CN106754728B - 后肾间充质细胞系及其制备方法与应用 - Google Patents

后肾间充质细胞系及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种后肾间充质细胞系及其制备方法与应用，所述的后肾间充质细胞系中Bmi1基因或蛋白过表达。本发明的细胞系是来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞经过表达Bmi1基因或蛋白而得到的，可永生化并稳定传代，具有原代胚胎后肾间充质细胞的蛋白标志物和部分间充质干细胞的特性，并具有向成骨细胞、上皮细胞分化的能力，能够促进牙周膜干细胞的成骨分化。本发明为人类和动物肾脏发育和器官修复的研究提供了实验工具。

Description

后肾间充质细胞系及其制备方法与应用
技术领域
本发明是关于一种后肾间充质细胞系及其制备方法与应用，具体而言，本发明是关于一种使来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的后肾间充质细胞过表达Bmi1蛋白而得到的后肾间充质细胞系。
背景技术
哺乳动物肾脏不仅是一个排泄器官，也是一个内分泌器官，参与了机体代谢废物的排出、水和电解质稳态的维持等多种生理过程。一个具有正常功能的肾脏的形成依赖于肾脏内多种类型细胞的协调发展。哺乳动物肾脏源自中胚层，依次形成前肾、中肾和后肾，后肾最终发育为成年肾脏。中胚层中osr+细胞是后肾的主要细胞成分，osr+细胞又分为Wolffian管和后肾间充质(metanephric mesenchyme，MM)，Wolffian管向MM延伸形成输尿管芽(ureteric bud，UB)标志着后肾发育的开始。UB是上皮样组织，其向MM的延伸导致围绕在UB顶端的MM细胞聚集，形成帽状间充质(cap mesenchyme，CM)，二者之间的相互作用一方面引发了UB的进一步分支和延伸，另一方面则诱导了CM细胞的间充质-上皮转化，形成肾脏囊泡(renal vesicle，RV)。在机体多种机制的调控下，RV最终分化为肾小球、近端小管、髓襻和远端小管，远端小管与UB融合，UB则最终分化为集合管系统。MM中除了CM外还有血管前体细胞(可能分化为血管)和基质前体细胞(分化为周细胞、系膜细胞和肾间质)。因此，在哺乳动物肾脏发育过程中MM细胞分化形成了成年肾脏的绝大部分结构。而且，MM和UB之间的相互作用包含了多种发育生物学过程，包括上皮分支的形成、诱导组织之间的交叉对话、间充质-上皮细胞转化、细胞分化、细胞极性形成等。因此，肾脏已成为发育生物学研究过程中重要的模式器官。
肾脏发育过程及其机制的研究在小鼠等啮齿类动物中已比较广泛，小鼠后肾间充质及其细胞的提取和培养也有报道。但是，不同物种肾脏的结构和功能不完全一样。与啮齿类相比，猪的肾脏在形态、结构和功能上与人更为相似。比如与大鼠、豚鼠等单乳头肾脏动物相比，猪为多乳头肾脏，且主要为短髓袢的肾单位，这一点与人类相似；猪的肾盂、输尿管以及下尿道的尿动力学与人也极为相似。因此，研究猪等大动物的肾脏发育过程更具实际意义。研究发现，将猪的后肾移植到免疫缺陷大鼠体内，可以形成具有完整功能的肾脏；另有研究表明，猪胚胎早期的肾脏前体细胞移植到免疫缺陷小鼠体内可分化为多种肾脏固有细胞，形成具有功能的肾单位，而且胚胎早期的细胞免疫原性低，移植排斥反应小，在肾脏移植方面的应用前景十分广阔。即便如此，与小鼠等啮齿类动物相比，关于猪的肾脏器官形成的研究仍然比较欠缺，其中很重要的限制因素就是研究材料的缺乏。因为在此类研究中需要大量的胚肾移植物和胚肾细胞，且需要在体外培养相当一段时间，原代提取的胚肾和细胞在体外培养很容易衰老，寿命有限。因此，建立一种保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的猪胚肾细胞系，将会成为研究肾脏发育和器官修复再生的有力工具。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的胚肾细胞系，为研究肾脏发育和器官修复再生提供有力工具。
本发明的另一目的在于提供上述保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的胚肾细胞系的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的胚肾细胞系的应用。
一方面，本发明提供了一种后肾间充质细胞系，其中Bmi1基因或蛋白过表达。
根据本发明的具体实施方案，本发明的后肾间充质细胞系，其是来自受孕动物(例如中国实验用小型猪)胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞经过表达Bmi1基因或蛋白而得到的。
根据本发明的具体实施方案，本发明的后肾间充质细胞系为永生化细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明的后肾间充质细胞系为six2、pax2、gdnf、vimentin阳性，E-cadherin阴性的后肾间充质细胞。同时，该细胞系表达CD44、CD73、CD90和CD105；此外，几乎不表达CD11b、CD19、CD34和CD45。
根据本发明的具体实施方案，本发明的后肾间充质细胞系保留了原代细胞增殖和分化能力，具有向成骨细胞、上皮细胞等分化的能力。
另一方面，本发明还提供了所述的后肾间充质细胞系的制备方法，该方法包括：
使来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞(后肾间充质细胞，MMC)过表达Bmi1基因或蛋白，制得过表达Bmi1的所述后肾间充质细胞系。
根据本发明的具体实施方案，本发明的后肾间充质细胞系的制备方法中，是通过慢病毒转染方式使原代胚肾细胞过表达Bmi1。
在本发明的一具体实施方案中，本发明是在中国实验用小型猪母猪怀孕第28天或猪仔出生两周以内的时间段，从胚胎或猪仔肾脏生肾区提取原代猪胚肾细胞，通过慢病毒转染使Bmi1蛋白过表达，从而制备得到本发明的永生化后肾间充质细胞系。
更具体地，本发明的方法中，通过慢病毒转染方式使原代猪胚肾细胞过表达Bmi1的方法包括：pMSCV-Bmi1质粒和plk质粒共转染293T细胞，收集含病毒上清；后肾间充质细胞接种至细胞培养瓶，次日更换新鲜培养基，同时加含病毒上清和聚凝胺，6h后更换新鲜培养基，2天后更换含嘌呤霉素培养基，隔两天换液，共7天，即得Bmi1过表达后肾间充质细胞。本发明中将过表达Bmi1的后肾间充质细胞细胞命名为MMC-Bmi1。
另一方面，本发明还提供了过表达Bmi1的所述后肾间充质细胞系的相关应用。
本发明的过表达Bmi1的后肾间充质细胞系中，Bmi1基因表达水平较MMC升高(qPCR检测)，有明显的Bmi1蛋白表达(蛋白印迹检测)，而MMC中几乎无表达。本发明经实验证明，所述过表达Bmi1的后肾间充质细胞系为永生化细胞，可稳定传代，衰老速度显著减慢，具有原代胚胎后肾间充质细胞的蛋白标志物和部分间充质干细胞的特性，并具有向成骨细胞、上皮细胞分化的能力，能够促进牙周膜干细胞的成骨分化。本发明的细胞系是保留了原代细胞增殖和分化能力的永生化的胚肾细胞系，对于研究肾脏发育和器官修复再生具有重要意义。
从而，本发明提供了所述的后肾间充质细胞系在体外研究肾脏发育和器官修复再生中的应用。具体地说，本发明提供了所述的后肾间充质细胞系在制备用于研究肾脏发育和器官修复的材料中的应用。
本发明还提供了所述的后肾间充质细胞系在体外提高人牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性、增加人牙周膜干细胞成骨转录因子Runx2基因表达水平、和/或促进人牙周膜干细胞钙结节形成中的应用。具体地说，本发明提供了所述的后肾间充质细胞系在制备用于提高人牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性、增加人牙周膜干细胞成骨转录因子Runx2基因表达水平、和/或促进人牙周膜干细胞钙结节形成的材料中的应用。
本发明还提供了所述的后肾间充质细胞系在体外促进人牙周膜干细胞成骨分化中的应用。具体地说，本发明提供了所述的后肾间充质细胞系在制备用于促进人牙周膜干细胞成骨分化的材料中的应用。
综上所述，本发明提供了一种来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞经过表达Bmi1基因或蛋白而得到的后肾间充质细胞系，其可永生化并稳定传代，具有原代胚胎后肾间充质细胞的蛋白标志物和部分间充质干细胞的特性，并具有向成骨细胞、上皮细胞分化的能力，能够促进牙周膜干细胞的成骨分化。本发明为人类和动物肾脏发育和器官修复的研究提供了实验工具。
附图说明
图1显示原代猪后肾间充质细胞(MMC)的提取流程。正常孕70天中国实验用小型猪，颈部放血处死，剖宫取出胚胎；迅速分离胚肾，在4℃无菌生理盐水中冲洗并去除包膜，取肾皮质并剪碎；将孔径150μm和53μm无菌筛网上下叠放，肾皮质置于上层研磨；收集截留在下层筛网的组织于体外培养；将形成的细胞集落分离培养；慢病毒转染Bmi1基因使其永生化；有限稀释法挑取单克隆；鉴定胚肾标志物以及间充质标志物的表达情况。
图2显示细胞中Bmi1过表达鉴定结果。其中，图片A显示qPCR检测Bmi1基因表达情况的结果。图片B显示细胞蛋白印迹检测Bmi1蛋白表达情况的结果。图中*表示与MMC相比p<0.05。
图3显示MMC-Bmi1永生化鉴定结果。其中，图片A显示qPCR鉴定结果。图片B-图片D分别为第5代MMC、第10代和第50代的MMC-Bmi1光镜结果，100x。图片E显示第5代的MMC和第30代的MMC-Bmi1连续培养14d的蛋白印迹检测相关蛋白p16INK4a和p27的水平的结果。图片F和图片G显示第5代的MMC和第30代的MMC-Bmi1连续培养14d的SA-βGel染色结果，200x。图中*表示与MMC相比p<0.05。
图4显示MMC-Bmi1的单克隆挑取以及胚肾、间充质和上皮标志物的鉴定结果。其中，图片A-图片D显示有限稀释法挑取单克隆后第1、3、6天细胞生长状况(100x)及单克隆纯化的MMC-Bmi1细胞形态光镜结果(200x)。图片E-图片I每列分别显示Six2、Pax2、Gdnf、Vimentin和E-cadherin的免疫荧光染色及其对应的细胞核和融合后的情况，400x。
图5显示MMC-Bmi1间充质干细胞特性鉴定结果。其中，图片A显示RT-PCR检测MMC-Bmi1表达间充质干细胞表面分子CD44、CD73、CD90、CD105、单核/巨噬细胞表面分子CD11b、B细胞表面分子CD19和造血干细胞表面分子CD34、CD45的检测结果。图片B和图片C显示MMC-Bmi1结晶紫染色结果，10x与100x。图片D-图片G显示MMC-Bmi1茜素红染色结果，400x。
图6显示MMC-Bmi1上皮分化能力鉴定结果。其中，图片A的左图显示基础培养基条件下细胞形态光镜结果(200x)；图片A的右图显示诱导培养基连续培养10天的细胞形态光镜结果(200x)。图片B-图片D的左图显示细胞免疫荧光检测基础培养条件下细胞表达上皮标志物E-cadherin的结果(400x)；右图显示细胞免疫荧光检测诱导培养基培养10天细胞表达上皮标志物E-cadherin的结果(400x)。
图7显示MMC-Bmi1促进PDLSCs成骨分化检测结果。其中，图片A显示与后肾间充质细胞共培养7天PDLSCs的ALP水平检测结果。图片B显示qPCR检测与后肾间充质细胞共培养14天PDLSCs细胞成骨转录因子Runx2基因表达水平的检测结果。图片C-图片E显示与后肾间充质细胞共培养21天PDLSCs钙结节形成的数量的茜素红染色结果，200x。图中：*表示与对照-0d组比较p<0.05，#表示与对照-7d组比较p<0.05，$表示与对照-14d组比较p<0.05。
具体实施方式
下面通过具体实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
在进行动物实验前，实验用动物均通过实验动物伦理委员会批准。
实施例
1、原代猪胚肾细胞(MMC)的提取、分离和培养
本实施例中，原代猪后肾间充质细胞(MMC)的提取流程参见图1所示。具体操作如下：
1)正常孕70天中国实验用小型猪，颈部放血处死，迅速剖宫产取出胚胎；
2)迅速分离胚肾，在4℃无菌生理盐水中冲洗并去除包膜，剪碎肾皮质；
3)孔径150μm和53μm无菌筛网上下叠放，肾皮质置于上层研磨；
4)收集截留在下层筛网的组织，转移至50ml无菌离心管，1300rpm，离心5min；
5)倒掉上清，用α-MEM培养基(含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素)重悬细胞，接种至75cm2细胞培养瓶，置于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度细胞培养箱中培养；
6)隔两天换液，5天后细胞形成集落，即原代猪后肾间充质细胞(MMC)，可转移至6孔板继续扩增培养。
2、原代猪胚肾细胞的永生化及鉴定
通过慢病毒转染方式使原代猪胚肾细胞过表达Bmi1，即HEK-293T细胞(ATCC，Rockville，MD，USA)接种至直径100mm培养皿，待细胞融合至80％时取pMSCV-Bmi1质粒和plk质粒(质粒均可购自和元生物技术股份有限公司，上海，中国)各5μg共转染293T细胞，6h后换液，24h后收集含病毒上清；MMC以1×105接种至25cm2细胞培养瓶，次日更换新鲜培养基3ml，同时加含病毒上清3ml和48μg polybrene(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)终浓度8μg/ml，6h后更换新鲜培养基6ml；48h后更换含嘌呤霉素(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)500μg/ml培养基进行筛选，隔两天换液，共7天，即得Bmi1过表达细胞(MMC-Bmi1)。
对细胞中Bmi1过表达情况进行qPCR检测和蛋白印迹检测鉴定，鉴定结果参见图2。其中，图片A显示qPCR检测Bmi1基因表达情况，MMC-Bmi1中Bmi1基因表达水平较MMC显著升高。图片B显示细胞蛋白印迹检测Bmi1蛋白表达情况，MMC-Bmi1中有明显的Bmi1蛋白表达，而MMC中几乎无表达。
MMC-Bmi1永生化鉴定分析结果参见图3。其中，图片A为qPCR检测tert基因表达水平结果，结果显示MMC-Bmi1端粒酶催化组分tert的基因表达水平较MMC显著增高。图片B、图品C、图片D分别为第5代MMC、第10代和第50代的MMC-Bmi1光镜结果(100x)，显示不同时期的细胞形态无显著改变。第5代的MMC和第30代的MMC-Bmi1连续培养14d，蛋白印迹检测其中细胞衰老相关蛋白p16INK4a和p27的水平，结果参见图片E，显示MMC衰老相关蛋白p16INK4a和p27的水平显著较高；SA-βGel染色检测βGel水平，结果参见图片F和图片G(200x)，显示MMC中βGel水平显著高于MMC-Bmi1。
综合以上结果，MMC-Bmi1为永生化细胞，可稳定传代，衰老速度显著减慢。
3、MMC-Bmi1胚肾标志物鉴定
有限稀释法挑取MMC-Bmi1单克隆，进行胚肾标志物鉴定。图4中的图片A-图片D显示有限稀释法挑取单克隆后第1、3、6天细胞生长状况(100x)及单克隆纯化的MMC-Bmi1细胞形态，光镜结果显示细胞呈现均一的长梭形(200x)。
细胞免疫荧光检测MMC-Bmi1中后肾间充质标志物Six2、Pax2、Gdnf、Vimentin和E-cadherin的表达，结果参见图4中的图片E-图片I(400x)，这些图片每列分别为Six2、Pax2、Gdnf、Vimentin和E-cadherin的免疫荧光染色，及其对应的细胞核和融合后的情况，结果显示，MMC-Bmi1表达后肾间充质标志物six2、pax2和gdnf，表达间充质标志物vimentin，不表达上皮标志物E-cadherin。
以上结果提示，MMC-Bmi1保留了后肾间充质细胞的蛋白标志物，即MMC-Bmi1为永生化的后肾间充质细胞。
4、MMC-Bmi1间充质干细胞特性鉴定
对MMC-Bmi1间充质干细胞特性进行鉴定，鉴定结果参见图5。其中，图片A为RT-PCR检测结果，显示MMC-Bmi1表达间充质干细胞表面分子CD44、CD73、CD90和CD105，几乎不表达单核/巨噬细胞表面分子CD11b、B细胞表面分子CD19和造血干细胞表面分子CD34、CD45。图片B(10x)和图片C(100x)结晶紫染色显示MMC-Bmi1具有显著的集落形成能力。图片D-图片G茜素红染色结果显示MMC-Bmi1具有成骨分化的潜能，图片D和图片F示在完全培养基中培养18d无钙结节形成，图片E和图片G示在成骨诱导培养基(α-MEM含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg/ml L-抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠和10nmol/L地塞米松)中培养18d可见明显的矿化钙结节形成，400x。
以上结果提示，MMC-Bmi1具有部分间充质干细胞特性，可能为后肾间充质干细胞。
5、MMC-Bmi1-4上皮分化能力鉴定
MMC-Bmi1接种至直径12mm的塑料盖玻片上，用含50ng/ml bFGF(basicfibroblast growth factor)和10ng/ml TGF-α(transforming growth factor-α)的诱导培养基持续培养，基础培养基组作为对照，期间每隔两天更换培养基。细胞免疫荧光染色检测上皮标志物E-cadherin的表达。
图6显示MMC-Bmi1上皮分化能力鉴定结果。其中，图片A的左图光镜结果显示，基础培养基条件下，细胞形态呈现纤维样(200x)；图片A的右图光镜结果显示，诱导培养基连续培养10天，部分细胞形态有纤维样变为铺路石样(200x)。图片B-图片D的左图细胞免疫荧光结果显示，基础培养条件下，细胞不表达上皮标志物E-cadherin(400x)；图片B-图片D的右图细胞免疫荧光结果显示，诱导培养基培养10天，部分细胞开始表达上皮标志物E-cadherin(400x)。
以上结果显示，诱导培养基培养10d可见部分细胞有纤维样变为铺路石样，且开始表达E-cadherin，提示MMC-Bmi1保持原代细胞的上皮分化潜能。
6、MMC-Bmi的应用
利用transwell共培养体系将MMC-Bmi1与人牙周膜干细胞(PDLSC)共培养，检测PDLSC细胞碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨关键转录因子Runx2基因表达水平。
检测结果参见图7，结果发现，共培养7天后，PDLSC细胞碱性磷酸酶(ALP)活性显著增高(图7中的图片A)。图7中的图片B显示qPCR检测PDLSCs细胞成骨转录因子Runx2基因表达水平结果，显示与后肾间充质细胞共培养14d，PDLSCs细胞成骨转录因子Runx2基因表达水平显著增加。图7中的图片C-图片E为茜素红染色检测结果(200x)，显示与后肾间充质细胞共培养21d，PDLSCs钙结节形成的数量显著增加。
以上结果提示永生化的后肾间充质细胞系MMC-Bmi1可以促进人牙周膜干细胞成骨分化。
最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围当中。

Claims (8)

1.一种后肾间充质细胞系在体外提高人牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性、增加人牙周膜干细胞成骨转录因子Runx2基因表达水平、和/或促进人牙周膜干细胞钙结节形成中的应用，所述后肾间充质细胞系中Bmi1基因或蛋白过表达。
2.一种后肾间充质细胞系在体外促进人牙周膜干细胞成骨分化中的应用，所述后肾间充质细胞系中Bmi1基因或蛋白过表达。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述后肾间充质细胞系是来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞经过表达Bmi1基因或蛋白而得到的。
4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述动物为中国实验用小型猪。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述后肾间充质细胞系为永生化细胞。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述后肾间充质细胞系为six2、pax2、gdnf、vimentin阳性，E-cadherin阴性的后肾间充质细胞，表达CD44、CD73、CD90和CD105。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述后肾间充质细胞系具有向成骨细胞、上皮细胞分化的能力。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述后肾间充质细胞系是按照以下方法制备得到的：
通过慢病毒转染方式使来自受孕动物胚胎或出生两周龄以内动物肾脏生肾区的原代胚肾细胞过表达Bmi1基因或蛋白，制得过表达Bmi1的所述后肾间充质细胞系。
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