CN117965628B - 高表达lncRNA H19基因的腺病毒载体、重组腺病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，具体涉及高表达lncRNA H19基因的腺病毒载体、重组腺病毒及其应用。本发明构建的携带长链非编码RNA H19基因的重组腺病毒，能有效介导调控长链非编码RNA H19的表达水平，利用其转染内皮祖细胞可以将内皮祖细胞的长链非编码RNA H19上调10万倍以上，调控水平显著，操作方法简单，并且通过重组腺病毒介导的高表达长链非编码RNA H19基因的内皮祖细胞可以显著促进缺血下肢的血流恢复，明显降低缺血导致的自发性截肢发生率，疗效确切。

Description

高表达lncRNA H19基因的腺病毒载体、重组腺病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及高表达lncRNA H19基因的腺病毒载体、重组腺病毒及其应用。

背景技术

下肢缺血性疾病是一种严重的血液循环障碍，可能导致组织缺血、坏死和功能丧失，而外科血运重建、血管腔内治疗、截肢及药物等治疗方法目前均未能有效逆转重症下肢缺血状态。内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一类存在于骨髓及周围血液中的干细胞，它们具有再生内皮和血管修复的能力，然而未经改造的内皮祖细胞在外周阻塞性疾病等缺血缺氧环境下成活率低，增殖分化能力弱，导致内皮祖细胞疗效不显著；此外，由于下肢缺血肢体长期处于缺血缺氧状态，目前报道的体外修饰改造后的内皮祖细胞在此环境下的存活率仍较低，恢复缺血肢体的血流效果仍一般，无法逆转肢体缺血状态。

长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)定义为一类长度大于200nt，不编码蛋白质的RNA转录产物，仅仅是RNA聚合酶II转录副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输、蛋白质翻译后的修饰以及遗传学的表观调控等多种重要的调控过程，这些作用表明其与疾病的病理生理改变有着紧密联系。人lncRNA H19位于人染色体11p15.5，全长2.3kb，是最先被报道的lncRNA基因之一，据报道lncRNA H19在血管新生、血管功能和炎症反应等方面可以发挥作用，其可能通过调控相关基因或miRNA的表达，影响内皮祖细胞的增殖和血管生成，有助于改善血管供应，从而在下肢缺血性疾病中发挥作用。目前，通过慢病毒介导的体外内皮祖细胞修饰对lncRNA H19基因的过表达水平较低，导致其介导的内皮祖细胞功能改造不太理想，而由腺病毒介导lncRNA H19修饰的内皮祖细胞在下肢缺血性疾病的应用中还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足而提供一种高表达lncRNA H19基因的腺病毒载体、重组腺病毒及其应用，所述重组腺病毒通过体外感染正常培养的外周血内皮祖细胞即可获得高表达lncRNA H19的内皮祖细胞，操作方法简单，调控水平显著，且能实现lncRNA H19的持续稳定高表达。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

第一方面，本发明提供一种腺病毒载体，所述腺病毒载体采用以下方法制备而成：将长链非编码RNA H19基因进行扩增，并将扩增后的长链非编码RNA H19基因插入腺病毒穿梭载体质粒GV315的AgeI和NheI位点之间；由CMV启动子调控长链非编码RNA H19基因表达，即得到所述腺病毒载体；

所述长链非编码RNA H19基因进行扩增的上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示。

本发明选取穿梭质粒GV315作为载体，通过设计引物对长链非编码RNA H19基因进行扩增后经过同源重组技术将其插入GV315的AgeI和NheI位点之间，并由CMV启动子进行基因表达调控，实现了长链非编码RNA H19基因在宿主细胞中的高效表达，且稳定性高，确保基因在宿主细胞中的长期存在，同时方便克隆和筛选。

经试验探究发现，本发明构建的携带长链非编码RNA H19基因的重组腺病毒载体，能有效介导调控长链非编码RNA H19的表达水平，利用其转染内皮祖细胞可以将内皮祖细胞内的长链非编码RNA H19上调10万倍以上，调控水平显著，且操作方法简单，相较于慢病毒调控改造的内皮祖细胞，本发明利用构建的重组腺病毒介导制备内皮祖细胞所用时间缩短了将近2周。

优选地，所述扩增后的长链非编码RNA H19基因插入腺病毒穿梭载体质粒GV315的AgeI和NheI位点之间的方法为：通过EcoR I限制性内切酶酶切扩增后的长链非编码RNAH19基因序列和穿梭载体质粒GV315，然后将酶切后的长链非编码RNA H19基因序列和穿梭载体质粒GV315连接。

第二方面，本发明提供一种重组腺病毒，所述重组腺病毒由上述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒共转染包装细胞，在包装细胞中重组包装并收集得到。

优选地，本发明采用脂质体转染法进行共转染，包括以下步骤：

(1)将包装细胞接种于含5-10％FBS的DMEM培养基中，36-38℃、5％CO₂条件下培养；

(2)将所述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒与DMEM混合均匀，孵育5-10min；

(3)将Lipofectamine 2000试剂与DMEM混合均匀，孵育5-10min；

(4)将步骤(2)的混合液与步骤(3)的混合液混匀，孵育15-25min，得到转染复合液；

(5)将步骤(4)的转染复合液滴加至步骤(1)的包装细胞培养液中，36-38℃、5％CO₂条件下培养，6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入PBS洗涤残余的转染混和物，倒弃废液，再加入含10％血清的细胞培养基，37℃、5％CO₂条件下培养10-15d，离心收集细胞，即完成脂质体转染法共转染过程。

本发明通过Lipofectamine 2000脂质体转染法对腺病毒载体及辅助骨架质粒共转染包装细胞，操作方法简便，条件温和，具有相对较低的生物毒性，且能实现相对较高的转染效率，有助于维持细胞的健康状态和提高外源基因表达的稳定性。

更优选地，所述腺病毒载体、腺病毒辅助骨架质粒和Lipofectamine 2000试剂的质量体积比为腺病毒载体：腺病毒辅助骨架质粒：Lipofectamine 2000试剂＝1μg:1μg:2μL；所述步骤(1)中，培养基中细胞密度达到50-60％。

经试验探究发现，当腺病毒载体、腺病毒辅助骨架质粒和Lipofectamine 2000试剂的质量体积比1μg:1μg:2μL时，能获得最佳的转染效率，且避免细胞毒性的产生；转染效率也与细胞密度有关，当细胞密度为50-60％时，能保证良好的细胞状态和较少的传代次数，同时能明显提高腺病毒的转染效率。

优选地，所述腺病毒辅助骨架质粒为pBHG。

优选地，所述包装细胞为HEK293细胞。

优选地，还包括：将收集得到的重组腺病毒作为毒种进行扩大培养；

优选地，所述扩大培养直至获得第二代重组腺病毒为止。

所述扩大培养包括如下步骤：将收集得到的重组腺病毒粗提液加入含生长状态良好，且细胞密度达到60％的宿主细胞的培养基中培养，待大部分细胞出现典型的细胞病发(CPE)，且有50％细胞脱壁时，离心收集细胞，反复冻融，收集病毒上清，再将病毒上清加入含密度达到90％的宿主细胞的培养基中培养，待大部分细胞出现典型的细胞病发，且有50％细胞脱壁时，再次离心收集细胞，反复冻融，收集病毒上清，获得第二代重组腺病毒。

本发明将携带长链非编码RNA H19基因的腺病毒载体质粒与携带了腺病毒大部分基因组的辅助骨架质粒共转染HEK293细胞，利用Cre/loxP(或FLP/frt)重组酶系统的作用实现重组，经包装及多次扩增能获得高滴度重组腺病毒。

优选地，本发明经重组包装得到所述重组腺病毒后，还包括纯化步骤；所述纯化步骤采用Adeno-X^TM病毒纯化试剂盒进行。

第三方面，本发明还提供了一种转基因细胞，将上述的重组腺病毒转入内皮祖细胞中得到。

优选地，所述内皮祖细胞为传代后的第3-6代之间的内皮祖细胞。

发明人经试验探究发现，选用经原代细胞传代后的第3-6代之间的内皮祖细胞进行本发明所述携带长链非编码RNA H19的重组腺病毒感染制备的工程化内皮祖细胞具有更好的增殖能力，且稳定性强，更容易维持其生长状态和特性，对于实验的可重复性和结果的一致性非常重要；此外，第3-6代之间的内皮祖细胞具备更好的腺病毒感染效率，重组腺病毒能够更有效地复制和扩散，从而有助于长链非编码RNA H19在工程化内皮祖细胞中的稳定高表达。

优选地，所述内皮祖细胞是外周血来源内皮祖细胞。

优选地，所述内皮祖细胞的接种密度为40-70％；所述重组腺病毒的转染时间为72h。

本发明还对细胞接种密度和腺病毒转染时间进行优化，经试验探究发现，当内皮祖细胞的接种密度为40-70％，且重组腺病毒的转染时间为72h时，转染效率最佳，而超出以上限定范围时，重组腺病毒的表达量明显下降。

优选地，上述的重组腺病毒对目标细胞的最佳感染复数为150-200MOI。

更优选地，所述最佳感染复数为200MOI。

经试验探究发现，将过表达长链非编码RNA H19重组腺病毒转染内皮祖细胞，当MOI为150-200PFU/mL范围内时，重组腺病毒的转染效率达到80％以上，转染效果较佳，且长链非编码RNA H19表达量在内皮祖细胞内显著提升；当MOI为200PFU/mL时，细胞转染率达到90％以上，且细胞形态呈立方形或长梭形，细胞形态规则，细胞活力较高，且转染效果最佳，此时长链非编码RNA H19在细胞内上调10万倍以上；而随着MOI值的进一步升高，细胞转染虽然达到90％以上，但细胞呈现扁平样或者圆形，形态不规则，细胞活力降低，甚至可见死亡细胞悬浮于培养基中，转染效果明显降低。

第四方面，本发明还提供了上述转基因细胞在制备治疗缺血性疾病的细胞制剂中的用途。

未经改造的内皮祖细胞在外周阻塞性疾病等缺血缺氧环境下成活率低，增殖分化能力弱，通过腺病毒介导可能实现目的基因在内皮祖细胞中的瞬时高表达，然而移植到体内的内皮祖细胞需要较长时间的存活，且能通过旁分泌或者整合微血管内皮中促进血管新生，因此，瞬时高表达目的基因对内皮祖细胞移植治疗缺血性疾病存在较大问题，不能实现内皮祖细胞持续稳定高表达目的基因。而本发明经试验探究发现，通过重组腺病毒介导内皮祖细胞修饰实现了长链非编码RNA H19的持续稳定高表达，构建的工程化内皮祖细胞的增殖、迁移和管腔形成能力显著提高，且在小鼠实验中观察到，本发明构建的工程化内皮祖细胞作为细胞制剂注射于小鼠体内后能明显促进下肢缺血小鼠的血流恢复，有效降低缺血导致的自发性截肢发生率，疗效显著，为其在缺血性疾病的治疗中提供重要的应用价值。

优选地，所述缺血性疾病是下肢缺血或者血管损伤及其引起的组织、器官损伤。

本发明还对工程化内皮祖细胞用于下肢缺血性疾病的治疗方法进行了优化，通过对下肢缺血实验小鼠进行隔周腓肠肌注射所述工程化内皮祖细胞，并且为了确保内皮祖细胞疗效的显著性，发明人采用每周注射一次经修饰内皮祖细胞的细胞周期疗法以保证能持续高表达长链非编码RNA H19的内皮祖细胞在体内的数量，从而对下肢缺血或者血管损伤及其引起的组织、器官损伤达到稳定、充分的治疗效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)制备方法简单：腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞通过体外感染正常培养的外周血内皮祖细胞即可获得显著高表达长链非编码RNA H19的内皮祖细胞，操作方法简单，易于大规模推广，在获取病毒及正常内皮祖细胞的基础上，相较于慢病毒调控改造的内皮祖细胞，腺病毒介导制备的内皮祖细胞时间缩短了将近2周时间。

(2)调控水平显著：获取的工程化内皮祖细胞过表达长链非编码RNA H19的水平远高于慢病毒介导方式，从RT-QPCR结果可以看出，利用该长链非编码RNA H19过表达的腺病毒可以将内皮祖细胞的长链非编码RNA H19上调10万倍以上。

(3)持续稳定高表达：通过本发明所述重组腺病毒介导实现了长链非编码RNA H19在内皮祖细胞中的持续稳定高表达，避免了内皮祖细胞移植入体内后需较长存活时间而导致的瞬时表达的长链非编码RNA H19失效等问题。

(3)疗效显著：将腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞注射于缺血的小鼠下肢腓肠肌，可以显著促进缺血下肢的血流恢复，明显降低缺血导致的自发性截肢发生率，疗效确切。

附图说明

图1为携带长链非编码RNA H19腺病毒载体结构图谱。

图2为PCR结果图，其中A图为长链非编码RNA H19基因的PCR扩增结果图，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp；B图为目的基因交换入线性化表达载体的PCR鉴定结果图；1#：阴性对照(ddH₂O)；2#：阴性对照(空载自连对照组)；3#：阳性对照(GAPDH)；4#：Marker自上而下依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp、100bp；5-12#:1-8号转化子。

图3为携带长链非编码RNA H19重组腺病毒的滴度鉴定图。

图4为人外周血内皮祖细胞的提取与培养结果图，其中A图为EPCs分离工作流程图；B图为EPCs分离过程中的形态学变化情况；C图为流式细胞术评估人外周血源EPCs表面标记物CD31、CD144和CD309表达结果。

图5为荧光显微镜下不同感染复数的过表达长链非编码RNA H19腺病毒转染内皮祖细胞的情况图。

图6为重组腺病毒介导长链非编码RNA H19过表达后内皮祖细胞内的长链非编码RNA H19表达情况图。

图7为通过Western blot分析H19过表达后EPCs中Bax、P53、Bcl-2、GSDMD-FL、GSDMD-N和Caspase-1的蛋白表达情况结果图，其中，数值(n＝3)显示为平均值±标准差，使用单因素方差分析进行统计分析，*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.0001；ns表示无意义。

图8为腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞的增殖、迁移和管腔形成能力的结果图，其中，A图为通过EDU实验进行EPCs的增殖能力的评估结果；B图为通过CCK-8实验进行EPCs的增殖能力的评估结果，*，与PBS相比p<0.05；C图为通过伤口愈合迁移实验进行的EPCs的迁移潜力的检测结果；D图为通过转移迁移实验进行EPCs的迁移能力的检测结果；E图为通过体外管腔形成实验进行EPCs的血管生成潜力的评估结果；对于A、B、C、D和E图，数值(n＝3)显示为平均值±标准差，使用单因素方差分析进行统计分析；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。

图9为腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞对下肢缺血小鼠的治疗情况结果图，其中，A图为在手术前、术后0、1、3、7、14和21天以仰卧位拍摄的小鼠下肢缺血模型体视和激光多普勒灌注成像(LDPI)的代表性图；B图为相对于正常下肢，术前、术后0、1、3、7、14和21天的血液灌注比率定量评估结果；C图为术后21天缺血下肢的肢体挽救率；G6，6级，表示完全恢复；G5，5级，表示轻微坏死或指甲脱落；G4，4级，表示部分趾部切除；G3，3级，代表全趾部切除；G2，2级，表示部分或全部足部切除；G1，1级，表示部分或全部肢体切除。在A、B和C图中，均值±SD值的统计分析使用单因素方差分析(n＝4)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

无特殊说明情况下，本发明上下文中所列举细胞均按照现有技术进行培养，同时在-80℃冰箱中冷冻保存并用于后续实验。本发明所使用试剂，均通过市售获得。本发明所用实验方法，如引物设计、细胞实验、动物实验、免疫荧光，免疫组化、Western blot等均为本领域的常规方法和技术。

实施例1.构建过表达长链非编码RNA H19的腺病毒载体

1、目的基因片段的获取

设计引物对长链非编码RNA H19基因进行PCR扩增，以获得可重组到穿梭载体质粒GV315上的目的基因(产物上、下游分别带有AgeI、NheI酶切位点)，长链非编码RNA H19设计引物如下。上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示。PCR产物大小为2386bp，结果如图2(A)所示。

上述PCR反应条件如表1所示：

表1

2、腺病毒载体的构建及鉴定

携带长链非编码RNA H19基因的腺病毒载体为吉凯基因协助构建及包装。将经过EcoR I限制性内切酶消化获得AgeI、NheI位点酶切的线性化GV315腺病毒穿梭质粒和目的基因片段用琼脂糖凝胶电泳回收后，加入T4 DNA连接酶连接过夜，将连接产物转化新鲜制备的大肠杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性得到阳性重组子(图2B)，PCR产物大小为1039bp，并进行测序鉴定明确无突变；其中，PCR鉴定引物如下。上游引物：5’-GACACCATCGGAACAGCAGC-3’；下游引物：5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’。

上述PCR反应条件如表2所示：

表2

实施例2.过表达长链非编码RNA H19的重组腺病毒的构建

1、质粒转染与重组腺病毒的获得

将携带长链非编码RNA H19基因的腺病毒穿梭质粒与携带了腺病毒大部分基因组的辅助包装质粒pBHG共转染HEK293细胞，利用Cre/loxP(或FLP/frt)重组酶系统的作用实现重组，获得重组腺病毒。

本发明采用Lipofectamine 2000脂质体转染试剂进行共转染，具体方法如下：

(1)转染前24h，用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，以含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为达30％-40％，重新接种于细胞培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h左右待细胞密度达到50％-60％时即可用于转染；

(2)转染前2h更换为无血清培养基；

(3)将DNA溶液(穿梭质粒5μg、辅助质粒5μg)与DMEM混合均匀，调整总体积为50μl，室温下温育5min；将10μl Lipofectamine 2000试剂与50μl DMEM混合，室温下温育5min；将稀释后的DNA溶液与Lipofectamine 2000轻轻混匀，勿振荡，室温下温育20min，以便形成DNA/Lipofectamine 2000转染复合物；

(4)将转染复合液缓慢滴加至HEK293细胞培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

(5)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入2ml的PBS清洗一次，轻柔晃动以洗涤残余的转染混和物后倒弃；

(6)缓慢加入含10％血清的细胞培养基5ml，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养，每天观察转染后细胞生长状况，若培养基明显发黄，酌情补加适量的新鲜完全培养液；

(7)转染后约10-15d，显微镜观察HEK293细胞是否开始飘落，出现细胞病发(cytopathiceffect，CPE)；待大部分细胞显示典型CPE，且有50％细胞脱壁，低速离心收集HEK293细胞并重悬于2ml DMEM中。

2、重组腺病毒的扩增

(1)第1轮扩增

将生长状态良好的HEK293细胞传入T25细胞培养瓶中，待细胞汇合达60％，弃去旧培养液，加入重组成功后的复制缺陷型腺病毒粗提液2mL，置于细胞培养箱中孵育90min后补加完全培养液3mL，继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％细胞脱壁时，低速离心收集细胞并重悬于2ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，4℃、7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

(2)第2轮扩增

将生长状态良好的HEK293细胞传入T25细胞培养瓶中，待细胞汇合达90％，弃去旧培养液，加入第1轮扩增所得的病毒液2ml，置于细胞培养箱中孵育90min后补加完全培养液10mL，继续培养。待大部分细胞出现典型的CPE，且有50％细胞脱壁时，低速离心收集细胞并重悬于10ml DMEM中，-70℃/37℃反复冻融、振荡3次，4℃、7000g离心5min，收集病毒上清于-70℃保存。

3、重组腺病毒的纯化

本发明采用Adeno-X^TM病毒纯化试剂盒(BDBiosciences，Clontech)进行重组腺病毒的纯化，具体方法如下：

(1)取出BDAdeno-X纯化装置，0.45μm滤膜过滤10ml病毒粗提液，保存滤液于收集瓶中；

(2)向病毒滤液中加入4μl 25U/μl的Benzonase，混匀，37℃温育30min后，加入10ml 1×dilutionbuffer，混合均匀；

(3)组装过滤装置，使用灭菌PBS排尽滤器和套管中的空气后，将套管揑入收集瓶病毒滤液中，以5ml/min的速度向外拉动注射器，使病毒滤液流经滤器；注：避免空气进入系统；

(4)使用1×Wash Buffer洗涤过滤装置；

(5)使用5ml的BDLuer-Lok注射器洗脱腺病毒：在注射器中吸入3ml的1×EultionBuffer；连接注射器和滤器的凹口，推入lml Elution Buffer流经滤器至5ml灭菌离心管中；室温下孵育滤器5min，推入剩下的elution buffer流经滤器来收集剩下的腺病毒；

(6)将纯化后的腺病毒分装，-70℃保存。

4、重组腺病毒的滴度测定

本发明采用终点稀释法检测所述重组腺病毒滴度，具体方法如下：

(1)实验前24h，铺96孔板，每孔传100μl HEK293细胞悬液，约含1×10³个细胞；

(2)准备12个无菌EP管，第一个EP管中加入990μl完全培养液，其余11个EP管各加入900μl完全培养液；

(3)待测病毒液的稀释：取10μl腺病毒原液加入第一个EP管做1:100稀释；然后以此为起点，依次取100μl病毒稀释液加入到下一个EP管中做1:10稀释，直至稀释到10^-13；

(4)96孔板弃旧培养液，依次加入稀释度为10^-13至10^-6的病毒液，每一稀释度占用一行，每行前10孔每孔加入90μl病毒稀释液，第11-12孔加入90μl不含病毒的完全培养基作为对照；

(5)将96孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中继续培养；

(6)10d后观察细胞病发现象，并计数出现CPE的细胞孔，计算各稀释度病毒液处理后的CPE阳性率，计算病毒滴度。

病毒滴度分析(Spearman-Karber Method)：病毒滴度＝10(X+0.8)(PFU/mL)

X——10^-1到10^-13依次稀释度下CPE阳性率总和

经滴度测定，本发明经包装及多次扩增获得高滴度重组腺病毒，病毒滴度达到2×10¹⁰PFU/mL，滴度检测细胞感染情况如图3所示。

实施例3.腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞的制备

1、人外周血内皮祖细胞的提取与培养

从健康志愿者的外周血10ml(含有肝素的钠管)中采集外周血单个核细胞(PBMCs)，通过使用人类淋巴细胞分离液(TBD LTS1077-1)进行密度梯度离心分离。PBMCs被培养在预铺了Fibronetin(BD Biocoat 356008)的六孔板上，培养基为EGM-2Bullet Kit(内皮细胞基础培养基和Single Quots Kit)培养基，含有20％FBS，保存在37℃、5％CO₂和85％湿度的培养箱中。静置4天后，第一次更换培养基，随后每2-3天更换一次，待细胞长至21天后消化传代。EPCs在第3至第6代之间使用。EPCs经过共聚焦显微镜或流式细胞仪进行特性鉴定。此外，通过流式细胞仪分析CD31、CD144和CD309的表达来对EPCs进行表型分析，使用带荧光标记的单克隆抗体(BDBiosciences，美国)。

图4(B)中细胞形态学变化显示，在第1天，外周血单个核细胞(PBMCs)呈现出多种形态，其中一些细胞附着在培养皿上；到第7天，PBMCs形成了不同大小的中央聚集体；在第14天，内皮祖细胞(EPCs)呈现出梭形，不同的集落开始融合和生长；到第21天，培养皿被EPCs完全覆盖，呈现出类似HUVECs的鹅卵石状图案；图4(C)流式细胞仪结果显示，人外周血源EPCs表面标记物CD31、CD144和CD309呈阳性染色。

2、腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞的制备

(1)目的细胞感染预实验：内皮祖细胞(EPCs)生长至40％-70％的密度，加入不同用量的带有GFP标记的过表达长链非编码RNA H19的重组腺病毒，摸索重组腺病毒最佳感染复数(MOI，multiplicity of infection)。加入该重组腺病毒6h后，更换细胞培养基，分别于12h、24h、48h及72h观察内皮祖细胞GFP表达情况，确定过表达长链非编码RNA H19腺病毒最佳感染复数(MOI)，并通过RT-QPCR确定内皮祖细胞感染腺病毒后非编码RNA H19的表达情况；

(2)高表达长链非编码RNA H19工程化内皮祖细胞的制备：确定好过表达长链非编码RNA H19腺病毒最佳感染复数后，于T75细胞培养瓶中扩增内皮祖细胞，至40％-70％的密度，根据MOI计算腺病毒用量，加入进行感染，6h更换培养基，制备高表达长链非编码RNAH19的工程化内皮祖细胞，72小时后消化细胞用于后续下肢缺血小鼠的治疗应用。

本发明采用不同MOI值(10、50、100、150、200、300PFU/mL)将过表达长链非编码RNAH19重组腺病毒转染内皮祖细胞，荧光显微镜下观察转染效率，如图5所示，当MOI＝10PFU/mL时，未见明显绿色荧光，随着MOI值不断升高，转染效率逐渐升高，MOI＝150PFU/mL时，转染效率约为80％，当MOI＝200PFU/mL时，可见大量荧光细胞，细胞转染率约为90％以上且细胞形态呈立方形或长梭形，细胞形态规则，细胞活力较高，当MOI＝300PFU/mL时，虽然细胞转染率达到90％以上，但细胞形态不规则，细胞活力降低，可见大量死亡细胞悬浮于培养基中。因此确定MOI＝200PFU/mL作为过表达长链非编码RNA H19腺病毒的最佳感染复数。

并且，本发明对不同感染复数的重组腺病毒转染内皮祖细胞，RT-QPCR结果如图6所示，随着MOI值不断增加，H19表达水平逐渐提高，在MOI＝200PFU/mL时，H19表达量显著提升，表明长链非编码RNA H19重组腺病毒可显著过表达内皮祖细胞内长链非编码RNA H19，且可将长链非编码RNA H19上调10万倍以上。

本发明按MOI＝200PFU/mL重组腺病毒转染内皮祖细胞，还通过Western blot分析H19过表达后EPCs中Bax、P53、Bcl-2、GSDMD-FL、GSDMD-N和Caspase-1的蛋白表达情况，Bax、P53、Bcl-2、GSDMD-FL、GSDMD-N和Caspase-1基因在调节细胞凋亡活动中发挥着重要作用，结果如图7所示，腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞中GSDMD-FL、GSDMD-N和Caspase-1的蛋白表达量相较于初始内皮祖细胞显著降低，表明由腺病毒介导长链非编码RNA H19构建工程化内皮祖细胞能显著促进细胞的抗焦亡能力，在一定程度上提升经修饰的内皮祖细胞在外周阻塞性疾病等缺血缺氧环境下的存活率，从而促进缺血下肢的血流恢复以此达到良好的治疗效果。

实施例4.腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞的各项性能测试

本发明还对腺病毒介导长链非编码RNAH19高表达工程化内皮祖细胞的增殖、迁移和管腔形成能力进行评估，EPCs的增殖能力通过EDU实验进行评估，迁移潜力通过伤口愈合迁移实验检测，增殖能力通过CCK-8实验评估，迁移能力通过转移迁移实验确定，体外管腔形成实验用于评估EPCs的血管生成潜力。

图8(A)结果显示，腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞中EDU含量显著高于初始内皮祖细胞，表明本发明所述工程化内皮祖细胞的增殖能力显著提升，且当重组腺病毒的MOI＝200PFU/mL时，细胞增殖能力最为显著，而当MOI分别为100、300PFU/mL时，增殖能力发生下降；图8(B)的CCK-8实验结果同样表明，在培养72h后，MOI＝200PFU/mL介导的lncRNAH19高表达工程化内皮祖细胞的细胞存活率明显高于初始细胞，进一步证明本发明工程化内皮祖细胞的增殖能力在MOI＝200PFU/mL时显著提高，从而实现lncRNA H19基因的持续稳定高表达；图8(C)结果表明，所述lncRNA H19高表达工程化内皮祖细胞在12h时向缺口内迁移能力显著高于初始细胞，图8(D)细胞迁移实验也证实，本发明工程化内皮祖细胞的迁移活力明显提升，图8(E)体外管腔形成实验表明，所述lncRNA H19高表达工程化内皮祖细胞在相同时间内管腔结点数明显增多，成管数量增加；以上结论充分证明本发明通过重组腺病毒介导lncRNA H19高表达内皮祖细胞具有优异的增殖、迁移和管腔形成能力，且当重组腺病毒的MOI＝200PFU/mL时，效果最为显著，对于下肢缺血或者血管损伤及其引起的组织、器官损伤等疾病具备确切的疗效。

实施例5.腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞的治疗

1、构建裸鼠下肢缺血模型

将小鼠用1％戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉，并将其放置在干净的手术板上，采用橡皮带将其固定在仰卧位。然后，在左侧腹股沟区域的皮肤上涂抹碘伏进行消毒，随后进行斜向切口，大约0.5厘米长。在显微镜下，仔细将股动脉与神经血管束分离，并使用6-0Prolene线在股动脉的近端和远端永久性结扎，制备出下肢缺血模型。确认下肢动脉流动中断后，缝合伤口，将小鼠放置在加热的笼子中进行复苏，构建下肢缺血裸鼠模型。

2、腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞的治疗

将腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞消化后，将其悬浮于PBS中，细胞计数约500万个该细胞重悬于100ul PBS中，然后使用25号针头将其植入下肢缺血小鼠的腓肠肌中。细胞治疗分别在手术后第1天、第7天和第14天进行，通过体视观察及血流超声多普勒观察下肢血流恢复情况。

结果如图9(A、B、C)所示，由腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞对下肢缺血小鼠进行注射治疗，小鼠在术后14、21天的血液灌注比率明显高于对照组，且在术后21天缺血下肢的肢体基本完全恢复，表明腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞显著促进了下肢缺血小鼠的血流恢复，明显降低缺血导致的自发性截肢发生率；使用H&E染色、CD31和α-SMA免疫组化分析分别用于研究小鼠伤口样本的细胞增殖和血管生成情况，将长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞经腓肠肌注射后21天后，注射部位远端后肢腓肠肌组织结构完整，细胞增殖，血管内皮分化和血管生成明显，手术后第21天注射部位远端后肢腓肠肌组织每个视野内α-SMA⁺血管的数量显著增加，充分表明长链非编码RNA H19高表达工程化内皮祖细胞能显著加速缺血下肢的伤口愈合，疗效显著。

综上所述，本发明通过重组腺病毒介导长链非编码RNA H19可显著过表达内皮祖细胞内的长链非编码RNA H19，使其上调10万倍以上，调控水平显著，并且，本发明所述重组腺病毒实现了长链非编码RNA H19在内皮祖细胞中的持续稳定高表达，使得重组腺病毒介导长链非编码RNA H19高表达内皮祖细胞的增殖、迁移和管腔形成能力显著提高，将其作为细胞制剂用于下肢缺血性疾病的治疗时，所述经修饰皮祖细胞能够显著促进缺血下肢的血流恢复，加快血管的生成，明显降低缺血导致的自发性截肢发生率，疗效确切。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种转基因细胞，其特征在于，所述转基因细胞由重组腺病毒转染内皮祖细胞中得到；

所述重组腺病毒对所述内皮祖细胞的感染复数为150-200MOI；

所述重组腺病毒由腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒共转染包装细胞，在包装细胞中重组包装并收集得到；

所述腺病毒载体采用以下方法制备而成：

将长链非编码RNA H19基因进行扩增，并将扩增后的长链非编码RNAH19基因插入腺病毒穿梭载体质粒GV315的AgeI和NheI位点之间；由CMV启动子调控长链非编码RNA H19基因表达，即得到所述腺病毒载体；所述长链非编码RNAH19基因进行扩增的上游引物如SEQ IDNO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于，所述内皮祖胞为传代后的第3-6代之间的内皮祖细胞。

3.根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于，所述内皮祖细胞的接种密度为40-70％；所述重组腺病毒的转染时间为72h。

4.根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于，所述扩增后的长链非编码RNA H19基因插入腺病毒穿梭载体质粒GV315的AgeI和NheI位点之间的方法为：通过EcoR I限制性内切酶酶切扩增后的长链非编码RNAH19基因序列和穿梭载体质粒GV315，然后将酶切后的长链非编码RNAH19基因序列和穿梭载体质粒GV315连接。

5.根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于，所述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒采用脂质体转染法进行共转染，包括以下步骤：

(1)将包装细胞接种于含5-10％FBS的DMEM培养基中，36-38℃、5％CO₂条件下培养；

(2)将所述腺病毒载体及腺病毒辅助骨架质粒与DMEM混合均匀，孵育5-10min；

(3)将Lipofectamine 2000试剂与DMEM混合均匀，孵育5-10min；

(4)将步骤(2)的混合液与步骤(3)的混合液混匀，孵育15-25min，得到转染复合液；

(5)将步骤(4)的转染复合液滴加至步骤(1)的包装细胞培养基中，36-38℃、5％CO₂条件下培养，6h后弃去含有转染混合物的培养基，加入PBS洗涤残余的转染混和物，倒弃废液，再加入含10％血清的细胞培养基，37℃、5％CO₂条件下培养10-15d，离心，收集细胞，即完成脂质体转染法共转染包装细胞过程。

6.根据权利要求5所述的转基因细胞，其特征在于，所述步骤(1)中，所述培养基中细胞密度达到50-60％；

所述腺病毒载体、腺病毒辅助骨架质粒和Lipofectamine 2000试剂的质量体积比为腺病毒载体：腺病毒辅助骨架质粒：Lipofectamine 2000试剂＝1μg:1μg:2μL。

7.根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于，所述腺病毒辅助骨架质粒为pBHG；所述包装细胞为HEK293细胞。

8.根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于，所述重组腺病毒还包括：将收集得到的重组腺病毒作为毒种进行扩大培养。

9.根据权利要求8所述的转基因细胞，其特征在于，所述扩大培养直至获得第二代重组腺病毒为止。

10.权利要求1-9任一项所述的转基因细胞在制备治疗缺血性疾病的细胞制剂中的用途，其特征在于，所述缺血性疾病是下肢缺血或者血管损伤及其引起的组织、器官损伤。