KR20120003098A - ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법 - Google Patents
ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20120003098A KR20120003098A KR1020100063756A KR20100063756A KR20120003098A KR 20120003098 A KR20120003098 A KR 20120003098A KR 1020100063756 A KR1020100063756 A KR 1020100063756A KR 20100063756 A KR20100063756 A KR 20100063756A KR 20120003098 A KR20120003098 A KR 20120003098A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- foxa2
- nurr1
- differentiation
- cell
- Prior art date
Links
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims description 68
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 title abstract description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 185
- 101150026563 NR4A2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 76
- 101001062354 Xenopus tropicalis Forkhead box protein A2 Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000000574 ganglionic effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 102100021118 Microtubule-associated protein 2 Human genes 0.000 claims abstract 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 196
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 claims description 98
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 95
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 58
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 claims description 57
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 claims description 57
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 claims description 18
- -1 Ptx3 Proteins 0.000 claims description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 14
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 10
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 9
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 claims description 8
- 101710133555 Atrial natriuretic peptide-converting enzyme Proteins 0.000 claims description 6
- 102100037293 Atrial natriuretic peptide-converting enzyme Human genes 0.000 claims description 6
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims description 6
- 101100490767 Mus musculus Aldh1a1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 101100128484 Xenopus laevis lmx1b.1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 5
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims description 5
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 claims description 4
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004311 Gilles de la Tourette syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 claims description 3
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000323 Tourette Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000016620 Tourette disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 claims description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 claims description 3
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 claims description 3
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 claims description 3
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 claims description 2
- 101710113849 Sonic hedgehog protein Proteins 0.000 claims 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims 1
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims 1
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims 1
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims 1
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 claims 1
- 102100021796 Sonic hedgehog protein Human genes 0.000 claims 1
- 230000009225 memory damage Effects 0.000 claims 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 abstract description 18
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 8
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 abstract description 3
- 210000004002 dopaminergic cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 abstract 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 101150057663 Foxa2 gene Proteins 0.000 description 75
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 30
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 19
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 17
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 14
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 10
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 8
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 8
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 7
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 6
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 6
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 6
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 6
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 6
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 6
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 5
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 description 5
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N (S)-amphetamine Chemical compound C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 4
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 4
- 102100038554 Neurogenin-2 Human genes 0.000 description 4
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 4
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 4
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 4
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 4
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 101800000504 3C-like protease Proteins 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036464 Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15 Human genes 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 3
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 3
- 102100024458 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 3
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108050000588 Neurogenic differentiation factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 102100036691 Proliferating cell nuclear antigen Human genes 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100040250 Transcription elongation factor A protein-like 1 Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 3
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 3
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000002487 chromatin immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 230000022256 midbrain development Effects 0.000 description 3
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 3
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N oxidopamine Chemical compound NCCC1=CC(O)=C(O)C=C1O DIVDFFZHCJEHGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000607 p15 Proteins 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 3
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 3
- 230000001144 postural effect Effects 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 3
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 description 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 2
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 2
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102400001093 PAK-2p27 Human genes 0.000 description 2
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 230000018199 S phase Effects 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 229940097998 neurotrophin 4 Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 2
- 230000024642 stem cell division Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000993093 Arabidopsis thaliana Heat stress transcription factor B-2a Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108010027344 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000018720 Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 239000012624 DNA alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 101100202237 Danio rerio rxrab gene Proteins 0.000 description 1
- 101100309320 Danio rerio rxrga gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000001061 Dunnett's test Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010014612 Follistatin Proteins 0.000 description 1
- 102000016970 Follistatin Human genes 0.000 description 1
- 101150117946 Foxa1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000037057 G1 phase arrest Effects 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 1
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 1
- 102100020880 Kit ligand Human genes 0.000 description 1
- 101710177504 Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 102000016776 Midkine Human genes 0.000 description 1
- 108010092801 Midkine Proteins 0.000 description 1
- 101100163882 Mus musculus Ascl1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100023172 Nuclear receptor subfamily 0 group B member 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 101150050070 RXRA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101150076211 TH gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 1
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000007488 abnormal function Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 101150010487 are gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N bucladesine Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N 0.000 description 1
- 229960005263 bucladesine Drugs 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006369 cell cycle progression Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229930003836 cresol Natural products 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940043378 cyclin-dependent kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000001705 ectoderm cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 1
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000003966 growth inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007688 immunotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000386 immunotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000002197 limbic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 1
- 238000003468 luciferase reporter gene assay Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000028161 membrane depolarization Effects 0.000 description 1
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 1
- 229910001987 mercury nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000021616 negative regulation of cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007472 neurodevelopment Effects 0.000 description 1
- 230000016195 neuron homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 1
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 description 1
- 230000009207 neuronal maturation Effects 0.000 description 1
- 238000012743 neurosphere formation assay Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- DRXYRSRECMWYAV-UHFFFAOYSA-N nitrooxymercury Chemical compound [Hg+].[O-][N+]([O-])=O DRXYRSRECMWYAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXPANQJNYNUNES-UHFFFAOYSA-N nomifensine Chemical compound C12=CC=CC(N)=C2CN(C)CC1C1=CC=CC=C1 XXPANQJNYNUNES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001073 nomifensine Drugs 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012755 real-time RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000037425 regulation of transcription Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 101150088976 shh gene Proteins 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000008234 soft water Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 108020003113 steroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005969 steroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 239000003860 topical agent Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 1
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0619—Neurons
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 중뇌 특성을 나타내는 도파민성 신경세포로 효과적으로 분화(differention)시키는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 신경전구세포에서 FoxA2 및 Nurr1를 동시발현시킴으로써, 중뇌 특성을 나타내는 도파민 신경세포로 효과적으로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 중뇌 특성을 나타내는 도파민성 신경세포로 효과적으로 분화(differention)시키는 방법에 관한 것이다.
도파민 신경세포는 중간 뇌의 배쪽 및 복외측에 존재하며, 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다. 이들 신경세포는 전뇌 중의 다수의 구조를 자극하며 저산소증 및 허혈증으로 인한 뇌손상, 파킨슨 질환, 정신분열증, 및 약물 중독 등이 이들의 퇴행 또는 기능이상과 연관되어 있다 (Hynes 등, 1995, Cell 80:95-101).
인간을 비롯한 동물의 뇌에 있어서 도파민의 결핍은 다양하고 심각한 장애를 일으킨다. 그 중 운동장애가 특히 심각한데 이는 파킨슨씨병 등의 환자에서 잘 밝혀져 있다.
파킨슨씨병은 50대 이후에 주로 발병하며 중뇌의 흑질에서 도파민성 신경세포의 사멸로 인하여 선조체에서 도파민의 결핍을 초래하며 akinesis, bradykinesia, 경직, 떨림, 불안한 자세 등의 운동장애를 일으킨다. 이러한 운동장애는 6-히드록시도파민(OHDA)으로 처리한 실험동물에서도 거의 그대로 나타난다.
난치병으로 알려진 파킨슨씨병은 중뇌의 흑색질 부위의 도파민을 분비하는 신경세포의 소멸에 의해 야기되는 병으로 발병빈도가 높고 운동장애가 만성적으로 서서히 진행되는 치명적인 노인성 질환으로 치료방법의 개발이 시급하다. 현재까지 알려진 치료법으로는 몇 가지 유사약물을 이용한 약물치료와 심부자극기 설치 등의 수술적요법 등이 있으나 약물치료의 경우 단기적이며 지속적인 투여에 의한 부작용으로 적용이 쉽지 않고 수술적 요법 또한 신체적, 경제적 부담이 많아 대체치료법이 절대적으로 필요하다.
이러한 신경 퇴행성 장애 및 신경계 질환에서 소실된 신경세포를 대체할 수 있는 치료방법은 유전자 요법 또는 세포 이식이 있지만, 뇌신경조직은 손상시 스스로의 재건이 상당히 제한되어 있으므로 현재까지 이들 질환에 대한 효과적인 치료법은 없는 실정이다.
와그너 등은 Nurr1을 이용하여 신경 줄기세포주(신경 도파민성 신경세포주)를 도파민성 신경세포로 분화시키는데 성공하였지만, 이러한 분화에는 타입 I 중뇌 별아교세포로부터 유도된 보조인자를 필요로 할 뿐만아니라 상기에서는 신경 줄기세포주를 사용하였기 때문에 파킨슨씨병을 위한 세포 이식치료에는 부적합하였다(Wagner, et al., Nature Biotechnology, 1999, 17:653-659).
또한, 한국등록특허 880948호에서는 Nurr1 및 Mash1으로 도파민 신경세포를 제조하고 있으나, 실제로 체내에서 도파민 신경세포로 기능하기 위해서는 중뇌 특성을 나타내야 하는데 그렇지 못해, 마찬가지로 파킨슨씨병을 위한 치료에는 비효율적인 문제가 있다.
이에 본 발명자는 신경전구세포에서 FoxA2 및 Nurr1를 동시발현시킴으로써, 중뇌 특성을 나타내는 도파민성 신경세포로의 분화가 효과적으로 일어남을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 도입하는 것을 특징으로 하는 중뇌 특성 도파민 신경세포로의 분화방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포; 또는 이들이 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 질환 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 도입하는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법을 제공한다.
특히, 상기 도파민 신경세포는 중뇌 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는데, 이는 중뇌 발달관련 유전자인 wnt-3a, corin, lmx1b와 중뇌와 중뇌흑질 (A9) 도파민 신경세포 특이유전자인 Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2 등의 발현이 나타나는 것을 의미한다.
상기 신경전구세포는 배아 또는 성체 줄기세포로부터 분화시켜 수득할 수도 있고, 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 분리하여 수득할 수도 있다.
신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 도입하는데 있어서, 상기 도입은 바이러스 벡터를 이용하여 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용한다.
한편, 상기 FoxA2는 티로신 수산화 효소(TH)를 코딩하는 유전자 발현용 프로모터에 직접 결합됨으로써 도파민 신경세포로의 분화유도를 촉진하는데 이 때, 상기 FoxA2의 TH 프로모터에의 결합율은 Nurr1이 함께 발현될 때 더욱 증가한다. 또한, FoxA2는 세포분열 억제인자인 p15, p16, p21, p27 발현을 증가시켜 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식이 현저히 억제시킨다. 뿐만 아니라, FoxA2는 도파민 신경세포 생존인자인 BDNF, GDNF, NT-3 및 SHH로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현을 증가시킨다.
그리고 분화된 상기 도파민 신경세포는, 성숙한 형태적 기능적 도파민 신경세포임을 알 수 있는 마커 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, 및 DAT 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현한다.
한편, 본 발명은 상기 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포; 또는 이들이 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 질환 치료용 조성물을 제공한다.
이 때, 상기 뇌신경계 질환은 파킨슨병, 신경통, 관절염, 두통, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 불면증, 치매,우울증, 디스키네시아, 알츠하이머 질환, 루이제 치매, 헌팅톤 질환, 뚜렛 증후군, 불안, 기억 손상 또는 퇴행성 신경질환 등일 수 있는데, 특히 파킨슨 병에 효과적이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라서 FoxA2 및 Nurr1가 동시에 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포로부터 분화된 도파민성 신경세포는 중뇌 특성을 나타내는 도파민성 신경세포인바, 파킨슨씨병, 알쯔하이머, 뇌졸증, 국소빈혈 등의 뇌신경계 질환 등을 치료하기 위한 세포 대체 요법과 유전자 치료 요법에 이용되거나 신약개발에 있어 약물효과 검정 또는 각종 연구를 위한 재료로 폭넓게 이용될 수 있다.
도 1은 Nurr1 및/또는 Foxa2 발현에 의한 TH(Tyrosine Hydroxylase) 유전자 발현 기전에 대한 면역조직화학분석 결과, mRNA 분석결과 및 크로마틴-면역침전 분석결과들을 나타낸 것이다.
도 2는 배양된 신경줄기세포에서 Foxa2를 발현시켰을때 중뇌 발달관련 유전자 (wnt-3a, corin, lmx1b)와 중뇌 및 중뇌흑질 (A9) 도파민신경세포특이유전자 (Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2) 들의 RT-PCR분석 결과 및 면역화학분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Foxa2의 중뇌 도파민 신경세포 성숙과정에서의 역할 규명하기 위해, 도파민 신경세포 마커인 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, DAT가 발현을 관찰한 면역조직화학분석 결과 및 도파민 신경전달물질 분비능 및 재흡수능 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Foxa2의 세포주기 및 신경분화에의 관련성을 알아보기 위해, cell c세포수 증가패턴 분석결과, 뉴로스피어 형성분석결과, 증식 특이 단백질(Ki67, BrdU, pHH3)의 면역화학분석결과 및 유세포 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Foxa2 과발현에 따른 신경세포 분화 유도능을 확인하기 위한, 신경세포 분화인자 Ngn2, NeuroD의 발현여부를 확인한 RT-PCR 분석 결과 및 신경세포 마커의 면역조직화학분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Foxa2의 의한 도파민성 신경세포 생존능 향상을 알아보기 위한 TH+도파민 세포에 대한 면역조직화학 분석 결과 및 세포 생존능에 대한 MTT 분석 결과, 그리고 세포생존인자로 알려진 BDNF, GDNF, NT-3, SHH유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 마우스대뇌피질 유래 신경줄기세포, 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포 및 사람 배아줄기세포 유래 신경줄기세포에서의 도파민 신경세포 분화정도를 비교한 면역조직화학분석 결과이다.
도 8은 Nurr1+Foxa2 과발현된 신경줄기세포를 파킨슨 모델쥐의 선조체에 이식하고 세포 치료효과를 관찰한 결과로서, 암페타민-유도된 회전 불균형 실험 결과 및; 이식체 부피, 생존한 세포수, TH+ 도파민 신경세포의 수 확인을 위한 면역조직화학분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 배양된 신경줄기세포에서 Foxa2를 발현시켰을때 중뇌 발달관련 유전자 (wnt-3a, corin, lmx1b)와 중뇌 및 중뇌흑질 (A9) 도파민신경세포특이유전자 (Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2) 들의 RT-PCR분석 결과 및 면역화학분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Foxa2의 중뇌 도파민 신경세포 성숙과정에서의 역할 규명하기 위해, 도파민 신경세포 마커인 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, DAT가 발현을 관찰한 면역조직화학분석 결과 및 도파민 신경전달물질 분비능 및 재흡수능 분석결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Foxa2의 세포주기 및 신경분화에의 관련성을 알아보기 위해, cell c세포수 증가패턴 분석결과, 뉴로스피어 형성분석결과, 증식 특이 단백질(Ki67, BrdU, pHH3)의 면역화학분석결과 및 유세포 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Foxa2 과발현에 따른 신경세포 분화 유도능을 확인하기 위한, 신경세포 분화인자 Ngn2, NeuroD의 발현여부를 확인한 RT-PCR 분석 결과 및 신경세포 마커의 면역조직화학분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Foxa2의 의한 도파민성 신경세포 생존능 향상을 알아보기 위한 TH+도파민 세포에 대한 면역조직화학 분석 결과 및 세포 생존능에 대한 MTT 분석 결과, 그리고 세포생존인자로 알려진 BDNF, GDNF, NT-3, SHH유전자 발현에 대한 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 마우스대뇌피질 유래 신경줄기세포, 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포 및 사람 배아줄기세포 유래 신경줄기세포에서의 도파민 신경세포 분화정도를 비교한 면역조직화학분석 결과이다.
도 8은 Nurr1+Foxa2 과발현된 신경줄기세포를 파킨슨 모델쥐의 선조체에 이식하고 세포 치료효과를 관찰한 결과로서, 암페타민-유도된 회전 불균형 실험 결과 및; 이식체 부피, 생존한 세포수, TH+ 도파민 신경세포의 수 확인을 위한 면역조직화학분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"분화(differentiation)"라는 용어는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
"분화 시약"은 신경 계통 (전구세포 및 말단 분화된 세포를 포함)의 분화 세포를 생산하기 위해 본 발명의 배양 시스템에 사용된 화합물의 집합 및 생물학적 인자들의 집합을 말한다. 분화 시약은 표현형의 변화를 유도하거나 돕고, 특정 표현형을 가진 세포의 성장을 촉진시키거나 다른 것의 성장을 지연시키거나, 미지의 기작을 통해 다른 물질과 함께 작용함으로써 분화 과정을 도울 수 있다.
세포의 "증식(proliferation)" 또는 "성장(growth)'이라는 용어는 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다. 세포수가 증식(증폭)되어 어느 시기에 이르면, 형질이 변화(분화)되어 가는 것과 동시에 제어되고 있는 것이 보통이다. 체내에서 세포가 증가되어 가는 것과, 또 세포 내에서 세포질이 신생(新生)되어 가는 경우에는 생장으로 구별하는 경우가 많다. 그러나 생물학적으로 세포수가 증가된다는 점에서 보면, 다세포생물의 발생기에서 분화가 일어나지 않는 시기는 증식 또는 성장으로 보는 것이 정당하다. 본 발명에서는 상기 두 용어가 혼용되어 쓰이고 있다.
"성장억제제"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 성장억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에)차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 억제제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다.
"줄기세포(stem cell)"란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아와 성체 줄기 세포로 나눌 수 있다.
"신경세포"는 신경 체계의 세포이고, 용어 "뉴런" 또는 "뉴런 세포"로 서로 바꾸어 사용할 수 있다.
"신경 질환"은 운동 및 감각에 관여하는 신경이 손상되어 운동 및 감각을 포함하는 행동기능에 이상이 있는 질환을 의미하며, 이러한 질환으로서 뇌졸중(stroke), 알츠하이머병, 파킨슨병, 및 척추 손상 질환(spinal cord injury disease)을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"형질도입(transduction)" 박테리오파지를 매개로 유전적 형질이 한 세포에서 다른 세포로 옮아가 유전형질이 변화하는 현상으로, 박테리오파지가 어떤 형(型)의 세균에 감염되면 파지 DNA가 숙주 DNA와 결합하고, 용균현상으로 파지가 나올 때 자신의 DNA를 일부 잃는 대신 숙주 DNA의 일부를 갖고 나오는 경우가 있다. 이러한 파지가 다른 세균에 감염되면, 전 숙주의 유전자를 새롭게 도입하는 게 되어 새로운 형질이 나타나게 된다.
"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 발명의 일 실시예에서는 인간을 대상으로 하였다.
"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다.
"치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
"세포치료제"는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방 의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다.
치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 가축 및 동물원, 스포츠 혹은 개, 말, 고양이, 소, 원숭이 등의 애완용 동물을 포함하여 포유류로 분류되는 어떠한 동물도 가리킨다. 바람직하게는 상기 포유류는 인간이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 중뇌 특성을 갖는 도파민 신경세포로의 분화방법에 관한 것이다.
"도파민(DA) 신경세포"는 티로신 수산화효소(Tyrosine Hydroxylase, TH)을 발현하는 신경세포를 말한다. 본 발명에서는 "도파민성 신경세포", "도파민 뉴런", "DA" 등으로 혼용하여 사용한다. 도파민 신경세포은 중간 뇌 흑색질에 특이적으로 위치하고, 생체 내에서 선조체, 변연계 및 신피질을 자극하여 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다.
특히, 실제로 체내에서 도파민성 신경세포로 기능하기 위해서는 중뇌 특성을 나타내야만 한다.
파킨슨병과 같은 많은 뇌 신경질환들은 중간뇌 흑색질 중 도파민 신경세포의 손상을 특징으로 하고 있기 때문에, 상기 흑질 치밀부의 손상된 도파민 신경세포들을 대체(replacement)할 수 있는 치료로써, 실제 중뇌 특성을 가지는 도파민성 신경세포의 분화 및 증식이 필요하다.
실제로 태아의 중뇌세포를 파킨슨 증후군 환자의 뇌에 이식하였을 때에, 혹은 파킨슨 증후군의 동물 모델등에 이식하였을 때에 이들 이식세포가 기능을 가진 도파민성 신경세포의 역할을 보이며 또한 운동기능도 향상된다는 보고는 여러 연구팀에 의해 이미 수년 전부터 발표되었었다.
본 발명은 일 관점에서 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 FoxA2 및 Nurr1를 동시발현시키는 것에 의해 중뇌 특성을 나타내는 도파민 신경세포로 효과적인 분화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용하는 세포는 신경줄기세포 또는 신경전구세포이다. 바람직하게는 영장류의, 가장 바람직하게는 인간 유래 신경전구세포이다.
"신경줄기세포(Neural stem cells)" 는 20-30회 이상 세포 분열을 수행할 수 있고, 뉴런 및 신경아교세포를 생성할 수 있는 분화능(potency)을 유지하는 세포를 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 40회 이상, 보다 바람직하게는50회 이상, 가장 바람직하게는 무제한적인 세포 분열을 수행할 수 있다.
신경줄기세포는 대칭적으로, 또는 비대칭적으로 분열할 수 있다. 대칭적으로 분열할 때, 신경줄기세포는 분열하여 두 개의 딸 신경줄기세포 또는 두 개의 수임 전구세포를 형성할 수 있고, 달리 특정되지 않으면, 본 명세서에서 대칭적 분열은 대칭적 자가-분열(self-renewal)을 의미하고; 비대칭적으로 분열할 때, 신경줄기세포는 분열하여 하나의 딸 신경줄기세포 및 하나의 수임 전구세포(예를 들면, 뉴런 전구세포)를 형성한다.
본 발명의 신경줄기세포는 다분화능(multipotent)으로 정의되고, 즉, 다수의 신경세포 유형들(예를 들면, 뉴런/신경아교세포)로 분화할 수 있다.
다양한 출처로부터 본 발명의 신경줄기세포를 수득하는 것이 가능하다. 특히, 인간, 영장류, 설치류, 및 조류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 신경줄기세포는 포유류, 특히, 마우스, 랫트 및 인간으로부터 유래된다. 예를 들면, 신경줄기세포는 배아, 성체 조직, 태아조직, 배아줄기(ES) 세포(야생형 ES 세포 또는 유전적으로 변형된 ES 세포)로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는 인간 태아의 뇌로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 뇌는 종뇌, 간뇌, 중뇌, 소뇌, 연수, 뇌교 및 척수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 중뇌로부터 유래한 것일 수 있다. 상기 인간의 신경줄기세포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고, 바람직하게는 인간 태아의 뇌 조직으로부터 얻은 세포를 신경줄기세포 성장인자가 첨가된 배지에서 배양하여 제조할수 있다. 신경줄기세포 성장인자는 bFGF(fibroblast growth factor-basic), LIF(leukemia inhibitory factor) 및 헤파린(heparin)을 사용할 수 있다.
일 구체예서, 본 발명의 신경줄기세포는 마우스 ES 세포 또는 인간 ES 세포로부터 유래된다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 신경전구세포를 사용할 수 있다. '신경전구세포'는 성숙한 뉴런(신경세포)인 자손을 생성할 수 있는 세포이다.
상기 신경전구세포는 배아 혹은 성체 줄기세포나 신경줄기세포로부터 분화시켜 사용할 수도 있고, 또는 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 직접 분리하여 사용할 수 있다.
당업계에 알려져 있는 통상적인 방법 등에 의해 줄기세포 또는 신경줄기세포를 신경전구세포로 분화시킬 수 있다. 상기 분화방법의 구체적인 예로서, 이하와 같은 방법들이 있다.
신경 전구세포와 같은 외배엽성 세포로 분화시키기 위해 가용성 인자 및 성장 인자와 같은 생화학적 분화 유도물질을 함유하는 배지에서 배양함으로써 수행할 수 있다. 이 때, 상기 "성장 인자"는 세포 증식 및 분화 활성의 1차 결과로 세포 표면 상에서 수용체에 결합하는 단백질을 의미하고, 가용성 인자로는, 예를 들어, 뉴로트로핀, 미토겐, 줄기 세포 인자, 성장 인자, 분화 인자(예를 들면, TGF-β 상과), TGF-β 상과 아고니스트, 향신경성 인자, 산화제, 신경전달물질 및 생존 인자 등이 있다. 많은 가용성 인자는 수많은 상이한 세포 유형에서 세포 분할을 자극하는 반면에, 다른 것은 특정 세포 유형에 특이적이다. 신경세포 유형의 분화를 특이적으로 조장하는 통상의 분화제로는, 프로게스테론, 푸트레신, 라미닌, 인슐린, 아셀렌산나트륨, 트랜스페린, 뉴르투린, 소닉 헤지호그(SHH), 노긴, 폴리스타틴, 상피성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들면 FGF-4, FGF-8, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 성장 및 분화 인자 5(GDF-5), 뉴로트로핀 3(NT-3), 뉴로트로핀 4(NT-4), 뇌 유도 향신경성 인자(BDNF)), 형질전환 성장 인자 α(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타-3(TGF β3), 혈소판 유도 성장 인자(PDGF-AA), 인슐린양 성장 인자(IGF-1), 골형태형성 단백질(BMP-2, BMP-4), 신경아교 세포 유도향신경성 인자(GDNF), 레티노산(RA), 미드카인, 아스코르브산, 디부티릴 cAMP, 도파민 및 gp130과 착화하는 수용체에 대한 리간드(예컨대, LIF, CNTF, SCF, IL-11 및 IL-6) 등이 있다.
본 발명의 중뇌 특성을 나타내는 도파민 신경세포로의 분화방법은 상기 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1를 도입하여 발현시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 한다.
Nurr1은 중뇌 도파민성 신경세포에서 발현되는 스테로이드/방패샘(steroid/thyroid) 호르몬 수용체에 속하는 전사인자로서(Law, et al., Mol. Endocrinol., 1992,6:2129), 도파민성 신경세포에서 발현되어(Zetterstrom, et al., Mol. Brain Res., 1996, 41:111) 중뇌 도파민성 신경세포의 발생에 역할을 할 것이라 여겨지고 있다. 그러나, Nurr1의 단독발현으로 인한 도파민성 신경세포로의 분화 상승효과는 5% 미만이다(실시예 참조).
FoxA2는 중추 신경계에서 발현되는 전사인자로서, 중뇌 도파민성 신경세포 발달과의 연관성은 거의 알려진 바가 없다.
그러나, 본 발명에서는 상기 두 유전자를 신경전구세포에서 동시 발현시킴으로써 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화가 현저히 증가시키는 것을 특징으로 한다.각각의 유전자 단독발현과 비교하여 도파민 신경세포로의 분화효율이 약 10배 이상 증가한다.
특히, 본 발명은 Nurr1 유전자와 더불어 "FoxA2" 유전자를 도파민성 신경세포로의 분화유도에 사용함을 주요한 일 특징으로 하고 있으며, 이하와 같은 FoxA2 유전자의 기능을 규명하였다(실험예 1 참조).
(1) FoxA2는 티로신 수산화 효소(TH)를 코딩하는 유전자 발현에 있어서, TH 프로모터에 직접 결합함으로써 TH 발현증가 효과를 가져온다. 즉, 도파민 신경세포로의 분화유도를 촉진한다. 이 때, 상기 FoxA2의 TH 프로모터에의 결합율은 Nurr1이 함께 발현될 때 더욱 증가한다. 상기 FoxA2의 TH 프로모터 결합서열은 다음과 같다:CAATATTTGT.
(2) Foxa2를 발현시켰을 때, 중뇌 발달관련 유전자인 wnt-3a, corin, lmx1b와 중뇌와 중뇌흑질 (A9) 도파민 신경세포 특이유전자인 Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2등의 발현도 더욱 증가한다.
(3) Nurr1 단독 발현에 의해 유도된 도파민 신경세포가 신경세포로서의 분화 및 성숙이 미진함과는 달리, Nurr1과 Foxa2를 함께 발현시키는 경우 생성된 도파민 신경세포가 형태학적으로 성숙한 신경세포로서의 모양을 보인다.
특히, 두 유전자에 의해 분화된 대부분 (>90%)의 TH발현 도파민 세포들은 성숙된 신경세포로, 도파민 신경세포 마커인 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, DAT가 발현하고, 현저히 증가된 도파민 신경세포기능, 예를 들어 도파민 신경전달물질 분비능 및 재흡수능 등이 증가한다. 즉, Foxa2는 도파민 신경세포의 형태학적·기능적 성숙을 유발시킨다.
(4) Foxa2 과발현시, 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 증식이 현저히 억제된다. 이는 Foxa2에 의해 세포분열 억제인자(예를 들어, p15, p16, p21, p27) 발현이 증가되고, 이로 인해 세포분열억제현상이 나타나게 된다.
(5) 신경줄기세포 분열(증식)억제는 일반적으로 세포분화를 동반하는데, Foxa2 과발현시에도 마찬가지로 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 분열억제와 동반하여 신경세포쪽으로 분화가 유도된다. 이러한 Foxa2에 의한 신경세포로의 분화유도는 신경세포 분화인자인 Ngn2, NeuroD 등의 발현 유도에 의해 확인가능하다.
(6) Nurr1 단독 발현에 의해 분화된 TH+도파민 세포는 분화기간 동안 그 수가 현저히 감소하였으나 Nurr1과 Foxa2 동시발현에 의해 유도된 TH+도파민 세포수는 매우 잘 유지된다. 이는 Foxa2가 분화중인 또는 분화된 도파민 신경세포의 세포사멸을 억제하여 생존을 촉진하기 때문이다. 또한 Foxa2는 파킨슨독소인 H2O2 및 MPP+에 의해 유도되는 세포사멸도 억제한다. 이러한 세포 생존능 증가는 Foxa2이 신경줄기세포 및 신경세포의 세포생존인자로 알려진 BDNF, GDNF, NT-3, SHH 유전자 발현을 유도하기 때문이다.
이처럼, 본 발명에서 중뇌 특성의 도파민 신경세포로의 분화효율을 현저히 상승시킬 수 있는 것은 Nurr1 유전자와 더불어 상기 기능을 발휘하는 "FoxA2" 유전자를 사용하는 구성을 취하기 때문이다.
한편, 본 발명의 방법에서 "FoxA2 및 Nurr1를 도입(형질도입)한다"는 것은 두 유전자를 암호화하는 핵산을 신경줄기세포 또는 신경전구세포로 도입하는 것을 말한다. 두 유전자는 각각 별도로 또는 동시에 도입될 수 있다.
신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1를 코딩하는 유전자를 도입하기 위해 DNA-칼슘 침전법,리포좀을 이용하는 방법, 폴리아민 계열을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 레트로바이러스를 이용하는 방법, 아데노바이러스를 이용하는 방법 등 당분야에 공지된 유전자의 세포내 도입기술 방법이 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 FoxA2 및 Nurr1 도입은, 일 구체예로서 FoxA2 및 Nurr1를 암호화하는 핵산을 각각 별개의 발현 벡터 또는 하나의 발현벡터에 삽입시킨 후, 이를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 도입하는 것을 포함한다.
상기 FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 각 핵산은 당업계에 공지된 FoxA2 및 Nurr1를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
또한 상기 핵산은 FoxA2 및 Nurr1의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는80％,보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 본 발명의 FoxA2 및 Nurr1과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.
상기에서 '동등한 생리활성'이란 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 중뇌 특성의 도파민성 신경세포로의 분화를 유도하는 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물이란 FoxA2 및 Nurr1의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％,71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％,88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 상기 기능적 동등물은 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다.
또한 상기 FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다(Sambrook, Fritsch and Maniatis, 'Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory press, 1989; Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992). 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술이 있다.
상기 FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. '작동 가능하게 연결된다(operably linked)'는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 또한, 발현 조절 서열(expression control sequence)이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 이들을 통틀어 'FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물'이라고 표현할 수도 있다.
'발현 벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등이 있다. 특히, 레트로바이러스를 이용하는 방법이 바람직하다.
상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다
본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAEDextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 신경줄기세포 또는 신경전구세포 내로 도입할 수 있다.
예를 들어, FoxA2 및 Nurr1를 레트로바이러스 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제작한 후, 이 벡터를 포장(packaging) 세포에 형질도입하고, 형질도입된 포장세포를 배양한 후 여과하여 레트로바이러스 용액을 얻고, 이를 이용하여 신경전구세포를 감염시킴으로써 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1 유전자를 도입할 수 있다. 이어서, 상기 레트로바이러스 벡터에 포함된 선별마커를 이용하여 FoxA2 및 Nurr1를 동시 발현하는 신경전구세포를 수득할 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 FoxA2 및 Nurr1을 발현 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의하여 제조될 수 있다:
(a) FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(construct)을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계;
(b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 FoxA2 및 Nurr1 발현 재조합 바이러스를 제조하는단계; 및
(c) 상기 FoxA2 및 Nurr1 발현 재조합 바이러스로 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 감염시키는 단계.
먼저, FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물(construct)에 대해서는 위에서 설명한 바와 같다. 상기 DNA 구조물을 발현 조절 서열, 예컨대 프로모터에 작동가능하게 연결하고 당업계에 공지된 바이러스 벡터에 삽입시켜 재조합 바이러스 벡터를 제조한다.
이후, FoxA2 및 Nurr1을 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 도입하여 FoxA2 및 Nurr1을 발현하는 재조합 바이러스를 제조한다. 상기 바이러스 생산 세포주는 사용한 바이러스 벡터에 해당하는 바이러스를 생산하는 세포주를 사용할 수 있다.
그리고 나서, FoxA2 및 Nurr1을 발현하는 재조합 레트로바이러스를 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 감염시킨다. 이는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 FoxA2 및 Nurr1을 발현하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 및 배양될 수 있다.
본 발명의 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 목적 세포 타입의 생존 또는 증식을 뒷받침하는 배양액 내에서 배양된다. 종종 혈청 대신 자유 아미노산으로 영양을 공급하는 배양액을 사용하는 것이 바람직하다. 신경세포의 지속적인 배양을 위해 개발된 첨가제를 배양액에 보충하는 것이 바람직하다. 예컨대, Gibco 사에서 시판되는 N2 및 B27 첨가제가 있다. 배양시 배지와 세포의 상태를 관찰하면서 배지를 교환해 주는 것이 바람직하다. 이 때, 신경줄기세포가 계속 증식하여 서로 뭉쳐서 신경구(neurospheres)를 형성하면 계대배양을 실시하는 것이 바람직하다. 계대배양은 약 7-8일 마다 실시할 수 있다.
한편, 본 발명의 FoxA2 및 Nurr1을 발현하는 신경줄기세포 또는 신경전구세포는 중뇌 특성을 나타내는 도파민 신경세포로 분화한다.
중뇌 특성의 도파민 신경세포라 함은, 중뇌 흑질부에서 생성되는 도파민 신경세포의 표식 인자를 가지며 배지 내로 도파민을 분비하고 동물모델에 이식했을 때 기능회복을 보이는 세포를 말한다. 예를 들어, 중뇌 발달관련 유전자인 wnt-3a, corin, lmx1b와 중뇌와 중뇌 흑질 도파민 신경세포 특이유전자인 Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2등의 발현이 나타난다.
일반적으로 분화(differentiation)는 세포배지에 신경줄기세포 증식유발 사이토카인은 첨가하지 않고 적절한 기질 또는 분화 시약이 첨가되는 영양 배양액을 함유하는 배양 환경에서 실행한다. 적절한 기질은, 양전하로 코팅된 고체 표면, 예를 들면 폴리-L-라이신 및 폴리오르니틴이 적합하다. 기질은 세포외 매트릭스 성분, 일례로 피브로넥틴 및 라미닌으로 코팅 가능하다. 기타 허용되는 세포외 매트릭스는 매트리겔(Matrigel)을 포함한다. 기타 적절한 것은, 폴리-L-라이신을 피브로넥틴, 라미닌, 또는 이들의 혼합물과 혼합한 조합 기질이다.
적당한 분화 시약은 다양한 종류의 성장 인자, 예를 들면, 표피 성장 인자(EGF), 전환성장인자 α(TGF-α), 임의의 형태의 섬유아세포 성장인자(FGF-4, FGF-8 및 bFGF), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1 등), 고농도의 인슐린, 골형성 단백질(특히, BMP-2 및 BMP-4), 레틴산(RA) 및 gp130과 복합하는 수용체에 대한 리간드 (예: LIF, CNTF 및 IL-6)이 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포의 뇌신경계질환 회복을 위한 용도를 제공한다. 특히, 도파민 신경세포의 손상에 의해 야기되는 신경계 질환에 대한 치료적 용도를 제공한다.
예를 들면, 이들 세포는 치료하고자 하는 질환 또는 상태에 따라서 중뇌이 흑질 등의 부위로 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 직접 이식함으로써 치료적으로 사용할 수 있다. 또한, FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 치료학적 유효량으로 함유하는 조성물의 형태로 투여 또는 이식함으로써 치료적으로 사용할 수 있다. 그리고, 본 발명은 도파민 신경세포의 변성 또는 변형을 특징으로 하는 신경변성 장애 또는 신경병의 치료 방법도 포함한다.
상기 뇌신경계 질환은 파킨슨병, 신경통, 관절염, 두통, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 불면증, 치매,우울증, 디스키네시아, 알츠하이머 질환, 루이제 치매, 헌팅톤 질환, 뚜렛 증후군, 불안, 학습 및 기억 손상,퇴행성신경질환 등의 신경계의 기능 감소 또는 이상으로 인하여 뇌 또는 신경계에 나타나는 질환을 말한다. 바람직하게는 파킨슨 병의 치료에 유용하다.
"치료" 또는 "치료하다"는 치료학적 처치 및 예방 또는 방지 수단이다. 그러므로, 치료가 필요한 자들은 이미 신경변성 장애 또는 신경병을 가진 자, 뿐만 아니라 신경변성 장애 또는 신경병을 예방하고자 하는 자들을 포함한다. 본 발명의 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 영장류 및 가축, 사육,애완용 또는 스포츠 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 치료가 필요한 임의의 포유동물을 치료하는 데 사용할 수 있다. "장애"는 신경 원시세포, 분화된 신경세포 또는 본 발명의 세포의 두 가지 유형으로 치료하여 이익이 되는 임의의 상태이다.
상기 치료적 용도로서, 본 발명의 일 태양으로 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 질환 치료용 조성물 또는 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명의 세포 치료제는 손상된 도파민성 신경세포를 보충(재생)하거나 다시 구축(복원)한다. "재생(regeneration)"이란 형성된 기관 또는 개체의 일부가 상실되었을 때 그부분이 보충되는 현상이고, "복원"이란 "재구성(reconstitution)"이라고도 할 수 있는데, 이는 조직의 재구축을 의미하는 것으로 일단 해리된 세포나 조직으로부터 조직이나 기관을 다시 구축하는 것을 말한다.
본 발명의 치료용 조성물 또는 세포치료제는 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조될 수 있다. 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있으며 전형적으로 막을 통과하는, 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료용 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제 또는 동결건조제제, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 또는 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다.
예를 들어, 경구 투여시에는 결합체, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 또는 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 뇌 또는 신경계 질환을 치료하는 방법은 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질이 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 투여방법으로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 세포가 소화될 수 있으므로 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서 분해되는 것을 보호하기 위해 제형화하는 것이 바람직하다.
또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류 (예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 치료용 조성물을 이용하여 뇌 또는 신경계 질환을 치료하는 방법은, 본 발명의 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 약학적 유효량은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 태양으로, 앞서 설명한 FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포; 또는 이들이 분화된 중뇌 특성의 도파민 신경세포; 또는 이를 함유하는 조성물의 형태로 치료학적 유효량으로 병변 부위에 직접 이식하는 것을 포함하는 뇌신경계질환 치료방법에 관한 것이다. 이식 및 세포 배양의 방법은 당업자에게 널리 알려진 공지의 방법을 사용할 수 있다.
상기 세포의 "치료학적 유효량"은 도파민성 신경세포의 손실, 손상 또는 변성에 의해 유발되는 환자의 생리학적 효과를 중지 또는 경감시키기에 충분한 양이다.
사용된 세포의 치료학적 유효량은 환자의 필요성, 환자의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 소정의 치료 효과, 치료에 표적하고자 하는 조직의 크기 및 면적, 병변의 정도 및 선택된 전달 경로에 의존할 것이다. 예를 들면, 뇌의 더 큰 영역에 영향을 주는 장애의 치료는 보다 작은 표적 영역과 비교하였을 때 치료 효과를 달성하기 위하여 보다 다수의 세포를 요할 수 있다. 또한, 세포는 저 세포 투여량의 다중 소형 이식편으로 소정의 표적 조직내 1 이상의 부위에 투여할 수 있다. 본 발명의 세포는 이식 전에 완전히 분리되어, 예컨대 단일 세포의 현탁액을 형성하거나, 또는 이식 전에 거의 완전히 분리되어, 예컨대 세포의 소형 응집물을 형성할 수 있다. 세포는 이들을 소정의 조직 부위로 이식 또는 이동시키고, 기능적으로 결핍된 영역을 재구성 또는 재생하는 방식으로 투여할 수 있다.
치료학적으로 유효하게 달성하도록 투여할 수 있는 세포의 적당한 범위는 당업자의 통상의 지식 내에서 환자에 맞추어 적절히 사용할 수 있다. 예를 들어 약 1,000 내지 10,000,000 세포, 혹은 그 이상 일수도 있으나, 고용량이 되면 암세포로 변할 가능성을 완전히 배제할 수 없으므로 2,000,000 내지 4,000,000 정도가 바람직할 수 있다.
그러나, 투여량은 이에 한정되지 않고, 제형의 종류, 투여 방법, 환자의 연령이나 체중, 환자의 증상 등을 고려하여 최종적으로는 의사의 판단에 의해 적절히 결정할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
각 세포배양 실험에서, 세포 계수는 8-40 현미경 필드 조건의 무작위 선택에 의해 수행하였으며, 얻어진 데이터는 3 내지 5의 독립적인 실험의 평균±SEM으로 표시하였다.
통계 비교는 2이상의 그룹이 포함될 때 Student’s t-test 또는 one-wayANOVA with a post hoc analysis (SPSS 16.0; SPSS Inc., Chicago,IL, http://www.spss.com)으로 수행하여 비교하였다.
도파민(DA) 방출 및 흡수를 평가하였다. 표준 프로토콜로서 RT-PCR, 면역형광 및 웨스턴 블럿 분석이 적용되었다. 총 RNA 제조, cDNA 합성 및 RT-PCT 반응을 통상 알려진 방법대로 수행하였다. 루시퍼라아제 리포터 및 ChIP 분석방법을 이용하였다.
실시예
1 : 신경전구세포(
NPC
) 배양 및 형질도입
12일째 마우스(ICR) 배아(E12)의 뇌 영역 및 E 14 스프래그-다우리(Sprague-Dawley) 랫트 배아의 대뇌피질(Cortex)로부터 분리한 신경전구세포(NPC)를 배양하였다. 그리고, 인간 배아줄기세포(hES) in vitro 분화 프로토콜에 의하여, 인간 배아줄기세포(HSF-6; University of California,San Francisco)로부터 신경전구세포를 수득하였다.
세포들을 커버슬립(계대되지 않은 (P0) 배양용, 12mm 직경, Carolina Biological Supply Company,Burlington, NC) 또는 10 ㎝ 조직배양접시 (계대된 (P1) 배양용, Corning, NY, 폴리오르니틴/피브로넥틴으로 미리 코팅시킴)에 20,000cells/cm2으로 배양시켰다. 20 ng/㎖의 bFGF(basic fibroblast growth factors)(R&D Systems, Minneapolis, MN)가 포함된 무혈청 N2 배지하에서 상기 신경 전구세포를 증식시켰다.
바닥의 60-80%를 덮은(전형적으로 시험관내(in vitro) bFGF-증식에 3-4일 소요됨) 전구체를 1시간 동안 CMF-HBSS하에서 배양한 다음 물리적으로 떼어내고 N2+bFGF(P1 단세포물)내 미리 코팅된 커버 슬립상에 배양시켰다.
몇몇 실험용으로, CMF-HBSS에 1시간 배양된 전구체를 cell lifter (Corning)를 이용하여 떼어내고 추가 분쇄없이 폴리오르니틴/피브로넥틴 코팅된 커버 슬립상에서 직접 배양시켰다(P1 클러스터).
바닥의 50-60%를 덮을때(전형적으로 세포 재치후 1-2일 소요됨) P1 혹은 P0 세포에 레트로바이러스성 형질 도입을 수행하였다. 증식하는 신경전구세포들을 Nurr1 (Flag-tagged), Small Heterodimer Partner-1 (SHP), DAX-1, estrogen related receptor-c (ERRc), RXRa, Foxa1, 및 Foxa2 (hemagglutinin (HA)-tagged)를 발현하는 레트로바이러스로 형질도입하였다.
본 연구에 사용된 발현 벡터는 대한민국 특허 344090을 기반으로 하여 레트로바이러스성 벡터 pIRES-LacZ 혹은 pIRES-GFP에 기초하여 만들었다. 상기 레트로바이러스성 벡터는 293gpg 패키징 세포(Lipofectamine, Invitrogen)내로 유전자전이하였고 바이러스성 분획(VSV-G pseudotyped 재조합 레트로바이러스)을 포함하는 상청액을 접종 72시간후 얻었다. 바이러스성 적정기로 5x106 particles/ml로 조정하였다. 신경전구체를 폴리브렌(1mg/ml) 존재하에 2시간동안 바이러스성 상청액과 함께 배양하였다. 공동 발현 연구는 세포를 각각의 바이러스성 제조물(1:1, v:v)의 bi-/tri-cistronic 벡터 혹은 그 혼합물로 감염시켜 수행하였다.
바이러스 도입 후 1일째 분화를 유도하였다. 세포 분화는 200mM 아스코르브산(AA, Sigma, St Louis, MO)이 포함된 무혈청 N2 배지 내에서 bFGF 투여중지에 의해 유도하였다. 5% CO2 배양기에서 37℃ 배양을 유지하고, 이틀에 한번씩 배지를 갈아주었으며, bFGF는 분화 전까지 매일 넣어주었다.
실험 결과를 도 1에 나타내었다.
우선, TH(Tyrosine Hydroxylase) 유전자 발현 기전을 확인하였다.
신경전구세포에 Nurr1 (N), Foxa2 (F), Nurr1+Foxa2 (N+F) 또는 LacZ (control; C)를 형질도입한 결과, 마우스 태아 대뇌 피질 (cortex)유래의 신경줄기세포에서 Nurr1 전사인자 발현시 소수 (<5%)의 세포만이 도파민 신경세포 마커인 TH(tyrosine hydroxylase)를 발현하였고(도 1 b), Foxa2의 발현에 의해서도 비슷한 정도의 도파민 신경세포 분화가 일어났다(도 1 c). 그러나, Nurr1과 Foxa2를 동시에 발현시 도파민 신경세포 분화가 10배 이상 증가하였다(도 1 d). 그리고 이러한 수치를 도 1의 e에서 그래프로 표시하였다. .
즉, Foxa2 및 Nurr1 의 동시 발현이 신경전구세포로부터 TH+ 세포로의 분화를 매우 현저하게 향상시킴을 확인할 수 있었다.
이와 같은 Nurr1과 Foxa2에 의한 도파민 신경세포 분화의 synergism현상은 in vitro 분화 3일 후에 RT-PCR을 이용하여 수행한 TH mRNA정량분석 (도 1 f)과 TH 프로모터 분석(도 1 g)에서도 입증되었다.
그리고, TH promoter에 consensus Foxa2 binding site (도 1 i)를 제거한 mutant TH promoter를 제작하고 luciferase assay를 수행하였다. 그 결과를 도 1 j와 h에 나타내었다.
즉, 변이 프로모터에서는 루시퍼라아제 활성이 급격히 감소하여(도1 j), Foxa2에 의한 TH 유전자 발현 증가 효과는 Foxa2 단백이 직접적으로 TH 프로모터에 결합하여 일어남을 알 수 있었다.
또한, Foxa2 유전자의 TH promoter 결합은 Nurr1이 Foxa2와 함께 발현될 때 현저히 증가함을 Chromatin immuno-precipitation assay를 통해 입증하였다 (도 1 k).
실험예
2 :
Foxa2
발현에 의한 기능 확인
(1) 다양한 중뇌 도파민 신경세포 발생과정에서의 전사인자의 발현 조절
LacZ (C) 및 Foxa2(F)를 형질도입시킨 E12 마우스 대뇌피질 세포로부터 RNA를 준비하여, semi-quantitative 및 real-time PCR 분석기를 이용하여 mRNA 발현을 관찰하였다.
중뇌 DA 뉴런-특이적 마커의 mRNA 발현에 대한 결과를 도 2 a에 나타냈다. 또한 오른쪽 그래프는 real-time PCR에 의해 측정된 각각의 대조군에 상대적인 mRNA 값을 나타낸 것이다(n=3). 각 막대에는 평균 발현량을 나타낸다.
도 2 a로부터 알 수 있는 바와 같이, 배양된 신경줄기세포에서 Foxa2를 발현시켰을 때 중뇌 발달관련 유전자 wnt-3a, corin, lmx1b와 중뇌 및 중뇌흑질 (A9) 도파민 신경세포 특이유전자 (Nurr1, Ptx3, AHD2, GirK2 등이 RT-PCR 분석상 증가하였다. P <0.001에서 각각의 대조군에 비해 현저히 증가한 값을 나타냈다.
그리고, Nurr1 또는 Ptx3 발현에 있어서 Foxa2-매개 유도 효과를 알아보았다(b 내지 j).
도 2의 b 및 c는 Nurr1-면역반응성 세포의 대표적인 이미지를 나타낸 것이다. TH/Nurr1-염색된 세포를 작게 함께 표시하였다. 그래프 E는 전체 세포로부터 % Nurr1+ 세포를 표시한 것이고, HA-Foxa2-형질도입된 배양에서 Foxa2/Nurr1-colabeled (HA+/Nurr1+) 세포를 d에 나타냈다.
도 2의 f 내지 o에서는 Foxa2-유도된 Ptx3 발현에 대해 나타내고 있다. 도 2 f~i 및 k~n은 각각 배지에서 분화 3일 후의 Ptx3+ 세포 및 Ptx3+/TH+ 세포들의 대표적인 이미지이다. 외생성(Exogenous) Foxa2(HA)/Ptx3-염색된 현미경 필드의 이미지를 작게 함께 표시하였다(g 및 i). 그리고 화살표로 세포의 고-확대 사진을 m 및 n에 나타냈다(Scale bars: 40μm). 전체 DAPI+ 세포로부터% Ptx3+ 세포를 도 2의 j 그래프에 나타냈고, 전체 TH+ 세포로부터 % Ptx3+,TH+ 이중 양성 세포 (Ptx3을 발현하는 TH+ 세포)를 도 2 o에 나타내었다.
즉, 면역화학검사법을 통해 Foxa2을 형질도입한 경우 Nurr1과 Ptx3 발현 세포수가 증가함을 알 수 있었다.
(2)
Foxa2
의 중뇌 도파민 신경세포 성숙과정에서의 역할 규명
Nurr1 단독 발현에 의해 유도된 도파민 신경세포는 신경세포로서의 분화 및 성숙이 미진한 문제가 있었다. 이에 Nurr1과 Foxa2를 같이 발현유도시 생성된 도파민 신경세포의 성숙성 여부를 확인코자 하였다. 모든 면역세포화학적 기능적 분석은 in vitro 분화 후 15 일되는 E12 마우스 대뇌피질 신경전구세포 배양체를 이용하여 수행하였다.
Nurr1+Foxa2 과발현에 의해 유도된 TH+ 세포에서 TuJ1(a), MAP2 (b), HuC/D (c) 및 성숙 DA 뉴런 VMAT2 (d)에 대해 특이적인 단백질의 동일 위치화를 도 3 a~d에 도시하였다. 화살표로 함께 표지된 세포들을 확대하여 나타내었다(Scale bar, 50 μm). 그래프 도 3e는 총 TH+ 세포 중 이러한 신경세포 마커 단백질을 공동 발현하고 있는 TH+ 세포 %를 나타낸 것이다. 도 3f에서 LacZ (c), Nurr1 (N), Foxa2 (F), Nurr1+Foxa2 (N+F)로 형질도입시킨 경우의 DA 뉴런 항상성 유전자 DAT (왼쪽) 및 VMAT2 (오른쪽)에 대한 Real-time PCR 결과를 나타냈다. 발현 평균값을 막대로 나타냈다. 알 수 있는 바와 같이, 대조군에 비해 Nurr1+Foxa2 (N+F)의 경우 현저히 증가하였다(P <0.01, n=6).
즉, 두 유전자에 의해 분화된 대부분 (>90%)의 TH발현 도파민 세포는 성숙된 신경세포, 도파민 신경세포 마커인 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, DAT가 발현됨이 확인되었다(도3 a-f).
그리고, DA 방출에 대한 HPLC 결과를 도 3g에 도시하였다. 24시간 동안 조건화된 배지상에서의 DA 수준을 왼쪽 그래프에 나타냈고(24hr CM), 15분 동안 KCl-유도된 탈분극(depolarization)에 의해 유발시킨 경우를 오른쪽에 나타냈다(KCl evoked). KCL-유발된 방출 수준은 같은 시간 동안 56mM KCl을 보충한 동일 배지로부터 15분 동안 조건화된 배지에서의 DA 수준을 제외시켜 결정하였다. 역시 대조군에 비해 Nurr1+Foxa2 (N+F)의 경우가 DA 방출 수준이 훨씬 높았다.
그리고 도 3h에 DAT-매개된 특이적 DA 흡수를 전체 흡수량으로부터 나노특이적 흡수(nomifensine 이용)를 제외하여 계산하였다. 마찬가지로 대조군에 비해 Nurr1+Foxa2 (N+F)의 경우가 DA 흡수 수준이 훨씬 높았다. (P <0.01, Student’s t-test, n=4 for DA uptake 및 n=6 for DA release assays)
이처럼, 도파민 신경전달물질 분비능 및 재흡수능 분석에서 Nurr1+Foxa2 (N+F)의 경우가 현저히 증가된 도파민신경세포기능이 나타났다.
이와 같은 결과들은 Foxa2가 도파민 신경세포의 형태학적 기능적 성숙을 유발함을 보여주는 결과이다.
(3)
Foxa2
의 세포주기와 신경 분화에 관한 연구
형질도입 후 세포분화를 3일 동안 유도하였다. LacZ- (control) 및 Foxa2-형질도입된 세포 성장 프로파일을 형질도입 후 처음 4일 동안 살아있는 전체 세포수를 계수하였다. 세포수 증가 패턴을 분석하여 도 4a에 도시하였다. Foxa2-형질도입된 세포수가 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있다.
그리고, 뉴로스피어 형성 분석을 수행하였다. 1674(Foxa2) 및 1530(control) 뉴로스피어의 직경들을 3개의 독립적인 실험으로부터 측정하였다. 도 3c의 그래프는 뉴로스피어 직경의 범위내에서 스피어의 수를 표시한 것이다. 알 수 있는 바와 같이, Foxa2 형질도입은 대체로 작은 뉴로스피어(<100 μm)를 형성, 즉 뉴로스피어의 사이즈를 현저히 감소시켰다. 이는 도 3의 b에서도 확인할 수 있다.
또한, 증식특이 단백질 Ki67, BrdU, pHH3에 대하여 면역화학분석을 수행하였다. 감염 후 2일 째, Ki67에 대한 양성세포(d, e, j), BrdU에 대한 양성세포 (f, g, k) 및 pHH3에 대한 양성세포 (h, i, l)를 나타내고, i에는 화살표로 pHH3에 대한 면역반응성을 보이는 HA-양성 (Foxa2-발현) 세포가 없음을 함께 표시하였다. (Scale bar, 50 μm). P <0.001 에서 대조군과 현저한 차이를 보였다(Student’s t-test, n=3 독립적 배양)
또한, 유세포 분석결과를 도 4의 m 및 n에 도시하였다. 형질도입 후 2일째, LacZ-형질도입된 대조군의 세포주기 상태 결정을 위한 유세포 분석 결과(도 4m) 및 Foxa2-형질도입된 경우의 결과(도 4n)에 나타냈다. 그래프 상의 숫자는 4개의 독립적 분석으로부터 세포주기 단계에서 축적된 세포 %의 평균을 나타낸다.
상기 결과들로부터 Foxa2가 신경줄기세포에서 과발현시, 신경줄기세포의 증식을 현저히 억제한다는 사실을 알 수 있었다.
더욱이 Real-time PCR 분석결과(도 4o) 및 웨스턴 블랏 분석결과(도 4p)도 CDK 억제자의 iFoxa2-매개된 상향-조절을 보여주었다. 특히, P <0.01, n=3 에서 대조군과 비교해서 현저히 증가하였다. 즉, Foxa2에 의한 세포분열 억제현상이 세포분열억제인자인 p15, p16, p21, p27유전자 및 단백 발현을 증가 (도 4o-p)시킴으로 발생함을 알 수 있었다.
(4) 신경세포로의 분화
신경줄기세포 분열(증식)억제는 일반적으로 세포분화를 동반하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서도 Foxa2 과발현시 신경줄기세포의 분열억제와 동반하여 신경세포쪽으로 분화가 유도되는지를 확인하고자 하였다.
이를 위해 뉴런 특이적인 마커들, 전-뉴런 및 항-뉴런 bHLH 전사인자에 대하여 semi-quantitative 및 real-time RT-PCR 분석을 수행하였다. in vitro 분화 후 3일 째, mRNA 발현을 확인하였다.
그 결과를 도 5의 a에 나타내었다[semi-quantitative (위쪽) 및 real-time(아래쪽) RT-PCR]. 그래프 상의 숫자는 3회 real-time PCR 분석으로부터 각 대조군에 상대적인 mRNA 발현의 평균값을 의미한다.
Foxa2 과발현시 대조군에 비해 현저히 증가된 mRNA 발현을 확인할 수 있다(P <0.01, n=3).
그리고, in vitro 분화 3일 후, Foxa2-형질도입된 세포에서 Ngn2-면역반응성 세포의 현저한 증가(도 5 d, e, i) 및 신경 마커 TuJ1 (b-f), MAP2 (도5 g) 및 HuC/D (도5 h)들에 대해 양성을 나타내는 신경세포 군집들의 증가현상을 면역조직화학 분석 데이터 결과, 확인할 수 있었다(도 5 b-i). (Student’s t-test, n=3 독립적 배양). 도 5 c에서는 HA-Foxa2로 형질도입된 세포들 중 TuJ1+/HA+ 세포들의 대표적인 이미지를 함께 나타내었다(Scale bar,80um). 도 5 f~i의 그래프는 전체 DAPI+ 세포의 면역반응성 세포 %를 나타낸 것이다.
이러한 실험결과를 통해, Foxa2 과발현시 상기 (3)에서의 신경줄기세포의 분열억제와 동반하여 신경세포 쪽으로 분화가 유도됨을 알 수 있었고, 이러한 분화유도는 신경세포 분화인자인 Ngn2, NeuroD등의 발현 유도에 의함을 확인할 수 있었다.
(5)
Foxa2
의 사람
중뇌도파민성
신경세포 발생과정에서의 역할 관찰
지금까지 마우스 신경줄기세포에서 관찰된 Nurr1과 Foxa2 과발현에 의한 도파민 신경세포 분화가 종 (species)에 관계없이 관찰되는지를 알아보았다.
이를 위해, 마우스 대뇌피질 유래 신경줄기세포, 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포 및 사람 배아줄기세포 유래 신경줄기세포를 이용하여 비교관찰하였다.
그 결과, 도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 마우스대뇌피질 유래 신경줄기세포에서와 같이 (도7 a-b), Nurr1과 Foxa2가 과발현된 랫트 대뇌피질 유래 신경줄기세포 (도7 c-d) 및 사람 배아줄기세포 유래 신경줄기세포 (도7 e-f)에도 도파민 신경세포 분화가 원활이 일어남이 관찰되었다.
따라서, 이러한 결과는 본 발명에 따른 유전자 조작 방법이 인간의 뇌신경계 질환, 특히, 파킨슨 환자치료에 이용될 수 있음을 시사한다.
실시예
2 : 세포 증식 및
생존능
확인
5-브로모-2-데옥시우리딘(BrdU, Roche, Indianapolis, IN, http://www.roche.com)-통합(incorporation), 뉴로스피어 형성 분석 및 유세포 분석기에 의한 세포주기 분석을 이용하여 세포 증식을 확인하였다.
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 브로마이드, 테트라졸(MTT; Sigma,St. Louis, MO, http://www.sigmaaldrich.com) 테스트 및 H2O2 (25-200 lM; Sigma)의 존재하에서 사멸세포에 의해 ; 그리고 1-메틸-4-페닐피니디니움 아이오다이드(MPP+; 5-500 lM; Sigma)를 처리한 배양에서의 TH+ 세포수에 의해 세포 생존능을 평가하였다.
Foxa2
의 의한
도파민성
신경세포 생존 능력 향상 여부 확인
E14 랫트 대뇌피질 NPC를 Nurr1 (12.5 MOI)로 형질도입하면서, Foxa2 없이(a,c) 또는 함께(12.5 MOI, b, d) 형질도입하였다. 그리고, TH+ 세포 수를 분화 후 3일 및 15일에 측정하였다
그 결과, 도6 a-e로부터 알 수 있는 바와 같이, Nurr1단독발현에 의해 분화된 TH+ 도파민 세포는 분화기간 동안 그 수가 현저히 감소하였으나 Nurr1과 Foxa2동시발현에 의해 유도된 TH+도파민 세포수는 매우 잘 유도 및 유지되었다 (도6 a-e). 즉, Foxa2-발현은 TH+ 세포 수의 감소를 억제함을 알 수 있었다.
그리고, 생육가능한 세포의 총수를 위상차현미경하에 관찰하였다. 분해되고 응집된 아폽토시스 핵를 갖는 세포는 DAPI 염색으로 육안 관찰하였다. 세포 생존능력을 활성화된 캐스페이즈 3 (activatedcaspase 3) 검정 및 면역독성화학법을 사용하여 결정하였다.
분화 15일 째, 세포사멸성 핵을 가진 세포에 의해 사멸 세포(apoptotic cells)를 측정하고, 케스파제(caspase) 3+ 세포들을 분리해냈다(Scale bar, 20 μm) (도6 f-k). 알 수 있는 바와 같이, Nurr1 (e) or LacZ (j, k)-형질도입된 대조군과 현저한 차이를 보였다(P <0.05, Student’s t-test)
즉, 이를 통해, 상기 세포수 변화의 차이는 세포사멸의 차이에 의함을 apoptotic nuclei 및 caspase3+ 세포수 측정에 의해 확인할 수 있었다.
한편, E14 랫트 대뇌피질 NPC를 형질도입 후 6일동안 분화시키고 H2O2 (25-200μM) 또는 MPP+ (5-500 μM)를 24시간동안 처리하였다. H2O2-처리된 경우 세포 생존성은 MTT분석에 의해 측정하였고(l; n=6), 사멸세포 핵을 가진 세포수는 직접 계수하였다(m; n=6) 미처리된 대조군에 대한 상대적인 % MTT 값을 도 6 l에 나타내었다. 또한, MPP+-처리한 경우를 TH에 대해 면역염색한 후, 살아있는 TH+ 세포들을 계수하였다. 도 6 o에 나타낸 그래프는 미처리한 경우의 퍼센트로서 표시하였다. 이의 one-way ANOVA plus post hoc Dunnett’s test 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 각 독성 농도에서 대조군과 비교하여 현저한 차이를 나타냈다(P <0.05)
즉, 도 6 l-o에서 알 수 있는 바와 같이, Foxa2-발현 세포는 H2O2 (25-200μM) 또는 MPP+ (5-500 μM) 처리에 의해 유도된 독성 자극(toxic stimuli)에 저항성을 가지는 것이 확인되었다.
한편, 신경세포 성장인자들의 Foxa2-매개된 상향 조절 발현에 관해 알아보았다. 세포 생존 인자 BDNF, GDNF, NT3, 및 SHH의 mRNA 발현 수준을 Real-time RT-PCR 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 도6 p에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군과 비교하여 Foxa2 발현의 경우 상기 생존인자들의 발현도 현저히 증가함을 확인할 수 있었다(P <0.01, n=3)
상기와 같은 결과들은 Foxa2에 의해 세포생존능이 향상됨을 보여준다.
즉, Foxa2는 분화중인 또는 분화된 도파민 신경세포의 세포 사멸을 억제하여 생존을 촉진하고, 파킨슨 독소인 H2O2 및 MPP+에 의해 유도되는 세포 사멸도 억제한다(도6 l-o). Foxa2는 신경줄기세포 및 신경세포의 세포생존인자로 알려진 BDNF, GDNF, NT-3, SHH유전자 발현을 증가시키는바(도6 p), Foxa2에 의한 상기 세포 생존효과가 이와 같은 유전자 발현 유도에 의함을 추측할 수 있다.
실시예
3 :
In
Vivo
이식
Nurr1+Foxa2 과발현된 신경줄기세포를 파킨슨모델쥐의 선조체에 이식하고 세포 치료효과를 관찰하였다. E14 랫트 대뇌피질 유래 NPC에 Nurr1 (N) 및 Nurr1+Foxa2 (N+F)를 형질도입하고 성인 랫트 뇌의 선조체에 이식하였다.
6-하이드록시-도파민 (6-OHDA)-병변된 PD 랫트의 선조체에 후-형질도입 및 이식 후 2일 째 신경전구세포를 수득하였다. 이식 후 8주 동안 일정한 간격으로 4 경우에 대해서 암페타민-유도된 회전 불균형을 평가하였다. 이식체 부피 및 전체 TH+ 세포를 확인하였다.
우선, N (n=6) 및 N+F (n=10)가 형질도입된 NPCf를 이식한 모의-수술(sham-operated)(PBS-injected, n=6) 동물에서 암페타민-유도된 회전 불균형 실험으로 행동 회복성을 평가하였다.
그 결과를 도 8의 a에 도시하였다. 중앙 및 아래 그래프는 각각 N- 및 N+F-세포가 이식된 개개의 동물의 절대적인 회전 수를 나타낸다. 그리고 위의 그래프는 이식전 값과 비교한 회전 스코어에서 %변화의 평균±SEM 값을 나타낸다. N과 N+F의 경우 행동 회복성의 현저한 차이를 확인할 수 있었다. 즉, 암페타민 유도된 회전 불균형 테스트(Ampetamine-induced rotation test)에서 대조군 (Sham)과 Nurr1 단독 발현 신경줄기세포 이식쥐(N)에서는 회전 스코어(rotation score)가 의미있게 변화하지 않았으나, Nurr1+Foxa2 과발현 신경줄기세포를 이식한 쥐(NF)에서는 그 score가 현저히 감소하였다.
도 8의 b와 c는 이식 8주 후, N-(b 및 b’), N+F (c 및 c’)-형질도입된 세포들에 의해 생성된 TH+ 세포들의 공초점 이미지 사진이다(35 μm in z). 도8 b와 c의 점선 박스 영역을 확대하여 도8 b'와 c'로 나타냈다. 이식된 도파민신경세포는 형태학상 완숙한 신경세포의 모양을 보였다.
도 8의 d와 e는 이식 2주 후의 세포증식 마커 PCNA+ 세포들에 대한 사진이다. 이식 경계는 점선으로 표시하였다. 앞서 살핀 도 4의 in vitro 결과와 같이, 증식세포 마커인 PCNA+ 세포수는 Nurr1+Foxa2 이식 뇌조직에서 현저히 낮게 나타났다.
도 8의 f-i 그래프는 이식체 부피(graft volum)(f), 전체 생존 세포(g), TH+ 세포수(h) 및 PCNA+ 세포의 %를 나타낸다. N-세포 이식체와 N+F 세포 이식체의 결과 차이가 현저함을 확인할 수 있었다(P <0.001, Student's t-test, n=6 (N) 및 10 (N+F)). 즉, 면역화학검사상 Nurr1단독 발현세포 이식 부위에 비해 Nurr1+Foxa2 과발현 세포이식 뇌조직 부위에서, 이식체 부피(graft volume)(도8 f), 생존한 세포수 (도8 g)의 증가와 함께 TH+ 도파민신경세포의 수 (Fig. 8b-c, h)가 현저히 증가하였다.
그리고, 이식체에서 GFP(green fluorescent protein)-표지된 공여세포를 도 8의 j에 나타냈다. 공여세포는 N(Nurrl-IRES-GFP)+F로 형질도입함으로써 GFP로 표지하고, 이식 2주째에 GFP/DAPI(왼쪽) 및 GFP/TH(오른쪽)에 대해 염색하였다.
도 8의 k-m은 N+F 세포 이식에 의해 생성된 TH+ DA세포의 중뇌(midbrain) 및 A9 nigral 형태학적 발현을 나타내는 사진이다. N+F 이식체를 TH/Nurr1 (k), TH/GirK2 (l) 및 TH/Ptx3 (m)에 대해 염색하였다. 공통 표지된 세포들을 화살표로 나타내었다(Scale bars, 70 μm). 이를 통해 N+F 세포 이식에 의해 생성된 DA세포는 TH+ DA세포의 중뇌(midbrain) 및 A9 nigral 형태학적 발현을 보임을 확인할 수 있었다.
Claims (14)
- 신경줄기세포 또는 신경전구세포에 FoxA2 및 Nurr1을 도입하는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제1항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 중뇌특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신경전구세포는 배아 또는 성체 줄기세포로부터 분화시켜 수득한 것임을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제1항에 있어서, 상기 신경 전구세포는 포유동물의 중뇌(ventral midbrain), 대뇌 피질(cortex) 또는 측면 신경절 융기(lateral ganglionic eminence)(줄무늬체 원기(선조체 anlage))에서 분리된 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법
- 제1항에 있어서, 상기 도입은 바이러스 벡터를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제5항에 있어서, 상기 도입은 레트로 바이러스 벡터를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제1항에 있어서, 상기 FoxA2는 티로신 수산화 효소(TH)를 코딩하는 유전자 발현용 프로모터에 직접 결합되는 것을 특징으로 하는, 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제1항에 있어서, 상기 도파민 신경세포로의 분화는 그 과정 중 wnt-3a, corin, lmx1b, Nurr1, Ptx3, AHD2, 및 GirK2로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제1항에 있어서, 상기 도파민 신경세포는 TuJ1, MAP2, HuC/D, VMAT2, 및 DAT 로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제1항에 있어서, 상기 FoxA2는 도파민 신경세포 생존인자인 BDNF, GDNF, NT-3 및 SHH로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- 제1항에 있어서, 상기 FoxA2는 세포분열 억제인자인 p15, p16, p21, p27 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 도파민 신경세포로의 분화방법.
- FoxA2 및 Nurr1가 도입된 신경줄기세포 또는 신경전구세포; 또는 이들이 분화된 세포를 유효성분으로 함유하는 뇌신경계 질환 치료용 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 파킨슨병, 신경통, 관절염, 두통, 정신분열증, 간질, 뇌졸증, 불면증, 치매,우울증, 디스키네시아, 알츠하이머 질환, 루이제 치매, 헌팅톤 질환, 뚜렛 증후군, 불안, 기억 손상 및 퇴행성 신경질환으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 뇌질환은 파킨슨 병인 것을 특징으로 하는 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100063756A KR101544398B1 (ko) | 2010-07-02 | 2010-07-02 | ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100063756A KR101544398B1 (ko) | 2010-07-02 | 2010-07-02 | ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20120003098A true KR20120003098A (ko) | 2012-01-10 |
| KR101544398B1 KR101544398B1 (ko) | 2015-08-17 |
Family
ID=45610189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020100063756A KR101544398B1 (ko) | 2010-07-02 | 2010-07-02 | ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101544398B1 (ko) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190071930A (ko) * | 2017-12-15 | 2019-06-25 | 한양대학교 산학협력단 | 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법 |
| JP2019106895A (ja) * | 2017-12-15 | 2019-07-04 | インダストリー‐ユニバーシティー コーぺレーション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティ | 神経幹細胞または神経前駆細胞からドーパミン神経細胞への分化方法 |
| WO2020117031A3 (en) * | 2019-05-23 | 2020-07-30 | Innopeutics Corporation | Composition and method for inhibiting amyloid beta accumulation and/or aggregation |
| CN117363581A (zh) * | 2023-12-07 | 2024-01-09 | 首都医科大学宣武医院 | 一种a9区多巴胺能神经元的制备方法、试剂盒及应用 |
-
2010
- 2010-07-02 KR KR1020100063756A patent/KR101544398B1/ko active IP Right Grant
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190071930A (ko) * | 2017-12-15 | 2019-06-25 | 한양대학교 산학협력단 | 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법 |
| JP2019106895A (ja) * | 2017-12-15 | 2019-07-04 | インダストリー‐ユニバーシティー コーぺレーション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティ | 神経幹細胞または神経前駆細胞からドーパミン神経細胞への分化方法 |
| JP2022107819A (ja) * | 2017-12-15 | 2022-07-22 | インダストリー‐ユニバーシティー コーぺレーション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティ | 神経幹細胞または神経前駆細胞からドーパミン神経細胞への分化方法 |
| WO2020117031A3 (en) * | 2019-05-23 | 2020-07-30 | Innopeutics Corporation | Composition and method for inhibiting amyloid beta accumulation and/or aggregation |
| JP2022529394A (ja) * | 2019-05-23 | 2022-06-21 | イノピューティクス コーポレーション | アミロイドベータ蓄積及び／又は凝集抑制組成物及び抑制方法 |
| US11498957B2 (en) | 2019-05-23 | 2022-11-15 | Innopeutics Corporation | Composition and method for inhibiting amyloid β accumulation and/or aggregation |
| CN117363581A (zh) * | 2023-12-07 | 2024-01-09 | 首都医科大学宣武医院 | 一种a9区多巴胺能神经元的制备方法、试剂盒及应用 |
| CN117363581B (zh) * | 2023-12-07 | 2024-04-02 | 首都医科大学宣武医院 | 一种a9区多巴胺能神经元的制备方法、试剂盒及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101544398B1 (ko) | 2015-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2002324645B2 (en) | Compositions and methods for isolation, propagation, and differentiation of human stem cells and uses thereof | |
| AU716811B2 (en) | Regulation of neural stem cell proliferation | |
| JP3952508B2 (ja) | 中枢神経系の幹細胞の原位置修飾及び操作 | |
| JP4741189B2 (ja) | 増殖した細胞系およびその使用方法 | |
| JP2022084697A (ja) | 神経変性を治療するための方法及び組成物 | |
| US20110003358A1 (en) | Cultures of gfap+ nestin+ cells that differentiate to neurons | |
| AU2002324645A1 (en) | Compositions and methods for isolation, propagation, and differentiation of human stem cells and uses thereof | |
| JP2009106301A (ja) | ヒトｃｎｓ神経幹細胞の培養 | |
| AU6098394A (en) | Genetic modification of neural stem cells | |
| WO1999032606A2 (de) | Neurale vorläuferzellen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur therapie von neuralen defekten | |
| CN1833021A (zh) | 少突胶质祖细胞和获得及培养它们的方法 | |
| US9649358B2 (en) | Methods for use of neural stem cell compositions for treatment of central nervous system lesions | |
| KR101544398B1 (ko) | ＦｏｘＡ2 및 Ｎｕｒｒ1 도입을 이용한 중뇌 도파민성 신경세포로의 분화방법 | |
| KR20040079669A (ko) | Ｎｕｒｒ1 과발현에 의한 도파민성 신경세포의 분화방법 | |
| US20040115807A1 (en) | O-2a progenitors multipotent cells from neurohypophysis | |
| KR101186218B1 (ko) | 히레귤린 베타1의 ｅｇｆ-성 도메인 펩타이드의 용도 | |
| Class | Patent application title: COMPOSITIONS AND METHODS FOR ISOLATION, PROPAGATION, AND DIFFERENTIATION OF HUMAN STEM CELLS AND USES THEREOF Inventors: Toomas Neuman (Santa Monica, CA, US) Michel Levesque (Beverly Hills, CA, US) Assignees: LEVESQUE BIOSCIENCES, INC. | |
| Cesnulevicius | Expansion, differentiation and transfection of ventral mesencephalic progenitor cells: characterization in vitro and after implantation in animal model of Parkinson's disease | |
| MXPA97003492A (en) | Regulation of proliferation of cells germinal neural |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20100702 |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20140320 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20100702 Comment text: Patent Application |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20150604 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20150803 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20150807 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20150810 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180702 Year of fee payment: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20180702 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190624 Year of fee payment: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20190624 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200713 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| PC1903 | Unpaid annual fee |
Termination category: Default of registration fee Termination date: 20220518 |