KR20130016790A - 개의 제대 조직에서 유래한 다능성 중간엽 줄기세포의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개의 제대 (umbilical cord matrix)로부터 다능성 줄기세포를 보다 효율적으로 순수하게 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명으로 분리된 줄기세포는 전능분화능 마커(Oct-3/4, Sox-2, SSEA-4, Nanog 중 1종 이상)를 발현하고, 개 유래의 특이적인 세포 표면 마커인 CD44에 대한 특이항체에 대해 양성반응을 보이며, CD34, CD45에 대해 음성의 면역학적 특성을 나타내고, 내배엽, 중배엽 혹은 외배엽으로 분화가 가능하다는 특징을 가진다.

Description

개의 제대 조직에서 유래한 다능성 중간엽 줄기세포의 제조 방법{Method for preparing multipotent mesenchymal stem cell derived from canine umbilical cord matrix}

본 발명은 제대 조직(umbilical cord matrix 또는 워튼젤리(Wharton's jelly))으로부터 다능성 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 특히 개의 제대 조직으로부터 분리하여 효율적으로 다능성 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있는 방법에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포는 동물의 태반(placenta), 양막(amniotic membrane), 양수(amnionic fluid), 지방 조직(adipose tissue), 귀(ear), 골수(bone marrow), 제대혈(umbilical cord blood) 등 다양한 조직으로부터 분리, 제조되어 왔다.

이렇게 제조된 중간엽 줄기세포는 각각의 유래 조직과 개체의 연령에 따라 그 특성이 다르며, 줄기세포의 다능성(multipotency)에서도 크게 차이가 날 수 있어 세포의 효용성이 상이할 수 있다. 일반적으로는 줄기세포의 다능성은 유래 개체의 연령이 낮을수록 뛰어난 것으로 보고되고 있어, 태아관련 조직(태반, 제대혈, 양막, 양수 등)에서 다능성 줄기세포 제작 및 활용연구가 보다 활성화되고 있다. 특히 제대혈에서 유래된 중간엽 줄기세포에 대한 연구는 상당히 이루어져 있으며, 국내에서도 이를 이용한 무릎연골결손(임상 3상), 미숙아 기관지폐이형성증(임상 1상), 비혈연조혈모세포이식보조(임상 1상), 알츠하이머형치매(임상 1상) 등의 치료에 활용되고 있다.

한편, 중간엽 줄기세포는 오랜 배양 동안 세포군의 변화가 일어나고, 그와 동시에 다능성을 잃어버리게 되므로 대부분의 치료목적이나 그 외 성상분석에 있어서 중간엽 줄기세포는 초대배양에 가까운 세포를 이용한다. 그러나, 제대혈에서의 줄기세포 분리효율은 매우 낮아 초대배양에서 충분한 수의 줄기세포를 회수하는 것은 상당히 어렵다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 고려할 때 다능성을 갖춘 다량의 중간엽 줄기세포를 분리, 배양 등의 일련의 제작은 줄기세포의 활용에 있어 매우 중요하다.

이에 본 발명자들은 지금까지 알려져 있지 않은, 효용성이 높은 다능성 줄기세포를 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 찾고자 노력한 결과 개의 제대 조직을 효소로 소화시킴으로써 다능성 중간엽 줄기세포를 분리, 제조할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 보다 효율적인 방법으로 다능성 줄기세포를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 제대 조직을 채취하여 양막을 제거하는 단계; 2) 상기 1) 단계에서 양막이 제거된 제대 조직을 36~38℃에서 30분 내지 1시간 동안 트립신/EDTA를 처리하는 단계; 3) 상기 2) 단계를 거친 제대 조직으로부터 제대 동맥 및 제대 정맥 혈관을 제거하는 단계; 4) 상기 3) 단계를 거친 제대 조직을 콜라제나아제로 36~38℃에서 30분 내지 2시간 동안 소화시켜 단일세포를 회수하는 단계; 및 5) 배양배지에서 제대 조직 유래의 다능성 중간엽 줄기세포의 배양 및 회수 단계;를 포함하는 제대 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법을 이용하여 다른 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포와 유사한 다능성(multipotency)을 가지는 제대 조직 유래의 다능성 중간엽 줄기세포를 효율적으로 제조할 수 있다. 또한, 이렇게 제조된 다능성 중간엽 줄기세포를 근질환, 골관절염, 건염, 알츠하이머병, 파킨슨씨병 등의 신경변성질환, 뇌척수 손상 등의 신경질환, 뇌졸중, 당뇨병 등에 적용되는 세포치료제, 약물의 효과 및 독성의 평가 등에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1a는 bFGF를 첨가한 경우(우)와 첨가하지 않은 경우(좌)의 개의 제대 조직에서 유래 줄기세포의 사진이고, 도 1b는 bFGF를 첨가할 경우 보다 효율적으로 제대 조직 유래 줄기세포를 분리 배양됨을 보여주는 그래프이다.
도 2a는 bFGF가 첨가되지 않은 개의 제대 조직에서 유래된 다능성 중간엽 줄기세포를 계대(passage)별로 보여주는 사진이고, 도 2b는 계대 5(P5)의 중간엽 줄기세포에서 특이적으로 보이는 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)의 활성을 보여주는 사진이다.
도 3는 개의 제대 조직에서 유래된 다능성 중간엽 줄기세포의 전능분화능 (pluripotency) 마커인 Oct-3/4, Sox-2, SSEA-4 및 Nanog의 발현을 보여주는 사진이다.
도 4는 개의 제대 조직에서 유래된 다능성 중간엽 줄기세포에서 개 유래의 특이적인 세포 표면 마커(CD44)의 발현양상을 FACS로 분석한 결과를 보여주는 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 방법으로 제조된 줄기세포의 다능성을 확인하기 위하여 개의 제대 조직에서 유래된 다능성 중간엽 줄기세포를 지방세포(adipocyte)(A), 골세포(osteocyte)(B), 연골세포(chondrocyte)(C) 3종류의 세포로 분화시킨 것을 나타낸 것이다.

본 발명은 제대 조직(umbilical cord matrix 또는 Wharton's jelly)을 채취하고, 이는 효소로 소화하여 단일세포를 회수하며, 다능성 중간엽 줄기세포를 배양하여 제대 조직 유래의 다능성 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 효용성이 높은 다능성 줄기세포를 보다 효율적으로 제조할 수 있는 방법을 제공하며, 구체적으로는 하기의 단계를 포함한다.

1) 제대 조직을 채취하여 양막을 제거하는 단계;

2) 상기 1) 단계에서 양막이 제거된 제대 조직을 36~38℃에서 30분 내지 1시간 동안 트립신/EDTA를 처리하는 단계;

3) 상기 2) 단계를 거친 제대 조직으로부터 제대 동맥 및 제대 정맥 혈관을 제거하는 단계;

4) 상기 3) 단계를 거친 제대 조직을 콜라제나아제로 36~38℃에서 30분 내지 2시간 동안 소화시켜 단일세포를 회수하는 단계; 및

5) 배양배지에서 제대 조직 유래의 다능성 중간엽 줄기세포의 배양 및 회수 단계;

본 발명에서 사용하는 제대를 채취하는 과정은 당업계에서 일반적으로 사용하는 방법으로 이루어진다.

본 발명에서 사용되는 제대는 태반조직을 잘 분리한 후, 제대 동맥안의 제대혈을 완전히 모으고, 주사기를 이용하여 PBS로 수차례 세척한다. 다음 단계에서 세척된 제대를 멸균된 핀셋으로 양막을 제거하고, 0.05% 트립신/EDTA로 36~38℃에서 30분 내지 1시간 동안 처리하여 제대 조직이 아닌 양막(Amniotic membrane) 등의 다른 조직 유래 줄기세포의 분리 및 배양 가능성을 배제한다.

위에서 준비한 제대 조직을 가위로 횡으로 자른 다음, 핀셋과 가위로 제대 동맥 및 제대 정맥 혈관을 최대한 분리 및 제거하고, 남은 조직(umbilical cord matrix 혹은 워튼젤리(Wharton's jelly))을 세절한 다음, 콜라제나아제로 36~38℃에서 30분에서 2시간 동안 처리하여 단일세포로 만들고, 준비된 배지에서 배양하여 줄기세포를 대량으로 제조할 수 있다. 이 때 사용하는 콜라제나아제는 사용 농도가 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 0.01~10%의 범위에서 사용할 수 있으며, 처리 시간 및 처리 효율과의 관계를 고려하여 적절하게 선택할 수 있다.

이때, 배양배지로서 성장인자(growth factor) 중의 하나인 bFGF(basic Fibroblast Frowth Factor, 염기성 섬유모세포생장인자)를 포함한 배지를 이용하여 배양하는 것이 배양, 증식 효율을 높이는데 효과적이며, bFGF는 배지에 1~160ng/ml의 양으로 함유되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법을 적용하는 제대 조직은 특히 개의 제대 조직임이 바람직하다. 또한, 본 발명으로 제조된 중간엽 줄기세포는, 특히 cUCMSC-CL의 개 중간엽 줄기세포주의 것임을 특징으로 하고, 개 유래의 특이적인 세포 표면 마커인 CD44에 대한 특이 항체 등에 대해 면역학적 양성을 나타내며, CD34, CD45에 대해 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 또한 분리된 줄기세포는 플라스틱에 부착하여 자라며, 배양상태에 따라 둥근 모양(round shape) 혹은 방추형 모양(spindle shape)으로 보인다.

본 발명으로 제조된 중간엽 줄기세포는 20회 계대 이상 미분화 상태를 유지하며, 전능분화능 마커(pluripotency marker)인 Oct-3/4, Sox-2, Nanog 및 SSEA-4 등으로 이루어진 군에서 1종 이상을 발현하고, 지방세포(adipocyte), 골세포(osteocyte) 및 연골세포(chondrocyte) 등으로 이루어진 군에서 1종 이상으로 분화한다. 또한, 그 외 지금까지 알려진 중간엽 줄기세포의 분화가능 조직인 신경 또는 췌장 등으로도 분화가 가능하여 내배엽, 중배엽 또는 외배엽 등으로 분화될 수 있는 다능성을 가지고 있다.

따라서, 본 발명으로 제조되는 제대조직 유래의 중간엽 줄기세포는 근질환, 골관절염, 건염, 알츠하이머병, 파킨슨씨병 등 신경변성질환, 뇌척수 손상 등 신경질환, 뇌졸중, 당뇨병 등에 세포치료제로, 그 외 다양한 약물효과 및 독성평가 등에 유용하게 활용될 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에 통상적으로 주지된 변형이 가해질 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.

[실시예 1] 제대 조직 추출 및 중간엽 줄기세포의 분리

개(잡종, 5세, 30kg)로부터 제대를 채취하고, 제대혈관으로부터 제대혈을 주사기로 모은 후, 항생제 1%를 함유한 PBS로 혈관을 수차례 세척을 하고, 혈관 등 제대 조직 외의 다른 조직은 가능한 모두 제거하였다. 다음 단계로, 세척된 제대를 멸균된 핀셋으로 양막(amniotic membrane)을 제거하고, 0.05% 트립신/EDTA로 36~38℃에서 1시간 동안 처리하여 제대 조직이 아닌 다른 조직유래의 세포 혼입 가능성을 배제하였다.

위에서 준비된 제대 조직을 가위로 횡으로 자른 다음, 멸균된 핀셋과 가위로 제대 동맥 및 제대 정맥 혈관을 최대한 분리 및 제거하고, 남은 조직(umbilical cord matrix 혹은 Wharton's jelly)을 멸균된 수술용 가위로 1~2mm 크기로 세절한 후, 0.1% 콜라제나아제(collagenase type I)로 36~38℃에서 30분~2시간 동안 처리하였다. 그 후, 100㎛의 나일론 망에 소화된 조직을 거른 후, 1,500rpm에서 10분간 원심분리하여 단일세포를 수집하였다. 그리고, 수집한 세포를 중간엽 줄기세포 배양배지(페니실린(Penicillin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 10% FBS(Fetal bonive serum)가 첨가된 Dulbeco's Modified Eagles Medium (Sigma))에서 부유시킨 후, 조직배양 디쉬(tissue culture dish)와 조직배양 플라스크(tissue culture flask)에 넣어 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이때, 배양배지에 bFGF를 첨가하였으며, bFGF의 첨가에 따른 배양 효율을 확인하기 위하여, bFGF의 함량을 0, 1, 5, 10, 20, 40, 80, 160ng/ml의 양으로 하였다.

[실시예 2] 중간엽 줄기세포의 배양

실시예 1에서 배양된 초대배양(Passage 0) 중간엽 줄기세포는 70~80% 정도 배양되면, 0.25% 트립신/EDTA로 소화시켜 세포를 모은 후, 동결하여 액체질소에 보관하였다. 액체질수에 보관된 세포는 37℃ 수욕(waterbath)에서 용해하고, 실시예 1에서 사용된 중간엽 줄기세포 배양배지(bFGF를 0, 10, 20, 40, 80, 160ng/ml의 양으로 포함한 배양배지)에서 배양하면서 배양용기의 70~80%정도 자라면, 0.05% 트립신/EDTA를 이용하여 실시예 1에서 사용된 것과 같은 방법으로 소화시켜 배양한 세포를 모은 후, 다음 계대로 배양하는 방식으로 20대 이상 배양하였다.

이와 같은 방식으로 개의 제대 조직 유래의 중간엽 줄기세포를 분리 및 배양하였으며, 이는 특히 cUCMSC-CL의 개 중간엽 줄기세포주의 것이었다. 또한, 줄기세포의 배양 효율을 MTT 방법으로 측정하였으며, 배양한 줄기세포의 사진 및 배양 효율 측정 결과는 도 1a 및 1b에 나타내었다.

특히, 도 1b를 보면 배양배지에 bFGF를 첨가하여 배양하는 경우, 줄기세포의 배양 효율이 상당히 향상함을 확인할 수 있다.

[실시예 3] 제조된 중간엽 줄기세포의 특성분석

본 발명에서 제조된 중간엽 줄기세포의 특성을 제대조직 이외의 조직에서 유래된 중간엽 줄기세포와 비교, 분석하기 위해, 중간엽 줄기세포가 보여준 형태, 알칼라인 포스파타제 활성, 전능분화능 마커 발현여부에 대한 시험을 본 발명에 따라 상기 실시예 2에서 제조된 중간엽 줄기세포로 수행하였다. 이 때, 사용한 중간엽 줄기세포는 bFGF를 첨가하지 않은 배양배지에서 배양한 것이다.

도 1a 및 도 2a에서 보는 바와 같이, 제대조직으로 제조된 줄기세포를 역상현미경(phase contrast image)에서 관찰한 결과, 배양된 줄기세포는 플라스틱에 부착하여 자라며, 배양 상태에 따라 둥근 모양 또는 방추체 모양으로 단층으로 세포군을 형성하고 있어, 다른 조직유래의 중간엽 줄기세포와 매우 유사함을 알 수 있었다.

또한, 이들 세포의 알칼라인 포스파타제 활성을 보기위해 세포들을 4% 포름알데히드로 상온에서 30분간 고정하고 PBS(phosphate buffered saline)로 두 번 세척하였다. 그 다음 염색용액(BCIP/NBT 알칼라인 포스파타제 기질(Alkaline phosphatase substrate))을 고정된 세포와 1시간 동안 반응시켜 염색여부를 판명하였다. 실험결과 이들 세포는 줄기세포의 특징인 알칼라인 포스파타제 활성(도 2b)을 보였다.

덧붙여 줄기세포의 전능분화능 마커(Oct-3/4, SSEA-4, Nanog, Sox-2)의 발현을 보기위해 면역형광염색법을 수행하였다. 우선 중간엽 줄기세포를 4% 포름알데히드로 상온에서 30분간 고정한 후, 0.4% Triton X-100으로 10분 동안 상온에서 침투(permeabilization)를 시키고 5% BSA를 포함한 PBS로 1시간 동안 상온에서 차단하였다. 이후 전능분화능 마커(Oct-3/4, SSEA-4, Nanog, Sox-2)에 대한 항체를 0.2% BSA를 포함하는 PBS에 1:100의 비율로 희석한 후, 줄기세포를 4℃에서 24시간 처리하고, 형광물질이 함유된 이차항체를 상온에서 1시간 반응시켜 형광현미경으로 관찰하였다. 실험결과 개의 제대 조직 유래 중간엽 줄기세포는 전능분화능 마커를 발현(도 3)하는 것으로 나타나, 기존의 방법으로 다른 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포와 매우 유사한 것으로 판명되었다.

또한, 본 발명에서 배양된 줄기세포가 지금까지 알려진 중간엽 줄기세포 특이 표면 마커(CD44)를 발현하는지 여부를 보기위해 FACS(Flourescence-activated cell sorting) 분석실험을 수행하였다. 배양된 세포가 배양용기의 70~80%로 자라면, 0.05% 트립신/EDTA로 소화시켜 단일세포로 만든 다음, 중간엽 줄기세포 배양배지와 PBS로 순차적으로 세척하고, 개의 표면마커인 CD44에 대한 항체(FITC 결합)(R&D)로 30분간 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하였다. 준비된 샘플은 유세포분석기(flow cytometer)를 이용하여 표면마커의 발현여부를 확인한 결과, 95% 이상의 세포가 표면마커 CD44를 발현하고 있음을 알 수 있었다(도 4).

[실시예 4] 제조된 중간엽 줄기세포의 다능성 조사

본 발명에 따라 제조된 중간엽 줄기세포의 다능성을 확인하기 위하여 상기 실시예 2에서 제조된 중간엽 줄기세포를 지방세포(adipocyte), 골세포(osteocyte) 및 연골세포(chondrocyte) 3종류의 세포로 하기의 방법으로 분화시켰다. 이 때, 사용한 중간엽 줄기세포는 bFGF를 첨가하지 않은 배양배지에서 배양한 것이다.

1) 지방세포로의 분화: 줄기세포를 cm² 당 2× 10⁴ 세포를 조직배양 디쉬에 넣고 줄기세포 배지에 0.1mM b-메르캅토에탄올을 첨가하여 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양하였으며, 2~3일에 한번 신선한 배양액으로 갈아주었다. 세포가 조직배양 디쉬에 100% 차게 자라면, 지방 분화 배지(Lonza, USA)로 갈아주고, 4일마다 신선한 분화배지로 갈아주면서 21일 동안 분화를 유도시켰다. 그 후, 4% 포르말린으로 세포를 10분 동안 고정하고, PBS로 3회 이상 세척하였다. 이렇게 준비된 세포는 오일 레드 O 염색 키트(Oil Red O stain kit, Novaultra^TM, USA)를 이용하여 분화된 세포의 지방을 염색하였다. 상기 키트를 간단히 기술하면 예비염색 용액(pre-stain solution)으로 5분 처리하고, 상기 용액을 제거한 후, 미리 60℃로 데워둔 오일 레드 O 용액으로 10분간 처리하였다. 이를 물로 3회 세척한 후 헤마톡시린(hematoxylin) 용액으로 30초간 염색하고, 물로 3분 이상 세척한 후, 역상현미경(Phase contrast image)으로 붉게 염색된 지방을 확인하였다(도 5 (A)).

2) 골세포로의 분화: 줄기세포를 cm² 당 3.1× 10³ 세포를 조직배양 디쉬에 넣고 줄기세포 배지에 0.1mM b-메르캅토에탄올을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였으며, 2~3일에 한번 신선한 배양액으로 갈아주었다. 세포가 조직배양 디쉬에 100% 차게 자라면, 뼈분화 배지(Lonza, USA)로 갈아주고, 4일마다 신선한 분화배지로 갈아주면서, 21일 동안 분화를 유도시켰다. 그 후, 4% 포르말린으로 세포를 10분 동안 고정하고, PBS로 3회 이상 세척하였다. 이렇게 준비된 세포는 알자린 레드 염색 키트(Alzarin red stain kit, Novaultra^TM, USA)를 이용하여 분화된 세포의 칼슘을 염색하였다. 상기 키트를 간단히 기술하면, 알자린 레드 용액으로 5분간 처리하고, 이를 증류수로 3회 세척한 후, 역상현미경(Phase contrast image)으로 붉은 오렌지색으로 칼슘이 염색된 것을 확인하였다(도 5 (B)).

3) 연골세포로의 분화: 줄기세포를 cm² 당 1.6× 10⁷ 세포를 조직배양 디쉬에 0.1mM b-메르캅토에탄올을 첨가한 줄기세포배지 5㎕의 방울로 넣고 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였으며, 연골분화 배지(Lonza, USA)를 첨가하고, 4일마다 신선한 분화배지로 갈아주며, 21일 동안 분화를 유도시켰다. 그 후, 4% 포르말린으로 세포를 10분 동안 고정하고, PBS로 3회 이상 세척하였다. 이렇게 준비된 세포는 알시안블루 염색 키트(Alcian blue stain kit, Novaultra^TM, USA)를 이용하여 분화된 세포의 프로테오글리칸(proteoglycan)을 염색하였다. 상기 키트를 간단히 기술하면, 알시안블루 용액으로 30분 처리하고, 증류수로 3회 이상 충분히 세척한 후, 상기 용액을 제거하였다. 그 후 뉴클리어 패스트 레드 용액(nuclear fast red solution)으로 5분 동안 처리하고 이를 증류수로 1분 이상 충분히 세척한 후, 역상현미경(Phase contrast image)으로 프로테오글리칸이 파란색으로 염색된 것을 확인하였다(도 5 (C)).

Claims (4)

1) 제대 조직을 채취하여 양막을 제거하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 양막이 제거된 제대 조직을 36~38℃에서 30분 내지 1시간 동안 트립신/EDTA를 처리하는 단계;
3) 상기 2) 단계를 거친 제대 조직으로부터 제대 동맥 및 제대 정맥 혈관을 제거하는 단계;
4) 상기 3) 단계를 거친 제대 조직을 콜라제나아제로 36~38℃에서 30분 내지 2시간 동안 소화시켜 단일세포를 회수하는 단계; 및
5) 배양배지에서 제대 조직 유래의 다능성 중간엽 줄기세포의 배양 및 회수 단계;
를 포함하는 제대 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포의 제조 방법.

제1항에 있어서, 상기 5) 단계의 배양배지에는 염기성 섬유모세포생장인자(basic Fibroblast Frowth Factor, bFGF)를 더 함유함을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 제조 방법.

제2항에 있어서, 상기 bFGF는 1~160ng/ml의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 제조 방법.

제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제대 조직은 개의 제대 조직임을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 제조 방법.

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