로넥틴(vitronectin, Gibco사 제조)으로 상온에서 1시간 코팅한 후, 잔존하는 비트로넥틴을 제거한 다음 PBS로 세척한 것이다. 세포를 시딩한지 24시간이 경과하면 E8 배지로 교체해주고, 이후 매일 배지를 교체해주면서 3 ~ 4주까지 콜로니가 형성되는지 여부를 현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 일정 기간이 지나면 도 4의 Day 10에 나타낸 바와 같은 모양의 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다. 이후 일정 기간이 더 경과하면, 상기 iPSC 콜로니는 도 4의 Day 32에서 도시한 바와 같이 외형적으로 커지고, 기존에 시딩한 세포 대비 세포의 가장자리 부분이 구분될 정도로 자라면서 iPSC 콜로니의 동그란 부분이 입체감 있게 형성되는 모습을 확인할 수 있었다.
4.2. 센다이바이러스를 이용하여 제조된 역분화 줄기세포의 단백질 특성 분석
상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조된 역분화 줄기세포(iPSC)가 실제로 만능줄기세포의 성질을 가지는지 확인하기 위하여 상기 실시예 3에서 기술한 면역형광염색법을 이용, Oct-4, SSEA-4, Sox2 및 NANOG 발현 여부를 확인하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조된 역분화 줄기세포에서 상기 iPSC 미분화 마커인 Oct-4, SSEA-4, Sox2 및 NANOG가 발현되는 것을 확인하였다. 이를 통해 상기 역분화 줄기세포가 iPSC의 성질을 가지고 있음을 알 수 있었다. 즉 상기 결과는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조된 역분화 줄기세포가 배아줄기세포와 단백질 발현 측면에서 유의한 차이가 없음을 시사한다.
실시예 5: 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 제조된 역분화 줄기세포(hT-iPSC)의 계대배양(subculture, passaging) 및 대량 배양
상기 실시예 4의 4.1에서 트랜스덕션을 수행한 후 계대배양한 세포 중에는 바이러스에 의해 트랜스덕션 되지 않은, 즉 재프로그램밍 되지 않은 세포도 함께 섞여 있다. 이에 역분화 줄기세포만 선택적으로 배양하고자 하기와 같은 방법으로 계대배양을 수행하였다. 새로운 세포배양접시를 PBS로 희석한 비트로넥틴으로 상온에서 1시간 코팅한 후 잔존 비트로넥틴을 제거한 다음 PBS로 세척해주었다. 상기 실시예 4의 4.1 에서 트랜스덕션을 수행한 후 계대배양한 세포를 3 ~ 4주 가량 배양하면 도 4의 Day 32에서 도시된 바와 같이 콜로니가 형성되는데, 이 때 세포에서 배지를 제거한 다음 PBS로 세척하고 10μM ROCK inhibitor(Sigma사 제조)가 첨가된 E8 배지를 넣어준 후 현미경으로 관찰하면서 100μl 파이펫 팁을 이용하여 역분화 줄기세포의 가장자리부터 세포를 조각내었다. 새로운 세포배양접시에 E8(w/ 10μM ROCK inhibitor) 배지를 넣은 다음, 상기 조각낸 역분화 줄기세포를 E8 배지로 수획하여 상기 새로운 배양접시에 넣어주고 인큐베이터에서 배양하였다.
그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, day 1에는 크기가 작고 가장자리 부분이 길쭉한 모양으로 붙어있지만, 시간이 경과할수록 상기 가장자리 부분이 둥글게 변하고 콜로니의 크기 또한 커지게 되는 것을 확인하였다(도 6의 day 4 참조). 또한, 도 6의 우측 사진(배율×100)에서 세포 가운데에 존재하는 인(nucleolus)을 확인함으로써 역분화 줄기세포 콜로니가 정상적으로 분열하는 것을 확인하였다.
다음으로 역분화 줄기세포를 대량으로 배양하기 위하여 하기와 같은 방법으로 계대배양을 수행하였다. 상기 조각낸 역분화 줄기세포를 E8 배지에서 계대배양함으로써 역분화 줄기세포로만 구성된 콜로니를 얻었으며, 여기에 iPSC 전용 세포 분리 용액인 ReLeSR™(STEMCELL Technologies사 제조)을 상온에서 1분간 처리하였다. ReLeSR™ 용액을 제거한 다음, E8 배지로 세포를 수확한 후 1500 rmp에서 5분간 원심분리하였다. 상등액은 제거하고 펠릿을 E8(w/ 10μM ROCK inhibitor) 배지로 현탁하였다. 상기 현탁한 세포를 미리 준비한 E8(w/ 10μM ROCK inhibitor) 배지가 담긴 세포배양접시에 넣어 준 뒤 인큐베이터에서 배양하였다.
그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, day 1과 비교하여 day 4에서 세포의 콜로니가 증식하는 것을 확인할 수 있었다. 이처럼 ReLeSR™ 용액을 사용하면 단일 세포로 분리되므로, 콜로니가 증식하는 속도는 느려질 수 있다.
실시예 6: 역분화 줄기세포의 분화능 확인 - 기도 상피세포(airway epithelial cell)로의 분화
본 발명의 제조방법으로 얻은 역분화 줄기세포로부터 기도 상피세포로의 분화를 유도하여, 상기 역분화 줄기세포의 분화능을 확인하였다. 분화는 기도 상피세포 전용 배지(분화배지)를 이용하여 유도하였으며, 상세 방법은 하기와 같다.
분화배지에서 배양하기 위해 Transwell™ 12mm 폴리에스터 막(polyester membrane)이 삽입된 12-웰 플레이트(Costar사 제조)를 이용하였다. 상기 Transwell™의 상단 챔버 부분에 PBS로 희석한 비트로넥틴을 처리하여 상온에서 1시간 동안 코팅하였고, 이후 잔존하는 비트로넥틴을 제거한 다음 PBS로 세척하였다. 역분화 줄기세포는 배지를 제거한 후 PBS로 세척하고 ROCK-억제제가 함유된 E8 배지를 넣어준 뒤, 100μl 파이펫 팁을 이용하여 상기 역분화 줄기세포를 떼어내고, 이를 다시 수술용 파이펫(surgical pipette)을 이용하여 상기 떼어낸 역분화 줄기세포를 Transwell™의 상단 챔버에 넣어주었다. 다음날 세포 상태를 확인한 후 E8 배지로 교체해주었다. 2주 동안 E8 배지를 새 배지로 갈아주면서 live & dead 염색으로 세포가 잘 유지되고 있는지 확인하였다.
분화를 위하여 E8 배지와 PneumaCult™-EX Plus 배지(STEMCELL Technologies사 제조)를 1:1 비율로 혼합하여, 상기 세포가 있는 Transwell™의 상단 챔버와 하단 챔버에 각각 넣어주고 2일 간격으로 배지를 교체해 주면서 7일 동안 유지시켰다. 7일 간 상기 E8 배지와 PneumaCult™-EX Plus 배지를 혼합한 배지를 유지한 이후에, PneumaCult™-ALI 배지(w/ supplement, STEMCELL Technologies사 제조)를 하단 챔버에만 넣어주었다. 2일 간격으로 배지를 교체해 주었고 분화를 시작한 지 18일째 되는 날, 면역화학분석(immunochemistry) 방법을 이용하여 ZO-1 단백질의 발현을 확인하였다.
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, 세포 핵 사이에 ZO-1 마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. ZO-1 마커는 기도 상피세포에서 밀착연접(tight junction)을 인식하는 마커로서, 도 8에서 초록색 형광으로 나타난 부분이다. 파란색 형광으로 나타난 부분은 DAPI로 염색된 세포 핵 부분이다.
결론적으로, 본 발명의 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포 또는 유도만능줄기세포를 제조하는 방법은 기존의 중간엽 줄기세포보다 획득 과정에서 수술의 위험성이 낮고, 언제든지 획득할 수 있어 임상적으로 적절한 질병 모델 개발의 활용 가능성을 증가시킬 수 있을 것으로 기대된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (6)

  1. 하기의 단계를 포함하는 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell)의 제조방법으로서, 상기 역분화 줄기세포는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(human turbinate mesenchymal stem cells)로부터 유도된 것을 특징으로 하는, 역분화 줄기세포 제조방법:
    (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
    (b) 역분화 유도인자를 포함하는 센다이바이러스(sendai virus)를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계; 및
    (c) 상기 센다이바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계의 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포는 사람 하비갑개 절제술 시행과정에서 얻어지는 하비갑개 조직으로부터 분리되는 것을 특징으로하는, 역분화 줄기세포 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (b)단계의 역분화 유도인자는 Oct-4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 polycistronic Klf4-Oct3/4-Sox2로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 역분화 줄기세포 제조방법.
  4. 삭제
  5. 하기의 단계를 포함하는 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell)의 대량 배양방법으로서, 상기 역분화 줄기세포는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(human turbinate mesenchymal stem cells)로부터 유도된 것을 특징으로 하는, 역분화 줄기세포 대량 배양방법:
    (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
    (b) 역분화 유도인자를 포함하는 센다이바이러스(sendai virus)를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계;
    (c) 상기 센다이바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계;
    (d) 유도된 상기 역분화 줄기세포의 콜로니로부터 수확한 세포를 배양하여 계대하는 단계; 및
    (e) 계대한 상기 역분화 줄기세포에 미분화 줄기세포만 선택적으로 분리시키는 세포분리용액(cell dissociation reagent)을 처리하여 2차 계대하는 단계.
  6. 하기의 단계를 포함하는 역분화 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 기도 상피세포로 분화시키는 방법으로서, 상기 역분화 줄기세포는 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포(human turbinate mesenchymal stem cells)로부터 유도된 것을 특징으로 하는, 역분화 줄기세포를 기도 상피세포로 분화시키는 방법:
    (a) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
    (b) 역분화 유도인자를 포함하는 센다이바이러스(sendai virus)를 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포에 도입하는 단계;
    (c) 상기 센다이바이러스가 도입된 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 유도하는 단계; 및
    (d) 유도된 상기 역분화 줄기세포를 기도 상피세포 분화용 배지에서 배양하는 단계.
KR1020190048023A 2019-04-24 2019-04-24 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법 KR102181526B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190048023A KR102181526B1 (ko) 2019-04-24 2019-04-24 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190048023A KR102181526B1 (ko) 2019-04-24 2019-04-24 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200124553A KR20200124553A (ko) 2020-11-03
KR102181526B1 true KR102181526B1 (ko) 2020-11-20

Family

ID=73197721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190048023A KR102181526B1 (ko) 2019-04-24 2019-04-24 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102181526B1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101327076B1 (ko) 2010-03-22 2013-11-08 가톨릭대학교 산학협력단 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 연골, 골, 신경세포 또는 지방세포를 분화시키는 방법
KR102104120B1 (ko) * 2017-05-02 2020-04-23 가톨릭대학교 산학협력단 사람 코 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포 기반 3d 바이오프린팅 조직체 및 이의 이용
KR101807724B1 (ko) * 2017-10-23 2018-01-18 차의과학대학교 산학협력단 인간-유래의 체세포로부터 역분화 만능 줄기세포의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200124553A (ko) 2020-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tamagawa et al. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro
JP6581655B2 (ja) 多能性幹細胞由来ケラチノサイトの生成およびケラチノサイト培養の維持
CA2823265C (en) Method of generating induced pluripotent stem cells and differentiated cells
JP5750130B2 (ja) ヒト胚盤胞由来幹細胞に由来する多能性非収縮心臓前駆細胞の新規の集団
Lorenzo et al. Generation of mouse and human induced pluripotent stem cells (iPSC) from primary somatic cells
CN105683359B (zh) 将从间充质干细胞诱导的多能干细胞分化为肝细胞的方法
KR20040016785A (ko) 간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법
KR101781693B1 (ko) 심장내막 유래 성체줄기세포로부터 제조된 유도만능 줄기세포의 심혈관계 세포로의 분화방법 및 이의 용도
Hu et al. Derivation, expansion, and motor neuron differentiation of human-induced pluripotent stem cells with non-integrating episomal vectors and a defined xenogeneic-free culture system
CN113015794A (zh) 包含用于条件性永生化的可控转基因的诱导多能细胞
EP2481795A1 (en) Method of generating induced pluripotent stem cells and differentiated cells
WO2018143312A1 (ja) 多能性幹細胞の分化制御方法
US9163214B2 (en) Method for culturing stem cells
Haastert-Talini Culture and proliferation of highly purified adult Schwann cells from rat, dog, and man
KR102181526B1 (ko) 사람 하비갑개 유래 중간엽 줄기세포로부터 역분화 줄기세포를 제조하는 방법
JP6698626B2 (ja) 哺乳動物多能性幹細胞、それらの調製のための方法、およびその使用
WO2005108557A1 (ja) 前駆間葉系幹細胞
CN109852587B (zh) 一种人科凯恩氏综合征特异性成体干细胞的制备方法
CN111849884B (zh) 一种人胎盘羊膜干细胞向肝细胞定向分化的诱导方法
KR100662706B1 (ko) 양수세포를 배양한 후 수거한 배양액을 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법
CN101517069A (zh) 由人类胚泡来源的干细胞衍生的多能心脏前体细胞新种群
Neeman-Egozi et al. Methods for Isolation and Reprogramming of Various Somatic Cell Sources into iPSCs
WO2011145615A1 (ja) 多能性幹細胞の製造のための核酸
CN106754728B (zh) 后肾间充质细胞系及其制备方法与应用
KR100586462B1 (ko) 양수세포를 이용한 인간배아 줄기세포의 배양방법

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Publication of correction