CN112646779A - 一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维干细胞，以SV40LT和/或hTERT转染的方法构建永生羊水干细胞系，筛选出永生肺干细胞系，然后将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入永生肺干细胞系DNA，制备通过shRNA靶向干扰新冠病毒在肺干细胞内复制并能在体外产业化扩增的新冠病毒基因沉默永生肺干细胞。

Description

一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，属于生物医学领域的传染病防治技术。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已对全球公众健康构成严重威胁。SARS-CoV-2的主要结构包括单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中S蛋白在感染过程中被宿主蛋白酶切割成N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N 端的结构域(S1-NTD)和受体结合域(S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合宿主细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜之间的融合，使病毒进入细胞引起感染。N蛋白为RNA合成所必需，在病毒组装和RNA转录中起着至关重要的作用，同时也参与宿主细胞对病毒感染的反应。M和E蛋白在病毒装配中起重要作用。
目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞 (NK)，其中应用最多的是MSCs。MSCs来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，能迁移到损伤的确切部位，定向分化为肺组织细胞和毛细血管内皮细胞等多种细胞系，产生多种细胞因子和分泌大量的含有miRNA的外泌体、囊泡，通过影响PI3K/AKT、NF-κB等信号通路来治疗肺损伤，通过调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等机制修复受损器官。干细胞具有非常强的抗病毒能力，能在病毒感染局部幸存并发挥作用，已初步表明MSCs在重症新冠肺炎治疗中的安全性和有效性，具有良好的临床应用前景。但尚未见以进一步改造的新冠病毒基因沉默永生肺干细胞治疗COVID-19的文献报道。
通常间充质干细胞在体外传代至15-30代就会出现衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。这为干细胞体外培养寿命的改良和产业扩增提供了依据，但尚未见对干细胞进行永生化功能改造以用于治疗COVID-19的文献报道。
RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶 (Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶的作用下合成新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割成大量的次级siRNA，进而形成RISC而发挥作用，使RNAi的作用进一步放大，最终将外源靶mRNA完全降解。但尚未见对干细胞进行新冠病毒RNA干扰功能改造以用于治疗COVID-19的文献报道。
发明内容
基于目前治疗用干细胞的问题，本发明人提出了本发明。
本发明的目的是提供一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实施：
首选，分离羊水成纤维细胞：从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维细胞，或从新生儿脐带血、脐带组织或胎盘组织中分离间充质干细胞。
进而，构建永生化羊水细胞系：构建hTERT和/或SV40LT重组载体，转染羊水成纤维细胞或间充质干细胞，制备能无限传代、永久生存的永生化羊水细胞系或间充质干细胞系。
进而，筛选永生化干细胞系：用流式细胞仪检测来自不同克隆细胞系的表面分子，包括阳性分子CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5和阴性分子CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。
进而，筛选永生肺干细胞系：需符合以下特征①呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状；②细胞表面标志物CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44为阳性；③角蛋白表达呈阴性，c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin呈阳性；④vimentin、collagen III、fibronectin表达呈阳性，而pro-Surfactant protein C、von Willebrandfactor及α-smooth muscle actin表达呈阴性。
进而，给永生肺干细胞系装配RNA干扰基因：优选靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-shRNA或LV3-nCoV-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或将重组质粒LV3-nCoV-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染肺干细胞系，使shRNA基因整合到肺干细胞DNA上，从而获得能干扰nCoV在肺干细胞内复制的新功能。
进而，制成一种人工装配永生化基因、新冠病毒RNA干扰基因的肺干细胞系。
本发明的有益效果在于：
将原本弃用的组织细胞改造为兼具干细胞治疗功能、永生化功能、新冠病毒RNA干扰功能的肺干细胞系，可用于替换传统的腺病毒载体，制备新冠病毒永生干细胞载体疫苗。
肺干细胞因装配了永生化基因(SV40LT和/或hTERT)而解决了超低温永久保存问题、可再生利用问题、需无限扩增的商业化问题。
肺干细胞因装配了新冠病毒RNA干扰基因而更易抑制病毒在干细胞内复制，使原本易被病毒杀灭的干细胞改造为易杀灭病毒的基因沉默永生肺干细胞。
新冠病毒基因沉默永生肺干细胞被用作疫苗载体时，因取代了具有免疫原性的腺病毒载体、可以同型选用以及外源基因不进入宿主细胞内等原因，所以疫苗的使用较安全。
附图说明
图1是本发明所述的以G418和嘌呤霉素筛选得到的永生肺干细胞克隆图。
图2是本发明所述的被SV40LT和hTERT转染的永生肺干细胞克隆的传代培养图。
图3是永生肺干细胞与分离的病毒共培养72小时的细胞生长状态。
图4是新冠病毒基因沉默永生肺干细胞与分离的病毒共培养72小时的细胞生长状态。
在图1中，因被SV40LT和hTERT转染的永生肺干细胞不会被G418和嘌呤霉素杀死而存活，存活的单个细胞生长后形成细胞克隆。
在图2中，被SV40LT和hTERT转染的永生肺干细胞在传代中呈梭形贴壁生长，生长旺盛。
在图3中，可见细胞呈圆形、漂浮、死亡状态，说明永生肺干细胞受新冠病毒感染后致细胞较快死亡。
在图4中，可见细胞仍呈梭形贴壁生长，说明新冠病毒shRNA的表达能干扰病毒在胞内复制，新冠病毒基因沉默永生肺干细胞具有较好的抗病毒作用。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些范例性的描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。
1.细胞样本的采集
1.1.羊水成纤维细胞的采集
按产前诊断流程采集待检孕妇的羊水细胞，进行细胞培养和产前诊断，在倒置显微镜下从剩余的羊水细胞中筛选出贴壁生长的梭形羊水细胞。
1.2.肺间充质干细胞的采集
无菌取流产胎儿肺脏组织，机械离散，0.25％胰蛋白酶消化后，用孔径为100μm的纱布过滤，1000r/min离心5min，弃上清液，添加DMEM培养液(0.1umolβ-巯基乙醇，100UI/mL青链霉素，10％胎牛血清)。在37℃、5％CO2条件下培养。45min后换液，以去除尚未贴壁的细胞，后每48h换液。待细胞汇合度达80％后，0.25％胰蛋白酶消化传代。
2.永生化细胞系的构建及鉴定
2.1.SV40LT/pLXSN的构建
以SV40 DNA(strain 766)为模板，上游引物为5’-GCCCAGGATCCTTAACAACAACAACAAT-3’，下游引物为5’-ACGCTGAATTCCCTCTGAGCTAT-3’，进行SV40LT高保真长片段的PCR扩增；SV40 LT的PCR产物与pLXSN反转录病毒载体均经EcoR I/BamH I酶切、连接、转化、筛选和测序验证，获得含SV40LT/pLXSN重组反转录病毒载体。
2.2.hTERT/pLPCX的构建
用EcoR I酶切PIRES2-EGFP-hTERT质粒得到hTERT cDNA片段，去磷酸化后亚克隆到 pLPCX反转录病毒载体EcoR I位点，用T4DNA连接酶置22℃条件下连接，转化至感受态E.coliDH5-alpha大肠埃希氏菌，37℃培养过夜，挑选无色菌落接种，纯化重组质粒，经酶切和测序鉴定后，扩大培养含hTERT的大肠埃希氏菌，用Endotoxin-Free的质粒纯化 pLPCX-hTERT重组克隆。
2.3.hTERT/pLPCX和SV40LT/pLXSN联合转染
将待转染的细胞配成约8×105个细胞浓度接种，置5％CO2和37℃培养，24h后用含SV40LT 基因的重组逆转录病毒感染(Polybrene浓度为8ug/mL)，1周后用500ug/mL的G418筛选4 周，待细胞克隆出现后，再用含hTERT基因的重组逆转录病毒感染(Polybrene浓度为8ug/mL)， 1周后用2ug/mL的嘌呤霉素筛选，转染成功者可获得细胞克隆(如图1)。
2.4.永生化细胞的生物学特性鉴定
包括①细胞系为梭形、成纤维状。②Western检测可见分别在相对分子质量为120000和 93000处出现白色条带。③细胞系的生长曲线呈典型的“S”生长特征。④细胞系的染色体核型为二倍体。⑤细胞系不能在软琼脂中生长。⑥裸鼠致瘤试验呈阴性。
2.5.永生化干细胞的鉴定
用流式细胞仪检测干细胞膜表面分子，阳性分子包括CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、 CD105-Cy5.5；阴性分子包括CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。通过鉴定，获得能在体外永久传代的永生化干细胞系(图2)。
2.6.永生肺干细胞的鉴定
人肺干细胞系需符合：①相差显微镜观察：呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状。②流式细胞仪检测：细胞表面标志物CD45、CD11a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44为阳性。③共聚焦技术检测：角蛋白表达呈阴性，四个干性相关因子c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin呈阳性。④间接免疫荧光检测：波形蛋白(vimentin)、III型胶原(collagen III)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)表达呈阳性，而表面活性蛋白C前体(pro-Surfactant protein C，proSP-C)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF) 及α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达呈阴性。
3.永生肺干细胞的新冠病毒RNA干扰基因装配
3.1.设计新冠病毒的siRNA基因
以Ambion公司(http：//www.ambion.com/techl ib/misc/siRNAtools.html)的shRNA在线设计软件，从SARS-CoV-2(NC_045512.2株ORF1ab、3’UTR、S、E、M、N)的保守序列中筛选出多个siRNA备选序列，根据人类基因组数据库、RNA结合的Tm值及特异性的比对结果，分别优选3条与人类基因组没有同源性的保守siRNA序列(表1A)，同时设计1条无关的siRNA序列作为阴性对照(NC：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3’)。
表1A NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列
Figure BSA0000226452680000051
3.2.合成shRNA模板
靶序列确定以后，根据慢病毒干扰载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO的多克隆酶切位点，设计shRNA模板，使每个模板由两条大部分互补的长度为52-60nt的单链DNA构成，寡核苷酸单链DNA的3’端有2-5个U字形突出，包括靶序列的正义序列、loop序列、靶序列的反义序列、转录终止信号以及酶切后的粘性末端序列，经退火互补后能形成带有BamH I和ECORI酶切位点粘性末端的DNA双链(如用pSilencer4.1.CMV.neo，则用BamH I和Hind III)。如表1B，“斜体”表示酶切位点，“加粗”表示茎环结构，“下划线”表示正义链。
表1B以表1A中的siRNA合成S、E、M、N基因相对应的shRNA模板
Figure BSA0000226452680000061
3.3.慢病毒干扰载体的构建
以新冠病毒N基因的靶向干扰序列(nCoV-N-siRNA-1/2/3)作为实施例，以T4连接酶将合成的shRNA模板与线性化的慢病毒载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO连接，构建慢病毒干扰载体pHBLV-nCoV-N-shRNA1/2/3，转化感受态E.coli DH5α。
3.4.慢病毒干扰载体的鉴定
取慢病毒干扰载体转化的感受态E.coli DH5α10μL，涂布于含50μg.mL-1嘌呤霉素的 LB平板抗性培养，筛选出阳性克隆，提取质粒，以PCR、BamH I和ECORI酶切或测序鉴定，培养测序正确的阳性克隆，按质粒抽提试剂盒抽提质粒。观察重组慢病毒干扰载体中3个靶向nCoV-N-siRNA1/2/3干扰基因与设计的干扰序列是否完全一致。
3.5.携带shRNA慢病毒的包装
取对数生长期的293FT细胞，以5×106cell·mL-1的密度接种于培养瓶，加入重组质粒和慢病毒包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体三质粒组成)各4μg，并与Lipofectamine200脂质体共转染，8h后更换为完全培养基，继续培养48h，然后收集富含慢病毒的上清液，离心，过滤，分装，置于-80℃保存。
3.6.慢病毒滴度的检测
①孔稀释法计数荧光细胞：取慢病毒原液10μL，用10％FBS的DMEM培养液10倍稀释为3-5个梯度，将293FT细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于96孔板，37℃ 5％CO2培养24h后，每孔更换为10％FBS的DMEM培养液150μL继续培养48h，用荧光显微镜计数荧光细胞，计算病毒滴度。结果在重组质粒pHBLV-nCoV-N-shRNA(LV3-nCoV-N-shRNA)转染293FT 细胞后，被包装成慢病毒颗粒，在荧光显微镜下293FT细胞内呈现绿色荧光。②Real time 定量PCR法测定：以10％FBS的DMEM培养液培养293FT细胞，以待测定的慢病毒原液感染，根据Invitrogen公司的TRIZOL操作说明抽提RNA，RT-qPCR测定所抽提RNA的浓度。
3.7.永生肺干细胞的慢病毒转染
以每孔1×106个细胞密度将生长状态良好的永生肺干细胞接种于6孔板，待细胞融合至 30％时，试验组细胞分别加入5倍稀释的慢病毒原液，分别命名为pHBLV-nCoV-N-shRNA1组、 pHBLV-nCoV-N-shRNA2组、pHBLV-nCoV-N-shRNA3组。同时设立阴性对照组(仅转染慢病毒干扰载体的肺干细胞组)和空白对照组(未转染慢病毒干扰载体的正常肺干细胞组)。
3.8.转染阳性永生肺干细胞的筛选
上述细胞培养24h后更换10％FBS的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.00μ g·mL-1)，维持嘌呤霉素浓度，隔天换液，直至空白对照组细胞完全死亡，筛选结束。未被嘌呤霉素杀死的肺干细胞即为已被重组慢病毒干扰载体转染并已在DNA上整合了新冠病毒靶向干扰序列(nCoV-shRNA)的肺干细胞。理论上这种肺干细胞能表达dsRNA，dsRNA能干扰nCoV 基因，从而产生肺干细胞系内的抗病毒作用。
本发明包括选用慢病毒载体pSilencer4.1.CMV.neo、以EcoR I和Hind III酶切、构建重组载体LV3-nCoV-N-shRNA、将重组载体与包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、 pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞、包装慢病毒、以氨苄青霉素筛选阳性克隆。
3.9.验证永生肺干细胞的shRNA表达
3.9.1.RT-PCR检测shRNA的mRNA表达
用Trizol试剂提取永生肺干细胞的nCoV-N-shRNA1、nCoV-N-shRNA2和nCoV-N-shRNA3 组的总RNA，以GAPDH为内参照，设计表2所示的引物，定量分析nCoV-N-shRNA1/2/3的mRNA， PCR条件为：95℃ 3min变性，95℃ 12s，62℃ 40s，72℃ 30s，共40个循环。每组均设 3个随机复孔。反应结束后，仪器自动记录每个样品管中Ct值，以GAPDH为内参照，计算目的基因的相对含量，用2-ΔCt表示。观察空白对照组、阴性对照组pHBLV-nCoV-N的mRNA表达量以及pHBLV-nCoV-N-shRNA1、pHBLV-nCoV-N-shRNA2和pHBLV-nCoV-N-shRNA3组这3个干扰组中pHBLV-nCoV-N的mRNA表达量是否下降，推断3个特异性靶点对nCoV-N基因是否有沉默效果，与阴性和空白对照组有无统计学差异。结果提示pHBLV-nCoV-N-shRNA2干扰效果最佳。
表2新冠病毒S、E、M、N基因靶向干扰序列siRNA1～siRNA3扩增引物的设计
Figure BSA0000226452680000081
3.9.2.Western Blotting检测shRNA的蛋白表达
①抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。②观察空白对照组、阴性对照组的pHBLV-nCoV-N蛋白表达量以及pHBLV-nCoV-N-shRNA1、pHBLV-nCoV-N-shRNA2 和pHBLV-nCoV-N-shRNA3组这3个干扰组中重组慢病毒pHBLV-nCoV-N蛋白的表达量，与阳性对照组和空白对照组间有无统计学差异。③结果提示pHBLV-nCoV-N-shRNA2组能有效干扰 nCoV-N基因的蛋白表达，下称新冠病毒基因沉默永生肺干细胞。
本发明涉及的载体还包括干扰载体如pHBLV-U6-ZSGreen、pHBLV-U6-ZSGreen-puro、 pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Puro、pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Luc、pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro、 pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro、pHBLV-U6-Puro、pHBLV-U6-RFP、pHBLV-U6-RFP-T2A-luc。
4.基因沉默永生肺干细胞的功能检测
4.1.体外抗病毒功能检测
4.1.1.样本采集
取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg 的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。
4.1.2.病毒培养和分离
将Vero-E6接种至含(10％胎牛血清)DMEM培养液的12.5cm2培养瓶中，置36℃、5％CO2培养箱中培养成30％汇合度的单层细胞，吸去培养液，用DMEM清洗细胞2遍，然后在培养瓶中加入0.5mL经过双抗处理的COVID-19患者样本，置36℃、5％CO2培养箱中吸附90min后，吸去样本，加入3.5mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，每天观察细胞病变效应(CPE)，经培养5～7d后，取病变细胞上清液蔗糖梯度超速离心，分离新冠病毒，用培养液配成103～105TCID50/ml病毒液(同时用于后述的动物试验)。
4.1.3.基因沉默永生肺干细胞与病毒共培养
设立永生肺干细胞组、基因沉默永生肺干细胞组(携带新冠病毒N基因的靶向干扰序列 shRNA)，每组接种12孔板，使每孔含有2×105个细胞、2mL DMEM培养液(10％胎牛血清)，置36℃、5％CO2培养箱中培养至30％汇合度时，每孔加病毒液0.5mL，继续培养。然后分别于培养1小时、6小时、24小时和72小时后每组各取3孔的上清液，混合后以1∶4、1∶12、1∶36、 1∶108、1∶324、1∶972、1∶2916、1∶8748倍稀释，进行RT-PCR检测。
4.1.4.实时荧光RT-PCR检测病毒RNA
核酸提取试剂盒(批号：2019004)、2019新型冠状病毒(ORF1ab/N)核酸检测试剂盒(批号：20200123)和DA3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，ABI 7500型PCR 仪购自美国Thermo Fisher Scientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃15min； 95℃ 15min；94℃ 15s；55℃ 45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。
根据试剂盒说明，结果判断标准如下：①如果检测样本在ORF1ab和N基因通道无扩增曲线或Ct值＞38，判为SARS-CoV-2阴性；②如果检测样品在ORF1ab和N基因通道Ct值≤38，且有明显的扩增曲线，判为SARS-CoV-2阳性；③如果检测样品在ORF1ab或者N基因通道Ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为SARS-CoV-2阳性。
4.1.5.病毒RNA检测结果
检测结果见表3～8。在表3中，2组干细胞培养1小时培养液RNA检测阳性的最大稀释度均为1∶12，被认为是属于外源加入病毒检测结果。在表4～8中，2组干细胞随着培养时间的延长，永生肺干细胞组培养液和干细胞内病毒RNA检测结果的阳性滴度增高，且明显高于新冠病毒基因沉默永生肺干细胞组，说明后者具有较好的抗病毒作用。
表3肺干细胞与分离的新冠病毒共培养1小时培养液中病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452680000101
表4肺干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的培养液病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452680000102
表5肺干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452680000103
表6肺干细胞与分离的新冠病毒共培养24小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452680000104
表7肺干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时培养液的病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452680000105
Figure BSA0000226452680000111
表8肺干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞内病毒RNA检测结果
Figure BSA0000226452680000112
4.1.6.基因沉默永生肺干细胞与病毒共培养特点
永生肺干细胞组在培养72小时后细胞变圆、漂浮、死亡(图3)，而新冠病毒基因沉默永生肺干细胞组在培养72小时后仍呈贴壁生长(图4)，说明shRNA的表达能干扰新冠病毒在永生肺干细胞内复制。
4.2.动物体内抗病毒功能检测
4.2.1.基因沉默永生肺干细胞的准备
取基因沉默永生肺干细胞接种于10％FBS的DMEM完全培养液中进行细胞培养，每隔两三天更换培养液1次；5d左右细胞铺满瓶底约90％，0.25％胰酶消化2～3min，800r/min，离心半径12cm，离心5min，按1∶2接种于75cm2培养瓶中，于37℃、5％CO2恒温培养箱中扩增培养，4～5d传代1次。
4.2.2.实验动物的分组
选择6-8周龄、40克左右的SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分为基因沉默永生肺干细胞组(用于感染NC_045512.2株、接种基因沉默永生肺干细胞)、永生肺干细胞组(用于感染NC_045512.2株、接种永生肺干细胞)，另设阳性对照组(用于感染NC_045512.2株、接种生理盐水)和阴性对照组(仅接种生理盐水)。
4.2.3.实验动物的感染和接种
基因沉默永生肺干细胞组、永生肺干细胞组和阳性对照组分别经鼻腔喷雾接种40μl的 NC_045512.2株病毒液，滴度为105/mlTCID50，阴性对照组经鼻腔喷雾接种40μl生理盐水。然后，在各组小鼠腹腔注射5％水合氯醛溶液(0.006mL/g或0.6mg/g)，肌肉松弛后固定于板上；颈部皮肤备皮，碘伏擦拭消毒，颈部皮肤剪开约1cm小口，组织镊子分离组织，暴露气管；将1×106个干细胞缓慢注入小鼠气管(阴性和阳性对照组注入生理盐水)，复位组织、缝合皮肤；每天观察小鼠的临床症状，在感染后第7天处死小鼠，进行肺组织的病毒检测。
5.2.4.试验结果的检测
①RT-PCR检测
按Trizol法取200μl DMEM制成的处死小鼠肺组织匀浆标本，加入800μl Trizol，室温放置5min使蛋白彻底的裂解，加入氯仿200μl，用手剧烈震荡15sec，室温放置3min，4℃， 12,000g离心15min，取上清至新的Eppendorf管，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min， 4℃，12,000g离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，7,500g离心5min，弃上清，再重复漂洗1次，以30μl DEPC处理过的水溶解沉淀。按试剂盒进行引物设计、PCR扩增和产物电泳，为了比较不同实验组病毒复制量的不同，可同时扩增宿主基因β-actin作为内参，将目的基因与内参基因表达水平灰度值的比值作为各样品病毒的半定量分析。
②细胞病变效应(CPE)观察
将-70℃冰冻的肺组织解冻后用DMEM制成10％匀浆，3,000rpm离心20min，取100pl上清接种于长成单层VeroE6细胞的24孔培养板上，每份标本接种2个孔，37℃吸附1h，然后吸出标本液，用PBS(加2％双抗)洗3遍后加DMEM补充至1.5ml，置37℃、5％CO2培养箱培养，观察培养液的pH，如发现变黄或变蓝，及时调整pH或更换培养液，每天观察细胞病变效应(CPE)，记录是否出现CPE，连续观察7天，若不出现CPE进行盲传，传3～4代，观察结果。接种细胞产生病变的特点是细胞变圆、融合，透光性减弱，最终细胞死亡脱落。
③间接免疫荧光检测
将出现病变效应(CPE)的VeroE6细胞用胰酶消化和PBS清洗，按每孔10μl(107/ml)滴加于抗原载玻片上，待干燥后置冷丙酮中固定10min，用PBS冲洗(干燥后放-20℃保存)，在制备的抗原片上滴加抗S蛋白单抗(1∶200，PBS配置)，37℃湿盒中孵育30-40min，PBS冲洗三次后，滴加FITC标记的二抗(1∶500，0.02％伊文思蓝-PBS配制)，37℃湿盒中孵育20-30min， PBS冲洗3次后，用50％甘油-PBS封片，荧光显微镜下观察荧光。结果判定：在阴性对照和阳性对照成立的条件下，标本接种的VeroE6细胞均出现红色荧光判断小鼠未感染病毒；标本接种的VeroE6细胞细胞膜或细胞浆中出现绿色荧光判断为小鼠感染了病毒。
④细胞培养半数感染量(TCID50)的百分率
取每只处死小鼠(每组10只)肺组织匀浆上清100μl，以10倍递次稀释法稀释成不同的稀释度，分别接种经Hank氏液洗3次的组织培养单层VeroE6细胞96孔培养板，每孔细胞接种30μl，每个稀释度接种4个细胞孔，轻微振荡，使匀浆与细胞充分接触，放37℃吸附1min，以Hank氏液洗3次，加入细胞维持液，放37℃ CO2培养箱培养，在普通倒置显微镜下观察记录细胞病变情况，连续观察10-14天，分别计算各组VeroE6细胞半数感染量(TCID50) 的百分率，然后比较各组TCID50百分率的差异，百分率越大病毒含量越多。从表9-12可知，基因沉默永生肺干细胞组具有较低的VeroE6细胞半数感染量，表示抗病毒效果较好。
表9基因沉默永生肺干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452680000131
表10永生肺干细胞组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452680000132
表11阳性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452680000133
表12阴性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率
Figure BSA0000226452680000134
4.2.5.新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的应用
按本发明的方法，以产前诊断后剩余羊水细胞制备的新冠病毒基因沉默永生肺干细胞，可按姓名、ABO血型或HLA分型冻存于-196℃干细胞库备用。当新冠病毒流行时，可取各型基因沉默永生肺干细胞进行培养扩增，然后按自身或同型使用原则选用，进行个体化治疗，以提高干细胞治疗的效果，减少、消除其免疫排斥等副作用。

Claims (6)

1.一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维干细胞，以SV40LT和/或hTERT基因转染的方法构建永生化羊水干细胞系，筛选永生肺干细胞系，然后将新冠病毒M、N、E和/或S基因的RNA干扰序列shRNA插入永生肺干细胞系DNA，制备能通过shRNA靶向干扰新冠病毒在所述肺干细胞内复制并能在体外产业化扩增的新冠病毒基因沉默永生肺干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述肺干细胞从产前诊断后剩余的胎儿细胞、胚胎间充质干细胞、成体间充质干细胞中筛选，或经干细胞诱导获得肺干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述shRNA插入永生肺干细胞包括重组慢病毒载体的构建、重组慢病毒载体和包装质粒共转染293FT细胞进行慢病毒包装、慢病毒转染、肺干细胞系的筛选和鉴定。
4.根据权利要求1、3所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述重组慢病毒载体的构建包括将新冠病毒M、N、E和/或S基因的靶向干扰序列shRNA克隆到慢病毒载体的多克隆位点。
5.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，所述新冠病毒M、N、E和/或S基因的siRNA序列见“NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列”。
6.根据权利要求1所述的一种新冠病毒基因沉默永生肺干细胞的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备：
(1)分离羊水成纤维细胞：从产前诊断后剩余的羊水细胞中分离羊水成纤维细胞，或从新生儿脐带血、脐带组织或胎盘组织中分离间充质干细胞。
(2)构建永生羊水细胞系：构建hTERT和/或SV40LT重组载体，转染羊水成纤维细胞或间充质干细胞，制备能无限传代、永久生存的永生化羊水细胞系或间充质干细胞系。
(3)筛选永生干细胞系：用流式细胞仪检测来自不同克隆细胞系的表面分子，包括阳性分子CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、CD105-Cy5.5和阴性分子CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。
(4)筛选永生肺干细胞系：需符合以下特征①呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状；②细胞表面标志物CD45、CD1 1a、CD14、CD90、CD34、CD71、CD25、CD105、CD117、CD166和CD44为阳性；③角蛋白表达呈阴性，c-Myc、Oct4、Nanog和Nestin呈阳性；④vimentin、collagen III、fibronectin表达呈阳性，而pro-Surfactant protein C、von Willebrand factor及α-smooth muscle actin表达呈阴性。
(5)给永生肺干细胞系装配RNA干扰基因：优选靶向干扰序列siRNA，合成shRNA模板，连接到慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-nCoV-shRNA或LV3-nCoV-shRNA，将重组质粒pHBLV-nCoV-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或将重组质粒LV3-nCoV-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293FT细胞，包装携带shRNA的慢病毒，将慢病毒转染肺干细胞系，使shRNA基因整合到肺干细胞DNA上，从而获得能干扰nCoV在肺干细胞内复制的新功能。
(6)制成一种人工装配永生化基因、新冠病毒RNA干扰基因从而获得兼具干细胞治疗功能、永生化功能、新冠病毒RNA干扰功能的肺干细胞系。
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