KR100844971B1 - Ｂｍｉ-1을 이용한 아스트로사이트의 신경줄기세포로의역분화 조성물 및 이를 이용한 역분화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Bmi-1을 이용하여 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화 유도하는 조성물과 이를 이용한 역분화 방법에 관한 것으로, 상기 역분화된 신경줄기세포는 아스트로사이트, 뉴런 및 올리고덴드로사이트로의 분화능을 가진다.

Bmi-1, 아스트로사이트(astrocyte), 신경줄기세포(neural stem cell), 역분화 (de-differentiation)

Description

Ｂｍｉ-1을 이용한 아스트로사이트의 신경줄기세포로의 역분화 조성물 및 이를 이용한 역분화 방법{a composition for de-differentiating astrocytes into neural stem cell comprising human Bmi-1 protein or a nucleic acid encoding and the same and a process of de-differentiation using said composition}

도 1은 Bmi-1 유전자에 의해 p16^Ink4a와 p19^Arf의 발현을 감소시켜 아스트로사이트의 성장속도를 증가시킨 결과이다.

도 1a는 면역세포화학법(Immunocytochemistry)을 통해 마우스에서 분리한 아스트로사이트와 Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트를 아스트로사이트 특이적인 마커(GFAP, S100β)로 확인한 결과이다. 왼쪽은 마우스에서 분리한 아스트로사이트이고, 오른쪽은 Bmi-1유전자가 과발현된 아스트로사이트이다.

도 1b는 웨스턴 블랏 방법(western blot analysis)을 통해 Bmi-1유전자가 과발현된 것을 확인하고, 타겟 유전자인 p16^Ink4a와 p19^Arf의 발현이 Bmi-1유전자에 의해 감소하는 것을 확인한 것이다. α-튜불린(α-tubulin)은 동량을 로딩(loading)한 것을 나타낸다.

도 1c는 벡터(Vector)만 도입한 아스트로사이트(대조구)와 Bmi-1 유전자가 과발현 된 아스트로사이트의 성장속도를 비교한 결과이다.

도 2는 Bmi-1유전자가 과발현된 아스트로사이트가 in vitro에서 신경줄기세포-유사세포로 역분화가 유도되는 것을 보인다.

도 2a는 역분화 유도 과정을 보여주는 결과로, 도 2a의 a-c는 벡터(Vector)만 도입한 아스트로사이트(대조구), d-f는 Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트를 신경줄기세포 배양액에서 배양한 결과이다. g는 신경줄기세포, h는 Bmi-1유전자가 과발현된 세포이다.

도 2b는 Bmi-1이 과발현된 아스트로사이트의 역분화가 성장 인자에 의존적(growth factor dependent)인지 여부를 확인하기 위해 실험한 결과이다(N2: N2 배양액만, N2+EGF: N2 배양액에 EGF첨가, N2+bFGF: N2 배양액에 bFGF첨가, N2+bFGF+EGF: N2배양액에 bFGF 및 EGF첨가).

도 2c는 Bmi-1 유전자를 과발현시킨 아스트로사이트를 역분화시킨 신경줄기세포-유사세포(NSCLCs ; neural stem cell-like cells)의 자가재생(self-renewal)능력의 유지가 bFGF에 의존적인지 여부를 확인한 결과이다.

도 2d는 Bmi-1을 과발현시킨 아스트로사이트를 역분화시키는 과정에 FGF 신호 경로(signalling pathway)가 관여하는지를 확인하기 위해서 Bmi-1과발현된 세포를 single cell로 만들어서 신경줄기세포 배양액에 여러 가지 저해제(inhibitor)를 처리하였을 때, 역분화가 유도되는지를 확인한 결과이다. FGF 신호 경로(signalling pathway)에 관여하는 인자 (factor) 중에 몇 가지의 인자를 저해(inhibition)했을 때, 신경구(neurospheres)가 형성되지 않는지를 확인한 결과이다.

도 2e는 Bmi-1을 과발현시킨 아스트로사이트를 역분화시킨 신경줄기세포-유사세포가 신경줄기세포와 동일한 성격을 가지는지를 면역세포화학법(Immunocytochemistry)으로 확인한 결과이다. Nestin, Sox2, CD133은 아스트로사이트 특이적 마커, Ki-67는 증식 마커(proliferation marker), 도 2e의 a-d는 신경줄기세포(NSCs), e-h는 신경줄기세포-유사세포(NSCLCs)를 나타낸다.

도 2f는 도 2e에서 확인한 마커를 RT-PCR 방법을 통해 확인한 결과이다. 신경줄기세포-유사세포에서는 신경줄기세포와 같이 Nestin, Sox2가 발현되고, Vector만 도입한 또는 Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트에서는 발현되지 않는다(vector: astrocyte-pBabe puro, NSC: neural stem cell, Bmi-1:astrocyte-pBabe puro Bmi-1, Bmi-1 sphere: NSCLCs: neural stem cell-like cell).

도 3은 신경줄기세포-유사세포(NSCLCs)가 신경줄기세포(NSCs)처럼 다분화능(multipotency)을 가지고 있는지를 실험실 내 분화(in vitro differentiation)실험을 통해 확인한 결과이다.

도 3a는 신경줄기세포 (NSCs)와 신경줄기세포-유사세포(NSCLCs)를 아스트로사이트 (astrocyte)로 분화시킨 후, 면역세포화학법 (Immunocytochemistry)으로 확인한 결과이다. 도 3a의 a,c는 신경줄기세포, b,d는 신경줄기세포-유사세포로, 아스트로사이트 특이적인 마커인 GFAP와 S100β의 발현을 나타낸다.

도 3b는 신경줄기세포(NSCs)와 신경줄기세포-유사세포(NSCLCs)를 뉴런으로 분화시 킨 후, 특이적인 마커(Tuj1, Map2, TH)를 면역세포화학법(Immunocytochemistry)으로 확인한 결과이다. 도 3b의 a,c-e는 신경줄기세포, b,f-h는 신경줄기세포와 같은 세포를 분화시킨 후 확인한 결과이다.

도 3c는 신경줄기세포와 신경줄기세포-유사세포(NSCLCs)를 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte)로 분화시킨 후, 특이적인 마커 (O1,O4,CNPase)를 면역세포화학법으로 확인한 결과이다. 도 3c의 a-c, g-i는 신경줄기세포, d-f, j-l는 신경줄기세포-유사세포를 분화시킨 후 확인한 결과이다.

도 4는 역분화과정이 Bmi-1유전자에 의존적인(dependent)지 여부를 확인하기 위해 실험한 결과이다.

도 4a는 유도가능 벡터(inducible vector)인 pBI-Bmi-1-EGFP와 pBabe puro rTTA를 함께 감염시킨 아스트로사이트에서 Bmi-1의 발현을 확인한 결과이다. 독시사이클린(Doxycycline) 1μg/ml로 Bmi-1유전자의 발현을 유도(induction)할 수 있고, 독시사이클린(doxycycline; DOX)이 있을 때와 없을 때의 Bmi-1의 발현의 차이를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과이다.

도 4b는 신경줄기세포의 배양액으로 바꾸었을 때, 독시사이클린이 있을 때와 없을 때를 비교한 결과이다.

도 4c는 신경줄기세포의 배양액으로 바꾸고, 독시사이클린을 첨가하였을 때, 신경줄기세포와 같은 모양의 세포가 만들어지고, GFP가 발현되는 것을 확인한 결과이다. 도 4c-a는 신경줄기세포와 같은 모양의 세포의 사진이고, 도 4c-b는 이 세포의 GFP발현을 확인한 결과이다 또한, 4c-c는 신경줄기세포의 마커가 발현되는 것을 면역화학염색법으로 확인한 결과이다.

도 4d는 도 4c에서 확인한 세포가 분화능력이 있는지를 확인한 결과이다. 도 4d의 a,b는 아스트로사이트, c-e는 뉴런, f,g는 올리고덴드로사이트로의 분화를 유도한 후, 면역화학염색법으로 각각의 특이적인 마커를 확인한 결과이다.

도 4e는 생체 내(in vivo)에서 분화능력이 있는지를 확인한 결과이다. 6주령의 누드 마우스(nude mouse)에 독시사이클린이 첨가된 신경줄기세포의 배양액에서 배양한 신경줄기세포-유사세포를 피하주사(subcutaneous injection)하고, 2주 후에 조직을 고정(fixation)하여, 각각의 분화 마커를 사용하여 확인한 결과이다.

도 5는 HDAC 저해제(inhibitor)에 의해 Bmi-1 유전자에 의한 작용이 저해(inhibition)되는지를 확인한 결과이다.

도 5a-f는 TSA (Trichostatin A)를 처리하면서 Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트의 성장 속도(growth rate)와 역분화 여부를 확인한 결과이다.

도 5a는 Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트에 TSA를 처리하였을 때, 성장 속도가 저하된다는 것을 나타내고, 도 5b는 3일동안 처리한 후의 세포사진이고, 5B의 가장 오른쪽 사진은 100ng/ml처리한 후에 SA-β-갈락토시다아제 분석(SA-β-galactosidase assay)을 하여 노화(senescence)여부를 확인한 결과를 나타내는 세포 사진이다. 도 5c는 각각의 농도에서의 단백질 발현 차이를 나타내고, 도 5d는 역분화과정에 처리하였을 때, 신경구가 형성되는지 여부를 확인한 결과이다. 도 5e 는 도 5d에서 확인한 샘플에서 추출한 RNA 수준(level)에서 신경줄기세포의 마커인 nestin과 sox2의 발현이 줄어드는 것을 나타낸다. 또한, 도 5f에서는 100개의 세포를 신경줄기세포 배양조건과 같은 배양액에 TSA를 농도별로 처리하면서 2주간 배양하고, 신경구가 형성되는지 여부를 확인한 결과를 나타낸다.

도 5g-j는 Bmi-1유전자가 과발현된 아스트로사이트에 VPA (Valproic acid)를 처리한 결과이다. 도 5g는 VPA를 농도별로 처리하였을 때, 아스트로사이트의 성장속도의 차이를 보여주고, 도 5h는 신경줄기세포의 배양액에서 3일동안 처리한 후의 세포의 모양을 보여준다. 도 5i는 도 5h에서 확인한 샘플에서 추출한 RNA에서 신경줄기세포의 마커인 nestin과 sox2의 발현이 줄어드는 것을 나타낸다. 또한, 도 5j에서는 Bmi-1이 과발현된 아스트로사이트 세포 100개를 신경줄기세포의 배양액과 VPA를 농도별로 처리한 배양액에서 2주간 배양을 하였을 때, 신경구가 형성되는 지 여부를 확인한 결과이다.

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신경줄기세포(Neural stem cells: NSCs)는 신경계에 존재하는 전구세포(progenitor cell)의 서브타입(subtype)으로 아스트로사이트(astrocytes), 올리고덴드로사이트(oligodendrocytes), 뉴런(neurons)으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 중추신경계(Central nervous system: CNS)와 말초신경계(peripheral nervous system: PNS)에서 분리하여 다세포 신경구(Multicellular neurospheres)를 만들 수 있고 이 세포가 각각의 조건에서 아교 계통(glial lineage)과 신경 계통(neural lineage)으로 분화하게 된다(Sally Temple et al. 2001). 이 신경줄기세포는 난치병의 치료에 응용되어 현재 세포치료의 한 가지 방법으로 연구되고 있다. 이러한 신경줄기세포는 성체줄기세포의 하나로 윤리적인 문제가 거의 없기 때문에 많이 연구되고 있는 실정이다. 최근에 역분화에 관련된 연구가 진행되고 있는 상황에서 성체줄기세포의 중요성이 좀 더 강조되고 있다. 이러한 성체줄기세포는 배아줄기 세포보다 얻기 쉽지만 실제로 적용하기에 아직 어려운 부분이 많다. 또한 다른 사람의 성체줄기세포를 사용할 땐 면역거부 반응이란 문제도 제기될 수 있다. 따라서 자신의 세포를 이용하여 역분화를 유도할 경우 현재 제기되고 있는 문제를 해결 할 수 있다. 이와 같은 취지에서 이미 분화가 진행된 세포를 이용하여 역분화를 유도하는 부분이 중요하다. 현재 세포융합(cell fusion), 핵이식(Nuclear transfer)등의 방법을 이용하여 역분화를 유도하는 연구가 진행 중에 있고 또 다른 방법을 이용한 그룹으로 Alexis J (Lancet 2004)는 피부에서 분리한 세포를 신경줄기세포 배양 조건에서 배양했을 때 신경 줄기세포의 특성을 가지고 있다고 보고하였다. 또한, Toru K. (Genes & Development 2004)은 올리고덴드로사이트 전구체(oligodendrocyte precursors)를 신경줄기세포로 역분화시켰음을 보고하였다. 이 그룹은 2000년부터 이와 관련된 논문을 연구하여 발표하였고, 최근 2004년 논문에서 각 분화 단계에서 유전자의 발현이 크로마틴 리모델링(chromatin remodeling)과 히스톤 수식(histone modification)에 관련이 있다고 보고하였다.

본 발명에서는 기존의 여러 가지 방법의 문제점을 해결하고, 좀 더 사용하기에 적절한 방법을 확립하고자 하였다. NSCs의 특성을 조절하고 있는 전사 인자(transcription factor)중 하나를 선별하고 과발현을 유도하여 신경줄기세포(neural stem cell)로의 분화를 연구하였다. 발명자가 선별한 polycomb 그룹의 Bmi-1 유전자는 히스톤 수식(histone modification)과 세포주식 조절자(cell cycle regulators)를 조절하는 단백질 중 하나를 코딩하는 유전자이다(Jan W. et al. 1999). cdkn2a/INK4A locus는 Bmi-1 유전자의 타겟으로 알려져 있으며 Bmi-1 유전자는 이러한 타겟 유전자를 전사과정에서 억제하는 작용을 한다고 알려져 있다. 최근에 Bmi-1 유전자는 신경줄기세포(neural stem cell)에서 발현되고 있고, 신경줄기세포(neural stem cell)의 자가재생(self-renewal)을 유지시키는데 작용하고 있음이 보고되었다 (Anna V.M et al. 2003, 2005, In-Kyung Park et al. 2004).

이런 배경하에, 본 발명자들은 이미 분화된 마우스 아스트로사이트에 Bmi-1 유전자를 과발현시키면 자가재생능과 아스트로사이트(astrocyte), 뉴런(neuron), 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)로의 분화능을 가지는 신경줄기세포-유사세포(neural stem cell-like cell)로 역분화될 수 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 Bmi-1 단백질 또는 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 핵산을 포함하는 아스트로사이트(astrocyte)를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Bmi-1 단백질 또는 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 신경줄기세포를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 생산되어 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트로 분화능을 가지는 신경줄기세포를 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 Bmi-1 단백질 또는 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 핵산을 포함하는 아스트로사이트 (astrocyte)를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "신경줄기세포-유사세포(neural stem cell-like cells)"란 뉴런, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트 등의 세포로 분화될 수 있는 다분화능을 가지는 줄기세포 (multipotent stem cell)로, 체세포의 역분화에 의하여 기원한 신경줄기세포이다. 본 발명에서 신경줄기세포-유사세포는 신경줄기세포로 기술되기도 한다.

본 발명자는 아스트로사이트에서 Bmi-1 을 과발현시킬 경우, 이미 분화된 세포 타입인 아스트로사이트가 다분화능을 가지는 신경줄기세포-유사세포(multipotent neural stem-like cell)로 역분화 (de-differentiation)되는 것을 발견하였다.

본 발명의 Bmi-1은 단백질 또는 이의 단백질을 코딩하는 핵산의 형태로 제공된다.

본 발명의 조성물에 사용되는 Bmi-1은 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 Bmi-1을 포함하며, 바람직하게는 인간 Bmi-1 이다. 또한, 신경세포로의 역분화에 사용되는 본 발명의 Bmi-1 단백질은 이의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 Bmi-1 단백질의 변이체를 포함한다.

Bmi-1 단백질의 변이체란 Bmi-1의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있다. 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체이다

바람직하게는, Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산의 형태로 제공된다.

Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다.

상기한 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA 분자일 수 있다.

하나의 바람직한 양태에서, 본 발명에서 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물은 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드인 핵산을 포함하는 Bmi-1 단백질을 발현하는 벡터를 포함한다.

본 발명에서 용어,“벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어,“작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서 열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retrovirus), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, MLV-기반-바이러스 벡터 (Moloney leukemia virus based virus vector)로 푸로마이신에 대한 선별마커를 포함하는 pBabe puro 벡터와 GFP 마커를 포함하는 pBI-EGFP 벡터를 이용하였다.

Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 당 분야의 공지 방법, 예를 들어 벡터 형태의 네이키드 DNA로 세포내로 전달하거나(Wolff et al. Science,1990: Wolffet al. J Cell Sci. 103:1249-59, 1992), 리포좀(Liposome), 양이온성 고분자(Cationic polymer)등을 이용하여 세포내로 전달할 수 있다. 리포좀은 유전자 전달을 위하여 DOTMA나 DOTAP 등의 양이온성 인지질을 혼합하여 제조한 인지질 막으로, 양이온성의 리포좀과 음이온성의 핵산이 일정 비 율로 혼합하면 핵산-리포좀 복합체가 형성된다.

또 다른 바람직한 양태로서, 본 발명에서 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 조성물은 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드인 핵산을 포함하는 Bmi-1 단백질을 발현하는 바이러스를 포함한다.

본 발명에서 용어, “바이러스”는 Bmi-1 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 벡터를 패키징 세포로 형질전환 및 감염시켜 제작한, Bmi-1을 발현하는 바이러스를 의미한다.

본 발명의 Bmi-1 단백질을 발현하는 바이러스 제조에 사용될 수 있는 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 등을 포함하며 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 레트로바이러스이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, pBabe puro 벡터에 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 삽입하여 제조한 벡터(pBabe puro Bmi-1)를 광범위한 포유류 숙주세포에 감염이 가능한 고역가 바이러스를 생성하는 패키징 세포인 PT67 세포에 형질전환시켜 Bmi-1 단백질을 발현하는 바이러스를 제조하여 아스트로사이트를 감염시켰다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 아스트로사이트에 Bmi-1 단백질 또는 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 핵산을 처리하는 단계를 포함하는 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, (i) 아스트로사이트를 배지에서 배양하는 단계; (ii) Bmi-1 단백질 또는 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 핵산을 삽입한 벡터를 트렌스펙션시킨 패키징 세포로 감염시키는 단계; 및 (iii) 상기 감염시킨 아스트로사이트를 신경줄기세포 배양 조건과 동일한 배양조건에서 배양하여 신경줄기세포로 역분화를 유도하는 단계를 포함한다.

상기 방법의 (i) 단계에서 아스트로사이트를 배양하는 배지는 당해 분야에서 신경줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 또한, 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다. 바람직하게는 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor)를 포함하는 배지이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 마우스의 뇌(braion)에서 분리한 아스트로사이트를 트립신 처리하여 FBS(fetal bovine serum), 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민이 포함되어 있는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에서 배양하였다.

상기 방법의 (ii) 단계에서 처리되는 Bmi-1 단백질 또는 Bmi-1 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 핵산은 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 Bmi-1일 수 있으며, 야생형 및 변이체를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 Bmi-1(NCBI accession No. L13689)을 이용하였다.

상기 방법의 (iii) 단계의 신경줄기세포 배양 조건은 당해 분야에서 신경줄기세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 서는 두가지 방법을 사용하였다. 한가지 방법으로 세포를 플레이팅하고, 12시간 후에 인슐린, 아포-트랜스페린, 셀레늄, 프로게스테론, 페니실린/스트렙토마이신이 포함되어 있는 DMEM/F12 배지(N2)에 혈청 대체물인 B27과 인간 재조합 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) 가 첨가된 배지로 바꾸고, 매일 bFGF 처리를 하고 배지는 이틀에 한번 바꿔주면서 배양하였다. 또 다른 한가지 방법으로는 10% FBS, 1% 페니실린(Penicillin) 또는 스트렙토마이신(Streptomycin), 및 1% L-글루타민(L-glutamine)을 포함하는 성장배지(Growth medium) DMEM 에서 배양하던 세포를 trypinization한 후에 박테리아 배양 플레이트에 씨딩을 하고 상기와 같은 배지에서 배양하여 신경줄기세포로의 역분화를 유도하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 신경줄기세포에 관한 것이다.

본 발명의 역분화 방법으로 제조된 신경줄기세포는, 신경줄기세포 특이적인 마커인, Nestin, CD133, Sox2가 신경줄기세포와 같은 수준으로 발현하며 일반적인 신경줄기세포와 동일한 다분화능을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 역분화 방법으로 제조된 신경줄기세포는 자가재생 (self-renewal)의 특징을 가진다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 생산된 신경줄기세포를 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트로 분화시키는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 조성물과 방법에 따라 제조된 신경줄기세포를 당 분야에 알려진 통상적 인 아스트로사이트, 뉴런 또는 올리고덴드로사이트 분화 조건에서 분화를 유도할 경우, 각각의 세포로 분화가 유도되는 것을 각 세포 특이적인 마커의 발현으로 확인하였다.

아스트로사이트로의 분화유도를 위해서는 FBS가 포함된 DMEM에 인간 재조합 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor)와 EGF(Epidermal Growth Facor) 또는 랫 재조합 CNTF(recombinant rat ciliaryneurotrophic factor)를 첨가하여 배양할 수 있으며, 아스트로사이트 특이적 마커로 GFAP, S100β 등을 사용할 수 있다.

뉴런으로의 분화는 혈청 대체물인 B27이 포함되어 있는 N2 배양액에 인간 재조합 FGF 처리를 한 후, 몇일 동안은 FGF가 없는 배지에서 배양하여 유도할 수 있고, 다른 방법으로는 RA(retinoic acid)를 첨가하여 배양하거나, VPA(valproic acid)를 RA와 함께 첨가하여 배양하여 분화를 유도할 수 있다. 뉴런 특이적 마커로는 Tuj1, Map2, TH 등을 사용할 수 있다.

올리고덴드로사이트로의 분화는 혈청 대체물이 첨가된 B27이 첨가된 N2 배양액에 PDGF-AA(platelet derived growth factor-AA)와 T3(3,3,5-triiodo-L-thyronine) 및 인간 재조합 bFGF를 함께 첨가하여 배양하여 분화를 유도할 수 있다. 올리고덴드로사이트 특이적 마커로는 01, 04, CNPase 등을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 마우스 아스트로사이트 (mouse astrocyte)와 마우스 신경줄기세포 (mouse neural stem cell ) 배양

마우스 아스트로사이트(mouse astrocytes)는 신생 마우스(neonatal mouse, 1-5days)의 뇌(brain)에서 분리하여 적합한 배양 조건에서 배양하였다. 분리한 세포를 트립신(Gibco 0.05%)으로 처리한 후에 단세포(single cell)로 만들어서 FBS(HyClone) 10%, 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 1%, L-글루타민(L-glutamine) 1% (cambrex)가 포함되어 있는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM; high glucose, Hyclone))에서 배양하였다. 배양한 후 다음 날부터 배지 교환을 하였으며 1-3 계대(passage) 사이의 세포를 사용하였다. 아스트로사이트에서 특이적으로 발현되는 마커인 GFAP (Dako)를 면역세포화학법으로 확인하였다(도 1a 왼쪽).

<실시예 2> 레트로바이러스-매개 감염(Retroviral-mediated infection)

pBabe puro 벡터에 인간 Bmi-1(NCBI accession No. L13689)유전자를 삽입하여 제조한 pBabe puro Bmi-1(from Dr.G.P.Dimri, Evanston Northwestern Healthcare Research Institute, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, Evanston, IL 60201, USA)과 pBabe puro(대조구)를 PT67 팩키징 세포주(packaging cell line , Clontech)에 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen)을 사용하여 트랜스펙션(transfection)을 한 후 푸로마이신(puromycine, 3μg/ml)(BD science)로 선별하였다. PT67 팩키징 세포주는 광범위한 포유류 숙주세포에 감염이 가능한 고역가 virus를 생성하는 세포이다.

이와 같이 만들어진 세포주가 90%이상 되었을 때 상등액(supernatant)을 취하여 0.45μm(Millipore)로 필터링(filtering)을 하여 세포 파편 (cell debris)를 제거한 후에 폴리브렌(polybrene, 6μg/ml)(sigma)을 첨가하여 10시간 간격으로 분리한 마우스 아스트로사이트 세포에 두 번 감염시키고, 3-5일동안 푸로마이신(puromycine)을 0.5μg/ml로 처리하여 선별하였다.

<실시예 3> 웨스턴 블랏 분석 (Western blot analysis)과 반정량적인(semi-quantitative) PCR

실시예 2에서 선별한 세포에서 Bmi-1 유전자가 과발현된 것을 확인하기 위해서 웨스턴 블랏 분석 방법을 사용하였다. Bmi-1이 발현되고 있는 것을 확인하였고, 그 타겟 유전자인 p16^INK4a와 p19^Arf의 발현이 감소하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1b). 또한 이렇게 확인한 세포가 아스트로사이트의 성격을 유지하고 있는지 확인하기 위해서 면역세포화학법을 사용하였다. 아스트로사이트의 특이적인 마커인 S100β가 발현되고 있는 것을 확인하였고(도 1a의 오른쪽), 그 타겟유전자인 p16^INK4A 와 p19^Arf의 발현이 감소하고 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1b).

실시예 1에서 선별한 세포를 아이스-콜드 용해 버퍼(ice-cold cell lysis buffer)인 RIPA 버퍼 (proteinase inhibitor cocktail과 phosphatase inhibitor가 포함되어 있음)로 재부유(resuspend)한 후에 얼음(ice)에서 30분간 인큐베이션(incubation)하면서 보텍싱(vortexing)을 하였다. 14000rpm에서 30분간 원심분리(centrifugation)를 한 후 상층액을 얻어서 브래드포드 분석 시약(Bradford assay reagents. Bio-rad)으로 단백질 농도를 측정한 후 각 50μg-100μg씩 10% 혹은 4-12% 미리제조된(precasted) SDS-PAGE NuPAGE 겔 (Invitrogen)에 러닝(running) 하였다. 이를 PVDF 막(membrane)(Millipore)에 트랜스퍼(transfer) 한 후, 3-5% 탈지우유(Skimmed milk)가 포함된 TBST (Tris buffered saline with 0.1% Tween 20)로 블로킹(blocking)을 하였다. 항-Bmi-1 (Upstate Biotechnology), 항-p16^INK4A (Santa Cruz Biotechnology), 항-p19^ARF (Novous Biologies), 항-아세틸 H3(anti-acetyl H3, Cell signalling), 항-p21^WAF1 (Neomarker), α-튜불린(Sigma)을 사용하여 4℃에서 하룻밤 쉐이킹(shaking overnight)을 한 후에 상온에서 1시간동안 호세라디쉬 퍼옥시다아제-접합 항-2차 IgG(horseradish peroxidase-conjugated anti-secondary IgG, Invitrogen)로 반응시키고, 수퍼 시그날 웨스트 피코 화학발광 기질 키트(Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate kit, Pierce)로 검출하였다.

각각의 세포에서 트리졸(Trizol, Invitrogen)을 사용하여, RNA를 분리한 후, 역전사(Reverse-transcription: RT)는 전체 RNA 의 500 ng, 올리고(oligo) d(T)_12-18 프라이머 (Invitrogen), 수퍼스크립타아제 Ⅱ 리버스 트랜스크립타아제 (superscriptase Ⅱ reverse transcriptase, Invitrogen)를 사용하여 cDNA를 만들었다. RT-PCR은 cDNA 1㎕, 각각의 프라이머 10 pmol, 그리고 PCR 프리믹스(premix)(1U Tag DNA polymerase, 250 μM dNTPs, 10 mM Tris-HCl, 40 mM KCl and 1.5 mM MgCl₂, Bioneer, Korea)을 사용하여 실시하였다. 마우스 GAPDH, Nestin, Sox2를 대조구와 각각의 마커로 사용하였고, 각각의 프라이머 조건에 따라 PCR 증폭하였다. 사용한 프라이머 서열은 서열번호 1 내지 6과 같다.

<실시예 4> Bmi-1이 과발현된 아스트로사이트의 성장속도 측정

과발현 유무를 확인한 세포의 성장속도의 차이를 보기 위해서 성장 곡선 분석(growth curve analysis)을 하였다. 벡터(대조구)와 Bmi-1이 과발현된 아스트로사이트의 성장속도를 측정하기 위해서 2.5-5.0× 10⁴cell/6 웰 플레이트(well plate)를 플레이팅(plating)한 후에, 0.01% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 사용하여 5일동안 매일 관찰하고 염색(stain)을 하여 분석을 하였다. 크리스탈 바이올렛 염색(Crystal violet stain)의 추출물(extract)은 10% 아세트산(acetic acid)을 사용하여 분광광도계(spectrophotometer; 600nm)에서 값을 측정하고 상대적인 성장속도를 비교하였다. 또한, 히스톤 디아세릴라아제 저해제(histone deacerylase inhibitor)를 처리하였을 때, 성장속도가 떨어지는 시점에서 노화(senescence)여부를 확인하기 위해서 SA-β-갈락토시다아세 분석(galactosidase assay)방법을 사용하였다. 대조군으로 사용된 신경줄기세포(neural stem cells)는 E13.5일령의 마우스에서 분리하여 인슐린(Insulin, sigma), 아포-트랜스페린(apo-transferrin, sigma), 셀레니움(selenium, sigma), 프로게스테론(progesteron, sigma), 페니실린/스토렙토마이신(penicillin/streptomycin, cambrex)가 포함되어 있는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium/F12, DMEM/F12, Gibco) 배지(N2)에 혈청-대체물(serum-replacement)인 B27 (Gibco)과 인간 재조합 bFGF(human recombinant basic Fibroblast Growth Factor), 인간 재조합 EGF(human recombinant Epidermal Growth Factor, R&D)를 더 첨가하여 배양하였다. 피펫팅(Pipetting)을 하여 계대를 하면서 배양을 하고, 서브스피어 분석(subsphere assay)을 통해 스피어의 성장(sphere growth)도 측정해보았다. 100개의 세포를 12 웰 플레이트(well plate)에 씨딩(seeding)을 하고 14일 후에 스피어(sphere)수와 전체 세포의 수를 측정하여 확인하였다.

도 1c는 벡터와 Bmi-1이 과발현된 아스트로사이트의 성장속도를 비교한 결과로, Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트가 벡터에 비해 성장속도가 차이나게 증가하고 있는 것을 알 수 있었다.

<실시예 5> 역분화 (de-differentiation) 유도

Bmi-1 유전자가 과발현된 세포와 그에 해당하는 벡터를 감염시킨 세포를 신경줄기세포 배양 조건과 동일한 조건에서 배양하면서 역분화를 유도하였다. 신경줄 기세포의 배양액은 인슐린(Insulin, Sigma), 아포-트랜스페린(apo-transferrin, Sigma), 셀레늄(selenium, Sigma), 프로게스테론(progesteron, Sigma), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, cambrex)이 포함되어 있는 둘베코 변형 이글 배지/F12(Dulbecco's modified Eagle's medium/F12, DMEM/F12, Gibco)(N2)에 혈청-대체물(serum-replacement)인 B27 (Gibco)과 인간 재조합 bFGF(human recombinant basic Fibroblast Growth Factor , R&D systems)가 첨가된 배지를 사용하였다. bFGF 처리는 매일 하였고, Bmi-1유전자가 과발현된 세포와 이의 대조구인 벡터만 있는 세포를 2500-5000 세포/cm₂만큼 6 웰 플레이트(well plate)에 플레이팅(plating)하였다. 플레이팅 12시간 후에 신경줄기세포 배양액으로 바꿔준 후, 세포 모양의 변화를 관찰하였다.

신경줄기세포(Neural stem cells) 배양 조건과 동일한 배양 조건으로, 두 가지 방법을 사용하였는데, 그 중 하나는 6 웰 플레이트에 1× 10⁵의 세포를 플레이팅을 한 후, 12시간 후에, 신경줄기세포의 배양액으로 바꿔준 후, 매일 bFGF를 처리하고, 배지는 이틀에 한 번 바꿔주면서 배양하는 것이다. 역분화 유도 과정 결과는 도 2a에서 나타내었다. 도 2a의 a-c는 벡터, d-f는 Bmi-1유전자가 과발현된 아스트로사이트를 신경줄기세포 배양액에서 배양한 결과이다. 동일한 수의 세포를 부착(attach)시킨 후, 12시간 후에 안정이 되었을 때 신경줄기세포의 배양 조건으로 배양한 것으로, a,d는 부착 12시간 후; b,e는 3일 후; c,f는 6일 후의 세포의 모습 이다. 신경줄기세포의 배양액에서 배양을 시작한 지 3일 째에 Bmi-1유전자가 과발현된 세포에서 신경구(neurosphere)가 형성되려는 모습이었고, 6일 째는 신경구가 형성되어 벡터와 현저히 다른 모습을 보였다. 반면에 벡터만 감염시킨 세포는 거의 자라지 못하고, 신경구도 형성하지 못했다. 벡터의 세포는 노화(senescence)과정을 보이지만, Bmi-1유전자가 과발현된 세포는 신경줄기세포와 유사한 모습으로 변한 것을 볼 수가 있다. 도 2A에서 g는 신경줄기세포, h는 Bmi-1유전자가 과발현된 세포로 두 가지를 비교하였을 때, 거의 비슷한 모습을 보였다.

신경줄기세포(Neural stem cells) 배양 조건과 동일한 배양 조건으로, 또 다른 한 가지 방법은 10% FBS, 1% 페니실린 또는 스트렙토마이신, 및 1% L-글루타민을 포함하고 있는 성장배지(Growth medium)에서 배양하던 세포를 트리피니제이션(trypinization)한 후에 3× 10⁵씩 60mm 박테리아 배양 플레이트 (BD Bioscience)에 씨딩을 하여 인슐린(sigma), 아포-트랜스페린(sigma), 셀레늄(sigma), 프로게스테론(sigma), 페니실린/스트렙토마이신(cambrex)이 포함되어 있는 둘베코 변형 이글 배지/F12(DMEM/F12, Gibco)(N2)에 혈청-대체물인 B27 (Gibco)과 인간 재조합 bFGF(human recombinant basic Fibroblast Growth Factor, R&D)가 첨가된 배지에서 배양을 하는 것이다. 신경줄기세포와 같은 세포가 만들어진 후부터는 60mm 박테리아 플레이트에서 신경줄기세포 배양액에 bFGF와 EGF를 처리하면서 배양하였다.

이는 역분화 과정 중에 사용하는 bFGF가 필요한지 여부를 보기 위한 것으로 도 2b에서와 같이 여러 가지 조건을 달리하여 확인하였다. bFGF 단독으로 처리한 경우와 bFGF와 EGF를 함께 처리한 경우에만 신경구가 형성되었다.

역분화된 신경줄기세포-유사세포에 자가재생(self-renewal)능력이 유지되고 있는지를 확인하기 위하여 100개의 단일 세포(single cell)를 신경줄기세포의 배양액에서 배양하여 2차 구 형성(Secondary sphere formation)을 시도한 경우에도 도 2c에서와 같이 bFGF 혹은 bFGF와 EGF를 함께 처리한 경우에만 구(spheres)가 형성되었다. N2 배양액과 EGF가 첨가된 경우에는 구(spheres)가 형성되지 않았으나, bFGF 혹은 bFGF아 EGF를 함께 처리한 경우에는 12.3± 4.5, 15.6± 1.5개의 신경구(nuerospheres)가 형성되었다. 이러한 결과는 신경줄기세포의 기본 배양액에 bFGF가 필요함을 의미하는 것이다.

또한, 신경줄기세포와 역분화된 신경줄기세포-유사세포의 증식능(proliferative capacity)을 비교하기 위해 10000개의 single cell을 60mm 플레이트에서 14일동안 배양하여 형성된 2차 스피어(secondary spheres)의 전체 세포수(total cell number)를 계산하여 서브스피어 형성 분석(subsphere forming assay)을 한 결과 형성된 신경구의 전체 세포의 수가 180,000± 30,550 (NSCLCs), 160,667± 75,000 (NSCs)개로 더 증가했음을 확인하였다.

< 실시예 6> 면역세포화학법 ( Immunocytochemistry )과 RT - PCR 로 각각의 마커 확인

상기에서 만들어진 신경구(Neurosphere)가 신경줄기세포의 성격을 가지는지 확인해 보기 위하여, 신경구를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, EMS)로 1시간 동안 4℃에서 고정을 한 후 20% 수크로즈를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 쉐이킹(shaking overnight)하였다. 그 후 OCT 컴파운드(compound) (Tissue Tek, Sacura)로 8-웰 챔버 슬라이드(well chamber slide, Nunc)에 냉동보존(cryopreservation)을 하였다. 8-10 μm로 절단(section)을 한 후 염색을 하였다. 또한, 신경구를 PLO(poly-L-orthinine, sigma)와 fibronectin(sigma)로 미리 코팅한 플레이트에 플레이팅을 한 후에, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, EMS)를 20분동안 처리를 하여 고정을 한 후, 0.1% BSA(bovine serum albumine, sigma)이 포함된 PBS(Ca와 Mg가 포함되어 있습니다.)로 세척 한 후, 염색을 하였습니다. 두 가지 방법으로 고정을 한 세포를 아래와 같은 방법으로 블로킹, permeabilization과 항체 인큐베이션(antibodies incubation)을 하였다.

10% 정상 원숭이 혈청(Normal donkgey serum, Jackson Immunoresearch), 0.1% BSA (Sigma), 0.3% 트리톤 X-100 (Sigma)이 포함된 PBS로 블로킹을 한 후 항-nestin(Chemicon), 항-CD133 (MACS)(CD133은 surface marker이기 때문에, permeabilization시간을 10분정도로 제한하였다), 항-Sox2(Sigma)을 사용하여 4℃에서 하룻밤(overnight) 반응을 시킨 후에 상온에서 항-마우스-cy3 (Jackson Immunoresearch), 항-래빗-FITC (Molecular probe)로 반응을 시킨 후 마지막으로 DAPI(sigma)를 사용하여 핵염색(nuclear stain)을 하였다. 염색을 한 후에 Zeiss confocal(Carl Zeiss)로 확인을 하였다. 분화된 세포의 경우 위와 같은 방법으로 염색을 하였고, 이 때 사용한 항체는 항-GFAP (Dako), 항-S100β (Sigma), 항-β-튜불린 Ⅲ(Covance), 항-Map2a (Sigma), 항-TH (Chemicon), 항-NeuN (Chemicon), 항-O4, 항-O1, 항-A2B5 (R&D)였다.

면역세포화학법을 통해 신경줄기세포의 특이적인 마커를 확인한 결과, Nestin, Sox2, CD133 이 동일하게 발현되고, Nestin-양성 세포는 증식마커인 Ki-67도 함께 발현되었다(도 2e, 도2 e의 a-d;신경줄기세포, 도2 e의 e-h; 신경줄기세포-유사세포).

상기에서 확인한 마커를 RT-PCR 방법을 통하여 확인한 결과는 도 2f에서 보였다. 신경줄기세포-유사세포(Bmi1-sphere)에서는 신경줄기세포(NSC)와 같이 Nestin, Sox2가 발현된 반면, 벡터(Vector) 혹은 Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트(Bmi1)에서는 발현되지 않았다.

< 실시예 7> 인 비트로 분화 ( In vitro differentiation )

신경줄기세포-유사세포가 신경줄기세포와 같이 다분화능(multipotency)을 가지는지 여부를 확인하기 위하여, 배양하고 있던 신경구를 PLO(poly-L-ornithinte, Sigma)와 라미닌(laminin) 혹은 피브로넥틴(fibronectin, sigma)으로 코팅(coating)을 한 플레이트에서 아래와 같은 분화 조건으로 배양을 하였다.

아스트로사이트(astrocyte)로의 분화는 10% FBS (Hyclone)이 포함된 DMEM (Hyclone, high glucose)에 인간 재조합 bFGF와 EGF (R&D systems)를 첨가하거나 CNTF (recombinant rat ciliaryneurotrophic factor)(upstate)에서 5-7일 동안 배양하여 분화를 유도하였다. 아스트로사이트로 분화를 확인하는 마커로 GFAP, S100β를 사용하였다(도 3a, 도 3a의 a,c; 신경줄기세포, 도 3a의 b,d; 신경줄기세포-유사세포).

뉴런 (neuron)으로의 분화는 혈청-대체물인 B27 (Gibco)이 포함되어 있는 N2 배양액에 인간 재조합 FGF를 4일 동안 처리를 한 후, 8일 동안은 FGF를 없는 배지에서 배양을 하였다. 다른 방법으로는 RA (retinoic acid, sigma)를 1-10μM으로 첨가하여 7-14일 동안 배양을 하였다. 또 다른 방법으로 사용한 것은 1-10mM의 농도의 VPA (valproic acid, sigma)를 1-10μM 농도의 RA (retinoic acid, sigma)과 함께 첨가하여 7-14일 동안 배양하여 분화를 유도하였다. 뉴런으로 분화를 확인하는 마커로 βⅢ-튜불린(Tuj1), Map2a, TH를 사용하였다(도 3b, 도 3b의 a,c-e; 신경줄기세포,도 3b의 b,f-h; 신경줄기세포-유사세포).

올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte)로의 분화는 혈청 대체물인 B27이 첨가된 N2 배양액에 PDGF-AA (platelet derived growth factor-AA, R&D)와 T3 (3,3,5-triiodo-L-thyronine, sigma), 인간 재조합 bFGF와 EGF (R&D)를 함께 첨가 하여 배양하다가 상기 첨가된 성분들을 차례로 하나씩 제거한 배양액으로 교환하면서 20일 동안 배양하여 분화를 유도하였다. 올리고덴드로사이트로 분화를 확인하는 마커로 04, CNPase, 01을 사용하였다(도 3c, 도 3c의 a-c,g-i; 신경줄기세포, 도 3c의 d-f,j-l; 신경줄기세포-유사세포).

위에서 언급한 조건에서 배양을 하고, 각각의 분화된 세포의 모양을 관찰하면서, 각각의 분화 마커로 사용되는 항체를 사용하여 면역세포화학법(immunocytochemistry)으로 확인한 결과 신경줄기세포의 특징과 같이 세가지로의 분화가 신경줄기세포-유사세포(NSCLCs)에서도 동일하게 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

< 실시예 8> Bmi -1 유전자가 역분화에 미치는 영향 확인

pBI-Bmi-1-EGFP와 pBabe puro rTTA를 함께 트렌스펙션하고 독시사이클린(doxycycline)으로 Bmi-1 유전자의 발현을 유도한 세포를 신경줄기세포 배양액에서 배양하였다.

독시사이클린-유도가능한(Doxycycline-inducible) pBI-Bmi-1-EGFP 벡터는 pBI-EGFP (BD Bioscience) 벡터를 pvuⅡ로 다이제스쳔(digestion)한 후, 인간 Bmi-1유전자를 라이게이션(ligation)하여 클로닝(cloning)을 하였다. 이렇게 만들어진 벡터(vector)와 pBabe puro rTTA를 함께 아스트로사이트에 트랜스펙션을 하고, 푸 로마이신(puromycine) 0.5μg/ml로 선별을 하면서 독시사이클린 (Dox) 1μg/ml처리를 하고 GFP로 발현을 확인하였다(도 4a). 독시사이클린으로 Bmi-1 유전자의 발현을 유도(Dox +)할 수 있고, 독시사이클린이 없을 때(Dox -)는 Bmi-1 유전자가 발현되지 않음을 알 수 있다. 신경줄기세포의 배양액으로 바꾸었을 때, 독시사이클린이 있을 때, 신경구가 형성되고, 없을 때는 신경구가 형성되지 않는 것을 확인하였다(도 4b). 이는 Bmi-1 유전자가 아스트로사이트의 역분화를 유도하는 역할을 한다는 것을 의미한다.

Bmi-1 유전자의 발현이 유도된 세포를 독시사이클린이 첨가된 신경줄기세포의 배양액에서 배양하면, 신경줄기세포와 유사한 모양의 세포가 만들어 지고, GFP가 발현되고(도 4c), 신경줄기세포의 마커가 발현되었다(도 4c의 c)

독시사이클린이 첨가된 신경줄기세포의 배양액에서 배양한 신경줄기세포-유사세포의 분화를 유도한 후, 면역화학염색법으로 각각의 특이적 마커를 확인한 결과 각각 아스트로사이트(도 4d의 a,b), 뉴런(도 4d의 c-e), 올리고덴드로사이트(도 4d의 f,g)로 분화가 유도되었음을 확인하였다.

< 실시예 9> 생체 내 분화 ( In vivo differentiation )

독시사이클린이 첨가된 신경줄기세포의 배양액에서 배양한 신경줄기세포-유사세포를 6주령의 누드 마우스(nude mouse)의 피하조직에 주사(injection)하고 2주 후에 조직을 절제(section) 하여 각각의 분화 마커로 확인을 하였다. 면역세포화학법으로 분화마커를 염색을 하고, GFP로 머지(merge)하여 주사한 세포에 의해 분화가 되었는지를 확인한 결과 상기 세포는 마우스의 생체내(in vivo)에서도 분화능이 있음을 확인하였다(도 4e).

< 실시예 10> 생화학 저해제( Biochemical inhibitors ) 처리가 Bmi -1 유전자가 과발현된 아스트로사이트의 성장과 역분화에 미치는 영향 분석

히스톤 디아세틸라아제 저해제(Histone deacetylase(HDAC) inhibitor)에 속하는 VPA(Valproic acid, Sigma), TSA(Trichostatin A, Sigma)와 FGF 신호 경로(signal pathway)에 관여하고 있는 인자(factor)중에서 열쇠(key)가 되는 분자를m 저해(inhibition)하는 물질인 NL-71-101(Sigma), PD98059 (Calbiochem), Wortmannin (Sigma) 및 U0126(Promega)를 몇 가지 농도를 정하여, Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트의 성장 배지(Growth media, GM) 및 신경줄기세포-유사세포로 역분화 시키기 위한 신경줄기세포 배양액에 생화학 저해제처리를 한 경우, Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트 세포의 성장과 신경줄기세포로의 역분화에 미치는 영향을 분석하였다.

성장 배지에 처리를 한 경우는 적정량의 세포를 플레이팅한 후 3일동안 처리를 하면서 매일 0.01% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하고, 10% 아세트산으로 추출하여 상대적인 성장속도를 측정하였다. 또한, 신경줄기세포 배양액에 처리를 한 경우는 적정량의 세포를 플레이팅한 후에 처리를 하면서 역분화가 유도되는지를 확인해보았다. 다른 방법으로 12 웰 플레이트에 100cells/well 정도의 세포를 신경줄기세포 배양액으로 플레이팅하면서 위에 언급한 저해제를 처리해보았다. 처리 14일 후에 신경구가 형성되는지 여부를 관찰하였다.

그 결과, HDAC 저해제에 의해서 Bmi-1의 작용이 억제되고, 신경줄기세포로의 역분화도 이루어지지 않는 다는 것을 확인하였다(도 5). VPA(Valproic acid)와 TSA(Trichostatin A)를 처리한 결과 Bmi-1 유전자의 과발현이 유도된 세포의 성장속도가 감소하였고, 이를 신경줄기세포의 배양 조건에서 배양한 결과 역분화가 유도되지 않는 것을 관찰할 수 있었다. TSA를 20ng/ml 내지 100ng/ml 범위로 처리한 결과 농도가 높아질 수록 성장속도가 현저하게 떨어지는 것을 확인하였고(도 5a, 도 5b), 100ng/ml로 3일간 처리한 후 SA-β-갈락토시다아제 분석(SA-β-galactosidase assay)을 했을 때, 양성(positive)을 나타내는 세포들이 있음을 관찰할 수 있었다(도 5b에서 화살표). 또한, TSA는 히스톤 디아세틸라이제 저해제(histone deacetylase inhibitor)로 작용하므로, TSA의 처리에 의해서 히스톤 H3가 아세틸화(acetylation)되었음을 확인하였고,이 때 p16과 p21의 발현도 높아지고, TSA 처리농도가 높아질수록 단백질의 발현이 높아졌다(도 5c). 이와 같은 처리를 신경줄기세포로의 역분화 유도와 함께 한 결과 TSA 100ng/ml로 처리한 경우에는 신경구도 형성되지 않았고(도 5d), nestin과 sox2의 발현도 대조구에 비해 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 5e). 또한, Bmi-1 유전자의 과발현이 유도된 100개의 아스트로사이트 세포에 TSA를 첨가하고 신경줄기세포 배양조건에서 2주간 배양하고, 신경구가 형성되는지 관찰한 결과, 처리농도가 높아질 수록 신경구가 형성이 현저하게 저해되는 것을 확인하였다(도 5f).

또한, Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트에 각각 1mM, 5mM, 10mM VPA를 처리를 한 경우에도, 처리농도가 높아질수록 Bmi-1 유전자의 과발현이 유도된 세포의 성장속도가 현저히 떨어지고(도 5g), 역분화를 위해 신경줄기세포의 배양액으로 배양하는 경우에도 VPA 처리농도가 높아질 수록, 신경구가 형성되지 않는 것을 확인하였다(도 5j). 도 5h는 Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트를 신경줄기세포의 배양약에서 VPA를 3일동안 처리한 후의 세포의 모양을 보여준다. 또한, nestin 과 sox2의 발현도 VPA 처리의 경우 대조구에 비해 감소하는 것을 확인하였다(도 5i). 또한, Bmi-1 유전자의 과발현이 유도된 100개의 아스트로사이트 세포에 VPA를 첨가하고 신경줄기세포 배양조건에서 2주간 배양하고, 신경구가 형성되는지 관찰한 결과, 처리농도가 높아질 수록 신경구가 형성이 현저하게 저해되는 것을 확인하였다(도 5j).

또한, bFGF에 의해 신경줄기세포-유사세포로 역분화가 유도되는 것을 확인하고 그의 관련 경로(pathway)에 대하여 실험해 보았다. bFGF에 의해 활성화 되는 경로인 P13K-AKT, MEK1/MAPK 경로가 신경줄기세포로의 역분화 기작에 관련이 있는지 확인해 보았다. P13K-inhibitor(wortmannin), AKT-inhibitor(NL-71-101), EPK- inhibitor(PD98059), MEK1-inhibitor(U0126)을 Bmi-1 유전자가 과발현된 아스트로사이트의 역분화 유도를 위한 신경줄기세포 배양액에 1μM, 10μM로 처리하였을 때, 1μM에서는 대조군과 비교하였을 때, 크게 차이나지 않았으나, 10μM에서는 신경구가 거의 형성되지 않는 것을 볼 수 있었다. 그러나 PD98059를 처리한 경우는 대조군에 비해 신경구가 형성되는 수가 현저하게 차이나지 않는 것을 확인하였다(도 2d).

따라서, HDAC 저해제가 신경줄기세포-유사세포의 증식(proliferation), 역분화(dedifferentiation), 유지(maintenance)를 감소시키는 작용을 함을 알 수 있다.

상기에서 기술한 바와 같이, Bmi-1 을 이용하여 아스트로사이트를 신경줄기세포로 역분화를 유도할 수 있으며, 역분화된 신경줄기세포는 다양한 질병치료에 사용될 수 있다.

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Claims (17)

1. 인간 Bmi-1(B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1) 단백질 또는 인간 Bmi-1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 포함하는 아스트로사이트(astrocyte)를 신경줄기세포로의 역분화를 유도하는 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인간 Bmi-1 단백질을 코딩하는 핵산분자가 삽입된 Bmi-1 단백질 발현 벡터를 포함하는 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 pBabe puro 벡터에 인간 Bmi-1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 삽입하여 제조한 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인간 Bmi-1 단백질을 코딩하는 핵산분자가 도입되어 Bmi-1 단백질을 발현하는 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 바이러스는 인간 Bmi-1 단백질을 코딩하는 핵산분자가 삽입된 Bmi-1 단백질 발현 벡터를 PT67 패키징 세포주(packaging cell line)에 트랜스펙션(transfection)하여 생성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 역분화된 신경줄기세포는 아스트로사이트(astrocyte), 뉴런(neuron) 또는 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)로의 다분화능(multipotency)을 가지는 신경줄기세포인 조성물.
7. (i) 아스트로사이트를 배지에서 배양하는 단계, (ii) 상기 배양한 아스트로사이트를 인간 Bmi-1 유전자를 삽입한 벡터를 트랜스펙션시킨 패키징 세포로 감염시키는 단계, (iii) 상기 감염시킨 아스트로사이트를 신경줄기세포 배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 아스트로사이트를 신경줄기세포로의 역분화를 유도하는 방법.
8. 제7항에 있어서, 단계(i)은 마우스의 뇌에서 아스트로사이트를 분리하여 트립신 처리 후 단세포(single cell)로 만들어서, FBS(fetal bovine serum), 페니실 린(penicillin) 또는 스트렙토마이신(streptomycin) 및 L-글루타민(L-glutamine)이 포함되어 있는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항에 있어서, 단계(ii)의 상기 벡터는 pBabe puro 벡터에 인간 Bmi-1 단백질을 코딩하는 핵산분자를 삽입하여 제조한 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제7항에 있어서, 단계(ii)의 상기 패키징 세포는 PT67 패키징 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제7항에 있어서, 단계(iii)의 신경줄기세포 배양조건은 세포를 플레이팅하여 배양 한 후 12시간 후, 인슐린(Insulin), 아포-트랜스페린(apo-transferrin), 셀레늄(selenium), 프로게스테론(progesteron), 및 페니실린 또는 스트렙토마이신이 포함되어 있는 둘베코 변형 이글 배지/F12(Dulbecco's modified Eagle's medium/F12)에 혈청-대체물(serum-replacement) B27과 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)가 첨가된 배지로 바꾸어준 후, 매일 bFGF 처리를 하고 배지를 2일에 한번씩 바꿔 주면서 배양하는 것인 방법.
12. 제7항에 있어서, 단계(iii)의 신경줄기세포 배양조건은 10% FBS, 1% 페니실린 또는 스트렙토마이신, 및 1% L-글루타민을 포함하고 있는 성장배지(Growth medium)에서 배양하던 세포를 트리피니제이션(trypinization)한 후에 박테리아 배양 플레이트에 씨딩하여 인슐린, 아포-트랜스페린, 셀레늄, 프로게스테론, 및 페니실린 또는 스트렙토마이신이 포함되어 있는 둘베코 변형 이글 배지/F12 에 혈청-대체물 B27과 bFGF가 첨가된 배지에서 배양하는 것인 방법.
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