JP2022529394A - アミロイドベータ蓄積及び／又は凝集抑制組成物及び抑制方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤に関し、より詳細には、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を同時に導入して発現を誘導することによって、アミロイドベータ蓄積及び／又は凝集を抑制する技術に関する。本発明の組成物は、アルツハイマー病のようなアミロイドベータの蓄積及び／又は凝集によって発病する脳神経疾患の予防又は治療に活用可能である。【選択図】図１０Ｂ

Description

本発明は、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）抑制剤に関し、より詳細には、哺乳類にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を同時に導入して発現を誘導することにより、アミロイドベータ蓄積及び／又は凝集を抑制する組成物及び方法に関する。

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）は、記憶力減退、言語、及び認知障害などを症状とする慢性神経退行性疾患である。

アルツハイマー病は、神経病理学的に脳細胞、神経組織、及び血管内沈着物（ｐｌａｑｕｅ）の存在、神経線維濃縮剤（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴ）、アミロイドプラークを形成するアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）ペプチドの存在、シナプス損傷などを特徴とする。アルツハイマー病の原因は、完全に知られておらず、その治癒法も現在のところ存在しない。アルツハイマー病は、痴呆の通常の形態であり、心血管系疾患及び癌と共に死亡の主要原因である。人間の平均寿命が増加するにつれ、アルツハイマー病の頻度も増加すると予想される。

また、アルツハイマー病を管理し治療するためには莫大な費用がかかり、患者の精神的苦痛も非常に大きい。したがって、効果的なアルツハイマー病の予防及び治療方法が望まれる状況である。

そこで、本発明者らは、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が脳細胞に導入されて発現する時にアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）の蓄積及び／又は凝集を抑制することを実験的に究明し、本発明を完成するに至った。特に、Ｎｕｒｒ１遺伝子単独発現効果よりはＦｏｘａ２遺伝子が共に発現した時に、これら両遺伝子の相乗効果による強力なアミロイドベータ蓄積及び／又は凝集抑制効果があることを確認した。

したがって、本発明の一実施例は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤を提供する。

本発明の他の実施例は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｎｅｕｒｏｎａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤を提供する。

本発明の更に他の実施例は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤を提供する。

本発明の更に他の実施例は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤を提供する。

本発明の更に他の実施例は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明の更に他の実施例は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明の更に他の実施例は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集による細胞老化抑制用組成物を提供する。

本発明の更に他の実施例は、次の段階を含む、アルツハイマー病に悩んでいる患者を治療する方法である：
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む組成物の治療学的有効量を患者に投与する段階。

本発明の更に他の実施例は、次の段階を含む、アルツハイマー病に悩んでいる患者を治療する方法である：
Ｎｕｒｒ１遺伝子が導入されたベクター及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された２番目のベクターを含む組成物の治療有効量を患者に投与する段階。

核受容体関連因子１（Ｎｕｃｌｅａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ，Ｎｕｒｒ１；ＮＲ４Ａ２とも知られている。）は、初期に中脳ドパミン（ｍｉｄｂｒａｉｎ ｄｏｐａｍｉｎｅ，ｍＤＡ）ニューロンの発生、成熟、及び軸索突起方向設定を含むｍＤＡニューロン発達に重要な転写因子として特徴付けられる孤児核受容体である。Ｎｕｒｒ１は、成熟したｍＤＡニューロン内で続けて発現し、成熟期に発生する当該タンパク質の削除は、ｍＤＡニューロンの進行性損失につながる。異質接合されたＮｕｒｒ１マウスにおいて、ｍＤＡニューロンはＤＡ神経毒素に対してより脆弱である。ｍＤＡニューロン内のＮｕｒｒ１数値は、老人及びアルツハイマー病患者において減少する。これらの発見は、Ｎｕｒｒ１が細胞自発的な方式で成熟したｍＤＡニューロンを保護する効果を奏するという研究結果を裏付ける。

実際に、Ｎｕｒｒ１を媒介とした細胞生存に関連した種々の内因性基剤が確認されてきた。特に、神経組織において膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）と小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）を含み、これは神経細胞の機能と生存を助ける補助細胞である。

そこで、本発明者は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の主要原因として知られたアミロイドベータの蓄積及び／又は凝集抑制のための方法について鋭意研究してきた。その結果、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が同時に発現した場合に、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制効果、炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制効果、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積による細胞老化抑制効果があることを明らかにした。

本発明の一態様によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤を提供する。

本発明の一具現例によれば、前記ベクターは、ウイルス性ベクター又は非ウイルス性ベクターである。

本発明の一具現例によれば、前記哺乳類への遺伝子の導入は、遺伝子編集技術によってなされる。

本発明の他の態様によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入され、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２タンパク質を発現する神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤を提供する。

本発明の一具現例において、前記導入は、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、又は遺伝子編集によってなされる。

本発明の一具現例において、前記膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である。

本発明の更に他の態様によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクター及び薬剤学的に許容される担体を含む、炎症誘発複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤を提供する。

本発明の一具現例において、前記ベクターは、ウイルス性ベクター又は非ウイルス性ベクターである。

本発明の一具現例において、前記遺伝子の導入は、遺伝子編集技術によってなされる。
本発明の更に他の態様によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、炎症誘発複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤を提供する。

本発明の一具現例において、前記遺伝子の導入は、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、又は遺伝子編集によってなされる。

本発明の一具現例において、前記膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である。

本発明の更に他の態様によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明の一具現例において、前記ベクターは、ウイルス性ベクター又は非ウイルス性ベクターである。

本発明の一具現例において、前記遺伝子の導入は、遺伝子編集技術によってなされる。

本発明の更に他の態様によれば、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供する。

本発明の一具現例において、前記導入は、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、又は遺伝子編集によってなされる。

本発明の一具現例において、前記膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠細胞である。

本発明の更に他の態様によれば、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集による細胞老化抑制用組成物を提供する。

本発明の一具現例において、前記細胞は膠細胞（ｇｌｉａ）である。

本発明の一具体例において、前記膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である。

本発明は、Ｎｕｒｒ１遺伝子及びＦｏｘａ２遺伝子を発現させることにより、これら両遺伝子の相乗作用によってアルツハイマー病の予防及び治療に用いることができる。Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現は、（１）アミロイドベータ蓄積、（２）脳細胞老化、（３）シナプス損失のようなアルツハイマー病の病理的症状を緩和させる。また、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘ２の発現は、脳細胞を損傷させる炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）の発現を顕著に減らし、末梢免疫細胞又は補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の蓄積を抑制して、アルツハイマー病の予防及び治療の効果を奏する。Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が共に発現する時、脳細胞においてＮｕｒｒ１又はＦｏｘａ２を単独で発現させる時に比べて劇的に、相乗作用を起こし、アルツハイマー病の病理的症状を緩和させ、アルツハイマー病の予防及び治療の効果を奏する。

一方、本発明の方法において“Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入（形質導入）する”とは、両遺伝子を暗号化する核酸を脳細胞に導入することをいう。両遺伝子はそれぞれ別に又は同時に導入されてよい。脳細胞に、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をコードする遺伝子を導入するために、ＤＮＡ－カルシウム沈殿法、リポソームを用いる方法、ポリアミン系列を用いる方法、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、レトロウイルスを用いる方法、アデノウイルスを用いる方法、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）などを用いる方法など、当分野に公知された遺伝子の細胞内導入技術方法が用いられてよい。

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入する時、ウイルス性又は非ウイルス性ベクターを使用することができ、ウイルス性ベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、及び／又はレンチウイルスなどがあり、非ウイルス性ベクターは、ＲＮＡ分子、プラスミド、リポソーム複合体、分子結合体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、及び／又は遺伝子はさみタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ，例えばＣａｓ９）などがある。

したがって、本発明に係るＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２導入は、一具体例として、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する核酸をそれぞれ個別の発現ベクター又は単一の発現ベクターに挿入させた後、それを脳細胞に導入することを含む。

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を導入する時に、遺伝子編集技術を用いることができ、遺伝子編集技術とは、生命体の遺伝情報を自由に矯正し、目的とする遺伝形質を表させるものであり、遺伝子編集技術に利用可能なシステムには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及び周期的に間隔を帯びて分布する短い回文構造の反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔ）／ＣＲＩＳＲ関連システム（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）などがある。

本発明において、用語“ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼ”とは、目的とする遺伝体上の特定位置を認識して切断できるヌクレアーゼで、特にガイドＲＮＡによって標的特異性を有するヌクレアーゼのことを指す。前記ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼは、これに制限されるものではないが、具体的に、微生物兔疫体系であるＣＲＩＳＰＲに由来したＣａｓタンパク質でよく、より具体的に、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ９）ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）及びその変異体であるＣａｓ９ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を含むことができる。

本発明において、用語“Ｃａｓタンパク質”は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であって、活性化されたエンドヌクレアーゼとして作用可能なタンパク質である。前記Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ）と複合体を形成してその活性を示すことができる。

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ヒト細胞をはじめとする動植物細胞の遺伝体において特定塩基配列を認識し、二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）を起こす。前記二本鎖切断は、ＤＮＡの二本鎖を切って鈍端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）又は粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）を作るいずれをも含む。ＤＳＢは、細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）又は非相同再接合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）機序により効率的に修繕されるが、この過程で研究者が所望の変異を標的位置に導入することができる。前記ＲＮＡ－ガイドヌクレアーゼは、人工的な、或いは操作された非自然的に発生した（ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ものであってよい。

前記Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの触媒的ドメインのいずれか１個に１個以上の突然変異を含むが、ここで、前記１個以上の突然変異は、ＲｕｖＣドメイン内Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、及びＤ９８６Ａからなる群から選ばれるか、又は前記１個以上の突然変異は、ＨＮＨドメイン内Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａからなる群から選ばれる。前記Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは違い、一本鎖切断（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ）を起こす。したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼが作動するためには、２個のガイドＲＮＡを必要とし、対（ｐａｉｒ）として機能する。前記２個のガイドＲＮＡは、それぞれの標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を指示し、各標的配列近傍のＤＮＡデュプレックスの１本の鎖の切断を指示し、異なるＤＮＡ鎖に２個のニック（ｎｉｃｋ）を誘導することができる。

Ｃａｓタンパク質又は遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。具体的に、前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってよい。また、前記Ｃａｓタンパク質は、これに制限されるものではないが、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属由来のＣａｓタンパク質でよく、より具体的には、スタフィロコッカス属のＣａｓ９タンパク質でよい。しかし、上述の例に本発明が制限されるものではない。本発明において、前記Ｃａｓタンパク質は組換えタンパク質であってよい。

前記Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する各核酸は、当業界に公知のＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する塩基配列を有するものであれば、いずれも使用可能である。また、前記核酸はＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の各機能的同等物を暗号化する塩基配列を有することができる。前記機能的同等物とは、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の配列相同性（すなわち、同一性）を有するポリペプチドのことを指す。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリペプチドを含む。前記機能的同等物は、アミノ酸配列の一部が付加、置換又は欠失した結果として生成されるものでよい。アミノ酸の欠失又は置換は、好ましくは、本発明のポリペプチドの生理活性に直接関連しない領域に位置している。

また、前記Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する核酸は、当業界に公知の遺伝子組換え方法によって製造されてよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，‘Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９２）。例えば、ゲノムから核酸を増幅させるためのＰＣＲ増幅、化学的合成法又はｃＤＮＡ配列を製造する技術がある。

前記Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する核酸は、発現調節配列に作動可能に連結されて発現ベクター内に挿入されてよい。‘作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）’とは、一つの核酸断片が他の核酸断片と結合し、それの機能又は発現が他の核酸断片に影響を受けることを指す。また、発現調節配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とは、特定の宿主細胞において作動可能に連結された核酸配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味する。このような調節配列は、転写を開始するためのプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含む。それらを総じて‘Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する核酸を含むＤＮＡ構造物’と表現することができる。

‘発現ベクター’とは、構造遺伝子を暗号化する核酸が挿入可能であり、宿主細胞内で前記核酸を発現可能な当業界に公知のプラスミド、ウイルスベクター、又はその他媒介体を意味する。一つの好ましいベクターは、ウイルスベクターであってよい。前記ウイルスベクターには、これに制限されないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、アビポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどがある。

前記アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、特定細胞にウイルスを生産可能な材料を導入して作製されたものであり、レンチウイルスベクターも、特定細胞株にウイルスを生産可能に諸段階を経て作製されたものである。遺伝子療法のためのアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスベクターの長所は、効率性と安全性である。

本発明に係る核酸を含む発現ベクターは、当業界に公知の方法、例えば、これに限定されないが、一時的形質感染（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、微細注射、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介の形質感染（ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ＤＥＡＥデキストラン媒介の形質感染（ＤＥＡＥ Ｄｅｘｔｒａｎ－ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ポリブレン媒介の形質感染（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、遺伝子銃（ｇｅｎｅ ｇｕｎ）、及び細胞内に核酸を取り込むための他の公知の種々の方法によって脳細胞内に導入することができる。例えば、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をＡＡＶ又はレンチウイルスベクターに挿入して発現ベクターを作製した後、このベクターを包装（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）細胞に形質導入し、形質導入された包装細胞を培養後に濾過してＡＡＶ又はレンチウイルス溶液を得、これを用いて脳細胞、神経細胞及び／又は神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）を感染させることにより、脳細胞にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を導入することができる。次いで、前記ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターに含まれた選別マーカーを用いてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を同時発現させることを確認後に、所望の脳細胞を得ることができる。

一具体例として、本発明に係るＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を発現させた脳細胞は、次の段階を含む製造方法によって製造されてよい：
（ａ）Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する核酸を含むＤＮＡ構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を含む組換えウイルスベクターを製造する段階；
（ｂ）前記組換えウイルスベクターをウイルス生産細胞株に形質感染させてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現組換えウイルスを製造する段階；及び
（ｃ）前記Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現組換えウイルスで脳細胞を感染させる段階。

まず、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する核酸を含むＤＮＡ構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）については、上述した通りである。

前記ＤＮＡ構造物を発現調節配列、例えばプロモーターに作動可能に連結し、当業界に公知のウイルスベクターに挿入させて組換えウイルスベクターを製造する。その後、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を暗号化する核酸を含む組換えウイルスベクターをウイルス生産細胞株に導入し、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を発現させる組換えウイルスを製造する。前記ウイルス生産細胞株は、使用したウイルスベクターに該当するウイルスを生産する細胞株を使用することができる。その後、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を発現させる組換えＡＡＶ又はレンチウイルスを脳細胞に感染させる。これは、当業界に公知の方法で行うことができる。

本発明に係るＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を発現させる脳細胞は、当業界に公知の方法によって増殖及び培養されてよい。

本発明の一具現例において、本発明の脳細胞は、目的細胞タイプの生存又は増殖を手伝う培養液内で培養される。しばしば、血清に替えて、自由アミノ酸に栄養を供給する培養液を使用することが好ましい。脳細胞の持続培養のために開発された添加剤を培養液に補充することが好ましい。例えば、Ｇｉｂｃｏ社から市販しているＮ２培地及びＢ２７添加剤、ウシ血清などがある。一具体例において、培養時に、培地と細胞の状態を観察しながら培地を交換することができる。この時、脳細胞が継続増殖して固まり合って神経球（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）を形成すると、継代培養を実施することが好ましい。継代培養は、状況によって、細胞成長を管理するための特定プロトコルにしたがって約７～８日間ごとに実施することができる。

一方、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が脳細胞に発現すれば、（１）アミロイドベータ蓄積（２）脳細胞老化、（３）シナプス損失のようなアルツハイマー病の病理的症状を緩和させ、また脳細胞を神経栄養化してアルツハイマー病の予防及び治療を助ける。Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が共に発現する時、脳細胞においてＮｕｒｒ１やＦｏｘａ２を単独で発現させる時に比べて劇的に、相乗作用を起こして、アルツハイマー病の病理的症状を緩和させ、アルツハイマー病の予防及び治療の効果を奏する。

また、本発明は、他の観点において、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が導入された脳細胞のアルツハイマー病の治療のための用途を提供する。

例えば、それらの細胞は、治療しようとする疾患又は状態によって、中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）部位にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が導入された哺乳類の脳細胞を直接導入することによって治療的に使用することができる。また、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が導入された脳細胞を治療学的有効量で含有する組成物の形態で投与又は移植することによって治療的に使用することができる。そして、本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を発現させる細胞をアルツハイマー病に病んでいる患者に導入することによるアルツハイマー病の治療方法も含む。

本発明の一態様において、Ｆｏｘａ２及びＮｕｒｒ１が導入された脳細胞を有効成分として含有する、アミロイドベータ蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患（例えば、アルツハイマー病など）の予防又は治療用組成物、細胞治療剤又は遺伝子治療剤に関する。

本発明の遺伝子治療剤又は細胞治療剤は、ベータアミロイド蓄積を防ぎ、神経細胞及び膠細胞を含む脳細胞を損傷から保護することにより、記憶関連神経細胞が補充（再生）されたり、再び構築（復元）されたりするようにする。

本発明の細胞治療剤は、脳の損傷された神経細胞を補充（再生）したり、或いは再び構築（復元）したりする。“再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）”とは、形成された器官又は個体の一部が喪失されたとき、その部分が補充される現象であり、“復元”は“再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）”とも呼ぶことができ、これは、組織の再構築を意味するもので、一旦解離した細胞又は組織から組織又は器官を再び構築することを指す。

本発明の組成物又は細胞治療剤は、投与方式によって許容可能な担体を含んで適切な製剤とすることができる。投与方式に適合する製剤は公知されており、典型的に、膜を通過する、移動を容易にさせる製剤を含むことができる。

また、本発明の組成物は、一般的な医薬品製剤の形態で使用されてよい。非経口用製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、又は凍結乾燥製剤、経口投与時には錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、サスペンション、シロップ、又はウエハーなどの形態で製造でき、注射剤の場合は、単位投薬アンプル又は多回投薬形態で製造できる。また、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容される担体と共に投与されてよい。例えば、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、又は香料などを使用することができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。

また、本発明の治療用組成物を用いてアルツハイマー病を治療する方法は、適切な方法で対象体又は患者に所定の物質が導入される一般の経路を通じて投与することを含むことができる。前記投与方法には、脳内投与、脳室内投与、脊髄腔投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、血内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、及び直腸内投与があるが、これに制限されない。ただし、経口投与時に細胞が消化されることがあるので、経口用組成物は、活性薬剤をコーティングするか、胃で分解されることから保護するために剤形化することが好ましい。

また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてよい。好ましい投与方式及び製剤は、定位固定機（Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いた海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）注射剤、脳室注射剤、中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）注射剤、脳脊髄液注射剤、静脈注射剤、皮下注射剤、血内注射剤、筋肉注射剤、又は点滴注射剤などである。注射剤は、生理食塩液又はリンゲル液などの水性溶剤、植物油、高級脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、アルコール類（例えば、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール又はグリセリンなど）などの非水性溶剤などを用いて製造でき、変質防止のための安定化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＢＨＡ、トコフェロール、ＥＤＴＡなど）、乳化剤、ｐＨ調整のための緩衝剤、微生物発育を阻止するための保存剤（例えば、硝酸フェニル水銀、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、フェノール、クレゾール、ベンジルアルコールなど）などの薬剤学的担体を含むことができる。好ましくは、本発明の治療用組成物を用いてアルツハイマー病を治療する方法は、本発明の治療用組成物を薬学的有効量で投与することを含む。前記薬学的有効量は、疾患の種類、対象体（患者）の年齢、体重、健康、性別、対象体（患者）の薬物に対する敏感度、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合又は同時使用される薬物などの、医学分野によく知られた要素によって、当業者が容易に決定できる。

また、本発明の他の態様において、前述したＦｏｘａ２及びＮｕｒｒ１が導入された脳細胞を含有する組成物の形態で、治療学的有効量で病変部位に直接移植することを含む、アミロイドベータ蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患（例えば、アルツハイマー病など）の治療方法に関する。移植及び細胞培養の方法は、当業者に広く知られた公知の方法を用いることができる。

前記細胞の“治療学的有効量”は、アルツハイマー病によって誘発される対象体又は患者の生理学的効果を中止又は軽減させるのに十分な量である。使用された細胞の治療学的有効量は、対象体（患者）の必要性、対象体（患者）の年齢、生理学的状態及び健康、所定の治療効果、治療標的である組織の大きさ及び面積、病変の程度及び選択された伝達経路に依存するであろう。また、細胞は、低細胞投与量の多重小型移植片であり、所定の標的組織内の１以上の部位に投与できる。本発明の細胞は移植前に完全に分離され、例えば単一細胞の懸濁液を形成したり、又は移植前に略完全に分離され、例えば細胞の小型凝集物を形成できる。細胞は、それらを所定の組織部位に移植又は移動させ、機能的に欠乏している領域を再構成又は再生する方式で投与できる。

治療学的に有効達成可能に投与できる細胞の適当な範囲は、当業者の通常の知識内で、対象体又は患者に応じて適切に使用することができる。例えば、約１００～１００，０００，０００細胞、或いはそれ以上であってもよいが、低容量では効果がなく、高容量では副作用の発生可能性があることを排除できないことから、１００，０００～５０，０００，０００個程度が好ましいだろう。

ただし、投与量はそれに限定されず、剤形の種類、投与方法、対象体（患者）の年齢や体重、患者の症状などを考慮し、最終には医師の判断によって適切に決定されてよい。

本発明の組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、対象体（患者）の年齢、体重、性別、疾病症状の程度、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。一般に、本発明の薬剤学的組成物は、１×１０^５～１×１０^１３ｖｇ／μｌのウイルスベクター、又はウイルス遺伝子を含み、通常、１×１０^５～１×１０^１６ｖｇ／ｄｏｓｅを患者に１回～５回注射し、効果の持続のために数ヶ月又は数年後に再び類似の方法で注射できる。

本発明において、前記組成物は、上述の医薬品製剤の形態で使用できる。

本発明において、“遺伝子治療剤”は、疾病治療などを目的に遺伝物質又は遺伝物質を移入した運搬体を人体に投与する医薬品を意味する。

遺伝子治療剤として適用可能な本発明の組成物に対して薬学的に許容可能な担体は、滅菌及び生体に適合するものとして、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びそれら成分の１成分以上を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの別の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を更に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤として製剤化でき、標的器官に特異的に作用できるように標的器官特異的抗体又はその他リガンドを前記担体と結合させて使用することができる。

前記組成物は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を発現させる脳細胞ではなく、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を発現させるベクターを直接使用する以外は、前述した内容を適用又は準用することができる。

本発明は、また、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が導入された脳細胞を含む組成物を治療学的有効量で対象体に投与することを含む、アルツハイマー病予防又は治療方法を提供する。

その他、アルツハイマー病予防又は治療用組成物に関して上述した全ての内容が、アルツハイマー病予防又は治療方法にも制限なく適用又は準用されてよい。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである。
（ａ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤を提供する。
（ｂ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｒｏｕｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤を提供する。
（ｃ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤を提供する。
（ｄ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤を提供する。
（ｅ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
（ｆ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｒｏｕｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物を提供する。
（ｇ）本発明は、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集による細胞老化抑制用組成物を提供する。
（ｈ）本発明の組成物を用いる場合、アルツハイマー病のようなアミロイドベータの蓄積及び／又は凝集によって発病する脳神経疾患の予防又は治療に活用することができる。

ＡＡＶ９ウイルスを用いた遺伝子伝達テスト実験過程を示す。 ＡＡＶ９ウイルスを用いた遺伝子伝達テスト実験結果（海馬体と脳室でのＧＦＰ発現程度）を示す Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標と対照群ウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標とを比較した結果を示す 明示的記憶能力検査により、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標と対照群ウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標とを比較した結果を示す 新しい事物認知（Ｎｏｖｅｌ ｏｂｊｅｃｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）試験により、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標と対照群ウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標とを比較した結果を示す 膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位におけるアミロイドベータとタンパク質凝集体（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓ）の蛍光を免疫染色方法で確認した結果を示す 膠細胞にＮｕｒｒ１遺伝子又はＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を導入したアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位におけるアミロイドベータの蛍光を免疫染色方法で確認した結果を示す 膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位におけるアミロイドベータをコンゴレッド染色法で確認した結果を示す 膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位におけるアミロイドベータの量をウェスタンブロット分析（タンパク質電気泳動法）で分析した結果を示す チオフラビンＴ試験を用いてアミロイドベータ線維（Ａβ ｆｉｂｒｉｌｓ）の量を測定するアミロイドベータ分解実験過程を示す。 チオフラビンＴ試験を用いてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を同時に発現した群のシナジー効果を証明するために、アミロイドベータ線維（Ａβ ｆｉｂｒｉｌｓ）の量を測定したアミロイドベータ分解実験結果を示す折れ線グラフである。 チオフラビンＴ試験を用いてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を同時に発現した群のシナジー効果を証明するために、アミロイドベータ線維（Ａβ ｆｉｂｒｉｌｓ）の量を測定したアミロイドベータ分解実験結果を示す棒グラフである。 マウスの１次星状細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現後に、アミロイドベータ凝集体の分解に関連したタンパク質に対するＲＮＡ－Ｓｅｑ分析を行った結果であり、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現した膠細胞における当該酵素の遺伝子発現程度と対照群膠細胞における遺伝子発現程度との比率を示す。 マウスの１次星状細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現後に、アミロイドベータ凝集体の分解に関連したタンパク質に対するＲＮＡ－Ｓｅｑ分析を行った結果であり、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現した膠細胞におけるＣＤ１１ｂとＣＤ１８の遺伝子発現程度と対照群膠細胞における遺伝子発現程度との比率を示す。 マウスの１次星状細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現後に、アミロイドベータ凝集体の分解に関連したタンパク質に対する実時間ＰＣＲ分析を行った結果であり、対照群膠細胞、Ｎｕｒｒ１単独で発現した膠細胞、Ｆｏｘａ２単独で発現した膠細胞、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が同時に発現した膠細胞における、アミロイドベータ分解酵素（例えば、ＮＥＰ、ＭＭＰ１４、ＩＤＥ、ＥＣＥ２）の遺伝子発現程度を示す。 チオフラビンＴ試験（ＴｈＴ ａｓｓａｙｓ）を用いてアミロイドベータ単量体（Ａβ ｍｏｎｏｍｅｒ）の量を測定するアミロイドベータ凝集実験過程を示す。 チオフラビンＴ試験（ＴｈＴ ａｓｓａｙｓ）を用いてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を同時に発現した群のシナジー効果を証明するために、アミロイドベータ単量体（Ａβ ｍｏｎｏｍｅｒ）の量を測定したアミロイドベータ凝集実験結果を示す折れ線グラフである。 チオフラビンＴ試験（ＴｈＴ ａｓｓａｙｓ）を用いてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を同時に発現した群のシナジー効果を証明するために、アミロイドベータ単量体（Ａβ ｍｏｎｏｍｅｒ）の量を測定したアミロイドベータ凝集実験結果を示す棒グラフである。 膠細胞でＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現後に、Ｃ１ｑａ，Ｃ３に対するＲＴ－ＰＣＲ分析を行った結果を示す。 膠細胞でＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現後に、ＣＣＬ３とＣＣＬ４に対するＲＮＡ－Ｓｅｑ分析を行った結果を示す。 アミロイドベータアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入後に、海馬部位で炎症調節複合体タンパク質（ＮＬＲＰ３、ＡＳＣ、ＣＡＳＰ１）を対象にＲＴ－ＰＣＲした結果を示す。 マウスの海馬及び脳室の膠細胞において特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を導入し、２ヶ月後にウェスタンブロットを用いて海馬部における炎症調節複合体マーカーのタンパク質レベルを確認した結果を示す。 アミロイドベータアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入後に、海馬部位で炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）を対象にＲＴ－ＰＣＲした結果を示す。 アミロイドベータアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入後に、海馬部位で神経栄養性因子（ＳＨＨ、ＢＤＮＦ、Ａｒｇ１）を対象にＲＴ－ＰＣＲした結果を示す。 大脳皮質星状細胞をＣＭＶプロモーター対照群、Ｎｕｒｒ１、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の４群に分けて発現させた後、ベータアミロイド凝集剤を処理してＮＦ－ｋＢ信号伝達因子の発現程度をウェスタンブロットで確認した結果を示す。 大脳皮質星状細胞をＣＭＶプロモーター対照群、Ｎｕｒｒ１、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の４群に分けて発現させた後、ベータアミロイド凝集剤を処理してＮＦ－ｋＢ信号伝達因子の発現程度をウェスタンブロットで確認し、定量的に分析した結果を示す。 海馬部位の星状細胞をベータアミロイド凝集剤で処理又は非処理し、ベータアミロイド凝集剤処理された細胞は、ＣＭＶプロモーターコントロール、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の３群に分けて発現させた後、ＮＦ－ｋＢ信号伝達因子の発現程度をウェスタンブロットで確認した結果を示す。 海馬部位の星状細胞をベータアミロイド凝集剤で処理又は非処理し、ベータアミロイド凝集剤処理された細胞は、ＣＭＶプロモーターコントロール、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の３群に分けて過発現させた後、ＮＦ－ｋＢ信号伝達因子の発現程度をウェスタンブロットで確認し、定量的に分析した結果を示す。 マウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入して２ヶ月後にウェスタンブロットを用いて海馬部でシナプス形成（Ｓｙｎａｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）マーカーのタンパク質レベルを確認した結果を示す。 マウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入して２ヶ月後にウェスタンブロットを用いて海馬部でシナプス形成マーカーのタンパク質レベルを確認し、定量的に分析した結果を示す。 膠細胞でＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現後に、老化誘発因子であるＩＬ６、ＭＭＰ１ａ、ＭＭＰ１ｂ、及びＭＭＰ１０に対するＲＮＡ－Ｓｅｑ分析を行った結果を示す。 対照群培養膠細胞とＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２導入された培養膠細胞のベータガラクトシダーゼ（細胞老化マーカー）染色結果を示す。 コントロール培養膠細胞とＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２導入された培養膠細胞のベータガラクトシダーゼ（細胞老化マーカー）染色結果からベータガラクトシダーゼ陽性細胞の数を測定し、棒グラフで示す結果である。 膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を導入したアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位におけるＳｏｘ２、ＵＧＴ１Ａ１及びＧＦＡＰの蛍光を免疫染色方法で確認した結果を示す。

Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは、当業界における通常の知識を有する者には明らかであろう。

本明細書で使われる用語に対する定義は、次の通りである。

“脳細胞（ｂｒａｉｎ ｃｅｌｌｓ）”は、脳に位置している細胞を意味し、神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ，ｎｅｕｒｏｎ ｃｅｌｌｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、及び膠細胞（ｇｌｉａ，ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）などで構成されている。

“神経細胞”は、神経系の細胞であり、用語“ニューロン”又は“ニューロン細胞”と同じ意味で使用可能である。

“膠細胞”は、脳に存在する細胞のうち最も多い部分を占める細胞であり、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）細胞を含む。

前記星状細胞は、神経細胞の保護及び栄養供給、炎症に関与し、前記小膠細胞は、脳で炎症を担当する細胞であって、アルツハイマー病のような脳疾患において重要な役割を担う細胞群として知られている。

“形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）”は、バクテリオファージを媒介にして遺伝的形質が一つの細胞から他の細胞に移って遺伝形質が導入される現象であり、バクテリオファージがいずれかのタイプの細菌に感染されるとファージＤＮＡが宿主ＤＮＡと結合し、溶菌現象によってファージが出る時、自分のＤＮＡを一部失う代わりに宿主ＤＮＡの一部を持ち出す場合がある。このようなファージが他の細菌に感染されると、前宿主の遺伝子を新しく導入することになり、新しい形質が現れる。生物学的研究において“形質導入”という用語は、一般に、ウイルスベクターを用いて標的細胞において特定外因性遺伝子過発現をすることを意味する。

“蓄積及び／又は凝集抑制”は、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）の生成を抑制して凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を抑制する場合と、既に生成されたアミロイドベータを分解して蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）を抑制する場合のいずれをも含む概念である。

“対象体”は、治療、観察又は実験の対象である脊椎動物、好ましくは哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウサギ、ギニアピッグ（モルモット）、ヒトなどであってよい。

“組織又は細胞サンプル”は、対象体又は患者の組織から得た類似の細胞の集合体を意味する。組織又は細胞サンプルの供給源は、新鮮な、凍結した及び／又は保存された臓器又は組織サンプル若しくは生検又は吸引物からの固形組織；血液又は任意の血液構成分；対象の妊娠又は発生の任意の時点における細胞であってよい。組織サンプルは、また、１次又は培養細胞又は細胞株であってよい。

“治療”は、有益な或いは好ましい臨床的結果を得るための接近を意味する。本発明の目的のために、有益な或いは好ましい臨床的結果は、非制限的に、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾病進行の遅延又は速度の減少、疾病状態の改善又は一時的緩和及び軽減（部分的に又は全体的に）、検出可能か又は検出されないことを含む。また、“治療”は、治療を受けない時に予想される生存率と比較して生存率を上げることを意味することもできる。“治療”は、治療学的治療及び予防的又は予防措置方法のいずれをも指す。前記治療は、予防される障害の他に既に発生した障害においても要求される治療を含む。疾病を“緩和（Ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）”させることは、治療をしない場合と比較して、疾病状態の範囲及び／又は好ましくない臨床的徴候が減少し及び／又は進行の時間的推移（ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ）が遅延されたり、延びたりすることを意味する。

“細胞治療剤”は、ヒトから分離、培養及び特殊な操作によって製造された細胞及び組織に治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品（米国ＦＤＡ規定）であり、細胞或いは組織の機能を復元させるために、生きている自家、同種、又は異種細胞を体外で増殖、選別したり、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させたりするなどの一連の行為によって治療、診断及び予防の目的で使用される医薬品のことを指す。細胞治療剤は、細胞の分化程度によって、概ね、体細胞治療剤、幹細胞治療剤に分類される。
治療目的のための“哺乳類”は、ヒト、家畜、農場家畜、及びイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、サルのような動物園、スポーツ或いは愛玩用の動物を含め、哺乳類として分類されるいかなる動物も可能である。好ましくは、前記哺乳類はヒトである。

“遺伝子治療剤”は、疾病治療などを目的に遺伝物質又は遺伝物質を移入した運搬体を人体に投与する医薬品を意味する。

“投与”は、いずれか適切な方法で対象体又は患者に本発明の組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、経口又は非経口の様々な経路を通じて投与されてよい。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、血内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与されてよいが、それに制限されない。

“有効量”は、目的とする治療すべき特定疾患の発病又は進行を遅延させたり、或いは全的に中止させるために必要な量を意味する。本発明において、組成物は、薬学的有効量で投与されてよい。適度な総１日使用量は、正確な医学的判断範囲内で処置医によって決定され得るということは、当業者にとって明らかである。

本発明の目的上、特定対象体又は患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって、他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的な組成物、対象体（患者）の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に使用されたり、或いは同時使用される薬物を含む様々な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって異なるように適用することが好ましい。

本発明で使われる技術用語はいずれも、特に断りのない限り、本発明の関連分野における通常の当業者が一般的に理解するのと同じ意味で使われる。また、本明細書には好ましい方法や試料が記載されるが、これと類似又は同等なものも本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、本発明に組み込まれる。

実施例１．材料及び方法
（１）細胞培養
１）膠細胞の培養
星状細胞及び小膠細胞の混合物のための一次培養物は、以前に公表された論文に開示の方法に基づき、生後１日目の仔マウス（ＩＣＲ）の腹側中脳（ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ，ＶＭ）から由来した（Ｓａｕｒａ Ｊ（２００７）Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｓｔｒｏｇｌｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ａ ｃａｕｔｉｏｎａｒｙ ｎｏｔｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ４：２６）。簡単にいうと、ＶＭが除去され、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含有したダルベッコ変形イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内で粉砕し、７５ｃｍ^２ Ｔフラスコに細胞を塗抹（ｐｌａｔｅ）した。細胞密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０～９０％に達した時、膠細胞は０．１％トリプシンで採集し、培養表面上に塗抹して使用可能に準備された。

純粋星状細胞は、生後５～７日目のマウスＶＭから分離され、アストロ培地内で培養された（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ Ｃ，Ｇａｓｃｏｎ Ｓ，Ｍａｓｓｅｒｄｏｔｔｉ Ｇ，Ｌｅｐｉｅｒ Ａ，Ｓａｎｃｈｅｚ Ｒ，Ｓｉｍｏｎ－Ｅｂｅｒｔ Ｔ，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ Ｔ，Ｇｏｔｚ Ｍ，Ｂｅｒｎｉｎｇｅｒ Ｂ（２０１１） Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ａｓｔｒｏｇｌｉａ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ６：２１４－２２８）。小膠細胞を丁寧に振って除去した後、細胞を採集し、ＰＤＬ（ｐｏｌｙ－ｄ－ｌｙｓｉｎｅ）でコートされた培養皿に再塗抹した。ＢＶ２小膠細胞は、１０％ ＦＢＳを含有したＤＭＥＭで培養された（Ｂｌａｓｉ Ｅ，Ｂａｒｌｕｚｚｉ Ｒ，Ｂｏｃｃｈｉｎｉ Ｖ，Ｍａｚｚｏｌｌａ Ｒ，Ｂｉｓｔｏｎｉ Ｆ（１９９０） Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｖ－ｒａｆ／ｖ－ｍｙｃ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ ２７：２２９－２３７）。

２）ＮＰＣ（Ｎｅｕｒｏｎａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ）の培養
神経原性電位（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を持つＮＰＣは、１０．５日目のマウス胚或いは１２日目のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット胚のＶＭ（ｖｅｎｔｒａｌ ｍｉｄｂｒａｉｎ）（ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｅｇｉｏｎ ［ＩＣＲ］）から培養された。ＶＭ－ＮＰＣは、ｂＦＧＦ（ｍｉｔｏｇｅｎｓ ｂａｓｉｃ ＦＧＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＥＧＦ（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、マウス培養細胞に対してのみ）で補充された無血清Ｎ２培養液において細胞密集度が７０％以上（通常、３～４日間）になるまで培養された後、継代培養した（ｐａｓｓａｇｅｄ）。更に、ＮＰＣ培養をした後、細胞は共同培養及びその他実験のために採取されるか（ＣＭ治療実験において）、或いはミトゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ）を減少させることによって分化を直接誘導した。

３）星状細胞培養
星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）は、生後５～７日目のマウス又はラットＶＭ又はＣｔｘから分離され、アストロ培地で培養された。ＶＭは、分離後に、１０％ ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で砕けられ、７５－ｃｍ^２ Ｔフラスコにプレートされた。細胞密集度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）が８０％～９０％に達した時、細胞は、０．１％トリプシンで採取された後、ＰＤＬ（ｐｏｌｙ－ｄ－ｌｙｓｉｎｅ）でコートされた培養表面（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）に継代培養された。４～６日間後、オービタルシェーカーを用いて、２ｇの強度で振って小膠細胞を除去した。７日間培養後に、星状細胞は共同培養実験のために採取されるか、Ｎ２で更に８日間培養され、ＣＭ（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｃｕｍ）を準備した。小膠細胞除去過程後にも小膠細胞は少し残っていることがある。小膠細胞を少し含んでいる培養星状細胞を、下の実験に使用した。小膠細胞汚染による影響を測定するために、小膠細胞のない培養星状細胞も作った。これは、振る過程後に２０～３０分間培養星状細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液の０．０６％トリプシンで処理し、浮遊している細胞を捨てることによって作ることができる。

４）共同培養（ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ）
神経原性電位を持つＶＭ－ＮＰＣｓを採取した後、Ｃｔｘ－Ａｓｔ又はＶＭ－Ａｓｔと２：１（ＶＭ－ＮＰＣ：星状細胞）の比率で混ぜた。混ぜられた細胞はプレートされ、無血清Ｎ２培養液内でＶＭ－ＮＰＣの分化が直接促進された。

（２）ウイルス生成
ＣＭＶ促進遺伝子（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の統制下に、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２を発現させるレンチウイルス性ベクターを、それぞれのｃＤＮＡをｐＣＤＨ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）の多重クローニング部位に挿入することによって生成した。ｐＧＩＰＺ－ｓｈＮｕｒｒ１とｐＧＩＰＺ－ｓｈＦｏｘａ２レンチウイルス性ベクターをＯｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。空（ｅｍｐｔｙ）バックボーンベクター（ｐＣＤＨ又はｐＧＩＰＺ）が陰性対照群として用いられた。レンチウイルスを、前述のように、生体外培養を形質導入するために製造して使用した（Ｙｉ ＳＨ，Ｈｅ ＸＢ，Ｒｈｅｅ ＹＨ，Ｐａｒｋ ＣＨ，Ｔａｋｉｚａｗａ Ｔ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｋ，Ｌｅｅ ＳＨ（２０１４）Ｆｏｘａ２ ａｃｔｓ ａｓ ａ ｃｏ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｒｒ１－ｉｎｄｕｃｅｄ ＤＡ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｖｉａ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４１：７６１－７７２）。レンチウイルスの力価は、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ^ＴＭ ＨＩＶレンチウイルス定量キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて測定され、１０^６個の形質導入ユニット（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｔ，ＴＵ）／ｍｌ（６０～７０ｎｇ／ｍｌ）を含む２００μｌ／ウェル（２４ウェル皿）又は２ｍｌ／６ｃｍ皿がそれぞれの形質導入反応に使用された。

定位注射（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）によって生体内発現を誘導するために、ＣＭＶプロモーターの統制下に、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２［赤血球凝集素（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡ）でタグされる。］を発現させるＡＡＶを、それぞれのｃＤＮＡをｐＡＡＶ－ＭＣＳベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）にサブクローニングすることによって生成した。転移遺伝子発現の効率を評価するために、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＰ）を発現させるＡＡＶも生成した。ＡＡＶ（血清型２）の包装及び生成は、韓国科学技術研究院（ＫＩＳＴ、大韓民国ソウル）で行った。ＡＡＶ力価は、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ^ＴＭ ＡＡＶ定量キット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社）で測定された。共同発現研究は、個別ウイルス製剤の混合物（１：１，ウイルス遺伝子コピー（ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｐｙ，ｇｃ）：ウイルスｇｃ）で細胞を感染させて行った。

（３）膠細胞調節培地の製造
Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２をそれぞれ単独で発現し、空の対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）集団を発現させる一次膠細胞培養物（星状細胞＋小膠細胞）をレンチウイルス性形質導入によって製造した。

対照群は、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の共同発現のために、各転移遺伝子を個別に発現させるレンチウイルスを１：１（ｖ：ｖ）に混合して培養物に追加した。ウイルスの総体積及びＮｕｒｒ１又はＦｏｘａ２を単独で発現する培養物内におけるウイルスの力価を、コントロールウイルスを追加することにより、共同形質導入された培養物のそれと同一となるように調節した。新鮮な培地は、形質導入後３日目に追加し、培地形質導入された膠細胞内で調節された培地を３日間隔で２回採集した。調節された培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉａ，ＣＭ）を０．４５μＭで濾過し、使用するまで－８０℃で保管した。

（４）免疫染色
培養された細胞及び低温切断された脳切片を、次のような一次抗体で染色した：Ｎｕｒｒ１（１：５００、ウサギ、胎芽２０日目、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ、及び１：１，０００、マウス、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）；Ｆｏｘａ２（１：５００、ヤギ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）；ＧＦＰ（１：２，０００、ウサギ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）；ＧＦＡＰ（１：２００、マウス、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社、Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）；Ｉｂａ－１（１：２００、ウサギ、Ｗａｋｏ）、ＮｅｕＮ（１：１００、マウス、ＥＭＤ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）；アミロイドベータ（６Ｅ１０）（１：１，０００、マウス、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；アミロイドベータ（Ｄ５４Ｄ２）（１：５００、ウサギ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；ｓｏｘ２（１：５００、ウサギ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．）；ＵＧＴ１Ａ１（１：１０００、ウサギ、Ａｂｃａｍ）；Ｇａｌ Ｃ（１：５００、ウサギ、Ａｂｃａｍ）。

培養された細胞は、ＰＢＳ溶液の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）によって固定され、０．３％トリプトンＸ－１００及び１％ ＢＳＡによって４０分間ブロックされた。そして、４℃で一晩、一次抗体と共に培養された。視角化のための２次抗体は、次の通りである。Ｃｙ３（１：２００，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（１：２００，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）。染色された細胞は、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤとＤＡＰＩマウント液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と共にマウントされ、写真は、落射蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｌｅｉｃａ社）及び共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＰＣＳ ＳＰ５）によって得られた。

チオフラビンＳ（１ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）の染色法は、次のようになされた。まずマウス犠牲と脳抽出をする。脳をガラススライドに載せて完全に乾燥させる。１分間７０％エタノールでスライドを洗浄する。その後、１分間８０％エタノールでスライドを洗浄する。１５分間フィルタリング（０．２μｍのフィルター）されたチオフラビンＳ溶液（エタノール８０％で１％）にスライドを染色する。この時、光からチオフラビンＳを保護し、光から染色スライドを保護する。１分間８０％エタノールでスライドを洗浄する。その後、１分間７０％エタノールでスライドを洗浄する。蒸留水で２回洗浄する。カバースリップを水性マウント培地のスライド上にマウントし、少なくとも２時間暗所で乾燥させた後、透明マニキュアで密封する。このスライドを４℃の暗所に保管した。

（５）コンゴレッド染色
コンゴレッド染色は、組織にアミロイドが沈着されたか否かを確認するために用いる染色方法である。

コンゴレッド染色法は次の方法で行われた。脱パラフィン化した脳組織切片を、コンゴレッド水溶液に３０分間～６０分間染色する。蒸留水で洗浄した後、アルカリ性アルコール溶液に迅速に２～３回軽く入れて出す。その後、水道水で洗浄し、ヘマトキシリンを用いて対照染色する。その後、水道水で洗浄し、アンモニア水（水道水に水酸化アンモニウムを数滴添加したもの）に３０秒間漬す。水道水で５分間洗浄した後、アルコールを用いて脱水する。その後、顕微鏡で観察する。

（６）転写ＲＮＡ発現分析
総ＲＮＡの製造、ｃＤＮＡの合成及びＲＴ－ＰＣＲを通常の方法で行った。総ＲＮＡの製造は、通常のＲＮＡ分離プロトコルに従い、トリゾール試薬（Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて行った。ｃＤＮＡ合成は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。実時間ＰＣＲをｉＱ^ＴＭ ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いるＣＦＸ９６^ＴＭ実時間システムで行った。遺伝子発現値をＧＡＰＤＨのそれらに正規化した。プライマーに関する情報は、次表１に示される。酸化ストレス遺伝子のための高処理量遺伝子発現プロファイリングは、ＲＴ２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ ＡｒｒａｙＲ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いるマウス酸化ストレスＲＴ２ ＰｒｏｆｉｌｅｒＴＭ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ（ｃａｔ．３３０２３１ＰＡＭＭ－０６５ＺＡ）を用いて完了した。

（７）免疫沈降法（ＩＰ）及びタンパク質ウェスタンブロット（ＷＢ）分析
Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２（生後１０週マウスのＶＭ組織内に存在）との相互作用を免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＩＰ）で分析した。組織は、プロテアーゼ抑制剤で補充されたＩＰ溶解緩衝剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）内で溶解された。溶解物は、抗Ｎｕｒｒ１（１：１，０００、マウス、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）又は抗Ｆｏｘａ２（１：１，０００、ヤギ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）抗体で、４℃にて１８～２４時間培養した。混合物を、磁石ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて室温で１～２時間振った。洗浄後、免疫沈殿されたタンパク質は、サンプル溶解剤内に溶出させ、抗Ｆｏｘａ２（１：１，０００、ヤギ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）又は抗Ｎｕｒｒ１（１：５００、マウス、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ，ＷＢ）分析を実施した：Ｃａｓｐａｓｅ－１（１：１，０００、マウス、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＡＳＣ（１：１，５００、マウス、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、β－アクチン（１：２，０００、マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐ－ＩＫＫα／β（１：１，０００、ウサギ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ－ＩｋＢα（１：１，５００、ウサギ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐ－ｐ６５（１：１，０００、ウサギ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＮＦｋＢ（１：２，０００、ウサギ、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＰＳＤ９５（１：２，０００、ウサギ、Ａｂｃａｍ）、Ｓｙｎ１（１：１，５００、ウサギ、Ｓｉｇｍａ）、ＳＹＰＴ（１：２，０００、マウス、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。

（８）動物管理及び実験
３ｘＦＡＤ動物モデル実験に関する全ての手続は、承認番号２０１８－００４７Ａ下にハンヤング医学専門大学院動物実験倫理議員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ，ＩＡＣＵＣ）の承認を受けた。また、３ｘＦＡＤ動物モデル実験に関する全ての手続は、ハンヤング大学校実験動物使用に関するガイドラインに従ってなされた。動物を１２時間、明／暗サイクルを用いた特定の無菌障壁施設に収容し、標準食物（５０５３ ＰｉｃｏＬａｂ^Ｒ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０）を提供した。本実験のための動物の大きさは、本実験の生体外分析及び予備試験によって、事前統計的演算無しで決定された。実験は、ＮＩＨガイドラインに従って実施された。偏向を最小化するために、挙動的分析は、概ね、２名の実験者によって盲検方式で行われた。１８ヶ月及び１５ヶ月アルツハイマー病遺伝子導入（３ｘＴｇ－ＡＤ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）が実験に使用された。

また、５ｘＦＡＤ動物モデル実験に関する全ての手続は、承認番号ＫＩＳＴ－２０１９－０５７下に、韓国科学技術院動物実験倫理委員会の承認を受けた。

（９）アルツハイマー病モデルマウスに対する正位方法のＡＡＶ注射
１８ヶ月及び１５ヶ月アルツハイマー病遺伝子導入（３ｘＴｇ－ＡＤ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）に、Ｎｕｒｒ１－ＡＡＶ９（１μｌ）＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９（１μｌ）（２μｌ，１０^１０ｖｇ／μｌ，Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２群）又は対照群－ＡＡＶ９（２μｌ，１０^１０ｖｇ／μｌ、対照群のみで構成）を、Ｒｏｍｐｕｍ（９３．２８μｇ／ｋｇ）と混合されたＺｏｌｅｔｉｌ５０（０．１ｍｇ／ｋｇ）によって誘導された麻酔状態で、１０分間にわたって海馬（ブレグマの後方に１．５ｍｍ；ミッドラインの側方に±１ｍｍ；硬膜の前方に－２ｍｍ）及び脳室（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｌｅ，ＩＣＶ）（ブレグマの後方に０．９ｍｍ；ミッドラインの側方に±１．７ｍｍ；硬膜の前方に－２．２ｍｍ）に注射した。毎注射完了後、針（２６ゲージ）は、注射部位に刺された状態で５～１０分間置いた後、徐々に除去した。海馬（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）及び脳室（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｌｅ，ＩＣＶ）部位での注射に誤りがあったと判明される場合、それらのマウスは分析から除外した。

（１０）挙動検査
１）水迷路（Ｗａｔｅｒ Ｍａｚｅ）法
水迷路法は、モーリスウォーター迷路とも呼ばれ、空間記憶と学習を研究する上で広く用いられている。動物は、粉状の無脂肪牛乳や無毒性ペイントで不透明に染めた水溜まりに置かれるが、そこから彼らは、隠された脱出プラットホームまで泳いで行かなければならない。動物は不透明な水中にいるため、プラットホームを見ることができず、脱出路を探すには臭いに依存するしかない。代わりに、動物は外部或いは迷路外の端緒に依存しなければならない。動物が脱出プラットホームを探すことに熟練するにつれ、そのプラットホームをより速く探すことができる。１９８４年にリチャードＧ．モーリスによって開発されたこのパラダイムは、行動神経科学の“ゴールドスタンダード”の一つとなった。

２）Ｙ迷路（Ｙ－Ｍａｚｅ）法
Ｙ迷路（Ｙ－Ｍａｚｅ）法は、空間学習と記憶を研究するための事前臨床研究において行動を評価するために広く用いられている。動物は、Ｙ迷路法において、Ｙ状の迷路で３個の腕（ａｒｍ）のいずれか一方の腕の端に置かれるが、ここで、彼らは、別れ道から左側又は右側のどこへ移動するかを決定する。このようなテストは同一動物に数回反復されてよい。観察者は、Ｙ迷路内で動物の一連の選択（例えば、特定腕を訪問した回数、３個の腕を訪問した総回数、動物基準で左側の腕を選択した回数、動物基準で右側の腕を選択した回数）を記録する。Ｙ迷路テストの使用は、自発的交代テスト（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）と認識記憶力テストを含む。自発的交代テストにおいて、観察者は、動物が最近に訪問しなかった腕に訪問する傾向を示すかを観察して記録する（例えば、自発的交代数字を測定）。これらの検査は、海馬損傷、遺伝子操作、そして記憶喪失薬物に敏感であることが明らかにされた。

３）明示的記憶能力検査（Ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）
明示的記憶能力検査（Ｐａｓｓｉｖｅ ａｖｏｉｄａｎｃｅ ｔｅｓｔ）は、電気衝撃発生器と回避装置とから構成されている。回避装置は、黒いアクリルでできた暗い箱（３０×３０×３０ｃｍ）であり、底にはアルミニューム棒が一定の間隔で敷かれており、これを通じて動物の足の裏に電気衝撃を加えることができる。箱の前面外側の壁には、１匹の動物をやっと載せておくことが可能な程度の大きさ（５×１５ｃｍ）の欄干が設置されている。欄干上方４５ｃｍの地点には、ハロゲン電球（ＡＣ１２Ｖ－５０Ｗ）が設置されている。欄干と回避箱との間には小さい扉（５×５ｃｍ）が装置されている。動物に電気衝撃をかける装置は、Ｃｏｕｌｂｏｕｍ社で生産したスクランブルショック発生器（ｓｃｒａｍｂｌｅ ｓｈｏｃｋ ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）であった。

実験過程は、まず、箱の外側に設置されている欄干に、動物を頭が外側に向くようにして乗せると同時に箱に通じる扉を開けた。扉が開くと否や、欄干上の４５ｃｍ地点に設置された照明装置から５０Ｗの光を動物に照らした。このような条件で動物は明るい所を避けて暗い箱に入り、回避反応を見せた。動物が箱に入ると、１０秒間の試行間隔をあけて２番目の試行を行った。このような試行が３回反復され、３回目の試行では、動物が暗い箱に入る瞬間、箱の底に敷かれているアルミニューム格子を通じて電気衝撃（０．４ｍＡ、５秒）がかかった。四肢が全て箱中に入る場合のみを、反応したものと見なした。これで訓練試行を終了した。２４時間が経った翌日、同じ手順で記憶検査試行（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）を行った。検査試行では、動物が箱に入ると電気衝撃がかからず、直ちに試行が終了した。訓練試行、検査試行両方とも、動物が嫌悪状況である欄干から暗い箱に入るまでかかった反応潜在期（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｌａｔｅｎｃｙ）が訓練又は記憶成績として測定された。動物が嫌う明るい所から暗い所に入った時に電気衝撃を経験した記憶をよく形成すれば、記憶検査試行では暗い所に入らずに明るい所で長く留まることから、反応潜在期がまさに記憶成績となった。

４）新しい事物認知（Ｎｏｖｅｌ Ｏｂｊｅｃｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）（ＮＯＲ）試験
新しい事物認知（Ｎｏｖｅｌ Ｏｂｊｅｃｔ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）（ＮＯＲ）試験は、ＣＮＳ障害の齧歯類モデルにおいて認知、特に認識記憶を評価するために用いられる。この試験は、齧歯類動物が見慣れた事物よりも新しい事物を探索するのに、より多い時間を消費する自発的な行動に基づく。動物モデルにおいて、新しい対象を探索するための選択は、学習及び認識記憶の使用を反映する。

新しい事物認知試験を、２種の個体がある公開的な場所で行った。２つの物体は、概ね高さと体積が一定であるが、形状が異なるようにした。習慣を維持する間、動物は空ボックスを探険することができた。療法完了後に２４時間が経つと、同じ距離に２つの同一物体がある見慣れたボックスに動物が露出された。翌日、マウスは、見慣れた対象と長期認識メモリーをテストするための新しい客体とがある状態で、開放されたボックスを探索することができた。各対象を探索するのにかかった時間と差別指数百分率を記録した。

この試験は、アルツハイマー病遺伝子変形マウスにおける認知機能損傷を評価し、認知に及ぶ影響に対する新しい化学物質を評価するのに有用である。

（１１）細胞数集計及び統計分析
免疫染色及びＤＡＰＩ－染色された細胞は、２００倍又は４００倍の倍率でアイピースグリッド（ｅｙｅｐｉｅｃｅ ｇｒｉｄ）を用いて、各培養カバースリップ内の無作為領域で計算された。全ての数値に対してデータは平均±ＳＥＭと表示され、統計テストは適切に立証される。統計学的比較は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ（ｕｎｐａｉｒｅｄ）、２－ｔａｉｌｅｄ、又はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、ＳＰＳＳ（登録商標）（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２１；ＩＢＭ Ｉｎｃ．Ｂｅｎｔｏｎｖｉｌｌｅ，ＡＲ，ＵＳＡ）を用いたＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ ｈｏｃ分析で行われた。ｎ、Ｐ－値及び統計分析方法は、図面凡例に表示されている。０．０５未満のＰ値は有意のものと見なされた。

（１２）ＲＮＡ－ＳＥＱ分析
ＲＮＡシーケンシンク分析（ＲＮＡ－ｓｅｑ分析）は、マクロジェン（Ｍａｃｒｏｇｅｎ、大韓民国、ソウル）で行われた。２０未満の品質点数（ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）を持つリード（ｒｅａｄｓ）を、ＦａｓｔＱＣを用いて整え、Ｂｏｗｔｉｅを用いて不整合率（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒａｔｉｏ）を点検した後、全てのＲＮＡ－ｓｅｑデータを、ＳＴＡＲを用いてマウス基準ゲノム（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）にマップした。（ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ Ｒｅｌｅａｓｅ １０５：Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１５に基づく）マウスゲノムの全４６，４３２個の注釈付き遺伝子（ａｎｎｏｔａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ）、１０７，６３１個のトランスクリプト（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）、及び７６，１３１個のタンパク質－コーディング（ｍＲＮＡ）レコードの発現レベルを測定するために、遺伝子のエクソン（ｅｘｏｎｓ）にマップされたリード（ｒｅａｄｓ）を、Ｈｔｓｅｑ－ｃｏｕｎｔを用いて数え、ＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｍａｐｐｅｄ）数字を計算した。グループ間の技術全般的な発現偏向（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｇｌｏｂａｌ ｂｉａｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を減らすために、クオンタイル正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行った。全データはＧＥＯデータベース（ＧＥＯ：ＧＳＥ１０６２１６）に寄託された。

（１３）ＲＴ－ＰＣＲ分析
ＲＮＡ分離プロトコルに従ってトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して総ＲＮＡを準備した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡ合成を行った。実時間ＰＣＲは、ｉＱＴＭ ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＣＦＸ９６ＴＭ実時間システムで行われ、遺伝子発現レベルは、ＧＡＰＤＨレベルによって決定された。ＲＴ^２ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ^Ｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて酸化ストレスに関連した８４個の遺伝子発現をプロファイリングするために、マウス酸化ストレスＲＴ２Ｐｒｏｆｉｌｅｒ^ＴＭ ＰＣＲ Ａｒｒａｙ（カタログ３３０２３１ ＰＡＭＭ－０６５ＺＡ）を使用した。プライマー情報は、前記表１に示されている。

実施例２．結果
（１）アルツハイマー病（ＡＤ）マウスモデルにおいてＡＡＶを用いた星状細胞へのＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子伝達結果確認
ヒトで免疫原性のないアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）を用いて、脳において膠細胞に主に感染される性向のＡＡＶ９血清型を用いて膠細胞に特異的にターゲッティングするＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子伝達システムを構築した。Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子発現のためにＣＭＶ又はＧＦＡＰプロモーターが使用された。Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスの注入は、アルツハイマー病の病変部位である海馬体（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）と脳室（Ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｌｅ，ＩＣＶ）に行われた。

ＡＡＶ９ウイルスを用いた遺伝子伝達テストを行うために、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）に特異的なＧＦＡＰプロモーター下でＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現させるＡＡＶ９ウイルスをマウスの海馬体と脳室（ＩＣＶ）に注入した。ＧＦＰ－ＡＡＶ９ウイルス注入３週後にＧＦＰ発現を測定した（図１）。ＧＦＰ－ＡＡＶ９を海馬体と脳室に注入した結果、ＧＦＰが海馬体の全領域に発現し、ＧＦＡＰ＋星状細胞に特異的に発現した（図２）。ＧＦＡＰは星状細胞マーカー、ＮｅｕＮは成熟神経細胞（ｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒｏｎ）マーカー、Ｉｂａ１は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）マーカーとしてＧＦＡＰとＧＦＰは共発現し、ＮｅｕＮとＩｂａ１はＧＦＰと共発現しないことから、ウイルスの発現する細胞が星状細胞において特異的に発現することがわかった。

（２）水迷路とＹ迷路行動実験を用いたアルツハイマー病（ＡＤ）マウスモデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子伝達による認知欠損症（学習と記憶力）改善確認
アルツハイマー病において、膠細胞にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現によるアルツハイマー病の治療効果を調べるために、３種の遺伝子であるＡＰＰ、ＰＳ１、及びｔａｕを突然変異させてアルツハイマー病を誘発した１５～１８月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現を起こした。１５～１８月齢は、マウスの平均寿命が約２４ヶ月であることからして、相当な年齢である。アルツハイマー病モデルマウスにＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を伝達し、遺伝子伝達２～３ヶ月後に、当該マウスの認知能力分析を行った。

アルツハイマー病は、患者の記憶力及び認知力の低下が徐々に進む退行性脳神経系疾患であり、これを代弁するための動物実験として水迷路とＹ迷路実験を行った。水迷路とＹ迷路実験は、記憶力及び認知力に対する効能実験の代表的な公認実験方法であり、アルツハイマー病の進行及び治療効果を判断するための行動実験指標として用いられる。

１５～１８月齢のマウスにＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入して約２週後から２週間隔で２ヶ月間、水迷路とＹ迷路行動実験を行い、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標とコントロールウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標とを比較した。実験の結果、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２が発現したマウスは、コントロールマウスに比べてより良い行動指標及びより速い反応速度を示した。このことから、膠細胞にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現が学習及び記憶部分の認知活動の有意な改善をもたらし、これにより、アルツハイマー病治療効果を奏することを確認した。すなわち、脳細胞におけるＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現を用いたアルツハイマー病の臨床遺伝子治療効果を確認した（図３）。

（３）明示的記憶能力検査及び新しい事物認知試験を用いたアルツハイマー病（ＡＤ）マウスモデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子伝達による認知欠損症（学習と記憶力）改善確認

アルツハイマー病において、膠細胞にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現によるアルツハイマー病の治療効果を調べるために、５種の遺伝子ＡＰＰ、ＰＳ１、ＮＣＴ、ＰＥＮ２、及びＡＰＨ１を突然変異させてアルツハイマー病を誘発した６～８月齢の５ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２発現を起こした。アルツハイマー病モデルマウスにＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を伝達し、遺伝子伝達１週後に当該マウスの認知能力分析を行った。

アルツハイマー病は、患者の記憶力及び認知力の低下が徐々に進む退行性脳神経系疾患であり、これを代弁するための動物実験として明示的記憶能力検査及び新しい事物認知試験を行った。明示的記憶能力検査及び新しい事物認知試験は、記憶力及び認知力に対する効能実験の代表的な公認実験方法であり、アルツハイマー病の進行及び治療効果を判断するための行動実験指標として用いられる。

６～８月齢のマウスにＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入して約２週後に新しい事物認知実験を行い、１１週後に明示的記憶能力検査を行い、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標とコントロールウイルス（ＧＦＰ－ＡＡＶ９）を注入したアルツハイマー病モデルマウスの行動指標とを比較した。実験の結果、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現したマウスは、明示的記憶能力検査においてコントロールマウスに比べて、すぐに暗い所に入らずに明るい所に留まり、進入潜在期（ｅｎｔｒｙ ｌａｔｅｎｃｙ）が増加した結果を示した（図４）。また、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現したマウスは、新しい事物認知試験においてコントロールマウスに比べて記憶能力が回復された様子を示した（図５）。このことから、膠細胞へのＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現が、学習及び記憶部分の認知活動の有意な改善をもたらし、これにより、アルツハイマー病治療効果を奏することを確認した。すなわち、脳細胞におけるＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現によるアルツハイマー病の臨床的な遺伝子治療の効果を確認した（図４、図５）

（４）アルツハイマー病（ＡＤ）マウスモデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子伝達を用いたアミロイドベータ蓄積低減効果
アルツハイマー病では、アミロイドベータ（Ａｍｙｌｏｉｄ β，Ａβ）ペプチドでできた老人性プラーク（ｓｅｎｉｌｅ ｐｌａｑｕｅ，Ａβ ｐｌａｑｕｅ）のようなタンパク質が主成分である神経線維塊（Ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴ）が発見される。したがって、このような神経線維塊の形成を抑制し、塊を分解することが、アルツハイマー病の治療の効果の指標として用いられてよい。

１５月齢、１８月齢の３ｘＦＡＤマウス（ＡＰＰ、ＰＳ１、及びｔａｕを突然変異させてアルツハイマー病を誘発したマウス）の海馬及び脳室に位置している膠細胞に、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを用いて特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を導入した。遺伝子導入２ヶ月後に、海馬部位において免疫染色方法によってアミロイドベータとタンパク質凝集体に対する蛍光（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓ）を確認した。

その結果、上のＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２処理群において約２ヶ月後に、海馬において免疫染色方法により上のマーカーを確認した。また、上のＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２処理群において、アミロイドベータ（Ａｍｙｌｏｉｄ β，Ａβ）とタンパク質凝集体（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｓ）タンパク質の有意な減少を、（アミロイドベータに特異的な抗体及びチオフラビンＳ染色を用いた）免疫染色法で確認した（図６）。

なお、Ｎｕｒｒ１を単独で処理した群に比べてＮｕｒｒ１＋ Ｆｏｘａ２同時処理群が、アミロイドベータ（Ａｍｙｌｏｉｄ β，Ａβ）タンパク質蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）が有意に減少することを免疫染色法で確認した（図７）。

免疫染色法以外の方法として、アミロイドベータの凝集を確認するためにコンゴレッド染色及びウェスタンブロット分析を用いた。

その結果、コンゴレッド染色法により、Ｎｕｒｒ１＋ Ｆｏｘａ２処理群においてアミロイドベータ（Ａｍｙｌｏｉｄ β，Ａβ）の有意な減少を確認した（図８）。

また、ウェスタンブロット分析（タンパク質電気泳動法）により、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２処理群においてアミロイドベータ（Ｄ５４Ｄ２）の有意な減少を確認した（図９）。

（５）チオフラビンＴ試験（チオフラビンＴ ａｓｓａｙｓ）を用いたアミロイドベータ線維化（ｆｉｂｒｉｌ）量測定
膠細胞におけるＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現がアミロイドベータの分解を促進するかどうか確認するために、チオフラビンＴ試験（チオフラビンＴ ａｓｓａｙ）を行った。アミロイドベータ線維の量測定のために、濁度分析及びチオフラビンＴ試験（ＴｈＴ ａｓｓａｙｓ）が用いられた。

図１０Ａは、アミロイドベータ分解試験過程を説明している。サンプルを３７℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離機に処理した後、遠心分離して得たペレット及びＣＭにアミロイドベータ線維を混ぜると、アミロイドベータ線維の一部が単量体として分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）される。その後、ＴｈＴ試験溶液を混ぜると、アミロイドベータ線維にＴｈＴが付着し、ＴｈＴの蛍光度に基づいてアミロイドベータ線維の量を測定することができる。

Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現した膠細胞が培養された培地及び粉砕された細胞の上澄み液（Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２）５０μｌ、Ｎｕｒｒ１の発現した膠細胞が培養された培地及び粉砕された細胞の上澄み液（Ｎｕｒｒ１）５０μｌ、コントロール膠細胞が培養された培地及び粉砕された細胞の上澄み液（Ｃｏｎｔ）５０μｌ、及び何ら添加されていない培地（Ｍｅｄｉａ）のそれぞれを前記方法で処理後に、２００μｌのＴｈＴ試験溶液に混ぜた。ここで、ＴｈＴ試験溶液は、２５μＭ ＴｈＴ（ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３５１６，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が１０ｍＭグリシンバッファ（ｐＨ９．０）に溶解された溶液である。その後、アミロイドベータ線維の量は、４８２ｎｍにて蛍光分光光度計で測定（４４０ｎｍで励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ））されたＴｈＴ蛍光度に基づいて測定された。

ｉｎ ｖｉｔｒｏアミロイドベータ試験の結果、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現した膠細胞が処理された培養液（Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２）サンプルは、他のサンプル（Ｎｕｒｒ１単独発現群、コントロールベクター群、培地処理群）と比較して、増加したアミロイドベータ分解を示した（図１０Ｂ、図１０Ｃ）。

Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現した膠細胞が培養された培養液が処理されたサンプルのアミロイドベータ線維分解程度は、他の培養液（Ｎｕｒｒ１単独発現群、コントロールベクター群、培地処理群）が処理されたサンプルのアミロイドベータ線維分解程度に比べて有意に高かった。したがって、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２を発現させる膠細胞によって処理された培養液は、コントロール膠細胞によって処理された培養液と比較した時、アミロイドベータ分解促進効果を有するといえ、特に、Ｎｕｒｒ１を単独で発現する膠細胞によって処理された培養液果と比較した時、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２同時に発現することによって相乗効果があることが分かった。

（６）Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現がアミロイドベータの分解に及ぼす影響
マウスの１次星状細胞（ｒｏｄｅｎｔ ｐｒｉｍａｒｙ ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）に、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ ｖｉｒｕｓ）を用いてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現後にＲＮＡ－Ｓｅｑ及びＲＴ－ＰＣＲを行って、関連した遺伝子のそれぞれのｍＲＮＡレベルを確認した。

培養された膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現させた時、（ａ）ＭＭｐ１４、（ｂ）ＭＭＥ、（ｃ）ＭＭＰ２、（ｄ）ＦＯＬＨ１、（ｅ）ＥＣＥ１、（ｆ）ＡＣＥなど（Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｎ．，Ｗｕ，Ｍ．Ｆ．，Ｌｉｕ，Ｃ．Ｃ．，Ｊｕｎｇ，Ｗ．Ｈ．，Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｗ．Ｐ．，．．．Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｃ．（２０１７）．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｇａｉｎｓｔ Ａｂｅｔａ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｎ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉａ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，２６（２０）、３９０９－３９２１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｘ２７８ ａｎｄ Ｒｉｅｓ，Ｍ．，＆ Ｓａｓｔｒｅ，Ｍ．（２０１６）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ａｂｅｔａ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ Ａｇｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，８，１６０．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｎａｇｉ．２０１６．００１６０）アミロイドベータ凝集体の分解に関連した酵素の発現が増加することを確認した（図１１Ａ、図１１Ｂ）。

図１１Ａは、ＲＮＡ－ｓｅｑデータで示した、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現した膠細胞における当該酵素の遺伝子発現程度とコントロール膠細胞における遺伝子発現程度との比率を示している。図１１Ｂは、実時間ＰＣＲデータで示した、コントロール膠細胞、Ｎｕｒｒ１単独で発現した膠細胞、Ｆｏｘａ２単独で発現した膠細胞、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が同時に発現した膠細胞におけるアミロイドベータ分解酵素（例えば、ＮＥＰ、ＭＭＰ１４、ＩＤＥ、ＥＣＥ２）の遺伝子発現程度を示す。

Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２のそれぞれを単独で発現した膠細胞と比較したとき、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を共に発現した場合が、アミロイドベータ凝集体分解に関連したＮＥＰ、ＭＭＰ１４、ＩＤＥ、ＥＣＥ２の各遺伝子の発現が相乗効果を起こし、より大きいことを確認した。これは、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子の両者が共に発現する場合が、各遺伝子単独発現する場合に比べてアミロイドベータ凝集の抑制を相乗的に（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ）より大きくすることを確認した。

Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現した膠細胞において補体受容体３（ＣＲ３，ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ ｏｆ ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）の発現が減ることを確認した（図１１Ｃ）。図１１Ｃは、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現した膠細胞におけるＣＤ１１ｂとＣＤ１８の遺伝子発現程度とコントロール膠細胞における遺伝子発現程度との比率を示している。ＣＲ３は、上述したアミロイドベータ分解に関与する酵素生成を妨害するものと知られている（Ｃｚｉｒｒ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．“Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｂｒａｉｎ Ａｂｅｔａ ｌｅｖｅｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．” Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１４（４）：１０８１－１０９２）。したがって、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現がＣＲ３発現を減少させ、その影響により、アミロイドベータ分解を促進させる種々の酵素の発現が高くなったと解析できる。

（７）チオフラビンＴ試験（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ Ｔ ａｓｓａｙｓ）を用いてアミロイドベータ単量体量測定
チオフラビンＴ試験（ＴｈＴ ａｓｓａｙｓ）を用いてアミロイドベータ単量体（Ａβ ｍｏｎｏｍｅｒ）の量を測定した。図１２Ａは、アミロイドベータ凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）生成試験過程を説明している。サンプルを３７℃、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離機に処理した後、遠心分離して得たペレット及びＣＭにアミロイドベータ単量体を混ぜると、単量体が互いに凝集してアミロイドベータ線維（Ａβ ｆｉｂｒｉｌ）に線維化（ｆｉｂｒｉｌｌｉｚａｔｉｏｎ）する。その後、ＴｈＴ試験溶液を混ぜると（すなわち、チオフラビンＴ試験を行うと）、アミロイドベータ線維にＴｈＴが付着し、ＴｈＴの蛍光度に基づいてアミロイドベータ線維の量が測定できる。

Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現した膠細胞が培養された培地（培養液）（Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２）５０μｌ、Ｎｕｒｒ１が発現した膠細胞が培養された培地（培養液）（Ｎｕｒｒ１）５０μｌ、コントロール膠細胞が培養された培地（培養液）（Ｃｏｎｔ）５０μｌ、及び何ら添加されていない培地（Ｍｅｄｉａ）のそれぞれを前記方法で処理後に２００μｌのＴｈＴ試験溶液に混ぜた。ここで、ＴｈＴ試験溶液は、２５μＭ ＴｈＴ（ｃａｔ．ｎｏ．Ｔ３５１６，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が１０ｍＭグリシンバッファ（ｐＨ９．０）に溶解された溶液である。その後、アミロイドベータの凝集程度は、４８２ｎｍにて蛍光分光光度計で測定（４４０ｎｍで励起）されたＴｈＴ蛍光度に基づいて測定された。

その結果、ｉｎ－ｖｉｔｒｏアミロイドベータ凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）生成試験において、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現した膠細胞が処理された培養液（Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２）サンプルは、他のサンプル（Ｎｕｒｒ１、Ｃｏｎｔ、Ｍｅｄｉａ）と比較して減少したアミロイドベータ凝集を示した（図１２Ｂ、図１２Ｃ）。

Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現した膠細胞が処理された培養液サンプルのアミロイドベータ凝集程度が、コントロール膠細胞が培養された培地（培養液）サンプルのアミロイドベータ凝集程度に比べて有意に低かった。

また、アミロイドベータ凝集において、Ｎｕｒｒ１を単独で発現した場合に比べて、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を共に発現した場合、凝集程度がより低く示される結果から、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を共に発現させた場合に相乗効果があるという事実がわかった。
この実験結果に基づき、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２を発現させる膠細胞によって処理された培養液は、コントロール膠細胞によって処理された培養液又はＮｕｒｒ１を単独で発現する膠細胞によって処理された培養液に比べて改善されたアミロイドベータ凝集抑制効果を有すると考えられる。

（８）Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現がＣ３及びＣ１ｑ発現に及ぼす影響
補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）Ｃ３及びＣ１ｑは、アルツハイマー病においてシナプス損失（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｌｏｓｓ）及び認知能力減退（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｉｔ）を誘発するものと知られている（Ｈｏｎｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）．“Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｓｙｎａｐｓｅ ｌｏｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．” Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２（６２８６）：７１２－７１６）（Ｓｈｉ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）。“Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｃ３ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｄ ｐｌａｑｕｅ－ｒｉｃｈ ＡＰＰ／ＰＳ１ｍｉｃｅ．” Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ９（３９２））。膠細胞においてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現によるアルツハイマー病の治療効果を調べるために、ＡＰＰ、ＰＳ１、及びｔａｕの３つの遺伝子を突然変異させてアルツハイマー病を誘発した１５月齢、１８月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２を発現させて２ヶ月後に、海馬部位を粉砕し、ＲＴ－ＰＣＲを行った。

上述した実験方法でＲＴ－ＰＣＲを行ったとき、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９を導入したアルツハイマー病モデルマウスにおいてコントロール－ＡＡＶ９を導入したマウスと比較して、Ｃ１ｑａ、Ｃ３のｍＲＮＡレベルの有意な減少を確認し、ＲＮＡ－Ｓｅｑにおいてもそれを確認した。このことから、アルツハイマー病においてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現がシナプス損失（ｓｙｎａｐｔｉｃ ｌｏｓｓ）及び認知能力減退（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｉｔ）を抑えるということを確認した（図１３）。

（９）Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現がＣＣＬ３及びＣＣＬ４遺伝子発現に及ぼす影響
アルツハイマー病にかかった脳は、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）であるＣＣＬ３及びＣＣＬ４を分泌し、これは、好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）、単核球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）のような末梢免疫細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ）の増加を誘導する。ＣＣＬ３及びＣＣＬ４が媒介する末梢免疫細胞の増加は、アルツハイマー病の主要病理的症状の一つと知られている（Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．“Ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ ＡＰＯＥ ｐａｔｈｗａｙ ｆｒｏｍ ａｇｉｎｇ，ａｍｙｌｏｉｄ，ａｎｄ ｔａｕ．” Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１５（９）：２２３５－２２４５）。

膠細胞においてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現によるアルツハイマー病の治療効果を調べるために、ＡＰＰ、ＰＳ１、及びｔａｕの３つの遺伝子を突然変異させてアルツハイマー病を誘発した１５月齢、１８月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２を発現させて２ヶ月後に海馬部位を粉砕し、ＲＮＡ－Ｓｅｑを行った。その結果、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現した培養膠細胞において、コントロール培養膠細胞に比べてＣＣＬ３とＣＣＬ４遺伝子の発現が有意に減少した（図１４）。これは、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の発現が少なくともアルツハイマー病の病理的症状を緩和するのに効果があることを示している。

（１０）アミロイドベータアルツハイマー病モデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の相乗的反応による炎症因子、炎症調節複合体減少及び神経栄養因子増加
アルツハイマー病において、アミロイドベータ凝集に関与する重要な機序として炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）を提示できるが、炎症調節複合体は、ＡＳＣ、ＮＬＲＰ３、Ｃａｓｐａｓｅ１で構成される多重タンパク質オリゴマー（ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒ）であり、炎症反応（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を活性化させる。

脳内においてアミロイドベータの凝集（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、先天性免疫システム（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）を伴い、小膠細胞では炎症調節複合体依存的ＡＳＣ粒子（ｓｐｅｃｋｓ）が作られる。小膠細胞において分泌されるＡＳＣ粒子は、アミロイドベータに素早く付着してアミロイドベータオリゴマー、凝集体が形成される。すなわち、炎症調節複合体活性化がアミロイドベータ病理のシーディングとスプレッディングに関連する（Ｖｅｎｅｇａｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）．Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ－ｄｅｒｉｖｅｄ ＡＳＣ ｓｐｅｃｋｓ ｃｒｏｓｓ－ｓｅｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ，５５２（７６８５）、３５５－３６１．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２５１５８）。

更に他の炎症調節複合体の構成要素であるＮＬＲＰ３／Ｃａｓｐａｓｅ１を媒介とする炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）も同様、アルツハイマー病において行動的、認知的欠損（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）に重要な役割を担う。例えば、アミロイドベータによってＮＬＲＰ３炎症調節複合体が活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）されると、慢性的な炎症組織反応（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が起き、アルツハイマー病の進行が促進される。したがって、ＮＬＲＰ３炎症調節複合体の活性を防ぐか、炎症調節複合体由来サイトカインの活性を阻害させることが、アルツハイマー病の進行を防ぐ治療的概念となり得る（Ｈｅｎｅｋａ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）．ＮＬＲＰ３ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ＡＰＰ／ＰＳ１ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ，４９３（７４３４）、６７４－６７８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１１７２９）。

アルツハイマー病において、膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現によるアルツハイマー病の治療効果を調べるために、前記１０週齢のＩＣＲマウスの脳室にアミロイドベータ凝集体（ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を注入し、海馬部位にはＡＡＶ－９（遺伝子発現のためのプロモーターは、ＣＭＶ又はＧＦＡＰプロモーターを使用した。）によりＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を導入した。そして、海馬部位を粉砕（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅ）し、ＲＴ－ＰＣＲを行った。

図１５は、アミロイドベータアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位にＡＡＶ－９（ＣＭＶ ｏｒ ＧＦＡＰ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）によりＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入後に、海馬部位をＲＴ－ＰＣＲした結果を示している。アミロイドベータアルツハイマー病モデルにおいて、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２をそれぞれ単独で処理した組織部位と比較して、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２を共に処理した組織部位の炎症及び炎症調節複合体の減少が相乗的に（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ）より大きいことを確認した。

また、上述したように、アルツハイマー病の誘発に密接な関連を有する炎症調節複合体関連タンパク質を電気泳動で確認し、アルツハイマー病モデルマウスの海馬部位においてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の発現によって炎症調節複合体が減少するか否か確認した。

図１６は、１５月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を導入して２ヶ月後に、ウェスタンブロットを用いて海馬部位で炎症調節複合体マーカーのタンパク質レベルを確認した結果を示す。その結果、炎症調節複合体マーカーであるｐｒｏ－ｃａｓｐａｓｅ１とｃｌｅａｖａｇｅ ｃａｓｐａｓｅ１タンパク質の減少を確認し、ＡＳＣタンパク質も概ね減少を確認した。

図１７は、アミロイドベータアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入後に、海馬部位で炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β、ＴＮＦ－α）を対象にＲＴ－ＰＣＲした結果を示す。その結果、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子の発現による、炎症性サイトカインであるＩＬ－１β、ＴＮＦ－αの減少を確認し、特に、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を共に発現した場合、炎症性サイトカインの発現が大きく減少することを確認した。

図１８は、アミロイドベータアルツハイマー病モデルマウスの海馬部位にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入後に、海馬部位で神経栄養因子（ＳＨＨ、ＢＤＮＦ、Ａｒｇ１）を対象にＲＴ－ＰＣＲした結果を示す。その結果、Ｎｕｒｒ１又はＦｏｘａ２遺伝子の発現を通じて神経栄養因子の増加を確認し、特に、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を共に発現した場合、神経栄養因子も同様に相乗的に（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ）より増加することを確認した。

このことから、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の相乗的な反応により脳細胞の炎症減少、炎症調節複合体の減少、神経栄養因子増加の効果が得られると考えられる。

（１１）アミロイドベータアルツハイマー病モデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の相乗的反応によるＮＦｋＢ信号伝達因子の活性減少
ＮＫ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ）－ｋＢは転写因子であって、様々な生理作用を示すが、特に、免疫と炎症反応において中心的な役割を担うと知られている。また、ＮＫ－ｋＢは、ｐ５０とｐ６５（ＲｅｌＡ）タンパク質のヘテロ二量体であって、主にＤＮＡに結合する。親炎症性遺伝子発現においてＮＦ－ｋＢが中心的役割を担うことから、慢性炎症治療では、この経路の抑制剤を開発するために多くの研究が行われている。

上述したように、Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２が星状細胞において相乗作用を起こしながら炎症反応を調節するということを確認した。したがって、炎症調節反応がＮＦ－ｋＢによって調節されるかを確認するために実験を行った。

生後１日のマウスの大脳皮質星状細胞を一次培養（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ）した後、レンチウイルスを用いてＣＭＶプロモーターコントロール、Ｎｕｒｒ１、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の４群に分けて各遺伝子を細胞に発現させた。その後、ベータアミロイド凝集体を処理し、ＮＦ－ｋＢ信号伝達要因をウェスタンブロットで確認した。

その結果、マウス大脳皮質星状細胞においてレンチウイルスを用いてコントロール、Ｎｕｒｒ１、Ｆｏｘａ２、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２をそれぞれ発現させた時、細胞質においてＮＦＫＢ信号伝達（ｓｉｇｎａｌ）の主要因子であるＩＫＫα／β、Ｉｋβα、ＮＦｋＢのリン酸化（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）が主にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２群において減少することを確認し、核におけるＮＦｋＢのタンパク質量も減少することを確認した（図１９Ａ、図１９Ｂ）。このような減少が、Ｎｕｒｒ１、ｆｏｘａ２単独群に比べてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２群においてより多く減少することから、Ｎｕｒｒ１とｆｏｘａ２が相乗作用によってＮＦｋＢを調節することを確認した。

生後１日目のマウスの海馬の星状細胞を一次培養（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ）し、ベータアミロイド凝集体を処理又は非処理した。ベータアミロイド凝集体を処理した細胞は、ＣＭＶプロモーターコントロール、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２の３群に分けた。全ての星状細胞はレンチウイルスにより該当の遺伝子を発現させるようにした。その後、ＮＦｋＢ信号伝達経路に含まれる因子をウェスタンブロットで確認した。

その結果、マウス海馬星状細胞においてレンチウイルスを用いてコントロール、Ｎｕｒｒ１、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２をそれぞれ発現させた時、細胞質においてＮＦＫＢ信号伝達の主要因子であるＮＦｋＢのリン酸化（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）が主にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２群において減少することを確認した（図１９Ｃ、図１９Ｄ）。このような減少が、Ｎｕｒｒ１単独群に比べてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２群においてより多く減少することから、Ｎｕｒｒ１とｆｏｘａ２が相乗作用によってＮＦｋＢを調節することを確認した。

（１２）アミロイドベータアルツハイマー病モデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の相乗的反応によるシナプス消失の保護作用
アルツハイマー病において、シナプスの消失は認知能力の減退と密接な関連があるが、このようなシナプスの消失は、小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）と補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）による神経炎症（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）によって誘発され、これはアルツハイマー病においてシナプスの消失を招く（Ｈｏｎｇ，Ｓ．，Ｂｅｊａ－Ｇｌａｓｓｅｒ，Ｖ．Ｆ．，Ｎｆｏｎｏｙｉｍ，Ｂ．Ｍ．，Ｆｒｏｕｉｎ，Ａ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．，Ｍｅｒｒｙ Ｋ．Ｍ．，Ｓｈｉ Ｑ．，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ａ．，Ｂａｒｒｅｓ Ｂ．Ａ．，Ｌｅｍｅｒｅ Ｃ．Ａ．，Ｓｅｌｋｏｅ Ｄ．Ｊ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｂ．（２０１６）．Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｓｙｎａｐｓｅ ｌｏｓｓ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５２（６２８６）、７１２－７１６．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ８３７３）。

したがって、成熟したシナプスにおいて発現するシナプス形成タンパク質を電気泳動で確認し、アルツハイマー病モデルマウスの海馬部位においてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２によるシナプスの消失の保護作用を確認した。

アルツハイマー病において、膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現によるアルツハイマー病の治療効果を調べるために、３つの遺伝子ＡＰＰ、ＰＳ１、及びｔａｕを突然変異させてアルツハイマー病を誘発した１５月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＡＡＶ９血清型ウイルスを用いてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２を発現させた。そして約２ヶ月後に海馬部位を抽出し、シナプス形成と炎症調節複合体タンパク質電気泳動を行った。

１５月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入２ヶ月後に、海馬部位においてシナプス形成と炎症調節複合体のタンパク質を、ウェスタンブロット実験で分析した。

図２０は、１５月齢の３ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室の膠細胞に特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入して２ヶ月後に、ウェスタンブロットを用いて海馬部位においてシナプス形成マーカーのタンパク質レベルの確認及びその結果を定量的に分析した結果である。その結果、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２処理群において対照群に比べてシナプス形成マーカーであるｓｙｎａｐｓｉｎ１とｓｙｎａｐｔｏｐｈｓｉｎタンパク質が増加していることを確認した。

（１３）Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子導入が膠細胞老化（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）防止に及ぼす影響
膠細胞老化（ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）は、アルツハイマー病の代表的な症状として知られている（Ｂｕｓｓｉａｎ，Ｔ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）．“Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｔａｕ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｃｌｉｎｅ．” Ｎａｔｕｒｅ ５６２（７７２８）：５７８－５８２）（Ｃｈｉｎｔａ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）。“Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｉｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ Ｐａｒａｑｕａｔ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ．” Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２２（４）：９３０－９４０）（Ｂｈａｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７（９）、ｅ４５０６９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４５）。アミロイドベータは老化を誘発し、老化された星状細胞（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）はインターロイキン－６（ＩＬ－６）のような炎症性サイトカイン（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）を生産して、アルツハイマー病を誘発する機序が知られた（Ｂｈａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。培養された膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を発現させた時、膠細胞老化症状にいかなる影響を及ぼすかを実験した。

図２１Ａは、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子含有ウイルスが導入された培養膠細胞と、コントロールウイルスが導入された培養膠細胞において、細胞老化に関係する遺伝子の発現を示す実時間ＰＣＲデータを示している。膠細胞においてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現によるＲＮＡ－Ｓｅｑ結果において、コントロール膠細胞と比較して、老化誘発因子であるＩＬ６、ＭＭＰ１及びＭＭＰ１０のｍＲＮＡレベルの減少を確認した（図２１Ａ）。

また、膠細胞においてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現が老化の減少を誘発するかを調べるために、老化関連ベータガラクトシダーゼ染色法（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ＳＡ－β－ｇａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）（Ａｂｃａｍ）を行った（Ｄｉｍｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。細胞は、密度４．０×１０^４細胞／ｃｍ^２（又は、４．０×１０^４細胞／１２ｍｍ径ウェル）の時にプレートされ、少なくとも４，０００個の細胞をシーディングし、１２～１８時間後に老化関連ベータガラクトシダーゼ活性（ＳＡ－β－ｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定した。マウスの海馬部分膠細胞にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子をレンチウイルス（レンチウイルス）を用いて導入した後、老化のマーカーであるベータガラクトシダーゼの染色を確認した。

図２１Ｂは、コントロール培養膠細胞とＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２導入された培養膠細胞のベータガラクトシダーゼ（細胞老化マーカー）染色結果を示している。コントロール培養膠細胞とＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現培養膠細胞の両方において、マーカーであるベータガラクトシダーゼの染色を確認し、コントロール細胞に比べて、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２処理群において、染色された細胞数が減少したことを確認した。

図２１Ｃは、青色で染色された陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞数字（β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ＋膠細胞）を全体細胞数字の割合で示したグラフである。コントロール膠細胞と比較し、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を導入した膠細胞において、青色で染色された陽性細胞数字が有意に減少したことを確認した。このような結果から、老化星状細胞（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）においてＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２発現によって老化の減少を誘導し、このことから、炎症反応の減少する機序が老化に関連していると結論付けることができる。

（１４）アミロイドベータアルツハイマー病モデルにおいてＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２の相乗的反応がＳｏｘ２、ＵＧＴ１Ａ１、及びＧＦＡＰに及ぼす影響
Ｓｏｘ２は、幹細胞の自己複製又は多分化能に必須の転写因子であり、幹細胞においてベータアミロイドフリーカーソルタンパク質（βＡＰＰ）と共局在化（ｃｏｌｏｃａｌｉｚｅ）する。また、Ｓｏｘ２は、アルツハイマー病患者の脳で減少する様相を示す。

ＧＦＡＰは星状細胞マーカーであり、神経ＧＦＡＰ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ＧＦＡＰ）は主にアルツハイマー病患者、ダウン症候群患者及び老人の海馬のピラミッドニューロンから観察されるものと知られている。

１５月齢の５ｘＦＡＤマウスの海馬及び脳室に位置している膠細胞に、Ｎｕｒｒ１－ＡＡＶ９＋Ｆｏｘａ２－ＡＡＶ９ウイルスを用いて特異的にＮｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２遺伝子を導入した。遺伝子導入２ヶ月後に、海馬部位において免疫染色方法によりＳｏｘ２、ＵＧＴ１Ａ１及びＧＦＡＰの蛍光を確認した。

その結果、前記Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２処理群において、約２ヶ月後に海馬において免疫染色方法で測定した時、Ｓｏｘ２は増加、ＵＧＴ１Ａ１及びＧＦＡＰは減少することを確認した（図２３）。

前記結果は、Ｎｕｒｒ１＋Ｆｏｘａ２処理がアルツハイマー病疾患と関連した因子の発現に影響を与えるということを示す。

本発明は、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）抑制剤に関し、より詳細には、哺乳類にＮｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子を同時に導入して発現を誘導することによってアミロイドベータ蓄積及び／又は凝集を抑制する組成物及び方法に関する。

Claims (22)

1. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤。
2. 前記ベクターは、ウイルス性ベクター又は非ウイルス性ベクターである、請求項１に記載のアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤。
3. 前記遺伝子の導入は、遺伝子編集技術によってなされる、請求項１に記載のアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤。
4. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤。
5. 前記遺伝子の導入は、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、又は遺伝子編集によってなされる、請求項４に記載のアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤。
6. 前記膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である、請求項４に記載のアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集抑制剤。
7. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤。
8. 前記ベクターは、ウイルス性ベクター又は非ウイルス性ベクターである、請求項７に記載の炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤。
9. 前記遺伝子の導入は、遺伝子編集技術によってなされる、請求項７に記載の炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤。
10. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤。
11. 前記遺伝子の導入は、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、又は遺伝子編集によってなされる、請求項１０に記載の炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤。
12. 前記膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である、請求項１０に記載の炎症調節複合体（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）、ケモカイン（ＣＣＬ３及びＣＣＬ４）、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ，ＡｐｏＥ）、核受容体カッパＢ（ＮＦκＢ）、又はアスパラギンエンドペプチダーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌ ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，ＡＥＰ）の発現抑制剤。
13. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。
14. 前記ベクターは、ウイルス性ベクター又は非ウイルス性ベクターである、請求項１３に記載のアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。
15. 前記遺伝子の導入は、遺伝子編集技術によってなされる、請求項１３に記載のアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。
16. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入された神経細胞（ｎｅｕｒｏｎｓ）、神経幹細胞（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）、又は膠細胞（ｇｌｉａ）を含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。
17. 前記導入は、ウイルス性ベクター、非ウイルス性ベクター、又は遺伝子編集によってなされる、請求項１６に記載のアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。
18. 前記膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である、請求項１６に記載のアミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集によって発病する疾患の予防又は治療用組成物。
19. Ｎｕｒｒ１及びＦｏｘａ２遺伝子が導入されたベクターを含む、アミロイドベータ（ａｍｙｌｏｉｄ β）蓄積及び／又は凝集による細胞老化抑制用組成物。
20. 前記細胞は膠細胞（ｇｌｉａ）である、請求項１９に記載の細胞老化抑制用組成物。
21. 前記膠細胞（ｇｌｉａ）は、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、又は小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ）である、請求項２０に記載の細胞老化抑制用組成物。
22. 請求項１３から２１のいずれか一項の組成物の治療学的有効量を患者に投与することを含む、アルツハイマー病に病んでいる哺乳動物患者を治療する方法。

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