CN115521901B - 永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉一种永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株及其构建方法与应用。该方法是使用混合酶消化法，采用Ⅱ型胶原酶、分散酶和脱氧核糖核酸酶I从树鼩视网膜组织中分离并通过差速消化法纯化获得原代树鼩视网膜微血管内皮细胞，然后利用携带SV40T的慢病毒转染原代细胞，胰酶消化后挑选单克隆并经过50代以上的传代，获得永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞；本发明方法获得的细胞能够稳定传代至50代以上，有效维持了树鼩视网膜微血管内皮细胞稳定的生长状态和增殖能力，改善了目前视网膜血管研究只能现用现取的烦琐程序，为眼科相关疾病的研究提供了稳定的视网膜微血管内皮细胞系，真正做到省时、省力、高效、便利。

Description

永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于细胞分离培养技术和永生化构建技术领域，具体涉及一种永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株及其构建方法与应用。
背景技术
血管内皮细胞是位于血管内壁的单层扁平细胞，主要参与血管通透性和凝血功能的调节，在血管生理状态，释放血管活性物质以及新生血管的形成中发挥着重要作用。视网膜微血管调节血压功能和屏障功能，容易受到心、脑、肾或血液循环等病变的影响而发生管壁形态改变以及渗出、出血、新生血管增生等病变。视网膜微血管内皮细胞（retinalmicrovascular endothelial cells，RMECs）是糖尿病视网膜病变、视网膜动脉硬化、高血压的眼底改变等各种生理、病理性因素的靶细胞，是构建视网膜血管病理模型的重要工具细胞之一。
目前已有大鼠视网膜微血管内皮细胞、人视网膜微血管内皮细胞、牛视网膜微血管内皮细胞、羊视网膜微血管内皮细胞以及恒河猴视网膜微血管内皮细胞被分离出，并且基于不同物种的视网膜微血管内皮细胞开展了各个方向的眼科相关疾病研究。树鼩作为一种小型哺乳类的攀鼩目动物，具有体型小、繁殖快的特点，进化上比啮齿类更接近非人灵长类，在生理解剖、神经系统、视觉系统、免疫系统及心理应激模式等方面与灵长类甚至人类高度相似，已被用于眼部、视神经以及脑部神经发育相关疾病的研究，以及多种肝炎病毒、寨卡病毒、单纯疱疹病毒及流感病毒等病毒性疾病模型中。树鼩具有较大的眼睛，发达的视觉系统，锥细胞数量占感光细胞的96%，具有较好的色觉及立体视觉，在近视、弱视、角膜炎和青光眼等模型的建立，视网膜、视神经、角膜和视皮质的基础研究以及在眼科相关疾病的研究中是一个潜在的有可能替代非人灵长类的实验动物。
近年来对微血管内皮细胞的功能研究不断深入发展，微血管内皮细胞体外培养技术也越来越受到重视，尤其针对具体某组织器官的病变，则更需要该组织器官的微血管内皮细胞作为细胞模型。视网膜血管内皮细胞然是构成血-视网膜屏障的主要成分，更是在视网膜病变中发挥重要作用。然而原代细胞往往只有特定的几个代次能够稳定增长，传代次数过多后，细胞便会出现形态发生改变、增殖变缓，无法重复试验、实验效率受到影响等问题，这对于构建眼科疾病相关细胞模型以及相关机制研究有较大阻碍，而永生化细胞恰恰能够有效弥补原代细胞的上述不足。
原代视网膜微血管内皮细胞常用的分离方法有机械分离法、组织块培养法、胰蛋白酶和胶原酶二步消化法、胶原酶和DNA酶混合法等几种方法进行分离，机械消化法对细胞的损伤较大，胰蛋白酶消化对视网膜细胞会产生较大的毒性，组织块培养法周期长且产生较多杂细胞，有研究将胶原酶消化制备的细胞悬液接种于纤维粘连蛋白(FN)包被的培养瓶进行培养，所需时间较长；体外常用的视网膜微血管内皮细胞纯化方法有单克隆法、磁珠筛选法、percoll密度梯度离心法、差速消化法，但percoll离心法操作繁琐，磁珠筛选法价格昂贵操作不便，单克隆法实验周期较长，单纯使用差速消化法容易产生杂细胞，达到纯化标准的时间较长。因此如何克服现有技术的不足是目前本技术领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株及其构建方法与应用。利用本方法可以分离培养出树鼩原代视网膜微血管内皮细胞，并且构建能够多次稳定传代的永生化细胞；该方法使用混合酶消化法，采用Ⅱ型胶原酶、分散酶和脱氧核糖核酸酶I（DNase I）分离得到树鼩原代视网膜微血管内皮细胞后，采用添加血管内皮生长因子、内皮细胞生长添加剂、肝素的DMEM/F12完全培养基培养；利用携带SV40T的慢病毒转染原代细胞，之后挑选单克隆并进行细胞传代，经过50代以上的传代培养后，细胞仍能保持较强的活性和增殖能力，获得永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞；该方法可以有效的诱导树鼩视网膜原代细胞向永生化细胞转化。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，包括如下步骤：
将树鼩原代视网膜微血管内皮细胞以2×105 cells/孔铺到细胞培养板中采用普通培养基在37℃、5%CO2条件下培养至细胞汇合度达到80%以上时，PBS清洗，然后加入含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，接着以MOI=30接种HBLV-SV40T-3xflag-PURO慢病毒为实验组，同时以未接种慢病毒的细胞作为对照组；在37℃、5%CO2条件下培养4h后，补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，培养24h后将培养基更换为普通培养基继续培养24h，最后用含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基进行嘌呤霉素药物筛选，2天更换一次培养基，将培养基更换为含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基，直至对照组细胞完全死亡；之后采用普通培养基对实验组继续传代培养，即得到永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞系；
所述的普通培养基为含10%FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基。
进一步，优选的是，所述的树鼩原代视网膜微血管内皮细胞的获取方法为：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成1mm*1mm的碎片；弃掉培养基后加入1-3mg/mLⅡ型胶原酶和50-70U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用1-3mg/mLⅡ型胶原酶、1-3mg/mL分散酶和50-70U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、0.5-1.5%ECGs、3-5ng/mL VEGF、40-60mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
进一步，优选的是，步骤（1）中，完全培养基的用量为1mL；1-3mg/mLⅡ型胶原酶和50-70U/mL DNase I的用量均为2mL；消化时间为1h，消化过程中每15分钟轻摇混匀一次；离心参数为1000rpm离心8min。
进一步，优选的是，步骤（2）中，4℃离心参数为2000rpm离心10min；1-3mg/mLⅡ型胶原酶、1-3mg/mL分散酶、50-70U/mL DNase I的用量均为1mL；消化时间为30min；室温下离心参数为：1000rpm离心8min；用完全培养基漂洗后于1000rpm离心8min；漂洗次数为3次；
步骤（3）中，用2mL完全培养基重悬细胞；补加新鲜完全培养基的量为2mL；步骤（4）中，PBS清洗细胞次数为3次；0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶用量为500mL。
进一步，优选的是，补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基的量为1mL；采用普通培养基对实验组继续传代培养时，先消化后再经有限稀释步骤后传代。
进一步，优选的是，所述的先消化后再经有限稀释步骤具体为：
用0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温下消化，待镜下观察到有小型梭状、多角形样细胞皱缩变圆时加入普通培养基终止消化，并将其吹洗下来收集培养，然后用普通培养基将细胞按10倍稀释法稀释至10cells/mL的浓度接种后于37℃、5%CO2条件下培养，然后选取并标记由单个细胞增殖形成的单细胞群，待长至汇合率达80%以上时，弃去普通培养基，PBS清洗，用质量浓度0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温消化，镜下观察细胞待细胞变圆后，弃胰酶后加入普通培养基终止消化，采用普通培养基悬浮细胞后进行扩大培养。
进一步，优选的是，稀释至10cells/mL的浓度后接种于96孔板上，100μL/孔。
本发明同时提供上述永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法构建得到的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株。
本发明还提供上述永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法构建得到的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株在药物筛选中的应用。
本发明另外提供一种树鼩原代视网膜微血管内皮细胞分离培养方法，包括如下步骤：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成碎片；弃掉培养基后加入1-3mg/mLⅡ型胶原酶和50-70U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用1-3mg/mLⅡ型胶原酶、1-3mg/mL分散酶和50-70U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、0.5-1.5%ECGs、3-5ng/mL VEGF、40-60mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
本发明中，含4μg/mL聚凝胺的普通培养基为在普通培养基中添加聚凝胺至浓度为4μg/mL；含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基为在普通培养基中添加嘌呤霉素至浓度为5μg/mL。
本发明使用混合酶消化法，采用Ⅱ型胶原酶、分散酶和脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）从树鼩眼球视网膜组织中分离纯化获得原代树鼩视网膜微血管内皮细胞，然后利用携带SV40T的慢病毒转染原代细胞，通过挑选单克隆并经过50代以上的传代，获得永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞，方法实施过程中细胞传代过程中使用的培养基为含10%FBS、和1%青-链霉素的DMEM/F12培养基（称作普通培养基）。
本发明采用混合酶消化法从树鼩眼球视网膜组织中分离纯化获得原代树鼩视网膜微血管内皮细胞，分离过程中使用的混合酶为Ⅱ型胶原酶、DNase I、分散酶，消化酶37℃提前预热20分钟，第一步采用Ⅱ型胶原酶（1-3mg/mL）和DNase I（50-70U/mL）各2mL，离心后第二步消化使用这三种酶的混合液（Ⅱ型胶原酶（1-3mg/mL）、分散酶（1-3mg/mL）和DNase I（50-70U/mL）各1mL）；在分离纯化过程中使用的完全培养基为含有20%FBS、1%ECGs、4ng/mLVEGF、50mg/mL肝素和1%青-链霉素的DMEM/F12培养基（称作完全培养基）。
本发明采用树鼩这一新型模式动物，通过改进细胞分离培养的细节问题，探讨可靠的RMECs原代分离培养方法，使得分离的视网膜微血管内皮细胞纯度更高，状态更好，并缩减实验周期。在此基础上研究建立了永生化视网膜微血管内皮细胞株，为进一步研究视网膜新生血管疾病及其病理机制奠定基础。本发明方法获得的细胞能够稳定传代至50代以上，有效维持了树鼩视网膜微血管内皮细胞稳定的生长状态和增殖能力，改善了目前视网膜血管研究只能“现用现取”的烦琐程序，为眼科相关疾病的研究提供了稳定的视网膜微血管内皮细胞系，真正做到省时、省力、高效、便利。
本发明通过实验筛选，提出最适合的嘌呤霉素筛选浓度，有效抑制了未转染SV40的细胞生长，同时在分离视网膜微血管内皮细胞时提出混合酶消化法的组合顺序及浓度，第一步采用Ⅱ型胶原酶和DNase I。Ⅱ型胶原酶主要水解结缔组织中胶原蛋白的成分，胶原酶的消化作用温和，但单纯用胶原酶消化时产生的大量DNA黏液使组织成团，影响组织贴壁及生长，加入DNase I的混合酶可以及时将消化过程中释放的DNA分解掉。第二次消化加入分散酶，一种非特异性的金属蛋白酶，作用于细胞基底膜，具有组织解聚功能，防止细胞结块，并且不会给细胞膜带来伤害，该混合酶方法缩短了消化时间，简化实验过程；并且提出除基础培养基DMEM/F12+1%青-链霉素+20%FBS外，还添加了血管内皮生长因子（VEGF）、内皮细胞生长添加剂(ECGs)以及肝素，能提供给内皮细胞足够的营养，利于内皮细胞生长，适量的肝素可有效抑制成纤维细胞增生，使内皮细胞纯度提高；此外在细胞纯化阶段采取差速消化结合有限稀释法，利用内皮细胞黏附能力弱的特点，优先快速分离出大部分内皮细胞，再进行有限稀释法进一步纯化，采用该方法缩短了实验周期并提高细胞纯度和细胞活性。在此基础上进行永生化，所得到的细胞能够稳定传代至50代以上，有效维持了树鼩视网膜微血管内皮细胞稳定的生长状态和增殖能力，建立了高效、简易的RMECs 培养方法，也实现了细胞的即用即取，为后续视网膜血管疾病的研究奠定重要的细胞生物学实验基础。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明首次提供了树鼩原代视网膜微血管内皮细胞分离培养及其永生化细胞株的建立方法，可以得到有明显内皮细胞标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1的树鼩原代视网膜微血管内皮细胞以及有永生化基因SV40T的树鼩永生化视网膜微血管内皮细胞，增加了细胞的特异性，实现了不同代次间细胞生长状态和增殖能力的稳定性；该方法获得的视网膜微血管内皮细胞纯度较高，形态典型，细胞扩增能力强、产量高，填补了目前没有针对树鼩这一物种的视网膜微血管内皮细胞这一空缺，本发明提供的原代细胞取材与纯化方法操作简单，体外培养的树鼩视网膜微血管内皮细胞可以在长期（大于P50代）的传代过程中维持良好的细胞形态，利用树鼩与人亲缘关系近且眼球结构与人相似的特点，为人类眼科相关疾病的研究提供了新的能够稳定传代的视网膜微血管内皮细胞，省去了每次需要时都要从组织中分离培养的繁琐，保证实验的可重复性。
附图说明
图1为不同培养代次的树鼩视网膜微血管内皮细胞的显微镜图（100×）；其中A图为第30代，B图为第39代，C图为第45代，D图为第50代；
图2为第52代树鼩视网膜微血管内皮细VWF免疫荧光鉴定结果示意图（100×），其中，A是树鼩视网膜微血管内皮细胞VWF（绿色）；B是树鼩视网膜微血管内皮细胞核DAPI（蓝色）；C是树鼩视网膜微血管内皮细胞VWF与细胞核重叠；
图3为第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞CD34免疫荧光鉴定结果示意图（100×），其中，A是树鼩视网膜微血管内皮细胞CD34（绿色）；B是树鼩视网膜微血管内皮细胞核DAPI（蓝色）；C是树鼩视网膜微血管内皮细胞CD34与细胞核重叠；
图4为第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞Claudin1免疫荧光鉴定结果示意图（100×），其中，A是树鼩视网膜微血管内皮细胞Claudin1（绿色）；B是树鼩视网膜微血管内皮细胞核DAPI（蓝色）；C是树鼩视网膜微血管内皮细胞Claudin1与细胞核重叠；
图5为第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞ZO-1免疫荧光鉴定结果示意图（100×），其中，A是树鼩视网膜微血管内皮细胞Z0-1（绿色）；B是树鼩视网膜微血管内皮细胞核DAPI（蓝色）；C是树鼩视网膜微血管内皮细胞ZO-1与细胞核重叠；
图6为第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化基因SV40T免疫荧光鉴定结果示意图（100×），其中，A为树鼩视网膜微血管内皮细胞SV40T（红色）；B为树鼩视网膜微血管内皮细胞核DAPI（蓝色）；C为树鼩视网膜微血管内皮细胞SV40T与细胞核重叠；
图7为第52代树鼩永生化视网膜微血管内皮细胞核型分析结果（100×，油镜）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例中如无特殊说明百分含量均为质量百分含量（75%酒精、0.5% Triton X-100、20%山羊血清封闭液，及抗体稀释均为体积百分含量）
本发明中，1%青-链霉素购自Gibco、1%ECGs购自Sciencell，肝素购自Stemcell。Ⅱ型胶原酶、DNase I、分散酶购自索莱宝
本发明中慢病毒为携带SV40T基因的慢病毒载体。
HBLV-SV40T-3xflag-PURO慢病毒购自汉恒生物科技(上海)有限公司。
实施例1
永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，包括如下步骤：
将树鼩原代视网膜微血管内皮细胞以2×105 cells/孔铺到细胞培养板中采用普通培养基在37℃、5%CO2条件下培养至细胞汇合度达到80%以上时，PBS清洗，然后加入含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，接着以MOI=30接种HBLV-SV40T-3xflag-PURO慢病毒为实验组，同时以未接种慢病毒的细胞作为对照组；在37℃、5%CO2条件下培养4h后，补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，培养24h后将培养基更换为普通培养基继续培养24h，最后用含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基进行嘌呤霉素药物筛选，2天更换一次培养基，将培养基更换为含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基，直至对照组细胞完全死亡；之后采用普通培养基对实验组继续传代培养，即得到永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞系；
所述的普通培养基为含10%FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基。
实施例2
永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，包括如下步骤：
将树鼩原代视网膜微血管内皮细胞以2×105 cells/孔铺到细胞培养板中采用普通培养基在37℃、5%CO2条件下培养至细胞汇合度达到80%以上时，PBS清洗，然后加入含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，接着以MOI=30接种HBLV-SV40T-3xflag-PURO慢病毒为实验组，同时以未接种慢病毒的细胞作为对照组；在37℃、5%CO2条件下培养4h后，补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，培养24h后将培养基更换为普通培养基继续培养24h，最后用含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基进行嘌呤霉素药物筛选，2天更换一次培养基，将培养基更换为含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基，直至对照组细胞完全死亡；之后采用普通培养基对实验组继续传代培养，即得到永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞系；
所述的普通培养基为含10%FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基。
所述的树鼩原代视网膜微血管内皮细胞的获取方法为：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成1mm*1mm的碎片；弃掉培养基后加入1mg/mLⅡ型胶原酶和50U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用1mg/mLⅡ型胶原酶、1mg/mL分散酶和50U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、0.5%ECGs、3ng/mL VEGF、40mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
步骤（1）中，完全培养基的用量为1mL；1mg/mLⅡ型胶原酶和50U/mL DNase I的用量均为2mL；消化时间为1h，消化过程中每15分钟轻摇混匀一次；离心参数为1000rpm离心8min。
步骤（2）中，4℃离心参数为2000rpm离心10min；1mg/mLⅡ型胶原酶、1mg/mL分散酶、50U/mL DNase I的用量均为1mL；消化时间为30min；室温下离心参数为：1000rpm离心8min；用完全培养基漂洗后于1000rpm离心8min；漂洗次数为3次；
步骤（3）中，用2mL完全培养基重悬细胞；补加新鲜完全培养基的量为2mL；步骤（4）中，PBS清洗细胞次数为3次；0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶用量为500mL。
采用普通培养基对实验组继续传代培养时，先消化后再经有限稀释步骤后传代。
所述的先消化后再经有限稀释步骤具体为：
用0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温下消化，待镜下观察到有小型梭状、多角形样细胞皱缩变圆时加入普通培养基终止消化，并将其吹洗下来收集培养，然后用普通培养基将细胞按10倍稀释法稀释至10cells/mL的浓度接种后于37℃、5%CO2条件下培养，然后选取并标记由单个细胞增殖形成的单细胞群，待长至汇合率达80%以上时，弃去普通培养基，PBS清洗，用质量浓度0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温消化，镜下观察细胞待细胞变圆后，弃胰酶后加入普通培养基终止消化，采用普通培养基悬浮细胞后进行扩大培养。
稀释至10cells/mL的浓度后接种于96孔板上，100μL/孔。
实施例3
永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，包括如下步骤：
将树鼩原代视网膜微血管内皮细胞以2×105 cells/孔铺到细胞培养板中采用普通培养基在37℃、5%CO2条件下培养至细胞汇合度达到80%以上时，PBS清洗，然后加入含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，接着以MOI=30接种HBLV-SV40T-3xflag-PURO慢病毒为实验组，同时以未接种慢病毒的细胞作为对照组；在37℃、5%CO2条件下培养4h后，补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，培养24h后将培养基更换为普通培养基继续培养24h，最后用含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基进行嘌呤霉素药物筛选，2天更换一次培养基，将培养基更换为含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基，直至对照组细胞完全死亡；之后采用普通培养基对实验组继续传代培养，即得到永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞系；
所述的普通培养基为含10%FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基。
所述的树鼩原代视网膜微血管内皮细胞的获取方法为：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成1mm*1mm的碎片；弃掉培养基后加入3mg/mLⅡ型胶原酶和70U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用3mg/mLⅡ型胶原酶、3mg/mL分散酶和70U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、1.5%ECGs、5ng/mL VEGF、60mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
步骤（1）中，完全培养基的用量为1mL；3mg/mLⅡ型胶原酶和70U/mL DNase I的用量均为2mL；消化时间为1h，消化过程中每15分钟轻摇混匀一次；离心参数为1000rpm离心8min。
步骤（2）中，4℃离心参数为2000rpm离心10min；3mg/mLⅡ型胶原酶、3mg/mL分散酶、70U/mL DNase I的用量均为1mL；消化时间为30min；室温下离心参数为：1000rpm离心8min；用完全培养基漂洗后于1000rpm离心8min；漂洗次数为3次；
步骤（3）中，用2mL完全培养基重悬细胞；补加新鲜完全培养基的量为2mL；步骤（4）中，PBS清洗细胞次数为3次；0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶用量为500mL。
采用普通培养基对实验组继续传代培养时，先消化后再经有限稀释步骤后传代。
所述的先消化后再经有限稀释步骤具体为：
用0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温下消化，待镜下观察到有小型梭状、多角形样细胞皱缩变圆时加入普通培养基终止消化，并将其吹洗下来收集培养，然后用普通培养基将细胞按10倍稀释法稀释至10cells/mL的浓度接种后于37℃、5%CO2条件下培养，然后选取并标记由单个细胞增殖形成的单细胞群，待长至汇合率达80%以上时，弃去普通培养基，PBS清洗，用质量浓度0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温消化，镜下观察细胞待细胞变圆后，弃胰酶后加入普通培养基终止消化，采用普通培养基悬浮细胞后进行扩大培养。
稀释至10cells/mL的浓度后接种于96孔板上，100μL/孔。
实施例4
永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，包括如下步骤：
将树鼩原代视网膜微血管内皮细胞以2×105 cells/孔铺到细胞培养板中采用普通培养基在37℃、5%CO2条件下培养至细胞汇合度达到80%以上时，PBS清洗，然后加入含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，接着以MOI=30接种HBLV-SV40T-3xflag-PURO慢病毒为实验组，同时以未接种慢病毒的细胞作为对照组；在37℃、5%CO2条件下培养4h后，补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，培养24h后将培养基更换为普通培养基继续培养24h，最后用含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基进行嘌呤霉素药物筛选，2天更换一次培养基，将培养基更换为含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基，直至对照组细胞完全死亡；之后采用普通培养基对实验组继续传代培养，即得到永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞系；
所述的普通培养基为含10%FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基。
补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基的量为1mL。
所述的树鼩原代视网膜微血管内皮细胞的获取方法为：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成1mm*1mm的碎片；弃掉培养基后加入2mg/mLⅡ型胶原酶和60U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用2mg/mLⅡ型胶原酶、2mg/mL分散酶和60U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、1%ECGs、4ng/mL VEGF、50mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
步骤（1）中，完全培养基的用量为1mL；2mg/mLⅡ型胶原酶和60U/mL DNase I的用量均为2mL；消化时间为1h，消化过程中每15分钟轻摇混匀一次；离心参数为1000rpm离心8min。
步骤（2）中，4℃离心参数为2000rpm离心10min；2mg/mLⅡ型胶原酶、2mg/mL分散酶、60U/mL DNase I的用量均为1mL；消化时间为30min；室温下离心参数为：1000rpm离心8min；用完全培养基漂洗后于1000rpm离心8min；漂洗次数为3次；
步骤（3）中，用2mL完全培养基重悬细胞；补加新鲜完全培养基的量为2mL；步骤（4）中，PBS清洗细胞次数为3次；0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶用量为500mL。
采用普通培养基对实验组继续传代培养时，先消化后再经有限稀释步骤后传代。
所述的先消化后再经有限稀释步骤具体为：
用0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温下消化，待镜下观察到有小型梭状、多角形样细胞皱缩变圆时加入普通培养基终止消化，并将其吹洗下来收集培养，然后用普通培养基将细胞按10倍稀释法稀释至10cells/mL的浓度接种后于37℃、5%CO2条件下培养，然后选取并标记由单个细胞增殖形成的单细胞群，待长至汇合率达80%以上时，弃去普通培养基，PBS清洗，用质量浓度0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温消化，镜下观察细胞待细胞变圆后，弃胰酶后加入普通培养基终止消化，采用普通培养基悬浮细胞后进行扩大培养。
稀释至10cells/mL的浓度后接种于96孔板上，100μL/孔。
实施例5
一种树鼩原代视网膜微血管内皮细胞分离培养方法，包括如下步骤：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成碎片；弃掉培养基后加入1mg/mLⅡ型胶原酶和50U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用1mg/mLⅡ型胶原酶、1mg/mL分散酶和50U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、0.5%ECGs、3ng/mL VEGF、40mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
实施例6
一种树鼩原代视网膜微血管内皮细胞分离培养方法，包括如下步骤：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成碎片；弃掉培养基后加入3mg/mLⅡ型胶原酶和70U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用3mg/mLⅡ型胶原酶、3mg/mL分散酶和70U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、1.5%ECGs、5ng/mL VEGF、60mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
实施例7
一种树鼩原代视网膜微血管内皮细胞分离培养方法，包括如下步骤：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成碎片；弃掉培养基后加入2mg/mLⅡ型胶原酶和60U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用2mg/mLⅡ型胶原酶、2mg/mL分散酶和60U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、1%ECGs、4ng/mL VEGF、50mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
实施例8
1.树鼩原代视网膜微血管内皮细胞分离纯化
取1岁左右的树鼩，腹腔注射3%戊巴比妥钠0.5mL麻醉后处死，消毒眼球周围，取眼球，放入D-Hank液中，清洗，冰上操作，眼科剪在赤道部破开眼球，用剪刀沿赤道剪开眼球，去除眼前节及玻璃体，见略偏淡黄色膜样组织与视乳头粘连，钝性分离出完整视网膜组织，在4℃预冷的冰D-Hank液中展平视网膜，剪除肉眼可见的视网膜大血管分支及部分色素组织，眼科剪剥取树鼩视网膜经PBS冲洗3次，转入无菌培养皿中，并用D-Hank液反复漂洗，加入1mL完全培养基，并将其剪碎成1mm*1mm。分别加入Ⅱ型胶原酶（2mg/mL）和DNase I（60U/mL）各2mL，37℃消化1h，每15分钟轻摇混匀一次；将消化液转入15mL离心管中，4℃1000rpm离心8min，弃上清，用完全培养基重悬后，4℃2000rpm离心10min，弃上清，加入Ⅱ型胶原酶（2mg/mL）、分散酶（2mg/mL）、DNase I（60U/mL）各1mL，混匀后37℃消化30min，室温下1000rpm离心8min，弃上清后，用完全培养基漂洗，再1000rpm离心8min，重复3次。用2mL 完全培养基重悬，接种于T25瓶，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，之后每天观察细胞生长状况；72h后可见瓶底有贴壁细胞，培养基中有较多悬浮死细胞，弃掉一半培养基，添加2mL新鲜完全培养基；待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗原代细胞3次，采用差速消化法加入0.25%Trypsin-EDTA胰蛋白酶室温消化，由于内皮细胞粘附性弱，可首先被胰酶消化，倒置显微镜下观察细胞，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打，变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来后，将细胞悬液转至T25瓶中培养，弃去此时仍附在原培养瓶上的大多平滑肌细胞、周细胞、成纤维细胞等。显微镜下观察细胞状态；细胞多呈现梭形或多角形，呈团簇状分布，边界清楚，少量呈铺路石样螺旋向外生长，形态较一致，为树鼩原代视网膜微血管内皮细胞，且生长状态良好。
2.树鼩永生化视网膜微血管内皮细胞建立
1、慢病毒转染树鼩原代视网膜微血管内皮细胞
将生长状态良好的原代视网膜微血管内皮细胞以1×105cells/mL接种于6孔板，2mL/孔，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞汇合度达到80%以上时，用PBS缓冲液清洗2次，加入含4μg/mL聚凝胺的普通培养基1mL，以MOI=30接种HBLV-SV40T-3xflag-PURO慢病毒（设空白孔不接种），置于37℃、5%CO2培养箱中培养，4h后补加1mL含聚凝胺（4μg/mL）的培养液，培养24h后更换为普通培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养；24h后将培养液更换为含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基，继续培养，2天更换一次培养基，直至对照孔（未接种慢病毒）细胞完全死亡。显微镜下可观察到对照孔细胞完全漂浮，皿底没有贴壁细胞，即为完全死亡，实验孔中细胞长满，只有少部分死细胞漂浮。
2、挑取单克隆及细胞传代
首先将筛选成功的细胞用0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶消化，待镜下观察到有小型梭状、多角形样细胞皱缩变圆时及时采用普通培养基终止消化，用普通培养基将其吹洗下来收集培养。之后将收集的细胞采用普通培养基稀释至10cells/mL，接种于96孔板，100μL/孔，放入37℃、5%CO2培养箱中培养，之后每隔一天进行观察，标记由单个细胞增殖形成的单细胞群。单克隆细胞长至汇合率达80%以上时，弃去培养液，PBS清洗，用质量浓度0.25%trypsin-EDTA胰蛋白酶室温消化，倒置显微镜下观察细胞，待细胞变圆时，弃胰酶后加入普通培养基终止消化，转至24孔板中，放入37℃、5%CO2培养箱继续培养，之后逐步扩大培养，每消化一次记为一代，定期拍照记录细胞形态，可稳定传代50代以上，不同代次间细胞形态差异小，多呈现梭形或多角形，团簇状分布，边界清楚，在第2-4天细胞数量明显增加，处于对数生长期，具有较好的生长状态和较强的增殖能力，为树鼩永生化视网膜微血管内皮细胞。培养至52代时细胞仍保持稳定的生长状态，图1为4个不同培养代次的树鼩视网膜微血管内皮细胞，A为第30代、B为第39代、C为第45代、D为第50代，不同代次细胞间形态差异较小，均呈现梭形或多角形（放大倍数为目镜10×，物镜10×）。
3.树鼩永生化视网膜微血管内皮细胞特征鉴定---内皮细胞特异性VWF蛋白、CD34蛋白、Claudin1蛋白、ZO-1蛋白和永生化基因SV40T鉴定
取第52代细胞消化后普通培养基稀释至1×105cells/mL，接种于24孔板，500μl/孔，待细胞贴壁后，吸弃培养基，PBS清洗1次；加入4%多聚甲醛于室温固定细胞20min，PBS清洗3次，每次3min；加入0.5% Triton X-100(PBS稀释)室温进行细胞穿孔20min，PBS清洗3次，每次3min；使用3%BSA（PBS稀释）封闭30min，去除封闭液后PBS清洗3次，每次3min；加入稀释好的兔抗VWF多克隆抗体（稀释比1：400）、兔抗CD34多克隆抗体（稀释比1：200）、兔抗Claudin1多克隆抗体（稀释比1：200）、兔抗ZO-1多克隆抗体（稀释比1：200）和兔抗SV40T单克隆抗体（稀释比1：50）（一抗稀释液稀释，每个抗体2个复孔），4℃孵育过夜；将培养板用PBS清洗3次，每次3min；避光条件下进行二抗孵育步骤，在培养孔分别加入羊抗兔二抗和驴抗兔二抗（稀释比1：500）（PBS稀释），37℃避光孵育1h，PBS清洗3次，每次3min；加入5μg/mLDAPI染色液，室温避光孵育2min，对标本进行染核，PBS漂洗3次，每次3min；在荧光显微镜下观察；图2为视网膜微血管内皮细胞特异性蛋白VWF免疫荧光鉴定结果，其中图A是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞VWF绿色荧光，分布于细胞质中，图B是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞核蓝色荧光，将图A、B重叠得到图C，可见细胞质中均能检测到明显的VWF蛋白（放大倍数为目镜10×，物镜10×）；图3为视网膜微血管内皮细胞特异性蛋白CD34免疫荧光鉴定结果，其中图A是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞CD34绿色荧光，分布于细胞质中，图B是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞核蓝色荧光，将图A、B重叠得到图C，可见细胞质中均能检测到明显的CD34蛋白（放大倍数为目镜10×，物镜10×）；图4为视网膜微血管内皮细胞特异性蛋白Claudin1免疫荧光鉴定结果，其中图A是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞Claudin1绿色荧光，分布于细胞质中，图B是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞核蓝色荧光，将图A、B重叠得到图C，可见细胞质中均能检测到明显的Claudin1蛋白（放大倍数为目镜10×，物镜10×）；图5为视网膜微血管内皮细胞特异性蛋白ZO-1免疫荧光鉴定结果，其中图A是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞ZO-1绿色荧光，分布于细胞质中，图B是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞核蓝色荧光，将图A、B重叠得到图C，可见细胞质中均能检测到明显的ZO-1蛋白（放大倍数为目镜10×，物镜10×），说明所得细胞确为视网膜微血管内皮细胞；图6为皮肤永生化基因SV40T所编码蛋白的免疫荧光鉴定结果，其中图A是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞SV40T红色荧光，分布于细胞核处，图B是第52代树鼩视网膜微血管内皮细胞核蓝色荧光，将图A、B重叠得到图C，可见细胞核处均能检测到明显的SV40T蛋白，说明所得细胞成功转入了SV40T永生化基因（放大倍数为目镜10×，物镜10×）。
4.树鼩永生化视网膜微血管内皮细胞核型鉴定
取第52代细胞，吸弃原培养基，加入4mL 4℃预冷的终浓度为0.1-0.2mg/mL的秋水仙素（普通培养基配制），置于37℃、5%CO2培养箱中培养4h~6h，吸弃上清液，PBS清洗3次，每次5min，用0.25%胰蛋白酶消化细胞并转至15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入37℃预热的0.075M KCl溶液6mL，轻轻吹散细胞，室温低渗25min，期间若有沉淀时需要轻轻吹打，使细胞与KCl低渗液充分接触，1000rpm离心5min，弃上清，加入现配卡诺固定液（甲醇:冰醋酸体积比=3:1）6mL，固定5min后，沿管壁轻轻吹打，使沉淀的细胞翻转，固定5min后，轻轻吹散细胞，继续固定20min，1000rpm离心5min，弃上清，再次以6mL固定液以同样方式固定25min，1000rpm离心5min，弃去上清后重新加入3mL卡诺固定液，重悬细胞，取4℃预冷的载玻片，吸管吸取混匀的细胞液悬空30cm垂直滴3滴至载玻片上，斜靠载玻片流掉多余细胞液，自然风干12h，将载玻片放入染缸中，加入Giemsa染液染色2h，之后流水冲洗载玻片，自然风干12h后封片，在显微镜下用油镜观察，如图7，细胞的染色体数目为62条，与滇西亚种中缅树鼩的染色体数目完全一致，即验证了该永生化视网膜微血管内皮细胞为树鼩来源（放大倍数为物镜100×，油镜）。
综上，本发明方法可成功建立树鼩原代视网膜微血管内皮细胞及其永生化细胞株，以期成为眼科疾病相关细胞模型、视网膜血管病理模型的重要工具细胞，以及在视网膜新生血管增生、出血、动脉阻塞、黄斑变性等病变的研究中发挥价值，并且作为血视网膜屏障的重要组成部分，探究其在高血糖、氧化应激、炎症和缺氧等多种复杂因素作用下的机制。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
将树鼩原代视网膜微血管内皮细胞以2×105 cells/孔铺到细胞培养板中采用普通培养基在37℃、5%CO2条件下培养至细胞汇合度达到80%以上时，PBS清洗，然后加入含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，接着以MOI=30接种HBLV-SV40T-3xflag-PURO慢病毒为实验组，同时以未接种慢病毒的细胞作为对照组；在37℃、5%CO2条件下培养4h后，补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基，培养24h后将培养基更换为普通培养基继续培养24h，最后用含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基进行嘌呤霉素药物筛选，2天更换一次培养基，将培养基更换为含5μg/mL嘌呤霉素的普通培养基，直至对照组细胞完全死亡；之后采用普通培养基对实验组继续传代培养，即得到永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞系；
所述的普通培养基为含10%FBS和1%双抗的DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1所述的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，所述的树鼩原代视网膜微血管内皮细胞的获取方法为：
（1）取树鼩视网膜经PBS冲洗后，再用D-Hank液漂洗，加入完全培养基，并将其剪成1mm*1mm的碎片；弃掉培养基后加入1-3mg/mLⅡ型胶原酶和50-70U/mL DNase I于37℃下进行消化，后4℃离心弃上清；
（2）用完全培养基重悬细胞后，4℃离心弃上清，再采用1-3mg/mLⅡ型胶原酶、1-3mg/mL分散酶和50-70U/mL DNase I一起在37℃消化，室温下离心弃上清，用完全培养基漂洗细胞；
（3）用完全培养基重悬细胞后，置于37℃，5%CO2培养箱中培养；72h后弃掉一半培养基，补加新鲜完全培养基，继续培养；
（4）待细胞铺满瓶底时，用PBS清洗细胞，采取差速消化法，加入0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶，室温消化，待细胞变圆后吸弃胰蛋白酶，加入完全培养基反复吹打至变圆的视网膜微血管内皮细胞被吹打下来，即得；
其中，所述的培养基完全培养基为含有20%FBS、0.5-1.5%ECGs、3-5ng/mLVEGF、40-60mg/mL肝素和1%双抗的DMEM/F12培养基。
3.根据权利要求2所述的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，完全培养基的用量为1mL；1-3mg/mLⅡ型胶原酶和50-70U/mL DNase I的用量均为2mL；消化时间为1h，消化过程中每15分钟轻摇混匀一次；离心参数为1000rpm离心8min。
4.根据权利要求2所述的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，4℃离心参数为2000rpm离心10min；1-3mg/mLⅡ型胶原酶、1-3mg/mL分散酶、50-70U/mL DNase I的用量均为1mL；消化时间为30min；室温下离心参数为：1000rpm离心8min；用完全培养基漂洗后于1000rpm离心8min；漂洗次数为3次；
步骤（3）中，用2mL完全培养基重悬细胞；补加新鲜完全培养基的量为2mL；步骤（4）中，PBS清洗细胞次数为3次；0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶用量为500mL。
5.根据权利要求1所述的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，补加含4μg/mL聚凝胺的普通培养基的量为1mL；采用普通培养基对实验组继续传代培养时，先消化后再经有限稀释步骤后传代。
6.根据权利要求5所述的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，所述的先消化后再经有限稀释步骤具体为：
用0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温下消化，待镜下观察到有小型梭状、多角形样细胞皱缩变圆时加入普通培养基终止消化，并将其吹洗下来收集培养，然后用普通培养基将细胞按10倍稀释法稀释至10cells/mL的浓度接种后于37℃、5%CO2条件下培养，然后选取并标记由单个细胞增殖形成的单细胞群，待长至汇合率达80%以上时，弃去普通培养基，PBS清洗，用质量浓度0.25% trypsin-EDTA胰蛋白酶室温消化，镜下观察细胞待细胞变圆后，弃胰酶后加入普通培养基终止消化，采用普通培养基悬浮细胞后进行扩大培养。
7.根据权利要求6所述的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法，其特征在于，稀释至10cells/mL的浓度后接种于96孔板上，100μL/孔。
8.权利要求1-7任意一项所述的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法构建得到的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株。
9.权利要求1-7任意一项所述的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株的构建方法构建得到的永生化树鼩视网膜微血管内皮细胞株在药物筛选中的应用。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002088320A2 (en) * 2001-05-01 2002-11-07 University Of Florida Research Foundation Inc. rAAV-VECTORED RIBOZYME COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF RETINAL DISEASES
WO2003093479A1 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav expression systems and methods for enhancing transduction of mammalian neural cells
ITRM20040634A1 (it) * 2004-12-23 2005-03-23 Uni Degli Studi Di Roma Tor Vergata Cellule endoteliali immortalizzate.
WO2015015655A1 (ja) * 2013-07-30 2015-02-05 京都府公立大学法人 フックス角膜内皮ジストロフィ不死化細胞株およびその作製法
CN106939300A (zh) * 2017-04-26 2017-07-11 中国医学科学院医学生物学研究所 树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与应用
CN108486156A (zh) * 2018-01-15 2018-09-04 中国医学科学院医学生物学研究所 一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用
CN111249462A (zh) * 2015-05-08 2020-06-09 李玮 Scg3作为治疗靶标在制备治疗血管增生型或渗出型疾病的药物中的应用
CA3125605A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for promoting angiogenesis in the eye
CN113209000A (zh) * 2014-09-17 2021-08-06 盼光公司 用于药物递送和保护眼睛前段的眼用制剂
CN113637707A (zh) * 2021-08-09 2021-11-12 中国医学科学院医学生物学研究所 一种树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法
CN114149977A (zh) * 2021-12-09 2022-03-08 东南大学 一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法
CN115786237A (zh) * 2022-10-27 2023-03-14 中国医学科学院医学生物学研究所 一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2970891B1 (en) * 2013-03-15 2020-10-21 Miromatrix Medical Inc. Use of perfusion decellularized liver for islet cell recellularization

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002088320A2 (en) * 2001-05-01 2002-11-07 University Of Florida Research Foundation Inc. rAAV-VECTORED RIBOZYME COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF RETINAL DISEASES
WO2003093479A1 (en) * 2002-05-01 2003-11-13 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved raav expression systems and methods for enhancing transduction of mammalian neural cells
ITRM20040634A1 (it) * 2004-12-23 2005-03-23 Uni Degli Studi Di Roma Tor Vergata Cellule endoteliali immortalizzate.
WO2015015655A1 (ja) * 2013-07-30 2015-02-05 京都府公立大学法人 フックス角膜内皮ジストロフィ不死化細胞株およびその作製法
CN113209000A (zh) * 2014-09-17 2021-08-06 盼光公司 用于药物递送和保护眼睛前段的眼用制剂
CN111249462A (zh) * 2015-05-08 2020-06-09 李玮 Scg3作为治疗靶标在制备治疗血管增生型或渗出型疾病的药物中的应用
CN106939300A (zh) * 2017-04-26 2017-07-11 中国医学科学院医学生物学研究所 树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与应用
CN108486156A (zh) * 2018-01-15 2018-09-04 中国医学科学院医学生物学研究所 一种永生化树鼩小肠上皮细胞系及其构建方法与应用
CA3125605A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for promoting angiogenesis in the eye
CN113301915A (zh) * 2019-01-04 2021-08-24 加利福尼亚大学董事会 用于促进眼中的血管生成的组合物和方法
CN113637707A (zh) * 2021-08-09 2021-11-12 中国医学科学院医学生物学研究所 一种树鼩永生化皮肤成纤维细胞的建立方法
CN114149977A (zh) * 2021-12-09 2022-03-08 东南大学 一种小鼠肺微血管内皮细胞永生化以获得胞外囊泡的方法
CN115786237A (zh) * 2022-10-27 2023-03-14 中国医学科学院医学生物学研究所 一种自发永生化树鼩脑微血管内皮细胞系的建立方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘斌主编.《细胞培养》.世界图书出版公司,2018,第37-38页. *

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