JP2019513366A - 促進された直接心臓リプログラミング - Google Patents
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Abstract
本開示は、誘導心筋細胞を生成するための方法を提供する。本開示は、心血管疾患を治療するための方法および組成物をさらに提供する。本開示は、非心筋細胞哺乳動物細胞を、例えば、心筋細胞または心筋細胞様細胞へと誘導するための向上された方法を提供する。本開示は、ヒト細胞を、ヒト心臓細胞、例えばヒト心筋細胞へと誘導するための方法を提供する。本発明は、in vitro、in situ、および/またはin vivoでの誘導心筋細胞の効率的な生成を可能にする、リプログラミング因子および導入作用剤の組合せの使用を提供する。
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2016年3月30日に出願された米国仮出願番号第62/315,437号、および2016年8月3日に出願された米国仮出願番号第62/370,344号に基づく優先権を主張しており、これらの仮出願は、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
本出願は、2016年3月30日に出願された米国仮出願番号第62/315,437号、および2016年8月3日に出願された米国仮出願番号第62/370,344号に基づく優先権を主張しており、これらの仮出願は、すべての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書によって援用される。
NIH資金提供に関する記載
本発明は、国立衛生研究所が授与した補助金HL100406に基づく政府支援でなされたものである。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所が授与した補助金HL100406に基づく政府支援でなされたものである。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、概して、細胞リプログラミングおよび細胞分化の分野に関する。
本発明は、概して、細胞リプログラミングおよび細胞分化の分野に関する。
背景
以下の論述において、ある特定の物品および方法が、背景および導入の目的で記載される。本明細書の記載はいずれも、従来技術の「承認」として解釈されるべきでない。本出願人は、必要に応じて、本明細書で参照されている物品および方法が、適用される法規条項に基づき従来技術を構成しないことを説明する権利を明示的に留保する。
以下の論述において、ある特定の物品および方法が、背景および導入の目的で記載される。本明細書の記載はいずれも、従来技術の「承認」として解釈されるべきでない。本出願人は、必要に応じて、本明細書で参照されている物品および方法が、適用される法規条項に基づき従来技術を構成しないことを説明する権利を明示的に留保する。
心筋梗塞(MI)または心臓発作は、心臓の血流の遮断により引き起こされ、これは、酸素レベルを低下させ、組織を損傷し(虚血)、ほぼ10億個の心筋細胞を死滅させる場合がある。Burridgeら(2012年)Cell Stem Cell、10巻:16〜28頁。
MI後、線維芽細胞は、梗塞区域内に遊走して増殖し、電気生理学的に駆動される心臓の収縮に寄与することができない、心筋細胞が枯渇した傷痕を作り出す。心不全が続いて起こることが多く、疲労、末梢性浮腫、および死亡にさえ至る。
誘導心筋細胞様マウス細胞(iCM)の生成が最初に成功して以来、哺乳動物細胞の心臓リプログラミングを誘導または増強するために使用することができる遺伝子の組合せが特定されている。Iedaら(2010年)Cell、142巻:375〜386頁;Christoforouら(2013年)PLoS ONE、8巻:e63577;Addisら(2013年)J. Mol. Cell Cardiol.、60巻:97〜106頁;Jayawardenaら(2012年)Circ. Res.、110巻:1465〜1473頁;Nam Yら、PNAS USA.、2013年;110巻:5588〜5593頁;Wada Rら、PNAS USA.、2013年;110巻:12667〜12672頁;およびFu Jら、Stem Cell Reports.、2013年;1巻:235〜247頁。リプログラミングは、最初のリプログラミングカクテル中に、因子Gata4、Mef2C、およびTbx5、Hand2、Nkx2.5、ミオカルディン、SRF、Mesp1、またはmiR−133を含む、ある特定の中心的な転写因子(TF)を使用することに基づいている。より最近では、in vitroで生成されたiCMの品質および効率には幾つかのわずかな向上がなされている。Wangら(2015年)Circ. Res.116巻:237〜24頁。
in vivo研究でも、リプログラミングされたiCMが産生されている。例えば、心臓リプログラミングカクテルを傷害マウス心臓にin vivoで導入すると、リプログラミングされたiCMが産生され、心臓機能が増加し、傷害後の傷痕サイズが減少した。しかしながら、心臓機能は完全には回復しなかった。Jayawardenaら(2012年)Circ. Res.、110巻:1465〜1473頁;Qianら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁。心臓機能および傷痕サイズは、Gata4、Mef2C、およびTbx5により向上し、チモシンβ4およびVEGFでさらに増強された。Bock-Marquetteら(2004年)Nature、432巻:466〜472頁;Mathisonら(2012年)J. Am. Heart Assoc.、1巻:e005652。
in vivo研究でも、リプログラミングされたiCMが産生されている。例えば、心臓リプログラミングカクテルを傷害マウス心臓にin vivoで導入すると、リプログラミングされたiCMが産生され、心臓機能が増加し、傷害後の傷痕サイズが減少した。しかしながら、心臓機能は完全には回復しなかった。Jayawardenaら(2012年)Circ. Res.、110巻:1465〜1473頁;Qianら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁。心臓機能および傷痕サイズは、Gata4、Mef2C、およびTbx5により向上し、チモシンβ4およびVEGFでさらに増強された。Bock-Marquetteら(2004年)Nature、432巻:466〜472頁;Mathisonら(2012年)J. Am. Heart Assoc.、1巻:e005652。
Burridgeら(2012年)Cell Stem Cell、10巻:16〜28頁
Iedaら(2010年)Cell、142巻:375〜386頁
Christoforouら(2013年)PLoS ONE、8巻:e63577
Addisら(2013年)J. Mol. Cell Cardiol.、60巻:97〜106頁
Jayawardenaら(2012年)Circ. Res.、110巻:1465〜1473頁
Nam Yら、PNAS USA.、2013年;110巻:5588〜5593頁
Wada Rら、PNAS USA.、2013年;110巻:12667〜12672頁
Fu Jら、Stem Cell Reports.、2013年;1巻:235〜247頁
Wangら(2015年)Circ. Res.116巻:237〜24頁
Jayawardenaら(2012年)Circ. Res.、110巻:1465〜1473頁
Qianら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁
Bock-Marquetteら(2004年)Nature、432巻:466〜472頁
Mathisonら(2012年)J. Am. Heart Assoc.、1巻:e005652
多大な努力にも関わらず、心不全に有効な療法は、依然として見つかっていない。心臓状態を治療するためのより良好な治療手法の開発に結び付くことになる、リプログラミングおよび心臓細胞運命転換を向上させる必要性が依然として存在している。本発明は、この必要性に取り組むものである。
発明の要旨
本発明は、非心筋細胞哺乳動物細胞を、例えば、心筋細胞または心筋細胞様細胞へと誘導するための向上された方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト細胞を、ヒト心臓細胞、例えばヒト心筋細胞へと誘導するための方法を提供する。本発明は、in vitro、in situ、および/またはin vivoでの誘導心筋細胞の効率的な生成を可能にする、リプログラミング因子および導入作用剤の組合せの使用を提供する。
本発明は、非心筋細胞哺乳動物細胞を、例えば、心筋細胞または心筋細胞様細胞へと誘導するための向上された方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト細胞を、ヒト心臓細胞、例えばヒト心筋細胞へと誘導するための方法を提供する。本発明は、in vitro、in situ、および/またはin vivoでの誘導心筋細胞の効率的な生成を可能にする、リプログラミング因子および導入作用剤の組合せの使用を提供する。
一態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、有効量の1つまたは複数のリプログラミング因子および1つまたは複数の作用剤を非心筋細胞に投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。リプログラミング因子および作用剤を投与する方法は、in vitroまたはin vivoで実施して、誘導心筋細胞を生成することができる。
特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、WNT活性を阻害する有効量の作用剤を投与することを含む方法を提供する。他の特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、WNT活性を阻害する有効量の作用剤および少なくとも1つのリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。さらに他の特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、WNT活性を阻害する有効量の作用剤および抗炎症剤を投与することを含む方法を提供する。関連する態様では、in vivoで誘導心筋細胞を生成するために、対象にWNT活性を阻害する作用剤を投与する方法が提供される。そのような作用剤の非限定的な例としては、本明細書でより詳しく記載されているような、WNT活性の低分子阻害剤およびWNT活性のsiRNA阻害剤が挙げられる。
他の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、TGF−β活性を阻害する有効量の作用剤を投与することを含む方法を提供する。他の特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、TGF−β活性を阻害する有効量の作用剤および少なくとも1つのリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。さらに他の特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、TGF−β活性を阻害する有効量の作用剤および抗炎症剤を投与することを含む方法を提供する。関連する態様では、in vivoで誘導心筋細胞を生成するために、対象にTGF−β活性を阻害する作用剤を投与するための方法が提供される。そのような作用剤の非限定的な例としては、本明細書により詳しく記載されているような、TGF−β活性の低分子阻害剤およびTGF−β活性のsiRNA阻害剤が挙げられる。
ある特定の態様では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、および1つまたは複数のリプログラミング因子を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。
本発明で使用される例示的なリプログラミング因子としては、例えば、Baf60c、Esrrg、Gata4、Gata6、Hand2、Irx4、Isl1、Mef2c、Mesp1、Mesp2、ミオカルディン、Nkx2.5、SRF、Tbx5、Tbx20、Zfpm2、miR−133、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。
ある特定の態様では、WNT阻害剤および/またはTGF−β阻害剤は、低分子である。他のある特定の態様では、WNT阻害剤および/またはTGF−β阻害剤は、それぞれWNTシグナル伝達活性またはTGF−βシグナル伝達活性を阻害するsiRNAである。WNT阻害剤およびTGF−β阻害剤を両方とも投与する場合、TGF−β阻害剤は、WNT阻害剤の投与前に投与してもよく、またはWNT阻害剤の投与と同時に投与してもよい。
使用される非心筋細胞は、心筋細胞へと誘導し易い任意の細胞であってもよい。非限定的な例としては、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。特定の態様では、非心筋細胞はヒト細胞である。
特定の実施形態では、非心筋細胞に投与されるリプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、およびTbx5(すなわち、GMT)を含む。他の特定の実施形態では、非心筋細胞に投与されるリプログラミング因子は、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5(すなわち、MMT)を含む。さらに他の特定の実施形態では、非心筋細胞に投与されるリプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、Tbx5、およびミオカルディン(すなわち、4F)を含む。他の実施形態では、リプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、およびTbx5、Essrg、ミオカルディン、Zfpm2、およびMesp1(すなわち、7F)を含む。
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、ならびにGata4、Mef2c、およびTbx5(すなわち「GMT」)を含むリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、ならびにミオカルディン、Mef2c、およびTbx5(すなわち「MMT」)を含むリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。また、これらの方法は、抗炎症剤の投与を含んでいてもよい。これらの方法は、in vitroまたはin vivoで実施することができる。
TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤は、同時にまたは順次に対象に投与してもよく、また、1つまたは複数のリプログラミング因子および/または抗炎症剤と同時にまたは順次に投与してもよい。より特定の態様では、WNT阻害剤を添加する前に、第1の期間にわたって非心筋細胞に有効量のTGF−β阻害剤を投与することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。別の特定の態様では、WNT阻害剤の添加と同時に、非心筋細胞に有効量のTGF−β阻害剤を投与することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。
特定の態様では、Gata4、Mef2C、およびTbx5と組み合わせて、有効量のTGF−β阻害剤および有効量のWNT阻害剤と共に、in vitroで非心筋細胞を培養することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。他の特定の態様では、ミオカルディン、Mef2C、およびTbx5と組み合わせて、有効量のTGF−β阻害剤および有効量のWNT阻害剤と共に、in vitroで非心筋細胞を培養することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。
特定の態様では、方法では、Gata4、Mef2c、およびTbx5を含むリプログラミング因子が使用される。他の特定の態様では、方法では、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5を含むリプログラミング因子が使用される。また、方法は、対象に、コルチコステロイド(例えば、デキサメタゾン)などのステロイド系抗炎症剤または非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)を含む、有効量の抗炎症分子を投与することをさらに含んでもよい。
WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、および1つまたは複数のリプログラミング因子の使用に加えて、コルチコステロイド(例えば、デキサメタゾン)を非心筋細胞に投与して、心筋細胞または心筋細胞様細胞への細胞の誘導の効率を増加させることができる。
本発明は、心血管疾患を治療するための種々の方法を提供する。ある特定の態様では、本開示は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のWNT阻害剤を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。他の態様では、本開示は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のTGF−β阻害剤を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。好ましい態様では、本開示は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のWNT阻害剤および有効量のTGF−β阻害剤を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する方法を提供する。
したがって、別の特定の実施形態では、本発明は、心血管疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、および1つまたは複数のリプログラミング因子を投与することを含む方法を提供する。本発明のある特定の態様では、WNT阻害剤および/またはTGF−β阻害剤は、低分子であってもよい。本発明の他の態様では、WNT阻害剤および/またはTGF−β阻害剤は、siRNA分子であってもよい。本発明のある特定の態様では、投与することができるリプログラミング因子としては、例えば、Baf60c、Esrrg、Gata4、Gata6、Hand2、Irx4、Isl1、Mef2c、Mesp1、Mesp2、ミオカルディン、Nkx2.5、SRF、Tbx5、Tbx20、Zfpm2、miR−133、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。好ましい態様では、リプログラミング因子、例えば、Baf60c、Esrrg、Gata4、Gata6、Hand2、Irx4、Isl1、Mef2c、Mesp1、Mesp2、ミオカルディン、Nkx2.5、SRF、Tbx5、Tbx20、Zfpm2、miR−133、またはそれらの任意の組合せの他の組合せの投与と組み合わせて、非心筋細胞に有効量のTGF−β阻害剤および有効量のWNT阻害剤を投与することにより、誘導心筋細胞を生成するための方法が提供される。
特定の態様では、心血管疾患を治療する方法は、それを必要とする対象に、有効量のWNT阻害剤および有効量のTGF−β阻害剤を、リプログラミングカクテルGMTと共に投与して、対象中にin vivoで誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む。他の特定の態様では、心血管疾患を治療する方法は、それを必要とする対象に、有効量のWNT阻害剤および有効量のTGF−β阻害剤を、リプログラミングカクテルMMTと共に投与して、対象中にin vivoで誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む。
他の実施形態では、本発明は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法により産生された有効量の誘導心筋細胞を投与することを含む方法を提供する。さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載の単離された誘導心筋細胞の集団、および担体、任意選択で薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、安定化剤および/または保存剤をさらに含む。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に、例えば、WNT阻害剤を添加する約6時間〜約72時間前に、TGF−β阻害剤の存在下で、ある期間にわたって培養される。1つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に約24時間にわたってTGF−β阻害剤の存在下で培養される。一部の実施形態では、非心筋細胞は、ある期間にわたってTGF−β阻害剤およびWNT阻害剤の存在下で同時に培養される。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法により生成された単離された誘導心筋細胞であって、少なくとも1つの心臓遺伝子を、天然に存在する心筋細胞よりも高いレベルまたは低いレベルで発現する誘導心筋細胞を提供する。ある特定の態様では、誘導心筋細胞の実質的に均質な集団が生成される。一部の実施形態では、実質的に均質な集団の誘導心筋細胞は、少なくとも1つの心臓遺伝子を、天然に存在する心筋細胞よりも高いレベルまたは低いレベルで発現する。
本発明のある特定の態様は、単離された誘導心筋細胞の集団を含む組成物の産生を含む。そのような組成物は、例えば、担体、薬学的に許容される賦形剤、安定化剤、および/または保存剤をさらに含んでいてもよい。特定の態様では、組成物は、実質的に均質である単離された誘導心筋細胞の集団を含む。
一部の実施形態では、方法は、TGF−β阻害剤を非心筋細胞に投与した後で、TGF−β活性化因子を細胞に投与することを含む。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、非心筋細胞は、哺乳動物非心筋細胞である。好ましい実施形態では、非心筋細胞は、ヒト非心筋細胞である。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約12時間〜約36時間後に、TGF−β阻害剤と最初に接触させる。他の実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約24時間〜約72時間後に、WNT阻害剤と最初に接触させる。
一部の実施形態では、WNT阻害剤は、XAV939、D4476、IWR1、およびミリセチンからなる群から選択される。他の実施形態では、WNT阻害剤は、WNTまたはWNTシグナル伝達経路のメンバーに対するsiRNAである。
一部の実施形態では、TGF−β阻害剤は、SB431542、D4476、LDN−193189、デキサメタゾン、およびLY364947からなる群から選択される。他の実施形態では、TGF−β阻害剤は、TGF−βまたはTGF−βシグナル伝達経路のメンバーに対するsiRNAである。
一部の実施形態では、WNT阻害剤および/またはTGF−β阻害剤は、それぞれWNT経路および/またはTGF−β経路の活性を阻害するsiRNA分子である。
一部の実施形態では、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方は、リプログラミングの10日目後に除去される。
一部の実施形態では、TGF−β阻害剤は、WNT阻害剤を投与する前に、例えば、WNT阻害剤を投与する約6時間〜約72時間前に、ある期間にわたって、対象に投与される。1つの好ましい実施形態では、対象には、WNT阻害剤を投与する前に約24時間にわたってTGF−β阻害剤が投与される。一部の実施形態では、対象には、ある期間にわたってTGF−β阻害剤およびWNT阻害剤が同時に投与される。
一部の実施形態では、TGF−β阻害剤は、リプログラミング因子を導入した約12時間〜約36時間後に、対象に投与される。他の実施形態では、WNT阻害剤は、リプログラミング因子を導入した約24時間〜約72時間後に、対象に投与される。
本発明のこれらの態様ならびに他の特徴および利点は、下記により詳細に記載されている。当業者であれば、日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し得るか、または確認し得る。そのような等価物は、以下の開示および特許請求の範囲により包含されることが意図されている。
本発明は、記載されている特定の実施形態に限定されず、したがって無論、様々であってもよいことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになるため、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定は意図されていないことも理解されるべきである。
本開示の詳細な説明は、種々のセクションに分割されているが、それは読者の便宜のために過ぎず、任意のセクションに見出される開示は、別のセクションの開示と組み合わせることができる。別様に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価である任意の方法および物質も、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および物質をここに記載する。本明細書で言及されている全ての刊行物は、参照により組み込まれ、刊行物がそれらに関して引用されている方法および/または物質が開示および記載される。
本開示の実施は、別様に示されない限り、当技術分野の技術内にある組織培養、免疫学、分子生物学、細胞生物学、および組換えDNAの従来技法を使用する。例えば、SambrookおよびRussell編(2001年)Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版;Ausubelら編(2007年)Current Protocols in Molecular Biologyのシリーズ;Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.、N.Y.)のシリーズ;MacPhersonら(1991年)PCR 1: A Practical Approach(IRL Press at Oxford University Press);MacPhersonら(1995年)PCR 2: A Practical Approach;HarlowおよびLane編(1999年)Antibodies、A Laboratory Manual;Freshney(2005年)Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、第5版;Gait編(1984年)Oligonucleotide Synthesis;米国特許第4,683,195号;HamesおよびHiggins編(1984年)Nucleic Acid Hybridization;Anderson(1999年)Nucleic Acid Hybridization;HamesおよびHiggins編(1984年)Transcription and Translation;IRL Press(1986年)Immobilized Cells and Enzymes;Perbal(1984年)A Practical Guide to Molecular Cloning;MillerおよびCalos編(1987年)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory);Makrides編(2003年)Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells;MayerおよびWalker編(1987年)Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press、ロンドン);Herzenbergら編(1996年)Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual、第3版(2002年)Cold Spring Harbor Laboratory Press;Sohail(2004年)Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application (CRC Press);Sell(2013年)Stem Cells Handbookを参照されたい。
文脈が別様に示さない限り、本明細書に記載されている本発明の種々の特徴は、任意の組合せで使用することができることが特に意図されている。さらに、本開示は、一部の実施形態では、本明細書に示されている任意の特徴または特徴の組合せを除外または省くことができることも企図している。例えば、本明細書にて、複合体が、成分A、B、およびCを含むと記載されている場合、A、B、もしくはCのいずれかまたはそれらの組合せを、単独でまたは任意の組合せで省くおよび放棄することができることが、特に意図されている。
全ての数値指定、例えば、範囲を含むpH、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて1.0もしくは0.1の増分だけ、または代わりに+/−15%、または代わりに10%、または代わりに5%、または代わりに2%の変分だけ、(+)または(−)で変動する近似値である。全ての数値指定は、必ずしも明示的に記載されていないが、用語「約」がそれらの前に付いていると理解されるべきである。そのような範囲形式は、便利さおよび簡潔さのために使用されており、範囲の限界として明示的に指定されている数値を含むが、個々の数値またはその範囲内に包含される部分範囲も全て、あたかも各数値および部分範囲が明示的に指定されているかの如く含むと柔軟に理解されるべきであることを理解すべきである。例えば、約1〜約200の範囲の比は、約1および約200の明示的に記載されている限界を含むが、約2、約3、および約4などの個々の比、ならびに約10〜約50および約20〜約100などの部分範囲も含むと理解されるべきである。また、必ずしも明示的に記載されていないが、本明細書に記載されている試薬は例示に過ぎず、そのようなものの等価物は当技術分野で公知であると理解されるべきである。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明白にそうではないと指示しない限り、複数の指示物を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「心筋細胞」への言及は、複数の心筋細胞を含む。
定義
本明細書中で使用されている用語は、当業者により理解されるような平易で通常の意味を有することが意図されている。以下の定義は、読者による本発明の理解を支援するためのものであり、特に示されていない限り、そのような用語の意味を変更またはそうでなければ限定することは意図されていない。
本明細書中で使用されている用語は、当業者により理解されるような平易で通常の意味を有することが意図されている。以下の定義は、読者による本発明の理解を支援するためのものであり、特に示されていない限り、そのような用語の意味を変更またはそうでなければ限定することは意図されていない。
量または濃度などの測定可能な値を参照する際の用語「約」は、本明細書で使用される場合、指定されている量の20%、10%、5%、1%、0.5%、またはさらに0.1%の変動を包含することを意図する。
用語「許容される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示されている任意の成分、範囲、剤形などの選択を記載するために使用されている場合、前記成分、範囲、剤形などが、開示されている目的に好適であることを意図している。
また、本明細書で使用される場合、「および/または」は、関連する列挙項目の1つまたは複数のありとあらゆる考え得る組合せ、ならびに選択肢(「または」)として解釈される場合は組合せの欠如を指し、包含する。
「投与」および「投与すること」などは、本発明の組成物に関して使用される場合、in vitroで非心筋細胞に投与すること、in vivoで非心筋細胞に投与すること、医療従事者によりもしくは対象の自己投与により対象に投与することであってもよい直接投与、および/または本発明の組成物を処方する行為であってもよい間接投与の両方を指す。細胞に関して本明細書で使用される場合、組成物を細胞に導入することを指す。典型的には、有効量が投与され、その量は、当業者により決定することができる。任意の投与方法を使用することができる。低分子は、例えば、低分子を細胞培養培地に添加することにより、または心外傷の部位にin vivoで注射することにより、細胞に投与することができる。対象への投与は、例えば、血管内注射および心筋内送達などにより達成することができる。
本明細書で使用される場合、用語「心臓細胞」は、心収縮もしくは血液供給などの心臓機能を提供するか、またはそうでなければ心臓の構造を維持する役目を果たす、心臓に存在する任意の細胞を指す。心臓細胞は、本明細書で使用される場合、心臓の心外膜、心筋層、または心内膜に存在する細胞を包含する。また、心臓細胞としては、例えば、心臓筋肉細胞または心筋細胞、および冠状動脈または静脈の細胞などの心臓血管構造の細胞が挙げられる。心臓細胞の他の非限定的な例としては、心筋、血管、および心臓細胞支持構造を構成する上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、心臓伝導細胞(cardiac conducting cell)、および心臓ペースメーカー細胞(cardiac pacemaking cell)が挙げられる。心臓細胞は、例えば、胚幹細胞または誘導多能性幹細胞を含む幹細胞から導出されてもよい。
用語「心筋細胞」または「心筋細胞(複数)」は、本明細書で使用される場合、骨格筋細胞に対立するものとして、哺乳動物の心臓に天然で見出される、サルコメア含有横紋筋細胞を指す。心筋細胞は、特殊な分子、例えば、ミオシン重鎖、ミオシン軽鎖、心臓α−アクチニンのようなタンパク質の発現により特徴付けられる。用語「心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、任意の心筋細胞部分集団または心筋細胞サブタイプ、例えば、心房性、心室性、およびペースメーカー心筋細胞を含む包括的用語である。
用語「心筋細胞様細胞」は、心筋細胞と特徴を共有するが、全ての特徴を共有していなくてもよい細胞を意味することが意図されている。例えば、心筋細胞様細胞は、ある特定の心臓遺伝子の発現が心筋細胞と異なる場合がある。
用語「培養」または「細胞培養」は、人工のin vitro環境中で細胞を維持することを意味する。「細胞培養系」は、本明細書中では、細胞の集団を単層としてまたは懸濁中で成長させることができる培養条件を指すために使用される。「培養培地」は、本明細書中では、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養溶液を指すために使用される。培養培地は、これらに限定されないが、細胞を特定の状態(例えば、多能性状態、休止状態など)に維持する能力、細胞を成熟させる能力、一部の場合では、特に、特定の系統の細胞(例えば、心筋細胞)への前駆細胞の分化を促進する能力などの機能的特性により特徴付けることができる。
本明細書で使用される場合、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはそれらの組合せの組成物に関する用語「有効量」は、誘導心筋細胞を生成するのに十分な量である。非心筋細胞を、誘導心筋細胞を生成するのに有効な量の、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはそれらの組合せの組成物と接触させる。それを必要とする対象への投与に関して本明細書で使用される場合、「有効な量」または「有効量」という用語は、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、もしくはそれらの組合せ、または心血管疾患を治療する誘導心筋細胞の組成物の量を意味する。有効量は、1つまたは複数の投与、適用、または投薬で投与することができる。そのような送達は、個々の投薬単位が使用されることになる期間、組成物の生物学的利用能、投与経路などを含む、幾つかの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の対象のための、組成物(例えば、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、もしくはそれらの組合せ、または誘導心筋細胞の組成物)の具体的な量は、使用される特定の作用剤の活性、対象の年齢、体重、全体的な健康、性別、および食事、投与の時間、排泄率、組成物の組合せ、治療している特定の心血管疾患の重症度、ならびに投与の形態を含む、様々な要因に依存することが理解される。
本明細書で使用される場合、用語「発現」または「発現する」は、ポリヌクレオチドが、mRNAへと転写されるプロセス、および/または転写されたmRNAが、その後ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムDNAから導出される場合、発現は、真核細胞でのmRNAのスプライシングを含む場合がある。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のmRNAまたはタンパク質の量を測定することにより決定することができる。さらに、複数の遺伝子の発現レベルを決定して、特定の試料の発現プロファイルを確立することができる。本明細書で使用される場合、発現レベルに関する「より低いレベル」という用語は、天然心筋細胞対照試料中の量よりも少ない誘導心筋細胞の量を指す。発現レベルに関する「より高いレベル」という用語は、天然心筋細胞対照試料中の量よりも少ない誘導心筋細胞の量を指す。
用語「誘導心筋細胞」は、心筋細胞(および/または心筋細胞様細胞)へと転換された非心筋細胞(およびその後代)を指す。本開示の方法は、現時点で公知であるかまたは今後発見される、誘導心筋細胞を生成するための任意の方法と共に使用して、例えば、他の技法を増強することができる。例えば、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはそれらの組合せの組成物は、直接リプログラミング技法と共に使用することができる。
用語「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、標的分子またはシグナル伝達経路の発現、機能、活性などを阻害する能力を有する作用剤を指す。本発明の阻害剤としては、これらに限定されないが、低分子、siRNA、アンチセンスRNA、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、およびそれらの断片が挙げられる。
本明細書で使用される場合、細胞に関する「単離された」という用語は、細胞が天然に生じる環境とは異なる環境にある細胞を指す。例えば、天然では多細胞生物中で生じる細胞が、多細胞生物から取り出された場合、細胞は「単離」されている。例えば、単離された細胞は、表現型または遺伝子型が異なる組織または細胞から分離されている細胞である。
用語「非心筋細胞」は、本明細書で使用される場合、本明細書で定義および使用されている「心筋細胞」の基準を満たさない細胞調製物中の任意の細胞または細胞の集団を指す。非心筋細胞の非限定的な例としては、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。
語句「薬学的に許容される」は、本明細書では、合理的なベネフィット/リスク比に見合う、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な、健全な医学的判断の範囲内にある、化合物、物質、組成物、および/または剤形を指すために使用される。
用語「再生する」および「再生」などには、傷害を受けた心臓組織の文脈で本明細書中で使用される場合、それらの通常の意味が与えられるものとし、また、傷害を受けた、例えば、虚血、梗塞、再潅流、または他の疾患により傷害を受けた心臓または心臓組織中に新しい心臓組織を成長および/または発生させるプロセスを指すものとする。一部の実施形態では、心臓組織再生は、心筋細胞の生成を含む。
本明細書で使用される場合、「リプログラミング」は、分化転換および脱分化などを含む。
本明細書で使用される場合、用語「リプログラミング効率」は、試料中の細胞の総数に対する、心筋細胞へのリプログラミングが成功した試料中の細胞の数を指す。リプログラミング効率は、心筋細胞マーカーの関数として測定してもよい。そのような多能性マーカーとしては、これらに限定されないが、心筋細胞マーカータンパク質およびmRNAの発現、心筋細胞形態、および電気生理学的表現型が挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定的な例としては、α−サルコグリカン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、骨形態形成タンパク質4(BMP4)、コネクシン37、コネクシン40、crypto、デスミン、GATA4、GATA6、MEF2C、MYH6、ミオシン重鎖、NKX2.5、TBX5、およびトロポニンTが挙げられる。一部の態様では、リプログラミング効率は、対照と比べて、約5%、10%、20%、30%、40%、50%、50%、70%、80%、90%、1倍、1.1倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、50倍、100倍、またはそれを超えて増加する。適切な対照の非限定的な例としては、リプログラミング因子と共にもしくは伴わずに、有効量のWNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはそれらの任意の組合せに曝露されていない試料が挙げられる。
用語「リプログラミング因子」は、本明細書で使用される場合、細胞中で発現させて、誘導心筋細胞への細胞のリプログラミングを支援するために導入される因子が挙げられる。リプログラミング因子としては、これに限定されないが、転写因子が挙げられる。
用語「幹細胞」は、自己再生し、分化した後代を生成する能力を有する細胞を指す。用語「多能性幹細胞」は、3つ全ての胚葉(内胚葉、中胚葉、および外胚葉)の細胞を生じさせることができるが、完全な生物を生じさせる能力を有していない幹細胞を指す。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、哺乳動物、好ましくは、ヒトを指すが、非ヒト霊長類、ネズミ科(すなわち、マウスおよびラット)、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどを含み、それらに限定されない。一部の実施形態では、対象はヒト対象である。用語「対象」および「患者」は、本明細書では同義的に使用される場合がある。
用語「形質転換増殖因子ベータ」、「TGF−β」、およびそれらの等価物は、形質転換増殖因子β(TGFβ)スーパーファミリーの亜科に属するTGFβ分泌タンパク質のいずれかを指す。TGFβ(TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3)は、増殖、分化、接着、および遊走を制御する多機能ペプチドであり、多くの細胞型に存在する。成熟ペプチドは、ホモダイマー、または他のTGFβファミリーメンバーとのヘテロダイマーとして見出される場合がある。TGFβは、細胞表面の形質転換増殖因子ベータ受容体(TGF−βRまたはTGFβR)と相互作用し、その結合は、MAPキナーゼ、Akt、Rho、およびRac/cdc42により指図されるシグナル伝達経路、細胞構造の再編成、およびSMADタンパク質の核局在化、および標的遺伝子転写の調節を活性化する。TGFβシグナル伝達の阻害剤は、当業者であれば、幾つかの方法のいずれかにより、例えば、当技術分野で周知のように、TGFβもしくはTGFβ受容体との結合に関する競合結合アッセイ、または機能アッセイ、例えば、MAPK、Akt、Rho、Rac、およびSMADなどの下流シグナル伝達タンパク質、例えば、AR−Smadなどの活性の抑制を測定することにより、容易に特定することができる。
「治療」、「治療すること」、および「治療する」は、作用剤を用いて、疾患、障害、または状態に作用して、疾患、障害、もしくは状態、および/またはその症状の有害なまたは任意の他の望ましくない効果を低減または緩和することと定義される。「治療」は、本明細書で使用される場合、それを必要とする対象の治療を包含し、心血管疾患、例えば、心不全、心筋虚血、低酸素症、脳卒中、心筋梗塞、および慢性虚血性心疾患の治療を含む。それを必要とする状態または対象を「治療すること」または「治療」は、(1)症状の低減などの臨床結果を含む、有益なもしくは所望の結果を得るためのステップを行うこと;(2)疾患を予防すること、例えば、その疾患に罹り易い可能性があるが、その疾患の症状をまだ経験していないかもしくは呈していない患者にその疾患の臨床症状を発生させないこと;(3)疾患を阻害すること、例えば、疾患もしくはその臨床症状の進行を停止もしくは低減させること;(4)疾患を軽減すること、例えば、疾患もしくはその臨床症状の退行を引き起こすこと;または(5)疾患を遅延させることを指す。本発明の目的では、有益なまたは所望の臨床結果としては、これらに限定されないが、誘導心筋細胞の生成および/または心筋再生の促進が挙げられる。
用語「WNT」は、胚形成および成熟組織の両方に重要な役割を果たす高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリーを含むことを意図する。ヒトWNT遺伝子ファミリーは、少なくとも19個のメンバーを有する(WNT−1、WNT−2、WNT−2B/WNT−13、WNT−3、WNT3a、WNT−4、WNT−5A、WNT−5B、WNT−6、WNT−7A、WNT−7B、WNT−8A、WNT−8B、WNT−9A/WNT−14、WNT−9B/WNT−15、WNT−10A、WNT−10B、WNT−11、WNT−16)。WNTタンパク質は、Frizzled(Fz)ファミリーのタンパク質に由来するポリペプチドおよび低密度リポタンパク質受容体(LDLR)関連タンパク質(LRP)ファミリータンパク質のポリペプチドを含むWNT受容体複合体に結合することにより、細胞活性を調節する。WNT受容体複合体は、WNT結合により活性化されると、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達カスケードを活性化することになる。細胞内シグナル伝達カスケードとしては、古典的WNTシグナル伝達経路;WNT/平面内細胞極性(WNT/PCP)経路;およびWNT−カルシウム(WNT/Ca2+)経路が挙げられる。
リプログラミング方法
非心筋細胞は、当業者が利用可能である任意の方法を使用して、in vitroまたはin vivoで心筋細胞へと分化させることができる。例えば、Iedaら(2010年)Cell、142巻:375〜386頁;Christoforouら(2013年)PLoS ONE、8巻:e63577;Addisら(2013年)J. Mol. Cell Cardiol.、60巻:97〜106頁;Jayawardenaら、(2012年)Circ. Res.、110巻:1465〜1473頁;Nam Yら、PNAS USA.、2013年;110巻:5588〜5593頁;Wada Rら、PNAS USA.、2013年;110巻:12667〜12672頁;およびFu Jら、Stem Cell Reports.、2013年;1巻:235〜247頁に記載されている方法を参照されたい。
非心筋細胞は、当業者が利用可能である任意の方法を使用して、in vitroまたはin vivoで心筋細胞へと分化させることができる。例えば、Iedaら(2010年)Cell、142巻:375〜386頁;Christoforouら(2013年)PLoS ONE、8巻:e63577;Addisら(2013年)J. Mol. Cell Cardiol.、60巻:97〜106頁;Jayawardenaら、(2012年)Circ. Res.、110巻:1465〜1473頁;Nam Yら、PNAS USA.、2013年;110巻:5588〜5593頁;Wada Rら、PNAS USA.、2013年;110巻:12667〜12672頁;およびFu Jら、Stem Cell Reports.、2013年;1巻:235〜247頁に記載されている方法を参照されたい。
一部の実施形態では、使用されるリプログラミング因子は、Baf60c、Esrrg、Gata4、Gata6、Hand2、Irx4、Isl1、Mef2c、Mesp1、Mesp2、ミオカルディン、Nkx2.5、SRF、Tbx5、Tbx20、Zfpm2、miR−133、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、上記の列挙されているリプログラミング因子の1つまたは複数は、明示的に除外される。
一部の実施形態では、使用されるリプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、およびTbx5(すなわち、GMT)である。一部の実施形態では、リプログラミング因子は、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5(すなわち、MMT)である。一部の実施形態では、リプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、Tbx5、およびミオカルディン(すなわち、4F)である。他の実施形態では、リプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、およびTbx5、Essrg、ミオカルディン、Zfpm2、およびMesp1(すなわち、7F)である。
リプログラミング因子は、当業者に一般的に知られている様々な機序により、非心筋細胞に導入することができる。例えば、好適な宿主中でウイルスを産生させることにより、ウイルス構築物を送達することができる。次いで、ウイルスを宿主細胞から回収し、心臓細胞と接触させる。目的の遺伝子を発現することが可能なウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを、DNA/リポソーム複合体、ミセル、および標的化ウイルスタンパク質−DNA複合体により非心筋細胞に送達することができる。
本発明の方法では、標的指向性抗体またはその断片も含むリポソームを使用することができる。非心筋細胞または細胞集団へのポリヌクレオチドの送達に加えて、非心筋細胞または細胞集団への本明細書に記載のタンパク質の直接導入は、タンパク質トランスフェクションの非限定的な技法により実施することができ、あるいは本発明のタンパク質の発現を増強および/または活性を促進することができる培養条件は、他の非限定的な技法である。
リプログラミング因子をコードするベクターを送達する他の方法としては、これらに限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合法、またはリポソーム媒介性トランスフェクションが挙げられる。本発明のベクターをトランスフェクトする宿主細胞としては、これらに限定されないが、E.coliまたは他の細菌、酵母、真菌、またはマウス、ヒト、もしくは他の動物(例えば、哺乳動物)から導出される細胞を挙げることができる。クローニングされたDNAによりコードされたタンパク質、融合タンパク質、ポリペプチド断片、または突然変異体のin vitro発現も使用することができる。分子生物学分野の当業者であれば、幅広く様々な発現系および精製系を使用して、組換えタンパク質およびそれらの断片を産生することができることを理解するだろう。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約12時間〜約36時間後に、TGF−β阻害剤と最初に接触させる。1つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約24時間後に、TGF−β阻害剤と最初に接触させる。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約24時間〜約72時間後に、WNT阻害剤と最初に接触させる。1つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、リプログラミング因子を導入した約48時間後に、WNT阻害剤と最初に接触させる。
細胞および培養条件
本開示を読むと当業者に明白となるように、本開示は、非心筋細胞から誘導心筋細胞および心筋細胞様細胞を生成するための方法を提供する。
本開示を読むと当業者に明白となるように、本開示は、非心筋細胞から誘導心筋細胞および心筋細胞様細胞を生成するための方法を提供する。
細胞
本発明で使用される非心筋細胞は、当業者に公知の任意の非心筋細胞であってもよい。非心筋細胞の非限定的な例としては、例えば、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。非心筋細胞は、心臓の心外膜、心筋層、または心内膜に由来する心臓細胞であってもよい。非心筋細胞心臓細胞としては、例えば、平滑筋および内皮細胞が挙げられる。心臓細胞の他の非限定的な例としては、心筋、血管、および心臓細胞支持構造を構成する上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、心臓伝導細胞、および心臓ペースメーカー細胞が挙げられる。
本発明で使用される非心筋細胞は、当業者に公知の任意の非心筋細胞であってもよい。非心筋細胞の非限定的な例としては、例えば、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞が挙げられる。非心筋細胞は、心臓の心外膜、心筋層、または心内膜に由来する心臓細胞であってもよい。非心筋細胞心臓細胞としては、例えば、平滑筋および内皮細胞が挙げられる。心臓細胞の他の非限定的な例としては、心筋、血管、および心臓細胞支持構造を構成する上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、心臓伝導細胞、および心臓ペースメーカー細胞が挙げられる。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、対象内の内因性細胞であり、誘導心筋細胞を生成する方法は、in vivo誘導によるものである。他の実施形態では、非心筋細胞は、外因性であり、in vitroで改変される。
心筋細胞へと誘導される非心筋細胞は、様々な供給源のいずれに由来していてもよい。哺乳動物非心筋細胞(例えば、ヒトまたはマウス)を使用してもよい。一部の実施形態では、心筋細胞は、哺乳動物心筋細胞であり、特定の実施形態では、非心筋細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、非心筋細胞は、幹細胞(例えば、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、リプログラミングされた心臓細胞、または心臓幹細胞)または前駆細胞(例えば、心臓前駆細胞)から導出されてもよい。心筋細胞は、心臓細胞または非心臓細胞から導出されてもよい。心筋細胞は、様々な組織供給源のいずれに由来してもよく、または導出されてもよい。例えば、心臓線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞など。非心筋細胞は、胚細胞、胎仔細胞、または出生後(例えば成体)細胞であってもよい。好ましい実施形態では、非心筋細胞は、成体細胞である。
非心筋細胞は、生体対象から得ることができる。細胞は、生体対象から採取される組織から得ることができる。細胞は、好適な組織ドナーと考えられる最近死亡した対象から得ることができる。一部の実施形態では、対象を、種々の遺伝子障害、ウイルス感染などについてスクリーニングして、対象が細胞の好適な供給源であるか否かを決定する。一般的に、本発明での使用に好適な細胞は、形質転換されておらず(例えば、正常な細胞増殖を示す)、そうでなければ正常である(例えば、正常な核型を示す)。
リプログラミングするための細胞が、非心筋細胞の集団である場合、細胞の集団は、少なくとも約30%の非心筋細胞、少なくとも約35%の非心筋細胞、少なくとも約40%の非心筋細胞、少なくとも約45%の非心筋細胞、少なくとも約50%の非心筋細胞、少なくとも約55%の非心筋細胞、少なくとも約60%の非心筋細胞、少なくとも約65%の非心筋細胞、少なくとも約70%の非心筋細胞、少なくとも約75%の非心筋細胞、少なくとも約80%の非心筋細胞、少なくとも約85%の非心筋細胞、少なくとも約90%の非心筋細胞、少なくとも約95%の非心筋細胞、少なくとも約98%の非心筋細胞、少なくとも約99%の非心筋細胞、または99%よりも多くの非心筋細胞で構成されている。
細胞(心臓または非心臓)は、非胎仔対象、新生幼仔、小仔、または成体の組織から導出されてもよい。細胞は、帝王切開による出生を含む出生から死亡までの期間内の対象から収集された新生仔組織または出生後組織から導出されてもよい。例えば、非心筋細胞は、約10分齢より年長の、約1時間齢よりも年長の、約1日齢よりも年長の、約1か月齢よりも年長の、約2か月齢よりも年長の、約6か月齢よりも年長の、約1歳よりも年長の、約2歳よりも年長の、約5歳よりも年長の、約10歳よりも年長の、約15歳よりも年長の、約18歳よりも年長の、約25歳よりも年長の、約35歳よりも年長の、>45歳、>55歳、>65歳、>80歳、<80歳、<70歳、<60歳、<50歳、<40歳、<30歳、<20歳、または<10歳の対象に由来してもよい。
非心筋細胞を組織から単離する方法は、当技術分野で公知であり、任意の公知の方法を使用することができる。非限定的な例として、成体心臓細胞は、心臓外科手術を受けている患者から得られるヒト心臓心房生検標本から得ることができる。心臓組織を、細かく刻み、コラゲナーゼで消化し、心臓幹細胞/前駆細胞を、Choiら(2013年)Transplantation Proceedings、45巻:420〜426頁の方法を使用して、c−kit+前駆細胞増殖培地中で増殖させることができる。加えて、心臓線維芽細胞は、Iedaら(2009年)Dev. Cell、16巻(2号):233〜244頁の方法を使用して得ることができる。包皮線維芽細胞は、雄個体の包皮組織から得ることができる。線維芽細胞は、包皮組織を細かく刻み、次いで組織を単一細胞へと解離させることにより得ることができる。包皮細胞集塊は、物理的脱集塊または例えばトリプシンを使用する酵素消化を含む、当技術分野で公知の任意の手段により解離させることができる。
心筋細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的または免疫化学的方法(例えば、酵素結合免疫吸着測定法および免疫組織化学的アッセイなど)により検出することができる。あるいは、心筋細胞特異的マーカーをコードする核酸の発現を評価してもよい。心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸の細胞での発現は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)またはハイブリダイゼーション分析、任意のマーカータンパク質をコードするmRNAを増幅、検出、および分析するために過去に一般的に使用されている分子生物学的方法により確認することができる。心筋細胞に特異的なマーカーをコードする核酸配列は公知であり、GenBankなどの公的データベースから入手可能である。したがって、プライマーまたはプローブとして使用するために必要なマーカー特異的配列は、容易に決定される。
培養条件
本開示の細胞は、当業者に公知の任意の条件下で培養することができる。一部の実施形態では、細胞(例えば、非心筋細胞、心筋細胞、およびそれらの組合せ)は、1〜20%の酸素(O2)および5%の二酸化炭素(CO2)の条件で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、低酸素条件下(例えば、10%未満のO2の存在下)で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、約37℃で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、約37℃、5%CO2、および10〜20%のO2で培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、ある期間にわたって低酸素条件で培養される。例えば、細胞は、ある期間にわたって正常酸素圧条件下(約20%O2)で培養し、次いで低酸素条件、例えば約5%O2に切り替えてもよい。
本開示の細胞は、当業者に公知の任意の条件下で培養することができる。一部の実施形態では、細胞(例えば、非心筋細胞、心筋細胞、およびそれらの組合せ)は、1〜20%の酸素(O2)および5%の二酸化炭素(CO2)の条件で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、低酸素条件下(例えば、10%未満のO2の存在下)で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、約37℃で培養される。一部の実施形態では、本開示の細胞は、約37℃、5%CO2、および10〜20%のO2で培養することができる。一部の実施形態では、細胞は、ある期間にわたって低酸素条件で培養される。例えば、細胞は、ある期間にわたって正常酸素圧条件下(約20%O2)で培養し、次いで低酸素条件、例えば約5%O2に切り替えてもよい。
非心筋細胞をin vitroまたはex vivoで心筋細胞へと分化させる利点は、移植に好適な細胞を容易に特定し、または損傷しているかもしくは未分化の細胞を識別することができることである。in vitroまたはex vivoで分化させることにより、未分化の非心筋細胞から誘導心筋細胞を精製または単離することが可能になる。
一部の実施形態では、有効量の作用剤(低分子またはsiRNA)を使用して非心筋細胞を誘導し、誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する。
一部の実施形態では、作用剤は、SB431542、LDN−193189、デキサメタゾン、LY364947、D4476、ミリセチン、IWR1、XAV939、ドコサヘキサエン酸(DHA)、S−ニトロソ−N−アセチルペニシラミン(SNAP)、Hh−Ag1.5、アルプロスタジル、クロマカリム、MNITMT、A769662、レチノイン酸p−ヒドキシアニリド(retinoic acid p-hydoxyanlide)、デカメトニウムジブロミド、ニフェジピン、ピロキシカム、バシトラシン、アズトレオナム、ハルマロール塩酸塩、アミド−C2(A7)、Ph−C12(C10)、mCF3−C−7(J5)、G856−7272(A473)、5475707、またはそれらの任意の組合せからなる群から選択される低分子である。
リプログラミングのための作用剤
形質転換増殖因子ベータ(TGF−β)阻害剤
形質転換増殖因子ベータ(TGF−β)は、細胞機能の多くの局面を制御するサイトカインの大ファミリーの原型的メンバーである多機能制御ポリペプチドである。TGF−β経路は、線維化、アポトーシス、分化転換、増殖、および他の細胞機能に影響を及ぼす。Leask, A.(2015年)Circ. Res.、116巻:1269〜1276頁;Xu, J.ら(2009年)Cell Res.、19巻:156〜172頁;Schmierer, B.ら(2007年)Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.、8巻:970〜982頁。TGFβシグナル伝達脱制御は、腫瘍では頻繁に起こり、腫瘍発生、進行、および転移に重大な役割を有する。TGFβシグナル伝達阻害は、がん療法の新たな戦略である。
形質転換増殖因子ベータ(TGF−β)阻害剤
形質転換増殖因子ベータ(TGF−β)は、細胞機能の多くの局面を制御するサイトカインの大ファミリーの原型的メンバーである多機能制御ポリペプチドである。TGF−β経路は、線維化、アポトーシス、分化転換、増殖、および他の細胞機能に影響を及ぼす。Leask, A.(2015年)Circ. Res.、116巻:1269〜1276頁;Xu, J.ら(2009年)Cell Res.、19巻:156〜172頁;Schmierer, B.ら(2007年)Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.、8巻:970〜982頁。TGFβシグナル伝達脱制御は、腫瘍では頻繁に起こり、腫瘍発生、進行、および転移に重大な役割を有する。TGFβシグナル伝達阻害は、がん療法の新たな戦略である。
TGF−β阻害剤は、TGF−βリガンド、TGF−βI型受容体、TGF−βII型受容体、TGF−βIII型受容体、(β−グリカンおよびエンドグリン)、可溶型のTGF−β受容体、Smadタンパク質、シグナル伝達経路に関与する受容体およびリガンドに対する抗体、経路メンバーを標的とする核酸に基づく分子(例えば、アンチセンス、siRNA、アプタマー、およびリボザイム)、またはそれらの組合せなどの、TGF−βシグナル伝達系経路を構成する因子のいずれかを阻害することによりTGF−βシグナル伝達を阻害する化合物である。
一部の実施形態では、TGF−β阻害剤は、SB431542、D4476、LDN−193189、デキサメタゾン、およびLY364947からなる群から選択される。TGF−β阻害剤は、当技術分野では抗TGF−β化合物と呼ばれる場合もある。抗TGF−β化合物の非限定的な例としては、抗体(例えば、フレソリムマブ(Fresolumimab)/GC1008(Genzyme、Cambridge、MA、USA))、PF−03446962(Pfizer、New York、NY、USA))、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)(例えば、トラベデルセン(AP12009)(Isarna Therapeutics、New York、NY、USA))、受容体キナーゼ阻害剤(例えば、LY2157299(Eli Lilly、Indianapolis、IN、USA)、およびTGF−β ASOとワクチンとの組合せ(例えば、Lucanix(商標)(Belagenpumatucel−L)(Nova Rx Corp、San Diego、CA、USA))、およびTGF−β2 ASO+GMCSF発現ベクター(Mary Crowley Medical Research Centre、Dallas、TX、USA))が挙げられる。
WNT阻害剤
WNT阻害剤は、WNTの発現または活性を下方制御する作用剤である。WNT/β−カテニンシグナル伝達は、幹細胞、胚発生、および成体器官を含む広囲な生物系に関与する。WNT/β−カテニンシグナル伝達に関与する成分の脱制御は、幾つかのがんおよび変性疾患を含む広範な疾患に関与している。WNTシグナル伝達は、3つの主要経路:古典的平面内細胞極性、非古典的平面内細胞極性、および非古典的WNT/カルシウムを介して生じる。古典的経路では、WNTは、frizzledに結合して、ユビキチン化およびプロテアソームでの分解のためにβ−カテニンを標的とする複合体の機能を妨害する。幹細胞の再生、誘導多能性幹(iPS)細胞リプログラミング、および種々の系統への細胞分化におけるWNTシグナル伝達の役割は、依然として議論されている。
WNT阻害剤は、WNTの発現または活性を下方制御する作用剤である。WNT/β−カテニンシグナル伝達は、幹細胞、胚発生、および成体器官を含む広囲な生物系に関与する。WNT/β−カテニンシグナル伝達に関与する成分の脱制御は、幾つかのがんおよび変性疾患を含む広範な疾患に関与している。WNTシグナル伝達は、3つの主要経路:古典的平面内細胞極性、非古典的平面内細胞極性、および非古典的WNT/カルシウムを介して生じる。古典的経路では、WNTは、frizzledに結合して、ユビキチン化およびプロテアソームでの分解のためにβ−カテニンを標的とする複合体の機能を妨害する。幹細胞の再生、誘導多能性幹(iPS)細胞リプログラミング、および種々の系統への細胞分化におけるWNTシグナル伝達の役割は、依然として議論されている。
しかしながら、心筋細胞への幹細胞分化中のWNTシグナル伝達の二相性調節は、中胚葉分化を促進し、純粋な心筋細胞を高収率で産生する。目的の作用剤、例えば、薬物、すなわち低分子、遮断抗体などは、WNTと直接的に相互作用することができるか、またはWNT関連タンパク質、例えば、WNT共受容体LRP5/6および膜貫通型タンパク質Kremenと相互作用することができる。幾つかのWNT阻害剤が記載されており、当技術分野で公知である。
目的のWNT阻害剤は、可溶性細胞外WNTタンパク質と、正常細胞の表面に存在するfrizzled受容体との相互作用に干渉する。そのような作用剤としては、限定ではないが、WNT結合ドメインを含む可溶性frizzledポリペプチド;可溶性frizzled関連ポリペプチド;WNT特異的抗体;frizzled特異的抗体;および細胞外WNTシグナル伝達を遮断することが可能な他の分子が挙げられる。
公知のWNT阻害剤の中には、Dickkopf(Dkk)遺伝子ファミリーのメンバーがある(Krupnikら(1999年)Gene、238巻(2号):301〜13頁を参照)。ヒトDkk遺伝子ファミリーのメンバーとしては、Dkk−1、Dkk−2、Dkk−3、およびDkk−4、ならびにDkk−3関連タンパク質Soggy(Sgy)が挙げられる。
WNTの他の阻害剤としては、分泌タンパク質であるWise(Itasakiら(2003年)Development、130巻(18号):4295〜30頁)が挙げられる。Wiseタンパク質は、WNT共受容体、リポタンパク質受容体関連タンパク質6(LRP6)と物理的に相互作用し、LRP6との結合をWNT8と競合することができる。
WNTの他の阻害剤としては、分泌タンパク質であるWise(Itasakiら(2003年)Development、130巻(18号):4295〜30頁)が挙げられる。Wiseタンパク質は、WNT共受容体、リポタンパク質受容体関連タンパク質6(LRP6)と物理的に相互作用し、LRP6との結合をWNT8と競合することができる。
また、阻害剤としては、天然阻害剤の誘導体、変異体、および生物学的活性断片を挙げることができる。
一部の実施形態では、WNT阻害剤は、XAV939、D4476、IWR1、IWR類似体、IWP類似体、53AH、WNT−C59、およびミリセチンなどの低分子である。WNTを標的とする化合物の非限定的な例としては、OMPT−18RS(OncoMed Pharmaceuticals/Bayer、Redwood City、CA、USA)、OMP−54F28(OncoMed Pharmaceuticals/Bayer、Redwood City、CA、USA)、PRI−724(株式会社PRISM Pharma/エーザイ株式会社、横浜、日本)、LGK974(Novartis Pharmaceuticals、East Hanover、NJ、USA)、およびJW55(Tocris Bioscience、Bristol、UK)が挙げられる。
特定の実施形態では、WNT阻害剤は、WNT活性を標的とするsiRNAである。siRNA WNT阻害剤の例としては、WNT自体の発現に干渉するsiRNA、またはWNTシグナル伝達経路の伝達に必要な分子、例えばタンキラーゼ1の発現に干渉するsiRNAが挙げられる
抗炎症剤
ある特定の実施形態では、リプログラミングは、1つまたは複数の抗炎症剤、例えば抗炎症性ステロイドまたは非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)を投与することにより増強される。
ある特定の実施形態では、リプログラミングは、1つまたは複数の抗炎症剤、例えば抗炎症性ステロイドまたは非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)を投与することにより増強される。
本発明で使用される抗炎症性ステロイドとしては、コルチコステロイド、および特にグルココルチコイド活性を有するもの、例えば、デキサメタゾンおよびプレドニゾンが挙げられる。本発明で使用される非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)は、一般的に、炎症および疼痛を引き起こすプロスタグランジン、シクロオキシゲナーゼ−1(COX−1)、および/またはシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)の産生を遮断することにより作用する。従来のNSAIDは、COX−1およびCOX−2を両方とも遮断することにより働く。COX−2選択的阻害剤は、COX−2酵素のみを遮断する。ある特定の実施形態では、NSAIDは、COX−2選択的阻害剤、例えばセレコキシブ(Celebrex(登録商標))、ロフェコキシブ(Vioxx(登録商標))、およびバルデコキシブ(Bextra(登録商標))である。ある特定の実施形態では、抗炎症剤は、NSAIDプロスタグランジン阻害剤、例えばピロキシカムである。
本発明で使用される抗炎症剤の投薬量は、使用される特定の抗炎症剤、対象が受けている場合がある他の治療および薬剤、ならびに当業者が知ることになる対象の他の必要性に関する知識に基づいて決定することができる。例えば、セレコキシブは、従来、100mgまたは200mgのカプセルで処方され、一般的用量(例えば、関節炎により引き起こされる疼痛の場合)は、1日当たり100〜400mgが一般的である。
in vitroで改変するための方法
本開示は、心筋細胞および/または心筋細胞様細胞をin vitroで生成するための方法を提供する。
本開示は、心筋細胞および/または心筋細胞様細胞をin vitroで生成するための方法を提供する。
一部の態様では、本明細書では、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、有効量のWNT阻害剤の存在下で非心筋細胞を培養し、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む方法が提供される。
一部の態様では、本明細書では、誘導心筋細胞を生成するための方法であって、a)WNT阻害剤を添加する前に、第1の期間にわたって有効量のTGF−β阻害剤を非心筋細胞に投与すること;およびb)第2の期間にわたって、有効量のWNT阻害剤と同時に有効量のTGF−β阻害剤を非心筋細胞に投与することを含む方法が提供される。
一部の実施形態では、方法は、有効量のTGF−β阻害剤の存在下で、非心筋細胞を培養することを含む。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に、例えば、WNT阻害剤を添加する約6時間〜約72時間前に、TGF−β阻害剤の存在下で、ある期間にわたって培養される。一部の実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に、TGF−β阻害剤の存在下で、約12時間〜約60時間、約18時間〜約48時間、約24時間〜約42時間、約30時間〜約36時間(数値のいずれか2つの間の任意の範囲、終点を含む)にわたって培養される。一部の実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に、TGF−β阻害剤の存在下で、約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約30時間、約36時間、約42時間、約48時間、約60時間、または約72時間にわたって培養される。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に、約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約30時間、約36時間、約42時間、または約48時間にわたって、TGF−β阻害剤の存在下で培養される。1つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に約24時間にわたってTGF−β阻害剤の存在下で培養される。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、ある期間にわたってTGF−β阻害剤およびWNT阻害剤の存在下で同時に培養される。
別の実施形態では、非心筋細胞は、TGF−β阻害剤の後で、TGF−β活性化因子の存在下で培養される。TGF−β活性化因子は、当技術分野で周知である。市販のTGF−β活性化因子の非限定的な例は、例えば、SD208(Tocris Bioscience、Bristol、UK)が挙げられる。
一部の実施形態では、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方は、リプログラミングの1日目後、2日目後、3日目後、4日目後、5日目後、6日目後、7日目後、8日目後、9日目後、10日目後、11日目後、12日目後、13日目後、14日目後、15日目後、20日目後、25日目後、30日目後、1か月後、2か月後、3か月後、または4か月後に除去される。一部の実施形態では、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方は、リプログラミングの10日目後に除去される。
組成物
また、本開示は、本発明の方法により生成される単離された誘導心筋細胞を提供する。誘導心筋細胞は、少なくとも1つの心臓遺伝子を、天然の心筋細胞で見出されるものよりも高いレベルまたは低いレベルで発現し得る。
また、本開示は、本発明の方法により生成される単離された誘導心筋細胞を提供する。誘導心筋細胞は、少なくとも1つの心臓遺伝子を、天然の心筋細胞で見出されるものよりも高いレベルまたは低いレベルで発現し得る。
一部の実施形態では、天然の心筋細胞に見出されるものよりも高いレベルで発現される心臓遺伝子は、Tnnt2、Actn2、Atp2a2、Myh6、Ryr2、Myh7、およびActc1からなる群から選択される。一部の実施形態では、天然の心筋細胞に見出されるものよりも低いレベルで発現される心臓遺伝子は、Mybpc3、Pln、Mb、Lmod2、Myl2、Myl3、Cox6a2、Atp5a1、Ttn、Tnni3、Pdk4、Mycz2、Cacna1c、Scn5a、Mycod、およびNppaからなる群から選択される。
別の態様では、本発明の方法により生成された誘導心筋細胞の実質的に均質な集団が提供される。一部の実施形態では、実質的に均質な集団の誘導心筋細胞は、少なくとも1つの心臓遺伝子を、天然の心筋細胞に見出されるものよりも高いレベルまたは低いレベルで発現する。
一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の単離された誘導心筋細胞の集団、および担体、任意選択で薬学的に許容される賦形剤を含む。一部の実施形態では、組成物は、安定化剤および/または保存剤をさらに含む。
組成物は、薬学的に許容される賦形剤、薬学的に許容される塩、希釈剤、担体、媒体、および当業者に周知のそのような他の不活性作用剤を含んでいてもよい。医薬調製物に一般的に使用される媒体および賦形剤としては、例えば、タルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、カカオ脂、水性または非水性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコールなどが挙げられる。溶液は、水、またはエタノール、1,2−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪アルコール、トリグリセリド、およびグリセリンの部分エステルなどの、生理学的に適合する有機溶媒を使用して調製することができる。
無菌等張性生理食塩水、水、1,3−ブタンジオール、エタノール、1,2−プロピレングリコール、水と混合されたポリグリコール、リンゲル液などを含んでいてもよい非経口組成物は、従来技法を使用して調製することができる。一態様では、組成物を意図する治療部位に位置させることおよび適切に配置することを容易にするために、着色剤が添加される。
組成物は、移植可能なデバイスを使用して投与される作用剤を含むことができる。本開示により企図されている好適な移植可能なデバイスとしては、血管内ステント(例えば、自己拡張型ステント、バルーン拡張型ステント、およびステントグラフト)、スキャフォールド、およびグラフトなどが挙げられる。そのような移植可能デバイスは、少なくとも1つの表面が、誘導心筋細胞を生成することが可能な組成物でコーティングされていてもよくまたは含浸されていてもよい。また、組成物は、移植可能なデバイスのレザバー内に含有されている作用剤を含んでいてもよい。作用剤が移植可能なデバイスのレザバー内に含有されている場合、レザバーは、デバイスからの作用剤の溶出を可能にするように構成されている。移植可能なデバイスから投与される組成物の作用剤は、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方を含んでもよい。
医薬組成物は、投与し易い任意の形態で提供することができる。組成物は、保存剤および/または安定化剤を含んでいてもよい。保存剤の非限定的な例としては、メチル−、エチル−、プロピル−パラベン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、チメロサール、フェニル水銀酸塩、クロルヘキシジン、フェノール、3−クレゾール、四級アンモニウム化合物(QAC)、クロルブタノール(chlorbutanol)、2−エトキシエタノール、およびイミドウレアが挙げられる。
張性を制御するために、水性医薬組成物は、ナトリウム塩などの生理学的塩を含んでいてもよい。塩化ナトリウム(NaCl)が好ましく、塩化ナトリウムは1〜20mg/mlで存在していてもよい。存在していてもよい他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸水素二ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムが挙げられる。
組成物は、1つまたは複数の緩衝剤を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤としては、リン酸緩衝剤、Tris緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、典型的には、5〜20mMの範囲の濃度で含まれるだろう。組成物のpHは、一般的には、5〜8、より典型的には6〜8、例えば、6.5〜7.5、または7.0〜7.8であり得る。
組成物は、好ましくは無菌である。組成物は、好ましくはグルテンを含まない。組成物は、好ましくは非発熱性である。
医薬組成物は、任意の適切な経路により投与することができ、適切な経路は、当業者であれば、治療しようとする疾患または状態に応じて明白である。典型的な投与経路としては、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内、鼻腔内、または腹腔内が挙げられる。
一部の実施形態では、細胞を含む組成物は、凍結保護剤を含んでいてもよい。凍結保護剤の非限定的な例としては、グリコール(例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびグリセロール)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ホルムアミド、スクロース、トレハロース、デキストロース、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
一部の実施形態では、本発明の方法で使用される1つまたは複数の作用剤は、制御放出製剤で提供される。用語「制御放出製剤」は、持続放出製剤および徐放製剤を含む。制御放出製剤は、当技術分野で周知である。それらには、組成物の持続放出、定期的放出、パルス放出、または遅延放出を可能にする賦形剤が挙げられる。制御放出製剤としては、限定ではないが、組成物(WNT阻害剤および/またはTGF−β阻害剤)をマトリックスに埋め込むこと;腸溶コーティング;マイクロカプセル化;ゲルおよびヒドロゲル;インプラント;ならびに組成物の制御放出を可能にする任意の他の製剤が挙げられる。
一態様では、上述の作用剤、組成物、または製剤を含む部分のキットが提供される。
治療の方法
本開示の組成物、細胞、および方法を使用した治療を必要とする対象としては、これらに限定されないが、先天性心臓欠陥を有する個体、変性筋肉疾患を罹患している個体、および虚血性心臟組織をもたらす状態を罹患している個体(例えば、冠状動脈疾患を有する個体)などが挙げられる。一部の例では、方法は、変性筋肉疾患または状態(例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、またはその結果として虚心性心筋症を起こす冠状動脈疾患)の治療に有用である。一部の例では、本方法は、心臓または心血管疾患または障害、例えば、心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作(脳卒中)、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患(valve disease coronary)、拡張型動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧(高血圧症)、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、その結果として虚血性心筋症を起こす冠状動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞(心臓発作)、または静脈血栓塞栓症を有する個体の治療に有用である。
本開示の組成物、細胞、および方法を使用した治療を必要とする対象としては、これらに限定されないが、先天性心臓欠陥を有する個体、変性筋肉疾患を罹患している個体、および虚血性心臟組織をもたらす状態を罹患している個体(例えば、冠状動脈疾患を有する個体)などが挙げられる。一部の例では、方法は、変性筋肉疾患または状態(例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、またはその結果として虚心性心筋症を起こす冠状動脈疾患)の治療に有用である。一部の例では、本方法は、心臓または心血管疾患または障害、例えば、心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作(脳卒中)、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患(valve disease coronary)、拡張型動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧(高血圧症)、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、その結果として虚血性心筋症を起こす冠状動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞(心臓発作)、または静脈血栓塞栓症を有する個体の治療に有用である。
本開示の組成物、細胞、および方法を使用する治療に好適な対象としては、虚血性心臓組織をもたらす状態を含むがそれに限定される、心臓の状態を有する個体(例えば、ヒト、非ヒト霊長類、飼育哺乳動物などの哺乳動物対象、マウス、ラットなどの実験非ヒト哺乳動物対象)(例えば、冠状動脈疾患を有する個体)などが挙げられる。一部の例では、治療に好適な個体は、心臓または心血管疾患または状態、例えば、心血管疾患、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管発作(脳卒中)、脳血管疾患、先天性心疾患、うっ血性心不全、心筋炎、冠状動脈弁疾患、拡張型動脈疾患、拡張機能障害、心内膜炎、高血圧(高血圧症)、心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、その結果として虚血性心筋症を起こす冠状動脈疾患、僧帽弁逸脱、心筋梗塞(心臓発作)、または静脈血栓塞栓症を罹患している。一部の例では、本方法による治療に好適な個体としては、変性筋肉疾患、例えば、家族性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、またはその結果として虚血性心筋症を起こす冠状動脈疾患を有する個体が挙げられる。
誘導心筋細胞のin vivo生成
一部の態様では、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のWNT阻害剤、TGF−β阻害剤、および1つまたは複数のリプログラミング因子を投与し、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤は、リプログラミング因子と同時に投与される。他の実施形態では、TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤は、互いに同時に投与される。さらに他の実施形態では、TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤は、互いにおよび/またはリプログラミング因子と順次的に投与される。
一部の態様では、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のWNT阻害剤、TGF−β阻害剤、および1つまたは複数のリプログラミング因子を投与し、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成することを含む方法が提供される。一部の実施形態では、TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤は、リプログラミング因子と同時に投与される。他の実施形態では、TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤は、互いに同時に投与される。さらに他の実施形態では、TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤は、互いにおよび/またはリプログラミング因子と順次的に投与される。
一部の実施形態では、TGF−β阻害剤は、WNT阻害剤の前に、例えば、WNT阻害剤を投与する約6時間〜約72時間前に、ある期間にわたって投与される。一部の実施形態では、TGF−β阻害剤は、WNT阻害剤を添加する約12時間〜約60時間、約18時間〜約48時間、約24時間〜約42時間、約30時間〜約36時間前に(または数値のいずれか2つの間の任意の範囲、終点を含む)、TGF−β阻害剤の存在下で送達される。一部の実施形態では、TGF−β阻害剤は、WNT阻害剤を添加する約1時間、約2時間、約3時間、約4時間、約5時間、約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約30時間、約36時間、約42時間、約48時間、約60時間、または約72時間前に、対象に送達される。
WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方は、当業者に公知の任意の方法により投与することができる。例えば、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方は、例えば、経口送達、血管内送達、筋肉内送達、心筋内送達、および腹腔内送達などにより達成することができる。
WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方は、任意のスケジュールに従って、例えば、毎日、1日毎、1日2回、2日毎、3日毎、4日毎、および5日毎などで投与することができる。一部の実施形態では、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方は、およそ5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、またはそれよりも長期間にわたって毎日投与される。
一部の実施形態では、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方は、およそ14日間にわたって毎日投与される。
一部の実施形態では、対象には、TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤がある期間にわたって同時に投与される。
一部の実施形態では、対象には、TGF−β阻害剤の後でTGF−β活性化因子が投与される。TGF−β活性化因子は、当技術分野で周知である。市販のTGF−β活性化因子の非限定的な例は、例えば、SD208(Tocris Bioscience、Bristol、UK)が挙げられる。
一部の実施形態では、少なくとも1つのリプログラミング因子、例えばBaf60c、Esrrg、Gata4、Gata6、Hand2、Irx4、Isl1、Mef2c、Mesp1、Mesp2、ミオカルディン、Nkx2.5、SRF、Tbx5、Tbx20、Zfpm2、miR−133、またはそれらの任意の組合せが、対象に投与されている。好ましい実施形態では、リプログラミング因子の2つまたはそれよりも多くの、より好ましくは3つまたはそれよりも多くの組合せが、対象に投与される。一部の実施形態では、上記の列挙されているリプログラミング因子の1つまたは複数は、明示的に除外される。他の実施形態では、リプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、Tbx5、ミオカルディン、またはそれらの任意の組合せの群から選択される。特定の実施形態では、リプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、およびTbx5(GMT)である。他の特定の実施形態では、リプログラミング因子は、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5(すなわち、MMT)である。他の特定の実施形態では、リプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、Tbx5、およびミオカルディン(すなわち、4F)である。他の実施形態では、リプログラミング因子は、Gata4、Mef2c、およびTbx5、Essrg、ミオカルディン、Zfpm2、およびMesp1(すなわち、7F)である。
一部の実施形態では、TGF−β阻害剤は、リプログラミング因子を導入した約12時間〜約36時間後に、対象に投与される。TGF−β阻害剤の非限定的な例としては、SB431542、D4476、LDN−193189、デキサメタゾン、およびLY364947が挙げられる。また、TGF−β、TGF−β受容体、またはTGF−βシグナル伝達経路のメンバーを標的とするsiRNAを、本発明と共に使用することができる。
一部の実施形態では、WNT阻害剤は、リプログラミング因子を導入した約24時間〜約72時間後に、対象に投与される。一部の実施形態では、WNT阻害剤は、XAV939、D4476、IWR1、およびミリセチンからなる群から選択される。
誘導心筋細胞を使用する治療方法
本発明は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法により産生された有効量の誘導心筋細胞を投与することを含む方法を提供する。
本発明は、心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の方法により産生された有効量の誘導心筋細胞を投与することを含む方法を提供する。
一部の態様では、本開示の誘導心筋細胞を使用して、それを必要とする対象を治療することができる。一部の実施形態では、誘導心筋細胞を、それを必要とする対象体に投与することができ、対象への誘導心筋細胞の投与は、対象において心血管疾患を治療する。したがって、一部の実施形態では、心血管疾患を治療する方法は、それを必要とする対象に誘導心筋細胞の集団を投与することを含む。他の実施形態では、心血管疾患を治療する方法は、それを必要とする対象に、WNT阻害剤、TGF−β阻害剤、またはその両方を含む有効量の組成物を投与することを含む。
一部の実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に、約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約30時間、約36時間、約42時間、または約48時間にわたって、TGF−β阻害剤の存在下で培養される。1つの好ましい実施形態では、非心筋細胞は、WNT阻害剤を添加する前に約24時間にわたってTGF−β阻害剤の存在下で培養される。
本明細書の全体にわたって使用されている略語は、別様の記載がない限り、以下の意味を有する:α−MHC−GFP、アルファ−ミオシン重鎖緑色蛍光タンパク質;CF、心臓線維芽細胞;cm、センチメートル;CO、心拍出量;EF、駆出率;FACS、蛍光活性化細胞選別;GFP、緑色蛍光タンパク質;GMT、Gata4、Mef2c、およびTbx5;GMTc、Gata4、Mef2c、Tbx5、TGFβi、WNTi;GO、遺伝子オントロジー;HCF、ヒト心臓線維芽細胞;iCM、誘導心筋細胞;kg、キログラム;μg、マイクログラム; μl、マイクロリットル;mg、ミリグラム;ml、ミリリットル;MI、心筋梗塞;msec、ミリ秒;min、分;MMT、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5;MMTc、ミオカルディン、Mef2c、Tbx5、TGFβi、WNTi;MRI、磁気共鳴画像法;PBS、リン酸緩衝生理食塩水;PBST、リン酸緩衝生理食塩水、triton;PFA、パラホルムアルデヒド;qPCR、定量的ポリメラーゼ連鎖反応;qRT−PCR、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応;RNA、リボ核酸;RNA−seq、RNA配列決定;RT−PCR、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応;sec、秒;SV、心拍血液量;TGF−β、形質転換増殖因子ベータ;TGF−βi、形質転換増殖因子ベータ阻害剤;WNT、wingless−Int;WNTi、wingless−Int阻害剤;YFP、黄色蛍光タンパク質;4F、Gata4、Mef2c、TBX5、およびミオカルディン;4Fc、Gata4、Mef2c、TBX5、およびミオカルディン+TGF−βiおよびWNTi;7F、Gata4、Mef2c、およびTbx5、Essrg、ミオカルディン、Zfpm2、およびMesp1;7Fc、Gata4、Mef2c、およびTbx5、Essrg、ミオカルディン、Zfpm2、およびMesp1+TGF−βiおよびWNTi。
以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態をさらに例示するためのものである。これらの実施例は、当業者に提供するために示されており、その範囲を限定するためのものではない。
(実施例1)
TGF−βおよびWNTシグナル伝達は、心臓リプログラミングの障壁である
心臓リプログラミングを向上させるために操作することができる生物学的経路を特定するために、無作為低分子ライブラリースクリーニングを含む化学生物学的手法を使用した。Wangら(2015年)Circ. Res.、116巻:237〜244頁に詳細に記載されているように、最近記載された多シストロン性GMTレトロウイルスMef2c−P2A−Gata4−T2A−Tbx5を用いて、心臓リプログラミングを誘導し、3つの転写因子の各々が至適に発現されることを保証した。
TGF−βおよびWNTシグナル伝達は、心臓リプログラミングの障壁である
心臓リプログラミングを向上させるために操作することができる生物学的経路を特定するために、無作為低分子ライブラリースクリーニングを含む化学生物学的手法を使用した。Wangら(2015年)Circ. Res.、116巻:237〜244頁に詳細に記載されているように、最近記載された多シストロン性GMTレトロウイルスMef2c−P2A−Gata4−T2A−Tbx5を用いて、心臓リプログラミングを誘導し、3つの転写因子の各々が至適に発現されることを保証した。
手短に言えば、マウス心臓線維芽細胞(CF)を、以前に記載されるような遊走法を使用して、PO−P4 αMHC−GFPトランスジェニック新生仔から単離した。Burridgeら(2012年)Cell Stem Cell、10巻:16〜28頁;Iedaら(2010年)Cell、142巻:375〜386頁。心臓を単離し、細かく刻み、ゼラチンコーディングプレートに配置し、線維芽細胞外植片培地(IMOM中の20%FBS)で1週間37℃にてインキュベートした。組織を2×PBSで洗浄し、0.05%トリプシンで5分間消化し、線維芽細胞外植片培地に再懸濁した。組織を、70μΜフィルターでろ過し、ペレットにした。ペレットにした細胞を、以前に記載されているように、Thy−1−APC(抗マウス/ラットCD90.1 thy−1.1)(Ebioscience、San Diego、CA、USA)で20分間染色し、PBSで2回洗浄した。Iedaら(2010年)Cell、142巻:375〜386頁。細胞を、蛍光活性化細胞選別(FACS)によりAPC+細胞について選別し、10cmのゼラチンコーティングプレートに播種し、凍結させずに新鮮なまま全ての研究に使用した。
Thy1+ CFのiCMへの直接転換を、Iedaら(2010年)Cell、142巻:375〜386頁に以前に記載されているように完了させた。手短に言えば、pMX−Gata4、pMX−Mef2c、pMX−Tbx5、多シストロン性pMX−Mef2c−Gata4−Tbx5(GMT多シストロン性)、またはpMX−dsRedを、以前に記載されているように構築した。Iedaら(2010年)Cell、142巻:375〜386頁;Wang, L.ら(2015年)Circ Res、116巻、237〜244頁(2015年)。レトロウイルスベクターを、以前に記載のように、Fugene HD(Roche)を使用してパッケージングし、線維芽細胞外植片培地中約80%コンフルエントPlatE細胞を含む15cmプレートに、OptiMEM(10μg)中で送達した。Qian, L.ら(2012年)Nature、485巻、593〜59頁。トランスフェクションの48時間後にウイルス上清を収集し、0.6μg/mlポリブレン(Chemicon)を添加した心臓線維芽細胞に感染させるために使用し、−1日目に心臓線維芽細胞に添加した。24時間後、0日目に、培養培地を、心筋細胞培養培地(iCM培地(Qian, L.ら(2013年)Nature Protocols、8巻:1204〜1215頁))で置換し、3〜4日毎に置換した。3つの個別のGata4、Mef2c、およびTbx5レトロウイルスを、初期薬物スクリーニングおよびin vivo実験に使用した。しかしながら、初期スクリーニング後のさらなるin vitro実験では、GMT多シストロン性レトロウイルスを使用した。
薬物スクリーニングでは、α−MHC−GFPトランスジェニックマウスに由来するThy1+新生仔心臓線維芽細胞を、2000細胞/ウェルの密度で384ウェルプレートに播種した。細胞を、上述のようにGMTレトロウイルスでリプログラミングした。リプログラミングの1日目に、ウイルスをiCM培地で置換し、Biomek液体ハンドリングロボットステーションを使用して、化合物をウェルに添加して、薬物−ライブラリー濃度の1:1000希釈を達成した。5500個の毒物学的に試験された化合物のライブラリー(例えば、LOPAC、TOCRIS、LONZA、およびSPECTRUM)をスクリーニングした。リプログラミングの14日目に、プレートを固定し、免疫細胞化学法に記載されているように、GFPおよびトロポニンTについて染色し、INCELLシステムを用いたハイスループットハイコンテントイメージングを使用して画像化した。データは、INCELL画像分析パッケージを使用して分析した。
免疫細胞化学的分析および定量化では、試料を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して固定し、0.1%Triton X−100を含むPBS(PBST)で2回洗浄し、以前に記載のように、Power Blockユニバーサルブロッキング試薬(Biogenex、#HK085−5K)を用いて15分間室温でブロッキングした。Qianら(2013年)Nature protocols、8巻:1204〜1215頁。PBSTおよびブロッキング緩衝液(1:1)で希釈し、4℃で一晩インキュベートした一次抗体を含む混合液中で、試料をインキュベートした。以下の一次抗体を使用した:トロポニンT、心臓アイソフォームAb−1、マウスモノクローナル抗体(Thermo Scientific、#MS−295−PO、1:200)、モノクローナル抗α−アクチニンサルコメア抗体(Sigma Aldrich、#A7811、1/200)、および抗GFP(Thermo Scientific、#A11120、1:200)。試料を、各々室温で15分間PBSTで2回洗浄し、次いで、PBSTおよびブロッキング緩衝液(1:1)で希釈した二次抗体を含む混合液中で1時間室温にてインキュベートした。試料を、各々室温で15分間PBSTで3回洗浄し、視覚化した。染色した細胞を、ImageJ画像分析ソフトウェアで定量化した。標準誤差平均を全ての比較のために算出した。p<0.05を統計的に有意であるとみなした。
潜在的iCMを、α−MHC−駆動性GFPリポーターの活性化により検出した。384ウェル形式で直接リプログラミングするこの方法を最適化した後、毒物学的に試験された化合物のライブラリー(例えば、LOPAC、TOCRIS、およびSPECTRUM薬物ライブラリー)に由来する化合物を、ハイスループットハイコンテントイメージングを使用してスクリーニングした(図1)。化合物を、GMT形質導入の1日後に添加し、α−MHC−GFP+細胞を2週間後に定量化した。Zスコアが5よりも高い上位26ヒット(図2)を特定し、その後検証したところ、これらヒットは、GFP+iCMのパーセントを2倍〜6倍増加させた(図3)。上位ヒットは、TGF−βシグナル伝達を阻害する3つの分子(SB431542、LDN−193189、およびデキサメタゾン)、WNTシグナル伝達を阻害する3つの分子(XAV939、IWR1、およびミリセチン)、ならびにWNTシグナル伝達およびTGF−βシグナル伝達を両方とも阻害する1つの分子(D4476)、ならびに抗炎症特性を有する分子(例えば、デキサメタゾン、DHA、およびピロキシカム)を含んでいた(図3)。共通の経路に複数ヒットがあることは、これらシグナル伝達経路が、心臓リプログラミングに影響を及ぼしていることを示唆した。
WNT阻害剤化合物またはTGF−β阻害剤化合物のうちどちらが最も効果的にリプログラミング品質を向上させるかを特定するために、一連の心臓遺伝子および線維芽細胞遺伝子についてqRT−PCRを実施した。手短に言えば、全RNAを、市販キットで単離した(Direct−Zol RNAミニプレップ、Zymo Research)。オリゴ(dT)およびランダム六量体プライマーの混合物を使用して逆転写を実施した(qRT−PCR用のSuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix、ThermoFisher Scientific)。7900HT FASTリアルタイムPCR検出システム(Applied Biosystems)でリアルタイムPCR分析を実施した。使用したTaqmanプローブは、表1に列挙されている。ハイスループットリアルタイムPCR分析では、試料を、96.96 Dynamic Array IFCを用いてBiomark HDシステム(Fluidigm)で分析した。
(実施例2)
SB431542およびXAV939は、in vitroでiCMの効率および品質を増加させる
低分子をリプログラミングカクテルに添加するタイミング、用量、および条件を検証および最適化した後、GMT−過剰発現線維芽細胞を、1日目にはSB431542(2.6μΜ)で、および2日目にはXAV939(5μΜ)で処理した。GFP発現のFACS分析の場合、リプログラミングされた心臓線維芽細胞を、培養皿から回収し、FlowJoソフトウェアを用いてLSR−II(BD)で分析した。生細胞選別および分析の場合、TRYPLE(Thermo Fisher)を使用して細胞を解離させ、LSRII(BD)機械を使用して選別した。固定細胞FACSの場合、細胞を、ホルマリンで15分間固定し、0.1%v/vのTriton X−100で透過処理し、抗GFP抗体(Thermo Fisher)、および抗α−サルコメアアクチニン抗体(Sigma)または抗心筋ミオシン2抗体(Thermo Fisher)のいずれかで染色し、その後、Alexa−594(Thermo Fisher)にコンジュゲートされている二次抗体で染色した。
SB431542およびXAV939は、in vitroでiCMの効率および品質を増加させる
低分子をリプログラミングカクテルに添加するタイミング、用量、および条件を検証および最適化した後、GMT−過剰発現線維芽細胞を、1日目にはSB431542(2.6μΜ)で、および2日目にはXAV939(5μΜ)で処理した。GFP発現のFACS分析の場合、リプログラミングされた心臓線維芽細胞を、培養皿から回収し、FlowJoソフトウェアを用いてLSR−II(BD)で分析した。生細胞選別および分析の場合、TRYPLE(Thermo Fisher)を使用して細胞を解離させ、LSRII(BD)機械を使用して選別した。固定細胞FACSの場合、細胞を、ホルマリンで15分間固定し、0.1%v/vのTriton X−100で透過処理し、抗GFP抗体(Thermo Fisher)、および抗α−サルコメアアクチニン抗体(Sigma)または抗心筋ミオシン2抗体(Thermo Fisher)のいずれかで染色し、その後、Alexa−594(Thermo Fisher)にコンジュゲートされている二次抗体で染色した。
1日目のSB431542(2.6μΜ)および2日目のXAV939(5μΜ)の組合せは、2週間以内に心臓線維芽細胞のリプログラミング効率を約30%増加させた(図10)。SB431542単独の場合、細胞は、より速く成熟し、GMT感染の3週間後には早くも拍動細胞が出現した。驚くべきことに、SB431542およびXAV939の組合せでは、GMT単独の場合の6〜8週間と比較して、早くも1週間で拍動細胞が出現した。また、トロポニンT染色およびサルコメア組織化の進行は、GMT単独の場合の4〜6週間と比べて、GMT+SB431542/XAV939によるリプログラミングのわずか2週間後にiCMで観察された。
カルシウムトランジエントを、以前に記載されているように評価した。Qian, L.ら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁。手短に言えば、単離筋細胞を、室温で30分間Fluo−4で負荷してから、潅流チャンバーに移した。負荷溶液は、乾燥DMSO中5mMのFluo−4 AMと、懸濁筋細胞を含む細胞外タイロード溶液で100倍希釈されたPowerload(商標)濃縮液(Invitrogen)との1:10混合物を含んでいた。脱エステル化のためにさらに20分間を取ってから記録を取った。目的の細胞のいずれかの側に配置され、電場刺激装置(IonOptix、Myopacer)に接続された白金線間に1Hzの電圧パルスを印加することにより、収縮およびカルシウムトランジエントを誘発させた。Fluo−4蛍光トランジエントを、標準フィルターセット(#49011 ET、Chroma Technology)で記録した。ペーシングの停止後に休止蛍光を記録し、実験の終了時に細胞をピックアップして視野から取り除いた後でバックグラウンド光を得た。収縮は、明視野にある目的の細胞に光を当て、その後、CCDカメラ(IonOptix Myocam)に向けることにより、カルシウムトランジエントと同時に光学的に記録した。細胞長シグナルを、ビデオモーションディレクター(video motion director)(VED205;Crescent Electronics)により電圧に変換し、様々な筋細胞の収縮振幅を、細胞長の変化パーセントを算出することにより正規化した。これらの研究は、2つの化合物の存在下でのリプログラミングの4週間以内に、約50%よりも多くの細胞が、自発的なカルシウムトランジエントを示したことを明らかにした(図11)。
また、RNAseqを使用して、心臓リプログラミングの3、5、および6週間後のiCMの遺伝子発現プロファイルを調査した。これら実験では、α−MHC−GFP+ in vitroマウスiCM、TNT−GFP+ ヒトiCM、および対照dsRed感染心臓線維芽細胞(偽)を、FACS AriaII細胞選別器で選別した。RNAseq用に生細胞を選別する場合、α−MHC−GFPマウス心臓線維芽細胞またはhTNT−GFP+のリプログラミングされたヒト心臓線維芽細胞を、培養皿から解離させ、AriaII FACS選別器を用いてGFP+発現について選別した。in vivoでリプログラミングされたiCMのランゲンドルフ単離後、iCMを、それらのperiostin cre YFPリポーターの発現に基づき、マイクロピペットを使用してピックアップした。それらのRNAを、Qiagen miRNeasy Microキット#210874を使用して単離した。Ovation RNA−seqシステムv2キット(NuGEN)を使用し、ランダム六量体およびポリTキメラプライマーの組合せを使用して、全RNA(20〜50ng)を逆転写して、第一鎖cDNAを合成した。次いで、加熱することによりRNA鋳型を部分的に分解し、DNAポリメラーゼを使用して第二鎖cDNAを合成した。次いで、単一プライマー等温増幅法(SPIA)を使用して、二本鎖DNAを増幅した。SPIAは、RNaseHが、二本鎖DNAの5’末端のDNA/RNAヘテロ二本鎖のRNAを分解し、その後、SPIAプライマーがcDNAと結合し、ポリメラーゼが、既存のフォワード鎖を置換することによりプライマーの3’末端で複製を開始する、線形cDNA増幅プロセスである。次いで、ランダム六量体を使用して、第二鎖cDNAを線形的に増幅した。cDNA試料を、Covaris S2ソニケーターを使用して、200bpの平均サイズに断片化した。断片化cDNAから、Ovation Ultralow V2キット(NuGen)を使用してライブラリーを作製した。末端修復およびライゲーション後、ライブラリーを、9サイクルでPCR増幅した。ライブラリー品質は、高感度DNAチップ(Agilent)を用いてBioanalyzerで評価し、濃度は、qPCR(KAPA)で定量化した。HiSeq 2500シーケンサー(Illumina)を、シングルリード、50サイクルシーケンシングランで用いて、ライブラリーを配列決定した。RNAseq分析パイプラインを、以前に報告されているように使用した。Theodoris, C.V.ら(2015年)Cell、160巻:1072〜1086頁。
単一の化合物で3週間処理したiCMではなく、SB431542およびXAV939(GMTc)で3週間処理したiCMのみが、主成分分析(PCA)および発現が異なる上位遺伝子のヒートマップにより反映されているように、より心筋細胞様の転写プロファイルを示した(図12)。GMTcによる5または6週間のリプログラミングは、GMT単独によるリプログラミングよりも、成体マウス心室心筋細胞により近い遺伝子発現プロファイルをもたらした(図12)。SB431542およびXAV939(+SBXAV)を、GMT形質導入線維芽細胞に添加すると、GMT単独(−SBXAV)と比較して、心筋細胞(CM)状態により近い、リプログラミングの進行状態がもたらされた。GMTと組み合わせたSB431542(+SB)単独またはXAV939(+XAV)単独はいずれも、この効果を示さなかった。
さらに、GMTcで3、5、または6週間リプログラミングされたiCMは、心筋細胞と同様に、TGF−βおよびWNTシグナル伝達に関連する遺伝子オントロジー(GO)タームを示す遺伝子を有意に下方制御した。5週目のGMTとGMTcとの遺伝子発現プロファイルを比較すると、制御が異なる上位GOタームは、細胞外マトリックス、イオンチャネル、および筋肉形成の制御と関連していることが見出された(図13)。最も高度に発現された心臓収縮性イオンハンドリングおよび細胞外マトリックス遺伝子をより詳細に分析すると、これら遺伝子の発現は、化合物により、完全でないとはいえ、成体心筋細胞の遺伝子発現と非常に近いものにされることが見出された。したがって、TGF−βおよびWNTシグナル伝達の阻害は、in vitroにおいて、細胞運命転換の品質および速度を両方とも増加させた。
(実施例3)
SB431542およびXAV939は、古典的TGF−βおよびWNTシグナル伝達を阻害することにより心臓リプログラミングを増強する
次に、低分子が、TGF−βおよびWNTシグナル伝達を制御する機序を調査した。20μgのタンパク質を含む細胞溶解物からSDS−PAGEによりタンパク質を分離し、電気泳動的にポリビニリデンジフルオリド膜(BioRad)へと移した。次いで、膜をPBSで洗浄し、ブロッキング緩衝液(Li−cor)で処理し、次いで、一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した:抗GAPDH抗体負荷対照(Abcam #ab9484、0.5μg/ml)、抗活性β−カテニン抗体(Millipore、#05−665、1:1000)、抗T−抗原(Abcam、#ab16879、1:1000)、および抗ホスホSmad2/3(Cell Signaling、#8685S、1:1000)。膜をPBSで洗浄し、適切な二次抗体(Li−Cor、IRDye 600LT;IRDye 800CW、1:10,000)と共に室温で1時間インキュベートした。膜を洗浄し、Odyssey Fcデュアルモードイメージングシステムで視覚化した。
SB431542およびXAV939は、古典的TGF−βおよびWNTシグナル伝達を阻害することにより心臓リプログラミングを増強する
次に、低分子が、TGF−βおよびWNTシグナル伝達を制御する機序を調査した。20μgのタンパク質を含む細胞溶解物からSDS−PAGEによりタンパク質を分離し、電気泳動的にポリビニリデンジフルオリド膜(BioRad)へと移した。次いで、膜をPBSで洗浄し、ブロッキング緩衝液(Li−cor)で処理し、次いで、一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体を使用した:抗GAPDH抗体負荷対照(Abcam #ab9484、0.5μg/ml)、抗活性β−カテニン抗体(Millipore、#05−665、1:1000)、抗T−抗原(Abcam、#ab16879、1:1000)、および抗ホスホSmad2/3(Cell Signaling、#8685S、1:1000)。膜をPBSで洗浄し、適切な二次抗体(Li−Cor、IRDye 600LT;IRDye 800CW、1:10,000)と共に室温で1時間インキュベートした。膜を洗浄し、Odyssey Fcデュアルモードイメージングシステムで視覚化した。
SMAD2/3のリン酸化(TGF−β活性化の指標)、および活性βカテニンの発現(WNT活性化の指標)は、SB431542またはXAV939により有意に低減された。また、TGF−βまたは古典的WNTシグナル伝達を活性化させると、それぞれSB431542またはXAV939により誘導されたリプログラミング効率増加が反転することが観察された。リプログラミング中に過剰なTGF−β1リガンドを添加すると、SB431542の効果が反転し、SB431542およびXAV939の併用効果が部分的に阻害された。しかしながら、TGF−βシグナル伝達の他の局面を制御するBMP4は、心臓リプログラミングに有意な影響を及ぼさなかった(図14)。さらに、構成的に活性なSMAD2またはSMAD3(TGF−βシグナル伝達エフェクター)の過剰発現は、SB431542による心臓リプログラミング増強を消失させた(図15)。SB431542は、アクチビン受容体様キナーゼ(ALK)4およびALK5受容体を特異的に阻害するため、siRNAによるALK4またはALK5のノックダウンが、直接心臓リプログラミングに及ぼす効果を試験した。ALK4またはALK5の約80%の低減(図16)は、SB431542と同様に、直接心臓リプログラミングを増強した(図16)。同様に、古典的WNTシグナル伝達を活性化するWNT3aは、心臓リプログラミングに対するSB431542およびXAV939の効果を部分的に遮断した。しかしながら、WNT5またはWNT11による非古典的WNT経路の活性化は、有意な効果を示さなかった。さらに、古典的WNT経路を活性化するグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)阻害剤CHIR99021の添加は、SB431542およびXAV939の併用効果を反転させた(図17)。したがって、SB431542およびXAV939は、TGF−βおよび古典的WNTシグナル伝達を阻害することにより心臓リプログラミングを増強する。
(実施例4)
TGF−βおよびWNT阻害剤は、in vivoで心臓リプログラミングを増強する
GMTの心筋内注射は、in vivoで線維芽細胞をiCMへとリプログラミングすることに成功し、心臓機能を増加させ、傷害後の傷痕サイズを減少させたが、心臓機能を完全には回復させないことが以前に示された。Qian, L.ら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁。TGF−βおよびWNTシグナル伝達の阻害が、in vivoでの心臓リプログラミングに及ぼす効果を、冠状動脈結紮およびGMTをコードするレトロウイルス(GMTc)の心筋内注射後の2週間にわたって、SB431542(10mg/kg/日)およびXAV939(2.5mg/kg/日)を毎日腹腔内注射することにより試験した。
TGF−βおよびWNT阻害剤は、in vivoで心臓リプログラミングを増強する
GMTの心筋内注射は、in vivoで線維芽細胞をiCMへとリプログラミングすることに成功し、心臓機能を増加させ、傷害後の傷痕サイズを減少させたが、心臓機能を完全には回復させないことが以前に示された。Qian, L.ら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁。TGF−βおよびWNTシグナル伝達の阻害が、in vivoでの心臓リプログラミングに及ぼす効果を、冠状動脈結紮およびGMTをコードするレトロウイルス(GMTc)の心筋内注射後の2週間にわたって、SB431542(10mg/kg/日)およびXAV939(2.5mg/kg/日)を毎日腹腔内注射することにより試験した。
動物研究では、Postn−CreマウスおよびRosa26−EYFPマウスを交配することにより、Postn−Cre:R26R−YFPマウスを得た。外科手術の動物プロトコールは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の動物実験倫理委員会により承認を受けた。全ての外科手術は、以前に記載のように実施した。Qian, L.ら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁。手短に言えば、マウスを、2.4%イソフルラン/97.6%酸素で麻酔し、保温パッド(37℃)に仰臥位で配置した。動物に19G断端針を挿管し、MiniVent845型マウス人工呼吸器(Hugo Sachs Elektronik−Harvard Apparatus;心拍血液量、250μl;呼吸数、120呼吸/分)を使用して、室内空気で人工呼吸した。Qian, L.ら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁に記載されているように、7−0 prolene縫合で左前下行枝(LAD)動脈を恒久的に結紮することにより、心筋梗塞(MI)を誘導した。偽手術動物は、外科手術対照としての役目を果たし、LADを結紮しなかったことを除いて実験動物と同じ手順に供した。濃縮ウイルス(GMT)のプールを混合し、10μlの混合ウイルスおよび10μlのPBSを、一体型29G針を有するインスリン用注射器(BD)で心筋層内に注射した。全投薬量の注射は、冠状動脈閉塞後の分岐梗塞区域に基づき、梗塞域と境界域との境界に沿って実施した。2日目から15日目まで、動物に、SB431542(10mg/kg/日)およびXAV939(2.5mg/kg/日)を毎日腹腔内注射した。
連続心エコー検査を、MIの前、ならびにMIの1、2、4、8、および12週間後に実施して、心臓機能を評価した。心エコー検査は、15MHz線形アレイ超音波振動子を有するVevo770高解像度マイクロイメージングシステム(VisualSonics)を用いて実施した。左心室を、フレームレートが120Hzの傍胸骨長軸像および傍胸骨短軸像の両方で評価した。収縮終期または拡張終期は、それぞれ左心室が最も小さくおよび最も大きく見えた位相と定義し、駆出率測定に使用した。短縮率を算出するために、左心室収縮終期および拡張終期直径を、掃引速度が50mm/sの乳頭筋における左心室Mモードトレースから測定した。収縮終期および拡張終期寸法の二次元測定のためにBモードを使用した。
実験の終了時に(MIの12週間後)、動物を磁気共鳴画像法(MRI)にかけ、心臓の構造および機能を評価した。in vivo MRI画像法は、Agilentイメージングコンソールに接続された7T前臨床水平ボアマグネットで実施した。動物を2%イソフルランおよび98%酸素の吸入により麻酔し、28mm内径(ID)を有する自作線形極性化バードケージコイルに配置した。画像化実験中の体温は、34℃に維持した。動物の心拍動、呼吸、および体温を、MRI互換性の小動物生命維持システム(SA Instruments Inc、Stony Brook、NY)でモニターした。マウス心臓の位置ならびに長軸および短軸を、以下のパラメーターを用いたスカウト画像から決定した:繰り返し時間(TR)、10msec;エコー時間(TE)、4msec;励起フリップ角、20度;視野(FOV)、6cm2;マトリックス寸法、128×128;スライス厚、1mm;反復数、2回。対照および梗塞心臓の機能パラメーターを評価するため、短軸のMRI画像をスピンエコーパルスシーケンスで取得した。取得のパラメーターは、TR=1sec、TE=10msec、面内画像解像度=200□m、および取得時間=約20分間(心拍数に依存する)であった。心臓および呼吸ゲーティングを使用した。駆出率を測定するため、心臓の9枚または10枚の短軸スライスを、心拡張期(R−心臓ピーク後ゼロ遅延)および心収縮期(RピークからのRR間隔遅延の45%)で取得した。
この評価の後、動物を犠牲にし、組織学的研究のために心臓を回収した。ウイルス送達および冠状動脈結紮の12週間後、心臓に標準的マッソン三色染色法を実施した。傷痕サイズを決定するため、ImageProソフトウェアを使用して、MI心臓の左心室内の4つのレベルにわたって横断面の傷痕面積(青色)および健常面積(赤色)を測定した。各レベルの4スライスの組織を、技術的4回反復として測定した(合計16区画)。
GMTcは、心エコー検査により評価した駆出率(EF)の変化により反映されているように、GMT単独による治療と比較して、心臓機能を有意に増強した(図18)。GMTcによる治療は、GMT単独で治療した動物と比較して、心臓機能を有意に保存した。機能改善は、早くもMIの1週間後に生じた。これは、リプログラミング速度の増加を示すin vitro観察と一致している。阻害剤単独は、心臓機能に有意な影響を及ぼさなかった。MIの12週間後、盲検磁気共鳴画像法(MRI)を実施して、心臓の構造および機能を評価した。これは、磁気共鳴画像法が、最も正確な測定形態であるためである。GMTcで治療した群でのみ、梗塞領域内に、心臓の心尖部にさえ厚い筋肉が観察された。MRIにより明らかにされた心臓機能は、心拍血液量(SV)、EF、および心拍出量(CO)の変化により評価したところ、GMT単独と比較して、GMTcで治療した動物で有意に改善された(図19)。
組織学的分析を実施して、傷痕サイズを定量化し、治療した心臓の梗塞区域内の筋肉の存在を検出した。以前の報告と同様に、GMT単独で治療した心臓の梗塞部位内に糸状の筋細胞が発生したことが見出された。これは、in vivo画像化観察と一致していた。しかしながら、GMTcで治療した動物から単離した心臓では、筋細胞の厚いバンドが梗塞域内に観察された。この筋肉再形成が、リプログラミングによるものであったことを確認するために、ROSA−Lox−Stop−Lox−YFPマウスを、PeriostinCreマウスと交配して、ROSA−YFP/Periostin−Cre系統追跡マウスを生成した。これらマウスは、線維芽細胞およびそれらの後代でのみYFPを発現するため、線維芽細胞由来心筋細胞は、内因性心筋細胞と区別される(図20)。これら細胞がトロポニンTおよびYFPリポーターについて陽性染色されたため、梗塞区域周囲での筋肉再形成は、新たに形成されたiCMによるものであることが見出された。しかしながら、YFP+細胞は、対照群または梗塞部位の遠位区域では見出されなかった。
in vivo iCMの機能性および品質を評価するために、ランゲンドルフ調製を使用して、ROSA−YFP/Periostin−CreマウスからiCMを単離した。成体心筋細胞(CM)を、多少の変更を加えたが、Qian, L.ら(2012年)Nature、485巻:593〜598頁に記載されているように単離した。手短に言えば、成体マウスを、イソフルランで麻酔し、人工呼吸器を装着した。心臓を取り出し、ランゲンドルフ装置を用いて3ml/分の定流にて大動脈カニューレ挿入により逆行的に潅流した。心臓を、116mM NaCl、5.4mM KCl、6.7mM MgCl2、12mMグルコース、2mMグルタミン、3.5mM NaHCO3、1.5mM KH2PO4、1.0 NaH2PO4、21 HEPESを含むヴィッテンベルク分離培地(WIM)、1.5nMインスリン、必須ビタミン(GIBCO)、および必須mMアミノ酸(GIBCO)(pH7.4)で5分間37℃にて潅流し、その後、消化溶液(0.8mg/mlコラゲナーゼIIおよび10μΜ CaCl2で補完されたWIM)で10分間(細胞間結合実験で使用した対のCMで4分間)潅流した。次いで、心臓を、完全性を保ったまま(組織が緩く繋がったまま)、ランゲンドルフ装置から取り外した。次いで、所望の区域(すなわち、境界/梗塞域)を、顕微鏡下で顕微解剖し、機械的に解離させ、すりつぶし、低カルシウム溶液(5mg/mlウシ血清アルブミン、10mMタウリン、および150μΜ CaCl2で補完されたWIM)に再懸濁した。次いで、細胞を低速で遠心分離し、上清を除去し、一連の洗浄によりカルシウムを徐々に再導入した。電気生理学実験の場合、単離した同じ日に細胞を使用し、記録するまで、5mMクレアチン、2mM 1−カルニチン、5mMタウリン、および1.5nMインスリンで補完されたM199(Gibco)中で室温(21℃)にて保管した。免疫組織化学的検査の場合、細胞を、単離した日に、ラミニンコーティング培養スライドに播種し、付着させ、固定した。RNAseq、収縮性分析、およびカルシウムトランジエント測定の場合、iCMを、単離直後に蛍光顕微鏡下でperiostin−Cre:R26R−YFPシグナルの存在に基づき、マイクロピペットにより手作業で選択した。
GMTcで治療した動物のYFP+iCMの数は、GMT単独と比較して、5倍と著しく増加した。(図31)GMTまたはGMTc治療マウスから単離した全てのiCMは、成体心筋細胞と同様に、桿状であり、良好に組織化されたサルコメア構造を形成した。収縮性の点では、GMT治療マウスから単離した全ての細胞は、自発的カルシウムトランジエントを示したが、GMTcマウスから単離した細胞の70%よりも多くは、自発的に拍動しなかった。しかしながら、それらは、外部的電気刺激と同期し、より成熟した表現型を示した(図31)。
また、RNA−seqを実施して、対照心筋細胞、in vivoでリプログラミングされた心臓から単離したGMT iCMおよびGMTc iCMの間の全トランスクリプトーム変化を比較した。PCA分析により反映されているように、GMTc iCMの遺伝子発現は、GMT iCMよりも、成体心室心筋細胞に類似していたが、新生仔心筋細胞とは異なっていた(図22)。加えて、GMTc iCMは、成体心筋細胞と同様に、TGF−βおよびWNTシグナル伝達と関連するGOタームを有する遺伝子のより完全な下方制御を示した。GMT iCMとGMTc iCMとの間で制御が少なくとも2倍異なる遺伝子のGO分析により、GMTcでは、細胞分裂および有糸分裂に関与する遺伝子の下方制御、ならびにより成熟した表現型と一致する代謝遺伝子およびcAMP関連遺伝子の上方制御が明らかになった(図23)。高度に発現された主要な心臓遺伝子および線維芽細胞遺伝子の変化に着目すると、GMTc iCMは、GMT iCMと比較して、心臓遺伝子のより完全な上方制御および線維芽細胞遺伝子の下方制御を示すことが見出された。
(実施例5)
TGF−βおよびWNT阻害剤は、ヒト成人心臓線維芽細胞のリプログラミングを増強する
GMT単独では、ヒト線維芽細胞のリプログラミングには不十分であることが以前に報告されていたが、GMT(7F)をESSRG、MYOCD、ZFPM2、およびMESP1と組み合わせると、ヒト細胞を、マウスと同様の品質にリプログラミングすることができることが見出された。Fu, J.D.ら(2013年)Stem Cell Reports、1巻:235〜247頁。ここでは、SB431542およびXAV939の添加が、7Fにより誘導されるヒト心臓リプログラミングに及ぼす効果を試験した。
TGF−βおよびWNT阻害剤は、ヒト成人心臓線維芽細胞のリプログラミングを増強する
GMT単独では、ヒト線維芽細胞のリプログラミングには不十分であることが以前に報告されていたが、GMT(7F)をESSRG、MYOCD、ZFPM2、およびMESP1と組み合わせると、ヒト細胞を、マウスと同様の品質にリプログラミングすることができることが見出された。Fu, J.D.ら(2013年)Stem Cell Reports、1巻:235〜247頁。ここでは、SB431542およびXAV939の添加が、7Fにより誘導されるヒト心臓リプログラミングに及ぼす効果を試験した。
心室正常ヒト心臓線維芽細胞(HCF)を、Lonzaから購入した。最も関連するタイプの線維芽細胞を使用するために、loxPが導入されたT−抗原を用いて、成人ヒト心臓線維芽細胞の可逆的に不死化された細胞株を生成した。安定不死化細胞株を生成するために、細胞を、ピューロマイシン選択カセットを含むloxPが導入されたヒトT−抗原レンチウイルスに感染させた(Addgene プラスミド#18922)。1μg/mlピューロマイシンを5日間使用して細胞を選択した。次いで、細胞を、リプログラミングの日にCreウイルスに感染させて、T−抗原を切り出した。リプログラミングは、以前に記載されているように実施した。Fu, J.D.ら(2013年)Stem Cell Reports、1巻:235〜247頁。手短に言えば、7つのヒト心臓発生因子(Gata4、Mef2c、Tbx5、ミオカルディン、Esrrg、Mesp1、およびZnfpm2)をコードするpMXsレトロウイルスベクターを、Platinum−A(Cell Biolabs)細胞にトランスフェクトして、ウイルスを生成した。48時間後、HCFを、上清を含むウイルスのプールで一晩形質導入し、6μg/mlポリブレンを補完した。次いで、培地を、感染の24時間後にSB431542(2.6μΜ)を含むiCM培地[DMEM:M199(4:1)、10%FBS、1×非必須アミノ酸(NEAA)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン]と置換し、感染の48時間後にXAV939(5μΜ)を含むiCM培地[DMEM:M199(4:1)、10%FBS、1×非必須アミノ酸(NEAA)、1×ペニシリン/ストレプトマイシン]と置換した。リプログラミングの視覚化および細胞選別の場合、リプログラミングされたHCFを、plx−hTNT−GFPまたはplx−hTNT−GCaMP5のいずれかで形質導入した。手短に言えば、plx−hTNT−GFPまたはplx−hTNT−GCaMP5を、レンチウイルスパッケージングプラスミドpMD2.GおよびpsPAX2と共にFugene HDを用いてHEK293FT細胞にトランスフェクトして、レンチウイルスを生成した。48時間後、HCFを、一晩形質導入し、6μg/mlポリブレンを補完した。リプログラミングの4日目に、B27補完剤を有するRPMI1640を、15日目にiCM培地と完全に置換されるまで、25%のiCM増分で3日毎に添加した。
TNT−GCaMPリポーターを使用して心臓リプログラミングを検出したところ(図24)、7F+SB431542およびXAV939(7Fc)は、7FによりリプログラミングされたiCMのパーセントを2倍にさせることが見出された(図25)。また、7FcでリプログラミングされたiCMは、早くも3週間でサルコメア形成を示した。さらに、7Fcでリプログラミングしたわずか10日後には、カルシウムスパークが生じ、これらのカルシウムトランジエントは、リプログラミングの3週間以内に、細胞全体にわたってより均質になった。4週間以内に、7Fcリプログラミングの50%よりも多くが、自発的なカルシウムトランジエントを示したのに比べて7Fでは5%未満であったが、これは、それらが成熟していることを示している可能性がある(図26)。
リプログラミングされた細胞の品質を評価するために、化学薬品を用いてまたは用いずに7Fでリプログラミングを誘導した4週間後に、RNA−seqを実施した。実際、7Fc iCMの遺伝子発現プロファイル変化は、PCAにより示されているように、7F iCMと比較して加速された(図27)。4FCによるリプログラミングは、7Fcを使用してリプログラミングし、TNT−GFPをリポーターとして使用した場合と同様の結果をもたらした。さらに、WNTおよびTGF−βシグナル伝達経路の遺伝子発現は、7F iCMと比較して、7Fc iCMでは有意に下方制御された。7F iCMと7Fc iCMとの間で制御が少なくとも2倍異なる遺伝子のGO分析を実施し、これら遺伝子はほとんどが、マウスリプログラミングで見出されたものと同様に、細胞外マトリックス形成およびコラーゲンの下方制御、ならびにカルシウムおよびイオン輸送関連遺伝子の上方制御に関与していることが見出された。(図28)主要な心臓遺伝子および線維芽細胞遺伝子をより詳しく分析すると、化学薬品は、心臓遺伝子の発現を有意に増強し、線維芽細胞遺伝子の発現を抑制することが見出された。4FCによるリプログラミングは、7Fcを使用してリプログラミングし、TNT−GFPをリポーターとして使用した場合と同様の結果をもたらした。
まとめると、これらのデータは、低分子によりTGF−βおよびWNTシグナル伝達を阻害すると、in vitroおよびin vivoでの生後マウスおよびヒト心臓線維芽細胞の心臓リプログラミングを有意に増強したことを示す。
驚くべきことに、TGF−βシグナル伝達は、SB431542、ALK5(TGF−β I型受容体)、ALK4、およびALK7を選択的に阻害する低分子でこの経路を阻害することによる直接心臓リプログラミングにとって不可欠であることも発見された。
興味深いことには、RNA−seqデータは、GMTc iCMが、in vitroおよびin vivoで、新生仔心筋細胞ではなく成体心室心筋細胞とより一致する遺伝子発現プロファイルを有することを明らかにした。驚くべきことには、GMTc iCM中のある特定の心臓遺伝子のin vitroおよびin vivoでのRNA発現レベルは、実際に、単離された対照内因性心筋細胞よりも高かった(例えば、TNNT、ACTC1、ACTN2、MYH7、およびRYR2)。この予期しない観察は、iCMが、依然としてリプログラミング中であり、したがって、これら系統特異的遺伝子を高レベルで活発に転写して、細胞運命転換を支援していることを反映している可能性がある。あるいは、これら遺伝子は、外因性GMTの活性保持に特に感受性である標的である可能性がある。それにもかかわらず、GMTcは、in vitroおよびin vivoで、線維芽細胞遺伝子のほとんどを、効率的に、成体心室心筋細胞と同様のレベルに下方制御した。
(実施例6)
従来の7F系よりも少数の因子によるヒト線維芽細胞のリプログラミング
ヒト線維芽細胞の心筋細胞への十分な分化転換に必要であることが以前に報告されている7Fリプログラミング因子のいずれか1つまたは組合せが非必須であるか否かを決定するために、単一の因子および複数の因子の種々の組合せを取り除いて、リプログラミングを評価した。
従来の7F系よりも少数の因子によるヒト線維芽細胞のリプログラミング
ヒト線維芽細胞の心筋細胞への十分な分化転換に必要であることが以前に報告されている7Fリプログラミング因子のいずれか1つまたは組合せが非必須であるか否かを決定するために、単一の因子および複数の因子の種々の組合せを取り除いて、リプログラミングを評価した。
まず、7Fc中の単一因子の除去を試験して、それを除去しても、ヒト心臓線維芽細胞を依然として完全にリプログラミングすることができるか否かを観察した。一度に1つの因子を除去することにより、Mesp1、ZFPM2、またはESSRGがなくとも、ヒト線維芽細胞のリプログラミングは、7Fcリプログラミング法と比較して同様の遺伝子発現プロファイルをもたらすことが見出された。加えて、2つの因子の異なる組合せを除去した場合、(1)Zfpm2およびEsrrgならびに(2)Zfpm2およびMesp1の組合せが無くとも、SB431542およびXAV939の存在下でのリプログラミングから同様の遺伝子発現プロファイルがもたらされることが見出された。その一方で、ミオカルディンは、ヒト線維芽細胞の心筋細胞への効率的なリプログラミングにとって特に重要であると考えられた。リプログラミングカクテルからミオカルディンを除去すると、心筋細胞遺伝子の発現が低下し、線維芽細胞遺伝子の残留発現が増加した。
驚くべきことに、SB431542およびXAV939の存在下でリプログラミングする場合にわずか4つの因子:GATA4、MEF2C、TBX5、およびミオカルディンにより同程度のリプログラミングを達成することができることも見出された(4Fc)。FACS分析は、同様のパーセントのTNT+ iCMが、4Fc法を使用して得られることを示し、免疫蛍光法は、4Fcおよび7Fcで誘導したiCMでは、サルコメアが高度に組織化されていることを明らかにした(図29、30)。特に、リプログラミング因子カクテルからMesp1、Zfpm2、およびEsrrgを取り除いても、7Fcリプログラミング法でリプログラミングされたヒト線維芽細胞と比較して、同様の発現レベルの心筋細胞遺伝子がもたらされる。
驚くべきことに、SB431542およびXAV939の存在下では、わずか3つの因子の組合せ、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5(MMT)により、ヒト線維芽細胞を心筋細胞へと効率的にリプログラミングすることができることが発見された。MMTの組合せは、TNT−GFPリポーターの発現増加により示されるように、SB431542およびXAV939の存在下での心臓リプログラミングの誘導に十分である。また、抗炎症試薬(デキサメタゾン)の添加は、SB431542およびXAV939の存在下でのMMTリプログラミングを可能にすることが見出された(データ非表示)。加えて、MMTおよび化合物の組合せは、リプログラミングの3週間以内に、サルコメア組織化が進行したトロポニン−T陽性細胞の出現をもたらした。
(実施例7)
MMTcリプログラミングにおけるsiRNAおよびデキサメタゾンの併用
MMTcの低分子化学阻害剤の代わりにsiRNA分子を使用することができることを、TGF−β受容体1およびタンキラーゼ1に対するsiRNAを使用して試験した。低分子干渉RNAの使用は、同じ程度に効率的にヒト線維芽細胞をiCMへとリプログラミングし、TGF−β受容体1およびタンキラーゼ1に対するsiRNAは、リプログラミング活性がそれぞれSB431542およびXAV939と本質的に等しいことが示された(図32)。
MMTcリプログラミングにおけるsiRNAおよびデキサメタゾンの併用
MMTcの低分子化学阻害剤の代わりにsiRNA分子を使用することができることを、TGF−β受容体1およびタンキラーゼ1に対するsiRNAを使用して試験した。低分子干渉RNAの使用は、同じ程度に効率的にヒト線維芽細胞をiCMへとリプログラミングし、TGF−β受容体1およびタンキラーゼ1に対するsiRNAは、リプログラミング活性がそれぞれSB431542およびXAV939と本質的に等しいことが示された(図32)。
手短に言えば、RNAiMAXを100nM siRNA/ウェルの濃度で使用して、20000細胞/ウェルをリプログラミングの−1日目にトランスフェクトし、トランスフェクション試薬を24時間後に除去した。MMTをコードするレトロウイルスを、実験の0日目にヒト心臓線維芽細胞に感染させ、24時間後に除去した。次いで、リプログラミングを、以前に記載されているように実施した。Mohamed TMAら、Circulation.、2017年;135巻:978〜995頁。手短に言えば、各々3つのリプログラミング因子の1つをコードする3つの別個のレトロウイルスベクターのカクテルを使用して、1日目にHCFを感染させ、24時間後に過剰ウイルスを除去した。レトロウイルスは、実験の全期間にわたってゲノムへの組み込みが維持された。SB431542(2.6uM)を、1日目から8日目まで添加し、XAV9393(5uM)を、2日目から8日目まで添加し、デキサメタゾン(100nΜ)を、1日目から21日目まで添加した。
上記に示されている例は、in vitroおよびin vivoでのリプログラミング因子を使用した生後ヒトおよびマウス心臓線維芽細胞の直接心臓リプログラミングを増強する能力を有する、低分子またはsiRNAのいずれかを使用した最初の単純なカクテルを提供する。これらのデータは、TGF−β阻害剤およびWNT阻害剤が、心臓機能を有意に改善し、ヒトリプログラミングに必要とされるリプログラミング因子の数を、7つから4つまたはわずか3つの因子へと減少させることを示している。
本発明は、上記の実施形態と共に記載されているが、上述の記載および例は例示のためのものであり、本発明の範囲を限定することは意図されていないことが理解されるべきである。本発明の範囲内にある他の態様、利点、および改変は、本発明が関する分野の当業者にとって明白である。
加えて、本発明の特徴または態様が、マーカッシュ群の観点で記載されている場合、当業者であれば、本発明は、それにより、マーカッシュ群の任意の個々の要素または要素の部分群の観点でも記載されていることを認識するだろう。
本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が参照により個々に組み込まれているのと同じ程度まで、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先されることになる。
Claims (41)
- 誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のWNT阻害剤および1つまたは複数のリプログラミング因子を導入することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する、方法。
- 前記WNT阻害剤が低分子である、請求項1に記載の方法。
- 前記WNT阻害剤がsiRNAである、請求項1に記載の方法。
- 誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のTGF−β阻害剤および1つまたは複数のリプログラミング因子を導入することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する、方法。
- 前記TGF−β阻害剤が低分子である、請求項4に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤がsiRNAである、請求項4に記載の方法。
- 誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、および1つまたは複数のリプログラミング因子を導入することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する、方法。
- 前記非心筋細胞が、ヒト細胞である、請求項1〜8に記載の方法。
- 前記WNT阻害剤が低分子である、請求項7または8に記載の方法。
- 前記WNT阻害剤がsiRNAである、請求項7または8に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤が低分子である、請求項7〜10に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤がsiRNAである、請求項7〜10に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤が、前記WNT阻害剤を投与する前に投与される、請求項7〜12に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤が、前記WNT阻害剤の投与と同時に投与される、請求項7〜12に記載の方法。
- 前記非心筋細胞が、体細胞、心臓線維芽細胞、非心臓線維芽細胞、心臓前駆細胞、および幹細胞からなる群から選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 投与される前記リプログラミング因子が、Gata4、Mef2c、およびTbx5を含む、請求項1〜15に記載の方法。
- 投与される前記リプログラミング因子が、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5を含む、請求項1〜15に記載の方法。
- 誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、ならびにGata4、Mef2c、およびTbx5を含むリプログラミング因子を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞を生成する、方法。
- 誘導心筋細胞を生成するための方法であって、非心筋細胞に、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、ならびにミオカルディン、Mef2c、およびTbx5を含むリプログラミング因子を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞を生成する、方法。
- 前記非心筋細胞が、in vivoで心筋細胞へと誘導される、請求項1〜19に記載の方法。
- 抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項1〜19に記載の方法。
- in vivoで誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成するための方法であって、対象に、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、および1つまたは複数のリプログラミング因子を投与することを含み、それにより誘導心筋細胞または心筋細胞様細胞を生成する、方法。
- 前記非心筋細胞が、ヒト細胞である、請求項22に記載の方法。
- 前記WNT阻害剤が低分子である、請求項22または23に記載の方法。
- 前記WNT阻害剤がsiRNAである、請求項22または23に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤が低分子である、請求項22〜25に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤がsiRNAである、請求項22〜25に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤が、前記WNT阻害剤を投与する前に投与される、請求項22〜27に記載の方法。
- 前記TGF−β阻害剤が、前記WNT阻害剤の投与と同時に投与される、請求項22〜27に記載の方法。
- 前記リプログラミング因子が、Gata4、Mef2c、およびTbx5を含む、請求項22〜29に記載の方法。
- 前記リプログラミング因子が、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5を含む、請求項22〜29に記載の方法。
- 抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項22〜31に記載の方法。
- 請求項1〜21に記載の方法に従って産生された単離された誘導心筋細胞の集団を含む組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項33に記載の組成物。
- 安定化剤および/または保存剤をさらに含む、請求項33に記載の組成物。
- 請求項1〜21に記載の心筋細胞の実質的に均質な集団。
- 心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法により産生された有効量の誘導心筋細胞集団を投与することを含む方法。
- 心血管疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、有効量のWNT阻害剤、有効量のTGF−β阻害剤、および1つまたは複数のリプログラミング因子を投与することを含む方法。
- 前記1つまたは複数のリプログラミング因子が、ミオカルディン、Mef2c、およびTbx5を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のリプログラミング因子が、Gata4、Mef2c、およびTbx5を含む、請求項38に記載の方法。
- 前記対象に、有効量の抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項38〜40に記載の方法。
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