CN1203532A - 用胶质细胞系衍生神经营养因子(gdnf)蛋白产物治疗感光器的方法 - Google Patents

用胶质细胞系衍生神经营养因子(gdnf)蛋白产物治疗感光器的方法 Download PDF

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Abstract

本发明总体上涉及使用胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)治疗视网膜神经元特别是感光器损伤或变性的方法。本发明特别涉及治疗有视觉丧失的视网膜情况或疾病如色素性视网膜炎、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病、周围性玻璃体视网膜病、感光性视网膜病、手术诱发的视网膜病、病毒性视网膜病、局部缺血性视网膜病、视网膜脱离和创伤性视网膜病的方法。

Description

用胶质细胞系衍生神经营养因子 (GDNF)蛋白产物治疗感光器的方法
发明领域
本发明总体上涉及用胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物治疗视网膜神经元损伤或变性。本发明特别涉及治疗病理性情况如遗传性视网膜变性和年龄、疾病或损伤相关的视网膜病的方法，在这些病理性情况中均存在感光器的变性，并因此导致视觉丧失。发明背景
最近，许多自然存在的蛋白质分子因对各种类型的神经元有营养活性而被鉴定出来。这些分子被称作“神经营养因子”。神经营养因子是内源性、可溶性蛋白质，在发育过程中神经元的存活和生长以及成熟神经元功能的维持和可塑性上扮演重要角色；参见Fallon和Laughlin，神经营养因子，学术出版社，San Diego，CA(1993)。鉴于它们能促进神经元再生，防止神经元死亡和变性，推测神经营养因子用来治疗神经系统的神经变性情况可能有效，如，举几个例子，帕金森氏病、阿尔采默氏病、肌萎缩性侧索硬化和中风。
神经损伤是由危及一类或多类神经细胞生存和/或适当功能的情况引起，包括：(1)物理性损伤，它使受损部位的轴突变性(这反过来引起神经细胞死亡)和/或神经细胞胞体变性；(2)对神经系统某些部分的血供暂时或永久性终止(局部缺血)，如中风时的情况；(3)有意地或意外地接受神经毒素，如患癌症和AIDS病时分别使用化疗剂顺铂和双脱氧胞苷；(4)慢性代谢性疾病，如糖尿病或肾功能不良；或(5)神经变性疾病，如由特异神经元群变性引起的帕金森氏病、阿尔采默氏病和肌萎缩性侧索硬化症。一种特异的神经营养因子可能用于治疗神经损伤，被损伤的神经细胞所属的一类或各类神经细胞必须对这个因子有反应；典型地，不同的神经因子影响绝然不同类的神经细胞。所有的神经元群不是对所有的神经营养因子都有反应，受神经营养因子的影响也不相同，这一点已经确定。
第一个被鉴定出来的神经营养因子是神经生长因子(NGF)。NGF是一个被确定的称为神经营养素的营养因子家族的第一个成员，它目前包括脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养素-3(NT-3)、NT-4/5和NT-6(Thoenen，神经科学动向，14：165-170，1991；Lapchak等，神经科学评论，3：1-10，1993；Bothwell，神经科学年评，18：223-253，1995)。已知这些神经营养素通过trk酪氨酸激酶受体家族即trkA、trkB、trkC和低亲合力p75受体起作用(Lapchak等，神经科学评论，3：1-10，1993；Bothwell，神经科学年评，18：223-253，1995；Chao等，TINS，18：321-326，1995)。在中枢神经系统(CNS)，NGF的受体trkA的表达几乎全部限于前脑基底部的胆碱能神经元(Venero等，神经科学报告，4：959-962，1993)，它们也表达p75和trkB。这些胆碱能神经元有特殊的神经学研究意义，因为胆碱能神经元变性和/或营养不良是阿尔采默氏病的标记(Hefti，神经生物学杂志，25：1418-1435，1994；Olson，Neurochem.Jul.15：1-3，1994)。通过使用乙酰胆碱脂酶组化的形态学方法或使用针对胆碱乙酰基转移酶(ChAT)-乙酰胆碱的合成酶或针对p75的抗体可以很容易地鉴定出前脑基底部胆碱能神经元(Batchelor等，比较神经病学杂志，284：187-204，1989；Kiss等，Neurosic.27：731-748，1988；Woolf等，Neuroscience.30：143-152，1989)。
胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)是最近被发现的一种蛋白质，根据它在体外能延长中脑多巴胺能神经元的存活并刺激其表达递质传递者表型进行实验而鉴定和纯化出来(Lin等，科学，260：1130-1132，1993)。GDNF是一个糖基化的、二硫键连接的同源双体分子，与神经营养性蛋白质中的转化生长因子-β(TGF-β)超家族有微小联系(Krieglstein等，EMBO J.，14：736-742，1995；Poulsen等，Neuron，13：1245-1252，1994)。GDNF已被克隆，重组的人GDNF(rhuGDNF)在体外以及体内均对黑质多巴胺能神经元和脊髓运动神经元有营养和延长存活的作用(Beck等，自然，273：339-341，1995；Henderson等，科学，266：1130-1132，1994；Tomac等，自然，273：335-339；Yan等，自然，273：341-343；Zurn等，神经科学报告，6：113-118，1994)。在体内，给帕金森氏病，一种以丧失多巴胺能神经元为特征的神经变性性疾病的动物模型应用外源性GDNF，刺激了黑质神经元的多巴胺能表型，恢复了由轴突切开术或多巴胺能神经毒素引起的功能缺陷(Hudson等，脑研究通报，36：425-432，1995；Hoffer等，神经科学快报，182：107-111，1994)。尽管一开始认为GDNF对多巴胺能神经元有相对特异性，至少在体外是这样，但接下来的实验发现GDNF对脑干和脊髓胆碱能运动神经元有神经营养作用，体内和体外都如此(Oppenheim等，自然，373：344-346，1995；Zurn等，Neuroreport，6：113-118，1994；Yan等，自然，373：341-344，1995；Henderson等，科学，266：1062-1064，1994)。因此，在治疗脊髓运动神经元变性性疾病如肌萎缩性侧索硬化方面GDNF是一个有潜在治疗作用的因子。
因此，已开始有证据说明除中脑多巴胺能神经元和躯体运动神经元外，GDNF可能有一个更大的神经营养靶细胞谱(Yan和Matheson，自然，373：341-344，1995；Miller等，Soc.Neurosci.Abstr.20：1300，1994)。在肌肉、周围神经系统的许旺氏细胞和中枢神经系统的I型星形胶质细胞(Schaas等，实验神经病学，124：368-371，1993)中已经检测到GDNF的信使RNA(mRNA)。GDNF mRNA也高水平表达于发育中的大鼠纹状体(Stromberg等，实验神经病学，124：401-412，1993)及低水平表达于成年大鼠和人中枢神经系统的某些部位，包括纹状体、海马、皮质和脊髓(Springer等，实验神经病学，127：167-170，1994)。
本发明主要感兴趣的是1993年4月1日出版的WO 93/06116(Lin等，Syntex-Synergen  Neuroscience Joint Venture)，其中报道了GDNF治疗神经损伤，包括帕金森氏病相关的损伤有效。本发明还感兴趣的是Schmidt-Kastner等，Mol.Brain Res.，26：325-330，1994的报道，指出GDNF mRNA可以检测出来了，并且在毛果芸香碱诱导的癫痫发作后水平升高；Schaar等，实验神经病学，124：368-371，1993和Schaar等，实验神经病学，130：387-393，1994的报道指出在培养条件下前脑基底部星形胶质细胞表达中等水平的GDNFmRNA，但GDNF并不改变前脑基底部ChAT活性；在于1995年9月28日提交的目前未决的美国申请系列号08/535,682，的报告指出GDNF对治疗前脑基底部胆碱能神经元的损伤或变性有效。
哺乳动物中许多眼部神经变性性情况或疾病涉及感光器的损伤或变性。能够使这些神经元存活延长或再生的营养因子将为这样的疾病的治疗提供有效的治疗措施。
感光器是一群特殊的视网膜神经元，负责视觉。感光器由视杆和视锥组成，它们是视网膜的光敏感细胞。每一个视杆和视锥都精巧地生出一根纤毛，被称作外节，其内容纳光传导装置。视杆中包含一种特殊的与视觉有关的光吸收性色素视紫红质。人类有三种视锥，其特色是表达不同的与视觉有关的色素：兰色视锥色素、绿色视锥色素和红色视锥色素。每类与视觉有关的色素蛋白有不同的最大光吸收波长。视杆视紫红质介导暗适应视觉(在黯淡的光线中)，而视锥色素则负责光适应视觉(在明亮的光线中)。红色、兰色和绿色色素也形成了人色觉的基础。视杆和视锥中的与视觉有关的色素对光线发生反应，在输出细胞即视杆双极神经元中产生一个动作电位，此信号然后经视网膜神经节神经元中转，在皮质视觉区产生一个视觉刺激。
在人类，许多视网膜疾病都有感光器进行性变性及最终死亡，不可避免地导致失明。由像遗传性视网膜营养不良(如色素性视网膜炎)、年龄相关的黄斑变性和其它黄斑病，或者视网膜脱离而引起的感光器的变性都具有感光器外节进行性营养不良和功能丧失的特点。此外，患视网膜营养不良的病人，其感光器的死亡和功能丧失导致二级视网膜神经元(视杆双极细胞和水平细胞)的部分传入神经阻滞，因而降低了感光器所产生电信号的整体传播效率。能够使感光器免于死亡和/或恢复机能不良(萎缩或营养不良)的感光器功能的营养因子也许代表了治疗象这样病情的有效治疗措施。
一些证据表明某些蛋白因子可以延长感光器的存活。例如，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可以在某种程度上挽救皇家外科学院(RCS)大鼠和白化病大鼠因接受持续性光照而受损的感光器(Faktorovich等，自然，347：83-86，1990)。RCS大鼠表达在视网膜色素上皮层(RPE)的一个基因有一处遗传性突变，使RPE不能吞噬感光器外节不断脱落的部分，导致感光器变性和最终的死亡。在变性刚开始时，简单地将bFGF注射到玻璃体或视网膜下间隙、视杆和视锥周围的胞外区可以暂时性挽救感光器(Faktorovich等，自然，347：83-86，1990)。在白化病大鼠光损伤模型上，于持续性光照开始前两天将bFGF注射到视网膜下层或玻璃体可明显保护感光器不受光照损害，防止了细胞死亡(LaVail等，美国国家科学院院刊，89：11249-11253，1992)。在这个模型上，使用酸性FGF(aFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、睫状体神经营养因子(CNTF)和白细胞介素-1β(IL-1β)后也可见到感光器存活下来。神经营养素-3(NT-3)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)和肿瘤坏死因子alpha(TNF-alpha)有中等作用。神经生长因子(NGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和IGF-I没有作用(LaVail等，美国国家科学院院刊，89：11249-11253，1992)。也可参见WO93/15608，LaVail等。
尽管bFGF在RCS大鼠和大鼠的光诱导损伤模型上有效，它对人的治疗作用却非常有限，因为它有致低血压作用，促有丝分裂活性和强烈的血管生成活性。实际上，注射到玻璃体的bFGF引起血管来源的巨噬细胞入侵视网膜内层，导致大面积的增殖性玻璃体视网膜病(Faktorovich等，自然，347：83-86，1990)。使用聚合酶链反应技术也证明GDNF的信使RNA在出生后6天和成年的大鼠眼中有表达，基本上是与视网膜神经层和视网膜色素上皮层有关系。RPE细胞产生、贮存和运输许多负责感光器的生存和功能维护的因子。RPE细胞对光传导过程也是必不可少的：它们通过吞噬作用清除感光器外节脱落的顶端，并使维生素A再循环。将正常RPE细胞移植到RCS大鼠的视网膜可以防止感光器细胞的死亡(Li和Turner，实验眼科研究，47：911-917，1988；Mullen和LaVail，科学，192：799-801，1976)，这表明RPE细胞为感光器产生一种可扩散的营养因子。
对于用于治疗感光器细胞损伤的方法和治疗性组合物一直是需要的。这样的方法和治疗性组合物将非常理想地保护感光器免于进行性损伤，延长受损伤的神经元群体的存活或促其再生，没有严重的副作用。发明概述
本发明提供一种通过使用治疗有效剂量的胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物治疗因感光器变性所致视觉丧失的方法。本发明的一个方面是提供通过使用治疗有效剂量的GDNF蛋白产物治疗因感光器变性所致视觉丧失的方法。我们认为这样的GDNF蛋白产物会包括GDNF蛋白，如在SEQ ID NO：1所列的氨基酸序列所表述的那样，以及其变体和衍生物。本发明是基于以下新发现：使用GDNF蛋白产物能延长受损感光器神经元的存活并促其再生，其中感光器神经元是导致失明的视网膜变性中主要的受损神经元群体。
GDNF蛋白产物可以以约0.001mg/天到10mg/天的剂量眼内使用，优选使用约0.01mg/天到1mg/天的剂量，最优选使用约0.1mg/天到0.5mg/天的剂量。我们也认为感光器的变性或损伤的治疗可以通过联合使用GDNF蛋白产物和另一种治疗剂，包括脑源神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4/5、神经营养素-6、胰岛素样生长因子、睫状体神经营养因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子以及可卡因-安非他明调节的转录子，但不仅限于此。我们还认为治疗眼部情况或疾病使用GDNF蛋白产物时的给药方式最好包括局部用药、眼内插入、眼内注射、眼内植入、细胞治疗或基因治疗。
本发明也提供GDNF蛋白产物在制造用于治疗感光器损伤或变性的药剂或药物组合物中的应用。这样的药物组合物包括经局部、口内、胃肠外应用的GDNF蛋白产物制剂。那些本领域的技术人员也会赞同通过细胞治疗和基因治疗方式进行给药，如下面进一步描述的那样。本发明还在另一方面包括了一种提供移植用感光器细胞的方法，其中的感光器细胞在有GDNF蛋白产物存在的条件下培养。本发明还包括了一种含感光器细胞和GDNF蛋白产物的组合物，所含GDNF蛋白产物量能够延长感光器细胞存活，允许其不断生长和成熟。本领域技术人员在考虑了下面的描述本发明优选实施方案的详文之后就会对本发明的各个方面和各种好处了如指掌。附图简述
图1表示胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物对视网膜神经元培养物中感光器存活的影响。每个值是三次培养的平均值±标准差。
图2表示GDNF蛋白产物对感光器轴突长出的促进作用。数据被绘制成轴突长度的累积频率分布图。图中包括其轴突比用毫米表示的给定长度(横坐标)长的感光器的百分数(纵坐标)。
图3表示GDNF蛋白产物对培养的感光器摄入谷氨酸的刺激作用。结果表示为谷氨酸的摄入值(以dpm/孔表示)占对照的百分数。每个数据点是一次有代表性实验中三个复孔的平均值±标准差。
图4表示GDNF蛋白产物在视网膜神经元培养物中延长感光器存活的作用。图中绘制了取自18天和39天小鼠的培养物经GDNF蛋白产物处理后感光器数目的变化。每个值是2-3次培养的平均值±标准差。
图5表示GDNF蛋白产物在rd/rd小鼠视网膜培养物中延长感光器存活的作用。感光器存活以计数每个6-mm孔中抑制蛋白阳性神经元数目表示。每个值是3-4次培养的平均值±标准差。
图6表示GDNF在鸡视网膜培养物中对感光器存活的影响。感光器的存活以计数每6平方毫米直径样长带(代表一个6-mm孔全面积的约21％)中视锥的数目表示。每个值是3次培养物的平均值±标准差。发明详述
本发明是基于GDNF蛋白产物对感光器有神经营养活性这个证明。在此发现之前，尚无暗示或迹象表明GDNF或许会有这样的神经营养活性。本发明提供一种使用有效治疗剂量的胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物，以药物组合物、GDNF表达细胞移植或GDNF基因治疗的方式治疗视网膜神经元尤其是感光器损伤或变性的方法。在本发明的实践中可以使用任何有生物活性的GDNF蛋白产物，包括含有SEQ ID NO：1所列的氨基酸序列的GDNF、其变体以及衍生物。
为提供用于衡量感光器对使用GDNF蛋白产物的反应性的视网膜神经元，本发明发展了一项独特的细胞培养技术。这项培养技术将在下面进一步详述。用GDNF蛋白产物处理感光器揭示GDNF蛋白产物除能延长感光器的存活外，还能刺激感光器的轴突样突起伸长，因而证明它对感光器的形态学发育也有影响。谷氨酸摄入试验进一步证明GDNF蛋白产物的处理促进了感光器的功能分化。这些结果提示GDNF蛋白产物疗法可能的益处包括延长感光器的存活，促进感光器轴突和外节的再生以及恢复视觉功能。因此，GDNF蛋白产物的应用将造福于因感光器变性而视觉丧失的情况，如遗传性视网膜变性、年龄相关的黄斑变性、损伤诱导的视网膜变性以及视网膜营养不良。
本发明还证明GDNF蛋白产物的使用在取自患遗传性视网膜变性小鼠的视网膜培养物中延长了感光器的存活。对rd/rd小鼠感光器的研究说明GDNF蛋白产物的使用增强了感光器对其上rd/rd突变的有害作用的抗性。这表明GDNF蛋白产物的使用在缓解和阻止视网膜变性和死亡中有用，甚至在逆转以感光器变性为特征的人类遗传性视网膜疾病(如，举个例子色素性视网膜炎)的视网膜变性中有用。如下述研究所说明的那样，GDNF蛋白产物的应用或许会造福于许多有感光器变性并因之而视觉丧失的病理情况。这些情况包括遗传性视网膜变性，如色素性视网膜炎、Bardet-Biedl综合征、Bassen-Kornzweig综合征、(β-脂蛋白缺乏症)、 Best病(卵黄型营养障碍，vitelliformdystrophy)、无脉络膜(choroidemia)、环状萎缩、先天性黑蒙、Refsum综合征、Stargardt病和Usher综合征。其它的可能得益于GDNF蛋白产物应用的视网膜病包括年龄相关的黄斑变性(干型和湿型)、糖尿病性视网膜病、周围性玻璃体视网膜病、感光性视网膜病、手术诱发的视网膜病、病毒性视网膜病(如AIDS相关的HIV视网膜病)、局部缺血性视网膜病、视网膜脱离和创伤性视网膜病。
根据本发明目前优选的实施方案，GDNF蛋白产物最好以约0.001mg/天～10mg/天的剂量眼内给药，优选以约0.01mg/天～1mg/天的剂量给药，最优选以0.1mg/天～0.5mg/天的剂量给药。我们还认为GDNF蛋白产物可以联合或结合有效剂量的另一种用于治疗视网膜变性或视网膜营养不良的治疗剂使用。这另一种治疗剂可以包括：丝裂原，如胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血管活性生长因子、垂体腺苷酸环化酶活化多肽、干扰素和生长激素；神经营养因子，如脑源神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4/5、神经营养素-6、胰岛素样生长因子、睫状体神经营养因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-5、转化生长因子-β和可卡因-安非他明调节的转录子(CART)；其它生长因子，如表皮生长因子、白血病抑制因子、白细胞介素、干扰素和集落刺激因子；以及功能与这些因子相当的分子和物质，但不仅限于此。
本发明也提供GDNF蛋白产物在制备用于治疗感光器损伤或变性，包括上述疾病和情况的药物时的应用。在下文中有对这样的GDNF蛋白产物药物制剂更详细的描述。
如此处所用，术语“GDNF蛋白产物”包括纯化的天然、合成或重组的胶质细胞系衍生神经营养因子、有生物活性的GDNF变体(包括插入、替代和缺失变体)和其经化学修饰的衍生物。与含有SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的人GDNF基本同源的GDNF也包括在内。GDNF蛋白产物有生物学活性的形式可以是同源双体或异源双体。
如此处所用，术语“有生物学活性”是指GDNF蛋白产物表现出与含有SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的GDNF有相似的神经营养特性，但不是必须所有的特性均相同，也不是必须要达到相同的水平。对感兴趣的特殊的神经营养特性的选择取决于使用GDNF蛋白产物所起的作用。
如此处所用，术语“基本同源”是指与含有SEQ ID NO：1所列氨基酸序列的GDNF有一定程度的同源性，优选超过70％，最优选超过80％，甚至更优选超过90或95％。例如，大鼠和人此蛋白产物的同源程度约为93％，我们认为优选的哺乳动物GDNF含有类似的高度同源性。有两个序列作对比，在其中被比较的那段序列中相同的氨基酸残基对齐，这时可以在100个氨基酸的长度中引入4个间隙以帮助对齐，计算较小序列中相同氨基酸的百分数就作为此处所述的同源性的百分数；这就如同Dayhoff在《蛋白质序列和结构图谱》v.5.p.124.国家生物化学研究基金会，Washington.D.C.(1972)所阐述的那样，其公开的内容在此引入以供参考。基本同源还包括任何根据其能与SEQID NO：1 GDNF的抗体发生交叉反应的特点而进行分离的GDNF蛋白产物或任何根据其基因能与SEQ ID NO：1 GDNF的基因或其片段杂交而进行分离的GDNF蛋白产物。
根据本发明的GDNF可以由本领域技术人员以任何熟悉的方式进行分离或制备。制备本发明所用的GDNF蛋白产物的典型方法在以下各专利中有所描述：1994年5月23日提交的美国专利申请No.08/182,183及其母申请；1992年9月17日提交的PCT申请No.PCT/US92/07888，出版物号为WO 93/06116(Lin et al，Syntex-SynergenNeuroscience Joint Venture)；欧洲专利申请No.92921022.7，出版物号为EP 610254；以及1995年9月28日提交的共享的共同未决的美国申请系列号08/535,681(“截短的胶质细胞系衍生神经营养因子”)，所有这些专利的公开内容在此引入以供参考。
自然存在的GDNF蛋白产物可以从哺乳动物神经细胞样品中分离，或者从一种分泌或表达GDNF的哺乳动物细胞系中分离。例如，WO 93/06116描述了从B49恶性胶质瘤细胞的无血清生长条件培养基中分离GDNF。本领域的技术人员也可以以任何熟知的方式化学合成GDNF蛋白产物。GDNF蛋白产物优选以重组技术进行制备，因为重组技术能够获得相对更多更纯的蛋白质。重组GDNF蛋白产物的形式包括蛋白的糖基化和非糖基化形式，以及在细菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞表达系统中表达的蛋白质。
通常，重组技术包括分离负责编码GDNF的基因，在适当的载体和细胞类型中克隆此基因，对此基因进行修饰，如果这对于编码想要的一种变体来说是必需的话，以及表达此基因以制备GDNF蛋白产物。作为一种选择，编码想要的GDNF蛋白产物的核苷酸序列也可以进行化学合成。我们认为GDNF蛋白产物可以利用因遗传密码简并或等位变体造成密码子使用不同的核苷酸序列进行表达。WO 93/06116描述了大鼠GDNF基因cDNA克隆的分离和测序，以及人GDNF基因基因组DNA克隆的分离，测序和表达。WO 93/06116也描述了GDNF蛋白产物表达所用的载体、宿主细胞和培养物生长条件。适合GDNF蛋白产物在E.coli中表达的其它载体在于1991年4月24日出版的欧洲专利申请No.EP 0 423 980(干细胞因子)中公开，公开的内容在此引入以供参考。编码成熟的人GDNF基因的DNA序列和GDNF的氨基酸序列列在WO93/06116图19(SEQ ID NO：5)中。图19没有列出GDNF脯氨酸以前部分的所有编码序列，但在WO 93/06116的图22(SEQ ID NO：8)中列出了GDNF脯氨酸以前部分的前50个氨基酸。
自然存在的GDNF有生物学活性的形式是二硫键连接的二聚体。经细菌系统表达之后分离出来的物质基本无生物学活性，以单体的形式存在。要制备有生物学活性的二硫键连接的二聚体就必须进行再折叠。在WO 93/06116中描述了对表达于细菌系统的GDNF的再折叠和成熟过程。在WO 93/06116和1995年9月28日提交的共享的共同未决的美国申请系列号08/535,681中也描述了测定GDNF活性的标准体外实验，在此引入以供参考。A.GDNF变体
如此处所用，术语“GDNF变体”包括自然存在的GDNF其氨基酸序列的残基中有氨基酸缺失(“缺失变体”)、插入(“插入变体”)或替代(“替代变体”)的多肽。像这样的变体的制备可以通过把适当的核苷酸变化引入编码多肽的DNA中或通过体外化学合成想要的多肽的方法。本领域的技术人员可以理解，只要最后得到的分子有GDNF生物学活性，可以进行许多替代、插入和缺失的组合。
本领域的技术人员已经熟知对一个或多个挑选出来的氨基酸残基进行替代、插入或缺失的诱变技术(如美国专利号4,518,584，其公开的内容在此引入以供参考)。在构建变体时有两方面主要变动：突变点的位置和突变的性质。在设计GDNF变体的时候，突变点和突变性质的选择要根据要修饰的GDNF的某个或多个特性。对突变点的修饰可以单独进行，也可以依次进行，如(1)先选择保守性氨基酸替代，再根据所得的结果选择变化更大的替代；(2)去掉目的氨基酸残基；或者(3)紧邻氨基酸残基所在部位插入氨基酸残基。优选1～20个氨基酸的保守性变动。一旦想要的GDNF蛋白产物的氨基酸序列决定了，用于表达这个蛋白的核酸序列也就很容易决定了。N-末端和C-末端缺失变体也可通过蛋白水解酶制备。
对于GDNF缺失变体，缺失的范围通常在约1～30个残基，更常见约1～10个残基，典型的是约1～5个连续性残基。N-末端、C-末端和序列内的缺失均可考虑。为了修正GDNF的活性，可以在与其它的TGF-β超家族成员同源性较低的区域引入缺失。在与其它的TGF-β超家族成员基本同源的区域进行缺失突变更可能更显著地改变GDNF的生物学活性。对连续性缺失的数目要进行选择以维持GDNF蛋白产物受影响的功能区的三级结构，如半胱氨酸交联。缺失变体的范例还包括但不局限于下面的例子：截去GDNF N-末端1-40个氨基酸的GDNF蛋白产物；缺失GDNF C-末端残基的变体；或兼而有之；如在1995年9月28日提交的共享的共同未决的美国申请系列号08/535,681所述，该专利申请在此引入以供参考。
对于GDNF插入变体，被插入的氨基酸序列一般包括N-和/或C-末端融合的氨基酸序列，长度从一个残基到包含一百或更多个残基的多肽，以及插入序列内的一个或多个氨基酸残基。内部插入的序列一般为约1-10个残基，更典型的是约1-5个残基，通常1-3个氨基酸残基。N-末端插入变体的范例包括含N-末端蛋氨酸残基的GDNF(GDNF在细菌重组细胞培养物中直接表达的人工产物)，它被称作[Met-1]GDNF，和为了便于成熟的GDNF从重组宿主细胞中分泌出来而在GDNF的N-末端融合了异源性N-末端信号序列的融合产物。这样的信号序列通常从要用的宿主细胞种中获得，因而也与之同源。插入物还可以包括源自其它神经营养因子序列的氨基酸序列。根据本发明，优选的可使用的GDNF蛋白产物是重组人[Met-1]GDNF。
GDNF替代变体至少有一个GDNF氨基酸序列的氨基酸残基被去掉，一个不同的残基插入到它的位置。这样的替代变体包括等位变体，它们的特征在于在种群中有自然存在的核苷酸序列的变化，此变化或许能或许不能引起氨基酸的变化。替代变体的范例(参见SEQ ID NO：50)在1995年9月28日提交的共享的共同未决的美国申请系列号08/535,681中被公开，在此引入以供参考。
GDNF氨基酸序列的特殊突变可以包括对糖基化位点(如丝氨酸、苏氨酸或天门冬酰胺)进行修饰。无糖基化或只有部分糖基化是在任何天门冬酰胺相关的糖基化识别位点或在因加上O键碳水化合物而被修饰的分子的任何位点发生氨基酸的替代或缺失造成的。天门冬酰胺相关的糖基化识别位点包括一个三肽序列，它被相应的细胞糖基化酶特异识别。这些三肽序列要么是Asn-Xaa-Thr，要么是Asn-Xaa-Ser，其中Xaa可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。许多发生在糖基化识别位点第1位或第3位氨基酸其中之一或两者兼有的氨基酸替代或缺失(和/或第2位氨基酸的缺失)均导致被修饰的三肽序列的非糖基化。因此，表达经改变的合适的核苷酸序列可制备出在那个位点不发生糖基化的变体。此外，GDNF氨基酸序列也可以进行修饰以加入糖基化位点。
找出用于诱变的GDNF氨基酸残基或区域的方法之一称为“丙氨酸校验诱变法”，如Cunningham和Wells所述(科学，244：1081-1085，1989)。在这个方法中，先找出一个氨基酸残基或一组目的残基(如带电荷的残基象Arg，Asp，His，Lys和Glu)，然后用一个中性的或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，目的是改变氨基酸与胞内或胞外周围水环境的相互作用。那些对这些替代表现出功能敏感性的功能区接着可以通过在替代位点引入新的或换成其它的残基而被进一步改进。这样，可以引入氨基酸序列变异的目的位点就被确定下来，然后在DNA序列上相应的目的密码子或区域进行丙氨酸校验或随机诱变，检查表达出来的GDNF变体，以找到预期的活性和活性水平的最佳组合。
替代诱变最感兴趣的位点包括侧链大小、电荷、和/或疏水性在来自不同种的蛋白中基本不同的氨基酸所在的位点。其它感兴趣的位点是在来自不同种的GDNF样蛋白中均一致的特殊残基所在位点。这些位置对蛋白的生物活性通常较为重要。开始时，这些位点以一种相对保守的方式被替代。表1在优选替代标题下列出了像这样的保守性替代。如果这样的替代导致了生物学活性的改变，那么更基本的改变(示范替代)就会被引入，和/或引入其它的插入或缺失，所得的产物要进行活性筛选。
                       表  1
                     氨基酸替代
初始残基          优选替代           示范替代
Ala(A)            Val                Val；Leu；Ile
Arg(R)            Lys                Lys；Gln；Asn
Asn(N)            Gln                Gln；His；Lys；Arg
Asp(D)            Glu                Glu
Cys(C)            Ser                Ser
Gln(Q)            Asn                Asn
Glu(E)            Asp                Asp
Gly(G)            Pro                Pro
His(H)            Arg                Asn；Gln；Lys；Arg
Ile(I)            Leu                Leu；Val；Met；Ala；
                                     Phe；norleucine
Leu(L)            Ile                norleucine；Ile；Val；
                                     Met；Ala；Phe
Lys(K)            Arg                Arg；Gln；Asn
Met(M)            Leu                Leu；Phe；Ile
Phe(F)            Leu                Leu；Val；Ile；Ala
Pro(P)            Gly                Gly
Ser(S)            Thr                Thr
Thr(T)            Ser                Ser
Trp(W)            Tyr                Tyr
Tyr(Y)            Phe                Trp；Phe；Thr；Ser
Val(V)            Leu                Ile；Leu；Met；Phe；
                                     Ala；norleucine
对氨基酸序列的保守性修饰(和对编码核酸序列的相应修饰)预期能制备出与天然GDNF有相似功能和化学特性的GDNF蛋白产物。相反，通过选择在维持(a)替代区域多肽骨架的结构，如片层或以螺旋构象，(b)目的位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链大小方面所起作用明显不同的替代可以对GDNF蛋白产物的功能和/或化学特性进行基本修饰。根据共同的侧链特点将自然存在的残基分成下列各组：
1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Lle；
2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr；
3)酸性的：Asp，Glu；
4)碱性的：Asn，Gln，His，Lys，Arg；
5)影响链方向的残基：Gly，Pro；以及
6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守性替代可以包括用这些组中的一个成员代替另一个成员。像这样的替代残基可以引入GDNF蛋白与其它TGF-β超家族蛋白同源的区域或引入分子的非同源区域。B.GDNF衍生物
本领域技术人员根据此处公开的内容可以制备GDNF或GDNF变体化学修饰的衍生物。最适合形成衍生物的化学部分包括水溶性聚合物。水溶性聚合物之所以合乎需要，是因为它所连接的蛋白质不在水环境如生理环境中沉淀。此聚合物优选在制药方面适宜制备治疗性产品或组合物。本领域技术人员可以根据这样的考虑：象聚合物/蛋白质结合物是否可以用于治疗，如果可以，理想的剂量、循环时间、蛋白水解抗性以及其它的考虑等等来选择合乎需要的聚合物。这样衍生的效果可以通过以理想的方式(即通过渗透压，或较优选地通过注射或灌注，或更进一步进行配制以适合经口、经肺或经其它给药途径施用)使用衍生物并测定它的效果而确定。
合适的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二噁茂烷、聚1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、葡聚糖或聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、氧化聚丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇以及它们的混合物，但不仅限于此。聚乙二醇丙醛因在水中稳定可能在制备时有优势。
聚合物可以是任何分子量，可以分支或不分支。对于聚乙二醇，优选的分子量范围在约2kDa～约100kDa，以便于操作和制备(术语“约”指的是制备聚乙二醇时，有的分子的分子量比所说的分子量要大，有的要小)。根据需要的医疗特性(如所需的持续释放的时间；对生物学活性的影响，如果有的话；操作的方便性；抗原性的强弱或是否缺乏抗原性以及其它已知的聚乙二醇对治疗性蛋白质或其变体的影响)也可以使用其它大小的分子。
如此连接的聚合物分子数目可以不同，本领域的技术人员能确定它对功能的影响。可以在单个位置进行衍生，也可以用相同或不同的化学部分(如聚合物，象不同分子量的聚乙二醇)在两个位置、三个位置、四个位置或某些位置的组合进行衍生。聚合物分子与蛋白质(或多肽)分子的比例可以改变，它们在反应混合物中的浓度也可以改变。通常，最佳比例(从反应效率方面来说就是没有多余的未反应的蛋白质或聚合物)要根据如下因素来确定，所述因素如需要衍生的程度(如单个位置、两个位置、三个位置等)、所选聚合物的分子量、聚合物有无分支和反应条件。
聚乙二醇分子(或其它的化学部分)在连接到蛋白质上去的时候要考虑到它们对蛋白质功能性或抗原性功能区的影响。有许多连接方法可以供本领域的技术人员使用。参见，如EP 0 401 384，其公开的内容在此引入以供参考(将PEG偶联至G-CSF上)；也可参见Malik等，实验血液学，20：1028-1035(1992)(报告用tresyl chlaride进行GM-CSF的聚乙二醇化)。举个例子，聚乙二醇可以通过一个活性基团，如一个自由氨基或羧基与氨基酸残基共价结合。活性基团是那些可以结合一个活化的聚乙二醇分子的基团。有自由氨基的氨基酸残基可以包括赖氨酸和N-末端氨基酸残基。有自由羧基的氨基酸残基可以包括天门冬氨酸、谷氨酸和C-末端氨基酸残基。巯基也可以作为一个连接聚乙二醇分子(或多个分子)的活性基团。出于治疗的目的，优选在氨基基团处进行连接，如在N-末端或赖氨酸基团处连接。如果要结合受体，则应避免在对于结合受体重要的位点进行连接。
有人或许特别想要一种N-末端化学修饰的蛋白。以聚乙二醇作为此组合物的一个例子进行说明，人们可以从许多聚乙二醇分子中进行挑选(通过分子量、分支情况等)，可以选择在反应混合物中聚乙二醇与蛋白(或多肽)分子的比例、要进行的聚乙二醇化反应的类型以及获得所选的N-末端被聚乙二醇化的蛋白的方法，以达到特定目的。获得N-末端聚乙二醇化制品(即若必要的话将这种部分与其它单位置聚乙二醇化的部分分开)的方法可为通过从一系列聚乙二醇化蛋白分子中纯化出该所需N-末端聚乙二醇化的蛋白。选择性N-末端化学修饰可通过还原性烷基化来完成，它是利用特定蛋白质中可供衍生的不同类型的伯氨基的不同反应活性(赖氨酸相对于N-末端)来完成的。在适当反应条件下，利用含羰基聚合物，可以在N-末端对该蛋白质实现基本上选择性的衍生。例如，在一定的pH值下，即可利用蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基和N-末端残基的α-氨基的pKa不同的pH值下进行反应，即可对蛋白质的N-末端选择性地实现聚乙二醇化。通过这样的选择性衍生，水溶性聚合物与蛋白的连接就可以被控制：与聚合物的结合主要发生在蛋白质的N-末端，其它活性基团，如赖氨酸侧链氨基基团不会发生明显的修饰。使用还原性烷基化，水溶性聚合物可以是属于上面所描述的类型，并且应该有与蛋白结合的单个活性醛基。聚乙二醇丙醛有单个的活性醛基，可以被使用。
本发明包括将原核细胞表达的GDNF或其变体连接到至少一个聚乙二醇分子上形成的衍生物的应用，以及通过酰基或烷基连接到一个或多个聚乙二醇分子上的GDNF或其变体的应用。
聚乙二醇化可以以任何本领域已知的聚乙二醇化反应进行。参见，如，Focus on Growth Factor 3(2)：4-10(1992)；EP0154316，其公开的内容在此引入以供参考；EP 0 401 384；以及其它此处引用的与聚乙二醇化有关的出版物。通过与活性聚乙二醇分子(或类似的活性水溶性聚合物)发生酰化反应或烷基化反应就可以进行聚乙二醇化。
通过酰化作用的聚乙二醇化通常包括用聚乙二醇的活性酯衍生物与GDNF蛋白或其变体反应。任何已知的或随后发现的活性PEG分子都可以用来进行GDNF蛋白或其变体的聚乙二醇化。优选的活性PEG酯是N-羟基琥珀酰亚胺PEG酯。本文中“酰化”应理解为包括但不限于下列各类存在于治疗性蛋白质和象PEG这样的水溶性聚合物之间的连接键：酰胺键、氨基甲酸酯键、氨基甲酸乙酯键等等。参见Bioconjugate Chem.5：133-140(1994)。反应条件可以从任何在聚乙二醇化技术领域中已知的反应条件或随后发展的反应条件中进行选择，但应避免能使待修饰的蛋白或变体失活的温度、溶剂和pH值等条件。
通过酰化作用的聚乙二醇化通常产生多处聚乙二醇化的GDNF蛋白或变体。连接键优选酰胺键。所得的产物也优选基本上只有(如＞95％)单个位置、两个位置或三个位置的聚乙二醇化。但是，根据所用的特殊反应条件，可能会产生大量的聚乙二醇化程度较高的蛋白。如果需要的话，利用常规纯化技术，包括透析、盐析、超滤、离子交换色谱、凝胶过滤色谱和电泳等，可以从混合物，特别是未反应的物质中分离出加纯净的聚乙二醇化蛋白。
通过烷基化作用的聚乙二醇化通常包括在有还原剂存在时用末端带醛基的PEG衍生物与GDNF蛋白或变体发生反应。通过烷基化的聚乙二醇化也会产生多处聚乙二醇化的GDNF蛋白或变体。此外，人们可以控制反应条件以利于基本上只在GDNF蛋白或变体N-末端的α-氨基处发生聚乙二醇化(即单个位置聚乙二醇化的蛋白)。不管是单个位置聚乙二醇化还是多个位置聚乙二醇化，PEG基团优选以-CH2-NH-基团与蛋白相连接。这种类型的连接键，特指-CH2-基团，此处被称作“烷基”连接键。
通过还原性烷基化用以制备单个位置聚乙二醇化产物的衍生方法利用了可供衍生的不同类型的伯氨基(赖氨酸对N-末端)的不同反应活性。反应是在一定的pH值下，即可利用蛋白质赖氨酸残基的ε-氨基和N-末端残基的α-氨基的pKa不同的pH值下进行的。通过这样的选择性衍生，含有醛基等反应基团的水溶性聚合物与蛋白的连接就可以被控制：与聚合物的结合主要发生在蛋白质的N-末端，其它活性基团，如赖氨酸侧链氨基基团不会发生明显的修饰。一个重要的方面是本发明包括使用单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)的结合分子的基本均质制剂(意思是聚合物分子基本上(即＞95％)只连接到GDNF蛋白或变体的一个位置)。更特殊的是，如果用到聚乙二醇，本发明也包括使用聚乙二醇化的缺乏可能有抗原性的连接基团的蛋白或其变体，并且使聚乙二醇分子直接偶联到GDNF蛋白或其变体上。
因此，根据本发明而使用的GDNF蛋白产物可以包括聚乙二醇化的GDNF蛋白或变体，其中单个或多个PEG基团通过酰基或烷基被连接上去。如上面所讨论的那样，这样的产物可以是单个位置聚乙二醇化，也可以是多个位置聚乙二醇化(如包含2-6个，优选包含2-5个PEG基团)。通常，PEG连接到蛋白质氨基酸的α-或ε-氨基基团上，但是可以设想的是，PEG基团可以连接到与蛋白质相连的任何氨基基团上，它已充分活化，在适当的反应条件下就可与PEG基团相连。
在酰化和烷基化的方法中使用的聚合物分子均可以从上述的水溶性聚合物中进行挑选。所选的聚合物应该被修饰成只含一个活性基团，如用于酰化的活性酯基或用于烷基化的醛基，而优选的选择为使得在使用本发明的方法时聚合度可控。活性PEG醛的一个例子是聚乙二醇丙醛，它是水溶性的；或者是其单C1-C10烷氧基或C1-C10芳氧基衍生物(参见，美国专利5,252,714)。聚合物可以有分支，也可没有分支。对于酰化反应，所选的单个或多个聚合物应该有单个活性酯基。对于还原性烷基化反应，所选的单个或多个聚合物应该有一个活性醛基。通常，水溶性聚合物不从自然存在的糖基化残基中选择，因为一般来说通过哺乳动物重组表达系统这些残基可以更方便地制备。聚合物可以是任何分子量，可以分支或不分支。
此处使用的一种特别优选的水溶性聚合物是聚乙二醇。本文中所用“聚乙二醇”意谓包含任何形式的用于衍生其它蛋白的PEG，如单(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。
通常，化学衍生可以在任何合适的使一种有生物学活性的物质与一种活化的聚合物分子发生反应的条件下进行。制备聚乙二醇化的GDNF蛋白或变体的方法通常包括下列几步：(a)在一定条件下使一种GDNF蛋白或变体与聚乙二醇(如PEG的活性酯或醛类衍生物)发生反应，由此蛋白与一个或多个PEG基团相连接；和(b)获取一种或多种反应产物。通常，烷基化反应的最佳反应条件将根据已知的参数和需要的结果具体情况具体对待。例如，PEG：蛋白的比值越大，多位置聚乙二醇化产物的百分比就越高。
用以制备基本均质的一系列单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合分子的还原性烷基化反应通常包括下列步骤：(a)在还原性烷基化反应条件下，使一种GDNF蛋白或变体与一种活性PEG分子反应，反应在一定的pH值，即可对该GDNF蛋白或变体氨基末端的α-氨基基团进行选择性修饰的pH值下进行；和(b)获得一种或多种反应产物。
对于基本均质的一系列单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合分子，还原性烷基化反应的条件是允许水溶性聚合物部分与GDNF蛋白或变体的N-末端发生选择性连接。这样的反应条件通常依赖氨酸氨基基团和N-末端的α-氨基基团之间pKa的不同而定(pKa是50％的氨基基团质子化，50％的未质子化时的pH值)。此pH值也影响所采用的聚合物和蛋白质的比值。通常，如果pH越低，就要求相对蛋白质而言聚合物的过量越多(即活性N-末端α-氨基越少，为达到最佳条件所需的聚合物就越多)。如果pH值较高，聚合物：蛋白质的比值就不需要那么大(即活性基团更多，故所需聚合物分子较少)。本发明中pH值通常会在3-9范围之内，优选3-6。
另一个重要的考虑是聚合物的分子量，通常，聚合物的分子量越大，与蛋白相连的聚合物分子就越少。同样，当要使这些参数最优化时，就应该考虑聚合物的分支情况。通常，分子量越大(或分支越多)，聚合物∶蛋白的比值就越大。通常，为了此处所要进行的聚乙二醇化反应，优选的平均分子量是约2kDa～约100kDa。优选平均分子量为约5kDa～约50kDa，特别优选的是约12kDa～约25kDa。水溶性聚合物与GDNF蛋白质或变体的比值通常在1∶1～100∶1，优选(对多个位置聚乙二醇化来说)1∶1～20∶1和(对单个位置聚乙二醇化来说)1∶1～5∶1。
使用上述条件，还原性烷基化作用将产生聚合物对任何在氨基末端有α-氨基基团的GDNF蛋白或变体的选择性连接，并且产生一种基本均质的单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合物的制品。术语“单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合物”此处用来指一种组合物，它包含单一的聚合物分子连接到GDNF蛋白或GDNF蛋白变体的一个分子上。单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合物优选在N-末端而不是在赖氨酸的侧氨基基团上有一个聚合物分子。该制品优选含单个聚合物/GDNF蛋白(或变体)结合物超过90％，更优选超过95％，并且剩余的能观察到的分子未发生反应(即缺少聚合物部分的蛋白质)。
至于此处的还原性烷基化作用，还原剂应该在水环境中稳定，优选只能还原在还原性烷基化反应过程一开始时形成的Schiff碱。优选的还原剂可以从氢硼化钠、氰氢硼化钠、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷中挑选。特别优选的还原剂是氰氢硼化钠。其它反应参数，如溶剂、反应时间、温度等以及产物纯化的方法，可以根据已出版的有关用水溶性聚合物衍生蛋白质的文献视具体情况而定(参见本文所引用的出版物)。C.GDNF蛋白产物药物组合物
GDNF蛋白产物药物组合物典型地包括一种治疗有效剂量的GDNF蛋白产物和一种或多种药用和生理上可接受的配制材料的混合物。合适的配制材料包括抗氧化剂、防腐剂、色素、香料、稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、膨化剂、缓冲剂、输送载剂、稀释剂、赋形剂和/或药物性佐剂，但不仅限于此。例如，合适的载剂可以是用以注射的水，生理盐水，或者人工合成CSF，还可能补充上其它的胃肠外给药的组合物中常见的材料。中性缓冲盐水或混合了血清白蛋白的盐水也是比较典型的载剂。
载剂中主要的溶剂本质上既可以是水性的，也可以是非水性的。此外，载剂中还可包括其它的可用于制药的赋形剂以调整或维持制剂的pH、渗透性、粘滞度、澄清度、颜色、无菌性、稳定性、溶解率或味道。同样，载剂中还可再包括其它的可用于制药的赋形剂以调整或维持GDNF蛋白产物释放的速度，或促进GDNF蛋白产物通过眼睛的各种膜而被吸收或促进它透过眼睛的各种膜。像这样的赋形剂通常和传统上是那些以单剂或多剂形式制成经胃肠外给药的制剂的物质。
一旦治疗性组合物被制成，它就可以作为溶液、悬液、凝胶、乳剂、固体、脱水或冻干的粉剂被贮存在无菌小瓶中。像这样的制剂既可以即用形式贮存，也可以给药前需重配的形式，如冻干粉贮存。
最佳药用制剂可以由本领域的技术人员考虑给药途径和需要的剂量等而决定。参见，如Remington制药科学，第18版(1990，Mack出版公司，Easten，PA 18042)，1435-1472页，其内容在此引入以供参考。这些制剂或许会影响GDNF蛋白、变体及衍生物的物理状态、稳定性、体内释放率和体内清除率。
其它有效的给药形式，如胃肠外缓释制剂、吸入雾剂或口内活性制剂均可以考虑。例如，以持续释放的制剂，GDNF蛋白产物可以结合或掺入到聚合物复合物(如聚乳酸、聚羟基乙酸等)或脂质体的微粒性制品中。Hylauronic acid也可以使用，这或许能延长在循环中持续的时间。GDNF蛋白产物药物组合物还可制成胃肠外给药如眼内灌注或注射的制剂，也可包括缓释或持续循环的制剂。像这样的胃肠外给药治疗性组合物典型的形式是无致热原、包含存在于药用载体中的GDNF蛋白产物、适于胃肠道外给药的水性溶液。一种优选的载剂是无菌蒸馏水。
我们也考虑了某些含GDNF蛋白产物的制剂要经口服给药。以这种方式使用的GDNF蛋白产物要用胶囊包裹，并且用或不用那些习惯上在合成固体制剂时使用的载体一起配制。胶囊可以设计成在胃肠道中当生物利用率最高而系统前降解最低的那一刻释放出制剂的有效成分。其它的赋形剂也可被包含在内以加速GDNF蛋白产物的吸收。稀释剂、香料、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、药片分散剂和粘合剂也可以使用。
局部眼用制品，包括用于眼部的溶液、悬液和软膏的配制，已为本领域的技术人员所熟知(参见Remington制药科学，第18版，86章，1581-1592页，Mark出版公司，1990)。其它的给药方式也可以用，包括眼房内注射(直接注射到前房或直接注射到玻璃体腔)、结膜下注射以及球后注射，制备以这样方式使用的眼用制品的方法和方式已经众所周知。
如本申请所用，“眼外”指的是眼睛表面和眼球与眼睑之间的(外面的)空间。眼外区的实例包括眼睑穹窿、结膜表面和角膜表面。这个部位在所有眼组织的外面，到达此部位不需要侵入性操作。眼外系统的实例包括嵌入物和“局部”应用的滴剂、凝胶或软膏，它们可以把治疗性物质送到这些区域。眼外装置通常很容易被去掉，甚至病人自己就可以。
下列专利公开了用以在眼外区使用药物的眼外系统。在美国专利号3,981,303、3,986,510和3,995,635中Higuchi等公开了一种包含药物的生物降解性眼用嵌入物。为了能在眼球的穹窿，即眼球和眼睑之间的眼外空间滞留，嵌入物被制成不同的形状。几种适合用来制作此装置的常见的生物相容性聚合物已被公开。这些聚合物包括藻酸锌、聚乳酸、聚乙烯醇、聚酸酐和聚羟基乙酸。这些专利也描述了减低药物渗透的膜包被装置和装有药物制剂的中空小室。
在美国专利号4,217,898中Theeuwes公开了用以进行控制性药物输送的微孔贮存器。这些装置被放在眼外眼穹窿中。感兴趣的聚合物系统包括聚氯乙烯-共聚聚乙酸乙烯酯共聚体。在美国专利号4,865,846和4,882,570中Kaufman公开了一种眼部药物输送系统，它包含至少一种针对结膜囊的可生物降解的材料或软膏载体。该专利公开了一些聚合物系统，如聚交酯、聚乙交酯、聚乙烯醇和交联的胶原，作为合适的输送系统。
在当前所述的GDNF蛋白产物治疗视网膜疾病或损伤的应用中，一种局部应用的眼用制剂包含一种能促进治疗药剂透入或运送到眼睛的媒剂也是很有好处的。这样的媒剂在本领域里已经知道。例如，Ke等在美国专利5,221,696中公开了能促进眼用制品透入角膜的材料的应用。
眼内系统是那些适合在眼睛本身各组织层之内、之间或周围的任何组织间隔中使用的系统。这些部位包括结膜下(在紧邻眼球的眼部粘膜之下)、眼球后(眼球的后面)和房室内(在眼球本身的房室内)。与眼外系统相反，要到达这些区域需要包括注射和植入在内的侵入性操作。
下列专利公开了眼内装置。在美国专利号4,853,224中Wong公开了用以导入眼内房室的微胶囊包裹的药物。在这个系统中使用的聚合物包括多聚酯和多聚醚。在美国专利号4,863,457中Lee公开了一种可生物降解的装置，为了治疗剂的持续性释放，它经外科手术植入眼内。这个装置被设计成用于结膜(眼球的粘膜)下外科手术植入。在美国专利号4,188,373中Krezancaki公开了一种能在人体温下胶化的药用载剂。此载剂是一种药物和树胶或纤维素来源的合成衍生物的水性悬液。在美国专利号4,474,751和4,474,752中Haslam等公开了一种在室温下是液态在体温下是胶体的聚合物-药物系统。适宜用于此系统的聚合物包括聚氧乙烯和聚氧丙烯。在美国专利5,384,333中Davis等公开了一种能提供长期药物释放的可生物降解可注射的药物输送聚合物。药物组合物由可生物降解的聚合物基质中的具药物活性的药剂组成，其中聚合物基质在温度是20°-37℃时是固态，在温度是38°～52℃时就具有流动性。药物输送聚合物并不只限于输送可溶性或液态药物制剂。比如，聚合物可以被用作一种基质以在注射部位固定和保留含有药物的微球、脂质体或其它结合了药物的微粒。
一种特别适于眼内注射的载剂是无菌蒸馏水，GDNF蛋白产物在其内被制成一种无菌等渗的溶液，并适当保存，另一种眼用制品可以包括GDNF蛋白产物与一种媒剂如可注射的微球或脂质体一起制成的制剂，其中媒剂使蛋白缓慢或持续性释放，这样蛋白就可以以储存注射的方式给药。其它合适的眼内导入GDNF蛋白产物的方式包括可植入的药物输送装置，其中含有GDNF蛋白产物。
本发明的眼用制品特别是局部制品可以包括其它的成分，如眼部可用的防腐剂、张力调节剂、共溶剂、致湿剂、复合剂、缓冲剂、抗微生物剂、抗氧化剂和表面活性剂，正如本领域中已众所周知的那样。比如，适宜的张力增强剂包括碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露醇、山梨醇等等。加入足量的张力增强剂是有好处的，这样要滴注入眼内的药品就会是低张或基本等张的。适宜的防腐剂包括氯化苯甲烃铵、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必太、山梨酸等等，但不仅限于此。过氧化氢也可以用作防腐剂。适宜的共溶剂包括甘油、丙二醇和聚乙二醇，但不仅限于此。适宜的复合剂包括咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精。适宜的表面活性剂或致湿剂包括山梨聚糖酯、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80、缓血酸胺、卵磷脂、胆固醇、tyloxapol等等。但不限于此。缓冲液可以是传统的缓冲液如硼酸盐、枸椽酸盐、磷酸盐或Tris-HCl。
制剂成分以眼外或眼内给药部位可以接受的浓度存在。如维持组合物的缓冲液是处于生理性pH值或稍低一点儿的pH值，典型地是处于pH值约5～约8。
其它的制剂成分可以包括能延长眼外给予的治疗剂在眼部的停留时间，以使局部接触最大化并促进吸收的材料。合适的材料包括能增加眼用制品粘滞度的聚合物或凝胶形成材料。在持续性释放液态眼用药物制剂中，作为一种眼部释放率控制剂，脱乙酰壳多糖是一种特别合适的材料(参见美国专利5,422,116，Yen等)。本发明的制剂是否适合眼用治疗剂在眼中有控制地释放(如持续性和长时间的释放)可通过本领域已知的各种操作如在Journal of Controlled Release 6：367-373，1987所描述的以及其变通方式来决定。
另一种眼用制品可包括有效量的GDNF蛋白产物与无毒的眼部可用的适于制成片剂的赋形剂的混合物。把片剂溶解于无菌水或其它合适的载剂中就可以制备单剂形式的眼用溶液。合适的赋形剂包括惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳酸或磷酸钙；或粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉，但不限于此。D.GDNF蛋白产物的给药/输送
GDNF蛋白产物可以通过皮下、肌内、静脉内、经肺、经皮、鞘内或大脑内途径胃肠外给药。对于治疗眼部情况，GDNF蛋白产物也可以更优先地经眼外或眼内给药，如上文所述那样，通过局部用药、嵌入、注射、植入、细胞治疗或基因治疗。例如，包含嵌入可生物降解的聚合物基质中的神经营养因子的缓释植入物就可以输送GDNF蛋白产物。GDNF蛋白产物还可以被化学修饰或被包装的形式大脑外给药，这样它就可以通过血脑屏障；或者它可以与一种或多种能促进GDNF蛋白产物穿过屏障的媒剂联合应用。同样地，GDNF蛋白产物可以眼内给药；或者它可以与一种或多种能促进GDNF蛋白产物穿过或运输过眼的各种膜的媒剂联合应用。给药频率取决于GDNF蛋白产物制品的药代动力参数和给药途径。
根据对体重、体表面积或器官大小的考虑，可计算出特殊的给药剂量。决定涉及上述每一种制剂的治疗所用的合适剂量所必需的进一步精确计算是本领域普通技术人员常规进行的，是在常规的任务范围之内，特别是根据此处公开的剂量信息和试验更易进行。通过使用已建立的确定所用剂量的测定方法结合适当的剂量-反应数据就可以确证合适的剂量。根据本发明目前的优选实施方案，GDNF蛋白产物最好以约0.001mg/天～10mg/天的剂量眼内给药，优选约0.01mg/天～1mg/天的剂量，最优选约0.1mg/天～0.5mg/天的剂量。本领域的技术人员将会理解眼内给药制剂所用的剂量与系统注射或口内给药所用剂量相比将会是很微小的。
治疗上述情况的方法里所用的最终剂量范围将由主治医生在考虑各种影响药物作用的因素，如病人的年龄、身体条件、体重、性别、饮食、任何感染的严重程度，用药时间和其它临床因素之后再作决定。随着研究的进行，与治疗各种疾病和情况所用的合适的剂量水平相关的更多信息还会出现。
我们设想对于一次给定的治疗，连续给药或持续性输送GDNF是有好处的。尽管连续给药可通过机械方式如通过灌注泵来完成，我们认为其它连续性或接近连续性的给药方式也是行得通的。例如，化学衍化或胶囊包被会产生蛋白质的持续性释放形式，根据已经决定的剂量范围，它们可以以能预测的数量持续存在。因此，GDNF蛋白产物包括为实现像这样的持续给药而被衍化或另行配制的蛋白质。
GDNF蛋白产物细胞治疗，如眼内植入产生GDNF蛋白产物的细胞，也有所考虑。这个实施方案包括给病人植入能够合成和分泌生物活性形式的GDNF蛋白产物的细胞。像这样的产生GDNF蛋白产物的细胞可以是GDNF蛋白产物的自然产生细胞(B49恶性胶质瘤细胞的类似物)，也可以是重组的细胞，其产生GDNF蛋白产物的能力已经通过用位于可促进其表达和分泌的载体中，编码所需GDNF蛋白产物的基因转化细胞而被增强。为了使被给予外来物种的GDNF蛋白产物的病人可能发生的免疫反应最小化，优选GDNF蛋白产物的自然产生细胞是人类起源的，并且产生人GDNF蛋白产物。同样地，优选产生GDNF蛋白产物的重组细胞以包含编码人GDNF蛋白产物的基因的表达载体转化。植入的细胞可以用胶囊包裹起来以避免周围组织的浸润。人或非人动物细胞可以包入生物相容的、半透性的聚合物套或膜内被植入病人体内，这样能允许GDNF蛋白产物释放，但防止细胞被病人免疫系统或被其它来自周围组织的有害因子破坏。这样的一个植入物，举个例子，可以被贴附于巩膜上而直接向玻璃体液中产生和释放GDNF蛋白产物。
我们也认为病人自身的细胞可以离体转化以产生GDNF蛋白产物，并且不用胶囊包被可直接植入。细胞用适当的载体转化并回植入病人的视网膜，在那儿它们会产生和释放所需的GDNF蛋白或GDNF蛋白变体。
在视网膜变性的动物模型中已经成功地进行了用以代替因视网膜疾病或损伤而有缺陷或丢失的细胞的感光器细胞移植研究(Sliverman和Hughes，实验眼科学与视觉科学，30：1684-1690，1989；Gouras等，Neuro-Ophthalmol.，10：165-176，1990)。我们认为感光器细胞可以从供者眼中获得并以培养物维持，如此处所述，然后，这些细胞就可以作为待移植的纯化的感光器来源经视网膜下层被移植到患视网膜疾病或损伤的病人的视网膜中。病人将接受免疫抑制疗法的治疗以减小对移植细胞的免疫反应和排斥。离体供者的视网膜要在有GDNF存在的情况下进行培养，目的是促其生长和存活。将接受感光器细胞移植的病人要进行GDNF玻璃体内注射，这对促进被移植的感光器的存活和成熟是必需的。
我们也考虑到通过核酸构建物或其它合适的运送载体的局部注射把编码GDNF蛋白产物的基因导入靶细胞中，就可以进行GDNF蛋白产物的体内基因治疗(Hefti，神经生物学杂志，25：1418-1435，1994)。如编码GDNF蛋白产物的核酸序列可被包含在腺病毒相关病毒载体或腺病毒载体中以运送到视网膜细胞中。其它的病毒载体包括逆转录病毒、单纯疱疹病毒和乳头瘤病毒载体，但不限于此。通过脂质体介导的转送、直接注射(裸露DNA)、受体介导的转送(配体-DNA复合体)、电穿孔、磷酸钙沉淀或微粒轰击(基因枪)(适合体内或离体进行)，也可以进行物理性转送。
用膜包裹活细胞的一套方法对本领域的普通技术人员来说是很熟悉的，并且不需过多的实验，就可完成对被包裹细胞的准备和在病人体内的植入。参见，如美国专利号4,892,538、5,011,472和5,106,627，每一个在此均特别引入以供参考。在Aebischer等的PCT申请WO91/10425中描述了一种包裹活细胞的系统，在此特别引入以供参考。也可参见Aebischer等的PCT申请WO 91/10470；Winn等，实验神经病学，113：322-329，1991；Aebischer等，实验神经病学，111：269-275，1991；Tresco等，ASAIO 38：17-23，1992；每一个均在此特别引入以供参考。其它的可植入装置在WO 93/21902(国际申请No.PCT/US 93/03850)中有所描述，该申请在此引入以供参考。许多其它的持续性或可控制性输送工具如脂质体载体、可生物降解的微粒或圆珠和沉积注射液的制作技术对本领域的技术人员来说也是熟知的。
应当指出的是此处所述的GDNF蛋白产物制剂在应用于人的同时也可用于兽医；术语“病人”不应以局限的方式解释。在兽医应用时，剂量范围应与上面所确立的一样。
在考虑了下面的说明性实例后就会了解本发明其它的方面和优点。实例阐述了GDNF蛋白产物对正常的和突变的视网膜神经元两者的影响。此外，实例中阐述了独特的培养视网膜细胞的技术。
                     实例材料和方法
下面的实例中所用材料的来源如下：
细胞培养基
高葡萄糖Dulbecco’s改良Eagle’s培养基(DMEM；#11965-092)，Ham’s F12培养基(F12；#11765-021)，不含碳酸氢钠的Leibovitz’s L15培养基(#41300-039)，B27培养基添加剂(#17504-010)，青霉素/链霉素(#15070-014)，L-谷氨酰胺(#25030-016)，Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(D-PBS；#14190-052)，钙盐和镁盐的Hank’s平衡盐溶液(HBSS；#24020-026)，H-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES；#15630-015)，小鼠层粘连蛋白(#23017-015)，牛血清白蛋白和第五组分(#110-18-017)均来自GIBCO/BRL，Grand Island，NY。热灭活的马血清来自Hyclone，Logan，Utah。L-鸟氨酸氢溴化物(P-3655)，牛胰岛素(I-5500)，人转铁蛋白(T-2252)，丁二胺(P-6024)，黄体酮(P-6149)，硒酸钠(S-9133)，来自Sigma化学公司，Saint-Louis，MO。木瓜蛋白酶，脱氧核糖核酸酶I(DNAase)和卵白蛋白(木瓜蛋白酶分解系统)来自Worthington生物化学公司，Freehold，NJ。Falcon无菌96孔板(#3072)、组织培养塑料器皿和聚丙烯离心管来自Beckon-Dickinson，Oxnard，CA。Nunc Lab-Tek组织培养小室玻璃盖片(#136439)来自Baxter，Irvine，CA。Nitex 20μm尼龙筛(#460)来自Tetko，Elmsford，NY。4″解剖镊和4″解剖剪来自Roboz Surgical，Washington，DC。
抗体、放射性同位素和相关试剂
兔多克隆抗体和小鼠单克隆rho 4D2抗牛视紫红质抗体来自BritishColumbia大学，Vancouver，Canada，兔多克隆抗体针对的是下面的视杆特异蛋白抑制蛋白的合成多肽序列：Val-Phe-Glu-Glu-Phe-Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cys(SEQ ID NO：2)。生物素化马抗小鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG、过氧化酶标记的亲合素/生物素复合体和得克萨斯红标记的链亲合素(ABC Elite；试剂盒PK-6100)来自Vector实验室Burlingame，CA。异硫氰酸荧光素标记的兔抗小鼠免疫球蛋白来自Dako公司(Carpinteria，CA)。3′，3′-二氨基联苯胺来自Cappel实验室，West Chester，PA。在PBS中的Superblock封闭缓冲液(#37515)来自Pierce，Rockford，IL。Triton X-100(X100)，Nonidet P-40(N6507)和过氧化氢(30％，v/v；H 1009)来自Sigma。L-〔3，4-3H〕-谷氨酸(NET-490；40-80 Ci/mmol)来自New England Nuclear，Boston，MA。Optiphase Supermix闪烁液来自Wallac，Turku，Finland。白色ViewPlate-96微量板(#6005182)来自Packard InstrumentsCorporation，Meriden，CT。除非特别说明，所有其它试剂均来自SigmaChemical Company (Saint-Louis，MO)。
培养基的配制
用DMEM和F12培养基1∶1的混合物配制成基本培养基，并补充B27培养基添加剂50倍浓缩贮存液。B27培养基添加剂包括生物素、L-肉硷、皮质酮、乙醇胺、D(+)-半乳糖、还原型谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸、黄体酮、丁二胺、乙酸视黄酯、硒、T3(triodo-1-甲腺原氨酸)，DL-α-生育酚(维生素E)、DL-α-生育酚乙酸酯、牛血清白蛋白、过氧化氢酶、胰岛素、超氧化物歧化酶和转铁蛋白。加入终浓度约2mM的谷氨酰胺，约100 IU/l的青霉素和约100mg/l的链霉素。以约2.5％的终浓度加入热灭活的马血清，以约5g/l的终浓度加入D-葡萄糖，以约20mM的浓度加入HEPES缓冲剂，以约2.5mg/ml的终浓度加入牛胰岛素，以约0.1mg/ml的终浓度加入人转铁蛋白。混合后，调pH值至约7.3，培养基4℃保存。培养基要用前新鲜配制以减少实验间的差别。为减少蛋白吸附，自始至终要使用塑料移液管和容器。
GDNF蛋白产物溶液
用含5％牛血清白蛋白的D-PBS(用蒸馏水配制的磷酸盐缓冲液)配制1mg/ml纯化的重组人GDNF蛋白产物的溶液。溶液在-85℃分装保存。在96孔板中配制系列稀释液。在含培养基(90μl)的细胞培养物中加入10μl 10倍浓缩的GDNF蛋白产物。对照培养物中加入含5％白蛋白的D-PBS(10μl)。细胞铺板后一小时开始用GDNF蛋白产物处理，在某些情况下，每隔一天重复一次。
培养基质
为促进感光器在基质上的最大粘附及外节的生长和轴突的生长，培养板表面(培养基质)要根据下述步骤先后用多聚L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被。室温下，用多聚鸟氨酸在0.1M硼酸(pH 8.4)中的0.1mg/ml的无菌溶液完全覆盖培养板表面，持续至少一个小时，然后用无菌的Super-Q水冲洗。接下来吸干冲洗的水，加入溶于PBS的小鼠层粘连蛋白的1μg/ml溶液，37℃孵育2个小时。这些步骤要在用板之前进行，以保证结果的重复性。
鸡和小鼠感光器培养物的制备
17天大的White Leghor鸡胚胎和5天大的C578l/b幼鼠(获自Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine)被断头处死，无菌分离眼睛，放入L15培养基中(不含碳酸氢钠)。每次实验最多取24只眼睛。将眼睛对切开，去掉晶体和玻璃体。小心剥离出视网膜神经层，去掉色素上皮，把它切成小块(约1平方毫米或更小)后放入冰冷的D-PBS中。收集细胞，然后转入10ml分解培养基中(HBSS中含120单位的木瓜蛋白酶和2000单位的DNAase)。细胞在转速约200rpm的旋转平台振荡器上以约37℃孵育45分钟。然后用火琢的Pasteur吸管研磨打散，过20μm Nitex尼龙筛以去掉未解离的组织，用一台IEC临床用离心机以200xg离心5分钟。所得的细胞沉淀用含卵白蛋白和约500单位DNAase的HBSS重悬，铺在4％卵白蛋白(在HBSS中)上面，以500xg离心约10分钟。最终的细胞沉淀用完全培养基(见上)重悬，调至约15,000个细胞/ml，铺到以前用多聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被过的96孔板的6-mm孔中，每孔90μl。细胞很快就会贴壁，植板率约75％。
取自成年小鼠视网膜的感光器培养物
成熟感光器的培养物是把已分离的取自出生后18-39天小鼠的视网膜细胞铺到预先建立的出生后5天小鼠视网膜胶质细胞单层细胞或大鼠视网膜色素上皮细胞单层细胞的上面而获得的。分离的步骤和培养基同上面所述。视网膜胶质细胞和色素上皮细胞的培养是在组织培养瓶(225cm2 Costar培养瓶)中进行，一直长到出现细胞汇合。接下来通过与0.1％胰蛋白酶进行短暂的(约2分钟)共育，细胞被分开，再将细胞铺到96孔板或16孔玻璃盖片小室中。约3-5天后加入分离的成熟视网膜细胞。
取自rd/rd小鼠视网膜的感光器培养物
Rd/rd C57Bl/b小鼠(获自Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine)有因表达磷酸二酯酶(定位于外节，参与光传导过程的一种酶)的β亚单位的一种突变所致的遗传性感光器变性。这些小鼠为研究营养因子对受损感光器的作用提供了一种有用的模型。rd/rd小鼠感光器的死亡在出生后10天左右达到高峰。从5天大的小鼠建立rd/rd感光器培养物，培养物维持8天。涵盖了感光器死亡最多的阶段。经分离的视网膜细胞以每6-mm孔约10,000个细胞的密度铺在预先建立的视网膜胶质细胞的单层细胞上(参见上文)，在上文所讲的培养基中维持。
感光器的免疫组织化学
为了鉴定小鼠的感光器，使用了Louis等所述的间接免疫过氧化物酶法(J.Pharmacol.Exp.Therp.，262：1274-1283，1992；科学，252：689-692，1993)，并作了如下细微的改动。感光器培养物在室温下用溶于D-PBS，pH 7.4的4％低聚甲醛固定约30分钟，然后用D-PBS洗三次(每个6-mm孔200μl)。已固定的培养物然后被孵育于在PBS中的Superblock封闭缓冲液，其中含1％Nondiet P-40以增加抗体的透入。接着在同一缓冲液中使用1∶1000-1∶4000稀释的抗视紫红质抗体(兔的和小鼠的)，培养物在旋转振荡器上37℃孵育1小时。在D-PBS洗三次之后，使用羊抗兔或马抗小鼠的生物素化IgG(Vectastain试剂盒，来自Vector Laboratories，Burlingame，CA)约1∶500稀释后检测与感光器结合的抗体：这些第二抗体在37℃与细胞共育约1小时，然后用D-PBS洗细胞三次。第二抗体接着用1∶500稀释的亲合素-生物素-过氧化物酶复合物标记，细胞在37℃孵育约45分钟。D-PBS再洗3次之后，被标记的细胞培养物在含0.04％3′，3′-二氨基联苯胺四盐酸、0.06％NiCl2和0.02％过氧化氢的0.1MTris-HCl中反应5-20分钟。
对于双染实验，培养物要在玻璃盖片小室中生长。在低聚甲醛固定、增强通透性和封闭非特异性部位(如上文所述)之后，培养物用兔抗抑制蛋白抗体和小鼠抗视紫红质抗体孵育。通过更进一步地与生物素化羊抗兔IgG以及接下来的得克萨斯红标记的链亲合素(1∶200稀释)一起孵育，就可测出抑制蛋白。通过进一步地与异硫氰酸荧光素标记的兔抗小鼠IgG就可测出视紫红质。使用适当的适合得克萨斯红和荧光素的滤片，在落射荧光显微镜下就可看到荧光。
检测感光器存活
小鼠感光器培养物的固定、处理和免疫染色如上述，然后用明视场显微镜(bright-light optics)放大200倍进行检测。计数一个直径样长1×6mm条带中被染色的神经元数目，此条带代表了一个6-mm孔全部表面积的约20％。活感光器的特征在于有形状规则的胞体，通常还有一个短的轴突样突起。表现出变性迹象如有不规则的空泡样核周体或碎片状轴突的感光器被排除在计数之外(不过大多数变性的感光器会脱离培养基质)。细胞数目要么表示为细胞数/6-mm孔，要么表示为相对于对照细胞密度的倍数变化。
对轴突的分析
轴突(即感光器胞体的突起)发育的形态测量分析是通过使用小鼠视网膜的6天培养物进行的。为测出抑制蛋白，对每个6-mm孔约含10,000个神经元的培养物进行免疫染色并用明视场显微镜检查。用Optronics摄像机拍照随机选择的视野中对照和经处理的6-mm孔中培养物里的感光器，最后的放大倍数接近800倍。利用一根偶联至SummaSketchll digitizing tablet(Summagraphics Corporation，Houston，TX)的细探针，通过一种数字化程序(MacMeasure 1.9)和一台Macintosh Centris 650个人电脑，测量每一个感光器的轴突长度，就可确定轴突的大小。结果
                        例 1
在出生后小鼠视网膜培养物中对视杆感光器的存活和发育的促进作用
用小鼠的视网膜培养物来显示GDNF蛋白产物对感光器存活的影响。感光器培养物的制备是通过在补充了B27培养基添加剂、2.5％热灭活马血清、D-葡萄糖、HEPES、胰岛素和转铁蛋白的DMEM/F12培养基中以每个6-mm孔约12,500个细胞的密度将已分离的视网膜细胞铺到多聚鸟氨酸-层粘连蛋白包被的培养板中。以抑制蛋白(一种视杆特异性抗原)和视紫红质(视杆特异性视觉色素)免疫反应性的存在鉴定感光器。
在体外6天后，细胞用4％低聚甲醛固定，培养物中的感光器用抑制蛋白进行免疫染色，抑制蛋白为鉴定哺乳动物视杆感光器的一种标志。免疫染色之后，如上述，对挑选出来的有不同类型视网膜细胞存在的视野作相差显微镜检查可识别出感光器(在针对抑制蛋白的免疫染色之后，为覆盖褐色反应物质的小细胞而可鉴定)、神经元和Mueller胶质细胞。对指定区域的明视场检查显示抗抑制蛋白抗血清(在兔体内针对抑制蛋白特异性合成多肽而产生的抗血清)主要与视杆感光器结合，不与其它的视网膜神经元或Mueller胶质细胞结合。
根据抑制蛋白免疫反应性确定培养物中约90％的细胞是感光器。剩下的细胞是大的多极和小的单极NSE阳性神经元。接下来细胞作针对视紫红质的免疫染色。大约50％的感光器表达视杆视觉色素视紫红质，如用小鼠抗视紫红质单克隆抗体作免疫染色所测定的那样。感光器表现为胞体直径较小的圆形细胞，有一或两个轴突，有一些还有代表连接纤毛的短的垂直突起。在这种分辨率水平下，没有外节形成的证据。
出生后6天的小鼠的视网膜培养物接着被用来评价使用GDNF蛋白产物对感光器存活的影响。用重组人GDNF蛋白产物(从10ng/ml～1pg/ml作10倍连续稀释)处理感光器培养物(10,000/6-mm孔)。6天后固定培养物，针对抑制蛋白作免疫染色，通过计数每6平方毫米视野(代表一个6-mm孔全部表面积的约21％)中抑制蛋白阳性细胞数来测定感光器的存活情况。
在不经GDNF蛋白产物处理的培养物中，感光器的数目随时间的推移逐渐下降，培养6天后达到开始时数目的约25％。用大肠杆菌表达的重组人GDNF蛋白产物处理这些培养物导致培养6天后活下来的抑制蛋白阳性感光器的数目增加约两倍(参见图1；每个值是3次培养的平均值±标准差)。GDNF蛋白产物的效应在约200pg/ml时最大，ED50约为30pg/ml。
除了促进感光器存活，GDNF蛋白产物的加入也刺激了感光器轴突样突起(进一步称作轴突)的伸展，因而显示了对感光器形态学发育的影响。感光器的培养物在有或没有重组人GDNF蛋白产物的存在下(1ng/ml)孵育6天，然后针对抑制蛋白进行免疫染色。来自两个独立的对照培养物的约715个感光器和来自两个独立的经GDNF蛋白产物处理的培养物的约710个感光器被拍照并分析其轴突长度。通过测量感光器轴突的长度可以定量确定使用GDNF蛋白产物对轴突伸长的影响。图2显示了GDNF蛋白产物对感光器轴突生长的促进作用。数据被绘制成轴突长度的累积频率分布图，图中包括其轴突长度比用毫米表示的给定长度(横坐标)长的感光器的百分数(纵坐标)。与未经处理的培养物相比，GDNF蛋白产物的加入使轴突长度的分布向高值偏移。在GDNF蛋白产物处理过的培养物中一些感光器有长约180μm的轴突，而在未经处理的培养物中观察到的最长的轴突长100μm。与对照培养物中感光器的轴突平均长度为27μm相比，经GDNF蛋白产物处理的培养物中感光器轴突的平均长度为68μm。
感光器用谷氨酸作为神经递质向二级神经元传递信号。在含感光器＞90％的培养物中，细胞摄取谷氨酸的程度表示了存在于感光器上的高亲合性谷氨酸再摄取转移位点的数目和活性，因而反映了感光器功能的分化。测定GDNF蛋白产物的使用对谷氨酸摄取的刺激作用以估测它对感光器功能分化的影响。培养物如上面所讲述的那样进行培养，用或不用重组人GDNF蛋白产物处理6天。然后根据下述步骤处理培养物进行〔3H〕谷氨酸(50nM；1.5×106dpm/ml；37℃孵育1小时)的摄入。
谷氨酸摄入实验：通过培养在96孔板中的来自5天大幼鼠的感光器培养物测定谷氨酸的摄入。培养物用约100μl预热的摄入缓冲液洗三次，此缓冲液由含约120mM NaCl、4.7mM KCl、1.8mMCaCl2、1.2mM MgSO4、32mM NaHPO4、1.3mM EDTA和5.6mM D-葡萄糖，pH 7.4的改良Krebs-Ringer溶液组成。细胞然后在摄入缓冲液中37℃预孵育约10分钟。接着将氚标记的谷氨酸(约60Ci/mmol)以在75μl摄入缓冲液中的50nM的浓度加到培养物中，培养物在37℃孵育约60分钟。通过吸出孵育液终止摄入，接着用约120μl的冰冷的摄入缓冲液快速洗三次。加入200μl Optiphase Supermix闪烁液(Wallac)裂解细胞，利用一台Wallac MicrobetaPlus 96孔微量板读数仪以闪烁光谱测定法测定放射活性。结果要么表示为dpm/6-mm孔，要么表示为相对对照培养物的倍数变化。
GDNF蛋白产物被发现以剂量依赖方式刺激谷氨酸摄入，在约200pg/ml时达到最大活性，ED50为约25pg/ml。结果表示在图3中。每个数据点是一次代表性实验的3个孔的平均值±标准差。在两次独立的实验中获得了相同的结果。结果显示，除了促进感光器的存活和形态学发育之外，GDNF还促进了神经传导相关的功能如谷氨酸摄入的成熟，它对视觉传导过程是至关重要的。
                      例 2
在成年小鼠视网膜培养物中对视杆感光器存活和再生的促进作用
在出生约3周之后，感光器发育结束。这时感光器形成了功能性外节，它集中了光传导所必需的细胞装置，包括视觉色素。成熟大鼠感光器从18和39天的视网膜中分离出来，维持培养超过1周。神经元(以约2,500/6-mm孔的密度)铺在预先存在的单层视网膜胶质细胞上。胶质细胞促进分离下来的感光器的贴壁，提供给它们发育所不可缺少的营养和因子。使用上述的抗体和免疫染色技术，通过针对抑制蛋白和视紫红质的双染可鉴定出与视网膜胶质细胞共培养的成熟感光器。
培养物用重组人GDNF蛋白产物(0.1、1或10ng/ml)进行处理。7天后固定细胞，进行针对抑制蛋白的免疫染色。通过计数每6-mm孔中抑制蛋白阳性神经元的数目测定感光器的存活情况。18和39天视网膜的培养物中视杆感光器的数目在经GDNF蛋白产物处理的培养物中高约3.5倍(参见图4；每个值是2-3次培养的平均值±标准差)。GDNF蛋白产物浓度为约300pg/ml时作用最大，ED50为约40pg/ml。这些结果说明由于GDNF蛋白产物的处理感光器数目发生了变化，因而说明了对感光器存活的促进作用。
在进一步的研究中，被分离的视网膜细胞铺在预先建立的单层小鼠视网膜胶质细胞上(1000视网膜细胞/6-mm孔)，并用重组人GDNF蛋白产物(1或10ng/ml)处理。7天后固定培养物，进行针对抑制蛋白的免疫染色。除促进感光器的存活外，GDNF蛋白产物被发现强烈促进感光器的形态学发育，如表现出来的轴突的生长和在某些情况下，一个短的尖突起的生长，提示是一个不成熟的外节。这些培养物来源于成熟的视网膜，感光器在其中已经充分发育。由于感光器在分离过程中失去了它们的突起，目前的数据表明GDNF蛋白产物有促进感光器再生的能力，特别是促进对视觉过程至关重要的轴突和外节的发育。这些结果表明GDNF蛋白产物的使用或许是一种针对因感光器变性而导致视觉丧失的情况，如老年性黄斑变性、遗传性视网膜变性和其它视网膜营养不良的有效治疗方法。
                           例 3
在遗传性视网膜变性小鼠(rd/rd)的视网膜培养物中对视杆感光器存活的促进作用
Rd/rd小鼠在磷酸二酯酶(一种定位于外节参与光传导过程的酶)的β亚单位有突变，这导致了它的功能障碍，引起感光器早发性变性和暴发性死亡。在人身上存在着与rd/rd类似的突变，它是一部分色素性视网膜炎病例的发病原因。rd/rd小鼠感光器的死亡在出生后10天左右达到高峰。这些突变小鼠为研究GDNF蛋白产物对rd/rd感光器存活的影响提供了有用的模型。
对取自5天大小鼠的rd/rd感光器进行培养，维持培养7天，覆盖了感光器死亡发生最多的时期。由于它们先天就容易患病，因此被分离的rd/rd感光器(以约2,500/6-mm孔的密度)铺在预先建立的单层视网膜胶质细胞上(如上文所述)。将rd/rd视网膜培养物与取自同年龄以同样方式处理的正常(野生型)小鼠视网膜细胞培养物进行比较。培养物用重组人GDNF蛋白产物(1ng/ml)进行处理，7天后固定并进行针对抑制蛋白的免疫染色。通过计数每个6-mm孔中抑制蛋白阳性的神经元数目测定感光器的存活情况。
GDNF蛋白产物的加入使在体外培养7天后感光器的数目发生不太大但是很明显的增长(参见图5；每个值是3-4次培养的平均值±标准差)。与之形成对照的是不加入GDNF蛋白产物，即使有胶质细胞的支持，rd/rd小鼠培养物中感光器的数目在培养7天后急剧下降至野生型感光器的约40％。有GDNF蛋白产物的存在(1ng/ml)，存活的rd/rd感光器的数目增加了约2.5倍，达到了在未处理的野生型感光器培养物中所见到的存活的水平。这些数据表明GDNF蛋白产物的处理使突变的感光器更能抵抗rd/rd突变施加给它们的压力。这说明使用GDNF蛋白产物可能对治疗遗传性视网膜变性如色素性视网膜炎有用。
                          例 4
在鸡胚视网膜培养物中对视锥感光器存活和外节发育的促进作用
鸡视觉系统的发育比啮齿动物视觉系统的发育要早得多。感光器外节的生长开始于孕期约11-12天，出生时感光器已经发育完全。因此，可以在鸡胚视网膜的培养物中研究使用GDNF蛋白产物对感光器存活和再生的影响。
17天鸡胚视网膜细胞在96孔板中培养，如上文所述，体外培养6天后用4％的低聚甲醛固定。培养物被发现含有约60％感光器和40％大的多极神经元。对对照培养物一个有代表性的视野进行相差显微检查发现培养物中主要存在两类视网膜细胞：视锥感光器，通过在胞体顶端有一个液滴可进行鉴定，以及视网膜神经元。感光器细胞可以通过几乎全部被胞核占据的卵圆形胞体、一个短的含有小液滴的内节、从液滴对侧伸出的单一短的未分支轴突以及一个短的远侧纤毛而进行鉴定。这些特点是视锥的特征。如上文所述作抗视紫红质的免疫染色，对6天的培养物进行明视野显微检查发现有视杆感光器的存在。据检测约20％的感光器是视杆。剩下的80％感光器是视锥感光器，不含视紫红质。
图6表示GDNF蛋白产物对17天鸡胚视网膜培养物中感光器存活的影响。用重组人GDNF蛋白产物(从10ng/ml～1pg/ml作10倍连续稀释)处理经分离的视网膜细胞培养物(以约10,000/6-mm孔铺板)。6天后用4％低聚甲醛固定培养物并在相差显微镜下进行观察。以明相液滴的存在鉴定视锥感光器。液滴标志着内节和外节之间的连接。通过计数每6平方毫米直径样长条带(代表每个6-mm孔全部面积的约21％)中视锥的数目测定感光器的存活情况。每个值是三次培养的平均值±标准差。在经GDNF蛋白产物处理的鸡视网膜培养物中发现的视锥数目比未经处理的培养物中要高约2倍。GDNF蛋白产物的最大效应在约200pg/ml时可观察到，ED50约为50pg/ml。
用相差显微检查法测评感光器的细胞形态，发现GDNF蛋白产物促进了内节和外节以及轴突的发育。与未经处理的培养物相反，经GDNF蛋白产物处理的培养物(1ng/ml持续7天)含高比例的视锥感光器，表现为高度延伸、多极化、隔室化的细胞。这些视锥有一个伸长的内节，在某些培养物中它与一个三维的明相结构相连。而后者是外节的特征。其它的视锥形成一个细长有分支的轴突。在某些情况下，在GDNF蛋白产物处理的培养物中观察到伸出两个外节(鸟类视网膜的典型特征)的双视锥。GDNF蛋白产物除了有促细胞存活/增殖的作用外，它对鸡培养物外节发育的影响说明它有促进因分离操作而被损伤的外节再生的作用。这反过来说明使用GDNF蛋白产物除了对治疗遗传性视网膜变性情况和视网膜病有效之外，对治疗视网膜营养不良也有效。
本领域技术人员在考虑了前文对本发明目前优选的实施方案的描述之后，在实践本发明过程中可进行各种修改和变动。因而，本发明的范围仅由所附权利要求限定。
                    序列表(1)一般信息：
(i)申请人：Jean-Claude Louis
(ii)发明名称：用胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白
              产物治疗感光器的方法
(iii)序列数目：2
(iv)通讯地址：
    (A)联系人：AMGEN INC
    (B)街道：1840 DeHavilland Drive
    (C)城市：Thousand Oaks
    (D)州：California
    (E)国家：美国
    (F)邮政编码：91320
(v)计算机可读形式：
    (A)载体类型：软盘
    (B)计算机：IBM兼容
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patent Release#1.0，Version#1.25
(vi)当前申请资料：
    (A)申请号：
    (B)申请日：
    (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
    (A)姓名：Curry，Daniel R
    (B)登记号：32,727
    (C)参考/摘要号：A-263
(ix)电讯信息：
    (A)电话：805-447-8102
    (B)传真：805-449-8011
    (C)电传：(2)SEQ ID NO：1信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：134氨基酸残基
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特点：
   (A)名称/关键词：推断的成熟人GDNF氨基酸序列
(xi)序列表述：SEQ ID NO：1Ser Pro Asp Lys Gln Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg1               5                   10                 15Gln Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg
        20                  25                  30Gly Gln Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala Ile His Leu
     35                  40                  45Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile
 50                 55                  60Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp65                  70                  75                  80Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys
             85                  90                  95Val Gly Gln Ala Cys Cys Arg Pro Ile Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser
        100                 105                 110Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Ala
    115                 120                 125Lys Arg Cys Gly Cys Ile
130(2)SEQ ID NO：2信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：12氨基酸残基
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线性
(ix)特点：
   (A)名称/关键词：视杆特异性蛋白抑制蛋白的合成多肽序
                   列
(xi)序列表述：SEQ ID NO：2
Val Phe Glu Glu Phe Ala Arg Gln Asn Leu Lys Cys
1                5                   10

Claims (12)

1.一种胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物在制备治疗感光器损伤或变性的药物组合物中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其中感光器的损伤或变性与色素性视网膜炎、Bardet-Biedl综合征、Bassen-Kornzweig综合征(β-脂蛋白缺乏症)、Best病(卵黄型营养障碍)、无脉络膜、环状萎缩、先天性黑蒙、Refsum综合征、Stargardt病、Usher综合征、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病、周围性玻璃体视网膜病、感光性视网膜病、手术诱发的视网膜病、病毒性视网膜病、局部缺血性视网膜病、视网膜脱离或创伤性视网膜病相关。
3.根据权利要求1或2的应用，其中药物组合物包含在SEQ ID NO：1中列出的GDNF氨基酸序列或其变体、衍生物。
4.根据权利要求3的应用，其中药物组合物包含[Met-1]GDNF。
5.根据权利要求1或2的应用，其中药物组合物包含连接到水溶性聚合物上的GDNF。
6.根据权利要求1或2的应用，其中药物组合物包含截短的人GDNF蛋白。
7.根据权利要求1或2的应用，其中药物组合物包含经修饰能产生和分泌GDNF蛋白产物的细胞。
8.根据权利要求1或2的应用，其中药物组合物进一步包含有效剂量的治疗视网膜疾病的第二种治疗剂。
9.根据权利要求8的应用，其中第二种治疗剂选自脑源神经营养因子、神经营养素-3、神经营养素-4/5、神经营养素-6、胰岛素样生长因子、睫状体神经营养因子、酸性和碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-5、转化生长因子-β和可卡因-安非他明调节的转录子。
10.根据权利要求1或2的应用，其中药物组合物配制成眼内嵌入物、眼内注射物或眼内植入物。
11.提供用于植入的感光器细胞的方法，包括在胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物存在的情况下培养经分离的感光器细胞。
12.包含感光器细胞和在数量上能促进该感光器细胞存活、允许其持续性生长和成熟的、胶质细胞系衍生神经营养因子(GDNF)蛋白产物的组合物。
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