KR20010099203A

KR20010099203A - 신경 줄기세포를 도파민성 신경세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR20010099203A
Application number: KR1020010055795A
Authority: KR
Inventors: 이상훈; 이지연; 김주연; 이용성
Original assignee: 이상훈; 이용성
Priority date: 2001-09-11
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2001-11-09

Abstract

본 발명은 신경 줄기세포(neural stem cell)를 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신경 줄기세포의 배양액에 아스코르브산(ascorbic acid)을 처리하여 신경 줄기세포를 도파민성 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 신경 줄기세포에서 도파민성 신경세포로의 분화율을 높일 수 있으며, 상기 도파민성 신경세포는 파킨슨씨병을 포함하는 뇌신경 퇴행성 질환의 세포치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신경 줄기세포를 도파민성 신경세포로 분화시키는 방법{Method for differentiation of neural stem cell to dopaminergic neuron}

본 발명은 신경 줄기세포(neural stem cell)를 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)로 분화시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신경 줄기세포의 배양액에 아스코르브산(ascorbic acid)을 처리하여 신경 줄기세포를 도파민성 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 그래서 줄기세포를 그 분화 유연성(differential plasticity)에 따라 배아발생과정을 토대로 분류한다. 배아발생 초기인 포배기(blastocyte)의 세포내괴(inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 세포내괴로부터 확립한 배아간세포(embryonic stem(ES) cell)는 이론적으로 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력(pluripotent)을 지닌 줄기세포(stem cells)로 볼 수 있다. 그 후 태아 발생과정이 진행되어 태아의 각 장기가 형성되는 과정에 도입되면 각각의 장기에는 그 장기에 특이한 줄기세포(tissue specific stem cells; primary stem cells)가 존재하여 각 장기를 형성하는 분화 과정에 참여하게 된다. 이와 같이 조직 특이적 줄기세포는 일반적으로 분화할 수 있는 그 분화능력이 그 조직을 구성하는 세포로만 한정되게 되며(multipotent or unipotent), 성인이 된 후에도 대부분의 장기에는 각 장기에 특이한 줄기세포가 남아 있게 되어 정상적 또는 병리적으로 발생하는 세포의 손실을 보충하게 된다.

약 10여년 전만 해도 중추신경계(Central Nervous System (CNS))에는 다른 대부분의 조직과는 달리 줄기세포가 존재하지 않는다고 여겨졌으며, 이것이 뇌신경조직이 손상을 받았을 때 스스로 복구되지 않는 원인이라 여겨졌었다. 그러나 근자에 들어와서 성인의 뇌조직에도 줄기세포(뇌신경 줄기세포; CNS stem cell)가 존재하며, 그 줄기세포로부터 신경세포의 형성과정(neurogenesis)이 증명되었다. 현재까지 성인의 뇌신경 줄기세포는 측면 뇌실(lateral ventricle)의 SVZ(subventricular zone) 및 해마(hippocampus)에서만 발견되어 매우 제한된 부위에만 그 존재가 입증되었으며(Doetsch F et al,Cell, 1999, 703-716; Gage FH,Science, 2000, 1433-1438), 또한 이 신경 줄기세포로부터의 신경형성과정도 매우제한적이어서, 이점이 뇌신경조직이 스스로 재건되지 못하는 원인이라고 생각이 바뀌어 가고 있다.

bFGF(Basic fibroblast growth factor;bFGF, FGF2) 또는 EGF(epidermal growth factor)는 신경 줄기세포를 선택적으로 증식을 유도하는 분열촉진제(mitogen)라는 사실이 알려짐으로써 신경 줄기세포를 뇌신경조직에서 분리하고 배양하는 것이 가능하여졌다. 분리된 신경 줄기세포를 bFGF(또는 EGF) 존재 하에 증식시킨 후 이 분열촉진제를 제거하면 신경 줄기세포의 세포주기(cell cycle)가 정지되면서 증식을 멈추고 분화가 유도되기 시작하며, 혈청이나 RA(retinoic acid)를 첨가하면 그 분화가 촉진되기도 한다. 다중잠재성(Multipotent)인 신경 줄기세포는 분화 유도시 뇌신경조직을 구성하는 세포인 신경세포(neuron), 성상세포(astrocyte) 및 올리고덴트로사이트(oligodentrocyte)로 분화되어지는데 일반적으로 CNTF(cilliary neurotrophic factor)나 LIF(leukemia inhibitory factor)는 다중잠재성인 신경 줄기세포를 성상세포 쪽으로, PDGF(platelet derived growth factor)는 신경세포 쪽으로, 티로이드 호르몬(tyroid hormone) T3는 올리고덴트로사이트 쪽으로의 분화되도록 한다고 알려져 있다(Johe K et al.,Genes Dev., 1996, 10:3129-3140). 그러나 신경 줄기세포는 분리한 부위 및 신경 줄기세포 분리에 사용한 동물의 태아일수에 따라 그 특성에 많은 차이를 보이는데, 예를 들어서 흰쥐 태생 12일(embryonic day 12)에서 분리한 신경 줄기세포를 배양하여 분화 유도 시 주로(약 70-80%) 신경세포로의 분화가 일어나는 반면 태생 14일 이후의 흰쥐 태아에서 분리한 신경 줄기세포는 주로 성상세포 쪽으로 분화가 일어나는 특성의 차이를 보인다. 그 이외에도 세포가 자라는 양상, 각종 사이토카인에 대한 반응에 많은 차이를 보인다.

신경 줄기세포는 태아 발생 과정 중 태아 중추신경계의 각 세부 조직 어디에나 존재하므로 원하는 태아뇌신경조직을 잘라 내어 그 신경 줄기세포를 분리 배양할 수 있고(embryonic CNS neural stem cell), 성인의 경우에는 측면 뇌실의 SVZ(subventricular zone)이나 해마로부터 성인 신경 줄기세포(adult CNS neural stem cell)를 분리하여 배양할 수 있으며 이와 같은 신경 줄기세포 배양을 이용한 연구는 신경 줄기세포로부터 정상적인 뇌신경계 발생 과정을 이해하는데 많은 정보를 제공할 수 있다.

파킨슨씨병, 알쯔하이머병(노인성치매), 탈수초질환(demyelinating disease), ALS(amyotrophic lateral sclerosis) 및 척추손상에 의한 사지마비 등의 뇌신경 퇴행성 질환(neurodegenerative disorder)은 뇌신경조직에 특정 신경세포의 영구적 손실 및 기능 장애에 의해 초래되며 뇌신경조직은 손상시 스스로의 재건이 상당히 제한되어 있으므로 현재까지 이들 질환에 대한 근본적인 치료법은 없는 실정이다. 뇌신경조직이 신경 세포간의 시냅스에 의한 회로에 의해 그 기능을 담당하고 있다는 점을 고려할 때, 손상된 뇌조직의 재건을 꽤하기 위해서는 신경간세포로부터 신경세포로의 분화의 유도, 분화된 신경세포로부터 목표로 액손의 연장(axonal guidance) 및 새로운 기능적 시냅스 형성이 도모되어야 한다. 아직까지 이들 각 단계가 어떠한 기전에 의한 지에 대한 정보는 상당히 미약한 상태인데 이는 이를 연구할 수 있는 적절한 실험 시스템이 구축되어 있지 않기 때문이다.

현재 이를 위한 연구에 주로 초파리, 선충류(nematode) 등의 무척추 동물이나 제노퍼스(Xenopus), 닭 및 쥐 등의 태아의 신경조직을 잘라 배양하는 절편배양(slice culture)은 생체내(in vivo) 상태 유지가 가능하고, 외식배양(explant culture)은 신경계 분화발달에 대한 연구가 용이하다. 또한, 분화가 완성된 신경세포를 분리하여 배양하는 일차 신경배양(primary neuronal culture)은 성숙된 신경세포 특성을 연구하기가 용이하고 암 유전자를 도입한 신경 세포주(neuronal cell line) 배양은 증식 유도로 대량으로 세포를 획득할 수 있는 장점이 있다. 하지만 절편배양이나 일차 신경배양은 분화발달 연구가 불가능하고, 외식배양은 원활한 세포획득이 불가능하고 혼합된 세포 배양시 특정 정보제공이 불가능하다. 또한, 신경 세포주는 암 유전자를 도입했기 때문에 정상 신경세포 발달에 대한 연구가 불가능하다는 점에서 한계성을 보이고 있다.

그러나 신경 줄기세포는 배양접시 상에서 특정 분열촉진제에 의해 증식을 유도할 수 있어 대량 세포를 획득하는 것이 가능하여 원활한 연구수행을 가능케 하며, 적절한 자극에 의해 특정신경세포로의 분화가 유도될 수 있어 특정 세포의 분화 발달과정을 연구하기에 용이하여 신경 줄기세포 배양은 신경계 분화 발달 및 그 기능획득과정에 관한 연구를 위한 최상의 연구 시스템이며, 이에 이를 통해 각종 신경 퇴행성 질환의 뇌조직 재건을 위한 근간이 되는 정보를 제공할 수 있다.

대표적인 뇌신경 퇴행성질환의 하나인 파킨슨씨병의 치료를 위해 도파민성 신경세포가 함유되어 있는 사산한 사람 태아의 중뇌(midbrain)조직을 환자에 이식하였을 때 증상 호전을 보임으로서 뇌신경 퇴행성질환 뿐만 아니라 영구적인 세포손실로 초래되는 소아당뇨, 심근경색, 백혈병 등의 질병에 이들 질병에서 손실된 세포를 이식해 주는 세포대체요법(cell replacement therapy)의 개념이 제시되었다. 그러나 파킨슨 환자에게 이식할 세포를 사람 태아에서 얻는데는 윤리적인 문제가 따를 뿐만 아니라, 한 환자의 치료를 위해 5명 가량의 태아의 뇌가 필요하는 등의 원활한 공급의 문제점이 있어 다른 경로로 세포를 공급할 수 있는 방법이 모색되어야 했다. 신경 줄기세포는 배양접시 수준에서 충분한 양으로 증식, 배양될 수 있으며, 적절한 분화 자극을 가함으로써 특정 신경 세포로 분화될 수 있어 많은 환자에 필요한 신경세포를 충분히 공급할 수 있어 세포이식치료를 위한 가장 적절한 세포이다.

특히 뇌신경계 질환은 다른 어느 질병 보다 세포이식치료에 가장 합당한 대상이라 여겨지는데, 이는 뇌신경계 조직이 다른 조직과는 달리 면역거부반응이 거의 없어, 외부로부터 세포를 이식하였을 때 이식된 세포의 장기간 생존을 기대할 수 있기 때문이다. 이에 90년대 중반 이후 신경 줄기세포를 이용한 세포치료에 관한 연구가 활발히 진행돼 오고 있으며, 뇌졸중, 치매, 파킨슨씨병, 탈수초질환 (demyelinating disease) 및 척추손상(spinal cord injury)등의 질환 치료에 적용하려는 시도가 현재 진행중이다(Isacon O, Deacon T,Trends. Neurosci., 1997, 10:477-482)

파킨슨씨병은 중뇌 흑핵(substantia nigra)의 주 신경세포인 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)의 영구적 손실에 의해 도파민 신경전달물질(neurotransmitter)을 선조체(striatum)에 공급하지 못해 손떨림 등 각종 운동장애를 일으키는 뇌신경 퇴행성질환의 하나이다.

앞에서 언급한 바대로 파킨슨씨병은 정확한 의미에서 세포치료라고 볼 수는 없지만 이미 태아의 중뇌조직을 이용한 이식치료를 시행하고 있을 정도로 세포이식치료에 가장 근접한 질환인데, 이는 파킨슨씨병이 알쯔하이머병 등의 다른 신경 퇴행성질환과는 달리 그 발병 병리가 비교적 단순하여 이식할 세포와 그 이식 부위가 명확하기 때문이다. 또한 척추 손상에 의한 사지 마비를 비롯하여 대부분의 신경 퇴행성질환에서는 위의 제시한 모든 면의 복구에 의한 새로운 신경회로의 재건을 요하는 반면, 파킨슨씨병의 경우에는 이식한 도파민성 신경세포로부터 선조체로 도파민 신경전달물질의 분비만으로도 뚜렷한 기능 회복을 보이기 때문이다.

앞에서 제시한 바대로 태아의 뇌조직을 사용하는 데는 윤리적, 사회적 문제가 따르므로 파킨슨씨병 환자에 공급할 도파민성 신경세포의 다른 공급원으로, 돼지의 뇌, 유전 조작된 섬유아세포(fibroblast), 부신수질(adrenal medulla), 카로티드 바디(carotid body) 등이 제시되었으나 모두 매우 낮은 이식 후 생존률 및 세포 공급의 문제점 등으로 그다지 큰 관심을 끌지 못하였으며, 증식이 가능하며 증식 후 특정 신경세포로 분화가 가능한 신경 줄기세포가 가장 적합한 세포로 여겨져 왔다.

이에, 신경 줄기세포 배양을 이용하여 파킨슨씨병의 세포치료를 시도하였는데(Studer et al.,Nat. Neurosci., 1998, 1:290-295) 그들은 태아 12일의 쥐의 중뇌로부터 신경 줄기세포를 분리 배양하여 일정 기간 증식시킨 후 분화를 유도하였을 때 소량의 세포가 도파민성 신경세포로 분화되었으며, 이를 파킨슨씨병 모델 쥐에 이식하였을 때 뚜렷한 증상의 호전을 보인다 하여 신경 줄기세포를 이용한 파킨슨씨병 세포이식치료에 밝은 전망을 시사하였다.

이와 같이, 신경 줄기세포는 각종 신경퇴행성 질환의 세포치료를 위한 적절한 세포이며, 정상적인 뇌신경계 발달 및 뇌신경퇴행성 질환의 병리 기전을 이해하고자 하는 연구를 위한 가장 적절한 연구 시스템임에는 틀림이 없다.

아스코르브산(Ascorbic acid)은 뇌에서 항산화제와 산소-래디컬 포착제(scavenger)로서 역할을 하고 대뇌 국소빈혈(cerebral ischemia)과 부종(edema)에 대한 신경방어(neuroprotection) 역할을 한다(Cao et al.,Neurosci.Lett., 1988, 88:233-238; Scimanna and Lee,Arch. Biochem. Biophys., 1993, 305:215-224; Ranjan et al.,Acta Neurochir., 1993, 140:977-980; Henry and Chandry,Acta Neurochir., 1998, 140:977-980; Perez-Pinzon et al.,Brain Res., 1997, 754:163-170; Brahma et al.,J. Neurochem., 2000, 74(3):1263-1270). 또한 아스코르브산은 도파민 또는 글루탐산 매개 신경물질 전달을 조절하고(Grunewald,Brain Res. Rev., 1993, 18:123-133; Rebec and Pierece,Prog. Neurobiol., 1994, 43:537-565), 시냅스 소포(synaptic vesicles)에서 노르아드레날린(noradrenalin)과 아세틸콜린의 분비 촉진 역할을 한다(Kuo et al.,Jpn. J. Pharmacol., 1978, 28:789-791).

포유류의 뇌에서 아스코르브산의 세포내 농도는 약 2-5 mM이고, 이는 세포외 유체(extracellular fluid)보다 20배 정도 높다. 아스코르브산은 CNS의 뉴런과 성상세포(astrocytes)에서만 발현되는 막단백질인 Na-의존적 L-아스코르브산 트랜스포터(transporter, SVCT2)에 의해 뇌세포 안으로 흡수된다(Tsukaguchi et al.,Nature, 1999, 399:70-75). 특히 태아 쥐 뇌에서 아스코르브산의 레벨은 성체보다 매우 높다. 임신(gestation) 15일에서 20일에 2배가 되고 태어나면서 급격히 떨어진다(Kratzing et al.,J. Neurochem.,1985, 44:1623-1624). 이는 CNS 발생에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.

이에, 본 발명자들은 파킨슨씨병의 세포 이식치료에 적합한 재료인 신경 줄기세포를 도파민성 신경세포로 분화시키기 위하여, 아스코르브산을 신경 줄기세포의 배양액에 첨가하였을 때 신경 줄기세포가 도파민성 신경세포로의 분화율이 높다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신경 줄기세포를 도파민성 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 태생 12일 내지 태생 14일인 태아 중뇌(ventral midbrain)로부터 신경 줄기세포를 분리하여 bFGF (basic fibroblast growth factor) 존재하에 일정 기간 증식시킨 후 bFGF를 제거하여 분화를 유도하였을 때 전체 세포에 대비하여 도파민성 신경세포의 마커인 TH(tyrosine hydroxylase)를 발현하는 세포의 수를 나타낸 그래프이고,

도 2는 태생 12일인 태아 중뇌 신경 줄기세포 일차 배양액에 증식 단계, 분화 단계 또는 증식과 분화 단계에 본 발명의 아스코르브산을 처리한 것을 TH에 대한 항체로 면역조직화학법으로 염색한 사진이고,

-AA : 아스코르브산을 처리하지 않음, +AA : 아스코르브산으로 처리함,

도 3은 태생 13일인 태아 중뇌 신경 줄기세포 일차 배양액에 증식 단계, 분화 단계 또는 증식과 분화 단계에 본 발명의 아스코르브산을 처리한 것을 TH에 대한 항체로 면역조직화학법으로 염색한 사진이고,

도 4는 태생 12일 또는 태생 13일에서 분리한 신경 줄기세포에 아스코르브산을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 TH를 발현하는 세포의 수를 나타낸 그래프이고,

도 5는 신경 줄기세포의 아스코르브산을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 증식 또는 분화 단계에서 RNA를 분리하여 도파민성 신경세포의 마커인 TH로 RT-PCR을 수행하여 전기영동한 사진이고,

도 6은 신경 줄기세포의 아스코르브산을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 분화단계에서 단백질을 분리하여 TH 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블럿을 수행하여 비교한 사진이고,

도 7은 태생 14일인 중뇌 신경 세포 일차배양에 아스코르브산을 처리하지 않은 세포와 아스코르브산을 처리하여 배양한 신경 세포를 도파민신경세포의 마커인 TH로 면역조직화학법으로 나타낸 사진이고,

도 8은 태생 14일인 중뇌신경세포 일차배양에서 아스코르브산을 처리하지 않은 세포와 아스코르브산을 처리하여 배양한 신경세포의 기능적 성숙도(functional maturity)의 차이를 알아보기 위하여 전기생리학적 실험으로 mEPSC (miniature excitatory post-synaptic current; 꼬마연접후전류)를 측정한 그래프이고,

A : X축은 시간이고, Y축은 전류량(단위 : 암페어)을 나타낸 것이고,

B : A의 그래프를 확대한 것이고,

도 9는 파킨슨씨병 모델 흰쥐에 태생 13일인 태아로부터 분리한 신경 줄기세포를 아스코르브산으로 처리하고 배양한 후 이를 이식하였을 때 파킨슨씨병 증상이 현저히 호전됨을 아포몰핀(apomorphine) 주사에 의해 유도되는 로테이션 테스트(rotation test)를 통해 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.

●: 아스코르브산을 처리하지 않은 세포로 이식,

○: 아스코르브산을 처리한 세포로 이식.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경 줄기세포의 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 신경 줄기세포를 도파민성 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 신경 줄기세포는 태아 중뇌에서 분리한 신경 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 사용 가능한 동물로는 인간을 포함한 모든 포유동물이 될 수 있다. 본 발명에서 바람직한 실시예로서 상기 신경 줄기세포는 태생 12일(embryonic day 12, 이하 'E12'라 약칭한다) 내지 태생 13일(이하 'E13'이라 약칭한다)이 되는 랫트(rat)의 태아 중뇌에서 분리한 신경 줄기세포를 사용하였다.

E12가 되는 랫트의 태아 중뇌에서 분리하여 일차 배양한 신경 줄기세포에 아스코르브산을 처리하는 경우에, 아스코르브산을 처리하지 않은 경우보다 티로신 하이드록시라제(Tyrosine hydroxylase; 이하 'TH'라 칭한다)를 발현하는 (이하 'TH+'라 약칭한다) 세포수가 5-10배 이상 증가하고, E13이 되는 랫트의 태아 중뇌에서 분리한 신경 줄기세포인 경우에는 아스코르브산을 처리했을 때 TH+ 세포수가 20-30배 증가한다(도 4참조). 신경 줄기세포에서 분화된 도파민성 신경세포는 TH를 발현하므로 TH+ 세포수를 측정함으로써 신경 줄기세포에서 도파민성 신경세포로의 분화정도를 알 수 있다. 따라서 본 발명에서 신경 줄기세포는 E12 내지 E13인 태아 중뇌에서 분리한 신경 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 신경 줄기세포 배양액에 첨가되는 아스코르브산의 최종농도가 10 uM 이하에서는 그 효과가 없고, 1 mM 이상에서는 세포의 생존율을 떨어뜨리는 세포독성 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명에서 상기 신경 줄기세포의 배양액에 첨가되는 아스코르브산의 최종농도는 통상 50 내지 500 uM을 첨가하는 것이 바람직하고, 100 내지 400 uM을 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명에서는 신경 줄기세포의 배양액에 B-27 무혈청 보강제(B-27 serum-free supplement, Life Technologies, USA)를 추가로 첨가하면 신경 줄기세포의 도파민성 신경세포로의 분화 효율이 증가된다. 상기 신경 줄기세포의 배양액에 첨가되는 B-27 무혈청 보강제(50X)는 통상 1:50으로 희석하여 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 B-27 무혈청 보강제가 첨가된 신경 줄기세포의 배양액에 아스코르브산을 처리하면 B-27 무혈청 보강제가 없는 신경 줄기세포의 배양액에 아스코르브산을 처리한 것에 비해 도파민성 신경세포로의 분화 효율이 증가한다.

또한, E12 내지 E13 태아 중뇌에서 분리한 신경 줄기세포 배양액에 증식 단계, 분화 단계 또는 증식 및 분화의 전 과정에 아스코르브산을 처리하여 아스코르브산을 처리하지 않은 신경 줄기세포와 비교 분석한 결과, E12 또는 E13에서 분리한 신경 줄기세포에서 증식 단계 또는 분화 단계에서만 아스코르브산을 처리했을 때보다도 증식 단계와 분화 단계 전 과정에 아스코르브산을 처리했을 때가 TH를 발현하는 수가 급격히 증가하였다(도 2및도 3참조). 따라서 신경 줄기세포의 증식 단계에만 또는 분화단계에서만 아스코르브산을 첨가하는 것보다도 증식단계 및 분화 단계의 전과정에 아스코르브산을 첨가하는 것이 바람직하다.

특히, E13 태아 중뇌에서 추출한 신경 줄기세포 배양에 아스코르브산을 처리하지 않고 분화단계 종료 후 도파민성 신경세포의 비율이 전체 세포의 0.5%를 넘지 않는 반면, 증식단계와 분화 단계에 지속적으로 아스코르브산을 배양액에 첨가하였을 때는 분화단계 종료 후 도파민성 신경세포가 전 세포의 최대 30%까지 검출되었다.

TH를 발현하는 신경세포로는 도파민성 신경세포 이외에도 아드레날린성, 노르아드레날린성 신경세포가 포함된다. 도파민성 신경세포는 DBH(dopaminergic beta-hydroxylase)라는 단백질을 발현하지 않는데 반해 아드레날린성 또는 노르아드레날린성 신경세포는 TH 이외에도 DBH 단백질을 발현하는 점에서 구분되는데 아스코르브산에 의해 분화 유도된 TH+ 세포는 DBH에 대한 면역화학염색법에서 염색되지 않음으로서 DBH를 발현하는 아드레날린성 또는 노르아드레날린성 신경세포가 아니고 전부 도파민성 신경세포로 분화를 유도함을 알 수 있다.

또한, 본 발명에서는 도파민성 신경세포 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 신경세포를 성숙(maturation)시킨다. 본 발명에서 성숙은 신경세포의 수지상 돌기의 가지수 및 그 길이가 증가하는 형태학적 성숙 및 주변의 신경세포와 시냅스(연접)를 형성하고 시냅스를 통해 자신이 생산한 신경 전달물질을 분비하여 기능적으로 성숙한 것으로 정의한다. 구체적으로, 성숙하지 않은 어린 신경세포는 신경세포의 마커 단백인 튜블린 Ⅲ(tublin Ⅲ) 또는 MAP2(a+b) 등과 신경 전달물질인 GABA, 글루타민산염(glutamate), 도파민(dopamine), 세로토닌(serotonin)등을 발현할 뿐 다른 신경세포와의 시냅스를 형성하는 등의 현상은 일어나지 않는다. 또한, 형태학적으로도 어린 신경세포는 양쪽으로만 가지를 뻗고 그 가지의 길이가 짧다. 그러나 성숙된 신경세포는 수지상 돌기의 가지수가 증가하고 그 길이도 길어지는 등의 형태학적인 성숙이 일어난다. 또한, 기능적으로도 주변의 신경세포와 시냅스를 형성하고 시냅스를 통해 자기가 생산한 신경전달물질을 분비하며, 이는 전기생리학적인 분석을 통해 확인할 수 있다.

본 발명에서 일차 신경세포 배양액에 아스코르브산을 첨가하면 도파민성 신경세포의 수지상 돌기의 가지수가 많아지고 그 길이가 증가하며, 전기생리학적 분석에서 mEPSC (miniature excitatory post-synaptic current; 꼬마연접후전류)의 크기와 빈도가 아스코르브산을 처리하지 않은 세포에 비해 크게 증가함을 보임으로써 아스코르브산은 도파민성 신경세포를 비롯한 신경세포의 형태학적 및 기능적 성숙(maturation)도 유발함을 알 수 있다(도 7및도 8참조).

본 발명의 아스코르브산에 의해 분화 유도된 도파민성 신경세포가 파킨슨씨병의 세포치료에 사용될 수 있는지를 알아보기 위하여, 파킨슨씨병 모델 흰쥐의 선조체(striatum)에 태아 중뇌 신경 줄기세포 배양에서 아스코르브산의 처리로 분화유도된 도파민성 신경세포를 이식하였다. 상기 세포이식에서는 1x10³개 내지 1x10⁹개의 도파민성 신경세포를 각각 선조체의 세 부위에 이식한다. 그 증상의 호전정도를 로테이션 테스트(rotation test)를 이용하여 조사한 결과, 아스코르브산을 처리한 세포 이식 후 그 로테이션 수가 현저히 감소되었으며, 이는 아스코르브산에 의해 분화 유도된 도파민성 신경세포가 파킨슨씨병의 세포치료에 사용될 수 있음을 알 수 있다(도 9참조).

상기와 같이, 신경 줄기세포 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 분화시킨 도파민성 신경세포는 파킨슨씨병을 포함한 뇌신경 퇴행성 질환의 세포치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<참고예 1> 신경 줄기세포의 분리 및 배양

본 발명자들은 도파민성 신경세포로 분화하기 위하여 우선 랫트로부터 신경 줄기세포를 분리하여 배양하였다.

구체적으로, 임신중인 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트(대한 바이오링크(한국)에서 구입)의 배를 가르고, 가위와 포셋을 이용하여 배아(embryo)를 분리하고 미리 준비해 놓은 해부용 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척한 후 HBSS가 담겨있는 플레이트에 넣어 얼음 위에 놓았다. E12 내지 E15인 태아 중뇌(ventral midbrain)를 잘라내었고, 상기 분리해낸 조직을 CMF-HBSS(Ca²⁺/Mg²⁺-free HBSS)에서 파이펫으로 10-20번 정도 파이펫팅 하여 세포들을 물리적으로 떼어내었다. 상기 해리된 세포들은 폴리오르니틴(polyornithine)으로 처리 후 피브로넥틴(fibronectin)으로 미리 코팅된 12 mm 글래스 커버슬립(coverslips, Carolina Biological Supply Company, Burlington)에 1.27X10⁴- 1.27X10⁵세포/㎠으로 3-5분 동안 놓아 세포가 디쉬 또는 커버슬립에 붙도록 기다렸다. 20 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factors)가 포함된 N2 배지를 첨가하였고 CO₂배양기에서 키워 세포가 증식하여 바닥의 60-80% 정도를 세포가 덮을 때까지(60-80% confluence) 4-6일간 배양하였다. bFGF는 분화 전까지 매일 넣어주고 배지는 이틀에 한번씩 갈아주었다.

N2 배지 500 ㎖의 조성은 F12/DMEM(Gibco) 6 g, D(+) 글루코스(Sigma) 0.775 g, L-글루타민(Sigma) 0.0365 g, NaHCO₃(Sigma) 0.845 g, 인슐린(Sigma) 0.0125 g, 트랜스퍼린(tranferrin, Sigma) 0.05 g, 1 M 프트레신(Putrescine, Sigma) 50 mcl(최종 100 mcM), 0.5 mM 세레나이트(Selenite, Sigma) 30 mcl(최종 30 nM), 0.1 mM 프로제스테론(Sigma) 100 mcl(최종 20 nM)으로 구성되어 있다.

<참고예 2> 신경 줄기세포의 분화

본 발명자들은 신경 줄기세포를 배양했을 때 TH를 발현하는 도파민성 신경세포로 분화하는지를 확인하였다.

구체적으로 E12 내지 E15 태아 중뇌를 상기 실시예 1과 같이 분리하고 분리된 신경 줄기세포를 bFGF의 존재 하에서 4-6일 동안 증식을 시켰다. 상기 증식시킨 신경 줄기세포에서 bFGF를 제거하고 6일이 지나면 신경 줄기세포는 분화하는데, 발명자들은 TH+ 세포수를 측정하였다. TH+ 세포의 측정은 면역화학염색법(immunocytochemistry)을 이용하였는데, 먼저 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정하고 PBS로 5분간 3번 세척하였다. 1:1,000으로 희석한 TH 단일클론 항체(Sigma사) 또는 1:250으로 희석한 다클론 항체(Pel-Freeze사)를 처리하고 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 3번 세척한 후 형광(FITC 또는 Rodamine)이 붙어 있는 2차 항체로 1시간 반응하여 TH+ 세포를 표지하였다.

그 결과, E12 태아 중뇌에서 분리한 신경 줄기세포인 경우에는 6일 동안의 분화 후에 전체 세포의 5-10%만이 TH+ 세포로 분화하였다. 태생 일수가 증가할수록 TH+ 세포로 분화하는 것은 급격히 감소하였고, E13인 경우에는 bFGF를 제거하고 6일 동안 분화하면 TH+ 세포는 1% 미만의 아주 적은 양이 생성되었고 E14 경우에는 거의 생성되지 않았다(도 1).

<실시예 1> 아스코르브산을 이용한 신경 줄기세포의 도파민성 신경세포로의 분화

본 발명자들은 아스코르브산이 신경 줄기세포를 도파민성 신경세포로 분화시키는지 확인하기 위하여, 신경 줄기세포의 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 신경줄기세포가 분화되는 것을 관찰하였다.

랫트의 E12 또는 E13 태아 중뇌 신경 줄기세포 일차 배양액에 증식 단계, 분화 단계 또는 증식 및 분화 단계에 아스코르브산을 처리하여 아스코르브산을 처리하지 않은 신경 줄기세포와 비교 분석하였다. 구체적으로, E12 또는 E13 태아 중뇌 신경 줄기세포 일차 배양의 세포 배양액(N2 배지)에 증식 단계에서만 아스코르브산을 처리하거나, 또는 분화 단계에서만 아스코르브산을 처리하거나, 또는 증식 단계와 분화 단계 전과정에서 아스코르브산을 최종농도가 100-400 uM이 되게 첨가하여 분화를 유도하였다.

상기 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포가 도파민성 신경세포로 분화하였는지는 하기의 면역조직화학, RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 통하여 확인하였다.

<1-1> 면역조직화학 분석

본 발명자들은 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포가 도파민성 신경세포로 분화되었는지 확인하기 위하여 면역조직화학 방법을 수행하였다.

면역조직화학 방법을 수행하기 위해, 일차항체로 1:400으로 희석한 TH 다클론 항체(Pel-Freeze, Rogers, AR) 또는 1:1,000으로 희석한 TH 단일클론 항체(Sigma), DBH(dopamine-β-hydroxylase) 다클론 항체를 사용하였고 상기 일차항체를 검출하기 위하여 형광 표지된 이차항체(Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) 또는 벡타스테인 ABC 키트(Vectastain ABC kit; Vector Laboratories, Burlingame CA)/DAB 기질(Pierce, Rockford, IL) 검출 시스템을 제조회사의 매뉴얼에 따라 수행하였다.

구체적으로, 세포 또는 알코올로 30분 동안 상온에서 처리한 조직을 커버슬립에 놓은 후 4% 파라포름알데히드, 0.15% 피크린산(Picric acid)으로 상온에서 20분간 고정시켰다. 상기 고정된 것은 0.1% BSA/PBA로 5분씩 3회 세척하고 10% NGS(normal goat serum), 0.3% Triton X-100, 0.1% BSA/PBS로 상온에서 30-45분간 블로킹시켰다. 일차항체를 10% NGS, 0.1% BSA/PBS에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3회 세척하고 0.1% BSA/PBS에 이차항체를 넣어 상온에서 45분간 반응시킨 후 0.1% BSA/PBS로 5분간 3회 세척하였다. 반응이 끝나면 과산화효소 용액(Vectastain ABC kit)을 넣고 45분간 반응시킨 후 DAB(Diaminobenzidine) 용액으로 3-5분간 반응시켰다.

그 결과, E12 또는 E13에서 분리한 신경 줄기세포에서 증식 단계에서만 아스코르브산을 처리했을 때나 분화 단계에서 아스코르브산을 처리했을 때보다도 증식 단계와 분화 단계 모두에서 아스코르브산을 처리했을 때가 TH를 발현하는 세포수가 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 2및도 3)

E12에서 분리한 신경 줄기세포인 경우에는 아스코르브산을 처리하지 않은 것에 비해 아스코르브산을 처리한 것이 TH+ 세포수가 5-10배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었고, E13에서 분리한 신경 줄기세포인 경우에는 아스코르브산을 처리하지 않았을 때는 TH+ 세포가 거의 없었는데 아스코르브산을 처리했을 때 TH+ 세포수가 20-30배 증가하였다(도 4).

TH를 발현하는 신경세포로는 도파민성 신경세포 이외에도 아드레날린성, 노르아드레날린성 신경세포가 포함되는데, 도파민성 신경세포는 DBH라는 단백질을 발현하지 않는데 반해 아드레날린성 또는 노르아드레날린성 신경세포는 TH 이외에도 DBH 단백질을 발현하는 점에서 구분이 된다. 본 실시예에서 아스코르브산을 첨가한 배양에서 분화된 세포를 TH와 DBH 일차항체로 이중 면역형광염색하였을 때 TH+ 세포는 전부 DBH에 염색되지 않았다. 이는 아스코르브산에 의해 분화 유도된 TH+ 세포는 아드레날린성 또는 노르아드레날린성 신경세포가 아니고 전부 도파민성 신경세포임을 말한다.

<1-2> RNA 분리 및 RT-PCR

본 발명자들은 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포가 중뇌 도파민성 신경세포로 분화가 되었는지 확인하기 위하여, 중뇌 도파민성 신경세포의 마커인 TH를 이용하여 RT-PCR 분석을 수행하였다.

신경 줄기세포의 배양액에 증식 단계부터 아스코르브산을 처리한 세포와 아스코르브산을 처리하지 않은 세포를 증식 단계 또는 분화단계에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, RT-PCR 분석을 하기 위하여 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포와 처리하지 않은 신경 줄기세포의 모든 RNA를 추출하기 위하여 트리졸(Trizol; Life Technologies, Gaithersberg, MD)을 사용하여 제조회사의 매뉴얼에 따라 수행하여 모든 RNA를 분리하였다. 상기 분리한 RNA를 주형으로 역전사효소(Superscript kit, Life Technologies)를 이용하여 cDNA를 합성하였고이를 주형으로 다시 PCR을 수행하였다. PCR은 수퍼믹스(Supermix, Life Technologies)를 사용하여 제조회사의 매뉴얼에 따라 수행하였고, TH 마커 프라이머는서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 프라이머를 사용하였다.

그 결과, 아스코르브산을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포를 증식 단계에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하면 둘 다 도파민성 신경세포의 마커인 TH에 대한 밴드가 매우 약한 밴드가 나타나고, 아스코르브산을 처리하지 않은 세포를 분화단계에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하여도 비슷한 결과를 얻었다. 그러나 아스코르브산을 처리한 세포를 분화단계까지 배양하여 RT-PCR을 수행하면 TH에 대한 밴드가 명확히 나타나는 것으로 보아 증식 단계 보다는 분화 단계 이후에 신경 줄기세포가 도파민성 신경세포로 많이 분화되는 것을 알 수 있다(도 5).

<1-3> 웨스턴 블럿

본 발명자들은 상기 실시예 <1-1> 및 실시예 <1-2>에서 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포가 TH 를 발현하는 도파민성 신경세포로 분화한다는 것을 확인한 후 상기 결과가 TH 단백질 발현에서도 일치하는지 다시 한번 확인하였다.

구체적으로, 분화 단계 후 세포를 획득하여 그 단백질로부터 웨스턴 블럿을 수행하였다. 분화 후 6 ㎝ 배양접시에서 세포를 트립신으로 처리하여 획득하고(2 X 10⁶내지 1X 10⁷세포) 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 용해 완충액(20 mM Tris(pH7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 2.5 mM 나트륨 피로포스페이트,1 mM β-글라세로포스페이트, 1% 트리톤 X-100, 1 mM PMSF, 1 mM Na₃VO₄)를 첨가하여 세포를 깨뜨리고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취하고 그 단백질을 브래트포드 정량법에 의해 정량하였다. 한 레인 당 30 ㎍의 단백질 시료를 로딩하여 전기영동한 후 니트로셀룰로스 막에 트랜스퍼한다. 블록킹 용액(TBS 버퍼에 5% 탈지유, 0.1% 트윈 20)으로 1차항체를 희석(생쥐 항-TH 항체(Sigma사 1:1000))하고 이를 첨가하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. PBS로 3번 세척하고 HRP-접합 2차 항체(NewEngland Biolabs사; 희석비 1:2000)를 상온에서 2시간 반응한 후 ECL 키트(Amershampharmacia biotech사)로 확인한다.

그 결과, 아스코르브산을 처리한 신경 줄기세포 배양액에서의 TH 단백질의 발현이 아스코르브산을 처리하지 않은 신경 줄기세포 배양에 비해 현저히 증가하였으며, 상기 결과는 TH에 대한 면역화학염색 및 RT-PCR 결과와 함께 아스코르브산이 도파민성 신경세포로의 분화를 촉진한다는 것을 나타낸다(도 6).

<1-4> B-27 무혈청 보강제 첨가에 의한 도파민성 신경세포로의 분화 효율 분석

본 발명자들은 B-27 무혈청 보강제(B-27 serum-free supplement, Life Technologies, USA)가 신경세포의 생존(survival)에 영향을 미친다는 기존의 보고를 참고하여(J. Neurosci. Res., 35:567-576;Exp. Brain. Res.,613:168-172), 본 발명의 신경 줄기세포 배양액에 B-27 무혈청 보강제를 첨가하고 이를 아스코르브산을 처리하여 배양했을 때 도파민성 신경세포로의 분화효율을 알아보았다.

랫트의 E12 또는 E13 태아 중뇌 신경 줄기세포 일차 배양액에 B-27 무혈청 보강제(50X)를 1:50으로 희석하여 사용하였고, 신경 줄기세포의 증식 및 분화 단계 전과정에서 아스코르브산을 최종농도가 100-400 uM이 되게 첨가하여 분화를 유도하였다. 상기 신경 줄기세포의 분화된 정도를 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 면역조직화학 분석을 수행하였다.

그 결과, 신경 줄기세포 배양액에 B-27 무혈청 보강제를 첨가하고 아스코르브산을 처리하여 신경 줄기세포를 분화시키면 B-27 무혈청 보강제가 없는 배양액에 비해 도파민성 신경세포로의 분화가 5-10배 증가하는 것을 관찰하였다. 상기 결과는 본 발명의 아스코르브산을 이용한 신경 줄기세포의 도파민성 신경세포로의 분화에서 B-27 무혈청 보강제를 신경 줄기세포의 배양액에 첨가함으로써 도파민성 신경세포로의 분화효율이 증가한다는 것을 나타낸다.

<실시예 2> 아스코르브산에 의한 도파민성 신경세포를 비롯한 신경세포의 성숙(maturation)

본 발명자들은 상기 실시예에서 아스코르브산에 의해 신경 줄기세포가 도파민성 신경세포로 분화한다는 사실을 알고 아스코르브산이 도파민성 신경세포의 성숙(maturation)에도 영향을 미치는지 확인해보았다.

랫트의 태생 14일인 태아 중뇌에서 신경세포만을 배양하는 일차 신경세포 배양액에 아스코르브산을 처리한 경우와 처리하지 않은 경우에 대해서 도파민성 신경세포의 마커인 TH에 대한 항체로 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 면역조직화학법을 수행하였다.

일차 신경 줄기세포 배양은 신경조직에서 신경줄기세포를 분리하여 증식을 유발한 후 분화를 유도하는 배양임에 반해, 일차 신경세포 배양은 신경조직으로부터 신경세포만을 분리하여 배양하는 것으로 신경세포는 증식할 수 없으므로 증식단계가 포함되어 있지 않은 점이 신경줄기세포 배양과 다르다. 그러므로 일차 신경세포 배양에서는 신경줄기세포의 증식인자인 bFGF를 사용하지 않는 점과 N2배지 대신 NB배지(Life Technologies, USA)를 사용함이 다르다.

그 결과, 아스코르브산을 처리하지 않은 도파민성 신경세포는 수지상 돌기가 많이 뻗어나가지 않았으나, 아스코르브산을 처리한 배양에서는 도파민성 신경세포의 수지상 돌기의 가지수와 그 길이가 증가한 것으로 보아 아스코르브산이 도파민성 신경세포의 형태학적인 성숙도 유발함을 확인할 수 있었다(도 7).

<2-1> 전기 생리학적 분석

본 발명자들은 아스코르브산에 의한 신경세포의 기능적 성숙을 평가하기 위해 신경세포에 대한 전기생리학적인 분석을 수행하였다. 1 mM의 TTX와 10 mM의 비큐큘린(Bicuculine)을 세포외액(150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM 글루코스(glucose), pH는 NaOH를 이용하여 pH 7.4로 맞추었고 삼투압 농도는 310~320 mOsm이 되게 하였다)에 첨가시켜 활동전압의 발생을 억제하고 억제성 시납스(연접)후 막전류를 차단한 후, 여러 단계로(-70~-30mV) 세포막전압을 고정하여 꼬마 흥분성 시납스(연접)후 막전류를 기록하였다. NMDA(N-methyl-D-aspartic acid) 수용체의 활성을 보기 위해서 Mg²⁺이 제거된 세포외액으로도 실험하였다. 팻치용 피펫은 저항이 3-5 MW이 되도록 만들었으며, 피펫용액(17.5 mM CsCl, 122.5 mM Gluconic Acid, 122.5 mM CsOH, 8 mM NaCl, 0.3 mM GTP, 2 mM Mg-ATP, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH는 CsOH를 이용하여 7.2로 맞추었고 삼투압농도는 280~300 mOsm이 되게 하였다)을 채웠다. 세포막 전류는 AxoPatch1D(Axon Instrument) 증폭기로 증폭하였으며 5 kHz로 필터링 하였고, 40 kHz로 신호를 추출하여 기록하였다. 기록과 데이터 분석용 소프트웨어는 LabVIEW6 (National Instrument)를 이용하여 직접 제작한 프로그램을 사용하였다.

그 결과, 아스코르브산을 배양액에 첨가한 배양의 신경세포는 아스코르산을 첨가하지 않은 배양의 신경세포에 비해 mEPSC(miniature excitatory post-synaptic current; 꼬마연접후전류)의 빈도와 크기가 현저히 증가하였으며, 상기 결과로부터 아스코르브산은 신경세포의 기능적 성숙도 유발함을 알 수 있다(도 8).

<실시예 3> 신경 줄기세포에 아스코르브산으로 처리하여 분화된 도파민성 신경세포를 이용한 세포치료

랫트의 태아 중뇌에서 추출한 신경 줄기세포 배양에서는 분화단계 종료 후 도파민성 신경세포의 비율이 전체 세포의 0.5%를 넘지 않는 반면, 증식단계와 분화 단계에 지속적으로 아스코르브산을 배양액에 첨가하였을 때는 분화단계 종료 후 도파민성 신경세포가 전체 세포의 최대 30%까지 검출됨을 보여 주었다.

본 발명자들은 아스코르브산에 의해 분화 유도된 도파민성 신경세포가 파킨슨씨병의 세포치료에 사용될 수 있는지를 알아보기 위하여, 파킨슨씨병 모델 흰쥐의 선조체(striatum)에 E13 랫트 태아 중뇌 신경 줄기세포 배양에서 아스코르브산의 처리로 분화 유도된 도파민성 신경세포를 이식하고 그 증상의 호전정도를 로테이션 테스트(rotation test)를 이용하여 조사하였다.

파킨슨씨병 흰쥐 모델을 제조하기 위하여, 우선 흰쥐를 50 ㎎/㎏ 펜토바비탈(pentobarbital)로 마취시킨 후 뇌 고정 위 장치에 고정하였다. MFB(Median forebrain bundle)에 0.2 ㎎/㎖ 아스코르브산/생리수에 있는 3 ㎎/㎖ 6-하이드록시도파민 3 ㎕를 해밀톤 주사기를 이용하여 주입하였다. 주입 부위는 팍시노스(Paxinos)의 MFB 스테레오택신(stereotaxic) 조정(AP;-0.18, ML; -0.18, DV; 0.80mm)에 준하여 주입하였다. 파킨슨씨병 흰쥐 모델이 만들어졌는지 확인하기 위하여는 6-OHDA 주입 2주 후 0.25 ㎎/㎏ 아포몰핀(apomorphine)을 복강내 주입하여 회전수를 측정하였다. 이는 선조체 내의 도파민 분비가 90% 이상 고갈된 것을 의미함으로서 파킨슨씨병 흰쥐 모델이 제조되었음을 확인하였다.

이식 할 도파민 신경세포의 농도를 1 ㎕ 당 1 x 10⁷개의 세포로 준비하여, 3 ㎕ 씩 각각 선조체의 세 부위에 이식하였다. 이식할 첫째 부위는 팍시노스(Paxinos) 좌표에 따라 브레그마(bregma)에서 앞(anterior)으로 0.02, 측면(lateral)으로 0.30 및 등쪽(dorsal)으로 0.55 ㎜에 주입하며, 둘째 및 셋째 부위는 각각 브레그마에서 앞쪽으로 0.02 및 0.12, 측면으로 0.30 및 0.25, 등쪽으로 0.40 및 0.47 ㎜에 주입하였다. 이식된 도파민 신경세포의 효과를 관찰하기 위해 아포몰핀 유도 로테이션 테스트를 시행하였다. 이는 0.25 ㎎/㎏ 아포몰핀을 복강내 주사하여 세포 주입 후 1, 2, 4, 8, 16 및 32주째 각각 회전수를 측정하여 이를 5분당 회전수로 나누어 회전수 변동을 측정하였다.

그 결과, 아스코르브산을 처리하지 않은 세포에 비해 아스코르브산 처리한 세포를 파킨슨씨병 모델 쥐에 이식 후 로테이션 테스트를 한 결과, 그 로테이션 수가 현저히 감소되었다(도 9). 상기 결과로 아스코르브산에 의해 분화 유도된 도파민성 신경세포는 파킨슨씨병 세포치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 아스코르브산을 이용하여 E12 내지 E13의 태아 중뇌에서 분리 배양한 신경 줄기세포에서 도파민성 신경세포를 대량생산할 수 있고, 상기 도파민성 신경세포는 파킨슨씨병을 포함하는 뇌신경 퇴행성 질환의 세포치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

신경 줄기세포(neural stem cell) 배양액에 아스코르브산(ascorbic acid)을 첨가하여 신경 줄기세포를 도파민성 신경세포(dopaminergic neuron)로 분화시키는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 신경 줄기세포는 태아 중뇌(ventral midbrain)에서 분리 배양한 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 신경 줄기세포는 태생 12일(E12) 또는 태생 13일(E13)인 태아 중뇌에서 분리 배양한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 아스코르브산의 최종농도는 100 내지 400 uM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 신경 줄기세포의 증식 단계 또는 분화 단계에 아스코르브산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 신경 줄기세포의 배양액에 B-27 무혈청 보강제(B-27 serum-free supplement)를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
도파민성 신경세포 배양액에 아스코르브산을 첨가하여 신경세포를 성숙(maturation)시키는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 아스코르브산의 최종농도는 100 내지 400 uM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 7항의 방법에 의하여 얻어진 도파민성 신경세포를 유효성분으로 포함하는 파킨슨씨병 치료용 조성물.