CN113759131A - 一种靶标蛋白组合在检测视网膜黄斑病变中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶标蛋白组合在检测视网膜黄斑病变中的应用，属于视网膜黄斑病变的快速检测技术领域，包括含有P蛋白的金标抗体、A蛋白的金标抗体的试剂；这种试剂主要用于与泪液样品预混后制成混合液，再进行后续检测。本发明还公开了一种基于上述金标抗体，制备的胶体金试纸条和检测试剂盒。本发明首次发现了选取特定氨基酸序列的P蛋白、A蛋白为对象制备相应的金标抗体进行联用，能够作为胶体金等检测手段的试剂，用于检测视网膜黄斑病变中，具有非常高的检测准确性。
Description
技术领域
本发明属于视网膜黄斑病变的快速检测技术领域，特别是靶标蛋白组合在检测视网膜黄斑病变中的应用。
背景技术
人的视网膜病变分为两种类型(两种阶段)：非增生型视网膜病变和增生型视网膜病变。在非增生型视网膜病变阶段，眼睛中有些地方(微血管瘤血管)扩张，也可能出现血管堵塞或有少量出血(视网膜出血)，并有液体渗漏到视网膜内。增生型视网膜病变阶段是更晚期和更严重的疾病状态，眼睛内开始生长出新的血管(血管生成)。这些新的血管非常脆弱并可能流血(出血)。随后视网膜和眼睛的其他部分(玻璃体)出现小块疤痕，最终导致视力丧失，并产生其他问题。
现有技术中，例如中国授权专利CN102994507B提供了一种视网膜色素变性相关基因的鉴别以及与其相关的产品、方法及用途，该发明提供了一种试剂和相应的试剂盒，能够鉴别出人CYP4V2基因中是否存在突变，含有突变的人CYP4V2基因的受试者患有视网膜色素变性疾病；试剂包含至少两对特殊的PCR引物。然而，该专利文献，均仅仅研究了CYP4V2基因突变对视网膜黄斑病变的存在的影响，应用于视网膜黄斑病变检测中效果仍有待验证。对于如何快速、便捷、准确地检测视网膜黄斑病变，仍具有非常广阔的研发前景。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了一种靶标蛋白组合在检测视网膜黄斑病变中的应用，这种靶标蛋白组合为P蛋白和A蛋白，将这两种蛋白的序列送至第三方生物技术公司生产合成相应的金标抗体以及用于胶体金试纸条检测线处包被的抗体，就能够用于检测视网膜黄斑病变，且具有较高非常高的患病符合率。具体通过以下技术实现。
一种用于检测视网膜黄斑病变的金标抗体组合，包括P蛋白的金标抗体和A蛋白的金标抗体；所述P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，所述A蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.02所示。上述金标抗体组合，可以应用于利用胶体金法检测受测人是否患有视网膜黄斑病变的诊断中。例如可以将上述金标抗体组合用于包被在硝酸纤维素膜上制成胶体金试纸条。
上述试剂中所用的两种蛋白的金标抗体，是将两种蛋白的氨基酸序列提供给第三方金标抗体合成机构合成的。利用提供的氨基酸序列合成和制备相应的金标抗体，属于行业内非常成熟的技术。只要是提供的上述两种蛋白的金标抗体，就都可以用于本发明的上述试剂中，并同样能取得相似的技术效果。
一种用于检测视网膜黄斑病变的试剂，包括P蛋白的金标抗体、A蛋白的金标抗体；所述P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，所述A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示。
技术人员发现，将上述两种蛋白的氨基酸序列作为靶向蛋白序列，按照胶体金检测技术，特定地制备上述两种蛋白相应的金标抗体，并将这两种金标抗体联合使用在受测试人员是否患有视网膜黄斑病变的诊断检测中，偶然发现具有非常高灵敏度和准确性。相比于单独使用上述两种氨基酸片段的金标抗体中的任意一种，其患病检出率都明显不及两者联合使用的情况。上述试剂的使用方法，例如可以将采集的待测试人员的泪液与上述试剂混合，然后滴加到胶体金试纸条中，或是用于其他荧光免疫检测中。
优选地，P蛋白的金标抗体的用量为1:5000(1mg/ml)，A蛋白的金标抗体的用量为1:5000(1mg/ml)。
更优选地，所述试剂中还包括体积分数为5％的甘油，以及质量体积分数为5％的牛血清蛋白。
本发明还提供了一种用于检测视网膜黄斑病变的胶体金试纸条，在硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线上包被有用于抗P蛋白的第一抗体(直接在市场上的第三方生物技术公司下单采购即可)，所述第二检测线上包被有抗A蛋白的第二抗体(直接在市场上的第三方生物技术公司下单采购即可)，所述质控线上包被有抗Ig片段的兔多克隆抗体(浓度为1:10000(1mg/ml)，直接在市场上的第三方生物技术公司下单采购即可)；所述P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，所述A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示。
上述胶体金试纸条的双检测线的技术方法，以及试纸条的结构、制备方法、装配方式，都是本领域非常成熟的技术。胶体金试纸条的种类很多，例如最常规的将上述用于检测视网膜黄斑病变的试剂制备成胶体金垫，搭接在试纸条的上样区和检测区之间；也可以采用微孔胶体金试纸条的技术思路，预先将上述试剂与采集的待测泪液混合后，滴加到试纸条的微孔上。不论是哪种胶体金试纸条，其技术原理和所用的上述试剂都是相同的。
本发明还提供了一种用于检测视网膜黄斑病变的试剂盒，包括P蛋白的金标抗体溶液和A蛋白的金标抗体溶液，还包括上述的胶体金试纸条；所述P蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.01所示，所述A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示。
上述胶体金试纸条的使用方法是，将待测患者的泪液与上述试剂混合5min；如果待测患者的泪液中含有P蛋白或A蛋白，就会被相应的金标抗体结合形成复合物，然后将这种含有复合物的样品混合液滴加到试纸条的加样区(或微孔中)，样品混合液在试纸条上扩散到NC膜上进一步层析；首先遇到包被在NC膜上的第一检测线位置的抗P蛋白的第一抗体时，复合物又和第一抗体结合，被捕获在第一检测线处；然后继续扩散遇到包被在NC膜上的第二检测线位置的抗A蛋白的第二抗体时，复合物又和第二抗体结合，被捕获在第二检测线处。随着被捕获的胶体金复合物达到一定数量，就形成一条肉眼可见的第一或第二检测线；最后，继续扩散并在质控线处形成肉眼可见的质控线。如果待测患者的泪液中不含有P蛋白和/或A蛋白，就不会被会相应的金标抗体结合形成复合物，进而不会在第一和/或第二检测线附近形成肉眼可见的线条。通过这种方法，即可判断泪液中是否含有P蛋白和A蛋白，并且发现将P蛋白、A蛋白的两种金标抗体联合使用，试纸条上只要同时出现两条检测线，就基本可以判定该受测人员患有视网膜病变，正确率接近100％，这与受测人员实际的患病情况符合度非常高。由此可见，采用上述胶体金试纸条可以比较准确地诊断视网膜病变疾病。
优选地，上述试剂盒中，还包括甘油和牛血清蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：首次发现了将以特定氨基酸序列的P蛋白、A蛋白为对象制备相应的金标抗体进行联用，能够作为胶体金等检测手段的试剂，用于诊断检测是否患有视网膜黄斑病变，具有非常高的准确性。
附图说明
图1为实施例2制备的胶体金试纸条的结构示意图中，且图中提供了5种不同的检测线和质控线显色的检测结果。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下针对P蛋白、A蛋白作为靶向蛋白制备金标抗体，并将其制备成试纸条，进行检测视网膜黄斑病变的检测效果的验证。
实施例1：试剂制备
以P蛋白、A蛋白为对象，获取相应的金标抗体，具体获取方法为：将P蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO.01所示)，A蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO.02所示)发送给武汉三鹰生物技术有限公司，由武汉三鹰生物技术有限公司合成相应的金标抗体溶液成品，同时还提供了合成、分泌相应金标抗体的杂交瘤细胞株。
将上述金标抗体成品与甘油、牛血清蛋白(BSA)、超纯水混合，制备成试剂。试剂中，两种金标抗体的浓度均为1:5000(1mg/ml)，甘油的体积分数(v/v)为5％，牛血清蛋白的质量体积分数(m/v，mg/ml)为5％。
实施例2：胶体金试纸条的制备
1、主要材料
抗P蛋白的第一抗体、抗A蛋白的第二抗体均采购自武汉三鹰生物技术有限公司，用于硝酸纤维素膜两条检测线包被；抗Ig片段的兔多克隆抗体采购自武汉三鹰生物技术有限公司，用于硝酸纤维素膜质控线包被；硝酸纤维素膜，采购自上海金标生物科技有限公司。其他常用试剂和材料均为分析纯试剂；
如图1所示，胶体金试纸条的结构包括：塑料底板、样品垫、吸水垫、硝酸纤维素膜(NC膜)，NC膜贴在塑料底板上，样品垫、吸水垫分别搭接在NC膜两侧，NC膜上划有第一检测线、第二检测线和质控线；第一检测线上包被有用于抗P蛋白的第一抗体，所述第二检测线上包被有抗A蛋白的第二抗体，所述质控线上包被有抗Ig片段的兔多克隆抗体，10000:1(1mg/ml)。
实施例3：试剂和胶体金试纸条的效果验证
1、试验对象：分别选取283名患有视网膜黄斑病变的病人，和相同数量的未患病的正常人，每个病人和正常人分别采集3份泪液样品。
2、试验方法：将每个病人和正常人的泪液样品分别与实施例1制备的试剂混合，然后滴加到微孔板中，将实施例2制备的胶体金试纸条的样品垫插入/浸入微孔板的微孔中，计时15min，直至所有的试纸条的质控线出现肉眼可见的条带。如果质控线始终未出现条带，则说明试纸条过期，可按相同方法重新检测。
同时，另外在试剂中只加入P蛋白的金标抗体或A蛋白的金标抗体，分别作为对照一组和对照二组，按照相同的方法对泪液进行检测。
3、数据统计
统计同时出现两条检测线条带，只出现任意一条检测线条带，以及只出现质控线条带的试纸条数量；条带出现的情况如图1所示。统计数据如下表所示。
不论是试验组、对照一组还是对照二组，都未发现只出现质控线条带的情况。从上表可以看到，试验组、对照一组、对照二组，对正常人检测的试纸条上均未出现检测线条带，说明其检测特异性非常好，基本不会出现误测。试验组中，不论是试纸条出现任意一条检测线条带，还是同时出现两条检测线条带，其与真实患病的符合率均较高，当然也存在一定程度的漏检；并且，同时出现两条检测线条带的患病符合率为100％，基本可以认定只要出现两条检测线条带，则该受测者肯定患有视网膜黄斑病变。因此，在正式检测使用时，可以将“是否出现两条检测线条带”作为是否患有视网膜黄斑病变为重要依据。这也说明了选取P蛋白和A蛋白为对象制成相应的金标抗体，并将两种金标抗体联用在胶体金试纸条，能够获得比较好的视网膜黄斑病变诊断精准度。
序列表
<110> 嘉兴蔚康科技有限公司
<120> 一种靶标蛋白组合在检测视网膜黄斑病变中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5 10 15
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Claims (7)
1.一种用于检测视网膜黄斑病变的金标抗体组合，其特征在于，包括P蛋白的金标抗体和A蛋白的金标抗体；所述P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，所述A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示。
2.一种用于检测视网膜黄斑病变的试剂，其特征在于，包括P蛋白的金标抗体、A蛋白的金标抗体；所述P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，所述A蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.02所示。
3.根据权利要求2所述的用于检测视网膜黄斑病变的试剂，其特征在于，P蛋白的金标抗体的浓度为1:5000，1mg/ml；A蛋白的金标抗体的浓度为1:5000，1mg/ml。
4.根据权利要求2或3所述的用于检测视网膜黄斑病变的试剂，其特征在于，所述试剂中还包括体积分数为5％的甘油，以及质量体积分数为5％的牛血清蛋白。
5.一种用于检测视网膜黄斑病变的胶体金试纸条，其特征在于，在硝酸纤维素膜上设有第一检测线、第二检测线和质控线，所述第一检测线上包被有用于抗P蛋白的第一抗体，所述第二检测线上包被有抗A蛋白的第二抗体，所述质控线上包被有抗Ig片段的兔多克隆抗体；所述P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，所述A蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.02所示。
6.一种用于检测视网膜黄斑病变的试剂盒，其特征在于，包括P蛋白的金标抗体溶液和A蛋白的金标抗体溶液，还包括权利要求5所述的胶体金试纸条；所述P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，所述A蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示。
7.根据权利要求6所述的用于检测视网膜黄斑病变的试剂盒，其特征在于，还包括甘油和牛血清蛋白，以及微孔板。
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