CN106381282B

CN106381282B - 一种诱导多能干细胞传代方法

Info

Publication number: CN106381282B
Application number: CN201610891785.5A
Authority: CN
Inventors: 蔡亚雄; 单磊; 陈勇; 乔志平
Original assignee: Guangdong Xtem Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Xtem Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-10-12
Filing date: 2016-10-12
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2036-10-12
Also published as: CN106381282A

Abstract

本发明提供了一种人诱导多能干细胞的传代方法。该方法包括如下步骤：将诱导多能干细胞经4℃预冷的DPBS处理后，细胞因冷冻收缩而使其贴壁能力下降，再通过巴氏吸管轻轻吹打散成小的细胞团块；离心重悬后先通过100目的不锈钢细胞筛网过滤去除大的细胞团块，然后再通过400目的不锈钢细胞筛网过滤去除掉小的细胞团块，最终获得大小较为均一，不易自发分化的多能干细胞团块，将其移入新的培养板中完成传代。传代10代后，诱导多能干细胞的多能性和细胞的核型均未发生改变。本发明是一种无需酶消化，对细胞损伤较小，能用于干细胞大规模的生产和传代。

Description

一种诱导多能干细胞传代方法

技术领域

本发明涉及一种诱导多能干细胞的传代方法。

背景技术

诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）的研究最先是由Shinya Yamanaka等人在《细胞》杂志上报道的。他们通过逆转录病毒载体将Oct3/4, Sox2,c-Myc和Klf4这四个转录因子引入小鼠成纤维细胞，发现可将其诱导形成具有类似胚胎干细胞形态和生长特性的一类细胞。诱导形成的这种细胞在细胞形态，增殖能力，表面抗原，基因表达谱，多能细胞特异性基因的甲基化状态以及分化成不同胚层细胞的能力等方面和胚胎干细胞都相似。此后，其他科学家的研究证明其他类型的体细胞也可以通过诱导去分化形成多能干细胞。

iPSCs在新药筛选，体外疾病模型的建立，细胞替代性治疗以及再生医学方面具有广泛的应用前景。诱导多能干细胞的培养过程中，当细胞增殖达到一定密度后，需要进行传代处理，进行再培养。目前iPSCs的传代方法主要有机械传代法和酶消化传代法。

目前的机械传代方法是采用刀片，注射器针头或者毛细管玻璃拉丝将大的细胞克隆分割成小的细胞团块的方法来进行传代的。这种方法所得到的细胞团块大小不均一，需要自己制作切割工具或者玻璃拉丝等，步骤较为繁琐，传代过程比较耗时。

酶消化传代法是向细胞克隆中加入分散酶、胰酶或者胶原酶等酶进行消化处理，使的克隆变得松散，然后通过移液管吹打成小的细胞团块，将小的细胞团块铺到含有饲养层细胞中来进行传代。这种方法通常不能很好地把握酶浓度和作用时间，制备的细胞团块大小不均一，细胞易于分化，并且如果消化时间过长常会导致细胞受到损伤，影响传代后的细胞活力，甚至会导致iPSC核型异常。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种诱导多能干细胞的传代方法，该方法对干细胞损伤较小，操作简便，无需用到胰酶等消化液，可以降低成本。传代后的多能干细胞可以迅速增殖并保持未分化的状态，传代后的多能干细胞仍然维持着干细胞的特性：表达干细胞表面标记，具有正常的核型和分化潜能。

本发明的技术方案如下：

诱导多能干细胞的传代方法，主要包括如下步骤：

（1）细胞传代前两天制备饲养层细胞。

（2）将需要传代的细胞（六孔板）从二氧化碳培养箱中拿出，在显微镜下观察，标记出已经分化的克隆，并用细胞刮子将分化的克隆刮下，然后每孔加入2 mL的37℃预温的缓冲液，轻轻冲洗培养板两遍，将已分化的细胞充分地洗涤下来。

（3）弃洗涤液后，加入预冷的缓冲液，并连同细胞培养板一块置于4℃冰箱中2-3min。将细胞培养板置于显微镜下观察，当观察到多能干细胞因冷冻而收缩时，将细胞培养板移入生物安全柜，轻轻吹打细胞培养板，将多能干细胞克隆吹散成小的细胞团块。

（4）将吹打下来的细胞悬液转移至15 mL无菌离心管中，800 rpm离心5 min，弃去离心上清，加入2-3 mL的37℃预热的培养基，轻轻拍打离心管管底和管壁或者吸吹液体一次，轻轻打散细胞沉淀和较大的细胞团块，得到相对均匀的细胞团悬液。

（5）吸取上述多能干细胞团块的悬液，使其通过大孔径的不锈钢细胞筛网，收集滤液，去除大的细胞团块。

（6）将收集的滤液再经过小孔径的不锈钢细胞筛网，弃滤液，将含有单细胞的多能干细胞和多能干细胞小块的滤液弃掉，合适大小的多能干细胞团块被截留在不锈钢细胞筛网上，将筛网反扣于细胞培养皿，用培养基沿着过滤的反方向将干细胞团块洗涤下来，并收集洗涤液。

（7）调整细胞团块密度，按1:3或者1:4的比例进行传代。

（8）次日，观察细胞密度和贴壁情况，并更换新鲜的培养基进行培养，以后每天换液，直至汇和率再次达到80%左右时便可进行传代或者冻存处理。

如上所述的传代方法，优选地，所述步骤（1）中的饲养层细胞为STO细胞、MEF细胞和SNL细胞，考虑到成本和处理的容易和方便性，更优选为STO细胞。饲养层细胞的接种密度为2-8×10⁵个。

优选地，步骤（3）中所用的缓冲液为4℃预冷的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液（DPBS），不能使用常温的DPBS，因为该传代方法的原理是利用诱导多能干细胞本身贴壁能力不强，冷冻后干细胞会收缩，从而使其贴壁能力更弱，经液体的轻轻吹洗后便会从细胞培养板中脱落。

优选地，步骤（3）-（6）中，用于吹打细胞和吸取液体所用的是巴氏吸管，因为巴氏吸管吸头孔径较大，不会因轻轻的吸吹干细胞团块而将其吹散成单细胞。

优选地，步骤（5）中，使干细胞团块的悬液通过100目的大孔径不锈钢细胞筛网（孔径约为150 μm），目的是去除大的细胞团块，收集滤液，使得传代后的多能干细胞团块大小更均一，并且团块过大的诱导多能干细胞接种到饲养层上后易于自发分化。

优选地，步骤（6）中，将收集的滤液再经过400目的小孔径不锈钢细胞筛网（孔径约为38 μm），目的是将单细胞的多能干细胞和小于38 μm的多能干细胞小块过滤掉，因为单细胞的多能干细胞或者过小的多能干细胞团块，传代后易于死亡。

优选地，步骤（6）中，将收集的滤液过滤后，合适大小的多能干细胞团块会被截留在不锈钢细胞筛网上，将筛网反扣于细胞培养皿，用培养基沿着过滤的反方向将干细胞团块洗涤下来。

此外，本发明提供的技术方案具有下列技术效益：

（1）使得传代后的多能干细胞团块大小较为均匀，能有效的降低克隆团块的自发分化，提高了诱导多能干细胞的品质。

（2）该传代方法简单可行：本发明通过冷冻法，使多能干细胞团块因冷冻收缩而脱离细胞板再通过巴氏吸管吹打，以及细胞筛网的过滤，即可完成传代，传代步骤简单可行。

（3）该传代方法可有效的降低生产成本，由于本发明的传代方法无需酶消化，只需用到巴氏吸管和不锈钢细胞筛网，并且这些耗材可以通过高压灭菌后重复利用，因而可以节省酶试剂所需的成本，用于工业化大量生产多能干细胞时可以有效地降低生产成本。

（4）适用于诱导多能干细胞的大规模传代和扩增，可用于iPSCs细胞的工业化生产。

（5）传代后的细胞活力较高，使用该方法传代10代后，人诱导多能干细胞其核型没有发生改变，并且仍具有类似于胚胎干细胞的特征，碱性磷酸酶染色阳性、表达多能性相关的表明抗原和具有分化成不同胚层组织的能力。

附图说明

为了清晰地阐明本发明的具体实施方式，提供了以下附图，用以描述本发明的一些实施方式。

图1为实施例1利用冷冻法进行诱导多能干细胞传代的实施流程图；

图2为实施例1诱导多能干细胞传代前和传代后第二天的细胞形态图；

图3为实施例2诱导多能干细胞传代10次后的碱性磷酸酶染色鉴定；

图4为实施例3诱导多能干细胞传代10次后利用免疫荧光鉴定干细胞多能性标志物的结果图；

图5为实施例4诱导多能干细胞传代10次后的细胞核型分析图。

具体实施方式

本发明公开了一种诱导多能干细胞的传代方法，以下对本发明的特定部分进行了详细的描述。对于具有本领域普通知识的人员而言，这些具体描述仅为期望的实施方式，并且本发明的范围并不限于这些实施方式。因此，本发明的实质范围应被解释为由所附的权利要求及其等同物限定。

实施例1 人诱导多能干细胞的传代方法

如图 1 所示，实验包括如下步骤：

（1）细胞传代前两天制备饲养层细胞。

（2）将需要传代的细胞（六孔板）从二氧化碳培养箱中拿出，在显微镜下观察（图2A），标记出已经分化的克隆，并用细胞刮子将分化的克隆刮下，然后每孔加入2 mL的37℃预温的缓冲液，轻轻冲洗培养板两遍，将已分化的细胞充分地洗涤下来。

（7）调整细胞团块密度，按1:3或者1:4的比例进行传代。

（8）次日，观察细胞密度和贴壁情况（图2B），并更换新鲜的培养基进行培养，以后每天换液，直至汇和率再次达到80%左右时便可进行传代或者冻存处理。

实施例2 碱性磷酸酶染色鉴定

实验包括如下步骤：

(1)hiPSCs采取实施例1的方法冷冻法传代10代后，取部分传代后hiPSCs转移至小鼠胚胎成纤维细胞（STO细胞）饲养层细胞上，待其贴壁后进行碱性磷酸酶的染色鉴定。

(2)将贴壁的iPSCs在4%多聚甲醛中于室温固定20 min，DPBS洗涤两次，每次洗涤5min。

(3)洗涤后，加入碱性磷酸酶染色试剂对其细胞的碱性磷酸酶活性进行测定。操作按照碱性磷酸酶试剂盒 (Sigma, AB0300) 说明书进行。

结果如图3所示：经过10次传代后，hiPSCs的碱性磷酸酶染色呈现阳性，而STO饲养层细胞碱性磷酸酶染色呈阴性。

实施例3 干细胞多能性标志物的检测

实验包括如下步骤：

(1)hiPSCs采取实施例1的方法冷冻法传代10代后，取部分传代后hiPSCs转移至小鼠胚胎成纤维细胞（STO细胞）饲养层细胞上，待其贴壁后进行干细胞多能性标记物免疫荧光染色的鉴定（以NANOG为例）。

(2)将传代后的hiPSCs在含4%多聚甲醛的DPBS中室温固定10 min。

(3)DPBS洗涤3次，每次5 min，加入含1%BSA的DPBS和0.1% Triton X-100，于室温孵育45 min。

(4)DPBS洗涤后，加入一抗稀释液 (山羊抗人NANOG抗体, 1:20, AF1997, R&DSystems），于室温孵育1 h或4度孵育过夜。

(5)DPBS洗涤一抗后，孵育二抗（Alexa488-偶联的驴抗山羊IgG抗体, 1:500,Invitrogen)，于室温避光孵育30 min。

(6)DPBS洗涤5次，每次洗涤5 min，然后进行DAPI染色，室温避光孵育10 min，荧光显微镜下观察并拍照。

(7)SSEA-3、TRA-1-60和TRA-1-81三种抗体的操作同上，只需替换掉相应的一抗和对应的二抗即可。

结果如图4所示：经过10次传代后，诱导多能干细胞仍然表达人胚胎干细胞特异的表面抗原（NANOG、SSEA-3、TRA-1-60和TRA-1-81），这表明hiPSCs通过本发明中的冷冻传代法传代10次以后其多能性并未受到影响。

实施例4 诱导多能干细胞细胞核型分析

实验包括如下步骤：

(1)hiPSCs采取实施例1的方法冷冻法传代10代后，取部分传代后hiPSCs转移不含饲养层细胞的培养体系中，待细胞生长至汇合度达到80%左右时，弃去培养基，加入DPBS洗涤三次。

(2)洗涤后，加入20 ng/mL的秋水仙素于37°C孵育45 min。

(3)处理完后，加入DPBS洗涤三次，然后加入0.25%胰酶消化细胞。

(4)离心收集消化后的细胞，弃上清，加入37°C预温的0.075 mol/L的KCl溶液低渗处理18 min；加入37°C预温的固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）于37°C水浴固定1 h，固定后吸取少量细胞滴于-20°C预冷的载玻片上，烘干后加入吉姆萨染色液染色8 min，显微镜下观察并拍照。

结果显示，随机选取的10个分裂相中，所有的分裂相均为46条染色体，且染色体形态正常。结果表面通过本发明中的传代方法传代10代后，该诱导多能干细胞株的核型仍能维持正常，表明这种传代方法适用于诱导多能干细胞的传代。图5为其中一个分裂相的核型分析图。

Claims

1.一种诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:

（1）细胞传代前两天制备饲养层细胞；

（2）将需要传代的细胞从二氧化碳培养箱中拿出，在显微镜下观察，标记出已经分化的克隆，并用细胞刮子将分化的克隆刮下，然后每孔加入 2 mL 的 37℃预温的缓冲液，轻轻冲洗培养板两遍，将已分化的细胞充分地洗涤下来；

（3）弃洗涤液后，加入预冷的缓冲液，并连同细胞培养板一块置于 4℃冰箱中2-3 min；将细胞培养板置于显微镜下观察，当观察到多能干细胞因冷冻而收缩时，将细胞培养板移入生物安全柜，轻轻吹打细胞培养板，将多能干细胞克隆吹散成小的细胞团块；

（4）将吹打下来的细胞悬液转移至 15 mL 无菌离心管中，800 rpm 离心 5 min，弃去离心上清，加入 2-3 mL 的 37℃预热的培养基，轻轻拍打离心管管底和管壁或者吸吹液体一次，轻轻打散细胞沉淀和较大的细胞团块，得到相对均匀的细胞团悬液；

（5）吸取上述多能干细胞团块的悬液，使其通过大孔径的不锈钢细胞筛网，收集滤液，去除大的细胞团块；所用的不锈钢细胞筛网为 100 目，孔径为 150 μm 的不锈钢细胞筛网；

（6）将收集的滤液再经过小孔径的不锈钢细胞筛网，弃滤液，将含有单细胞的多能干细胞和多能干细胞小块的滤液弃掉，合适大小的多能干细胞团块被截留在不锈钢细胞筛网上，将筛网反扣于细胞培养皿，用培养基沿着过滤的反方向将干细胞团块洗涤下来，并收集洗涤液；将收集的滤液再经过小孔径的不锈钢细胞筛网，所用的不锈钢细胞筛网为 400目，孔径为38 μm 的不锈钢细胞筛网；

（7）调整细胞团块密度，按 1:3 或者 1:4 的比例进行传代；

（8）次日，观察细胞密度和贴壁情况，并更换新鲜的培养基进行培养，以后每天换液，直至汇和率再次达到 80%左右时便可进行传代或者冻存处理；所述步骤（1）中的饲养层细胞为 STO 细胞、MEF 细胞或者 SNL 细胞，饲养层

细胞的接种密度为 2-8×10⁵个；所述步骤（2）中需要传代的细胞为汇合度达到 80%，处于对数生长期的细胞。

2.根据权利要求 1 所述的诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤（3）中传代用到的缓冲液是 4℃预冷的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液（DPBS）。

3.根据权利要求1 所述的诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，所述步骤（6）中，最终获得大小合适的干细胞团块的方法是通过培养基沿着过滤的反方向冲洗细胞团块，收集洗涤液而得到。