KR20190037195A - 증진된 직접적인 심장 재프로그래밍 - Google Patents

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KR20190037195A
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디팩 스리바스타바
다메르 모하마드
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더 제이. 데이비드 글래드스톤 인스티튜트, 어 테스터멘터리 트러스트 이스타빌리쉬드 언더 더 윌 오브 제이. 데이비드 글래드스톤
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Abstract

본 개시내용은 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 심혈관 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 추가로 제공한다.

Description

증진된 직접적인 심장 재프로그래밍
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 3월 30일 출원된 미국 가출원 62/315,437, 및 2016년 8월 3일 출원된 미국 가출원 62/370,344에 대한 우선권을 주장하고, 상기 출원은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참조로 포함된다.
NIH 재정 지원에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)이 수여하는 보조금(Grant) HL 100406 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
본 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 세포 재프로그래밍(cell reprogramming) 및 세포 분화 분야에 관한 것이다.
하기 논의에서는 특정 물품 및 방법이 배경 및 도입 목적으로 기술될 것이다. 본원의 어떤 것도 선행 기술을 "인정하는 것"으로 해석되지 않아야 한다. 적용가능한 법률 조항하에 출원인은 적절할 경우, 본원에서 언급된 물품 및 방법이 선행 기술을 구성하지 않음을 입증할 수 있는 권리를 특별히 가진다.
심근 경색 (MI), 또는 심장 마비는 심장내 혈류 폐색에 의해 유발되며, 이는 산소 수준을 감소시키고, 조직을 손상시키며 (허혈), 거의 10억 개의 심근세포를 괴사에 이르게 할 수 있다 (문헌 [Burridge et al. (2012) Cell Stem Cell 10: 16-28]).
MI 후, 섬유모세포는 경색된 부위로 이동하고, 증식하고, 이로써, 전기 생리적으로 구동되는 심장 수축에 기여할 수 없는 심근세포가 고갈된 반흔이 생성된다. 종종 심부전이 뒤따라 발생하게 되고, 이는 피로감, 말초 부종을 초래하고, 심지어는 사망에 이르게 한다.
유도 심근세포 유사 마우스 세포 (iCM)를 최초로 성공적으로 생성한 이래로, 포유동물 세포에서 심장 재프로그래밍을 유도 또는 증진시키는 데 사용될 수 있는 유전자 조합이 확인되어 왔다 (문헌 [Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386]; [Christoforou et al. (2013) PLoS ONE 8:e63577]; [Addis et al. (2013) J. Mol . Cell Cardiol. 60:97-106]; [Jayawardena et al. (2012) Circ . Res. 110: 1465-1473]; [Nam Y et al., PNAS USA. 2013; 110:5588-5593]; [Wada R et al. PNAS USA. 2013; 110: 12667-12672]; 및 [Fu J et al., Stem Cell Reports. 2013; 1:235-247]. 재프로그래밍은 원래의 재프로그래밍 칵테일 중의, 인자 Gata4, Mef2C 및 Tbx5, Hand2, Nkx2.5, 미오카르딘(Myocardin), SRF, Mesp1, 또는 miR-133을 비롯한, 특정 핵심 전사 인자 (TF) 사용에 기초해 왔다. 더욱 최근에는, 시험관내에서 생성된 iCM의 품질 및 효율의 개선도 다소 이루어졌다 (문헌 [Wang et al. (2015) Circ . Res. 116:237-24]).
또한, 생체내 연구를 통해 재프로그래밍된 iCM도 제조되었다. 예를 들어, 생체내에서 심장 재프로그래밍 칵테일을 손상된 뮤린 심장 내로 도입하였을 때, 재프로그래밍된 iCM이 생성되었고, 심장 기능이 증가하였고, 손상 후의 반흔 크기는 감소되었다. 그러나, 심장 기능이 완전히 회복되지는 않았다 (문헌 [Jayawardena et al. (2012) Circ . Res. 110: 1465-1473]; [Qian et al (2012) Nature 485:593-598]). 심장 기능 및 반흔 크기는 Gata4, Mef2C 및 Tbx5로 개선되었고, 티모신 β4 및 VEGF를 통해 추가로 증진되었다 (문헌 [Bock-Marquette et al. (2004) Nature 432:466-472]; [Mathison et al. (2012) J. Am. Heart Assoc . 1:e005652]).
엄청난 노력에도 불구하고, 심부전에 효과적인 요법은 여전히 찾기 어려운 상태로 남아있다. 심장 병태 치료를 위한 더욱 우수한 치료적 접근법 개발에 이르게 할 수 있는 재프로그래밍 및 심장 세포 운명 전환 개선이 여전히 요구되고 있다. 본 발명에서는 이러한 요구를 다룬다.
본 발명의 요약
본 발명은 비-심근세포 포유동물 세포를 예컨대, 심근세포 또는 심근세포 유사 세포로 유도하는 개선된 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 세포를 인간 심장 세포, 예컨대, 인간 심근세포로 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 시험관내, 계내 및/또는 생체내에서 유도 심근세포가 효율적으로 생성될 수 있도록 허용하는 재프로그래밍 인자 및 도입된 작용제의 조합의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 유효량의 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및 하나 이상의 작용제를 비-심근세포에 투여하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 재프로그래밍 인자 및 작용제를 투여하여 유도 심근세포를 생성하는 단계는 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
구체적인 측면에서, 본 발명은 비-심근세포에 유효량의, WNT 활성을 억제시키는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 다른 구체적인 측면에서, 본 발명은 비-심근세포에 유효량의, WNT 활성을 억제시키는 작용제 및 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 추가의 다른 구체적인 측면에서, 본 발명은 비-심근세포에 유효량의, WNT 활성을 억제시키는 작용제 및 항염증제를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 관련된 측면에서, 생체내에서 유도 심근세포를 생성하기 위해 대상체에게 WNT 활성을 억제시키는 작용제를 투여하는 방법을 제공한다. 상기 작용제의 비제한적인 예로는 본원에 더욱 상세하게 기술된, WNT 활성의 소분자 억제제 및 WNT 활성의 siRNA 억제제를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 비-심근세포에 유효량의, TGF-β 활성을 억제시키는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 다른 구체적인 측면에서, 본 발명은 비-심근세포에 유효량의, TGF-β 활성을 억제시키는 작용제 및 적어도 하나의 재프로그래밍 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 추가의 다른 구체적인 측면에서, 본 발명은 비-심근세포에 유효량의, TGF-β 활성을 억제시키는 작용제 및 항염증제를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 관련된 측면에서, 생체내에서 유도 심근세포를 생성하기 위해 대상체에게 TGF-β 활성을 억제시키는 작용제를 투여하는 방법을 제공한다. 상기 작용제의 비제한적인 예로는 본원에 더욱 상세하게 기술된, TGF-β 활성의 소분자 억제제 및 TGF-β 활성의 siRNA 억제제를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 투여하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하기 위한 예시적 재프로그래밍 인자로는 예컨대, Baf60c, Esrrg, Gata4, Gata6, Hand2, Irx4, Isl1, Mef2c, Mesp1, Mesp2, 미오카르딘, Nkx2.5, SRF, Tbx5, Tbx20, Zfpm2, miR-133, 또는 그의 임의 조합을 포함한다.
특정 측면에서, WNT 억제제 및/또는 TGF-β 억제제는 소분자이다. 다른 특정 측면에서, WNT 억제제 및/또는 TGF-β 억제제는 각각 WNT 또는 TGF-β 신호전달 활성을 억제시키는 siRNA이다. WNT 억제제 및 TGF-β 억제제, 둘 모두 투여될 때, TGF-β 억제제는 WNT 억제제 투여 이전에, 또는 WNT 억제제 투여와 함께 동시에 투여될 수 있다.
사용되는 비-심근세포는 심근세포로 유도가능한 임의의 세포일 수 있다. 비제한적인 예로는 체세포, 심장 섬유모세포, 비-심장 섬유모세포, 심장 전구 세포, 및 줄기 세포를 포함한다. 구체적인 측면에서, 비-심근세포는 인간 세포이다.
구체적인 실시양태에서, 비-심근세포에 투여되는 재프로그래밍 인자로는 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5 (즉, GMT)를 포함한다. 다른 구체적인 실시양태에서, 비-심근세포에 투여되는 재프로그래밍 인자로는 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5 (즉, MMT)를 포함한다. 추가의 다른 구체적인 실시양태에서, 비-심근세포에 투여되는 재프로그래밍 인자로는 Gata4, Mef2c, Tbx5, 및 미오카르딘 (즉, 4F)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 재프로그래밍 인자로는 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5, Essrg, 미오카르딘, Zfpm2, 및 Mesp1 (즉, 7F)을 포함한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 비-심근세포에 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5 (즉, "GMT")를 포함하는 재프로그래밍 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 비-심근세포에 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5 (즉, "MMT")를 포함하는 재프로그래밍 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 또한 항염증제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
TGF-β 억제제 및 WNT 억제제는 대상체에게 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있고, 이는 또한 하나 이상의 재프로그래밍 인자 및/또는 항염증제와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 더욱 구체적인 측면에서, WNT 억제제 첨가 이전 제1 기간 동안 비-심근세포에 유효량의 TGF-β 억제제를 투여함으로써 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체적인 측면에서, WNT 억제제 첨가와 동시에 비-심근세포에 유효량의 TGF-β 억제제를 투여함으로써 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다.
구체적인 측면에서, 시험관내에서 비-심근세포를, Gata4, Mef2C 및 Tbx5와 조합하여 유효량의 TGF-β 억제제 및 유효량의 WNT 억제제와 함께 배양함으로써 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다. 다른 구체적인 측면에서, 시험관내에서 비-심근세포를, 미오카르딘, Mef2C 및 Tbx5와 조합하여 유효량의 TGF-β 억제제 및 유효량의 WNT 억제제와 함께 배양함으로써 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다.
구체적인 측면에서, 본 방법은 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 재프로그래밍 인자를 사용한다. 다른 구체적인 측면에서, 본 방법은 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 재프로그래밍 인자를 사용한다. 본 방법은 또한 대상체에게 유효량의, 스테로이드성 항염증성 약물, 예컨대, 코르티코스테로이드 (예컨대, 덱사메타손) 또는 비-스테로이드성 항염증성 약물 (NSAID)을 포함하는, 항염증성 분자를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
WNT 억제제, TGF-β 억제제, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 사용하는 것 이외에도, 비-심근세포의 심근세포 또는 심근세포 유사 세포로의 유도 효율을 증가시키기 위해 코르티코스테로이드 (예컨대, 덱사메타손)를 비-심근세포에 투여할 수 있다.
본 발명은 심혈관 질환을 치료하는 다양한 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 본 개시내용은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 WNT 억제제를 투여하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 개시내용은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 TGF-β 억제제를 투여하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 측면에서, 본 개시내용은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 WNT 억제제 및 유효량의 TGF-β 억제제를 투여하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
따라서, 또 다른 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 측면에서, WNT 억제제 및/또는 TGF-β 억제제는 소분자일 수 있다. 본 발명의 다른 측면에서, WNT 억제제 및/또는 TGF-β 억제제는 siRNA 분자일 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 투여될 수 있는 재프로그래밍 인자로는 예컨대, Baf60c, Esrrg, Gata4, Gata6, Hand2, Irx4, Isl1, Mef2c, Mesp1, Mesp2, 미오카르딘, Nkx2.5, SRF, Tbx5, Tbx20, Zfpm2, miR-133, 또는 그의 임의 조합을 포함한다. 바람직한 측면에서, 비-심근세포에 재프로그래밍 인자, 예컨대, Baf60c, Esrrg, Gata4, Gata6, Hand2, Irx4, Isl1, Mef2c, Mesp1, Mesp2, 미오카르딘, Nkx2.5, SRF, Tbx5, Tbx20, Zfpm2, miR-133, 또는 그의 임의 조합의 다른 조합의 투여와 함께 조합하여 유효량의 TGF-β 억제제 및 유효량의 WNT 억제제를 투여함으로써 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다.
구체적인 측면에서, 심혈관 질환을 치료하는 방법은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 재프로그래밍 칵테일 GMT와 함께 유효량의 WNT 억제제 및 유효량의 TGF-β 억제제를 투여하여 대상체 중 생체내에서 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함한다. 다른 구체적인 측면에서, 심혈관 질환을 치료하는 방법은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 재프로그래밍 칵테일 MMT와 함께 유효량의 WNT 억제제 및 유효량의 TGF-β 억제제를 투여하여 대상체 중 생체내에서 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 유도 심근세포를 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 단리된 유도 심근세포의 집단 및 담체, 임의적으로, 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 안정제 및/또는 보존제를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-심근세포는 WNT 억제제의 첨가 이전에 TGF-β 억제제의 존재하에서 일정 기간 동안, 예를 들어, WNT 억제제의 첨가 이전에 약 6시간 내지 약 72시간 동안 배양된다. 한 바람직한 실시양태에서, 비-심근세포는 WNT 억제제의 첨가 이전에 약 24시간 동안 TGF-β 억제제의 존재하에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 비-심근세포는 일정 기간 동안 동시에 TGF-β 억제제 및 WNT 억제제의 존재하에서 배양된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은, 유도 심근세포가 자연적으로 발생된 심근세포보다 더 높은 수준으로, 또는 더 낮은 수준으로 적어도 하나의 심장 유전자를 발현하는 것인, 본 발명의 방법에 따라 생성된 단리된 유도 심근세포를 제공한다. 특정 측면에서, 유도 심근세포의 실질적으로 균질한 집단이 생성된다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 균질한 집단 중의 유도 심근세포는 자연적으로 발생된 심근세포보다 더 높은 수준으로, 또는 더 낮은 수준으로 적어도 하나의 심장 유전자를 발현한다.
본 발명의 특정 측면은 단리된 유도 심근세포의 집단을 포함하는 조성물 제조를 포함한다. 상기 조성물은 예컨대, 담체, 제약상 허용되는 부형제, 안정제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적인 측면에서, 조성물은 단리된 유도 심근세포의 실질적으로 균질한 집단을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 비-심근세포에 TGF-β 억제제를 투여한 후, 세포에 TGF-β 활성인자를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-심근세포는 체세포, 심장 섬유모세포, 비-심장 섬유모세포, 심장 전구 세포, 및 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비-심근세포는 포유동물 비-심근세포이다. 바람직한 실시양태에서, 비-심근세포는 인간 비-심근세포이다.
일부 실시양태에서, 재프로그래밍 인자 도입 후 약 12시간 내지 약 36시간째에 비-심근세포를 먼저 TGF-β 억제제와 접촉시킨다. 다른 실시양태에서, 재프로그래밍 인자 도입 후 약 24시간 내지 약 72시간째에 비-심근세포를 먼저 WNT 억제제와 접촉시킨다.
일부 실시양태에서, WNT 억제제는 XAV939, D4476, IWR1, 및 미리세틴으로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, WNT 억제제는 WNT, 또는 WNT 신호전달 경로의 구성원에 대한 siRNA이다.
일부 실시양태에서, TGF-β 억제제는 SB431542, D4476, LDN-193189, 덱사메타손, 및 LY364947로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, TGF-β 억제제는 TGF-β, 또는 TGF-β 신호전달 경로의 구성원에 대한 siRNA이다.
일부 실시양태에서, WNT 억제제 및/또는 TGF-β 억제제는 각각 WNT 및/또는 TGF-β 경로의 활성을 억제시키는 siRNA 분자이다.
일부 실시양태에서, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두는 재프로그래밍 10일째에 제거된다.
일부 실시양태에서, TGF-β 억제제는 대상체에게 WNT 억제제의 투여 이전 일정 기간 동안, 예를 들어, WNT 억제제 투여 이전에 약 6시간 내지 약 72시간 동안 투여된다. 한 바람직한 실시양태에서, 대상체는 WNT 억제제 투여 이전에 약 24시간 동안 TGF-β 억제제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 일정 기간 동안 TGF-β 억제제 및 WNT 억제제를 동시에 투여받는다.
일부 실시양태에서, TGF-β 억제제는 대상체에게 재프로그래밍 인자 도입 후 약 12시간 내지 약 36시간째 투여된다. 다른 실시양태에서, WNT 억제제는 대상체에게 재프로그래밍 인자 도입 후 약 24시간 내지 약 72시간째 투여된다.
본 발명의 상기 측면 및 다른 특징은 하기에서 더욱 상세하게 기술된다. 당업자는 단지 통상의 실험 사용만으로도 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태의 다수의 등가물을 이해하거나, 또는 그를 확인할 수 있을 것이다. 상기 등가물은 하기 개시내용 및 특허청구범위에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
도 1은 Thy 1+ 마우스 심장 섬유모세포에서 α-MHC-GFP 리포터를 사용하여 직접적인 심장 재프로그래밍에서의 WNT 및 TGF-β 신호전달 장벽을 입증하는 약물 스크리닝 전략법에 대한 개략도이다.
도 2는 도 1의 약물 스크리닝 전략법을 사용하여 확인된 5,500개의 화합물에 대한 Z 점수 플롯이고, 이는 Z 점수가 5 초과인 상위 히트를 보여준다.
도 3은 도 1의 약물 스크리닝 전략법을 사용하여 입증된 히트의 효율을 보여주는 막대 그래프이고, 여기서, 상기 히트 중 7개는 TGF-β 또는 WNT를 억제시킨다 (n=3).
도 4는 상이한 투여량의 SB431542가 GMT의 재프로그래밍 효율에 미치는 효과의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다 (n=2 독립 실험, *p<0.05).
도 5는 상이한 시점에서의 SB431542 첨가가 GMT의 재프로그래밍 효율에 미치는 효과의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다 (n=2 독립 실험, *p<0.05).
도 6은 상이한 시점에서의 XAV939 첨가가 GMT의 재프로그래밍 효율에 미치는 효과의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다 (n=2 독립 실험, *p<0.05).
도 7은 단독, 또는 SB431542의 존재 또는 부재하에서의 상이한 투여량의 XAV939가 GMT의 재프로그래밍 효율에 미치는 효과의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다 (n=2 독립 실험, *p<0.05).
도 8은 1일째 첨가된 SB431542와 함께 상이한 투여량의 XAV939가 GMT의 재프로그래밍 효율에 미치는 효과의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다 (n=2 독립 실험, *p<0.05).
도 9는 명시된 시점 (일째)에 GMT로 재프로그래밍하였을 때, GMTc 형질도입된 섬유모세포로부터 SB431542 및 XAV939를 제거한 시간적 처리 과정을 보여주는 막대 그래프이다.
도 10은 재프로그래밍에 대한 리포터로서 αMHC-GFP를 사용한, TGF-β 억제제 SB431542 및 WNT 억제제 XAV939와 함께 수행된 재프로그래밍 2주 후의 GFP+ iCM에 대한 대표적인 FACS 플롯이다.
도 11은 재프로그래밍 8주에 걸쳐 자발적 칼슘 과도 상태를 보인 iCM의 비율(%)의 정량화를 보여주는 것이다 (n=200 세포가 2회의 독립 실험으로부터 각 시점에 분석됨, GMT 대비 *p<0.05).
도 12는 GMT 재프로그래밍된 섬유모세포가 섬유모세포와 심근세포 사이의 중간 상태임을 보여주는 주성분 분석 플롯이다.
도 13은 5주째 GMT iCM과 GMTc iCM 사이의 상위의 차별적으로 발현된 유전자를 보여주는 막대 그래프이다.
도 14는 재프로그래밍 동안 도입된 과도한 TGFβ1 (TGF-β) 리간드는 SB431542 (TGFβi)의 효과를 역전시켰고; BMP4 및 액티빈은 어떤 유의적인 효과도 없었다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 15는 구성적으로 활성을 띠는 SMAD2 또는 SMAD3의 과다발현은 SB431542 (TGFβi)에 의한 심장 재프로그래밍 증진을 무효화시켰다는 것을 보여주는 막대 그래프이다 (n=3, *p<0.05).
도 16은 ALK4 또는 ALK5 수용체의 넉 다운은, SB431542 하의 재프로그래밍 효율에는 영향을 미치지 않으면서, SB431542 (TGFβi)의 것과 유사한 정도로 심장 재프로그래밍을 증진시켰다는 것을 보여주는 막대 그래프이다 (n=3, *p<0.05).
도 17은 글리코겐 신타제 키나제 3 베타 (GSK3β) 억제제 CHIR99021이 SB431542 (TGFβi) 및 XAV939 (WNTi)의 효과를 크게 역전시켰고; WNT5 또는 WNT11을 통한 비정규 WNT 경로 활성화는 단지 미미한 영향을 미칠 뿐이었다 (n=3, *p<0.05).
도 18은 1, 2, 4, 8 및 12주째 실험 동안 심장초음파검사에 의해 사정된 바, 박출률 (ΔEF) 변화로 입증된 바와 같이, SB431542 및 XAV939가 GMT에 의한 생체내 재프로그래밍을 증진시킨다는 것을 보여주는 선 그래프이다.
도 19는 박출량 (SV), 박출률 (EF), 심박출량 (CO), 및 반흔 크기는 GMT로 처리된 마우스 및 대조군 마우스 (dsRed 또는 dsRedc)와 비교하였을 때, GMTc로 처리된 마우스에서 유의적으로 개선되었다는 것을 보여주는 막대 그래프 시리즈이다.
도 20은 섬유모세포에서 심근세포로의 세포 운명 전환을 추적하기 위한, ROSA-YFP/페리오스틴 Cre 마우스를 이용한 계통 추적에 관한 개략도이다.
도 21은 GMT 및 GMTc를 사용한 다중 심장 절편에서의 생체내 재프로그래밍된 iCM 개수의 증가 배수의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다 (각 군당 동물 n=5, *p<0.05).
도 22는 RNA-seq에 의해 사정된, 섬유모세포, 신생 마우스 심근세포 (CM), 생체내 GMT iCM (GMT), 생체내 GMTc iCM (GMTc), 및 성체 심실 심근세포의 전체 트랜스크립톰에 대한 주성분 분석 (PCA) 플롯이다.
도 23은 생체내 GMT iCM과 GMTc iCM 사이에 차별적으로 발현된 유전자에 대한 상위 GO 용어에 대한 막대 그래프이다.
도 24는 플록스된(Floxed) T-항원을 사용하여 인간 심장 섬유모세포의 세포주를 생성하기 위한 전략법을 나타낸 개략적 대표도이다.
도 25는 리포터로서의 TNT-GCaMP, 및 αMHC 항체 염색을 사용하여 SB431542 및 XAV939하의 성인 인간 심장 섬유모세포 재프로그래밍의 효율을 보여주는 대표적인 FACS 플롯 및 정량화를 나타낸 것이다.
도 26은 재프로그래밍 3주 이내의 자발적 칼슘 과도 상태 (상단 패널), 및 재프로그래밍 2, 4, 6, 및 8주째 자발적 칼슘 과도 상태를 보인 세포의 비율(%) 정량화 (하단 패널)를 보여주는 것이다 (각 군당 n=100 세포, *p<0.05).
도 27은 인간 심장 섬유모세포, 7F 재프로그래밍된 iCM, 또는 7Fc 재프로그래밍된 iCM의 RNAseq로부터의 완전한 유전자 발현 프로파일에 대한 주성분 분석 (PCA) 플롯을 보여주는 것이다.
도 28은 생체내 7F iCM 및 7Fc iCM 사이에서 차별적으로 발현된 유전자에 대한 상위 유전자 온톨로지 용어 (GO) 주석에 대한 막대 그래프이다.
도 29는 B431542 및 XAV939, 및 4개 인자 (Gata4, Mef2c, Tbx5, 및 미오카르딘) (4Fc)로 인간 섬유모세포 재프로그래밍이 일어났다는 것을 입증하는 대표적인 FACS 플롯을 보여주는 것이다.
도 30은 SB431542 및 XAV939, 및 4개 인자 (Gata4, Mef2c, Tbx5, 및 미오카르딘) (4Fc)로 인간 섬유모세포 재프로그래밍이 일어났다는 것을 입증하는 막대 그래프이다.
도 31은 GMT 및 GMTc를 사용한 다중 심장 절편에서의 생체내 재프로그래밍된 iCM 개수의 증가 배수의 정량화를 보여주는 막대 그래프이다 (각 군당 동물 n=5, *p<0.05).
도 32는 WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두로서 siRNA 분자를 사용하였을 때의 MMT 재프로그래밍의 효율을 보여주는 막대 그래프이다.
본 발명은 기술된 특정 실시양태로 제한되는 것이 아니며, 따라서, 본 발명은 당연히 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 본 발명의 범주는 단지 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되는 바, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기술하고자 하는 것을 목적으로 하며, 제한하려는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
본 개시내용의 상세한 설명은 단지 독자의 편의를 위해서 다양한 섹션으로 나누어진 것이며, 임의 섹션에서 찾아볼 수 있는 개시내용은 또 다른 섹션의 것과 조합될 수 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 임의의 방법 및 물질도 또한 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수는 있지만, 이제 바람직한 방법 및 물질을 기술한다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌은 공개문헌이 인용된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시하고, 기술하기 위해 참조로 포함된다.
달리 명시되지 않는 한, 본 개시내용의 실시는 당업계의 기술 범위 내에 있는, 조직 배양, 면역학, 분자 생물학, 세포 생물학, 및 재조합 DNA의 종래 기술을 이용할 것이다. 예컨대, 문헌 [Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition]; 시리즈 [Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology]; 시리즈 [Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; [MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)]; [MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach]; [Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual]; [Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition]; [Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis]; 미국 특허 번호 4,683, 195; [Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization]; [Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation]; [IRL Press (1986) Immobilized Cells and Enzymes; Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning]; [Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)]; [Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells]; [Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cells and Molecular Biology (Academic Press, London)]; [Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology]; [Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition (2002) Cold Spring Harbor Laboratory Press]; [Sohail (2004) Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press)]; [Sell (2013) Stem Cells Handbook]을 참조한다.
문맥상 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기술된 본 발명의 다양한 특징들은 임의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다. 더욱이, 본 개시내용은 또한 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제되거나, 또는 생략될 수 있다는 것을 고려한다. 예시하기 위해, 본 명세서에서 복합체가 성분 A, B 및 C를 포함한다고 언급하였다면, 이는 A, B 또는 C 중 임의의 것, 또는 그의 조합은 단독으로, 또는 임의 조합으로 생략될 수 있고, 권리가 포기될 수 있는 것으로 구체적으로 의도된다.
범위를 포함하는, 모든 수적 지정값, 예컨대, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 적절하게, 1.0 또는 0.1의 증분량만큼, 또는 대안적으로, +/- 15%, 또는 대안적으로 10%, 또는 대안적으로 5%, 또는 대안적으로 2%의 편차만큼 다양한 근사치이다. 비록 항상 명확하게 언급되는 것은 아니지만, 모든 수적 지정값 앞에는 "약"이라는 용어가 선행함을 이해하여야 한다. 상기 범위 포맷은 편의상 및 간결하게 하기 위해 사용되는 것이며, 유연적으로, 범위로 한계로서 명확하게 언급된 수치값을 포함할 뿐만 아니라, 마치 각 수치값 및 하위 범위가 명확하게 언급된 것처럼 상기 범위 내에 포함된 모든 개별 수치값 또는 하위 범위를 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 약 1 내지 약 200인 범위의 비는 약 1 및 약 200이라고 명확하게 언급된 한게를 포함할 뿐만 아니라, 비, 예컨대, 약 2, 약 3, 및 약 4, 및 하위 범위, 예컨대, 약 10 내지 약 50, 약 20 내지 약 100 등도 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 비록 항상 명확하게 언급되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 시약은 단지 예시적인 것이고, 상기 시약의 등가물은 당업계에 공지되어 있다는 것도 이해하여야 한다.
본원에서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 명시되지 않는 한, 복수 개의 지시 대상을 포함한다는 것에 주의하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "심근세포"라고 언급하는 것은 복수 개의 심근세포를 포함한다.
정의
본원에서 사용된 용어는 당업계의 숙련가가 이해하는 것과 같은 평이한 보통의 의미를 가지는 것으로 의도된다. 하기 정의는 본 발명에 관한 독자의 이해를 돕기 위한 것으로 의도되지만, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 상기 용어의 의미를 달리하거나, 또는 다르게는, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
측정가능한 값, 예컨대, 양 또는 농도 등을 언급할 때, 본원에서 사용되는 "약"이라는 용어는 언급된 양의 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 또는 심지어는 0.1%의 편차를 포함한다는 것을 의미한다.
"본원에 개시된, 임의 성분, 범위, 용량 형태 선택을 기술하기 위해 사용되었을 때, "허용되는," "효과적인," 또는 "충분한"이라는 용어는 상기 성분, 범위, 용량 형태 등이 개시된 목적에 적합하다는 것으로 의도한다.
또한, 본원에서 사용되는 바, "및/또는"이라는 것은 연관된 열거된 항목 중 하나 이상의 것의 임의의 모든 가능한 조합 뿐만 아니라, 대안으로 해석될 때 ("또는") 조합은 없는 것을 지칭하고, 그를 포함한다.
"투여," "투여하는"이라는 것 등은 본 발명의 조성물과 연결하여 사용될 때, 시험관내에서의 비-심근세포에의 투여, 생체내에서의 비-심근세포에의 투여, 전문 의료진에 의한 대상체에게로의 투여 또는 대상체에 의해 자가 투여일 수 있는 직접 투여 및/또는 본 발명의 조성물의 처방 조치일 수 있는 간접 투여, 둘 모두를 지칭한다. 세포와 관련하여 본원에서 사용될 때, 투여란, 조성물을 세포에 도입시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 당업자에 의해 결정될 수 있는 양인 유효량으로 투여된다. 임의의 투여 방법이 사용될 수 있다. 소분자는 예를 들어, 소분자의 세포 배양 배지에의 첨가, 또는 심장 손상 부위로의 생체내 주사에 의해 세포에 투여될 수 있다. 대상체에게로의 투여는 예를 들어, 정맥내 주사, 심근내 전달 등에 의해 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "심장 세포"라는 용어는 예컨대, 심장 수축 또는 혈액 공급과 같은 심장 기능을 제공하거나, 또는 심장 구조를 유지시키는 역할을 하는, 심장 내에 존재하는 임의의 세포를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바, 심장 세포는 심장의 심외막, 심근 또는 심내막에 존재하는 세포를 포함한다. 심장 세포로는 또한 예를 들어, 심장 근육 세포 또는 심근세포, 및 심장 혈관구조의 세포, 예컨대, 관상동맥 동맥 또는 정맥의 세포를 포함한다. 심장 세포의 다른 비제한적인 예로는 상피 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 심장 줄기 세포 또는 전구 세포, 심장 근육을 구성하는 심장 전도 세포 및 심장 심박조율 세포, 혈관 및 구조를 지지하는 심장 세포를 포함한다. 심장 세포는 예를 들어, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포를 비롯한, 줄기 세포로부터 유래된 것일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "심근세포" 또는 "심근세포들"이라는 용어는 골격근 세포와 대조적으로, 자연적으로 포유동물 심장에서 발견되는 근절 함유 횡문근 세포를 지칭한다. 심근세포는 분화된 분자, 예컨대, 단백질, 예컨대, 미오신 중쇄, 미오신 경쇄, 심장 α-액티닌의 발현을 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 바, "심근세포"라는 용어는 임의의 심근세포 하위집단 또는 심근세포 하위유형, 예컨대, 심방, 심실 및 심방조율기 심근세포를 포함하는 포괄적 용어이다.
"심근세포 유사 세포"라는 용어는 심근세포와 특징을 공유하지만, 모든 특징을 공유할 수는 없는 세포를 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 심근세포 유사 세포는 특정 심장 유전자 발현에 있어 심근세포와 상이할 수 있다.
"배양" 또는 "세포 배양"이라는 용어는 인공, 시험관내 환경에서 세포를 유지시키는 것을 의미한다. "세포 배양 시스템"은 본원에서 세포 집단이 단일층으로서 또는 현탁액 중에서 성장될 수 있는 배양 조건을 지칭하는 것으로 사용된다. "배양 배지"는 본원에서 세포의 배양, 성장, 또는 증식을 위한 영양액을 지칭하는 것으로 사용된다. 배양 배지는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 세포를 특정 상태 (예컨대, 만능 상태, 휴지 상태 등)로 유지시킬 수 있거나, 세포를 성숙화시킬 수 있거나 - 일부 경우에서, 구체적으로, 전구 세포의 특정 계통의 세포 (예컨대, 심근세포)로의 분화를 촉진시킬 수 있는 능력과 같은 기능적 특성을 특징으로 할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그의 조합으로 이루어진 조성물과 관련하여 "유효량"이라는 용어는 유도 심근세포를 생성하는 데 충분한 양이다. 비-심근세포는, 유도 심근세포를 생성하는 데 효과적인 양의, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그의 조합으로 이루어진 조성물과 접촉된다. 그를 필요로 하는 대상체에게로의 투여와 관련하여 본원에서 사용될 때, "효과적인 양" 또는 "유효량"이란, 심혈관 질환을 치료하는, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그의 조합으로 이루어진 조성물, 또는 유도 심근세포의 양을 의미한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 1회 이상의 적용 또는 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 상기 전달은 개별 투여 단위가 사용되는 기간, 조성물의 생체이용성, 투여 경로 등을 비롯한, 다수의 변수에 의존한다. 그러나, 임의의 특정 대상체를 위한 조성물 (WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그의 조합으로 이루어진 조성물, 또는 유도 심근세포)의 구체적인 양은 사용되는 특정 작용제의 활성, 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별 및 섭식, 투여 시간, 배설률, 조성물 조합, 치료되는 특정 심혈관 질환의 중증도 및 투여 형태를 비롯한, 다양한 인자에 의존함을 이해한다.
본원에서 사용되는 바, "발현" 또는 "발현하다"라는 용어는 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 프로세스, 및/또는 이어서, 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된 것이라면, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 유전자의 발현 수준은 세포 또는 조직 샘플 중 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 추가로, 다중 유전자의 발현 수준을 측정하여 특정 샘플에 대한 발현 프로파일을 확립할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 발현 수준과 관련하여 "더 낮은 수준"이라는 용어는 자연적으로 발생된 심근세포 대조군 샘플 중의 양보다 더 적은 양인 유도 심근세포 중의 양을 지칭한다. 발현 수준과 관련하여 "더 높은 수준"이라는 용어는 자연적으로 발생된 심근세포 대조군 샘플 중의 양보다 더 적은 양인 유도 심근세포 중의 양을 지칭한다.
"유도 심근세포"라는 용어는 심근세포 (및/또는 심근세포 유사 세포)로 형질전환된 비-심근세포 (및 그의 자손)를 지칭한다. 본 개시내용의 방법은 예를 들어, 다른 기술을 증진시키기 위해 유도 심근세포를 생성하는 것으로서 현재 공지되어 있거나, 또는 추후에 발견될 임의의 방법과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그의 조합으로 이루어진 조성물은 직접적인 재프로그래밍 기술과 함께 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "억제제"라는 용어는 표적 분자 또는 신호전달 경로의 발현, 기능, 활성 등을 억제시킬 수 있는 능력을 가진 작용제를 지칭한다. 본 발명의 억제제로는 소분자, siRNA, 안티센스 RNA, 단백질, 펩티드, 압타머, 항체 및 그의 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바, 세포와 관련하여 "단리된"이라는 용어는 세포가, 세포가 자연적으로 존재하는 환경, 예컨대, 세포가 자연적으로 다세포 유기체 중에 존재하는 환경과 상이한 환경에 존재하고, 세포가 다세포 유기체로부터 제거된 상태라면, 세포는 "단리된" 것임을 지칭한다. 예를 들어, 단리된 세포는 표현형 또는 유전자형이 다른 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다.
본원에서 사용되는 바, "비-심근세포"라는 용어는 본원에서 정의 및 사용되는 바와 같은 "심근세포"의 기준을 이행하지 못하는 세포 제제 중의 임의의 세포 또는 세포 집단을 지칭한다. 비-심근세포의 비제한적인 예로는 체세포, 심장 섬유모세포, 비-심장 섬유모세포, 심장 전구 세포, 및 줄기 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는"이라는 어구는, 상기 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태가 타당한 의학적 판단 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 이익/위험 비에 상응하여 인간 및 동물의 조직과의 접촉 사용에 적합하다는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 손상된 심장 조직과 관련하여 "재생하다," "재생"이라는 용어 등은 그의 일반적인 의미로 제공되어야 하고, 이는 또한 손상된, 예를 들어, 허혈, 경색, 재관류, 또는 다른 질환에 기인하여 손상된 심장 또는 심장 조직 중에서의 새로운 심장 조직의 성장 및/또는 발생 프로세스를 지칭하여야 한다. 심장 조직 재생은 심근세포의 재생을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "재프로그래밍"은 전환분화, 탈분화 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "재프로그래밍 효율"이라는 용어는 샘플 중 세포 총 개수 대비 심근세포로 성공적으로 재프로그래밍된 샘플 중 세포의 개수를 지칭한다. 재프로그래밍 효율은 심근세포 마커의 함수로서 측정될 수 있다. 상기 만능성 마커로는 심근세포 마커 단백질 및 mRNA의 발현, 심근세포 형태 및 전기생리적 표현형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 심근세포 마커의 비제한적인 예로는 α-사르코글리칸, 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP), 골 형성 단백질 4 (BMP4), 코넥신 37, 코넥신 40, 크립토, 데스민, GATA4, GATA6, MEF2C, MYH6, 미오신 중쇄, NKX2.5, TBX5, 및 트로포닌 T를 포함한다. 일부 측면에서, 재프로그래밍 효율은 대조군 대비 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 1배, 1.1배, 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 50배, 100배 이상만큼 더 높게 증가된다. 적절한 대조군의 비제한적인 예로는 재프로그래밍 인자의 존재 또는 부재하의 유효량의 WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그의 임의 조합에 노출되지 않은 샘플을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "재프로그래밍 인자"라는 용어는 세포의 유도 심근세포로의 재프로그래밍을 지원하는, 세포에서의 발현을 위해 도입된 인자를 포함한다. 재프로그래밍 인자로는 전사 인자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"줄기 세포"라는 용어는 자가 재생할 수 있고, 분화된 자손을 생성할 수 있는 능력을 가진 세포를 지칭한다. "만능 줄기 세포"라는 용어는 3개의 배엽층 모두 (내배엽, 중배엽 및 외배엽)의 세포를 생성할 수 있지만, 완전한 유기체를 생성할 수 있는 능력은 없는 줄기 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "대상체"라는 용어는 포유동물, 바람직하게, 인간을 지칭하고, 비-인간 영장류, 뮤린 (즉, 마우스 및 래트), 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. "대상체" 및 "환자"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
"형질전환 성장 인자 베타," "TGF-β"라는 용어 및 그의 동의어는 형질전환 성장 인자 β (TGFβ) 슈퍼패밀리의 하위패밀리에 속하는 TGFβ 분비 단백질 중 임의의 것을 지칭한다. TGFβ (TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3)는 다수의 세포 유형에서 증식, 분화, 부착, 및 이주를 조절하는 다기능성 펩티드이다. 성숙한 펩티드는 동종이량체로서, 또는 다른 TGFβ 패밀리 구성원과의 이종이량체로서 발견될 수 있다. TGFβ는 세포 표면 상의 형질전환 성장 인자 베타 수용체 (TGF-β R, 또는 TGFβR)와 상호작용하고, 결합은 MAP 키나제-, Akt-, Rho- 및 Rac/cdc42-유도 신호 전달 경로, 세포 구조의 재조직화 및 SMAD 단백질의 핵 국재화, 및 표적 유전 전사 조절을 활성화시킨다. TGFβ 신호전달의 억제제는 예를 들어, TGFβ 또는 TGFβ 수용체에의 결합에 대한 경쟁 결합 검정법, 또는 기능성 검정법, 예컨대, 당업계에 널리 공지된 바와 같은, 하류 신호전달 단백질, 예컨대, MAPK, Akt, Rho, Rac, 및 SMAD, 예컨대, AR-Smad 등의 활성 억제를 측정하는 것과 같은 다수의 방법들 중 임의의 방법에 의해 당업계의 숙련가에 의해 쉽게 확인될 수 있다.
"치료," "치료하는," 및 "치료하다"란, 질환, 장애, 또는 병태 및/또는 그의 증상의 유해한 또는 임의의 다른 원치않는 효과를 감소시키거나, 또는 호전시키는 작용제를 이용하여 질환, 장애, 또는 병태에 영향을 주는 것으로서 정의된다. 본원에서 사용되는 바, "치료"는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료를 포괄하고, 심혈관 질환, 예를 들어, 심부전, 심근 허혈, 저산소증, 뇌졸중, 심근 경색 및 만성 허혈성 심장 질환의 치료를 포함한다. 병태 또는 치료를 필요로 하는 대상체를 "치료하는," 또는 병태 또는 치료를 필요로 하는 대상체의 "치료"란, (1) 예컨대, 증상 감소와 같은 임상적 결과를 비롯한, 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 조치를 취하거나; (2) 질환을 예방하거나, 예를 들어, 질환에 잘 걸릴 수 있지만, 아직 질환의 증상을 경험하지 않았거나, 보이지 않은 환자에서 질환의 임상적 증상이 발생하지 않게 하거나; (3) 질환을 억제시키거나, 예를 들어, 질환 또는 그의 임상적 증상의 발생을 정지 또는 감소시키거나; (4) 질환을 완화시키거나, 예를 들어, 질환 또는 그의 임상적 증상 퇴행시키거나; 또는 (5) 질환을 지연시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익한 또는 원하는 임상적 결과로는 유도 심근세포를 생성하는 것 및/또는 심근 재생을 촉진시키는 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"WNT"라는 용어는 배발생 및 성숙한 조직, 둘 모두에서 중요한 역할을 하는 고도로 보존되는 분비된 신호전달 분자의 패밀리를 포함한다는 것을 의미한다. 인간 WNT 유전자 패밀리는 적어도 19개의 구성원 (WNT-1, WNT-2, WNT-2B/WNT-13, WNT-3, WNT3a, WNT-4, WNT-5A, WNT-5B, WNT-6, WNT-7A, WNT-7B, WNT-8A, WNT-8B, WNT-9A/WNT-14, WNT-9B/WNT-15 , WNT-10A, WNT-10B, WNT-11, WNT-16)을 가진다. WNT 단백질은 프리즐드(Frizzled: Fz) 패밀리의 단백질로부터의 폴리펩티드, 및 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR) 관련 단백질 (LRP) 패밀리의 단백질을 포함하는 WNT 수용체 복합체에 결합함으로써 세포 활성을 조절한다. WNT 결합에 의해 일단 활성화되고 나면, WNT 수용체 복합체는 하나 이상의 세포내 신호전달 캐스케이드를 활성화시킬 것이다. 이는 정규 WNT 신호전달 경로; WNT/평면 세포 극성 (WNT/PCP) 경로; 및 WNT-칼슘 (WNT/Ca2+) 경로를 포함한다.
재프로그래밍 방법
비-심근세포 세포는 시험관내 또는 생체내에서 당업자에게 이용가능한 임의의 방법을 사용하여 심근세포 세포로 분화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386]; [Christoforou et al. (2013) PLoS ONE 8:e63577]; [Addis et al. (2013) J. Mol . Cell Cardiol . 60:97-106]; [Jayawardena et al. (2012) Circ . Res. 110: 1465-1473]; [Nam Y et al., PNAS USA. 2013; 110:5588-5593]; [Wada R et al. PNAS USA. 2013; 110: 12667-12672]; 및 [Fu J et al., Stem Cell Reports. 2013; 1:235-247]에 기술된 방법을 참조한다.
일부 실시양태에서, 사용되는 재프로그래밍 인자는 Baf60c, Esrrg, Gata4, Gata6, Hand2, Irx4, Isl1, Mef2c, Mesp1, Mesp2, 미오카르딘, Nkx2.5, SRF, Tbx5, Tbx20, Zfpm2, miR-133, 또는 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 열거된 재프로그래밍 인자 중 하나 이상의 것은 명백하게 배제된다.
일부 실시양태에서, 사용되는 재프로그래밍 인자는 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5 (즉, GMT)이다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5 (즉, MMT)이다. 일부 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 Gata4, Mef2c, Tbx5, 및 미오카르딘 (즉, 4F)이다. 다른 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5, Essrg, 미오카르딘, Zfpm2, 및 Mesp1 (즉, 7F)이다.
재프로그래밍 인자는 당업자에게 보편적으로 공지되어 있는 다양한 기전에 의해 비-심근세포로 도입될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 구축물을 적합한 숙주에서의 바이러스 생산을 통해 전달할 수 있다. 이어서, 숙주 세포로부터 바이러스를 수거하고, 심장 세포와 접촉시킨다. 관심 유전자를 발현할 수 있는 바이러스 벡터 및 비-바이러스 벡터를 DNA/리포솜 복합체, 미셀 및 표적화된 바이러스 단백질-DNA 복합체를 통해 비-심근세포로 전달할 수 있다.
표적화 항체 또는 그의 단편 또한 포함하는 리포솜은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 비-심근세포 또는 세포 집단으로 전달하는 것 이외에도, 본원에 기술된 단백질을 비-심근세포 또는 세포 집단으로 직접 도입하는 것이 단백질 형질감염의 비제한적인 기술에 의해 수행될 수 있고, 대안적으로, 본 발명의 단백질의 발현을 증진시킬 수 있고/거나, 상기 단백질의 활성을 촉진시킬 수 있는 배양 조건도 다른 비제한적인 기술이다.
재프로그래밍 인자를 코딩하는 벡터를 전달하는 다른 방법으로는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 형질감염, 전기천공, 미세주입, 원형질체 융합, 또는 리포솜 매개 형질감염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터로 형질감염되는 숙주 세포로는 E. 콜라이(E. coli) 또는 박테리아, 효모, 진균, 또는 마우스, 인간, 또는 다른 동물 (예컨대, 포유동물)로부터 유래된 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 단백질, 융합 단백질, 폴리펩티드 단편, 또는 클로닝된 DNA에 의해 코딩된 돌연변이체의 시험관내 발현 또한 사용될 수 있다. 분자 생물학 분야의 당업자는 재조합 단백질 및 그의 단편을 제조하는 데 매우 다양한 발현 시스템 및 정제 시스템이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시양태에서, 재프로그래밍 인자 도입 후 약 12시간 내지 약 36시간째에 비-심근세포를 먼저 TGF-β 억제제와 접촉시킨다. 한 바람직한 실시양태에서, 재프로그래밍 인자 도입 후 약 24시간째에 비-심근세포를 먼저 TGF-β 억제제와 접촉시킨다.
일부 실시양태에서, 재프로그래밍 인자 도입 후 약 24시간 내지 약 72시간째에 비-심근세포를 먼저 WNT 억제제와 접촉시킨다. 한 바람직한 실시양태에서, 재프로그래밍 인자 도입 후 약 48시간째에 비-심근세포를 먼저 WNT 억제제와 접촉시킨다.
세포 및 배양 조건
본 개시내용을 읽을 때 당업자에게는 자명한 바와 같이, 본 개시내용은 비-심근세포로부터 유도 심근세포 및 심근세포 유사 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
세포
본 발명에서 사용하기 위한 비-심근세포는 당업자에게 공지된 임의의 비-심근세포일 수 있다. 비-심근세포의 비제한적인 예로는 예를 들어, 체세포, 심장 섬유모세포, 비-심장 섬유모세포, 심장 전구 세포, 및 줄기 세포를 포함한다. 비-심근세포는 심장의 심외막, 심근 또는 심내막으로부터의 심장 세포일 수 있다. 비-심근세포 심장 세포로는 예를 들어, 평활근 및 내피 세포를 포함한다. 심장 세포의 다른 비제한적인 예로는 상피 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 심장 줄기 세포 또는 전구 세포, 심장 근육을 구성하는 심장 전도 세포 및 심장 심박조율 세포, 혈관 및 구조를 지지하는 심장 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-심근세포는 대상체 내의 내인성 세포이고, 유도 심근세포를 생성하는 방법은 생체내 유도에 의한 것이다. 다른 실시양태에서, 비-심근세포는 외인성 세포이고, 시험관내에서 변형된다.
심근세포로 유도되는 비-심근세포는 다양한 공급원 중 임의의 것으로부터의 것일 수 있다. 포유동물 비-심근세포 (예컨대, 인간 또는 뮤린)가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 심근세포는 포유동물 심근세포이고, 구체적인 실시양태에서, 비-심근세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 비-심근세포는 줄기 세포 (예컨대, 만능 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 재프로그래밍된 심장 세포 또는 심장 줄기 세포) 또는 전구 세포 (예컨대, 심장 전구 세포)로부터 유래된 것일 수 있다. 심근세포는 심장 세포 또는 비-심장 세포로부터 유래된 것일 수 있다. 심근세포는 다양한 조직 공급원 중 임의의 것으로부터의 것, 또는 그로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 심장 섬유모세포, 포피 섬유모세포, 진피 섬유모세포, 폐 섬유모세포 등. 비-심근세포는 배아, 태아, 또는 출생 후 (예컨대, 성체) 세포일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 비-심근세포는 성체 세포이다.
비-심근세포는 살아있는 대상체로부터 수득될 수 있다. 세포는 살아있는 대상체로부터 채취된 조직으로부터 수득될 수 있다. 세포는 적합한 조직 기증자인 것으로 간주되는 최근 사망한 대상체로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 대상체가 적합한 세포 공급원인지 여부를 측정하기 위해 각종 유전적 장애, 바이러스 감염 등에 대해 스크리닝된다. 일반적으로, 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포는 비-형질전환된 것 (예컨대, 정상적인 세포 증식을 보이는 것)이고, 다르게는 정상인 것 (예컨대, 정상적인 핵형을 보이는 것)이다.
재프로그래밍을 위한 세포가 비-심근세포의 집단인 경우, 세포 집단은 적어도 약 30%의 비-심근세포, 적어도 약 35%의 비-심근세포, 적어도 약 40%의 비-심근세포, 적어도 약 45%의 비-심근세포, 적어도 약 50%의 비-심근세포, 적어도 약 55%의 비-심근세포, 적어도 약 60%의 비-심근세포, 적어도 약 65%의 비-심근세포, 적어도 약 70%의 비-심근세포, 적어도 약 75%의 비-심근세포, 적어도 약 80%의 비-심근세포, 적어도 약 85%의 비-심근세포, 적어도 약 90%의 비-심근세포, 적어도 약 95%의 비-심근세포, 적어도 약 98%의 비-심근세포, 적어도 약 99%의 비-심근세포, 또는 99% 초과의 비-심근세포로 구성된 것이다.
세포 (심장 또는 비-심장)는 비-배아 대상체, 신생아, 아동 또는 성인의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 세포는 제왕절개에 의한 출생을 비롯한 출생에서부터 사망에 이르기까지의 기간 내에 대상체로부터 수집된 신생아 조직 또는 출생 후 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 비-심근세포는 생후 약 10분 초과, 약 1시간 초과, 약 1일 초과의 시간이 경과한 대상체, 생후 약 1개월 초과, 생후 약 2개월 초과, 생후 약 6개월 초과의 시간이 경과한 대상체, 약 1세 초과, 약 2세, 약 5세 초과, 약 10세 초과, 약 15세 초과, 약 18세 초과, 약 25세 초과, 약 35세 초과, >45세, >55세, >65세, >80세, <80세, <70세, <60세, <50세, <40세, <30세, <20세 또는 <10세인 대상체로부터의 것일 수 있다.
조직으로부터 비-심근세포 세포를 단리시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 임의의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, 성인 심장 세포는 심장 수술을 받은 환자로부터 수득된 인간 심장 심방 생검 표본으로부터 수득할 수 있다. 심장 조직을 다지고, 콜라게나제로 분해하고, 문헌 [Choi et al. (2013) Transplantation Proceedings 45:420-426]의 방법을 사용하여 심장 줄기 세포/전구 세포를 c-kit+ 전구 세포 확장 배지 중에서 확장시킨다. 추가로, 심장 섬유모세포는 문헌 [Ieda et al. (2009) Dev . Cell 16(2):233-244]의 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 포피 섬유모세포는 수컷 개체의 포피 조직으로부터 수득할 수 있다. 섬유모세포는 포피 조직을 다진 후, 조직을 단일 세포로 분리시킴으로써 수득할 수 있다. 물리적 탈군집화 또는 예를 들어, 트립신을 사용하여 효소적 분해를 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 포피 세포 군집체를 분리시킬 수 있다.
심근세포에 특이적인 각종 마커의 발현은 종래 생화학적 또는 면역화학적 방법 (효소 결합 면역흡착 검정법, 면역조직화학적 검정법 등)에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 심근세포에 특이적인 마커를 코딩하는 핵산의 발현을 사정할 수 있다. 세포에서의 심근세포에 특이적인 마커 코딩 핵산의 발현은 역전사효소 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 또는 하이브리드화 분석, 지난 과거에 보편적으로 사용되어 왔던, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 및 분석하는 분자 생물학적 방법에 의해 확인할 수 있다. 심근세포에 특이적인 마커를 코딩하는 핵산 서열은 공지되어 있고, 이는 공개된 데이터베이스, 예컨대, 진뱅크(GenBank)를 통해 이용가능하다. 따라서, 프라이머 또는 프로브로서의 사용을 위해 필요한 마커 특이적 서열은 쉽게 결정된다.
배양 조건
본 개시내용의 세포는 당업자에게 공지된 임의의 조건하에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 (예컨대, 비-심근세포, 심근세포, 및 그의 조합)는 1-20% 산소 (O2) 및 5% 이산화탄소 (CO2)인 조건에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 세포는 저산소 조건에서 (예컨대, 10% 미만의 O2의 존재하에서) 배양된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 세포는 약 37℃에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 세포는 약 37℃, 5% CO2 및 10-20% O2에서 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 일정 기간 동안 저산소 조건에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 일정 기간 동안 정상 산소 조건 (~20% O2)에서 배양된 후, 이어서, 저산소 조건, 예를 들어 ~5% O2로 전환될 수 있다.
비-심근세포의 심근세포로의 시험관내 또는 생체외 분화가 가지는 이점은 이식, 또는 손상되거나, 또는 분화되지 않는 세포를 구별하는 데 적합한 세포를 쉽게 확인할 수 있는 능력이다. 시험관내 또는 생체외 분화를 통해 분화되지 않은 비-심근세포로부터 유도 심근세포를 정제 또는 단리시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-심근세포는 유효량의 작용제 (소분자 또는 siRNA)의 사용으로 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하도록 유도된다.
일부 실시양태에서, 작용제는 SB431542, LDN-193189, 덱사메타손, LY364947, D4476, 미리세틴, IWR1, XAV939, 도코사헥사엔산 (DHA), S-니트로소-N-아세틸페니실라민 (SNAP), Hh-Ag1.5, 알프로스타딜, 크로마칼림, MNITMT, A769662, 레티노산 p-히드록시아닐리드, 데카메토늄 디브로마이드, 니페디핀, 피록시캄, 바시트라신, 아즈트레오남, 하르말롤 히드로클로라이드, 아미드-C2 (A7), Ph-C12 (C10), mCF3-C-7 (J5), G856-7272 (A473), 5475707, 또는 그의 임의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 소분자이다.
재프로그래밍을 위한 작용제
형질전환 성장 인자 베타 ( TGF -β) 억제제
형질전환 성장 인자-베타 (TGF-β)는 많은 측면의 세포 기능을 제어하는 시토카인의 큰 패밀리의 원형 구성원인 다기능성 조절 폴리펩티드이다. TGF-β 경로는 섬유 형성, 아폽토시스, 전환분화, 증식, 및 다른 세포 기능에 영향을 미친다 (문헌 [Leask, A. (2015) Circ . Res. 116: 1269-1276]; [Xu, J., et al. (2009) Cell Res. 19: 156-172]; [Schmierer, B. et al (2007) Nat. Rev. Mol . Cell. Biol. 8:970-982]). TGFβ 신호전달 탈조절은 종양에서 빈번하게 나타나고, 종양 개시, 발생 및 전이에서 중요한 역할을 한다. TGFβ 신호전달 억제는 암 요법을 위한 신흥 전략법이다.
TGF-β 억제제는 TGF-β 신호 전달 시스템 경로를 구성하는 인자, 예컨대, TGF-β 리간드, TGF-β 타입 I 수용체, TGF-β 타입 II 수용체, TGF-β 타입 III 수용체 (β-글리칸 및 엔도글린), TGF-β 수용체의 가용성 형태, Smad 단백질, 신호전달 경로에 연루되어 있는 수용체 및 리간드에 대한 항체, 상기 경로 구성원을 표적화하는 핵산 기반 분자 (예컨대, 안티센스, siRNA, 압타머 및 리보자임), 또는 그의 조합 중 임의의 것을 억제시킴으로써 TGF-β 신호 전달을 억제시키는 화합물이다.
일부 실시양태에서, TGF-β 억제제는 SB431542, D4476, LDN-193189, 덱사메타손 및 LY364947로 구성된 군으로부터 선택된다. TGF-β 억제제는 또한 당업계에서 항-TGF-β 화합물로 지칭될 수 있다. 항-TGF-β 화합물의 비-제한적인 예로는 항체 (예컨대, 프레솔리무맙(Fresolimumab)/GC1008 (겐자임(Genzyme: 미국 매사추세츠주 케임브리지)), PF-03446962 (화이자(Pfizer: 미국 뉴욕주 뉴욕)), 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) (예컨대, 트라베더슨(Trabedersen) (AP12009) (이사르나 테라퓨틱스(Isarna Therapeutics: 미국 뉴욕주 뉴욕)), 수용체 키나제 억제제 (예컨대, LY2157299 (엘리 릴리(Eli Lilly: 미국 인디애나주 인디애나폴리스)), 및 백신과 조합된 TGF-β ASO (예컨대, 루카닉스(Lucanix)™ (벨라겐퓨마투셀-L(Belagenpumatucel-L)) (노바 Rx 코포레이션(Nova Rx Corp: 미국 캘리포니아주 샌디에고)), 및 TGF-β2 ASO +GMCSF 발현 벡터 (마리 크로울리 메디컬 리서치 센트레(Mary Crowley Medical Research Centre: 미국 텍사스주 댈러스))를 포함한다.
WNT 억제제
WNT 억제제는 WNT의 발현 또는 활성을 하향조절하는 작용제이다. WNT/β-카테닌 신호전달은 줄기 세포, 배아 발생 및 성체 기관을 비롯한, 다양하고, 폭넓은 생물학적 시스템에 관여한다. WNT/β-카테닌 신호전달에 관여하는 성분의 탈조절이 다수의 암 및 퇴행성 질환을 비롯한 매우 광범위한 질환에 연루되어 왔다. WNT 신호전달은 3개의 주요 경로: 정규, 비정규 평면 세포 극성, 및 비정규 WNT/칼슘을 통해 일어난다. 정규 경로에서, WNT는 프리즐드에 결합하여 유비퀴틴화 및 프로테아좀에서의 분해를 위해 β-카테닌을 표적화하는 복합체의 기능을 파괴시킨다. 줄기 세포 재생, 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 재프로그래밍, 다양한 계통으로의 세포 분화에서의 WNT 신호전달의 역할에 대해서는 여전히 논쟁 중에 있다.
그러나, 줄기 세포의 심근세포로의 분화 동안 WNT 신호전달의 이상성 조절은 중배엽 분화를 촉진시키고, 순수한 심근세포를 고수율로 생산한다. 관심 작용제는 WNT, 예컨대, 약물, 즉, 소분자, 차단 항체 등과 직접 상호작용할 수 있거나, 또는 WNT 연관 단백질, 예컨대, WNT 공수용체 LRP5/6, 및 막횡단 단백질 크레멘(Kremen)과 상호작용할 수 있다. 다수의 WNT 억제제가 기술되어 왔고, 당업계에 공지되어 있다.
관심 WNT 억제제는 가용성, 세포외 WNT 단백질과, 정상 세포의 표면 상에 존재하는 프리즐드 수용체 사이의 상호작용을 간섭한다. 상기 작용제로는 제한 없이, WNT 결합 도메인을 포함하는 가용성 프리즐드 폴리펩티드; 가용성 프리즐드 관련 폴리펩티드; WNT 특이적 항체; 프리즐드 특이적 항체; 및 세포외 WNT 신호전달을 차단할 수 있는 다른 분자를 포함한다.
공지된 WNT 억제제 중에는 딕코프(Dickkopf) (Dkk) 유전자 패밀리의 구성원이 있다 (문헌 [Krupnik et al. (1999) Gene 238(2):301-13] 참조). 인간 Dkk 유전자 패밀리의 구성원으로는 Dkk-1, Dkk-2, Dkk-3, 및 Dkk-4, 및 Dkk-3 관련 단백질 소기(Soggy) (Sgy)를 포함한다.
다른 WNT 억제제로는 분비된 단백질인 와이즈(Wise) (문헌 [Itasaki et al. (2003) Development 130(18):4295-30])를 포함한다. 와이즈 단백질은 WNT 공수용체, 지단백질 수용체-관련 단백질 6 (LRP6)과 물리적으로 상호작용하고, LRP6에의 결합에 대해 WNT8과 경쟁할 수 있다.
억제제는 또한 천연 억제제의 유도체, 변이체, 및 생물학적으로 활성인 단편을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, WNT 억제제는 소분자, 예컨대, XAV939, D4476, IWR1, IWR 유사체, IWP 유사체, 53AH, WNT-C59 및 미리세틴이다. WNT 표적화 화합물의 비제한적인 예로는 OMPT-18RS (온코메드 파마슈티칼즈/바이엘(OncoMed Pharmaceuticals/Bayer: 미국 캘리포니아주 레드우드 시티)), OMP-54F28 (온코메드 파마슈티칼즈/바이엘: 미국 캘리포니아주 레드우드 시티), PRI-724 (프리즘 파마 컴퍼니, 리미티드/에이사이(Prism Pharma Co, Ltd/Eisai: 일본 요코하마)), LGK974 (노파르티스 파마슈티칼즈(Novartis Pharmaceuticals: 미국 뉴저지주 이스트 하노버)), 및 JW55 (토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience: 영국 브리스틀))를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, WNT 억제제는 WNT 활성을 표적화하는 siRNA이다. siRNA WNT 억제제의 예로는 WNT 그 자체의 발현을 간섭하는 siRNA, 또는 WNT 신호전달 경로에서 전달에 필요한 분자, 예컨대, 탄키라제 ( Tankyrase ) 1의 발현을 간섭하는 siRNA을 포함한다.
항염증제
특정 실시양태에서, 재프로그래밍은 하나 이상의 항염증제, 예컨대, 항염증성 스테로이드성 또는 비-스테로이드성 항염증성 약물 (NSAID) 투여에 의해 증진된다.
본 발명에서 사용하기 위한 항염증성 스테로이드제로는 코르티코스테로이드, 및 특히, 글루코코르티코이드 활성을 가지고 있는 것, 예컨대, 덱사메타손 및 프레드니손을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 비-스테로이드성 항염증성 약물 (NSAID)은 일반적으로 염증 및 통증을 유발하는 프로스타글란딘, 시클로옥시게나제-1 (COX-1) 및/또는 시클로옥시게나제-2 (COX-2)의 생산을 차단함으로써 작용한다. 전통적 NSAID는 COX-1 및 COX-2, 둘 모두를 차단함으로써 작용한다. COX-2 선택적 억제제는 오직 COX-2 효소만을 차단한다. 특정 실시양태에서, NSAID는 COX-2 선택적 억제제, 예컨대, 셀레콕시브 (셀레브렉스(Celebrex)®), 로페콕시브 (바이옥스(Vioxx)®), 및 발데콕시브 (벡스트라(Bextra)®)이다. 특정 실시양태에서, 항염증제는 NSAID 프로스타글란딘 억제제, 예컨대, 피록시캄(Piroxicam)이다.
당업계의 숙련가가 알고 있는 바와 같이, 본 발명에서 사용하기 위한 항염증제의 투여량은 사용되는 특정 항염증제, 대상체가 현재 받고 있을 수 있는 다른 치료법 및 약물, 및 대상체(들)의 다른 요구 사안에 관한 정보에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 셀레콕시브는 통상 100 mg 또는 200 mg 캡슐제로 처방되고, 일반적인 용량 (예컨대, 관절염에 의해 유발된 통증인 경우)은 일반적으로 1일 00-400 mg이다.
시험관내 변형 방법
본 개시내용은 시험관내에서 심근세포 및/또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에서는 유효량의 WNT 억제제의 존재하에서 비-심근세포를 배양함으로써 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본원에서는 a) WNT 억제제 첨가 이전 제1 기간 동안 비-심근세포에 유효량의 TGF-β 억제제를 투여하는 단계; 및 b) 제2 기간 동안 비-심근세포에 유효량의 WNT 억제제와 함께 동시에 유효량의 TGF-β 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 방법은 유효량의 TGF-β 억제제의 존재하에서 비-심근세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, WNT 억제제 첨가 이전 일정 기간 동안, 예를 들어, WNT 억제제 첨가 이전 약 6시간 내지 약 72시간 동안 TGF-β 억제제의 존재하에서 비-심근세포를 배양한다. 일부 실시양태에서, WNT 억제제 첨가 이전 약 12시간 내지 약 60시간, 약 18시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 42, 약 30시간 내지 약 36시간 (또는 상기 시간들 (종점 포함) 중 임의의 두 시간 사이의 임의의 범위) 동안 TGF-β 억제제의 존재하에서 비-심근세포를 배양한다. 일부 실시양태에서, WNT 억제제 첨가 이전 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 또는 약 72시간 동안 TGF-β 억제제의 존재하에서 비-심근세포를 배양한다.
일부 실시양태에서, WNT 억제제 첨가 이전 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 또는 약 48시간 동안 TGF-β 억제제의 존재하에서 비-심근세포를 배양한다. 한 바람직한 실시양태에서, WNT 억제제 첨가 이전 약 24시간 동안 TGF-β 억제제의 존재하에서 비-심근세포를 배양한다.
일부 실시양태에서, 일정 기간 동안 동시에 TGF-β 억제제 및 WNT 억제제의 존재하에서 비-심근세포를 배양한다.
또 다른 실시양태에서, TGF-β 억제제 이후에 TGF-β 활성인자의 존재하에서 비-심근세포를 배양한다. TGF-β 활성인자는 당업계에 널리 공지되어 있다. 상업적으로 이용가능한 TGF-β 활성인자의 비제한적인 예로는 예를 들어, SD 208 (토크리스 바이오사이언스: 영국 브리스틀)을 포함한다.
일부 실시양태에서, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두는 재프로그래밍의 1일째, 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 6일째, 7일째, 8일째, 9일째, 10일째, 11일째, 12일째, 13일째, 14일째, 15일째, 20일째, 25일째, 30일째, 1개월째, 2개월째, 3개월째, 또는 4개월째 이후에 제거된다. 일부 실시양태에서, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두는 재프로그래밍의 10일째 이후에 제거된다.
조성물
본 개시내용은 또한 본 발명의 방법에 따라 생성된 단리된 유도 심근세포를 제공한다. 유도 심근세포는 자연적으로 발생된 심근세포에서 발견되는 것보다 더 높은 수준으로, 또는 더 낮은 수준으로 적어도 하나의 심장 유전자를 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 자연적으로 발생된 심근세포에서 발견되는 것보다 더 높은 수준으로 발현되는 심장 유전자는 Tnnt2, Actn2, Atp2a2, Myh6, Ryr2, Myh7, 및 Actc1로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 자연적으로 발생된 심근세포에서 발견되는 것보다 더 낮은 수준으로 발현되는 심장 유전자는 Mybpc3, Pln, Mb, Lmod2, Myl2, Myl3, Cox6a2, Atp5a1, Ttn, Tnni3, Pdk4, Mycz2, Cacna1c, Scn5a, Mycod, 및 Nppa로 구성된 군으로부터 선택된다 .
또 다른 측면에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 유도 심근세포의 실질적으로 균질한 집단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 실질적으로 균질한 집단 중의 유도 심근세포는 자연적으로 발생된 심근세포에서 발견되는 것보다 더 높은 수준으로, 또는 더 낮은 수준으로 적어도 하나의 심장 유전자를 발현한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기술된 단리된 유도 심근세포의 집단 및 담체, 임의적으로, 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 안정제 및/또는 보존제를 추가로 포함한다.
조성물은 제약상 허용되는 부형제, 제약상 허용되는 염, 희석제, 담체, 비히클 및 당업자에게 널리 공지된 상기 다른 불활성 작용제를 포함할 수 있다. 제약 조성물에서 보편적으로 사용되는 비히클 및 부형제로는 예를 들어, 활석, 아라비아 검, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 코코아 버터, 수성 또는 비수성 용매, 오일, 파라핀 유도체, 글리콜 등을 포함한다. 용액은 물 또는 생리적으로 화합성을 띠는 유기 용매, 예컨대, 에탄올, 1,2-프로필렌 글리콜, 폴리글리콜, 디메틸술폭시드, 지방산 알콜, 트리글리세리드, 글리세린의 부분 에스테르 등을 사용하여 제조될 수 있다.
비경구용 조성물은 멸균 등장성 염수, 물, 1,3-부탄디올, 에탄올, 1,2-프로필렌 글리콜, 물과 혼합된 폴리글리콜, 링거액 등을 포함할 수 있는 종래 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 한 측면에서, 착색제는 조성물을 의도된 치료 부위로 국재화시키고, 적절하게 배치시키는 것을 촉진시키기 위해 첨가된다.
조성물은 이식가능한 장치를 사용하여 투여되는 작용제를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 의해 고려되는 적합한 이식가능한 장치로는 정맥내 스텐트 (예컨대, 자기 확장형 스텐트, 풍선 확장형 스텐트, 및 스텐트-그라프트), 스캐폴드, 그라프트 등을 포함한다. 상기 이식가능한 장치는 유도 심근세포를 생성할 수 있는 조성물과 함께 적어도 하나의 표면 상에 코팅될 수 있거나, 또는 함침될 수 있다. 조성물은 또한 이식가능한 장치 중의 저장소 내에 함유되어 있는 작용제를 포함할 수 있다. 작용제가 이식가능한 장치 중의 저장소 내에 함유되어 있는 경우, 저장소는 작용제가 장치로부터 용출될 수 있도록 구조화된다. 이식가능한 장치로부터 투여되는 조성물 중의 작용제는 WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두를 포함할 수 있다.
제약 조성물은 투여가능한 임의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 보존제 및/또는 안정제를 포함할 수 있다. 보존제의 비제한적인 예로는 메틸-, 에틸-, 프로필-파라벤, 벤조산 나트륨, 벤조산, 소르브산, 소르브산 칼륨, 프로피온산, 염화벤즈알코늄, 벤질 알콜, 티메로살, 페닐머큐레이트 염, 클로르헥시딘, 페놀, 3-크레졸, 4급 암모늄 화합물 (QAC), 클로르부탄올, 2-에톡시에탄올, 및 이미드우레아를 포함한다.
장성 조절을 위해, 수성 제약 조성물은 생리적 염, 예컨대, 나트륨 염을 포함할 수 있다. 염화나트륨 (NaCl)이 바람직하고, 이는 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염으로는 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 디소듐포스페이트 건조물, 염화마그네슘 및 염화칼슘을 포함한다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충제로는 포스페이트 완충제; 트리스 완충제; 보레이트 완충제; 숙시네이트 완충제; 히스티딘 완충제; 또는 시트레이트 완충제를 포함한다. 완충제는 전형적으로 5-20 mM 범위의 농도로 포함되어 있을 것이다. 조성물의 pH는 일반적으로 pH 5 내지 8, 및 더욱 전형적으로, pH 6 내지 8, 예컨대, pH 6.5 내지 7.5, 또는 pH 7.0 내지 7.8일 것이다.
조성물은 바람직하게 멸균성이다. 조성물은 바람직하게 글루텐 무함유이다. 조성물은 바람직하게 비-발열성이다.
당업자에게 자명한 바, 제약 조성물은 치료하고자 하는 질환 또는 병태에 의존하여 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 전형적인 투여 경로로는 경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 두개내, 비내, 또는 복강내 투여를 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포를 포함하는 조성물은 동결보호제를 포함한다. 동결보호제의 비제한적인 예로는 글리콜 (예컨대, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리콜), 디메틸 술폭시드 (DMSO), 포름아미드, 수크로스, 트레할로스, 덱스트로스, 및 그의 임의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용되는 하나 이상의 작용제는 방출 조절형 제제로 제공된다. "방출 조절형 제제"라는 용어는 서방형 및 지속 방출형 제제를 포함한다. 방출 조절형 제제는 당업계에 널리 공지되어 있다. 이는 조성물의 서방형 방식, 주기적, 펄스식, 또는 지연 방식의 방출을 허용하는 부형제를 포함한다. 방출 조절형 제제는 제한 없이, 조성물 (WNT 억제제 및/또는 TGF-β 억제제)을 매트릭스; 장용 코팅제; 마이크로캡슐화; 겔 및 히드로겔; 임플란트; 및 조성물의 조절형 방식의 방출을 허용하는 임의의 다른 제제로의 매립을 포함한다.
한 측면에서, 상기 언급된 작용제, 조성물 또는 제제를 포함하는 부품들의 키트를 제공한다.
치료 방법
본 개시내용의 조성물, 세포 및 방법을 사용하는 치료를 필요로 하는 대상체로는 선천성 심장병을 앓는 개체, 퇴행성 근육 질환을 앓는 개체, 허혈성 심장 조직을 초래하는 병태를 앓는 개체 (예컨대, 관상 동맥 질환을 앓는 개체) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 방법은 퇴행성 근육 질환 또는 병태 (예컨대, 가족성 심근증, 확장성 심근증, 비후성 심근증, 제한 심근증, 또는 허혈성 심근증을 초래하는 관상 동맥 질환)를 치료하는 데 유용하다. 일부 예에서, 대상 방법은 심장 또는 심혈관 질환 또는 장애, 예를 들어, 심혈관 질환, 동맥류, 협심증, 부정맥, 죽상동맥경화증, 뇌혈관 사고 (뇌졸중), 뇌혈관 질환, 선천성 심장 질환, 울혈성 심부전, 심근염, 관상동맥 판막 질환, 동맥 질환 확장성, 이완기 기능장애, 심내막염, 높은 혈압 (고혈압), 심근증, 비후성 심근증, 제한 심근증, 허혈성 심근증을 초래하는 관상 동맥 질환, 승모 판막 탈출증, 심근 경색 (심장 마비), 또는 정맥 혈전색전증을 앓는 개체를 치료하는 데 유용하다.
본 개시내용의 조성물, 세포 및 방법을 사용하는 치료에 적합한 대상체로는 허혈성 심장 조직을 초래하는 병태를 포함하나, 이에 제한되지 않는 심장 병태를 앓는 개체 (예컨대, 관상 동맥 질환을 앓는 개체) 등 (예컨대, 포유동물 대상체, 예컨대, 인간, 비-인간 영장류, 가축 포유동물, 실험용 비-인간 포유동물 대상체, 예컨대, 마우스, 래트 등)을 포함한다. 일부 예에서, 치료에 적합한 개체는 심장 또는 심혈관 질환 또는 병태, 예컨대, 심혈관 질환, 동맥류, 협심증, 부정맥, 죽상동맥경화증, 뇌혈관 사고 (뇌졸중), 뇌혈관 질환, 선천성 심장 질환, 울혈성 심부전, 심근염, 관상동맥 판막 질환, 동맥 질환 확장성, 이완기 기능장애, 심내막염, 높은 혈압 (고혈압), 심근증, 비후성 심근증, 제한 심근증, 허혈성 심근증을 초래하는 관상 동맥 질환, 승모 판막 탈출증, 심근 경색 (심장 마비), 또는 정맥 혈전색전증을 앓는 개체이다. 일부 예에서, 대상 방법을 사용하는 치료에 적합한 개체로는 퇴행성 근육 질환, 예컨대, 가족성 심근증, 확장성 심근증, 비후성 심근증, 제한 심근증, 또는 허혈성 심근증을 초래하는 관상 동맥 질환을 앓는 개체를 포함한다.
생체내 유도 심근세포 생성
일부 측면에서, 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 WNT 억제제, TGF-β 억제제, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 투여하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, TGF-β 억제제 및 WNT 억제제는 재프로그래밍 인자와 함께 동시에 투여된다. 다른 실시양태에서, TGF-β 억제제 및 WNT 억제제는 서로 함께 동시에 투여된다. 추가의 다른 실시양태에서, TGF-β 억제제 및 WNT 억제제는 서로 및/또는 재프로그래밍 인자와 순차적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, TGF-β 억제제는 WNT 억제제 이전 일정 기간 동안, 예를 들어, WNT 억제제 투여 이전에 약 6시간 내지 약 72시간 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, TGF-β 억제제는 WNT 억제제 첨가 이전 TGF-β 억제제의 존재하에 약 12시간 내지 약 60시간, 약 18시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 42시간, 약 30시간 내지 약 36시간 (또는 상기 시간들 (종점 포함) 중 임의의 두 시간 사이의 임의의 범위) 사이에 전달된다. 일부 실시양태에서, TGF-β 억제제는 대상체에게 WNT 억제제 첨가 이전 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 또는 약 72시간 전에 전달된다.
WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두는 당업자에 의해 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두는 예를 들어, 경구 전달, 정맥내 전달, 근육내 전달, 심근내 전달, 복강내 전달 등에 의해 달성될 수 있다.
WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두는 임의 스케줄에 따라, 예를 들어, 매일, 격일로, 1일 2회, 매 2일, 매 3일, 매 4일, 매 5일마다 및 그 등의 스케줄로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두는 대략 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일 이상 동안 매일 투여된다. 일부 실시양태에서, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두는 대략 14일 동안 매일 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 일정 기간 동안 TGF-β 억제제 및 WNT 억제제를 동시에 투여받는다.
일부 실시양태에서, 대상체는 TGF-β 억제제 이후에 TGF-β 활성인자를 투여받는다. TGF-β 활성인자는 당업계에 널리 공지되어 있다. 상업적으로 이용가능한 TGF-β 활성인자의 비제한적인 예로는 예를 들어, SD 208 (토크리스 바이오사이언스: 영국 브리스틀)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 재프로그래밍 인자, 예를 들어, Baf60c, Esrrg, Gata4, Gata6, Hand2, Irx4, Isl1, Mef2c, Mesp1, Mesp2, 미오카르딘, Nkx2.5, SRF, Tbx5, Tbx20, Zfpm2, miR-133, 또는 그의 임의 조합이 대상체에게 투여되어 왔다. 바람직한 실시양태에서, 재프로그래밍 인자 중 2개 이상의 것, 및 더욱 바람직하게, 3개 이상의 것의 조합이 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 열거된 재프로그래밍 인자 중 하나 이상의 것이 명백하게 배제된다. 다른 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 Gata4, Mef2c, Tbx5, 미오카르딘, 또는 그의 임의 조합의 군으로부터 선택된다. 구체적인 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5 (GMT)이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5 (즉, MMT)이다. 다른 구체적인 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 Gata4, Mef2c, Tbx5, 및 미오카르딘 (즉, 4F)이다. 다른 실시양태에서, 재프로그래밍 인자는 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5, Essrg, 미오카르딘, Zfpm2, 및 Mesp1 (즉, 7F)이다.
일부 실시양태에서, TGF-β 억제제는 대상체에게 재프로그래밍 인자 도입 후 약 12시간 내지 약 36시간째 투여된다. TGF-β 억제제의 비제한적인 예로는 SB431542, D4476, LDN-193189, 덱사메타손 및 LY364947을 포함한다. TGF-β, TGF-β 수용체, 또는 TGF-β 신호전달 경로의 구성원을 표적화하는 siRNA 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, WNT 억제제는 대상체에게 재프로그래밍 인자 도입 후 약 24시간 내지 약 72시간째 투여된다. 일부 실시양태에서, WNT 억제제는 XAV939, D4476, IWR1, 및 미리세틴으로 구성된 군으로부터 선택된다.
유도 심근세포를 사용하는 치료 방법
본 발명은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 유도 심근세포를 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용의 유도 심근세포는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도 심근세포는 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있고, 여기서, 유도 심근세포의 대상체에게로의 투여가 대상체에서 심혈관 질환을 치료한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 심혈관 질환을 치료하는 방법은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유도 심근세포의 집단을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시양태에서, 심혈관 질환을 치료하는 방법은 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의, WNT 억제제, TGF-β 억제제, 또는 그 둘 모두를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-심근세포는 WNT 억제제의 첨가 이전에 TGF-β 억제제의 존재하에서 약 6시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 또는 약 48시간 동안 배양된다. 한 바람직한 실시양태에서, 비-심근세포는 WNT 억제제의 첨가 이전에 TGF-β 억제제의 존재하에서 약 24시간 동안 배양된다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서 전역에 걸쳐 사용된 약어는 하기 의미를 가진다: α- MHC - GFP, 알파-미오신 중쇄 녹색 형광 단백질; CF, 심장 섬유모세포; cm, 센티미터; CO, 심박출량; EF, 박출률; FACS, 형광 활성화 세포 분류; GFP, 녹색 형광 단백질; GMT, Gata4, Mef2c 및 Tbx5; GMTc, Gata4, Mef2c, Tbx5, TGFβi, WNTi; GO, 유전자 온톨로지; HCF, 인간 심장 섬유모세포; iCM, 유도 심근세포; kg, 킬로그램; ㎍, 마이크로그램; ㎕, 마이크로리터; mg, 밀리그램; ml, 밀리리터; MI, 심근 경색; msec, 밀리초; min, 분; MMT, 미오카르딘, Mef2c 및 Tbx5; MMTc, 미오카르딘, Mef2c, Tbx5, TGFi, WNTi; MRI, 자기 공명 영상; PBS, 포스페이트 완충처리된 염수; PBST, 포스페이트 완충처리된 염수, 트리톤; PFA, 파라포름알데히드; qPCR, 정량적 중합효소 연쇄 반응; qRT - PCR, 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄 반응; RNA, 리보핵산; RNA- seq, RNA 서열분석; RT- PCR, 역전사효소 중합효소 연쇄 반응; sec, 초; SV, 박출량; TGF -β, 형질전환 성장 인자 베타; TGF - βi, 형질전환 성장 인자 베타 억제제; WNT, 윙리스(wingless)-Int; WNTi, 윙리스-Int 억제제; YFP, 황색 형광 단백질; 4F, Gata4, Mef2c, TBX5, 및 미오카르딘; 4Fc, Gata4, Mef2c, TBX5, 및 미오카르딘 + TGF-βi 및 WNTi; 7F, Gata4, Mef2c, 및 Tbx5, Essrg, 미오카르딘, Zfpm2, 및 Mesp1; 7Fc, Gata4, Mef2c, 및 Tbx5, Essrg, 미오카르딘, Zfpm2, 및 Mesp1 + TGF-βi 및 WNTi.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 특정 실시양태를 추가로 예시하고자 하는 것이다. 본 실시예는 당업계의 숙련가에게 제공하기 위해 제시된 것이며, 그의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1. TGF -β 및 WNT 신호전달은 심장 재프로그래밍을 막는 장벽이다.
심장 재프로그래밍 개선을 위해 조작될 수 있는 생물학적 경로를 확인하기 위해, 비편향 소분자 라이브러리 스크린을 포함하는 화학 생물학 접근법을 사용하였다. 문헌 [Wang et al. (2015) Circ . Res. 116:237-244]에 상세하게 기술된 바와 같이, 3개의 전사 인자가 각각 확실하게 최적으로 발현될 수 있도록 최근 기술된 폴리시스트론성 레트로바이러스 Mef2c-P2A-Gata4-T2A-Tbx5로 심장 재프로그래밍을 유도하였다.
간략하면, 앞서 기술된 바와 같은 이주 방법을 사용하여 PO-P4 αMHC-GFP 트랜스제닉 신생 마우스로부터 마우스 심장 섬유모세포 (CF)를 단리시켰다 (문헌 [Burridge et al. (2012) Cell Stem Cell 10: 16-28]; [Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386]). 심장을 단리시키고, 다지고, 젤라틴 코팅된 플레이트 상에서 및 섬유모세포 외식편 배지 (EVIOM 중 20% FBS) 중에서 37℃에서 1주일 동인 인큐베이션시켰다. 조직을 2x PBS로 세척하고, 0.05% 트립신 중에서 5분 동안 분해하고, 섬유모세포 외식편 배지 중에 재현탁시켰다. 조직을 70 μM 필터를 통해 여과하고, 펠릿화시켰다. 펠릿화된 세포를 Thy-1-APC (항-마우스/래트 CD90.1 thy-1.1) (에바이오사이언스(Ebioscience: 미국 캘리포니아주 샌디에고))로 20분 동안 염색시키고, 앞서 기술된 바와 같이 PBS로 2x 세척하였다 (문헌 [Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386]). 세포를 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 APC+ 세포에 대하여 분류하고, 10 cm 젤라틴 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하고, 모든 연구를 위해 냉동시키지 않고 신선한 상태로 사용하였다.
문헌 [Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386]에 앞서 기술된 바와 같이, Thy1+ CF의 iCM으로의 직접적인 전환을 완료하였다. 간략하면, pMXs-Gata4, pMXs-Mef2c, pMXs-Tbx5, 폴리시스트론성 pMXs-Mef2c-Gata4-Tbx5 (GMT 폴리시스트론성) 또는 pMXs-dsRed를 앞서 기술된 바와 같이 구축하였다 (문헌 [Ieda et al. (2010) Cell 142:375-386]; [Wang, L., et al. (2015) Circ Res 116, 237-244 (2015)]). 앞서 기술된 바와 같이, 퓨젠(Fugene) HD (로슈(Roche))를 사용하여 레트로바이러스 벡터를 패키징하고, 옵티MEM(OptiMEM) (10 ㎍) 중에서, 섬유모세포 이식편 배지 중 ~80% 전면생장 플레이트(PlatE) 세포를 함유하는 15 cm 플레이트로 전달하였다 (문헌 [Qian, L., et al. (2012) Nature 485, 593-59]). 형질감염 후 48시간째에 바이러스 상청액을 수집하고, 이를 사용하여 심장 섬유모세포를 감염시키고, 0.6 ㎍/ml 폴리브렌 (케미콘(Chemicon))을 첨가하고, -1일째 심장 섬유모세포에 첨가하였다. 24시간 후, 0일째 배양 배지를 심근세포 배양 배지 (iCM 배지 (문헌 [Qian, L., et al. (2013) Nature Protocols 8: 1204-1215]))로 교체하고, 매 3-4일마다 교체하였다. 초기 약물 스크리닝 및 생체내 실험에서는 3가지 별개의 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5 레트로바이러스를 사용하였지만; 초기 스크리닝 이후의 추가 시험관내 실험을 위해서는 GMT 폴리시스트론성 레트로바이러스를 사용하였다.
약물 스크리닝을 위해, α-MHC-GFP 트랜스제닉 마우스로부터의 Thy1+ 신생 마우스 심장 섬유모세포를 2,000개의 세포/웰인 밀도로 384 웰 플레이트에 플레이팅하였다. 상기 기술된 바와 같이 세포를 GMT 레트로바이러스로 재프로그래밍하였다. 재프로그래밍 1일째, 바이러스를 iCM 배지로 교체하고, 바이오멕(Biomek) 액체 취급 로봇 스테이션을 사용하여 화합물을 웰에 첨가하여 1:1,000 희석률의 약물 라이브 농도를 달성하였다. 5,500개의 독물학적으로 시험되는 화합물로 이루어진 라이브러리 (예컨대, LOPAC, TOCRIS, LONZA, 및 SPECTRUM)를 스크리닝하였다. 재프로그래밍 14일째, 플레이트를 고정시키고, 면역화학법하에 기술된 바와 같이 GFP 및 트로포닌 T에 대해 염색하고, INCELL 시스템을 이용하여 초고속 대용량 영상화를 사용하여 영상화하였다. INCELL 영상 분석 패키지를 이용하여 데이터를 분석하였다.
면역세포화학적 분석 및 정량화를 위해, 앞서 기술된 바와 같이, 4% 파라포름알데히드 (PFA)를 이용하여 샘플을 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS (PBST) 중에서 2회에 걸쳐 세척하고, 실온에서 15분 동안 파워 블록 유니버셜 블로킹 리에이전트(Power Block Universal Blocking Reagent) (바이오게넥스(Biogenex), #HK085-5K)로 차단시켰다 (문헌 [Qian et al. (2013) Nature protocols 8: 1204-1215]). PBST 및 차단 완충제 중에 희석된 1차 항체 (1:1)를 함유하는 혼합물 중에서 샘플을 인큐베이션시키고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 하기 1차 항체를 사용하였다: 트로포닌 T, 심장 이소폼 Ab-1, 마우스 모노클로날 항체 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific) #MS-295-PO, 1:200), 모노클로날 항-α-액티닌 사코메트릭 항체 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich) #A7811, 1/200), 및 항-GFP (써모 사이언티픽 #A11120, 1:200). 샘플을 실온에서 매회 15분 동안 2회에 걸쳐 PBST로 세척한 후, PBST 및 차단 완충제 중에 희석된 2차 항체 (1:1)를 함유하는 혼합물 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 실온에서 매회 15분 동안 3회에 걸쳐 PBST로 세척하고, 시각화하였다. 이미지J 이미징 애널리시스 소프트웨어(ImageJ Imaging Analysis Software)를 이용하여 염색된 세포를 정량화하였다. 모든 비교를 위해 평균의 표준 오차를 계산하였다; p<0.05인 것을 통계학상 유의적인 것으로 간주하였다.
α-MHC 구동 GFP 리포터의 활성화에 의해 잠재적 iCM이 검출되었다. 384 웰 포맷에서의 본 직접적인 재프로그래밍 방법을 최적화한 후, 독물학적으로 시험되는 화합물로 이루어진 라이브러리 (예컨대, LOPAC, TOCRIS, 및 SPECTRUM 약물 라이브러리)로부터의 화합물을 초고속 대용량 영상화를 사용하여 스크리닝하였다 (도 1). GMT 형질도입 후 1일째 화합물을 첨가하고, 2주 후, α-MHC-GFP+ 세포를 정량화하였다. Z 점수가 5 초과인 26개의 상위 히트 (도 2)가 확인되었고, 입증 결과에 따르면, 상기 히트는 GFP+ iCM의 비율(%)을 2 내지 3배만큼 증가시켰다 (도 3). 상위 히트는 TGF-β 신호전달을 억제시키는 분자 3개 (SB431542, LDN-193189, 및 덱사메타손), WNT 신호전달을 억제시키는 분자 3개 (XAV939, IWR1, 및 미리세틴), 및 WNT 및 TGF-β 신호전달, 둘 모두를 억제시키는 분자 1개 (D4476) 뿐만 아니라, 항염증성 특성을 가지는 분자 (예컨대, 덱사메타손, DHA 및 피록시캄)를 포함한다 (도 3). 공통 경로 상에 있는 다중 히트는 상기 신호전달 경로가 심장 재프로그래밍에 영향을 주었다는 것을 제안하였다.
WNT 또는 TGF-β 억제제 중 어느 것이 재프로그래밍 품질을 가장 효과적으로 개선시키는지 확인하기 위해, 심장 및 섬유모세포 유전자 패널에 대해 qRT-PCR을 수행하였다. 간략하면, 시판용 키트 (다이렉트-졸 RNA 미니-프렙(Direct-Zol RNA Mini-prep), 자이모 리서치(Zymo Research))를 사용하여 전체 RNA를 단리시켰다. 올리고(dT) 및 랜덤 육량체 프라이머의 혼합물 (qRT-PCR용 슈퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드 신테시스 슈퍼믹스(Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR), 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))을 사용하여 역전사를 수행하였다. 7900HT FAST 실시간 PCR 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosysystems))을 사용하여 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 사용된 태크맨 프로브는 표 1에 열거되어 있다. 초고속 실시간 PCR 분석을 위해, 바이오마크 HD 시스템(Biomark HD system) (플루다임(Fluidigm)) 상에서 96.96 다이나믹 어레이 IFC(96.96 Dynamic Array IFC)를 사용하여 샘플을 분석하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
재프로그래밍 2주째에, SB431542가 섬유모세포 유전자 발현을 하향조절하는 데 있어 가장 효율적인 TGF-β 억제제였고, XAV939가 심장 유전자 발현을 활성화시키는 데 있어 가장 효율적인 WNT 억제제였다. SB431542 (2.6 μM) (도 4)는 재프로그래밍 1일째 첨가되었을 때 (도 5), 가장 효과적인 것으로 나타났다. XAV939의 최적의 타이밍 및 농도 확인을 위해, XAV939를 다양한 용량 및 타이밍으로 시험하였다. 5 μM이 가장 효과적인 용량이었고, 재프로그래밍 처음 8일 동안에는 어느 시점에 첨가되든 증진 효과는 동일하였다 (도 6). 2개의 소분자를 조합하였을 때, 재프로그래밍 1일째 SB431542를 첨가한 후, 2일째 XAV939를 첨가함으로써 최대 재프로그래밍 효율을 달성한 것으로 나타났다 (도 7). α-MHC-GFP+ iCM 증가로 나타난 바와 같이, 상기 프로토콜을 통해 심장 재프로그래밍은 ~9배 증가되었다 (도 8). 추가로, 프로그래밍 10일째 이후, 화합물은 없어도 되었다 (도 9).
실시예 2. SB431542 및 XAV939가 시험관내에서 iCM의 효율 및 품질을 증가시킨다.
소분자를 재프로그래밍 칵테일에 첨가하기 위한 타이밍, 용량, 및 조건을 입증하고, 최적화한 후, GMT 과다발현 섬유모세포를 1일째 SB431542 (2.6 μM)로 및 2일째 XAV939 (5 μM)로 처리하였다. GFP 발현의 FACS 분석을 위해, 재프로그래밍된 심장 섬유모세포를 배양된 디쉬로부터 수거하고, 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 LSR-II (BD) 상에서 분석하였다. 살아있는 세포 분류 및 분석을 위해, TRYPLE (써모 피셔(Thermo Fisher))를 사용하여 세포를 해리시키고, LSRII (BD) 기계를 이용하여 분류하였다. 고정 세포 FACS를 위해, 세포를 15 min 동안 포르말린으로 고정시키고, 0.1% v/v 트리톤 X-100을 투과시키고, 항-GFP (써모 피셔) 및 항-α-사코메트릭 액티닌 (시그마) 또는 항-심장 미오신 2 (써모 피셔) 항체, 이어서, 알렉사(Alexa)-594 (써모 피셔)와 접합된 2차 항체로 염색하였다.
1일째 SB431542 (2.6 μM) 및 2일째 XAV939 (5 μM)의 조합은 2주 이내에 심장 섬유모세포에서의 재프로그래밍 효율을 ~30%까지 증가시켰다 (도 10). SB431542 단독인 경우, 세포는 더욱 빠르게 성숙화되었고, 박동 세포는 일찍이 GMT 감염 후 3주째에 출현하였다. 놀랍게도, SB431542 및 XAV939 조합 결과, GMT 단독인 경우, 6-8주인 것과 비교하였을 때, 박동 세포는 일찍이 1주째에 출현하였다. GMT 단독인 경우, 4-6주인 것과 비교하여, GMT + SB431542/XAV939인 경우, 단지 재프로그래밍 2주 이후에 iCM에서 트로포닌 T 염색 및 진행성 근절 조직화 또한 관찰되었다.
앞서 기술된 바와 같이 칼슘 과도 상태를 사정하였다 (문헌 [Qian, L., et al. (2012) Nature 485:593-598]). 간략하면, 실온에서 30 min 동안 단리된 근세포에 플루오-4(Fluo-4)를 로딩한 후, 과융해 챔버로 옮겨 놓았다. 로딩 용액은 무수 DMSO 중의 5 mM 플루오-4 AM과 파워로드TM(PowerloadTM) 농축물 (인비트로겐(Invitrogen))의 1:10 혼합물을 함유하였고, 이는 현택된 근세포를 함유하는 세포외 타이로드 용액(Tyrode's solution) 내로 100배 희석되었다. 기록 측정 전, 탈에스테르화를 위해 추가의 20 min을 허용하였다. 관심 세포 양측에 배치되고, 장 자극기 (이온옵틱스(IonOptix), 미오페이서(Myopacer))에 연결된 백금 선 사이에 1 Hz에서 전압 펄스를 인가함으로써 수축 및 칼슘 과도 상태를 유발하였다. 표준 필터 세트 (#49011 ET, 크로마 테크놀러지(Chroma Technology))를 통해 플루오-4 형광 과도 상태를 기록하였다. 심장박동조율 정지 후, 휴지 형광을 기록하고, 실험 종료시 시야에서 세포를 주워, 제거한 후, 배경 광을 수득하였다. 명시야의 관심 세포에 빛을 조사한 후, 후속하여 CCD 카메라 (이온옵틱스 미오캠(IonOptix Myocam))로 바로 이어지도록 함으로써 칼슘 과도 상태와 함께 동시에 수축을 광학적으로 기록하였다. 비디오 모션 디렉터 (VED 205; 크레센트 일렉트로닉스(Crescent Electronics))를 통해 세포 길이 신호를 전압으로 전환시키고, 세포 길이 변화율(%)을 계산함으로써 상이한 근세포로부터의 수축 증폭을 정규화시켰다. 본 연구를 통해 ~50% 초과의 세포가 두 화합물 존재하에서 재프로그래밍 4주 이내에 자발적 칼슘 과도 상태를 보였다는 것이 밝혀졌다 (도 11).
심장 재프로그래밍 후 3, 5 및 6주째에 RNAseq를 사용하여 iCM 중의 유전자 발현 프로파일 또한 조사하였다. 본 실험을 위해, α-MHC-GFP+ 시험관내 마우스 iCM, TNT-GFP+ 인간 iCM, 및 대조군 dsRed 감염된 심장 섬유모세포 (모의)를 FACS 아리아 II(FACS Aria II) 세포 분류기로 분류하였다. RNAseq를 위해 살아있는 세포를 분류하기 위하여, α-MHC- GFP 마우스 심장 섬유모세포 또는 hTNT-GFP+ 재프로그래밍된 인간 심장 섬유모세포를 디쉬로부터 해리시키고, 아리아 II FACS 분류기를 이용하여 GFP+ 발현에 대하여 분류하였다. 생체내 재프로그래밍된 iCM의 랑겐도르프(Langendorff) 단리 후, iCM을 그의 페리오스틴 cre YFP 리포터 발현에 기초하여 마이크로피펫을 이용하여 채취하였다. 퀴아젠(Qiagen), miRN이지 마이크로 키트(miRNeasy Micro Kit) #210874를 사용하여 그의 RNA를 단리시켰다. 오베이션 RNA-seq 시스템 v2 키트(Ovation RNA-seq System v2 Kit) (NuGEN)를 사용하여, 전체 RNA (20-50 ng)를 역전사시켜 랜덤 육량체 및 폴리-T 키메라 프라이머의 조합을 이용하여 제1 가닥 cDNA를 합성하였다. 이어서, 가열하여 RNA 주형을 부분적으로 분해시키고, DNA 폴리머라제를 사용하여 제2 가닥 cDNA를 합성하고, 이어서, 단일 프라이머 등온 증폭 (SPIA)을 이용하여 이중 가닥 DNA를 증폭시켰다. SPIA는, RNase H가 이중 가닥 DNA의 5' 단부에서 DNA/RNA 이종이중체 중의 RNA를 분해한 후, SPIA 프라이머가 cDNA에 결합하고, 폴리머라제가 기존 정방향 가닥을 치환시킴으로써 프라이머의 3' 단부에서 복제를 시작하는 것인 선형 cDNA 증폭 프로세스이다. 이어서, 랜덤 육량체를 사용하여 제2 가닥 cDNA를 선형으로 증폭시켰다. 코바리스 S2(Covaris S2) 초음파 분쇄기를 사용하여 cDNA 샘플을 평균 크기 200 bp로 단편화시켰다. 오베이션 울트라로우 V2 키트(Ovation Ultralow V2 kit) (뉴겐(NuGen))를 사용하여 단편화된 cDNA로부터 라이브러리를 제조하였다. 단부 수복 및 결찰 후, 라이브러리를 9 사이클로 PCR 증폭시켰다. 하이-센시티비티 DNA 칩(High-Sensitivity DNA chips)(애질런트(Agilent)) 상의 바이오애널라이저(Bioanalyzer)에 의해 라이브러리의 품질을 사정하고, qPCR (KAPA)에 의해 농도를 정량화하였다. 단일-리드, 50-사이클 서열분석 실행으로 HiSeq 2500 서열분석기 (일루미나(Illumina)) 상에서 라이브러리를 서열분석하였다. 앞서 보고된 바와 같이 RNAseq-분석 파이프라인을 사용하였다 (문헌 [Theodoris, C.V., et al. (2015) Cell 160: 1072-1086]).
상위의 차별적으로 발현된 유전자에 대한 주성분 분석 (PCA) 및 열 지도에 의해 반영된 바와 같이, 단일 화합물로 처리된 iCM이 아닌, SB431542 및 XAV939 (GMTc)로 처리된 iCM만이 오직 3주 동안 더 많은 심근세포 유사 전사 프로파일을 보였다 (도 12). 5 또는 6주 동안의 GMTc에 의한 재프로그래밍 결과, 유전자 발현 프로파일은 GMT 단독으로 수행된 재프로그래밍 경우에서보다도 성체 마우스 심실 심근세포에 더 가까웠다 (도 12). SB431542 및 XAV939 (+SBXAV)를 GMT 형질도입된 섬유모세포에 첨가한 결과, GMT 단독인 것 (-SBXAV)과 비교하였을 때, 재프로그래밍 상태는 심근세포 (CM) 상태에 더 가깝게 진행되었다. GMT 존재하에 SB431542 (+SB) 단독 또는 XAV939 (+XAV) 단독인 것은 그 어느 것도 상기와 같은 효과를 보이지 않았다.
추가로, 3, 5 또는 6주 동안 GMTc로 재프로그래밍된 iCM은 심근세포와 유사하게, TGF-β 및 WNT 신호전달과 관련된 유전자 온톨로지 (GO) 용어를 가지는 유전자를 유의적으로 하향조절하였다. 5주째 GMT와 GMTc 사이의 유전자 발현 프로파일을 비교해 본 결과, 상위의 차별적으로 조절된 GO 용어는 세포외 기질, 이온 채널, 및 근육 형성 조절과 관련이 있는 것으로 나타났다 (도 13). 가장 고도로 발현된 심장 수축, 이온 취급, 및 세포외 기질 유전자에 관하여 더욱 면밀한 분석을 수행하였을 때, 화합물은 비록 완전하지는 않지만, 상기 유전자의 발현이 성체 심근세포의 것에 매우 가까워지도록 만든 것으로 나타났다. 따라서, TGF-β 및 WNT 신호전달을 억제시키는 것이 시험관내에서 세포 운명 전환의 품질 및 속도, 둘 모두를 증가시켰다.
실시예 3. SB431542 및 XAV939는 정규 TGF -β 및 WNT 신호전달을 억제시킴 으로써 심장 재프로그래밍을 증진시킨다.
이어서, 소분자가 TGF-β 및 WNT 신호전달을 조절하는 기전에 대해 조사하였다. 20 ㎍의 단백질을 함유하는, 세포 용해물로부터의 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (바이오래드(BioRad)) 상에서 전기영동에 의해 이동시켰다. 이어서, 막을 PBS 중에서 세척하고, 차단 완충제 (Li-코르(Li-cor))로 처리한 후, 4℃에서 밤새도록 1차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 하기 1차 항체를 사용하였다: 항-GAPDH 항체 로딩 대조군 (압캠(Abcam) #ab9484, 0.5 ㎍/ml), 항-활성 β-카테닌 항체 (밀리포어(Millipore) #05-665, 1:1,000), 항-T-항원 (압캠 #abl6879, 1:1,000), 및 항-포스포-Smad2/3 (셀 시그널링(Cell Signaling) #8685S, 1:1,000). 막을 PBS 중에서 세척하고, 실온에서 1시간 동안 적절한 2차 항체 (Li-코르, IRDye 600LT; IRDye 800CW, 1: 10,000)와 함께 인큐베이션시켰다. 막을 세척하고, 오딧세이 Fc 듀얼 모드 이미징 시스템(Odyssey Fc Dual-mode Imaging System)으로 시각화하였다.
SMAD2/3 (TGF-β 활성화의 지표)의 인산화 및 활성 β 카테닌 (WNT 활성화의 지표)의 발현은 SB431542 또는 XAV939에 의해 유의적으로 감소되었다. 또한, TGF-β 또는 정규 WNT 신호전달 활성화는 각각 SB431542 또는 XAV939에 의해 유도된 재프로그래밍 효율 증가를 역전시킨 것으로 관찰되었다. 재프로그래밍 동안의 과량의 TGF-β1 리간드 첨가는 SB431542의 효과를 역전시켰고, SB431542 및 XAV939의 조합 효과를 부분적으로 억제시켰지만; TGF-β 신호전달의 다른 측면을 조절하는 BMP4는 심장 재프로그래밍에 유의적인 영향을 미치지 않았다 (도 14). 더욱이, 구성적으로 활성을 띠는 SMAD2 또는 SMAD3 (TGF-β 신호전달 이펙터)의 과다발현은 SB431542에 의한 심장 재프로그래밍 증진을 무효화시켰다 (도 15). SB431542는 액티빈 수용체 유사 키나제 (ALK) 4 및 ALK5 수용체를 특이적으로 억제시키기 때문에, siRNA를 이용한 ALK4 또는 ALK5의 넉 다운이 직접적인 심장 재프로그래밍에 미치는 효과를 시험하였다. ALK4 또는 ALK5의 ~80% 감소 (도 16)는 SB431542와 유사하게, 직접적인 심장 재프로그래밍을 증진시켰다 (도 16). 유사하게, 정규 WNT 신호전달을 활성화시키는 WNT3a는 SB431542 및 XAV939가 심장 재프로그래밍에 미치는 효과를 부분적으로 차단하였지만; WNT5 또는 WNT11을 통한 비-정규 WNT 경로 활성화는 어떤 유의적인 효과도 없었다. 추가로, 정규 WNT 경로를 활성화시키는 글리코겐 신타제 키나제 3β (GSK3P) 억제제 CHIR99021 첨가는 SB431542 및 XAV939의 조합 효과를 역전시켰다 (도 17). 따라서, SB431542 및 XAV939는 TGF-β 및 정규 WNT 신호전달을 억제시킴으로써 심장 재프로그래밍을 증진시킨다.
실시예 4. TGF -β 및 WNT 억제제는 생체내 심장 재프로그래밍을 증진시킨다.
앞서, GMT로 성공적으로 재프로그래밍된 섬유모세포의 생체내에서의 iCM로의 심근내 주사가 심장 기능을 증가시켰고, 손상 후 반흔 크기는 감소시켰지만, 심장 기능을 완전히 회복시키지는 못한 것으로 밝혀진 바 있다 (문헌 [Qian, L., et al. (2012) Nature 485:593-598]). 관상동맥 결찰 후 2주 동안 매일 복강내로 SB431542 (10 mg/kg/일) 및 XAV939 (2.5 mg/kg/일)를 주사하고, GMT 코딩 레트로바이러스를 심근내 주사하여 (GMTc) TGF-β 및 WNT 신호전달을 억제시키는 것이 생체내에서 심장 재프로그래밍에 미치는 효과를 시험하였다.
동물 연구를 위해, Postn-Cre 마우스 및 Rosa26-EYFP 마우스를 교배시켜 Postn-Cre:R26R-YFP 마우스를 수득하였다. 동물 수술에 관한 프로토콜은 캘리포니아 대학(University of California), 샌프란시스코 실험 동물 운영 위원회(San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 것이었다. 모든 수술은 앞서 기술된 바와 같이 수행되었다 (문헌 [Qian, L., et al. (2012) Nature 485:593-598]). 간략하면, 마우스를 2.4% 이소풀루란/97.6% 산소로 마취시키고, 가열 패드 (37℃) 상에 바로 누운 자세로 배치시켰다. 19 G 스텀프 니들을 이용하여 동물에 관을 삽입하고, 미니벤트 타입 845(MiniVent Type 845) 마우스 산소 호흡기 (휴고 삭스 일레트로닉-하버드 애퍼레터스(Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus); 박출량, 250 ㎕; 호흡률, 분당 120회 호흡)를 이용하여 실내 공기를 공급하였다. 문헌 [Qian, L., et al. (2012) Nature 485:593-598]에 기술된 바와 같이, 7-0 프로렌 봉합사를 이용하여 좌전 하행 (LAD) 동맥을 영구적으로 결찰시킴으로써 심근 경색 (MI)을 유도하였다. 모의 수술을 받은 동물은 수술 대조군으로서의 역할을 하였고, 이는 실험 동물과 동일한 처치를 받되, 단, 예외적으로, LAD는 결찰되지 않았다. 농축된 바이러스 풀 (GMT)을 혼합하고, 10 ㎕의 혼합된 바이러스 및 10 ㎕의 PBS를 도입된 29-G 니들 (BD)을 이용하여 인슐린 시린지를 통해 심근 내로 주사하였다. 관상동맥 동맥 폐색 후, 창백해진 경색 부위에 기초하여 경색 구역과 경계 구역 사이의 경계선을 따라 전체 투여량을 사용한 주사를 수행하였다. 2일째부터 15일째까지, 동물은 매일 SB431542 (10 mg/kg/일) 및 XAV939 (2.5 mg/kg/일)의 복강내 주사를 맞았다.
심장 기능 사정을 위해 MI 이전, 및 MI 이후 1, 2, 4, 8 및 12주째에 연속 심장초음파검사를 수행하였다. 15 MHz 선형 배열 초음파 변환기가 장착된 베보 770 하이-레졸루션 마이크로-이미징 시스템(Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System) (비주얼소닉스(VisualSonics))을 이용하여 심장초음파검사를 수행하였다. 120 Hz인 프레임 속도로 흉골연 장축 및 단축 단면도, 둘 모두에서 좌심실을 사정하였다. 수축말기 또는 확장말기이란, 각각 좌심실이 가장 작게 및 크게 보이는 단계로서 정의되었고, 이는 박출률 측정을 위해 사용되었다. 단축률을 계산하기 위해, 유두근에서 50 mm/s의 스윕 속도로 좌심실 M-모드 추적으로부터 좌심실 수축말기 및 확장말기 직경을 측정하였다. B-모드는 수축말기 및 확장말기 크기의 2차원적 측정을 위해 사용하였다.
실험 종료시 (MI 후 12주째), 동물을 자기 공명 영상 (MRI)에 노출시켜 심장 구조 및 기능을 사정하였다. 애질런트 영상화 콘솔과 인터페이스된 7T 임상전 수평 보어(bore) 자석을 이용하여 생체내 MRI 영상화를 수행하였다. 98% 산소 존재하의 2% 이소풀루란 흡입에 의해 동물을 마취시키고, 내경 (ID)이 28 mm인, 자가제(home-built)이고, 선형으로 분극화된 새장 코일 내로 배치시켰다. 영상화 실험 동안 체온을 34℃로 유지시켰다. MRI-호환형, 소형 동물 생명 유지 장치 (SA 인스트루먼츠 인크.(SA Instruments Inc.: 미국 뉴욕주 스토니 브룩))를 이용하여 동물의 심장박동, 브레딩, 및 체온을 모니터링하였다. 하기 파라미터와 함께, 스카우트 영상으로부터 마우스 심장의 위치 및 장축 및 단축을 측정하였다: 반복 시간 (TR), 10 msec; 에코 시간 (TE), 4 msec; 여기 플립 각, 20도; 시야 (FOV), 6 ㎠; 매트릭스 크기, 128x128; 슬라이스 두께, 1 mm; 반복 횟수, 2. 대조군 및 경색된 심장의 기능성 파라미터 평가를 위해, 스핀 에코 펄스 연쇄를 이용하여 단축의 MRI 영상을 획득하였다. 획득 파라미터는 TR=1 sec, TE=10 msec, 평면내 영상 해상도 = 200 □m, 및 획득 시간 = ~20 min (심박수에 따라 달라짐). 심장 및 호흡 게이팅을 이용하였다. 박출률을 측정하기 위해, 확장기 (R-심장-피크 이후 0 지연) 및 수축기 (R-피크로부터 R-R 간격 지연의 45%)에 심장의 단축 슬라이스 9 또는 10개를 획득하였다.
상기 사정 후, 조직학적 연구를 위해 동물을 희생시키고, 심장을 수거하였다. 바이러스 전달 및 관상동맥 동맥 결찰 이후 12주째에 심장에 대하여 표준 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome) 염색을 수행하였다. 반흔 크기를 측정하기 위해, 이미지프로(ImagePro) 소프트웨어를 사용하여 MI 심장의 좌심실 내에 4개 층에 걸쳐있는 횡단면 상의 반흔 부위 (청색) 및 건강한 부위 (적색)를 측정하였다. 각 층으로부터, 4개의 조직 슬라이스를 기술상 4개의 부본으로서 측정하였다 (총 16개의 절편에 대해).
심장초음파검사에 의해 사정된 박출률 (EF) 변화로 반영되는 바와 같이 (도 18), GMT 단독으로 처리한 것과 비교하였을 때, GMTc는 심장 기능을 유의적으로 증진시켰다. GMT 단독으로 처리된 동물과 비교하였을 때, GMTc 처리는 심장 기능을 유의적으로 보존하였다. 기능 개선은 일찍이 MI 후 1주째에 발생하였고, 이는 재프로그래밍 속도 증가를 보인 시험관내 관찰 결과와 일관되는 것이었다. 억제제 단독으로는 심장 기능에 유의적인 영향을 미치지 못했다. MI 후 12주째, 가장 정확한 측정 형태이기 때문에, 맹검 방식의 자기 공명 영상 (MRI)을 수행하여 심장 구조 및 기능을 평가하였다. 오직 GMTc로 처리된 군에서만 경색 부위 내에서 두꺼운 근육이 관찰되었고, 심지어 심장 첨단부에서도 관찰되었다. 박출량 (SV), EF, 및 심박출량 (CO) 변화에 의해 사정되는 바와 같이 (도 19), MRI에 의해 밝혀진 심장 기능은 GMT 단독으로 처리된 동물과 비교하였을 때, GMTc로 처리된 동물에서 유의적으로 개선된 것으로 나타났다.
조직학적 분석을 수행하여 처리된 심장의 경색 부위 내의 반흔 크기를 정량화하고, 근육의 존재를 검출하였다. 생체내 영상화 관찰 결과와 일관되게, 근세포의 스레드는 이전 보고와 유사하게, GMT 단독으로 처리된 심장의 경색 부위 내에서 발생하였지만; GMTc로 처리된 동물로부터 단리된 심장에서는 경색 구역 내에서 근세포의 두꺼운 밴드가 관찰된 것으로 나타났다. 상기의 재근육화가 재프로그래밍에 기인한 것인지 확인하기 위해, ROSA-Lox-Stop-Lox-YFP 마우스를 페리오스틴Cre 마우스와 교배시켜 ROSA-YFP/페리오스틴-Cre 계통 추적 마우스를 생성하였다. 상기 마우스는 오직 섬유모세포에서만 YFP를 발현하고, 그러므로, 그의 자손은 내인성 심근세포로부터 섬유모세포 유래 심근세포를 구별한다 (도 20). 상기 세포는 트로포닌 T 및 YFP 리포터에 대하여 양성으로 염색되었는 바, 경색 부위 주변의 재근육화는 새로 형성된 iCM에 기인하는 것으로 나타났다. 그러나, 대조군에서 또는 경색 부위로부터의 원위부에서는 YFP+ 세포가 관찰되지 않았다.
생체내 iCM의 기능성 및 품질을 사정하기 위해, 랑겐도르프 표본을 사용하여 ROSA-YFP/페리오스틴-Cre 마우스로부터 iCM을 단리시켰다. 최소로 수정하여 문헌 [Qian, L., et al. (2012) Nature 485:593-598]에 기술된 바와 같이 성체 심근세포 (CM)를 단리시켰다. 간략하면, 성체 마우스를 이소풀루란으로 마취시키고, 기계로 공기를 공급하였다. 심장을 제거하고, 랑겐도르프 장치에서 3 ml/min의 일정한 유량으로 대동맥 관삽입술을 통해 역방향으로 관류시켰다. 37℃에서 5 min 동안 1.5 nM 인슐린, 필수 비타민 (기브코(GIBCO)), 및 필수 mM 아미노산 (기브코) (pH 7.4)과 함께 116 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 6.7 mM MgCl2, 12 mM 글루코스, 2 mM 글루타민, 3.5 mM NaHCO3, 1.5 mM KH2PO4, 1.0 NaH2PO4, 21 HEPES를 함유하는 비텐베르크 단리 배지(Wittenberg Isolation Medium: WIM)를 심장에 관류시킨 후, 이어서, 10 min (세포-세포 커플링 실험에서 사용된 쌍별 CM인 경우, 4 min) 동안 분해 용액 (0.8 mg/ml 콜라게나제 II 및 10 μM CaCl2로 보충된 WIM)을 관류시켰다. 이어서, 무손상일 때 (조직이 느슨하게 연결되어 있을 때), 심장을 랑겐도르프 장치로부터 제거하였다. 이어서, 원하는 부위 (즉, 경계/경색 구역)를 현미경하에서 미세해부하고, 기계로 해리시키고, 분쇄시키고, 저칼슘 용액 (5 mg/ml 소 혈청 알부민, 10 mM 타우린, 및 150 μM CaCl2로 보충된 WIM) 중에 재현탁시켰다. 이어서, 세포를 저속으로 회전시키고, 상청액을 제거하고, 연속으로 세척하여 칼슘을 점진적으로 재도입시켰다. 전기생리적 실험을 위해, 세포를 단리 당일 사용하였고, 기록할 때까지, 실온에서 (21℃) 5 mM 크레아틴, 2 mM l-카르니틴, 5 mM 타우린, 및 1.5 nM 인슐린으로 보충된 M199 (기브코) 중에서 보관하였다. 면역조직화학법을 위해, 세포를 단리 당일 라미닌으로 코팅된 배양 슬라이드 상에 플레이팅하고, 부착시키고, 고정시켰다. RNAseq, 수축성 분석, 및 칼슘-과도 상태 측정을 위해, 단리 후 즉시 형광 현미경하에서 페리오스틴-Cre:R26R-YFP 신호 존재에 기초하여 마이크로피펫에 의해 수동으로 iCM을 선별하였다.
YFP+ iCM의 개수는 GMT 단독으로 처리된 동물과 비교하였을 때, GMTc로 처리된 동물에서 5배만큼 유의적으로 증가되었다 (도 31). GMT 또는 GMTc로 처리된 마우스로부터 단리된 iCM은 모두 성체 심근세포와 유사하게, 막대 형상의 세포였고, 잘 조직화된 근절 구조를 형성하였다. 수축성 면에 있어서, GMT로 처리된 마우스로부터 단리된 세포 모두 자발적 칼슘 과도 상태를 보였지만, GMTc 마우스로부터 단리된 세포 중 70% 초과의 세포는 자발적으로 박동하지 않았다. 그러나, 상기 세포는 외부의 전기 자극과 동조화되었고, 이는 표현형이 더욱 성숙화된 것임을 나타내는 것이다 (도 31).
RNA-seq 또한 수행하여 생체내 재프로그래밍된 심장으로부터 단리된 대조군 심근세포, GMT iCM, 및 GMTc iCM 사이의 전체 트랜스크립톰 변화를 비교하였다. PCA 분석에 의해 반영되는 바와 같이 (도 22), GMT iCM보다 GMTc iCM의 유전자 발현이 성체 심실 심근세포와 더욱 유사하였지만, 신생 마우스 심근세포와는 상이하였다. 추가로, GMTc iCM에서는 성체 심근세포와 유사하게, TGF-β 및 WNT 신호전달과 관련된 GO 용어를 가지는 유전자가 더욱 완전히 하향조절된 것으로 나타났다. GMT iCM과 GMTc iCM 사이에 적어도 2배만큼 차별적으로 조절된 유전자에 대한 GO 분석 결과, GMTc에서 세포 분열 및 유사 분열에 관여하는 유전자는 하향조절된 것으로 나타났고, 그뿐만 아니라, 대사성 유전자 및 cAMP 관련 유전자는 상향조절된 것으로 나타났으며, 이는 더욱 성숙한 표현형인 경우에 나타나는 것과 일관된 것이었다 (도 23). 고도로 발현된 주요 심장 및 섬유모세포 유전자의 변화에 초점을 맞추었을 때, GMT iCM과 비교하였을 때, GMTc iCM은 심장 유전자의 더욱 완전한 상향조절, 및 섬유모세포 유전자의 더욱 완전한 하향조절을 보인 것으로 나타났다.
실시예 5. TGF -β 및 WNT 억제제는
인간 성인 심장 섬유모세포의 재프로그래밍을 증진시킨다.
GMT 단독으로는 인간 섬유모세포를 재프로그래밍하는 것이 충분하지 않은 것으로 앞서 보고된 바 있지만, GMT와 조합된 ESSRG, MYOCD, ZFPM2, 및 MESP1 (7F)은 마우스에서와 것과 유사한 품질로 인간 세포를 재프로그래밍할 수 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Fu, J.D., et al. (2013) Stem Cell Reports 1:235-247]). 여기서, 7F에 의해 유도된 인간 심장 재프로그래밍에 SB431542 및 XAV939를 첨가하는 것이 미치는 효과에 대해 시험하였다.
심실 정상인 인간 심장 섬유모세포 (HCF)를 론자(Lonza)로부터 구입하였다. 가장 관련성이 높은 섬유모세포 유형을 사용하기 위해, 플록스된 T-항원을 이용하여 성인 인간 심장 섬유모세포의 가역적 무한증식 세포주를 생성하였다. 안정적인 무한증식 세포주를 생성하기 위해, 퓨로마이신 선별 카세트 (애드진(Addgene) 플라스미드 #18922)를 함유하는 플록스된 인간 T-항원 렌티바이러스로 세포를 감염시켰다. 5일 동안 1 ㎍/ml 퓨로마이신을 사용하여 세포를 선별하였다. 이어서, 재프로그래밍 당일 Cre 바이러스로 세포를 감염시켜 T-항원을 잘라내었다. 앞서 기술된 바와 같이 재프로그래밍을 수행하였다 (문헌 [Fu, J.D., et al. (2013) Stem Cell Reports 1:235-247]). 간략하면, 7개의 인간 심장 발생 인자 (Gata4, Mef2c, Tbx5, 미오카르딘, Esrrg, Mesp1, 및 Znfpm2)를 코딩하는 pMX 레트로바이러스 벡터를 플래티넘-A(Platinum-A) (셀 바이오랩스(Cell Biolabs)) 세포 형질감염시켜 바이러스를 생성하였다. 48 h 후, 바이러스 함유 상청액 풀을 HCF에 형질도입시키고, 6 ㎍/ml 폴리브렌을 보충해 주었다. 이어서, 배지를, 감염 후 24 h째 SB431542 (2.6 μM), 및 감염 후 48 h째 XAV939 (5 μM)를 함유하는 iCM 배지 [DMEM:M199 (4:1), 10% FBS, 1x 비필수 아미노산 (NEAA), 1x 페니실린/스트렙토마이신]로 교체하였다. 재프로그래밍 및 세포 분류를 시각화하기 위해, 재프로그래밍된 HCF에 plx-hTNT-GFP 또는 plx-hTNT-GCaMP5를 형질도입시켰다. 간략하면, plx-hTNT-GFP 또는 plx-hTNT-GCaMP5를 렌티바이러스 패키징 플라스미드 pMD2.G 및 psPAX2와 함께 퓨젠 HD를 사용하여 HEK 293FT 세포로 형질감염시켜 렌티바이러스를 생성하였다. 48 h 후, HCF를 밤새도록 형질도입시키고, 6 ㎍/ml 폴리브렌을 보충해 주었다. 재프로그래밍 4일째, B27 보충물을 포함하는 RPMI1640을 그가 15일째 iCM 배지 완전히 교체할 때까지, iCM과 함께 25% 증분으로 매 3일마다 첨가하였다.
TNT-GCaMP 리포터를 사용하여 심장 재프로그래밍을 검출한 결과 (도 24), 7F + SB431542 및 XAV939 (7Fc)는 7F에 의해 재프로그래밍된 iCM의 비율(%)을 배가시킨 것으로 나타났다 (도 25). 7Fc에 의해 재프로그래밍된 iCM은 또한 일찍이 3주째에 근절 형성을 보였다. 추가로, 7Fc에 의한 재프로그래밍 불과 10일만에, 및 재프로그래밍 3주 이내에 칼슘 스파크가 발생하였고, 이러한 칼슘 과도 상태는 세포 전역에 걸쳐 더욱 균질해졌다. 4주 이내, 7F에 의해 재프로그래밍된 iCM의 경우, 5% 미만인 것과 비교하여, 7Fc에 의해 재프로그래밍된 iCM 중 50% 초과의 것이자발적 칼슘 과도 상태를 보였고, 이는 잠재적으로는 그의 성숙도를 나타내는 것이다 (도 26).
재프로그래밍된 세포의 품질을 사정하기 위해, 화학물질의 존재하에 또는 부재하에서 7F로 유도된 재프로그래밍 4주 후에 RNA-seq를 수행하였다. 실제로, PCA에 의해 제시된 바와 같이 (도 27), 7F iCM과 비교하여 7Fc iCM의 유전자 발현 프로파일 변화는 가속화되었다. 4FC에 의한 재프로그래밍은 7Fc, 및 리포터로서 TNT-GFP를 사용하였을 때의 재프로그래밍 결과와 유사한 결과를 낳았다. 추가로, WNT 및 TGF-β 신호전달 경로의 유전자 발현은 7F iCM과 비교하여 7Fc iCM에서 유의적으로 하향조절되었다. 7F iCM과 7Fc iCM 사이에 적어도 2배만큼 차별적으로 조절된 유전자에 대한 GO 분석을 수행하였고, 마우스 재프로그래밍에서 나타난 것과 유사하게, 이들 유전자들은 대개 세포외 기질 형성, 및 콜라겐의 하향조절 뿐만 아니라, 칼슘, 및 이온 수송 관련 유전자 상향조절에 관여한 것으로 나타났다 (도 28). 주요 심장 및 섬유모세포 유전자에 대해 더욱 면밀히 살펴본 결과, 화학물질이 심장 유전자의 발현을 유의적으로 증진시켰고, 섬유모세포 유전자의 발현을 억제시킨 것으로 나타났다. 4FC에 의한 재프로그래밍은 7Fc, 및 리포터로서 TNT-GFP를 사용하였을 때의 재프로그래밍 결과와 유사한 결과를 낳았다.
종합해 보면, 상기 데이터는 소분자를 이용하여 TGF-β 및 WNT 신호전달을 억제시키는 것이 시험관내 및 생체내에서 출생 후 마우스 및 인간 심장 섬유모세포의 심장 재프로그래밍을 유의적으로 증진시켰다는 것을 나타낸다.
놀랍게도, TGF-β 신호전달은, ALK5 (TGF-β 타입 I 수용체), ALK4, 및 ALK7을 선택적으로 억제시키는 소분자인 SB431542로 상기 경로를 억제시킴으로써 직접적인 심장 재프로그래밍을 위해 필수적이라는 것 또한 발견되었다.
흥미롭게도, RNA-seq 데이터를 통해 시험관내 및 생체내 GMTc iCM은 신생아 심근세포보다는 성인 심실 심근세포와 더욱 일관된 유전자 발현 프로파일을 가지는 것으로 밝혀졌다. 놀랍게도, 시험관내 및 생체내에서 GMTc iCM에서의 특정 심장 유전자의 RNA 발현 수준은 실제로 단리된 대조군 내인성 심근세포에서보다 더 높았다 (예컨대 TNNT, ACTC1, ACTN2, MYH7 및 RYR2). 이러한 예상 밖의 관찰 결과는 iCM이 여전히 재프로그래밍되고 있는 중이며, 이로써, 그의 세포 운명 전환을 지원하기 위해 상기 계통 특이적 유전자를 더 높은 수준으로 활발히 전사시키고 있다는 것을 반영할 수 있다. 대안적으로, 이들 유전자는 외인성 GMT의 지속적인 활성에 대해 특별히 감수성을 지닌 표적을 나타낼 수 있다. 그럼에도 불구하고, GMTc는 시험관내 및 생체내에서 섬유모세포 유전자 대부분을 성인 심실 심근세포 수준과 유사한 수준으로 효율적으로 하향조절하였다.
실시예 6. 종래 7F 시스템보다 더 적은 개수의 인자에 의한
인간 섬유모세포의 재프로그래밍
인간 섬유모세포의 심근세포로의 충분한 전환분화를 위해 필요한 것으로 앞서 보고된 7F 재프로그래밍 인자 중 어느 하나 또는 그의 조합이 비필수적인지 여부를 측정하기 위해, 단일 인자, 및 다중 인자의 다양한 조합을 제거해가면서 재프로그래밍을 사정하였다.
먼저, 7Fc 중 단일 인자가 제거될 수 있고, 인간 심장 섬유모세포를 여전히 완전하게 재프로그래밍하는지 여부를 알아보기 위해 상기 단일 인자 제거를 시험하였다. 한 번에 하나의 인자를 제거함으로써, Mesp1, ZFPM2, 또는 ESSRG 부재하에서의 인간 섬유모세포의 재프로그래밍은 7Fc 재프로그래밍 방법과 비교하였을 때, 유사한 유전자 발현 프로파일을 가져온 것으로 나타났다. 추가로, 두 인자의 상이한 조합을 제거하였을 때, 유사한 유전자 발현 프로파일은 (1) Zfpm2 및 Esrrg, 및 (2) Zfpm2 및 Mesp1의 조합의 부재하에 SB431542 및 XAV939의 존재하에서의 재프로그래밍으로부터 일어난 것으로 나타났다. 한편, 미오카르딘은 인간 섬유모세포의 심근세포로의 효율적인 재프로그래밍을 위해 특히 중요한 것으로 보였다. 재프로그래밍 칵테일로부터 미오카르딘을 제거하였을 때, 심근세포 유전자의 발현은 감소되었고, 섬유모세포 유전자의 잔류 발현은 증가되었다.
놀랍게도, 또한, SB431542 및 XAV939의 존재하에서 재프로그래밍되었을 때에는 단지 4개 인자: GATA4, MEF2C, TBX5, 및 미오카르딘 (4Fc)만으로도 동일한 정도의 재프로그래밍이 달성될 수 있는 것으로 나타났다. FACS 분석 결과, 4Fc 방법을 사용하였을 때, 유사한 비율(%)의 TNT+ iCM을 수득한 것으로 나타났고, 면역형광을 통해 4Fc 및 7Fc 유도 iCM에서의 고도로 조직화된 근절 조직화가 나타났다 (도 29, 30). 특히, 재프로그래밍 인자 칵테일로부터 Mesp1, Zfpm2, 및 Esrrg의 제거는 7Fc 재프로그래밍 방법으로 재프로그래밍된 인간 섬유모세포와 비교하였을 때, 심근세포 유전자의 유사한 발현 수준을 나타내었다.
놀랍게도, SB431542 및 XAV939의 존재하에서, 인간 섬유모세포는 단지 3개의 인자 조합, 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5 (MMT)만으로도 심근세포로 효율적으로 재프로그래밍될 수 있다는 것이 발견되었다. TNT-GFP 리포터의 발현 증가로 제시된 바와 같이, MMT의 조합은 SB431542 및 XAV939의 존재하에서 심장 재프로그래밍을 유도하는 데 충분하다. 항염증제 (덱사메타손) 첨가 또한 SB431542 및 XAV939의 존재하에서 MMT 재프로그래밍을 가능하게 하는 것으로 나타났다 (데이터는 나타내지 않음). 추가로, MMT 및 화합물의 조합으로 트로포닌-T 양성 세포가 출현하게 되었고, 재프로그래밍 3주 이내에 근절 조직화가 진행되었다.
실시예 7: MMTc 재프로그래밍에서 덱사메타손과 함께 siRNA의 사용
TGF-β 수용체 1 및 탄키라제 1에 대한 siRNA를 사용하여 MMTc의 소분자 화학적 억제제를 대체할 수 있는 siRNA 분자에 대한 능력을 시험하였다. 소형 간섭 RNA를 사용하는 것이 인간 섬유모세포를 iCM으로 재프로그래밍하는 데 있어 유사하게 효율적인 것으로 나타났고, TGF-β 수용체 1 및 탄키라제 1에 대한 siRNA는 각각 재프로그래밍 활성에 있어서 SB431542 및 XAV939와 본질적으로 등가인 것으로 보였다 (도 32).
간략하면, 재프로그래밍 -1일째 낮에 RNAiMAX를 사용하여 100 nM siRNA/웰인 농도로 20,000개의 세포/웰을 형질감염시키고, 24시간 후 형질감염 반응물을 제거하였다. 실험 0일째, MMT를 코딩하는 레트로바이러스로 인간 심장 섬유모세포를 감염시키고, 24시간 후 제거하였다. 이어서, 앞서 기술된 바와 같이 재프로그래밍을 수행하였다 (문헌 [Mohamed TMA et al., Circulation. 2017;135:978-995]. 간략하면, 1일째 각각이 3개의 재프로그래밍 인자 중 하나를 코딩하는 것인, 3개의 별개의 레트로바이러스 벡터의 칵테일을 사용하여 HCF를 감염시키고, 24시간 후, 과량의 바이러스를 제거하였다. 레트로바이러스는 실험 전 기간 동안 게놈 내로 통합되어 상태 그대로 유지되어 있다. 1일째부터 8일째까지 SB431542 (2.6 uM)를 첨가하고, 2일째부터 8일째까지 XAV9393 (5 uM)을 첨가하고, 1일째부터 21일째까지 덱사메타손 (100 nM)을 첨가하였다.
상기 기술된 실시예는 시험관내 및 생체내에서 출생 후 인간 및 마우스 심장 섬유모세포에서 재프로그래밍 인자를 사용하여 직접적인 심장 재프로그래밍을 증진시킬 수 있는 능력을 가진, 소분자 또는 siRNA를 사용하는 제1의 간단한 칵테일을 제공한다. 상기 데이터는 TGF-β 억제제 및 WNT 억제제가 심장 기능을 유의적으로 개선시켰고, 인간 재프로그래밍을 위해 필요한 재프로그래밍 인자의 개수를 7개에서 4개로 또는 3개 정도로 적은 개수의 인자로 감소시켰다는 것을 나타낸다.
본 발명이 상기 실시양태와 함께 기술되었지만, 상기 기술내용 및 실시예는 본 발명을 예시하려는 것이며, 그의 범주를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명의 범주 내의 다른 측면, 이점 및 변형은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
추가로, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 군에 의해 기술된 경우, 당업자는 그에 의해 본 발명은 또한 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 하위군 구성원에 의해 기술된다는 것도 이해할 것이다.
본원에서 언급된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은, 마치 그 각각이 개별적으로 참조로 포함된 것과 같은 정도로 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다. 상충할 경우, 정의를 포함하는 본 명세서를 통해 조정될 것이다.

Claims (41)

  1. 유효량의 WNT 억제제 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자(reprogramming factor)를 비-심근세포에 도입하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, WNT 억제제가 소분자인 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, WNT 억제제가 siRNA인 것인 방법.
  4. 유효량의 TGF-β 억제제 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 비-심근세포에 도입하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, TGF-β 억제제가 소분자인 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, TGF-β 억제제가 siRNA인 것인 방법.
  7. 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 비-심근세포에 도입하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 방법.
  8. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 비-심근세포가 인간 세포인 것인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, WNT 억제제가 소분자인 것인 방법.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, WNT 억제제가 siRNA인 것인 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 억제제가 소분자인 것인 방법.
  12. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 억제제가 siRNA인 것인 방법.
  13. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 억제제가 WNT 억제제 투여 이전에 투여되는 것인 방법.
  14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 억제제가 WNT 억제제 투여와 함께 동시에 투여되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 비-심근세포가 체세포, 심장 섬유모세포, 비-심장 섬유모세포, 심장 전구 세포, 및 줄기 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 재프로그래밍 인자가 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 투여되는 재프로그래밍 인자가 미오카르딘(Myocardin), Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 것인 방법.
  18. 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 재프로그래밍 인자를 비-심근세포에 투여하여 유도 심근세포를 생성하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법.
  19. 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 재프로그래밍 인자를 비-심근세포에 투여하여 유도 심근세포를 생성하는 단계를 포함하는, 유도 심근세포를 생성하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 비-심근세포가 생체내에서 심근세포로 유도되는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  22. 대상체에게 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 투여하여 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 단계를 포함하는, 생체내에서 유도 심근세포 또는 심근세포 유사 세포를 생성하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 비-심근세포가 인간 세포인 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, WNT 억제제가 소분자인 것인 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, WNT 억제제가 siRNA인 것인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 억제제가 소분자인 것인 방법.
  27. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 억제제가 siRNA인 것인 방법.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 억제제가 WNT 억제제 투여 이전에 투여되는 것인 방법.
  29. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, TGF-β 억제제가 WNT 억제제 투여와 함께 동시에 투여되는 것인 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 재프로그래밍 인자가 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 것인 방법.
  31. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 재프로그래밍 인자가 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 것인 방법.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항염증제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  33. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 제조된 단리된 유도 심근세포의 집단을 포함하는 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 안정제 및/또는 보존제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  36. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 심근세포의 실질적으로 균질한 집단.
  37. 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 유효량의 유도 심근세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법.
  38. 심혈관 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 WNT 억제제, 유효량의 TGF-β 억제제, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 투여하는 단계를 포함하는, 심혈관 질환을 치료하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자가 미오카르딘, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자가 Gata4, Mef2c, 및 Tbx5를 포함하는 것인 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 유효량의 항염증제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2021515808A (ja) * 2018-03-01 2021-06-24 ジョージア テック リサーチ コーポレイション ｍＲＮＡに基づく細胞表現型の調節および検出のための方法および組成物
US11399803B2 (en) * 2018-08-08 2022-08-02 General Electric Company Ultrasound imaging system and method
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CN114615985A (zh) * 2019-09-11 2022-06-10 西奈山伊坎医学院 包含修饰mRNA的分子的组合物及其使用方法
WO2022022624A1 (zh) * 2020-07-29 2022-02-03 南京昕瑞再生医药科技有限公司 通过重编程产生心肌细胞的方法
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006109170A2 (en) * 2005-04-14 2006-10-19 Esperion Therapeutics Inc. Combination therapy for treatment of cardiovascular diseases and related conditions
WO2010007031A2 (en) * 2008-07-14 2010-01-21 Novartis Ag Methods for improving cardiac differentiation of human embryonic stem cells
EP2563907B1 (en) * 2010-04-28 2019-06-19 The J. David Gladstone Institutes Methods for generating cardiomyocytes
CN103429732B (zh) * 2010-12-27 2015-09-16 Lsip基金运营联合公司 iPS细胞及其制造方法

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Li et al. TRPA1 promotes cardiac myofibroblast transdifferentiation after myocardial infarction injury via the calcineurin-NFAT-DYRK1A signaling pathway
Guo et al. Insulin-like growth factor 1 treatment of MSCs attenuates inflammation and cardiac dysfunction following MI
Tang et al. VEGF-A promotes cardiac stem cell engraftment and myocardial repair in the infarcted heart
JP2010520181A (ja) 心血管疾患の予測および治療のためのオステオポンチン
Zhao et al. The effects of macrophage-stimulating protein on the migration, proliferation, and collagen synthesis of skin fibroblasts in vitro and in vivo
Meng et al. Osteopontin plays important roles in pulmonary arterial hypertension induced by systemic‐to‐pulmonary shunt
Mathison et al. Cardiac reprogramming factor Gata4 reduces postinfarct cardiac fibrosis through direct repression of the profibrotic mediator snail
Kleiman et al. Elevated IGF2 prevents leptin induction and terminal adipocyte differentiation in hemangioma stem cells
Li et al. Activating CD137 signaling promotes sprouting angiogenesis via increased VEGFA secretion and the VEGFR2/Akt/eNOS pathway
Xie et al. Cardiac fibroblast heat shock protein 47 aggravates cardiac fibrosis post myocardial ischemia–reperfusion injury by encouraging ubiquitin specific peptidase 10 dependent Smad4 deubiquitination
Li et al. Circulating fibrocytes stabilize blood vessels during angiogenesis in a paracrine manner
Tu et al. LncRNA TINCR improves cardiac hypertrophy by regulating the miR-211-3p-VEGFB-SDF-1α-CXCR4 pathway
Yang et al. Roles of TRPV4 in Regulating Circulating Angiogenic Cells to Promote Coronary Microvascular Regeneration
Zhu et al. Sfrp1 as a Pivotal Paracrine Factor in the Trained Pericardial Stem Cells that Foster Reparative Activity
WO2018064580A1 (en) Primed cardiac progenitors and methods for making and using same