CN103224908A

CN103224908A - 一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法

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Publication number: CN103224908A
Application number: CN2013101262261A
Authority: CN
Inventors: 李炜; 肖华强; 张丽颖; 李三明; 刘祖国
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2013-04-12
Publication date: 2013-07-31

Abstract

一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法，涉及一种干细胞的组织工程材料。1）新鲜人羊膜的获取和分离；2）将获得的羊膜间充质干细胞的原位扩增；3）采用不同的细胞分化培养基诱导羊膜间充质干细胞向特定类型细胞的分化；4）构建不同形态的组织工程材料。采用体外组织培养技术原位扩增羊膜间充质干细胞，并诱导间充质干细胞向神经细胞、肝脏细胞等多种类型细胞分化，构建相应细胞类型的组织工程材料，并可用于相应疾病的治疗。

Description

一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞的组织工程材料，尤其是涉及一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法。

背景技术

间充质干细胞广泛存在于各种成体组织中，大量研究证实，间充质干细胞可以向多种体细胞分化，并可以用于临床治疗多种疾病。当前，人们主要从骨髓、脂肪等组织中获得间充质干细胞，但存在一些缺陷：或者获取干细胞的过程造成对机体的机械侵入式损伤（比如骨髓），或者得到的干细胞其增殖分化能力有限（比如脂肪），或者材料来源不足（比如牙髓）。这些缺陷限制了间充质干细胞的临床应用。

羊膜是胎儿胎膜中最里的一层，为无血管、无神经、无淋巴的透明光滑薄层，厚度为0.02～0.05mm，由羊膜上皮、基底膜和基质三个部分组成。羊膜组织细胞主要由来源于外胚层的羊膜上皮和来源于中胚层的羊膜基质（间充质）两类细胞组成，开始形成于受精第8天，保持有前原肠胚胚胎细胞的可塑性。人们已经从胎盘获得多种干细胞，如脐血干细胞、绒毛膜干细胞和羊膜基质细胞（羊膜间充质干细胞），对其研究也遵循一般的干细胞研究方法。羊膜基质里面有大量活细胞，这些细胞包含大量间充质干细胞，称为羊膜间充质干细胞（AM-MSCs），也称为羊膜基质细胞。

与其他间充质干细胞一样，羊膜间充质干细胞能向脂肪细胞、血管内皮细胞、神经细胞等多个方向分化。羊膜间充质干细胞来源于中胚层，在体外扩增培养至少可以传15代，形态不发生明显改变，其在体外扩增的潜能远远大于骨髓间充质干细胞。羊膜间充质干细胞不表达端粒酶，这将排除细胞移植后肿瘤形成的风险；也不表达白细胞抗原，因此术后一般不发生移植免疫排斥反应。与其他成体组织间充质干细胞比较起来，胎盘材料来源充足，获取过程没有侵入式损伤，细胞增殖分化能力强，因此是较为理想的材料来源。

目前，基于羊膜间充质干细胞的研究都是将羊膜组织酶解消化，分离获得单个细胞悬液，再进行扩增培养，然后诱导间充质干细胞向特定方向分化。这种方法虽然可以获得较大量的细胞，但是存在两个方面的问题。一是间充质干细胞离开了它们原来存在的微环境，体外扩增过程中其干细胞特性容易发生改变，导致细胞的终末分化；二是间充质干细胞进行单细胞培养扩增以后，如果要进行体内移植，往往需要进一步构建组织工程化的产品，如骨组织、软骨组织、肌肉组织、肌腱组织、神经组织等等，给这类细胞的应用造成较大困难。到目前为止，还未见研究成功构建羊膜间充质干细胞来源的组织工程产品有关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法。该方法采用体外组织培养技术大量原位扩增羊膜间充质干细胞，并诱导其向特定类型细胞分化，最终构建相应细胞类型的组织工程材料。

本发明包括以下步骤：

1）新鲜人羊膜的获取和分离；

2）将获得的羊膜间充质干细胞的原位扩增；

3）采用不同的细胞分化培养基诱导羊膜间充质干细胞向特定类型细胞的分化；

4）构建不同形态的组织工程材料。

在步骤1）中，所述新鲜人羊膜的获取和分离的具体方法可为：

（1）羊膜组织取自已签订知情同意书的HIV-I、乙肝、丙肝、梅毒均阴性的健康剖宫产妇获得的胎盘；

（2）在超净工作台下，把带有绒毛膜的羊膜组织从胎盘上剪下并剪成不同规格、不同大小以及不同形状的片状，用Hanks’平衡盐溶液（HBSS）漂洗2次，去除血迹，然后撕除绒毛膜，再用1×HBSS漂洗，直至羊膜组织无血渍，光滑透明，放置于培养基中。

在步骤（1）中，羊膜组织可以为完整的包含上皮细胞的羊膜组织，或除去上皮细胞的羊膜组织，所述上皮细胞可以在培养之前予以除去，或在培养之后予以除去，羊膜基质成分予以保留，并在所有操作中尽量保持羊膜基质细胞的活性，同时通过培养，使基质内的细胞得以大量扩增。

在步骤2）中，经过原位扩增的羊膜间充质干细胞，可以用酶消化方法进行分离，以获取单个细胞悬液。

在步骤3）中，所述采用不同的细胞分化培养基诱导羊膜间充质干细胞向特定类型细胞的分化的具体方法可为：采用不同的培养基，原位诱导羊膜间充质干细胞向神经细胞、肝脏细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肌腱细胞、韧带、心肌细胞、内皮细胞等多种类型细胞转化分化；根据不同的分化细胞类型，培养的时间可以从2周到16周不等；在羊膜间充质干细胞向特定类型细胞成功分化以后，可以形成具有不同形态和一定功能的组织工程材料，并有可能用于移植治疗相应疾病。

本发明采用体外组织培养技术原位扩增羊膜间充质干细胞，并诱导间充质干细胞向神经细胞、肝脏细胞等多种类型细胞分化，构建相应细胞类型的组织工程材料，并可用于相应疾病的治疗。

在本发明中，采用组织培养法，即不采用单细胞培养而直接取羊膜组织培养，建立一个更加接近体内环境的条件，一则有利于间充质干细胞的扩增，干细胞特性的维持。二则原位扩增以后，诱导其向特定方向分化，利用羊膜的细胞外间质成分直接构建组织工程化的骨组织、软骨组织、肌肉组织、肌腱组织、神经组织等，而无需利用其它细胞载体进行二次组织工程化构建。

羊膜基质里面有大量活细胞，这些细胞包含大量间充质干细胞，与其他成体组织间充质干细胞比较起来，胎盘材料来源充足，获取过程没有侵入式损伤，细胞增殖分化能力强，因此是较为理想的材料来源。采用组织培养法，即不采用单细胞培养而直接取羊膜组织培养，建立一个可能更加接近体内环境的条件，对间充质干细胞进行扩增，然后通过特定的细胞分化培养基诱导羊膜间充质干细胞向特定类型细胞分化，最终构建成为含特定类型细胞的组织工程产品。

本发明的优点在于：

1、羊膜间充质干细胞来源于中胚层，其扩增潜能远远大于骨髓间充质干细胞。羊膜间充质干细胞不表达端粒酶，这将排除细胞移植后肿瘤形成的风险；也不表达白细胞抗原，因此术后一般不发生移植免疫排斥反应。与其他成体组织间充质干细胞比较起来，胎盘材料来源充足，获取过程没有侵入式损伤，细胞增殖分化能力强，因此是较为理想的材料来源。

2、羊膜基质可以给基质中的间充质干细胞提供一个更加接近于体内的微环境，更有利于间充质干细胞的增殖与分化。

3、间充质干细胞在羊膜基质原位分化后可以形成具有相应功能的组织工程产品，无需再进行二次组织工程化构建，直接用于临床移植来治疗相应疾病。

本发明的重要用途：

1、通过羊膜组织培养法诱导间充质干细胞分化形成多种功能细胞，可以用于治疗相应疾病。

2、原位分化形成的组织工程产品可以直接移植，减少了间充质干细胞体外构建组织工程产品的环节，方便临床移植。

附图说明

图1为羊膜间充质干细胞原位培养不同时间的形态学观察图。在图1中，（A），培养一周的去上皮羊膜；（B），培养两周的去上皮羊膜；（C），培养三周的去上皮羊膜；（D），培养四周的去上皮羊膜。Magnification：400×。

图2为羊膜间充质干细胞向神经元定向分化后的TUBB3实时定量PCR检测结果。

图3为羊膜间充质干细胞向神经元定向分化后的TUBB3Western blotting检测结果。

图4为羊膜间充质干细胞向神经元定向分化后的TUBB3免疫荧光染色结果。

图5为羊膜间充质干细胞向神经干细胞定向分化后的Nestin实时定量PCR检测结果。

图6为羊膜间充质干细胞向神经干细胞定向分化后的Nestin Western blotting检测结果。

图7为羊膜间充质干细胞向神经干细胞定向分化后的Nestin免疫荧光染色结果。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明采用体外组织培养技术大量原位扩增羊膜间充质干细胞，并诱导其向神经细胞、肝脏细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肌腱细胞、韧带、心肌细胞、内皮细胞等多种类型细胞定向分化，最终构建相应细胞类型的组织工程材料。

本发明的具体实施方式采用体外羊膜组织培养原位扩增羊膜间充质干细胞，并诱导其向神经细胞方向分化作为实施例进一步说明，但该实施例的目的仅是阐明本发明，并不构成对本发明的限制。

1、活羊膜的获取和分离：

1）从医院已签订知情同意书的健康剖宫产妇（HIV-I、乙肝、丙肝、梅毒均阴性）获得胎盘；

2）在超净工作台中，把带有绒毛膜的羊膜从胎盘上剪下并剪成大小约3×3cm，用Hanks’平衡盐溶液（HBSS）漂洗2次，以去除血迹，然后撕除绒毛膜，再用1×HBSS漂洗，直至羊膜无血渍，光滑透明，放置于DMEM培养基中。

2、将活羊膜安装在培养插件上：

1）在超净工作台中把干净的固定羊膜的培养插件浸泡在75%酒精至少5min；

2）用灭菌的去离子水漂洗环和底座，洗去沾有的酒精；

3）在解剖显微镜下，确定羊膜的上皮面和基底面；

4）以羊膜上皮面朝上固定于培养插件上，放入六孔板中。

3、去上皮羊膜的制备：

1）在每个安装固定有羊膜的培养插件环内加入2mg/ml的Dispase II200μl于37℃10min；

2）消化后，用1×PBS反复漂洗，把Dispase II洗去；

3）在解剖显微镜下，用上皮刮刀小心刮除羊膜上皮，并用1×PBS反复清洗除去多余的上皮。

4、采用间充质干细胞培养基DMEM+10%FBS在37℃,5%CO₂条件下进行羊膜间充质干细胞原位扩增。根据需要，氧气的浓度可以从2%到20%。培养时间可以从1周到4周，以将羊膜间充质干细胞扩增到不同数量。

5、采用神经细胞分化培养基诱导羊膜间充质干细胞的定向分化；

1）Neuro-medium（500ml）培养基配制：将10ml B27、5ml N2、0.2ml25μg/ml bFGF依次加入500ml Neurobasal medium中，每加一个成分混匀一次，最后充分混匀，4℃保存。

2）用微量移液器加入2.5ml Neuro-medium，前后左右轻轻摇动6孔板，使培养基充分浸没羊膜。

3）连续培养4周，每3天换液一次。

6、羊膜间充质干细胞向神经细胞方向分化后的表型鉴定：采用real-time PCR、Westernblotting、免疫荧光染色等方法检测TUBB3、Nestin等基因的表达情况。

羊膜间充质干细胞原位培养不同时间的形态学观察图参见图1。在图1中，（A），培养一周的去上皮羊膜；（B），培养两周的去上皮羊膜；（C），培养三周的去上皮羊膜；（D），培养四周的去上皮羊膜。放大倍数：40×。

羊膜间充质干细胞向神经元定向分化后的TUBB3实时定量PCR检测结果参见图2。

羊膜间充质干细胞向神经元定向分化后的TUBB3Western blotting检测结果参见图3。

羊膜间充质干细胞向神经元定向分化后的TUBB3免疫荧光染色结果参见图4。

羊膜间充质干细胞向神经干细胞定向分化后的Nestin实时定量PCR检测结果参见图5。

羊膜间充质干细胞向神经干细胞定向分化后的Nestin Western blotting检测结果参见图6。

羊膜间充质干细胞向神经干细胞定向分化后的Nestin免疫荧光染色结果参见图7。

本发明首先提供一种原位扩增羊膜间充质干细胞的体外组织培养方法，其中：所述的步骤1）是从已签订知情同意书的健康剖宫产妇（HIV-I、乙肝、丙肝、梅毒均阴性）获得胎盘。在超净工作台中把带有绒毛膜的羊膜从胎盘上剪下并剪成不同规格大小的圆形或正方形。用Hanks’平衡盐溶液（HBSS）漂洗2次，去除血迹，然后撕除绒毛膜，再用1×HBSS漂洗，直至羊膜无血渍，光滑透明，放置于培养基中。

本发明首先提供一种原位扩增羊膜间充质干细胞的体外组织培养方法，其中：所述的步骤2）是羊膜间充质干细胞的原位扩增。采用间充质干细胞培养基在37℃,5%CO₂条件下进行培养。根据需要，氧气的浓度可以从1%～20%。培养时间可以从1周到4周，以将羊膜间充质干细胞扩增到不同数量。

本发明在原位扩增获得一定数量的羊膜间充质干细胞之后，可以采用胶原酶联合胰蛋白酶的酶解方法收取单个细胞悬液。收取时先用胶原酶在37℃消化2～5h，离心收取细胞团块，然后用0.05%～0.25%胰蛋白酶在37℃消化15～20min，形成单个细胞悬液，即可用于其它用途。

本发明在原位扩增获得一定数量的羊膜间充质干细胞之后，也可以采用不同的细胞分化培养基诱导羊膜间充质干细胞在培养的羊膜组织内原位向特定类型细胞的分化。其中：所述的步骤3）是诱导羊膜间充质干细胞的定向分化。根据构建组织工程产品的需要，采用不同的培养基，诱导羊膜间充质干细胞向神经细胞、肝脏细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肌腱细胞、韧带、心肌细胞、内皮细胞等多种类型细胞转化分化。分化培养基采用目前常用的培养基，可以进行适当调整。分化培养的时间可以从2周到8周不等。

本发明在采用不同的细胞分化培养基诱导羊膜间充质干细胞向特定类型细胞分化的同时，可以根据不同的细胞类型以及临床需要，构建不同形态的组织工程材料。所述的步骤4）是采用不同的培养插件、生物反应器或特定形状的生物模具界定羊膜的形态结构，用以构建不同形态的组织工程材料。

在羊膜间充质干细胞向特定类型细胞成功分化以后，可以形成具有一定功能的组织工程材料，可以用于移植治疗相应疾病。

Claims

1.一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）新鲜人羊膜的获取和分离；

2）将获得的羊膜间充质干细胞的原位扩增；

4）构建不同形态的组织工程材料。

2.如权利要求1所述一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法，其特征在于在步骤1）中，所述新鲜人羊膜的获取和分离的具体方法为：

3.如权利要求2所述一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法，其特征在于在步骤（1）中，羊膜组织为完整的包含上皮细胞的羊膜组织，或除去上皮细胞的羊膜组织。

4.如权利要求2所述一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法，其特征在于在步骤（1）中，所述上皮细胞是在培养之前予以除去，或在培养之后予以除去，羊膜基质成分予以保留，并在所有操作中尽量保持羊膜基质细胞的活性，同时通过培养，使基质内的细胞得以大量扩增。

5.如权利要求1所述一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法，其特征在于在步骤2）中，经过原位扩增的羊膜间充质干细胞，用酶消化方法进行分离，以获取单个细胞悬液。

6.如权利要求1所述一种基于羊膜间充质干细胞的组织工程材料构建方法，其特征在于在步骤3）中，所述采用不同的细胞分化培养基诱导羊膜间充质干细胞向特定类型细胞的分化的具体方法为：采用不同的培养基，原位诱导羊膜间充质干细胞向神经细胞、肝脏细胞、脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、肌腱细胞、韧带、心肌细胞、内皮细胞等多种类型细胞转化分化；根据不同的分化细胞类型，培养的时间可以从2周到16周不等；在羊膜间充质干细胞向特定类型细胞成功分化以后，可以形成具有不同形态和一定功能的组织工程材料，并有可能用于移植治疗相应疾病。