JP2022551911A - 遺伝子治療の心外膜送達 - Google Patents

Abstract

さまざまな局面および態様において、本発明は、治療を必要とする対象の心血管疾患を治療する方法であって、治療用ポリヌクレオチドを含む有効量のウイルスベクターを対象の心臓に直接投与する工程を含む方法を提供する。TIFF2022551911000018.tif167156

Description

関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. § 119（e）の定めにより、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2019年10月9日に出願された米国特許仮出願番号62/912,958の優先権を主張する。

発明の背景
American Heart Association 2019 Heart Disease and Stroke Statistics Update（非特許文献1）によると、20歳以上の米国成人における心血管疾患の有病率は全体で48.0%（2016年は1億2,150万人）であり、米国では心血管疾患による死亡が841,000件（≒全世界で1,760万）近くを占めている。推定1,820万人の20歳以上の米国人が冠動脈性心疾患を患っており、これは米国の心血管疾患に起因する死亡において主な死因（43.2%）である。2006年から2016年にかけて、冠動脈性心疾患に起因する年間死亡率は31.8%減少したが、負荷および危険因子は驚くほど高いままである。虚血性心疾患は、心臓への血流量の減少を特徴としている。慢性虚血は、筋肉の領域への血液供給が制限される、冠動脈の狭窄によって引き起こされる。急性虚血は、突然のプラーク破綻に起因する。治療せずに放置すると、冠動脈疾患（coronary artery disease:CAD）が進行して症状および病的状態が悪化し、心筋梗塞（myocardial infarction:MI）または死亡につながる可能性がある。人口が高齢化し、肥満および糖尿病の罹患率が上昇するにつれて、重度のCAD患者の数は増え続けるであろうとの報告がある。

難治性狭心症の死亡率は新しい治療法で減少する可能性があるという証拠にもかかわらず、至適薬物療法が利用可能であっても、外科的または経皮的冠動脈血行再建に適さない、日常生活に支障を来す狭心症にかかっている患者（「選択肢のない患者（no option patients）」）の数は増加すると予測されている。NHANES 2013～2016のデータによると、狭心症の全体的な有病率は、20歳以上の米国成人（940万人）で3.6%である。CADの病歴（急性冠症候群、冠動脈血行再建術後または安定狭心症）のある患者のうち、32.7%が過去1か月間に少なくとも1回の狭心症の発症を自己申告した。狭心症を申告した患者のうち、23.3%が毎日または毎週における狭心症の症状を申告し、毎日または毎週の狭心症を伴うこれらの患者の56.3%が、少なくとも2種の抗狭心症薬を服用していた。推定によれば、米国では600,000～180万人の患者が難治性狭心症を患っており、毎年75,000～200,000人の新しい患者が診断され、ヨーロッパでは毎年30,000～50,000例の新しい症例が診断されている。

CADおよび難治性狭心症の治療選択肢には、薬物療法、バルーン血管形成術（ステント留置ありまたはなし）、アテレクトミーおよびバイパス手術が含まれる。薬理学的療法は、CADのほとんどの病型、特に難治性狭心症の疾患管理の中心である。薬理的治療には、β遮断薬、カルシウム拮抗薬、硝酸薬による一次治療、ラノラジンによる二次治療、ならびに、抗血小板療法、脂質低下療法、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害薬を含む、MIおよび/または死亡のリスクを低減する追加療法が含まれる。最善で、薬理的療法は症状を治療し、さらなる疾患の進行を防ぐが、疾患の病状を好転させることはない。薬またはカテーテルベースの血管形成術およびステントで状態を効果的に治療できない場合は、CABGが推奨される場合がある。CABGは、体の他の部分からの動脈および/または静脈を使用して、遮断された冠動脈を心臓表面でバイパスする。費用、および手術に関連する患者の病的状態および死亡率にもかかわらず、これらの手術は症状の長期的な緩和をもたらさず、多くの場合繰り返しの外科的介入が必要になる。現在の血行再建術を妨げる解剖学的理由には、多数の合併症に加えて、重度のびまん性CAD、側副血行依存心筋、複数の冠状動脈再狭窄、慢性冠動脈完全閉塞、伏在静脈グラフトの変性、遠位標的の不良（poor distal targets）、または以前のCABGによる導管の欠如が含まれる。糖尿病の罹患率の増加により、個人がこの解剖学的基盤を有しやすくなる。医薬品の選択肢も尽きた場合、ライフスタイルの変更のみが残り、厳しい制限が生じる可能性がある。治療法の改善に伴い、従来の治療法の選択肢が尽きるまで生き残るCAD患者の数が増えている。薬物および外科的治療は、多くの場合CADを患う個人に適切な短期治療を提供可能であるが、特に、バイパス手術が心筋の限られた領域のみに適用可能である、PCIまたはCABGに不向きな個人であって、薬物療法が失敗に終わった個人にとって、依然として現在のモダリティを改善する必要性が大いにある。心筋虚血、心臓の痛み、および血行再建に対する不適合の間の関係は、新しい治療法の必要性をもたらした。本開示はその必要性に対処するものである。

American Heart Association 2019 Heart Disease and Stroke Statistics Update

一局面において、本発明は、治療を必要とする対象の心血管疾患を治療する方法であって、治療用ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む有効量の薬学的組成物を、経胸壁心外膜手術（TECAP）中に対象の心臓に直接投与する工程を含む方法を提供する。

さまざまな態様において、薬学的組成物は、対象の心臓における別々の送達部位における一連の15回の注射を通して投与され、ウイルスベクターは、実質的に心臓全体に拡散する。

さまざまな態様において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。

さまざまな態様において、ウイルスベクターは、VEGFの1つまたは複数のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む。

さまざまな態様において、手術全体を通して、胸腔鏡を使用して対象の心臓が視覚化される。

さまざまな態様において、約1×10⁹vp、約1×10¹⁰vp、約4×10¹⁰vpまたは約1×10¹¹vpのウイルスベクターの用量が投与される。

さまざまな態様において、各注射の注入量は約0.1mLである。

さまざまな態様において、心血管疾患は冠動脈疾患である。

さまざまな態様において、TECAPは、対象の第5～第7肋間隙に4～5cmの前側方切開を行うことを含む。

さまざまな態様において、注射は左心室で行われる。

本発明の好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでよりよく理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在好ましい態様が図面に示されている。しかしながら、本発明は、図面に示されている態様の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。

本発明の一態様における注射部位間の間隔を示すサンプル注射グリッドを示す図である。 実施例1に記載された研究のための研究デザインの概略図を示す図である。 AdVEGF-All6A+の遺伝的構造を示す図である。

詳細な説明
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の試験の実施において、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい材料および方法は本明細書に記載されている。本発明を記載および請求する際に、以下の用語が使用される。

本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを記載することを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

冠詞「1つ（a）」および「1つ（an）」は、冠詞の、1つまたは複数（つまり、少なくとも1つ）の目的語を指すために本明細書で使用される。例として、「要素（an element）」は、1つの要素または2つ以上の要素を意味する。

量、時間の長さなどの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」は、指定された値から±20%または±10%、より好ましくは±5%、さらに好ましくは±1%、さらに好ましくは±0.1%の変動を包含することを意味する。そのような変動は、開示される方法を実施するのに適切であるためである。

本明細書で使用する場合、「冠動脈疾患」または「CAD」という用語は、通常、アテローム性動脈硬化症または心臓の動脈の内壁にプラークが蓄積することによって引き起こされる冠動脈の狭窄または閉塞を意味し、これにより心臓の領域への血流が制限されることがある。

本明細書で使用する場合、「組成物」または「薬学的組成物」という用語は、本発明において有用な少なくとも1種の化合物と薬学的に許容される担体との混合物を指す。薬学的組成物により、患者または対象への化合物の投与が容易になる。当技術分野において、静脈内、筋肉内、皮下、経口、エアロゾル、非経口、眼、肺および局所投与を含むが、これらに限定されない、化合物を投与する複数の技術が存在する。

化合物の「有効量」または「治療的有効量」は、化合物が投与される対象に有益な効果をもたらすのに十分な化合物の量である。送達ビヒクルの「有効量」は、化合物を効果的に結合または送達するのに十分な量である。

「患者」、「対象」、「個体」などの用語は本明細書において同じ意味で使用され、本明細書に記載される方法に適した任意の動物、またはインビトロかインサイチューかを問わず、その細胞を指す。特定の非限定的な態様において、患者、対象または個人はヒトである。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を無効にせず、かつ比較的毒性がない担体または希釈剤などの材料を指し、すなわち、該材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こしたり、該材料が含有されている組成物の成分のいずれかと有害な方法で相互作用したりすることなく個人に投与することができる。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、本発明において有用な化合物を、患者の体内でまたは体内へ輸送または運搬して、意図された機能を実施できるようにすることに関わる、液体もしくは固体充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物または担体を意味する。通常、そのような構成体は、ある器官または体の一部から別の器官または体の一部に輸送または運搬される。各担体は、本発明において有用な化合物を含む、製剤の他の成分と適合性があり、患者にとって有害でないという意味で「許容される」必要がある。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる:ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖;コーンスターチおよびジャガイモでんぷんなどのでんぷん;セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのセルロース誘導体;粉末状トラガカント;麦芽;ゼラチン;タルク;ココアバターおよび坐薬用ワックスなどの賦形剤;ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、大豆油などの油;プロピレングリコールなどのグリコール;グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール;オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル;寒天;水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤;界面活性剤;アルギン酸;パイロジェンフリー水;等張食塩水;リンゲル液;エチルアルコール;リン酸緩衝液;ならびに医薬製剤に使用される他の非毒性で適合性のある物質。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」はまた、本発明におい有用な化合物の活性と適合性があり、患者に生理学的に許容される、任意の全てのコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに吸収遅延剤などを含む。補助的な活性化合物もまた、組成物に組み込まれ得る。「薬学的に許容される担体」は、本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩をさらに含んでもよい。本発明の実施に使用される薬学的組成物に含まれ得る他の追加の成分は、当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences （Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA）に記載されている。

本明細書で使用する場合、「TECAP」または「経胸壁心外膜手術」という用語は、経胸壁心外膜アクセスのための低侵襲外科的手法を指す。

本明細書で使用する場合、「疾患または障害の治療」は、疾患もしくは障害の症状を患者が経験する頻度を減らすこと、または患者の機能的能力を改善することを意味する。疾患および障害は同じ意味で使用される。

本明細書で使用する場合、「治療（treatment）」または「処置（treating）」という用語は、予防および/または療法を包含する。したがって、本発明の組成物および方法は、治療用途に限定されず、予防用途で使用することができる。したがって、容態、障害、または状態の「処置」または「治療」には、以下が含まれる:（i）容態、障害、もしくは状態にかかっている、またはかかりやすくなっている可能性があるが、容態、障害、もしくは状態の臨床または亜臨床的症状を経験していない、または示していない対象において発症する、容態、障害、または状態の臨床症状の現れを予防または遅延させること、（ii）容態、障害、または状態を阻害すること、すなわち、疾患、または該疾患の臨床もしくは亜臨床的症状のうちで少なくとも1つの発症を停止または軽減すること、あるいは（iii）疾患を緩和すること、すなわち容態、障害、もしくは状態、または該疾患の臨床もしくは亜臨床的症状のうちで少なくとも1つの緩解を引き起こすこと。

本明細書で使用する場合、「VEGF」という用語は、遺伝子またはタンパク質の血管上皮増殖因子を指す。当業者は、VEGFおよびそのアイソフォームに精通している。例えば、Yla-Herttuala et al Vascular Endothelial Growth Factors Biology and Current Status of Clinical Applications in Cardiovascular Medicine. J Am Coll Cardiol 2007;49:1015-26を参照のこと。

本明細書で使用する場合、「vp」または「ウイルス粒子」という用語は、機能性（感染性）および非機能性（非感染性）ウイルス粒子の総数を意味する。

範囲:本開示全体を通して、本発明のさまざまな局面を範囲形式で提示することがある。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する変更できない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、その範囲内で可能な全ての部分的な範囲および個々の数値を詳細に開示していると考えるべきである。例えば、1～6などの範囲の記載は、1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6などの部分的な範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6、を詳細に開示していると考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

説明
一局面において、本発明は、治療を必要とする対象の心血管疾患を治療する方法であって、治療用ポリヌクレオチドを含む有効量のウイルスベクターを含む薬学的組成物を対象の心臓に直接投与する工程を含む方法を提供する。心血管疾患の治療を必要とする患者へのVEGFの効果的な投与は達成困難であることが証明されている。驚くべきことに、治療用ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを対象の心臓に直接注射し、それによって対象の心臓に対応するポリペプチドを発現させることが、心血管疾患を治療する安全かつ効果的な方法であることが今や見出されている。さまざまな態様において、心血管疾患は、対象の心臓に血管新生を誘導することによって治療することができる任意の心血管疾患であり得る。さまざまな態様において、心血管疾患は冠動脈疾患である。理論によって制限されることを意味するものではないが、現在、心臓への直接注射は、さまざまな態様において、低用量のウイルスベクターにより対象の治療においてより大きな利益をもたらし、それによって全身投与によるさまざまな不利益を回避することを可能にすると考えられている。

VEGFの1つまたは複数のアイソフォームを含むウイルスベクター
さまざまな態様において、本明細書で教示される方法によって送達される治療剤は、VEGFの1つまたは複数のアイソフォームをコードし、対象の組織においてVEGFの1つまたは複数のアイソフォームに対応するポリペプチドを発現するように構成されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターである。さまざまな態様において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。当業者は、本発明のさまざまな態様の実施に適したさまざまなウイルスベクターに精通している。さまざまな態様において、ウイルスベクターは、野生型ベクターの複製を可能にするさまざまな遺伝子が欠損しているため、対象への遺伝子導入に適している。さまざまな態様において、治療用ポリヌクレオチドは、VEGFアイソフォーム121、165および189のうちの1つまたは複数をコードする。さまざまな態様において、治療用ポリヌクレオチドは、VEGFアイソフォーム121、165、および189をコードする。さまざまな態様において、ウイルスベクターは、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,518,255号および第7,368,553号に記載される通りである。

さまざまな態様において、治療剤は、バイアル、プレフィルドシリンジまたは他の容器などの適切な容器および施栓系における製剤用バッファー中のアデノウイルスベクターである。医薬品は、凍結乾燥（フリーズドライ）形態または他の物理的状態など、さまざまに提示される可能性がある。医薬品は、ロボティック、セミロボティック、または非ロボティックデバイスを含む、薬物とデバイスとの任意の組み合わせ（組み合わせ薬物製品）で構成することができる。

さまざまな態様において、ウイルスベクターは、複製欠損の組換えヒトアデノウイルス血清型5（Ad5）ウイルスベクターであるAdVEGFXC1であり、これは、イントロンとVEGF121、VEGF165およびVEGF189を含むVEGFの複数の天然型アイソフォームを生成するスプライス部位とを含むヒト血管内皮増殖因子（VEGF）の発現カセットを含む。さまざまな態様において、VEGF発現カセットは、アデノウイルスE1AおよびE3遺伝子を欠失させ、E1Bを部分的に欠失させたアデノウイルスバックボーンのE1領域に挿入される。AdVEGFA116A+の完全なDNA配列解析は、SEQ ID NO:1で提供され、表1に示すウイルスゲノム導入遺伝子領域のアノテーションによって確認されている。

AdVEGF-All6A+の遺伝的構造を図3に示す。ヒトVEGFcDNA/ゲノムハイブリッド発現カセットの位置は灰色の矢印で示されている。Ad初期遺伝子（E2A、E2B、およびE4）、Ad後期遺伝子（L1、L2、L3、L4、およびL5）、逆位末端反復配列（inverted terminal repeats:ITR）、およびカプシド形成シグナル（encapsidation signal:ES）の位置も示されている。

（表１）AdVEGFAll6A+の機能アノテーション

SEQ ID NO:1 AdVEGFAll6A+のDNA配列

投与方法
さまざまな態様において、ウイルスベクターはTECAP中に一連の注射によって投与される。さまざまな態様において、手術は、対象の心臓における左心室への一連の心筋内注射を含む。さまざまな態様において、ウイルスベクターは、対象の心臓における別々の送達部位における一連の15回の注射を通して投与され、ウイルスベクターは、実質的に心臓全体に拡散する。さまざまな態様において各注射の注入量は約0.1mLである。さまざまな態様において、手術全体を通して、胸腔鏡を使用して対象の心臓を視覚化することができる。以下でより詳細に説明するように、胸腔鏡を使用して対象の心臓を視覚化することにより、低侵襲手術によるウイルスベクターの投与が可能になる。さまざまな態様において、約1×10⁹vp～約1×10¹¹vpのウイルスベクターの用量が投与される。さまざまな態様において、約1×10⁹vp、約1×10¹⁰vp、約4×10¹⁰vpまたは約1×10¹¹vpのウイルスベクターの用量が投与される。さまざまな態様において、TECAPは、対象の第5～第7肋間隙に4～5cmの前側方切開を行うことを含む。さまざまな態様において、注射は左心室で行われる。

実験例
本発明は、以下の実験例を参照することによりさらに詳細に記載される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供されており、特に明記されていない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供された教示の結果として明らかになる、任意の全ての変形形態を包含すると解釈されるべきである。

さらなる記載なしに、当業者は、前述の記載および以下の例示的実施例を使用して、本発明の化合物を作製および利用し、特許請求される方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を詳細に示すものであり、いかなる方法でも本開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。

以下の実施例を実施する際に使用される材料および方法を以下に記載する。

実施例1
アテローム性動脈硬化症の影響を防止するための1つのストラテジーは、心臓の既存の血管を、アテローム性動脈硬化症のプロセスによって閉塞された動脈系をバイパスする新しい血管ネットワークを生成するよう誘導して、組織が必要とする十分な酸素を供給する循環を提供することである。「血管新生」と呼ばれるプロセスである血管の新規生成は、内皮細胞の制御された増殖および遊走、発芽する新生血管の部位での基底膜/細胞外マトリックスの局所的な分解、内皮細胞の遊走、および内皮細胞の管様構造への合体、周囲の基底膜の再形成、ならびに、新しい血管による、好適な静脈系への連結を伴うネットワークの形成を含む、複雑で正常な生理学的プロセスである。血管新生の生理学的プロセスは、秩序だった方法で新しい血管を生成するように機能するいくつかのメディエーターと関連する。VEGFは、このプロセスを開始する主要な要素の1つである。

VEGFをコードする遺伝子の心筋投与は、心筋への遺伝子情報の送達を使用して新しい血管ネットワークを生成するストラテジーである。遺伝子を心筋に導入する最も直接的な方法は、直視下での注射によるものである。これは、胸腔鏡検査、左開胸もしくは胸骨切開による心筋の露出、または低侵襲手術によって達成することができる。直接注入ストラテジーの利点は次の通りである。（1）他の送達技術と比較して、最高レベルの局所導入遺伝子発現が達成可能である、（2）ベクターを高精度で送達可能である、（3）複数の的を絞った注射を実施することができる、（4）ベクターの全身拡散の発生が限定的である。

この研究の被験者は、治療的血管新生（血行再建）を誘導するために、ヒトVEGFを発現するXC001の直接投与を受ける。心筋へのアクセスは、経胸壁心外膜アクセスのための低侵襲外科的手法である経胸壁心外膜手術またはTECAPを介して得られる。VEGFは血管新生のプロセスに不可欠であるだけでなく、無傷細胞から分泌され得るため、虚血心筋への灌流を改善することを目的とした遺伝子導入治療に理想的である。臨床的に重要なCADを患う被験者におけるVEGF DNA（プラスミドとして、またはアデノウイルス遺伝子導入ベクターによって発現される）の心筋内注射に基づくいくつかの臨床試験が完了した。これらの試験は、VEGFをコードするプラスミドDNAまたはアデノウイルスベクターを使用した遺伝子導入の忍容性を実証しており、治療対象における心筋灌流の増強および狭心症症状の軽減の可能性を示しているが、証明はされていない。対照的に、本発明者らの提案する研究では、より効果的に局所的に保持され、動物研究では血管新生能の改善につながることが明らかであるヘパリン結合アイソフォームが優勢な、複数の天然に存在するVEGFアイソフォームを生成するヒトVEGF cDNA/ゲノムハイブリッドを使用する。

VEGF遺伝子治療
血管新生因子のベクター送達遺伝情報を介した治療的血管新生は、1990年代後半から動物モデルおよび臨床試験で研究されてきた。研究には、プラスミドおよびウイルスベクター（特にアデノウイルス）、ならびにその他のさまざまな管理経路および送達システムによって送達される多くのタンパク質血管新生因子の遺伝子が含まれている。非悪性組織では、ヒトVEGF遺伝子は、転写後スプライシングに続いて複数のアイソフォームで発現する。VEGFタンパク質は血管新生を誘導することができるが、VEGFの半減期が非常に短く、高用量のVEGF投与が低血圧および浮腫に関連し、VEGFの全身投与は、標的器官以外の組織において血管新生が無差別に誘導される理論上の危険性を伴うため、治療目的でのVEGFタンパク質の送達は大きな課題を提示している。これらの問題を回避するために、VEGF cDNAコード配列を、投与部位での局所VEGFの供給源として使用することができる。心筋内注射後の血管新生能を改善するためのXC001の最適化には、非臨床研究が示すところによればAdVEGF121前駆体ウイルス導入剤で得られたよりもさらに良好な臨床的有効性が得られる可能性がある複数アイソフォーム手法の使用、および、より強く細胞外マトリックスに結合するその能力に起因してより強い局所血管新生効果を有すると予想され得るヘパリン結合アイソフォームの発現比率を増加させるための構成体の使用が含まれた。

非臨床データ
ブタ心臓およびマウス後肢モデルにおけるアデノウイルスを用いたVEGFアイソフォームの送達によって、心筋灌流および機能の両方が改善された側副血管の発達を含む血管新生反応が実証されている。VEGF121、VEGF165、およびVEGF189が約2:2:1の比率で発現するXC001の前駆体であるAdVEGF-Allは、虚血マウス後肢モデルにおいて、個々のVEGFアイソフォームのcDNAを含む比較可能なベクターよりも、血管新生および後肢血流の誘導に効果的であることが示された。AdVEGF-Allの投与は、特定の用量範囲にわたって、個々のアイソフォームをコードするcDNAを輸送するAdベクターの投与よりも優れた血流量の回復をもたらした。筋肉量に基づくAdVEGF-Allの最小有効量（MED）は、約10⁴～10⁵vp（ヒト等価用量[human equivalent dose:HED]約10⁸～10⁹pu）であった。この研究により、それぞれが単一のVEGFアイソフォームを発現する導入遺伝子を含む複数のAdウイルスベクターの混合物、または複数のVEGFアイソフォームをコードする導入遺伝子を含むAdウイルスベクターが、単一アイソフォームのcDNAを含むAdベクターの投与と比較して、後肢血流量比（血管新生反応）において著しい改善をもたらすことが実証された。これにより、これらの個々のアイソフォームが相乗的に機能し、そのような複数アイソフォーム薬物を使用すると、AdVEGF121前駆体よりもさらに良好な臨床的有効性が得られる可能性があるという結論を裏付けられる。

AdVEGF-Allで観察された血管新生能の改善は、臨床開発候補薬の安全性プロファイルのさらなる最適化をもたらす可能性のある変更された比率の主要なVEGFアイソフォームの投与の影響の調査へとつながった。薬剤候補であるXC001は、エクソン6a含有アイソフォームの比率を高めるように構成された。XC001は、VEGF-Allと類似の方法で強力な血管新生反応をもたらすことが見出されたが、IV投与後のマウスの死亡率で測定すると、より良好な安全性プロファイルを示し（ヒトへの予定最高用量よりも約10倍多いXC001用量において、死亡は認められなかった）、製品のIV注射後にマウス皮下組織に注射されたルイス肺がん細胞の塊における腫瘍増殖がより遅く、AdVEGFベクターの気管内投与後の肺重量で認められる肺浮腫が少ないことが見出された。

後者の人工動物実験2件の、人間への変換可能性は不明である。マウス死亡率研究では、XC001およびAdVEGF-Allを5×10⁹および5×10¹⁰puの用量で静脈内投与した。体表面積に基づくHEDは、それぞれ約2×10¹²および2×10¹³puであった。HED2×10¹³では、両方の群で全ての動物が死亡したが、HED2×10¹²ではXC001において死亡は観察されず、AdVEGF-All群において66%が死亡した。これにより、XC001の無影響量（no-observed-effect-level:NOEL）は、ヒトへの予定最高用量の約20倍となる。死亡の原因は不明であるが、肝臓のVEGFレベルは両群間で同等であったため、VEGFレベルでは十分に説明できないようである。特に最高用量での死亡率は、マウスへの静脈内投与後に脾臓や肝臓などの組織に蓄積する大量のアデノウイルスに一部起因している可能性がある。これらの2つの臓器には、肝臓のクッパー細胞、脾臓の樹状細胞およびマクロファージなどを含む、多くの免疫細胞が含有されている。これらの細胞は、死に至る可能性のある自然免疫応答の活性化を引き起こす炎症性サイトカイン/ケモカインの産生に関与していると考えられている。心筋内XC001送達は、静脈内投与よりも製品への全身性曝露が少ないと予想されることに留意されたい。

XC001の最初のINDに向けた毒性試験
INDをサポートするために、成体Fisher344ラット心臓にXC001を投与することにより毒性試験を実施した。試験は、動物10匹/群（雄5匹および雌5匹）を含む21群で構成された。15群（ラット150匹）に急性冠動脈結紮を受けさせた直後に、5本の均一に分散した20μLの心筋内注射に分割したPBS（pH7.4）、AdNullベクター（10⁷pu）、またはXC001（10⁵vp（ヒト等価用量（HED）4×10⁷）、10⁶vp（HED4×10⁸）もしくは10⁷vp（HED4×109））を左心室壁に注射し、手術および投薬後5、14、および30日を予定屠殺時点とした。6群（ラット60匹）は結紮を受けなかったが、10⁵、10⁶または10⁷vpのXC001ベクターもしくはPBS（pH7.4）のいずれかを投与し、手術および投薬後30日および1年を予定屠殺時点とした。

試験の過程にわたって、XC001治療に関連する死亡（死亡6件のうち、4件は冠動脈結紮を受けた動物に起こり、2件は非結紮動物で起こったが、XC001に関連するものはなかった）、臨床所見、または体重、血液学、もしくは血清化学への影響はなかった。XC001の注射は、試験されたいずれの用量レベルでも、心臓または任意の他の臓器系に、ベクターに起因する病理学的変化を全くもたらさなかった。心臓への注射プロセスにより、左肺と心膜との間の接着斑、左胸壁と左肺との間の接着斑、および心膜肥厚、のさまざまな変化が生じた。これらは全て、外科的処置の状況で予想されるものである。

脳、眼、皮膚、脂肪、胸腺、肺、心膜、心臓、肝臓、骨格筋-大腿四頭筋、骨大腿骨、坐骨神経、男性器および女性器、膀胱、脾臓、膵臓、腎臓、胃および腸管、ならびにリンパ節の検査では、治療に関連した変化が示されなかった。トロポニン陽性の結果が全くなかったことで、ベクターにより心筋に深刻な持続的損傷が誘発されなかったことが示された。全体として、心筋梗塞を誘導した、またはしていない成体Fisher344ラットへの、最大10⁷vpの用量におけるXC001の心筋内投与は、手術および投薬後5、14、または30日において治療の悪影響がなく良好な耐容性を示した。

さらに、XC001の心筋内投与（冠動脈結紮なし）およびそれに続く1年間の観察期間では、肉眼的病理学、組織病理学、血液学、および血液生化学検査の治療に変化はもたらされなかった。観察された他の病変は、ラットで一般的に観察される、自然に発生する病理学的プロセスと一致しており、治療または他の実験的操作に関連するとは見なされなかった。

追加毒性試験
XC001の毒性を評価するために、Fischerラットの心筋への、91日間の単回投与に続き、正常ラットでのブリッジング毒性試験が実施された。動物の左室自由壁に合計5回の心筋注射を行い、次の用量を与えた:群1はビヒクルのみ（製剤用バッファー）、群2は1×10⁷vp（HED4×10⁹）、群3は2.5×10⁸vp（HED1×10¹¹）（これは臨床試験での高用量に相当する）、群4は2.5×10⁹vp（HED1×10¹²）であった。

試験期間を通して評価された生存中パラメータ（毎日の一般的な健康観察、臨床所見、および体重）は、臨床的観点から試験の目的を支持するために使用された。これらのパラメータの結果は、群間に有意差がないことを明らかにし、臨床的に懸念される所見はなかった。凝固、臨床化学、および血液学の結果は、群間および性別間に有意差をもたらさなかった。8日目、30日目、または90日目のコホートのラット血漿において、ヒトVEGFは検出されなかった。肉眼的剖検所見では、特定の試験群に起因する異常は見られなかった。臓器重量、および臓器重量と最終体重との比率も、群間および性別間に有意差がないことが明らかになった。

8日目の動物の組織病理学的分析では、関連する唯一の明らかな顕微鏡観察は、一部の動物における、主に注射が行われた左室自由壁に関係する混合単核細胞（リンパ球およびマクロファージ）の浸潤および不定量の線維増殖/線維症として定義される心筋の慢性炎症の所見からなっていた。炎症は、群2および群1と比較して炎症の罹患率および重症度が上昇した群3および群4の動物で用量反応的に生じた。臨床試験における計画最高用量のHEDに相当する群3では、最小限から軽度の炎症のみが観察されたが、計画最高臨床用量の10倍のHEDに相当する群4では、炎症は軽度から著しい重度まで変化した。しかし、罹患率および重症度は30日目までに減少し、群1～3の動物では最小限/軽度の炎症のみ見られ、群4の動物10匹のうち1匹のみでより強い程度の炎症（中等度）が見られた。炎症プロセスは、左室自由壁、すなわち実験的注射の部位に関係しており、心室中隔の心筋、右心自由壁、または右心房または左心房には影響しなかった。中等度から著しい例（群4でのみ見られた）では、慢性炎症は左室自由壁（注射部位）の多くに影響を及ぼし、経壁的に存在した。29/30日目における追加の観察では、慢性炎症性病変の影響を受けた心筋領域内の線維組織の量が増加する傾向にあった。90日目のコホートでは、XC001に関連する変化は、群3および4の、雄および雌のラットにおける心筋の線維症からなっていた。心筋の単核細胞も、90日目のラットの心臓でよく見られ、全ての治療群（対照;群1を含む）で発生した。これは、ラットでよく認識されている加齢に伴う自発的な所見であり、XC001による治療によって引き起こされたものではなかった。30日目および90日目のコホートの動物における観察は、8日目の心筋で見られたXC001誘発性炎症性病変の分析と一致していた。8日目、30日目、または90日目のコホートの動物で分析された他の組織は、試験群に特有の異常を示さなかった。

血清心筋トロポニンI（Cardiac Troponin I:cTnI）の結果は、8日目、30日目、および90日目のコホートにおける用量漸増とcTnI値の上昇との相関関係を示さなかった。cTnIは心筋損傷を示すバイオマーカーであるため、心筋の慢性炎症の重症度が高い動物では、血清cTnI値の上昇が予想される。しかし、これは事実ではなく、場合によっては、cTnIのレベルが最も高い動物でも、心筋の炎症が全くないまたは最小限であった。

結論として、XC001の心筋内投与は、8日目において、左室自由壁（すなわち、実験的注射の部位）を含む心筋の慢性炎症と関連しており、該慢性炎症はXC001用量の増加に伴い罹患率および重症度が上昇した。30日目および90日目における観察は、8日目の心筋で見られたXC001誘発性炎症性病変の分析と一致していた。さらに、全ての生存中パラメータ、臨床病理学、血清cTnI、血漿VEGF、および剖検観察は、どの試験群とも相関する臨床的懸念の兆候を示さなかった。

臨床データ
アデノウイルスおよびVEGFアイソフォームについては、幅広い臨床使用経験が得られている。アデノウイルスベクターは、治療的血管新生のためのVEGF遺伝子の送達に理想的な特性、すなわち、心血管組織の効果的な形質導入、ヒトゲノムへの非組み込み、および短期間での形質導入、を有する。最も重要なことは、これらのベクターは、ヒトの遺伝子治療に関する幅広い実績、および評価されている用量で実証された安全性プロファイルを有することである。さらに、アデノウイルスを用いて心臓に送達されたVEGFアイソフォームの長期的な安全性（遺伝子治療後の中央値11.8年まで）が実証されている。しかし、臨床でVEGFをコードする遺伝子を使用するいくつかの試みは、非効果的送達経路、非効果的遺伝子ベクター、および有効性評価項目基準の不十分な選択を含む、以下のさまざまな潜在的な理由のために、限られた成功しか収めていない:
・心臓への治療剤送達を受けている動物において、心筋内送達と比較して効果が数log低い、冠動脈内注入による送達。
・NOGAガイダンスカテーテルシステムを使用した間接的な心内膜注射による送達は、研究者によると、標的領域の50～60%にしか送達されないと予測されており、非常に不正確であると考えられている。重要なことに、心室内経路では、ベクターが血管内に注入されるリスクがあり、それに伴い、抗ベクターの自然免疫および重篤な有害事象のリスクがある。
・ウイルスベクターではなくプラスミドDNAを使用すると、ウイルスよりも効率が大幅に低下し、発現期間に違いが生じる可能性がある。
・一部の試験において、単一光子放射型コンピューター断層撮影（SPECT）の主要評価項目としての選択が制限となる可能性がある。SPECT心筋灌流イメージングには、比較的長い撮影プロトコル、および他の利用可能なモダリティよりも空間分解能がかなり低く、心内膜下血流欠損の検出が限られることを含む、複数の制限がある。さらに、より多い心筋血流量でのトレーサー取り込みの不一致（トレーサー取り込みは心筋血流量と相関しない）により、軽度から中等度の狭窄を検出する際の感度が制限される。

しかしながら、前臨床検討での概念実証と臨床での肯定的な効果確認の両方が、単一のアイソフォームVEGF121をコードするAd5ベクターが小開胸により直接心筋へと送達される、プロトタイプ遺伝子治療候補AdVEGF121を使用したVEGF遺伝子送達ストラテジーで実証されている。小開胸/心外膜投与経路は、心筋注射部位の確実な制御をもたらし、不注意による血管内投与を制限し、少用量の漸増第1相試験および第2相REVASC試験において安全であることが示されている。

有効性に関しては、ST部分が1mm低下するまでの時間および総運動時間、狭心症が緩和されるまでの時間、ならびに狭心症CCS分類およびSAQによって評価された狭心症症状は、全てVEGF遺伝子導入によって改善された。

これらの2つの試験では、ベクターに関連する全身性または心臓関連の有害事象の証拠はなかった。第1相試験では、AdVEGF121を投与された患者群の中で、胸骨正中切開でCABGを受けている間に3人の死亡が報告されたが、現在の研究で計画される手術と同様に、開胸で心筋内AdVEGF121のみを投与された患者では死亡は報告されなかった。著者らは、ベクター投与に関連する全身性または心臓関連の有害事象の証拠はなかったと報告した。死亡のうち2件は、CABG手術および患者らの進行したCADに関連している可能性が最も高く、3番目の患者は原因不明の突然死を迎えた。REVASC試験の12か月のフォローアップ中に、プラセボ群の35人の被験者中1人と比較して、AdVEGF121で治療された32人の被験者中2人が死亡した。公表文献に因果関係は記載されていないが、筆頭著者は、AdVEGF121で治療された両被験者は重度の虚血性疾患を患っており、術後合併症と相まって、AdVEGF121自体に起因するものではない悪い結果に寄与した可能性が高いと述べた。また、公表文献において、手術に関連すると考えられる4件の深刻な心イベントが報告された。しかし、対照群における9人の患者と比較して、AdVEGF121群では3人の患者のみが、最初の3週間以降に主要心イベントを経験しており、治療的血管新生による遅れた有用性（late benefit）と一致する可能性が見られた。VEGF遺伝子療法（REVASCを含む）とCADの標準治療（平均6か月のフォローアップ）とを比較したランダム化対照試験（randomized controlled trials:RCT）のメタ分析では、深刻な心イベント（MI、急性冠症候群、心停止、心原性ショック、心不全、および外科的心臓介入）のリスク低減が実証され、VEGFを送達するためのアデノウイルスベクターの使用は、死亡率に差は認められなかったものの、深刻な心イベントのリスクに関してより大きな潜在的有用性を示した。さらに、冠動脈内Ad-VEGF-A165の8年間のフォローアップにより、プラセボ対照群と変わらない主要な心血管有害事象の罹患率が明らかになった。

Adベクターは免疫原性があると考えられているが、用量および投与経路は免疫応答の重要な要素である。筋肉内注射とは対照的に、静脈内投与は、より全身性の曝露をもたらし、潜在的に免疫反応の可能性を高めると予想される。VEGF121およびVEGF165導入遺伝子産物を産生するAdベクターの、最大4×10¹⁰vpの用量における多くの非臨床および臨床データは、中央値11.8年までのフォローアップで、臨床的に意味のある、免疫に関連する安全性の傾向または問題を顕在化させていない。マウスでは、全身投与されたAdベクターが、半減期2分未満でマウスの血液から急速に除去され、肝臓および脾臓に大量に蓄積することが示されている。これらの2つの器官には、肝臓クッパー細胞、脾臓樹状細胞、マクロファージなどの多くの免疫細胞が含有されており、これらの細胞は、自然免疫応答の活性化に関与する炎症性サイトカイン/ケモカインの産生に関与すると考えられている。上記の心筋内AdVEGF121注射の用量漸増第1相試験（最大用量4×10¹⁰pu）では、ベクターまたは野生型Adの排出は、いずれのサンプル（2、4、および7日目）でも、いずれの被験者のいずれの部位（鼻、喉、尿、および血液）においても検出されなかった。さらに、血漿VEGFレベルは、投与後3日目以降はベースライン値を上回っていなかった。ただし、血清抗Ad5中和抗体レベルは全ての個人で増加したが、治療前の抗Ad5中和抗体が高い患者ではさらに増加した。心筋内AdVEGF121注射（4×10¹⁰pu）のREVASC試験では、VEGF治療を受けた患者23人について約7日目に評価されたアデノウイルス培養用の尿および咽頭スワブは全て陰性であった。したがって、多くの臨床的および非臨床的データに基づくと、現在の試験で研究されている用量では、臨床的に関連する免疫反応のリスクは低いようである。

試験の理論的根拠
CADは、心臓に酸素が豊富な血液を供給する冠動脈の血流が妨げられ、虚血を引き起こす慢性疾患である。未治療の場合、CADは通常悪化し続ける。多くのCAD患者は、心臓が十分な酸素を受け取っていない場合に発生する胸痛（狭心症）や倦怠感などの症状を有する。しかし、50%もの患者が、心臓発作が起こるまで症状を経験しない。CADは依然として世界の男性および女性の主な死因である。心臓の虚血状態には、薬理学的、冠動脈ステント、および心臓外科的バイパスを含む治療的介入が必要である。ただし、これらの介入がもはや効果的ではないか、使用できない、閉塞性CADに続発する難治性狭心症のCAD人口はかなり多い。アデノウイルスベクターを使用したVEGF121および165アイソフォームの外因性送達の前臨床研究により、心臓および骨格筋において血管再生させ、虚血を軽減する該治療法の能力が実証された。アイソフォームVEGF121を発現する導入遺伝子を含むアデノウイルスの心筋内送達の安全性は、いくつかのヒトでの試験で確立されており、AdVEGF121の予備的な有効性は有望に見える。VEGFの個々のアイソフォームを発現するAdベクターとは著しく対照的に、虚血性後肢モデルXC001を用いた前臨床研究において、VEGF遺伝子のcDNA/ゲノムハイブリッドを発現するAd5ベクターは、以前の臨床ベクターAdVEGF121で必要とされた用量よりも2log少ない用量で、血流量のほぼ完全な回復を媒介した。したがって、XC001は心臓でのVEGFの自然な発現により近いだけでなく、以前の臨床研究で使用されたものよりも（ベクターあたり）強力であり、したがって安全性プロファイルが改善されている可能性がある。提案される第1/2相臨床試験は、虚血性心筋へのベクターXC001の直接投与の安全性および忍容性を決定し、虚血性心筋へのXC001の直接投与が側副血管の成長を誘導し、心機能およびQOLを改善するかどうかに関する証拠を生み出すために使用される。

提案される用量の理論的根拠
XC001は、TECAPによる1回限りの治療として投与され、標的組織コンパートメントへのベクターの直接送達を可能にする。これは、非臨床および臨床研究で使用された投与経路を再現するものであり、データは、この手術が冠動脈内または心内膜カテーテル投与よりもベクター送達においてはるかに効果的であることを示唆している。手術前に、各被験者は、試験候補者の適合性についてのコンセンサスを得るために、心臓専門医および心臓血管外科医のチームによって、病歴、身体検査、およびその他の評価を審査される。

AdベクターならびにVEGFアイソフォーム121および165については、幅広い臨床使用経験が得られており、これらのベクターは、心筋内投与によるヒト遺伝子治療の幅広い実績があり、安全性プロファイルが実証されている。さらに、アデノウイルスを用いて心臓に送達されたVEGFアイソフォームの長期的な安全性（遺伝子治療後の中央値11.8年まで）が実証されている（表5）。エクソン6aを含有する他のアイソフォームは、ヒトで研究されていないようであるが、上述のように、エクソン6を除く全てのエクソンはVEGF165で表される。VEGF121およびVEGF165のヒト使用経験に照らして、また、エクソン6a含有アイソフォームは天然に存在し、細胞外マトリックスへの結合によりVEGF121よりも全身への影響が少ないと予想されるため、XC001における安全上のリスクが、VEGF121またはVEGF165を発現するAdベクターにおける安全上のリスクを超える可能性は低いと考えられる。

XC001を使用した非臨床安全性薬理学および毒性データの全体を考慮すると、提案されているヒトへの初回用量1×10⁹vpは安全であると考えられる。2回目～4回目のXC001用量（1×10¹⁰、4×10¹⁰、および1×10¹¹vp）の安全性は、VEGFアイソフォーム含有Adベクターの非臨床および臨床使用経験、ならびにXC001毒性試験の全体によって裏付けられている。被験者は、XC001投与後の最初の1～2日間（または必要と思われる場合はそれ以上）、病院で監視される。XyloCor医療モニターは、全てのAE/SAEが発生した場合にAE/SAEを綿密に監視する。コホート内では、内部安全グループが、別の被験者に投与する任意の決定を下す前に、コホート内で最後に投与された被験者の7日目の来院を含む全ての利用可能な安全データを審査する。悪い傾向が観察されない場合、次の被験者への投薬が開始される。AE/SAEプロファイルでは、外部の独立データモニタリング委員会（IDMC）が、後続の被験者に投与する決定の一部に携わる必要がある場合もある。さらに、コホート間で、IDMCは、次の任意の被験者が投与される前に、最後のコホートにおける3番目の被験者のデータを含み、被験者らの7日目の来院までを含む全ての利用可能な安全性データを審査する。手術による潜在的な安全性の所見は手術中に生じると予想され、発現の動態により、全身において導入遺伝子産物がピークレベルとなっているであろうことを考慮すると、1週間の投薬間隔は適切であると考えられる。後者について、臨床データにより、心筋内投与後48～72時間に最大のVEGF発現が示され、投与2日後にAdベクター排出がないことが観察されることが示される。XC001は、1×10⁹vpで有効であると予想される。これは、マウス後肢モデルから推定されるMEDによると、HEDが約10⁸～10⁹vpであるためである（表3）。この用量での有効性は、REVASC試験（4×10¹⁰puでのAdGVVEGF121.10）で観察された明らかな有効性によって、およびXC001がAdVEGF121よりも数log強い効力がある可能性を示唆する非臨床研究の所見によっても裏付けられている。

4番目のコホートにおける3番目の被験者が投薬され、7日目の来院に参加した後、約17～21人の追加被験者へ最大耐用量での投薬を進めるかどうか、およびいつ進めるかをXyloCorに推奨するため、全ての累積安全性データがIDMCによって審査される。用量漸増後に最大耐用量でさらなる被験者を追加することの背後にある理論的根拠は、リスク便益分析の信頼性を高めてさらなる研究における用量を選択する助けとなる、ある程度の有効性およびさらなる安全性を検出する能力の向上に関連している。コホートごとに3人の被験者がいるため、重要な安全性および忍容性の情報が期待されるが、一部の有効性パラメータの傾向のみが予想される。約17～21人の被験者を最大耐用量（この用量でN=20～24）に追加すると、有効性の予備的証拠を評価するための、緩く相関する一連の虚血の評価基準（すなわち、運動負荷試験におけるST部分低下の時間、総灌流欠損（total perfusion deficit）、PETによる心筋血流および冠血流予備能;狭心症発症;携帯型ECGによる虚血負荷）の検査が可能となる。これらのデータは、治療効果に関する特定の仮定をチェックするためのより豊富なデータセットを提供し、さらなる開発のために進められる用量の信頼性を高めるはずである。

全体的な研究デザイン
これは、XC001の6か月（6か月延長）第1/2相、ファースト・イン・ヒューマン、多施設、非盲検、単群用量漸増試験である。対照群は含まれない。難治性狭心症を患う約12人の被験者（コホートあたりN=3）は、4つの漸増用量群（1×10⁹、1×10¹⁰、4×10¹⁰、および1×10¹¹vpのXC001）に入り、その後、約17～21人の追加被験者において最大耐用量が拡大される。XC001は、TECAPを介して被験者の左室自由壁に直接投与される。

参加基準に基づいて研究の資格を得て、研究心臓専門医および外科医の両方によって評価された後、適格性評価委員会（Eligibility Review Committee：ERC）が各候補者の過去の病歴およびスクリーニング評価を審査し、試験へ加入する各候補者を正式に明確する。被験者は、XC001投与後の最初の1～2日間（または必要と思われる場合はそれ以上）、病院で監視される。医療モニターは、全てのAE/SAEが発生した場合にAE/SAEを綿密に監視する。コホート内では、内部安全グループが、別の被験者に投与する任意の決定を下す前に、コホート内で最後に投与された被験者の7日目の来院を含む全ての利用可能な安全データを審査する。悪い傾向が観察されない場合、次の被験者の投薬が開始される。AE/SAEプロファイルでは、外部の独立データモニタリング委員会（IDMC）が、後続の被験者に投与する決定の一部に携わる必要がある場合もある。さらに、コホート間で、IDMCは、次の任意の被験者が投与される前に、最後のコホートにおける3番目の被験者のデータを含み、被験者らの7日目の来院までを含む全ての利用可能な安全性データを審査する。IDMCの会議がある場合、IDMCは試験を中止すること、現在の用量を追加の被験者へ投薬すること、次の用量コホートへ進むこと、または追加の被験者へのより低用量の投与を進めることを推奨する場合がある（さらなる詳細はIDMC手順書に記載されている）。4番目のコホートにおける3番目の被験者が投薬され、7日目の来院に参加した後、追加被験者へ最大耐用量での投薬を進めるかどうか、およびいつ進めるかをXyloCorに推奨するため、全ての累積安全性データがIDMCによって審査される。

臨床試験用医薬品（IP）の説明
臨床試験用医薬品XC001は、血管内皮増殖因子タンパク質の複数のアイソフォームをコードするcDNA/ゲノムハイブリッドカセット含有複製欠損アデノウイルス血清型5ベクターである有効成分AdVEGFXC1で構成される。最大4つの用量が研究される:1×10⁹、1×10¹⁰、4×10¹⁰、および1×10¹¹vpのXC001。投与経路は、TECAPによる左室自由壁への1回限りの直接心筋内注射である。投与される臨床試験用医薬品の総量は1.5mLになる。

IPは、非滅菌アウターバッグにパッケージされ、次いで被験薬サービス（Investigational Drug Service:IDS）から手術室（OR）に輸送するための容器に入れられた2つの滅菌バッグとして手術室に配送される。1つの滅菌バッグには0.1mLの調製済みXC001が事前に充填された14本のシリンジが含まれ、もう1つの滅菌バッグには0.2mLの調製済みXC001が事前に充填された3本のシリンジが入っている。各滅菌バッグには、施設の慣例に従ってラベルが付けられる。3本のプレフィルドシリンジは、注入直前に任意の気泡を除去し、針を適切にプライミングできるように、0.2mLのIPでわずかに過充填されている。27ゲージのスパイナル針3本も提供される。注入量は、以下でさらに詳細に説明するように、左室自由壁全体に分布された15回の心筋内注射のそれぞれにつき0.1mLである。

このプロトコルは、AdVEGFXC1のウイルス粒子（vp）で表される4つの可能な用量コホート:1×10⁹vp、1×10¹⁰vp、4×10¹⁰vp、および1×10¹¹vpのうちの1つに被験者が割り当てられる、用量漸増試験デザインを有する。試験の拡大段階では、全ての被験者は、漸増相から決定された最大耐用量を投与される。用量の割り当ておよび希釈のワークシートは、各シリンジおよび針またはシリンジキャップの外部滅菌を維持して、手術室の滅菌フィールドに入ることができるようにすることを含む、注射剤滅菌配合についてのバイオセーフティーレベル2（Biosafety Level 2:BSL-2）手順および通常の施設の慣例に従う、シリンジの受け取り、短期保管、解凍、希釈、および事前充填の主な責任を有する被験薬薬剤師に提供される。

被験薬サービスの準備は、臨床試験用医薬品にラベル付けされた安定性パラメータ内で、手術室での活動と積極的に連係することが重要である。詳細には、投薬は、冷凍庫から医薬品を取り出してから7時間以内に行うべきである。現場コーディネーターは、IPの準備をいつ開始するかについて現場薬剤師に通知する（IPの準備には最大1.5時間かかる場合があることに留意されたい）。

最終臨床試験用医薬品は、充填量が約1.2mL（抽出可能量1.0mL以上）であり、ラテックスフリーの栓およびアルミニウムキャップで密封された、3mLのホウケイ酸ガラスバイアルで提供される。各クライオバイアルには、製品名、濃度、充填量およびバイアル番号;投与経路;「警告:新薬-連邦法により研究目的での使用に限定されている。」の記載;保管条件;ロット番号;ならびに製造者のラベルが付けられる。

投与
被験者は背中の下にロールを置いて30°仰臥位になり、アームレスト上に腕を90°外に出して、より前方からの手法で胸膜腔にアクセスできるようにし、除細動パッチを胸に配置する。外科医は、撮影を利用するとき、同じ側にカメラを保持する助手を置いて、被験者の心臓に向かって立つ。テレビモニターは、外科医、被験者の左心室、およびモニターが、外科医が手術中に真っ直ぐ前を向くことができるように位置合わせされるよう配置するべきである。

経胸壁心外膜へのアクセスは、低侵襲外科的手法に従う。第5～第7肋間隙に4～5cmの前側方切開を行う（心臓における心尖のすぐ横における基部への最良のアクセスを提供するための関連する画像解析に基づく）。この切開は、通常、女性の乳房下のしわになる。Tuffier Retractor（または任意の自己保持型リトラクター）が挿入される。肺から胸壁の癒着は、電気焼灼により取り除く。胸腔鏡を使用する場合、前腋窩線の第7または第8肋間隙に胸腔鏡用ポートを挿入するか、胸腔鏡を一次切開部から直接挿入することができる。次いで、心膜を横隔神経の1cm前方で縦方向に開く。以前胸骨切開を行ったことがある場合は、心膜面を生成するために心膜を心外膜表面から切除する必要がある場合がある。これは通常簡単に実施できるが、切開が非常に大きなリスクと見なされる場合は、心膜を通して注射を実施できる（それに応じて針の深さおよび適切な角度の配置を調整するべきである）。心膜を開いたり下ろしたりすることが過度のリスクをもたらすと判断されない限り、心膜を通した注射を試みない。この場合、心膜を通した注射は細心の注意を払い、心膜の厚さを考慮して直角クランプの遠位にある針の深さを調整して実施することができる。注射中は冠動脈および冠静脈を避けるべきである。これは、注射前にシリンジを吸引することで容易になる。これにより、心室に注射が行われていないことも確認される。次いで、以下の手順に従って注入が実施される。手術が完了したら、ExparelまたはMarcaineを使用して直接肋間神経ブロックを検討することができる。胸腔鏡ポートを配置している場合は、疼痛管理のために肋間神経を完全にクライオアブレーションすることを検討できる。

マイクロインジェクションを開始する直前に、ビデオレコーダーを起動する（該当する場合）。注射グリッドは、手術前に計画される。

第1の原則として、左心室は、互いに約1.5～2cm離れた臨床試験用医薬品各0.1mLによる合計15回のマイクロインジェクションで覆われるべきである（図1）。外科医は、全ての臨床情報に基づいて虚血性であることが知られている領域への注射を強調するべきである。この領域では、側副血管の形成が最大の利益をもたらす可能性がある。傷の明確な切り口および薄くすることは避けるべきである。

長い直角止血鉗子をスパイナル針の先端から約4～7mmに配置して、注射の深さを制御し、5拍超にわたって針を安定させて、臨床試験用医薬品が最大限に吸収されるようにする。斜めに向けた注射は、針を取り外したときの流出を防ぐのに役立つ場合がある。最初の注射では、27ゲージのスパイナル針を取り付け、プライミングして任意の気泡を除去し、任意のデッドスペースを排除できるように、0.2mLでわずかに過充填されたプレフィルドシリンジの1つを使用する（注入するのは0.1mLのみ）。残りの14回の注射では、プレフィルドシリンジ（0.1ml）は、同じ27ゲージのスパイナル針（直角鉗子が取り付けられている）を使用する。手術前の注射計画を支援し、手術室での注射に関する問題を記録するために、空白の注射マップが提供される。

全ての注射が実施された後、針穴で出血している部位がないか心臓を検査するべきである。出血が持続する注射部位には、指圧をかけるべきである。止血が達成されたら、胸腔鏡を取り外す。次いで、胸腔チューブをポート部位または別の切開部から挿入し、Pleurovacに接続する。開胸切開は、切開の上に配置される吸収性縫合糸および滅菌創被覆で層状に閉じられる。麻酔を止め、被験者は麻酔後のケアに関する制度的ガイドラインに従うように看護される。

有効性の評価
修正Bruceプロトコル運動負荷試験
主要な有効性評価基準である、ST部分の1mm低下が起こるまでの時間に関して、標準試験よりも低いワークロードで開始するように標準Bruce法から修正したトレッドミル運動プロトコルは、心機能を監視しながら、トレッドミルの傾斜%および速度を上げることにより徐々にワークロードが上がる複数の段階からなる。ベースライン測定の一部として、試験はスクリーニング期間中に2回実施され、各試験は少なくとも72時間以上の時間間隔で行われる。試験の対象となるためには、被験者は、少なくとも1つの試験で1mm以上の水平方向または下り傾斜のST部分低下を示し、他の試験で0.5mm超のST部分低下を示しながら、90秒～約9分間運動できる必要がある。ST部分の要件は、コホート4の被験者、および拡大相の被験者に適用される。ST部分の要件は、コホート1、2、および3の被験者には適用されない。被験者は、通常抗狭心症薬を朝に服用している場合、評価の朝は抗狭心症薬の服用を控えるように指示される。任意の短時間作用型NTGは、評価から4時間以内は控えるべきである。この期間中に短時間作用型NTGを服用した場合、または患者が通常の健康状態にない場合、被験者は現場スタッフに通知し、ETTのスケジュールを変更するように指示される。

一般的な要件、人員配置、メンテナンスおよびキャリブレーションを含む設備、ならびに試験の終了に関する全ての仕様を備えた、詳細なETTプロトコルおよび独立審査手順書は、第三者の盲検化されたETTコアラボラトリーにより提供される。ETTコアラボラトリーは、被験者の試験を実施する看護師または技術者の研修および認定の責任を有する。理想的には、試験期間中の主任看護師または技術者、および代替人1人が明確化される。ETTコアラボラトリーの解釈（盲検化された評価者）および各試験の分析は、試験の全ての有効性分析に使用される。さらに、ETTコアラボラトリーは、ベースラインと対にしたETTを審査および承認し、適格性を審査する必要がある。

陽電子放出断層撮影による心筋灌流イメージング
局所的および全体的な心筋灌流は、研究固有の撮影プロトコルに従って、PETイメージングを使用して評価される。PETスキャンは全身PETスキャナーを使用して実施される。スキャンの朝は、降圧薬およびβ遮断薬、およびカルシウム拮抗薬を控える。被験者は、必要に応じて舌下ニトログリセリンの使用を継続することができる。研究は、4時間絶食し、カフェイン含有製品を24時間断った後に実施される。PETスキャンは被験者の準備を含めて約2.5時間かかる。

心筋灌流は、安静時および標準的なアデノシンまたはリガデノソン注入を使用した最大充血時に、血流トレーサーとして13N-アンモニアまたは82ルビジウムを使用して評価される。透過イメージング後、13N-アンモニア[（約10～20ミリキュリー（mCi）または82-ルビジウム（約10～60mCi）]の静脈内（IV）ボーラス投与を開始すると、リストモード画像が約19分間（13N-アンモニア）または7分間（82ルビジウム）取得される。15分または30分後、被験者はアデノシンの標準的な注入（0.14mg/kg/minで4分間）またはリガデノソン（0.4mgボーラス注射）を受ける。最大充血時に、2回目の13N-アンモニア（約10～20mCi）または82ルビジウム（約10～60mCi）用量が静脈内注射され、同じ方法で画像が記録される。心拍数、血圧、および12誘導ECGは、ベースライン、アデノシンまたはリガデノソンの注入中、および回復時に記録される。

全てのPETスキャンは、研究（非臨床）目的でのみ行われる。安全上の理由から、全てのPETスキャンは、臨床的に重要な所見について、施設試験責任者またはその被指名人によって現場で審査される。スクリーニングPETは、ERCパケットの一部として現場で読み取られる。PETコアラボラトリーからの報告または分析は現場へ提供されず、研究はリアルタイムで評価されない。PETコアラボラトリーは、次のサービスを提供する:現場設備および研究技術者の適格性評価;研究担当者向けの画像取得プロトコルおよびクイックリファレンスガイドの作成;プロセス、サービス、画像の解釈を記載する独立審査手順書の作成;試験実施中の現場技術研修、認定、および継続的なサポート;画像解析の追跡および品質審査;以下に説明する、全ての画像解析の定量分析および独立通読、ならびに最終データのデータ管理およびデータ転送サービス。

安静時およびストレス時の心筋灌流PET画像の完全定量分析には、以下が含まれる。

心筋灌流半定量分析
総灌流欠損（TPD）は、安静時（心筋挫傷（scarred myocardium）を反映）およびストレス時（心筋挫傷+虚血性心筋の両方を反映）左心室灌流欠損の合計、ならびにストレス時と安静時（虚血性心筋を反映）の差を測定する。TPDスコアは、標準のソフトウェアを使用して処理される。

各被験者について、ベースラインおよびフォローアップスキャン中に次の変数が取得される:（a）安静時TPD - 冠血管領域（左前下行枝（LAD）；左回旋枝（LCx）；および右冠動脈（RCA））の各々について、および左心室（LV）全体 （全体的安静TPD（global rest TPD））について個別の値が取得される;（b）最大充血ストレスTPD - 冠血管領域（LAD、LCx、およびRCA）の各々について、およびLV全体（全体的ストレスTPD（global stress TPD））について個別の値が取得される;（c）差TPD - 冠血管領域（LAD、LCx、およびRCA）の各々について、およびLV全体（全体的差TPD（global difference TPD））について個々の値が取得される。

左心室機能の定量化
安静時およびストレス後の左室駆出率（LVEF）は、市販のソフトウェアを使用して、心電図同期された心筋灌流画像から計算される。各被験者について、ベースラインおよびフォローアップスキャン中に次の変数が取得される:安静時LVEFおよびストレス後LVEF。

携帯型心電図検査
評価スケジュールに示されているように、一時的なST部分の変動は、5日間の継続的な携帯型ECGによって監視される。5日間の携帯型ECGは、予定来院（nominal visit）の指定された期間内に実施するべきである。1日目、すなわちベースラインの携帯型ECGは、1日目の直前のスクリーニング期間中任意の5日間に実施する必要がある。常套的な日常活動中におけるほとんどの虚血発症は、心拍数の増加に関連しているため、各携帯型ECG記録時に同様の日常活動を促すことが不可欠である。携帯型ECGモニタリングコアラボラトリーは、ePatchデバイスの形態で携帯型ECGレコーダーを提供する。コアラボラトリーはまた、携帯型ECGの使用および配置に関する現場技術研修、研究担当者向けの手順マニュアルおよびクイックリファレンスガイド、試験中の継続的なサポート、携帯型ECG研究の追跡および品質審査、書面による独立手順書での盲検化分析、ならびに最終データのデータ管理およびデータ転送サービスを提供する。虚血発症の基準は、1mm以上の水平または下り傾斜のST部分低下が1分以上続き、別の発症から1分以上離れていることである。各発症中のST部分低下の最大深さは、「総虚血負荷」としてのST部分低下（mm）×持続時間（min）の指標の計算を可能にするために記録される。

アクチグラフィー
運動バイオセンサーデバイス（活動トラッカー）は、14日間着用して総運動活動を測定するため、被験者に提供される。14日間の期間は、評価スケジュールに示されている研究来院の前に行われるべきである。これにより、来院時までに期間を終了し、アクチグラフィーコアラボラトリーによる解釈のためにデバイスを返却できる。アクチグラフィーコアラボラトリーは、研究担当者の研修および年中無休の技術サービスおよびサポート、研究ガイド、デバイスレンタル、運動分析サービス、ならびに書面による独立審査手順書でのデータ分析を提供する。

生活の質（Quality of Life:QOL）
シアトル狭心症質問票（Seattle Angina Questionaire:SAQ）は、冠動脈疾患に対する最も高感度で、詳細で、応答性の高い、健康関連の生活の質における指南書である。SAQは自己管理型であり、妥当で再現性があり、臨床的変化に対し高感度であることが示されている。SAQは、狭心症によって引き起こされる被験者の身体的制限、症状の頻度および最近の変化、治療に対する満足度、ならびに疾患が生活の質に与える影響を感じる程度を定量化する。各スケールは0～100のスコアに変換され、スコアが高いほど機能が優れている（例えば、身体的制限が少なく、狭心症が少なく、生活の質が高い）ことを示す。該手段には、身体的制限、狭心症の安定性、狭心症の頻度、治療の満足度、および疾患の認識という5つのサブスケールスコアをもたらす19の項目がある。いずれかのサブスケールにおける10ポイントの変化は、臨床的に重要であると考えられる。

EQ-5D-3L QOL手段は、基本的に2ページからなる:EQ-5D記述システムおよびEQビジュアルアナログスケール（EQ visual analogue scale:EQ VAS）。EQ-5D-3L記述システムは、次の5つの側面を含む:運動性、セルフケア、通常の活動、痛み/不快感、不安/抑うつ。EQ VASは、患者の自己評価による健康状態を垂直方向のビジュアルアナログスケールで記録する。

臨床的総合印象尺度（Clinical Global Impression:CGI）は2つの部分に分かれている。ベースラインで収集された、臨床的総合印象尺度-重症度スコアは、試験責任者が記入する1つの質問からなる:「過去7日間と比較して、患者の難治性狭心症はどのようであるか:1=正常 - 全く病気ではなく、過去7日間に障害の症状が見られない;2=病気の境界線上 - 微妙なまたは疑わしい病状;3=軽度の病気 - 明確に定まった症状で、苦痛、または社会的および職業的機能における困難があったとしても最小限である;4=中等度の病気 - はっきりしているが中等度の機能障害または苦痛を引き起こす明白な症状;症状レベルは投薬に値する場合がある;5=顕著な病気 - 社会的/職業的機能を明らかに損なう、または煩わしいレベルの苦痛を引き起こす煩わしい症状;6=重度の病気 - 破壊的な病状、挙動、機能、そして症状の影響を頻繁に受け、他人の助けが必要になる場合がある;7=非常に重度の病気を患う患者に含まれる - 病状により多くの生活機能が劇的に妨害される。

臨床的総合印象尺度-改善度スコアは、試験責任者が記入する1つの質問からなる:「ベースラインの患者の状態と比較すると、この患者の難治性狭心症は:1=治療開始から著明改善;2=中等度改善;3=軽度改善;4=ベースライン（治療の開始）から不変;5=軽度悪化;6=中等度悪化;7=治療開始から著明悪化。」

狭心症および予防的ニトログリセリン（NTG）使用ログ
被験者には、狭心症の発症および各発症の詳細（きっかけ、重症度、治療など）を収集するための紙の日誌が渡される。予防的なニトログリセリン使用日誌もある。被験者は、狭心症の発症およびNTGの使用を次の間隔で記録する:1日目の来院の14日前、ベースラインとして機能、1日目に日誌を収集;3か月目の来院の14日前、3か月目の来院時に日誌を収集;6か月目の来院の14日前、6か月目の来院時に日誌を収集;および12か月目の来院の2週間（14日）前。日誌の収集は、12か月目の来院を除いて、被験者が活動トラッカーを着用しているときと一致するべきである。

本明細書で引用されている全ての特許、特許出願、および公報の開示は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は特定の態様を参照して開示されてきたが、他の当業者によって、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の態様および変形形態が考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような態様および同等の変形形態を全て含むように解釈されることを意図している。

列挙される態様
以下に列挙される態様が提供されるが、その番号付けは、重要性のレベルを指定するものとして解釈されるべきではない。

態様1は、治療を必要とする対象の心血管疾患を治療する方法であって、治療用ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む有効量の薬学的組成物を、経胸壁心外膜手術（TECAP）中に対象の心臓に直接投与する工程を含む方法を提供する。

態様2は、前記薬学的組成物が対象の心臓における別々の送達部位における一連の15回の注射を通して投与され、前記ウイルスベクターが実質的に心臓全体に拡散する、態様1の方法を提供する。

態様3は、前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、態様1または態様2のいずれか1つの方法を提供する。

態様4は、前記ウイルスベクターがVEGFの1つまたは複数のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む、態様1～3のいずれか1つの方法を提供する。

態様5は、対象の心臓が胸腔鏡を使用して手術全体を通して視覚化される、態様1～4のいずれか1つの方法を提供する。

態様6は、約1×10⁹vp、約1×10¹⁰vp、約4×10¹⁰vpまたは約1×10¹¹vpのウイルスベクターの用量が投与される、請求項1～5のいずれか一項記載の方法を提供する。

態様7は、各注射の注入量が約0.1mLである、態様2の方法を提供する。

態様8は、心血管疾患が冠動脈疾患である、態様1～8のいずれか1つの方法を提供する。

態様9は、TECAPが対象の第5～第7肋間隙に4～5cmの前側方切開を行うことを含む、態様1～8のいずれか1つの方法を提供する。

態様10は、注射が左心室で行われる、態様1～9のいずれか1つの方法を提供する。

Claims (10)

1. 治療を必要とする対象の心血管疾患を治療する方法であって、治療用ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを含む有効量の薬学的組成物を、経胸壁心外膜手術（Transthoracic Epicardial Procedure:TECAP）中に対象の心臓に直接投与する工程を含む、方法。
2. 前記薬学的組成物が対象の心臓における別々の送達部位における一連の15回の注射を通して投与され、前記ウイルスベクターが実質的に心臓全体に拡散する、請求項1記載の方法。
3. 前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項1または請求項2記載の方法。
4. 前記ウイルスベクターがVEGFの1つまたは複数のアイソフォームをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項1～3のいずれか一項記載の方法。
5. 対象の心臓が胸腔鏡を使用して手術全体を通して視覚化される、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
6. 約1×10⁹vp、約1×10¹⁰vp、約4×10¹⁰vpまたは約1×10¹¹vpのウイルスベクターの用量が投与される、請求項1～5のいずれか一項記載の方法。
7. 各注射の注入量が約0.1mLである、請求項2記載の方法。
8. 心血管疾患が冠動脈疾患である、請求項1～8のいずれか一項記載の方法。
9. TECAPが対象の第5～第7肋間隙に4～5cmの前側方切開を行うことを含む、請求項1記載の方法。
10. 注射が左心室で行われる、請求項1記載の方法。

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