FI117556B - Yhdistelmä-DNA-menetelmä hermoston tukikudosperäisen neurotrofisen tekijän tuottamiseksi - Google Patents

Description

. 1 117556

Yhdistelmä-DNA-menetelmä hermoston tukikudosperäisen neuro-trofisen tekijän tuottamiseksi

Keksinnön ala 5 Esillä oleva keksintö koskee yhdistelmä-DNA-mene- ?, telmää neurotrofisten tekijöiden ja erityisesti hermoston -s tukikudosperäisen neurotrofisen tekijän (GDNF) tuottamiseksi. Samoin tähän keksintöön sisältyy menetelmiä GDNFrää koodittavien rotta- ja ihmisgeenien kloonaamiseksi sekä 10 GDNFiää koodittavien rotta- ja ihmisgeenien nukleiinihap- posekvenssit. GDNF-geeni on alakloonattu ilmentämisvekto- f riin ja vektoria käytetty biologisesti aktiivisen GDNF:n ilmentämiseksi.

Keksinnön tausta 15 Neurotrofiset tekijät ovat luonnollisia proteiine ja, joita esiintyy hermostossa tai hermoston hermottamissa ei-hermokudoksissa ja joiden tehtävänä edistää on hermo-ja/tai hermoston tukikudossolujen eloonjääntiä ja ylläpitää niiden fenotyyppistä differentiaatiota [Varon ja Bunge, 20 Ann. Rev, Neuroscience 1 (1979) 327; Thoenen ja Edgar, Science 229 (1985) 238]. Tämän fysiologisen roolin johdosta 7 :.·, neurotrofiset tekijät saattavat olla käyttökelpoisia eri- • * * • V laisissa hermoston rappeutumissairauksissa esiintyvien her- * · *. mosolujen rappeutumisen ja differentioituneen funktion me- * · · ** *] 25 netyksen hoidossa.

Jotta nimenomainen neurotrofinen tekijä olisi mah- • · * dollisesti käyttökelpoinen hermovaurion hoidossa, vaurioi- ·*« V: tuneiden hermosolujen luokan tai luokkien on reagoitava te- ΐ kijään. Erilaiset neurotrofiset tekijät vaikuttavat tyypil- : ;: 30 lisesti selvästi erilaisiin hermosoluluokkiin. Tämän vuoksi * · · :***; edullisesti käytettävissä on valikoima erilaisia neurotro- i ··« fisia tekijöitä kunkin niistä vaurioituneiden hermosolujen luokista hoitamiseksi, joita voi esiintyä sairauden tai * · ’···* vaurion eri muodoissa.

"·*: 35 Neurotrofiset tekijät pystyvät suojaamaan alttiita :*·.· hermosoluja lukuisia erilaisia toisiinsa liittymättömiä • · f 2 117556 loukkauksia vastaan. Esimerkiksi neurotrofinen tekijä her-mokasvutekijä (NGF) pelastaa merkittävän osan tuntohermoso-luista kuolemalta, jonka aiheuttaa niiden aksonaalisten prosessien katkaiseminen [Rich et ai., J. Neurocytol. 16 5 (1987) 261; Otto et ah, J. Neurosci. 83 (1987) 156], onto- geneettiseltä kuolemalta alkiokehityksen aikana [Hamburger et ai,, J. Neurosci. 4 (1984) 767] ja vauriolta, jonka ai heuttaa taksolin tai cis-platinan antaminen [Apfel et ai.,

Ann. Neurol. 29 (1991) 87] . Tämä suojauksen ilmeinen ylei- 'Ι- ΙΟ nen luonne on johtanut siihen käsitykseen, että jos neurotrofinen tekijä suojaa alttiita hermosoluja kokeelliselta vauriolta, se saattaa olla käyttökelpoinen sellaisten sairauksien hoidossa, joihin liittyy vaurio noille hermosoluille potilaissa, vaikkakin etiologia saattaa olla tunte-15 maton.

Tiettyä neurotrofista tekijää on sen lisäksi, että sillä on oikeanlainen hermosoluspesifisyys, oltava saatavana riittävä määrä farmaseuttisessa hoidossa käytettäväksi.

Koska neurotrofisiä tekijöitä esiintyy tyypillisesti kudok-20 sissa häviävän pieniä määriä [esim. Hofer ja Barde, Nature 331 (1988) 261; Lin et al^, Science 246 (1989) 1023], far- •maseuttisten määrien neurotrofisiä tekijöitä valmistaminen * · * · suoraan eläinkudoksista ei olisi käytännöllistä. Vaihtoeh- • · · ; tona olisi toivottavaa paikantaa neurotrofisen tekijän gee- • · · 25 ni ja käyttää tuota geeniä perustana yhdistelmä-DNA- •«tl.

, llmentämissysteemin luomiseksi potentiaalisesti rajattomien • · · ·“! määrien proteiinia tuottamiseksi.

··· *·* ' Tämän hakemuksen keksijät kuvaavat menetelmää bio logisten näytteiden seulomiseksi neutrotrofisen aktiivi- • ' 30 suuden suhteen Parkinsonin taudissa rappeutuvien aivojen ϊ ϊ mustatumakkeen dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolu- ,*J·. jen alkioprekursoreihin. Tämä biomääritys Parkinsonin • · · taudin hoidossa mahdollisesti käyttökelpoisten neurotrofis-*"* ten tekijöiden identifioimiseksi perustuu aiemmin kuvattuun "**! 35 määritykseen [Friedman et ai., Neuro Sei. Lett. 79 (1987) 65 - 72, joka spesifisesti sisällytetään osaksi tätä hake- 3 117556 musta tällä viitteellä] ja se suoritetaan modifioiden esillä olevassa keksinnössä. Tätä määritystä käytettiin erilaisten mahdollisten lähteiden seulomiseksi dopamiinivaiku-tukseen liittyviin hermosoluihin kohdistuvan neurotrofisen 5 aktiivisuuden suhteen. Esillä oleva keksintö kuvaa yhdestä tällaisesta lähteestä puhdistetun neurotrofisen tekijän karakterisointia, joka lähde oli glioblastoomasolulinjalla B49 käsitelty kasvualusta [Schubert et ai., Nature 249 (1974) 224 - 227, joka spesifisesti sisällytetään osaksi 10 tätä hakemusta tällä viitteellä]. Tällä solulinjalla käsitellyn kasvualustan raportoitiin aiemmin sisältävän dopa-miinivaikutukseen liittyvää neurotrofista aktiivisuutta [Bohn et ai., Soc. Neurosci. Abs. 15 (1989) 277] . Tässä aiemmassa raportissa neurotrofisen aktiivisuuden lähdettä ei 15 puhdistettu, karakterisoitu kemiallisesti tai osoitettu olevan seurausta yhdestä aineesta käsitellyssä kasvualustassa. Hermovaurion aiheuttavat olosuhteet, jotka vaarantavat yhden tai useamman hermosolutyypin eloonjäännin ja/tai oikeanlaisen toiminnan. Tällainen hermovaurio saattaa ta-20 pahtua laajasta valikoimasta eri syitä, joista joitakin mainitaan alla.

J Hermovaurio saattaa seurata fyysisestä vauriosta, • · · · joka aiheuttaa aksonaalisten prosessien ja/tai hermosolu- « · · runkojen rappeutumista lähellä vauriokohtaa. Hermovaurio • ·· I 25 saattaa samoin seurata veren virtauksen hermoston osiin ti-·«··· lapäisestä tai pysyvästä loppumisesta, kuten halvauksessa.

• · · ···· Hermovaurio saattaa niinikään seurata tahallisesta tai va- • · * * * · *.* * hingossa tapahtuneesta altistamisesta hermomyrkyille, kuten kemoterapeuttiset syöpä- ja aids-lääkkeet cis-platina ja ϊ.ί.ϊ 30 vastaavasti dideoksisytidiini (ddC) . Hermovaurio saattaa .-· myös johtua kroonisista aineenvaihdunnallisista sairauksis-ta, kuten diabeteksestä tai munuaisten vajaatoiminnasta.

* · ·

Hermovaurio saattaa samoin olla seurausta hermoston rappeu- * · tumissairauksista, kuten Parkinsonin tauti, Alzheimerin *:··: 35 sairaus ja amyotrofinen lateraaliskleroosi (ALS), jotka • · * * » • · * • · / 4 117556 seuraavat spesifisten hermosolupopulaatioiden rappeutumisesta. ·:':Ι Tämä hakemus kuvaa uutta yhdistelmä-DNA-menetelmää neurotrofisen tekijän tuottamiseksi. Neurotrofiset tekijät * 5 ovat luonnollisia proteiineja, jotka edistävät spesifisten hermosolujen normaaleja funktioita ja/tai suojaavat samoja soluja lukuisia erilaisia vaurion muotoja vastaan. Juuri nämä ominaisuudet viittaavat siihen, että GDNF saattaa olla käyttökelpoinen hermovaurion eri muotojen hoidossa, mukaan 10 lukien ne muodot, jotka edellä spesifisesti mainitaan.

Parkinsonin tauti identifioidaan ainoalaatuisesta oireryhmästä, johon kuuluu jäykkyys, hidasliikkeisyys, talirauhasen lisääntynyt eritys, kiiruhtava kävelytapa, taipunut ryhti, lisääntynyt syljeneritys ja "pillerinpyöri-15 tys"-vapina. Tautia tavataan kaikissa roduissa maailmanlaajuisesti ja keskimääräinen alkamisikä on 60 vuotta. V

Vuosien ristiriitaisten teorioiden ja kiistelyn jälkeen biokemiallinen perusta on paljastunut Parkinsonin taudin pääasialliseksi aiheuttajaksi [katso esim. Bergman, y ,t 20 Drug Store News 12 (1990) IP19] . Huomattava merkitys Par- kinsonin taudin ymmärtämiselle on aivojen mustatumakkeena, • aivojen tyvitumakkeena ja erityisesti kahden tyvitumakkeen • · * · : y ja niiden välisten juosteiden muodostamana alueena tunne- • * · tuilla aivoalueilla. Aivojen mustatumake, joka on bilate- u • ·· :··"7 m' I 25 raalinen kerrospari pigmentoitua harmaata ainetta kes-• · . kiaivoissa, osallistuu dopamiinin siirtoon, kun taas nor- y • * * . :? •|;j maaliin aivojen tyvitumakkeen toimintaan liittyy sarja vuo- • * · *·* * rovaikutuksia ja feedback-systeemejä, jotka ovat yhteydessä aivojen mustatumakkeeseen ja joita osaltaan välittävät do- • ··.···; ·.·.* 30 pamiini, asetyylikoliini ja muut aineet.

• · · ί>#>: Parkinsonin taudissa kyseessä on aivojen mustatu- 1 .···, makkeen dopamiiniliitteisen aktiivisuuden vajaatoiminta, i • · I.. jonka aiheuttaa hermosolujen rappeutuminen. Tästä seuraa • · *’* dopamiinipuutostila ja aktiivisuustasapainon siirtyminen 35 asetyylikoliinivaikutusten hallitsevuuteen. Tämän vuoksi, • · vaikka mitään lisäystä asetyylikoliinin pitoisuudessa ei 5 117556 tapahdu, tämän asetyylikoliinivälittäjän kiihottavat vaikutukset keskushermostoon (eli vapinat) ylittävät vähentyneen dopamiinin inhiboivat vaikutukset.

Parkinsonin taudin tehokkain hoito tähän mennessä 5 on Levodopa-valmisteen antaminen suun kautta. Levodopa tunkeutuu keskushermostoon ja tulee entsymaattisesti muutetuksi dopamiiniksi aivojen tyvitumakkeessa. Uskotaan, että Levodopa-valmisteen edulliset vaikutukset ovat tämän vuoksi dopamiinin pitoisuuden nostaminen aivoissa. Valitettavasti 10 sen paremmin Levodopa-valmiste kuin mikään harvemmin käytetyistä lääkityksistäkään ei tosiasiassa ehkäise dopamiini-vaikutukseen liittyvien hermosolujen rappeutumisen aiheuttaman sairauden etenemistä.

Muut tutkijat ovat raportoineet dopamiiniaktiivi-15 suuden esiintymisestä erilaisissa biologisissa lähteissä.

Springerin et ai. PCT-julkaisussa WO91/01 739 identifioitiin neurotrofista dopamiiniaktiivisuutta uutteesta, joka oli peräisin ääreishermostosoluista. Identifioitua aktiivisuutta ei puhdistettu, mutta sen katsottiin johtuvan teki-20 jästä, jonka molekyylipaino oli alle 10 000 daltonia. Tekijä eristettiin rotan iskiashermosta, mutta se ei ilmeises-J tikään ole CNTF, jota myös tavataan hermossa [Lin et ai., "V Science 246 (1989) 1023].

,·/· Appelin et ai. US-patenttijulkaisussa nro 5 017 735 • * * 25 dopamiiniaktiivisuutta identifioitiin aivojen häntä-linssi- • · . tumakekudosuutteesta. Taaskaan mitään aktiivisuuden aiheut- • · * *"* tavia tekijöitä ei puhdistettu ja aktiivisuuden sisältävien • · * " *·* * fraktioiden näennäinen molekyylipaino oli suhteellisen pieni. Katso myös Niijima et ai,. Brain Res, 528 (1990) 30 151 - 154 (täysikasvuisen rotan aivojen aivojuovio, josta • · · , : : tuova hermo oli kemiallisesti katkaistu); Lo et ai., Soc.

• t* - -- .···. Neurosci. Abstr. 16 (1990) 809 (aivojuovioperäinen neuro- .

« · a trofinen tekijä) . Lisäksi muillakin tunnetuilla neurotrofi- • · • · "* silla tekijöillä on osoitettu olevan dopamiiniaktiivisuut- 35 ta, esim. aivoperäinen neurotrofinen tekijä (BDNF) ja hapan ja emäksinen sidekudosmuodostussolukasvutekijä.

6 117556

Esillä olevan keksinnön menetelmän mukainen GDNF J

eristettiin sen kyvyn perusteella edistää rotan alkion keskiaivoista eristettyjen dopamiinivaikutukseen liittyvien |

hermosolujen funktionaalista aktiivisuutta ja eloonjääntiä 5 soluviljelmässä. Nämä dopamiinivaikutukseen liittyvät hermosolut ovat alkion prekursoreita täysikasvuisen aivojen mustatumakkeen dopamiinivaikutukseen liittyville hermosoluille, jotka rappeutuvat Parkinsonin taudissa. Tämän vuoksi GDNF saattaa olla käyttökelpoinen Parkinsonin taudin oi- 'J

10 reet aiheuttavan hermosolujen rappeutumisen vähentämisessä.

Lisäksi GDNF voi olla käyttökelpoinen dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen muiden vauriomuotojen tai virheellisen toiminnan hoidossa ihmispotilaissa. Tällainen vaurio tai virheellinen toiminta voi esiintyä skitsofreni-15 assa ja muissa psykoosimuodoissa. Tämänhetkiset hoidot tällaisille tiloille edellyttävät usein dopamiinireseptoreilla aktiivisia lääkkeitä, mikä viittaa siihen, että näitä re- ; septorin käsittäviä hermosolupopulaatioita hermottavien dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen virheellinen 20 toiminta voi liittyä sairausprosessiin.

Aiemman kokemuksen nojalla muilla neutotrofisillä j tekijöillä hermovaurion uusia muotoja, joita voidaan hoitaa ·*· · .·.·. GDNF: llä, ilmaantuu opittaessa enemmän erityyppisistä her- * * · mosoluista, jotka reagoivat tähän neurotrofiseen tekijään.

• ·· 25 Esimerkiksi hermokasvuteki j ä (NGF) paljastui Alzheimerin • · , sairauden mahdollisesti käyttökelpoiseksi hoidoksi vasta, • · * .’Ϊ *·*· kun vast'ikään havaittiin, että NGF toimii neurotrof isena ··· ' • · ** * tekijänä etuaivojen tyven asetyylikoliinivaikutukseen liit- y • ·#· tyville hermosoluille, jotka rappeutuvat Alzheimerin sai-30 raudessa. [Williams et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 • · · ϊ4>ίί (1986) 9231] . Esillä olevassa keksinnössä annetaan käyttöön ,···, menetelmiä muiden hermovauriomuotojen määrittämiseksi, joi- • · · ta voidaan edullisesti hoitaa GDNF: llä.

• · * · "* Patrick Aebischer ja kanssatyöntekijät ovat kuvan- *"*! 35 neet puoliläpäisevien, istutettavien membraanilaitteiden !.*.! käyttöä, jotka ovat käyttökelpoinen keino lääkeaineiden tai 7 117556 lääkkeiden perille toimittamiseksi tietyissä olosuhteissa.

Esimerkiksi he ovat ehdottaneet hermojen välittäjäaineteki-jöitä erittävien solujen kapselointia ja tällaisten laittei-den istuttamista Parkinsonin taudista kärsivien potilaiden . ΐ 5 aivoihin. Katso US-patenttijulkaisu nro 4 892 538, Aebi-scher et ai.; US-patenttijulkaisu nro 5 011 472, Aebischer et ai.; US-patenttijulkaisu nro 5 106 627, Aebischer et ai.; PCT-hakemusjulkaisu W091/ 10 425; PCT-hakemusjulkaisu WO 91/10 470; Winn et ai., Exper. Neurol. 113 (1991) 322 - 329; 10 Aebischer et ai., Exper. Neurol. Ill (1991) 269 - 275; ja Tresco et ai.; ASAIO 38 (1992) 17 - 23.

Keksinnön yhteenveto Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-menetelmää hermoston tukikudosperäisen neurotrofisen tekijän (GDNF) 15 tuottamiseksi, jolle on tunnusomaista, että se käsittää vaiheet: (a) alakloonataan hermoston tukikudosperäistä neu-rotrofista tekijää (GDNF) koodittava nukleiinihapposek-venssi ilmentämisvektoriin, joka käsittää siihen alakloo-20 natun nukleiinihapposekvenssin ilmentämiseksi tarvittavat ' säätelyelementit ja jossa mainittu nukleiinihapposekvenssi • käsittää nukleiinihapposekvenssin, joka on valittu seuraa-

Hl * vista: • · · • · : i. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa pre- • t · 25 pro-rotta-GDNF: n kuviossa 13 esitettyä aminohapposekvens- • · . siä (sekvenssi tunnusnumero 3); : • · · *"| ii. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa rotan 1 • · · *·* * kypsän GDNF:n kuviossa 13 esitettyä aminohapposekvenssiä 1 (sekvenssi tunnusnumero 4); f *.·.* 30 iii. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa ihmi- ··· ϊι##ϊ sen pre-pro-GDNF:n kuvioissa 19 (sekvenssi tunnusnumero 5) ja 22 (sekvenssi tunnusnumero 8) esitettyä aminohappose- tl • * * ... kvenssiä; • m * * T iv. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa ihmi- *·*’· 35 sen kypsän GDNF:n kuviossa 19 esitettyä aminohapposekvens- • · ϊ *.! siä (sekvenssi tunnusnumero 6); * 8 117556 v. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa aminohapposekvenssiä, jolla on yli 70-prosenttinen homologia-aste tunnusnumerolla 4 esitettyjen sekvenssien kanssa; vi. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa amino-5 happosekvenssiä, jolla on yli 70-prosenttinen homologia- aste tunnusnumerolla 6 esitettyjen sekvenssien kanssa; vii. nukleiinihapposekvenssi, joka hybridisoituu ankarissa olosuhteissa (i) - (vi) -kohdassa esitetyn sekvenssin komplementaariseen sekvenssiin 10 (b) transformoidaan isäntäsolu mainitulla ilmentä- misvektorilla; (c) viljellään isäntäsoluja olosuhteissa, joissa vektori monistuu ja hermoston tukikudosperäinen neurotro-finen tekijä (GDNF) ilmentyy; ja 15 (d) otetaan talteen hermoston tukikudosperäinen neurotrofinen tekijä (GDNF) isäntäsoluviljelmästä. ·: Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä yhdessä suoritusmuodossa saadaan oleellisesti puhdistettu GDNF, jonka spesifinen aktiivisuus on ainakin noin 24 000 kertaa ; 20 suurempi kuin B49-käsitellyn kasvualustan spesifinen aktiivisuus. Oleellisesti puhdistetun GDNF:n spesifinen aktii- j .*. visuus on ainakin noin 12 000 TU/pg.

·····

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä • · · ,·,*· saatavan oleellisesti puhdistetun GDNF: n näennäinen mole- • · · 25 kyylipaino on noin 31 - 42 kD ei-pelkistävässä SDS-PAGE:ssa ; , ja noin 20 - 23 kD pelkistävässä SDS-PAGE:ssa. Oleellisesti ··· ··" puhdistetulla GDNF:llä on aminopään sekvenssi, joka koostuu • · · *·’* oleellisesti aminohapposekvenssistä (sekvenssi tunnusnro 1) : 30 (Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-( ) -Gln-Ala-Ala-Ala-Ala- (Ser) -Pro- (Asp) - (Asn) .

.···. Rotta-GDNF:n kypsän ja pre-pro-muodon aminohappo- Φ · * sekvenssit esitetään kuvioissa 13 ja 14 (sekvenssit tun- * · * * *;* nusnro 3 ja 4). Kypsän ihmis-GDNF:n aminohapposekvenssi "**! 35 esitetään alleviivattuna kuviossa 19 (sekvenssi tunnusnro 6) . Ihmis-GDNF:n pre-pro-muodon aminohapposekvenssi esite- g 117556 tään kuvioissa 19 (sekvenssi tunnusnro 5) ja 22 (sekvenssi tunnusnro 8).

Samoin kuvataan B49-solulinjasta valmistetusta cDNA-kirjastosta saadun rotta-GDNF-geenin kloonausta. Kyp- ^ 5 sää ja pre-pro-rotta-GDNF:ää koodittava nukleiinihappose-kvenssi esitetään kuviossa 13 (sekvenssi tunnusnro 3). Myös julkistetaan menetelmä GDNF:ää koodittavan ihmisgeenin saamiseksi, Kypsää ihmis-GDNF:ää koodittava nukleiinihappose-kvenssi esitetään kuviossa 19 (sekvenssi tunnusnro 5) . Ih-10 mis-GDNF:n pre-pro-segmentin ensimmäisiä 50 aminohappoa koodittava nukleiinihapposekvenssi esitetään kuviossa 22 (sekvenssi tunnusnro 8).

Tässä keksinnössä GDNF tuotetaan yhdistelmä-DNA-menetelmillä käyttäen tässä kuvatun mukaisesti GDNFrää koo-15 dittavia geenejä. Esillä oleva keksintö sisältää vektorin käytettäväksi biologisesti aktiivisen GDNF:n tuottamisessa, joka vektori koostuu ilmentämisen säätelyelementeistä, jotka on operatiivisesti kytketty kypsää tai pre-pro-GDNF:ää koodittavaan nukleiinihapposekvenssiin, sekä tällaisella :ΐ 20 vektorilla transformoidun isäntäsolun. Samoin keksintöön sisältyy yhdistelmä-DNA-menetelmä GDNF:n tuottamiseksi, jo- : ka käsittää: GDNF:ää koodittavan DNA-sekvenssin alakloona- • · · • * · ♦ uksen ilmentämisvektoriin, joka käsittää DNA-sekvenssin il- • · · mentämiseen tarvittavat säätelyelementit; isäntäsolun • ♦* I 25 transformoinnin mainitulla ilmentämisvektorilla; isäntä- solujen viljelemisen sellaisissa olosuhteissa, joissa vek- t • · · tori tulee monistetuksi ja GDNF:n ilmentyy; ja GDNF:n otta- • · · *.* * misen talteen.

Kuvataan yhdistelmä-DNA-menetelmää GDNF:n tuottami-30 seksi, joka käsittää: tämän keksinnön mukaisten isäntäsolu-:***: jen viljelemisen sellaisissa olosuhteissa, joissa vektori tulee monistetuksi ja GDNF:n ilmentyy; ja GDNF:n ottamisen * ♦ · talteen.

• · 7 Piirustusten kiivaus 35 Kuvio 1 esittää tuloksia hepariinisefaroosikromato- grafiasta B49-glioblastoomasoluja kasvattamalla käsitel- 117556 ίο , lyn, seerumia vailla olevan konsentroidun kasvualustan liuoksella. Tuloksina esitetään eluaatin O.D.290 (—), johto-kyky (-delta-) ja GDNF-aktiivisuus TU-yksiköissä (-0-). Janalla merkityt fraktiot yhdistettiin pooliksi jatkopuhdis-5 tusta varten.

Kuviossa 2 esitetään tulokset FPLC-Superose-kroma-tografiästä kuvion 1 mukaisilla pooliksi yhdistetyillä fraktioilla. Tuloksina esitetään O.D.280 (-) ja GDNF-aktiivisuus TU-yksiköissä (-0-).

10 Kuviossa 3 esitetään tulokset RP-HPLC:stä kuvion 2 mukaisella fraktiolla 14. Tuloksina esitetään O.D.214/ jolloin GDNF-aktiivisuus TU-yksiköissä esitetään alla.

Kuviossa 4 esitetään tulokset SDS-PAGE-analyysistä hopealla värjäten edellisen kuvion 3 mukaan saaduilla frak-15 tioilla 3-10. Vyöhyke S sisältää molekyylipainostandar-dit.

Kuviossa 5 esitetään tulokset preparatiivisesta SDS-PAGE:sta kuvion 4 mukaisilla fraktioilla 5 ja 6. Tes- ; tattiin geeliviipaleiden GDNF-aktiivisuus TU-yksiköissä.

20 Geeliviipaleet korreloitiin myös molekyylipainoon käyttämällä molekyylipainomerkkejä (Amersham).

J Kuviossa 6 esitetään tulokset RP-HPLC:stä kuvion 5 • · · • · * ♦ mukaisilla fraktioilla 16 - 23. Kromatogrammi A sisältää • · · \\ näytteen ja kromatogrammi B on verrokki (pooliksi yhdistet- • ·« * * 25 ty geeliuute tyhjän vyöhykkeen vastaavista viipaleista).

·····

Kuviossa 7 esitetään tulokset SDS-PAGE-analyysistä ···· hopealla värjäten kuvion 6A mukaisella piikillä 3 (vyöhyke ··· : 1) ja molekyylipainoverrokilla (vyöhyke S) .

Kuviossa 8 kuvataan puhdistetusta GDNF:stä saatu Ι^ϊ 30 aminopään aminohapposekvenssi. Tyhjät sulkeet osoittavat aseman, jonka aminohappoa ei voitu määrittää käytettyä sek- • * · ventointitekniikkaa käyttämällä. Sulkeissa esitettyjen täh- • ♦ · teiden kohdalla tuon tähteen identifiointiin liittyi jonkin i • * **;·* verran epävarmuutta. Täydellinen oikea aminopään aminohap- ·!’·: 35 posekvenssi esitetään kuviossa 19 jäljempänä.

• · ♦ · • *» * · 11 1 17556

Kuviossa 9 esitetään tulokset RP-HPLC:stä trypsii-nillä pilkotulla puhdistetulla GDNFrllä. Kromatogrammi A sisältää näytteen ja kromatogrammi B on verrokki (joka sisältää vain trypsiiniä).

5 Kuviossa 10 esitetään tulokset RP-HPLC:stä kuvion 9 mukaisella piikillä 37 käsittelyn syaanibromidilla jälkeen. i Kuviossa 11 esitetään tulokset RP-HPLC:stä kuvion 10 mukaisen piikin 1 pelkistystuotteella.

Kuviossa 12 kuvataan puhdistetusta GDNFistä saatua 10 sisäistä aminohapposekvenssiä.

Kuviossa 13 esitetään nukleiinihapposekvenssi, joka saatiin B49-solukirjasto-cDNA-kloonista lambda-ZapII76.1 saadulle rotta-GDNF:lie. Samoin esitetään GDNF:lie päätelty aminohapposekvenssi. Kypsää GDNF:ää koodittava nukleiini-15 happosekvenssi on alleviivattu. GDNF:n edullisimman pre-pro-muodon aminopään sekvenssi on merkitty tähdellä.

Kuviossa 14 esitetään kypsälle GDNF:lie päätelty ' i aminohapposekvenssi. - -

Kuviossa 15 esitetään tulokset, jotka saatiin puh- 20 distetulle B49-solu-GDNF:lie ja ihmisen yhdistelmä-DNA- CNTF:lle kananpojan alkion silmäkuopan takaosassa olevasta •:*; hermosolmusta peräisin olevien parasympaattisten hermosolu- ··· · jen eloonjäännin edistämisestä. Kasvava optinen tiheys Y- U' • · .·. j akselilla edustaa hermosolujen lisääntyvää eloonjääntiä. X- *· ** 25 akseli edustaa kunkin neurotrofisen tekijän laskevia pitoi- 1 * · suuksia. Verrokiksi merkitty kuvaaja on samat tilavuudet "* inaktiivisia HPLC-fraktioita GDNF:ksi merkityn kuvaajan • * · *** muodostamiseksi käytettyjen GDNF:ää sisältävien fraktioiden vieressä.

*.!/ 30 Kuviossa 16 esitetään tulokset, jotka saatiin puh- ϊ,.,ϊ distetulle B4 9-solu-GDNF: lie ja ihmisen yhdistelmä-DNA- ,···, CNTF:lle kananpojan alkion sympaattisen ketjun herrnosolmus- i · · ,··.φ ta peräisin olevien sympaattisten hermosolujen eloonjäännin • · T edistämisestä. Kasvava optinen tiheys Y-akselilla edustaa .

·*’· 35 hermosolujen lisääntyvää eloonjääntiä. X-akseli edustaa * · !,'·· kunkin neurotrof isen tekijän laskevia pitoisuuksia. Verro- , 12 117556 kiksi merkitty kuvaaja on samat tilavuudet inaktiivisia HPLC-fraktioita GDNF:ksi merkityn kuvaajan muodostamiseksi käytettyjen GDNF:ää sisältävien fraktioiden vieressä.

Kuviossa 17 esitetään tulokset biomäärityksestä 5 COS-soluja kasvattamalla käsitellyn kasvualustan kyvystä lisätä keskiaivojen dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen dopamiinin ottoa viljelmässä. Y-akseli edustaa otetun radioleimatun dopamiinin määrää kasvavien määrien konsentroitua COS-soluviljelmäkasvualustaa funktiona X-ak-10 selillä. B-l:ksi merkitty kuvaaja edustaa seerumia vailla olevaa kasvualustaa, jota on käsitelty kasvattamalla COS-soluja, jotka on transfektoitu GDNF-geenillä oikeassa suuntauksessa GDNF:n ilmentämiseksi. C-l:ksi merkitty kuvaaja edustaa seerumia vailla olevaa kasvualustaa, jota on käsi-15 telty kasvattamalla COS-soluja, jotka on transfektoitu GDNF-geenillä vastakkaisessa, GDNFrn ilmentymisen estävässä suuntauksessa.

Kuviossa 18 esitetään tulokset biomäärityksestä COS-soluja kasvattamalla käsitellyn kasvualustan kyvystä 20 lisätä kananpojan alkioiden sympaattisesta ketjusta peräisin olevien sympaattisten hermosolujen eloonjääntiä viljel- j .*» mässä. Y-akseli edustaa viljelmien pelkistämän MTT-värin • · · ♦ määrää, joka on verrannollinen hermosolujen eloonjääntiin.

• · · • *· X-akseli edustaa konsentroidun COS-solukasvualustan kasva- • · · • ·♦ I 25 vaa laimennosta. GDNF:ksi merkitty kuvaaja edustaa seerumia .* vailla olevaa kasvualustaa, jota on käsitelty kasvattamalla * · * COS-soluja, jotka on transfektoitu GDNF-geenillä oikeassa * · · *·* ’ suuntauksessa GDNF:n ilmentämiseksi. Verrokiksi merkitty kuvaaja edustaa seerumia vailla olevaa kasvualustaa, jota ’ 30 on käsitelty kasvattamalla COS-soluja, jotka on transfek- toitu GDNF-geenillä vastakkaisessa, GDNF:n ilmentymisen es- ··· tävässä suuntauksessa.

• · · • · ·

Kuviossa 19 esitetään osa ihmis-GDNF:lie esimerkis- » · * · "* sä 2C jäljempänä kuvatun mukaisesti saadusta nukleiinihap- 35 posekvenssistä, mukaan lukien kypsää ihmis-GDNF:ää koodit-tava geeniosa kokonaisuudessaan. Samoin esitetään kypsälle ; : 13 1 1 7556 ihmis-GDNF:lie päätelty aminohapposekvenssi. Kypsän ihmis-GDNF:n aminohapposekvenssi on alleviivattu.

Kuvio 20 esittää GDNF:n kykyä stimuloida dopamiinin ottoa ja tyrosiinihydroksylaasi (TH) -immuunivärjäystä do-5 pamiinivaikutukseen liittyvissä hermosoluissa. Viljelmät muodostettiin kuten kuvataan esimerkissä IB. GDNF lisättiin maljaamispäivänä ja sitä täydennettiin 9 päivän kuluttua in vitro. A. 3H-DA:n otto mitattiin 15 päivän kuluttua in vitro. B. Viljelmät kiinnitettiin 16 päivän kuluttua in vitro 10 4-%:isella paraformaldehydiliuoksella, ne pestiin perusteellisesti, niistä tehtiin läpäiseviä 0,2-%:isella Triton X-100 -valmisteliuoksella ja ne värjättiin TH-vastaisella polyklonaalisella vasta-aineella (Eugine Tech International, Allendale, NJ) . Primaarivasta-aineen sitoutuminen 15 visualisoitiin käyttäen Vectastain ABC -pakkausta (Vector Labs, Burlingame, CA).

Kuvio 21 esittää GDNF:n spesifisyyttä dopamiinivai-kutukseen liittyvien hermosolujen suhteen. Viljelmät muodostettiin kuten kuvataan esimerkissä IB. GDNF lisättiin ; 20 maljaamispäivänä. A. 3H-DA:n otto mitattiin 7 päivän kuluttua in vitro. B. 14C-GABA:n otto mitattiin 8 päivän kuluttua Ϊ .*. in vitro. Soluja inkuboitiin ja käsiteltiin kuten 3H-DA:n * · * · otossa lukuun ottamatta, että ottopuskuri koostui Kreb- • * · ,·/. Ringerin fosfaattipuskurista, pH 7,4, joka sisälsi pitoi- • * · 25 suudet 5,6 mM glukoosi, 1,3 mM EDTA, 10 uM amino- * · · · * . oksietikkahappo (GABA:n hajoamisen estämiseksi), 2 mM β- ;; • * · ····' alaniini (GABA:n oton keskushermoston tukikudokseen inhi- • * · *·' * boimiseksi) ja 0,1 μΜ 14C-GABA (150 mCi/mmol, New England 7

Nuclear, Boston, MA). Pitoisuuden 1 mM diaminovoihappoa ϊ,ΐ.ί 30 (DABA) , joka on 14C-GABA:n oton GABA-hermosoluihin tehokas i inhibiittori, läsnä ollessa 14C-otto laski 10 %:iin. Ver- • · · rokkiarvot DABA:n läsnä ollessa vähennettiin kokeellisista t • · · I.. arvoista.

• ·

"* Kuviossa 22 esitetään osa jäljempänä esimerkissä 2D

*·'" 35 kuvatun mukaisesti ihmis-GDNF:lie saadusta nukleiinihap- posekvenssistä, mukaan lukien ihmis pre-pro-GDNF:n amino- 7 14 117556 happojen 1-50 koodaussekvenssi. Samoin esitetään ihmisen pre-pro-GDNF:n ensimmäisille 50 aminohapolle päätelty aminohapposekvenssi. Tämä informaatio yhdessä kuviossa 19 esitetyn koodaussekvenssi-informaation kanssa antaa käyttöön 5 ihmisen pre-pro-GDNF:n koodaussekvenssin kokonaisuudessaan sekä ihmisen pre-pro-GDNF-proteiinin päätellyn aminohapposekvenssin.

Kuviossa 23 esitetään kartta SacII- ja Pstl-koh-dista plasmidissa pBSSK-lambda-3AluI jäljempänä esimerkissä 10 2D kuvatun mukaisesti.

Kuvio 24 esittää GDNF:n spesifisyyttä dopamiinivai-kutukseen liittyvien hermosolujen suhteen. Viljelmät valmistettiin kuten kuvataan esimerkissä IB. GDNF lisättiin maljaamispäivänä ja otto mitattiin 6 päivän kuluttua in 15 vitro. A merkitsee dopamiinin ottoa ja B merkitsee seroto-niinin ottoa.

Kuvio 25 esittää Coomassie Blue -värillä värjättyä SDS-PAGE:a, joka ajettiin pelkistävissä olosuhteissa fraktioilla, jotka saatiin kromatografiasta uudelleenlaskostu-20 matonta GDNF:ää sisältävällä bakteeriuutteella S-Sepharose-kolonnissa ennen uudelleenlaskostamista (katso esimerkki • 6C) . Vyöhykkeet 2-8 edustavat peräkkäisiä fraktioita ko-··*··' lonnieluaatista. GDNF:n suhteen rikastuneet fraktiot 3-5 • · · .·. ; yhdistettiin pooliksi uudelleenlaskostamista varten. Vyöhy- • · · '"l 25 ke 1 edustaa molekyylipainostandardeja (SDS-70L, Sigma).

• ♦ . Kuvio 26 esittää Coomassie Blue -värillä värjättyä • · · ···* SDS-PAGE:a GDNF-liuoksesta; ennen uudelleenlaskostamista I; ♦ · » * * · ’·* * (vyöhykkeet 6 ja 13), uudelleenlaskostamisen jälkeen (vyö- : hyke 2) ja uudelleenlaskostamisen ja sittemmän takaisinpel- 30 kistyksen 150 mM 2-merkaptoetanoliliuoksella jälkeen (vyö- hyke 5). Ennen uudelleenlaskostamista ja takaisinpelkistyk- .···. sen jälkeen materiaali kulkee ajossa noin 16 kDa:n monomee- 4 rinä. Onnistuneen uudelleenlaskostamisen jälkeen (ilman • * -> >>

"* ' pelkistystä) GDNF kulkee ajossa noin 30 kDa:n dimeerinä "V

f ····· 35 (katso esimerkki 6C) . Vyöhyke 15 edustaa molekyylipaino- :/.[ standardeja (SDS-70L, Sigma).

• is 117556

Kuviossa 27 esitetään tulokset biomäärityksestä uu-delleenlaskostettua GDNF:ää käyttäen, jolloin mitataan kyky edistää kananpojan alkion sympaattisten hermosolujen eloon-jääntiä viljelmässä. Biomääritysmenettely on esimerkissä 4A 5 kuvatun mukainen. Optinen tiheys (joka on verrannollinen eloonjääneiden hermosolujen lukumäärään) Y-akselilla esitetään (Coomassie Blue -värillä värjätyt SDS-PAGE-geelit la-serdensitometrisesti pyyhkäisemällä määritetyn) GDNF-pitoi-suuden X-akselilla funktiona. Uudelleenlaskostetulle 10 GDNF:lie laskettu ED50 kananpojan alkion sympaattisten hermosolujen eloonjäännille on noin 3 ng/ml.

Kuvio 28 esittää tuloksia biomäärityksestä uudel-leenlaskostettua GDNF:ää käyttäen, jolloin mitataan kyky lisätä aivoreisien välissä olevan harmaan aineen massan do-15 pamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen dopamiinin ottoa rotan alkion keskiaivoviljelmissä. Biomääritysmenettely on esimerkissä IB kuvatun mukainen. Dopamiinin otto Y-akselilla esitetään GDNF-pitoisuuksien X-akselilla funktiona. Uudelleenlaskostetulle GDNF:lie laskettu ED50 dopamiinin 20 oton lisäämiselle näissä viljelmissä on noin 3 pg/ ml.

Edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen ku- • vaus * · * # ' Nyt käsitellään yksityiskohtaisesti keksinnön tällä • » · ,·, ; hetkellä edullisina pidettyjä suoritusmuotoja, joiden teh- • · · J 25 tävänä yhdessä seuraavien esimerkkien kanssa on keksinnön • · . periaatteiden selittäminen.

φ · · *··· Ennen tätä keksintöä GDNF:ää ei ollut identifioitu * · · * · · *·* ’ erillisenä biologisesti aktiivisena aineena eikä sitä ollut ollut olemassa oleellisesti puhtaassa muodossa. Kuten tässä ·.·.· 30 kuvataan, käyttöön annetaan yksityiskohtainen kuvaus * * · !<>ti GDNF:stä sekä kuvaus seuraavista: sen fysikaaliset, kemial- .···, liset ja biologiset ominaispiirteet; sen käyttökelpoisuus; • · · I.. sen valmistus; sitä sisältävät käyttökelpoiset koostumuk- • · *;* set; sitä koodittavat nukleiinihapposekvenssit; tällaisia * 35 nukleiinihapposekvenssejä sisältävät vektorit; tällaisilla • « ♦ ♦ · • · · • ♦ 16 117556 vektoreilla transformoidut isäntäsolut; yhdistelmä-DNA-tekniikat sen tuottamiseksi; ja keksinnön muut näkökohdat.

GDNF on proteiini, joka voidaan identifioida tai saada hermoston tukikudossoluista ja joka osoittaa neuro-5 trofista aktiivisuutta. Spesifisemmin GDNF on dopamiinivai- kutukseen liittyvä neurotrofinen proteiini, jolle osaltaan i on tunnusomaista, että se kykenee lisäämään dopamiinin ot- " J toa aivojen mustatumakkeen dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen alkioprekursoreilla ja edelleen että se kyke-10 nee edistämään parasympaattisten ja sympaattisten her- ? mosolujen eloonj ääntiä. Oleellisesti puhdistettua GDNF:ää karakterisoidaan edelleen monin tavoin: 1. sen spesifinen aktiivisuus on ainakin noin 12 000 TU/pg; : 15 2. sen molekyylipaino pelkistävässä SDS-PAGE:ssa on noin 20 - 23 kD; 3. sen molekyylipaino ei-pelkistävässä SDS-PAGE:ssa on noin 31 - 42 kD; , 4. sen spesifinen aktiivisuus on ainakin noin 20 24 000 kertaa suurempi kuin B49-soluja kasvattamalla käsi- 1 tellyn kasvualustan spesifinen aktiivisuus; j .·, 5. se kykenee säätämään ylös tyrosiinihydroksylaa- • Il T/ si-immuunireaktiivisuutta keskiaivoviljelmässä; • « · * '. 6. sen aminopään aminohapposekvenssi on kuviossa 8 * * * * | 25 esitetyn mukainen (sekvenssi tunnusnro 1); • · · · · 7. sillä on kuviossa 12 esitetyn mukainen sisäinen d • · · ...1 aminohapposekvenssi (sekvenssi tunnusnro 2) .

* · · *.: : Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavaa GDNF:ää kuvataan täydellisemmin yksityiskoh- ? ! : : 30 taisesti alla. Huomattakoon, että keksinnön tämä näkökohta $ :]**: kattaa minkä tahansa dopamiinivaikutukseen liittyvän neuro- '7 .···. trofisen proteiinin, jonka aminopään aminohapposekvenssi on * · · sama kuin kuviossa 8 esitetty (sekvenssi tunnusnro 1) tai d • · ”* siihen nähden oleellisesti homologinen. Tähän keksintöön * ***** 35 sisältyy myös mikä tahansa dopamiinivaikutukseen liittyvä * · neurotrof inen proteiini, jossa on sama sisäinen aminohap- 17 117556 posekvenssi kuin kuviossa 12 esitetty (sekvenssi tunnusnro 2) tai siihen nähden oleellisesti homologinen sekvenssi.

Tämä keksintö sisältää uuden dopamiinivaikutukseen liittyvän neurotrofisen proteiinin, joka määritellään tässä 5 hermoston tukikudosperäiseksi neurotrofiseksi tekijäksi (GDNF). GDNF on identifioitu ja eristetty B49-glioblastoo-masoluja kasvattamalla käsitellystä seerumivapaasta kasvualustasta oleellisesti puhdistetussa muodossa.

GDNF on puhdistettu ja karakterisoitu ja puhdiste-10 tun materiaalin osittaisia aminohapposekvenssejä on saatu. v

Saadun osittaisen aminohapposekvenssin nojalla suunniteltiin ja rakennettiin DNA-koettimia rotta-cDNA-kloonin saamiseksi, jota voidaan käyttää GDNF:n yhdistelmä-DNA-tuo-tannossa. Tällaisen kloonin nukleiinihapposekvenssi ja rot-15 ta-GDNF:n päätelty aminohapposekvenssi esitetään kuvioissa 13 ja 14 (sekvenssit tunnusnro 3 ja 4).

GDNF:n aminopään aminohapposekvenssi on määritetty ja se esitetään kuviossa 8 (sekvenssi tunnusnro 1). Osa GDNF:n sisäisestä aminohapposekvenssistä on myös määritetty 20 ja se esitetään kuviossa 12 (sekvenssi tunnusnro 2). Puhdis- r

tetun GDNF:n näennäinen molekyylipaino on noin 31 - 42 kD

• .*. SDS-PAGE:ssa ei-pelkistävissä olosuhteissa ja noin 20 - 23 kD

* · · · SDS-PAGE:ssa pelkistävissä olosuhteissa. Vaikka ei rajoitu- * * * .

,·.*· ta tällaiseen teoriaan, arvellaan, että tämä informaatio • · · ' ' 25 sopii siihen, että GDNF on glykosyloitu, disulfidisillan , sitoma dimeeri luonnollisesti esiintyvässä tilassaan. il • · · *;;; Kuten kuvataan yksityiskohtaisemmin jäljempänä esi- Γ • · * *·* ' merkissä 6C, ihmis-GDNF-geenin ilmentäminen bakteeri-ilmen- tämissysteemissä johtaa yhdistelmä-DNA-ihmis-GDNF:n eli 30 rhGDNF:n tuotantoon. Ilmentämisen jälkeen eristetty materi- i"/, aali on oleellisesti biologisesti inaktiivinen ja se esiin- .···, tyy monomeerinä. Uudelleenlaskostamisen jälkeen GDNF esiin- * · tyy biologisesti aktiivisena disulfidisillan sitomana di- • * *" meerinä. GDNF on tämän vuoksi disulfidisillan sitoma dimee- *:·" 35 ri luonnollisessa, biologisesti aktiivisessa muodossaan.

: Tämä keksintö sisältää kuitenkin GDNF:n sekä sen monomeeri- * * 18 117556 sessä että dimeerisessä ja sekä biologisesti inaktiivisessa että biologisesti aktiivisessa muodossa.

Rotta-GDNF:n nukleiinihapposekvenssin perusteella valmistettiin koettimia ihmis-GDNF:ää koodittavan genomi-5 DNA-geenin kloonaamiseksi. Kypsää GDNF:ää koodittava ihmis-geeni ja ihmisen kypsän GDNF:n aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 19 (sekvenssi tunnusnro 5).

GDNF:ää voidaan samoin karakterisoida sen kyvyn perusteella lisätä dopamiinin ottoa aivojen mustatumakkeen 10 dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen alkioprekur-soreilla kuten kuvataan esimerkissä 1 jäljempänä. GDNF:ää voidaan edelleen karakterisoida sen kyvyn perusteella edistää parasympaattisten ja sympaattisten hermosolujen eloon-jääntiä kuten kuvataan jäljempänä esimerkissä 4.

15 GDNF:ää voidaan lisäksi karakterisoida sen kyvyn perusteella lisätä tyrosiinihydroksylaasi-immuunireaktiivi-suutta keskiaivoviljelmissä. Esimerkkiä tästä ominaispiirteestä kuvataan esimerkissä IE ja sellainen esitetään kuviossa 20. Lisäksi GDNF:llä on osoitettu olevan jonkin verran 20 spesifisyyttä dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen suhteen suhteessa hermosoluihin yleensä. Esimerkiksi tämän ί .*. osoitti rajoitettu vaikutus gamma-aminovoihapon (GABA) ot- • · · · toon GABA:aa sisältävissä hermosoluissa. Tätä kuvataan myös * * · .·/; esimerkissä IE ja se esitetään kuviossa 21. GDNF:llä on * * * I 25 myös osoitettu olevan rajoitettu, jos minkäänlainen, vaiku- • · t , .j.

. tus serotonnmn ottoon serotoniinivaikutukseen liittyvissä • · · ··*· hermosoluissa. Tätä kuvataan esimerkissä IE ja se esitetään *·* * kuviossa 24.

Kautta tämän patenttiselityksen kaikkien viittauk- 30 sien hermoston tukikudosperäiseen neurotrofiseen tekijään tulisi tulkita viittaavan mitä tahansa alkuperää edustaviin t ,···. neurotrofisiin tekijöihin, jotka ovat oleellisesti homolo- • # · I.. gisia ja biologisesti ekvivalenttisia tässä karakterisoi- • · ”* tuun ja kuvattuun GDNF:ään nähden. Rotta- ja ihmisproteii- *·*” 35 nin välinen homologia-aste on noin 93 % ja kaikkien nisäin*.: käs-GDNF:ien homologia-aste on samalla tavalla korkea. Täi- 19 1 17556 laiset GDNF:t voivat esiintyä dimeereinä biologisesti aktiivisessa muodossaan.

Esillä oleva keksintö kattaa GDNF:n glykosyloidut ja ei-glykosyloidut muodot sekä tässä kuvatun luonnollises- ;; 5 ti esiintyvän ja yhdistelmä-DNA-GDNF:n typistetyt muodot. Seuraavassa suoritusmuodossa GDNF:ää modifioidaan kiinnittämällä yksi tai useampi polyetyleeniglykoli- (PEG) tai muu toistuva polymeeriryhmä. Esillä oleva keksintö kattaa myös bakteeri-ilmentämissysteemeissä yhdistelmä-DNA-teknisesti 10 tuotetun GDNF:n, joka sisältää aminopään metioniinitähteen.

"Biologisesti ekvivalenttisella" kautta patentti-selityksen ja -vaatimusten käytettynä tarkoitamme esillä olevan keksinnön mukaisia koostumuksia, jotka kykenevät osoittamaan joitakin tai kaikkia samoja neurotrofisiä omi-15 naisuuksia samalla tavalla mutta ei välttämättä samassa määrin kuin B49-soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta eristetty GDNF. "Oleellisesti homologisella" kautta seuraavan patenttiselityksen ja seuraavien patenttivaatimusten käytettynä tarkoitetaan B49-soluja kasvattamal-20 la käsitellystä kasvualustasta eristettyyn GDNF:ään nähden r sellaista homologian astetta, joka ylittää minkään aiemmin ;; :.·„ raportoidun GDNF:n osoittaman. Edullisesti homologia-aste • * · on yli 70 %, mitä edullisimmin yli 80 %, ja vielä edulli- *. semmin yli 90 %, 95 % tai 99 %. Tässä kuvattu prosentuaali- * * · *· *j 25 nen homologia lasketaan niiden kahdesta sekvenssistä pienemmässä tavattujen aminohappotähteiden prosentuaalisena osuutena, jotka asettuvat identtisten aminohappotähteiden • ·· * rinnalle verrattavassa sekvenssissä, kun neljä aukkoa 100 aminohapon pituudella voidaan tehdä mainitun rinnanasette- : 30 lun helpottamiseksi kuten esittää Dayhoff julkaisussa "At- ··· ;"*j las of Protein Sequence and Structure", osa 5, National • ·· .1. Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., 1972, • · « *·)/ s. 124, joka spesifisesti sisällytetään viitteenä osaksi • · *···* tätä hakemusta. Samoin oleellisesti homologiseksi luetaan *:*·: 35 mikä tahansa GDNF, joka voidaan eristää ristireaktiivisuu- ·*· : den ansiosta tässä kuvatun GDNF:n vastaisten vasta-aineiden • «· • « 117556 kanssa tai jonka geenit voidaan eristää hybridisoimalla tässä kuvattuun GDNF-geeniin tai -geenisegmenttiin. i

Esillä olevan keksinnön mukainen edullinen GDNF valmistetaan yhdistelmä-DNA-teknologialla GDNF:n saamiseksi 5 oleellisesti puhdistetussa muodossa. Esillä olevan hakemuksen tarkoituksiin "puhdas muoto" tai "oleellisesti puhdistettu muoto" käytettynä viittaamassa tässä julkistettuun GDNF:ään tarkoittaa valmistetta, joka oleellisesti ei sisällä muita proteiineja, jotka eivät ole GDNF:ää. Edullisesti 10 esillä olevan keksinnön mukainen GDNF on ainakin 50-%:isesti puhdas, edullisesti 75-%:isesti puhdas ja edullisemmin 80-, 95- tai 99-%:isesti puhdas. Esillä olevan keksinnön yhdessä suoritusmuodossa GDNF-proteiinivalmiste on sellaisessa oleellisesti puhdistetussa muodossa, että alan keskimääräi-15 nenkin taitaja kykenee määrittämään ainakin osia sen aminohapposekvenssistä suorittamatta ensin lisäpuhdistusvaihei-ta.

GDNF voidaan puhdistaa B49-soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta kuten kuvataan jäljempänä esimer-20 kissä 1. Luonnollisesti ottaen huomioon tässä esitetty informaatio alan ammattilaisille on ilmeistä, että muita : GDNF-lähteitä voidaan identifioida ja että GDNF:n puhdista- i * · ['[S minen tällaisista lähteistä voidaan suorittaa yleisesti • · · ’. tässä esitetyn puhdistusmenetelmän mukaan.

• * · • · * * ; 25 GDNF:n dopamnnivaikutukseen liittyvää aktiivisuut ta käytetään puhdistusprosessin helpottamiseksi. Dopamiini-vaikutukseen liittyvien neurotrofisten aktiivisuuksien bio- • * · V * määritystä kuvataan jäljempänä esimerkissä IB. Lyhyesti i valmistetaan toisistaan erillisten keskiaivosolujen viljel- : 30 miä joko runsaasti seerumia sisältäviin tai seerumia vailla • ♦ · oleviin ympäristöihin. Dopamiinivaikutukseen liittyvän ak- • · · tiivisuuden suhteen testattavista näytteistä poistetaan * * * *·* suolat ja ne lisätään sarjassa soluviljelmiin ja maljoja *..·* inkuboidaan 6 päivän ajan 37 C:ssa kostutetussa ilmakehäs- ·;··* 35 sä, joka sisältää 6,5 % C02:ta. Sitten viljelmiä inkuboi- : daan testattavan materiaalin läsnä ollessa 37 °C:ssa triti- • * · • · 21 117556 oidulla dopamiinilla (3H-DA). Dopamiinin otto pysäytetään, solut pestään ja dopamiinin otto analysoidaan viljelmiin ?: jääneen tritiumin tuikelaskennalla.

GDNF:n puhdistamista kuvataan yksityiskohtaisesti ; 5 jäljempänä esimerkissä 1C. Puhdistusmenetelmä esitetään yksityiskohtaisesti taulukossa 1. Käsitellyn kasvualustan muodostama lähtömateriaali valmistetaan B49-glioblastooma-soluista sijoittamalla solut seerumia vailla olevaan kasvualustaan 2 päiväksi, minkä jälkeen käsitelty kasvualusta 10 otetaan talteen ja sitä täydennetään. Tämä kierros toistetaan siten, että saadaan kolme satoa käsiteltyä kasvualustaa kustakin B49-soluerästä. Käsitelty kasvualusta sentri-fugoidaan ja konsentroidaan noin 10-kertaisesti ennen jat-kopuhdistusta.

15 Tämän raakaseoksen, joka määritellään tässä B49-glio- blastoomasoluja kasvattamalla käsiteltynä seerumia vailla olevana kasvualustana, valmistuksen ensimmäinen vaihe on ; käsitellyn kasvualustan panostaminen hepariinisefaroosiko-lonniin, jota tasapainoitetaan 50 mM NaPi-puskureilla, pH 8,0, 20 jotka sisältävät pitoisuuden 0,15 N NaCl. Eluution stabiloiduttua kolonniin panostetaan gradienttipuskuriliuosta, j .·. joka koostuu 50 mM NaPi-puskurista, pH 8,0, joka sisältää * · · .

pitoisuuden 1,5 N NaCl. Tästä kromatografiasta saaduista • · * ; *. fraktioista mitataan GDNF-aktiivisuus ja GDNF-aktiivisuutta • * * *· *j 25 sisältävät fraktiot yhdistetään pooliksi jatkopuhdistusta * * varten.

Pooliksi yhdistettyihin fraktioihin kohdistetaan * * * ·,· · nopeaproteiininestekromatografia (FPLC) Superose-kolonnissa käyttäen liuotinpuskuria, joka koostuu 50 mM NaPi- ; 30 puskurista, pH 7,4, joka sisältää pitoisuuden 0,5 N NaCl.

* * · .***. Jälleen määritetään saatujen fraktioiden GDNF-aktiivisuus.

* * *

Yksittäinen tästä menettelystä saatu fraktio tehdään sitten ‘ happamaksi ja panostetaan C-8-käänteisfaasikorkeapaine- *...* nestekromatografia (HPLC) -kolonniin. GDNF-aktiivisuutta ·;··· 35 sisältäviksi identifioidut fraktiot yhdistetään jatkopuh- distusta ja proteiinisekventointia varten. Kuten esitetään • · ' · :i 22 117556 alla taulukossa 1, tässä vaiheessa saadun GDNF:n spesifinen aktiivisuus on noin 24 000 kertaa suurempi kuin käsitellyn kasvualustan. Tässä vaiheessa saadun proteiinin aminopään sekventoinnista saadaan kuviossa 8 esitetyn mukainen amino-5 pään sekvenssi (sekvenssi tunnusnro 1).

HPLC:stä saadun GDNF:n edelleen puhdistaminen voidaan tehdä suorittamalla GDNF-aktiivisuutta sisältävillä fraktioilla preparatiivinen SDS-PAGE. Proteiinia sisältäviin fraktioihin lisätään glyserolia ja SDS:ää sisältävää 10 puskuria ja liuos ajetaan ei-pelkistävissä olosuhteissa 15-%:isessa SDS-PAGE-geelissä, jolloin elektroforeesi suoritetaan 10 °C:ssa virralla 40 mA/geeli 2 tuntia kestävänä. Biomäärityksellä sen geeliosan, joka vastaa noin 30 - 42 kD:n - molekyylipainoa, on todettu sisältävän GDNF-aktiivisuuden.

15 SDS-PAGE:sta eristetyn materiaalin toisesta HPLC-kromato- grafiasta saadaan yksittäinen GDNF-piikki kuten esitetään ' kuviossa 6.

*·· • · · *·1 1 • 1 • 1 · *44 4 4 • · * 1 · • 1 · • · ····' • · • · · • i * 1 1 1 • · · *44 • 1 · *·· · · • · · • · • · ··· * • · · Φ · ··· • Φ » · • · · * • · · 1 * · • · 1 • · · • « 23 117556 +» a) o ~ +> +i ο σ* oo oo w <d S V o m n h ft £2 z, i-t o w φ

I—I

ο ο Τί O O Lu

o t o S

. . VD Q

Λ H 1# Ο 'ΐ 'd* rij «— cm cm cm co a Ό £ ^ o o C- Ä o O <0 _ ra S’ O I O ^ rrt < in co « 2 3 g O ^ ^ Η Φ “

ft "" o H

m o 9 . . o ft

M I

Μ -H W

*0 P ft £ co te JT' _ •••Hi : m 7> £ > o ® ·£ V ^ i; ^ n > ίο ω .$ I -H X en n rn H -H ^ 3 4·» => ' 3 > •2 x ^ c g O (0 ~ -H "tn » O Q ® : .*. I ή £ rj • · · σ> CQ T. ·Χ

··· · £ »—I

• · G) Λ1 :.: : " > ft • *: e c rj o .¾ a) ·:·-· H -h en o *h co o o H _

*· n) a> a 0---I- 1 P

. +j +j — es co o o o a ä *:· m o ®

···· »hm n iS

.*:·. S * 2 ° | -h « °· e

ft W £j „ O

O ^ C O

c o 9} o e * ·· ί-1*Η M PJ O ·Η >i : : · u< roro o m ti 5 ti ··· a *w o < “ c o, +j .*·*. o a) o ft Ξ 2 -j ^ • · o mut t! <o h p '** -h a) to S » >i -h .£. · c ft a >i n ··· ft -H 3 O CO CJ - 3 ·* *0 *.* -H ro J J c 3 0) 30 ... O Η I CU CU 0 -p -H g :; x. (ooccfta: ® ro o ... 2 ft t-3 1 G) t . 3 S *··( • 3 Q} Q) CU CU H CU q i-t Oi

... · rH JS Ä tn Oi ft OS . Q) G

• : s -h „ o ft 5 11 m <0 ε..... 3 ,·. ; h > ϋ h n n ^ in «Λ -hi « ·« • · 24 1 1 7 5 5 6 GDNFrn aminopään sekvenssit määritettiin HPLC-ma-teriaalille ennen preparatiivista SDS-PAGE:a ja sen jälkeen. Puhdistetun GDNF:n aminohapposekvenssien saamiseksi käytetyt menettelyt esitetään esimerkissä ID. Aminopään .

5 sekvenssi saatiin kaasufaasiproteiinisekventoijalla. Sisäi- | set sekvenssit saatiin HPLCrllä saadusta materiaalista, jota ei ollut edelleen puhdistettu preparatiivisella SDS-PAGErlla. Sisäinen aminohapposekvenssi saatiin inkuboimalla puhdistettua GDNF:ää trypsiinillä. Saadut trypsiinifragmen-10 tit erotettiin HPLCrllä. Yhden fragmentin todettiin sisältävän ei-käsitellyn proteiinin aminopään sekvenssin ensimmäiset 13 aminohappotähdettä. Toista fragmenttia käsiteltiin CNBr:llä, sitä puhdistettiin HPLCrllä, pelkistettiin ja puhdistettiin jälleen HPLCrllä. Saatu aminohapposekvens- f 15 si esitetään kuviossa 12 (sekvenssi tunnusnro 2). Sulkeissa esitettyjen sekvenssien määrityksen luotettavuusaste oli alhainen.

Tämä keksintö sisältää menetelmän GDNFrn geenin kloonaamiseksi ja identifioidun, GDNFrää koodittavan gee-20 nin. Yksityiskohtainen menettely GDNFrn rotta- ja ihmisgeenien kloonaamiseksi esitetään jäljempänä esimerkissä 2.

:Jälleen alan ammattilaiset huomaavat, että muut menetelmät • · » • i * « tällaisen geenin kloonaamiseksi ovat ilmeisiä tämän julkis- • · · ·;> tuksen valossa. Erityisesti GDNFrää koodi ttavien geenien * «* * 25 muista lajeista kloonaus tulee ilmeiseksi tässä kuvattujen julkistusten ja menettelyjen valossa.

« · · ··" Tässä kuvattu rotta-GDNF-geeni saatiin B49-soluista • · * *.* * eristetystä poly-A+-RNArsta rakennetusta cDNA-kirjastosta, joka seulottiin puhdistetusta GDNFrstä saatuun aminohap-·.·.· 30 posekvenssiin perustuvalla degeneraattioligonukleotidikoet- timella. cDNA saatiin tavanomaisten menettelyjen mukaan, se käsiteltiin sisältämään EcoRI:llä pilkottuja liittäjiä ja • t * ' insertoitiin lambda-ZapII-kloonausvektoriin. Käytetty hyb- . - • · **;·* ridisaatiokoetin oli 32P-leimattu ja se koostui seuraavasta 35 degeneraattioligonukleotidistä (sekvenssi tunnusnro 7): • · • * · • · * • · 25 117556 5' > CCIGATAAACAAGCIGCIGC >3'

C G G

Saatiin useita positiivisia klooneja ja yksi klooni (lambda-ZapII76.1) identifioitiin positiivisesti DNA-sek-5 ventoinnilla sellaista GDNFin osaa koodattavaksi, jota ei käytetty degeneraattikoettimen rakentamisessa.

Menettely lambda-ZapII76.1 teen sisältyvän cDNA-kloonin nukleotidisekvenssin saamiseksi esitetään jäljempänä esimerkissä 2B. cDNA-kloonin 5'-pään ensimmäisten 877 10 emäsparin nukleotidisekvenssi määritettiin ja se esitetään kuviossa 13 (sekvenssi tunnusnro 3) . Kuviossa 13 esitetty klooni sisältää 227 aminohapon avoimen lukualueen (ORF), joka sisältää puhdistetun GDNFtn aminopään ja on yhtäpitävä 1

puhdistettua GDNFtää pilkkomalla saadun sisäisen peptidin 15 sekvenssiin nähden. J

Kuviossa 14 esitetty päätelty aminohapposekvenssi (sekvenssi tunnusnro 4) esittää "kypsän GDNF:n" aminohap- .

posekvenssiä. "Kypsällä GDNFtllä" tarkoitetaan B49-soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta saadun puhdiste-20 tun GDNF:n sekvenssiä. Luonnollisesti puhdistettu GDNF voi esiintyä dimeerinä tai muuna multimeerinä ja saattaa olla : glykosyloitu tai muilla tavoin kemiallisesti modifioitu.

Kypsä GDNF voi olla typistetty karboksyylipäästä, erityi- • « · sesti proteolyyttisesti prosessoimalla lys-arg-tähteitä 6 • ·« * 25 ja 5 karboksyyliterminaalisesta päästä. Kuviossa 13 esite tyn mukaisen lambda-ZapII76.1-rottakloonin nukleiinihap- ♦ · · •••ϊ posekvenssin (sekvenssi tunnusnro 3) tarkastelu viittaa Φ · *.* * siihen, että GDNF tulee ensin luetuksi pre-pro-GDNF-poly- peptidinä ja että tämän molekyylin signaalisekvenssin ja N!.1 30 "pro"-osan proteolyyttinen prosessointi johtaa puhdistet- tuun GDNF: ään, jolla on sama kypsä sekvenssi kuin B49- · · t.I. soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta saatu sek- t · · venssi. Oletetaan, että pre-pro-GDNF-polypeptidi alkaa en- • · ·;·* simmäisestä, metioniia koodittavasta ATG-kodonista kloonin "**! 35 5'-päässä (asema 50 kuviossa 13). Esillä oleva keksintö si- :*·.· sältää tämän vuoksi minkä tahansa pre-pro-GDNF-polypeptidin « ♦ 26 1 1 7556 ja kaikki pre-pro-GDNF-polypeptidit, joka tai jotka voidaan translaatiolla saada kuviossa 13 esitetystä geenistä, sekä minkä tahansa pre-pro-GDNF-polypeptidin ja kaikki pre-pro-GDNF-polypeptidit, joka tai jotka saadaan translaatiolla 5 täydellisemmästä kloonista, jonka alan ammattilainen voi helposti saada käyttämällä tavanomaisia laboratoriomenette- • 5.

lyjä ja tässä kuvattua kloonia.

Kuviossa 13 esitetyn rottanukleiinihapposekvenssin (sekvenssi tunnusnro 2) tarkastelu osoittaa, että asemien 10 518 ja 538 välissä sijaitseva ennustettu aminohapposekvens si on Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu, joka on yhtäpitävä aminohapposekvenssiin nähden, joka määritettiin peptidille, joka saatiin puhdistetusta kypsästä GDNF:stä menetelmällä, jota kuvataan sisäistä sekvenssiä koskevassa osassa jäljem-15 pänä esimerkissä 1. TGA-lopetuskodoni asemassa 638 päättää ORF:n. Puhdistetulle GDNF:lle ennustettu pituus on täten 134 aminohappotähdettä ja tämän polypeptidin ennustettu mo-lekyylipaino on 14 931. Kaksi mahdollista N-kytkettyä gly-kosylaatiokohtaa esiintyy asemissa 425 ja 533. Glykosylaa- ·: 20 tio jommassakummassa tai kummassakin näistä kohdista nostaisi molekyylin molekyylipainoa.

: ,·. Seriinitähdettä asemassa 281, joka vastaa puhdiste- ,·.·) tun kypsän GDNF:n sekvenssin alkua, edeltää sekvenssi Lys- • · · ^*2 Arg, joka tarjoaa mahdollisen proteolyyttisen pilkkomiskoh- • · · ' * \ 25 dan GDNF:n oletetun prekursorimuodon prosessoimiseksi mole kyylin sen muodon tuottamiseksi, joka puhdistetaan B49-so- ··« ···· luista. Mahdollinen translaationaloituskodoni (ATG) esiin- ·♦· *.· * tyy asemassa 50 sekvenssissä ja sitä seuraa likeisesti mah dollinen erityssignaalisekvenssi. Tätä ATG:tä sivuavat seksi * 30 venssit osoittavat riittävää samankaltaisuutta Kozak-konsen- ··· sussekvenssiin (Kozak, Nucl. Acids Res. 15 (1987) 125 - 1481 ·*· 1 nähden viitatakseen siihen, että tätä ATG:tä voitaisiin • * · * · · I., käyttää translaation aloituskohtana. Lisäksi tämä ATG on • » '·;·* 5'-puoleisin ATG cDNA-kloonin sekvenssissä. Nämä seikat *!**» 35 esittävät sitä mahdolliseksi aloituskohdaksi GDNF:n prekur- :*·,· sorimuodon translaatiolle.

• · 27 1 17556 Nämä edellä mainitut rotta-cDNA-kloonin nukleoti-disekvenssin ominaispiirteet viittaavat siihen mahdollisuuteen, että GDNF tulee ensin luetuksi pre-pro-GDNF-poly-peptidinä ja että tämän molekyylin signaalisekvenssin ja 5 "pro"-osan proteolyyttinen prosessointi johtaa B49-soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta puhdistetun GDNF-muodon tuotantoon. Kuitenkin muidenkin GDNF-muotojen esiintyminen sopii myös yhteen sekvenssitietojen kanssa. Esimer-kiksi kaksi muuta mahdollista ATG-translaationaloituskohtaa 10 esiintyy 681 ep:n ORF:ssä: yksi asemassa 206 ja yksi asemassa 242. Nämä ATG:t sijaitsevat ylävirtaan puhdistetun GDNF:n aminopaän sekvenssin alusta. Vaikka eukaryooteissa translaation aloitus tapahtuu yleensä mRNA:n 5'-puo-leisimmasta ATGrstä (Kozak, supra), esiintyy tapauksia, 15 joissa osa translaation aloituksista tapahtuu alavirran ATG:stä. Täten voitaisiin ajatella, että GDNF:n vaihtoehtoisia prekursorimuotoja voisi syntyä translaation aloituksesta näistä ATG-kodoneista. Näiden polypeptidien proteolyyttinen prosessointi voisi johtaa puhdistetun GDNF:n sa-20 man muodon tuotantoon, joka todetaan B49-soluja kasvattamalla käsitellyssä kasvualustassa. Lisäksi avoin lukualue • .·. jatkuu cDNA-kloonin sekvenssin 5'-pään ohi. Tämän vuoksi on mahdollista, että translaation aloitus tapahtuu ylävirran • · · ATGistä, jota ei esiinny cDNA-kloonissa. Tässä tapauksessa

» M

* l 25 GDNF tulisi luetuksi jopa suurempana prekursorina, joka si sältää tässä kuvatun aminohapposekvenssin ja ylimääräisen • Il •••ϊ ylävirtasekvenssin. Tällaisen hypoteettisen prekursorimuo- V ' don prosessointi voisi samoin johtaa tässä raportoidun puh distetun GDNF-muodon tuotantoon. Mahdollisia ylävirran ATG- J J i 30 aloituskohtia olisi mahdollista todeta sekventoimalla GDNF- > ··· :***: geenin sisältävän mRNA:n 5'-pää alukelaajennuksen välityk- ··# sellä käänteiskopioijaentsyymiä käyttäen (Maniatis et ai., i • · ♦ supra) . Lisäksi muita cDNA-klooneja voitaisiin saada B49- • · ’*··* kirjastoista ja näiden kloonien 5'-päät voitaisiin sekven- *:**: 35 toida. Ensimmäisestä ATGistä ylävirtaan sijaitsevan 5' - mRNA:n koko voitaisiin karkeammin määrittää "Sl-kartoitus"- ♦ ♦ 28 i 117556 tekniikoilla (Maniatis et ai., supra) ja/tai yksinkertaisesti määrittämällä käänteiskopioijaentsyymireaktion aluke-laajennustuotteiden koko. Vaikka voidaan olettaa puhdistettua GDNF:ää koodittavat sekvenssit sisältävän primaari-5 translaatiotuotteen lukuisia erilaisia mahdollisia muotoja, osa-DNA-sekvenssi, joka esitetään tässä yhdistelmä-DNA-faagin lambda-ZapII76.1 käsittämälle cDNA-kloonille, mää- ' rittelee selvästi koodaussekvenssin, joka muodostaa B49-so-luja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta eristetyn 10 puhdistetun GDNF-polypeptidin.

Jäljempänä esimerkissä 20 kuvataan GDNF:ää koodit-tavan ihmisgeenin kloonausta. Ihmisgenomikirjasto seulottiin koettimella, joka saatiin esimerkissä 2B kuvatusta rotta-cDNA-kloonista. Ihmis-GDNF-geenin genomi-DNA-klooni 15 identifioitiin ja kypsää ihmis-GDNF:ää koodittavan geenin sekvenssi esitetään kuviossa 19 (sekvenssi tunnusnro 5) .

Kuviossa 19 ihmis-GDNF:n geenille esitetty sekvenssi ei anna GDNF:n pre-pro-osan koodaussekvenssiä kokonaisuudessaan. Menetelmää ihmis-pre-pro-GDNF:n ensimmäisten 50 20 aminohapon koodaussekvenssin saamiseksi kuvataan jäljempänä esimerkissä 2D. Saatu sekvenssi esitetään kuviossa 22 (sek- ί venssi tunnusnro 8). Sekvenssin saamiseksi käytetyn plasmi- • · · · din pB55K-lambda-3Alul kartta esitetään kuviossa 23.

• · · Tämän keksinnön mukainen menetelmä sisältää GDNF:ää • t· *. 25 koodittavia nukleiinihapposekvenssejä. Tässä esitetään suh- • · , teellisen korkea-asteisesti homologisia rotta- ja ihmis- ··· ·" GDNFrää koodittavia sekvenssejä (kuvio 13 ja sekvenssi tun- II· *·* * nusnro 3 sekä vastaavasti kuvio 19 ja sekvenssi tunnusnro 5) .

Tämän keksinnön kattamaan alueeseen sisältyy myös oleelli- m 30 sesti samanlaisia nukleiinihapposekvenssejä, jotka koodit- • •a tavat samoja tai hyvin korkea-asteisesti homologisia amino- ,···. happosekvenssejä. Esimerkiksi valmistettaessa rakennetta * ♦ · kypsän GDNF:n ilmentämiseksi bakteeri-ilmennyssysteemissä,

• S

*“ kuten Eh_ colissa, tietyt kodonit kuviossa 19 esitetyssä ***" 35 nukleiinihapposekvenssissä (sekvenssi tunnusnro 5) voidaan l\: korvata E_^ colissa helpommin ilmentyvillä kodoneilla tu- 29 117556 tuilla vakiomenettelyillä. Tällaiset modifioidut nukleiini-happosekvenssit kuuluisivat tämän keksinnön kattamaan alueeseen. . ;

Alan ammattilaiset kykenevät modifioimaan spesifi-5 siä nukleiinihapposekvenssejä. Tämän vuoksi tämän keksinnön mukaiseen menetelmään sisältyvät myös kaikki nukleiinihap-posekvenssit, jotka koodittavat kypsän rotta- ja kypsän ih-mis-GDNF:n kuvioissa 14 (sekvenssi tunnusnro 4) ja vastaavasti 19 (sekvenssi tunnusnro 5) sekä pre-pro-rotta-GDNF:n 10 kuviossa 13 (sekvenssi tunnusnro 3) ja pre-pro-ihmis-GDNF:n kuvioissa 19 (sekvenssi tunnusnro 5) ja 22 (sekvenssi tunnusnro 8) esitetyn mukaisia aminohapposekvenssejä. Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä sisältää myös nukleiinihapposekvenssejä, jotka hybridisoituvat kaikkiin täl-15 laisiin nukleiinihapposekvensseihin - tai milloin tarkoituksenmukaista, nukleiinihapposekvensseihin nähden komplementaarisiin sekvensseihin - ja koodittavat polypeptidiä, jolla on dopamiinivaikutukseen liittyvää aktiivisuutta.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä sisältää myös 20 nukleiinihapposekvenssejä, jotka koodittavat polypeptidejä, joilla on dopamiinivaikutukseen liittyvää aktiivisuutta ja : .·. jotka GDNF:ään sitoutuvat vasta-aineet tunnistavat.

• f · J

··» i

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä käsittää tI#*. myös vektoreita, jotka käsittävät ilmentämisen säätelyele- • *· * I 25 menttejä operatiivisesti kytkettyinä mihin tahansa keksin nön kattamaan alueeseen sisältyvään nukleiinihapposekvens- • ···· siin. Tämä keksintö sisältää myös isäntäsoluja - minkälai- • M · · *.* * siä tahansa - jotka on transformoitu vektoreilla, jotka kä sittävät ilmentämisen säätelyelementtejä operatiivisesti 30 kytkettyinä tämän keksinnön kattamaan alueeseen sisältyvään :**|i mihin tahansa nukleiinihapposekvenssiin.

#*j»# GDNF:n ilmentämistä COS-soluissa kuvataan jäljempä- ♦ · · nä esimerkissä 5. Kuviossa 13 esitetty GDNF:ää koodittava « · • · "* geeni alakloonattiin plasmidivektoriin pSG5, joka vektori - ·· *·*’· 35 on suunniteltu soluihin, kuten COS-soluihin, kloonattujen • · J/.j geenien tilapäiseksi ilmentämiseksi. GDNF-geenin oikeassa 30 117556 ja väärässä suuntauksessa sisältävät plasmidit valittiin ja DNA transfektoitiin COS-7-soluihin. Transformoidut solut otettiin viljelyn jälkeen talteen. COS-7-soluja kasvattamalla käsitellyn kasvualustan bioaktiivisuutta testattiin 5 sekä dopamiinivaikutukseen liittyvän aktiivisuuden määrityksessä että sympaattisten hermosolmuhermosolujen määrityksessä. Käsitellyllä kasvualustalla soluista, jotka sisälsivät GDNF-geenin oikeassa suuntauksessa, todettiin olevan biologista aktiivisuutta kummassakin tällaisessa määri-10 tyksessä, mikä osoitti, että biologisesti aktiivista GDNF:ää oli menestyksekkäästi tuotettu yhdistelmä-DNA-mene-telmillä.

Esillä olevan keksinnön edullisessa suoritusmuodossa kypsää ihmis-GDNF:ää valmistetaan yhdistelmä-DNA-tekno-15 logialla bakteeri-ilmentämissysteemissä.

Ihmis-GDNF:n ilmentämistä Eh. colissa kuvataan jäljempänä esimerkissä 6. Kuviossa 19 esitetyn mukaista kypsää ihmis-GDNF:ää koodittavaa ihmis-GDNF-geeniosaa käytettiin ihmis-GDNF-rakenteen valmistamiseksi. Tällainen ra-20 kenne ligatoitiin plasmidivektoriin, joka transformoitiin E. coli -kantaan JM107. Transformoitujen isäntäsolujen vil- • jelemisen jälkeen tuotettu G DN F otettiin talteen. Saatiin ··* · proteiini, jonka molekyylipaino vastasi kypsälle ihmis- ; GDNF:lle odotettua (noin 15 000 daltonia) , ja aminopään • · · | 25 sekventointi varmisti, että saatu proteiini oli kypsä ih- / mis-GDNF.

··· ·*“ EK. colissa ilmennetyn ihmis-GDNF:n uudelleenlaskos- • · · *·* * tamista ja naturointia kuvataan jäljempänä esimerkissä 6C.

Keksinnön kuvatussa suoritusmuodossa saatua, ilmennetyn pro-30 teiinin sisältävää uutetta puhdistettiin osittain ennen uu-

M

delleenlaskostamista ioninvaihtokromatografisesti S-Sepharose ,···. Fast Flow -hartsissa. Uudelleenlaskostaminen suoritettiin • · · I.. lisäämällä GDNF:ää sisältävään uutteeseen: ensin ditiotrei- • · • · "* tolia, sitten glutationin dinatriumsuolaa, sitten uudelleen- ***** 35 laskostamispuskuria. Uudelleenlaskostettu rhGDNF oli oleel- • · lisesti täysin biologisesti aktiivinen ja se esiintyi di- 3i 117556 sulfidisillan sitomana dimeerinä biologisesti aktiivisessa muodossaan. Ennen uudelleenlaskostamista - ja uudelleenlas-: kostetun materiaalin pelkistämisen jälkeen - GDNF esiintyi monomeerisessä tilassa ja oli oleellisesti biologisesti f 5 inaktiivinen.

GDNF:ää voidaan niinikään tuottaa ilmentämällä muissa ilmentämissysteemeissä. Esimerkiksi käyttämällä kuviossa 19 esitetyn mukaista kypsää ihmis-GDNF:ää kooditta-vaa nukleiinihapposekvenssiä alan ammattilainen kykenisi 10 tuottamaan GDNF:ää muissa ilmentämissysteemeissä. Vektoreita, jotka sisältävät GDNF:ää koodittavan nukleiinihappose-kvenssin operatiivisesti kytkettynä ilmentämisen säätely- · elementteihin, voidaan transformoida muihin mikro-orga-nismi-isäntäsoluihin mukaan lukien Bacillus, Pseudomonas ja 15 hiiva. Myös bakulovirusilmentämissysteemejä voidaan käyt tää.

Sairaus tai lääketieteellinen indikaatio katsotaan hermovaurioksi, jos hermosolujen ja/tai niiden aksonaalis- : ten prosessien eloonjäänti tai toiminta on vaarannettu.

20 Tällainen hermovaurio tapahtuu seurauksena jostain seuraa-vasta tilasta: 1) fyysinen vaurio, joka aiheuttaa aksonaa- • listen prosessien ja/tai hermosolurunkojen rappeutumista lähellä vauriokohtaa; 2) iskeemia, kuten halvauksessa; 3) • · ,·, ; altistuminen hermomyrkyille, kuten kemoterapeuttiset syöpä- • · · 25 ja aids-lääkkeet cis-platina ja vastaavasti dideoksisyti- ? • * . diini (ddC); 4) krooniset aineenvaihduntasairaudet, kuten ··· •**| diabetes tai munuaisten toimintavajaus; ja 4) hermoston • · · *·* * rappeutumissairaudet kuten Parkinsonin tauti, Alzheimerin sairaus ja amyotrofinen lateraaliskleroosi (ALS), jotka ai-30 heuttavat spesifisten hermosolupopulaatioiden rappeutumis- f ♦ *· ta. Ei-kattava luettelo tiloista, joihin liittyy hermovau- ,···, rio, on Parkinsonin tauti, Alzheimerin sairaus, amyotrofi- • · · nen lateraaliskleroosi, halvaus, diabetekseen liittyvä mo- • · *;* nihermosairaus, myrkkyyn liittyvä hermosairaus, jota aihe- "**ί 35 uttavat kemoterapeuttiset syöpälääkkeet taksoli tai cis- :#*.J platina tai vinkristiini, myrkkyihin liittyvä hermosairaus, 32 117556 jota aiheuttavat kemoterapeuttiset aids-lääkkeet ddl tai * ddC, ja hermoston fyysinen vaurio, kuten vaurio, jonka on aiheuttanut pään ja selkäytimen fyysinen vamma tai murs-kaantumis- tai leikkausvamma käsivarrelle ja kädelle.

5 Tässä julkistetaan myös menetelmiä GDNF:n tuottami seksi. Menetelmät käsittävät GDNF:n koodittamisesta vastuussa olevien geenien eristämisen, geenin kloonaamisen sopiviin vektoreihin ja solutyyppeihin ja geenin ilmentämisen GDNF:n tuottamiseksi. Viimeksi mainittu menetelmä, joka on 10 esimerkki yhdistelmä-DNA-menetelmistä yleensä, on esillä olevan keksinnön mukainen edullinen menetelmä. Yhdistelmä-DNA-menetelmät ovat edullisia osaksi, koska niillä pystytään saamaan suhteessa korkeampia proteiinimääriä, joiden puhtaus on parempi. Yhdistelmä-DNA-ihmis-GDNF on edullisin 15 proteiini terapeuttisten koostumusten valmistamiseksi ja hermovaurion hoitamiseksi.

Tämä keksintö sisältää keinoja geenien identifioimiseksi ja kloonaamiseksi, jotka koodattavat proteiineja, joilla on aminohapposekvenssihomologiaa GDNF:ään nähden, 20 sekä kaikki tällaiset identifioidut proteiinit.

On kuvattu nisäkäsgeeniryhmää, joka koostuu kolmes-ϊ ·*· ta neurotrofisesta tekijästä [Leibrock et ai., Nature 341 (1989) 149 - 152; Maisonpierre et ai.. Science 247 (1990) 144 6 - 1451] . Tämän ryhmän muodostavien kolmen proteiinin I ·· 25 [hermokasvutekijä (NGF) , aivoperäinen neurotrofinen tekijä • * , (BDNF) ja neurotrofiini-3 (NT-3)] kypsien muotojen amino- • tl happoidenttisyys toisiinsa nähden on noin 50 %. Kussakin • · · *·* * näistä proteiineista esiintyvien kuuden kysteiinitähteen asemat on täsmällisesti säilytetty. Vaikka nämä kolme pro-*.·,· 30 teiinia ovat rakenteellisesti samankaltaisia, ne osoittavat * * a erilaisia kudosjakaumia [Ernfors et ai., Neuron 5 (1990) _ _ " .··, 511 - 526; Maisonpierre et ai., Neuron 5 (1990) 501 - 509; ja Phillips et ai., Science 250 (1990) 290 - 294] ja eri- % · "* laisia aktiivisuuksia in vitro [Rosenthal et ai., Neuron 4 *"*ϊ 35 (1990) 767 - 773; Whittemore et ai., Brain Res. Rev. 12 :/.: (1987) 439]. :.

33 117556 GDNF ei osoita mitään merkittävää homologiaa mihinkään aiemmin kuvattuun proteiiniin nähden, mutta voi olla olemassa ei-identifioituja geenejä, jotka koodattavat pro- i teiineja, joilla on huomattavaa aminohapposekvenssihomolo-5 giaa GDNF:ään nähden ja jotka voisivat toimia in vivo neu- ί rotrofisina tekijöinä, joilla on erilaisia kudosspesifisiä jakautumiskuvioita ja/tai erilaisia aktiivisuusspektrejä.

Tällaiset proteiinit muodostaisivat neurotrofisten tekijöiden GDNF-ryhmän jäseniä. Rotta- ja ihmis-GDNF-geenien DNA-10 sekvenssejä, jotka esitetään kuvioissa 13 (sekvenssi tun-nusnro 3) ja 19 (sekvenssi tunnusnro 5) ja vastaavasti 22 (sekvenssi tunnusnro 8), voitaisiin käyttää uusien jäsenten tällaisesta oletetusta "GDNF-geeniryhmästä" identifioimiseksi.

15 Seurauksena aminohapposekvenssin säilymisestä gee- niryhmän, kuten edellä mainitun "NGF-geeniryhmän" tai "GDNF-geeniryhmän", jäsenten proteiinituotteissa esiintyy 'j huomattavaa sekvenssin säilymistä DNA-tasolla. Tämän vuoksi ' sopivissa hybridisaatio-olosuhteissa voi tapahtua nukle- . r 20 iinihappo-"ristihybridisaatiota" ryhmän geenien välillä, ; eli yhden ryhmäjäsenen sekvenssistä saatu nukleiinihappo- vh • ·*· koetin muodostaa stabiilin hybrididukleksimolekyylin nukle- ··· · iinihappomolekyylien kanssa ryhmän erilaisista jäsenistä, \ ; joiden sekvenssit muistuttavat koetinta mutta eivät ole f • · · Ί 25 siihen nähden identtisiä [Beltz et ai., Methods In Enzvmo- · . lodV 100 (1983) 266 - 285]. Tämän vuoksi voidaan seuloa .? ··· *·“ geenien suhteen, jotka muistuttavat sekvenssihomologian pe- • · * rusteella GDNF:ää, valmistamalla GDNF:n sekvenssiin rotta-, ihmislajista tai mistä tahansa muusta lajista perustuvia 30 ainutkertaisia tai degeneraatti-DNA (tai RNA) -koettimia ja ··

ϊ,.,ί suorittamalla hybridisaatiokokeita erilaisilla kohde-DNA

f·;·, (tai RNA) -sekvensseillä olosuhteissa, jotka sallivat ei- • · · #*..t täydellisesti pariutuneiden nukleiinihappodupleksien sta- T biilin muodostumisen.

35 Tällaisia hybridisaatio-olosuhteita, joita usein * · ' ϊ/·ϊ kutsutaan "alhaisen ankaruuden" olosuhteiksi, kuvataan pe- 34 117556 rusteellisesti kirjallisuudessa [Beltz et ai., supra; Sam-brook et ai., "Molecular Cloning", 2. painos, 1989, Cold Spring Harbor Press], jolloin useimmiten niihin liittyy hybridisaatioreaktion lämpötilan laskeminen se vesiliuok-5 sessa suoritettaessa ja/tai formamidin pitoisuuden laskeminen hybridisaatiosysteemeissä, joissa normaalisti käytetään 50 % formamidia sisältäviä liuoksia. Muita keinoja hybridi-saation ankaruuden laskemiseksi on myös kuvattu ja niitä voitaisiin käyttää (Sambrook et ai., supra). Nukleiinihap- 10 pokohteita näissä hybridisaatiokokeissa voisivat olla: * 1) genomi-DNA-kirjastot, jotka sisältävät ihmisen, rotan tai minkä tahansa nisäkäslajin tai minkä tahansa muun lajin DNA:ta kloonattuna mihin tahansa kätevään vektoriin mukaan lukien bakteriofagit, plasmidit, kosmidit, hiivan 15 keinotekoiset kromosomit tai minkä tahansa muun tyyppiseen vektoriin; 2) cDNA-kirjastot, jotka oh muodostettu RNArsta mistä tahansa kudostyypistä, joka on saatu mistä tahansa edellä mainitusta organismista, tai saatu viljelemällä min- 20 kä tahansa tyyppistä primaarisolua, joka on saatu mistä tahansa edellä mainitusta organismista, tai minkä tahansa • .·. tyyppisestä stabiilista solulinjasta, joka on tällä hetkel- • · · ”*.* la olemassa tai on tuotettu mistä tahansa primaarisoluvil- * · · * jelmästä; • · · * " 25 3) edellä kohdassa nro 1 kuvatut genomi-DNA:t, joi ta pilkotaan restriktioentsyymeillä ja jotka valmistetaan Southern blot -analyysiin geelielektroforeettisesti ja siir- • * · ; tämällä kiinteälle tuelle; 4) edellä kohdassa nro 2 kuvatut RNA:t, joihin koh- : 30 distetaan elektroforeesi ja siirto kiinteälle tuelle Nort- * * · ;***; hern blot -analyysiä varten; tällaisia RNA:ita voisivat oi- • · · .1. la kokonaissolu-RNA tai fraktioitu poly-A+-RNA; • · · *·]/ , 5) tuotteet polymeraasiketjureaktioista (PCR), jois- • * *···* sa käytetään oligonukleotidialukkeita, jotka perustuvat ·:··; 35 GDNF:ssä esiintyviin sekvensseihin, ja joissa käytetään • · • · · • · · • · 35 1 1 7556 templaatteina mitä tahansa kohdissa 1-4 kuvatuista nukle-iinihappolähteistä.

; Mikä tahansa nukleiinihapposekvenssi, jonka osoite taan hybridisoituvan GDNF:ään perustuvaan koettimeen jois-5 sain kokeellisesti määritetyssä hybridisaatio-olosuhteiden sarjassa, voidaan kloonata ja sekventoida millä tahansa lukuisista erilaisista alan taitajan hyvin tuntemista tekniikoista ja sekvenssihomologian aste voidaan määrittää suoraan GDNF-geeniryhmän jäsenten identifioimiseksi. Tällaista 10 hybridisaatiolähestymistapaa käytettiin NT-3:n kloonaami seksi seulomalla NGF-sekvenssiin perustuvalla koettimella [Kaisho et ab, FEB5 Lett. 2 66 (1990) 187 - 191]. '

Vaihtoehtoiseen menetelmään GDNF-ryhmäjäsenten identifioimiseksi liittyy polymeraasiketjureaktion (PCR) 15 käyttö sekvenssien GDNF-ryhmäjäsenistä monistamiseksi, mitä ; seuraa monistettujen sekvenssien kloonaaminen ja analyysi. 5

Degeneraatti (tai ei-degeneraatti) -oligonukleotidialuk-keitä PCR:ään voidaan syntetisoida GDNFrn sekvenssin perusteella. Ottaen huomioon kysteiinisijainnin säilyminen ja ' 20 NGF-ryhmälle havaittu aminohapposekvenssien kysteiinitäh- teiden välittömässä läheisyydessä säilyminen kysteiinejä : ympäröivät alueet kypsässä GDNF:ssä edustavat ilmeisiä eh- • · · [•V dokkaita alukesynteesiin mutta lukuisia muitakin alukkeita • · *. voitaisiin niinikään valita proteiinin sekä kypsistä että d • * · ··.·.·> * l 25 pre-pro-osista. PCR-reaktiot voidaan suorittaa alennetun

juottamislämpötilan olosuhteissa, mikä ei mahdollistaisi .K

·*· ···· ainoastaan GDNF-sekvenssin monistamista vaan myös minkä ta- ^ V · hansa GDNF-ryhmäjäsenen sekvenssin monistamisen. Katso In- i nis et ai., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applica- : 30 tions", Academic Press, 1990. Tällaisten PCR-reaktioiden ··* tuotteet voidaan valita koon perusteella geelielektrofo- • * reettisesti, kloonata tarkoituksenmukaiseen vektoriin ja kloonattu DNA sekventoida GDNF-ryhmäjäsenten identifioimia • · *;** seksi. Vaihtoehtoisesti kloonit voidaan ensin seuloa hybri- *:*: 35 disoimalla GDNF:lle spesifiseen koettimeen hyvin ankarissa olosuhteissa GDNF-kloonien identifioimiseksi. Kaikki kloo- • · ' 1 1 7556 3 o .

nit, jotka eivät hybridisoidu GDNF:ään ankarissa olosuhteissa, sekventoitaisiin sitten tai tällaiset kloonit voitaisiin hybridisoida GDNF-koettimeen alhaisen ankaruuden i' olosuhteissa ja kaikki kloonit, jotka hybridisoituvat GDNF-5 koettimeen näissä olosuhteissa, sekventoitaisiin sitten.

Toinen lähestymistapa PCR:n käyttämiseksi GDNF-ryh-mäjäsenten kloonaamiseksi olisi edellä kuvatun PCR-reaktion tuotteiden leimaaminen ja noiden tuotteiden käyttäminen koettimena edellä lueteltujen nukleiinikohteiden seulomiseksi 10 ankarissa ja/tai vähemmän ankarissa olosuhteissa. Hybridi- soituvia klooneja tai nukleiinisegmenttejä voitaisiin ana- ? lysoida, kuten edellä yksityiskohtaisesti esitettiin, GDNF- \ kloonien ja -ryhmäjäsenten identifioimiseksi. Tällaista lähestymistapaa on käytetty NT-3:n kloonaamiseksi NGF- ja 15 BDNF-sekvenssien perusteella [Maisonpierre et ai., Science 247 (1990) 1446 - 1451].

Alan ammattilaiset tuntevat lukuisia erilaisia käytettävissä olevia määrityksiä sen osoittamiseksi, mitkä ' d hermosolut olisivat alttiita käsittelylle GDNF:lle, ja mui-20 den GDNF:lie alttiiden hermosolujen määritys voitaisiin suorittaa ilman laajoja kokeita. Alan taitaja kykenisi hei- :.·. posti määrittämään, milloim GDNF-lähetti ilmentyy kautta • · · koko ruumiin ja mitkä GDNF-proteiinitasot ovat kullakin • * « noilla alueilla. Alan taitaja kykenisi myös määrittämään • · · * * 25 sitoutumiskeskusten GDNF:lie sijainnin kautta hermoston.

Tämä tieto sallisi alan taitajan määrittää hermosolutyypit, jotka todennäköisesti olisivat alttiita GDNF:lie, mikä puo- * * · V · lestaan osoittaisi sopivat kliiniset indikaatiot tälle pro teiinille. Sopivia soluviljely- ja eläinkokeita voitaisiin :j*i 30 sitten suorittaa todennäköisyyden sille määrittämiseksi, että GDNF olisi käyttökelpoinen tällaisten indikaatioiden * * * hoidossa.

• i · \tt B49-soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustas- • * *·;·* ta eristetyn puhdistetun GDNF:n on samoin osoitettu edistä- *:*·: 35 vän parasympaattisten ja sympaattisten hermosolujen eloon- * · • · · • ·♦ • · f ; 37 117556 jääntiä viljelmissä. Näitä tuloksia kuvataan yksityiskohtaisesti esimerkissä 4.

Koska on mahdollista, että GDNF:n neurotrofisen funktion tuo mukanaan yksi tai useampi erillinen ja muista 5 erotetettava osa, arvellaan samoin, että esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavaa GDNF:ää voi- v daan käyttää terapeuttisessa koostumuksessa, jonka vaikuttava ainesosa koostuu GDNF:n tuosta osasta (tai noista osista), joka kontrolloi (tai jotka kontrolloivat) GDNFrn 10 neurotrofista funktiota.

Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettava GDNF on käyttökelpoinen terapeuttisessa tai farmaseuttisessa koostumuksessa, joka annetaan edullisesti ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta ruiskeena tai suoraan .15 aivoselkäydinnesteeseen (CSF) jatkuvana nestesiirtona istu- tetusta pumpusta. Samoin voidaan ajatella muitakin tehokkaita antomuotoja, kuten ruoansulatuskanavan ulkopuoliset hitaan vapautumisen koostumukset, sisäänhengitettävät sumut, suun kautta vaikuttavat koostumukset tai peräpuikot. Samoin 20 voidaan ajatella antoa yhdessä yhden tai useamman aineen kanssa, joka kykenee edistämään GDNF:n tunkeutumista veri- : aivoesteen poikki. Yksi edullinen kuljetusväline on fysio- ♦ * · loginen suolaliuos, mutta arvellaan, että muitakin far- • » « *. maseuttisesti hyväksyttäviä kantajia, kuten keinotekoista • · · * ‘ 25 CSF:ää, voidaan käyttää. Yksi edullinen suoritusmuoto näh dään sellaisena, jossa kantaja ja GDNF muodostavat fysiolo- ··* •••Ϊ gisesti yhteensopivan, hitaan vapautumisen koostumuksen.

• * · ·.* · Primaariliuotin tällaisessa kantajassa voi olla luonteel taan joko vesi- tai ei-vesipohjainen. Lisäksi kantaja voi ϊ^ϊ 30 sisältää muita farmakologisesti hyväksyttäviä täyteaineita koostumuksen pH:n, osmolaalisuuden, viskositeetin, kirkkau- * * den, värin, steriilisyyden, stabiilisuuden, liukenemisno- ,.

* · * peuden tai hajun modifioimiseksi tai ylläpitämiseksi. Sa- • · *·;·* maila tavalla kantaja voi sisältää edelleen muita farmako- ·;··: 35 logisesti hyväksyttäviä täyteaineita GDNF:n stabiilisuuden, ;*♦.· liukenemisnopeuden, vapautumisen tai imeytymisen tai tun- • · 38 117556 keutumisen veri-aivoesteen poikki modifioimiseksi tai ylläpitämiseksi. Tällaiset täyteaineet ovat niitä aineita, joi- f ta tavallisesti ja tavanomaisesti käytetään koostumusten ? muodostamiseksi ruoansulatuskanavan ulkopuoliseen antoon 5 joko yksikköannos- tai moniannosmuodossa tai suoraan neste-siirtoon CSF:ään jatkuvalla tai ajoittaisella nestesiirrol-la istutetusta pumpusta.

Sitten kun terapeuttinen koostumus on valmistettu, se voidaan varastoida steriileihin ampulleihin liuoksena, 10 suspensiona, geelinä, emulsiona, kiinteänä aineena tai de-hydratoituna tai kylmäkuivattuna jauheena. Tällaiset koostumukset voidaan varastoida joko käyttövalmiissa muodossa tai muodossa, joka edellyttää rekonstituointia juuri ennen antoa. Tällaiset koostumukset varastoidaan edullisesti ai-15 nakin niin alhaisissa lämpötiloissa kuin 4 °C ja edullisesti -70 °C:ssa.

Edullisesti GDNFrää sisältävien koostumusten antotapa ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta on ihonalaista, lihaksensisäistä, lukinkalvon alaisen tilan sisäistä tai ai- ' 20 vojensisäistä tietä. GDNF:n haluttuun annokseen pääsemiseksi voidaan antaa toistuvia päivittäisiä tai harvempia ihon- ; ,·, alaisia tai lihaksensisäisiä ruiskeita, tai GDNF voidaan * · · "V antaa jatkuvana tai ajoittaisena nestesiirtona istutetusta

• · i J

• · · *, pumpusta. Annostuksen tiheys riippuu GDNF:n koostumuksessa • · · • *j 25 farmakokineettisistä parametreistä ja käytetystä antoties- ta.

GDNF:n haluttuun annokseen pääsemiseksi dopamiini- *»· V · vaikutukseen liittyville ja muille vaurioituneille hermo soluille, joiden solurungot sijaitsevat aivoissa ja sei- : 30 käytimessä, arvellaan, että GDNF annetaan aivojen tai sei- • · · •***j käytimen lukinkalvon alaiseen tilaan tai aivokammion sisäi- • · # .1. sesti. Anto voi olla jatkuvaa tai ajoittaista ja se voidaan • · · **|#* saada käyttämällä jatkuvatoimista tai virtaukseltaan ohjel- • · *···* moitavaa istutettavaa pumppua tai antamalla ajoittaisia *:··· 35 ruiskeita. Anto voi samoin tapahtua aineiden yhteydessä, • · ··· • · · • · 39 117556 jotka mahdollistavat GDNF:n tunkeutumisen veri-aivoesteen läpi.

Arvellaan myös, että tiettyjä GDNFrää sisältäviä koostumuksia tullaan antamaan suun kautta. Edullisesti täl-5 lä tavalla annettu GDNF on kapseloitu. Kapseloitu GDNF voidaan koostaa käyttäen tai käyttämättä kiinteitä annostus-muotoja koostettaessa tavanomaisesti käytettyjä kantajia.

Edullisesti kapseli on suunniteltu siten, että koostumuksen vaikuttava osa vapautuu siinä ruoansulatuskanava-alueen 10 kohdassa, jossa biosaatavuus on maksimissaan ja presystee- minen hajoaminen minimissään. Lisätäyteaineita voidaan si- * säilyttää mukaan GDNF:n imeytymisen helpottamiseksi. Voi- 1 • t daan käyttää myös laimentimia, flavoriaineita, vahoja, joi- ; den sulamispiste on alhainen, kasviöljyjä, voiteluaineita, 15 suspendoimisaineita, tablettia hajottavia aineita ja sideaineita.

Riippumatta antotavasta spesifinen annos lasketaan j potilaan likimääräisen ruumiin painon tai ruumiin pinta-alan mukaan. Kutakin edellä mainittua koostumusta käyttä-20 vään hoitoon tarkoituksenmukaisen annostuksen määrittämiseksi tarpeellisten laskelmien loppuviimeistelyn suoritta- • .·. vat alan keskimääräisetkin taitajat rutiininomaisesti ja se • * · ^ *IV kuuluu heidän rutiininomaisesti suorittamiinsa tehtäviin • · · • · · I *. ilman laajoja kokeita, etenkin tässä julkistettujen annos- • · • «· • * 25 tustietojen ja -määritysten valossa. Nämä annostukset voi daan vahvistaa käyttämällä vakiintuneita määrityksiä annos- • · · ••.ί tusten määrittämiseksi, joita käytetään tarkoituksenmukais- V : ten annos-vastetietojen yhteydessä.

GDNFrää voidaan antaa terapeuttisesti istuttamalla 30 potilaisiin soluja, jotka kykenevät syntetisoimaan ja erit- - ·***· tämään GDNFrn biologisesti aktiivista muotoa. Tällaiset • · · GDNFrää tuottavat solut voivat olla soluja, jotka ovat li • · · ·,.* GDNF:n luonnollisia tuottajia (analogisesti B49-soluihin • · *·;·* nähden), tai ne voisivat olla soluja, joiden kykyä tuottaa ·:··· 35 GDNF:ää on lisätty transformoimalla GDNF-geenillä sopivassa ;*·,· muodossa sen ilmentymisen ja erityksen edistämiseksi. Mah- ♦ « 117556

40 I

dollisen immunologisen reaktion GDNF:n annosta vieraasta lajista minimoimiseksi potilaissa luonnollisesti GDNF:ää tuottavat solut ovat edullisesti ihmisalkuperää ja tuottavat ihmis-GDNF:ää. Samoin solut ihmis-GDNF:n ilmentämiseksi 5 transformoitaisiin käyttämällä ihmis-GDNF:ää koodittavaa il- · mentämisrakennetta menetelmillä, jotka ovat analogisia jäljempänä esimerkeissä 5 ja 6 käytettyihin menetelmiin nähden.

Luonnollisesti ihmis-GDNF:ää erittämään kykenevät 10 solut voidaan identifioida käyttäen seuraavia työvälineitä: (1) oligonukleotidejä, jotka edustavat osaa ihmis-GDNF:n lähetti-RNA:sta tai jotka ovat komplementaarisia osaan ih-mis-GDNF:n lähetti-RNA:ta nähden, voidaan käyttää ihmis-GDNF-lähettiä tuottavien solulinjojen löytämiseksi Northern 15 blot -analyysillä, RN-aasisuojauksella, hybridisaatiolla in situ, polymeraasiketjureaktiolla tai muilla näitä muistuttavilla menetelmillä; tai (2) ihmis-GDNF:n tunnistavia po-lyklonaalisia tai monoklonaalisia vasta-aineita voidaan ; käyttää solulinjojen löytämiseksi, joiden uutteet tai joita 20 kasvattamalla käsitelty kasvualusta sisältää GDNF-prote- i iinia, Western blot -analyysillä, ELISA-määrityksellä, ra- • ,·. dioimmunologisella määrityksellä tai muilla näitä muistut- • » i "Y tavilla menetelmillä. Edullinen strategia on seuloa sarjaa • ♦ * * ihmisalkuperää olevia soluja kasvattamalla käsitellyt kas-• · · ** *j 25 vualustat ihmis-GDNF-vastaisilla vasta-aineilla kohdan (2) edellä menetelmillä solujen löytämiseksi, jotka erittävät GDNF:ää kasvualustaansa. Näin tuotetulle GDNF:lle saatai- • · · V · siin vahvistus puhdistamalla ja aminohapposekvenssianalyy- sillä, kuten suoritettiin B49-solujen tuottamalla ja niiden : :*j 30 kasvualustaansa erittämällä GDNF:llä. Esimerkissä 7 jäljem- ·*· ;*"· pänä kuvataan ihmisyhdistelmä-DNA-GDNF:n vastaisten vasta- ··· aineiden tuottamista ja eristämistä.

• · ·

Soluja, jotka erittävät luonnollisesti tai jotka on • · *···* transformoitu erittämään ihmis-GDNF:ää, voidaan käyttää po- ·;·*: 35 tilaiden hoitamiseksi. Ihmis- tai ei-ihmiseläinsoluja voi- •\J daan istuttaa potilaisiin puoliläpäisevissä polymeerikapse- • · 117556 41 t leissa, jotka sallivat GDNF:n vapautumisen mutta estävät potilaan immuunijärjestelmää tuhoamasta soluja. Vaihtoehtoisesti potilaan omia soluja, jotka on transformoitu tuottamaan GDNFrää ex vivo, voitaisiin istuttaa suoraan poti-5 laaseen ilman tällaista kapselointia.

Metodologia elävien solujen membraanikapseloimisek-si on tuttu alan keskimääräisillekin taitajille ja kapseloitujen solujen valmistus ja niiden istuttaminen potilaisiin voidaan suorittaa ilman laajoja kokeita. Katso 10 US-patenttijulkaisut 4 892, 538; 5 011 472; ja 5 106 627, joista kukin sisällytetään spesifisesti viitteenä osaksi tätä patenttihakemusta. Systeemiä elävien solujen kapseloi-miseksi kuvataan Aebischerin et ai. PCT-hakemusjulkaisussa W0 91/10 425, joka sisällytetään spesifisesti viitteenä 15 osaksi tätä patenttihakemusta. Katso myös Aebischerin et ai. PCT-hakemus julkaisu W0 91/104 70; Winn et ai., Exper.

Neurol. 113 (1991) 322 - 329; Aebischer et ai,, Exper Neurol. Ill (1991) 269 - 275; Tresco et al^, ÄSAIO 38 (1992) 17 - 23, joista kukin sisällytetään spesifisesti viitteenä 20 osaksi tätä patenttihakemusta. - :

Erityisesti GDNF:ää erittäviä soluja voidaan istut- : .·, taa Parkinsonin tautipotilaisiin aivojuovioon GDNFrn saarni- • · · · •· seksi aivoreisien välissä olevan harmaan aineen massan do- • · · • · · *. pamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen terminaalisille

• · S

’ 1 25 kentille ja aivoreisien välissä olevaan harmaan aineen mas saan GDNF:n saamiseksi dopamiinivaikutukseen liittyviin so- ··· ···! lurunkoihin. Tällainen paikallisesti annettu GDNF edistäisi * ·*· V 1 aivojuovion versomista ja uudelleenhermottumista dopamiini vaikutukseen liittyvillä pälliä ja estäisi tai hidastaisi Ϊ,:.: 30 dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen rappeutumista :***; edelleen.

«··

Huomattakoon, että tässä kuvattuja keksinnön mukai- • · · sella menetelmällä valmistettavia G DN F-koostumuksia voidaan 1 • · ·1·1 käyttää sekä eläin- että ihmislääketieteellisiin käyttöihin *ί·1ί 35 ja että ilmaisua "potilas" ei tulisi tulkita rajaavalla ta- • · • · · ♦ 42 .

117556 valla. Eläinlääketieteellisten käyttöjen yhteydessä annos-tusalueiden tulisi olla samat kuin spesifioidaan edellä.

Huomattakoon, että esillä olevan keksinnön oppien soveltaminen spesifiseen ongelmaan tai ympäristöön on alan 5 keskimääräisenkin taitajan kykyjen puitteissa tähän sisältyvien oppien valossa. Esimerkkejä esillä olevan keksinnön ; edustavista käytöistä esitetään seuraavissa esimerkeissä.

Esimerkkejä

Esimerkki 1 10 GDNF:N puhdistaminen ja sekventointi Tämä esimerkki kuvaa menetelmiä GDNF:n biomäärityk- ΐ seen ja sen puhdistamiseksi. Se kuvaa myös menetelmiä B49-solulinjaa kasvattamalla käsitellyn kasvualustan valmistamiseksi, joka on puhdistuksen lähtömateriaali. Kuvataan sa-15 moin menetelmiä puhdistetun GDNF:n aminohapposekvenssin j saamiseksi sekä puhdistetusta proteiinista saatuja osa-aminohapposekvenssejä. .

A. Materiaalit

Ajoitetusti raskaana olevat rotat olivat laborato- 20 riosta Zivie Miller Lab, Allison Park, PA. Ellei toisin ole * spesifioitu, kaikki reagenssit olivat valmistajalta Sigma : .·. Chemical Co., St. Louis, MO.

* · · ..V B. Dopamiinivaikutukseen liittyvien neurotrofisten • i · ' *, aktiivisuuksien biomääritys * * 25 Viljelyolosuhteet e··*·

Erillisiä soluja käsittäviä keskiaivosoluviljelmiä • I» •••t valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [Friedman ja Myti- ··· V * lineou, Neurosci. Lett. 79 (1987) 65 - 72], pienin modifi kaatioin. Lyhyesti, raskauden 16. päivänä Sprague-Dawley- ί 30 rotta-alkioiden aivoista leikattiin keskiaivojen suun puo- ·«* :’**· leinen aivoreisiosa mikroskooppia käyttäen steriileissä Φ· olosuhteissa, ne kerättiin Dulbeccon fosfaatilla puskuroi- < t * ·], tuun suolaliuokseen, joka ei sisältänyt Ca2+- ja Mg2+-ioneja • · *···* (Gibco, Gaithersburg, MD), ja rikottiin mekaanisesti ke- *:·*: 35 vyesti trituroimalla. Soluja maljattiin 100 μΐ/kuoppa ku- dosvil j elykuoppiin, joiden halkaisija oli 16 mm (Falcon, « · 43 117556

Lincoln Park, NJ, 24-kuoppainen levy), ja jotka sisälsivät 400 μΐ kasvualustaa, jolloin tiheydeksi tuli 2,5 - 3,5 x 105 solua/kuoppa. Viljelykuoppia oli aiemmin käsitelty po-ly-L-ornitiinin 0,1 mg/ml liuoksella 10 mM natriumboraat-5 tipuskurissa, pH 8,4, 3 tunnin ajan 37 °C:ssa, ne oli pesty kolmeen kertaan milli-Q-H20:11a ja kerran Earlen tasapai-noitetulla suolaliuoksella (Gibco). Syöttöalusta (10/10) koostui minimivaatimuskasvualustasta (MEM, Gibco), jota oli täydennetty glukoosilla (33 mM), natriumbikarbonaatilla 10 (24,5 mM) , glutamiinilla (2 mM), HEPES-valmisteella (15 mM), penisilliini-G:llä (5 U/ml), streptomysiinillä (5 pg/ml), 10 %:lla lämpöinaktivoitua vasikansikiöseerumia (Gibco) ja 10 %:lla lämpöinaktivoitua hevosseerumia (Gibco). Viljelmiä pidettiin 37 °C:ssa vedellä kyllästetyssä 15 ilmakehässä, joka sisälsi 6,5 % C02ita. 3 tunnin kuluttua valtaosan soluista tartuttua kuopan pohjaan kasvualusta korvattiin 500 piillä tuoretta kasvualustaa. Tänä ajankohtana GDNF-aktiivisuuden suhteen määritettävän näytteen sar-jalaimennos lisättiin kuoppiin käyttäen kaksinkertaisia 20 määrityksiä ja levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa inkubaattoris-sa. Viikon kuluttua viljelmiä käsiteltiin 24 tunnin ajan ! ,·. fluorodeoksiuridiinilla (13 ug/ml) ja uridiinilla (33 ug/ ml) hermoston tukikudossolujen liiallisen lisääntymisen es- * · · Γ *. tämiseksi, minkä jälkeen niille syötettiin edeltävää kasvu-

• M

* * 25 alustaa, joka ei sisältänyt vasikansikiöseerumia. Syöttö- kasvualusta vaihdettiin viikoittain.

• · · ···· Vaihtoehtoisesti käytettiin kemiallisesti määritel- *.* * tyä, seerumia vailla olevaa kasvualustaa, jossa seerumi oli korvattu proteiini-, hormoni- ja suolaseoksella. Määritelty ϊφϊ#ϊ 30 kasvualusta (DM) koostui seoksesta, jossa oli MEM:iä ja :***; F12-ravintoseosta (molemmat Gibcolta, 1:1, v/v) ja joka si- 1 sälsi glukoosia (33 mM) , glutamiinia (2 mM) , NaHCCbia (24,5 l.. mM), HEPES-valmistetta (15 mM) ja jota oli täydennetty • · *·;** transferriinillä (100 pg/ml), insuliinilla (25 pg/ml) , put- "”ί 35 reskiinilla (60 μΜ), progesteronilla (20 nM) , natriumse- leniitillä (30 nM), penisilliini-G:llä (5 U/ml) ja strepto- 44 117556 mysiinillä (5 pg/ml). DM:n osmolaalisuudeksi säädettiin 325 lisäämällä milli-Q-H20:ta (110 - 125 ml Η20:ta/litra) . DM:ää käytettäessä esiintyi harvoja ei-hermosoluja morfologian μ perusteella tai värjättäessä hermoston tukikudoksen säikei-5 nen hapan proteiini (GFAP), joka on tähtisoluspesifinen solun tukiverkostoproteiini. GDNFrllä on dopamiinin ottoa stimuloivaa aktiivisuutta sekä seerumia sisältävässä että - määritellyssä kasvualustassa. Kaikki seuraavissa esimer keissä suoritetut määritykset tehtiin seerumia sisältävässä 10 kasvualustassa.

Dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen funktionaalinen status näissä viljelmissä voidaan määrittää mittaamalla dopamiinin otto spesifisten "sieppaaja"-kuljettajien välityksellä dopamiinivaikutukseen liittyvissä 15 hermosoluissa ja laskemalla immuunikudoskemiallisin menetelmin niiden hermosolujen lukumäärä, jotka ovat positiivisia dopamiinisynteesientsyymille tyrosiinihydroksylaasi. Se mahdollisuus, että viljelmät olisivat merkittävästi kontaminoituneita noradrenaliinivaikutukseen liittyvillä her-20 mosoluilla, jotka myös kykenevät kuljettamaan dopamiinia ja myös sisältävät tyrosiinihydroksylaasia, suljettiin pois : .·. leikkaamalla huolellisesti ja osoittamalla, että dopa- • · · ^ miinikulj että j illa oli dopamiinivaikutukseen paremminkin « · · t’.'. kuin noradrenaliinivaikutukseen liittyville hermosoluille * * · * * 25 tunnusomainen farmakologinen profiili. Dopamiinin ottoa näissä viljelmissä inhiboi GBR12909, joka on monoamiinikul- • · ♦·” jettajan dopamiinivaikutukseen liittyvillä hermosoluilla • ·*· V * inhibiittori ED50:n ollessa 20 nM. Sitä vastoin ainakin 300 : kertaa enemmän desipramiinia, joka on monoamiinikuljettäjän ’ f ϊ.ί,ϊ 30 inhibiittori noradrenaliinivaikutukseen liittyvillä her- :***: mosoluilla, tarvitaan dopamiinin oton inhiboimiseksi näissä *·· #.j. viljelmissä. Nämä arvot ovat monoamiinikulj että j alle dopa- λ • * * I., miinivaikutukseen liittyvissä hermosoluissa raportoituja.

• ♦ * · Näytteen valmistus *ϊ**ί 35 Ennen kuin niistä määritettiin dopamiinivaikutuk- :*·.· seen liittyvä neurotrofinen aktiivisuus keskiaivosoluvil- 45 117556 jelmissä, kaikista puhdistuksen vaiheissa 1-3 (katso osa C jäljempänä) muodostetuista näytteistä poistettiin seuraavasti suolat- 100 μΐ kasvualustaa 10/10 (kantajana) mitattiin Centricon-10-putkiin (Amicon) ja annettiin seistä 5 10 minuutin ajan. Centricon-putkiin lisättiin erät määri tettävistä näytteistä ja sitten 1 ml Dulbeccon runsaasti glukoosia sisältävää modifioitua Eagle-kasvualustaa, joka ei sisältänyt bikarbonaattia mutta sisälsi pitoisuuden 10 mM HEPES-valmistetta, pH 7,2 (liuos A), ja sentrifugoitiin 10 5 000 x g:ssä 70 minuutin ajan. Retentaatti (noin 0,1 ml) täytettiin takaisin 1,1 mliksi lisäämällä tuoretta liuosta A ja sentrifugoitiin kahdesti toistamiseen. Näyte suodatettiin steriilin 0,11 pm:n Ultrafree-MC Durapore -yksikön i (Millipore, Bedford, MA) läpi ennen kuin se lisättiin vil-15 jelykuoppaan.

3H-dopamiinin otto

Tritioidun dopamiinin (3H-DA) oton määritys viljelmissä suoritettiin päivänä 6 tai 7 kuten aiemmin on kuvattu [Friedman ja Mytilineou, Neurosci. Lett. 79 (1987) 65 - 72] 20 pienin modifikaatioin, ja kaikkia liuoksia pidettiin 37 °C:ssa. Lyhyesti, kasvualusta poistettiin, huuhdottiin kah-: desti 0,25 ml:11a ottopuskuria, joka koostui Krebs-Ringerin V/ fosfaattipuskurista, pH 7,4, joka sisälsi pitoisuudet 5,6 • · ·

mM glukoosi, 1,3 mM EDTA, 0,1 mM askorbiinihappo ja 0,5 mM

* * 25 pargyliini, joka on monoamiinioksidaasi-inhibiittori. Vil- * · · · « jelmiä inkuboitiin 0,25 ml:11a 50 nM 3H-DA-valmistetta (New • m •••J England Nuclear, Boston, MA, spesifinen aktiivisuus 36 - 37 V * Ci/mmol) 15 minuutin ajan 37 °C:ssa. 3H-DA:n otto pysäytet tiin poistamalla inkubointiseos, minkä jälkeen solut pesisi 30 tiin kahdesti 0,5 ml:11a ottopuskuria. 3H-DA:n vapauttami- :***: seksi soluista viljelmiä inkuboitiin 0,5 ml:11a 95-%:ista «· .1. etanolia 30 minuutin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen ne li- i « | ^ sättiin 10 ml:aan EcoLite-valmistetta (ICN, Irvine, CA) ja • · ’·“* laskettiin tuikelaskijalla. Sokeat arvot saatiin lisäämällä ·:**: 35 ottopuskuriin pitoisuus 0,5 mM GBR-12909 (RBI), joka on do- j- pamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen korkean affini- • ♦ 46 117556 teetin ottopumpun spesifinen inhibiittori [Heikkilä et ai., Europ. J. Pharmacol. 103 (1984) 241 - 248], ja ne olivat tavallisesti alle 5 % 3H-DA:n otosta ei-käsitellyissä ver-rokkiviljelmissä. GDNF-aktiivisuuden trofisten yksiköiden 5 (TU) lukumäärä määriteltiin sen laimennoksen käänteisarvoksi, joka antoi 50 % viljelmän 3H-DA:n oton maksimaalisesta stimulaatiosta. Spesifinen aktiivisuus määritettiin jakamalla TU-yksiköiden lukumäärä näytteen sisältämän proteiinin määrällä.

10 C. GDNF:n puhdistaminen Lähtömateriaali B49-hermotukikudossolut, jotka saatiin D. Schubertilta, Salk Institute, La Jolla, CA [katso Schubert et ai., Nature 249 (1974) 224 - 227], kasvatettiin yhteenkasvaviksi 15 DMEM-kasvualustassa, joka sisälsi 10 % vasikansikiöseeru-mia, pitoisuuden 4 mM glutamiini, 50 U/ml penisilliini-G:tä ja 50 pg/ml streptomysiiniä, viljelykolveissa (225 cm , Costar, Cambridge, MA) . Seerumia vailla oleva, soluja kasvattamalla käsitelty kasvualusta (CM) valmistettiin pese-20 mällä viljelmä kerran 10 ml:11a seerumia vailla olevaa kasvualustaa ja sijoittamalla solut sitten 50 ml:aan kolvia • · · ··! «1 kohden seerumia vailla olevaa kasvualustaa kahdeksi päiväk- • · *.2.1 si. CM otettiin talteen ja soluja täydennettiin tuoreella, • · V·· seerumia vailla olevalla kasvualustalla joka 2. päivä sen *:··; 25 jälkeen päivään 6. Yhdistettyä CM:ää kolmesta sadosta kus- ··· takin soluerästä sentrifugoitiin 5 000 x g:ssä 20 minuutin ···· .2j1. ajan 4 °C:ssa solujen ja jätteen poistamiseksi. Superna- tanttia konsentroitiin noin 10-kertaisesti Amicon- konsentroijassa (YM10-membraani) ja sentrifugoitiin 40 000 • 2 ♦ I!1 30 x g:ssä 20 minuutin ajan 4 C:ssa. Supernatantti suodatet- • · ’2;·1 tiin 0,2 μ: n Micro Culture Capsule -laitteen (Gelman

Sciences) läpi ja sitä voitiin varastoida 4 °C:ssa aina :3: kuukauden ajan.

···.

• ...

·····'.

· · · • · 1 2 • · · 3 • · 47 117556

Vaihe 1

Hepariinisefaroosikromatografia

Edeltävä valmiste (200 mg proteiinia) panostettiin '

Heparin Sepharose CL-6B -kolonniin (1 x 25 cm) (Pharmacia, 5 Piscataway, NJ), jota oli tasapainoitettu 50 mM NaPi-puskurilla, pH 8,0, ja joka sisälsi pitoisuuden 0,15 N NaCl (puskuri A) . Sitten kolonnia pestiin samalla puskurilla, kunnes ulosvirtausnesteen optinen tiheys 280 nmrssä (0.D. 280) palasi pohjatasoon, minkä jälkeen eluoitiin 100 10 ml:lla lineaarista gradienttia, joka oli puskurista A 50 mM NaPi-puskuriin, pH 8,0, joka sisälsi pitoisuuden 1,5 N NaCl (puskuri B) . Kerättiin 2 ml:n fraktioita. Fraktioista analysoitiin johtokyky ja GDNF-aktiivisuus. Kuviossa 1 esitetään tällainen kromatogrammi. Elutoitujen proteiinien pro-15 fiili esitetään O.D.28o-kuvaajana. Kustakin fraktiosta mitattujen johtokyvyn ja GDNF-aktiivisuuden kuvaajat asettuvat päällekkäin. Janalla merkityt, GDNF-aktiivisuushuiput sisältävät fraktiot (pitoisuudessa noin 0,6 - 0,8 N NaCl) yhdistettiin pooliksi jatkoanalyysejä varten.

20 Vaihe 2 FPLC-Superose-kromatografia • · · ϊ·! : Edellä saatu pooli haihdutettiin 0,4 ml:ksi käyttä- • · *.·,· mällä Amicon-konsentroi j aa (Amicon, Beverly, MA, YM10- • · ·,*·· membraani) ja suoritettiin kromatografia-ajo nopeaprote- *:··; 25 iininestekromatograf ia (FPLC) Superose 12 -kolonnissa ··· (Pharmacia) 50 mM NaPi-puskurissa, pH 7,4, joka sisälsi pi- »M· •*j*. toisuuden 0,5 N NaCl, virtausnopeuden ollessa 0,5 ml/min.

« 14 minuutin eluoinnin jälkeen kerättiin 0,5 ml:n fraktioita , .·. silikonilla käsiteltyihin mikrofugiputkiin, jotka sisälsi- • · » 30 vät 5 μΐ 0,4-%:ista Tween 20 -valmisteliuosta. Näytteestä • · "* kustakin fraktiosta analysoitiin GDNF-aktiivisuus. Kuviossa ··· V ! 2 esitetään tällainen kromatogrammi, jolloin proteiinipro- : fiili esitetään O. D.28o-kuvaajana, jonka päälle asettuu GDNF-aktiivisuuskuvio. 85 % kolonniin panostetusta GDNF- * · . . 35 aktiivisuudesta otettiin talteen fraktioissa nro 12 - 15.

• · · • * · « · 48 117556

Vaihe 3

RP-HPLC

Fraktio nro 14 edeltä tehtiin happamaksi lisäämällä 10 μΐ 25-%:ista trifluorietikkahappoa (TFA). Puolet happa-5 maksi tehdystä materiaalista panostettiin Aquapore RP-300 C-8 -käänteisfaasi-HPLC-kolonniin (Brownlee-kolonni, Applied Biosystems, San Jose, CA), jonka halkaisija oli kapea, 2, 1 x 220 mm, ja eluoitiin käyttäen gradienttia H2O/ 0,1 % TFA: 80 % asetonitriili/0, 085 % TFA. Proteiinia UV- 10 absorption 214 nmrssä nojalla sisältävät fraktiot kerättiin käsin silikonilla käsiteltyihin mikrofugiputkiin. Eristä kustakin fraktiosta analysoitiin GDNF-aktiivisuus. Kuviossa 3 esitetään tällainen kromatogrammi, jolloin proteiinipro-fiili esitetään O.D.2i4“kuvaajana ja aktiivisuuskuvio ala- 15 osassa. Fraktiot 5 ja 6 sisälsivät noin 90 % RP-HPLC: ssä talteen saadusta aktiivisuudesta, kun puolestaan fraktiossa 7 oli loput 10 % aktiivisuudesta. Kuviossa 4 esitetään hopealla värjätty SDS-PAGE-geeli, joka ajettiin fraktioista kuviossa 3 esitetyn GDNF-aktiivisuushuipun ympärillä.

2 0 Vaihe 4

, Preparatiivinen SDS-PAGE

• * · ··' ϊ GDNF-aktiivisuushuipun sisältävät fraktiot 5 ja 6 1' • · *.*.· yhdistettiin pooliksi ja haihdutettiin 20 yl:ksi 10 μ1:η • · ·,**: 0,4-%:ista Tween 20 -valmisteliuosta läsnä ollessa Speed Λ *:*·: 25 Vac -laitteessa. Näytteeseen lisättiin 1 μΐ 1 M Tris-emästä ϊ ··· ja 5 μΐ 0,2 M Tris-HCl:ää, pH 6,8, joka sisälsi 40 % glyse- • · · · j*·’. rolia ja 5 % SDS:ää, ja se ajettiin ei-pelkistetyssä 15- | %:isessa SDS-PAGE-geelissä [Laemmli, Nature 277 (1970) 680 . - 684] (0, 075 x 14 x 11,5 cm:n palanen, 20 kuoppaa, 0, 075 x • · · 30 0, 4 x 2, 8 cm/näytekuoppa) . Elektroforeesi suoritettiin 10 “** °C:ssa virralla 40 mA/geeli 2 tuntia kestävänä. Geelipala * ··· ϊ.ϊ J leikattiin 1,14 mm:n siivuiksi. Kukin siivu leikattiin 2 :***: pienemmäksi palaseksi ja eluoitiin vaihtaen kolme kertaa • ♦ · 1 peräkkäin 25 μΐ 5 mM NaPi-puskuria, pH 6,7, joka sisälsi • ♦ . , 35 0,01 % Tween 20 -valmistetta, 20 tunnin aikana jatkuvasti • · « ravistellen 4 °C:ssa. Saadut kolme erää eluoitua materiaa- 49 117556 lia yhdistettiin, niistä määritettiin GDNF-aktiivisuus (kuvio 5) ja elutaatti, jonka aktiivisuus oli korkein (geeli-palasta nro 16-23, mikä vastaa 30 - 42 kD kuviossa 5), yhdistettiin pooliksi. Sokea geeliliuska (jonka päälle panos-5 tettiin ennen elektroforeesia vain SDS-PAGE-näytepuskuria) prosessoitiin samalla tavalla verrokkina.

Vaihe 5

RP-HPLC

Pooliksi yhdistetty geelieluentti haihdutettiin 10 noin 150 piiksi Speed Vac -laitteessa, se tehtiin happamaksi lisäämällä 20 μΐ 25-%:ista TFA:ta ja ajettiin RP-HPLC :llä kuten kuvattiin vaiheessa 3. Proteiinia O.D.2i4:n ' nojalla sisältävät fraktiot kerättiin käsin silikonilla käsiteltyihin mikrofugiputkiin ja määritettiin niiden GDNF-15 aktiivisuus. Kuviossa 6 esitetään tulokset tällaisesta kro-matografiästä. Samankokoisista sokeista geelipaloista saatu eluentti ajettiin verrokkina myös RP-HPLC: llä. Ainoa mer-kittävä O.D.2i4-piikki näytteessä verrokkiprofiilin (kuvio 6, paneelit A ja B) yläpuolella on piikki 3, joka sisältää 20 70 % HPLC-kolonniin panostetusta GDNF-aktiivisuudesta. Ku viossa 7 esitetään hopealla värjätyssä SDS-PAGE-geelissä • 1 1 ί·: : ajettu piikki 3. Ainoa näkyvä värjäys on hyvin leveä nauha • · :.V välillä 30 - 42 kD, joka osuu päällekkäin preparatiivisessa • · :,1·· SDS-PAGE:ssa havaitun GDNF-aktiivisuusprofiilin kanssa (ku- *:1·· 25 vio 5) . Yhteenveto tyypillisestä puhdistuksesta esitetään ··· taulukossa 1. , .

* · · · D. Puhdistetun GDNF:n aminohapposekvenssi

Aminopään sekvenssi . Kuvion 6 mukainen piikki 3 sekventoitiin kaasu- • · · 30 faasiproteiinisekventoijalla (Applied Biosystems) . Saatu • 1 ·“1 sekvenssi esitetään kuviossa 8. Sekventoitaessa fraktiot, • · « I joissa oli GDNF-aktiivisuushuippu puhdistuksen vaiheen 3 jälkeen (fraktiot 5 ja 6 kuviossa 3), ilmeni samoin yksit- * 1 1 täinen sekvenssi, joka oli identtinen kuviossa 8 esitettyyn • · . . 35 sekvenssiin nähden, joka saatiin puhdistetusta näytteestä.

* e « V1 Ainoa materiaali, joka näillä eri fraktioilla on yhteisenä, 50 117556 on materiaali, joka kulkee tahrana välillä 30 - 42 kD. Tämän vuoksi 30 - 42 kD-alueen ulkopuolella olevat konta-minoivat nauhat, jotka nähdään fraktioiden 5 ja 6 hopealla värjätyssä geelissä kuviossa 4, voisivat a) olla määrältään 5 liian pieniä (< 1 pikomoolia) sekventoitavaksi tämänhetkisellä teknologialla; b) liittyä 30 - 42 kD:n tahranauhaan sekvenssissä; tai c) käsittää salvatun aminopään.

Sisäinen sekvenssi GDNF-valmistetta, joka saatiin edellä kuvatun puh- 10 distuksen vaiheesta 3, käytettiin lähtömateriaalina sisäisen sekvenssin saamiseksi. Kuvion 3 mukaiset fraktiot 5 ja 6 yhdistettiin pooliksi silikonilla käsiteltyyn mikrofugi-putkeen, joka sisälsi 9 μΐ 0,4-%:ista Tween-valmiste-liuosta, ja haihdutettiin 40 piiksi Speed Vac -laitteessa.

15 Näytteeseen lisättiin 160 μΐ l-%:ista Nf^HCCb-liuosta, joka sisälsi pitoisuuden 2,5 M guanidiinihydrokloridi ja 1 pg:n trypsiiniä, ja näytettä inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa. Seos tehtiin happamaksi lisäämällä 20 μΐ 25-%:ista TFA:ta, se haihdutettiin noin 150 piiksi Speed Vac -laitteessa ja pep- 20 tidit erotettiin Aquapore RP-300 C-8 -käänteisfaasi-HPLC- kolonnissa (Brownlee-kolonni), jonka halkaisija oli kapea, • * · · 2,1 x 220 mm, ja eluoitiin käyttäen gradienttia ΗςΟ/Ο,Ι % V.: TFA: 80 % asetonitriili/0,085 % TFA. Peptidejä absorption • · ·.*·· 214 nmrssä nojalla sisältävät fraktiot kerättiin käsin si- *ί**ί 25 likonilla käsiteltyihin mikrofugiputkiin. Kuviossa 9 esite- *;· tään tulokset tällaisesta kromatografiästä. Kuvion 9 mukai- :*·'· sen piikin 10 sekvenssi määritettiin identtiseksi ei- käsitellyn proteiinin aminopään kuviossa 8 esitetyn sek- , ,·, venssin (sekvenssi tunnusnro 1) ensimmäisiin 13 aminohappo- • · · 30 tähteeseen nähden. Kuvion 9 mukaista piikkiä 37 käsiteltiin • · T edelleen CNBr:llä. Näyte haihdutettiin 20 piiksi Speed Vac « · · ·.· · -laitteessa. Näytteeseen lisättiin 70 μΐ 90-prosenttista ··* muurahaishappoa ja 5 mg CNBrrää, ja näytettä inkuboitiin pimeässä yön yli huoneenlämpötilassa. Tämä seos haihdutet- « · 35 tiin 20 piiksi Speed Vac -laitteessa, sitä laimennettiin - ’ * lisäämällä 100 μΐ 0,l-%:ista TFA-liuosta ja se erotettiin 51 117556 käänteisfaasi-HPLC:llä edellä kuvatun mukaisesti. Kuviossa 10 esitetään tulokset tällaisesta kromatografiästä. Kuvion 10 mukainen piikki 1 haihdutettiin 20 piiksi 5 piin 0,4-% lista Tween 20 -valmisteliuosta läsnä ollessa Speed Vac - k 5 laitteessa. Näytteeseen lisättiin 100 pl l-%lista NH4HCO3- 7 liuosta ja 5 pl 50 mM ditiotreitoliliuosta ja näytettä in-kuboitiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Seos tehtiin happamaksi lisäämällä 10 pl 25-prosenttista TFAita, se haihdutettiin 100 piiksi Speed Vac -laitteessa ja erotet-10 tiin käänteisfaasi-HPLC:llä kuten edellä. Kuviossa 11 esitetään tulokset tällaisesta kromatografiästä. Kuvion 11 mukaisilla piikeillä sekä 33 että 34 on identtinen sekvenssi (kuvio 12) (sekvenssi tunnusnro 2).

E. GDNFin ominaispiirteet 15 Liikkuvuus SDS-PAGE:ssa

Ilman näytteen minkäänlaista lämpökäsittelyä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa GDNF kulkee SDS-PAGEissa tahra-nauhana 31 - 42 kD:n välillä. Kun näytettä kuumennetaan 100 °Cissa 3 minuutin ajan pelkistävän aineen (4 % β-merkap- 20 toetanolia) läsnä ollessa, GDNF kulkee useana erillisenä nauhana 20 - 23 kD:n välillä. Koska noin 50 % geeliin pa- • · · i.: i nostetusta bioaktiivisuudesta voitiin saada talteen edellä- • · V.· sissä (ei-pelkistävissä) mutta ei jälkimmäisissä (pelkistä- • · ϊ/.j vissä) olosuhteissa, GDNF voi olla disulfidisillan sitoma ·:··· 25 dimeeri ja aktiivinen vain dimeerinä. Vaikka yksi aminopää ··· viittaa siihen, että GDNF-valmiste on homogeeninen ydinpri- ·«»· maarirakenteeltaan, tahra tai moninauhakuvio viittaa hete- * · · rogeenisesti glykosyloituun proteiiniin.

Spesifinen aktiivisuus • ♦ t “I 30 Puhdistetun GDNFin arvioitu spesifinen aktiivisuus • · *"1 oli noin 17 trofista yksikköä/ng, mikä osoittaa, että dopa- * 1 · V 1 miinin oton puolimaksimaalinen stimulaatio tapahtuu noin 60 : ]ί pg:n/ml suhteellisen alhaisessa pitoisuudessa. Puhdistetul- le GDNF:lie mitattu spesifinen aktiivisuus voi olla jonkin . . 35 verran aliarvioitu, mikä johtuu GDNFin osittaisesta inak- • · · • ·« 1 tivoitumisesta puhdistuksen aikana sen altistuessa RP- " ' 52 117556 HPLC:ssä käytetyille happamiksi tehdyille orgaanisille liu-ottimille sekä denaturoiville olosuhteille SDS-PAGE:ssa.

GDNF:n spesifisyys GDNF puhdistettiin sen kyvyn perusteella lisätä do-5 pamiinin ottoa dopamiinivaikutukseen liittyvillä hermo- ‘ soluilla (kuvio 20A). Sen määrittämiseksi, nostiko GDNF myös toista dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen eloonjäännin ja/tai kypsymisen arvolukua, mitattiin myös tyrosiinihydroksylaasi (TH) -immuunireaktiivisuus keskiai-10 voviljelmissä. TH on dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen viljelmissä spesifinen merkki, Immuunireaktiivi-suuden lisääntyminen GDNF:n vaikutuksesta voisi johtua dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen lisääntyneestä eloonjäännistä ja/tai TH-tuotannon dopamiinivaikutukseen 15 liittyvää hermosolua kohden lisääntymisestä. Puhdistetun GDNF:n lisääminen maljaamispäivänä oli viljelmiä 8 päivää myöhemmin tarkasteltaessa johtanut 10 kertaa suurempaan lukumäärään TH+-hermosoluja verrattuna GDNF:ää vailla olleisiin verrokkeihin. Jos päivänä 9 lisättiin toinen GDNF-20 annos, voitiin viljelmiä 7 päivän kuluttua (16 päivää in vitro) tarkasteltaessa havaita edelleen samanlainen annok- » i : sesta riippuvainen lisäys verrokkiin verrattuna (kuvio • · V.* 20B). Täten GDNF kykeni ylläpitämään dopamiinivaikutukseen i#‘.j liittyvien hermosolujen eloonjääntiä ja/tai lisäämään TH- ·;··; 25 geenin ilmentymistä keskiaivojen dopamiinivaikutukseen liittyvillä hermosoluilla.

Sen osoittamiseksi, että GDNF:llä on spesifinen stimuloiva vaikutus dopamiinivaikutukseen liittyvien her- mosolujen kypsymiseen ja/tai eloonjääntiin eikä yleistä **’ 30 vaikutusta kaikkiin hermosoluihin, analysoitiin gamma- • · *···1 aminovoihappoa (GABA) sisältävien, myös keskiaivoviljelmis- sä esiintyvien hermosolujen reaktiontuottokykyä GDNF: lie.

;***; 3H-dopamiinin (3H-DA) ja 14C-GABA:n otto mitattiin kes- • · · * , kiaivosolujen sisarviljelmistä, joita oli kasvatettu käyt- ' ····· 35 täen eri GDNF-pitoisuuksia 15 . ja vastaavasti 16 päivän 1 · · · ajan. Kuten edellä kuvattiin, GDNF lisäsi keskiaivojen do- 53 117556 pamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen 3H-DA:n ottoky-kyä noin 150 % verrattuna GDNF:ää vailla olleisiin verrok-keihin (kuvio 21A). Kuitenkaan GDNF:llä ei ollut mitään merkittävää vaikutusta GABA-hermosolujen 14C-GABA:n ottoky-5 kyyn, sillä 14C-GABA:n otto GDNF:n läsnä ollessa oli vain j noin 20 % korkeampi kuin verrokin (kuvio 21B). Tätä havainnollistaa myös lasketun 3H-DA/14C-GABA-ottosuhteen nousu (kuvio 21C). Nämä tulostiedot osoittavat, että keskiaivojen dopamiinivaikutukseen liittyvät hermosolut ja GABA-10 hermosolut reagoivat eri tavalla GDNF:n läsnäoloon ja että GDNF:n stimuloiva vaikutus 3H-DA:n ottoon keskiavoviljel-missä on spesifinen dopamiinivaikutukseen liittyville hermosoluille GABA-hermosoluihin verrattuna.

Nämä havainnot valaisevat edelleen, miksi GDNF:ää 15 voidaan käyttää Parkinsonin taudin tai muiden sairauksien, jotka liittyvät dopamiinivaikutukseen liittyviin hermo-soluihin, hoitamiseksi. Nämä tulokset osoittavat, että GDNF lisää dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen ainakin kahta tärkeää ominaisuutta: dopamiinin ottoa ja TH-ent- 20 syymitasoja. Tulokset osoittavat myös, että GDNF:n vaikutukset ovat ainakin osittain spesifisiä dopamiinivaikutuk- • « : seen liittyville hermosoluille, koska GABA-hermosoluilla ei • * ί.ί.ί ilmene samaa vaikutusta.

Dopamiini- ja GABA-vaikutukseen liittyvien hermo-····· 25 solujen lisäksi rotan alkion keskiaivoviljelmissä esiintyy vielä toinen hermosolupopulaatio, serotoniinivaikutukseen • * « · liittyvät hermosolut. Jotkut tekijät, kuten orvaskeden kas- , • mm vutekijä (EGF), jotka lisäävät dopamiinivaikutukseen liit- . tyvien hermosolujen dopamiinin ottoa keskiaivoviljelmissä, * * * ;;; 30 lisäävät samoin serotoniinivaikutukseen liittyvien her- • · *·;·’ mosolujen serotoniinin ottoa ja GABA-vaikutukseen liittyviin:*: en hermosolujen GABA:n ottoa. Katso Casper et ai., J. Neu- rosci. 30 (1991) 372. Tämä osoittaa, etteivät nämä tekijät » * · ole spesifisiä dopamiinivaikutukseen liittyville her- • · . . 35 mosoluille.

* · t • ·» • · : 54 117556

Sitä vastoin GDNF ei lisää serotoniinivaikutukseen liittyvien hermosolujen serotoniinin ottoa. 3H-serotoniinin otto mitattiin samalla tavalla kuin 3H-DA:n otto esimerkissä B kuvatun mukaisesti lukuun ottamatta, että ottopuskuri 5 sisälsi 50 nM 3H-serotoniinia (11 Ci/mol, Amersham, Arlington Heights, IL) 3H-DA;n asemesta. Kun läsnä oli pitoisuus 10 μΜ Citalpram-tuotetta (joka saatiin Dr. C. Mytilineoul-ta, Mount Sinai School of Medicine), joka on tunnettu tehokas serotoniinin oton inhibiittori serotoniinivaikutukseen 10 liittyvissä hermosoluissa, 3H-serotoniinin otto laski 15 %:iin. Verrokkiarvot Citalpram-tuotteen läsnä ollessa vähennettiin kuviossa 24 esitetyistä kokeellisista arvoista.

Vastoin kuin ei-spesifiset tekijät, kuten EGF, · GDNF, ei lisää GABA:n ottoa (kuvio 21) ja serotoniinin ot-15 toa (kuvio 24) olosuhteissa, joissa dopamiinin otto kasvaa merkittävästi. Nämä ja edellä kuvatut tulokset osoittavat, että GDNF on spesifinen dopamiinivaikutukseen liittyville hermosoluille keskiaivoviljelmissä verrattuna samoissa viljelmissä esiintyviin GABA- ja toisaalta serotoniinivaiku-20 tukseen liittyviin hermosoluihin. Tällainen spesifisyys li- ti sää GDNF:n käyttökelpoisuutta Parkinsonin taudin hoidossa, • · :.· I jonka katsotaan olevan keskiaivojen (aivoreisien välissä • · oleva harmaan aineen massa) dopamiinivaikutukseen liitty- ville hermosoluille spesifinen sairaus.

• · * ·;··· 2 5 Esimerkki 2 GDNF-geenin kloonaaminen ····..

A. GDNF:ää koodittavan rottageenin cDNA-kopion kloonaaminen . . GDNF:ää koodittavan geenin kloonaamiseksi B49- » · « 30 soluista eristetystä poly-A+-RNA:sta rakennettiin cDNA- • · *·;·* kirjasto ja tämä kirjasto seulottiin puhdistetusta GDNF:stä saatuun aminohapposekvenssiin perustuvalla degeneraattioli- ·"*; gonukleotidikoettimella. Tähän koettimeen hybridisoituvan • * ♦ ’ . cDNA-kloonin määritettiin DNA-sekventoinnilla sisältävän ··«·· • 9 , . 35 DNA-sekvenssejä, jotka sijaitsevat 3' degeneraattioligonuk- * * · '*·'· leotidikoettimessa käytettyihin sekvensseihin, jotka koo- 55 117556 dittivat GDNF:ssä esiintyvää aminohapposekvenssiä ja sijaitsivat karboksiterminaalisesti aminohapposekvenssiin nähden, johon seulova oligokoetin perustui.

B49-solulinjan viljelyolosuhteita kuvataan yksi-5 tyiskohtaisesti edellä esimerkissä 1. RNA:n valmistamiseksi solut kasvatettiin lähes yhteenkasvaviksi seerumia sisältävässä kasvualustassa, ne pestiin kerran kasvualustalla (DMEM), joka ei sisältänyt seerumia, ja kasvatettiin 4 päivän ajan DMEM-kasvualustassa käyttäen yhtä kasvualustan 10 vaihtoa 2 päivän jälkeen. Sitten solut otettiin talteen ja kokonais-RNA uutettiin Chomczynskin ja Sacchin menetelmällä, Anal. Biochem. 162 (1987) 156 - 159. Polyadenyloitu RNA valmistettiin tästä kokonais-RNA:sta käyttämällä se oligo-dT-selluloosa-affiniteettikolonnissa kuten kuvaavat Ma-15 niatis et ai., "Molecular Cloning", 2. painos, CSH Press, 1989.

cDNA:n synteesi suoritettiin käyttäen M-MLV-RN- ! aasi-H-käänteiskopioijaentsyymiä (Bethesda Research Lab,

Gaithersburg, MD) myyjän kuvaamien menettelyjärjestelyjen 20 mukaan. Ensimmäisen säikeen reaktio pohjustettiin oligo- . . dTis-alukkeella (Pharmacia) ja se sisälsi myös 8 yksikköä { · · ··* · RN-asiinia (Promega, Madison, WI) 5 pg poly-A+-RNA:ta koh- • · · *·*.· den. Toisen säikeen synteesiä ohjattiin EA_ colin DNA-poly- • i ·.1: meraasi-I: llä, Eh_ colin RN-aasi-H: 11a ja Eh_ colin DNA- * 25 ligaasilla (kaikki BRL:Itä) myyjän menettelyjärjestelyn mu- *:· kaan. Kloonaamisen helpottamiseksi cDNArta käsiteltiin T4- :*·*: DNA-polymeraasilla (BRL) tasaisten päiden tuottamiseksi ja se metyloitiin EcoRI-metylaaslila (BRL). Nämä vaiheet suo- . ritettiin entsyymimyyjän toimittamia menettelyjärjestelyjä * # · 30 noudattaen. Sitten cDNA:ta uutettiin kahteen kertaan yhdel- • · ‘Γ lä tilavuudella fenolin ja kloroformin l:l-seosta ja vesi- • · * V · fraktio saostettiin H tilavuudella 7,5 M NHiAc-liuosta ja 3 * » · '•S tilavuudella etanolia huoneenlämpötilassa. Sakka otettiin talteen sentrifugoimalla 15 minuutin ajan huoneenlämpöti- • · . . 35 lassa 16 000 x g:ssä, se pestiin 70-%:isella etanolilla, • · · • ·« kuivattiin tyhjössä ja uudelleensuspendoitiin 50 pl:aan 56 117556 seosta, jossa olivat pitoisuudet 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5 % PEG-8000-valmistetta ja joka sisälsi 500 pikomoolia fosforyloitua liittäjää (CCCGAATTCGGG, Pharmacia) (sekvenssi tunnusnro 9) ja 3 yk-5 sikköä T4-DNA-ligaasia (BRL). Liittäjää ligatoitiin 16 °C:ssa yön yli (noin 16 tuntia). Reaktioseosta uutettiin feno-li/kloroformilla ja se saostettiin kuten edellä. Pesty pelletti kuivattiin ja uudelleensuspendoitiin 50 pl:aan EcoRI-pilkkomispuskuria [100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl2, 50 10 mM NaCl ja 0,025 % Triton X-100 -valmistetta], johon lisättiin 400 yksikköä EcoRI:tä (New England Biolabs, Beverly, MA). Reaktioseosta inkuboitiin 37 °C:ssa 2 tunnin ajan. Sa-ostamisen jälkeen (kuten edellä) pelletti uudelleensuspendoitiin EcoRI-pilkkomispuskuriin ja toinen pilkkomiskierros 15 EcoRI:llä suoritettiin kuten edellä kuvattiin. Tämä reak-tioseos saostettiin ja uudelleensuspendoitiin 40 pl:aan 10 mM Tris-HCl:ää (pH 8,0), jossa olivat pitoisuudet 1 mM ED-TA, 100 mM NaCl. Tämä cDNA, joka nyt sisälsi EcoRI:llä pilkottuja liittäjiä, fraktioitiin koon perusteella sentrifu-20 goimalla Sephacryl-S-300 (Pharmacia) -kierrekolonnin läpi noin 1 100 x g:ssä 5 minuutin ajan. Ulosvirtausneste tästä v i.: ! kolonnista kerättiin talteen, se saostettiin etanolilla ku- * ·

V.* ten edellä ja uudelleensuspendoitiin 10 mM Tris-HCl:ään (pH

:/·: 8,0), jossa oli pitoisuus 1 mM EDTA, pitoisuudeksi noin 0,1 ·:··: 25 pg/μΐ.

··· Rakennettiin cDNA-kir jasto lambda-ZapII-kloonaus-

MM

vektoriin (Stratagene, La Jolla, CA) . Tyypillisesti 1 pg EcoRI:llä pilkottuja ja fosfataasilla käsiteltyjä vektori-varsia (jotka hankittiin valmistajalta Stratagene) ligatoi- ‘ · · 30 tiin 0,1 pg:aan EcoRI:llä pilkottuja liittäjiä sisältävää • · *“·* cDNA:ta 5 μΐ:n ligatointiseoksessa, jossa olivat pitoisuu-

ϊφί : det noin 3 Weiss-yksikköä T4-DNA-ligaasia (NEB) , 50 mM

Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5 % PEG-8000- • * · valmistetta ja 1 mM ATP. Ligatoinnit suoritettiin 16 °C:ssa * · . . 35 yön yli kestävinä. Ligatointiseokset pakattiin Gigapackll • * · 1 *: Gold -pakkausuutteisiin (jotka hankittiin Stratageneltä) 57 . .

117556 myyjän toimittaman menettelyjärjestelyn mukaan. Kirjastot maljättiin titrausta ja seulontaa varten Stratagenen toimittamalle XLl-Blue-isännälle.

Yhdestä tällaisesta ligatoinnista ja pakkauksesta 5 noin 270 000 plakin muodostavaa yksikköä saatiin maljatuksi . kaikkiaan 12 petrimaljalle, joiden halkaisija oli 150 mm.

Näistä maljoista valmistettiin kaksinkertaiset nostokopiot nitroselluloosasuodattimille Maniatiksen et ai. kuvaamien menettelyjärjestelyn mukaan. Suodattimia hybridisoitiin 10 seuraavaan 32P-leimattuun degeneraattioligonukleotidiin (sekvenssi tunnusnro 7) (I = inosiini): _ 5' > CCIGATAAACAAGCIGCIGC >3'

C G G

15 Tämä sekvenssi perustuu aminohapposekvenssiin (kuvio 8) (sekvenssi tunnusnro 1), joka saatiin puhdistetun GDNF:n aminopään (sekvenssi tunnusnro 10) ympärille kuten kuvattiin edellä esimerkissä 1:

Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala 20 Oligonukleotidi leimattiin 32P~ATP:stä (Amersham,

Arlington Heights, IL) peräisin olevalla 32P:llä käyttäen • · · ί·ϊ I T4-polynukleotidikinaasia (Pharmacia tai United States *.*.· Biochemical, Cleveland, OH) . Hybridisaatioreaktiot suori- V·· tettiin seoksessa 6X SSPE, 0,1 % SDS:ää, 0,1 mg/ml tRNA:ta "**: 25 (Sigma, St. Louis, MO) ja 2X Denhardtin reagenssi (0,4 ·»· mg/ml kutakin: Ficoll-valmiste, polyvinyylipyrrolidoni, M»i ;‘j'; BSA-fraktio-V) 50 °C:ssa yön yli kestävinä (noin 16 tun- tia) . Hybridisaatioliuos sisälsi 2 - 3 x 106 tuiketta/min . leimattua oligoa kohden millilitraa liuosta. Hybridisaation • · ♦

lii 30 jälkeen suodattimet pestiin kahdesti huoneenlämpötilassa 2X

• I

SSPEissä, jossa oli 0,1 % SDS:ää, ja kahdesti samassa liu- ·# · oksessa, joka oli esi kuumennettu 50 °C:seen. Suodattimien : annettiin kuivua ilmassa ja niitä valotettiin filmille 7 päi- vän ajan -70 °C:ssa vahvistussuotimia käyttäen.

• m . . 35 Kehitettyjä filmejä tarkasteltiin seulovaan oligo- ; · ·· , , _* * nukleotidiin hybndisoituvien plakkien identifioimiseksi.

58 117556 Tässä alustavassa seulonnassa identifioitiin 24 mahdollista positiivista kopiota. Positiivisia signaaleja vastaavat kir-jastomalja-alueet leikattiin irti, uudelleensuspendoitiin ja uudelleenmaljättiin toista seulontakierrosta varten 5 edellä yksityiskohtaisesti esitetyllä hybridisaatiomenette-lyllä. Tässä toisessa seulonnassa kahdeksan alkuperäisistä 24:stä testattiin toistamiseen positiivisiksi, kun taas 16 antoi negatiivisen tuloksen. Näitä 8 positiivista plakki-puhdistettiin 1 tai 2 lisähybridisaatiokierroksella ja kuu-10 si näistä analysoitiin sitten DNA-sekventoinnilla sen mää-rittämiseksi, sisälsivätkö ne DNA-sekvenssejä, jotka voisivat koodittaa GDNF:ää.

Lambda-ZapII-fagin kloonatut insertit sisältävää . fagemidiosaa kutsutaan nimellä pBluescript SK-. pBluescript 15 SK- -fagemidi leikattiin kustakin oligonukleotidikoettimeen hybridisoituvasta lambda-ZapII-yhdistelmä-DNA-tuotteesta.

Menettely yhdistelmä-DNA-pBluescript SK- -plasmidin leikkaamiseksi in vivo lambda-ZapII-vektorista esitetään yksityiskohtaisesti myyjän menettelyjärjestelyissä. Lyhyesti, ' 20 lambda-ZapII:n ja M13-"avustaja"-faagin yhteistartutus joh taa yhdistelmä-DNA-pBluescript-plasmidin yksisäikeisen DNA- • 1 · ί·ί : kopion pakkaukseen tartutuskykyiseen M13-virioniin. Kun · · tällainen virioni tartuttaa alttiin solun, yksisäikeinen • t :.1·· DNA muuttuu kaksisäikeiseksi DNArksi ja lisääntyy vertikaa- *:··; 25 lisesti plasmidina. Tämän tapahtuman suhteen valikoinnin - ··· mahdollistaa pBluescript SK- -plasmidiin kooditettu am- • · ♦ ♦ ;1·1. pisilliiniresistenssigeeni. Täten |b_ coli XLl-Blue -johdan- naisia, jotka sisälsivät "pelastetun" yhdistelmä-DNA- , pBluescript SK- -plasmidin kustakin 8 positiivisesta lamb- • · · VV. 30 da-ZapII-kloonista, saatiin helposti Stratagenen kuvaamia • · menettelyjärjestelyjä noudattaen ja käyttämällä lambda- ··· V ί ZapII-vektorin ohessa toimitettua "avustaja"-faagia.

: : DNA-sekventointia varten valmistettiin kaksisäikei- ·· nen plasmidi-DNA kuudesta näistä yhdistelmä-DNA-plasmidista • · . . 35 "mini-prep"-menettelyllä Birnboimin ja Dolyn, NAR 7 (1979) • · — .1 1 1513 - 1523, mukaan. DNA-sekventointireaktiot dideoksiket- ' 59 117556 jupäämenetelmällä suoritettiin käyttäen näitä templaatteja ja seulovaa oligoa alukkeena. Sekventointireagenssit saatiin valmistajalta United States Biochemical pakkauksena (Sequenase Version 2.0) ja sekventointimenettelyt suoritet-5 tiin myyjän toimittamien menettelyjärjestelyjen mukaan. Yhdelle kloonille, pBluecsript SK-76.1, joka oli peräisin kloonista lambda-ZapII76.1, saatiin seuraava sekvenssi (sekvenssi tunnusnro 11): 10 5’ > CAG AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA >3'

T AA TA T A T

Tämä sekvenssi voidaan lukea seuraavaksi aminohapposekvenssiksi (sekvenssi tunnusnro 12):

Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro 15 joka sopii yhteen aminohapposekvenssin kanssa, joka määritettiin GDNF:n aminopään alueelle, joka alkaa 5 aminohappotähdettä karboksiterminaalisesti aminohapposekvenssin päähän, jota käytettiin seulovan oligon/sekventointialukkeen muodostamiseksi. Tämä tulos osoitti, että lambda-20 Zapll76.1:een sisältyvän cDNA-kloonin täytyy koodittaa osaa t # B49-soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta puh- • · · *·ϊ ϊ distettua GDNF-proteiinia tai sitä kokonaisuudessaan.

• 9 • · f *.*.* B. cDNA-kloonin Iambda-Zapll76.1 sen alueen nukleo- • · :,*·· tidisekvenssi, joka sisältää GDNF:n koodaussekvenssin 9 •”*i 25 Määritettiin cDNA-kloonin 5'-pään ensimmäisten 877 ··· emäsparin nukleotidisekvenssi. Tämän alueen todettiin si- • •99 ·*;*; sältävän 227 aminohapon avoimen lukualueen (ORF) , joka si- 9 sältää puhdistetun GDNF:n aminopäälle saadun aminohappose-, kvenssin ja sekvenssin, joka on yhtäpitävä puhdistettua 9 9 9 30 GDNF:ää pilkkomalla saatuun sisäiseen peptidiin nähden.

9 9 Tälle ORF:lie ennustetut karboksiterminaaliset 134 amino- ä 9 9 9 V* happoa käsittävät puhdistetulle kypsälle GDNF-proteiinille ? : : ennustetun aminohapposekvenssin. Edeltävät 93 aminohappoa tm\m* sisältävät mahdollisen ATG-aloituskodonin, jota seuraa mah- 9 9 . , 35 dollinen erityssignaalisekvenssi, ja ne sisältävät mahdol- liset proteolyyttiset prosessointikohdat proteiinin prekur- 60 117556 sori- tai "pre-pro"-muodon pilkkomiselle GDNF:n edellä esimerkissä 1 kuvatun kypsän, puhdistetun muodon muodostamiseksi.

Templaatti-DNA sekventointireaktioihin sisälsi yk-5 sisäikeiset ja kaksisäikeiset versiot pBluescript SK-76.1 -plasmidi-DNA:sta. Kaksisäikeinen DNA valmistettiin XLl-Blue (pBluescript SK-76.1) -viljelmistä "keittovalmistus"-menetelmällä [Anal.Biochem. 114 (1993) 97] ja siitä muodostettiin nauha käyttäen CsCl-tiheysgradienttia. Yksisäikei-10 nen templaatti valmistettiin tartuttamalla XLl-Blue (pBluescript SK-76.1) myyjän (Stratagene) toimittamalla "avustaja"-M13-faagilla käyttäen faagin ohessa toimitettuja oleellisia menettelyjärjestelyjä. 15 - 23 nukleotidin mittaiset yksisäikeiset oligonukleotidialukkeet syntetisoitiin 15 Applied Biosystems-valmistajan (Foster City, CA) DNA-synte- :·' tisaattorilla, malli 380A, ja niitä käytettiin yleensä puh-distamattomina. Sekvenssi määritettiin käyttäen dideoksi-ketjupäämenetelmää. Käytetyt reagenssit sisältyivät Se-quenase Version 2.0 -pakkaukseen (United States Biochemi-20 cal) ja niitä käytettiin myyjän toimittamien menettelyjär- jestelyjen mukaan. 1 • · · cDNA-kloonin lambda-ZapII76.1 5’-pään ensimmäisten . | • » ί^ί 877 nukleotidin nukleotidisekvenssi, johon sisältyy puhdis- ;; tetun kypsän GDNF-proteiinin koodaussekvenssi, esitetään * * 25 kuviossa 13 (sekvenssi tunnusnro 3) tässä sekvenssissä ta-vatun 681 emäsparin avoimen lukualueen (ORF) päätellyn ami- • · · · nohapposekvenssin ohella. Puhdistettua kypsää GDNF:ää vas- i * * * taava sekvenssi alkaa asemassa 281 seriinitähteellä ja se . esitetään kuviossa 14 (sekvenssi tunnusnro 4) . Tälle alu- • · · • · · *" 30 eelle saatu DNA-sekvenssi ennustaa aminohapposekvenssin, * · ’·;·* joka on täydellisesti sopusoinnussa ensimmäisten 23 tähteen : Γ; kanssa puhdistetun GDNF:n aminopäässä havaitussa aminohap- i ' ,s posekvenssissä (katso esimerkki 1) .

• · · * . Kuviossa 13 esitetyn geenin analyysin perusteella ····*- . 35 on todennäköistä, että GDNF tulee aluksi luetuksi pre-pro- • · · *· GDNF-polypeptidinä ja että tämän molekyylin signaalise- 61 117556 kvenssin ja "pro"-osan proteolyyttinen prosessointi johtaa . . GDNF:n sen muodon tuotantoon, joka puhdistetaan B49-soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta. Todennäköisin kohta tällaisen pre-pro-muodon translaation aloitukselle on 5 ATG-kodoni, joka esiintyy asemassa 50 kuvion 13 mukaisessa sekvenssissä (sekvenssi tunnusnro 3).

C. GDNFrää koodittavan ihmisgeenin kloonaaminen Monien neurotrofisten tekijöiden aminohapposekvenssit ovat hyvin säilyviä kautta laajan valikoiman nisäkäsla-10 jeja [Hallbook et ai., Neuron 6 (1991) 845 - 858; McDonald et ai,, BBA (1991, painossa)]. Seurauksena aminohapposekvenssien säilymisestä esiintyy näitä proteiineja koodattavien geenien nukleotidisekvenssien huomattavaa säilymistä.

Tämän vuoksi pitää yleensä ottaen paikkansa, että neurotro-15 fista tekijää yhdessä nisäkäslajissa koodattava geeni voi sopivissa juottamisolosuhteissa ristihybridisoitua (eli muodostaa stabiilin kaksisäikeisen DNA-hybridin) geenien kanssa, jotka koodattavat tuota tekijää muissa nisäkäslajeissa. Tätä ominaisuutta käytettiin GDNF-geenin sisältävi-20 en kloonattujen ihmis-DNA-segmenttien identifioimiseksi.

Vektoriin lambda-FIXII rakennettu ihmisgenomikir-: jasto hankittiin valmistajalta Stratagene (kataloginro * · 946203) ja se seulottiin käyttäen GDNF:n edellä esimerkissä :#\j 2B kuvatusta rotta-cDNA-kloonista (pBluescript SK-76.1) pe- *:··· 25 räisin olevaa 32P-leimattua koetinta. Koetin koostui noin .j. 250 ep:stä kypsän GDNF:n koodaussekvenssiä ja se saatiin * * · · spesifisesti monistamalla käyttäen polymeraasiketjureaktio- • e·.4, ta [Saiki et ai., Science 230 (1985) 1350] seuraavasti. 50 . ui:n tai 100 ui:n PCR-reaktio suoritettiin käyttäen alle 1 * · · 30 ng lambda-ZapH7 6.1-DNA:ta templaattina ja 10 - 20 pmol • * *·;·* kumpaakin kahta sekvenssiin rotta-GDNF: stä perustuvaa oli- :T: gonukleotidialuketta. Yksi oligo oli "seulova oligo" (ku- tustaan myös DHD-21:ksi), jota kuvataan edellä esimerkissä • * · ' * . 2A, kun taas toisen oligon (DHD-26) (sekvenssi tunnusnro 35 13) sekvenssi oli: • · • · · • · · • · y 117556 62 ' ' .¾ 5’ > AAATTTTTTAAIATTTTATC > 3’

GG C G C G

joka perustuu aminohapposekvenssiin (Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-

Asn-Leu) (sekvenssi tunnusnro 14), joka saatiin GDNF:ää 5 pilkkomalla tuotetusta sisäisestä peptidistä (katso esimerkki 1). Reaktio suoritettiin 10 mM Tris-HCl:ssä (pH 8,3 ;> 25 °C:ssa), jossa olivat pitoisuudet 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 10 pg/ml BSArta (Promega R3961), 0,2 mM kutakin dNTP:tä (Pharmacia), ja käyttäen 2,5 - 5 μ Polymerase-val-10 mistetta (USB). Reaktio käsitti 30 seuraavaa sykliä: 95 °C 1 minuutin ajan, 44 °C 1,5 minuutin ajan ja 72 °C 1,5 minuutin ajan. Tämän reaktion tuotteen kooksi havaittiin agaroosigeelielektroforeesilla noin 250 ep, mikä sopii yhteen kahden alukkeen asemien kanssa kuviossa 13 esite-15 tyssä cDNA-sekvenssissä. Tämä ei-leimattu fragmentti eluoitiin geelistä sentrifugoimalla Ultrafree-MC Filter Unit -laitteella (Millipore, Bedford, MA) myyjän menettely] ärjestelyjä noudattaen, ja sitä käytettiin templaattina myöhemmissä PCR-leimausreaktioissa käyttäen samoja kahta 20 oligoaluketta. Nämä reaktiot suoritettiin identtisissä olosuhteissa lukuun ottamatta, että ei-leimatun dCTP:n pi- t : .·. toisuus laskettiin arvoon 12,5 μΜ ja reaktioon lisättiin * * * t*V pitoisuus 2,5 μΜ 3 000 - 5 000 Ci/mmol a-32P-dCTP (Amer- * * * sham). Leimausreaktiotuotteet käytettiin BioSpin 6-kier- • · · * ; 25 rekolonnissa (BioRad, Richmond, CA). Ulosvirtausnestettä tästä kolonnista käytettiin koettimena ihmisgenomikirjaston II* • ••I seulomiseksi.

* * * V* Kirjasto maljattiin käyttäen Stratageneltä saatua E. coli -kantaa PLK17. Valmistettiin 24 petrimaljaa, joista 30 kunkin halkaisija oli 150 mm ja joista kukin sisälsi noin 50 000 plakkia. Kustakin maljasta valmistettiin kaksinker- * · · .h täiset nostokopiot nitroselluloosasuodattimille Maniatiksen • * · .

et ai., suora, kuvaamien menettelyjär jestelyjen mukaan. Nä- • *···* mä 48 suodatinta seulottiin määrällä 250 x 106 tuiketta/min *:*·: 35 edellä kuvattua PCR-koetinta (joka denaturoitiin käsittele- ;*·.· mällä 0,5 N NaOH-liuoksella) 250 mlissa seosta 6X SSPE, 0,1 • · 117556 63 % SDS:ää, 2X Denhardtin reagenssi, 0,1 mg/ml tRNAtta ja 30 % formamidia (USB), 42 °C:ssa yön yli (noin 16 tuntia).

Sitten suodattimet pestiin kahdesti 250 ml:ssa 2X SSPE:tä, jossa oli 0,1 % SDS:ää, huoneenlämpötilassa ja kahdesti 1,6 5 litrassa 0,1X SSPE:tä, jossa oli 0,1 % SDS:ää ja joka oli esikuumennettu 50 °C:seen. Suodattimien annettiin kuivua huoneenlämpötilassa ja niitä valotettiin filmille 6 päivän ajan -70 °C:ssa vahvistussuotimia käyttäen. Filmit kehitettiin ja arvosteltiin. Havaittiin 6 voimakkaasti positiivis-10 ta kopiota. Positiivisia signaaleja vastaavat alueet leikattiin kirjastomaljoista, uudelleensuspendoitiin ja uudel-leenmaljättiin toista seulomiskierrosta varten edellä yksityiskohtaisesti esitetyllä hybridisaatiomenettelyllä. Kaikki kuusi testattiin toistamiseen positiivisiksi ja niitä 15 plakkipuhdistettiin suorittamalla yksi ylimääräinen maljaa-mis- ja hybridisaatiokierros.

Alan taitajalle on rutiiniluonteinen menettely ala-kloonata ja sekventoida koettimeen hybridisoituvaa aluetta ympäröivä DNA-segmentti ja siten määrittää kokonaisuudes-20 saan ihmis-GDNF-geenin sekvenssi tai osa siitä. Jos ihmis- GDNF-geeni kokonaisuudessaan ei esiinny näissä klooneissa, ; • .*. on samoin rutiiniluonteista "kävellä" genomia pitkin ja • · · · kloonata tätä aluetta ympäröivät limittyvät DNA-segmentit • · · ‘ .·, ♦ geenin mahdollisesti jäljellä olevan osan saamiseksi ja • * · l 25 sekventoimiseksi.

····· • · . Edellä mainittuja menettelyjä ja lukuisia erilaisia »·· *“j muita menettelyjä, jotka olisivat alan taitajalle ilmeisiä, • · · ’·* * voitaisiin soveltaa muiden ihmisgeenikirjastojen seulomi- seksi. Esimerkiksi käyttäen edellä kuvattua koetinta ja 30 hybridisaatiomenettelyä seulottiin ihmis-cDNA-kirjasto, jo- • * · ka oli rakennettu ihmisen aivojen linssitumakkeen tummem- ,···, masta ulkokerroksesta uutetusta poly-A+-RNA: sta. Tämä kir- • · · ' jasto, joka sisältyi kloonausvektoriin lambda-gtlO, hankit-"* tiin Clontech-valmistajalta (Palo Alto, CA) (kataloginro 35 HL1092a, erä nro 1561). Tämä kirjasto maljättiin (yhteensä noin 250 000 plakkia) E_^ coli -kannalle LE392 (Maniatis et 64 * 1 1 7556 ai., supra) tiheydeksi noin 20 000 plakkia/ malja ja seu- ,4 lottiin hybridisoimalla edellä kuvatuissa olosuhteissa. .p

Hybridisaation jälkeen suodattimet pestiin kahdesti huoneenlämpötilassa 0,2X SSPE:ssä, jossa oli 0,1 % SDS:ää, ja 5 kahdesti 0,1X SSPE:ssä, jossa oli 0,1 % SDS:ää ja joka oli ; esikuumennettu 50 °C:seen. Suodattimet kuivattiin ilmassa huoneenlämpötilassa ja valotettiin filmille. 3 päivän valo-tuksen 70 °C:ssa jälkeen vahvistussuotimia käyttäen filmit kehitettiin ja identifioitiin 8 positiivista kopiota.

10 Kuusi lambda-FIXII-kloonia identifioitiin ihmis- genomikirjastosta hybridisoimalla rotta-GDNF-koettimeen ja plakkipuhdistettiin homogeenisiksi (katso edellä). Lysaat-teja kustakin faagista valmistettiin Sambrookin et ai. menetelmällä ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 15 1989). Näistä klooneista valmistettiin DNA seuraavalla me nettelyllä: DN-aasi-I:tä (Pharmacia) ja RN-aasi-A:ta (Sigma) lisättiin 5 ml:aan kutakin viljelmää loppupitoisuuteen 1 ug/ml. Liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan. Sitten lisättiin 5 ml 20-%:ista polyetyleeniglykoliliuosta 20 (Sigma), joka sisälsi pitoisuuden 2 M NaCl, ja liuosta inkuboitiin 0 °C:ssa 1 tunnin ajan. Lambda-faagi pelletoitiin • sentrifugoimalla 12 000 x g:ssä 10 minuutin ajan. Faagipel-*»· · •V. letti uudelleensuspendoitiin 250 pl:aan TE:ta (10 mM Tris, • · ; pH 7,4, 1 mM EDTA) ja uutettiin peräkkäin samalla tilavuu- • «· • · 25 della seuraavia: a. kloroformi; b. fenoli; c. kloroformin * · . ja fenolin l:l-seos; ja d. kloroformi. Ammoniumasetaattia • · · ^ *.*.*’ lisättiin loppupitoisuuteen 0,25 M ja DNA saostettiin li- * * · **' * säämällä 2 tilavuutta etanolia ja sentrifugoimalla 10 000 x g:ssä. DNA-pelletti uudelleensuspendoitiin TE:hen.

30 DNA:ta kustakin kuudesta lambda-isolaatista pilkot- • · · tiin eri restriktioendonukleaaseilla ja fragmentit erotet- tiin elektroforeettisesti agaroosigeelissä (Sambrook et ,··*. ai.) . DNA-f ragmentit siirrettiin kahdelle identtiselle • · ’·* nailonmembraanille (Schleicher & Schuell) ja hybridisoi- • * 35 tiin radioleimattuihin koettimiin rotta-GDNF:stä. Rotta- * · ·.**: GDNF:ssä on EcoRI-kohta nukleotidien 356 - 357 välissä 117556 ; 65 ' :ί> (noudattaen kuvion 13 numerointia). Tällöin pilkkominen tapahtuu kypsän GDNF:n koodaussekvenssin alueella. Sen määrittämiseksi, onko ihmisgenomi-GDNF-klooneissa kohta homologisessa asemassa, EcoRI:tä käytettiin yhtenä res-5 triktioendonukleaaseista ihmiskloonien pilkkomiseksi. Spesifisiä radioleimattuja koettimia valmistettiin geeni-alueille joko ylävirtaan (koetin 1) tai alavirtaan (koetin 2) rotta-GDNF:n EcoRI-kohdasta. Koetin 1 oli 268 ep:n pituinen ja se koostui 14 ep:stä rotta-GDNF:n 5'-ei-luettua 10 sekvenssiä ja 254 ep:stä koodaussekvenssiä (aminohapot 1 -85). Se valmistettiin monistamalla lambda-ZapII76.l-DNA:ta käyttäen polymeraasiketjureaktiota ja oligonukleotidialuk-keita PD1 (GACGGGACTCTAAGATG) (sekvenssi tunnusnro 15) ja DHD23 [GCIGCIGC(C/T)TG(T/C)TT(A/G)TCIGG] (sekvenssi tun-15 nusnro 16). Reaktio-olosuhteet koettimen valmistamiseksi ovat edellä kuvatun mukaiset lukuun ottamatta, että reak- j tio käsitti 30 seuraavaa sykliä: 95 °C 1 minuutin ajan, 50 °C 1,5 minuutin ajan ja 72 °C 1,5 minuutin ajan. Koetin 2 oli 195 ep:n pituinen ja se koostui 17 nukleotidistä 20 rotta-GDNF:n 3'-ei-luettua sekvenssiä ja 178 ep:stä koodaussekvenssiä (aminohapot 153 - 211). Se valmistettiin • ·*; käyttäen polymeraasiketjureaktiota ja oligonukleotidialuk- * · · * keitä LF2 (CGAGACAATGTACGACA) (sekvenssi tunnusnro 17) ja : PD2 (CTCTGGAGCCAGGGTCA) (sekvenssi tunnusnro 18) ja lambda- • · · 25 ZAPII76.1:tä DNA-templaattina. Reaktio-olosuhteet olivat • · . samat kuin koett i nielle 1.

• · · "*; Viidelle kuudesta lambda-kloonista saatiin identti- • · φ *·* set hybridisaatiokuviot. Koetin 1 hybridisoitui noin 700 ep:n EcoRI-fragmenttiin ja koetin 2 hybridisoitui noin 30 2,8 ke:n EcoRI-fraqmenttiin. Se seikka, että kaksi koetinta ··* ϊ,.,ί hybridisoitui kahteen eri EcoRI-DNA-fraqmenttiin, viittasi voimakkaasti siihen, että ihmis-GDNF-geeni sisältää homolo- • ♦ · gisen EcoRI-kohdan. 700 ep:n ja 1,8 ke:n EcoRI-fragmentit • · *Γ alakloonattiin erikseen pBluescript SK- -plasmidiin (Stra- 35 tagene) . Näiden kahden fragmentin nukleotidisekvenssit mää- i *·ί ritettiin kuten kuvattiin esimerkissä 2B. Näiden DNA- • · ! : 66 117556 fragmenttien sekvenssi esitetään kuviossa 19 (sekvenssi tunnusnro 5). Sekvenssin perusteella on selvää, että introni edeltää pre-pro-GDNF:n aminohappoa 52. Siinä geeniosas-sa, joka koodittaa kypsää ihmis-GDNF:ää, ei ole intronia. : 5 Kypsän ihmis-GDNF:n ennustettu aminohapposekvenssi on ;? 93-%:isesti homologinen kypsään rotta-GDNF:ään nähden. Tämä on suunnilleen sama aminohapposekvenssihomologian aste, joka tavataan rotta- ja ihmisproteiinien välillä muille neu-rotrofisille tekijöille [rotta- ja ihmis-CNTF:n välinen 10 aminohapposekvenssihomologia on 83 %; McDonald et ai., BBA (1991, painossa); rotta- ja ihmis-NGF:n välinen aminohapposekvenssihomologia on 95 %, BDNF:n kohdalla vastaava arvo ( on 100 % ja NT-3:lla 100 %; Hallbook et ai., Neuron 6 a (1991) 845 - 855] .

15 Täydellisen ihmis-pre-pro-GDNF-sekvenssin saamisek si voidaan valmistaa radioleimattu hybridisaatiokoetin ihmis-GDNF: n jo saadun sekvenssin perusteella ja tätä voidaan käyttää ihmis-cDNA-kirjastojen seulomiseksi. Koska cDNA:t ovat kopioita prosessoidusta mRNA:sta, introneja ei ole 20 läsnä ja voidaan saada täydellisen koodaussekvenssin sekvenssi. Vaihtoehtoisesti, nyt kun intronin asema suhteessa • ·*· koodaussekvenssiin tunnetaan, rotta-cDNA-kloonista voidaan valmistaa sekvensseille intronista ylävirtaan spesifinen • * ,·. ; hybridisaatiokoetin ja tätä koetinta voidaan käyttää geno- • ·· | 25 mikirjaston seulomiseksi 5'-eksonin (5'-eksoneja) sisältä- * · , vien kloonien suhteen.

··· • _ **·· D. Ihmisen pre-pro-GDNF:n ensimmäisiä 50 aminohap- • · ; *»* * poa koodittava nukleotidisekvenssi

Kuten esitettiin yksityiskohtaisesti esimerkissä ..j • .> 30 2C, löytyy introni, joka jakaa ihmisen pre-pro-GDNF:n ami- ··· nohappoa 51 vastaavan nukleotidisekvenssin. Molekyylin tä-män osan sekvenssin saamiseksi ihmisgenomikirjasto seulot- • φ · .···. tiin rotta-pre-pro-GDNF:n aminopään koodaussekvenssistä pe- • * *Γ räisin olevalla koettimella ja yksi hybridisoituva klooni ***** 35 sekventoitiin ja sen osoitettiin sisältävän ihmisen pre- • · • ♦ · • i· • · 117556 67 pro-GDNF:n aminohappojen 1-50 koodaussekvenssin kuviossa 22 esitetyn mukaisesti (sekvenssi tunnusnro 8). , ' Tätä kirjastoseulontaa varten syntetisoitiin PCR-koetin kuten kuvattiin esimerkissä 2C. Käytetyt oligonukle- ; 5 otidialukkeet olivat: ;; PD1 = 5' > CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG > 3' (sekvenssi tunnusnro 19) LFA = 5' > CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC > 3' (sekvenssi tunnusnro 20) 10 PCR-reaktioiden (sekä "kylmien" että 32P-leimattujen) olosuhteet olivat esimerkissä 2B kuvatun mukaiset lukuun ottamatta, että reaktio käsitti 25 tai 30 seuraavaa sykliä: 95 °C 1 minuutin ajan, 50 °C 1,5 minuutin ajan ja 72 °C 1 minuutin ajan. Tämän reaktion tuote sisältää ensimmäiset 15 122 ep rotta-pre-pro-GDNF:n koodaussekvenssistä ja 14 emäs- paria 5' oletettuun ATG-aloituskodoniin nähden (katso kuvio 13 ja sekvenssi tunnusnro 3). Olosuhteet ihmisgenomikirjas-ton seulomiseksi tällä koettimella olivat esimerkissä 2C kuvatun mukaiset. Samoja suodatinnostokopioita kuin joita 20 käytettiin sekvenssejä kypsälle ihmis-GDNF:lie käsittävien kloonien identifioimiseksi, pestiin kahdesti 15 minuutin . ^ ; ajan kiehuvaksi kuumennetulla deionisoidulla, tislatulla • · · · H20:lla, seulottiin yön yli ja pestiin noudattaen esimer- • · · kissä 2C kuvattua menettelyjärjestelyä. Suodattimia valo- • *· 25 tettiin filmille 3 päivän ajan -70 °C:ssa vahvistussuotimia • · . käyttäen. Kehityksen jälkeen havaittiin lukuisia positiivi- • · · "·· siä kopioita, joiden intensiteetit vaihtelivat. 12 suhteel- • * · *·* lisen voimakasta positiivista noukittiin talteen ja 10:ta näistä plakkipuhdistettiin toisiaan seuraavilla hybridisaa-30 tiokierroksilla seulomisolosuhteissa.

• · ·

Kloonatut DNA:t näistä yhdistelmä-DNA-faageista analysoitiin Southern blot -hybridisaatiolla. Noin 1 000 • · · .···. ep:n Alul-fragmentin todettiin hybridisoituvan seulomis- • · *Γ koettimeen ja se alakloonattiin Smal:llä pilkottuun ·**· 35 pBluescript SK- -plasmidiin, jolloin saatiin pBSSK-lambda- • · 3AluI. Tämä kloonattu Alul-fragmentti alakloonattiin edel- ••3 117556 68 leen oleellisen DNA-segmentin sekventoinnin helpottamiseksi. Puhdistettua pBSSK-lambda-3AluI-DNA:ta pilkottiin sarjalla restriktioentsyymejä, jotka pilkkovat vektorin vain kerran (polyliittäjäalueelta) ja pilkkomistuotteet analy-5 soitiin elektroforeettisesti agaroosigeelissä. Täten identifioitiin kaksi restriktioentsyymiä (PstI ja Sacl), jotka pilkkoivat kerran kloonatun DNA:n alueella. Kuviossa 22 esitetään kartta SacII- ja Pstl-kohdista. Southern blot -analyysit paljastivat, että kloonatun segmentin seulovaan 10 koettimeen hybridisoituva alue sijaitsi kloonatun AluI-segmentin SacII- ja Pstl-kohtien välissä. Tämän vuoksi sek-ventointia varten rakennettiin pBBSK-lambda-3AluI:n kaksi deleetiojohdannaista. Yhdessä tapauksessa pieni, noin 300 ep:n Pstl-fragmentti deletoitiin seuraavasti: plasmidia 15 pilkottiin PstI:llä ja pilkkomistuote ligatoitiin ja transformoitiin E_;_ coliin. Trans formant it seulottiin niiden suhteen, joista puuttui pieni Pstl-f ragmentti. Rinnan 300 ep:n i;

SacII-fragmentti deletoitiin vastaavalla tavalla pBSSK-lambda-3AluI:stä toisen deleetiojohdannaisen tuottamiseksi.

20 Näitä kahta deleetioplasmidia käytettiin templaatteina sek- 1 ventointireaktioissa. Sekventointi suoritettiin kuten kuva-' .*· taan esimerkissä 2B.

• · · - - y- • · · *

Kuviossa 22 (sekvenssi tunnusnro 8) esitetään 233 * · * • · ; emäsparia näin saadusta sekvenssistä. Tämä sekvenssi sisäl- • ·· ^ j 25 tää 151 ep:n alueen, joka osoittaa hyvin korkea-asteista • · , homologiaa rotan pre-pro-GDNF:n koodaussekvenssin ensimmäi- ··· "*j siin 151 ep:hen nähden; identtisyys on 88 % aminohappota- » · · *·* ’ solia ja 95 % DNA-tasolla. Tämän vuoksi päätellään, että tämä alue on osa eksonista, joka käsittää ihmisen pre-pro-30 GDNF:n aminopään 50 tähteen koodaussekvenssiin ja ensimmäi- • · « sen nukleotidin tähteen 51 kodonista. Sekvenssi, joka si- ,···. jaitsee välittömästi 3' tähän 151 ep:n sekvenssiin nähden, • ♦ · · on homologinen konsensussekvenssiin nähden nisäkäsintronien *Γ 5'-päälle [Shapiro ja Senapathy, Nucl Acids Res. 15 (1987) > ***** 35 7155 - 7174]. Sekvenssi, joka sijaitsee välittömästi 5' « · i#*.j oletettuun ATG-aloituskodoniin nähden, osoittaa voimakasta . - ? .

. : 69 117556 homologiaa rottasekvenssiin nähden 28 ep:lle; 27 28 tähteestä on identtistä. Tässä kohdassa ylävirtasekvenssi poikkeaa jyrkästi. Poikkeamiskohtaa ympäröivä sekvenssi osoittaa huomattavaa homologiaa konsensussekvenssiin nähden ni-5 säkäsintronien 3'-päälle (Shapiro ja Senapathy, supra). Täten vaikuttaa todennäköiseltä, että tämä on silmukoitumis- ; kohta, vaikkakaan tästä ei ole suoria todisteita. Ihmisen pre-pro-GDNF:n sisältävä avoin lukualue jatkuu ainakin 27 emäsparia ylävirtaan ATG-aloituskodonista. Kuten esitetään 10 edellä kohdassa, jossa kuvataan yksityiskohtaisesti edullisia suoritusmuotoja, on mahdollista, että voitaisiin tuottaa muita pre-pro-GDNF:n muotoja, jotka sisältäisivät ylävirran lisäaminohappoja. Nämä muodot saatettaisiin myös prosessoida siten, että muodostuisi se kypsä GDNF-molekyy-15 li, joka on puhdistettu ja sekventoitu (katso esimerkki 1).

Tässä ja esimerkissä 2C esitetyt nukleotidisekvens- v sit sisältävät täydellisen koodaussekvenssin ihmis-pre-pro- GDNF:lie, joka osoittaa laajaa homologiaa rotta-pre-pro- GDNF:ään nähden, joka on menestyksekkäästi ilmennetty nisä- i 20 kässoluissa (katso esimerkki 5) aktiivisen rotta-GDNF:n tuottamiseksi. e ··*·.. Esimerkki 3 • · · · GDNF:n käyttö kokeellisen parkinsonismin estämisek- j • · .·. : si • t · 25 Tässä esimerkissä kuvataan menetelmiä kokeellisen * · . parkinsonismin synnyttämiseksi apinoissa antamalla eläimil- * * * "" le tarkoituksenmukaisesti hermomyrkkyä MPTP (l-metyyli-4- • · · *·’ fenyyli-1,2,3,6-tetrahydropyridiini). Siinä kuvataan samoin menetelmiä GDNF:n antamiseksi MPTP:lie altistuneille eläi- ·.·,· 30 mille parkinsonismin kehittymisen lievittämiseksi tällai- · * ϊ : sissa eläimissä.

• · * A. GDNF:n antaminen apinoille, joille on annettu • · · ,···, MPTPitä kokeellisen parkinsonismin tuottamiseksi * · T* Ruostumattomasta teräksestä valmistettu kanyyli *"*; 35 voidaan istuttaa oikeaan sivuaivokammioon ja yhdistää ihon • * :,'*i alle istutettuun osmoottiseen minipumppuun (Alzet 2002).

117556 70

Minipumppu sisältää GDNF:ää vaihtelevina pitoisuuksina tai sen laimenninta negatiivisena verrokkina. Pumppu kuljettaa 0,5 μΐ tunnissa 14 päivän ajan. Kahden päivän kuluttua kanyylin ja pumpun istuttamisesta apinoille (Cebus apella) 5 annetaan ruiskeena 0,6 mg/kg MPTP:tä oikeaan päänvaltimoon.

Kuuden viikon kuluttua alkuperäisestä istuttamisesta eläimet perfusoidaan suolaliuoksella ja aivot poistetaan nopeasti. Aivot leikataan jäissä ja kudosstansseja poistetaan aivojen häntätumakeytimestä ja aivojen linssitumakkeen tum-10 memmasta ulkokerroksesta. Aivojen mustatumake sijoitetaan kiinnitteeseen. Häntätumake-linssitumakekudoksesta analysoidaan HPLC-EC:llä dopamiini, aivojen mustatumake prosessoidaan tyrosiinihydroksylaasi (TH) -immuunireaktiivisuutta varten. ϊ 15 B. GDNF:n tehokkuus

Aivoreisien välissä olevan harmaan aineen massan dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen ja niiden ak-sonaalisten projektioiden häntä/linssitumakkeeseen rappeutuminen aiheuttaa kokeellista parkinsonismia tässä apina-20 mallissa. Löytyy lukuisia kokeellisia osoituksia siitä, että GDNF voi estää tämän hermosolujen rappeutumisen tai vä- • :*; hentää sen voimakkuutta. Esimerkiksi GDNF voi estää TH- .*.*. positiivisten hermosolurunkojen menetyksen aivojen mustatu- 1 • · v" ; makkeessa. Tämä viittaa siihen, että GDNF säästää aivo- 1 * · · 25 reisien välissä olevan harmaan aineen massan dopamiinivai- ' • · . kutukseen liittyvät hermosolut MPTP:n myrkyllisiltä vaiku- "" tuksilta. GDNF saattaa samoin estää TH-positiivisten kuitu- • · * *·* ‘ jen menetyksen häntä/linssitumakkeessa. Tämä viittaa sii hen, että GDNF säästää aivoreisien välissä olevan harmaan 30 aineen massan dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen • · · ·...! aksonaaliset projektiot MPTP:n myrkyllisiltä vaikutuksilta.

«

GDNF saattaa myös estää dopamiinisisällön menetyksen hän- G

• · · ··· tä/linssitumakkeessa. Tämä viittaa siihen, että GDNF: n a k- φ r - • · T sonien ja niiden dopamiinisisällön MPTP:n myrkyllisiltä 1 35 vaikutuksilta säästäminen ulottuu aivoreisien välissä ole- • · · · • · · • ♦ 117556 71 ·. t . $ van harmaan aineen massan dopamiinivaikutukseen liittyvistä hermosoluista häntä/linssitumakkeeseen.

Esimerkki 4 GDNF:n biologisia aktiivisuuksia ja mahdollisia , ' 5 kliinisiä indikaatioita

Puhdistettu GDNF lisää dopamiinin ottoa dopamiinivaikutukseen liittyviin hermosoluihin, jotka ovat alkion keskiaivohermosolujen viljelmissä sekä runsaasti ravinteita sisältävässä että määritellyssä kasvualustassa kuten osoi-10 tettiin esimerkissä 1. Tämä osoittaa, että GDNF on neuro-trofinen tekijä näille dopamiinivaikutukseen liittyville hermosoluille. Sellaisena GDNF saattaa osoittautua käyttökelpoiseksi näiden hermosolujen Parkinsonin taudissa tapahtuvan rappeutumisen hoidossa. Lisäksi GDNF saattaa osoit-15 tautua käyttökelpoiseksi aivojen muiden dopamiinivaikutukseen liittyvien hermosolujen virheellisen toiminnan hoidossa. Tällaista virheellistä toimintaa saattaa esiintyä skit- . sofreniassa ja muissa hoitoa neurolepteillä edellyttävissä sairauksissa.

20 A. Puhdistettu GDNF edistää parasympaatti s ten ja sympaattisten hermosolujen eloonjääntiä viljelmässä • 1. Hermosolujen eloon jäännin määrittäminen *»· t ·1.'· Materiaalit • · · • 1 : 3-[4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-difenyylitetrat- • · · 25 soliumbromidi (MTT) saatiin valmistajalta Sigma Chemical • 1 . Co.; St. Louis, Missouri. Vasikansikiöseerumi hankittiin • · · *;;1 valmistajalta Hyclone Laboratories, Logan, Utah. Kasvualus- • 1 · ’·1 1 tat ja suolaliuokset saatiin valmistajalta Irvine Scienti fic, Santa Ana, Kalifornia. Viljelymaljat saatiin valmista- \·,· 30 jalta Costar, Cambridge, Massachusetts. Käyttöluokan pato- • · 1 ί,##ί geeneistä vapaita hedelmällisiä kanan alkion munia saatiin .···, yritykseltä Spafas, Roanoke, Illinois.

• » · Määritys t · *;1 Kananpojan alkion säteittäisten hermosolmujen ja :t*.j kuten aiemmin on kuvattu [Collins, Develop. Biol. 65 (1978) :**: 35 sympaattisen ketjun hermosolmujen viljelmiä valmistettiin : 72 117556 50; Manthorpe et ai., Develop. Brain Res. 25 (1986) 191].

Lyhyesti, säteittäisiä tai sympaattisia hermosolmuja poistettiin hedelmällisistä, patogeeneistä vapaista kananmunista, joita oli inkuboitu 8 ja vastaavasti 10 päivän ajan 5 38 °C:ssa kostutetussa ilmakehässä. Hermosolmut erotettiin toisistaan kemiallisesti käsittelemällä ensin Hankin tasa-painoitetulla suolaliuoksella, joka ei sisältänyt kaksiva-lenssisia kationeja mutta sisälsi pitoisuuden 10 mM HEPES-puskuri, pH 7,2, 10 minuutin ajan 37 °C:ssa, ja käsittele-10 mällä sitten 0,125-%:isella baktotrypsiiniliuoksella 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) Hankin, kuten edellä, modifioidussa tasapainoitetussa suolaliuoksessa 12 minuutin ajan 37 °C:ssa. Trypsinointi keskeytettiin lisäämällä vasikansi-kiöseerumia loppupitoisuuteen 10 %.

15 Tämän käsittelyn jälkeen hermosolmut siirrettiin liuokseen, joka koostui Dulbeccon runsaasti glukoosia sisältävästä modifioidusta Eagle-kasvualustasta, joka ei si-

sältänyt bikarbonaattia mutta sisälsi 10 % vasikansikiösee- L

rumia ja pitoisuuden 10 mM HEPES, pH 7,2, ja erotettiin me- t 20 kaanisesti toisistaan trituroimalla noin 10 kertaan lasisen !i pasteurpipetin läpi, jonka aukko oli viimeistelty liekittä- • .*. mällä ja vedetty sellaiseen halkaisijaan, että pipetin t **· « täyttäminen kesti 2 sekuntia.

* · .·, · Toisistaan erotetut hermosolmut maljättiin sitten • * · 25 kasvualustaan (Dulbeccon modifioitu Eagle-kasvualusta, jota • ♦ . oli täydennetty 10 %:lla vasikansikiöseerumia, pitoisuuk- * · ·

silla 4 mM glutamiini, 60 mg/litra penisilliini-G:tä, 25 mM

* * · *** * HEPES, pH 7,2) kudosviljelymaljoissa, joiden halkaisija oli 100 mm (40 toisistaan erotettua hermosolmua maljaa kohden) * 30 3 tunniksi. Tämä esimaljaus suoritettiin maljaan tarttuvien ··» ϊ#>ιί ei-hermosolujen erottamiseksi ei-tarttuvista hermosoluista.

.···. 3 tunnin kuluttua ei-tarttuvat hermosolut otettiin talteen * · · sentrifugoimalla, ne uudelleensuspendoitiin kasvualustaan ja • · *" maljättiin määränä 50 μΐ/kuoppa puolelle alueelle 96-kuop- Φ 35 parsilla mikrotiitterikudosviljelylevyillä tiheydeksi 1 500 !t*.j hermosolua/kuoppa. Mikrotiitterilevykuoppia oli edeltäpäin 73 % 117556 käsitelty poly-L-ornitiinin 1 mg/ml liuoksella 10 mM natri-umboraattipuskurissa, pH 8,4, yön yli 4 °C:ssa, minkä jälkeen ne oli pesty tislatulla vedellä ja kuivattu ilmassa. i- 10 μΐ neurotrofisen aktiivisuuden suhteen määritet-5 tävän näytteen sarjalaimennosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja levyjä inkuboitiin 20 tunnin ajan 37 °C:ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 7,5 % C02:ta. 18 tunnin kuluttua säteittäisten ja 40 tunnin kuluttua sympaattisten hermosol-mujen kohdalla lisättiin 15 μΐ/kuoppa tetratsoliumvärin MTT 10 1,5 mg/ml liuosta Dulbeccon runsaasti glukoosia sisältäväs sä modifioidussa Eagle-kasvualustassa, joka ei sisältänyt bikarbonaattia mutta sisälsi pitoisuuden 10 mM HEPES, pH 7,2, ja viljelmät sijoitettiin 37 °C:seen inkubaattoriin 4 k.

tunniksi. Sitten lisättiin 75 μΐ liuosta, jossa oli 6,7 ml 15 12 N HCl:ää litrassa isopropanolia, ja kunkin kuopan sisäl töä trituroitiin 30 kertaan solujen avaamiseksi ja värin suspendoimiseksi. Absorbanssi 570 nm:ssä määritettiin suhteessa 690 nm:n verrokkiin kullekin kuopalle käyttäen auto- j maattista mikrotiitterilevylukijaa (Dynatech, Chantilly, 20 Virginia). Neurotrofista ainetta ei lainkaan vastaanottaneiden kuoppien (negatiivisten verrokkien) absorbanssi vä- • ' s • ·*; hennettiin näytteen sisältävien kuoppien absorbanssista.

♦ ·

Saatu absorbanssi on verrannollinen elävien solujen luku- i • · · -* • · .·. : määrään kussakin kuopassa, jolloin eläviksi määritellään ne • ·· 25 hermosolut, jotka kykenevät pelkistämään värin. Neurotrofi- • « , sen aktiivisuuden trofisten yksiköiden lukumääräksi määri- *** *·** teltiin sen laimennoksen käänteisarvo, joka antoi 50 % her- ♦ · ♦ *·* * mosolujen maksimaalisesta eloonjäännistä. Spesifinen aktii visuus määritettiin jakamalla trofisten yksiköiden lukumää-30 rä näytteen sisältämän proteiinin määrällä.

··· ·„/ Tulokset

Kuten esitetään kuviossa 15, puhdistettu G DNF edis- • · · tää kananpojan alkion säteittäisistä hermosolmuista peräi- • · "* sin olevien parasympaattisten hermosolujen eloonjääntiä

***** 35 viljelmässä. Kuten esitetään kuviossa 16, puhdistettu GDNF

• · ί.*·{ edistää samoin kananpojan alkion sympaattisen ketjun her- 117556 74 mosolmuista peräisin olevien sympaattisten hermosolujen eloonjääntiä viljelmässä.

Nämä tulokset osoittavat, että GDNF toimii eloon-jääntitekijänä parasympaattisille ja sympaattisille her- i 5 mosoluille. Sellaisena se saattaa olla käyttökelpoinen hermovaurion autonomiselle (eli parasympaattiselle ja sympaattiselle) hermostolle eri muotojen hoitamiseksi. Tällainen vaurio voi johtua aineenvaihduntasairauksista kuten diabeteksesta tai munuaisten vajaatoiminnasta. Tällainen vaurio 10 voi samoin seurata potilaiden hoitamisesta erilaisilla ke-moterapeuttisilla aineilla, kuten kemoterapeuttiset syöpä-J lääkkeet cis-platina ja vinkristiini tai kemoterapeuttiset aids-lääkkeet ddl ja ddC. Tällainen vaurio voi niinikään olla seurausta geneettisistä tiloista kuten autonomisen 15 hermoston sairaus. Tällainen vaurio saattaa myös olla seurausta fyysisestä vammasta.

Esimerkki 5

Yhdistelmä-DNA-GDNF:n ilmentäminen eläinsoluissa A. Yhdistelmä-DNA-plasmidien rakentaminen COS-solu-20 ilmentämiseen GDNF:n koodaussekvenssin kokonaisuudessaan sisältä- • ·*· vä noin 1,5 ke:n Smal-fragmentti pBluescript SK-76.1:stä ··· · alakloonattiin plasmidivektoriin pSG5 [Green et ai., Nucl.

• · .·, ; Acids Res. 16 (1988) 369], joka on suunniteltu kloonattujen • · · 25 geenien tilapäiseen ilmentämiseen SV40-T-antigeenin ilmen- • · . tävissä soluissa, kuten COS-solut.

*«· GDNF-cDNA:n DNA-sekvenssistä (kuvio 13) (sekvenssi • * · *·' tunnusnro 3) identifioitiin restriktioendonukleaasikartoi- tuksella Smal-fragmentti, jota rajasivat yksi Smal-kohta, 30 joka sijaitsi vektorin polyliittäjässä (18 ep 5' cDNA- • · · Σ,,.ϊ kloonin 5'-päähän), ja yksi Smal-kohta (noin 1 500 ep:n .

.···. päässä), joka sijaitsi cDNA-kloonissa noin 800 ep 3’ kypsän · t f · GDNF:n koodaussekvenssin päähän. Tämä Smal-fragmentti kloo- • · nättiin pSG5:een seuraavasti. Puhdistettua pSG5-plasmidi- ♦ 35 DNA: ta (Stratagene) pilkottiin EcoRI: llä ja käsiteltiin va- " • · ϊ,*·ϊ sikansuolen alkalisella fosfataasilla (CIAP, Promega) myy- f 117556 75 .* jän menettelyjärjestelyjä noudattaen. Sitten vektorilla suoritettiin elektroforeesi ja se eluoitiin agaroosigeelis-tä. Puhdistettu pBluescript ΞΚ-76.1-plasmidi-DNA metyloi-tiin EcoRI-metylaasilla, sitä pilkottiin Smal:llä ja se li-5 gatoitiin esimerkissä 2A kuvattuun EcoRI-liittäj ämole-kyyliin. EcoRI:llä pilkkomisen ja elektroforeesin aga-roosigeelissä jälkeen kiinnostava noin 1,5 ke:n Smal-fragmentti (nyt EcoRI-metyloituna ja -liitettynä) eluoitiin ja ligatoitiin EcoRI:llä pilkottuun ja fosfataasilla käsi-10 teltyyn pSG5-vektoriin. Ligatointituotteilla transformoitiin transformoitumiskelpoinen coli -kanta XLl-Blue

CaCl2 -menettelyä käyttäen (Maniatis et ai., suora). Valittiin ampisilliiniresistentit transformantit ja analysoitiin yhdistelmä-DNA-plasmidien suhteen restriktioendonukle-15 aaseilla pilkkoen ja agaroosigeelielektroforeettisesti.

Pilkkominen EcoRI:llä osoitti, että useimmat transformantit sisälsivät halutun insertin käsittäviä plasmideja. Pilkkomalla BamHI:llä identifioitiin kloonatun GDNF-geenin suuntaus suhteessa vektorin sisältämään SV40-promoottoriin g 20 (huomaa BamHI-kohta asemassa 15 kuvion 13 mukaisessa sekvenssissä) . Saatiin molempia suuntauksia.

• ;'· Kaksi transformanttia valittiin jatkoanalyyseihin: ··♦ » yksi sisälsi plasmidin, joka nimettiin pSG5: : rGDNF-7 : ksi ja j • ♦ .·, : joka käsitti GDNF-geenin oikein suuntautuneena sen ilmentä- • ·· • 25 miseksi SV40-promoottorista lähtöisin olevissa RNA- • t · · · ·*- . transkripteissa, kun taas toinen sisälsi plasmidin, joka ’

• M

nimettiin pSG5::rGDNF-4:ksi ja joka käsitti GDNF-geenin • · « *·* * vastakkaisesti suuntautuneena, jolloin SV40-promoottorista lähtöisin olevat RNA-transkriptit eivät ilmennä GDNFrää.

30 Kummankin näistä plasmideista puhdistetut valmisteet vai- ··· mistettiin CsCl-tiheysgradienttisentrifugoinnilla käytettä- ,···. viksi COS-soluilmentämiskokeissa. : • · * ··. B. GDNF: n ilmentäminen COS-7-soluissa • · • · *lm Näistä rakenteista valmistettiin plasmidi-DNA aika- **’*· 35 lisen lyysin menetelmällä, jota seurasi CsCl-tiheysgra- ^ • ·

J/.i dienttisentrifugointi (Maniatis et ai., supra). Tämä DNA

117556 I

76 transfektoitiin C0S-7-soluihin Sompayracin ja Dannan menetelmällä rProc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981) 7575 - i 7578], Verrokkina ekvivalenttisia COS-soluviljelmiä transfektoitiin GDNF-insertin vastakkaisesti suuntautuneena si-5 sältävällä plasmidivektori-DNA:11a, mikä ei sallisi GDNF-proteiinin ilmentymistä. 100 mm:n viljelymaljaa kohden käytettiin 30 pg lipofektiinia ja 0,3 - 1 pg plasmidi-DNA:ta.

24 tunnin transfektoinnin jälkeen kasvualusta imettiin pois ja korvattiin kasvualustalla OptiMEM I ± 3 % 10 FCS:ää. Viljelmiä inkuboitiin 48 tunnin ajan ja solut otettiin talteen seuraavasti: a) kasvualusta (käsitelty kasvualusta tai CM) imettiin pois ja varastoitiin -80 °C:seen; b) solumattoon lisättiin 5 ml PBS:ää, joka sisälsi 15 pitoisuuden 2,5 mM EDTA, ja pidettiin 25 °C:ssa 3 minuutin ajan, minkä jälkeen solut pipetoitiin pois maljalta ja niitä sentrifugoitiin 1 000 x g:ssä 5 minuutin ajan. Superna-tantti poistettiin ja solupelletit varastoitiin -80 °C:seen.

CM konsentroitiin 30-kertaisesti Centricon 10-20 konsentroijissa ja määritettiin sen bioaktiivisuus. Solu-pellettejä käsiteltiin ultraäänellä 500 pl:ssa liuosta, ϊ jossa olivat pitoisuudet 10 mM EDTA, pH 7,0, 1 mM bentsami- ' * * * # diini, 100 pM PMSF, 1 mM E-amino-N-kapronihappo. Soluly- .·,*· saatteja sentrifugoitiin 14 000 x g:ssä 5 minuutin ajan ja I 25 supernatanteista määritettiin bioaktiivisuus.

• * , C. Ilmennetyn GDNF:n biomääritys ·*· •••| Solulysaatista ja kasvualustasta COS-soluista, jot- * · · *·* * ka oli transfektoitu GDNF:n ilmentävillä plasmideilla ja ί verrokkiplasmideilla (joissa GDNF:n koodaussekvenssi oli 30 väärin suuntautunut), määritettiin sekä kyky lisätä dopa- ♦ ·· miinin ottoa keskiaivojen hermosoluviljelmissä (katso esi- .···. merkki 1) että kyky lisätä sympaattisen hermosolmun her- * * · I,. mosolujen eloonjääntiä (katso esimerkki 4) . COS-solukasvu- • · "* alusta (kuvio 17) ja -solulysaatti (tulostietoja ei ole 35 esitetty) lisäsivät dopamiinin ottoa kuten GDNF:Itä odotet- > tiin. Kuten esitetään kuviossa 18, COS-solukasvualusta ja -so- ; 77 117556 lulysaatti lisäsivät sympaattisen ketjun hermosolujen eloonjääntiä kuten GDNFrltä odotettiin.

Nämä tulokset osoittavat selvästi, että GDNF-geenin ilmentäminen eläinsolussa johtaa proteiinin tuotantoon, 5 jolla on puhdistetulle GDNFrlle osoitettuja biologisia aktiivisuuksia.

Esimerkki 6 ^

Ihmis-GDNF:n ilmentäminen EL. colissa Λ. Ihmis-GDNF:ää koodittavan plasmidin rakentaminen 10 Ihmis-GDNF-geenin sekvenssi-informaatiota (esimerk ki 2C) käyttäen valmistettiin synteettiset oligonukleotidit PD3 ja PD4 alukkeiksi ihmis-GDNF-geenin monistamiseksi ja sen ilmentämiseksi plasmidi-ilmentämisvektorista EL. colis- ' sa. Oligonukleotidien PD3 ja PD4 sekvenssit (sekvenssit 15 tunnusnro 21 ja vastaavasti 22) ovat: PD3: 5' CGCGGATCCAATAAGGAGGAAAAAAAATGTCACCAGATAAACAAAT 3' PD4: 5' CGCGGTACCCAGTCTCTGGAGCCGGA 3'

Oligonukleotidi PD3 on 46 nukleotidin mittainen. 17 nukleotidiä 3'-päässä sopivat täydellisesti yhteen ihmis-20 GDNF-geenin kanssa alueella, joka koodittaa kypsän proteiinin N-päätä. Näitä 17 nukleotidiä edeltää translaation :? • ;*; aloituskodoni, ATG, jolloin kypsän ihmis-GDNF:n synteesi * * * *

alkaa oikeasta aminohaposta EL. colissa. Muut nukleotidit on T

* * .·. : suunniteltu antamaan käyttöön muita signaaleja, jotka arvi- * ·· 25 oidaan tarpeellisiksi hyvälle ilmentymiselle EL. colissa, > • · , sekä BamHI-endonukleaasirestriktiokohdan, joka on välttämä- • Il "" tön GDNF-ilmentämisplasmidin rakentamiseksi.

• · « *·* Oligonukleotidi PD4 on 26 nukleotidin mittainen. 17 nukleotidiä 3'-päässä sopivat täydellisesti yhteen ihmis-30 GDNF-geenin 17 nukleotidin kanssa 3' lopetuskodonista. Tämä • * · oligonukleotidi antaa samoin käyttöön sekvenssejä, jotka * ovat välttämättömiä Kpnl-restriktioendonukleaasikohdan uu- * · · ,···, delleenrakentamiseksi GDNF-ilmentämisplasmidin rakentami- ‘I* seksi.

**** 35 Reaktio-olosuhteet ihmis-GDNF:n monistamiseksi ovat • · :.*·· seuraavat: kokonaisreaktiotilavuus oli 100 μΐ ja se sisälsi 78 1 1 7556 1 ng:n ihmis-GDNF-geenin sisältävää lambda-DNA-kloonia, 20 pmol kumpaakin PD3:ea ja PD4:ää, pitoisuudet 20 mM Tris-HC1, pH 8,8, 10 mM KC1, 6 mM (NH4)2S04, 1,5 mM MgCl2 ja 0,1 % Triton X-100-valmistetta. Reaktioseosta kuumennettiin 95 5 °C:ssa 5 minuutin ajan, se jäähdytettiin 44 °C:seen ja 2 yksikköä Pfu-DNA-polymeraasia (Stratagene) lisättiin. Reak-tio käsitti 30 seuraavaa sykliä: 72 °C 1,5 minuutin ajan, 95 °C 1 minuutin ajan ja 44 °C 1,5 minuutin ajan. Reaktion päätteeksi lisättiin MgCl2:ta loppupitoisuuteen 10 mM. 5 10 yksikköä DNA-polymeraasi-I:n suurta (Klenow-) fragmenttia (Promega) lisättiin ja reaktioseosta inkuboitiin 37 °C:ssa 10 minuutin ajan. Sitten lisättiin 10 μΐ 3 M NaAc-liuosta ja 220 μΐ EtOH:ta ja liuosta sentrifugoitiin 12 000 x g:ssa 15 minuutin ajan DNA:n saostamiseksi. Saostettu DNA uudel-15 leensuspendoitiin 100 pl:aan 50 mM Tris-HCl:ää (pH 8), jos sa olivat pitoisuudet 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 20 yksikköä BamHI:tä ja 20 yksikköä Kpnl:tä, ja inkuboitiin 37 °C:ssa 1 5 tunnin ajan. Oikean kokoinen DNA-fragmentti identifioitiin elektroforeettisesti agaroosigeelissä ja puhdistettiin 20 käyttäen Ultrafree-MC Filter Unit -laitetta (Millipore).

Tämä fragmentti ligatoitiin coli -ilmentämisvektoriin j .·, pT3XI-2 (jota kuvataan jäljempänä) . Ligatointiolosuhteet • · · olivat seuraavat: kokonaisreaktiotilavuus oli 5 μΐ ja se • · · I*. sisälsi 10 ng Kpnl:llä ja BamHI:llä pilkkomalla lineaari- ; * * 25 seksi tehtyä pT3XI-2-DNA:ta, 5 ng edellä kuvattua ihmis- GDNF-DNA-fragmenttia, pitoisuudet 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), - ··*' 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5 % polyetyleeniglykoli- ·*· V* 8000-valmistetta ja 1 yksikön T4-DNA-ligaasia (Bethesda Re search Laboratories). Reaktioseosta inkuboitiin 14 °C:ssa 2 t i i 30 tunnin ajan.

*··

Vektori pT3XI-2 rakennettiin seuraavalla tavalla.

• · · Lähtöplasmidi tälle rakenteelle oli plasmidi pKK223-3 (Bro- 9 · * sius ja Holy, 1984), joka hankittiin Pharmacialta. Plasmidi « · *···* pKK223-3 käsittää tetrasykliiniresistenssin osittaisen gee- * *5*" 35 nin. Tämä ei-funktionaalinen geeni korvattiin plasmidiin :*·.· pBR322 sisältyvällä täydellisellä tetrasykliiniresistenssi- 1 r 117556 79 geenillä. Plasmidi pKK223-3 pilkottiin täydellisesti Sphl:llä ja osittain BamHI:llä. 4,4 kepin fragmentti geeli-puhdistettiin ja yhdistettiin synteettiseen siltasekvens-siin (sekvenssi tunnusnro 23): > 5 5' GAT C TAGAAT TGTCATGTTT GACAGC T TAT CAT 3' 3' _ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5'

Bglll Clal ja 539 ep:n DNA-fragmenttiin pBR322:n (PL Biochemicals, 21-4891-01) tetrasykliiniresistenssigeenin Clal,Sphl-pilkko-10 mistuotteesta. Saatu plasmidi nimettiin pCJlrksi.

Sitten valmistajalta New England Biolabs hankittu Xhol-liittäjä insertoitiin plasmidin pCJl PvuII-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pCJX-1. Tämä insertio katkaisee rop-geenin, joka kontrolloi plasmidin kopiolukua. Sitten 15 lacl-geenin sisältävä EcoRI-fragmentti puhdistettiin plas-midista pMC9 (Calos et ai., 1983) ja insertoitiin sitten

Xhol-kohtaan XhoI—»EcoRI-siltasekvenssein. Sitten polyliit-täjäalue plasmidissa pKK223-3 korvattiin polyliittäjällä, joka sisälsi EcoRI:llä ja Pstlillä leikkaamalla saatuja li-20 säkohtia (sekvenssi tunnusnro 24):

5' AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3' j 3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5' / U

Näin saatu plasmidi vektori nimetään pCJXI-liksi.

• · · • · ; Lopuksi tetrasykliiniresistenssigeeni korvattiin * t· | 25 samanlaisella geenillä, jossa tunnistuskohdat restriktio- , entsyymeille Hindlll, BamHI ja Sali oli tuhottu muta- • · · genisoimalla bisulfiitilla. pBR322:n tetrasykliiniresis- • · · tenssigeenin mutagenisoimiseksi käytetty menettely oli seu-raava. Plasmidia pBR322 leikattiin Hindlll:11a, minkä jäi- t \·,· 30 keen se mutagenisoitiin natriumbisulfiitilla (Shortle ja · ·

Botstein, 1983) . Mutagenisoitu DNA ligatoitiin ympyrän muo- .♦··, toisen DNA:n muodostamiseksi, minkä jälkeen sitä leikattiin • · ·

Hindlll: 11a mutagenisoinnilta mahdollisesti välttyneen • · plasmidin tekemiseksi lineaariseksi. coli JM109 (Ya- * 35 nisch-Perron et ai., 1985) [transformoitiin tuotteella].

• · ϊ/.ϊ Eristettiin tetrasykliiniresistentit plasmidit, joista tar- - 80 : 117556 ’ kastettiin Hindi!Ι-kohdan menetys tetrasykliiniresistenssi-geenistä. Onnistuneesti mutagenisoitu plasmidi nimettiin pTl:ksi. Samanlaista menettelyä käytettiin BamHI-kohdan mu-tagenisoimiseksi pTl:ssä, jolloin saatiin plasmidi pT2.

5 Plasmidi pT2 puolestaan mutagenisoitiin Sali-kohdan poistamiseksi, jolloin muodostui plasmidi pT3. Mutagenisoidun tetrasykliiniresistenssigeenin käsittävä Clal-Styl-fraq-mentti eristettiin pT3:sta ja sillä korvattiin pCJXI-l:n homologinen fragmentti, jolloin muodostui pT3XI-2. Muta-10 genisoitu tetrasykliiniresistenssigeeni koodittaa yhä funktionaalista proteiinia. Alavirtaan tac-promoottorialueesta sijoitettiin polyliittäjä, joka sisältää mm. BamHI- ja Kpnl-restriktiokohdat, jotka ovat käyttökelpoisia geenien kloonaamiseksi niiden ilmentämiseksi EE. colissa.

15 Sitten kun vektoria oli ligatoitu 2 tunnin ajan kypsään ihmis-GDNF-rakenteeseen, 2 pl:lla reaktioseosta transformoitiin erittäin transformoitumiskelpoisia EE. coli -soluja Epicurian Coli SUREr (Stratagene) valmistajan ohjeiden mukaan. Yhden yhdistelmä-DNA-plasmidin DNA-sekvenssi 20 määritettiin kuten kuvattiin esimerkissä 2B. Sekvenssi vahvisti tämän plasmidin sisältävän kypsää ihmis-GDNF:ää koo- • dittavan ihmis-GDNF-geenin täydellisen koodaussekvenssin.

• · * · B. Ihmis-GDNF:n ilmentäminen E. colissa • · * - * · : Ihmis-GDNF:ää koodattavia DNA-sekvenssejä sisältävä ····' .]φ>· 25 yhdistelmä-DNA-plasmidi transformoitiin EE. coli -kantaan . JMlO70rMCBOOO5, joka on JM107:n Tl-resistentti variantti • · · “** (Yanisch-Perron et ai., 1985), käyttäen CaCl2-menetelmää, • « * **’ * jota kuvaavat Sambrook et ai. (1989) . Yhtä yhdistelmä-DNA- kannoista kasvatettiin 50 ml:ssa LB-kasvualustaa (Sambrook 30 et ai. ) , jossa oli 100 pg/ml ampisilliiniä (Sigma), ravis- | ··· telien 37 °C:ssa yön yli. Seuraavana päivänä viljelmä lai-mennettiin 1:70 LB-kasvualustaan, jossa oli 100 ug/ml am- • · · ,···, pisilliiniä, ja kasvatettiin 5 tunnin ajan ravistellen 37 • · *1* °C:ssa. 20 ml soluja otettiin talteen sentrifugoimalla 8 ***** 35 000 x g:ssä 10 minuutin ajan. Pelletti uudelleensuspendoi- V*: tiin 4 ml: aan 10 mM EDTA-liuosta, pH 7,4. Solut rikottiin 81 : 117556 käyttäen French Press Pressure Cell -painekennoa (SLM Instruments) paineella 1 300 kp/cm2. Lysaattia sentrifugoi-tiin 12 000 x g:ssä 15 minuutin ajan 4 °C:n lämpötilassa.

Pelletti uudelleensuspendoitiin 10 mM EDTA-liuokseen. On 5 todettu, että GDNF:ää kerääntyy suhteellisesti enemmän, jos fermentoinnin annetaan tapahtua 42 °C:n lämpötilassa paremminkin kuin 37 °C:ssa tai 30 °C:ssa.

Tällä hetkellä edulliseksi katsottu menetelmä korkeiden GDNF-ilmentymistasojen saamiseksi Eh_ colissa käyttä-10 en esimerkissä 6A kuvattua yhdistelmä-DNA-plasmidia (jossa ihmisen kypsän GDNF:n koodaussekvenssi on kloonattu ilmen-tämisvektoriin pT3XI-2) on seuraava. 10 litran fermentoin-tia varten 500 ml: n ymppi kasvatetaan LB-kasvualustassa (pH

7), joka sisältää 15 pg/ml tetrasykliiniä, 37 °C:ssa 2 lit-15 ran väliseinällä varustetussa ravistelukolvissa optiseen ... tiheyteen (Αεεο) 2-3. Tällä viljelmällä siirrostetaan 10 litraa kasvualustaa, joka sisältää: 12 g/litra tryptonia, 24 g/litra hiivauutetta, 25 g/litra glyserolia, 1,3 g/litra K2HP04:ää, 0,4 g/litra KH2P04:ää, 0,1 ml/litra Macol 19- ja 20 GE60-valmisteen 4:l-seosta ja 15 mg/litra tetrasykliini-HClrää. Tämä viljelmä kasvatetaan noin 12 - 18 tunnissa 42 • j*· °C:ssa optiseen tiheyteen noin 12 - 20 (A6eo) · Fermentoinnin • · · · pH pidetään 7,0:ssa ja liuenneen hapen määrä pidetään vas- • · ; taamassa 30 %:n kyllästystä. Fermentoinnin jälkeen viljelmä v : « ·* 25 jäähdytetään 4 °C:ssa ja solut otetaan talteen sentrifugoi- • · . maila.

• · *

Ihmis-GDNF:n edellä kuvattu tuottaminen tästä plas- * · · '·* * midista ei ole spesifinen tälle |h_ coli -kannalle, vaan se voidaan tuottaa missä tahansa sopivassa kannassa. Plasmidi \·.* 30 on transformoitu kahteen muuhun E_^ coli -kantaan, JM108 (Yanisch-Perron et ai., 1985) ja SUREr (Stratagene) . Näissä -j .*··. kummassakin kannassa oikeaa molekyylipainoa vastaava uusi • · · proteiininauha on saatu näkyviin värjäämällä Coomassie Blue * · " Ί* -värillä elektroforeesin polyakryyliamidigeelissä jälkeen.

***** 35 Erällä uudelleensuspendoitua materiaalia suoritet- • · ί#*.| tiin elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä. Geeli värjät- 117556 82 :.ί tiin Coomassie Blue -värillä. GDNFille odotettua molekyyli-painoa (15 000 daltonia) vastaava proteiini esiintyi vain viljelmissä, jotka sisälsivät yhdistelmä-DNA-ihmis-GDNF-plasmidin, mutta ei viljelmissä, jotka sisälsivät pelkäs-5 tään vektorin pT3XI-2. Talteen otetulla proteiinilla suori-tettiin tavanomaiset aminopään sekventointimenettelyt ja tämän proteiinin ensimmäiset 22 aminohappoa ovat identtiset ? ihmis-GDNF:n kuviossa 19 esitettyyn aminohapposekvenssiin nähden, mikä vahvistaa, että ihmis-GDNF on tullut oikein 10 ilmennetyksi E_^ colissa.

C. Bakteereissa tuotetun yhdistelmä-DNA-ihmis-GDNF :n uudelleenlaskostaminen ja bioaktiivisuus

Materiaalin valmistaminen uudelleenlaskostamista varten 15 E_;_ coli -transformanttia JM107 (pT3Xl2: :huGDNF) kasvatettiin stationaarifaasiin 37 °C:ssa hiivauutepohjäisessä (nro 0127-01 Difco Laboratories, Detroit, MI) ja tryptonipohjaisessa (nro 0123-05 Difco Laboratories, Det- ; roit, MI) kompleksisessa kasvualustassa [24 g/litra hiiva-20 uutetta, 12 g/litra tryptonia, 5 g/litra glyserolia, 1,3 g/litra foHPO^rää, 0,4 g/litra KH2P04:ää, 0,1 ml/litra Macol • :*; 19/GE60 -seosta (4:1), 15 mg/litra tetrasykliiniä] IPTG:llä « · · * indusoimatta. Soluja sentrifugoitiin 16 000 x g:ssä JA10- * · .·. : roottorissa 4 °C:ssa 20 minuutin ajan ja solutahna varas- 25 toitiin -20 °C:seen.

• · . Soluja prosessoitiin seuraavasti: 5 g solutahnaa • · · homogenisoitiin 40 ml:ssa 10 mM EDTA-liuosta, pH 7,0, jäis- * · · , *·* * sä käyttäen valmistajan OCI Instruments -homogenisoijaa.

Liete käytettiin ranskalaisessa painekennossa 3 kertaan 30 paineessa 1 400 kp/cm2, minkä jälkeen sitä sentrifugoitiin · · :...ϊ 30 000 x g:ssä JA20-roottoria käyttäen 10 minuutin ajan 4 °C:ssa. Supernatantti heitettiin pois ja pelletti homogeni- • · .···. soitiin ja sentrifugoitiin kuten edellä. Yhdessä suoritus- • « "* muodossa uudelleenuuttamisesta saatu pelletti homogenisoi- 35 tiin 40 ml:ssa 25 mM Tris-liuosta, pH 7,4, sentrifugoitiin • · ϊ,’·ί kuten edellä ja supernatantti heitettiin pois. Pelletti ho- 33 117556 mogenisoitiin 20 ml:ssa 50 mM Tris-liuosta, pH 8,0, joka sisälsi pitoisuuden 8 M urea ja johon oli tai ei ollut lisätty pitoisuus 30 mM 2-merkaptoetanoli, se sentrifugoitiin kuten edellä ja supernatantti otettiin talteen. Superna-5 tanttia kutsutaan TU-uutteeksi. Edullisessa suoritusmuodossa pelletti homogenisoitiin 40 mlrssa 10 mM Tris-liuosta, pH 8,0, joka sisälsi pitoisuudet 1 mM EDTA, 1 % NP-40- valmistetta, sentrifugoitiin kuten edellä ja supernatantti heitettiin pois. Pelletti liuotettiin sulfonyloimalla seu-10 raavasti: pelletti homogenisoitiin 25 ml:ssa 20 mM natrium-fosfaattiliuosta, pH 7,4, joka sisälsi pitoisuudet 8 M urea, 100 mM natriumsulfaatti ja 10 mM natriumtetrationaat-ti. Sulfonyloinnin annettiin kestää 4 °C:ssa yön yli samalla sekoittaen, minkä jälkeen sentrifugoitiin 16 000 x g:ssä 15 4 °C:ssa 10 minuutin ajan liuoksen kirkastamiseksi.

TU-uutteen osittainen puhdistaminen ennen uudelleenlaskostamista

TU-uute puhdistettiin osittain ioninvaihtokromato-grafisesti S-Sepharose Fast Flow -hartsissa (Pharmacia). 20 Kolonnia tasapainotettiin ja eluoitiin huoneenlämpötilassa 25 mM Tris-liuoksella, pH 7,4, joka sisälsi pitoisuudet 8 M

• urea ja 30 mM 2-merkaptoetanoli (puskuri A). Näytteen pa- • · · · nostamisen ja pesun puskurilla A perustason optiseen tihey- • · .·. : teen jälkeen kolonnia eluoitiin käyttäen virtausnopeutta 10 .,,,· 25 % kolonnitilavuudesta/min ja 5 kolonnitilavuutta kumpaakin • · puskuria A ja 100 mM Tris-liuosta, pH 9,0, joka sisälsi pi- "" toisuudet 8 M urea, 500 mM NaCl ja 30 mM 2-merkaptoetanoli * * * **’ (puskuri B) . Kolonnifraktioiden absorbanssia 280 nm:ssä tarkkailtiin ja ne analysoitiin SDS-PAGE:11a. GDNF eluoitui 30 valtaproteiinipiikkinä gradientin pitoisuudessa 60 - 70 %.

• · · GDNF: n suhteen rikastetut fraktiot yhdistettiin pooliksi « uudelleenlaskostamista varten (kuvio 25) .

• · · .*··, Sulfonyloidun uutteen osittainen puhdistaminen en- • · *·* nen uudelleenlaskostamista * *· 35 Sulfonyloitu uute puhdistettiin osittain ioninvaih- • · \*·· tokromatografisesti Q-Sepharose Fast Flow -hartsissa (Phar- 117556 84 macia). Kolonnia tasapainoitettiin ja eluoitiin 4 °C:ssa 10 mM Tris-liuoksella, pH 8,0, joka sisälsi pitoisuuden 4 M urea (puskuri A). Näytteen panostamisen ja pesun puskurilla A perustason optiseen tiheyteen jälkeen kolonnia eluoitiin 5 käyttäen virtausnopeutta 5 % kolonnitilavuudesta/min ja 5 kolonnitilavuutta kumpaakin puskuria A ja 10 mM Tris-liuosta, pH 8,0, joka sisälsi pitoisuudet 4 M urea ja 500 mM NaCl (puskuri B) . Kolonnifraktioiden absorbanssia 280 nm:ssä tarkkailtiin ja ne analysoitiin SDS-PAGE:11a. GDNF 10 eluoitui valtaproteiinipiikkinä gradientin pitoisuudessa 50 ; %. GDNF:n suhteen rikastetut fraktiot yhdistettiin pooliksi uudelleenlaskostamista varten.

Osittain puhdistetun TU-uutteen uudelleenlaskosta-minen

15 Edellä kuvatun mukaisesti osittain puhdistettu GDNF

uudelleenlaskostettiin seuraavasti: 4 ml:aan pooliksi yh distettyä kolonnieluaattia, joka sisälsi GDNF:ää noin 1 mg:n/ml, lisättiin ditiotreitolia pitoisuuteen 5 mM. Putki suljettiin ilman sulkemiseksi pois ja sitä pidettiin '.

20 25 °C:ssa 15 minuutin ajan. Sitten hapettuneen glutationin dinatriumsuolaa lisättiin pitoisuuteen 15 mM, putki suljet- • tiin jälleen ilman sulkemiseksi pois ja sitä pidettiin • · · · ·*.*. 25 °C:ssa 15 minuutin ajan. Tätä liuosta laimennettiin sit- • * .*.S ten lisäämällä 14 tilavuutta uudelleenlaskostamispuskuria 25 (100 mM Na2HPO,j-liuos, jossa olivat pitoisuudet 10 mM eta- • · . noliamiini, pH 8,3, 4 M urea, 5 % polyetyleeniglykoli-300- *!" valmistetta ja 2 mM kysteiini), ja pidettiin argon-suoja- • * * ·* * kaasussa 5 °C:ssa 3 päivän ajan.

Osittain puhdistetun sulfonyloidun uutteen uudel- • ♦ · _ _ *.ί·* 30 leenlaskostaminen * · ·

Edellä kuvatun mukaisesti osittain puhdistettu GDNF

uudelleenlaskostettiin seuraavasti: pooliksi yhdistettyä .···. kolonnieluaattia, joka sisälsi GDNFiää noin 3 mg/ml, lai- * · "* mennettiin lisäämällä 19 tilavuutta uudelleenlaskostamis- ’* : 35 puskuria (100 mM Na2HP04, Tris, pH 8,3, jossa olivat pitoi- * · ·.*·· suudet 4 M urea, 5 % polyetyleeniglykoli-300-valmistetta ja 117556 85 . ; 3 mM kysteiini) ja pidettiin argon-suojakaasussa 5 °C:n lämpötilassa 3 päivän ajan. '

Uudelleenlaskostetun GDNF:n analysointi SDS-PAGE:11a 5 Bakteereista uutettu GDNF kulkee ilman aiempaa al tistamista pelkistimille monomeerina SDS-PAGE:ssa siten, että sen näennäinen molekyylipaino on noin 16 kD verrattuna .· 1' molekyylipainostandardiproteiinien migraatioon. Todettavaa .· GDNF:ää ei ole dimeerin asemassa. GDNF, joka altistetaan 10 pelkistimelle (30 - 150 mM 2-merkaptoetanoli) joko uuttamisen aikana tai juuri ennen SDS-PAGE:a mutta ennen uudel-leenlaskostamista, kulkee asemaan, jota ei voida erottaa ei-pelkistetystä bakteeriproteiinista, näennäisen molekyy-lipainon ollessa noin 16 kD (kuvio 26, vyöhykkeet 6 ja 13).

15 Tämä osoittaa, että bakteerisoluista valmistettu GDNF ei dimerisoidu ennen uudelleenlaskostamista.

Edellä kuvatun uudelleenlaskostamisen jälkeen valtaosa bakteerissa tuotetusta yhdistelmä-DNA-GDNF:stä kulkee ei-pelkistävässä SDS-PAGE:ssa ilmeisenä dimeerinä, jonka :: 20 molekyylipaino on noin 30 kD (kuvio 26, vyöhyke 2). Uudelleenlaskostetun GDNF:n pelkistäminen käyttäen pitoisuutta • 150 mM 2-merkaptoetanoli ennen SDS-PAGE:a saa sen jälleen • · · * kulkemaan monomeerin asemaan kohtaan noin 16 kD (kuvio 23, • · .·. : vyöhyke 5) . Nämä tulokset osoittavat, että GDNF:n uudel- • · · 25 leenlaskostaminen tekee proteiinista disulfidisillan sito- • · . man dimeerin. Uudelleenlaskostetun GDNF:n SDS-PAGE ajettiin pelkistämättä, geeli leikattiin pituussuunnassa ja paloista • * « *·* * määritettiin bioaktiivisuus sympaattisen hermosolmun her- .

mosolujen eloonjääntimäärityksessä (katso jäljempänä). Ai-30 noa todettava bioaktiivisuus oli dimeerin asemassa, mikä M* osoitti dimeerin olevan biologisesti aktiivinen.

Uudelleenlaskostetun GDNF:n analyysi käänteisfaasi- .*··. HPLC: llä (RP-HPLC) • · ‘I* S-Sepharose- tai Q-Sepharose-kromatografisesti ·· · * * * 35 osittain puhdistettu GDNF, kuitenkin ennen uudelleenlaskos- • · tamista, kulki jäljempänä esitetyn mukaisesti suoritetussa 117556 86 RP-HPLC:ssä siten, että retentioaika oli noin 21 minuuttia. -

Uudelleenlaskostamisen jälkeen GDNF kulki identtisissä olo- I

suhteissa siten, että retentioaika oli noin 15 minuuttia.

Siirtymää retentioajassa odotetaan GDNF:n onnistuneen uu- | 5 delleenlaskostamisen seurauksena. Usein nähdään, että proteiinien uudelleenlaskostamisen jälkeen voidaan havaita siirtymä RP-HPLC-retentioajoissa.

Näiden näytteiden RP-HPLC suoritettiin seuraavasti: virtausnopeus oli 1 ml/min ja 0,46 x 25 cm:n C-4-kolonnia 10 (VyDac nro 214TP54) kehitettiin seuraavasti: liuotin A = 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA) vedessä; liuotin B = 0,1 % TFA:ta asetonitriilissä; aikana 0,5 - 1,5 minuuttia B:tä nostetaan 5 %:sta 25 %:iin; aikana 1,5 - 31,5 minuuttia B:tä nostetaan 25 %:sta 55 %:iin.

15 Uudelleenlaskostetun GDNF:n analyysi biomäärityk- sillä

Uudelleenlaskostetulla GDNF:llä suoritettiin bio- määritys sekä kananpojan alkion (E10) sympaattisen her- mosolmun hermosolujen eloonjäännin biomäärityksellä (esi- ' 20 merkki 4A) että rotan alkion (E16) keskiaivoviljelmän dopa- miinin oton biomäärityksellä (esimerkki IB). Ennen uudel- · f ;*· leenlaskostamista GDNF, jota oli käsitelty pitoisuudella 30 * * · · .

mM 2-merkaptoetanoli ja puhdistettu S-Sepharose- tai Q- • * .·. ; Sepharose-kromatografisesti kuten edellä, ei osoittanut to- • · · 25 dettavaa bioaktiivisuutta keskiaivoviljelmän dopamiinin • · oton määrityksessä ja osoitti hyvin matalaa bioaktiivisuut-ta sympaattisten hermosolujen eloonjäännin biomääritykses- • · * ' . ·τ< *·' ’ sä. S-Sepharose-kromatografiän läpikäyneen materiaalin nä ennäinen ED50 sympaattisten hermosolujen eloonjäännin bio-30 määrityksessä oli noin 1 pg/ml, joka on noin 333 kertaa * · alempi kuin uudelleenlaskostetun rhGDNF:n (katso jäljempä-nä) . Q-Sepharose-kromatografian läpikäyneelle materiaalille • · · ,*··. näennäinen ED50 sympaattisten hermosolujen eloonjäännin * · biomäärityksessä oli noin 3 pg/ml, joka on noin 100 kertaa ***** 35 alempi kuin uudelleenlaskostetun rhGDNF:n (katso jäljempä- « · !.**: nä) . Uudelleenlaskostamisen jälkeen GDNF, joko altistaen 117556 tai altistamatta aiemmin 2-merkaptoetanolille, oli ilmeisesti täysin aktiivinen molemmissa biomäärityksissä (kuviot 27 - 28) . Tämä tulos osoittaa, että GDNF:n bioaktiivisuus lisääntyi merkittävästi uudelleenlaskostamisen yhteydessä, / 5 ja myös että alentunut tai puuttuva bioaktiivisuus ennen uudelleenlaskostamista ei johtunut altistamisesta 2-merkaptoetanolille, Γ ' Uudelleenlaskostetun yhdistelmä-DNA-ihmis-GDNF:n - ' (rhGDNF) ED50 oli näissä biomäärityksissä samanlainen kuin 10 todettiin edellä B49-soluja kasvattamalla käsitellystä kasvualustasta puhdistetulle rotta-GDNF:lie. Sympaattisten hermosolujen eloonjäännin biomäärityksessä rhGDNF:n ED50 oli noin 3 ng/ml (kuvio 27) ja rotta-GDNF:n ED50 oli noin 5 ng/ml. Keskiaivoviljelmän dopamiinin oton määrityksessä 15 rhGDNF:n ED50 oli noin 30 pg/ml (kuvio 28) ja rotta-GDNF:n noin 50 pg/ml. Nämä tulokset osoittavat, että huomattava osa rhGDNF:stä oli onnistuneesti uudelleenlaskostettu ja täysin biologisesti aktiivinen.

Esimerkki 7 20 GDNF:n vastaisten vasta-aineiden tuottaminen ja eristäminen : rhGDNF:n vastaisia vasta-aineita muodostettiin seu- ♦ · * · raavalla menettelyllä. Tämän menettelyn nähdään sisältävän • · ·-< : - kuitenkaan siihen rajoittumatta - tämän tehosteen, immu- • ·· 25 nointimenettelyjär jestelyn ja eläinlajin. Samoin GDNF:n • · vastaisia vasta-aineita voidaan tuottaa käyttäen uudelleen-

• · I

"" laskostettua, natiivia proteiinia tai denaturoitua, inak- 1 • · · tiivistä proteiinia kuten jäljempänä esitetyssä menettelyssä tai käyttäen GDNF-sekvenssin jatkuvia peptidejä ihmises-30 tä tai muista eläinlajeista.

•,..1 Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan muodostaa ♦ 1 1 jollain monista tavanomaisista menettelyistä (katso "Anti- .···. bodies, a Laboratory Manual"; Cold Spring Harbor Laboratory, > "* 1988, ISBN 087969-314-2, toim. Ed Harlow ja David Lane).

• *· 35 Lyhyesti, tällaisessa menettelyssä monoklonaalisten vasta- • · aineiden muodostamiseksi tyypillisesti mutta ei poissulke- 117556 88 vasti immunoidaan sopivia eläimiä ja tarkkaillaan näiden eläinten vasta-ainevastetta immunointimenettelyjärjestetylle, eristetään vasta-ainetta tuottavia soluja esimerkiksi yhden tai useamman reagoivan eläimen imujärjestelmäelimes- ; 5 tä, fuusioidaan nämä solut sopivaan solulinjaan, kuten mye-loomasoluihin, hybridoomien tuottamiseksi, jotka ovat vasta-ainetta erittäviä immortalisoituja soluja, ja seulotaan hybridoomien eristämiseksi progressiivisesti, kunnes saadaan yksisoluklooneja, jotka tuottavat haluttua monoklonaa-10 lista vasta-ainetta.

Polyklonaalisia vasta-aineita tuotettiin kaniineissa seuraavasti: 2 ml steriiliä suolaliuosta, joka sisälsi 0,005 - 0,25 mg rhGDNF:ää, ruiskutettiin RIBI-tehoste MPL-TDM-CWS-emulsioampulliin (RIBI ImmunoChem Research, Inc.) 15 ja vorteks-sekoitettiin emulsion muodostamiseksi valmistajan ohjeiden mukaan. Nukutetuille naaraspuolisille Uuden Seelannin valkoisille kaniineille annettiin ruiske RIBI:n esittämää immunointimenettelyjärjestelyä noudattaen. Yksi millilitra tehoste-antigeeniemulsiota annettiin seuraavas-20 ti: 0,30 ml ihonsisäisesti (0,05 ml kuhunkin 6 kohdas- : ta) • · m m 0,40 ml lihaksensisäisesti (0,20 ml kumpaankin ta- • ♦ .·. : kajalkaan) ^ • »f ,...· 25 0,10 ml ihonalaisesti (niskan alueelle) • · . 0,20 ml vatsaontelon sisäisesti ···

Eläimille annettiin jälleen ruiske (tehoste) joka • · · *** * 4.-6. viikko käyttäen samaa menettelyjärjestelyä. Eläimis tä otettiin verta ennen ensimmäistä ruisketta ja 10 - 14 h:.1 30 päivän kuluttua kustakin tehosteesta vasta-ainetuotannon * · · testaamiseksi neutralointimäärityksellä tai tavanomaisella ’ ELlSA-määrityksellä.

,···, Neutralointimääritys suoritettiin seuraavasti käyt- • · "* täen rotan E16-keskiaivoviljelmämääritystä. Kaniinites- ;.j ***" 35 tiseerumia laimennettiin Dulbeccon oleelliset minimiravin- d

\*·· teet sisältävään kasvualustaan, joka oli puskuroitu 25 mM

117556

89 J

HEPES-liuoksella pH:hon 7,4 ja joka sisälsi 5 mg/ml nau-taseerumialbumiinia (jota kutsutaan BSA5:ksi). Tämä puoles- r taan lisättiin määrityskuoppiin (25 μΐ laimennettua tes-tiseerumia 500 plraan kudosviljelyliuosta) ja inkuboitiin 5 37 °C:ssa 30 minuutin ajan. Sitten rhGDNF:ää lisättiin h 25 μΐ BSA5:een laimennettua varastoliuosta, joka sisälsi rhGDNF:ää 6,32 ng/ml, jolloin rhGDNF:n loppupitoisuudeksi ? määrityksessä tuli 0,316 ng/ml. Dopamiinin otto mitattiin 8 päivän kuluttua viljelmästä edellä kuvatulla menettelyllä.

10 Tulokset vastaseerumilla toisista tehosteista esitetään alla neutralointimääritykselle (viitataan seuraavaan taulukkoon 2) .

Taulukko 2

Kaniini nro Antigeeni 1Neut.EC5o +ELISA EC50 15 1604 uudelleenlask. rhGDNF 20xl03 25xl03 2257 uudelleenlask. rhGDNF 12xl03 7xl03 2506 uudelleenlask. rhGDNF 2xl03 3xl03 9380 denaturoitu rhGDNF 2xl03 2xl03 * vastaseerumilaimennos GDNF-stimuloidun dopamiinin oton 50 · . ; 20 %:n neutraloinnille + vastaseerumilaimennos 50 %:n signaalille maksimista (tali’: sanne) ELISA: ssa • · • •f • · · • · j\t: Vastaseerumi titrattiin myös GDNF-vasta-aineiden * · 25 suhteen standardi-ELISA: 11a käyttäen seuraavaa menettelyä: ; i mikrotiitterilevyjä (96 kuoppaa, Nunc Maxisorp) päällystet-tiin 100 μΐ: lla/kuoppa päällystämispuskuria, jossa oli * rhGDNF:ää 1,0 pg/ml 50 mM natriumbikarbonaattiliuoksessa, pH 9,6, yön yli 4 °C:ssa. Levyt pestiin neljään kertaan le- • f · 30 vypesupuskurilla (PWB, fosfaattipuskuroitu fysiologinen • · · suolaliuos, pH 7,2, joka sisälsi 0,5 % Tween 20 -valmis-;1j1. tetta), minkä jälkeen niitä salvattiin 2 tunnin ajan .1··. 25 °C:ssa 200 μΐ: lla/kuoppa liuosta, jossa oli 2 % nau- • • · ♦ • taseerumialbumiinia fosfaattipuskuroidussa fysiologisessa ·.**: kuoppiin lisättiin titrattavat seeruminäytteet (100 μΐ lai- 1 35 suolaliuoksessa, pH 7,2. Levyt pestiin jälleen PWB:llä ja · · 117556 90 mennettuna 20-prosenttiseen normaalivuohiseerumiin ja i PWB:hen). Levyjä inkuboitiin 1,5 tunnin ajan 35 °C:ssa, minkä jälkeen ne pestiin taas PWB:llä. Kuhunkin kuoppaan lisättiin alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen anti-5 kaniini-IgG:tä (Jackson Immunochemicals) laimennoksena i 1:2 500 PWB:ssä (100 μΐ) ja inkuboitiin 1,5 tunnin ajan 35 °C:ssa. Levyt pestiin PWB:llä kuten edellä. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin p-NPP-substraattia (dinatrium-p-nitrofenyylifosfaatti, Sigma kataloginro MP389) (100 μΐ 10 liuosta, jossa oli 1,0 mg/ml p-NPP:tä 10-%:isessa dietano-liamiinissa, pH 9,8) ja levyä inkuboitiin 25 °C:ssa. Värin kehittymistä seuraattiin lukemalla levyt 405 - 490 nm:ssä levylukijalla (Molecular Devices Enax).

Vastaseerumeja käytettiin myös GDNF:n toteamiseksi 15 ja kvantitoimiseksi Western blot -analyysillä seuraavasti: 5> natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforee-si (SDS-PAGE) suoritettiin perusmenettelyllä, jota ensimmäisenä on kuvannut U.K. Laemmli [Nature 227 (1970) 680 - 685] käyttäen 12,5-%:ista akryyliamidierotusgeeliä ja 4,5-20 % lista akryyliamidipanostusgeeliä. Geelien (16 x 14 x 0,15 cm) elektroforeesi suoritettiin käyttäen 40 milliampeerin • vakiovirtaa 3 tunnin ajan. Pelkistystä/denaturointia varten ·#·· näytteitä kuumennettiin 100 °C:ssa 10 minuutin ajan näyte- • ·

; puskurissa, joka sisälsi 1 %:n SDStää ja pitoisuuden 150 mM

• · · ·/· 25 2-merkaptoetanoli.

• * . Western blot -määritystä varten geeli blot -siir- > • · * rettiin sitten Immobilon-P-membraanille (Millipore katalo- · * ·;'*·} *** : ginro IPVH 151 50) käyttäen 80 milliampeerin vakiovirtaa 16

tunnin ajan liuoksessa, joka käsitti pitoisuudet 25 mM

30 Tris-emäs, 192 mM glysiini, 0,1 % SDS:ää ja 20 % metanolia, ; *·♦ ja prosessoitiin seuraavasti: 1) membraania salvattiin 1 tunnin ajan 25 °C:ssa • · ♦ ,*··# salpauspuskurissa (10 mM Tris, pH 7,4, joka sisälsi pitoi- Ί* suudet 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20 -valmistetta, 4 % kuo- *5*" 35 rittua maitoa ja 0,02 % natriumatsidia) kevyesti ravistel-

Ien; 117556 91 2) sitten membraania inkuboitiin 25 °C:ssa 2 tunnin ajan kevyesti ravistellen salpauspuskurissa, joka sisälsi laimennettua GDNF-vastaista primaarivastaseerumia; 3) membraani pestiin (4 kpl 5 minuutin pesuja) sai- .

5 pauspuskurilla; i* 4) sitten membraania inkuboitiin 25 °C:ssa 2 tunnin «to*.

ajan kevyesti ravistellen salpauspuskurissa, joka sisälsi i5”'s laimennettua sekundaarivasta-ainetta (alkaliseen fosfataa-siin konjugoitu affiniteettipuhdistettu vuohen anti- 10 kaniini-IgG, Cappel kataloginro 59299); 5) membraani pestiin (4 kpl 5 minuutin pesuja) sal-pauspuskurilla, joka ei sisältänyt kuorittua maitoa; 6) membraania kehitettiin 50 mlissa kehityspuskuria (100 mM Tris, pH 9,5, joka sisälsi pitoisuudet 100 mM NaCl 15 ja 5 mM MgCl2) 165 piillä NBTitä ja 83 piillä BCIPita (Pro-mega-pakkaus kataloginro P3771) 25 °Cissa kevyesti ravis- tellan, kunnes saatiin haluttu värjäys.

Esimerkki 8 GDNFiää erittävien membraaniin kapseloitujen solu-20 jen valmistaminen ja istuttaminen potilaaseen GDNFiää erittäviä soluja voidaan kapseloida puoli- ϊ läpäiseviin membraaneihin silmällä pitäen istuttamista her- * * · · movauriosta kärsiviin potilaisiin. Edullisessa suoritusmuo-dossa potilas kärsii Parkinsonin sairaudesta ja GDNFiää • · · 25 erittävät kapseloidut solut istutetaan potilaan aivojuovi- • · . oon GDNFin saamiseksi dopamiinivaikutukseen liittyville so- t*« lurungoille.

• * * ’·’ ‘ Keksinnön yhdessä suoritusmuodossa GDNFiää erittä mään manipuloituja soluja, kuten niitä, jotka valmistettiin 30 ja joita kuvattiin edellä esimerkeissä 5 ja 6, sisällyte- * · · tään bioyhteensopiviin, istutettaviin ja poistettaviin po- .···. lymeeri-insertteihin. Insertit voidaan suunnitella ja ra- • · · kentaa siten, että erittynyt GDNF pääsee istutettuja soluja • · *1* ympäröivään kudokseen, kun samalla estetään tekijöitä ympä- *·"· 35 röivästä kudoksesta, jotka olisivat tuhoisia soluille, pää- *m’-\ semästä soluihin.

117556 92 GDNF:ää erittämään manipuloidut solut voidaan kapseloida puoliläpäiseviin membraaneihin menetelmän mukaan, jota kuvataan PCT-hakemusjulkaisussa W0 91/10 425 nimeltä "Cell Capsule Extrusion Systems". Membraaniin kapseloidut 5 solut voidaan istuttaa aivojuovioon tavanomaisilla kirurgisilla toimenpiteillä.

• · • 1 · • · · • · 1 · • · · « · « * 1 • · • 1 1 • · · ♦ · ····· • · • · · • ♦ · « • « · ··♦ • · ♦ • 1 · • · · ··· • · ♦ · * · 1 t·· *·· • 1 1 * « 1 • · ··· « · · · · • « • · t • 1i • 1 93 1 1 7556

(1) GENERAL INFORMATION

(i) APPLICANT: Lin et ai.

(ii) TITLE OF INVENTION: Glial Derived Neurotrophic Factor ·. j (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 24 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Beaton S Swanson, P.C.

CB) STREET: 4582 South Ulster Street Parkway, Suite #403 (C) CITY: Denver (D) STATE: Colorado

(E) COUNTRY: USA

CF) ZIP: 80237

'I

(V) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Diskette, 5.25 inch, 360 Kb storage (B) COMPUTER: IBM compatible

(C) OPERATING SYSTEM: MS DOS

(D) SOFTWAftE: WordPerfect 5.1

(vi) CURRENT APPLICATION DATA: NONE

(vii) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: 07/788,423, 07/774,109, 07/764,685 (B) FILING DATE: 06-NOV-1991, 08-OCT-1991,20-SEP-1991 (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: Barry J. Swanson (B) . REGISTRATION NUMBER: 33,215 (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: SYNE-225C3 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: : CA) TELEPHONE! (303) 850-9900 r ../ (B) TELEFAX: (303) 850-9401 .....

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:! (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 25 amino acids (B) TYPE: amino acid (D) TOPOLOGY: linear J, (v) FRAGMENT TYPE: N-terminal fragment • · · ί·ί · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: * *

Ser Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Xaa • · :: ·. ·: 5 io 15 ·**· Gin Ala Ala Ala Ala Ser Pro Asp Asn . 20 25 : ··· * **** (3) INFORMATION FOR SEQ 10 NO:2 • · · *** (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: CA) LENGTH: 13 amino acids CB) TYPE: amino acid j . CC) TOPOLOGY: linear [ ··*..· ,ί·.Λ • · * .···, (v) FRAGMENT TYPE: internal fragment • ft • · · . (ix) FEATURE: Xaa is either Lys or Gin :·.* • · · *.* * (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2: a * a ·...· Asp Xaa He Leu Lys Asn Leu Gly Arg Val Arg Arg Leu ....: (4) INFORMATION FOR SEO ID NO:3 ’ • · ,·, J < i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: *, ; (A) lENGTm: 890 Dase pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single 117556 94 (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: nucleic acid for ret GDNF

<xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:3: " CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GGGG GTC TAC GGA GAC CGG ATC CGA GGT GCC GCC 54

Val Tyr Gly Asp Arg lie Arg Gly Ala Ala *90 -85 GCC GGA CGG GAC TCT AAG ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG GCT GTC TGC 92

Ala Gly Arg Asp Ser Lys Met Lys Leu Trp Asp Val Val Ala Val Cys -80 -75 -70

CTG GTG TTG CTG CAC ACC GCG TCT GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG HO

Leu Val Leu Leu His Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys -65 -60 -55 AGG CTT CTC GAA GCG CCC GCC GAA GAC CAC TCC CTC GGC CAC CGC CGC 188

Arg Leu Leu Glu Ala Pro Ala Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg -50 -45 -40 GTG CCC TTC GCG CTG ACC AGT GAC TCC AAT ATG CCC GAA GAT TAT CCT 236

Val Pro Phe Ala Leu Thr Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro -35 -30 -25 -20 GAC CAG TTT GAT GAC GTC ATG GAT TTT ATT CAA GCC ACC ATC AAA AGA 284

Asp Gin Phe Asp Asp Val Met Asp Phe He Gin Ala Thr lie Lys Arg -15 -10 -5 CTG AAA AGG TCA CCA GAT AAA CAA GCG GCG GCA CTT CCT CGA AGA GAG 332

Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu 15 10 AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA GAG AAT TCC AGA GGG AAA 380

Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys 15 20 25 GGT CGC AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAT CGG GGG TGC GTC TTA ACT GCA 428

Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala 30 35 40 45 ATA CAC TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT TTG GGC TAC GAA ACC AAG GAG 476 lie His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu 50 55 60 . . GAA CTG ATC TTT CGA TAT TGT AGC GGT TCC TGT GAA GCG GCC GAG ACA 524 1 ί l Glu Leu lie Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr "* ' 65 70 75 • ·

It* ***** ATG TAC GAC AAA ATACTA AAA AAT CTG TCT CGA AGT AGA AGG CTA ACA 572 1 Met Tyr Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr •••ί., 80 85 90 • * ’* AGT GAC AAG GTA GGC CAG GCA TGT TGC AGG CCG GTC GCC TTC GAC GAC 620 » Ser Asp Lys val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro Vai Ala Phe Asp Asp v, ..*·* 95 100 105 * · « : GAC CTG TCG TTT TTA GAC GAC AGC CTG GTT TAC CAT ATC CTA AGA AAG 668

Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys 110 115 120 125 : CAT TCC GCT AAA CGG TGT GGA TGT ATC TGA CCCTGGCTCC AGAGACTGCT 718 ·*· His Ser Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie .**·. 130 • · • · · GTGTATTGCA TTCCTGCTAC ACTGCGAAGA AAGGGACCAA GGTTCCCAGG AAATATTTGC 778 • · · * CCAGAAAGGA AGATAAGGAC CAAGAAGGCA GAGGCAGAGG CGGAAGAAGA AGAAGAAAAG 838 • * ♦ • · *···* AAGGACGAAG GCAGCCATCT GTGGOAGCCT GTAGAAGGAG GCCCAGCTAC AG 890 * (5) INFORMATION FOR SEQ ID NO:4 • · • · · *· " (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 134 amino acid residues (B) TYPE: amino acid i! ' :------ 1 17556 ' 95 <ix) FEATURE: (A) NAME/KE Y: inferred amino acid sequence for mature rat GDNF (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:4:

Ser Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg 1 5 10 15

Gin Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg 20 25 30

Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His Leu 35 40 45

Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu lie 50 55 60 1 '

Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Ala Ala Glu Thr Met Tyr Asp 65 70 75 80

Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys 85 90 95

Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro val Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser 100 105 110

Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val Tyr His He Leu Arg Lys His Ser Ala 115 120 125

Lys Arg Cys Gly Cys He 130 (6) INFORMATION FOR SEO ID N0:5 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 562 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (i x) FEATURE:

(A) NAME/tCEY: nucleic acid sequence for human GDNF

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:5: • « • · · ϊ·! I ATTTTCTCTT TTCTTTTTGA ACAGCA AAT ATG CCA GAG GAT TAT CCT GAT CAG 53

Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gin • · · • · .·. ; TTC GAT GAT GTC ATG GAT TTT ATT CAA GCC ACC ATT AAA AGA CTG AAA 101 *. *; Phe Asp Asp Val Met Asp Phe lie Gin Ala Thr lie Lys Arg Leu Lys • *·*“ AGG TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GIG CTT CCT AGA AGA GAG CGG AAT 149 , Arg Ser Pro Asp Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn *:* 1 5 10 15 • < · · ;*;*· CGG CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT CGG 197 • Arg Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg 20 25 30 . AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT 245

Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala lie His ··· 35 40 45 • · ft · TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG GAG GAA CTG 293 ,*:*» Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu *.· * 50 55 60 • · · *...· ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT GAG ACA ACG TAC 341 • He Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr ....Ϊ 65 70 75 • · : GAC AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA AGG CTG GTG ACT GAC 389 *. *: Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp 80 85 90 95 AAA GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT GAT GAC CTG 437 - 117556 96 TCC TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC CAT ATT CIA AGA AAG CAT TCC «85

Ser Phe Leu Asp Asp Asn leu Val Tyr His lie Leu Arg lys His Ser 115 120 125 GCT AAA AGG TGT GGA TGT ATC TGA CTCCGGCTCC AGAGACTGCT GTGTATTGCA 539

Ala Lys Arg Cys Gly Cys lie 130 ./ TTCCTGCTAC AGTGCAAAGA AAG 562 (7) INFORMATION FOR SEQ ID NO:6 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ΐ (A) LENGTH: 136 amino acid residues '·, (B) TYPE: amino acid ,.;ί, CD) topology: linear (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: inferred amino acid sequence for mature human GDNF

Cxi) - SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:6:

Ser Pro Asp Lys Gin Met Ala Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg 1 5 10 15

Gin Ala Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg 20 25 30

Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Ala He His Leu 35 40 45

Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu He 50 55 60

Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Ala Ala Glu Thr Thr Tyr Asp 65 70 75 80 --

Lys lie Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys 85 90 95

Val Gly Gin Ala Cys Cys Arg Pro lie Ala Phe Asp Asp Asp Leu Ser 100 105 110 ' - -'

Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His lie Leu Arg Lys His Ser Ala ... 115 120 125 • · · **· * Lys Arg Cys Gly Cys He .·.*. 130 • · · · -• * .*. : (8) INFORMATION FOR SE0 ID N0:7 • ·* ....· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: * · (A) LENGTH: 20 base pairs CB) TYPE: nucleic acid ..);* (C) STRANDEDNESS: single ::: CD) TOPOLOGY: linear • · · · · * (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: oligonucleotide probe (D) OTHER INFORMATION: N at positions 3, 15, and 18 is inosine • « * **!·* (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:7: * · *

·,,,· CCNGAYAARC ARGCNGCNGC

(9) INFORMATION FOR SEO ID NO:B

• ,···. <i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 223 base pairs • (B) TYPE: nuci e u acid •••S CC) STRANDEDNESS: single * (D) TOPOLOGY: linear • * *. ‘I (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: nucleic acid sequence for human GDNF

97 1 1 7556 TTCTCTCCCC CACCTCCCGC CTGCCCGCGC A GGT GCC GCC GCC GGA CGG GAC TTT 55

Gly Ala Ala Ala Gly Arg Asp Phe -5 AAG ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG GCT GTC TGC CTG GTG CTG CTC CAC 103

Lys Met Lys Leu Trp Asp Vai Vai Ala Val Cys Leu Val Leu Leu His ' 15 10 15 ACC GCG TCC GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG AGG CCT CCC GAG GCG 151

Thr Ala Ser Ala Phe Pro Leu Pro Ala Gly Lys Arg Pro Pro Glu Ala 20 25 30 CCC GCC GAA GAC CGC TCC CTC GGC CGC CGC CGC GCG CCC TTC GCG CTG 199

Pro Ala Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Ala Pro Phe Ala Leu 35 40 45 AGC AGT GAC TGTAAGAACC GTTCC 223

Ser Ser Asp 50 (10) INFORMATION FOR SEQ ID NO:9 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 12 base pairs (B) TYPE: nucleic acid CO STRANDEDNESS: single (D> TOPOLOGY: linear (ix) FEATURE: (A) NAMF/KEY: linker (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:9:

CCCGAATTCG GG

(11) INFORMATION FOR SEQ ID N0:10 (i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 7 amino acid residues (B) TYPE : amino acid (D) TOPOLOGY: linear (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:10: • · j,j j Pro Asp Lys Gin Ala Ala Ala i l : ; (12) INFORMATION FOR SEO ID NO:11 * * :*·.· (i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: * * (A) LENGTH; 33 base pairs ·«··· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear « ···· #·; ·# (ix) FEATURE: ·.· * (A) NAME/KEY: nucleic acid sequence from pBluescript SK-76.1 (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:11: : ;*; GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCW GMW GYM WGM CCU 33 • * * ·***; (13) INFORMATION FOR SEO ID NO:12 *» (i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: ! I I (A) LENGTH: 11 amino acid residues * (B) TYPE: amino acid • · (D) TOPOLOGY: linear • * * , (κί) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO;T2: • · · · * , , Glu Arg Asn Arg Gin Ala Ala Ala Ala Ser Pro i • ♦ * * * (14) INFORMATION FOR SEO ID NO:13 (i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs 98 1 1 7 5 5 6 (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: oligonucleotide DHD-26 (0) OTHER INFORMATION: N at positions 9 and 12 are inosine (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:13: ARRTTYTTNA RNATYTTRTC 20

(15) INFORMATION FOR SEQ ID NO:H

(i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 7 amino acid residues (B) TYPE : amino acid (D) TOPOLOGY: linear <xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:K:

Asp Lys lie Leu Lys Asn Leu (16) INFORMATION FOR SEO ID NO:15 (i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE : nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: oligonucleotide primer PD1 (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO;15: GACGGGACTC TAAGATG ; (17) INFORMATION FOR SEO ID NO:16 (i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 20 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURE: * ·*· (A) name/KEY: oligonucleotide primer DHD23 ··· · (D) OTHER INFORMATION: N at positions 3, 6, and 18 is inosine * · *.*.* (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID N0:16: • · t · «

*. "I GCNGCNGCYT GYTTRTCNGG

***** (18) INFORMATION FOR SEO ID NO:1/ (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ’*** (A) LENGTH: 17 base pairs J ί ί (B) TYPE: nucleic acid * (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear . (ix) FEATURE: ".i«* (A) NAME/KEY: oligonucleotide primer LF2 tl* *,..' (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:17: ,"·, CGAGACAATG TACGACA 'L__/ * · « * .···, (19) INFORMATION FOR SEO ID NO:18 * · *·* (i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: ·.··· (A) LENGTH: 17 base pairs (B) TYPE: nucleic acid : (C) STRANDEDNESS: single *. ‘I (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURE: ' 99 1 1 7 5 56 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:18:

CTCTGGAGCC AGGGTCA

(20) INFORMATION FOR SEQ ID NO:19 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 26 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: oligonucleotide primer PDI

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:19: CCCGAATTCG ACGGGACTCT AAGATG 26 (21) INFORMATION FOR SEQ ID NO:20 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: Single ., (D) TOPOLOGY: linear < ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: oligonucleotide primer LFA

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID N0:20: CGGTGGCCAG AGGGAGTGGT CTTC 24 (22) INFORMATION FOR SEQ ID NO:21 “‘*|·· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 46 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURE: - Ϊ .·. (A) NAME/KEY: oligonucleotide primer PD3 • · * • * · · * · (xi) SEOUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:21: * * · " * · I \ CGCGGATCCA ATAAGGAGGA AAAAAAATGT CACCAGATAA ACAAAT 46 • · * * · ♦ * ) ¢23) INFORMATION FOR SEQ ID NO:22 ****** * · (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: ·· (A) LENGTH: 26 base pairs ···· (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single *·* * (D) TOPOLOGY: linear (ix) FEATURE: . (A) NAME/KEY: oligonucleotide primer PD4 • · · (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22: • · • · *** CGCGGTACCC AGTCTCTGGA GCCGGA 26 • · · ·,* * (24) INFORMATION FOR SEQ ID N0:23 * * · ·,ψ'· (i) SEOUENCE CHARACTERISTICS: ” (A) LENGTH: 33 base pairs ,,,.1 (B) TYPE: nucleic acid * * (C) STRANDEDNESS: double • · (D) TOPOLOGT: linear • · · * ·· (ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: adapter fragment for plasmid pCJl (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO.-23: loo 1 1 7556 (25) INFORMATION FOR SEO ID NO:24 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 37 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: double (D) TOPOLOGY: linear C ix) FEATURE: (A) NAME/KEY: polylinker sequence for plasmid pCJXl11 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEO ID NO:24

AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA

• · * · · ···'·' ···· • · • 1 · • · · • · « 1 • · · • 1 • · • · · » · · · • · 1 • 1 1 *·· ' • · · • · « * · · * 1 · • « • 1 • · v ··· • 1 · • · · • · · * · • · · • · • 1 · * ·♦ • ·

Claims (6)

101 117556

1. Yhdistelmä-DNA-menetelmä hermoston tukikudospe-räisen neurotrofisen tekijän (GDNF) tuottamiseksi, t u n-5 n e t t u siitä, että se käsittää vaiheet: (a) alakloonataan hermoston tukikudosperäistä neu-rotrofista tekijää (GDNF) koodittava nukleiinihapposek-venssi ilmentämisvektoriin, joka käsittää siihen alakloo-natun nukleiinihapposekvenssin ilmentämiseksi tarvittavat 10 säätelyelementit ja jossa mainittu nukleiinihapposekvenssi käsittää nukleiinihapposekvenssin, joka on valittu seuraa-vista: i. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa pre-pro-rotta-GDNF:n kuviossa 13 esitettyä aminohapposekvens- 15 siä (sekvenssi tunnusnumero 3); ii. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa rotan kypsän GDNF:n kuviossa 13 esitettyä aminohapposekvenssiä (sekvenssi tunnusnumero 4); [ iii. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa ihmi-20 sen pre-pro-GDNF:n kuvioissa 19 (sekvenssi tunnusnumero 5) ja 22 (sekvenssi tunnusnumero 8) esitettyä aminohapposek- ί .*. venssiä; » · · «M φ iv. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa ihmi- ,·, ; sen kypsän GDNF:n kuviossa 19 esitettyä aminohapposekvens- • · · ‘ 25 siä (sekvenssi tunnusnumero 6); -o * · · · · * · . v. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa amino- • « · ·;;; happosekvenssiä, jolla on yli 70-prosenttinen homologia- • · · aste tunnusnumerolla 4 esitettyjen sekvenssien kanssa; vi. nukleiinihapposekvenssi, joka koodittaa amino- i 30 happosekvenssiä, jolla on yli 70-prosenttinen homologia- • « · aste tunnusnumerolla 6 esitettyjen sekvenssien kanssa; .···. vii. nukleiinihapposekvenssi, joka hybridisoituu • · · ankarissa olosuhteissa (i) - (vi) -kohdassa esitetyn sek- " • * Ί’ venssin komplementaariseen sekvenssiin *:·*: 35 " • · • · · «ta *·"··.· f • · . i£- ' ' 102 ; 1 17556 (b) transformoidaan isäntäsolu mainitulla ilmentä- misvektorilla; J· (c) viljellään isäntäsoluja olosuhteissa, joissa vektori monistuu ja hermoston tukikudosperäinen neurotro- 5 finen tekijä (GDNF) ilmentyy; ja (d) otetaan talteen hermoston tukikudosperäinen neurotrofinen tekijä (GDNF) isäntäsoluviljelmästä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA-menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää li- 10 säksi vaiheen, jossa talteen otettu hermoston tukikudosperäinen neurotrofinen tekijä (GDNF) uudelleenlaskostetaan ja jossa uudelleenlaskostetulla GDNF:llä on kyky edistää dopamiinin ottoa dopaminergisiin neuroneihin.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen yhdistel-15 mä-DNA-menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on eläinsolu.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdistelmä-DNA-menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on COS-7-solu.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen yhdistel- mä-DNA-menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu : .1. on bakteerisolu. • · ·

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen yhdistelmä-DNA- • 1 · 1. menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on E. ' \ 25 coli ♦ 1 · ♦ ·1· • · · • m · • · » • 1 • · · * ♦ · ··· • · * · • · · *·· • 1 · *·· • · · * 1 • · · ··»·· • · .I · **· • » · • 1 75/ .- 103 117556