JP2004520009A - 核酸構築物、それにより形質転換された血管細胞、血管形成を誘発するためのそれを用いた医薬組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は核酸構築物、それにより形質転換された血管細胞、および、血管形成を誘発するためのこのような形質転換された血管細胞を利用する方法に関する。より詳しくは、本発明は血管形成増殖因子少なくとも1種および血管形成成熟因子少なくとも1種を発現する遺伝子的に形質転換された血管細胞および哺乳類組織中の新しい血管の形成を誘発するための遺伝子的に形質転換された細胞の利用方法に関する。
【0002】
アテローム性動脈硬化閉塞性心臓血管病:
冠動脈、脳血管および末梢血管の疾患のようなアテローム性動脈硬化症により生じる疾患は西半球における罹患および死亡の最も一般的なものである[20]。
【0003】
公的および私的な研究がかなり行なわれているにもかかわらず、アテローム性動脈硬化症関連疾患はそれに起因する経済的負担の観点において他の如何なる知られた疾患よりも重大問題である。世界保健機構(WHO)は、アテローム性動脈硬化症関連疾患は2020年までに世界において罹患および死亡の第1の原因となると予測している。
【0004】
バイパス手術および血管形成術のような種々の侵襲的な治療方法がアテローム性動脈硬化症関連疾患の治療のために通常用いられている。これらの治療方法はアテローム性動脈硬化症患者の寿命を延長するが、このような方法は複雑さと高度に侵襲的な性質のため限定されている。
【0005】
更にまた、これらの方法は、動脈枝の遮断または合成、静脈または動脈の何れかのバイパス移植片の遮断から生じる虚血性症状を有する患者全てにおいて効果的に利用できるわけではない。現時点で、公的および私的基金による心臓血管研究施設は、アテローム性動脈硬化症の患者の治療において有効な新しい治療方法を発見するための研究においてかなりの時間と資源を投入している。
【0006】
血管形成
成人においては、正常および罹患した組織における新しい血管の形成は、2つの過程、即ち、反復される動脈形成(存在前の細動脈から小型の筋性動脈への変換)および血管形成、既存の血管の新芽形成(胚および成人の両方で起こる)により調節されている[1−5]。成人においては、生理学的血管形成は女性ホルモン周期において、そして多くの病理学的条件下、例えば成長中の腫瘍の内部および周囲における新しい血管の形成および虚血の心臓または四肢における副行血管の形成において起こる[4,5]。
【0007】
血管形成の過程は生物力学的および生化学的な刺激により調節される。血管形成過程は3つの逐次的な段階よりなる。開始時と称される第1段階では、内皮細胞と周囲組織との間の結合はより堅固である。第2段階では、ECが増殖して虚血性組織を侵襲し、これによりEC新芽形成が起こる。血管形成過程の最終段階では、新しく形成されたEC新芽が成熟して機能的血管となる。成熟過程の特徴は内皮細胞を包囲する細胞の漸増である。周囲内皮細胞、例えば毛細血管の周皮細胞、大血管の平滑筋細胞および心臓の心筋細胞が漸増することにより形成中の血管を維持し、モジュレーション機能を与える。
【0008】
血管の完成とリモデリングはパラクリンシグナルにより制御されており、その大部分は膜貫通チロシンキナーゼ受容体の活性をモジュレートする蛋白リガンドにより媒介されている[1,3,6]。これらの分子に属するものは、血管内皮細胞生育因子(VEGF)およびその受容体ファミリー(VEGFR1およびVEGFR2)、アンジオポエチン1および2(Ang−1およびAng−2)およびその受容体(Tie2)、塩基性腺維芽細胞生育因子(bFGF)、血小板由来生育因子(PDGF)、およびトランスフォーミング増殖因子β(TGF‐β)である。
【0009】
血管形成および管腔形成の予備的段階におけるVEGFおよびその受容体の主な役割はVEGF受容体ヌルヘテロ接合動物において明らかにされている[7−9]。胚の発生の早期の段階に生存し続けることができないこのような動物は、VEGFR1受容体に対してヘテロ接合の場合は内皮細胞を生産しないか、またはVEGFR2受容体に対してヘテロ接合である場合は血管を形成することができない。Tie2受容体またはそのリガンドアンジオポエチン1および2を破壊した実験によれば、内皮細胞は管を形成したが周囲内皮細胞は漸増しなかった[10−14]。興味深いことに、同様の表現型がPDGF−B、TGF‐βおよび組織因子を欠損した動物でも観察されており[15−18]、アンジオポエチンのその受容体への結合が内皮細胞からの上記因子の分泌をもたらしていることを示唆している。最近の研究によれば、VEGFは内皮細胞の崩壊と血漿成分の漏出を特徴とする血管形成の早期の段階に関与している[19,20]。この研究によればAng−1は新しく形成された血管の成熟を調節するが、別の研究によればAng−2とTie2との結合が既存の血管の後退に関与しているとされている[6,13]。
【0010】
血管形成の速度には微小血管の生育に影響する陽性および陰性の血管形成因子の間の局所的平衡の変化が関わっている。血管形成因子とその受容体の役割の部分的解明により幾つかの提案されている遺伝子治療方法がもたらされた。遺伝子治療は血管の治療において好都合であると考えられているが、その理由はトランスジーンは全身副作用を伴うことなく発現することができ、その治療効果は長期間にわたり顕著であり、その作用は血管組織の正常な生化学的調節を緊密に摸倣することができるからである[21−24]。
【0011】
遺伝子治療は血管形成術およびバイパス手術の後の平滑筋細胞の増殖の抑制について、そして、内皮細胞増殖の増強による血管形成の誘発について、in vitroおよび動物実験の両方で調べられている[23]。更にまた、それぞれVEGF165およびVEGF121をコードする裸のDNAおよび組み換えアデノウィルスベクターを用いて虚血性の末梢血管の疾患を有する患者の遺伝子的に修飾された血管細胞へのin vivoの遺伝子転移を行なった[25,26]。しかしながら、このような治療法の安全性および有効性は、上記試験に参加した患者6人が死亡した後には疑問視されている。
【0012】
動物モデルにおいてVEGFおよびAng−1コードベクターの同時投与は副行血管の形成を促進したが[39]、このような直接のベクターの投与は、虚血性組織および損傷を受けた臓器においては、このような組織は健康な細胞を欠いているため発現濃度に限界があることから、治療効果には限界がある。
【0013】
即ち、上記した限界のために、現在提案されている、または利用されている治療方法は、末梢、冠動脈および脳血管の血管の閉塞により生じる症状に罹患した広範囲の患者を治療するために効果的で安全に使用することができない。
【0014】
即ち、上記限界のない患者の組織領域における血管形成を誘発するための効果的で安全で侵襲性の低い方法が必要であること、および、それを保有することが極めて好都合であることは広く認められている事である。
【0015】
発明の要約
本発明の1つの特徴によれば、(a)血管形成増殖因子をコードする第1のポリヌクレオチドセグメント;および(b)血管形成成熟因子をコードする第2のポリヌクレオチドセグメントを含む核酸発現構築物が提供される。
【0016】
本発明の別の特徴によれば、(a)血管形成増殖因子をコードする第1のポリヌクレオチドセグメントを含む第1の核酸発現構築物;および(b)血管形成成熟因子をコードする第2のポリヌクレオチドセグメントを含む第2の核酸発現構築物を包含する核酸発現構築物系が提供される。
【0017】
後に記載する本発明の好ましい実施態様における別の特徴によれば、第1および第2のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも一方の発現を意図するためのプロモーター配列少なくとも1つを更に含む核酸発現構築物である。
【0018】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1のポリヌクレオチドセグメントは第2のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されており、第1および第2のポリヌクレオチドセグメントはプロモーター配列少なくとも1つの単一のプロモーター配列の転写制御下にある。
【0019】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1および第2のポリヌクレオチドセグメントの間に介在したリンカー配列を更に含む核酸構築物である。
【0020】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、リンカー配列はIRESおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される。
【0021】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、プロモーター少なくとも1つは真核細胞において機能する。
【0022】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、プロモーター少なくとも1つは構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される。
【0023】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、(c)第1のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図した第1のプロモーター配列;および(d)第2のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図した第2のプロモーター配列を更に含む核酸発現構築物である。
【0024】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1のプロモーターおよび第2のプロモーターは各々構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される。
【0025】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1のプロモーターおよび第2のプロモーターからの発現が1つのエフェクターにより調節可能である。
【0026】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、マーカーポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つを更に含む核酸発現構築物である。
【0027】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、マーカーポリペプチドは選択ポリペプチドおよびレポーターポリペプチドよりなる群から選択される。
【0028】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つは第1および第2のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも1つに転写可能に連結されている。
【0029】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つはリンカーセグメントを介して第1および第2のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも1つに転写可能に連結されている。
【0030】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、リンカー配列はIRESおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される。
【0031】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つは第1および第2のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも1つに翻訳可能に融合している。
【0032】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成増殖因子はVEGF、酸性または塩基性のFGF、PlGF、レプチンおよびHGFよりなる群から選択される。
【0033】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成成熟因子はアンジオポエチン−1、Tie−2、TGF−β1、TGF−β受容体−2、エンドグリン、Smad5、VE‐Cアドヘリン、エフリンB2、PDGF、BmxチロシンキナーゼおよびMCP−1よりなる群から選択される。
【0034】
本発明の更に別の特徴によれば、(a)血管形成増殖因子をコードする第1のポリヌクレオチドセグメント;および(b)血管形成成熟因子をコードする第2のポリヌクレオチドセグメントを含む核酸発現構築物を包含する遺伝子的に形質転換された細胞が提供される。
【0035】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、形質転換された細胞は内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球および線維芽細胞よりなる群から選択される。
【0036】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、形質転換された細胞は静脈または動脈のセグメント、骨髄細胞、末梢血液原種細胞、前駆細胞、循環内皮細胞および胚性幹細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである。
【0037】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、形質転換された細胞はヒトドナーおよび動物原材料よりなる群から選択される原材料に由来するものである。
【0038】
本発明の更に別の特徴によれば、血管形成増殖因子少なくとも1つおよび血管形成成熟因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された細胞集団が提供される。
【0039】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、細胞集団は内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球、線維芽細胞および骨髄由来細胞よりなる群から選択される細胞型少なくとも2つを含む。
【0040】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、細胞型少なくとも2つのうちの第1の細胞型は血管形成増殖生育因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換され、細胞型少なくとも2つのうちの第2の細胞型は血管形成成熟因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換される。
【0041】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1の細胞型は内皮細胞であり、第2の細胞型は平滑筋細胞である。
【0042】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、内皮細胞および平滑筋細胞は各々血管セグメントに由来のものである。
【0043】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成増殖因子少なくとも1つおよび血管形成成熟因子少なくとも1つの各々の発現は独立して調節可能である。
【0044】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成増殖因子少なくとも1つはVEGF、酸性または塩基性のFGF、PlGF、レプチンおよびHGFよりなる群から選択される。
【0045】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成成熟因子少なくとも1つはアンジオポエチン−1、Tie−2、TGF−β1、TGF−β受容体−2、エンドグリン、Smad5、VE‐Cアドヘリン、エフリンB2、PDGF、BmxチロシンキナーゼおよびMCP−1よりなる群から選択される。
【0046】
本発明の更に別の特徴によれば、個体の組織領域における新しい血管の形成を誘発する方法が提供され、該方法は、(a)哺乳類の組織領域内に血管形成増殖因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された第1の細胞型を投与すること;および(b)哺乳類の組織領域内に血管形成成熟因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された第2の細胞型を投与すること、の工程を含む。
【0047】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、組織領域は血管、虚血筋肉組織またはバイパス移植片の閉塞または狭窄したセグメントを含む。
【0048】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、バイパス移植片は合成移植片または動脈または静脈の組織に由来するものである。
【0049】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1および第2の細胞型は個体に由来するものである。
【0050】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1および第2の細胞型は各々、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球、線維芽細胞および骨髄幹細胞よりなる群から選択される。
【0051】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、方法は閉塞した血管セグメントをバイパスするか貫通させるため、または、虚血領域への副行血流を確立するために利用する。
【0052】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1および第2の細胞型を個体の組織領域に同時投与する。
【0053】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1の細胞型からの血管形成増殖因子少なくとも1つの発現は第1の因子により調節可能であり、第2の細胞型からの血管形成成熟因子少なくとも1つの発現は第2の因子により調節可能である。
【0054】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1および第2の因子は血管形成増殖因子少なくとも1つの発現をダウンレギュレートすることができ、そして、血管形成成熟因子少なくとも1つの発現をアップレギュレートすることができる単一の因子である。
【0055】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、工程(b)は工程(a)の後、少なくとも12時間経過後に行なう。
【0056】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第1の細胞型および第2の細胞型は単一の細胞型である。
【0057】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、活性成分として上記した核酸構築物、またはこれにより発現された蛋白および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物が提供される。
【0058】
本発明は、核酸構築物、これにより形質転換された細胞、および、哺乳類組織中の血管形成を誘発するためにこのような形質転換細胞を利用する方法を提供することにより、現時点で知られている構成の難点に良好に対処する。
【0059】
図面の簡単な説明
本発明は本明細書においては例示のみを目的として添付図面を参照しながら説明している。特定の参照例をここでは図面にて詳述するが、記載した特定のものは例示のため、そして、本発明の好ましい実施態様を説明的に論じるためのものであり、本発明の原理と概念的特徴の最も有用で容易に理解できる説明であると考えられるものを与えるために示している。この点に関し、本発明の基礎的理解のために必要である以上に詳細には本発明の構造的詳細を示すことは試みてはおらず、図面と組合せた説明は、本発明の幾つかの形態をどのようにして実際に実施するかを当業者に対して明らかにするものである。
図1は本発明によるVEGF発現ベクター構築物を示す。
図2は本発明によるAng−1発現ベクターを示す。
図3a−bはVEGF−LacZ(3a)またはVEGF−GFP(3b)発現構築物で形質転換された培養ECを示す。
図4a−cは閉塞した血管(図4a)、このような閉塞を治療するための従来技術のバイパス法(図4b)および本発明による閉塞血管を貫通またはバイパスする方法(図4c)を示す。
図5aは人工的に遮蔽しVEGF165を発現する組み換えアデノウィルスベクターを注入することにより再開通させたラット後肢動脈枝における閉塞部位と流動の測定を示す。
図5bはVEGF165アデノウィルスベクターまたは生理食塩水(対照)の注射後3、7および14日のラット大腿動脈中の血流を示すグラフである。数値は平均±S.D.,であり、各時点においてn=5である。
図6a−dはrAdAng1−GFPを感染させたECまたはSMC(それぞれ図6a−bおよび6c−d)を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡(それぞれ図6a−cおよび6b−d)写真である。
図7a−dはレトロAng1−GFPを感染させたECまたはSMC(それぞれ図7a−bおよび7c−d)を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡(それぞれ図7a−cおよび7b−d)写真である。
図8a−bはアデノウィルス感染後48時間のECおよびSMC(それぞれ図8aおよび8b)におけるAng−1 mRNAの発現を示す写真である。図8aのレーン:1−対照非感染EC、2−rAdAng1感染EC、3−rAdGFP感染EC、4−逆転写反応の陰性対照、5−プラスミドAng−1DNAの陽性対照。図8bのレーン:1−Ang−1コードプラスミドDNA、2−PCR反応の陰性対照、3−RT反応の陰性対照、4−rAdGFP感染SMC、5−rAdAng1感染SMC、6−対照非感染SMC。総RNAはアデノウィルスベクター注入後のECおよびSMCから抽出し、RT−PCR分析は以下に示す実施例の項において記載する通り実施した。試料はβ−アクチンmRNAのRT−PCR増幅により規格化した。
図9a−bはレトロウィルス形質導入後48時間のECおよびSMC(それぞれ図9aおよび9b)におけるAng−1 mRNAの発現を示す写真である。図9aのレーン:1−対照非形質導入EC、2−レトロGFP形質導入EC、3−レトロAng1形質導入EC、4−RT反応の陰性対照、5−陽性対照Ang‐1DNAコードプラスミド。図9bのレーン:1−陽性対照Ang−1DNAコードプラスミド、2−PCR反応の陰性対照、3−逆転写反応の陰性対照、4−レトロGFP形質導入SMC、5−レトロAng1形質導入SMC、6−対照非感染SMC。総RNAはレトロウィルスベクターによる形質導入後のECおよびSMCから抽出し、RT−PCR分析は以下に示す実施例の項において記載する通り実施した。試料はβ−アクチンmRNAのRT−PCR増幅により規格化した。
図10はアデノウィルス感染ECおよびSMCにおけるAng‐1蛋白の発現を示す写真である。レーン:1−対照非感染細胞、2−rAdGFP感染細胞、3−rAdUP50幹線細胞、4−rAdAng1感染細胞、C−陽性対照Ang−1組み換え蛋白。
図11はレトロウィルス形質導入ECおよびSMCにおけるAng‐1蛋白の発現を示す写真である。レーン:1−非形質導入EC、2−レトロGFP形質導入EC、3−レトロAng1形質導入EC、4−非形質導入SMC、5−レトロGFP形質導入SMC、6−レトロAng1形質導入SMC、7−Ang1陽性対照。
図12a−bはAng−1を過剰発現するアデノウィルス感染ECとVEGF165を過剰発現するECとの同時培養物におけるAng−1およびVEGF165蛋白の発現(それぞれ図12aおよび12b)のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。レーン:1−rAdVEGF感染EC+rAdAng1感染EC、2−rAdGFP感染EC+rAdAng1感染EC、3−rAdVEGF感染EC+rAdGFP感染EC、4−Ang−1を安定して過剰発現する陽性対照293FLYA細胞。
図13a−bはAng−1を過剰発現するアデノウィルス感染ECとVEGF165を過剰発現するSMCとの同時培養物におけるVEGF165およびAng−1蛋白の発現(それぞれ図13aおよび13b)のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。レーン:1−rAdVEGF感染EC+rAdAng1感染SMC、2−rAdGFP感染EC+rAdGFP感染SMC、3−Ang−1を安定して過剰発現する陽性対照293FLYA細胞。
図14はAng‐1過剰発現rAdAng1−GFP感染ECの正常な増殖を示すヒストグラムである。細胞はrAdAng1−GFP(AdAng1)、rAdVEGF−GFP(AdVEGF)、rAdGFP(AdGFP)で感染させたか、または非感染(対照)である。結果は感染後第7日における増殖を示す。
図15a−bはrAdAng1感染ECにおけるTie2受容体の増強されたリン酸化を示す写真である。rAdAng1‐GFP、rAdGFPまたはrAdVEGF−GFPに感染させたECの蛋白分解物をTie2のリン酸化を抗ホスホチロシン抗体による予備免疫沈降を行わない場合、および行った場合についてウエスタンブロットにより分析した(それぞれ図15aおよび15b)。レーン:1−非感染EC、2−rAdGFP感染EC、3−rAdAng1−GFP感染EC、4−rAdVEGF−GFP感染EC、5−陰性対照293細胞(図15aのみ)。
図16a−hはアデノウィルス感染ECを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの3次元in vitro血管形成新芽形成を示す顕微鏡写真である。パネルはrAdGFP感染EC(図16a−b)、同時培養rAdGFP+rAdVEGF感染EC(図16c−d)、同時培養rAdAng1‐GFP+rAdGFP感染EC(図16e−f)および同時培養rAdAng1−GFP+rAdVEGF−GFP感染EC(図16g‐h)を示す。2つの代表的な96時間試験の結果を示す。
図17a−dはアデノウィルス感染ECおよびレトロウィルス形質導入SMCを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの3次元in vitro血管形成新芽形成を示す蛍光顕微鏡写真である。パネルは同時培養rAdGFP感染EC+レトロGFP形質導入SMC(図17a)、rAdVEGF−GFP感染EC+レトロVEGF−GFP形質導入SMC(図17b)、rAdGFP感染EC+レトロAng1−GFP形質導入SMC(図17c)、rAdVEGF−GFP感染EC+レトロAng1−GFP形質導入SMC(図17d)。内皮細胞およびSMCはそれぞれ赤および緑の蛍光で示す。各実験群の代表的な48時間試験を示す。
図18a−hは血清枯渇条件下における血管形成分化増殖因子を過剰発現するウィルスで形質転換された血管細胞の同時培養物の生存性を示す蛍光顕微鏡写真である。パネルは以下の通り:rAdGFP感染SMC(図18a)、rAdAng1−GFP感染SMC(図18b)、rAdGFP感染EC(図18c)、rAdVEGF−GFP感染EC(図18d)、同時培養rAdGFP感染SMC+rAdGFP感染EC(図18e)、同時培養rAdGFP感染SMC+rAdVEGF−GFP感染EC(図18f)、同時培養rAdAng1‐GFP感染SMC+rAdGFP感染EC(図18g)および同時培養rAdAng1‐GFP感染SMC+rAdVEGF−GFP感染EC(図18h)。
図19a−hは血清枯渇24時間後のAng−1を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたTUNEL−染色ECの増強された生存性を示す光学顕微鏡写真(図19a、19c、19eおよび19g)および蛍光顕微鏡写真(図19b、19d、19fおよび19h)である。添加血清の存在下および非存在下(それぞれ図19a−bおよび19c−d)で培養した非形質導入ECおよび添加血清の存在下および非存在下(それぞれ図19e−fおよび19g−h)で培養したレトロAng1−GFP形質導入ECを示す無作為の視野を示した。アポトーシス細胞は緑色の蛍光で示す。
図20はAng−1を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたECにおけるアポトーシス率を示すヒストグラムである。結果は前の図に示したTUNEL試験のデータの定量値を示す。実験群は以下の通り:添加血清の存在下または非存在下[それぞれ血清(+)または血清(−)]で培養した非形質導入EC、レトロAng1‐GFP形質導入EC。結果は6つの無作為に選んだ顕微鏡視野において計数した総細胞集団中のアポトーシス細胞の比率を示す。
【0060】
好ましい実施例の態様
本発明は核酸構築物、それにより形質転換された血管細胞であり、これらは血管形成を誘発するために利用することができる。特に本発明は閉塞、傷害または虚血の状態の哺乳類組織をバイパスする、または、貫通することの可能な新しい血管の形成を誘発するために利用することができる。
【0061】
本発明の原理および作用は図面および附属の説明を参照することによりより良好に理解される。
【0062】
本発明の少なくとも1つの実施態様を詳細に説明する前に理解しておくべきことは、本発明は、以下の説明に記載した、または図面に示した要素の構築および配置の詳細への適用に限定されないことである。本発明は他の実施態様も可能であり、種々の方法で実施することができる。更にまた、本明細書において使用する表現や用語は説明を目的としたものであり、限定的な意味を有さない。
【0063】
血管形成を誘発および調節するための従来技術の非外科的方法は血管の閉鎖、障害または虚血の治療において既に一般的な慣行になっている。
【0064】
このような方法には使用する血管形成因子の種類および/または慣行されている投与方法に固有の制約がある。
【0065】
従来技術の方法に固有の制約を克服するために、本発明は血管組織の生成を促進するための新しい方法を提案するものであり、その方法は個体の治療すべき部位にVEGFおよびAng−1を含む血管形成因子2種以上を提供することにより行うことができる。好ましくは、提供される血管形成因子は治療部位に投与されたex−vivo形質転換内皮細胞および平滑筋細胞により発現され、分泌される。
【0066】
即ち、本発明の1つの特徴によれば、VEGF(GenBank受託番号AB021221)、HGF(GenBank受託番号D14012)、PlGF[28](GenBank受託番号X54936)、VEGF−C[30](GenBank受託番号NM005429)、bFGF[31](GenBank受託番号J04513)、aFGF(GenBank受託番号S67291)、レプチン[32](GenBank受託番号XM045426)または内皮細胞の増殖および移行をもたらす他の因子のような、ただしこれらに限定されない、血管形成増殖因子をコードする第1のポリヌクレオチドセグメント;および、アンジオポエチン−1、TGF−βファミリー(TGF−β1、TGF−β受容体−2、エンドグリン、Smad5)[33]、VE‐Cアドヘリン[34]、エフリンB2[35]、PDGF[36]、Bmxチロシンキナーゼ[37]、MCP−1[38]または血管の成熟および安定化をもたらす他の因子のような、ただしこれらに限定されない、血管形成成熟因子をコードする第2のポリヌクレオチドセグメントを含む核酸発現構築物が提供される。
【0067】
本発明のこの特徴の1つの好ましい実施態様によれば、血管形成増殖因子および血管形成成熟因子は核酸構築物に含まれる単一のプロモーター配列から発現される。
【0068】
種々の構築物スキームを利用することにより単一のプロモーター配列からの第1および第2のポリヌクレオチドセグメントの同時発現を行なうことができる。
【0069】
例えば、第1および第2のポリヌクレオチドセグメントをIRES配列の下流のポリヌクレオチドセグメントの翻訳を可能とする内部リボソームエントリー部位(IRES)配列を含むリンカー配列を介して転写可能に融合することができる。この場合、血管形成増殖因子および血管形成成熟因子の双方のコード配列を含む転写されたポリシストロニックRNA分子を5’キャップ末端およびポリシストロニックRNA分子の内部IRES配列の両方から翻訳することにより血管形成増殖因子および血管形成成熟因子の両方を生成することができる。
【0070】
或いは、第1および第2のポリヌクレオチドセグメントは核酸構築物で形質転換すべき細胞により発現されるプロテアーゼにより切断することができるプロテアーゼ認識部位を介して翻訳可能に融合することができる。この場合、翻訳されたキメラポリペプチドは細胞が発現したプロテアーゼにより分解され、これにより血管形成増殖因子と血管形成成熟因子の両方が生成される。
【0071】
本発明のこの特徴の別の好ましい実施態様によれば、血管形成増殖因子と血管形成成熟因子がおのおの個別に専用のプロモーター配列から転写されるように、核酸構築物は2つの同じか異なるプロモーター配列を含む。
【0072】
血管形成増殖因子および血管形成成熟因子の発現には2つの個別の核酸構築物が関与すると考えなければならない。
【0073】
即ち、本発明の別の特徴によれば、核酸構築物系が提供される。この場合、血管形成増殖因子をコードする第1のポリヌクレオチドセグメントは第1のプロモーター配列を介して第1の核酸構築物から発現され、血管形成成熟因子をコードする第2のポリヌクレオチドセグメントは第1のプロモーター配列と異なるか同じであることができる第2のプロモーター配列を介して第2の核酸構築物から発現される。
【0074】
以下に更に説明する通り、本発明の核酸構築物は、例えば内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球、線維芽細胞、胚性幹細胞または骨髄幹細胞のような哺乳類細胞を形質転換するために利用される。この点において、本発明の核酸構築物により利用されるプロモーター配列は好ましくは上記哺乳類細胞型において機能可能な構成的、組織特異的または調節可能な(例えば誘導可能な)プロモーターである。
【0075】
本発明の核酸構築物を生成するためには、血管形成増殖生育因子および/または血管形成成熟因子をコードするポリヌクレオチドセグメントを哺乳類細胞の形質転換に適し、形質転換細胞内部での上記因子の発現を意図した市販の発現ベクター系に連結することができる。このような市販のベクター系は一般的に用いられている組み換え技術により容易に修飾することができ、これにより、既存のプロモーターまたはエンハンサーの配列を置き換え、複製または突然変異させることができ、そして/または、例えば別の選択マーカーをコードする配列またはレポーターポリペプチドをコードする配列のような更に別のポリヌクレオチド配列を導入することができる。
【0076】
本発明の使用に適する哺乳類の発現ベクターは、例えば、Invitrogenより入手可能なpcDNA3、pcDNA3.1(+/−)、pZeoSV2(+/−)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、Promegaより入手可能なpCI、Stratageneより入手可能なpBK−RSVおよびpBK−CMV、Clontechより入手可能なpTRESおよびこれらの誘導体であるが、これらに限定されない。
【0077】
本発明によれば、血管形成増殖因子および血管形成成熟因子を虚血組織領域に提供することによりその内部に血管形成を誘発する。
【0078】
in vivoの遺伝子転移に関わる安全性の問題を回避するため、そして、新しい血管の形成を増強するために、血管形成因子は好ましくは採取され、ex−vivoで形質転換された血管細胞から得る。
【0079】
このような形質転換細胞は例えばBoston Scientific (USA)により製造された灌流カテーテルと原理的に同様の特別に設計されたデリバリーカテーテルを用いて治療すべき組織領域の内部または周囲に細胞を直接注入することにより、新しい血管の形成の誘発のために利用することができる。
【0080】
即ち、本発明の別の特徴によれば、血管形成増殖因子少なくとも1つおよび血管形成成熟因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された細胞の集団が提供される。
【0081】
細胞の採取後の異種の組織のin vivoの形質転換も本発明で用いることができるが、好ましくは細胞はex−vivoで形質転換する。
【0082】
本明細書においては、「遺伝子的に形質転換された」とう表現は外来のポリヌクレオチド配列で一過性に、または、安定して形質転換された細胞を指す。安定な形質転換においては、外来のポリヌクレオチド配列は細胞のゲノムに組み込まれ、そのまま娘細胞に遺伝子的に受け継がれるが、一過性の形質転換の場合は、外来のポリヌクレオチド配列は核または原形質の分子として一過性に存在し、そのまま娘細胞に遺伝子的に受け継がれるわけではない。
【0083】
本発明の核酸構築物は如何なる標準的な哺乳類形質転換方法により細胞集団に導入することもできる。このような方法としては、限定はされないが、例えば直接DNA取りこみ法およびウィルスまたはリポソーム媒介形質転換が挙げられる(詳細は例えばMethods in Enzymology, Vol.1−317, Academic Press参照)。
【0084】
本発明のこの特徴によれば、細胞集団は1種以上の細胞型を含む。血管の生成と成熟は数種の血管形成因子を発現する幾つかの細胞型が関与する段階的な過程であるため、本発明の細胞集団は好ましくは2種の異なる血管細胞型を含むものであり;第1の細胞型は例えば内皮細胞であり、そして第2の細胞型は例えば平滑筋細胞、周皮細胞または筋細胞である。
【0085】
好ましくは、細胞集団の各々の細胞型は特定の血管形成因子を発現する。例えば、第1の細胞型は血管形成増殖因子を発現するための核酸で形質転換され、第2の細胞型は血管形成成熟因子を発現するための核酸で形質転換される。
【0086】
しかしながら、血管形成増殖因子および血管形成成熟因子が両方の細胞型から発現される細胞集団、または、一方の細胞型が両方の因子を発現し、他方の細胞型が1つのみの因子を発現する細胞集団もまた本発明に包含される。
【0087】
以下に更に詳述する通り、本発明の細胞集団は例えば組織領域への供給路である血管内の閉塞部をバイパスするかまたは貫通するために個体の組織領域に投与する。後の実施例の項で更に詳述する通り、このような投与は閉塞血管内部に直接行なうか、または、閉塞血管周囲の組織内に行なうことができる。
【0088】
この点に関し、細胞集団の細胞型は好ましくは治療すべき個体の静脈または動脈組織または骨髄組織、または、同系の個体の組織に由来するものである。異種の細胞も細胞集団の調製のために利用することができるが、ただし、治療された個体によるその細胞の拒絶を回避するために投与の前、または投与中に手段を講じなければならない。
【0089】
本発明の別の特徴によれば、個体の組織領域内の新しい血管の形成を誘発するための方法が提供される。
【0090】
新しい血管の発生は各細胞型およびより重要なものとして各血管形成因子のタイムリーな提供に依存しているため、本発明の方法は好ましくは治療すべき組織領域においてそのような条件を発生させるために最も適する態様で行なう。
【0091】
即ち、本発明の1つの好ましい実施態様によれば、血管形成は、個体の組織領域内部に血管形成増殖因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された第1の細胞型を投与すること、次いで、個体の組織領域に血管形成成熟因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された第2の細胞型を投与することにより行う。
【0092】
第1の細胞型は好ましくは第2の細胞型の投与より12時間〜2週間前に投与する。これにより、治療すべき組織への血管形成増殖因子および血管形成成熟因子のタイムリーな提供が確実になり、これにより血管形成のための最適条件が確保される。
【0093】
血管形成因子のタイムリーな提供はまたエフェクターにより調節可能なプロモーター配列から血管形成因子を発現する細胞型1種以上を投与することによっても行なうことができる。
【0094】
本明細書においては、「エフェクター」という用語または「調節因子」という表現は、このようなエフェクターにより調節されるプロモーター配列からのポリヌクレオチド配列の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることのできる分子または物理的条件(例えば光、生物力学的ストレスなど)を互換的に指すものとする。本発明で使用できる調節可能なプロモーターの例は、化学的に調節されるプロモーター、例えばAgha−Mohammadi S, Lotze MT. 調節可能な系:遺伝子治療およびウィルス複製への応用(Regulatable systems: Applications in gene therapy and replicating viruses). J.Clinical Investigations 2000; 105:1177−1183に記載のテトラサイクリン調節性プロモーター系および生物力学的に調節されるプロモーター、例えばResnick等、PNAS USA 90:4591−4595,1993に記載の剪断応力応答性エレメントを包含する。
【0095】
後の実施例の項で更に詳述する通り、1種以上の細胞型は調節可能なプロモーター配列から血管形成因子を発現する核酸構築物を用いて形質転換することができる。このようなプロモーターは、治療すべき組織領域への細胞型の投与の後に血管形成因子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートして新しい血管の形成を誘発するのに適する所望の一時的発現パターンが得られるように選択する。
【0096】
即ち、例えば、血管形成増殖因子の発現は第1の調節因子により調節することができ、そして、血管形成成熟因子の発現は第2の調節因子により調節することができる。
【0097】
このような調節因子は細胞の投与後の種々の時点で利用することができ、これにより血管形成因子の各々に対し異なる発現パターンを得ることができる。
【0098】
或いは、プロモーター配列は、血管形成成熟因子の発現がある因子によりアップレギュレートされ、血管形成増殖因子の発現が同じ因子によりダウンレギュレートされるように選択することもできる。即ち、この場合、単一の調節因子を用いて血管形成因子の各々に対し異なる発現パターンを得ることができる。
【0099】
調節可能なプロモーターはその調節が治療すべき組織領域への細胞の投与の後に起こることができるように選択しなければならない。即ち、血管形成の最中に発生する条件、例えば細胞対細胞の相互作用に関わる力により調節可能なプロモーター、または、治療すべき個体の組織領域または血流の何れかに安全に提供できる外部から投与された因子により調節されることのできるプロモーターが好ましい。
【0100】
即ち、本発明は虚血組織を治療するための新しい方法を提供する。血管の形成を促進しながら細胞の生存性を改善する因子を過剰発現するように遺伝子的に形質転換された血管細胞による虚血臓器への栄養供給を行なうことは従来技術が意図した遺伝子転移方法よりも合理的で安全な方法である。内皮細胞と平滑筋細胞の組み合わせ、および、それによる2種の異なる遺伝子の発現により、投与された細胞と漸増した細胞との間の協力が確保され、これにより血管の形成と維持が確保される。
【0101】
上記した血管形成増殖および成熟因子は投与された細胞から発現されるのが好ましいが、このような因子はまた、化学的に合成されるか、またはこのような因子を発現するトランスジェニックな原核細胞または真核細胞の宿主から抽出したポリペプチド調製品として投与することもできる。
【0102】
好ましくは、ポリペプチド調製品は医薬組成物の部分を構成する。このような医薬組成物はポリペプチド因子のターゲティングを安定化し増強する作用を有する製薬上許容しうる担体を含む。
【0103】
適当な担体の例としては生理食塩水、リポソーム、ミセル体、ウィルス粒子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0104】
本発明の医薬組成物は当該分野で知られる如何なる方法で投与することもできる。好ましくは、組成物は前述した通り投与すべき組織領域の内部または周囲に注入する。
【0105】
即ち、本発明は、新しい血管の形成または閉塞または狭窄した血管組織領域の再疎通を促進するために使用することができる方法を提供する。
【0106】
本発明はバイパス手術や血管形成術よりもかなり侵襲性が低いため、このような外科的処置に伴う危険性を回避することができる。
【0107】
本発明の更に別の目的、利点および新しい特徴は限定する意図のない後述する実施例を検討することにより当該技術者には自明のものである。更にまた、上記した、および、請求項に記載した、本発明の種々の実施態様および特徴の各々は後述する実施例において実験的に裏付けられる。
【0108】
実施例
以下の実施例と上記した説明を参照することにより、非限定的な態様で本発明を説明する。
【0109】
一般的に、本明細書において使用した名称および本発明において用いた実験手法は分子学、生物化学、微生物学および組み換えDNA技術を含む。このような技術は文献に十分記載されている。例えば“Molecular Cloning: A laboratory Manual”, Sambrook等、(1989); “Current Protocols in Molecular Biology”, Vol.I−III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausbel等、“Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley and Sons, New York (1988); Watson等、“Recombinant DNA”、Scientific American Books, New York; Birren等、(eds)、“Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1−4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 米国特許4666828号;4683202号;4801531号;5192659号および5272057号に記載の方法;“Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Vol.I−III Cellis, J.E., ed (1994); “Current Protocols in Immunology” Vol.I−III Coligan J.E., ed (1994); Stites等、(eds), “Basic and Clinical Immunology” (第8版), Appleton and Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W.H.Freeman and CO., New York (1980)を参照することができ、そして;使用できる免疫検査は特許および学術文献に詳述されており、例えば米国特許3791932号;3839153号;3850752号;3850578号;3853987号;3867517号;3879262号;3901654号;3935074号;3984533号;3996345号;4034074号;4098876号;4879219号;5011771号および5281521号を参照でき;“Oligonucleotide Synthesis”, Gait, M.J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization”, Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1984); “Animal Cell Cluture” Freshney, R.I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984)および“Methods in Enzymology” Vol.1−317, Academic Press; “PCR Protocols: A guide To Mehtods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak等、“Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996)が参照され;これらは全て、その内容全体が参考により本明細書に組み込まれる。その他の一般的な参考文献は本明細書を通じて示したものである。そこに記載される手法は当該技術者のよく知るものであるが、読者の便宜のために示されている。そこにふくまれる情報の全ては参考により本明細書に組み込まれる。
【0110】
実施例1
発現ベクターおよびウィルス粒子
前述した通り、本発明の実施態様は虚血、傷害または閉塞組織中の血管形成を誘発するためのVEGFおよびAng−1を発現する形質転換血管細胞を利用する。以下に示す実施例は血管細胞を採取し、コンディショニングし、そして、形質転換するための方法、および、血管形成を促進する際にそのような細胞を利用する方法を概説するものである。
【0111】
材料および方法
VEGF165−GFP遺伝子を発現するレトロウィルスベクターの調製:
図1は本発明のVEGF−GFP発現ベクター構築物を示す。ヒトVEGF165(GenBank受託番号AB021221)および/またはEGFP(Clontech, Ca, USA)遺伝子を発現する組み換えレトロウィルスをLXSNプラスミド(Clontech, CA, USA)に2つの異なるベクターを個別にクローニングすることにより構築した。GFPのみを発現するLXSN系レトロウィルスベクターの構築のために、内部リボソームエントリー部位(IRES)およびGFP遺伝子を含有するEcoRI−HpaI1400bpのフラグメントをLXSNプラスミドマルチクローニングサイト(MCS)の特異的制限部位に挿入した。VEGF165およびGFP遺伝子を同時発現するLXSN−VEGF−IRES−GFPビシストロニックプラスミド(図1)の構築のために、VEGF165(600bp)をコードする2.0kBのEcoRI−MunIフラグメントおよびIRESおよびEGFP配列をLXSNMCSのEcoRI部位に連結した。これらのLXSNベクターによるトランスジーンの発現はMoMULV長末端リピート(LTR)(Clontech, Ca, USA)により調節される。レトロウィルスベクター生成のために、LXSN−GFPまたはLXSN−VEGFーGFPプラスミドDNA10μgを293E3エコトロピックパッケージング細胞にトランスフェクトし、48時間インキュベートし、その後、G418(Gibco BRL, USA)耐性産生細胞の全面培養物の上澄みを採取し、濾過(0.45μm)し、PA317両栄養性パッケージング細胞に添加した。形質導入された細胞をG418選択に付し、培養上澄みを更に48時間培養後に採取し、ECの高い形質導入効率でGALVエンベロープを特徴的に発現し、そして、ヒト血清不活性化に対して耐性のTEFLYGA両栄養性パッケージング細胞を感染させるために用いた。形質導入されたTEFLYGA細胞のG418選択の後、個々のコロニーを採取し、GFPおよびVEGF165の発現があるかどうかスクリーニングした。各コロニーのウィルス価をTE671細胞形質導入により測定し、105〜106pfu/mLのウィルス価を得た。最も高いウィルス価を示したコロニーの上澄みを採取し、−80℃で保存した。
【0112】
上記した段階は実施例6に記載する通り、Ang−1発現ベクター構築物LXSN−Ang1−IRES−EGFP(図2)の構築に適用する。
【0113】
パッケージング細胞系統の調製:パッケージング細胞系統は知られた方法で調製した。パッケージング細胞系統の詳細な説明は以下の文献:「アヒルプラークウィルスヘマグルチニンのネズミ白血病ウィルス粒子への組込みおよび偽形レトロウィルスの感染性の分析」、T.Hatziioannou, S.Valsesia−Wittmann, S.J., RussellおよびF.−L.Cosset, 1998, Journal of Virology, 72:5313−5317、「レトロウィルスベクターの逆ターゲティング:造血細胞および非造血細胞の混合集団における選択的遺伝子転移」、A.K.Fielding, M.maurice, F.J.Morling, F.−L.CossetおよびS.J.Russell, 1998, Blood, 91:1802−1809、「融合誘発性テナガザル白血病ウィルスエンベロープ糖蛋白:リガンドディスプレーによる細胞毒性遺伝子のターゲティング」、Fielding AK, Chapel−Fernandes S., Chadwick MP, Bullough FJ, Cosset F−LおよびRussell SJ, Human Gene Therapy, 2000;11;817−826に記載されている。
【0114】
形質転換された細胞の調製:
自己内皮細胞の採取:ECは5cmの長さのヒト伏在静脈セグメントから採取する。細胞は以前に報告された通り[27]コラゲナーゼ消化により採取する。3〜9回継代培養した細胞を収集することにより細胞の特性の安定性を確保する。細胞の同定はvon Willebrand因子の免疫組織化学的試験により行なう。
【0115】
自己平滑筋細胞の採取:平滑筋細胞はヒト伏在静脈(HSVSMC)および内乳動脈(HLSMC)からの外植体発芽後成長により培養した。細胞は10%プールヒト血清(Beit Haemek, Israel)を添加したダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)(Biological industries, Israel)中で培養した。平滑筋細胞は抗筋アクチン抗体(Zymed, USA)を用いて同定した。
【0116】
VEGFコードベクターによる骨髄前駆細胞感染:骨髄前駆細胞をVEGF−GFPをコードする組み換えアデノウィルスベクターに感染させる。分化は感染細胞においてvon Willebrand因子の形態学的および免疫組織化学的試験により行なう。細胞の採取および新血管形成に関するin vitroの分化に関しては、Asahara T.等のEMBO J 1999;18:3964−72およびHuang XL, Takakura N, Suda T.のBiochem Biophys Res Commun 1999, 264:133を参照できる。
【0117】
レトロウィルスベクターによるヒトおよびヒツジの伏在静脈ECの形質導入:ECをフィブロネクチンコーティングプレート(Sigma,USA)に播種(105個/35mm皿)し、20%胎児血清を含有するM199(Gibco−BRL,USA)中で生育させた。24時間後、形質導入の1時間前に細胞をカチオン性重合体DEAR‐デキストラン(0.1μG/mL)に曝露し、PBSで3回洗浄し、次にVEGF−LacZまたはVEGF−GFP遺伝子の何れかをコードする高ウィルス価の組み換えウィルスベクターで形質導入した。4時間37℃ででインキュベートした後、ウィルス含有培地を20%プールヒト血清を含有する新しい培地と交換した。図3a−bはそれぞれLacZ活性またはGFP蛍光により示されたVEGF−LacZまたはVEGF−GFP構築物からのトランスジーンの発現を示している。
【0118】
投与後の遺伝子発現の調節:エフェクター調節可能な発現系を用いてECおよび/またはSMCにおけるVEGFとAng−1の遺伝子発現を調節する。例えば、VEGFの発現はテトラサイクリンを介してダウンレギュレートされるのに対し、Ang−1の発現はこれによりアップレギュレートされる。このような系を用いて、投与された細胞を細胞増殖を必要とする第1週においてVEGFを発現させ、細胞のin vivo移植後12時間〜2週間にテトラサイクリンをin vivo投与するとVEGFの発現がダウンレギュレートされ、Ang‐1の発現がアップレギュレートされて細胞の成熟が促進される(Agha−Mohammadi S, Lotze MT. 「調節可能な系:遺伝子治療の応用とウイルスの複製(Regulatable systems: applications in gene therapy and replicating viruses)」, J.Clinical Investigations 2000, 105:1177)。
【0119】
実施例2
形質転換された細胞の分析
組み換え蛋白発現の分析:遺伝子的に修飾された細胞の培養物から採取した上澄み中のVEGFおよびAng−1の量を測定する。ELISAおよびウエスタンブロット分析を用いて24時間の期間にわたるVEGFまたはAng−1の生産を測定した。ドナーへの形質転換細胞のin vivo再注入の後、採血してVEGFとAng‐1の濃度をELISA分析する。
【0120】
実施例3
動物実験
in vivo動物実験:実験動物の短静脈セグメント(ウサギまたはヒツジの後肢由来)を用いて内皮細胞を採取する。ECの代替の原材料は吸引により抽出した骨髄または循環している内皮細胞前駆体である。採取された細胞をVEGF存在下に生育させ、細胞の分化および/または増殖を増強させる。細胞を実験室内で増殖させ、VEGFおよびAng−1をコードする偽形のレトロウィルスベクターを用いて遺伝子的に修飾する。
【0121】
実験動物の各後肢の浅大腿動脈を深大腿動脈の分岐部直後で結紮する。血流をドップラーフローメーター(Transonic Animal Research Flowmeter, NY, USA)を用いて結紮の両側で測定する。流量測定後、種々の相対的発現量でVEGFとAng−1を発現する同種または異種の血管細胞の集団を投与四肢の1つ目に注入し、マーカーポリペプチドを発現する対照細胞集団またはPBSを2つ目の四肢に注入する。注入は深大腿動脈の近位に行なう。細胞の投与後3、7、14および30日に両方の四肢において流量を測定する。総大腿動脈における流量増大は血管形成が起こっていることを示す。
【0122】
in vivo形態学的変化の評価:in vivoの実験の後、造影剤を用いて得たデジタル化された血管造影図のコンピューター分析を用いて新しい血管の形成を評価する。対象となる組織の顕微鏡切片にマーカーポリペプチドの発現(例えばGFP)により同定される移植細胞が存在するかどうか調べる。新しく形成された血管の種類および成熟段階をその血管の形態(細胞型の存在、弾性膜の数など)に基づいて評価する。
【0123】
実施例4
治療方法
材料および方法:
3種類の方法を用いて閉塞血管の治療を行なうことができる(図4a)。図4bは単一の閉塞血管を治療するための従来技術のバイパス手術を示している。図4cは本発明の方法を用いて閉塞血管をバイパスするか、貫通させるための代替治療法を示している。
【0124】
図4cは閉塞血管内またはその周囲に血管形成増殖因子少なくとも1つおよび血管形成成熟因子少なくとも1つを発現する血管細胞を投与した結果としての閉塞組織中の血管形成を示している。このような投与により、10に示すとおり血管の再疎通が可能となるか、または、20に示すとおり閉塞部周囲のバイパスの形成が可能となる。
【0125】
30に特に示されるとおり、本発明の血管形成はまた閉塞血管から非閉塞血管を相互連絡する血管架橋の形成をもたらすことができ、これにより効果的に閉塞を回避でき、閉塞血管が供給路となっていた標的組織への血流を再樹立することができるのである。
【0126】
上記した代替法の何れの場合も、閉塞または傷害血管が供給路となっていた組織領域に血流の供給を再開するために利用することができる。更にまた、本発明の方法は以前にバイパス手術または血管形成術により治療されていた血管の場合にも血流の再開のために利用することができる。
【0127】
実施例5
VEGFを過剰発現するように遺伝子的に修飾されたECにより誘発されたin vivoの血管形成
本発明の方法は最適な新血管形成を誘発するように遺伝子的に修飾されたECの投与により閉塞血管疾患を治療するように考案されている。従って、本発明の方法を適用する事により閉塞血管への血流の再開を以下の通り行なった。
【0128】
体重400〜450gの雄性または雌性のSprague−Dollyラット(Harlan, Israel)をケタミンまたはキシラジンを用いて麻酔した。これらのラットの大腿動脈を大貫通動脈の遠位に外科的に結紮した。次にラットにVEGF165をコードする組み換えアデノウィルスベクター(109pfu)、GFPをコードする組み換えアデノウィルスベクター(109pfu)または通常の生理食塩水を注入した。注入は結紮したセグメントの近位の大腿動脈の側枝に直接行なった(図5a)。大腿動脈中の血流はドプラーフローメーターを用いて注入後3、7および14日に測定した。VEGFを発現する組み換えアデノウィルスベクターを投与したラットにおいて測定した血流はGFPをコードする組み換えアデノウィルスベクターまたは生理食塩水を注入したラットで測定したものよりも有意に高値であった(図5b参照)。注入後のVEGFの局所的発現は筋肉組織抽出液のRT−PCRにより、そして、ELISAによる血漿中のVEGFの量を測定することにより確認した(データは示さず)。
【0129】
従って、これらの結果は、前血管形成因子を過剰発現するように遺伝子的に修飾されたECを用いて閉塞血管の新血管形成を誘発することによる閉塞血管疾患の治療における本発明の方法の有効性を示している。本発明の遺伝子的に修飾された細胞はまた虚血臓器内に投与することもでき、これにより有害である可能性のあるウィルスベクターの血流中への注入の必要性を回避でき、かつ、生存性の高い活性化された血管細胞を虚血臓器に供給することができるのである[40]。
【0130】
実施例6
ウィルスベクターで遺伝子的に修飾されたECおよびSMCにおける血管形成分化因子Ang‐1の発現
理想的には、閉塞血管疾患のような血管疾患の治療は血管の不全をバイパスするかまたは軽減するような新しい血管の形成により行なうことができる。しかしながら、従来技術の方法を用いたin vivoの新血管形成過程の誘発は解決されていない問題点をなお有している。本発明の方法は血管の生来の生育の間の血管細胞により使用される複数の前血管形成刺激の利用を介してこのような新血管形成を誘発するように考案されている。このような前血管形成刺激は前血管形成分化因子Ang−1およびEC生育因子VEGFにより与えられる。即ちこのような因子を発現する血管細胞は、これらが前駆細胞からの血管組織の分化およびその後の生育の双方を誘発し、これにより必要な治療用の血管の形成を可能にすることから、理想的な治療様式である。
【0131】
従って、閉塞性の血管疾患の治療のための血管細胞における前血管形成因子の発現を起こすために、以下に記載の通りAng‐1およびVEGFの発現のためのウィルスベクターを構築し、ECおよびSMC中での発現を行なった。
【0132】
材料および方法:
ヒトSMCからのAng‐1cDNAのクローニング:ヒトAng‐1cDNA(GenBank受託番号U83508のヌクレオチド座標310〜1806)をヒト伏在静脈SMCから抽出した総RNAからAMV逆転写酵素(RT)(Promega, USA)を用いて逆転写した。簡単に説明すると、RNA2μgをランダムヘキサマー500ngと混合し、混合物を10分間70℃で加熱し、氷冷した。この予備加熱したRNAに0.5mM dNTP、AMV−RT5単位、5mM DTT、RNAase out (Gibco−BRL, USA)32単位および1 x Promega RT緩衝液を含有する反応混合物を添加した。得られた混合物を2時間38℃で、次いで15分間95℃でインキュベートした。
【0133】
前段階のcDNA産物をExpand High Fidelity PCR System(Roche, Switzerland)を用いてPCR増幅した。増幅には以下のプライマー:5’−AGATCTTCAAAAATCTAAAGGTCGAAT−3’(配列番号1)および5’−AGATCTGCTGGCAGTACAATGACAGTT−3’(配列番号2)を用いた(下線部の配列はクローニングに用いたBglII切断部位を示す)。PCRはRT反応混合物cDNA産物テンプレート7μL、各プライマー20pmol、dNTP 5nmole、1U Ex−Taq DNAポリメラーゼ(Takara,Japan)および製造元の提供したPCR反応緩衝液を含有する容量20μL中で行なった。PCR反応は以下の通り、即ち:94℃/2’→10x:[94℃/30”→50℃/30”→72℃/1’]→24x:[94℃/30”→56℃/30→72℃/(60”+5”/サイクル)]→72℃/10’で行なった。1500bpのヒトAng−1cDNA(GenBank受託番号U83508のヌクレオチド座標310〜1806)をpGEMT−easyベクター(Promega)内にサブクローニングした。PCR産物の鎖2本とも配列決定したところ、報告されている配列と100%同一であった。
【0134】
組み換えベクターの作成
Ang‐1遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターの作成:ヒトAng−1遺伝子の発現のための組み換えアデノウィルスベクターを、通常の原核細胞クローニングおよび293細胞系統における相同組み換え法よりなる数段階で構築した。ヒトAng−1cDNAを含む1500bpのフラグメントを構成的CMV即時型プロモーターの制御下にpCA3プラスミド内に挿入した。得られたプラスミドをアデノウィルスE1遺伝子を構成的に発現する293細胞内にプラスミドpJM17を用いてコトランスフェクトした。プラスミドpJM17は、E3領域を除いた、そして、ウィルスのE1領域のインサート(pBRX)を含む、アデノウィルスゲノムを含んでいる。トランスフェクト後のAng‐1をコードするpCA3とpJM17との間の相同組み換えによりpJM17のE1領域とpCA3由来のCMV−Ang−1発現カセットとが入れ替わる。コトランスフェクションの2〜4週間後にプラークの形成が起こり、その後、各プラークを単離し、ウィルス抽出液をそこから293細胞感染により増幅させた。各ウィルス保存溶液のウィルス価は293細胞におけるプラーク試験により測定し、ウィルス価〜1011pfu/mLが得られた。
【0135】
形質転換細胞の生育培地中のAng−1蛋白の発現は、ウエスタンブロット分析により確認した。
【0136】
Ang‐1およびGFP遺伝子の両方をコードする組み換えアデノウィルスベクターの作成:ヒトAng‐1およびGFP遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターrAdAng1‐GFPをAdEasyプロトコールの変法を用いて構築した(He TC.等、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95:2509)。簡単に説明すると、CMVプロモーターの制御下に発現するためにpAdTrack−CMVシャトルベクターのBglII部位にヒトAng−1cDNAの1500bpBglIIフラグメントを挿入した。このシャトルベクターは第2のCMVプロモーターの制御下のトランスジーンの下流にGFP遺伝子をコードしている。Ang−1‐GFPコードシャトルベクターをPmeI消化により線状化し、Qiaquick Gel Extraciton Kit (Qiagen, Germany)で精製した。コンピテントなBJ5183細胞をエレクトロポレーションにより、線状化したAng−1−およびGFP−コードシャトルベクターおよびアデノウィルスベクターpAdEasy−1で共形質転換した。Ang‐1およびGFP遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターを発現する形質転換体をPCR分析および制限酵素マッピングにより同定した。組み換えアデノウィルスベクターをPacI消化により線状化し、精製し、リポフェクタミン2000(Gibco BRL, USA)を用いて293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後7日に、細胞障害作用が起こり、この時点で細胞の100%がGFPを発現した。細胞を採取し、ウィルス抽出液を調製し、ウィルス抽出液で293細胞を感染させる事によりウィルス生産を更に増幅した。ウィルス保存溶液のウィルス価を293細胞の連続希釈試験により測定し、〜1011pfu/mLのウイルス価を得た。トランスジーンの発現は感染細胞コンディショニング培地のウエスタンブロット分析により確認した。
【0137】
レトロウィルス発現ベクターにおけるAng−1遺伝子のクローニング:レトロウィルスプラスミドベクターpLXSN(#K1060−B、Clontech、USA)のBamHI部位に1500bpのヒトAng−1BglIIcDNAフラグメントをクローニングすることによりMo−MULV5’長末端リピート(LTR)の調節制御下にヒトAng−1遺伝子を発現する組み換えレトロウィルスベクターpLXSN−Ang−1を構築した。
【0138】
Mo−MULV5’長末端リピート(LTR)の調節制御下にヒトAng−1およびEGFP遺伝子の両方をコードする組み換えビシストロニック性のレトロウィルスベクターを、以下に記載の通り、2段階の工程においてpLXSNレトロウィルスプラスミドに上記遺伝子をクローニングすることにより構築した。第1に、pIRES2−EGFP(#6029−1,Clontech)から切り出した内部リボソームエントリー部位(IRES)−EGFP EcoRI−HpaIフラグメント(1400bp)を、対照プラスミドpLXSN−IRES−EGFPの構築のためにpLXSNのEcoRI−HpaI内に挿入した。第2段階において、pLXSN−IRES−EGFPのEcoRI部位にヒトAng−1の1361pbのEcoRIフラグメントをクローニングすることによりpLXSN−Ang−1−IRES−EGFPを構築した。
【0139】
ヒトAng−1遺伝子の発現のための偽形レトロウィルスの作成:レトロウィルスベクターの生成のために、pLXSN−IRES−EGFP、pLXSN−Ang−1−IRES−EGFPまたはpLXSN−Ang−1レトロウィルスベクタープラスミド10μgをリポフェクチン(Gibco BRL, USA)を用いて293FLYAパッケージング細胞内にトランスフェクトした。48時間後、ウィルス産生細胞の全面培養物の上澄みを採取し、0.45μmで濾過し、293FLY10Aまたは293FLYGALV両栄養性パッケージング細胞に添加した。形質導入された細胞をG418選択に付し、個々のコロニーを採取し、蛍光顕微鏡観察によりEGFP発現があるものをスクリーニングし、そして、形質導入細胞コンディショニング培地試料のウエスタンブロット分析によりAng−1発現を確認した。TE671細胞の形質導入により測定したウィルス価は105〜106pfu/mLの範囲であることがわかった。最も高いウィルス価を有するコロニーの上澄みを採取し、−80℃で凍結した。
【0140】
遺伝子移転後のトランスジーン発現の確認:
細胞培養:ヒト伏在静脈EC(HSVEC)を単離し、20%プールヒト血清、2mMのL−グルタミン(Biological Industries, Israel)、100単位/mLのペニシリン、0.1mg/mLストレプトマイシン(Biological Industries, Israel)、100μg/mLヘパリン(Sigma, USA)および2ng/mLbFGF(Haifa, IsraelのTechnion InstituteのNeufeld博士より寄贈)を添加したM199培地(Gibco BRL, USA)を含有する完全培地中、ゼラチンコーティングデイッシュ上で培養した。ヒトECはvon Willebrand因子抗体(Zymed, USA)の免疫組織化学的分析により同定した。平滑筋細胞はヒト伏在静脈SMC(HSVSMC)およびヒト左内乳動脈SMC(HLSMC)からの外植体発芽後成長により培養した。細胞は10%ヒト血清、2mMのL−グルタミン、100単位/mLのペニシリン、0.1mg/mLストレプトマイシンおよび2ng/mLbFGFを添加したダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)(Gibco BRL, USA)中で培養した。平滑筋細胞は抗平滑筋α−アクチン抗体(Zymed, USA)を用いた免疫組織化学的分析により同定した。
【0141】
パッケージング細胞系統293−FLYA、293−FLY10A、293−FLYGALVおよびTEFLYGA(Dr.F.L.Cosset−Lion, Franceより入手)を10%FCS(Biological Industries, Israel)、2mMのL−グルタミン、100単位/mLのペニシリン、0.1mg/mLストレプトマイシン、6μg/mLブラスチシジン(Sigma, USA)および6μg/mLフレオマイシン(Sigma, USA)を添加したDMEM中で生育させた。
【0142】
パッケージング細胞系統PA317、293E3(JerusalemのDr.J.Exelrodより入手)を10%FCS、2mMのL−グルタミン、100単位/mLのペニシリンおよび0.1mg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM中で生育させた。
【0143】
組み換えアデノウィルスベクターによるECおよびSMCの感染:内皮細胞およびSMCに以下に記載の通り組み換えアデノウィルスベクターを感染させた。簡単に説明すると、インフェクションの20時間前、フィブロネクチン(4.5μg/mL)を予備コーティングしたプレート上に〜70%全面培養の密度で細胞を播種し、完全培地(M20)中で生育させた。インフェクション日に培地を新しいM199培地(血清非含有)と交換し、細胞を3000のウィルス粒子/細胞、の密度で組み換えウィルスに感染させた。20分おきに穏やかに傾斜させながら90分間細胞を培養し、その後、ウィルス含有培地を完全培地(M20)と交換した。感染はGFP蛍光フィルター(GFP−LP、Nikon)を装着した倒立蛍光顕微鏡(TE200、Nikon、Japan)を用いてGFP発現を可視化することによりモニタリングした。
【0144】
組み換えレトロウィルスによるECおよびSMCの形質導入: レトロウィルスベクターによるECおよびSMCの形質導入は以下の通り行なった。簡単に説明すると、内皮細胞(4〜9回継代)をフィブロネクチン(4.5μg/mL)をコーティングしたプレート中、105個/35mmウェルの密度で播種し、24時間完全培地中で生育させた。形質導入の1時間前に、培地を0.1mg/mL DEAE−デキストランを含有する血清非含有のM199培地と交換した。細胞をPBSで3回洗浄し、ウイルス産生パッケージング細胞の培養物から新たに採取して濾過(0.45μm)した上澄みと共に細胞を4時間インキュベートすることにより形質導入を行なった。インキュベーション終了時に培地を新しいM20培地と交換した。
【0145】
感染ECおよびSMCによるAng−1の過剰発現:
Ang−1mRNA転写のRT−PCR分析:Ang−1遺伝子転写を検出するために、PURESCRIPT RNA Isolation Kit(Gentra systems,USA)を用いて形質導入されたHSVECおよびHSVSMCから総RNAを単離した。cDNA合成のために、RNA1μgをランダムヘキサマー500ngと混合し、10分間70℃に加熱し、その後混合物を氷冷した。0.4mM dNTP、5単位のAMV−RT(Promega)、5mM DTT、32単位のRNAse−out(Gibco BRL,USA)および1xRT緩衝液(Promega,USA)を含有する反応混合物を予備加熱したRNAヘキサマー混合物に添加した。逆転写は、反応混合物を2時間38℃でインキュベートし、その後15分間95℃でインキュベートすることにより行なった。HSVECのAng−1mRNA発現の分析のために、cDNAのPCR分析を、20μLの容量中、逆転写cDNA産物7μL、センスプライマー(5’−GCTGGCAGTACAATGACAGTT−3’、配列番号3)、20pmol、アンチセンスプライマー(5’−TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT−3’、配列番号4)、20pmol、dNTP 5nmol、1U Ex−TaqDNAポリメラーゼ(Takara,Japan)および製造元の提供するPCR緩衝液を用いて実施した。PCRは以下の一連のインキュベート、即ち:94℃/2’→10x:[94℃/30”→50℃/30”→72℃/1’]→24x:[94℃/30”→56℃/30”→72℃/(60”+5”/サイクル)]→72℃/10’で行なった。HSVSMCのAng−1mRNA発現の分析のために、cDNAのPCR分析を、逆転写cDNA産物7μL、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー(それぞれ、5’−GCTGGCAGTACAATGACAGTT−3’、配列番号5、および、5’−TCAAAAATCTAAAGGTCGAAT−3’、配列番号6)、10pmol、dNTP 5nmol、1U Ex−TaqDNAポリメラーゼ(Takara,Japan)および製造元の提供するPCR緩衝液を含有する20μLの容量で実施した。PCRは以下の一連のインキュベート、即ち:94℃/2’→10x:[94℃/30”→50℃/30”→72℃/1’]→21x:[94℃/30”→60℃/30”→72℃/(60”+5”/サイクル)]→72℃/10’で行なった。PCR産物は0.8%アガロース中の電気泳動で分離し、EtBrで標識し、UV蛍光により可視化した。
【0146】
ウエスタンブロット分析:アデノウィルスまたはレトロウィルスにより感染されたECおよびSMCによるAng−1またはVEGF165蛋白の発現の検出は、以下に記載する通り、感染24時間後、細胞コンディショニング培地のウエスタンブロット分析により行った。簡単に説明すると、ウィルス含有培地を血清非含有培地と交換し、細胞を更に24時間生育させる。細胞コンディショニング培地中の試料30μl中の分泌蛋白を還元条件下の10%SDSポリアクリルアミドゲル上のPAGEで分離し、ニトロセルロース膜(Schleicher&Schuell, Germany)上にエレクトロブロッティングした。穏やかに振とうしながら1時間室温で0.1%スキムミルクおよび0.3%Tween−20を含有するTBS中でインキュベートすることによりブロットをブロッキングした後、ブロットをブロッキング溶液中1:500希釈度のポリクローナルヤギ抗Ang−1抗体(#sc−6319 Santa−Cruz, USA)または1:700希釈度のポリクローナルウサギ抗VEGF165抗体(#sc 152 Santa Cruz, USA)とともに2時間室温でインキュベートした。予備抗体標識ブロットをTBSTで3回洗浄し、製造元の仕様に従ってTBST中希釈したパーオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギまたは抗ヤギ二次抗体(Sigma, USA)とともに1時間室温でインキュベートした。TBSTで3回洗浄した後、ECL試薬(Sigma, USA)にブロットを反応させることにより標識された蛋白を可視化し、これらをX線フィルムに露光した。
【0147】
結果:
ウィルス構築物:ECおよびSMCをAng−1に感染させるために構築して用いたアデノウィルスおよびレトロウィルスのベクターを表1に示す。
【表1】
【0148】
アデノウィルス感染またはレトロウィルス形質導入ECおよびSMCのAng−1−GFPトランスジーンの発現:rAdAng1−GFPに感染した内皮細胞およびSMCは高濃度のGFPを発現することがわかった(それぞれ図6bおよび6d)。同様に、レトロAng−1−GFPで形質導入したECおよびSMCもまた高濃度のGFPを発現することがわかった(それぞれ図7bおよび7d)。GFPの発現は蛍光顕微鏡により可視化した。
【0149】
内皮細胞およびSMCはrAdAng1−GFPによりアデノウィルス感染後48時間にAng−1mRNAを転写することがわかった(それぞれ図8aおよび図8b)。同様にレトロAng1−GFPをレトロウィルス形質導入されたECおよびSMCもまた形質導入後48時間にAng−1mRNAを発現することがわかった(それぞれ図9aおよび図9b)。
【0150】
内皮細胞およびSMCはrAdAng1のアデノウィルス感染後、または、レトロAng1のレトロウィルス形質導入後、24時間にAng−1蛋白を過剰発現していることがわかった(それぞれ図10および11)。
【0151】
従ってこれらの結果によれば、本発明のアデノウィルスおよびレトロウィルスベクターは一次ヒトECおよびSMCを遺伝子的に修飾する能力を有し、そこにAng−1およびGFPトランスジーンを発現させることができることがわかる。従って、これらの構築物は血管成熟因子Ang−1を過剰発現するようにヒト血管細胞を遺伝子的に修飾するために使用することができ、このため、閉塞、傷害または虚血の哺乳類組織をバイパスする、または、貫通する新しい血管の形成を誘発することを目的とした血管疾患の治療に対し、有効に応用できる。
【0152】
実施例7
血管細胞におけるAng−1およびVEGFの機能的同時過剰発現
血管疾患を治療するために、本発明の方法は血管形成因子Ang−1およびVEGFを同時過剰発現する血管細胞の投与を用いる。しかしながら、このような治療様式が有効であるためには、これらの蛋白の何れか一方の過剰発現がもう一方の発現や機能の何れかを妨害してはならない。
【0153】
即ち、これらの蛋白が機能的に同時過剰発現される能力を以下の通り明らかにした。
【0154】
結果:
Ang−1を過剰発現するアデノウィルス感染ECおよびVEGFを過剰発現するアデノウィルス感染ECまたはSMCの同時培養におけるAng−1およびVEGF蛋白の過剰発現の保持:本発明の方法はECおよびSMCのような遺伝子的に修飾された血管細胞において血管成熟因子Ang−1および血管形成因子VEGFの両方の過剰発現を用いることにより、このような細胞を血管疾患の治療に利用した場合に最適治療効果を媒介するようにこれらの細胞の分化と生育を最適化する。しかしながら、このような治療手段が最も有効であるためには、Ang−1を過剰発現するEC、またはVEGFを過剰発現するECまたはSMCが、その対応するトランスジーンの過剰発現をもう一方のトランスジーンの過剰発現状態において各々保持できる能力を有することが必要とされる。従って、rAdVEGF感染ECとrAdAng1感染ECの同時培養物中のAng−1とVEGFの蛋白の両方の過剰発現が維持されることをウエスタンブロット分析により明らかにした(それぞれ図12aおよび12b)。同様に、rAdVEGF感染SMCおよびrAdAng1感染ECの同時培養物中のVEGFおよびAng−1の両方の同時過剰発現もウエスタンブロット分析により明らかにした(それぞれ図13aおよび13b)。
【0155】
Ang−1の過剰発現により抑制されないEC増殖:
材料および方法:
増殖試験:アデノウィルス感染の24時間前、EC(5〜11継代)をフィブロネクチン(4.5mg/mL)で予備コーティングされた24ウェルプレート中104個/ウェル(〜30%全面培養)の密度で播種した。細胞にrAdAng1−GFPまたはrAdGFPを感染させ、90分間37℃でインキュベートした後、血清添加培地を添加した。16〜18時間の後、培地を2%ヒト血清および2ng/mL、bFGF添加M199培地と交換した。増殖試験は3連で行ない、感染後第3、5および7日にXTT比色試験により増殖を調べた。
【0156】
本発明の方法は同じ環境においてECのような血管細胞によりAng−1とVEGFが同時過剰発現される血管疾患の治療のための治療様式を包含する。しかしながら、最適作用のためには好ましくはECに対するVEGFの増殖作用が望まれるため、rAdAng1−GFP感染ECの増殖に対するAng−1過剰発現の抑制作用が無いことを調べた。ECにおけるこのようなAng−1の過剰発現はrAdGFPに感染した細胞の増殖速度と比較した場合に細胞増殖に対して抑制または促進作用の何れも有さないことが解かった(図14)。予測した通り、VEGFを過剰発現する陽性対照感染体の増殖は増強された。
【0157】
従ってこれらの結果によれば、本発明によるVEGFおよびAng−1の同時発現がこれらの蛋白両方の機能的発現をもたらすことがわかる。従って遺伝子的に修飾された血管細胞におけるこれらの蛋白両方の同時過剰発現が関与する本発明の方法は、新血管形成の必要な血管疾患の治療において効果的に使用できる。
【0158】
実施例8
血管細胞におけるAng−1過剰発現の生物学的活性
本発明の方法はECにおけるAng−1の過剰発現のためのウィルス構築物を用いており、血管疾患の治療において新血管形成を誘発するためにAng−1とVEGFを同時過剰発現させる様式を包含する。
【0159】
即ち、生物学的に活性ナAng−1蛋白の発現を引き起こす本発明のAng−1発現アデノウィルスベクターの機能、および、ECおよびSMCのような血管細胞においてAng−1とVEGFの同時過剰発現を介して新血管形成を最適に誘発する本発明の方法の能力を、以下の通り明らかにした。
【0160】
材料および方法:
Ang−1を過剰発現するECにおけるTie2リン酸化の免疫沈降免疫ブロッティング分析:フィブロネクチン(4.5μg/mL)を予備コーティングした60mmのプレートに内皮細胞を播種し、rAdAng1−GFP、rAdGFPまたはrAdVEGF−GFPに感染させた。感染後24時間に、ウィルス含有培地を血清非含有培地と交換し、細胞を更に24時間培養した後に細胞蛋白の免疫沈降を行なった。細胞を100μM Na3VO4添加冷PBS中で洗浄し、20mMトリス塩酸(pH7.5)、150mM NaCl、1%トリトンX−100、10%グリセロール、1mM PMSF、2μg/mLロイペプチン、2μg/mLアプロチニンおよび100μM Na3VO4を含有する細胞溶解緩衝液中で溶解させた。溶解液上澄みの蛋白含量を測定し、等しい量の蛋白を含有する溶解液上澄みを小分けした試料を一夜4℃でインキュベートすることにより抗ホスホチロシン抗体PY20(Transduction Laboratories, USA)で標識した。プロテインAセファロースビーズを抗体標識試料に添加し、2時間4℃で試料をインキュベートすることにより免疫沈降を行なった。次にビーズを冷PBSで4回洗浄し、3分間SDS−PAGE試料緩衝液中で煮沸し、遠心分離によりペレット化した。上澄みの蛋白を6%SDSポリアクリルアミドゲル中で電気泳動することにより分離した。分離した蛋白をニトロセルロース膜(Schleicher and Schuell, Germany)上にエレクトロブロッティングし、抗Tie2抗体(Santa Cruz, USA)を用いたウエスタン免疫ブロッティング分析によりプローブした。
【0161】
結果:
Ang−1の生物学的活性:ECにおけるAng−1の過剰発現は増強されたTie2リン酸化をもたらす:Ang−1を過剰発現するようにアデノウィルス感染されたECにおけるTie2リン酸化の免疫沈降および免疫ブロッティング分析によれば、増強されたTie2リン酸化が観察された(図15b)。
【0162】
従って、これらの結果によれば、本発明の構築物から分泌されたAng−1蛋白は同属体受容体、Tie2、への結合において有効であり、このため、そのような構築物は、本発明の方法によるECのような遺伝子的に修飾された血管細胞を用いて血管疾患を治療する際に血管成熟因子Ang−1を発現するために効果的に用いることができる。
【0163】
in vitro血管形成試験−Ang−1およびVEGFを過剰発現する同時培養血管細胞において誘発された最適3次元血管形成性新芽形成:
本発明の方法は血管疾患の治療のための最適な血管形成を促進するために、血管成熟および血管形成の因子であるそれぞれAng−1およびVEGFの両方を使用する。従ってこれらの因子の両方を過剰発現するECおよびSMCのような血管細胞による最適血管形成を、以下に記載する通り、ウィルス形質転換された血管細胞を含むコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの3次元新芽形成の分析により明らかにした。
【0164】
材料および方法:
ECのアデノウィルス感染スフェロイドによる、或いは、アデノウィルス感染ECおよびSMCの同時培養スフェロイドによる新芽形成(血管形成と等価なin vitroの状態)を前に報告された通り(Korff T.等、J.Cell.Biol.1998, 143:1341)コラーゲンゲルにおけるこのようなスフェロイドの新芽形成を分析することによりin vitroで評価した。簡単に説明すると、ECおよびSMCを、同時培養スフェロイドの発生のために適する場合はプールして、0.25%(w/v)カルボキシメチルセルロース(Sigma, USA)を含有する培地中に懸濁した。EC‐SMC同時培養物を発生させるために、ECをDiI−291赤色蛍光マーカーで標識した後に混合することにより、その後のスフェロイドの蛍光顕微鏡分析のためにSMCからのECの分化を可能とした。24時間培養後にウェル当たりスフェロイドあたり〜750個の細胞の単一のスフェロイドが形成されるように細胞懸濁液を非付着性丸底96ウェルプレート(Nunc, Denmark)中に播種した。このようにして得られたスフェロイドを次に以下の通り、コラーゲンゲルに包埋した。コラーゲン保存溶液は10 x M199培地(Gibco BRL, USA)1容量およびpH7.4とするための0.34 N NaOH1容量にラット尾部コラーゲンの酸性抽出液(4℃で2mg/mLに平衡化)8容量を混合することにより用時に新しく調製した。コラーゲンの保存溶液はゲルの重合よりも前にスフェロイドが沈降するのを防止するために0.25%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含有する40%ヒト血清を添加したM199培地等容量と室温で混合した。20〜30スフェロイドを含有するゲル試料を迅速に予備加温した24ウェルのプレートに移し、重合させた。ゲルを37℃、5%CO2でインキュベートし、各試料群から少なくとも20個のスフェロイドの新芽形成をデジタルビデオカメラ(DXM1200 Nikon, Japan)に記録した。
【0165】
Ang−1およびVEGFを過剰発現する血管細胞の同時培養物による最適血管形成の誘発:rAdGFP感染ECのスフェロイド(図16a−b)を蛍光顕微鏡分析により観察したところ、低いベースライン新芽形成活性が認められたが、これはrAdGFP感染およびrAdVEGF−GFP感染EC(図16c−d)並びにrAdAng1‐GFP感染およびrAdGFP感染EC(図16e−f)を含む同時培養スフェロイドにおいてアップレギュレートされることが観察された。しかしながらこの最も高い新芽形成活性は、rAdAng1‐GFPおよびrAdVEGF−GFP感染EC(図16g−h)を含む同時培養スフェロイドにおいて記録された。
【0166】
同様の結果はアデノウィルス感染ECおよびレトロウィルス感染SMCを同時培養した場合にも得られた。rAdVEGF−GFP感染ECおよびレトロGFP感染SMCを含有する同時培養スフェロイドは、rAdGFP感染ECおよびレトロGFP感染SMCを含有する同時培養スフェロイドと比較した場合、血管形成性新芽形成活性がやや上昇していることがわかった(それぞれ図17bおよび17a)。rAdGFP感染ECおよびレトロAng1−GFP感染SMCを含有する同時培養スフェロイドは高度にアップレギュレートされた血管形成性新芽形成活性を示したが(図17c)、rAdVEGF−GFP感染ECおよびレトロAng1−GFP感染SMCを含有する同時培養スフェロイドは相乗効果的に上昇した水準の血管形成性新芽形成活性を示した(図17d)。これらの結果は、rAdGFP感染SMC(図18a)、rAdAng1‐GFP感染SMC(図18b)、rAdGFP感染EC(図18c)、rAdVEGF−GFP感染EC(図18d)、同時培養rAdGFP感染SMC+rAdGFP感染EC(図18e)、同時培養rAdGFP感染SMC+rAdVEGF−GFP感染EC(図18f)、および同時培養rAdAng1−GFP感染SMC+rAdGFP感染EC(図18g)と比較した場合、血清枯渇条件下(図18h)、24時間スライドガラス上で培養したrAdAng1−GFP感染SMCと混合したrAdVEGF−GFP感染ECの同時培養物中で観察された劇的な生存率の上昇により裏付けられる。
【0167】
従ってこれらの結果はECおよびSMCのような血管細胞において血管成熟および血管形成因子であるそれぞれAng−1およびVEGFの同時発現を用いることにより、本発明の方法が最適な血管形成および細胞生存を誘発することができることを示している。即ち、本発明の方法は血管疾患を治療するための新血管形成誘発のために血管形成因子僅か1種のみを使用していた従来の方法よりも優れている。
【0168】
実施例9
Ang−1過剰発現による遺伝子的に修飾されたECのアポトーシスからの保護
本発明の方法はECのような血管細胞の遺伝子的修飾を用いてEC分化因子Ang−1の過剰発現とEC生育因子VEGFの過剰発現を組み合わせることにより血管疾患の治療のための最適な新血管形成を誘発している。しかしながら、このような最適治療効果を達成するためには、Ang−1を過剰発現するこのような遺伝子的に修飾された細胞は、一次細胞の採取、その遺伝子的修飾、そのex vivoの培養、および、とりわけ、低酸素圧と全般的に望ましくない条件が細胞の生存率を低下させる虚血組織へのin vivoの再移植の際など、全ての処理段階に渡って遭遇すると考えられる前アポトーシス条件を克服して生存することが可能であることが高度に望まれる。
【0169】
即ち、前アポトーシス条件に対してこのような耐性を示すAng−1を過剰発現するようにレトロウィルス形質導入されたECの能力を以下に記載する通り明らかにした。
【0170】
材料および方法:
アポトーシス細胞の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)媒介dUTPニック末端標識(TUNEL)試験:簡単に説明すると、非感染ECまたはレトロAng1−GFP形質導入ECを24ウェルの培養プレート中4x105個/ウェルの密度で播種した。培養24時間の後、細胞を20%ヒト血清添加M199培地中で更に24時間培養するか、または、血清非含有M199培地中で培養してアポトーシスを誘発した。前アポトーシス条件に曝露した後、浮遊および付着している全ての細胞をトリプシン処理により回収し、新たに調製したPBS−4%ホルムアルデヒド中で固定し、メタノール−3%H2O2でブロッキングし、そして更に0.1%トリトンX−100−0.1%クエン酸ナトリウム中で浸透性付与した。最後にフラグメント化したDNAの末端をTdTを用いてフルオレセインコンジュゲートヌクレオチドで標識し、細胞を蛍光顕微鏡により、励起波長450〜500nm、検出波長515〜565nm(緑色)で検査した。TUNEL法試験はIn Situ Cell Death Detection Kit(cat#1684817, Roche, Germany)を用いて製造元による取扱説明書に従って行なった。
【0171】
結果:
遺伝子的に修飾されたECにおけるアポトーシスからのAng−1過剰発現媒介による保護:Ang−1を過剰発現するようにレトロウィルス形質導入された内皮細胞はTUNEL染色細胞の顕微鏡蛍光分析による可視化によれば、非形質導入細胞と比較して前アポトーシス条件下でアポトーシスに対する顕著な耐性を示した(図19hおよび19d)。上記のとおり顕微鏡的に明らかにされたデータに対して行なった数的定量によれば、非形質導入ECの55%が血清枯渇24時間後にアポトーシス状態となったのに対し、Ang−1(図20)を過剰発現するようにレトロウィルス形質導入されたECでは僅か12%であった。同様のアポトーシス率低下と生存率向上はVEGFおよびAng−1を過剰発現する混合内皮細胞集団においても観察されている(データは示さず)。
【0172】
これらの実験から、好ましくはVEGFの過剰発現と組み合わせられた血管細胞によるAng−1の過剰発現は例えば虚血臓器において遭遇することが予測される生理学的ストレス下におけるこのような細胞の生存性を最適化すると結論することができる。即ち、本発明は一般的には血管疾患の治療のため、そして、とりわけ虚血組織が関わる病態において、従来技術の新血管形成を超えた進歩をもたらす。
【0173】
本発明は特定の実施態様との関連において記載したが、多くの変法は当業者の知る通りである。従ってこれらの変法は全て本発明とその請求項の精神および範囲に包含されるものである。全ての公報、特許、出願およびそこに開示される、そして/または明細書に記載したGenBank受託番号で認識される配列は、個々の公報、特許、出願または配列が、参考により本明細書に組み込まれるべく特定して個々に示される場合と同様の程度にまで、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。更にまた本出願中の参考文献の引用および確認のいずれも、その参考文献が本発明の先行技術として使用できることを受け入れたものと解釈してはならない。
【参考文献】
【図面の簡単な説明】
【図1】
本発明によるVEGF発現ベクター構築物を示す。
【図2】
本発明によるAng−1発現ベクターを示す。
【図3】
VEGF−LacZ(3a)またはVEGF−GFP(3b)発現構築物で形質転換された培養ECを示す。
【図4】
閉塞した血管(図4a)、このような閉塞を治療するための従来技術のバイパス法(図4b)および本発明による閉塞血管を貫通またはバイパスする方法(図4c)を示す。
【図5】
図5aは人工的に遮蔽しVEGF165を発現する組み換えアデノウィルスベクターを注入することにより再開通させたラット後肢動脈枝における閉塞部位と流動の測定を示す。図5bはVEGF165アデノウィルスベクターまたは生理食塩水(対照)の注射後3、7および14日のラット大腿動脈中の血流を示すグラフである。
【図6】
図6a−dはrAdAng1−GFPを感染させたECまたはSMC(それぞれ図6a−bおよび6c−d)を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡(それぞれ図6a−cおよび6b−d)写真である。
【図7】
図7a−dはレトロAng1−GFPを感染させたECまたはSMC(それぞれ図7a−bおよび7c−d)を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡(それぞれ図7a−cおよび7b−d)写真である。
【図8】
図8a−bはアデノウィルス感染後48時間のECおよびSMC(それぞれ図8aおよび8b)におけるAng−1 mRNAの発現を示す写真である。
【図9】
図9a−bはレトロウィルス形質導入後48時間のECおよびSMC(それぞれ図9aおよび9b)におけるAng−1 mRNAの発現を示す写真である。
【図10】
アデノウィルス感染ECおよびSMCにおけるAng‐1蛋白の発現を示す写真である。
【図11】
レトロウィルス形質導入ECおよびSMCにおけるAng‐1蛋白の発現を示す写真である。
【図12】
図12a−bはAng−1を過剰発現するアデノウィルス感染ECとVEGF165を過剰発現するECとの同時培養物におけるAng−1およびVEGF165蛋白の発現(それぞれ図12aおよび12b)のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。
【図13】
図13a−bはAng−1を過剰発現するアデノウィルス感染ECとVEGF165を過剰発現するSMCとの同時培養物におけるVEGF165およびAng−1蛋白の発現(それぞれ図13aおよび13b)のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。
【図14】
Ang‐1過剰発現rAdAng1−GFP感染ECの正常な増殖を示すヒストグラムである。
【図15】
図15a−bはrAdAng1感染ECにおけるTie2受容体の増強されたリン酸化を示す写真である。
【図16】
図16a−hはアデノウィルス感染ECを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの3次元in vitro血管形成新芽形成を示す顕微鏡写真である。
【図17】
図17a−dはアデノウィルス感染ECおよびレトロウィルス形質導入SMCを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの3次元in vitro血管形成新芽形成を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図18】
図18a−hは血清枯渇条件下における血管形成分化増殖因子を過剰発現するウィルスで形質転換された血管細胞の同時培養物の生存性を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図19】
図19a−hは血清枯渇24時間後のAng−1を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたTUNEL−染色ECの増強された生存性を示す工学顕微鏡写真(図19a、19c、19eおよび19g)および蛍光顕微鏡写真(図19b、19d、19fおよび19h)である。
【図20】
Ang−1を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたECにおけるアポトーシス率を示すヒストグラムである。
Claims (55)
- (a)血管形成増殖因子をコードする第1のポリヌクレオチドセグメント;および
(b)血管形成成熟因子をコードする第2のポリヌクレオチドセグメント
を含む核酸発現構築物。 - 前記第1および前記第2のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも1つの発現を意図するためのプロモーター配列少なくとも1つを更に含む請求項1に記載の核酸発現構築物。
- 前記第1のポリヌクレオチドセグメントは前記第2のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されており、前記第1および前記第2のポリヌクレオチドセグメントは前記プロモーター配列少なくとも1つの単一のプロモーター配列の転写制御下にある請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記第1および前記第2のポリヌクレオチドセグメントの間に介在したリンカー配列を更に含む請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記リンカー配列はIRESおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記プロモーター少なくとも1つは真核細胞において機能する請求項1に記載の核酸発現構築物。
- 前記プロモーター少なくとも1つは構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項1に記載の核酸発現構築物。
- (c)前記第1のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図した第1のプロモーター配列;および
(d)前記第2のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図した第2のプロモーター配列
を更に含む請求項1に記載の核酸発現構築物。 - 前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターは各々構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項8に記載の核酸発現構築物。
- 前記第1のプロモーターおよび前記第2のプロモーターからの発現が1つのエフェクターにより調節可能である請求項9に記載の核酸発現構築物。
- マーカーポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つを更に含む請求項1に記載の核酸発現構築物。
- 前記マーカーポリペプチドは選択ポリペプチドおよびレポーターポリペプチドよりなる群から選択される請求項11に記載の核酸発現構築物。
- 前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つは前記第1および前記第2のポリヌクレオチドセグメントの前記少なくとも1つに転写可能に連結されている請求項11に記載の核酸発現構築物。
- 前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つはリンカー配列を介して前記第1および前記第2のポリヌクレオチドセグメントの前記少なくとも1つに転写可能に連結されている請求項13に記載の核酸構築物。
- 前記リンカー配列はIRESおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される請求項14に記載の核酸構築物。
- 前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つは前記第1および前記第2のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも1つに翻訳可能に融合している請求項11に記載の核酸構築物。
- 前記血管形成増殖因子はVEGF、酸性または塩基性のFGF、PlGF、レプチンおよびHGFよりなる群から選択される請求項1に記載の核酸構築物。
- 前記血管形成成熟因子はアンジオポエチン−1、TGF−β1、TGF−β受容体−2、エンドグリン、Smad5、VE‐Cアドヘリン、エフリンB2、PDGF、BmxチロシンキナーゼおよびMCP−1よりなる群から選択される請求項1に記載の核酸構築物。
- 活性成分として請求項1に記載の核酸発現構築物および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物。
- 請求項1に記載の核酸発現構築物を含有する遺伝子的に形質転換された細胞。
- 前記形質転換された細胞は内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球および線維芽細胞よりなる群から選択される請求項20に記載の形質転換された細胞。
- 前記形質転換された細胞は静脈のセグメント、骨髄原種細胞、末梢血液原種細胞、循環内皮細胞および胚性幹細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項20に記載の形質転換された細胞。
- 前記形質転換された細胞はヒトドナーおよび動物原材料よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項20に記載の形質転換された細胞。
- (a)血管形成増殖因子をコードする第1のポリヌクレオチドセグメントを含む第1の核酸発現構築物;および
(b)血管形成成熟因子をコードする第2のポリヌクレオチドセグメントを含む第2の核酸発現構築物
を包含する核酸発現構築物系。 - 前記第1および前記第2の核酸発現構築物の少なくとも1つは選択マーカーポリペプチドまたはレポーターポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つを更に含む請求項24に記載の核酸発現構築物系。
- 前記第1および前記第2の核酸発現構築物は各々前記第1および前記第2のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図したプロモーター配列を更に含む請求項24に記載の核酸発現構築物系。
- 前記プロモーター配列は真核細胞において機能する請求項26に記載の核酸発現構築物系。
- 前記プロモーター配列は構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項26に記載の核酸発現構築物系。
- 前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つは前記第1のポリヌクレオチドセグメントまたは前記第2のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されている請求項24に記載の核酸発現構築物系。
- 前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも1つは、IRESおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択されるリンカー配列を介して前記第1のポリヌクレオチドセグメントまたは前記第2のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されている請求項29に記載の核酸構築物系。
- 活性成分として請求項24に記載の核酸発現構築物系および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物。
- 血管形成増殖因子少なくとも1つおよび血管形成成熟因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された細胞集団。
- 前記細胞集団は内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球および線維芽細胞よりなる群から選択される細胞型少なくとも2つを含む請求項32に記載の細胞集団。
- 前記細胞型少なくとも2つのうちの第1の細胞型は前記血管形成増殖生育因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換され、前記細胞型少なくとも2つのうちの第2の細胞型は前記血管形成成熟因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換される請求項32に記載の細胞集団。
- 前記第1の細胞型は内皮細胞であり、更に前記第2の細胞型は平滑筋細胞である請求項33に記載の細胞集団。
- 前記内皮細胞は静脈組織、動脈組織、脂肪組織、原種細胞、循環内皮細胞および骨髄幹細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものであり、更に前記平滑筋細胞は動脈組織および静脈組織よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項35に記載の細胞集団。
- 前記血管形成増殖因子少なくとも1つおよび前記血管形成成熟因子少なくとも1つの各々の発現は独立して調節可能である請求項32に記載の細胞集団。
- 前記血管形成増殖因子少なくとも1つはVEGF、酸性または塩基性のFGF、PlGF、レプチンおよびHGFよりなる群から選択される請求項32に記載の細胞集団。
- 前記血管形成成熟因子少なくとも1つはアンジオポエチン−1、TGF−β1、TGF−β受容体−2、エンドグリン、Smad5、VE‐Cアドヘリン、エフリンB2、PDGF、BmxチロシンキナーゼおよびMCP−1よりなる群から選択される請求項32に記載の細胞集団。
- 個体の組織領域における新しい血管の形成を誘発する方法であって、
(a)個体の組織領域内に血管形成増殖因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された第1の細胞型を投与する工程;および
(b)個体の組織領域内に血管形成成熟因子少なくとも1つを発現するように遺伝子的に形質転換された第2の細胞型を投与する工程、
を含む方法。 - 前記組織領域は虚血組織、閉塞したまたは狭窄した血管組織または傷害血管組織を含む請求項40に記載の方法。
- 前記閉塞したまたは狭窄した血管組織は閉塞したまたは狭窄した動脈である請求項40に記載の方法。
- 前記第1および前記第2の細胞型が個体に由来するものである請求項40に記載の方法。
- 前記第1および前記第2の細胞型は各々、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球、骨髄幹細胞、線維芽細胞および胚性幹細胞よりなる群から選択される請求項40に記載の方法。
- 方法は閉塞したまたは狭窄した血管をバイパスするか貫通させるために利用される請求項40に記載の方法。
- 前記第1および前記第2の細胞型を個体の組織領域に同時投与する請求項43に記載の方法。
- 前記第1の細胞型からの前記血管形成増殖因子少なくとも1つの発現は第1の因子により調節可能であり、更に前記第2の細胞型からの前記血管形成成熟因子少なくとも1つの発現は第2の因子により調節可能である請求項46に記載の方法。
- 前記第1および前記第2の因子は前記血管形成増殖因子少なくとも1つの発現をダウンレギュレートすることができ、そして、前記血管形成成熟因子少なくとも1つの発現をアップレギュレートすることができる単一の因子である請求項47に記載の方法。
- 工程(b)は工程(a)の後、少なくとも12時間経過後に行なわれる請求項40に記載の方法。
- 個体の組織領域における新しい血管の形成を誘発する方法であって、前記方法は個体の組織領域内に細胞を投与する工程を含み、前記細胞は、
(a)個体の組織領域内に血管形成増殖因子少なくとも1つ;および
(b)個体の組織領域内に血管形成成熟因子少なくとも1つ
を発現するように遺伝子的に形質転換され、それにより個体の組織領域内に新しい血管の形成を誘発する方法。 - 前記細胞は内皮細胞である請求項50に記載の方法。
- 活性成分として血管形成増殖因子および血管形成成熟因子を含む調製品および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物。
- 前記血管形成増殖因子はVEGF、酸性または塩基性のFGF、PlGF、レプチンおよびHGFよりなる群から選択される請求項52に記載の医薬組成物。
- 前記血管形成成熟因子はアンジオポエチン−1、TGF−β1、TGF−β受容体−2、エンドグリン、Smad5、VE‐Cアドヘリン、エフリンB2、PDGF、BmxチロシンキナーゼおよびMCP−1よりなる群から選択される請求項52に記載の医薬組成物。
- 前記製薬上許容しうる担体はリポソーム、ミセル、ウィルスよりなる群から選択される請求項52に記載の医薬組成物。
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