CN108486156B - 一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用，属于细胞技术领域。本发明通过用慢病毒介导hTERT基因转染获得的细胞系，激活了树鼩肠上皮细胞的端粒酶活性，能够迅速、有效的建立永生化的树鼩肠上皮细胞，所建立的永生化树鼩肠上皮细胞成功越过了复制衰老，获得了永生性，并且该永生化树鼩肠上皮细胞保持了与原代树鼩肠上皮细胞十分相近的表型，保持了细胞接触抑制和细胞增殖的密度限制，用呼肠孤病毒感染以后能够出现CPE，所以能够用于病毒感染等研究。

Description

一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用，该细胞系保持着原代细胞的生物学特性。
背景技术
肠道是机体内最大的免疫系统之一，有着80％左右的免疫细胞。肠上皮在肠道内是一道天然的物理屏障，与诸多因素有着密切的联系，如与疾病的发生、与肠道免疫细胞的相互作用、与肠道内的免疫耐受以及与炎症的发生等。但受到原代肠上皮细胞的体外培养一般不超过15天的限制，影响了许多实验的进行及实验的重复性。建立永生化的树鼩小肠上皮细胞系，则可以在很多方面得到应用，包括各种病原感染的疾病模型、细胞信号通路的研究、肠道疾病药物机制的研究以及癌症研究等。
树鼩作为人类的近亲正在被实验动物标准化。研究发现成年发病树鼩肠道中呼肠孤病毒的携带率高达76％，正常乳树鼩呼肠孤病毒携带率为20％。乳树鼩感染呼肠孤病毒后能在脑、心、肝、脾、肺、肾组织中复制，并造成这些器官的损伤。所以建立永生化的肠上皮细胞，能够为病毒受体等相关研究提供很好的细胞模型，并可减少对树鼩的使用。
目前，仅2016年马娜等人有关于永生化树鼩肝细胞的报道，并且她们的方法是用SV40的T抗原基因转染树鼩原代肝细胞来建立的细胞系。这种方法能够成功的建立永生化细胞系，但是该细胞系的端粒会随着传代次数的增加而缩短。除了肝细胞，树鼩其他器官组织细胞的永生化未见报道。
永生化细胞系建立的传统的方法主要包括两类，一是用病毒与细胞共培养来建立永生化细胞系，如EBV、HPV等，二是用基因工程的方法将抑癌基因敲除(p53、pTEN)、致癌基因敲入(Myc、c-Jun、c-Ias、vsrc、Mdm2)来建系。
传统的方法存在对于树鼩原代肠上皮细胞系的建立效果不理想、建立的细胞系是转化细胞、会引入新的抗原、无法成功建立永生化细胞系的问题。因此如何克服现有技术的不足是目前细胞技术领域亟待解决的问题。
发明内容
为解决传统的方法存在对于树鼩原代肠上皮细胞系的建立效果不理想、建立的细胞系是转化细胞、会引入新的抗原、无法成功建立永生化细胞系的问题，本发明提供一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用，申请人通过大量实验的优化，最终创新性以慢病毒介导转染hTERT基因的前提下，同时不断摸索筛选条件，确定了病毒转染后15天添加筛选剂puromycin 5μg/mL，待对照组细胞全部被杀死后将筛选剂浓度减半，继续培养3代。并且在传代时胰酶消化时间控制在10秒，消化下来的细胞与慢病毒一般操作步骤相比，能够获得阳性的转染细胞，细胞的形态好、活性高，并且通过鉴定表明该细胞为永生化细胞。其次，本发明首次将树鼩肠上皮细胞永生化，获得的永生化细胞保持着原代树鼩肠上皮细胞的生物学特性，能够在被呼肠孤病毒感染后出现明显的细胞病变(CPE)。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)，慢病毒转染前18-24小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×104/孔铺到细胞培养板中培养，并使细胞在慢病毒转染时的数量为2×104/孔；
其中，培养所采用的培养基为完全培养基；
所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加2-5％(v/v)胎牛血清，1％双抗，1％ITS-G，1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
步骤(2)，吸去细胞原有培养基，每孔加入250μL维持液，按照MOI＝2～100换算病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀，置于37℃培养箱感染4小时；之后再每孔加入250μL维持液继续培养12小时；吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养≥72小时，作为实验组；同时，对照组，对照组与上述实验组的区别在于不加入病毒原液，其余都相同；
所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1％双抗、1％ITS-G、1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
所述的病毒原液的制备方法为：采用RT-PCR扩增hTERT基因序列，之后对慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro进行双酶切，然后通过T4连接酶对扩增产物和双酶切后慢病毒表达载体通过T4连接酶进行连接，得到重组质粒；将得到的重组质粒与pSPAX2、pMD2G质粒采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；对制得的慢病毒进行滴度检测，得到病毒原液
所述的hTERT基因序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(3)，往实验组和对照组中分别加入嘌呤霉素至终浓度为2～10μg/mL，待对照组的细胞被嘌呤霉素杀光，将实验组的嘌呤霉素浓度减半继续培养，细胞汇合至70％-90％时，进行传代培养，三代内继续用含浓度减半的嘌呤霉素的完全培养基培养细胞，之后采用完全培养基继续传代培养，即得到永生化树鼩小肠上皮细胞系。
进一步，优选的是，步骤(2)中，按照MOI＝10换算病毒原液体积。
进一步，优选的是，步骤(2)中，吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养15天，作为实验组。
进一步，优选的是，步骤(3)中，往加病毒的实验组和未加病毒的对照组中加入嘌呤霉素至终浓度为5μg/mL。
进一步，优选的是，步骤(3)中，细胞汇合至70％-90％时，用0.25％胰酶消化传代。
进一步，优选的是，步骤(3)中，细胞汇合至80％时，用0.25％胰酶消化传代。
进一步，优选的是，步骤(3)中，消化后再经纯化步骤后传代；
所述的纯化的具体方法为：将经胰酶消化后的单细胞悬液用完全培养基稀释成10个/mL，将细胞接种于细胞培养板中，每个孔一个细胞，于37℃孵箱培养；待细胞汇合成片，再用0.25％胰酶消化，之后进行传代培养。
进一步，优选的是，步骤(3)中，在加入嘌呤霉素前，荧光显微镜检测实验组的ZsGreen荧光表达效率，当荧光表达效率达到>80％后再加入嘌呤霉素。
本发明还要求保护上述永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法构建得到的永生化树鼩小肠上皮细胞系。
本发明同时要求保护上述构建方法构建得到的永生化树鼩小肠上皮细胞系在药物筛选中的应用。
本发明得到的永生化树鼩小肠上皮细胞能够代替树鼩小肠原代细胞，作为树鼩源病原的增殖培养材料，从而对树鼩源病原的受体、受体阻断、基因敲入和敲出进行长期研究，永生化的树鼩小肠上皮细胞能够弥补受原代树鼩小肠上皮细胞体外培养代次限制的缺陷。
本发明加入筛选剂puromycin的时间相对于一般操作要延长至15天内，这样才能得到阳性的转染细胞。其次，在15天内，待细胞长至汇合度为70％-90％，便用0.25％胰酶消化传代，消化的时间不能太长，优选控制在10秒左右，镜下观察铺路石样细胞开始皱缩时便终止消化，这样处理获得的细胞能够初步得到纯化。
纯化时，优选将经胰酶消化后的单细胞悬液用完全培养基稀释成10个/mL，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每个孔加入0.1mL细胞悬液，即每个孔一个细胞，选择只有一个细胞的孔，做标记，于37℃孵箱培养；待细胞汇合成片，用胰酶消化传代培养。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明首次针对树鼩肠上皮细胞提供了一种有效的永生化细胞系建立的方法，避免了转染效率低且转染失败的问题，转染的细胞形态好。用脂质体转染法转染后的细胞不能形成克隆，并且在转染后的10天内便凋亡。而按照一般的慢病毒转染方法操作，细胞形态不再是上皮细胞的铺路石样，并且在相对较长的时间内开始凋亡。本发明通过对转染条件的摸索，确定了筛选剂添加的时间点和细胞传代时的消化时间，这种方法获得的细胞在体外传代至50代以上，并且表达肠上皮细胞标志性蛋白CK18、occludin。
附图说明
图1是原代肠上皮细胞通过慢病毒转染hTERT基因后的荧光显微镜观察结果；A.转染第5天阳性转染的细胞；B.转染第15天阳性转染的的细胞；C.阳性转染细胞纯化后形成的单克隆TIEC1；D.单克隆细胞荧光显微镜下发荧光；E.传代至第三代的原代pTIEC；F.转染后传代至第十五代的TIEC。
图2是RT-PCR检测细胞内hTERT mRNA水平结果；M：500DNAmarker；1：原代树鼩肠上皮细胞；2：第20代；3：第50代.；
图3是通过免疫荧光和western blot鉴定细胞内的相关标志分子；
图4是永生化树鼩肠上皮细胞感染呼肠孤病毒24h后CPE的情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明中的各组分均为常规市售产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数。
本发明所采用的部分试剂如表1所示。
表1
Figure BDA0001548390700000051
Figure BDA0001548390700000061
实施例1
一种永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)，慢病毒转染前18小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×104/孔铺到细胞培养板中培养，并使细胞在慢病毒转染时的数量为2×104/孔；
其中，培养所采用的培养基为完全培养基；
所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加2％(v/v)胎牛血清，1％双抗，1％ITS-G，1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
步骤(2)，吸去细胞原有培养基，每孔加入250μL维持液，按照MOI＝2换算病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀，置于37℃培养箱感染4小时；之后再每孔加入250μL维持液继续培养12小时；吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养72小时，作为实验组；同时，对照组，对照组与上述实验组的区别在于不加入病毒原液，其余都相同；
所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1％双抗、1％ITS-G、1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
所述的病毒原液的制备方法为：采用RT-PCR扩增hTERT基因序列，之后对慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro进行双酶切，然后通过T4连接酶对扩增产物和双酶切后慢病毒表达载体通过T4连接酶进行连接，得到重组质粒；将得到的重组质粒与pSPAX2、pMD2G质粒采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；对制得的慢病毒进行滴度检测，得到病毒原液
所述的hTERT基因序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(3)，往实验组和对照组中分别加入嘌呤霉素至终浓度为2μg/mL，待对照组的细胞被嘌呤霉素杀光，将实验组的嘌呤霉素浓度减半继续培养，细胞汇合至70％时，进行传代培养，用0.25％胰酶消化传代，三代内继续用含浓度减半的嘌呤霉素的完全培养基培养细胞，之后采用完全培养基继续传代培养，即得到永生化树鼩小肠上皮细胞系。
步骤(3)中，消化后再经纯化步骤后传代；
所述的纯化的具体方法为：将经胰酶消化后的单细胞悬液用完全培养基稀释成10个/mL，将细胞接种于细胞培养板中，每个孔一个细胞，于37℃孵箱培养；待细胞汇合成片，再用0.25％胰酶消化，之后进行传代培养。
实施例2
一种永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)，慢病毒转染前24小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×104/孔铺到细胞培养板中培养，并使细胞在慢病毒转染时的数量为2×104/孔；
其中，培养所采用的培养基为完全培养基；
所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加5％(v/v)胎牛血清，1％双抗，1％ITS-G，1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
步骤(2)，吸去细胞原有培养基，每孔加入250μL维持液，按照MOI＝100换算病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀，置于37℃培养箱感染4小时；之后再每孔加入250μL维持液继续培养12小时；吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养15d，作为实验组；同时，对照组，对照组与上述实验组的区别在于不加入病毒原液，其余都相同；
所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1％双抗、1％ITS-G、1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
所述的病毒原液的制备方法为：采用RT-PCR扩增hTERT基因序列，之后对慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro进行双酶切，然后通过T4连接酶对扩增产物和双酶切后慢病毒表达载体通过T4连接酶进行连接，得到重组质粒；将得到的重组质粒与pSPAX2、pMD2G质粒采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；对制得的慢病毒进行滴度检测，得到病毒原液
所述的hTERT基因序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(3)，往实验组和对照组中分别加入嘌呤霉素至终浓度为10μg/mL，待对照组的细胞被嘌呤霉素杀光，将实验组的嘌呤霉素浓度减半继续培养，细胞汇合至90％时，进行传代培养，用0.25％胰酶消化传代，三代内继续用含浓度减半的嘌呤霉素的完全培养基培养细胞，之后采用完全培养基继续传代培养，即得到永生化树鼩小肠上皮细胞系。
步骤(3)中，消化后再经纯化步骤后传代；
所述的纯化的具体方法为：将经胰酶消化后的单细胞悬液用完全培养基稀释成10个/mL，将细胞接种于细胞培养板中，每个孔一个细胞，于37℃孵箱培养；待细胞汇合成片，再用0.25％胰酶消化，之后进行传代培养。
步骤(3)中，在加入嘌呤霉素前，荧光显微镜检测实验组的ZsGreen荧光表达效率，当荧光表达效率达到>80％后再加入嘌呤霉素。
实施例3
一种永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)，慢病毒转染前20小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×104/孔铺到细胞培养板中培养，并使细胞在慢病毒转染时的数量为2×104/孔；
其中，培养所采用的培养基为完全培养基；
所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加3％(v/v)胎牛血清，1％双抗，1％ITS-G，1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
步骤(2)，吸去细胞原有培养基，每孔加入250μL维持液，按照MOI＝10换算病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀，置于37℃培养箱感染4小时；之后再每孔加入250μL维持液继续培养12小时；吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养8d，作为实验组；同时，对照组，对照组与上述实验组的区别在于不加入病毒原液，其余都相同；
所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1％双抗、1％ITS-G、1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
所述的病毒原液的制备方法为：采用RT-PCR扩增hTERT基因序列，之后对慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro进行双酶切，然后通过T4连接酶对扩增产物和双酶切后慢病毒表达载体通过T4连接酶进行连接，得到重组质粒；将得到的重组质粒与pSPAX2、pMD2G质粒采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；对制得的慢病毒进行滴度检测，得到病毒原液
所述的hTERT基因序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤(3)，往实验组和对照组中分别加入嘌呤霉素至终浓度为5μg/mL，待对照组的细胞被嘌呤霉素杀光，将实验组的嘌呤霉素浓度减半继续培养，细胞汇合至80％时，进行传代培养，用0.25％胰酶消化传代，三代内继续用含浓度减半的嘌呤霉素的完全培养基培养细胞，之后采用完全培养基继续传代培养，即得到永生化树鼩小肠上皮细胞系。
步骤(3)中，消化后再经纯化步骤后传代；
所述的纯化的具体方法为：将经胰酶消化后的单细胞悬液用完全培养基稀释成10个/mL，将细胞接种于细胞培养板中，每个孔一个细胞，于37℃孵箱培养；待细胞汇合成片，再用0.25％胰酶消化，之后进行传代培养。
步骤(3)中，在加入嘌呤霉素前，荧光显微镜检测实验组的ZsGreen荧光表达效率，当荧光表达效率达到>80％后再加入嘌呤霉素。
实施例4
1、树鼩肠上皮细胞的原代分离培养
取一只新生两日龄树鼩的小肠，尽量去除肠系膜，延纵向剖开去除内容物；用清洗液清洗数次至溶液上清变澄清；将小肠剪碎至1mm2大小的组织块，再用清洗液清洗数次至溶液上清变澄清；静置10分钟，去除清洗液，加入10mL酶消化液，置于孵箱37℃、180rpm摇动消化2小时；往消化产物中加入等体积的细胞分散液，移液枪反复吹打数次，室温静置1分钟；取上清，1200rpm离心5分钟；弃上清，加入10mL细胞分散液重悬，1200rpm离心5分钟，继续加入分散液离心重复两次；弃上清，加入5mL完全培养基重悬，1200rpm离心5分钟；弃上清，加入4mL完全培养基重悬接种于6孔板于孵箱37℃、5％CO2培养，得到树鼩原代肠上皮细胞；每隔3天换一次液。
其中的溶液配制为：
完全培养基：DMEM高糖培养基添加5％(v/v)胎牛血清，1％双抗，1％ITS-G，1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
酶消化液：DMEM培养基添加75U/ml胶原酶XI，20μg/ml中性蛋白酶II，0.5mM二硫苏糖醇DTT和1％(v/v)胎牛血清；
清洗液：HBSS溶液(Mg2+、Ca2+free)添加1％双抗、0.5mM二硫苏糖醇(DTT)；
细胞分散液：DMEM高糖培养基添加2％(w/v)山梨醇。
2、慢病毒的包装
将hTERT基因序列发给上海生工，用pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro载体连接基因序列，体外包装慢病毒。hTERT基因序列见SEQ ID NO.1。
慢病毒质粒载体构建：pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro载体用EcoRI、XbaI酶切，酶切体系：载体2ul(400ng/μL)，EcoRI 1μL，XbaI 2μL，10×buffer 4μL，H2O 31μL；40μL酶切体系37℃2小时。酶切后胶回收。
PCR扩增hTERT序列，引物设计：hTERT-EcoRI/XbaI-F：ggatctatttccggtgaattcgccaccatgccgcgcgctccccgct(SEQ ID NO.2)，hTERT-EcoRI/XbaI-R：ggatccgcggccgcttctagagtccaggatggtcttgaagt(SEQ ID NO.3)；体系为：10×PCR Buffer 5ul，MgSO4 2μL，dNTPs5μL，Forward/Reward primer 1μL，KOD plus 1μL，Plasmid template 0.5μL，ddH2O 34μL；50μL体系。PCR程序：95℃5分钟；94℃20秒，55℃20秒，25个循环；72℃90秒，72℃10分钟。
之后将酶切后的载体与hTERT扩增片段通过T4连接酶连接，连接体系：hTERT扩增片段2ul，酶切后载体100-200ng，ligase buffer2ul，T4ligase 1ul，H2O余量；总体积为20ul体系；于16℃过夜。
慢病毒质粒扩增：E.coli DH5αCompetent Cells使用前在冰上融化；轻微混匀，取100μl装入1.5mL离心管中，不能剧烈振荡混合细胞；加入DNA样品(≤10ng)；冰中放置30分钟；42℃放置45秒；冰中放置1～2分钟；添加SOC培养基(预先在37℃保温)至终体积1mL；37℃振荡培养1小时(160～225rpm)；取适量涂布于选择培养基；37℃过夜培养，抗性：Amp。按生工质粒大提试剂盒说明书提取质粒。在含0.01％氨苄青霉素的LB液体培养基中接种目标菌株，于37℃摇床充分振荡培养16h；取菌液，10,000rpm离心3分钟，收集菌体，吸干培养基；在菌体沉淀中加入10ml Buffer P1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体；加入10mL Buffer P2，立即温和颠倒离心管10次混匀，室温静置4分钟；加入14mL Buffer P3，立即上下颠倒10次，室温放置5分钟；90℃水浴8分钟，取出后-20℃放置10分钟；12,000rpm离心15分钟；将上清全部小心移入试剂盒中的离心管吸附柱，室温放置5分钟，8,000rpm离心2分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；向吸附柱中加入5mLBuffer DW1，8,000rpm离心2分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；向吸附柱中加入5mL WashSolution，8,000rpm离心2分钟。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；重复上一步；将空吸附柱和收集管放入离心机，10,000rpm离心2分钟；将吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入2mL Elution Buffer，室温静置2分钟，10,000rpm离心2分钟。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。浓度大于1μg/μL，A260/280在1.7～1.8之间方可用以包毒。
慢病毒包装：病毒包装质粒系统pSPAX2、pMD2G、慢病毒质粒(1:1:1)。铺板293T细胞用于转染，置于37℃、5％CO2培养箱中；转染。观察细胞密度，达到70～80％的汇合率即可进行脂质体转染；OptiMEM需在37℃水浴中预热，按lipo2000说明书操作。转染后更换含10％FBS的新鲜完全培养基，转染后6h进行换液；收毒：转染后48h和72h分别两次收集病毒上清(48h收集后置换新鲜完全培养基)。在48h收毒时，将100mm dish中的培养基倒入50mL离心管中，随后补入含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基，平稳置于37℃，5％CO2孵箱中继续培养。在72h收毒时，直接将100mm dish中的培养基倒入50mL离心管中；超速离心：将50mL离心管中的病毒上清，4℃，2000×g，10分钟，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心管中，4℃，82700×g，离心120分钟，最后将慢病毒超离液分装到灭菌处理的病毒管中；分装病毒，标记，-80℃冰箱保存。
慢病毒滴度检测：将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×105个/ml，加入96孔板，100μL/孔。放入37℃，5％CO2培养箱中培养；第二天，准备6个1.5mL EP管，第一个EP管中加入10μL病毒液，另外5个EP管用293T细胞培养基依次做3倍梯度稀释并加入到细胞培养瓶中与细胞一起培养；第三天，先吸去100mL含病毒培养基，加入100μL的10％FBS完全培养基；第五天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前6h需更换新鲜10％FBS完全培养基(更换方法为：从孔中吸出80μL培养基，然后加入80μL新鲜10％FBS完全培养基)，之后放入37℃，5％CO2培养箱中培养。6h后荧光显微镜下观察结果，荧光百分比在10～30％的孔计算病毒滴度。滴度(TU/mL)＝细胞数×荧光百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×103。最终测得的滴度为1×108TU/mL，即病毒原液。
3、慢病毒转染树鼩原代肠上皮细胞并纯化
实验组：慢病毒转染前24小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×104/孔铺到24孔板中，使细胞在慢病毒转染时的数量为2×104/孔，培养所采用的培养基为完全培养基；吸取细胞原有培养基，每孔加入250μL维持液，按照MOI＝10换算病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀，置于37℃培养箱感染4小时；再每孔加入250μL维持液继续培养12小时；吸去培养液，换上新鲜的完全培养基500μL，继续培养72小时；
所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1％双抗、1％ITS-G、1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
同时，设置对照组，对照组与上述实验组的区别在于不加入病毒原液，其余都相同。
荧光显微镜检测ZsGreen荧光表达效率；为了提高筛选获得的阳性细胞，当荧光表达效率达到>80％后再加入嘌呤霉素；
病毒感染后3d的荧光表达率为6.3％，15d的荧光率90％。
15天后往加病毒的实验组和未加病毒的对照组中加入puromycin至终浓度俄日5μg/mL，待对照组的细胞被puromycin杀光，把实验组中puromycin的浓度减半(1/2puro培养基)，三代内用0.25％胰酶消化按1:2传代，继续用1/2puro培养基培养细胞；之后采用完全培养基继续传代培养，即得到永生化树鼩小肠上皮细胞系。
优选消化后再经纯化步骤后传代，所述的纯化的具体方法为：
当用0.25％胰酶消化细胞至细胞缩小，细胞间隙增大，有极少量细胞漂起时，小心吸出胰酶，加入500μl完全培养基反复吹打，制成细胞悬液；用完全培养基稀释成10个/mL，将细胞接种于96孔板中，每个孔加入0.1mL细胞悬液，即得每孔一个细胞；选择只有一个细胞的孔，做标记，以便后期筛选单克隆细胞，于37℃孵箱培养；待细胞汇合至70％-90％，用0.25％胰酶消化细胞至细胞缩小，细胞间隙增大，有极少量细胞漂起后，小心吸出胰酶，加入完全培养基反复吹打后，将细胞悬液接种到24孔板。按照同样的方法依次接种到12孔板，6孔板扩大培养。
此时得到的细胞为永生化树鼩肠上皮细胞的单克隆命名为TIEC1。如图1所示，A.转染第5天阳性转染的细胞；B.转染第15天阳性转染的的细胞；C.阳性转染细胞纯化后形成的单克隆TIEC1；D.单克隆细胞荧光显微镜下发荧光；E.传代至第三代的树鼩原代肠上皮细胞(pTIEC)；F.转染后传代至第十五代的TIEC1。
所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加2-5％(v/v)胎牛血清，1％双抗，1％ITS-G，1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1％双抗、1％ITS-G、1％HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
4、树鼩永生化肠上皮细胞系的鉴定
4.1端粒酶活性检测
按照Qiagen的RNeasy Mini Kit说明书提取TIEC1的RNA。用0.25％胰酶将细胞消化下来，用细胞计数器计数，取≤1×106个细胞于1.5mL离心管中，离心取沉淀；加入350μL的Buffer RLT；加入与Buffer RLT等体积的70％乙醇，吹打混匀后转移至带收集管的离心柱中，8000×g离心15秒，弃滤液；加入700μL Buffer RW1至离心柱中，8000×g离心15秒，弃滤液；加入500μL Buffer RPE至离心柱中，8000×g离心15秒，弃滤液；加入500μL BufferRPE至离心柱中，8000×g离心15秒，弃滤液；加入500μL Buffer RPE至离心柱中，8000×g离心2分钟，弃滤液；将离心柱置于新的1.5mL离心管中，往离心柱中加入50μL RNase-freewater，8000×g离心1分钟；此时获得TIEC1的RNA。测浓度后，样品存放于-80℃超低温冰箱，用于后续实验。
按照TAKARA PrimeScriptⅡ1st Strand℃DNA Synthesis Kit说明书将RNA逆转成cDNA。
在microtube中配置下列反应混合液：Random 6mers 1μL，dNTP Mixture 1μL，模板RNA＜5μg，加水至10μL；65℃保温5分钟后，冰上迅速冷却；继续往microtube中加入下列反应液：5×PrimeScriptⅡBuffer 4μL，RNase Inhibitor 0.5μL，PrimeScriptⅡRTase 1μL，加水至20μL；缓慢摇匀后按照以下条件进行反转录反应：30℃10分钟，42℃60分钟，95℃5分钟，冰上冷却。
根据hTERT基因序列设计普通PCR引物：
上游F:5-tccgaggtgtccctgagtat-3(SEQ ID NO.2)
下游R：5-tgacacttcagccgcaaga-3(SEQ ID NO.3)
按照昆明硕擎生物科技有限公司金牌Green Mix说明书扩增目的片段。
在microtube中加入cDNA模板1μL，Green Mix溶液23μL，上游和下游引物25nM各0.5μL。将溶液混匀后按以下条件扩增：94℃1分钟；94℃10秒，55℃5秒，72℃10秒，30个循环；4℃保存。90V 55分钟电泳，照胶。结果如图2，第2和3涌道分别代表第20代和第50代TIEC1，均扩增出来约为286bp的条带。而原代树鼩肠上皮细胞则显示为阴性。表明外源性的hTERT已经转入细胞并表达。
4.2免疫荧光染色
取24孔板，弃除孔板外围的一圈孔，在中间8个孔中加入细胞爬片，并将第三代细胞接种于孔中；培养板中将已爬好细胞的爬片用PBS浸洗3次，每次3分钟；用4％的多聚甲醛固定爬片15分钟，PBS浸洗玻片3次，每次3分钟；0.5％Triton X-100室温通透20分钟；PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，吸干PBS，在玻片上滴加1％BSA，室温封闭30分钟；吸掉封闭液，不洗，每张爬片避光滴加按1：200稀释的一抗(兔抗鼠Anti-Cytokeratin 18抗体(abcam)，occludin(abcam)，pan-cytokeratin(abcam))并放入湿盒，4℃孵育过夜；PBS浸洗爬片3次，每次3分钟；加入羊抗兔IgG(abcam)二抗在37℃孵箱中孵育1h，PBS浸洗爬片3次，每次3分钟；吸干爬片上多余液体后，滴加DAPI避光孵育2分钟，对标本进行染核，用PBS洗去多余的DAPI(5分钟×4次)；吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。用角蛋白CK18和Pan-cytokeratin抗体、紧密连接蛋白Occludin抗体对TIEC1染色(图3)，结果显示均为阳性。
4.3western blot检测
(1)蛋白样本制备：将接种在6孔板的TIEC1细胞从孵箱取出，倒掉培养液，每孔细胞加1ml 4℃预冷的PBS(0.01mol/L，pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作2次，共洗细胞3次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。RIPA裂解液(1.0mmol/L PMSF)，摇匀置于冰上。每孔细胞加100μL裂解液，于冰上裂解30分钟。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于孔的一侧，然后用移液枪将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中，14000rpm离心10分钟，取上清至新的1.5mL离心管。按体积加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮10分钟。
(2)SDS-PAGE电泳：安装好Bio-Rad微型凝胶电泳模具后按Bio-Rad Mini-Protean电泳系统的使用说明书安装好玻璃板，固定于制胶板上；根据检测抗原的分子量大小选择合适的电泳分离胶浓度在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配置一定体积的分离胶溶液，迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，等待30～60分钟，使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间会出现一个清晰的界面；制备浓缩胶，并在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的预设计的梳子，将凝胶垂直放置于室温下；积层胶聚合完全后(30分钟)，移出梳子，把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液；把电泳装置与电源连接好，调节电压至60V，跑过积层胶后调至100V，待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。
(3)转膜：将PVDF膜在甲醇中浸泡30分钟后转入转膜液(碧云天)中。将滤纸也浸入转移液中。将胶卸下，在转膜液中稍稍浸泡一下，按顺序从下往上铺上滤纸、膜、胶、滤纸。注意用玻棒逐出气泡。封紧后放入半干转膜仪(Bio-rad)，注意膜在正极一侧。恒压15V，1h。
(4)封闭及杂交：将膜从转膜仪中取出，PBST(PBS中加入0.05％tween 20)稍加漂洗，浸没于封闭液(5％脱脂牛奶)中缓慢摇荡一小时。将含兔抗鼠ck18抗体的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，4℃静置过夜。一抗孵育结束后，用PBST漂洗膜后再浸洗3次，每次10分钟。山羊抗兔IgG二抗，按1:5000比例稀释，室温轻摇1h。二抗孵育结束后，用PBST漂洗膜后再浸洗3次，每次10分钟。
(5)发光鉴定：使用HRP-ECL发光法。将A、B发光液按体积比1:1的比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带(5分钟左右)后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液(millipore)中1～2分钟，清水漂洗一下后放在定影液(millipore)中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。结果如图3所示，在45kD有明显条带，说明TIEC1细胞中表达ck18。
5.永生化树鼩肠上皮细胞系的应用
将永生化树鼩肠上皮细胞接种于96孔板，将呼肠孤病毒按MOI＝10接种于细胞，24小时后显微镜下观察细胞CPE情况。如图4所示，细胞胞膜边缘不整齐；细胞皱缩，变圆直至碎裂，脱落。此现象说明永生化的树鼩小肠上皮细胞能够表现出原代细胞感染呼肠孤病毒后出现的CPE，因此，永生化树鼩小肠上皮细胞能够代替原代细胞作为树鼩呼肠孤病毒的宿主细胞对病毒进行增殖；永生化的树鼩小肠上皮细胞能够弥补受原代树鼩小肠上皮细胞体外培养代次限制的缺陷，如在树鼩呼肠孤病毒感染后，研究病毒受体，可用永生化小肠上皮细胞进行受体阻断、敲入和敲出进行长期研究。
本发明为一种树鼩永生化肠上皮细胞的建立通过用慢病毒介导hTERT基因转染获得的细胞系，激活了树鼩肠上皮细胞的端粒酶活性，能够迅速、有效的建立永生化的树鼩肠上皮细胞，所建立的永生化树鼩肠上皮细胞成功越过了复制衰老，获得了永生性，并且该永生化树鼩肠上皮细胞保持了与原代树鼩肠上皮细胞十分相近的表型，保持了细胞接触抑制和细胞增殖的密度限制，用呼肠孤病毒感染以后能够出现CPE，所以能够用于病毒感染等研究。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
SEQ ID NO.1
atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60
gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120
cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180
gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240
gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300
ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360
agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420
ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480
ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540
gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600
cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660
gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720
ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780
aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840
gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900
cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960
tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020
ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080
gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140
cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200
gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260
ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320
gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380
gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440
aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500
gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560
cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680
ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740
tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800
ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860
ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920
ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980
ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040
ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100
gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160
ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220
gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280
agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340
caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400
gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460
aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520
ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580
gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640
aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700
cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760
cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820
gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880
aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940
aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000
atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060
tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120
tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180
gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240
aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300
acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360
ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactag 3399
SEQ ID NO.2
tccgaggtgt ccctgagtat 20
SEQ ID NO.3
tgacacttca gccgcaaga 19
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3399
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60
gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120
cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180
gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240
gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300
ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360
agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420
ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480
ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540
gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600
cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660
gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720
ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780
aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840
gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900
cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960
tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020
ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080
gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140
cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200
gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260
ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320
gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380
gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440
aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500
gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560
cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620
ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680
ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740
tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800
ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860
ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920
ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980
ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040
ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100
gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160
ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220
gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280
agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340
caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400
gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460
aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520
ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580
gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640
aaaaccttcc tcaggaccct ggtccgaggt gtccctgagt atggctgcgt ggtgaacttg 2700
cggaagacag tggtgaactt ccctgtagaa gacgaggccc tgggtggcac ggcttttgtt 2760
cagatgccgg cccacggcct attcccctgg tgcggcctgc tgctggatac ccggaccctg 2820
gaggtgcaga gcgactactc cagctatgcc cggacctcca tcagagccag tctcaccttc 2880
aaccgcggct tcaaggctgg gaggaacatg cgtcgcaaac tctttggggt cttgcggctg 2940
aagtgtcaca gcctgtttct ggatttgcag gtgaacagcc tccagacggt gtgcaccaac 3000
atctacaaga tcctcctgct gcaggcgtac aggtttcacg catgtgtgct gcagctccca 3060
tttcatcagc aagtttggaa gaaccccaca tttttcctgc gcgtcatctc tgacacggcc 3120
tccctctgct actccatcct gaaagccaag aacgcaggga tgtcgctggg ggccaagggc 3180
gccgccggcc ctctgccctc cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaagc attcctgctc 3240
aagctgactc gacaccgtgt cacctacgtg ccactcctgg ggtcactcag gacagcccag 3300
acgcagctga gtcggaagct cccggggacg acgctgactg ccctggaggc cgcagccaac 3360
ccggcactgc cctcagactt caagaccatc ctggactag 3399
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tccgaggtgt ccctgagtat 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tgacacttca gccgcaaga 19

Claims (9)

1.一种永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），慢病毒转染前18-24小时，将树鼩原代肠上皮细胞以1×104/孔铺到细胞培养板中培养，并使细胞在慢病毒转染时的数量为2×104/孔；
其中，培养所采用的培养基为完全培养基；
所述的完全培养基为DMEM高糖培养基添加2-5%胎牛血清，1%双抗，1%ITS-G，1%HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
步骤（2），吸去细胞原有培养基，每孔加入250μL维持液，按照MOI=10换算病毒原液体积，并按体积将病毒原液加入细胞中，摇匀，置于37℃培养箱感染4小时；之后再每孔加入250μL维持液继续培养12小时；吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养≥72小时，作为实验组；同时，对照组，对照组与上述实验组的区别在于不加入病毒原液，其余都相同；
所述的维持液为DMEM高糖培养基添加1%双抗、1%ITS-G、1%HEPES和10ng/ml重组人表皮生长因子；
所述的病毒原液的制备方法为：采用RT-PCR扩增hTERT基因序列，之后对慢病毒表达载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro进行双酶切，然后通过T4连接酶对扩增产物和双酶切后慢病毒表达载体进行连接，得到重组质粒；将得到的重组质粒与pSPAX2、pMD2G质粒采用脂质体的方法共转染293T细胞中，制得慢病毒；对制得的慢病毒进行滴度检测，得到病毒原液；
所述的hTERT基因序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤（3），往实验组和对照组中分别加入嘌呤霉素至终浓度为2~10μg/mL，待对照组的细胞被嘌呤霉素杀光，将实验组的嘌呤霉素浓度减半继续培养，细胞汇合至70%-90%时，进行传代培养，三代内继续用含浓度减半的嘌呤霉素的完全培养基培养细胞，之后采用完全培养基继续传代培养，即得到永生化树鼩小肠上皮细胞系。
2.根据权利要求1所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，吸去培养液，换上新鲜的完全培养基，每孔500μL，继续培养15天，作为实验组。
3.根据权利要求1所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，15天后往加病毒的实验组和未加病毒的对照组中加入嘌呤霉素至终浓度为5μg/mL。
4.根据权利要求1所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞汇合至70%-90%时，用0.25%胰酶消化传代。
5.根据权利要求4所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞汇合至80%时，用0.25%胰酶消化传代。
6.根据权利要求4所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，消化后再经纯化步骤后传代；
所述的纯化的具体方法为：将经胰酶消化后的单细胞悬液用完全培养基稀释成10个/mL，将细胞接种于细胞培养板中，每个孔一个细胞，于37℃孵箱培养；待细胞汇合成片，再用0.25%胰酶消化，之后进行传代培养。
7.根据权利要求1所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，在加入嘌呤霉素前，荧光显微镜检测实验组的ZsGreen荧光表达效率，当荧光表达效率达到>80%后再加入嘌呤霉素。
8.权利要求1-7任意一项所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法构建得到的永生化树鼩小肠上皮细胞系。
9.权利要求1-7任意一项所述的永生化树鼩小肠上皮细胞系的构建方法构建得到的永生化树鼩小肠上皮细胞系在药物筛选中的应用。
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树鼩原代肠上皮细胞的体外分离培养与鉴定;尹博文等;《实验动物科学》;20170430;第34卷(第2期);11-15 *

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