DE69609422T2

DE69609422T2 - Verfahren zur behandlung von verletzten oder degenerierten photorezeptoren mit einem neurotrophischen faktor aus der glial-zellinie (gdnf)

Info

Publication number: DE69609422T2
Application number: DE69609422T
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Marcel Louis
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1995-11-29
Filing date: 1996-11-22
Publication date: 2001-02-15
Anticipated expiration: 2016-11-23
Also published as: AU1059297A; HUP9802374A2; DK0863766T3; IL124601A0; GR3034393T3; BR9611750A; CZ154498A3; EP0863766A1; ATE194773T1; NO982275D0; WO1997019694A1; KR19990071540A; ES2149511T3; DE69609422D1; SK65998A3; US5736516A; CN1203532A; NO982275L; AU698062B2; PT863766E

Description

Die Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Behandlung verletzter oder degenerierter retinaler Neurone durch Verabreichung eines Proteinprodukts eines von einer glialen Zelllinie abstammenden neurotrophischen Faktors (GDNF). Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Behandlung pathologischer Zustände wie erbliche retinale Degenerationen und alters-, krankheits- oder verletzungsbedingte Retinopathien, bei denen eine Degeneration der Photorezeptoren auftritt und für einen Verlust der Sehkraft verantwortlich ist. In jüngerer Zeit wurden mehrere natürlich vorkommende Proteinmoleküle, basierend auf ihrer trophischen Aktivität auf verschiedene Neuronen-Typen identifiziert. Diese Moleküle werden als "neurotrophische Faktoren" bezeichnet. Neurotrophische Faktoren sind endogene, lösliche Proteine, die für neuronale Lebensfähigkeit und Wachstum während der Entwicklung und für die Aufrechterhaltung von Funktion und für die Plastizität von reifen Neuronen von hauptsächlicher Bedeutung sind; vgl. Fallon und Laughlin, Neurotrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA (1993). Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Regeneration von Neuronen zu fördern und das Absterben und die Degeneration von Neuronen zu verhindern, wurde behauptet, dass neurotrophische Faktoren für die Behandlung neurodegenerativer Zustände des Nervensystems wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, amyotrophische Lateralsklerose und Schlaganfall verwendet werden können.
Eine Nervenschädigung wird durch Zustände hervorgerufen, die das Überleben und/oder die ordnungsgemäße Funktion eines oder mehrerer Typen von Nervenzellen beeinträchtigen, einschließlich: (1) physikalische Verletzung, die eine Degeneration axonaler Fortsätze (was wiederum zum Tod der Nervenzellen führt) und/oder von Nervenzellkörpern in der Nähe der Verletzung hervorruft, (2) temporärer oder permanenter Stillstand des Blutflusses (Ischämie) zu Teilen des Nervensystems, wie bei einem Schlaganfall, (3) beabsichtigte oder durch einen Unfall hervorgerufene Exposition mit Neurotoxinen, wie mit den Krebs- und AIDS- Chemotherapeutika Cisplatin bzw. Didesoxycytidin, (4) chronische metabolische Erkrankungen wie Diabetes oder renale Fehlfunktion oder (5) neurodegenerative Erkrankungen wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und amyotrophische Lateralsklerose, die aus der Degeneration spezifischer neuronaler Populationen resultieren. Damit ein bestimmter neurotrophischer Faktor möglicherweise für die Behandlung einer Nervenschädigung verwendet werden kann, müssen die Klasse oder Klassen beschädigter Nervenzellen auf den Faktor reagieren. Verschiedene neurotrophische Faktoren beeinflussen typischerweise verschiedene Nervenzell-Klassen. Man weiß, dass alle Neuronen-Populationen nicht auf alle neurotrophischen Faktoren reagieren oder gleichermaßen durch sie beeinflusst werden.
Der erste identifizierte neurotrophische Faktor war Nervenwachstumsfaktor (NGF). NGF ist das erste Mitglied einer definierten Familie neurotrophischer Faktoren, die Neurotrophine genannt werden, und umfasst gegenwärtig neurotrophischen Faktor aus Gehirn (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3), NT-4/5 und NT-6 (Thoenen, Trends. Neurosci. 14: 165-170, 1991; Lapchak et al., Rev. Neurosci. 3: 1-10, 1993; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci. 18: 223-253, 1995). Diese Neurotrophine wirken durch die trk Tyrosinkinase-Rezeptor-Familie, d. h., trkA, trkB, trkC und niedrig-affinen p75-Rezeptor (Lapchak et al., Rev. Neurosci. 3: 1-10, 1993; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci. 18: 223-253, 1995; Chao et al., TINS 18: 321-326, 1995). Im zentralen Nervensystem (ZNS) ist die Expression von trkA, der Rezeptor für NGF, fast ausschließlich auf cholinerge Neuronen im basalen Vorhirn begrenzt (Venero et al., Neuroreport 4: 959-962, 1993), die ebenfalls p75 und trkB exprimieren. Diese cholinergen Neurone sind für die Neurologie von besonderem Interesse, da Degeneration und/oder Dystrophie von cholinergen Neuronen ein Zeichen-von Alzheimer ist (Hefti, J. Neurobiol. 25: 1418-1435, 1994; Olson, Neurochem. Jul. 15: 1-3, 1994). Die cholinergen Neurone des basalen Vorderhirns können in morphologischen Präparaten durch Acetylcholinesterase-Histochemie oder Immunohistochemie mit einem Antikörper gegen Cholin-Acetyltransferase (ChAT), dem Enzym für die Synthese von Acetylcholin, oder gegen p75 einfach identifiziert werden (Bachelor et al., J. Comp. Neurol. 284: 187-204, 1989; Kiss et al., Neurosot 27: 731-748, 1988; Woolfet al., Neuroscience 30: 143-152, 1989).
Neurotrophischer Faktor aus der Glial-Zelllinie (GDNF) ist ein kürzlich entdecktes Protein und wurde in Tests, basierend auf seiner Effizienz zur Verstärkung der Lebensfähigkeit und Stimulation des Transmitter-Phänotyps von mesenzephalen, dopaminergen Neuronen in vitro identifiziert und gereinigt (Lin et al., Science 260: 1130-1132, 1993). GDNF ist ein glykosyliertes, über eine Disulfid-Brücke verbundenes Homodimer und ist mit der (TGF-β)- Superfamilie von transformierendem Wachstumsfaktor-β neurotrophischer Proteine entfernt verwandt (Krieglstein et al., EMBO J. 14: 736-742, 1995; Poulsen et al., Neuron 13: 1245- 1252, 1994). GDNF wurde kloniert und das rekombinante menschliche GDNF (rhuGDNF) hat in vitro und in vivo eine trophische und Lebensfähigkeit-verstärkende Wirkung auf dopaminerge Neuronen der Substantia nigra und auf Motorneuronen des Rückenmarks (Beck et al., Nature 273: 339-341, 1995; Henderson et al., Science 266 :1130-1132, 1994; Tomac et al., Nature 273: 335-339; Yan et al., Nature 273: 341-343; Zum et al., Neuroreport 6: 113-118, 1994). In vivo stimuliert eine Behandlung mit exogenem GDNF den dopaminergen Phänotyp von Neuronen der Substantia nigra und beseitigt funktionelle Fehlfunktionen, die durch Axatomie oder dopaminerge Neurotoxine in Tiermodellen der Parkinson-Krankheit, einer neurodegenerativen Erkrankung, die durch den Verlust von dopaminergen Neuronen gekennzeichnet ist, hervorgerufen Werden (Hudson et al., Brain Res. Bull. 36: 425-432, 1995; Hoffer et al., Neurosol. Lett. 182: 107-111, 1994). Obwohl man ursprünglich annahm, dass GDNF zumindest in vitro relativ spezifisch für dopaminerge Neuronen ist, zeigten nachfolgende Experimente, dass der Faktor in vivo und in vitro eine neurotrophische Wirkung auf cholinerge motorische Neurone des Stammhirns und des Rückenmarks hat (Oppenheim et al., Nature 373: 344-346, 1995; Zum et al., Neuroreporf 6: 113-118, 1994; Yan et al., Nature 373: 341-344, 1995; Henderson et al., Science 266: 1062-1064, 1994). GDNF ist daher ein Faktor mit einem möglichen therapeutischen Nutzen bei der Behandlung von degenerativen Erkrankungen von motorischen Neuronen des Rückenmarks wie amyotrophische Lateralsklerose.
Somit wird immer deutlicher, dass - GDNF ein größeres Spektrum neurotrophischer Ziele haben könnte als mesenzephale, dopaminerge und somatische motorische Neuronen (Yan und Matheson, Nature 373: 341-344, 1995; Miller et al., Soc. Neurosci. Abstr. 20: 1300, 1994). GDNF-Boten-RNA (mRNA) wurde im Muskel und in Schwann-Zellen des peripheren Nervensystems und in Typ I-Astrozyten des zentralen Nervensystems nachgewiesen (Schaas et al., Exp. Neurol. 124: 368-371, 1993). GDNF-mRNA wird in großen Mengen auch im sich entwickelnden Ratten-Striatum (Stromberg et al., Exp. Neurol. 124: 401-412, 1993) und in geringen Mengen in Bereichen des zentralen Nervensystems von ausgewachsenen Ratten und Menschen gefunden, einschließlich Striatum, Hippocampus, Cortex und Rückenmark (Springer et al., Exp. Neurol. 127: 167-170, 1994).
WO 93/06116 (Lin et al., Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture), veröffentlicht am 1. April 1993, beschreibt, dass GDNF für die Behandlung einer Nervenverletzung, einschließ lich einer Verletzung, die mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung steht, verwendet werden kann und ist für die vorliegende Erfindung von allgemeinem Interesse. Ebenfalls von Interesse sind Schmidt-Kastner et al., Mol. Brain Res. 26: 325-330, 1994, die beschreiben, dass GDNF-mRNA nach Pilokarpin-induzierten Anfällen nachweisbar und erhöht war, Schaar et al., Exp. Neurol. 124: 368-371, 1993 und Schaar et al., Exp. Neurol. 130: 387-393, 1994, die beschreiben, dass Astrozyten des basalen Vorderhims unter Kultivierungsbedingungen mäßige Mengen an GDNF-mRNA exprimierten, GDNF jedoch nicht die basale ChAT-Aktivität des Vorderhirns veränderte, und die US-Anmeldung Nr. 08/535,682, eingereicht am 28. September 1995, die beschreibt, dass GDNF für die Behandlung einer Verletzung oder Degeneration von cholinergen Neuronen des basalen Vorderhirns verwendet werden kann.
In Säugern betreffen eine Reihe opthalmischer neurodegenerativer Zustände oder Erkrankungen eine Verletzung oder Degeneration von Photorezeptoren. Trophische Faktoren, die zur Verstärkung der Lebensfähigkeit oder Regeneration dieser Neurone fähig sind, würden nützliche Therapien für die Behandlung derartiger Erkrankungen ermöglichen.
Photorezeptoren sind eine spezialisierte Untergruppe retinaler Neuronen, die für die Sehkraft verantwortlich sind. Photorezeptoren bestehen aus Stäbchen und Zapfen, die photosensitiven Zellen der Retina. Jedes Stäbchen und jeder Zapfen ist mit einem spezialisierten Cilium ausgestattet, das als äußeres Segment bezeichnet wird und die Phototransduktionsmaschinerie in sich birgt. Die Stäbchen enthalten ein spezielles, Licht-absorbierendes Sehpigment, Rhodopsin. Es gibt drei Klassen von Zapfen im Menschen, die durch die Expression bestimmter Sehpigmente charakterisiert sind: die blauen Zapfen-, grünen Zapfen- und roten Zapfenpigmente. Jeder Typus des Sehpigment-Proteins ist dazu ausgelegt, Licht bei verschiedenen Wellenlängen maximal zu absorbieren. Das Stäbchen-Rhodopsin vermittelt das Nachtsehen (im Halbdunkel), während die Zapfenpigmente für das Zapfen-Sehen (in hellem Licht) verantwortlich sind. Die roten, blauen und grünen Pigmente bilden auch die Grundlage für das Farbensehen beim Menschen. Die Sehpigmente in Stäbchen und Zapfen reagieren auf Licht und bilden ein Aktionspotential in den Ausgabezellen, den bipolaren Zapfen-Neuronen, das dann durch die retinalen Ganglion-Neurone zur Produktion eines visuellen Stimulus im visuellen Kortex weitergegeben wird.
Beim Menschen involvieren eine Reihe von Erkrankungen der Retina die progressive Degeneration und möglicherweise den Tod von Photorezeptoren, was unerbittlich zur Erblindung führt. Degeneration von Photorezeptoren, wie durch erbliche retinale Dystrophien (wie Retinitis pigmentosa), altersbedingter Macula-Degeneration und anderen Maculopathien oder Retina-Ablösung sind durch die progressive Atrophie und Verlust von Funktion der äußeren Segmente von Photorezeptoren charakterisiert. Zusätzlich führt der Tod von Photorezeptoren oder der Verlust von Photorezeptor-Funktion zur teilweisen Deafferenzierung von retinalen Neuronen der zweiten Ordnung (roten bipolaren Zellen und horizontalen Zellen) in Patienten mit retinalen Dystrophien, was zur Verringerung der Gesamteffizienz bei der Weiterleitung des von den Photorezeptoren geschaffenen elektrischen Signals verringert. Trophische Faktoren, die zur Rettung von Photorezeptoren vor einem Zelltod und/oder zur Wiederherstellung der Funktion von Photorezeptoren mit einer Fehlfunktion (atrophisch oder dystrophisch) fähig sind, könnten hilfreiche Therapien bei der Behandlung derartiger Zustände sein.
Es gibt einige Beweise dafür, dass bestimmte Proteinfaktoren die Lebensfähigkeit von Photorezeptoren verstärken könnten. Zum Beispiel können Photorezeptoren in einem gewissen Maße durch basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) in Royal College of Surgeons (RCS)-Ratten und Albino-Ratten gerettet werden, die durch Aussetzen gegen konstantes Licht beschädigt worden waren (Faktorovich et al., Nature 347: 83-86, 1990). RCS-Ratten besitzen eine erbliche Mutation eines im retinalen Pigment-Epithelium (RPE) exprimierten Gens, was zu einem Verlust des RPEs zur Phagozytose der kontinuierlich abgestreiften Teile von äußeren Segmenten der Photorezeptoren führt und eine Degeneration und möglicherweise den Zelltod von Photorezeptoren hervorruft. Eine einzige Injektion von bFGF in den Glaskörper oder in den subretinalen Raum, der extrazelluläre Raum, der die Stäbchen und Zapfen umgibt, im Verlauf der Degeneration, rettet vorübergehend die Photorezeptoren (Faktorovich et al., Nature 347: 83-86, 1990). Bei dem durch Licht geschädigten Albino-Ratten-Modell schützt eine Injektion von bFGF in den subretinalen Raum oder in den Glaskörper 2 Tage vor der konstanten Bestrahlung der Photorezeptoren signifikant vor der Licht- Schädigung und verhindert einen Zelltod (LaVail et al., Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 89: 11249- 11253, 1992). In diesem Modell wurde das Überleben der Photorezeptoren auch mit saurem FGF (aFGF), neurotrophischem Faktor des Gehirns (BDNF), ziliar neurotrophischem Faktor (CNTF) und Interleukin-1β (IL-1β) beobachtet. Mäßige Wirkungen wurden mit Neurotrophin- 3 (NT-3), Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor II (IGF-II) und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha) beobachtet. Nervenwachstumsfaktor (NGF), Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF), Blutplättchen-Wachstumsfaktor (PDGF) und IGF-I zeigten keine Wirkung (LaVail et al., Proc. Nafl. Acad. Sci. USA 89: 11249-11253, 1992); vgl. auch WO93/15608, LaVail et al. Obwohl bFGF in RCS-Ratten und in den Rattenmodellen mit einem durch Licht induzierten Schaden wirksam ist, ist seine therapeutische Verwendung beim Menschen aufgrund seiner hypotensiven, mitogenen und möglicherweise angiogenen Aktivitäten sehr begrenzt. Tatsächlich löst in den Glaskörper injiziertes bFGF das Einwandern von Makrophagen aus dem Blut in die innere Retina aus und kann eine starke proliferative Vitreoretinopathie hervorrufen (Faktorovich et al., Nature 347: 83-86, 1990). Man zeigte auch durch Polymerase-Kettenreaktion, dass Boten-RNA für GDNF in den Augen von post-natalen Ratten am Tag 6 und erwachsenen Ratten im wesentlichen in Assoziation mit der neuralen Retina und dem retinalen Pigment-Epithelium exprimiert wird. Die RPE-Zellen produzieren, speichern und transportieren eine Vielzahl von Faktoren, die für das Überleben und die Aufrechterhaltung der Funktion von Photorezeptoren verantwortlich sind. Die RPE-Zellen sind ebenfalls für die Phototransduktion unverzichtbar: sie klären die abgestreiften Spitzen der äußeren Segmente von Photorezeptoren und recyceln Vitamin A. Die Transplantation normaler RPE-Zellen in Retinas von RCS-Ratten verhindert den Zelltod von Photorezeptoren (Li und Turner, Exp. Eye Res. 47: 911-917, 1988; Mullen und LaVail, Science 192: 799-801, 1976), was die Produktion eines diffundierbaren trophischen Faktors für Photorezeptoren durch RPE-Zellen vermuten lässt.
Es besteht ein Erfordernis für Verfahren und therapeutische Zusammensetzungen, die für die Behandlung einer Verletzung von Photorezeptorzellen geeignet sind. Derartige Verfahren und therapeutische Zusammensetzungen würden idealerweise Photorezeptoren vor einer progressiven Verletzung schützen und die Überlebensfähigkeit oder Regeneration der beschädigten Neuronen-Population ohne ernsthafte Nebenwirkungen verstärken. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung des Verlusts der Sehkraft aufgrund von Photorezeptor-Degeneration durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Proteinprodukts eines neurotrophischen Faktors der Glial-Zelllinie (GDNF) bereit. Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Behandlung des Verlusts der Sehkraft aufgrund von Photorezeptor-Degeneration durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des GDNF-Proteinprodukts bereitgestellt. GDNF-Proteinprodukte umfassen ein GDNF-Protein, wie das durch die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 1 dargestellte, sowie Varianten und Derivate davon. Die Erfindung basiert auf der neuen Entdeckung, dass die Verabreichung eines GDNF-Proteinprodukts das Überleben und die Regeneration von geschädigten Photorezeptor-Neuronen verstärkt, die die Haupt-Population von Neuronen sind, die bei retinalen Degenerationen, die zur Erblindung führen, beschädigt werden.
GDNF-Proteinprodukt kann intraokular bei einer Dosis von etwa 0,001 mg/Tag bis 10 mg/Tag verabreicht werden, vorzugsweise bei einer Dosis von etwa 0,01 mg/Tag bis 1 mg/Tag und insbesondere bei einer Dosis von etwa 0,1 mg/Tag bis 0,5 mg/Tag. Die Erfindung sieht auch die Behandlung einer Photorezeptor-Degeneration oder -Verletzung durch die Verabreichung eines GDNF-Proteinprodukts vor, zusammen mit einem zweiten therapeutischen Wirkstoff, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, neurotrophischer Faktor des Gehirns, Neurotrophin-3, Neurotrophin-4/5, Neurotrophin-6, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor, ziliar neurotrophischem Faktor, saurem und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor-5, transformierendem Wachstumsfaktor-β und Kokain- Amphetamin-reguliertem Transkript. Die Verabreichung eines GDNF-Proteinprodukts bei der Behandlung ophthalmischer Zustände oder Erkrankungen können vorzugsweise topische Formulierungen, Augeneinsätze, Augeninjektionen, Augenimplantate, Zelltherapie oder Gentherapie einbeziehen.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung eines GDNF-Proteinprodukts für die Herstellung eines Medikaments oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung einer Photorezeptor-Verletzung oder -Degeneration bereit. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen beinhalten topische, orale oder parenterale GDNF-Proteinprodukt- Formulierungen. Der Fachmann wird erkennen, dass eine Verabreichung durch Zelltherapie und Gentherapie, wie nachstehend beschrieben, erfolgen kann. In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung von Photorezeptorzellen für eine Implantation, wobei Photorezeptorzellen in Gegenwart eines GDNF-Proteinprodukts kultiviert werden. Die Erfindung umfasst weiterhin eine Zusammensetzung mit Photorezeptorzellen, zusammen mit einem GDNF-Proteinprodukt in Mengen, die das Überleben fördern und das kontinuierliche Wachstum und die Reifung der Photorezeptorzellen ermöglichen. Zahlreiche zusätzliche erfindungsgemäße Aspekte und Vorteile werden dem Fachmann bei Betrachtung der nachstehenden detaillierten Beschreibung mit den bevorzugten Ausführungsformen deutlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Wirkung eines Proteinprodukts eines neurotrophischen Faktors der Glial- Zelllinie (GDNF) auf das Überleben von Photorezeptoren in Kulturen retinaler Neuronen. Jeder Wert ist ein Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Kulturen.
Fig. 2 zeigt die Verstärkung des Auswachsens von Photorezeptor-Neuriten durch GDNF- Proteinprodukt. Die Daten sind als Verteilungsdiagramm der Summenhäufigkeiten der Neuritenlängen dargestellt. Die Prozentzahl an Photorezeptoren (Ordinate) mit Neuriten, die länger als eine gegebene Länge in Mikrometern (Abszisse) sind, sind dargestellt.
Fig. 3 zeigt die Stimulation der Glutamat-Aufnahme durch GDNF-Proteinprodukt in Photorezeptor-Kulturen. Die Ergebnisse sind als Prozentzahlen der Glutamat-Aufnahmewerte (in dpmlWell) dargestellt, die in den Kontroll-Kulturen gefunden wurden. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 Wells eines repräsentativen Experiments.
Fig. 4 zeigt die Verstärkung des Überlebens von Photorezeptoren durch GDNF-Proteinprodukt in Kulturen retinaler Neuronen. Veränderungen der Photorezeptorzahl auf Behandlung mit GDNF-Proteinprodukt in Kulturen aus 18 Tage alten und 39 Tage alten Mäusen sind aufgetragen. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung von 2-3 Kulturen.
Fig. 5 zeigt die Verstärkung des Überlebens von Photorezeptoren durch GDNF-Proteinprodukt in Kulturen von rd/rd-Mäuse-Retinas. Das Überleben von Photorezeptoren wurde durch Zählen der Arestin-positiven Neurone pro 6-mm Well bestimmt. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung von 3-4 Kulturen.
Fig. 6 zeigt die Wirkung von GDNF auf das Überleben von Photorezeptoren in Kulturen der Hühnerretina. Überleben von Photorezeptoren wurde durch Zählen der Zapfen pro 6 mm² diametrischer Streifen (sie stellen etwa 21% der Gesamtfläche eines 6 mm-Wells dar) bestimmt. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus 3 Kulturen.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass das GDNF-Proteinprodukt eine neurotrophische Aktivität für Photorezeptoren besitzt. Vor dieser Erkenntnis gab es keinen Hinweis auf eine derartige neurotrophische Aktivität von GDNF. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung einer Verletzung oder Degeneration retinaler Neurone, insbesondere Photorezeptoren, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Proteinprodukts eines neurotrophischen Faktors aus der Glial-Zelllinie (GDNF) mit Hilfe einer pharmazeutischen Zusammensetzung, der Implantierung GDNF-exprimierender Zellen oder GDNF- Gentherapie bereit. Die Erfindung kann mit jedem biologisch aktiven GDNF-Proteinprodukt erfolgen, einschließlich einem GDNF mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz, Varianten und Derivaten davon.
Zur Bereitstellung der retinalen Neuronenpopulationen, die für das Testen des Reaktionsverhaltens von Photorezeptoren auf die Verabreichung eines GDNF-Proteinprodukts verwendet wurden, wurde ein Zellkultur-Verfahren entwickelt. Das Kultivierungsverfahren wird nachstehend im Detail beschrieben. Die Behandlung dieser Photorezeptoren mit einem GDNF-Proteinprodukt zeigte, dass zusätzlich zu einer Verstärkung der Lebensfähigkeit von Photorezeptoren das GDNF-Proteinprodukt auch die Verlängerung des Axon-ähnlichen Fortsatzes des Photorezeptors stimulierte, wodurch eine Wirkung auf die morphologische Entwicklung der Photorezeptoren gezeigt wurde. Tests zur Glutamat-Aufnahme zeigten ferner, dass eine Behandlung mit dem GDNF-Proteinprodukt die funktionelle Differenzierung von Photorezeptoren verstärkt. Diese Ergebnisse deuten an, dass die möglichen Vorteile einer Therapie mit dem GDNF-Proteinprodukt auch eine Verstärkung der Lebensfähigkeit von Photorezeptoren, die Regeneration der Axone und äußeren Segmente von Photorezeptoren und die Wiederherstellung der visuellen Funktion umfassen. Somit würde die Verabreichung eines GDNF-Proteinprodukts für Zustände vorteilhaft sein, bei denen aufgrund der Degeneration von Photorezeptoren die Sehkraft verloren geht, wie erbliche retinale Degenerationen, altersbedingte Macula-Degeneration, verletzungsbedingte retinale Degenerationen und retinale Dystrophien.
Die Erfindung zeigt weiterhin, dass eine Behandlung mit dem GDNF-Proteinprodukt die Lebensfähigkeit von Photorezeptoren in Retina-Kulturen von Mäusen mit einer erblichen retinalen Degeneration fördert. Untersuchungen mit Photorezeptoren von rd/rd-Mäusen zeigten, dass eine Behandlung mit dem GDNF-Proteinprodukt die Wiederstandsfähigkeit gegenüber der zerstörenden Wirkung der rd/rd-Mutation auf Photorezeptoren verstärkte. Das weist darauf hin, dass eine Behandlung mit dem GDNF-Proteinprodukt zur Verringerung und Vermeidung von Photorezeptor-Degeneration und -Tod und sogar für eine Umkehrung der Photorezeptor-Degeneration bei menschlichen erblichen Retina-Erkrankungen, die durch eine Photorezeptor-Degeneration charakterisiert sind wie Retinitis pigmentosa, verwendet werden könnte. Wie durch die nachstehend beschriebenen Untersuchungen gezeigt, könnte die Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts für eine Vielzahl pathologischer Zustände förderlich sein, bei denen eine Photorezeptor-Degeneration auftritt und für den Verlust des Augenlichts verantwortlich ist. Diese Zustände umfassen erbliche retinale Degenerationen wie Retinitis pigmentosa, Bardet-Biedl-Syndrom, Bassen-Kornzweig-Syndrom (Abetalipo proteinämie), Best-Krankheit (vitelliforme Dystrophie), Choroidämie, Gyrus-Atrophie, kongenitale Amaurose, Refsum-Krankheit, Stargardt-Syndrom und Usher-Syndrom. Weitere Retinopathien, für die eine Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts förderlich sein könnte, umfassen senile Macula-Degeneration (trockene und feuchte Formen), diabetische Retinopathie, periphere Vitreoretinopathien, Photoretinopathien, durch einen operativen Eingriff induzierte Retinopathien, virale Retinopathien (wie HIV-Retinopathie in Bezug auf AIDS), ischämische Retinopathien, Netzhautablösung und traumatische Retinopathie.
Gemäß der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird das GDNF-Proteinprodukt am besten intraokulär bei einer Dosis zwischen etwa 0,001 mg/Tag und 10 mg/Tag verabreicht, vorzugsweise bei einer Dosis zwischen etwa 0,01 mg/Tag und 1 mg/Tag und insbesondere bei einer Dosis zwischen etwa 0,1 mg/Tag und 0,5 mg/Tag. Vorgesehen ist auch eine Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts in Verbindung oder Kombination mit einer wirksamen Menge eines zweiten therapeutischen Wirkstoffs für die Behandlung einer retinalen Degeneration oder retinaler Dystrophien. Derartige zweite therapeutische Wirkstoffe können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Mitogene wie Insulin, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, Epidermis-Wachstumsfaktor, vasoaktiver Wachstumsfaktor, Hypophysen-Adenylatzyklase-aktivierendes Polypeptid, Interferon und Somatostatin, neurotrophische Faktoren wie neurotrophischer Faktor des Gehirns, Neurotrophin-3, Neurotrophin- 4/5, Neurotrophin-6, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor, Ziliar-neurotrophischer Faktor, saure und basische Fibroblasten-Wachstumsfaktoren, Fibroblasten-Wachstumsfaktor-5, transformierender Wachstumsfaktor-β und Cocain-Amphetamin-reguliertes Transkript (CART) und weitere Wachstumsfaktoren wie Epidermis-Wachstumsfaktor, Leukämie-inhibierender Faktor, Interleukine, Interferone und Kolonie-stimulierende Faktoren, sowie Moleküle und Stoffe, die funktionell äquivalent zu diesen Faktoren sind.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung eines GDNF-Proteinprodukts für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Verletzung oder Degeneration von Photorezeptoren bereit, einschließlich der Behandlung der vorstehend beschriebenen Erkrankungen und Zustände. Derartige pharmazeutische Zubereitungen des GDNF-Proteinprodukts werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Der Begriff "GDNF-Proteinprodukt" umfasst hier gereinigte natürliche, synthetische oder rekombinante neurotrophische Faktoren der Glial-Zelllinie, biologisch aktive GDNF-Varianten (einschließlich Insertions-, Substitutions- und Deletionsvarianten), und deren chemisch modifizierte Derivate. Umfasst werden auch GDNFs, die im wesentlichen zu menschlichem GDNF mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz homolog sind. GDNF-Proteinprodukte können als Homodimere oder Heterodimere in ihrer biologisch aktiven Form auftreten.
Der Begriff "biologisch aktiv" bedeutet hier, dass das GDNF-Proteinprodukt ähnliche neurotrophische Eigenschaften zeigt, jedoch nicht notwendigerweise alle identischen Eigenschaften und nicht notwendigerweise im gleichen Ausmaß wie das GDNF mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz. Die Auswahl der spezifischen interessierenden neurotrophischen Eigenschaften hängt von der beabsichtigten Verwendung des verabreichten GDNF- Proteinprodukts ab.
Der Begriff "im wesentlichen homolog" bedeutet hier ein Grad an Homologie zu GDNF mit der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz von bevorzugt 70%, besser 80% und noch besser 90% oder 95%. Zum Beispiel beträgt der Homologie-Grad zwischen dem Protein aus Ratte und Mensch etwa 93% und es ist vorgesehen, dass bevorzugtes Säuger- GDNF einen ähnlichen Homologie-Grad besitzen wird. Die hier beschriebene prozentuale Homologie wird als Prozentsatz an Aminosäureresten berechnet, die in der kleineren von zwei Sequenzen gefunden werden und die mit identischen Aminosäureresten in der verglichenen Sequenz paaren, falls vier Lücken in einer Länge von 100 Aminosäuren eingebracht werden können, um diese Paarung zu unterstützen, wie beschrieben durch Dayhoff in Atlas of Protein Sequence and Structure v. 5, Seite 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C. (1972). Ebenfalls umfasst als im wesentlichen homolog wird jedes GDNF-Proteinprodukt, das durch eine Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen das GDNF mit SEQ ID NO: 1 isoliert werden kann oder dessen Gene durch Hybridisierung mit dem Gen oder mit Segmenten des Gens, das für das GDNF mit SEQ ID NO: 1 kodiert, isoliert werden können.
Die erfindungsgemäßen GDNF-Proteinprodukte können durch alle bekannten Verfahren isoliert oder hergestellt werden. Beispielhafte Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäß verwendbarer GDNF-Proteinprodukte werden in der US-Patentanmeldung Nr. 08/182, 183, eingereicht am 23. Mai 1994, und in deren Ursprungsanmeldungen, in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US92/07888, eingereicht am 17. September 1992 und veröffentlicht als WO 93/06116 (Lin et al., Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture), in der EP-Anmeldung Nr. 92921022.7, veröffentlicht als EP 610 254 und in der US-Anmeldung Nr. 08/535,681, eingereicht am 28. September 1995 ("Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor") beschrieben.
Natürlich vorkommende GDNF-Proteinprodukte können aus Präparationen neuronaler Säuger-Zellen oder aus einer GDNF-sekretierenden oder -exprimierenden Säuger-Zelllinie isoliert werden. WO 93/06116 beschreibt z. B. die Isolierung von GDNF aus serumfreien Wachstums-konditioniertem Medium von B49-Glioblastomzellen. GDNF-Proteinprodukte können auch chemisch durch irgendein bekanntes Verfahren synthetisiert werden. GDNF- Proteinprodukte werden bevorzugt durch rekombinante Verfahren hergestellt, da sie im Vergleich höhere Mengen des Proteins in einer besseren Reinheit liefern. Rekombinante GDNF- Proteinprodukt-Formen umfassen glykosylierte und nicht-glykosylierte Formen des Proteins und in bakteriellen, Säuger- oder Insekten-Zellsystemen exprimiertes Protein.
Im allgemeinen beziehen rekombinante Verfahren die Isolierung der GDNF-kodierenden Gene, Klonierung des Gens in geeignete Vektoren und Zelltypen, Modifikation des Gens, falls notwendig, um eine gewünschte Variante zu kodieren, und Expression des Gens zur Produktion des GDNF-Proteinprodukts ein. Alternativ kann eine das gewünschte GDNF- Proteinprodukt kodierende Nukleotidsequenz chemisch synthetisiert werden. Eine Expression des GDNF-Proteinprodukts unter Verwendung von Nukleotidsequenzen, die sich aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes oder aufgrund allelischer Variationen unterscheiden, ist vorgesehen. WO 93/06116 beschreibt die Isolierung und Sequenzierung eines cDNA-Klons des GDNF-Gens aus Ratte und die Isolierung, Sequenzierung und Expression eines genomischen DNA-Klons des menschlichen GDNF-Gens. WO 93/06116 beschreibt auch Vektoren, Wirtszellen und Kultivierungsbedingungen für die Expression des GDNF-Proteinprodukts. Zusätzliche, für die Expression des GDNF-Proteinprodukts in E. coli geeignete Vektoren werden in der veröffentlichten EP-Anmeldung 0 423 980 ("Stem Cell Factor"), veröffentlicht am 24. April 1991, beschrieben. Die DNA-Sequenz des für das reife menschliche GDNF-kodierenden Gens und die Aminosäuresequenz des GDNFs sind in Fig. 19 (SEQ ID NO: 5) von WO 93/06116 gezeigt. Fig. 19 zeigt nicht die gesamte kodierende Sequenz für den Prä-Pro-Teil von GDNF, jedoch werden die ersten 50 Aminosäuren des menschlichen Prä-Pro-GDNFs in Fig. 22 (SEQ ID NO: 8) von WO 93106116 gezeigt.
Natürlich vorkommendes GDNF ist in seiner biologisch aktiven Form ein über eine Disulfid- Brücke verbundenes Dimer. Das nach Expression in einem bakteriellen System isolierte Material ist im wesentlichen biologisch inaktiv und ist ein Monomer. Für die Herstellung des biologisch aktiven, über eine Disulfid-Brücke verbundenen Dimers ist eine Rückfaltung notwendig. Verfahren zur Rückfaltung und Renaturierung des in bakteriellen Systemen exprimierten GDNFs sind in WO 93/06116 beschrieben. Standard-in vitro-Tests zur Bestimmung der GDNF-Aktivität werden ebenfalls in WO 93/06116 und in der US-Anmeldung Nr. 08/535,681, eingereicht am 28. September 1995, beschrieben.

A. GDNF-Varianten

Der Begriff "GDNF-Varianten" umfasst hier Polypeptide, bei denen Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des natürlich vorkommenden GDNFs deletiert ("Deletionsvarianten"), inseriert ("Additionsvarianten") oder substituiert ("Substitutionsvarianten") wurden. Derartige Varianten werden durch Einbringen geeigneter Nukleotid-Veränderungen in die das Polypeptid kodierende DNA oder durch in vitro-chemische Synthese des gewünschten Polypeptids hergestellt. Der Fachmann wird erkennen, dass viele Kombinationen von Deletionen, Insertionen und Substitutionen erfolgen können, vorausgesetzt, dass das Endmolekül biologische GDNF-Aktivität besitzt.
Mutageneseverfahren für den Austausch, die Insertion oder Deletion von einem oder mehreren ausgewählten Aminosäureresten sind bekannt (z. B. US-PS 4,518,584). Es gibt zwei grundsätzliche Variablen bei der Schaffung von Varianten: die Lokalisation der Mutationsstelle und die Art der Mutation. Bei der Planung von GDNF-Varianten wird die Auswahl der Mutationsstelle und die Art der Mutation von der/den zu modifizierenden GDNF-Eigenschaft(en) abhängen. Die Mutationsstellen können getrennt voneinander oder in Serie modifiziert werden, wie durch (1) anfängliche Substitution durch konservative Aminosäurereste und sodann durch schwerwiegendere Substitutionen in Abhängigkeit von den erreichten Ergebnissen, (2) Deletion des Ziel-Aminosäurerestes oder (3) Insertion von Aminosäureresten in Nachbarschaft zu der lokalisierten Stelle. Konservative Veränderungen von 1 bis 20 Aminosäuren sind bevorzugt. Falls die Aminosäuresequenz des gewünschten GDNF-Proteinprodukts bekannt ist, wird die für die Expression des Proteins zu verwendende Nukleinsäuresequenz leicht bestimmt. N-terminale und C-terminale Deletionsvarianten können auch durch proteolytische Enzyme geschaffen werden.
Für GDNF-Deletionsvarianten betragen Deletionen im allgemeinen etwa 1 bis 30 Reste, gewöhnlicher etwa 1 bis 10 Reste und typischerweise etwa 1 bis 4 benachbarte Reste. N- terminale, C-terminale und interne Deletionen sind vorgesehen. Deletionen können in Regi onen mit niedriger Homologie mit anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie eingebracht werden, um die Aktivität von GDNF zu modifizieren. Deletionen in Bereichen mit wesentlicher Homologie mit anderen Sequenzen der TGF-β-Superfamilie werden eher die biologische Aktivität von GDNF wesentlicher verändern. Die Zahl aufeinanderfolgender Deletionen wird so ausgewählt werden, dass die Tertiärstruktur des GDNF-Proteinprodukts in der betroffenen Domäne, wie eine Cystein-Vernetzung, erhalten bleibt. Nicht-begrenzende Beispiele von Deletionsvarianten umfassen verkürzte GDNF-Proteinprodukte, denen 1 bis 40 Nterminale Aminosäuren von GDNF fehlen oder Varianten ohne den C-terminaien Rest von GDNF oder Kombinationen davon, wie beschrieben in der US-Anmeldung Nr. 08/535,681, eingereicht am 28. September 1995.
Bei GDNF-Additionsvarianten umfassen Aminosäure-Sequenzadditionen N- und/oder Cterminale Fusionen in einem Längenbereich von einem Rest bis zu Polypeptiden mit 100 oder mehr Resten, sowie interne Additionen in der Sequenz von einem oder vielen Aminosäurerest(en). interne Additionen betragen im allgemeinen etwa 1 bis 10 Reste, typischerweise etwa 1 bis 5 Reste und gewöhnlich etwa 1 bis 3 Aminosäurereste. Beispiele von Nterminalen Additionsvarianten umfassen GDNF mit einem N-terminalen Methionylrest (ein Artefakt der direkten Expression von GDNF in einer bakteriellen rekombinanten Zellkultur), der als (Met&supmin;¹)GDNF bezeichnet wird, und eine Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N-Terminus von GDNF, um die Sekretion von reifem GDNF aus rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern. Derartige Signalsequenzen werden im allgemeinen aus der beabsichtigten Wirtszelle erhalten und werden somit homolog sein. Additionen können auch Aminosäuresequenzen umfassen, die von der Sequenz anderer neurotrophischer Faktoren abstammen. Ein bevorzugtes GDNF-Proteinprodukt für die erfindungsgemäße Verwendung ist rekombinantes menschliches [Met&supmin;¹]GDNF.
Bei GDNF-Substitutionsvarianten ist wenigstens ein Aminosäurerest der GDNF-Aminosäuresequenz entfernt und anstelle dessen ein anderer Rest eingefügt. Derartige Substitutionsvarianten umfassen allelische Varianten, die sich durch natürlich vorkommende Nukleotidsequenz-Veränderungen in der Spezies-Population auszeichnen, die zu einer Aminosäureveränderung führen oder nicht führen können. Beispiele von Substitutionsvarianten (vgl. z. B. SEQ ID NO: 50) sind in der US-Anmeldung Nr. 08/535,681, eingereicht am 28. September 1995, beschrieben.
Spezifische Mutationen der GDNF-Aminosäuresequenz können Modifikationen an einer Glykosylierungsstelle (wie Serin, Threonin oder Asparagin) einbeziehen. Das Fehlen von Glykosylierung oder nur teilweise Glykosylierung ergibt sich aus einer Aminosäuresubstitution oder -deletion an irgendeiner mit Asparagin verbundenen Glykosylierungs-Erkennungsstelle oder an irgendeiner Stelle des Moleküls, die durch Hinzufügen eines O-gebundenen Kohlenhydrats modifiziert ist. Eine Asparagin-gebundene Glykosylierungs-Erkennungsstelle umfasst eine Tripeptid-Sequenz, die spezifisch durch geeignete zelluläre Glykosylierungsenzyme erkannt wird. Diese Tripeptid-Sequenzen sind entweder Asn-Xaa-Thr oder Asn-Xaa- Ser, wobei Xaa irgendeine Aminosäure außer Pro sein kann. Eine Vielzahl von Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen an einer oder beiden der ersten oder dritten Aminosäurepositionen einer Glykosylierungs-Erkennungsstelle (und/oder eine Aminosäuredeletion an der zweiten Position) führen zu einer fehlenden Glykosylierung an der modifizierten Tripeptid- Sequenz. Somit schafft die Expression von geeigneten veränderten Nukleotidsequenzen Varianten, die an dieser Stelle nicht glykosyliert sind. Alternativ kann die GDNF-Aminosäuresequenz modifiziert werden, um Glykosylierungsstellen hinzuzufügen.
Ein Verfahren zur Identifizierung von GDNF-Aminosäureresten oder Bereichen für eine Mutagenese wird "Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt und ist durch Cunningham und Wells beschrieben (Science 244: 1081-1085, 1989). Bei diesem Verfahren werden ein Aminosäurerest oder eine Gruppe von Ziel-Resten identifiziert (z. B. geladene Reste wie Arg, Asp, His, Lys und Glu) und gegen neutrale oder negativ geladene Aminosäuren (insbesondere Alanin oder Polyalanin) ausgetauscht, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit der wässrigen Umgebung in oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Diese Domänen, die eine funktionelle Sensitivität gegenüber den Substitutionen zeigen, werden dann durch das Einbringen von zusätzlichen oder alternativen Resten an den Substitutionsstellen verbessert. Somit wird die Ziel-Stelle für das Einbringen einer Aminosäuresequenz-Variation bestimmt, ein Alanin-Scanning oder eine zufällige Mutagenese wird in dem entsprechenden Zielkodon oder Bereich der DNA-Sequenz durchgeführt und die exprimierten GDNF-Varianten werden in Bezug auf die optimale Kombination von gewünschter Aktivität und Grad an Aktivität untersucht.
Die Stellen, die am interessantesten für eine Substitutionsmutagenese sind, umfassen Stellen, wo die in den GDNF-Proteinen vorkommenden Aminosäuren aus verschiedenen Spezies grundsätzlich unterschiedlich in Bezug auf das Seitenketten-Volumen, die Ladung und/oder die Hydrophobizität sind. Bei anderen interessierenden Stellen sind bestimmte Reste GDNF-ähnlicher Proteine aus verschiedenen Spezies identisch. Derartige Positionen sind im allgemeinen wichtig für die biologische Aktivität eines Proteins. Zuerst werden diese Steffen relativ konservativ substituiert. Derartige konservative Substitutionen sind in Tabelle 1 unter der Überschrift bevorzugter Substitutionen gezeigt. Falls derartige Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen, werden eingreifendere Veränderungen (beispielhafte Substitutionen) eingeführt und/oder andere Additionen oder Deletionen können erfolgen und die resultierenden Produkte auf Aktivität untersucht werden. TABELLE 1 Aminosäuresubstitutionen
Es ist zu erwarten, dass konservative Modifikationen in der Aminosäuresequenz (und die entsprechenden Modifikationen in den kodierenden Nukleinsäuresequenzen) GDNF-Proteinprodukte schaffen, die funktionelle und chemische Eigenschaften ähnlich zu denen von natürlich vorkommendem GDNF besitzen. Im Gegensatz dazu können wesentliche Modifikationen in den funktionellen und/oder chemischen Eigenschaften des GDNF-Proteinprodukts durch Auswahl von Substitutionen erreicht werden, die signifikant unterschiedlich sind in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur des Polypeptid-Rückgrats im Bereich der Substitution, z. B. als Faltblatt- oder helikale Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) des Volumens der Seitenkette.
Natürlich vorkommende Reste werden aufgrund gemeinsamer Seitenketten-Eigenschaften in Gruppen eingeteilt:
1) hydrophobe Reste: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile
2) neutrale, hydrophile Reste: Cys, Ser, Thr
3) saure Reste: Asp, Glu
4) basische Reste: Asn, Gln, His, Lys, Arg
5) Reste, die die Orientierung der Seitenkette beeinflussen: Gly, Pro und
6) aromatische Reste: Trp, Tyr, Phe.
Nichtkonservative Substitutionen können den Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen gegen eine andere einbeziehen. Derartige substituierte Reste können in Regionen des GDNF-Proteins eingebracht werden, die in anderen Proteinen der TGF-β-Superfamilie homolog sind oder in die nicht-homologen Bereiche des Moleküls.

B. GDNF-Derivate

Chemisch modifizierte GDNF-Derivate oder GDNF-Varianten können durch den Fachmann aufgrund der hier beschriebenen Lehre hergestellt werden. Die für eine Derivatisierung am geeignetsten chemischen Reste umfassen wasserlösliche Polymere. Ein wasserlösliches Polymer ist erwünscht, da das Protein, an das es angeheftet ist, in einer wässrigen Umgebung wie einer physiologischen Umgebung nicht ausfällt. Vorzugsweise soll das Polymer für die Herstellung eines therapeutischen Produkts oder einer Zusammensetzung pharmazeutisch verträglich sein. Der Fachmann ist in der Lage, das gewünschte Polymer auszuwählen, auf der Basis von Erwägungen, wie z. B. ob das Polymer-/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet wird und falls dies der Fall ist, auf der Basis der gewünschten Dosis, Zirkulationsdauer, Resistenz gegenüber Proteolyse und anderen Erwägungen. Die Wirksamkeit der Derivatisierung kann durch Verabreichung des Derivats in der gewünschten Form (d. h. durch eine osmotische Pumpe oder mehr bevorzugt durch Injektion oder Infusion oder ferner für eine orale, pulmonäre oder andere Verabreichungsformen formuliert) und durch Bestimmung seiner Wirksamkeit festgestellt werden.
Geeignete wasserlösliche Polymere umfassen in nicht begrenzender Weise Polyethylenglykol (PEG), Copolymere von Ethylenglykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder zufällige Copolymere) und Dextran oder Poly(N-vinylpyrrolidon)-polyethylenglykol, Propropylenglykol-Homopolymere, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole (wie Glycerin), Polyvinylalkohol und Mischungen davon. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann bei der Herstellung aufgrund der Stabilität in Wasser Vorteile besitzen.
Das Polymer kann irgendein Molekulargewicht besitzen und kann verzweigt oder nicht verzweigt sein. Im Fall von Polyethylenglykol beträgt das bevorzugte Molekulargewicht etwa 2 kDa bis etwa 100 kDa für eine einfache Handhabung und Herstellung (der Begriff "etwa" bedeutet, dass manche Moleküle in Polyethylenglykol-Präparationen mehr wiegen, manche weniger als das angegebene Molekulargewicht). Andere Größen können verwendet werden in Abhängigkeit von dem gewünschten therapeutischen Profil (wie der Dauer der gewünschten verzögerten Freisetzung, der Wirkungen, falls welche auf die biologische Aktivität vorhanden sind, der einfachen Handhabung, des Grades oder Fehlens von antigener Wirkung und anderer bekannter Wirkungen von Polyethylenglykol auf ein therapeutisches Protein oder eine Variante).
Die Zahl der so gebundenen Polymer-Moleküle kann variieren und der Fachmann wird in der Lage sein, die Wirkung auf die Funktion festzustellen. Man kann Mono-derivatisieren oder es kann eine Di-, Tri-, Tetra- oder Kombination einer Derivatisierung mit den gleichen oder verschiedenen chemischen Resten (z. B. Polymere wie Polyethylenglykole mit verschiedenen Gewichten) erfolgen. Der Anteil an Polymer-Molekülen gegenüber Protein- (oder Peptid)- Molekülen und ihre Konzentrationen in der Reaktionsmischung werden unterschiedlich sein. Im allgemeinen wird das optimale Verhältnis (im Sinne von Wirksamkeit der Reaktion, dadurch, dass es keinen Überschuss an nicht-umgesetztem Protein oder Polymer gibt) durch Faktoren bestimmt, wie dem gewünschten Grad der Derivatisierung (z. B. Mono-, Di-, Tri-, usw.), dem Molekulargewicht des gewählten Polymers, ob das Polymer verzweigt oder nicht verzweigt ist und den Reaktionsbedingungen.
Die Polyethylenglykol-Moleküle (oder andere chemische Reste) sollten unter der Betrachtung von Wirkungen auf funktionelle oder antigene Domänen des Proteins an das Protein gebunden werden. Der Fachmann verfügt über eine Reihe von Bindungsverfahren; vgl. z. B. EP 0 401 384 (PEG wird an G-CSF gekoppelt), Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (beschrieben wird die Pegylierung von GM-CSF mit Hilfe von Tresylchlorid). Zum Beispiel kann Polyethylenglykol mit Hilfe einer reaktiven Gruppe wie einer freien Amino- oder Carboxylgruppe kovalent an Aminosäurereste angebunden werden. Reaktive Gruppen sind diejenigen, an die ein aktiviertes Polyethylenglykol-Molekül angebunden werden kann. Die Aminosäurereste mit einer freien Aminogruppe können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest umfassen. Die Reste mit einer freien Carboxylgruppe können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest umfassen. Sulfhydrylgruppen können ebenfalls als reaktive Gruppen für das Anbinden des/der Polyethylenglykol- MoleküIsIMoleküle verwendet werden. Für therapeutische Zwecke ist das Anbinden an eine Aminogruppe, wie das Anbinden am N-Terminus oder an einer Lysingruppe bevorzugt. Das Anbinden an Reste, die für eine Rezeptorbindung wichtig sind, sollte vermieden werden, falls eine Rezeptorbindung gewünscht ist.
Ein N-terminal chemisch modifiziertes Protein kann spezifisch gewünscht sein. Bei der für die erfindungsgemäßen Zusarümensetzungen beispielhaften Verwendung von Polyethylenglykol kann man aus einer Vielzahl von Polyethylenglykol-Molekülen (gemäß dem Molekulargewicht, der Verzweigung, usw.), dem Anteil der Polyethylenglykol-Moleküle gegenüber Protein- (oder Peptid)-Molekülen in der Reaktionsmischung, dem Typ der durchzuführenden Pegylierungsreaktion und dem Verfahren zur Schaffung des ausgewählten N-terminalen pegylierten Proteins wählen. Das Verfahren zur Herstellung der N-terminal pegylierten Zubereitung (d. h. eine Trennung dieser Fraktion von anderen mono-pegylierten Fraktionen, falls notwendig) kann die Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Population pegylierter Proteinmoleküle sein. Eine selektive N-terminale chemische Modifikation kann durch reduktive Alkylierung erfolgen,- die die unterschiedliche Reaktivität verschiedener Arten primärer Aminogruppen (Lysin gegenüber der N-terminalen), die für eine Derivatisierung in einem bestimmten Protein verfügbar sind, ausnutzt. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einem eine Carbonylgruppe enthaltenden Polymer erreicht. Zum Beispiel kann eine selektive N-terminale Pegylierung des Proteins dadurch erfolgen, dass die Reaktion bei einem pH- Wert erfolgt, der es erlaubt, aus den pKa-Unterschieden zwischen der E-Aminogruppe des Lysinrests und dem der α-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins einen Vorteil zu ziehen. Durch eine derartige selektive Derivatisierung wird die Anbindung eines wasserlöslichen Polymers an ein Protein gesteuert: die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich am N-Terminus des Proteins statt und es tritt keine signifikante Modifikation anderer reaktiver Gruppen, wie der Aminogruppen der Lysin-Seitenketten, auf. Unter Verwendung der reduktiven Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer dem vorstehend beschriebenen Typ entsprechen und sollte einen einzigen reaktiven Aldehyd für das Koppeln an das Protein besitzen. Polyethylenglykolpropionaldehyd mit einem einzigen reaktiven Aldehyd kann verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung von Derivaten vor, die von Prokaryonten exprimiertes GDNF oder Varianten davon sind und die an wenigstens ein Polyethylenglykol- Molekül gebunden sind. Weiterhin sieht die Erfindung die Verwendung von GDNF oder Varianten davon vor, verbunden mit einem oder mehreren Polyethylenglykol-Molekül(en) über eine Acyl- oder Alkylbindung.
Eine Pegylierung kann durch jedes bekannte Pegylierungsverfahren erfolgen; vgl. z. B. Focus on Growths Factors 3(2): 4-10 (1992), EP 0 154 316, EP 0 401 384 und die anderen hier erwähnten Druckschriften, die eine Pegylierung betreffen. Die Pegylierung kann durch eine Acylierungsreaktion oder eine Alkylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglykol-Molekül (oder einem analogen reaktiven wasserlöslichen Polymer) erfolgen.
Eine Pegylierung durch Acylierung bezieht im allgemeinen das Umsetzen eines aktiven Esterderivats von Polyethylenglykol mit dem GDNF-Protein oder der Variante ein. Jedes bekannte oder später entdeckte reaktive PEG-Molekül kann für die Pegylierung des GDNF- Proteins oder der Variante verwendet werden. Ein bevorzugter aktivierter PEG-Ester ist mit N-Hydroxysuccinimid verestertes PEG. Der Begriff "Acylierung" sieht hier vor, dass nicht begrenzend die nachstehenden Bindungstypen zwischen dem therapeutischen Protein und einem wasserlöslichen Polymer wie PEG umfasst sind: Amid, Carbamat, Urethan und ähnliche; vgi. Bioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994. Reaktionsbedingungen können aus allen für die Pegylierung bekannten oder aus den später entwickelten ausgewählt werden, sollten jedoch Temperatur-, Lösungsmittel- und pH-Bedingungen, die zur Inaktivierung des zu modifizierenden GDNFs oder der Variante führen würden, vermeiden.
Pegylierung durch Acylierung wird im allgemeinen zu einem Poly-pegylierten GDNF-Protein oder einer Variante davon führen. Vorzugsweise wird die verbrückende Bindung ein Amid sein. Vorzugsweise wird das resultierende Produkt im wesentlichen nur (z. B. > 95%) Mono-, Di- oder Tri-pegyliert sein. Jedoch können sich manche Spezies mit einem höheren Grad an Pegylierung bilden, wobei die Mengen von den spezifisch verwendeten Reaktionsbedingungen abhängen. Falls gewünscht, können stärker gereinigte pegylierte Spezies, insbesondere nicht-umgesetzte Spezies aus der Mischung durch Standard-Reinigungstechniken, ein schließlich Dialyse, Aussalzung, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Elektrophorese abgetrennt werden.
Eine Pegylierung durch Alkylierung bezieht im allgemeinen die Umsetzung eines terminalen Aldehyd-Derivats von PEG mit dem GDNF-Protein oder der Variante in Anwesenheit eines Reduktionsmittels ein. Pegylierung durch Alkylierung kann ebenfalls zu einem Poly-pegylierten GDNF-Protein oder einer Variante davon führen. Zusätzlich kann man die Reaktionsbedingungen derart beeinflussen, dass im wesentlichen nur eine Pegylierung an der α-Aminogruppe des N-Terminus des GDNF-Proteins oder der Variante (d. h. ein Mono-pegyliertes Protein) gefördert wird. Die PEG-Gruppen werden bei der Mono-Pegylierung oder Poly- Pegylierung bevorzugt an das Protein mittels einer -CH&sub2;-NH-Gruppe angebunden. Dieser Bindungstyp wird hier, mit spezifischem Verweis auf die -CH&sub2;-Gruppe, als "Alkyl"-Bindung bezeichnet.
Eine Derivatisierung mittels reduktiver Alkylierung zur Herstellung eines mono-pegylierten Produkts nutzt die unterschiedliche Reaktivität verschiedener Typen primärer Aminogruppen (Lysin gegenüber der N-terminalen), die für eine Derivatisierung verfügbar sind. Die Reaktion erfolgt bei einem pH-Wert, der erlaubt, einen Vorteil aus den pKa-Unterschieden zwischen den s-Aminogruppen der Lysinreste und dem der α-Aminogruppe des N-terminalen Rests des Proteins zu ziehen. Durch eine derartige selektive Derivatisierung wird die Bindung eines wasserlöslichen Polymers mit einer reaktiven Gruppe wie einem Aldehyd an ein Protein gesteuert: die Konjugation mit dem Polymer findet vor allem am N-Terminus des Proteins statt und es erfolgt keine signifikante Modifikation anderer reaktiver Gruppen wie der Aminogruppen von Lysin-Seitenketten. In einem wichtigen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung einer im wesentlichen homogenen Zubereitung aus Monopolymer/GDNF-Protein (oder Varianten)-Konjugat-Molekülen (d. h. ein GDNF-Protein oder eine Variante, an die ein Polymer-Molekül im wesentlichen nur (d. h. > 95%) an einer einzigen Stelle angefügt wurde) vor. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung bei der Verwendung von Polyethylenglykol auch die Verwendung eines pegylierten GDNF-Proteins oder einer Variante ohne mögliche antigene Bindungsgruppen, wobei das Polyethylenglykol- Molekül direkt an das GDNF-Protein oder die Variante angekoppelt wurde.
Somit ist vorgesehen, dass erfindungsgemäß verwendbare GDNF-Proteinprodukte auch pegyliertes GDNF-Protein oder Varianten umfassen können, wobei die PEG-Gruppe(n) über Acyl- oder Alkylgruppen gebunden ist (sind). Wie vorstehend erörtet, können derartige Pro dukte mono-pegyliert oder poly-pegyliert sein (sie können z. B. 2-6 und vorzugsweise 2-5 PEG-Gruppen enthalten). Die PEG-Gruppen sind im allgemeinen an die α- oder s-Aminogruppen von Aminosäuren des Proteins gebunden, es ist jedoch auch vorgesehen, dass die PEG-Gruppen an irgendeine Aminogruppe des Proteins gebunden werden können, die für die Bindung an eine PEG-Gruppe unter geeigneten Reaktionsbedingungen ausreichend reaktiv ist.
Die in den Acylierungs- und Alkylierungsverfahren verwendeten Polymermoleküle können aus den vorstehend beschriebenen wasserlöslichen Polymeren ausgewählt werden. Das ausgewählte Polymer sollte mit einer einzigen reaktiven Gruppe modifiziert sein, wie vorzugsweise einem aktiven Ester für eine Acylierung oder einem Aldehyd für eine Alkylierung, damit der Grad der Polymerisation wie für die erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen gesteuert werden kann. Ein Beispiel eines reaktiven PEG-Aldehyds ist der wasserstabile Polyethylenglykolpropionaldehyd oder Mono-C&sub1;-C&sub1;&sub0;-alkoxy- oder aryloxy-Derivate davon (vgl. US-PS 5,252,714). Das Polymer kann verzweigt oder nicht verzweigt sein. Für die Acylierungsreaktionen sollte(n) das (die) ausgewählte(n) Polymer(e) eine einzige reaktive Estergruppe besitzen. Für die erfindungsgemäße reduktive Alkylierung sollte(n) das (die) ausgewählte(n) Polymer(e) eine einzige reaktive Aldehydgruppe besitzen. Im allgemeinen wird das wasserlösliche Polymer nicht aus natürlich vorkommenden Glykosylresten ausgewählt werden, da sie gewöhnlich einfacher von rekombinanten Säuger-Expressionssystemen hergestellt werden. Das Polymer kann irgendein Molekulargewicht besitzen und kann verzweigt oder nicht verzweigt sein.
Ein besonders bevorzugtes wasserlösliches Polymer für die erfindungsgemäße Verwendung ist Polyethylenglykol. Polyethylenglykol umfasst hier alle PEG-Formen, die für die Derivatisierung anderer Proteine verwendet wurden, wie Mono-C&sub1;-C&sub1;&sub0;-alkoxy- oder -aryloxypolyethylenglykol.
Im allgemeinen kann die chemische Derivatisierung unter jeder geeigneten Bedingung, die für die Reaktion einer biologisch aktiven Substanz mit einem aktivierten Polymer-Molekül verwendet wird, erfolgen. Verfahren zur Herstellung eines pegylierten GDNF-Proteins oder einer Variante davon werden im allgemeinen die Schritte (a) Umsetzen eines GDNF-Proteins oder einer Variante mit Polyethylenglykol (wie einem reaktiven Ester- oder Aldehyd- Derivat von PEG) unter Bedingungen, bei denen das Protein an eine oder mehrere PEG- Gruppen gebunden wird, und (b) Gewinnen des (der) Reaktionsprodukts (Reaktionspro dukte) umfassen. Im allgemeinen werden die optimalen Reaktionsbedingungen für die Acylierungsreaktionen fallabhängig, basierend auf bekannten Parametern und dem gewünschten Ergebnis bestimmt. Zum Beispiel ist der prozentuale Anteil von poly-pegyliertem Produkt umso größer, je größer das Verhältnis von PEG : Protein ist.
Eine reduktive Alkylierung für die Herstellung einer im wesentlichen homogenen Population eines Monopolymer-GDNF-Protein (oder Varianten)-Konjugat-Moleküls wird im allgemeinen die Schritte (a) Umsetzen eines GDNF-Proteins oder einer Variante mit einem reaktiven PEG-Molekül unter Bedingungen für eine reduktive Alkylierung, bei einem für eine selektive Modifikation der α-Aminogruppe am Aminoterminus des GDNF-Proteins oder der Variante geeigneten pH-Wert, und (b) Gewinnen des (der) Reaktionsprodukts (Reaktionsprodukte) umfassen.
Für eine im wesentlichen homogene Population von Monopolymer-GDNF-Protein (oder Varianten)-Konjugat-Molekülen sind die Bedingungen für die reduktive Alkylierung derart, dass sie die selektive Bindung des wasserlöslichen Polymerteils an den N-Terminus des GDNF-Proteins oder der Variante erlauben. Derartige Reaktionsbedingungen sorgen im allgemeinen für pKa-Unterschiede zwischen den Lysin Aminogruppen und der α-Aminogruppe an dem Endterminus (der pKa ist der pH-Wert, bei dem 50% der Aminogruppen protoniert sind und 50% nicht-protoniert sind). Der pH-Wert beeinflusst ebenfalls das zu verwendende Verhältnis zwischen Polymer und Protein. Im allgemeinen wird ein größerer Überschuss an Polymer zu Protein gewünscht sein, falls der pH-Wert niedriger ist (d. h. je weniger reaktiv die N-terminaie α-Aminogruppe ist, desto mehr Polymer ist für das Erreichen optimaler Bedingungen erforderlich). Falls der pH-Wert höher ist, muss das Polymer : Protein-Verhältnis nicht so groß sein (d. h. mehr reaktive Gruppen sind verfügbar und somit werden weniger Polymer-Moleküle benötigt). Für die erfindungsgemäßen Zwecke wird sich der pH-Wert im allgemeinen im Bereich von 3 bis 9, vorzugsweise 3 bis 6 befinden.
Eine weitere wichtige Erwägung ist das Molekulargewicht des Polymers. Im allgemeinen können mit höherem Molekulargewicht des Polymers weniger Polymermoleküle an das Protein gebunden werden. Gleichsam sollte die Verzweigung des Polymers berücksichtigt werden, falls diese Parameter optimiert werden. Im allgemeinen ist das Polymer : Protein- Verhältnis umso höher, je höher das Molekulargewicht ist (oder je mehr Verzweigungen es gibt). Im allgemeinen beträgt das durchschnittliche Molekulargewicht für die hier vorgesehenen Pegylierungsreaktionen etwa 2 koa bis etwa 100 kDa. Das bevorzugte durchschnittliche Molekulargewicht beträgt etwa 5 kDa bis etwa 50 kDa, besonders bevorzugt etwa 12 kDa bis etwa 25 kDa. Das Verhältnis von wasserlöslichem Polymer zu GDNF-Protein oder der Variante davon wird im allgemeinen 1 : 1 bis 100 : 1, bevorzugt (für eine Polypegylierung) 1 : 1 bis 20 : 1 und (für eine Monopegylierung) 1 : 1 bis 5 : 1 betragen.
Bei Verwendung der vorstehend angegebenen Bedingungen wird die reduktive Alkylierung für eine selektive Anbindung des Polymers an irgendein GDNF-Protein oder eine Variante mit einer α-Aminogruppe an den Aminoterminus sorgen und wird eine im wesentlichen homogene Präparation eines Monopolymer/GDNF-Protein (oder Varianten)-Konjugats bereitstellen. Der Begriff "Monopolymer/GDNF-Protein (oder Varianten)-Konjugat" bedeutet hier eine Zusammensetzung, umfassend ein einziges Polymer-Molekül, das an ein Molekül des GDNF-Proteins oder der GDNF-Protein-Variante gebunden ist. Das Monopolymer/GDNF-Protein (oder Varianten)-Konjugat wird vorzugsweise ein Polymer-Molekül am N- Terminus besitzen, jedoch nicht an Lysin-Aminoseitengruppen. Die Zubereitung wird vorzugsweise zu mehr als 90% aus Monopolymer/GDNF-Protein (oder Varianten)-Konjugat bestehen, mehr bevorzugt zu mehr als 95% aus Monopolymer/GDNF-Protein (oder Varianten)-Konjugat, wobei die restlichen Moleküle nicht-umgesetzt sind (d. h. Protein ohne den Polymerteil).
Das Reduktionsmittel für die erfindungsgemäße reduktive Alkylierung sollte in wässriger Lösung stabil sein und bevorzugt zur Reduktion von nur der Schiffschen Base, die anfänglich bei der reduktiven Alkylierung gebildet wird, in der Lage sein. Bevorzugte Reduktionsmittel können ausgewählt sein aus Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Dimethylaminoboran, Trimethylaminoboran und Pyridinboran. Ein besonders bevorzugtes Reduktionsmittel ist Natriumcyanoborhydrid. Andere Reaktionsparameter wie Lösungsmittel, Reaktionszeiten, Temperaturen, usw. und Verfahren zur Produkt-Aufreinigung können fallabhängig bestimmt werden, basierend auf den Veröffentlichungen, die eine Derivatisierung von Proteinen mit wasserlöslichen Polymeren betreffen (vgl. die hier zitierten Veröffentlichungen).

C. Pharmazeutische Zusammensetzungen des GDNF-Proteinprodukts

Pharmazeutische Zusammensetzungen des GDNF-Proteinprodukts enthalten typischerweise eine therapeutisch wirksame Menge eines GDNF-Proteinprodukts in Mischung mit einem oder mehreren pharmazeutisch und physiologisch verträglichen Formulierungsstoffen. Geeignete Formulierungsstoffe umfassen in nicht beschränkender Weise Antioxidanzien, Konservierungsmittel, Farb-, Geschmacks- und Verdünnungsstoffe, emulgierende Stoffe, suspendierende Stoffe, Lösungsmittel, Füllstoffe, Quellungsmittel, Puffer, Verabreichungsvehikel, Verdünnungsmittel, Exzipienzien und/oder pharmazeutische Zusatzstoffe. Zum Beispiel kann ein geeigneter Träger Wasser für eine Injektion, eine physiologische Salzlösung oder künstliches CSF, möglicherweise supplementiert mit anderen für Zusammensetzungen für eine parenterale Verabreichung gewöhnlichen Materialien, sein. Neutrale, gepufferte Salzlösung oder mit Serumalbumin vermischte Salzlösung sind weitere beispielhafte Träger.
Das Primär-Lösungsmittel in einem Träger kann entweder wässriger oder nicht-wässriger Natur sein. Zusätzlich kann der Träger andere pharmazeutisch verträgliche Exzipienzien für die Veränderung oder Aufrechterhaltung des pH-Werts, der Osmolarität, Viskosität, Klarheit, Farbe, Sterilität, Stabilität, Auflösungsrate oder Geruch der Formulierung enthalten. In ähnlicher Weise kann der Träger noch andere pharmazeutisch verträgliche Exzipienzien für die Veränderung oder Aufrechterhaltung der Freisetzungsrate des GDNF-Proteinprodukts oder für die Verstärkung von Resorption oder Penetration des GDNF-Proteinprodukts über die Augenmembranen enthalten. Derartige Exzipienzien sind die gewöhnlich und üblicherweise für die Formulierung von Dosen für eine parenterale Verabreichung in entweder einer einheitlichen Dosis oder in Form von mehreren Dosen verwendeten Stoffe.
Sobald die therapeutische Zusammensetzung formuliert worden ist, kann sie in sterilen Gefäßen als Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, in einer festen Form oder als dehydratisiertes oder lyophilisiertes Pulver gelagert werden. Derartige Formulierungen können entweder in einer gebrauchsfertigen Form oder in einer Form, z. B. lyophilisiert, die vor der Verabreichung ein Lösen erfordert, gelagert werden.
Die optimalen pharmazeutischen Formulierungen werden von dem Fachmann aufgrund von Faktoren wie dem Verabreichungsweg und der gewünschten Dosis bestimmt; vgl. z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), Seiten 1435-1712. Derartige Formulierungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die in vivo-Freisetzungsrate und die in vivo-Abbaurate der erfindungsgemäßen GDFN-Proteine, Varianten und Derivate beeinflussen.
Weitere wirksame Verabreichungsformen wie parenterale Formulierungen mit einer langsamen Freisetzung, Inhalationsvernebler oder oral aktive Formulierungen sind ebenfalls vorgesehen. Zum Beispiel kann das GDNF-Proteinprodukt bei einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung an Partikel-Präparate oder polymere Verbindungen (wie Polymilchsäure, Polyglykolsäure, usw.) oder Liposomen gebunden oder in diese eingebaut sein. Hyaluronsäure kann ebenfalls verwendet werden und kann die verzögerte Freisetzung im Blutkreislauf verstärken. Die pharmazeutische Zusammensetzung des GDNF-Proteinprodukts kann auch für eine parenterale Verabreichung wie durch intraokulare Infusion oder Injektion formuliert sein und kann auch Formulierungen für den Blutkreislauf mit einer langsamen oder verzögerten Freisetzung umfassen. Derartige parenteral verabreichte therapeutische Zusammensetzungen sind typischerweise in Form einer pyrogenfreien, parenteral verträglichen wässrigen Lösung, umfassend das GDNF-Proteinprodukt in einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Ein bevorzugter Träger ist steriles destilliertes Wasser.
Es ist auch vorgesehen, dass bestimmte Formulierungen mit dem GDNF-Proteinprodukt oral verabreicht werden sollen. Das so verabreichte GDNF-Proteinprodukt kann sich in einer Kapsel befinden und kann mit oder ohne Träger, die gewöhnlich für die Zusammensetzung von festen Dosisformen verwendet werden, formuliert sein. Die Kapsel kann so geschaffen sein, dass der aktive Teil der Formulierung an der Stelle des Gastrointestinaltrakts freigesetzt wird, wo die Bioverfügbarkeit am höchsten ist und wo ein prä-systemischer Abbau am geringsten ist. Zusätzliche Exzipienzien können einverleibt werden, um eine Resorption des GDNF-Proteinprodukts zu erleichtern. Verdünnungsmittel, Geschmacksstoffe, niedrigschmelzende Wachse, Pflanzenöle, Schmierstoffe, Suspensionsstoffe, Tabletten-Zersprengmittel und Bindemittel können ebenfalls eingesetzt werden.
Die Formulierung für topische opthalmische Präparationen, einschließlich opthalmischen Lösungen, Suspensionen und Salben ist bekannt (vgl. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, Kapitel 86, Seiten 1581-1592, Mack Publishing Company, 1990). Andere Verabreichungsarten sind verfügbar, einschließlich Injektionen in die Augenkammer (sie können direkt in die vordere Kammer oder direkt in die Kammer des Glaskörpers erfolgen), subkonjunktivale Injektionen und retrobulbäre Injektionen und Verfahren und Mittel zur Herstellung ophthalmischer Zubereitungen, die für derartige Verabreichungsarten geeignet sind, sind auch bekannt.
Der in dieser Anmeldung verwendete Begriff "extraokular" betrifft die okulare Oberfläche und den (äußeren) Raum zwischen dem Augapfel und dem Augenlid. Beispiele extraokularer Bereiche umfassen das Augenlid-Gewölbe oder -Blindsack, die Bindehautoberfläche und die Hornhautoberfläche. Dieser Bereich liegt in Bezug auf das gesamte Augengewebe außen und ein invasives Verfahren ist für das Erreichen dieses Bereichs nicht erforderlich. Beispiele extraokularer Systeme umfassen Einsätze und "topisch" verabreichte Tropfen, Gele oder Salben, die zur Verabreichung eines therapeutischen Stoffs an diese Bereiche verwendet werden können. Extraokulare Vorrichtungen sind im allgemeinen leicht zu entfernen, selbst durch den Patienten.
Die nachstehenden Patente beschreiben extraokulare Systeme, die zur Verabreichung von Arzneimitteln an die extraokularen Bereiche verwendet werden. Higuchi et al. beschreiben in den US-PSen 3,981,303, 3,986,510 und 3,995,635 einen bio-abbaubaren okularen Einsatz mit einem Arzneimittel. Der Einsatz kann mit einer unterschiedlichen Form hergestellt werden für die Befestigung in dem Blindsack des Augapfels, dem extraokularen Raum zwischen dem Augapfel und dem Augenlid. Mehrere gewöhnliche biokompatible Polymere werden als für die Herstellung dieser Vorrichtung geeignet beschrieben. Diese Polymere umfassen Zinkalginat, Polymilchsäure, Polyvinylalkohol, Polyanhydride und Polyglykolsäure. Die Patente beschreiben auch Membran-beschichtete Vorrichtungen mit einer verringerten Durchlässigkeit für den Arzneistoff und Hohlkammern, die die Arzneistoffformulierung aufnehmen.
Theeuwes, US-PS 4,217,898 beschreibt Mikroporen-Reservoirs, die für eine gesteuerte Arzneistoff-Verabreichung verwendet werden. Diese Vorrichtungen werden extraokular in den okularen Blindsack eingebracht. Die interessierenden Polymersysteme umfassen Polyvinylchlorid-Co-Polyvinylacetat-Copolymere. Kaufman beschreibt in den US-PSen 4,865,846 und 4,882,150 ein ophthalmisches Arzneistoff-Verabreichungssystem mit wenigstens einem bioerudierbaren Material oder einem Salbenträger für den Bindehautsack. Das Patent beschreibt Polymersysteme wie Polylactide, Polyglykolide, Polyvinylalkohol und vernetztes Kollagen als geeignete Verabreichungssysteme.
Bei der erfindungsgemäß beschriebenen Verwendung des GDNF-Proteinprodukts für die Behandlung einer retinalen Erkrankung oder Verletzung ist es auch vorteilhaft, dass eine topisch verabreichte, ophthalmische Formulierung einen Stoff umfasst, der die Penetration oder den Transport des therapeutischen Wirkstoffs in das Auge verstärkt. Derartige Stoffe sind bekannt. Ke et al., US-PS 5,221,696 beschreibt z. B. die Verwendung von Materialien für die Verstärkung der Penetration ophthalmischer Zubereitungen durch die Comea.
Intraokulare Systeme sind die Systeme, die für die Verwendung in irgendeinem Gewebe- Kompartiment innerhalb, zwischen oder um die Gewebeschichten des Auges selbst geeignet sind. Diese Stellen umfassen subkonjunktivale (unter der okularen Schleimhautmembran, benachbart zum Augapfel), orbitale (hinter dem Augapfel) und in der Augenkammer gelegene (innerhalb der Kammern des Augapfels selbst) Bereiche. Im Gegensatz zu extraokularen Systemen ist ein invasives Verfahren, bestehend aus Injektion oder Implantation, erforderlich, um diese Bereiche zu erreichen.
Die nachstehenden Patente beschreiben intraokulare Vorrichtungen. Wong, US-PS 4,853,224, beschreibt in Mikrokapseln eingeschlossene Arzneistoffe für die Einbringung in die Augenkammer. In diesem System verwendete Polymere umfassen Polyester und Polyether. Lee, US-PS 4,863,457, beschreibt eine bio-abbaubare Vorrichtung, die operativ für die verzögerte Freisetzung therapeutischer Wirkstoffe intraokular eingesetzt wird. Diese Vorrichtung ist für die operative Implantation unter der Bindehaut (Schleimhautmembran des Augapfels) gestaltet. Krezancaki, US-PS 4,188,373, beschreibt ein pharmazeutisches Vehikel, das bei der menschlichen Körpertemperatur eine gelartige Form annimmt. Dieses Vehikel ist eine wässrige Suspension aus dem Arzneistoff und Gummi oder von Cellulose abgeleiteten synthetischen Derivaten. Haslam et al. beschreiben in den US-PSen 4,474,751 und 4,474,752 ein Polymer-Arzneistoffsystem, das bei Raumtemperatur flüssig ist und bei Körpertemperatur eine gelartige Form annimmt. Geeignete, in diesem System verwendete Polymere umfassen Polyoxyethylen und Polyoxypropylen. Davis et al. beschreiben in der US-PS 5,384,333 ein bio-abbaubares, injizierbares Arzneistoff-Verabreichungspolymer, das für eine Freisetzung des Arzneistoffs über einen langen Zeitraum sorgt. Die Arzneistoffzusammensetzung besteht aus einem pharmazeutisch aktiven Stoff in einer bio-abbaubaren Polymermatrix, wobei die Polymermatrix bei Temperaturen im Bereich von 20ºC bis 37ºC fest ist und bei Temperaturen im Bereich von 38ºC bis 52ºC flüssig ist. Das Arzneistoff-Verabreichungspolymer ist nicht auf die Verabreichung von löslichen oder flüssigen Arzneistoffformulierungen beschränkt. Zum Beispiel kann das Polymer als Matrix für die Stabilisierung und Zurückhaltung an der Injektionsstelle von Arzneistoff-enthaltenden Mikrosphären, Liposomen und anderen Partikel-gebundenen Arzneistoffen verwendet werden.
Ein besonders geeigneter Träger für eine intraokulare Injektion ist steriles destilliertes Wasser, in das das GDNF-Proteinprodukt als sterile, isotonische Lösung, passend konserviert formuliert ist. Eine andere ophthalmische Zubereitung kann die Formulierung des GDNF- Proteinprodukts mit einem Stoff wie injizierbare Mikrosphären oder Liposomen einbeziehen, der für die langsame oder verzögerte Freisetzung des Proteins sorgt und sie kann dann als Depot-Injektion verabreicht werden. Andere geeignete Mittel für die intraokulare Einbringung des GDNF-Proteinprodukts umfassen implantierbare Arzneistoff-Verabreichungsvorrichtungen, die das GDNF-Proteinprodukt enthalten.
Die erfindungsgemäßen ophthalmischen Zubereitungen, insbesondere topikale Zubereitungen, können andere Bestandteile enthalten, z. B. ophthalmisch verträgliche Konservierungsmittel, Tonizitätsmittel, Co-Solvenzien, Befeuchtungsmittel, Komplexierungsmittel, Pufferstoffe, antimikrobielle Stoffe, Antioxidanzien und Tenside, die bekannt sind. Beispielhafte, geeignete Tonizitäts-verstärkende Mittel umfassen Alkalimetallhalogenide (vorzugsweise Natrium- oder Kaliumchlorid), Mannit, Sorbit und ähnliches. Eine ausreichende Menge des Tonizitäts-verstärkenden Stoffes wird vorteilhafterweise hinzugegeben, damit die in das Auge einzuträufelnde Formulierung hypotonisch oder im wesentlichen isotonisch ist. Geeignete Konservierungsstoffe umfassen in nicht begrenzender Weise Benzalkoniumchlorid, Thimerosal, Phenylethylalkohol, Methylparaben, Propylparaben, Chlorhexidin, Sorbinsäure und ähnliches. Wasserstoffperoxid kann auch als Konservierungsmittel verwendet werden. Geeignete Co-Solvenzien umfassen in nicht begrenzender Weise Glycerin, Propylenglykol und Polyethylenglykol. Geeignete Komplexierungsmittel umfassen Coffein, Polyvinylpyrrolidon, beta-Cyclodextrin oder Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Geeignete Tenside oder Befeuchtungsmittel umfassen in nicht begrenzender Weise Sorbitanester, Polysorbate wie Polysorbat 80, Tromethamin, Lecithin, Cholesterin, Tyloxapol und ähnliches. Die Puffer können gewöhnliche Puffer wie Borat, Citrat, Phosphat, Hydrogencarbonat oder Tris-HCl sein.
Die Formulierungsbestandteile sind in Konzentrationen vorhanden, die für die extraokulare oder intraokulare Verabreichungsstelle verträglich sind. Die Puffer werden z. B. für die Aufrechterhaltung der Zusammensetzung bei physiologischem pH-Wert oder bei einem etwas niedrigeren pH-Wert, typischerweise innerhalb eines pH-Bereichs von etwa 5 bis etwa 8, verwendet.
Zusätzliche Formulierungsbestandteile können Materialien umfassen, die für ein verlängertes okulares Verweilen des extraokular verabreichten therapeutischen Stoffes sorgen, damit der topische Kontakt maximiert und die Resorption verstärkt wird. Geeignete Materialien umfassen Polymere oder Gel-bildende Materialien, die für eine erhöhte Viskosität der ophthalmischen Zubereitung sorgen. Chitosan ist ein besonders geeignetes Material als die okulare Freisetzungsrate kontrollierender Stoff bei flüssigen ophthalmischen Arzneistofffor mulierungen mit einer verzögerten Freisetzung (vgl. US-PS 5,422,116, Yen et al.). Die Eignung der erfindungsgemäßen Formulierungen für eine gesteuerte Freisetzung (wie einer Langzeitverabreichung oder verlängerten Verabreichung) eines ophthalmischen Behandlungsmittels im Auge kann durch verschiedene bekannte Verfahren bestimmt werden, z. B. wie beschrieben in Journal of Controlled Release 6: 367-373, 1987, sowie durch Variationen davon.
Eine andere ophthalmische Zubereitung kann eine wirksame Menge des GDNF-Proteinprodukts im Gemisch mit nicht-toxischen ophthalmisch verträglichen Exzipienzien einbeziehen, die für die Herstellung von Tabletten geeignet sind. Ophthalmische Lösungen können in einer einheitlichen Dosierungsform durch Lösen der Tabletten in sterilem Wasser oder anderen geeigneten Trägern hergestellt werden. Geeignete Exzipienzien umfassen in nicht begrenzender Weise inerte Verdünnungsmittel wie Calciumcarbonat, Natriumcarbonat oder - hydrogencarbonat, Lactose oder Calciumphosphat oder Bindestoffe wie Stärke, Gelatine oder Gummi arabicum oder Schmierstoffe wie Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talg.

D. Verabreichung/Bereitstellung des GDNF-Proteinprodukts

Das GDNF-Proteinprodukt kann parenteral über einen subkutanen, intramuskulären, intravenösen, transpulmonären, transdermalen, intrathekalen oder intracerebralen Weg verabreicht werden. Für die Behandlung ophthalmischer Zustände kann das GDNF-Proteinprodukt auch vorteilhafterweise extraokular oder intraokular, wie vorstehend beschrieben, durch eine topische Aufbringung, Einsätze, Injektion, Implantate, Zelltherapie oder Gentherapie verabreicht werden. Zum Beispiel können langsam-freisetzende Implantate mit dem in eine bioabbaubare polymere Matrix eingebetteten neurotrophischen Faktor das GDNF-Proteinprodukt bereitstellen. Das GDNF-Proteinprodukt kann extracerebral in einer Form verabreicht werden, die chemisch modifiziert oder verpackt worden ist, damit es die Blut-Hirn-Schranke überschreitet oder es kann in Verbindung mit einem oder mehreren Stoffen verabreicht werden, die zu einer Verstärkung des Übergangs des GDNF-Proteinprodukts über die Schranke fähig sind. In einer ähnlichen Weise kann das GDNF-Proteinprodukt intraokular verabreicht werden oder es kann in Verbindung mit einem oder mehreren Stoffen, die zur Verstärkung des Übergangs oder Transports des GDNF-Proteinprodukts über die Augenmembranen in der Lage sind, extraokular verabreicht werden. Die Dosierungshäufigkeit wird von den pharmakokinetischen Parametern des formulierten GDNF-Proteinprodukts und dem Verabreichungsweg abhängen.
Die spezifische Dosis kann gemäß dem Körpergewicht, der Körperoberfläche oder der Organgröße berechnet werden. Eine weitere Verbesserung der Berechnungen, die zur Bestimmung der geeigneten Behandlungsdosis in Bezug auf jede der vorstehend genannten Formulierungen notwendig sind, erfolgt routinemäßig durch den Fachmann und gehört zu den routinemäßig durchgeführten Aufgaben, insbesondere im Hinblick auf die hier beschriebene(n) Dosis-Information und Tests. Geeignete Dosen können mit Hilfe bekannter Tests zur Bestimmung von Dosen festgestellt werden, die in Verbindung mit geeigneten Dosis- Wirkungsdaten verwendet werden. Gemäß den erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsformen wird das GDNF-Proteinprodukt am vorteilhaftesten intraokular bei einer Dosis zwischen etwa 0,001 mg/Tag und 10 mg/Tag, vorzugsweise bei einer Dosis zwischen etwa 0,01 mg/Tag und 1 mg/Tag und insbesondere bei einer Dosis zwischen etwa 0,1 mg/Tag und 0,5 mg/Tag verabreicht. Der Fachmann wird erkennen, dass die für intraokular verabreichten Formulierungen verwendete Dosis im Vergleich zu der bei einer systemischen Injektion oder oralen Verabreichung gering ist.
Der endgültige Dosierungsverlauf in dem Verfahren zur Behandlung der vorstehend beschriebenen Zustände wird durch den behandelnden Arzt bestimmt, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, die die Wirkung von Arzneimitteln verändern wie das Alter, der Zustand, das Körpergewicht, das Geschlecht und die Ernährung des Patienten, die Schwere irgendeiner Infektion, die Verabreichungszeit und andere klinische Faktoren. Da Untersuchungen durchgeführt werden, wird man weitere Informationen im Hinblick auf die geeigneten Dosismengen für die Behandlung verschiedener Erkrankungen und Zustände erhalten. Es ist vorgesehen, dass die kontinuierliche Verabreichung oder Langzeitbereitstellung von GDNF für eine bestimmte Behandlung vorteilhaft sein kann. Während eine kontinuierliche Verabreichung durch mechanische Mittel erreicht werden kann wie mit einer Infusionspumpe, ist vorgesehen, dass andere Arten einer kontinuierlichen oder nahezu kontinuierlichen Verabreichung erfolgen können. Zum Beispiel kann eine chemische Derivatisierung oder Einkapselung zu Langzeitfreisetzungsformen des Proteins führen, die die Wirkung eines kontinuierlichen Auftretens, in voraussagbaren Mengen, basierend auf einem bestimmten Dosierungsverlauf, besitzen. Somit umfassen GDNF-Proteinprodukte derivatisierte oder anderweitig formulierte Proteine, um eine derartige kontinuierliche Verabreichung zu bewirken.
Eine Zelltherapie mit dem GDNF-Proteinprodukt wie die intraokulare Implantation von das GDNF-Proteinprodukt produzierenden Zellen ist ebenfalls vorgesehen. Diese Ausführungsform würde die Implantation von Zellen, die zur Synthese und Sekretion einer biologisch aktiven Form des GDNF-Proteinprodukts fähig sind, in Patienten einbeziehen. Derartige GDNF-Proteinprodukt-produzierende Zellen können Zellen sein, die natürliche Produzenten des GDNF-Proteinprodukts (analog zu B49 Glioblastomzellen) sind oder können rekombinante Zeilen sein, deren Fähigkeit das GDNF-Proteinprodukt zu produzieren durch Transformation mit einem Gen, das das gewünschte GDNF-Proteinprodukt kodiert, in einem Vektor, der für die Verstärkung seiner Expression und Sekretion geeignet ist, verstärkt worden ist. Um eine mögliche immunologische Reaktion in Patienten, denen das GDNF-Proteinprodukt einer fremden Spezies verabreicht wird, zu vermeiden, ist bevorzugt, dass die natürlichen, das GDNF-Proteinprodukt produzierenden Zellen menschlichen Ursprungs sind und menschliches GDNF-Proteinprodukt produzieren. Gleichsam ist es bevorzugt, dass die rekombinanten Zellen, die das GDNF-Proteinprodukt produzieren, mit einem Expressionsvektor transformiert werden, der ein Gen enthält, das für ein menschliches GDNF-Proteinprodukt kodiert. Die implantierten Zellen können gekapselt sein, um eine Infiltration von umgebendem Gewebe zu vermeiden. Menschliche oder nicht-menschliche tierische Zellen können in Patienten in biokompatiblen, semipermeablen polymeren Hüllen oder Membranen implantiert werden, die eine Freisetzung des GDNF-Proteinprodukts erlauben, jedoch die Zerstörung der Zellen durch das Immunsystem des Patienten oder andere zerstörende Faktoren des umgebenden Gewebes vermeiden. Ein derartiges Implantat kann z. B. an die Sclera angebracht werden, um das GDNF-Proteinprodukt zu produzieren und direkt in die Glaskörperflüssigkeit freizusetzen. Es ist auch vorgesehen, dass die eigenen Zellen des Patienten ex vivo transformiert werden können, um das GDNF-Proteinprodukt zu produzieren und sie würden ohne eine Kapselung direkt implantiert werden. Die Zellen würden mit einem geeigneten Vektor transformiert und in die Retina des Patienten zurückverpflanzt werden, wo sie das gewünschte GDNF-Protein oder die Variante des GDNF-Proteins produzieren und freisetzen würden.
Untersuchungen einer Photorezeptor-Transplantation, die zum Ersatz defekter oder verlorengegangener Zellen aufgrund einer retinalen Erkrankung oder Beschädigung gedacht waren, wurden in Tiermodellen mit einer retinalen Degeneration erfolgreich durchgeführt (Silverman und Hughes, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 1684-1690, 1989; Gouras et al., Neuro-Ophthalmol. 10: 165-176, 1990). Es ist vorgesehen, dass Photorezeptorzellen aus Spenderaugen erhalten und wie vorstehend beschrieben in Kultur gehalten werden können.
Die Zellen würden dann als Quelle von gereinigten Photorezeptoren für eine Transplantation über den subretinalen Raum in die Retina von Patienten verwendet werden, die an einer retinalen Erkrankung oder Beschädigung leiden. Diese Patienten werden mit Immunsuppressiva behandelt, um immunologische Reaktionen und eine Abstoßung der eingepflanzten Zellen zu verhindern. Die ex vivo-Retinas der Donoren werden in Gegenwart von GDNF kultiviert, um ihr Wachstum und ihre Lebensfähigkeit zu fördern. Die Patienten, die Photorezeptor-Zelltransplantate erhalten werden, werden mit Injektionen von GDNF in den Glaskörper behandelt, die für die Förderung der Lebensfähigkeit und der Reifung der eingepflanzten Photorezeptoren erforderlich sein werden.
Eine in vivo-Gentherapie mit dem GDNF-Proteinprodukt ist ebenfalls vorgesehen und erfolgt durch Einbringen des für das GDNF-Proteinprodukt kodierenden Gens in Zielzellen mittels lokaler Injektion eines Nukleinsäurekonstrukts oder anderer geeigneter Verabreichungsvektoren (Hefti, J. Neurobiol. 25: 1418-1435, 1994). Zum Beispiel kann eine ein GDNF-Proteinprodukt kodierende Nukleinsäuresequenz in einem Adeno-assoziierten Virusvektor oder einem Adenovirusvektor für die Bereitstellung an die retinalen Zellen enthalten sein. Alternative virale Vektoren umfassen in nicht begrenzender Weise Retrovirus-, Herpes simplex- Virus- und Papillomavirus-Vektoren. Der physikalische Transfer, entweder in vivo oder ex vivo, je nach dem, kann auch durch einen Liposomen-vermittelten Transfer, direkte Injektion (nackte DNA), Rezeptor-vermittelten Transfer (Ligand-DNA-Komplex), Elektroporation, Calciumphosphat-Präzipitation oder Mikropartikel-Beschuss (Gen-Kanone) erfolgen.
Das Verfahren der Kapselung von lebenden Zellen in Membranen ist bekannt und die Herstellung der gekapselten Zellen und ihre Implantation in Patienten kann ohne unangemessene Experimente erreicht werden; vgl. z. B. US-PSen 4,892,538, 5,011,472 und 5,106,627. Ein System für die Kapselung lebender Zellen wird in der PCT-Anmeldung WO 91/10425 von Aebischer et al. beschrieben; vgl. auch PCT-Anmeldung WO 91110470 von Aebischer et al., Winn et al., Exper. Neurol. 113: 322-329, 1991, Aebischer et al., Exper. Neurol. 111: 269- 275, 1991, Tresco et al., ASA10 38: 17-23, 1992. Zusätzliche implantierbare Vorrichtungen sind in der WO 93/21902 (Internationale Anmeldung Nr. PCT/US93/03850) beschrieben. Verfahren zur Formulierung einer Vielzahl von anderen Langzeit- oder gesteuerten Verabreichungsmitteln wie Liposomen-Carriem, bioerudierbaren Partikeln oder Teilchen und Depot-Injektionen sind auch bekannt.
Die hier beschriebenen GDNF-Proteinprodukt-Formulierungen können für die Veterinärmedizin und für Anwendungen am Menschen verwendet werden und der Begriff "Patient" ist nicht begrenzend aufzufassen. Im Falle von Anwendungen in der Veterinärmedizin sollten die Dosisbereiche mit den oben genannten identisch sein.
Weitere erfindungsgemäße Aspekte und Vorteile werden bei der Betrachtung der nachstehenden veranschaulichenden Beispiele klar werden. Die Beispiele betreffen die Wirkung des GDNF-Proteinprodukts auf normale und mutierte retinale Neurone. Zusätzlich beschreiben die Beispiele einzigartige Verfahren zur Kultivierung retinaler Zellen.

BEISPIELE

Materialien und Methoden

Die in den nachstehenden Beispielen verwendeten Materialien wurden wie folgt erhalten.

Zellkultur-Medien

Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium mit viel Glucose (DMEM, #11965-092), Hams F12- Medium (F12, #11765-021), Leibovitzs L15-Medium ohne Natriumhydrogencarbonat (#41300-039), B27-Medium-Supplement (#17504-010), Penicillin/Streptomycin (#15070- 014), L-Glutamin (#25030-016), Dulbeccos Phosphat-gepufferte Salzlösung (D-PBS, #14190-052), Hanks gepufferte Salzlösung mit Calcium- und Magnesiumsalzen (HBSS, #24020-026), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES, #15630-015), Maus-Laminin (#23017-015), Rinderserumalbumin und Fraktion V (#110-18-017) stammten von GIBCO/BRL, Grand Island, NY. Hitze-inaktiviertes Pferdeserum stammte von HyClone, Logan, Utah. Poly-L-ornithinhydrobromid (P-3655), Rinderinsulin (I-5500), menschliches Transferrin (T-2252), Putrescin (P-6024), Progesteron (P-6149) und Natriumselenit (S-9133) stammten von Sigma Chemical Company, Saint-Louis, MO. Papain, Desoxyribonuklease I (DNAse) und Ovalbumin (Papain-Dissoziationssystem) stammten von Worthington Biochemicals, Freehold, NJ. Sterile Falcon-96-Loch-Mikroplatten (#3072), Gewebekultur-Plastikgeschirr und Polypropylen-Zentrifugenröhrchen stammten von Beckton-Dickinson, Oxnard, CA. Nung Lab-Tek-Gewebekulturkammer-Deckgläser (#136439) stammten von Baxter, Irvine, CA. Das Nitex 20 um-Nylonnetz (#460) stammte von Tetko, Elmsford, NY. Die 4"-Dissektionszangen und die 4"-Dissektionsscheren stammten von Roboz Surgical, Washington, D. C.

Antikörper. Radioisotope und verwandte Reagenzien

Der polyklonale Kaninchen-Antikörper und die monoklonalen Mäuse-Antikörper rho4D2 gegen Rinderrhodopsin stammten von der University of British Columbia, Vancouver, Kanada. Der polyklonale Kaninchen-Antikörper war gegen die nachstehende synthetische Peptidsequenz des Stäbchen-spezifischen Proteins Arrestin gerichtet: Val-Phe-Glu-Glu-Phe- Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cys (SEQ ID NO: 2). Biotinyliertes Pferde-IgG gegen Maus, biotinyliertes Ziegen-IgG gegen Kaninchen, Peroxidase-konjugierter Avidin/Biotin-Komplex und Texasrot-konjugiertes Streptavidin (ABC Elite, Kit PK-6100) stammten von Vector Laboratories, Burlingame, CA. Fluorescein-Isothiocyanat-konjugierte Kaninchen-Immunoglobuline gegen Maus stammten von Dako Corporation (Carpinteria, CA). 3',3'-Diaminobenzidin stammte von Cappel Laboratories, West Chester, PA. Superblock-Blockierungspuffer in PBS (#37515) stammte von Pierce, Rockford, IL. Triton X-100 (X100), Nonidet P-40 (N6507) und Wasserstoffperoxid (30%, v/v, H1009) stammten von Sigma. L-[3,4-3H]-Giutaminsäure (NET-490, 40-80 Cl/mmol) stammte von New England Nuclear, Boston, MA. Der Optiphase Supermix Scintillations-Cocktail stammte von Wallac, Turku, Finnland. Weiße ViewPlate-96- Mikroplatten (#6005182) stammten von Packard Instruments Corporation, Meriden, CT. Alle anderen Reagenzien wurden von Sigma Chemical Company (Saint-Louis, MO) erhalten, es sei denn, es ist anders erwähnt.

Herstellung der Medien

Ein Grundmedium wurde als 1: 1-Mischung von DMEM- und F12-Medium hergestellt und mit B27-Mediumsupplement, hinzugefügt als 50-fache Stammlösung, supplementiert. Das B27- Mediumsupplement besteht aus Biotin, L-Carnitin, Corticosteron, Ethanolamin, D(+ )-Galactose, reduziertem Glutathion, Linoleinsäure, Linolensäure, Progesteron, Putrescin, Retinylacetat, Selen, T3 (Triiod-1-thyronin), DL-alpha-Tocopherol (Vitamin E), DL-alpha-Tocopherolacetat, Rinderserumalbumin, Katalase, fnsulin, Superoxiddismutase und Transferrin. L- Glutamin wurde in einer Endkonzentration von etwa 2 mM, Penicillin zu etwa 100 IU/l und Streptomycin zu etwa 100 mg/l zugegeben. Hitze-inaktiviertes Pferdeserum wurde in einer Endkonzentration von etwa 2,5%, D-Glucose in einer Endkonzentration von etwa 5 g/l,, HEPES-Puffermittel in einer Endkonzentration von etwa 20 mM, Rinderinsulin in einer Endkonzentration von etwa 2,5 mg/ml und menschliches Transferrin in einer Endkonzentration von etwa 0,1 mg/ml zugegeben. Nach dem Mischen wurde der pH-Wert auf etwa 7,3 einge stellt und das Medium wurde bei 4ºC gehalten. Die Medien wurden unmittelbar vor der Verwendung hergestellt, um Unterschiede zwischen den Experimenten zu minimieren. Plastikpipetten und Container wurden fortwährend verwendet, um eine Protein-Adsorption zu minimieren.

GDNF-Proteinprodukt-Lösungen

Gereinigte menschliche rekombinante GDNF-Proteinprodukte wurden als 1 mg/ml-Lösungen in D-PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung, hergestellt mit destilliertem Wasser) mit 5% Rinderserumalbumin hergestellt. Die Lösungen wurden bei -85ºC in kleinen Mengen gelagert. Serielle Verdünnungen wurden in 96-Loch-Mikroplatten hergestellt. 10 ul von 10-fach konzentrierten GDNF-Proteinprodukt-Lösungen wurden zu den Zellkulturen mit Kulturmedium (90 ul) hinzugegeben. Kontrollkulturen erhielten D-PBS mit 5% Albumin (10 ul). Die Behandlungen mit dem GDNF-Proteinprodukt wurden 1 Stunde nach dem Aussäen der Zellen begonnen und in manchen Fällen an jedem weiteren Tag wiederholt.

Kultursubstrat

Um eine optimale Anheftung von Photorezeptoren auf dem Substrat, das Auswachsen des äußeren Segments und von Neuriten sicherzustellen, wurden die Oberflächen der Mikrotiterplatten (das Kultursubstrat) durch sequenzielle Beschichtung mit Poly-L-ornithin, gefolgt von Laminin gemäß dem nachstehenden Verfahren, modifiziert. Die Plattenoberflächen wurden vollständig mit einer sterilen Lösung aus 0,1 mg/ml Polyornithin in 0,1 M Borsäure (pH 8,4) für wenigstens 1 Stunde bei Raumtemperatur bedeckt und sodann mit sterilem Super- Q-Wasser gewaschen. Die Waschlösung wurde sodann abgesaugt und eine Lösung mit 1 ug/ml Maus-Laminin in PBS hinzugefügt und 2 Stunden bei 37ºC inkubiert. Diese Verfahren erfolgten unmittelbar vor Verwendung der Platten, um eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen.

Herstellung von Hühner- und Mäuse-Photorezeptorkulturen

17 Tage alte White Leghorn-Hühnerembryos und 5 Tage alte C57BI/6-Mäuse (von Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) wurden durch Enthauptung getötet und die Augen steril in L15-Medium seziert (ohne Natriumhydrogencarbonat). Pro Experiment wurde maximal mit 24 Augen gearbeitet. Die Augen wurden halb seziert und die Linse und der Glaskörper wur den entfernt. Die neuralen Retinas wurden sorgfältig entfernt und vom Pigmentepithelium befreit, in kleine Stücke zerschnitten (etwa 1 mm² oder weniger) und in eiskaltes D-PBS gelegt. Die Zellen wurden gesammelt und sodann in 10 ml Dissoziationsmedium (120 Einheiten Papain und 2000 Einheiten DNAse in HBSS) übergeführt. Die Zellen wurden 45 Minuten bei etwa 37ºC auf einem Schüttler mit einer rotierenden Oberfläche bei etwa 200 Upm inkubiert. Die Zellen wurden sodann durch Zermahlen mit einer feuerpolierten Pasteur- Pipette dispergiert, durch ein 20 um Nitex Nylonnetz gesiebt, um nicht-dissozüertes Gewebe zu entfernen, und 5 Minuten bei 200 · g in einer IEC klinischen Zentrifuge zentrifugiert. Das resultierende Zellpellet wurde in HBSS mit Ovalbumin und etwa 500 Einheiten DNAse resuspendiert, auf eine 4%ige Ovalbuminlösung (in HBSS) geschichtet und etwa 10 Minuten bei 500 · g zentrifugiert. Das endgültige Pellet wurde in vollständigem Kulturmedium (vgl. oben) resuspendiert, auf etwa 15.000 Zellen/ml eingestellt und in 90 ul-Mengen in die 6 mm- Löcher von 96-Loch-Mikroplatten, die zuvor mit Polyornithin und Laminin beschichtet worden waren, ausgesät. Eine Anheftung der Zellen erfolgte schnell und die Plattierungseffizienz betrug etwa 75%.

Kulturen und Photorezeptoren der Retina erwachsener Mäuse

Kulturen ausgereifter Photorezeptoren wurden durch Aussäen dissozüerter retinaler Zellen aus 18-39 Tage alten Mäusen auf zuvor geschaffene Monolayer retinaler Glialzellen von 5 Tage alten Mäusen oder Pigmentepithelzellen der Ratten-Retina erhalten. Dissoziationsverfahren und Kulturmedien waren wie vorstehend beschrieben. Kulturen retinaler Glialzellen und Pigmentepithelzellen wurden in -Gewebekulturflaschen (225 cm² Costar-Flaschen) etabliert und bis zum Erreichen der Konfluenz vermehrt. Die Zellen wurden sodann durch eine kurze (etwa 2 Minuten) Inkubation mit 0,1% Trypsin gelöst und in 96-Loch-Mikroplatten oder 96-Lochkammern mit Glas-Deckgläsern ausplattiert. Dissozüerte ausgereifte Retina-Zellen wurden nach etwa 3 bis 5 Tagen hinzugegeben.

Photorezeptor-Kulturen der Retina von rd/rd Mäusen

Rd/rd C57BI/6-Mäuse (von Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) besitzen eine erbliche Photorezeptor-Degeneration aufgrund der Expression einer Mutation in der beta-Untereinheit von Phosphodiesterase (ein Enzym, das in den äußeren Segmenten lokalisiert ist und an der Phototransduktion beteiligt ist). Diese Mäuse sind ein nützliches Modell für die Untersuchung der Rolle trophischer Faktoren auf verletzte Photorezeptoren. Der Photorezeptor- Tod in rd/rd-Mäusen erreicht etwa 10 Tage nach der Geburt sein Maximum. Kulturen der rd/rd Photorezeptoren wurden aus 5 Tage alten Mäusen etabliert und 8 Tage lang in Kultur gehalten, was den Zeitraum eines maximalen Photorezeptor-Tods abdeckt. Die dissozüerten Retina-Zellen wurden auf einen zuvor geschaffenen Monolayer aus retinalen Glialzellen (siehe oben) bei einer Dichte von etwa 10.000 Zellen pro 6 mm-Loch ausgesät und im vorstehend beschriebenen Kulturmedium gehalten.

Immunohistochemie von Photorezeptoren

Für die Charakterisierung der Mäuse-Photorezeptoren wurde ein indirektes lmmuno-Peroxidase-Verfahren, beschrieben von Louis et al. (J. Pharmacol. Exp. Therap. 262: 1274-1283, 1992, Science 259: 689-692, 1993) mit den nachstehenden geringen Modifikationen verwendet. Photorezeptorkulturen wurden etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd in D-PBS, pH 7,4, fixiert und sodann dreimal in D-PBS gewaschen (200 ul pro 6 mm-Loch). Die fixierten Kulturen wurden sodann in Superblock-Blockierungspuffer in PBS mit 1% Nonidet P-40 inkubiert, um das Eindringen der Antikörper zu erhöhen. Die Anti-Rhodopsin-Antikörper (Kaninchen und Maus) wurden sodann bei einer Verdünnung von 1: 1000 bis 1: 4000 in dem gleichen Puffer hinzugefügt und die Kulturen 1 Stunde bei 37ºC auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Nach dreifachem Waschen mit D-PBS wurden die Photorezeptor-gebundenen Antikörper mit Ziegen-anti-Kaninchen- oder Pferd-anti-Maus-biotinyliertem lgG (Vectastain Kit von Vector Laboratories, Burlingame, CA) bei einer Verdünnung von etwa 1: 500 nachgewiesen: diese sekundären Antikörper wurden mit den Zellen etwa 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und die Zellen wurden sodann dreimal mit D-PBS gewaschen. Die sekundären Antikörper wurden dann mit einem 1: 500-fach verdünnten Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex markiert und die Zellen etwa 45 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach weiterem dreifachen Waschen mit D-PBS wurden die markierten Zellkulturen 5-20 Minuten mit einer Lösung aus 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, mit 0,04% 3',3'-Diaminobenzidin-(HCl)4, 0,06% NiCl&sub2; und 0,02% Wasserstoffperoxid zur Reaktion gebracht.
Für eine Doppelfärbung wurden die Kulturen auf Deckglaskammern angewachsen. Nach einer Fixierung mit Paraformaldehyd, der Permeabilisierung und Blockierung nichtspezifischer Stellen (wie vorstehend beschrieben) wurden die Kulturen mit Kaninchen-Antikörper gegen Arrestin und Maus-Antikörper gegen Rhodopsin inkubiert. Arrestin zeigte sich durch weitere Inkubation mit biotinyliertem Ziegen-IgG gegen Kaninchen, gefolgt von Texasrotkonjugiertem Streptavidin (1: 200-Verdünnung). Rhodopsin zeigte sich durch weitere lnkuba tion mit Fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem Kaninchen-IgG gegen Maus. Mit Hilfe geeigneter Filterkombinationen für Texasrot und Fluorescein wurde Fluoreszenz unter Epi-Fluoreszenz sichtbar gemacht.

Bestimmung der Photorezeptor-Lebensfähgkeit

Mäuse-Photorezeptorkulturen wurden fixiert, verarbeitet und wie vorstehend beschrieben immunogefärbt und die Photorezeptorkulturen sodann mit Hellfeld bei einer 200-fachen Vergrößerung untersucht. Die Zahl gefärbter Neurone wurde in einem diametrischen 1 · 6 mm- Streifen gezählt, der etwa 20% der Gesamtoberfläche eines 6 mm-Lochs darstellt. Lebende Photorezeptoren besaßen einen regelmäßig geformten Zellkörper mit einem gewöhnlich kurzen Axon-ähnlichen Fortsatz. Photorezeptoren, die die Anzeichen einer Degeneration zeigten wie unregelmäßige, vacuolierte Perikaryen oder fragmentierte Neuriten wurden nicht gezählt (die meisten der degenerierten Photorezeptoren lösten sich jedoch von dem Kultursubstrat ab). Die Zellzahlen wurden entweder als Zellen/6 mm-Loch oder als -fache Veränderung gegenüber der Kontroll-Zelldichte wiedergegeben.

Neuriten-Analyse

Eine morphometrische Analyse der Entwicklung von Neuriten (d. h. der Fortsatz am Zellkörper der Photorezeptoren) erfolgte mit 6 Tage alten Kulturen einer Maus-Retina. Kulturen mit etwa 10.000 Neuronen pro 6 mm-Loch wurden auf Arrestin immunogefärbt und im Hellfeld untersucht. Zufällig ausgewählte Felder mit Photorezeptoren in Kontroll- und behandelten 6 mm-Loch-Kulturen wurden mit einer Optronics-Videokamera photographiert und bis zu einer Endvergrößerung von etwa 800-fach vergrößert. Die Neuritengröße wurde durch Messung der Neuritenlänge eines jeden Photorezeptors bestimmt, wobei ein Stift an ein Summa- Sketchll-Digitalisierungsbord (Summagraphics Corporation, Houston, TX) befestigt war. Es wurde ein Digitalisierungsprogramm (MacMeasure 1.9) und ein Macintosh Centris 650 Computer verwendet.

ERGEBNISSE

Beispiel 1

Verstärkung der Stäbchen-Photorezeptor-Lebensfähigkeit und Entwicklung in Kulturen der post-natalen Mäuse-Retina.

Kulturen von Mäuse-Retinas wurden für die Darstellung der Wirkung des GDNF-Proteinprodukts auf die Lebensfähigkeit von Photorezeptoren verwendet. Die Photorezeptorkulturen wurden durch Aussäen dissozüerter retinaler Zellen in Polyornithin-Laminin-beschichteten Mikroplatten bei einer Dichte von etwa 12.500 pro 6 mm-Loch in DMEM/F12, supplementiert mit B27-Mediumsupplement, 2,5% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum, D-Glucose, HEPES, Insulin und Transferrin etabliert. Photorezeptoren wurden durch Immunoreaktivitäten mit Arrestin (einem Stäbchen-spezifischen Antigen) und Rhodopsin (dem Stäbchen-spezifischen Sehpigment) identifiziert.
Nach 6 Tagen in vitro wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd fixiert und Photorezeptoren in Kulturen mit Arrestin, einem Marker, der Säuger-Stäbchen-Photorezeptoren identifiziert, immunogefärbt. Nach der Immunofärbung, wie vorstehend beschrieben, zeigte die Phasenkontrast-Mikroskopie eines Feldes, das für das Auftreten verschiedener retinaler Zelltypen ausgewählt worden war, Photorezeptoren (identifizierbar als kleine Zellen, die von braunem Reaktionsmaterial nach Immunofärbung für Arrestin bedeckt sind), Neurone und Müllersche Glialzellen. Die Untersuchung im Hellfeld eines definierten Feldes zeigte, dass das Anti-Arrestin-Antiserum, das in Kaninchen gegen ein Arrestin-spezifisches synthetisches Polypeptid geschaffen worden war, ausschließlich an Stäbchen-Photorezeptoren band und nicht an andere retinale Neurone oder Müllersche Glialzellen.
Aufgrund der Arrestin-Monoreaktivität wurde bestimmt, dass etwa 90% der Zellen in den Kulturen Photorezeptoren waren. Die verbleibenden Zellen waren große multipolare und kleinere unipolare NSE-positive Neurone. Die Zellen wurden sodann auf Rhodopsin gefärbt. Etwa 50% der Photorezeptoren exprimierten das Stäbchen-Sehpigment Rhodopsin, wie durch Immunofärbung mit dem monoklonalen Maus-Antikörper gegen Rhodopsin gezeigt wurde. Photorezeptoren erschienen als abgerundete Zellen mit einem kleinen Zellkörper- Durchmesser, einem oder zwei Neuriten und in manchen Fällen einem kurzen vertikalen Fortsatz, der das verbindende Cilium darstellt. Bei dieser Auflösung gab es keinen Hinweis für eine Bildung des äußeren Segments.
Retina-Kulturen von 6 Tage alten Mäusen wurden dann auf die Wirkung der GDNF-Proteinprodukt-Verabreichung auf die Photorezeptor-Lebensfähigkeit untersucht. Photorezeptorkulturen (10.000/6 mm-Loch) wurden mit menschlichen rekombinantem GDNF-Proteinprodukt (10-fache serielle Verdünnungen im Bereich von 10 ng/ml bis 1 pg/ml) behandelt. Die Kulturen wurden nach 6 Tagen fixiert und für Arrestin immunogefärbt. Photorezeptor- Lebensfähigkeit wurde bestimmt durch Zählen der Anzahl Arrestin-positiver Zellen pro 6 mm²-Felder (sie stellen etwa 21% der Gesamtoberfläche eines 6 mm-Lochs dar).
In Kulturen, die nicht mit dem GDNF-Proteinprodukt behandelt worden waren, nahm die Photorezeptorzahl fortwährend mit der Zeit ab und erreichte etwa 25% der anfänglichen Zahl nach 6 Tagen in Kultur. Eine Behandlung der Kulturen mit E. coli exprimiertem rekombinanten menschlichen GDNF-Proteinprodukt resultierte in einer etwa 2-fachen Erhöhung der Zahl lebensfähiger Arrestin-positiver Photorezeptoren nach 6 Tagen in Kultur (vgl. Fig. 1; jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung aus drei Kulturen). Die Wirkung des GDNF- Proteinprodukts war bei etwa 200 pg/ml maximal, wobei der ED50 etwa 30 pg/ml betrug.
Zusätzlich zu einer Verstärkung der Photorezeptor-Lebensfähigkeit stimulierte die Zugabe des GDNF-Proteinprodukts auch die Verlängerung ihres Axon-ähnlichen Fortsatzes (im weiteren als Neuriten bezeichnet), was eine Wirkung auf die morphologische Entwicklung von Photorezeptoren zeigt. Photorezeptorkulturen wurden 6 Tage mit oder ohne rekombinantem menschlichen GDNF-Proteinprodukt (1 ng/ml) inkubiert. Die Kulturen wurden sodann für Arrestin immunogefärbt. Etwa 715 Photorezeptoren aus zwei unabhängigen Kontrollkulturen und 710 Photorezeptoren aus zwei unabhängigen GDNF-Proteinproduktbehandelten Kulturen wurden photographiert und in Bezug auf ihre Neuritenlängen analysiert. Die Wirkung der Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts auf das Auswachsen von Neuriten wurde durch Messung der Neuritenlängen der Photorezeptoren quantifiziert. Fig. 2 zeigt die Verstärkung des Auswachsens von Photorezeptor-Neuriten durch das GDNF- Proteinprodukt. Die Daten sind als Diagramm der Summenhäufigkeitsverteilung der Neuritenlängen dargestellt. Der Prozentsatz an Photorezeptoren (Ordinate) mit Neuriten, die länger sind als eine gegebene Länge in Mikrometern (Abszisse), ist aufgetragen. Die Zugabe des GDNF-Proteinprodukts erhöhte die Werte der Verteilung von Neuritenlängen im Vergleich mit unbehandelten Kulturen. Manche Photorezeptoren in den mit dem GDNF-Proteinprodukt behandelten Kulturen zeigten etwa 180 um lange Neuriten, während die längsten in unbehandelten Kulturen beobachteten Neuriten 100 um lang waren. Die mittlere Neuriten länge der Photorezeptoren in den mit dem GDNF-Proteinprodukt behandelten Kulturen betrug 68 um, verglichen mit 27 um in den Kontrollkulturen.
Photorezeptoren verwenden Glutamat als Neurotransmitter für die Weiterleitung des Signals an die Neurone der zweiten Ordnung. In aus > 90% Photorezeptoren bestehenden Kulturen zeigt der Grad an Glutamataufnahme durch die Zellen die Zahl und Aktivität hoch-affiner Glutamataufnahme-Transporterstellen auf den Photorezeptoren an und spiegelt somit deren funktionelle Differenzierung wieder. Die Stimulierung der Glutamataufnahme durch Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts wurde untersucht, um seine Wirkungen auf die funktionelle Differenzierung von Photorezeptoren zu bewerten. Kulturen wurden wie vorstehend beschrieben vermehrt und entweder mit rekombinantem menschlichen GDNF-Proteinprodukt 6 Tage behandelt oder nicht behandelt. Kulturen wurden sodann für die Aufnahme von [³H]-Glutamat (50 nM; 1,5 Mio. dpm/ml; 1 Stunde Inkubation bei 37ºC) gemäß dem nachstehenden Verfahren behandelt.
Test der Glutamataufnahme: Glutamataufnahme wurde in Kulturen mit Photorezeptoren aus 5 Tage alten Mäusen untersucht, die in 96-Loch-Mikroplatten etabliert worden waren. Die Kulturen wurden mit etwa 100 ul vorgewärmtem Aufnahmepuffer, bestehend aus modifizierter Krebs-Ringer-Lösung, pH 7,4, mit etwa 120 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl&sub2;, 1, 2 mM MgSO&sub4;, 32 mM NaHPO&sub4;, 1,3 mM EDTA und 5,6 mM D-Glucose gewaschen. Die Zellen wurden sodann bei 37ºC für etwa 10 Minuten in Aufnahmepuffer vorinkubiert. Tritiummarkiertes L-Glutamat (etwa 60 Ci/mmol) wurde sodann zu den Kulturen bei einer Konzentration von etwa 50 nM in 75 ul Aufnahmepuffer hinzugegeben und die Kulturen 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Aufnahme wurde durch Absaugen des Inkubationsmediums, gefolgt von drei schnellen Waschschritten mit etwa 120 ul eisgekühltem Aufnahmepuffer, gestoppt. Die Zellen wurden sodann durch Zugabe von 200 ul Optiphase Supermix Scintillations- Cocktail (Wallac) lysiert und Radioaktivität wurde durch Scintillationsspektrometrie mit einem Wallac MicrobetaPlus 96-Loch-Mikroplatten-Zähler bestimmt. Die Ergebnisse sind entweder als dpm/6 mm-Loch oder als -fache Veränderung gegenüber Kontrollkulturen wiedergegeben.
Man fand heraus, dass das GDNF-Proteinprodukt die Glutamataufnahme in einer Dosisabhängigen Weise stimulierte, wobei eine maximale Aktivität bei etwa 200 pg/ml erreicht wurde und der ED50 etwa 25 pg/ml betrug. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Löchern eines repräsentativen Experiments. Ähnliche Ergebnisse wurden aus zwei unabhängigen Experimenten erhalten. Die Ergebnisse zeigen, dass GDNF zusätzlich zur Verstärkung der Lebensfähigkeit und der morphologischen Entwicklung von Photorezeptoren die Reifung Neurotransmissions-verwandter Funktionen verstärkt, wie Glutamataufnahme, die für die visuelle Weiterleitung entscheidend sind.

Beispiel 2

Förderung der Stäbchen-Photorezeptor-Lebensfähigkeit und -Regeneration in Kulturen der Retina erwachsener Mäuse

Die Photorezeptorentwicklung ist nach etwa drei Wochen nach der Geburt vollständig. Zu diesem Zeitpunkt haben Photorezeptoren funktionelle äußere Segmente entwickelt, die die zelluläre, für die Phototransduktion notwendige Maschinerie, einschließlich der visuellen Pigmente, konzentrieren. Reife Ratten-Photorezeptoren wurden aus 18 und 39 Tage alten Retinas dissoziiert und für mehr als 1 Woche in Kultur gehalten. Die Neurone wurden auf einem zuvor geschaffenen Monolayer retinaler Glialzellen ausgesät (bei einer Dichte von etwa 2500/6 mm-Loch). Glialzellen fördern die Adhäsion dissoziierter Photorezeptoren und versorgen sie mit Nährstoffen und Faktoren, die für ihre Entwicklung essentiell sind. Ausgereifte Photorezeptoren, die mit retinalen Glialzellen co-kultiviert worden waren, wurden durch Doppel-Immunofärbung für Arrestin und Rhodopsin unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Antikörper und Immunofärbeverfahren identifziert.
Kulturen wurden mit dem rekombinanten menschlichen GDNF-Proteinprodukt behandelt (0,1, 1 oder 10 ng/ml). Die Zellen wurden nach 7 Tagen fixiert und für Arrestin immunogefärbt. Photorezeptor-Lebensfähigkeit wurde durch Zählen der Zahl an Arrestin-positiven Neuronen pro 6 mm-Loch bestimmt. Die Zahl an Stäbchen-Photorezeptoren in Kulturen von sowohl 18 als auch 39 Tage alten Retinas war etwa 3,5-fach höher in den Kulturen, die mit dem GDNF-Proteinprodukt behandelt worden waren (vgl. Fig. 4; jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung von 2-3 Kulturen). Eine maximale Förderung wurde bei GDNF- Proteinprodukt-Konzentrationen von etwa 300 pg/ml gefunden, wobei der ED50 etwa 40 pg/ml betrug. Diese Ergebnisse zeigen die Veränderungen in der Photorezeptorzahl und somit die Verstärkung der Photorezeptor-Lebensfähigkeit als Reaktion auf die Behandlung mit dem GDNF-Proteinprodukt.
In einer weiteren Untersuchung wurden dissozüerte Retinazellen auf zuvor etablierte Monolayer von Glialzellen der Maus-Retina (1000 Retina-Zellen/6 mm-Loch) ausgesät und mit rekombinantem menschlichen GDNF-Proteinprodukt behandelt (1 oder 10 ng/ml). Die Kulturen wurden nach 7 Tagen fixiert und für Arrestin immunogefärbt. Zusätzlich zur Verstärkung der Photorezeptor-Lebensfähigkeit verstärkte das GDNF-Proteinprodukt stark die morphologische Entwicklung der Photorezeptoren, wie gezeigt durch das Auswachsen ihrer axonalen Fortsätze und in manchen Fällen durch das Auswachsen eines kurzen apicalen Fortsatzes, einem Überbleibsel eines unreifen äußeren Segments. Diese Kulturen stammten aus ausgereiften Retinas, bei denen die Photorezeptoren voll entwickelt waren. Da die Photorezeptoren ihre Fortsätze während des Dissoziationsverfahrens verloren haben, zeigen die vorliegenden Daten die Fähigkeit des GDNF-Proteinprodukts zur Verstärkung der Regeneration von Photorezeptoren und insbesondere zur Verstärkung der Entwicklung ihrer axonalen Fortsätze und äußeren Segmente, die für den Sehprozess entscheidend sind. Diese Daten deuten an, dass die Verabreichung eines GDNF-Proteinprodukts eine nützliche Therapie für Zustände sein kann, bei denen die Sehkraft aufgrund der Degeneration von Photorezeptoren verloren geht, wie bei seniler Macula-Degeneration, erblichen Retina-Degenerationen und anderen retinafen Dystrophien.

Beispiel 3

Förderung der Stäbchen-Photorezeptor-Lebensfähigkeit in Kulturen der Retina von Mäusen mit einer erblichen retinalen Degeneration (rd/rd)

Rd/rd Mäuse tragen eine Mutation in der beta-Untereinheit von Phosphodiesterase (einem in den äußeren Segmenten lokalisiertes Enzym, das in Phototransduktionsprozessen beteiligt ist), die in seiner Fehlfunktion resultiert und zu einem frühen Ausbruch der Photorezeptor- Degeneration und dem plötzlichen Absterben von Photorezeptoren führt. Zu rd/rd ähnliche Mutationen finden sich in Menschen und sind verantwortlich für eine Untergruppe von Fällen der Retinitis pigmentosa. Photorezeptorsterben in rd/rd Mäusen ist bei etwa 10 Tagen nach der Geburt am stärksten. Diese mutanten Mäuse sind ein nützliches Modell für die Untersuchung der Wirkungen des GDNF-Proteinprodukts auf die Lebensfähigkeit von rd/rd Photorezeptoren.
Kulturen von rd/rd-Photorezeptoren wurden aus 5 Tage alten Mäusen etabliert und 7 Tage in Kultur gehalten, einem Zeitraum, der das Auftreten des maximalen Photorezeptorsterbens abdeckt. Aufgrund ihrer erblichen Verletzbarkeit wurden die dissoziierten rd/rd Photorezepto ren (bei einer Dichte von etwa 2500/6 mm-Loch) auf zuvor etablierte Monolayer retinaler Glialzellen (wie vorstehend beschrieben) ausgesät. Kulturen der rtt/rd Retinas wurden mit Kulturen von Zellen normaler (Wildtyp)-Mäuse-Retinas, die aus gleichaltrigen Tieren erhalten und in der gleichen Weise verarbeitet worden waren, verglichen. Die Kulturen wurden mit rekombinantem menschlichen GDNF-Proteinprodukt (1 ng/ml) behandelt, nach 7 Tagen fixiert und für Arrestin immunogefärbt. Photorezeptor-Lebensfähigkeit wurde durch Zählen der Zahl von Arrestin-positiven Neuronen pro 6 mm-Loch bestimmt.
Die Zugabe von GDNF-Proteinprodukt rief einen moderaten (etwa 15%), jedoch signifikanten Anstieg der Photorezeptorzahl nach 7 Tagen in vitro-Kultur hervor (vgl. Fig. 5; jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung von 3-4 Kulturen). Im Gegensatz und trotz des Glialzell-Trägers nahm die Zahl der Photorezeptoren in Kulturen der rd/rd-Mäuse stark ab und erreichte etwa 40% der Wildtyp-Photorezeptoren nach 7 Tagen, falls das GDNF-Proteinprodukt nicht hinzugegeben wurde. In Gegenwart des GDNF-Proteinprodukts (1 ng/ml) erhöhte sich die Zahl überlebender rd/rd-Photorezeptoren etwa 2,5-fach und erreichte den Überlebensgrad von Kulturen unbehandelter Wildtyp-Photorezeptoren. Diese Daten zeigen, dass eine Behandlung mit dem GDNF-Proteinprodukt die mutanten Photorezeptoren resistenter gegenüber dem Stress, dem sie durch die rd/rd-Mutation ausgesetzt waren, machte. Dies deutet an, dass die Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts nützlich für die Behandlung erblicher retinaler Degenerationen wie Retinitis pigmentosa sein kann.

Beispiel 4

Verstärkung der Zapfen-Photorezeptor-Lebensfähigkeit und der Entwicklung des äußeren Segments in Kulturen der embryonalen Hühner-Retina

Die Entwicklung des Sehsystems erfolgt bei Hühnern sehr viel früher als bei Nagetieren. Das Auswachsen der äußeren Segmente von Photorezeptoren beginnt etwa am Tag 11 bis 12 der agestationalen Phase und die Photorezeptoren sind bei der Geburt vollständig entwickelt. Daher kann die Wirkung der Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts auf die Photorezeptor-Lebensfähigkeit und -Regeneration in Kulturen embryonaler Hühner-Retinas untersucht werden.
Kulturen von Retina-Zellen von Hühnern am embryonalen Tag 17 wurden in 96-Loch-Mikroplatten wie vorstehend beschrieben vermehrt und mit 4% Paraformaldehyd nach 6 Tagen in vitro fixiert. Man fand, dass die Kulturen etwa 60% Photorezeptorzellen und 40% große mul tipolare Neurone enthielten. Eine Phasenkontrast-Mikrographie eines repräsentativen Feldes der Kontrollkulturen zeigte, dass zwei Haupttypen retinaler Zellen in der Kultur auftraten: Zapfen-Photorezeptoren, die durch das Vorkommen eines Fetttropfens in dem apicalen Teil des Zellsomas identifizierbar sind und retinale Neurone. Die Photorezeptorzellen wurden aufgrund der ovalen Zellkörper identifiziert, die fast ausschließlich von dem Kern besetzt waren, einem kurzen inneren Segment mit einem kleinen Fetttropfen, einem einzigen kurzen, unverzweigten Neurit, der von einer Stelle gegenüber dem Fetttropfen hervortritt und einem kurzen distalen Cilium. Diese Merkmale sind für Zapfen charakteristisch. Eine Anti- Rhodopsin-lmmunofärbung wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt und eine Hellfeld-Mikrographie einer 6 Tage alten Kultur zeigte das Auftreten von Stäbchen-Photorezeptoren. Es wurde bestimmt, dass etwa 20% der Photorezeptoren Stäbchen waren. Die verbleibenden 80% der Photorezeptoren waren Zapfen-Photorezeptoren, die kein Rhodopsin enthalten.
Fig. 6 zeigt die Wirkung des GDNF-Proteinprodukts auf die Photorezeptor-Lebensfähigkeit in Kulturen der Hühner-Retina am embryonalen Tag 15. Kulturen dissozüerter Retina-Zellen (plattiert bei einer Dichte von etwa 10.00016 mm-Loch) wurden mit rekombinantem menschlichen GDNF-Proteinprodukt (10-fache serielle Verdünnungen in einem Bereich von 10 ng/ml bis 1 pg/ml) behandelt. Die Kulturen wurden nach 6 Tagen mit 4% Paraformaldehyd fixiert und im Phasenkontrast beobachtet. Zapfen-Photorezeptoren wurden durch das Auftreten eines Phase-hellen Fetttropfens identifiziert. Der Fetttropfen markiert die Verbindung zwischen den inneren und den äußeren Segmenten. Photorezeptor-Lebensfähigkeit wurde durch Zählen der Anzahl an Zapfen pro 6 mm² diametrischer Streifen (sie stellen etwa 21% der gesamten Fläche eines 6 mm-Lochs dar) bestimmt. Jeder Wert ist der Mittelwert ± Standardabweichung von 3 Kulturen. Die Anzahl der in den Hühner-Retina-Kulturen gefundenen Zapfen war etwa 2-fach höher in den mit dem GDNF-Proteinprodukt behandelten Kulturen als in den unbehandelten Kulturen. Die maximale Wirkung des GDNF-Proteinprodukts wurde bei etwa 200 pg/ml beobachtet, wobei der ED50 etwa 50 pg/ml betrug.
Die Zellmorphologie der Photorezeptoren wurde durch Phasenkontrast-Mikrographie bewertet und es stellte sich heraus, dass das GDNF-Proteinprodukt die Entwicklung sowohl des inneren als auch äußeren Segments und der axonalen Fortsätze verstärkte. Im Gegensatz zu unbehandelten Kulturen enthielten mit dem GDNF-Proteinprodukt behandelte Kulturen (1 ng/ml für 7 Tage) einen großen Teil Zapfen-Photorezeptoren, die als stark verlängerte, polarisierte und kompartimentalisierte Zellen erschienen. Diese Zapfen besaßen ein verlängertes inneres Segment, das in manchen Fällen mit einer dreidimensionalen, Phasenhellen Struktur, die für ein äußeres Segment charakteristisch ist, verbunden war. Andere Zapfen entwickelten ein dickes, langes und verzweigtes Neurit. In manchen Fällen wurden Doppelzapfen mit zwei äußeren Segmenten (typisch für Vogel-Retinas) in mit dem GDNF- Proteinprodukt behandelten Kulturen beobachtet. Zusätzlich zu den Zell-Lebensfähigkeits- Nermehrungswirkungen zeigt die Wirkung der Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts auf die Entwicklung des äußeren Segments in den Hühnerkulturen seine Fähigkeit, die Regeneration äußerer Segmente, die durch das Dissoziationsverfahren beschädigt wurden, zu verstärken. Dies deutet wiederum an, dass eine Verabreichung des GDNF-Proteinprodukts auch für die Behandlung retinaler Dystrophien, zusätzlich zu der Behandlung erblicher retinaler degenerativer Zustände und Retinopathien, nützlich sein würde.
Zahlreiche Modifikationen und Variationen bei der Durchführung der Erfindung können bei Betrachtung der vorstehenden Beschreibung und der bevorzugten Ausführungsformen durch den Fachmann erfolgen. Dementsprechend begrenzen nur die beigefügten Ansprüche den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Sequenzprotokoll

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Amgen Inc.
(B) STRASSE: 1840 DeHavilland Drive
(C) STADT: Thousand Oaks
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 91320-1789
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Verfahren zur Behandlung von verletzten oder degenerierten Photorezeptoren mit einem neurotrophischen Faktor aus der Glial-Zelllinie (GDNF)
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25
(v) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER; EP 96941452.3
(B) ANMELDETAG: 22. November 1996
(C) KLASSIFIKATION:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 134 Aminosäurereste
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: abgeleitete Aminosäuresequenz von
reifem, menschlichem GDNF
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäurereste
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: synthetische Peptidsequenz des
Stäbchen-spezifischen Proteins
Arrestin
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2

Claims

1. Verwendung eines Proteinprodukts eines von einer glialen Zelllinie abstammenden neurotrophischen Faktors (GDNF) zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Zuständen, die mit der Verletzung oder Degeneration von Photorezeptoren in Verbindung stehen,

2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Verletzung oder Degeneration der Photorezeptoren in Verbindung steht mit Retinitis pigmentosa, Bardet-Biedl-Syndrom, Bassen- Kornzweig-Syndrom (Abetalipoproteinämie), Best-Krankheit (vitelliforme Dystrophie), Choroidämie, Gyrus-Atrophie, kongenitaler Amaurose, Refsum-Krankheit, Stargardt-Syndrom, Usher-Syndrom, seniler Makuladegeneration, diabetischer Retinopathie, peripheren Vitreoretinopathien, Photoretinopathien, durch einen operativen Eingriff induzierte Retinopathien, viralen Retinopathien, ischämischen Retinopathien, Netzhautablösung oder traumatischer Retinopathie.

3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung die in SEQ ID NO: 1 gezeigte GDNF-Aminosäuresequenz, eine Variante oder ein Derivat davon umfasst.

4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung [Met&supmin;¹]GDNF umfasst.

5. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung an ein wasserlösliches Polymer gebundenes GDNF umfasst.

6. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung ein verkürztes menschliches GDNF-Protein umfasst.

7. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung Zellen umfasst, die modifiziert wurden, um das GDNF-Proteinprodukt zu produzieren und zu sekretieren.

8. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung weiterhin eine wirksame Menge eines zweiten therapeutischen Wirkstoffs für die Behandlung einer Netzhauterkrankung umfasst.

9. Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei der zweite therapeutische Wirkstoff ausgewählt ist aus vom Gehirn abstammendem neurotrophischen Faktor, Neurotrophin-3, Neurotrophin-4/5, Neurotrophin-6, Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor, Ziliar-neurotrophischem Faktor, saurem und basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor-5, transformierendem Wachstumsfaktor-β und Cocain-Amphetamin-reguliertem Transkript.

10. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung als Augeneinlage, Augeninjektion oder Augenimplantat formuliert ist.

11. Verfahren zur Bereitstellung von Photorezeptorzellen für eine Implantation, umfassend Kultivieren dissozüerter Photorezeptorzellen in Gegenwart eines Proteinprodukts eines von einer glialen Zelllinie abstammenden neurotrophischen Faktors (GDNF).

12. Zusammensetzung, umfassend Photorezeptorzellen und ein Proteinprodukt eines von einer glialen Zellinie abstammenden neurotrophischen Faktors (GDNF) in Mengen, die das Überleben der Photorezeptorzellen fördern und das fortwährende Wachstum und die Reifung der Photorezeptorzellen ermöglichen.