JP2010520181A - 心血管疾患の予測および治療のためのオステオポンチン - Google Patents
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Abstract
Description
被験体の採用
コントロール不良の1型糖尿病(HbAl/c>10%により規定される)を有する患者であって、1年より長きにわたってインスリンを受けており、他の薬物療法をいずれも受けていない患者を、Diabetes Day Centre、University College Hospital Galway、Irelandから採用した。この研究の倫理的承認は、University College Hospital Galway Clinical Research and Ethical Committeeから得た。微小血管または大血管合併症を有する患者は、この研究から排除した。微小血管合併症は、ミクロアルブミン尿症、糖尿病網膜症および神経障害の存在として定義した。大血管合併症は、急性冠血管症候群、末梢血管疾患および脳血管疾患の任意の以前の病歴の存在として定義した。同意書に署名した後、1型糖尿病を有する患者および健常志願者から末梢血サンプルを採取した。
EPCを、以前に記載した技術に従って培養した。簡潔に述べると、単核細胞(MNC)を、Ficollpaque密度遠心分離法によって単離した。3回の洗浄工程による精製後、10×106または2×106のMNCを、フィブロネクチン被覆した6ウェルプレートまたは4ウェルのガラススライド上にそれぞれ播いた。細胞を、5%FBS、血管内皮増殖因子(VEGF)、線維芽細胞増殖因子−2、上皮増殖因子、インスリン様増殖因子−1およびアスコルビン酸からなるEGM−2シングルアリコート(Clonetics)を補充した内皮細胞基本培地−2(Clonetics)中で培養した。EPCを、DiI−アセチル化低密度リポタンパク質およびFITC−レクチンで二重染色することによって確認した。
糖尿病を、雄性ニュージーランド白ウサギにおいて、アロキサンの静脈内注射(150mg/kg)を使用して誘導した。血漿グルコース>22のウサギを、研究に含めた。静脈切開術を、麻酔下で辺縁動脈を介して実施した。この研究は、National University Ireland、Galway(NUIG)Animal Care and Use Committeeにより承認された。
フィブロネクチン(100g/mL)で、24ウェルプレート上を、37℃で2時間被覆した。ウェルを、PBS中1%のBSAで2時間ブロッキングし、EPC(1×105)を各ウェルに添加して、1時間接着させた。接着細胞を、0.1%クリスタルバイオレットで染色し、10%酢酸でリンスして、細胞から染色を溶出させた。培地の光学濃度を、600nmの波長でマイクロタイタープレートリーダーを用いて分析することにより、接着細胞を定量した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単層を、4ウェルガラススライドの各ウェル中に、2×105細胞(5〜8継代)を播くことによって、アッセイの48時間前に調製した。HUVECを、TNF−α(BD Biosciences)(1ng/mL)または培地によって、12時間にわたり前処理した。EPCをdiIで標識し、1×105細胞を各ウェルに添加し、37℃で3時間インキュベートした。非接着細胞を、PBSを用いて穏やかに除去し、接着EPCを4%パラホルムアルデヒドで固定し、盲検観察者が計数した。
Matrigel(Sigma)を解凍し、4ウェルのガラススライド中に室温で30分間置いて凝固させた。diI標識したEPC(2×104)を、4×104のヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)と同時に播き、5μg/mlのOPN(SIGMA)ありまたはなしで、37℃で12時間インキュベートした。細管形成を、その幅に対して4倍の長さを示す構造として規定した。形成した細管の数を、盲検計数者が評価した。オステオポンチンの効果がRGD依存的であるかどうかを決定するために、異なるRGD/RAD濃度を、オステオポンチンと共にインキュベートした。
総RNAを、4日目のEPCから、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を業者が記載したとおりに使用して、単離した。単離した総RNAの濃度を、NanoDropカウンターを使用して分析した。QuantIt DNA High Sensitivity Kitを使用して、総RNAサンプル中の任意のゲノムDNAの存在を検出した。
マイクロアレイ分析を、GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Affymetrix Arrayを使用して実施した。遺伝子発現プロフィールを、健常志願者由来のEPCをベースラインとし、MAS5.1ソフトウェア(Affymetrix)を使用して、コントロール不良のT1DMを有する患者由来のEPCと健常志願者由来のEPCとの間で比較した。変化倍率を、2つのグループ間の転写物を比較することによって計算した。K平均クラスタリングを使用して、検出された(存在するまたは存在しない)コールおよび変化した(増加または減少した)コールを同定した。
プライマーを、PrimerExpressソフトウェアを使用して設計し、SIGMA Genosysに注文した(表1)。
発現研究を、One Step QuantiTect SYBR Green PCR Kit(Qiagen)を用い、ABl Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)で、96ウェルプレートを使用して実施した。反応を、僅かな改変を加えて製造業者の指示に従って実施した。PCRプログラムを、25μlのサンプル容量を使用して、逆転写工程のため50℃で30分間で開始し、Taq DNAポリメラーゼの活性化のため95℃で15分間、その後95℃で15秒および60℃で30秒の40サイクルを行った。解離曲線を、60℃と95℃との間の温度範囲を使用したリアルタイムPCRの直後に作成した。各サンプルを3連で分析した。全ての反応をさらに、2%アガロースゲルでの電気泳動に供し、SyBrGreen色素で染色して、予測されたPCR産物の存在を確認した。
C57BL/6(WT)マウスおよびOPN−/OPN−マウスを、Charles River LabおよびJackson Labからそれぞれ購入した。8〜10週齢のOPN−KOマウスおよびWTマウスを使用した。マウスを、Regenerative Medicine Institute(REMEDI)、NCBES、NUIGのAnimal Facilityに収容した。全ての手順は、Cruelty to Animals Act、1876年の下で、Minister of Health and Childrenにより承認された。片側後肢虚血を、以前に記載されたとおりに、C57BL/6マウスおよびOPN−/OPN−マウスにおいて行った32。簡潔に述べると、左後肢の中央部を覆う皮膚において切開を行った。大腿動脈の近位末端の結紮後、伏在動脈の遠位部分を結紮し、動脈ならびに全ての側方分岐を自由に解剖し、切除した。皮膚を、吸収性の縫合糸を使用して閉じた。動物はケタミンおよびキシラジンで麻酔し、イソフルランで維持したことに注目されたい。
後肢および足の両方の後肢血流を、レーザードップラー血流(LDBF)分析器(PeriScan PIMII、Perimed Inc)を使用して、手術直前および手術後0日目、7日目、14日目および28日目に測定した。血流を、異なる色のピクセルを用い、レーザー周波数における変化として表示した。スキャン後、保存した画像を分析して血流を定量した。周囲の光および温度によって引き起こされるデータの変動を回避するために、後肢血流を、右(非虚血)LDBFに対する左(虚血)LDBFの比として表現した。
全てのサンプルを1時間以内に処理した。生きた細胞を、Sca−I、c−kitおよびCD31に対するコンジュゲート抗体(BD Biosciences)で染色した。FACS ARIA Coulterを使用して、FACS分析を実施した。上記試薬に対して陽性な骨髄細胞の頻度を、顆粒球を排除するため適切なゲートをかけた後、異なる試薬で染色したサンプルの2次元側方散乱蛍光ドットブロット分析によって決定した。最初に、Sca−1+の骨髄細胞にゲートをかけ、次いで、得られた集団をc−kitの二重発現について試験した。さらなる分析のために、Sca−1+細胞を、前駆細胞の内皮分化を反映する、フィコエリトリンコンジュゲート抗マウスCD31モノクローナル抗体(BD Biosciences)を使用して、CD31発現について研究した。Macintosh CELL Questソフトウェアプログラム(BD Biosciences)を使用してデータを処理した。動物の状態について盲検の1人の訓練された操作者(T.B.)が、研究を通して全てのフローサイトメトリー分析を実施した。
結果を、平均±SEMとして示す。グループ間の比較はANOVAによって実施した。事後分析およびペアワイズ多重比較を、Scheffe調整した両側t検定を使用して実施した。<0.05の確率値を統計的有意とみなした。全ての分析を、SPSSソフトウェア(SPSS Ver.14.0 Inc)を用いて実施した。
雄性Sprague−Dawleyラット(225〜250g)を麻酔し、心臓を迅速に切り取り、直ぐに、Tsuchidaら(Circulation Research 1994年)から適合させたプロトコルを使用して、Langendorff灌流装置にカニューレ処置した。簡潔に述べると、心臓を、60mmHgの一定圧力でKrebs−Ringer緩衝液を用いて灌流した。全ての灌流した心臓を、種々の処置の誘導前に、Langendorff装置上で20分間安定化した。処置グループ(n=3)当たり3つの心臓を使用した。灌流した心臓を、安定化後、1時間15分にわたって連続して灌流した。虚血/再灌流傷害を模倣するために、プレコンディショニングしていない心臓を、連続して30分間灌流し、その後30分間虚血に曝し(Kreb’s緩衝液の流れの停止)、その後15分間の再灌流(Kreb’s緩衝液の流れの再開)を行った。処置後、心臓を直ぐにTrizol試薬に取り出し、ホモジナイズした(Invitrogen)。20%クロロホルムの添加後、サンプルを倒置により混合し、12,000×gで15分間、2〜8℃で遠心分離した。RNAを取り出し、0.5mlのイソプロパノールを含むEppendorfチューブに添加し、激しくボルテックスをかけてRNAを沈殿させた。室温で10分間のインキュベーション後、RNAを、12,000×gで10分間遠心分離することによってペレット化し、75%エタノール1mlで洗浄した。RNAを、7,500×gで5分間の遠心分離によってペレット化し、上清を除去し、ペレットを室温で10分間風乾させた。引き続き、ペレットを、50μlのDEPC処理した水中に再懸濁した。RNAを、260nm(UV吸収範囲)でのその光学濃度に基づいて、分光測定によって定量した。定量PCRを、AMV Reverse Transcriptase(Sigma)を使用し、2μgのRNAおよびOligo(dT)12−18(Invitrogen)を用いて実施した。グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、オステオポンチンに対するプライマーを、Primer Expressソフトウェア(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して、National Centre for Biotechnology Information(NCBI)からの公開されたmRNA配列に対して設計し、配列特異性を、BLAST(NCBI)検索を実施することによって確認した。プライマーセットは、MWG Biotech(Ebersberg、Germany)が合成した。
新生仔心筋細胞初代培養物を、1〜4日齢のSprague Dawleyラットから単離した。簡潔に述べると、ラットを安楽死させ、心臓を切り取った。メスによるホモジネート化、4℃での一晩のトリプシン消化および37℃で20分間のコラゲナーゼ処理の後、心筋細胞を、Percoll勾配遠心分離(Amersham)によって富化し、0.2%ゼラチンで被覆した培養プレート上に、10%新生仔ウシ血清、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco−BRL)、5%インスリントランスフェリン亜セレン酸塩(ITS)液補充培地、100μMの5−ブロモ−2−デオキシウリジンを補充したDMEM/F12培地1ml当たり1×105の密度で播いた。細胞を、37℃および5%CO2で培養した。
被験体の採用
1型糖尿病を有する4人の患者ならびに4人の年齢および性別が一致した健常志願者を採用した(表2)。
T1DMを有する患者は、健常志願者と比較して、より少ない数のEPCを有する(244±20対334±7、p=0.02)(図1)。
T1DMを有する患者は、コラーゲンに対する正常な接着(1.00±0.11対1.34±0.15、p=0.13)(図2)およびフィブロネクチンに対する正常な接着(1.65±0.44対2.13±0.20、p=0.16)(図3)を有する。
次に、内皮細胞へのEPC接着に対する糖尿病の効果を、静止状態の内皮細胞において、TNF−αへの曝露後に評価した。コントロール不良のT1DMを有する患者由来のEPCは、静止状態の内皮細胞に対する正常な接着を実証したが(7.01±0.91対7.79±0.68、p=0.54)、活性化された内皮細胞に対する接着は損なわれていた(11.05±0.01対21.03±1.13、p=0.001)(図4)。
血管形成に関与するEPCの能力の測定であるin vitroの細管形成を、次に評価した。T1DMを有する患者由来のEPCは、コントロールと比較して、細管を形成する能力が損なわれていた(1.7±0.9対9.8±1.8、p=0.01)(図5)。この欠陥は、インスリン欠損糖尿病の動物モデルでも観察され、このとき、アロキソン誘導された糖尿病ウサギ由来のEPCもまた、非糖尿病のコントロールウサギ由来のEPCと比較して、損なわれた細管形成能力を示した(9.6±1.77対13.0±0.65:p=0.049)(図6)。
リアルタイムPCRを使用して、OPN発現が、健常志願者と比較して、コントロール不良の糖尿病を有する患者由来のEPCで減少することが実証された。
コントロール不良のT1DMを有する患者由来のEPCにおけるOPNの発現の減少が実証されたので、OPNに対するEPCの曝露がこの欠陥を逆転できるか否かを決定することが求められた。これを行うために、in vitroのEPC機能に対するOPN補充の効果を評価した。OPNとのインキュベーションは、非糖尿病ウサギ由来のEPCによって形成された細管の数を増加させた(13.0±0.65対16.5±1.15:p=0.039;図7)。OPNとのインキュベーションはまた、糖尿病ウサギ由来のEPCによって形成された細管の数も増加させた(9.88±2.48対16.56+/−2.21;p=0.01)(図8)。
マイクロアレイ分析は、オステオポンチンが、糖尿病被験体由来のEPCにおいて下方調節されることを実証した。これは、リアルタイムPCRを使用してさらに立証された。平均変化倍率を、マイクロアレイ結果と比較した(表3)。
in vivoの血管形成におけるOPNの役割を研究するために、片側後肢虚血のマウスモデルにおいて血管形成の程度を評価した。血流を、この手順の前および後に、WTマウスおよびOPN−KOマウスにおいて評価した。OPN−KOマウスにおいて、虚血肢と非虚血肢との間のLDBF比の測定により、虚血後肢における灌流の回復が、有意に損なわれたことが示された。手術後7日目、14日目および28日目に、LDPF比は、OPN−KOマウスにおいて減少し、それぞれWTマウスに対して、0.31±0.07対0.68±0.11(P=0.021)、0.32±0.03対0.54±0.05(p=0.006)および0.45±0.06対1.09±0.13(P=0.002)(図10および11)であった。
次に、OPNノックアウトマウスで観察された損なわれた欠陥形成の病因におけるEPC動員の役割を検討した。このために、循環EPC数を、OPNノックアウト動物および野生型動物において後肢虚血の誘導の前および後に測定した。EPC数のフローサイトメトリー分析を、後肢虚血の誘導の前および3日後に実施した。0日目に、両方のグループ間でEPC数に違いはなかった。さらに、EPC数は、OPNノックアウトマウスにおいて、後肢虚血の誘導の3日後に増加した(0日目の0.33±0.05対3日目の0.55±0.05;p=0.036)。この結果は、OPNがEPCの動員に関与しないことを示唆する。対照的に、EPC数は、コントロールマウスにおいて、後肢虚血の誘導の3日後に増大しなかった(図12および13)。
リアルタイムPCRによって決定したように、オステオポンチン発現レベルは、灌流したサンプルにおける発現レベルと比較して、虚血/再灌流ラット心臓において、5.14分の1に減少した。
内因性虚血状態をシミュレートする条件に供したラット新生仔心筋細胞初代培養物において、オステオポンチンタンパク質発現レベルは、ウエスタンブロット分析において決定したとおり、正常条件下で培養した心筋細胞と比較して、減少した(図14を参照のこと)。2時間目、8時間目、12時間目および24時間目に測定したオステオポンチン発現レベルは、虚血前のレベルに回復しなかった。
EPCの数および機能は、種々の因子によって効果を受け得る15。減少したEPC数が、1型DMおよび2型DMを有する患者において実証された16、17。しかし、微小血管合併症は、これらの研究において排除されなかった。最近、糖尿病網膜症がEPC数を増加させることが示されている20、21。この理由のために、糖尿病網膜症および他の合併症を有さない均一集団を選択した。T1DMを有するヒトにおいて他の混乱させる因子なしの高血糖症の効果を観察することが所望された。
糖尿病におけるEPCの機能不全は、OPN発現の減少と関連し、OPN補充によって逆転でき、これは、糖尿病被験体が血管合併症になる傾向がより高い理由を説明し得る。さらに、OPNノックアウト動物における研究は、血管形成におけるOPNの重要な役割を確認している。この結果は、この効果が、EPCにおけるより低いOPN発現に関連する可能性があることを示唆している。糖尿病におけるEPCの機能不全は、この障害のための新たな治療標的を同定する、OPN発現の減少に起因する。
Claims (31)
- 医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、活性化された内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
- 医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
- 医薬的に許容される担体または賦形剤と共にオステオポンチンを含む医薬組成物。
- 医薬的に許容される担体または賦形剤と共に、オステオポンチンをコードする遺伝子または機能的オステオポンチンもコードするその変異体を含む医薬組成物。
- 活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞を含む医薬組成物。
- オステオポンチンをさらに含む、請求項5に記載の医薬組成物。
- 心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞の使用。
- 心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製におけるオステオポンチンの使用。
- 心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、オステオポンチンをコードする遺伝子の使用。
- 心血管疾患、および糖尿病関連血管合併症を含む関連合併症の治療のための医薬の調製における、活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞の使用。
- 前記心血管疾患および糖尿病関連血管合併症が、心筋梗塞、冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全から選択される、請求項7から10に記載の使用。
- オステオポンチンを発現または過剰発現する、活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
- オステオポンチン遺伝子発現を増大させるように遺伝子改変された、請求項12に記載の活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
- オステオポンチンによって活性化された、請求項12に記載の活性化された内皮前駆細胞または活性化された間葉系幹細胞。
- 糖尿病を有する被験体が、糖尿病関係血管合併症を有するかどうか、または糖尿病関係血管合併症を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法であって、該被験体におけるオステオポンチン発現レベルを測定する工程、該オステオポンチン発現レベルを、糖尿病を有さないコントロール被験体に関連するオステオポンチン発現レベルと比較する工程とを含み、より低いオステオポンチン発現レベルが、該被験体における糖尿病関連血管合併症または糖尿病関係血管合併症を発症する危険性の増加のいずれかと相関する、方法。
- 被験体が、心血管疾患を有するかどうか、または心血管疾患を発症する危険性があるかどうかを決定するための方法であって、該被験体におけるオステオポンチン発現レベルを測定する工程と、該オステオポンチン発現レベルを、心血管疾患を有さないコントロール被験体に関連するオステオポンチン発現レベルと比較する工程とを含み、より低いオステオポンチン発現レベルが、該被験体における心血管疾患または心血管疾患を発症する危険性の増加のいずれかと相関する方法。
- 前記オステオポンチン発現レベルが、血液、血清、組織または細胞において測定される、請求項15または16に記載の方法。
- 遺伝子治療による心血管疾患または糖尿病関連血管合併症の治療のための医薬の製造における、オステオポンチンをコードする遺伝子の使用。
- 医薬的有効量のオステオポンチンを患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
- 医薬的有効量の、オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドを患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
- オステオポンチンを発現または過剰発現する内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
- オステオポンチンによって活性化された内皮前駆細胞または間葉系幹細胞を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
- オステオポンチンをコードする遺伝子または機能的オステオポンチンもコードするその変異体を患者に投与する工程を含む、心血管疾患および糖尿病関連血管合併症を治療する方法。
- 前記オステオポンチンをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子治療技術の一部として内皮前駆細胞中で投与される、請求項20に記載の方法。
- 前記心血管疾患または糖尿病関係血管合併症が、冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全および心筋梗塞から選択される、請求項18から24のいずれか一項に記載の方法。
- 冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全、心筋梗塞および糖尿病関連血管合併症などの心血管疾患の治療のための化合物を同定するための方法であって、試験化合物をオステオポンチン発現が下方調節される細胞と接触させる工程と、オステオポンチン発現に対する該候補化合物の効果を決定する工程とを含む方法。
- 冠血管疾患、末梢血管疾患、虚血、脳血管疾患、心不全、心筋梗塞および糖尿病関連血管合併症などの心血管疾患を治療するための血管形成因子としてのオステオポンチンの使用。
- 組換えオステオポンチンタンパク質、オステオポンチンの直接投与、またはオステオポンチンを過剰発現するように遺伝子改変されたEPCもしくはMSCなどの細胞、またはオステオポンチン処理によって活性化されたEPCもしくはMSCの使用である、請求項27に記載の使用。
- オステオポンチンに対して惹起された抗体。
- オステオポンチンに対して惹起された抗体で被覆され、活性化された内皮前駆細胞もしくは活性化された間葉系幹細胞で被覆され、またはオステオポンチンを過剰発現する内皮前駆細胞もしくは間葉系で被覆された医療用デバイス。
- ステント、縫合糸、絆創膏もしくは包帯、またはプロテーゼから選択される、請求項30に記載の医療用デバイス。
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