HU211984A9 - Neuroglial derived neurothrophic factors - Google Patents

Neuroglial derived neurothrophic factors Download PDF

Info

Publication number
HU211984A9
HU211984A9 HU95P/P00478P HU9500478P HU211984A9 HU 211984 A9 HU211984 A9 HU 211984A9 HU 9500478 P HU9500478 P HU 9500478P HU 211984 A9 HU211984 A9 HU 211984A9
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gdnf
neuroglia
neurotrophic factor
acid sequence
derived neurotrophic
Prior art date
Application number
HU95P/P00478P
Other languages
English (en)
Inventor
Leu-Fen Lin
Franklin D Collins
Daniel H Doherty
Jack Lile
Susan Bektesh
Original Assignee
Amgen Boulder Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Boulder Inc filed Critical Amgen Boulder Inc
Publication of HU211984A9 publication Critical patent/HU211984A9/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/26—Psychostimulants, e.g. nicotine, cocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
    • Y10S530/809—Fused cells, e.g. hybridoma
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/839—Nerves; brain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

Hivatkozás az igényelt elsőbbségű szabadalmi bejelentésekre
Az alábbi leírás a következő szabadalmi bejelentésekkel részben folytatólagos (CIP) szabadalmi bejelentés részét képezi: a 07/855 413 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtva: 1992. március 19-én, a 07/788 423 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtva: 1991. november 6-án, a ΰΠΠΊ4 109 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtva: 1991. október 8-án és a 07/764 658 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, benyújtva: 1991. szeptember 20-án, melyek mindegyike a „Neuroglia-eredetű neurotróf faktor” címet viseli.
A találmány alkalmazási területe
A találmány tárgyát neurotróf faktorok, főleg neuroglia-eredetű neurotróf faktorok (GDNF) képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a GDNF természetes forrásból való tisztítására szolgáló eljárások, valamint a GDNF-et kódoló patkány- és emberi gének klónozására szolgáló eljárások. A GDNF-gént egy expressziós vektorba klónozzuk, majd a vektorral biológiailag aktív GDNF-et expresszálunk. A találmány tárgya emellett a GDNF alkalmazása az idegkárosodás kezelésében és megelőzésében, illetve az idegrendszer betegségeiben, például a Parkinson-féle kórban.
Leírunk GDNF-elleni antitesteket, valamint olyan eljárásokat, amelyek alkalmazásával a neurotróf faktorok GDNF-családjának tagjait lehet azonosítani. Végezetül, a találmány tárgyát képezik olyan eljárások, melyek alkalmazásával idegkárosodást lehet kezelni vagy megelőzni, oly módon hogy a betegbe GDNF-et szekretáló sejteket ültetünk be.
A találmány háttere
A neurotróf faktorok természetes fehérjék, amelyeket az idegrendszerben, illetve az idegrendszer által beidegzett nem-idegszövetekben lehet találni, amelyeknek az a funkciójuk, hogy az ideg és/vagy neurogliasejtek túlélését, valamint a fenotípusos differenciálódását biztosítsák [Varon és Bunge, Ann. Rév. Neuroscience, /, 327 (1979); Thoenen és Edgár, Science, 229, 238 (1985)]. Ennek a fiziológiai szerepnek a következtében a neurotróf faktorok hasznosak lehetnek az idegsejtek degenerációjának és a differenciálódott funkciók elvesztésének kezelésében, ami számos neurodegeneratív betegségben előfordul.
Ahhoz, hogy egy adott neurotróf faktor potenciálisan használható legyen az idegkárosodás kezelésében, ahhoz az kell, hogy a károsodott idegsejtek osztálya vagy osztályai reagáljanak a faktorra. A különböző neurotróf faktorok tipikusan eltérő osztályba tartozó idegsejteket érintenek. Ennélfogva tanácsos, hogy kéznél legyen számos különböző neurotróf faktor, hogy a sérült neuronok minden egyes osztályát tudjuk kezelni, ami a betegség vagy sérülés különböző formáiban előfordul.
A neurotróf faktorok megőrizhetik a reagáló neuronokat számos, egymáshoz nem kapcsolódó sérüléssel szemben. Például a neurotróf faktor idegnövekedési faktor (NGF) az érzékelő neuronok jelentős részét képes megmenteni a pusztulástól amit az axonális folyamataik elvágása okoz [Rich és mtsai., J. Neurocytol., 16, 261 (1987); Ottó és mtsai., J. Neurosci., 83, 156 (1987)], az ontogenetikus pusztulástól az embrionális fejlődés során [Hamburger és mtsai., J. Neurosci., 4, 767 (1984)], valamint attól a pusztulástól, amit a taxol és a ciszplatin adagolása okozhat [Apfel és mtsai., Ann. Neurol., 9, 87 (1991)]. A védelemnek ez a látható általánossága vezetett ahhoz a koncepcióhoz, hogy ha egy neurotróf faktor megóvja a reagáló neuronokat a kísérleti pusztulással szemben, akkor hasznos lehet azoknak a betegségeknek a kezelése, amelyek magukba foglalják ezeknek a neuronoknak a károsodását a betegben, még akkor is, ha az etiológia nem ismert.
Egy adott neurotróf faktor, amellett, hogy a helyes neuronális specifitással rendelkezik, elegendő mennyiségben kell hogy hozzáférhető legyen ahhoz, hogy egy gyógyászati kezelésben alkalmazható legyen. Mivel a neurotróf faktorok a szövetekben végtelenül kis mennyiségben fordulnak elő [Hofer és Barde, Natúré, 331, 261 (1988); Lin és mtsai., Science, 246, 1023 (1989)], ezért nagyon kényelmetlen lenne ha a gyógyászatban alkalmazható mennyiségű neurotróf faktorokat közvetlenül állati szövetekből kellene izolálni. Ennek egy alternatívája az, hogy kívánatos lenne, ha egy neurotróf faktor génjét lokalizálni lehetne, abból a célból, hogy ezen az alapon egy rekombináns expressziós rendszert lehessen létrehozni, amellyel a fehérjét korlátlan mennyiségben elő lehet állítani.
A jelen találmány feltalálói olyan eljárást írnak le, amellyel biológiai mintákat lehet átvizsgálni neurotróf aktivitás szempontjából a feketeállomány dopaminerg neuronjainak embrionális prekurzorain, amelyek a Parkinson-kórban degenerálódnak. Ez a neurotróf faktorok azonosítását célzó biológiai vizsgálat, amely hasznos lehet a Parkinson-kór kezelésében, egy korábban leírt vizsgálaton alapul [Friedman és mtsai., Neuro. Sci. Lett., 79, 65-72 (1987), mely publikációt a kitanítás részeként kell tekinteni], és a jelen találmányban módosításokkal alkalmazunk.
Ezt a vizsgálati eljárást használtuk a dopaminerg neuronokra irányuló neurotróf aktivitás potenciális forrásainak átvizsgálására. Ajelen találmányban egy új neurotróf faktor jellemzését írjuk le, amelyet egy ilyen forrásból izoláltunk, a B49 jelű glioblasztóma-sejtvonal felhasználásával előállított kondicionált táptalajból [Schubert és mtsai., Natúré, 249, 224-227 (1974), mely publikációt a kitanítás részeként kell tekinteni]. Az ebből a sejtvonalból származó kondicionált tápközegről korábban leírták, hogy dopaminerg neurotróf aktivitással rendelkezik [Bohn és mtsai., Soc. Neurosci. Abs., 15, 277 (1989)]. Ebben a korábbi közleményben a neurotróf aktivitás forrását nem tisztították meg, nem jellemezték kémiailag, illetve nem mutatták ki, hogy a hatás egyetlen, a kondicionált közegben található ágensnek a következménye. Az idegkárosodást olyan körülmények okozzák, amelyek veszélyeztetik egy vagy több idegsejt típus túlélését és/vagy megfelelő működését. Az ilyen idegkárosodások
HU 211 984 A9 számos különböző okból felléphetnek, amelyek közül néhányat az alábbiakban megemlítünk.
Az idegkárosodás lehet fizikai sérülés következménye, ami az axonális folyamatok és/vagy az idegsejttestek degenerálódását okozza a sérülés helyének közelében. Az idegkárosodás akkor is előfordulhat, ha a vérnek az idegrendszer részeihez való áramlása ideiglenesen vagy véglegesen megszakad, például infarktus következtében. Idegkárosodás akkor is előfordulhat, ha szándékosan vagy véletlenül neurotoxinok hatásának tesszük ki az idegsejteket, például rák- vagy AIDS-kemoterápiás hatóanyagok hatásának, azaz ciszplatin vagy didezoxi-citidin (ddC) hatásának. Az idegkárosodás akkor is fellép, ha krónikus metabolikus betegségben szenved a beteg, ilyen például a cukorbaj, vagy a rossz veseműködés. Idegkárosodás felléphet neurodegeneratív betegségek következtében is, ilyen például a Parkinson-kór, az Alzheimer-kór, és a amiotrófiás laterális szklerózis (ALS), amely specifikus neuron populációk degenerációjának következménye.
Ebben a bejelentésben egy új neurotróf faktort írunk le. A neurotróf faktorok természetes fehérjék, amelyek elősegítik specifikus idegsejtek normális működését és/vagy megvédik ezeket a sejteket a károsodás számos különböző formájával szemben. Ezek azok a tulajdonságok, amelyek azt sugallják, hogy a GDNF hasznos lehet különböző idegkárosodások kezelésében, beleértve azokat, amelyeket az előzőkben konkrétan említettünk.
AParkinson-kórt egyedi tünetegyüttessel lehet azonosítani, ide tartozik a merevség, a mozgás lassúbbodása, seborrhea. felgyorsult járás, görbült testtartás, nyáladzás, „pirulagörgető” reszketés. A betegség a világ minden embertípusában előfordul, a fellépés átlagos életkora 60 év.
Az egymásnak ellentmondó elméletek, ellentmondások évei után a Parkinson-kór fő okozójaként egy biokémiai jelenség merült fel [lásd például Bergman, Drug Store News, /2, IP19 (1990)]. A Parkinson-kór megértéséhez lényeges fontosságúak az agynak azon részei, melyeket feketeállomány, bazális gangba és - különösen csíkolt test néven ismerünk. A feketeállomány, ami a középagyban pigmentált szürke anyag bilaterálisán páros rétege, vesz részt a dopamin transzmisszióban, míg a normális bazális ganglionok működése számos kölcsönhatást és visszaható rendszereket foglal magában, amelyek a feketeállománnyal vannak kapcsolatban és részben a dopamin, acetilkolin és más anyagok közvetítik.
A Parkinson-kórban működési zavar van a feketeállomány dopaminerg aktivitásában, amelyet neuronális degenerálódás okoz. Érmek egy eredménye a dopamin deficiencia állapota, és az aktivitás egyensúlyának eltolódása a kolinerg predominancia irányába. Ennélfogva, jóllehet nincs növekedés az acetilkolin koncentrációjában, ezen kolinerg mediátor központi idegrendszerre gyakorolt izgató hatása (azaz a reszketősek) meghaladja a lecsökkent dopamin gátló hatását.
A Parkinson-kór leghatékonyabb kezelése a mai napig a Levodopa orális beadása. A Levodopa behatol a központi idegrendszerbe, és enzimatikusan dopaminná alakul a ganglionokban. Az az elterjedt vélemény, hogy a Levodopa jótékony hatása az, hogy fokozza a dopamin koncentrációját az agyban. Sajnos azonban sem a Levodopa, sem egyetlen más, kevésbé gyakran használt gyógyszer sem akadályozza meg a betegség előrehaladását, amit a dopaminerg neuronok degenerációja okoz. Más kutatók leírták, hogy különböző biológiai forrásokban dopaminerg aktivitás található. Springer és munkatársai a WO 91/01739 számú PCT közzétételi iratban dopaminerg neurotróf aktivitást azonosítottak a perifériális idegrendszer sejtjeiből származó kivonatban. Az azonosított aktivitást nem tisztították, hanem hozzárendelték egy faktorhoz, amelynek molekulasúlya 10 000 daltonnál kevesebb volt. A faktort patkányülőidegéből izolálták, de láthatóan nem CNTF, amit szintén meg lehet találni az idegben [Lin és mtsai., Science, 246, 1023 (1989)].
Az Appel és munkatársai a 5,017,735 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban dopaminerg aktivitást azonosításáról számolnak be egy farokcsonti idegburok-szövetkivonatban. Ebben az esetben sem tisztították meg azokat a faktorokat, amelyek az aktivitást hordozták, és az aktivitást hordozó frakció látszólagos molekulasúlya viszonylag alacsony volt. [Lásd még Niijima és mtsai., Brain Rés., 258, 151-154 (1990) (felnőtt patkányagy kémiailag afferens mentesített striátuma); Lo és mtsai., Soc. Neurosci. Abstr., 16, 809 (1990) (striátum-eredetű neurotróf faktor)]. Emellett más ismert neurotróf faktorról is kimutatták, hogy dopaminerg aktivitással rendelkezik, például az agyi eredetű neurotróf faktorról (BDNF), valamint a savas és bázikus fibroblaszt növekedési faktorokról.
A találmány szerinti GDNF-et azon az alapon izoláltuk, hogy képes elősegíteni patkányembrió-középagyból izolált sejtek túlélését és funkcionális aktivitását. Ezek a dopaminerg idegsejtek a felnőtt feketeállományban található dopaminerg idegsejtek embrionális prekurzorai, amelyek a Parkinson-kórban degenerálódnak. Ennél fogva a GDNF hasznos lehet a neuronális degeneráció csökkentésében, ami a Parkinson-kór tüneteit okozza.
Emellett a GDNF hasznos lehet humán betegek dopaminerg idegsejtjei egyéb formájú károsodásának vagy helytelen működésének kezelésében. Az ilyen károsodás vagy helytelen működés előfordulhat skizofréniában, illetve egy másféle pszichózisokban. Az ilyen állapotok jelenlegi kezelési módszerei gyakran olyan gyógyszereken alapulnak, melyek a dopamin receptorokra hatnak, ami arra utal, hogy az ezeket a receptor-hordozó neuronális populációkat beidegző dopaminerg neuronok helytelen működése játszhat szerepet a kóros folyamatban.
Az egyéb neurotróf faktorokkal szerzett korábbi tapasztalatok alapján az idegkárosodás új formái, amelyek kezelhetők GDNF-fel, fognak előfordulni, amint többet tudunk azoknak az idegsejteknek a különböző típusairól, amelyek erre a neurotróf faktona reagálnak. Például az idegnövekedési faktor (NGF) csak azután vált az Alzheimer-kór potenciálisan hasznos kezelésére alkalmas anyaggá, miután újabban felfedezték, hogy az
HU 211 984 A9
NGF neurotróf faktorként hat a bazális előagy kolinerg neuronokra, amelyek az Alzheimer-kórban degenerálódnak [Williams és mtsai., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83, 9231 (1986)]. A jelen találmányban eljárásokat adunk meg más olyan idegkárosodási formák meghatározására, amelyeket jól lehet kezelni a GDNF-fel.
Patrick Aebischer és munkatársai leírtak egy féligáteresztő membránból kialakított, beültethető gyógyászati segédeszközt, amely jól használható gyógyszerek vagy gyógyhatású anyagok bejuttatására bizonyos körülmények között. Például azt javasolták, hogy olyan sejteket kell kapszulázni, amelyek neurotranszmitter faktorokat szekretálnak, és az ilyen gyógyászati segédeszközöket Parkinson-kórban szenvedő betegek agyába kell beültetni [Aebischer és mtsai., 4,892,538 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Aebischer es mtsai., 5,011,472 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Aebischer és mtsai., 5,106,627 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; WO 91/10425 számú PCT közzétételi irat; WO 91/10470 számú PCT közzétételi irat; Winn és mtsai.. Exper. Neurol., 113, 322-329 (1991); Aebischer és mtsai., Exper. Neurol., 111, 269-275 (1991); Tresco és mtsai., ASAIO, 38, 17-23 (1992)].
A találmány összefoglalása
A találmány tárgyát egy alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor képezi (GDNF). A találmány egy megvalósítási módja szerint az alapvetően megtisztított GDNF-et úgy állítjuk elő, hogy specifikus aktivitása legalább 24 000-szer magasabb, mint a B49 kondicionált táptalajé. Az alapvetően megtisztított GDNF specifikus aktivitása legalább körülbelül 12 000 TU/pg.
A találmány szerinti alapvetően megtisztított GDNF látszólagos molekulasúlya nem-redukáló SDSPAGE-eljárással körülbelül 31-42 kD-nak, redukáló SDS-PAGE-eljárással pedig körülbelül 20-23 kD-nak adódik. Az alapvetően megtisztított GDNF-nek az Nterminális szekvenciája alapvetően az alábbi aminosavakat tartalmazza (szekvencia-azonosítószám: 1):
(Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-ArgArg-Glu-(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)Pro-(Asp)-(Asn).
A patkány-GDNF érett és „prepro-”formáit a 13. és 14. ábrán mutatjuk be (szekvencia-azonosítószám: 3 és szekvencia-azonosítószám: 4). A humán érett GDNF aminosav-szekvenciáját a 19. ábrán mutatjuk be (szekvencia-azonosítószám: 5). A humán GDNF prepro-formájának az aminosav-szekvenciáját a 19. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 5) és a 22. ábrán (szekvenciaazonosítószám: 8) mutatjuk be.
A találmány tárgya egyrészt eljárás tisztított GDNF előállítására, amely a következő lépéseket tartalmazza: 1) szérummentes kondicionált tenyésztő táptalajt állítunk elő B49 jelű glioblasztóma-sejtek felhasználásával; 2) a kondicionált táptalajt betöményítjük; 3) a betöményített kondicionált táptalajt heparin-Sepharose kromatográfíát végzünk; 4) az említett heparin-Sepharose-kromatográfia során kapott frakciókat gyors protein-folyadékkromatográfiának (FPLC) vetjük alá; 5) az említett gyors protein-folyadékkromatográfia során kapott frakciókat fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiának (RP-HPLC) vetjük alá. Az egyik megvalósítási mód szerint a tisztított GDNF előállítása az alábbi lépéseket is tartalmazza: 6) a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával kapott frakciókat preparatív SDS-PAGE-eljárásnak vetjük alá; és 7) a preparatív SDS-PAGE-eljárás során kapott frakciókat fordított fázisú nagy hatékonyságú folyadékkromatográfiának vetjük alá.
A találmány tárgyát képezi továbbá a patkányGDNF-génjének klónozása a B49-sejtvonalból készített cDNS-könyvtárból. Az érett és prepro- patkányGDNF-et kódoló nukleinsav-szekvenciát a 13. ábrán mutatjuk be (szekvencia-azonosítószám: 3). Egy GDNF-et kódoló humán gén előállítását is közöljük. Az érett humán GDNF-et kódoló nukleinsav-szekvenciát a 19. ábrán adjuk meg (szekvencia-azonosítószám: 5). A humán GDNF prepro-szegmense első 50 aminosavának nukleinsav-szekvenciáját a 22. ábrán adjuk meg (szekvencia-azonosítószám: 8).
A találmány tárgyát képezik olyan gyógyászati készítmények is, amelyek hatásos mennyiséget tartalmaznak a tisztított GDNF-ből, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban. Leírunk egy olyan eljárást is, amellyel az idegkárosodást meg lehet előzni illetve kezelni lehet, és abból áll, hogy egy ilyen kezelést igénylő betegnek a GDNF terápiásán hatásos mennyiségét beadjuk. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint az idegkárosodás Parkinson-kórt, illetve károsodott vagy rosszul működő dopaminerg idegsejteket jelent.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a GDNF-et rekombináns DNS módszerrel állítjuk elő, az ismertetett, GDNF-et kódoló gének felhasználásával. A találmány tárgyát képezi egy biológiailag aktív GDNF előállítására szolgáló vektor, amely az érett vagy prepro-GDNF-et kódoló nukleinsav-szekvenciához funkcionálisan hozzákapcsolt expressziós szabályozó elemeket tartalmaz. A találmány tárgya továbbá rekombináns DNS eljárás GDNF előállítására, ami abból áll hogy: egy GDNF-et kódoló DNS-szekvenciát egy expressziós vektorba szubklónozzuk, amely a DNS-szekvencia expresszálásához szükséges szabályozó elemeket tartalmaz; egy gazdasejtet az említett vektorral transzformálunk; a gazdasejteket olyan körülmények között szaporítjuk, amelyek lehetővé teszik a vektor amplifikálódását és a GDNF expresszióját; kinyerjük a GDNF-et.
A találmány tárgya továbbá egy rekombináns DNS eljárás GDNF előállítására amire jellemző, hogy a találmány szerinti gazdasejteket a vektor megsokszorozódására és a GDNF expresszálására alkalmas körülmények között szaporítjuk; a GDNF-et kinyerjük.
A találmány tárgyát képezik a GDNF-et felismerő, alapvetően megtisztított antitestek. A találmány tárgya továbbá egy eljárás az idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére, ami abban áll, hogy a neuroglia-ere4
HU 211 984 A9 detű neurotróf faktort szekretáló sejteket beültetjük egy ilyen kezelésre szoruló betegbe. Végezetül, a találmány tárgyát képezi egy gyógyászati segédeszköz is amely idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére szolgál, oly módon, hogy a gyógyászati segédeszközt beültetjük egy betegbe. A gyógyászati segédeszköz egy féligáteresztő membrán, a GDNF-et szekretáló sejtet beültetjük a membránba, és az említett membrán átereszti a GDNF-et, de nem ereszti át azokat a faktorokat a betegből, amelyek káros hatással lennének a sejtekre.
Az ábrák leírása
Az 1. ábrán töményített B49 jelű glioblasztóma-sejtek felhasználásával készített szérummentes növesztő kondicionált táptalajoldaton végzett heparin-Sepharose-kromatográfia eredményeit mutatjuk be. Az ábrán az eluátum OD2go értéke (folyamatos vonal), vezetőképessége (háromszöggel szaggatott vonal) és GDNF-aktivitása TU-ban (körrel szaggatott vonal) látható. A megjelölt frakciókat egyesítjük a további tisztításhoz.
A 2. ábrán az 1. ábrából származó egyesített frakciókon végrehajtott FPLC-Superose-kromatográfia eredményei láthatók. Az ábrán az eluátum OD2g0 értéke (folyamatos vonal) és GDNF-aktivitása látható TU-ban (körrel szaggatott vonal).
A 3. ábrán a 2. ábrából származó 14-es frakció RP-HPLC-eredményei láthatók. Az ábrán az OD2|4 értéke látható, és a GDNF-aktivitása TU-ban megadva alatta.
A 4. ábrán a 3. ábra 3-10-es frakciójának ezüsttel festett SDS-PAGE-eljárással végzett elemzése eredményei láthatók. Az S-sáv tartalmazza a molekulasúly standardokat.
Az 5. ábrán a 4. ábra 5. és 6. frakciójával végzett preparatív SDS-PAGE-eljárás eredményei láthatók. A gélszeletek GDNF-aktivitását (TU-ban) vizsgáltuk. A gélszeletekben levő anyag molekulasúlyát is meghatároztuk molekulasúly markerek alkalmazásával (Amersham).
A 6. ábrán az 5. ábra 16-23-as frakcióinak RPHPLC eredményei láthatók. Az A-kromatogram tartalmazza a mintát, a B-kromatogram a kontroll (egyesített gélkivonat az üres sáv megfelelő szeleteiből).
A 7. ábrán láthatók a 6A ábra 3-as csúcsának (1-es sáv) ezüsttel festett SDS-PAGE-eredményei, valamint egy molekulasúly kontroll (az S sáv).
A 8. ábrán a tisztított GDNF-ből kapott N-terminális aminosav-szekvencia látható. Az üres zárójelek egy olyan pozíciót mutatnak, amelyben az aminosavat nem lehet az alkalmazott szekvenálási technikával meghatározni. Ahol a maradékokat zárójelben adjuk meg, ott bizonyos bizonytalanság volt a csoport meghatározásában. A teljes helyes aminosav-szekvencia a 19. ábrán látható.
A 9. ábrán a tisztított GDNF tripszines emésztésével kapott elegy RP-HPLC-s eredményei láthatók. Az A-kromatogram tartalmazza a mintát, a B-kromatogram a kontroll (csak tripszint tartalmaz).
A 10. ábrán a 9. ábra 37-es csúcsának RP-HPLC-s eredményei láthatók brómciános hasítás után.
All. ábrán a 10. ábra 1-es csúcsa redukciós termékén végzett RP-HPLC eredményei láthatók.
A 12. ábrán a tisztított GDNF-ből kapott belső aminosav-szekvencia látható.
A 13. ábrán egy B49-sejt-könyvtár cDNS-klónból (lambda-ZapII76.1) kapott nukleinsav-szekvencia látható. Látható emellett az ebből származtatott aminosav-szekvencia is. Az érett GDNF-et kódoló nukleinsav-szekvenciát aláhúztuk. A GDNF legelőnyösebb prepro-formája N-terminális szekvenciáját csillaggal jelöltük.
A14. ábrán az érett GDNF származtatott aminosavszekvenciája látható.
A 15. ábrán a tisztított B49-sejt GDNF-fel és a humán rekombináns CNTF-fel kapott eredmények láthatók, a csirke embrió ciliáris ganglionjából származó paraszimpatikus neuronok túlélésének vizsgálatában. Az Y-tengelyen a növekvő sűrűség fokozott neuron túlélést jelent. Az X-tengelyen az egyes neurotróf faktorok csökkenő koncentrációi láthatók. A kontrollnak jelzett görbe jelentése azonos térfogatú inaktív HPLCfrakciók, közel ahhoz, amely a GDNF-et tartalmazza, amellyel a GDNF-nek jelzett görbét előállítottuk.
A 16. ábrán a tisztított B49-sejt GDNF-fel és a humán rekombináns CNTF-fel kapott eredmények láthatók, a csirke embrió szimpatikus lánc-ganglionjából származó szimpatikus neuronok túlélésének vizsgálatában. Az Ytengelyen a növekvő sűrűség fokozott neuron túlélést jelent. Az X-tengelyen az egyes neurotróf faktorok csökkenő koncentrációi láthatók. A kontrollnak jelzett görbe jelentése azonos térfogatú inaktív HPLC-frakciók, közel ahhoz, amely a GDNF-et tartalmazza, amellyel a GDNFnek jelzett görbét előállítottuk.
A 17. ábrán A COS-sejt alkalmazásával előállított kondicionált táptalajjal végzett biológiai vizsgálatok eredményei láthatók, amelyben azt vizsgáltuk, hogy képese fokozni a középagyi dopaminerg neuronok dopamin felvételét tenyészetben. Az Y-tengelyen a felvett radioaktívan jelzett dopamin mennyisége látható, az X-tengelyen a töményített COS-sejt táptalaj növekvő mennyiségével szemben. A B-l-nek jelzett görbe jelenti a GDNF expressziójához megfelelő orientációban GDNF-génnel transzfektált COS-sejtek alkalmazásával előállított szérummentes kondicionált táptalajt. A C-l-nek jelzett görbe az ellentétes orientációban (ami megakadályozza az expressziót) transzfektált COS-sejtek alkalmazásával előállított szérummentes kondicionált táptalajt jelenti.
A 18. ábrán a COS-sejtek alkalmazásával előállított kondicionált táptalajjal végzett biológiai vizsgálat eredményei láthatók, amely arra irányult, hogy képes-e fokozni a túlélést csirke embriók szimpatikus láncából származó szimpatikus neuronok tenyészetében. Az Ytengelyen a tenyészetek által redukált MTT-festék mennyisége látható, ami a neuronok túlélésével arányos. Az X-tengelyen a töményített COS-sejt táptalaj növekvő hígításai láthatók. A GDNF-fel jelölt görbe a GDNF expresszálása céljából a helyes orientációban GDNF-génnel transzfektált COS-sejtek alkalmazásával előállított szérummentes kondicionált táptalajt jelöli. A CONTROL-nak jelzett görbe az ellentétes orientációban (ami megakadályozza az expressziót) transzfek5
HU 211 984 A9 tált COS-sejtek alkalmazásával előállított szérummentes kondicionált táptalajt jelenti.
A 19. ábrán az alábbi, 2C. példában leírt módon kapott humán GDNF nuklein-sav-szekvencia egy része látható, benne az érett humán GDNF-et kódoló teljes génnel. Ábrázoljuk az érett humán GDNF származtatott aminosav-szekvenciáját. Az érett humán GDNF aminosav-szekvenciáját aláhúztuk.
A 20. ábrán a GDNF-nek az a képessége látható, hogy serkenti a dopamin felvételt, és a tirozin hidroxiláz (TH) immunfestést a dopaminerg neuronokbán. A tenyészeteket az 1B. példában leírtak alapján hozzuk létre. A GDNF-et a szélesztés napján adjuk hozzá, majd kilenc nap elteltével in vitro megismételjük. A. 15 nap elteltével in vitro mérjük a 3H-DA felvételt. B. A tenyészeteket 16 nap elteltével fixáljuk in vitro 4%-os paraformaldehiddel, alaposan mossuk, 0,2%-os Triton Χ-100-zal permeabilizáljuk, és poliklonális TH-elleni antitesttel festjük (Eugine Tech International, Allendale, NJ). A primer antitest kötődést Vectastatin ABC kittel tesszük láthatóvá (Vector Labs, Burlingame, CA).
A 21. ábrán a GDNF dopaminerg neuronok elleni specifitása látható. A tenyészeteket az 1B. példában leírtak alapján hozzuk létre. A. A 3H-DA felvételt nyolc nap múlva mérjük in vitro. B: A l4C-GABA felvételt nyolc nap elteltével mérjük in vitro. A sejteket a ’H-DA felvételnél leírt módon inkubáljuk és kezeljük, azzal a különbséggel, hogy a felvételhez alkalmazott puffer Kreb-Ringer-féle foszfát puffer (pH = 7,4), amely 5,6 mmól/1 glükózt, 1,3 mmól/1 EDTA-t, 10pmól/l amino-oxiecetsavat (a GABA lebomlás megakadályozására), 2 mmól/1 β-alanint (hogy megakadályozzuk a neuroglia GABA felvételét), és 0,1 gmól/l 14GABA-t (150 mCi/mmól, New England Nuclear, Boston, MA). 1 mmól/1 diaminovajsav (DABA) jelenlétében, amely a l4C-GABA GABA neuronokba való felvételének erős gátlószere, a l4C-felvétel 10%-ra csökken. A DABA jelenlétében mért kontroll értékeket a kísérleti eredményekből kivontuk.
A 22. ábrán a humán GDNF nukleinsav-szekvenciájának egy része látható amint az alábbi, 2D. ábrán látható, beleértve a humán prepro-GDNF 1-50-es aminosavait kódoló szekvenciát. A humán prepro-GDNF első 50 aminosavának származtatott aminosav-szekvenciáját is ábrázoljuk. Ez az információ, a 19. ábrán megadott kódoló szekvencia információval együtt megadja a humán prepro-GDNF teljes kódoló szekvenciáját, valamint a humán prepro-GDNF-fehérje származtatott aminosav-szekvenciáját.
A 23. ábrán a Sacl és Pstl hasítási helyek térképe látható a pBSSK-lambda3AluI-plazmidban, a 2D. példában leírtak alapján.
A 24. ábrán a GDNF dopaminerg neuronokkal szemben mulatott specifitása látható. A tenyészeteket az 1B. példában leírtak alapján készítettük. A GDNF-et a szélesztés napján adjuk a tenyészethez, és a felvételt hat nap elteltével in vitro mérjük. Az A görbén a dopamin felvételt, a B. ábrán a szerotonin 21 felvételt látjuk.
A 25. ábrán Coomassie Blue-val festett SDS-PAGE-eljárás gél látható, amelyet redukáló körülmények között futtattunk. A futtatott frakciók egy baktérium kivonatból származtak, a természetes konformációt fel nem vett GDNF S-Sepharose oszlopon való futtatása után, a természetes konformáció felvétele előtt (lásd 6C. példa). A 2-8-as sávok az oszlopról egymás után eluált frakciókat jelentik. A 3-5-ös frakciókat, amelyekben a GDNF feldúsult, a természetes konformáció beállításához egyesítjük. Az 1-es sávban a molekulasúly standardok láthatók (SDS 70L, Sigma).
A 26. ábrán a GDNF-oldat SDS-poliakrilamid-géljének Coomassie Blue-val való festését láthatjuk; a természetes konformáció felvétele előtt (6. és 13. sáv), a természetes konformáció felvétele után (2-es sáv), illetve a természetes konformáció felvétele, majd 150 mmól/1 β-merkaptoetanollal való visszaredukálás után (5. sáv). Az anyag a természetes konformáció felvétele előtt, és a visszaredukálás után monomerként fut, molekulasúlya körülbelül 16 kD. A természetes konformáció sikeres felvétele után a GDNF (redukció nélkül) dimerként fut, molekulasúlya körülbelül 30 kD (lásd 6C. példa). A 15-ös sávban a molekulasúly standardok láthatók (SDS 70L, Sigma).
A 27. ábrán a természetes konformációt felvett GDNF-fel végzett biológiai vizsgálat eredményei láthatók; a vizsgálati eljárás a GDNF-nek azon a képességén alapul, hogy elősegíti a csirke embrió szimpatikus neuronok túlélését tenyészetben. A biológiai vizsgálati eljárást a 4A. példában írjuk le. Az X-tengelyen látható optikai sűrűséget (amely a túlélő neuronok számával arányos) az X-tengelyen látható GDNF koncentrációval szemben ábrázoljuk (amit Coomassie Blue-val festett SDS-poliakrilamid-gél lézerdenzitometriás letapogatásával mérünk). A természetes konformációt újra felvett GDNF ED50-értéke a csirke embrió szimpatikus neuron túlélésére körülbelül 3 ng/ml.
A 28. ábrán a természetes konformációt újra felvett GDNF-fel végzett biológiai vizsgálatok eredményei láthatók; a vizsgálatok során azt mértük, hogy képes-e fokozni a patkány embrionális középagyból származó nigrális dopaminerg neuronok dopamin felvételét. A biológiai vizsgálati eljárást az 1B. példában leírtak alapján végezzük. Az Y-tengelyre felvitt dopamin felvételt az X-tengelyre felvitt GDNF-koncentrációval szemben ábrázoljuk. A természetes konformációt újra felvett GDNF ED50-értéke a fokozott dopamin felvételre ezekben a tenyészetekben körülbelül 3 pg/ml.
Az előnyös megvalósítási módok részletes leírása
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány jelenleg előnyösnek tartott megvalósítási módjait, amelyek az alábbiakban bemutatott példákkal együtt a találmány elveinek magyarázatát szolgálják. A találmány szerinti megoldás kidolgozása előtt a GDNF-et nem azonosították diszkrét biológiailag aktív anyagként, illetve nem létezett alapvetően tiszta formában. Amint az alábbiakban láthatjuk, megadjuk a GDNF részletes leírását, amely kiterjed az alábbiakra: fizikai, kémiai és biológiai jellemzők; alkalmazhatóság; előállítási mód; a GDNF-et kódoló nukleinsav-szekvenciák; az ilyen
HU 211 984 A9 nukleinsav-szekvenciákat tartalmazó vektorok; rekombináns eljárások az előállítására; és a találmány egyéb megvalósítási módjai.
A GDNF egy olyan fehérje, amelyet neurogliasejtekben lehet azonosítani, illetve azokból nyerhető ki, és neurotróf aktivitással rendelkezik. Pontosabban, a GDNF egy dopaminerg neurotróf fehérje, amelyet részben azzal lehet jellemezni hogy képes a dopamin felvételét fokozni a feketeállomány dopaminerg neuronjai embrionális prekurzoraiban, valamint azzal, hogy képes elősegíteni a paraszimpatikus és szimpatikus idegsejtek túlélését. Az alapvetően megtisztított GDNF-et számos különböző módon lehet jellemezni:
1. Specifikus aktivitása legalább körülbelül 12 000 TU/gg.
2. Redukáló SDS-PAGE-eljárással mérve molekulasúlya körülbelül 20-23 kD
3. Nem-redukáló SDS-PAGE-eljárással mérve molekulasúlya körülbelül 31-42 kD.
4. Specifikus aktivitása legalább 24 000-szer magasabb, mint a B49 kondicionált táptalaj specifikus aktivitása.
5. Középagy tenyészetben képes a tirozin-hidroxiláz immunreaktivitását fokozni.
6. N-terminális aminosav-szekvenciája a 8. ábrán látható (szekvencia-azonosítószám: 1).
7. Belső aminosav-szekvenciája a 12. ábrán látható (szekvencia-azonosítószám: 2).
A találmány szerinti GDNF-et az alábbiakban részletesebben ismertetjük. Nyilvánvaló, hogy a találmánynak ez a megvalósítási módja magába foglal minden olyan dopaminerg neurotróf fehérjét, amelynek N-terminális aminosav-szekvenciája ugyanaz, vagy alapvetően homológ a 8. ábrán megadott szekvenciával (szekvencia-azonosítószám: 1). A találmány tárgyát képezi valamennyi olyan dopaminerg neurotróf fehérje, amelynek belső aminosav-szekvenciája ugyanaz, vagy alapvetően homológ a 12. ábrán megadottal (szekvencia-azonosítószám: 12).
A találmány tárgyát továbbá egy új dopaminerg neurotróf fehérje képezi amelyet az alábbiakban neuroglia-eredetű neurotróf faktornak nevezünk (GDNF). A GDNF-et B49 jelű glioblasztóma-sejtek felhasználásával készített szérummentes kondicionált táptalajban azonosítottuk, illetve onnan izoláltuk alapvetően megtisztított formában.
A GDNF-et tisztítottuk és jellemeztük, majd a tisztított anyag részleges aminosav-szekvenciáját meghatároztuk. A kapott részleges aminosav-szekvencia alapján DNS-próbákat terveztünk egy patkány-cDNS-klón előállítására, amelyet a GDNF rekombinánsok előállításában lehet használni. Az ilyen klón nukleinsav-szekvenciáját, valamint a patkány-GDNF ebből következő aminosav-szekvenciáját a 13. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 3) és a 14. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 4) adjuk meg.
A GDNF N-terminális aminosav-szekvenciáját meghatároztuk, ez látható a 8. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 1). A GDNF belső aminosav-szekvenciájának egy részét is meghatároztuk, ez látható a 12. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 2). A tisztított GDNF látszólagos molekulasúlya körülbelül 31-42 kD SDSPAGE-eljárással meghatározva nem-redukáló körülmények között, és körülbelül 2030 kD SDS-PAGE-val redukáló körülmények között anélkül, hogy erre a feltételezésre szorítkoznánk, azt állítjuk, hogy ez az információ konzisztens azzal, hogy a GDNF egy glikozilezett, diszulfid kötésekkel összetartott dimer molekula a természetes állapotában.
Amint azt az alábbi 6C. példában részletesebben leírjuk, a humán GDNF-gén expressziója egy bakteriális expressziós rendszerben rekombináns humán GDNF, azaz rhGDNF termelését eredményezi. Az expresszió után izolált anyag alapvetően inaktív biológiailag, és monomer formában létezik. A természetes konformáció újra felvétele után a GDNF biológiailag aktív, diszulfid kötésekkel Összetartott dimer formájában létezik. A GDNF tehát egy diszulfid kötésekkel összetartott dimer molekula a természetes, biológiailag aktív formájában. A találmány azonban a GDNF-nek mind a monomer, mind a dimer formájára, illetve a biológiailag aktív és inaktív formájára is vonatkozik.
Hibridizációs próbákat a patkány-GDNF nukleinsav-szekvenciája alapján készítettünk, azzal a céllal, hogy a humán GDNF-et kódoló genomi DNS gént klónozzuk. Az érett GDNF-et kódoló humán gént és a humán érett GDNF aminosav-szekvenciáját a 19. ábrán adjuk meg (szekvencia-azonosítószám: 5).
A GDNF-et jellemezhetjük azon képessége alapján is, hogy fokozza a dopamin felvételét a feketeállomány dopaminerg neuronok embrionális prekurzorain, amint azt az alábbi IC. példában közöljük. A GDNF-et továbbá azon az alapon is jellemezhetjük, hogy képes elősegíteni a paraszimpatikus és szimpatikus idegsejtek túlélését, amint azt az alábbi 4. példában leírjuk.
A GDNF-et emellett azzal is jellemezhetjük, hogy képes fokozni a tirozin-hidroxiláz immunreaktivitását középagy-tenyészetekben. Ennek a jellemzőnek egy példáját az 1E. példában írjuk le, és a 20. ábrán mutatjuk be. Emellett a GDNF-ről kimutattuk, hogy bizonyos specifitása van a dopaminerg neuronokra, általában a neuronokra vonatkozóan. Ezt például igazolja a GABA-t tartalmazó neuronokbán a gamma-amino-vajsav (GABA) felvételére gyakorolt korlátozott hatása. Ezt is leírjuk az 1E. példában, és a 21. ábrán mutatjuk be. A GDNF-ről az is kiderült, hogy korlátozott hatással van, ha van ilyen hatás egyáltalán, a szerotonin felvételére a szerotonerg neuronokbán. Ezt az 1E. példában írjuk le, és a 24. ábrán mutatjuk be.
A jelen leírásban minden, a neuroglia-eredetű neurotróf faktorokra tett hivatkozást úgy kell értelmezni, hogy az bármilyen eredetű olyan neurotróf faktorra vonatkozik, amely alapvetően homológ, és biológiailag ekvivalens az alábbiakban ismertetett és leírt GDNFfel. A patkány- és humán fehérjék között homológia körülbelül 93%, és mindegyik emlős-GDNF hasonló magas mértékű homológiával rendelkezik. Az ilyen GDNF-ek dimer formában is létezhetnek biológiailag aktív formájukban.
A találmány a GDNF glikozilezett és nem-glikozi7
HU 211 984 A9 lezett formáira, illetve a természetben előforduló vagy rekombináns GDNF csonkított formáira is vonatkozik, amint azt ismertetjük. Egy további megvalósítási mód szerint a GDNF-et módosítani lehet egy vagy több polietilén-glikol (PEG), vagy egyéb ismétlődő polimer egység kapcsolásával. A találmány tárgyát képezik olyan GDNF-ek is, melyeket rekombináns úton állítunk elő baktérium expressziós rendszerekben, és amelyek N-terminális metionin csoportot tartalmaznak.
A „biológiailag ekvivalens” szakkifejezés a leírásban és az igénypontokban olyan, a találmány szerinti készítményt jelöl, amely képes ugyanezeknek a neurotróf tulajdonságoknak néhány vagy összes jellemzőjét demonstrálni, de nem szükségszerűen ugyanolyan mértékben, mint a B49 kondicionált táptalajból származó GDNF. Az „alapvetően homológ” szakkifejezés a leírásban és az igénypontokban a B49 kondicionált táptalajból izolált GDNF-fel olyan mértékű homológiát jelent, amely jobb, mint amit bármely, korábban közölt GDNF-nél leírtak. A homológia mértéke előnyösen 70%-nál magasabb, előnyösebb, ha 80%-nál magasabb, és legelőnyösebb ha 90%-nál, 95%-nál vagy 99%-nál magasabb. Az alábbiakban ismertetett homológia százalékát úgy számítjuk ki, hogy a két szekvencia közül a rövidebben talált azon aminosavak számát, amelyek azonosak a hozzá hasonlított szekvencia megfelelő aminosavaival, számítjuk ki százalékosan, ha az illesztésben 100 aminosav közé négy lukat lehet beépíteni, amint azt Dayhoff közli [Atlas of Protein Sequence és Structure, 5, 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington D. C.], amely publikációt a kitanítás részeként kell tekinteni. Ide tartoznak. és alapvetően homológnak tartjuk azokat a GDNF-eket is, amelyeket azon az alapon lehet izolálni, hogy keresztreaktivitást adnak az ismertetett GDNF-re specifikus antitestekkel, illetve amelyeknek a génjeit hibridizációval lehet izolálni az itt ismertetett GDNFgénnel vagy annak darabjaival.
A találmány szerinti előnyös GDNF-et B49 kondicionált táptalajból izoláljuk alapvetően tiszta formában.
Egy további, előnyös GDNF-et rekombináns DNS technológiával állítunk elő, így kapunk egy alapvetően tiszta formájú GDNF-et. A találmány szempontjából a „tiszta forma” vagy a „alapvetően megtisztított forma” szakkifejezés a továbbiakban ha az ismertetett GDNFre vonatkoztatjuk, akkor olyan készítményt jelent, amely alapvetően mentes más fehérjéktől, amelyek nem GDNF-fehérjék. Előnyösen, a találmány szerinti GDNF legalább 50%-os tisztaságú, előnyösen 75%-os tisztaságú és még előnyösebb, ha 80%-os, 95%-os vagy 99%-os tisztaságú. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a GDNF-fehérjekészítmény olyan mértékben meg van tisztítva, ami lehetővé teszi szakember számára, hogy meghatározza az aminosav-szekvenciának bizonyos részeit, anélkül, hogy először további tisztítási lépéseket kellene végrehajtani.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a GDNF-et B49 kondicionált táptalajból tisztítjuk az alábbi 1. példában leírtak alapján. Természetesen, az alábbiakban ismertetett információk alapján szakember számára nyilvánvaló hogy a GDNF-nek más fonásait is azonosítani lehet, és az ilyen forrásokból származó GDNF tisztítását alapvetően az itt ismertetett tisztítási módszerrel végezhetjük.
A tisztítási eljárás megkönnyítésére a GDNF dopaminerg aktivitását használjuk. A dopaminerg neurotróf aktivitások biológiai vizsgálatát az alábbi 1B. példában ismertetjük. Röviden, disszociált középagysejtek tenyészetét állítjuk elő, akár szérumban gazdag, akár szérummentes környezetben. A dopaminerg aktivitás szempontjából vizsgálandó mintákat sómentesítjük, majd sorozathígításban hozzáadjuk a sejttenyészetekhez, és a lemezeket 6 napig 37 ’C-on inkubáljuk nedvesített, 6,5% széndioxidot tartalmazó atmoszférában. A tenyészeteket, a vizsgálandó anyag jelenlétében azután 37 ’C-on inkubáljuk triciált dopaminnal (3H-DA). A dopamin felvételt leállítjuk, a sejteket mossuk, majd a dopamin felvételt a tenyészetek által visszatartott trícium alapján szcintillációs számlálóval határozzuk meg.
A GDNF tisztítását az alábbi IC. példában részletesen ismertetjük. A tisztítási eljárást részletesen az 1. táblázatban adjuk meg. Akiindulási anyagként használt kondicionált táptalajt B49 jelű glioblasztóma-sejtek felhasználásával állítjuk elő, oly módon hogy a sejteket két napra szérummentes táptalajba tesszük, azután a kondicionált táptalajt összegyűjtjük, és frissel helyettesítjük. Ezt a ciklust megismételjük, így az egyes B49sejt sarzsokból háromszor készíthetünk kondicionált táptalajt. A kondicionált táptalajt centrifugáljuk, majd körülbelül tízszeresre töményítjük a további tisztítás előtt. Ennek a nyers keveréknek, amelyet B49 jelű glioblasztóma-sejtekből előállított szérummentes növesztő táptalajként definiálunk, a tisztításában az első lépés az, hogy a kondicionált táptalajt heparin-Sepharose oszlopra visszük, amelyet 0,15 mmól/1 NaCl-t tartalmazó 50 mmól/1 NaPi pufferrel (pH = 8,0) hoztunk egyensúlyba. Egy gradiens pufferoldatot készítünk 1,5 mmól/I NaCl-t tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú NaPi-ben (pH = 8,0), majd ezt visszük az oszlopra, miután az elúciót stabilizáltuk. Ez ebből a kromatográftából származó frakcióknak mérjük a GDNF-aktivitását, és azokat a frakciókat, amelyeknek GDNF-aktivitásuk van, a további tisztításhoz egyesítjük.
Az egyesített frakciókat FPLC kromatográfiának vetjük alá egy Superose oszlopon, 0,5 mmól/1 NaCl-t tartalmazó 50 mmól/1 koncentrációjú NaPi pufferben (pH = 7,4). Ismét meghatározzuk a GDNF-aktivitással rendelkező frakciókat. Ebből az eljárásból egy frakciót azután megsavanyítunk, és egy C-8 fordított fázisú HPLC oszlopra visszük. Azokat a frakciókat, amelyek GDNF-aktivitással rendelkeznek, egyesítjük, a további tisztítás és fehérje szekvenálás céljára. Amint az az alábbi 1. táblázatban látható, az ebben a pontban kapott GDNF specifikus aktivitása körülbelül 24 000-szer magasabb mint a kondicionált táptalajé. Az ebben a pontban kapott fehérje N-terminális szekvenálásával a
8. ábrán látható N-terminális szekvenciát kapjuk (szekvencia-azonosítószám: 1).
HU 211 984 A9
A HPLC-vel tisztított GDNF további tisztítását a GDNF-aktivitással rendelkező frakciók preparatív SDS-PAGE-eljárásával végezhetjük. A fehérjét tartalmazó frakciókhoz glicerint és SDS-t tartalmazó puffért adunk, majd az oldatot nem-redukáló 15%-os SDS- 5 PAGE-vel futtatjuk, az elektroforézist 10 °C-on végezve 40 mA/gél áramerősséggel, 2 óra hosszat. A körülbelül 30-42 kD molekulasúlynak megfelelő géldarabról biológiai vizsgálattal kiderült, hogy ez tartalmazza a GDNF-aktivitást. Az SDS-PAGE-ból izolált anyag második HPLC kromatográfiájával a GDNF-et egyetlen csúcsban kapjuk, amint az a 6. ábrán látható.
1. táblázat
GDNF tisztítása B49 kondicionált táptalajból
Lépés Fehétjék Biológiai aktivitás Specifikus aktivitás Tisztítás Kitermelés mértéke
(mg) (TUxlO-3) (TU/pg) (%)
Kond. tápt. 200 94 0,5 (100)
1. Heparin Sepharose 3,1 37 12 24 39
2. FPLC Superose 0,3a 31 103 206 33
3. RP-HPLC 0,000 lb 12 12 000 24 000 13
4. Preparatív SDS-PAGE n.m. 7 n.m. n.m. 7
5. RP-HPLC 0,00003b 5 17000 34 000 5
a: az OD2g0 érték alapján b: a fehérje szekvenálásból visszanyert fehérje alapján (pikomólokban), és a GDNF-re feltételezett 36 kDa molekulasúly alapján (nem-redukáló SDS-poIi(akril-amid) gélelektroforézis)
n.m.: nincs meghatározva
A GDNF N-terminális szekvenciáját a HPLC-vel tisztított, preparatív SDS-PAGE-eljárás végrehajtása előtti utáni anyagból határoztuk meg. A tisztított GDNF aminosav-szekvenciájának meghatározására használt eljárásokat az 1D. példában adjuk meg. Az N-terminális szekvenciákat egy gázfázisú fehérje-szekvenátorral határoztuk meg. A belső szekvenciákat abból az anyagból határoztuk meg, amelyet a HPLC után kaptunk, de még nem vittük SDS-poliakrilamid-gélelektroforézisre. A belső aminosav-szekvenciákat úgy kaptuk, hogy a tisztított GDNF-et tripszinnel inkubáltuk. A tripszinfragmenseket HPLC-vel választottuk el. Egy fragmensről kiderült, hogy a kezeletlen fehérje N-terminális szekvenciájának első 13 aminosavát tartalmazza. Egy második fragmenst CNBr-nal kezeltünk, HPLC-vel tisztítottuk, redukáltuk, majd ismét HPLCnek vetettük alá. A kapott aminosav-szekvenciát a 12. ábrán mutatjuk be (szekvencia-azonosítószám: 2). A zárójelben levő szekvenciákat bizonytalanul határoztuk meg.
A találmány tárgyát képezi a GDNF-gén klónozása, valamint annak a génnek a klónozása, amelynek segítségével a GDNF-et megklónoztuk. A patkány- és emberi GDNF-gének klónozásának részletes eljárását a 2. példában adjuk meg. Ismételten meg kell jegyeznünk, hogy szakember számára egy ilyen gén klónozására más eljárások is nyilvánvalóak, a leírás felhasználásával. Pontosabban, más fajokból GDNF-gén klónozása egyértelmű az alábbiakban ismertetett eljárás fényében.
Az alábbiakban ismertetett patkány-GDNF-gént B49-sejtekből izolált poliA+ RNS-ből készített cDNSkönyvtárból állítjuk elő, amelyet a tisztított GDNF aminosav-szekvenciája alapján készített degenerált oligonukleotid-próbával vizsgálunk át. A cDNS-t standard eljárásokkal állítjuk elő, úgy kezeljük, hogy EcoRl-gyel emészthető linkereket tartalmazzanak, majd a lambda-ZapII klónozó vektorba illesztjük. A használt hibridizációs próbát 32P-vel jeleztük, és az alábbi degenerált oligonukleotidot tartalmazta (szekvencia-azonosítószám: 7):
5’>CCIGATAAACAAGCIGCIGC>3’
C G G
Számos pozitív kiónt kaptunk, ezek közül egyet (lambdaZapII76.1) DNS-szekvenálással pozitívan úgy azonosítottunk, mint amely a GDNF egy olyan részét kódolja, amelyet nem használtunk fel a degenerált próba tervezésében.
A lambda-ZapII76.1-ben levő cDNS-klón nukleotid szekvenciájának meghatározását az alábbi, 2B. példában adjuk meg. A cDNS-klón 5’-vége első 877 bázispárjának nukleotid szekvenciáját meghatároztuk, ezt a 13. ábrán mutatjuk be (szekvencia-azonosítószám: 2). A 13. ábrán a kiónban egy 277 aminosavat kódoló nyitott leolvasási keret látható (ORF), amely tartalmazza a tisztított GDNF N-terminálisát, és megegyezik a tisztított GDNF hasításával kapott egy belső peptid szekvenciájával.
A 14. ábrán megadott származtatott aminosav-szekvencia (szekvencia-azonosítószám: 4) az „érett GDNF’ aminosav-szekvenciáját mutatja. Az „érett GDNF’ szakkifejezés alatt a B49 kondicionált táptalajból kinyert tisztított GDNF szekvenciáját értjük. A tisztított GDNF természetesen dimer vagy egyéb multimer formájában létezhet, és lehet glikozilezve vagy más módon kémiailag módosítva. Az érett GDNF csonkítva
HU 211 984 A9 lehet a C-terminálisán, különösen a C-terminálistól számítva 5.-6. Lys-Arg aminosavak közötti proteolítikus emésztés révén. A lambda-ZapII76.1 patkányklón nukleinsav-szekvenciájának (13. ábra, szekvencia-azonosítószám: 2) vizsgálata azt sugallja, hogy a GDNF először egy prepro-polipeptid formájában transzlálódik, és a szignál szekvencia, valamint a molekula „pro” részének proteolitikus emésztése eredményezi a tisztított GDNF-et, amelynek ugyanaz az érett szekvenciája, mint amit a B49 kondicionált táptalajból kaptunk. Azt állítjuk hogy a prepro-GDNF polipeptid az első ATG metionint kódoló kodonnál kezdődik a klón 5’-végén (50-es pozíció a 13. ábrán). A találmány tárgyát képezik továbbá az összes, illetve bármely prepro-GDNF polipeptid, amelyek a 13. ábrán bemutatott génről transzlálódhat, valamint az összes, illetve bármely prepro-GDNF polipeptid, amelyek egy teljesebb klónról transzlálódnak, amit könnyen előállíthat egy szakterületen jártas szakember, standard laboratóriumi eljárásokat és az alábbiakban ismertetett kiónt alkalmazva.
A 13. ábrán megadott patkány-nukleinsav-szekvenciát megnézve (szekvencia-azonosítószám: 2) azt láthatjuk, hogy az 518-as és az 538-as pozíció közötti megjósolt aminosav-szekvencia Asp-Lys-IleLeu-LysAsn-Leu, amely megegyezik azzal az aminosav-szekvenciával, amelyet a tisztított GDNF egy peptidjéből határoztunk meg az alábbi, 1. példában a belső szekvenciánál leírt módon. A 706-os pozícióban egy TGA stopkodon zárja le az ORF-et. A tisztított GDNF jósolt hossza így 134 aminosav, és ennek a polipeptidnek a jósolt molekulasúlya 14,931. Két potenciális N-kapcsolt glikozilezési hely található a 425-ös és 533-as pozíciókban. Akármelyik vagy mindkét helyen lejátszódó glikozilezés növeli a molekula molekulasúlyát.
A 281-es pozícióban levő szerint, ami megfelel a tisztított érett GDNF szekvencia startjának, a Lys-Arg szekvencia előzi meg, ami egy potenciális proteolitikus hasítási hellyel szolgál a GDNF feltételezett prekurzor formájának a processzálására, a molekula olyan alakjának előállításához, amelyet a B49-sejtekből lehet izolálni. Egy potenciális transzlációs iniciációs kodon (ATG) található a szekvenciában az 50-es pozícióban, és ezt szorosan követi egy potenciális szekréciós szignál szekvencia. Az ezt az ATG-t határoló szekvenciák elegendő hasonlósággal rendelkeznek a Kozák konszenzus szekvenciával [Kozák, Nucleic Acids Research, /5, 125-148 (1987)], jelezve ezzel, hogy ez az ATG használható transzlációs iniciációs helyként. Továbbá, ez az ATG az 5’-végen az utolsó ATG a cDNSklón szekvenciájában. Ezek a tények azt sugallják, hogy ez egy potenciális starthely a GDNF egy prekurzor formája számára.
A patkány-cDNS-klónnak ezek az előzőkben említett tulajdonságai annak a lehetőségét sugallják, hogy a GDNF először egy prepro-GDNF polipeptid formájában transzlálódik, és szignál szekvencia, valamint a molekula „pro” részének a proteolitikus processzálása eredményezi a GDNF-nek azt a formáját, amely a B49-sejtek felhasználásával készített kondicionált táptalajból előállítható. A GDNF egyéb formáinak előfordulása is összeegyeztethető a szekvencia adatokkal. Például két potenciális ATG transzlációs start fordul elő a 681 bázispár méretű ORF-ben: az egyik a 206-os, a másik a 242-es pozícióban. Ezek az ATG-k a tisztított GDNF N-terminális szekvenciája előtt helyezkednek el. Jóllehet az eukariótákban a transzláció áhalában az mRNS legszélső (5’-vég) ATG-jéről indul [Kozák, Nucleic Acids Research, 75, 125-148 (1987)], vannak példák, amelyekben a transzláció iniciációja egy későbbi ATG-nél fordul elő. Tehát a GDNF alternatív prekurzor formái is előfordulhatnak, az ezeknél az ATG kodonoknál induló transzláció következtében. Ezeknek a polipeptideknek a proteolitikus processzálása a tisztított GDNF-nek ugyanazt a formáját eredményezheti, mint ami a B49-sejtek felhasználásával készített kondicionált táptalajban fordul elő. Emellett a nyitott leolvasási keret a cDNS-klón 5’-végén túlnyúlik. Ennélfogva lehetséges, hogy a transzláció iniciációja a cDNS-klónon nem található, 5’-irányban feljebb levő ATG-nél indul. Ebben az esetben a GDNF egy még nagyobb prekurzor formájában transzlálódna, amely az itt ismertetett aminosav-szekvenciát tartalmazza, valamint előtte további szekvenciákat. Egy ilyen hipotetikus forma processzálása is vezethet a GDNF ismertetett tisztított formájának a termelődéséhez. Lehetséges lenne potenciális ATG-kodonokat kimutatni 5’-irányban, ha a GDNF-gént tartalmazó mRNS-nek az 5’-végét primer-meghosszabbításos eljárással szekvenálnánk, reverz transzkriptázzal [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. Emellett, más cDNS-klónokat is kaphatunk a B49 könyvtárakból, és ezeknek a kiónoknak az 5’-végeit szekvenálhatjuk. Az első ATG előtti 5’-mRNS méretét durván meghatározhatjuk az „Sí térképezés” módszerével [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], és/vagy a reverz transzkriptáz reakció primer-meghosszabbítási termékei méretének meghatározásával. Miközben a tisztított GDNF-et kódoló szekvenciákat tartalmazó primer transzlációs termékek számos feltételezett formája képzelhető el, az itt bemutatott, a lambda-ZapII76.1 rekombináns fág által hordozott cDNS-klón részleges DNS-szekvenciái világosan meghatározzák azt a kódoló szekvenciát, amely a B49 kondicionált táptalajból izolált tisztított GDNF polipeptidet képezik.
Az alábbi 2C. példában a humán GDNF-et kódoló gén klónozását írjuk le. Egy humán genomi könyvtárat vizsgálunk át a 2B. példában leírt patkány-cDNS-klónból származó próbával. A humán GDNF-gén egy genomi cDNS-klónját azonosítottuk és az érett humán GDNF-et kódoló gén szekvenciáját a 19. ábrán adjuk meg (szekvencia-azonosítószám: 5).
A 19. ábrán a humán GDNF-re megadott szekvencia nem tartalmazza a GDNF prepro-részének teljes kódoló szekvenciáját. Azt az eljárást, amellyel a humán prepro-GDNF első 50 aminosavát kódoló szekvenciát megkapjuk, az alábbi, 2D. példában ismertetjük. A kapott szekvenciát a 22. ábrán adjuk meg (szekvencia10
HU 211 984 A9 azonosítószám: 8). A pB55K-lambda3AluI-plazmid térképét használjuk a 23. ábrán megadott szekvencia meghatározásához.
A találmány tárgyát képezik GDNF-et kódoló nukleinsav-szekvenciák is. Viszonylag magas homológiájú, patkány- (13. ábra) (szekvencia-azonosítószám: 3) és humán (19. ábra) (szekvencia-azonosítószám: 5) GDNF-et kódoló szekvenciákat adunk meg az alábbiakban. A találmány oltalmi körébe tartoznak a alapvetően hasonló nukleinsav-szekvenciák, amelyek ugyanazt az aminosav-szekvenciát, illetve azzal erősen homológ aminosav-szekvenciát kódolnak. Például ha egy olyan konstrukciót készítünk, amellyel az érett GDNFet bakteriális expressziós rendszerben például Escherichia coli-ban akarjuk expresszálni, akkor a 19. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 5) megadott nukleinsavszekvenciában bizonyos kodonokat helyettesíthetünk olyan kodonokkal, amelyek az Escherichia coli-ban sokkal jobban expresszálódnak, a jól ismert és standard eljárások szerint. Az ilyen módosított nukleinsav-szekvenciák is a találmány oltalmi körébe tartoznak.
A specifikus nukleinsav-szekvenciákat szakember módosíthatja. Ennélfogva a találmány azokra a nukleinsav-szekvenciákra is vonatkozik, amelyek az érett patkány- és emberi GDNF aminosav-szekvenciáit kódolják, amint az a 14. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 4). valamint a 19. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 5) látható, illetve a prepro-patkány-GDNF-et (13. ábra, szekvencia-azonosítószám: 3) és a humán prepro-GDNF-et 19. ábra, szekvencia-azonosítószám: 5, valamint 22. ábra, szekvencia-azonosítószám: 8) kódolják. A találmány tárgyát képezik továbbá azok a nukleinsav-szekvenciák, amelyek az összes említett nukíeinsav-szekvenciával hibridizálnak - illetve ahol az úgy szükséges, ott a nukleinsav-szekvencia komplimentjével - és dopaminerg aktivitással rendelkező polipeptidet kódolnak. A találmány tárgyai olyan nukleinsav-szekvenciák is, amelyek olyan polipeptideket kódolnak, amelyek dopaminerg aktivitással rendelkeznek, és a GDNF-hez kapcsolódó antitestek felismerik.
A találmány tárgyát képezik továbbá azok a vektorok, amelyek a találmány oltalmi körébe tartozó nukleinsav-szekvenciákhoz funkcionálisan hozzákapcsolt expressziós szabályozó elemeket tartalmaznak. A találmány tárgyai továbbá a gazdasejtek - minden variáns amelyeket a találmány oltalmi körébe tartozó nukleinsav-szekvenciákhoz funkcionálisan hozzákapcsolt expressziós szabályozó elemeket tartalmazó vektorral transzformáltunk.
A GDNF COS-sejtekben való expresszióját az alábbiakban az 5. példában írjuk le. A GDNF-et kódoló gént a 13. ábrán mutatjuk be, ezt a pSG5-plazmid vektorba szubklónozzuk, amely vektort klónozott génnek például COS-sejtekben való tranziens expressziójához terveztünk. Azokat a plazmidokat választjuk ki, amelyek a GDNF-gént helyes illetve helytelen orientációban tartalmazzák, és a DNS-t COS-7-sejtekbe transzfektáljuk. A szaporítást követően a transzformált sejteket kinyerjük. A COS-7 kondicionált táptalajnak megvizsgáljuk a biológiai aktivitását mind a dopaminerg vizsgálattal, mind a szimpatikus ganglion neuron vizsgálattal. Azoknak a sejteknek a kondicionált táptalajában találtunk biológiai aktivitást mindkét módszerrel, amelyek a GDNF-gént a helyes orientációban tartalmazzák, jelezve ezzel, hogy biológiailag aktív GDNF-et sikerült rekombináns DNS úton előállítanunk.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a humán érett GDNF-et rekombináns DNS technológiával állítjuk elő bakteriális expressziós rendszerben.
A humán GDNF Escherichia coli-ban való expresszióját az alábbiakban, a 6. példában írjuk le. A humán GDNF-génnek azt a részét, amely az érett humán GDNF-et kódolja (19. ábra), használjuk egy humán GDNF konstrukció készítésére. Ezt a konstrukciót egy plazmidvektorba ligáljuk, amit azután Escherichia coli JM107-törzsbe transzformálunk. A transzformált gazdasejtek szaporítása után a GDNF terméket kinyerjük. A várt molekulasúlyú humán érett GDNF-fehérjét (körülbelül 15 000 dalton) kapjuk, és az N-terminális aminosav-szekvencia meghatározása megerősítette, hogy a kapott fehérje az érett humán GDNF.
Az Escherichia coli-ban expresszált humán GDNF természetes térszerkezetének kialakítását a 6C. példában írjuk le. A találmány megvalósítási módja szerint az expresszált fehérjét tartalmazó kivonatot részlegesen tisztítjuk, mielőtt a természetes térszerkezetét kialakítjuk, S-Sepharose Fást Flow gyantán végzett ioncserélő kromatográfiával. A térszerkezet kialakítását a következőképpen végezzük: először ditiotreitolt, majd glutation-dinátrium sót, végül pedig egy térszerkezet kialakító puffért adunk a GDNF-et tartalmazó kivonathoz. A kialakított térszerkezetű rhGDNF biológiailag alapvetően teljesen aktív, és diszulfid hidakkal egymáshoz kapcsolt dimer formában létezik. A térszerkezet kialakítása előtt - illetve a kialakított térszerkezetű anyag redukálása után - a GDNF monomer formájú, és biológiailag alapvetően inaktív.
A GDNF-et más expressziós rendszerekben való expresszióval is előállíthatjuk. Például a 19, ábrán bemutatott, érett humán GDNF-et kódoló nukíeinsavszekvenciával szakember más expressziós rendszerekben is képes GDNF-et előállítani. Azokat a vektorokat, amelyek a találmány oltalmi körébe tartozó nukleinsav-szekvenciákhoz funkcionálisan hozzákapcsolt expressziós szabályozó elemeket tartalmazzák, más mikroorganizmusokba is transzformálhatjuk, például Bacillus Pseudomonas és élesztősejtekbe. Bakulovírus expressziós rendszer is használható.
Amint az előzőkben megjegyeztük, a találmány tárgyát képezik idegkárosodásban szenvedő betegekben az ídegkárosodás kezelésére szolgáló eljárások. Ezek a eljárások abból állnak, hogy a humán fehérjét, a neuroglia-eredetű neurotróf faktort (GDNF) az idegkárosodásban szenvedő betegnek beadjuk.
Egy betegséget vagy orvosi indikációt akkor kell idegkárosodásnak tekinteni, ha az idegsejtek és/vagy axonális folyamataik túlélése vagy funkciója van veszélyben. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az ll
HU 211 984 A9 ilyen idegkárosodás az alábbi állapotok egyikének következtében áll elő: 1) Fizikai sérülés, amely az axonális folyamatok degenerációját és/vagy a sérülés közelében levő idegsejttestek degenerálódását okozza; 2) Iszkémia, úgy mint az infarktusban; 3) Neurotoxinokkal való érintkezés, ilyenek lehetnek például az AIDS és kemoterápiás ágensek, a ciszplatin és a didezoxicitidin (ddC); 4) Krónikus metabolikus betegségek, például a cukorbetegség és a veseműködés zavara; és 5) Neurodegeneratív betegségek, azaz például a Parkinson-kór, Alzheimer-kór, és az amiotrófiás laterális szklerózis (ALS), amely a specifikus neuronális populációk degenerálódását okozza.
Azoknak az állapotoknak a nem-teljes listája, amelyekben idegkárosodás fordul elő, tartalmazza a Parkinson-kórt, az Alzheimer-kórt, az amiotrófiás laterális szklerózist, az infarktust, a diabeteszes polineuropátiát, a taxol, ciszplatin vagy vinkrisztin nevű rák kemoterápiás ágensek által okozott toxikus neuropátiát, a ddl vagy ddC AIDS-kemoterápiás ágensek által okozott toxikus neuropátiát, valamint az idegrendszer fizikai sérülését, azaz az agy és a gerincvelő fizikai sérülését, valamint a kar és a kéz zúzott vagy vágott sérülését.
A GDNF előállításának módszereit is ismertetjük. Az egyik ismertetett eljárás a GDNF különböző forrásokból, például neurogliasejtvonal kondicionált táptalajából való izolálására szolgál. Egy második eljárás szerint a GDNF-et kódoló gének izolálását, a gén megfelelő vektorokban és sejttípusokban való klónozását és a gén expresszálását tartalmazza GDNF előállítása céljából. Az utóbbi eljárás, amely általában a rekombináns DNS eljárások egy példája, a találmány szerinti előnyös módszer. A rekombináns DNS eljárásokat részesítjük előnyben, részben mert ezekkel lehet viszonylag nagyobb mennyiségű fehérjét előállítani nagyobb tisztaságban. A rekombináns humán GDNF a legelőnyösebb fehérje a gyógyászati készítmények előállításához és az idegkárosodás kezeléséhez.
A találmány eszközöket ír le azoknak a géneknek az azonosítására és klónozására, amelyek olyan fehérjéket klónoznak, amelyek a GDNF-fel közös aminosav-szekvenciákkal rendelkeznek, valamint az összes ilyen azonosított fehérjét. Leírtak egy emlős géncsaládot, amely három neurotróf faktorból áll [Leibrock és mtsai., Natúré, 341, 149-152 (1989); Maisonpierre és mtsai., Science, 247, 1446-1451 (1990)]. Az ebbe a családba tartozó három fehérje érett formája [idegnövekedési faktor (NGF), agy-eredetű neurotróf faktor (BDNF) és a neurotrofin-3 (NT-3) aminosavainak 50%-a közös]. Mindegyik fehérjében pontosan megőrződött a hat ciszteincsoport pozíciója. Jóllehet szerkezetileg hasonlóak, ezek a fehérjék különbözőképpen oszlanak meg a szövetekben [Ernfosr és mtsai., Neuron, 5, 511-526 (1990); Maisonpierre és mtsai., Neuron, 5, 501-509 (1990); Phillips és mtsai., Science, 250, 290-294 (1990)], más az in vitro aktivitásuk [Rosenthal és mtsai., Neuron, 4, Kfl-TTi (1990); Whittemore és mtsai., Brain Rés. Rév., 12,439 (1987)].
A GDNF nem mutat jelentős homológiát egyetlen korábban ismertetett fehérjével sem, de létezhetnek azonosítatlan gének, amelyek lényeges aminosav hasonlósággal rendelkeznek a GDNF-fel, és amelyek képesek in vivő különböző szövetspecifikus eloszlással és/vagy különböző aktivitás-spektrummal neurotróf faktorokként működni. Az ilyen fehérjék a neurotróf faktorok GDNF-családjába tartoznak. A patkány- és a humán GDNF-gének DNS-szekvenciája, amelyet a 13. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 3) és a 19. ábrán mutatunk be (szekvencia-azonosítószám: 5), valamint a 22. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 8), használható egy ilyen feltételezett „GDNF-géncsalád” új tagjainak az azonosítására.
Egy géncsalád (azaz például az előzőkben említett „NGF-család” vagy a „GDNF-család”) tagjai közötti aminosav-szekvencia megőrződésének a következménye a DNS szintű szekvencia jelentős mértékű megőrződése is. Ennélfogva megfelelő hibridizációs körülmények között, nukleinsav „kereszt-hibridizáció” léphet fel a család génjei között, azaz a család egyik tagjából származó nukleinsav-próba stabil hibrid duplex molekulát képez a család más tagjának nukleinsav molekulájával, amely a próbával rokon, de nem azonos szekvenciával rendelkezik [Beltz és mtsai., Methods in Enzymology, 100, 266-285 (1983)]. Ennek következtében kereshetünk a GDNF-fel szekvencia szinten a GDNF-fel homológ géneket, oly módon hogy egyedi vagy degenerált DNS- (vagy RNS-) próbát készítünk a patkányból, emberből vagy egyéb fajból származó GDNF szekvenciája alapján, és hibridizációs kísérletet végzünk számos különböző cél-DNS-sel (vagy RNSsel) olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik a tökéletlenül párosodó nukleinsav duplexek kialakulását.
Az ilyen hibridizációs körülményeket, amelyeket gyakran „csökkent sztringencitású”-nak neveznek, jól leírták a szakirodalomban [Beltz és mtsai Methods in Enzymology, 100, 266-285 (1983); Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)], és leggyakrabban a hibridizációs reakció hőmérsékletének csökkentését jelenti, ha vizes oldatban hajtjuk végre a reakciót, és/vagy a formamid koncentrációjának csökkenését jelenti olyan hibridizációs rendszerekben, amelyekben általában 50% formamidot használunk. A hibridizáció sztringencitásának csökkentésére egyéb eljárásokat is ismertettek, és használhatunk [Maniatis és mtsai Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezekben a hibridizációs kísérletekben a nukleinsav célpontok az alábbiak lehetnek:
1) genomi DNS könyvtárak, amelyek humán, patkány- vagy bármely más emlősfaj eredetűek, illetve bármely más faj DNS-e megfelelő vektorba klónozva beleértve a bakteriofágokat, plazmidokat, kozmidokat, élesztő mesterséges kromoszómákat, illetve bármely más típusú vektorokat:
2) bármely előzőkben említett szervezetből nyert bármely szövetből, vagy bármely előzőkben említett szervezetből nyert primer sejtek tenyészetéből vagy bármely, jelenleg létező vagy bármely primer sejt12
HU 211 984 A9 tenyészetből előállított stabil sejtvonalból előállított
RNS-ből készített cDNS-könyvtárak:
3) az 1. pontban leírt genomi DNS-ek, amelyeket restrikciós enzimekkel emésztünk, és gélelektroforézissel Southem-blothoz készítünk elő, majd egy szilárd hordozóra viszünk át;
4) a 2. pontban leírt RNS-ek, amelyeket elektroforézisnek vetünk alá, és egy szilárd hordozóra viszünk át Northem-blot elemzés céljából. Az ilyen RNS lehet celluláris össz-RNS, vagy frakcionált poliA+RNS.
5) Polimeráz-láncreakció (PCR) termékei, amely a GDNF-ben előforduló szekvenciát használ oligonukleotid indító molekulaként, és templátként bármely, az 1-4. pontokban ismertetett nukleinsav forrást alkalmaz.
Bármely nukleinsav-szekvenciát, amelyről igazolni lehet, hogy hibridizál a GDNF-alapú próbával, kísérleti úton meghatározott hibridizációs körülmények között, szakember számára jól ismert számos különböző technikával klónozhatjuk és szekvenálhatjuk, és a szekvencia homológia mértékét közvetlenül meghatározhatjuk egy GDNF-család tagjainak azonosítására. Egy ilyen hibridizációs megközelítést alkalmaztak az NT-3 klónozására, egy NGF-alapú hibridizációs próbával [Kaisho és mtsai., FEBS Letters, 266, 187-191 (1990)].
Egy másik eljárás a GDNF-család tagjainak azonosítására a Polimeráz-láncreakció (PCR) alkalmazása a GDNF-család tagjaiból származó szekvenciák sokszorozására, a sokszorozott szekvenciák klónozásával és elemzésével. A PCR degenerált (vagy nem degenerált) oligonukleotid indító molekuláit a GDNF-szekvencia alapján szintetizálhatjuk. Mivel a ciszteinek helye konzerválódott, és a cisztein csoportok közvetlen szomszédságában levő aminosav-szekvenciák is konzerválódtak az NGF-családban, az érett GDNF-ben a ciszteinek körül levő régiók a nyilvánvaló jelöltek az indító molekula szintézisére, de számos más indító molekula is választható a fehérjének mind az érett, mind a prepro-részéből. PCR-reakciókat végezhetünk csökkentett illeszkedési hőmérsékleten, ami lehetővé teszi az nemcsak a GDNF-szekvenciák amplifikálását, hanem bármely GDNF-családtag szekvencia amplifikálását is [Innis és mtsai., PCR Protocols: A Guide To Methods és Applications, Academic Press (1990)]. Az ilyen PCR-reakciók termékeit gélelektroforézissel méret szerint el lehet választani, a megfelelő vektorba klónozni lehet, majd a klónozott DNS-t szekvenálni lehet a GDNF-család tagjainak azonosítása céljából. Egy másik eljárás szerint a kiónokat először egy GDNF specifikus próbával hibridizáltatjuk, sztringens körülmények között, hogy a GDNF kiónokat azonosítsuk. Azokat a kiónokat, amelyek sztringens körülmények között nem hibridizálnak, azután szekvenáljuk, illetve egy GDNF-próbához hibridizáltatjuk kevéssé sztringens körülmények között, és mindegyik kiónt, amely ilyen körülmények között hibridizál a GDNF-próbával, utána szekvenáljuk.
Egy második megközelítés PCR alkalmazására a GDNF-család tagjainak klónozására az lehel, hogy az előzőkben ismertetett PCR-reakció termékeit jelöljük, és ezeket a termékeket használjuk próbaként az előzőkben felsorolt nukleinsav célpontok átvizsgálására, sztringens és/vagy kevéssé sztringens körülmények között. A hibridizálódó kiónokat vagy nukleinsav szegmenteket azután elemezhetjük az előzőkben leírt módon a GDNF kiónok és családtagok azonosítása céljából. Egy ilyen megközelítést használtak az NT-3 klónozására, az NGF és a BDNF szekvenciái alapján [Maisonpierre és mtsai., Neuron, 5, 501-509 (1990); Phillips és mtsai., Science, 250, 290-294 (1990)].
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint egy GDNF-et tartalmazó terápiás vagy gyógyászati készítményt hatásos mennyiségben adunk be idegkárosodásban szenvedő betegnek. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a GDNF-et terápiásán alkalmazzuk Parkinson-kórban szenvedő betegek kezelésére. Szakember számára jól ismert a számos különböző vizsgálati eljárás, amelyekkel ki lehet mutatni, hogy melyik neuron válaszol a GDNF-re, és más GDNF-re reagáló neuron meghatározása szükségtelenül sok kísérlet nélkül is elvégezhető. Szakember könnyen meg tudja határozni, hogy a GDNF hol expresszálódik a testben, és azokban a régiókban a GDNFfehétje milyen szintet ér el. Szakember azt is meg tudja határozni, hogy az idegrendszerben a GDNF hova kötődik. Ez az információ lehetővé teszi szakember számára hogy meghatározza azokat a neurontípusokat, amelyek valószínűleg reagálnak a GDNF-re, és ennek következtében javasolni tudja ennek a fehérjének a megfelelő klinikai alkalmazásait. Ezután megfelelő sejttenyészet és állati kísérleteket lehet végezni annak meghatározására, hogy mennyi a valószínűsége annak, hogy a GDNF hasznos lehet ilyen területek kezelésében.
A B49 kondicionált táptalajból izolált tisztított GDNF-rőI az is kiderült, hogy elősegíti a paraszimpatikus és szimpatikus idegsejtek túlélését tenyészetekben. Ezeket az eredményeket a 4. példában ismertetjük.
Mivel az lehetséges, hogy a GDNF neurotróf funkciója egy vagy több diszkrét elválasztható szegmenthez kötődik, ezért az is elképzelhető, hogy a találmány szerinti eljárás úgy is alkalmazható, hogy egy gyógyászati készítményt, amelynek aktív alkotóeleme az a GDNF-rész (illetve azok a GDNF-részek), amely(ek) szabályozza(zák) a GDNF neurotróf funkcióját.
A találmány szerinti terápiás vagy gyógyászati készítményeket előnyösen parenterálisan injekcióval, illetve közvetlenül a gerincfolyadékba (CSF) adhatjuk folyamatos infúzióval egy beépített szivattyúról. Ezenkívül más hatékony adagolási formák is léteznek, például a parenterális lassan felszabaduló formulák, belélegzett por, orálisan aktív készítmények, illetve kúpok is elképzelhetők. Emellett egy vagy több olyan ágenssel való együtt adagolás is elképzelhető, amely képes a GDNF átjutását elősegíteni a véragygáton. Egy előnyös hordozó lehet a fiziológiás sóoldat, de elképzelhető, hogy más gyógyászatilag elfogadható hordozók is használhatók, például a mesterséges CSF. Egy előnyös megvalósítási mód szerint azt is el lehet képzelni, hogy
HU 211 984 A9 a hordozó és a GDNF fiziológiailag elfogadható, lassan felszabaduló készítmény formájában van. Egy ilyen hordozóban az elsődleges oldószer lehet vizes vagy nem-vizes természetű. Emellett a hordozó tartalmazhat más gyógyászatilag elfogadható töltőanyagot is a pH, ozmózisnyomás, viszkozitás, tisztaság, szín, sterilitás, oldódás sebessége, illetve a készítmény szaga módosítása vagy megtartása céljából. Hasonlóképpen, a hordozó tartalmazhat más gyógyászatilag elfogadható töltőanyagokat is, amelyek módosítják vagy fenntartják a GDNF stabilitását, oldódási sebességét, felszabadulását, illetve a véragygáton való átjutást vagy abszorpciót. Az ilyen töltőanyagok olyan vegyületek, amelyeket általában parenterális készítmények dozírozásánál alkalmaznak, akár egységdózis akár többszörös dózis formájában, illetve közvetlenül a CSF-be való infúzióval, egy beépített szivattyú folyamatos vagy periodikus működtetésével.
Ha egyszer a terápiás készítményt formuláztuk, akkor steril ampullákban tárolhatjuk oldat, szuszpenzió, gél, emulzió, szilárd vagy dehidrált vagy liofilezett por formájában. Az ilyen készítményeket vagy közvetlen használatra alkalmas formában tárolhatjuk, vagy úgy, hogy közvetlenül a felhasználás előtt még el kell készíteni. Az ilyen készítmények előnyös tárolási módja legalább 4 ‘C, előnyösen -70 °C.
A GDNF-et tartalmazó készítmények parenterális beadása előnyösen szubkután, intramuszkulárisan, intrathecalisan vagy intracerebrális úton történhet. A GDNF kívánatos dózisának eléréséhez ismételt napi vagy kevésbé gyakori szubkután vagy intramuszkuláris injekciók adhatók be, illetve a GDNF-et folyamatosan vagy periodikusan adhatjuk be infúzióval, egy beépített szivattyúval. A dózis frekvenciája függ a készítményben levő GDNF farmakokinetikai paramétereitől és a használt adagolási módtól.
Ahhoz, hogy a GDNF szükséges dózisát elérjük azoknál a dopaminerg és egyéb roncsolt idegsejteknél, amelyeknek a sejtteste az agyban illetve a gerincvelőben van, arra van szükség, hogy a GDNF-et az agy vagy a gerincvelő szubarachnoid terébe adjuk be, vagy pedig intracerebroventikulárisan. A beadás lehet folyamatos vagy periodikus, és egy konstans, vagy programozható működésű beépített szivattyúval, illetve periodikus injekciókkal hajthatjuk végre. A beadás történhet olyan ágensekkel együtt, amelyek lehetővé teszik, hogy a GDNF átjusson a véragygáton.
Az is elképzelhető, hogy bizonyos GDNF-et tartalmazó készítményeket orálisan adjunk be. Az ily módon beadott GDNF előnyösen kapszulázva van. A kapszulázott GDNF-et azokkal a hordozókkal, illetve azok nélkül formulázhatjuk, amelyeket szokás szerint használnak a szilárd dózisformák elkészítésénél. A kapszulát előnyösen úgy tervezik, hogy a készítmény aktív részét a gyomor-bél rendszer azon részén engedje ki, ahol a biológiai hozzáférhetőség maximális, és a preszisztémás lebomlás minimális. Más töltőanyagokat is használhatunk, hogy megkönnyítsük a GDNF abszorpcióját. Hígítószerek, illatosító szerek, alacsony olvadáspontú viaszok, növényi olajak, csúsztatóanyagok, szuszpendáló ágensek, tabletta dezintegrációt elősegítő anyagok és kötőanyagok is használhatók.
A beadás módjától függetlenül, a specifikus dózist úgy számítjuk ki, hogy figyelembe vesszük a beteg hozzávetőleges testsúlyát vagy testfelszínét. A számítások finomítását, amelyek ahhoz szükségesek, hogy meghatározzuk a hozzávetőleges dózist az egyes előzőkben említett készítményeknél, szakember rutinszerűen elvégezheti, és a szokásos tevékenységi körébe tartozik, anélkül hogy szükségtelen kísérleteket kellene végeznie, különösen az itt megadott dózis-információk és vizsgálatok fényében. Ezeket a dózisokat a megfelelő dózis-hatás adatoknál alkalmazott dózisok meghatározására kialakított vizsgálatokkal igazolhatjuk.
A találmány egyik megvalósítási módja szerint a GDNF-et terápiásán alkalmazhatjuk oly módon hogy a betegekbe olyan sejteket építünk be, amelyek képesek a GDNF egy biológiailag aktív formájának a szintézisére és szekretálására. Az ilyen GDNF-termeló sejtek lehetnek olyan sejtek, amelyek a GDNF természetes termelői (a B49-sejtekkel analógok), illetve lehetnek olyan sejtek, amelyeknek azt a képességét, hogy GDNF-et termel, azáltal érjük el, hogy a GDNF-génnel transzformáljuk olyan formában, amely elősegíti a GDNF expresszióját és szekrécióját. Abból a célból, hogy egy olyan betegben, akinek egy idegen fajból eredő GDNF-et adunk be, minimalizáljuk a potenciális immunológiai reakciót, az az előnyös, ha a természetes GDNF-termelő sejtek humán eredetűek és humán GDNF-et termelnek. Hasonlóképpen, ha humán GDNF-et expresszáló sejteket transzformálunk, akkor olyan expressziós konstrukciót használunk, amely humán GDNF-et kódol, és olyan eljárásokat használunk, amelyek analógok az alábbi, 5. és 6. példákban alkalmazott módszerekkel.
Azokat a sejteket, amelyek természetesen képesek humán GDNF-et szekretálni, az alábbi eszközök alkalmazásával azonosíthatjuk: 1) olyan oligonukleotidokat használunk, amelyek a humán GDNF hírvivő RNS-ének egy részét képviselik, illetve komplementerek a hírvivő RNS egy részével, olyan sejtvonalak felfedezésére, amelyek a humán GDNF-mRNS-t termelik, Northem-blot elemzés, RN-áz protekció, in situ hibridizáció, Polimeráz-láncreakció, vagy egyéb, rokon eljárások alkalmazásával; 2) a humán GDNF-et felismerő poliklonális vagy monoklonális antitesteket használhatunk olyan sejtvonalak felfedezésére, amelyek kivonatai vagy kondicionált táptalaja GDNF-fehéijét tartalmaz, Westem-blot elemzés, ELISA vizsgálat, radioimmunológiai vizsgálat, vagy egyéb rokon eljárások alkalmazásával.
Egy előnyös stratégia szerint egy humán eredetű sejtsorozatból származó kondicionált táptalajt humán GDNF-elleni antitestekkel vizsgálunk át a fenti 2) eljárás szerint, hogy olyan sejteket találjunk, amelyek GDNF-et szekretálnak a táptalajba. Az így termelt GDNF-et a tisztítás és aminosav-szekvencia meghatározás azonosítjuk, ahogy azt a B49-sejtek által termelt és a táptalajba szekretált GDNF-fel tettük. Az alábbi, 7. példában a humán rekombináns GDNF-elleni antitestek termelését és izolálását írjuk le.
HU 211 984 A9
A GDNF-et természetesen, illetve transzformáció következtében szekretáló sejteket használhatunk betegek kezelésére. Humán vagy nem-humán sejteket építhetünk be betegekbe félig áteresztő polimer burokban, hogy ezzel lehetővé tegyük a GDNF kiáramlását, de megakadályozzuk, hogy a sejteket a beteg immunrendszere elpusztítsa. Egy másik eljárás szerint a beteg saját sejtjeit, amelyeket expresszió vivő transzformálunk, hogy GDNF-et termeljenek, közvetlenül beépíthetjük a betegbe, az említett kapszulázás nélkül.
Az élő sejtek membránkapszulázása szakember számára jól ismert, és a kapszulázott sejtek készítését, valamint betegekbe való beépítését fölösleges kísérletezés nélkül elvégezheti (4,892,538; 5,011,472; 5,106,627 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, amely közleményeket a kitanítás részeként kell tekinteni). Élő sejtek kapszulázására szolgáló módszert Aebischer és munkatársai írnak le a WO 91/10425 számú PCT bejelentésben, mely publikációt a kitanítás részeként kell tekinteni. Lásd még Aebischer és mtsai., WO 91/10470; Winn és mtsai., Exper. Neurol., 113, 322-329 (1991); Aebischer és mtsai., Exper. Neurol., 111, 269-275 (1991); Tresco és mtsai., ASAIO, 38, 17-23 (1992), amely hivatkozásokat a kitanítás részeként kell tekinteni.
Pontosabban, a GDNF-et szekretáló sejteket Parkinson-kórban szenvedő betegekbe lehet beépíteni a striatumba, hogy ezzel szolgáltassunk GDNF-et a nigrális dopaminerg neuronok számára, valamint a nigrába. hogy ezzel biztosítsunk GDNF-et a dopaminerg sejttesteknek. Az ilyen lokálisan alkalmazott GDNF elősegítheti az újra növekedést és az újra beidegződést a striatum dopaminerg terminálok által, és megakadályozhatja, illetve lelassíthatja a dopaminerg idegsejtek további degenerációját.
A találmány tárgya tehát eljárás idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére oly módon hogy az ilyen kezelést igénylő betegbe sejteket építünk be; az ilyen sejteket vagy azon az alapon szelektáljuk, hogy természetesen képesek GDNF-et termelni, illetve génsebészeti úton változtatjuk meg őket úgy. hogy GDNF-et szekretáljanak. Előnyös, hogy a beteg az emberi fajhoz tartozik, akkor a szekretált GDNF érett humán GDNF legyen.
Meg kell jegyeznünk, hogy az alábbiakban ismertetett GDNF-készítmények használhatók állatgyógyászati célokra is és humán gyógyászati célokra is, és a „beteg” szakkifejezés nem lehet korlátozó érvényű. Az állatgyógyászati alkalmazások esetében a dózistartományok ugyanazok lehetnek, mint amit az előzőkben specifikáltunk.
Az nyilvánvaló, hogy a találmány kitanításának alkalmazása egy specifikus problémára vagy környezetben szakember számára nyilvánvaló, az ismertetett kitanítás fényében. A találmány jellemző alkalmazását bemutató példákat ismertetünk az alábbiakban.
Példák
1. példa: a GDNF tisztítása és szekvenálása
Ebben a példában a GDNF biológiai vizsgálatának és tisztításának módszereit ismertetjük. Emellett ismertetjük azokat a eljárásokat is, amelyekkel a B49-sejtvonal kondicionált táptalaját lehet előállítani, ami a tisztítás kiindulási anyaga. A tisztított GDNF aminosavszekvenciájának illetve a tisztított fehérjéből kapott részleges aminosav-szekvenciák meghatározásának módszerét is ismertetjük.
A. Anyagok: Az időzített terhes patkányok a Zivie Miller Lab-ból származnak (Allison Park, PA, USA). Hacsak nem specifikáljuk, minden reagenst a Sigma Chemical Co.-tól vásárolunk (St. Louis, MO, USA).
B. A dopaminerg neurotróf aktivitás biológiai vizsgálata.
Tenyésztési körülmények: Disszociált középagyi sejttenyészeteket készítünk az előzőkben leírt módon [Friedman és Mytilenou, Neurosci. Lett., 79, 75-72 (1987)], minimális módosításokkal. Röviden, Sprague-Dawley patkányembriók agyából a megtermékenyítés utáni 16. napon csőrszerű középagyi kérget bontunk szét a mikroszkóp alatt steril körülmények között, majd Ca2+- és Mg2+-mentes Dulbecco-féle foszfáttal puffereit sóoldatban (Gibco, Gaithersburg, MD) összegyűjtjük, mechanikailag és enyhe triturálással disszociáljuk. A sejteket lukanként 100 μΐ térfogatban 16 mm átmérőjű szövettenyésztő lukakban Falcon, Lincoln Park, NJ, 24 lukas lemez) osztjuk el, amelyek 400 μΐ táptalajt tartalmaznak, így kapunk 2,5-3,5xl05 sejt per luk sejtsűrűséget. A tenyésztő lukakat korábban 0,1 mg/ml koncentrációjú poli-L-ornitinnel hoztuk érintkezésbe (10 mmól/1 nátrium-borát pH = 8,4 oldatban) 3 óra hosszat 37 ’C-on, majd háromszor mostuk milli-Q vízzel és egyszer Earle-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (Gibco). A tápláló közeg (10/10) minimális eszenciális táptalajt (MÉM, Gibco) tartalmaz, amelyet 33 mmól/1 glükózzal, 24,5 mmól/1 nátrium-bikarbonáttal, 2 mmól/1 glutaminnal, 15 mmól/1 HEPES-sel, 5 E/ml penicillin G-vel, 5 μg/ml sztreptomicinnél, 10% hővel inaktivált borjúmagzat szérummal (Gibco) és 10% hővel inaktivált lószérummal egészítettünk ki. A tenyészeteket 37 ’C-on tartjuk vízzel telített atmoszférában, amely 6,5% széndioxidot tartalmaz. Három óra elteltével, amikor a legtöbb sejt hozzátapadt a luk fenekéhez, a táptalajt 500 μΐ friss táptalajjal helyettesítjük. Ebben az időpontban a GDNF-aktivitásra vizsgálandó minta sorozathígítását két párhuzamosban hozzáadjuk az egyes lukakhoz majd a lemezeket 37 ’C-on inkubáljuk egy inkubátorban. Egy hét elteltével, a tenyészeteket 24 óra hosszat fluor-dezoxiuridinnel (13 μg/ml) és uridinnel (33 pg/ml) kezeljük, hogy megakadályozzuk a fölösleges neurogliális szaporodást, majd ezt követően az előzőkben említett táptalajjal tápláljuk, borjúmagzat szérum nélkül.
Egy másik eljárás szerint a kémiailag definiált szérummentes táptalajt használunk, amelyben a szérumot fehérjék keverékével helyettesítjük; hormonok és sók. A definiált táptalaj MÉM és F12 tápkeverék elegye (mindegyik Gibco, 1:1 térfogatarányban), és tartalmaz 33 mmól/1 glükózt, 2 mmól/1 glutamint, 24,5 mmól/1 NaHCO3-at, 15 mmól/1 HEPES-t, 100pg/ml transzfer15
HU 211 984 A9 rint, 25 pg/ml inzulint, 60 μιηόΐ/ΐ putreszcint, 20 nmól/1 progeszteront, 30 nmól/1 nátrium-szelenitet, 5 E/ml penicillint és 5 pg/ml sztreptomicint. A DM ozmotikus nyomását 325-re állítjuk milli-Q víz hozzáadásával (110-125 ml víz/1). A DM alkalmazásával néhány nem-neuronális sejt volt evidens, morfológia alapján illetve a neurogliális fibrilláris savas fehérjére (GFAP) való festés alapján, ami egy asztrocitaspecifikus citoskeletális fehérje. A GDNF aktív a dopamin felvétel serkentésében mind a szérumot tartalmazó mind a definiált táptalajban. Mindegyik, az alábbi példákban említett vizsgálatot szérummentes táptalajban végezzük.
A dopaminerg neuronok funkcionális állapotát ezekben a tenyészetekben vizsgálhatjuk, oly módon hogy mérjük a dopaminerg neuronokbán a dopamin felvételt specifikus „tisztogató” transzportereken keresztül, és meghatározzuk azoknak a neuronoknak a számát, amelyek az immun-hisztokémiában használt tirozin hidroxiláz dopamin-szintetizáló enzimre specifikusak. A noradrenerg neuronok tenyészeteivel való jelentős fertőzés lehetőségét, amely neuronok szintén transzportálják a dopamint, és szintén tartalmaznak tirozin hidroxilázt, kizártuk az óvatos szétszedéssel, és annak igazolásával, hogy a dopamin transzporterek farmakológiai profilja jellegzetesen inkább a dopaminerg mint a noradrenerg neuronokra jellemző. Az ezekben a tenyészetekben lejátszódó dopamin felvételt a GBR12909 gátolja, amely a monoamin transzporter inhibitora a dopaminerg neuronokbán, ED50-értéke 20 nmól/1. Ezzel szemben legalább 300-szor több desipramin, amely a monoamin transzporter vagy noradrenerg neuronok inhibitora, szükséges ahhoz hogy tenyészeteikben a dopamin felvételt gátolja. Ezek azok az értékek, amelyeket a dopaminerg neuronoknál a monoamin transzporterre leírtak.
Minta előkészítés·. Mielőtt megvizsgáljuk a dopaminerg neurotróf aktivitást a középagyi sejttenyészetekben, mindegyik, az 1-3. tisztítási (lásd az alábbi C. pontot) lépésben kapott mintát az alábbiak szerint sómentesítjük. Száz μΐ 10/10 táptalajt (mint hordozót) adunk egy Centricon-10-hez (Amicon), majd 10 percig hagyjuk ülepedni. A vizsgálandó minta alikvot részeit hozzáadjuk a Centricon-hoz, majd 1 ml Dulbecco-féle magas glükóztartalmú módosított Eagle-féle táptalajt adunk hozzá bikarbónát nélkül, de 10 mmól/1 HEPES (pH = 7,2) tartalommal (A-oldat), és 7 percig 5000 x g-vel centrifugáljuk. A retentátot (körülbelül 0,1 ml) 1,1 ml-re töltjük vissza friss A-oldattal, és kétszer újra koncentráljuk, A mintát egy 0,11 pm-es Ultrafree-MC steril Durapore egységen szűrjük át (Millipore, Bedford, MA), mielőtt a tenyészetet tartalmazó lukhoz adjuk.
3H-dopamin felvétel: A triciált dopamin (3H-DA) felvételt a korábban leírt módon tenyészetekben a 6. vagy 7. napon végezzük [Friedman és Mytilineou, Neurosc. Lett. 79, 6572 (1987)], minimális módosításokkal, és mindegyik oldatot 37 °C-on tartjuk. Röviden, a szaporító táptalajt eltávolítjuk, kétszer öblítjük 0,25 ml felvevő pufferrel, amelynek összetétele Krebs-Ringerféle foszfát puffer (pH=7,4), amely 5,6 mmól/1 glükózt, 1,3 mmól/1 EDTA-t, 0,1 mmól/1 aszkorbinsavat es 0,5 mmól/1 pargylint tartalmaz (ez egy monoamin oxidáz inhibitor). A tenyészeteket 0,25 ml 50 nmól/1 3HDA-val (New England Nuclear, Boston, MA, spec. akt. 36-37 Ci/mmól) 37 ’C-on inkubáljuk 15 percig. A 3HDA felvételt azzal állítjuk le, hogy eltávolítjuk az inkubációs elegyet, majd a sejteket kétszer mossuk 0,5 ml felvevő pufferrel. Abból a célból, hogy a 3H-DA-t felszabadítsuk a sejtekből, a tenyészeteket 0,5 ml 95%os etanollal inkubáljuk 30 percig 37 ’C-on, majd 10 ml EcoLite-hoz adjuk (ICN, Irvine, CA), és szcintillációs számlálóval megszámláljuk. A vak értékeket úgy kapjuk, hogy a felvevő pufferhez 0,5 mmól/1 GBR12909et adunk (RBI), ami egy specifikus inhibitora a dopamin neuronok nagy affinitású pumpájának [Heikkila és mtsai., Eur. J. Pharmacol.,103, 241—48 (1984)], és általában kevesebb, mint 5%-a a kezeletlen kontroll tenyészetek 3H-DA felvételének. A GDNF-aktivitás trofíkus egységeinek (TU) számát úgy határozzuk meg, mint annak a hígításnak a reciprok értéke, amely a tenyészet 3HDA felvétele maximális serkentésének 50%-át adja. A specifikus aktivitást úgy határozzuk meg, hogy a TU-k számát osztjuk a mintában található fehérje mennyiségével.
C. A GDNF tisztítása
Kiindulási anyag: A B49 jelű glioblasztóma-sejteket D. Schubert bocsátotta a rendelkezésünkre (Salk Institute, La Jolla, CA) [Schubert és mtsai., Natúré, 249, 224-27 (1974)]. A sejteket addig szaporítjuk, ameddig egybefüggő réteget képeznek DMEM táptalajban, amely 10% borjúmagzat szérumot, 4 mmól/1 glutamint, 50 E/ml penicillin-G-t és 50 pg/ml sztreptomicint tartalmaz tenyésztő lombikokban (225 cm2, Costar, Cambridge, MA). A szérummentes kondicionált növesztő táptalajt (CM) úgy állítjuk elő, hogy a tenyészetet egyszer mossuk 10 ml szérummentes táptalajjal, majd a sejteket lombikonként 50 ml szérummentes táptalajba tesszük 2 napra. A CM-et összegyűjtjük, majd a sejteknek minden második napon friss szérummentes táptalajt adunk a 6. napig. Az egyes sejtsarzsokról háromszor gyűjtött kombinált CM-et centrifugáljuk (5000 x g, 20 perc, 4 ’C), hogy eltávolítsuk a sejteket és a törmeléket. A felülúszót körülbelül tízszeresre töményítjük Amicon koncentrátorral (YM10membrán), majd centrifugáljuk (40 000 x g, 20 perc, 4 ’C). A felülúszót 0,2 μ-os Micro Culture Capsule-n (Gelmen Sciences) szűrjük át. Körülbelül 1 hónapig tárolható 4 ’C-on.
1. lépés: heparin-Sepharose-kmmatográfia: A fenti készítményt (200 g fehérje) egy „Heparin Sepharose CL-6B” oszlopra visszük (1x25 cm) (Pharmacia Piscataway, NJ), amelyet 50 mmól/1 NaPi pufferrel (pH = 8,0, 0,15 mól/1 NaCI-t tartalmaz) (A puffer) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot azután ugyanezzel a pufferrel mossuk, addig, amíg az elfolyó 280 nm-en mért optikai sűrűsége (OD2go) visszatér az alapvonalra, majd egy 100 mles, lineáris gradienssel eluáljuk, amely az A puffertől 50 mmól/1 NaPi (pH = 8,0), 1,5 mól/1 NaCI-t tartalmazó
HU 211 984 A9 pufféiig (B puffer) változik. Két ml-es frakciókat szedünk. A frakcióknak vizsgáljuk a vezetőképességét és a GDNF-aktivitását. Az eluált fehérjék profilját OD^-ban ábrázoljuk. Erre rajzoljuk rá a vezetőképesség és az egyes frakciókban mért GDNF-aktivitás ábráját. A jelölt frakciókat, amelyek csúcs GDNF-aktivitással rendelkeznek (körülbelül 0,6-0,8 mól/1 NaCl) a további elemzéshez egyesítjük.
2. lépés: FPLC-Superose-kromatográfia: A fenti egyesített frakciókat 0,4 ml-re töményítjük be Amicon koncentrátorral (Amicon, Beverly, MA, YMlO-membrán), majd FPLC-vei kromatografáljuk (Superose 12 oszlop, Pharmacia) 50 mmól/1 NaPi pufferben (pH = 7,4), amely 0,5 mól/1 NaCl-t tartalmaz, az áramlási sebesség 0,5 ml/perc. Az eluálás 14. percében 0,5 mles frakciókat szedünk szilikonozott mikrofuga csövekbe, amelyek 5 μΐ 0,4% Tween 20-at tartalmaznak. Az egyes frakciók alikvot részeinek mérjük a GDNF-aktivitását. A 2. ábrán látható egy ilyen kromatográfia az OD280-nal követett fehérje profillal, és az erre rárajzolt GDNF-aktivitási mintázattal. Az oszlopra felvitt GDNF-aktivitás 85%-át kinyertük a 12-15-ös frakciókban.
3. lépés: RP-HPLC (fordított fázisú HPLC): Az előző lépés 14-es frakcióját 10 μΐ 25%-os trifluorecetsavval (TFA) savanyítjuk. A savanyított anyag felét egy vékony lukú Aquapore Replikáció 300 C 8 fordított fázisú HPLC oszlopra visszük (Brownlee oszlop, Applied Biosystems, San Jose, CA), 2,1x220 mm, majd egy víz/0,1% TFA: 80% acetonitril/0,085% TFA gradienssel eluáljuk. A fehérjetartalmú frakciókat manuálisan szedjük szilikonozott mikrofuga csövekbe, a 214 nm-en mért UV-abszorpció alapján. Az egyes frakciókból származó alikvot részeknek vizsgáljuk a GDNF-aktivitását. A 3. ábrán látunk egy ilyen kromatográfiát, az OD214-en mért fehérje profillal, és az alsó részen az aktivitási mintázattal. Az 5. és 6. frakció tartalmazza az RP-HPLC-vel kinyert aktivitás körülbelül 90%-át, míg a 7. frakcióban található a maradék 10%-os aktivitás. A 4. ábrán láthatunk egy ezüsttel festett SDS-PAGE-eljárás gélt, a 3. ábrán bemutatott GDNF-aktivitás csúcs körül levő frakciókból futtatva.
4. lépés: preparatív SDS-PAGE: A csúcs GDNFaktivitást tartalmazó 5. és 6. frakciókat egyesítjük és 20 μΐ-re töményítjük 10 μΐ 0,4% Tween 20 jelenlétében egy speed-vac-berendezésen. A mintához 1 μΐ 1 mól/1 TRIS-bázist és 5 μΐ 0,2 mól/1 TRIS-HCl-t (pH = 6,8) adunk, amely 40% glicerint és 5% SDS-t tartalmaz, majd nem-redukáló 15%-os SDS-poliakrilamid-gélen futtatjuk [Laemmli, Natúré, 277, 680-684 (1970)] (0,075x14x11,5 cm, 20 lukas fésű, 0,074x0,4x2,8 cm/mintaluk). Az elektroforézist 10 ’Con végezzük 40 mA/gél paraméterrel 2 óra hosszat. A gélcsíkot 1,14 mm-es szeletekre vágjuk. Mindegyik szeletet 2 kisebb részre vágjuk, majd eluáljuk, háromszor cserélve rajta a 25 μΐ NaPi (pH = 6,7) 0,01% Tween 20 összetételű puffért, egy húszórás időtartam alatt, 4 ’C-on, folyamatos rázatás közben. Az eluált anyag három alikvot részét egyesítjük, és vizsgáljuk a GDNF-aktivitását (5. ábra), majd a legnagyobb aktivitást mutató eluátumot (a 16-23-as géldarabokból, ami az 5. ábrán 30-42 kD-nak felel meg) egyesítjük. Egy üres géldarabot (amire az elektroforézis előtt csak az SDS-PAGE mintapuffer volt felvive) a kontrolihoz hasonló módon dolgozunk fel.
5. lépés: RP-HPLC: Az egyesített gél-eluátumokat körülbelül 150 μΐ-re töményítjük speed-vac-berendezésben, 20 μΐ 25%-os TFA-val savanyítjuk, majd a 3. lépésben leírt módon RP-HPLC-n futtatjuk. A fehérjetartalmú frakciókat manuálisan szedjük szilikonozott mikrofuga csövekbe, az OD2I4 alapján, és vizsgáljuk a GDNF-aktivitásukat. A 6. ábrán láthatjuk egy ilyen kromatográfia eredményeit. Kontrollként hasonló méretű üres géldarabok eluátumait is futtatjuk az RPHPLC-n. A kontroll profil fölötti (6. ábra, A panel a B panellel szemben) egyetlen jelentős OD214 csúcs a hármas csúcs, amely a HPLC oszlopra felvitt GDNF-aktivitás 70%-át tartalmazza. A 7. ábrán a hármas csúcs ezüsttel festett SDS-PAGE gélen való futtatását láthatjuk. Az egyetlen látható festődés egy nagyon széles csík 30-42 kD között, ami egybeesik a preparatív SDS-PAGE-eljárásnál megfigyelt GDNF-aktivitási profillal (5. ábra). Egy tipikus tisztítás összefoglalását az 1. táblázatban adjuk meg.
D. A tisztított GDNF aminosav-szekvenciája.
Amino-terminális szekvencia: A 6. ábra hármas csúcsát gázfázisú fehérje szekvenátorral szekvenáljuk (Applied Biosystems). A kapott szekvenciát a 8. ábrán adjuk meg. A tisztítás 3. lépése utáni csúcs GDNF-aktivitással rendelkező frakciók (5. és 6. frakció a 3. ábrán) szekvenálása szintén egyetlen szekvenciát adott, azonosat a 8. ábrán látottal, amit a tisztított mintával kaptunk. Az egyetlen, ezekben a frakciókban közös anyag a 30-42 kD között futó kenődés. Ennek következtében, a 30-42 kD-os régión kívüli szennyező csíkok, amelyek a 4. ábra 5. és 6. frakciója ezüsttel festett géljén láthatók, vagy a) túl kis mennyiségben fordulnak elő (<1 pikomól) ahhoz, hogy a jelenlegi technológiával szekvenálni lehessen; b) szekvenciájuk a 30—42 kD-os kenődés szekvenciájával rokon; vagy c) blokkolt Nterminálissal rendelkeznek.
Belső szekvencia: Az előzőkben ismertetett tisztítás 3. lépése utáni GDNF preparátumot használjuk kiindulási anyagként a belső szekvencia meghatározásához. A 3. ábrán látható 5. és 6. frakciót egyesítjük egy szilikonozott mikrofuga csőben amely 9 μΐ 0,4%-os Tween-t tartalmaz, és egy speed-vac-berendezésben 40 μΐ-re töményítjük. A mintához 160 μΐ 1%-os NH4HCO3-at adunk, amely 2,5 mól/1 guanidin-hidrokloridot és 1 μg tripszint tartalmaz, majd éjszakán át 37 ’C-on inkubáljuk. Az elegyet 20 μΐ 25%-os TFA-val savanyítjuk, speed-vac-berendezésen körülbelül 150 μΐ-re töményítjük, majd a peptideket egy kislukú Aquapore RP-300-as C-8 fordított fázisú HPLC oszlopon (Brownlee oszlop, 2,1x220 mm) választjuk el, az eluálást víz/0,1% TFA : 80% acetonitril/0,085% TFA gradienssel végezzük. A peptidet tartalmazó frakciókat manuálisan szilikonozott mikrofuga csövekbe gyűjtjük, a 214 nm-en mért abszorpció alapján. A 9. ábrán láthatók egy ilyen kromatográfia
HU 211 984 A9 eredményei. A 9. ábra 10-es csúcsának szekvenciáját azonosnak határoztuk meg a 8. ábrán bemutatott kezeletlen fehérje N-terminális szekvenciája első 13 aminosavával (szekvencia-azonosítószám: 1). A9. ábrán látható 37es csúcsot tovább kezeljük CNBr-rel. A mintát 20 μΐre töményítjük speed-vac-berendezésben. A mintához 7 μΐ 90%-os hangyasavat és 5 mg CNBr-t adunk, majd a mintát szobahőmérsékleten sötétben éjszakán át inkubáljuk. Ezt az elegyet speed-vac-berendezésben 20 μΐ-re töményítjük, majd 10 μΐ 0,1%-os TFA-val hígítjuk, és az előzőkben leírt módon fordított fázisú HPLC-vel választjuk el. A10. ábrán láthatók egy ilyen kromatográfia eredményei. A 10. ábrán látható 1. csúcsot speed-vac-berendezésben 20 μΐ-re töményítjük 5 μΐ 0,4%-os Tween 20 jelenlétében.
A mintához 10 μΐ 1%-os NH4HCO3-at és 5 μΐ ditiotreitolt adunk, majd a mintát egy óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az elegyet 10 μΐ 25 %-os TFA-val savanyítjuk, 100 μΐ-re töményítjük speed-vacberendezésben, és fordított fázisú HPLC-vel választjuk el, az előzőkben leírt módon. All. ábrán láthatjuk egy ilyen kromatográfia eredményeit. All. ábrán mind a 33-as, mind a 34-es csúcs azonos szekvenciával rendelkezik (12. ábra) (szekvencia-azonosítószám: 2).
E. A GDNF jellemzői
Mobilitás SDS-PAGE-n: A minta bármilyen hőkezelése nélkül, nem-redukáló körülmények között a GDNF egy elmosódott csík formájában fut 31-42 kD között SDS-PAGE-eljárással. Ha a mintát 100 ’C-ra melegítjük, és 3 percig itt tartjuk redukáló ágens (4%os β-merkaptoetanol) jelenlétében, akkor a GDNF több különálló csík formájában fut, méretük 20-23 kD. Mivel a gélre felvitt biológiai aktivitásnak közel az 50%-a kinyerhető az előző (nem-redukáló) körülmények között, de az utóbbi (redukáló) körülmények között semmi nem nyerhető ki, a GDNF egy diszulfid híddal összekötött dimer lehet, és csak dimerként aktív. Mivel egyetlen N-terminális szekvenciát kaptunk, ez azt sugallja, hogy a GDNF preparátum homogén a primer szerkezetet tekintve, ezért a többszörös elmosódott csíkozat arra utal, hogy ez egy heterogén módon glikozilezett fehérje.
Specifikus aktivitás: A tisztított GDNF becsült specifikus aktivitása körülbelül 17 trofikus egység/ng, ami azt mutatja, hogy a dopamin felvétel maximális serkentésének fele viszonylag alacsony koncentrációnál jön létre, körülbelül 60 pg/ml-nél. A tisztított GDNF mért specifikus aktivitását alulbecsülhetjük valamennyire, a GDNF tisztítás során fellépő részleges inaktiválódása következtében, ami a fordított fázisú HPLC során használt savas szerves oldószerekkel való érintkezés, és az SDS-PAGE során használt denaturáló körülmények következménye.
A GDNF specifitása: A GDNF-et azon az alapon tisztítjuk, hogy képes fokozni a dopamin felvételét a dopamin neuronokbán (20A. ábra). Annak meghatározására, hogy a GDNF emellett serkenti-e a túlélési indexet és/vagy a dopamin neuronok érését, a középagyi tenyészetekben a tirozin-hidroxiláz immunreaktivitását is mérjük. A TH specifikus markere a dopamin neuronoknak a tenyészetekben. Az immunreaktivitás GDNF által való serkentése a dopamin neuronok fokozott túlélésének és/vagy a TH/dopamin neuron termelés fokozásának következménye. A tisztított GDNFnek a szélesztés napján való hozzáadása, majd a tenyészetek nyolcadik napon való vizsgálata a nyolcadik napon azt eredményezte, hogy a TH+ neuronok száma tízszer magasabb, mint a GDNF-et nem kapott kontroliokban. Ha egy második adag GDNF-et adunk hozzá a 9. napon, és a tenyészeteket hét nappal később vizsgáljuk (16 nap in vitro), akkor a kontrollal szemben hasonló dózisfuggő fokozódás figyelhető meg (20B. ábra). Tehát a GDNF elősegítheti a dopamin neuronok túlélését és/vagy fokozza a TH gén expresszióját a középagyi dopamin neuronokbán.
Annak igazolására, hogy a GDNF specifikus serkentő hatással rendelkezik a dopamin neuronok érésére és/vagy túlélésére, és nincs általános hatása az összes neuronra, a GDNF gamma-amino-vajsavat (GABA) tartalmazó neuronokra, amelyek szintén jelen vannak a középagyi tenyészetekben, való hatását is vizsgáltuk. A H3-dopamin (3H-DA) és a ,4C-GABA felvételt is mérjük középagy sejtek testvértenyészeteiben, amelyeket különböző koncentrációjú GDNF jelenlétében szaporítottunk 15-16 napig. Amint az előzőkben ismertettük, a GDNF körülbelül 150%-kal fokozta a középagyi dopamin neuronok 3H-DA felvételét a GDNF-et nem tartalmazó kontrollal szemben (21 A. ábra). A GDNF-nek azonban nincs jelentős hatása a GABA neuronok kapacitására a 14C-GABA felvételét illetően, mivel a l4CGABA felvétele GDNF jelenlétében csak mintegy 20%-kal magasabb, mint a kontrolié (21B. ábra). Ezt illusztrálja még a számított 3H-DA/14C-GABA felvételi arány növekedése (2IC. ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a dopamin- és GABA középagyi neuronok eltérő módon reagálnak a GDNF jelenlétére, és a GDNF-nek a középagyi tenyészetekben a 3H-DA felvételre gyakorolt serkentő hatása specifikusan a dopamin és nem a GABA neuronokra irányul.
Ezek a megfigyelések további fényt vetnek arra, hogy a GDNF-et miért lehet használni a Parkinson-kór, illetve más, a dopaminerg neuronokra is vonatkozó kór kezelésére. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GDNF a dopaminerg neuronoknak legalább két érdekes tulajdonságát fokozza: a dopamin felvételt és a TH enzimszintet. Az eredmények azt is igazolják, hogy a GDNF hatásai legalább részben specifikusak a dopaminerg neuronokra, mivel a GABA neuronokat nem serkenti hasonlóképpen.
A dopaminerg és GABA-erg neuronok mellett a patkányközépagy tenyészetekben van más neuronális populáció is, a szerotoninerg neuronok. Néhány faktor azaz például az epidermális növekedési faktor (EGF), amely fokozza a dopaminerg neuronok dopamin felvételét a középagyi tenyészetekben, fokozza a szerotoninerg neuronok szerotonin felvételét is, és a GABA-erg neuronok GABA felvételét is [Casper és mtsai., J. Neurosci., 30, 372 (1991)]. Ez azt mutatja, hogy ezek a faktorok nem dopaminerg neuron specifikusak.
Ezzel szemben, a GDNF nem képes fokozni a szerotoninerg neuronok szerotonin felvételét. A 3H-szero18
HU 211 984 A9 tonin felvételt ugyanúgy mérjük, mint a 3H-DA felvételt az 1B. példában, azzal a különbséggel, hogy a felvevő puffer 50 nm 3H-szerotonint tartalmaz (11 Ci/mől, Amersham, Arlington Heights, IL) a 3HDA helyett. 10 pmól citalpram jelenlétében (amit Dr. C. Mytilenoutól kaptunk, Mount Sinai School of Medicine), ami egy ismert inhibitora a szerotonin felvételének a szerotonin neuronokbán, A 3H-szerotonin felvétele 15%-ra csökkent vissza. A citalpram jelenlétében kapott kontroll értékeket kivonjuk a 24. ábrán látható kísérleti értékekből.
A nem-specifikus faktorokkal, mint például az EGF, szemben, a GDNF nem fokozza a GABA felvételét (21. ábra) és a szerotonin felvételét (24. ábra) olyan körülmények között, amelyek között a dopamin felvételét jelentősen fokozza. Ezek, és egyéb, az előzőkben ismertetett eredmények azt mutatják, hogy a GDNF a középagyi tenyészetekben levő dopaminerg neuronokra specifikus, ha az ugyanabban a tenyészetben jelenlevő GABA-erg és szerotoninerg neuronokkal hasonlítjuk össze. Az ilyen specifitás fokozza a GDNF használhatóságát a Parkinson-kór kezelésében, amit a közép-agyi (nigrális) dopaminerg neuronokra specifikus betegségnek tekintenek.
2. példa: Λ GDNF-gén klónozása
A. A GDNF-et kódoló patkánygén cDNS-kópiájának klónozása
Ahhoz, hogy a GDNF-et kódoló gént klónozzuk, egy cDNS-könyvtárat hozunk létre B49-sejtekből izolált poliA+-RNS-ből, és ezt a könyvtárat vizsgáljuk át egy degenerált oligonukleotid-próbával, amely a tisztított GDNF aminosav-szekvenciája alapján készült. Egy ehhez a próbához hibridizálódó cDNS-klón DNS-szekvenciáját meghatározzuk, olyan kiónt keresve, amely a degenerált oligonukleotid-próbában használt szekvenciától 3’irányban található, egy, a GDNF-ben található aminosavszekvenciát kódol, és a C-terminális irányában található ahhoz az aminosav-szekvenciához képest, amelynek alapján a vizsgáló oligonukleotid-próba készült.
A B49-sejtek tenyésztésének körülményeit részletesen ismertetjük az előző, 1. példában. Az RNS készítéséhez a sejteket közel egybefolyásig növesztjük szérumtartalmú táptalajon, egyszer mossuk szérummentes táptalajjal (DMEM) és 4 napig növesztjük DMEMben, két nap elteltével egyszer cserélve a táptalajt. A sejteket azután kinyerjük, és az össz-RNS-t kivonjuk, Chomczynski és Sacchi módszerével [Analytical Biochemistry, 162, 156-159 (1987)]. A poliadenilezett RNS-t ebből az össz-RNS-ből izoláljuk, oly módon hogy egy oligo determináns cellulóz oszlopon bocsátjuk át, Maniatis és munkatársai leírása szerint [Maniatis és mtsai., MolecularCloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)].
A cDNS szintézisét M-MLV RN-áz-H reverz transzkriptázzal végezzük (Bethesda Research Láb, Gaithersburg, MD), a gyártó előírásai szerint. Az első szál reakciót egy oligo-dT láncindító molekulával (Pharmacia) indítjuk, és a reakcióelegy tartalmaz még 8 egység RN-asin-t is (Promega, Madison, WI), 5 pg poliA+-RNS-re számítva. A második lánc szintézisét Escherichia coli DNS polimerázzal, Esckerichia coli RN-áz-H-val és Escherichia coli DNS ligázzal (mindegyikét a BRL-től vesszük) végezzük, a gyártó előírásai szerint. A klónozás megkönnyítésére a cDNS-t T4 DNS polimerázzal (BRL) kezeljük, tompavégek előállítása céljából majd EcoRI metilázzal (BRL) kezeljük. Ezeket a lépéseket Az enzimet szállító cég előírásai szerint hajtjuk végre. A cDNS-t azután kétszer extraháljuk fenol:kloroform 1:1 arányú elegyével, majd kloroformmal, majd a vizes fázist 1/2 térfogat 7,5 mól/1 NH4Ac-tal és 3 térfogat etanollal szobahőmérsékleten kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással nyerjük ki (15 perc, 16 000 x g szobahőmérsékleten), 70%-os etanollal mossuk, vákuumban szárítjuk, és 50 pl 50 mmól/1 TRIS-HC1 pH = 7,6, 10 mmól/1 MgCl2, 1 mmól/1 ATP, 1 mmól/1 DTT, 5% PEG8000 összetételű pufferben szuszpendáljuk, amely 500 pikomól foszforilezett linkért (CCCGAATTCGGG, Pharmacia) (szekvenciaazonosítószám: 9) és 3 egység T4 DNS ligázt tartalmaz. A linker reakciót éjszakán át (körülbelül 16 óra) hajtjuk végre 16 °C-on. A reakcióelegyet azután fenokkloroform 1:1 arányú elegyével extraháljuk, és az előzőkben leírt módon kicsapjuk. A mosott üledéket megszárítjuk, és 50 pl EcoRI emésztési pufferben (100 mmól/1 TRIS-HC1 pH = 7,5, 5 mmól/1 MgCl2. 50 mmól/1 NaCl és 0,025% Triton X-100) szuszpendáljuk, majd 400 egység EcoRI (New England Biolabs Beverly, MA) adunk hozzá. A reakciót 2 óra hosszat 37 'C-on hagyjuk lejátszódni. A kicsapást követően (a fentiekben leírt módon) az üledéket EcoRI emésztési pufferben szuszpendáljuk, és egy második EcoRI emésztési reakciót is végrehajtunk, az előzőkben leírt módon. Ezt a reakcióelegyet is kicsapjuk, és 40 pl 10 mmól/1 TRIS-HC1 pH = 8,0, 1 mmól/1 EDTA, 100 mmól/1 NaCl összetételű pufferben szuszpendáljuk. Ezt a cDNS-t, amely most EcoRI-gyel emésztett linkereket tartalmaz, méret szerint frakcionáljuk egy Sephacryl S-300-as (Pharmacia) centrifugáló oszlopon történő centrifugálással (1100 x g, 5 perc). Az erről az oszlopról lejövő oldatot összegyűjtjük, etanollal az előzőkben leírt módon kicsapjuk, majd 10 mmól/1 TRISHC1 pH = 8,0, 1 mmól/1 EDTA összetételű pufferben szuszpendáljuk, körülbelül 0,1 pg/pl koncentrációban.
Egy cDNS-könyvtárat készítünk a lambda-ZapII (Stratagene, La Jolla, CA) klónozó vektorban. Tipikusan 1 pg EcoRI-gyel emésztett és foszfatázozott vektorkarokat (Stratagene termék) ligálunk 0,1 pg EcoRIgyel linkereit cDNS-sel 5 pl ligáló elegyben, körülbelül 3 Weiss egység T4 DNS ligázt használva 50 mmól/1 TRIS-HC1 pH = 7,6, 7 mmól/1 MgCl2, 1 mmól/1 DTT, 5% PEG8000 és 1 mmól/1 ATP összetételű pufferben. A ligálásokat 16 °C-on végezzük, éjszakán át. A ligáló elegyeket Gigapack Gold pakoló kivonatokkal (Stratagene termék) pakoljuk, a gyártó által mellékelt előírások szerint. A könyvtárakat a titer meghatározása céljából szélesztjük, a vizsgálatot a Stratagene által adott XLl-Blue gazdaszervezeten végezzük.
Egy ilyen ligálásból és pakolásból körülbelül 270 000 tarfoltképző egységet kapunk összesen 12,
HU 211 984 A9
150 mm átmérőjű Petri-csészére szélesztve. Ezekről a lemezekről nitrocellulóz-fil térré másolatokat készítünk Maniatis és munkatársai leírása szerint [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezeket a szűrőlapokat hibridizáljuk az alábbi, 32P-vel jelzett degenerált oligonukleotidhoz (szekvencia-azonosítószám: 7) (I jelentése inozin):
5'->CCIGATAAACAAGCIGCIGC>3'
CCG
Ezt a szekvenciát a tisztított GDNF N-terminálisa körül meghatározott aminosav-szekvencia (8. ábra, szekvencia-azonosítószám: 1) alapján adjuk meg, amint azt az előző, 1. példában ismertettük
Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala
Az oligonukleotidot 32P-ATP-ből származó 32P-vel jelezzük (Amersham Arlington, Heights, IL), T4 polinukleotid kináz (Pharmacia vagy United States Biochemical, Cleveland, OH). A hibridizációs reakciókat 6X SSPE, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml tRNS (SIGMA, St. Louis, MO), valamint 2X Denhardt (0,4-0,4 mg/ml ficoll, polivinil-pirrolidon, BSA V-ös frakció) oldatokkal végezzük, 50 °C-on, éjszakán át (körülbelül 16 óra). A hibridizációs oldat 2-3x106 cpm jelzett oligonukleotidot tartalmaz minden ml oldatban. Az alábbi hibridizáció után a szűrőket kétszer mossuk szobahőmérsékleten 2 X SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban, valamint kétszer ugyanebben az oldatban, de 50 °C-ra melegítve. A szűrőlapokat hagyjuk levegőn megszáradni, és 7 napig -70 °C-on exponáljuk, erősítő fólia alkalmazásával.
Az előhívott filmeket megvizsgáljuk, hogy tartalmaznak-e olyan tarfoltokat, amelyek a vizsgáló oligonukleotiddal hibridizálódnak. Ebben az elsődleges szűrővizsgálatban 24 feltételezett pozitív kiónt azonosítottunk. A pozitív jelnek megfelelő területeket kivágjuk a könyvtár lemezekből, szuszpendáljuk, és egy második szűrővizsgálathoz újra szélesztjük, amely során az előzőkben leírt hibridizációs eljárást alkalmazzuk. Ebben a második vizsgálatban az eredetileg talált 24 klón közül nyolcat találtunk pozitívnak, míg 16 negatív eredményeket adott. Ezt a nyolc pozitív kiónt tarfolttisztítással tisztítjuk 1-2 további hibridizációs lépésben, és ezek közül hatot DNS-szekvenálással tisztítunk, hogy meghatározzuk, vajon tartalmaznak-e olyan DNS-szekvenciákat, amelyek GDNF-et kódolnak.
A lambda-ZapII fág fágmid része, amely a klónozott inszertet tartalmazza, a pBluescript SK-jelzést kapta. A pBluescript SK- fágmidet kihasítjuk azokból a lambda-ZapII rekombinánsokból, amelyek hibridizálnak az oligonukleotid-próbával. Azt az in vivő eljárást, amellyel a lambda-ZapII vektorból a rekombináns pBluescript SK-plazmidot ki lehet vágni, részletesen megadják a gyártó leírásaiban. Röviden, a lambdaZapII fág és egy M13 „segítő” fág együttfertőzése eredményezi a rekombináns pBluescript egy egyszálú DNS másolatának a pakolását egy fertőzőképes Ml3 virionban. Ha egy ilyen virion egy érzékeny sejtet fertőz meg, akkor az egyszálú DNS kétszálú DNS-sé alakul, és a továbbiakban plazmidként szaporodik. Ennek az eseménynek a szelektálását a pBluescript SKáltal kódolt ampicillin rezisztencia teszi lehetővé. Tehát a nyolc pozitív lambda-ZapII klónból származó „megmentett” rekombináns pBluescript SK- plazmidot tartalmazó Escherichia coli XLl-Blue származékok könnyen előállíthatók, ha a Stratagene által megadott leírást követjük, és a lambda-ZapII vektor mellé adott „segítő” fágot is használjuk.
A DNS-szekvencia meghatározásához a kétszálú plazmid-DNS-t ezek közül a rekombinánsok közül hatból állítjuk elő, Bimbóim és Doly „miniprep” módszerének alkalmazásával [Bimbóim, Doly, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)]. Didezoxi-terminációs DNS-szekvenáló reakciókat végzünk ezeknek a templátoknak a felhasználásával, és a vizsgáló oligonukleotidokat használva indító molekulaként. A szekvenálási reagenseket az United States Biochemical-tól lehet beszerezni kit formájában (2.0 Sequenase Version), és a szekvenálási eljárást a gyártó által megadott leírás szerint végezzük. Az egyik klón, a pBluescript SK-76.1, amely a lambda-ZapII76.1 klónból származik, az alábbi szekvenciát tartalmazza (szekvencia-azonosítószám: 11):
5'>GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA>3' T AA ΤΑ T A T
Ezt a szekvenciát az alábbi aminosav-szekvenciára lehet lefordítani (szekvencia-azonosítószám: 12):
Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro, ami megegyezik azzal az aminosav-szekvenciával, amely a GDNF egy olyan N-terminális régiójában található, amely a vizsgáló oligonukleotid/szekvenáló indító molekula készítéséhez használt aminosav-szekvencia végétől számított 5 aminosavval kezdődik. Ez az eredmény azt igazolja, hogy a lambda-ZapII76.1ben található cDNS-klón a B49-sejt kondicionált táptalajából származó tisztított GDNF-fehérjének egy részét, vagy egészét kódolja.
B. A lambda-ZaplI76. J cDNS-klón GDNF-et kódoló régiójának nukleinsav-szekvenciája
A cDNS-klón 5’-végének első 877 bázispárjának nukleotid határozzuk meg. Erről a régióról kiderült, hogy egy 227 aminosav méretű nyitott leolvasási keretet (ORF) tartalmaz, amelyben megtalálható az az aminosav-szekvencia, amelyet a tisztított GDNF N-terminálisánál határoztunk meg, és megegyezik azzal a belső pep50 tiddel, amelyet a tisztított GDNF hasításával kaptunk meg. Az erre az ORF-re kikövetkeztetett C-terminális 134 aminosav tartalmazza a tisztított érett GDNF-fehérje származtatott aminosav-szekvenciáját. A megelőző 93 aminosav-szekvencia tartalmaz egy potenciális iniciáló
ATG-kodont, amelyet egy feltételezett szekréciós szignál-szekvencia követ, és egy potenciális proteolitikus processzálási helyet is tartalmaz a fehérje egy „prepro’prekurzor formájának a hasítása céljából, hogy így az érett, az 1. példában leírt érett, tisztított GDNF-et kapjuk.
HU 211 984 A9
A szekvenálási reakciókban használt templát-DNSek közé tartoznak a pBluescript SK-76.1-plazmid egyszálú és kétszálú verziói. A kétszálú DNS-t az XL1Blue (pBluescript SK-76.1) tenyészeteiből állítjuk elő a „forralt preparátum” eljárással [Analytical Biochemistry, 774,193-197], és egy CsCl sűrűségi gradiensen tisztítjuk. Az egyszálú templátot úgy állítjuk elő, hogy az XLl-Blue-t (pBluescript SK-76.1) egy „segítő” Μ13-fággal fertőzzük, amely segítő fágot a szállító cég (Stratagene) adja, a fággal együtt, megfelelő leírás alapján. A 15-23 nukleotid hosszúságú egyszálú oligonukleotid indító molekulákat Applied Biosystems (Foster City, CA) DNS szintetizátorral (38OA modell) állítjuk elő, és általában tisztítás nélkül használjuk. A szekvencia meghatározását a didezoxi-láncterminációs módszerrel végezzük. A használt reagensek közé tartozik a Sequenase Version 2.0 kit (United States Biochemical), amelyet a gyártó által mellékelt leírások alapján használunk.
A lambda-ZapII76.1 cDNS-klón 5’-vége első 877 nukleotidjának nukleotid szekvenciája, amely a tisztított, érett GDNF-fehérje kódoló szekvenciáját tartalmazza, a 13. ábrán mutatjuk be (szekvencia-azonosítószám: 3), azzal a származtatott aminosav-szekvenciával együtt, amely 681 nukleotid méretű nyitott leolvasási keretnek (ORF) felel meg, és ezen a szekvencián belül található meg. A tisztított, érett GDNF-nek megfelelő szekvencia a 281-es pozícióban indul egy szerinnel, ez a 14. ábrán látható (szekvencia-azonosítószám: 4). Az erre a régióra kapott DNS-szekvenciából egy olyan aminosav-szekvencia származtatható, amely tökéletesen megfelel a tisztított GDNF N-terminálisánál megfigyelt aminosav-szekvencia első 23 aminosavának (lásd 1. példa).
A génnek a 13. ábrán bemutatott analízise alapján az valószínű, hogy a GDNF először prepro-GDNF polipeptid alapján transzlálódik, és a szignál-szekvencia, valamint a „pro” rész proteolitikus hasítása eredményezi a GDNF-nek azt a formáját amelyet a B49-sejt kondicionált táptalajából lehet tisztítani. Egy ilyen prepro-forma transzlációs iniciációjának legvalószínűbb pontja az az ATG-kodon, amely a 13. ábrán látható szekvencia (szekvencia-azonosítószám: 3) 50-es pozíciójában található.
C. A GDNF-et kódoló humángén klónozása Számos neurotróf faktor aminosav-szekvenciája erősen megőrződik számos különböző emlősfajban [Hallböök és mtsai., Neuron, 6, 845-858 (1991); McDonald és mtsai., Biochimica et Biophysica Acta, (in press) (1991)]. Az aminosav-szekvencia konzerválódásának következménye az, hogy az ezeket a fehérjéket kódoló nukleotid szekvenciák is erősen konzerválódtak, Ennélfogva általában igaz, hogy egy neurotróf faktort egy emlősfajban kódoló gén képes kereszt-hibridizációra (azaz képes stabil kétszálú DNS hibridet létrehozni) azokkal a génekkel, amelyek egy másik emlős fajban kódolnak egy ilyen faktort, megfelelő hibridizációs körülmények között. Ezt a tulajdonságot használtuk olyan klónozott humán DNS-szekvenciák azonosítására, amely tartalmazza a GDNF-gént.
A lambda-FIXII vektorban készített humán genomi könyvtárat vásároltunk a Stratagene-től (katalógusszám #946203), és a GDNF patkány-cDNS-klónjából (pBluescript SK-76.1) származó, 32P-vel jelzett próba alkalmazásával vizsgáljuk át, a 2B. példában leírtak alapján. A próba körülbelül 250 bázispárt tartalmaz az érett GDNF kódoló szekvenciájából, és a polimerázláncreakcióval végzett specifikus amplifikálással állítjuk elő [Saiki és mtsai., (1985); Science, 230, 1350 (1985)], az alábbiak szerint. Egy 50 μΐ-es vagy 100 μΐes PCR-reakciót <lng lambdaZapII76.1 DNS-sel mint templáttal, és a patkány-GDNF szekvenciája alapján készített két oligonukleotid indító molekulából 1020 pmóllal végzünk. Az egyik oligonukleotid a „vizsgáló oligonukleotid” (DHD-21 jelzéssel is előfordul), amelyet az előző 2A. példában írtunk le, míg a második oligonukleotid (DHD-26) (szekvencia-azonosítószám: 13) szekvenciája az alábbi:
5'->AAATTTTTIAAIATTTTATC>3'
GG C G C G ami a GDNF hasításával kapott belső peptid-termék (lásd 1. példa) aminosav-szekvenciáján (Asp-Lys-IleLeu-Lys-Asn-Leu) alapul. A reakciót 10 mmól/1 TR1S-HC1 pH = 8,3 25 ’C-on, 50 mmól/1 KC1, 1,5 mmól/1 MgCl2, 10 pg/ml BSA (Promega R3961), 0,2-0,2 mmól dNTP (Pharmacia) összetételű reakcióelegyben végezzük 2,55 μ polimeráz felhasználásával (USB). A reakció 30 ciklusból áll: a ciklus első lépése 95 ’C egy percig, a második lépése 44 ’C 1,5 percig, a harmadik lépése 72 ’C 1,5 percig. Ennek a reakciónak a terméket agaróz-gélelektroforézissel figyeljük meg, körülbelül 250 bp méretű, ami megegyezik a két indító molekulának a 13. ábrán bemutatott cDNS-szekvencián elfoglalt pozíciójával. Ezt a jelzetlen fragmenst eluáljuk a gélből, egy Ultrafree-MC Filter Unit (Millipore, Bedford, MA) berendezésben, a gyártó által megadott eljárások szerint, és templátként használjuk a további PCR jelzési reakciókban, amelyet ugyanennek a két oligonukleotid indító molekulának a felhasználásával végzünk. Ezeket a reakciókat azonos körülmények között végezzük, azzal a különbséggel, hogy a hideg dCTP koncentrációját 12,5 pmól/l-re csökkentettük, és a reakcióelegyhez 2,5 pmól/l 30005000 Ci/mmól a-32P dCTP-t (Amersham) adtunk. A jelzési reakció termékeit egy Biospin 6 forgatott oszlopon (BioRad, Richmond, CA) bocsátjuk át. Az ezen az oszlopon átfolyó folyadékot használjuk próbaként a humán genomi könyvtár átvizsgálásában.
A könyvtár a Stratagene által rendelkezésünkre bocsátott Escherichia coli PLKJ7 törzsre szélesztjük ki. Huszonnégy darab 150 mm átmérőjű Petri csészét készítünk, mindegyik körülbelül 50 000 tarfoltot tartalmaz. Az egyes lemezekről nitrocellulóz filter másolatokat (2-2 db) készítünk, a Maniatis és munkatársai által leírt eljárás alkalmazásával [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezt a negyvennyolc szűrőlapot vizsgáljuk át 250xl06cpm
HU 211 984 A9
PCR-próbával (amelyet 0,5 mól/I NaOH-val denaturáltunk) az előzőkben leírt módon 250 ml 6 x SSPE, 0,1% SDS, 2x Denhardt reagens, 0,1 mg/ml tRNS és 30% formamid (USB) összetételű oldatban, 42 ’C-on, éjszakán át (körülbelül 16 óra). A szűrőket azután kétszer mossuk 250 ml SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban szobahőmérsékleten, majd kétszer mossuk 1,6 liter, 50 C-ra előmelegített 0,1 X SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban. A szűrőlapokat szobahőmérsékleten hagyjuk megszáradni, majd 6 napig filmre exponáljuk -70 °C-on, erősítő fólia alkalmazásával. A filmeket előhívjuk és kiértékeljük. Hat erős pozitív kiónt figyelhettünk meg. A pozitív jelnek megfelelő területeket kivágunk a lemezekből, szuszpendáljuk, majd újra szélesztjük egy második vizsgálat céljából, az előzőkben leírt vizsgálatot alkalmazva. Mind a hat újra vizsgált klón pozitív volt, ezeket tarfolt tisztításnak vetettük alá, egy újabb szélesztési és hibridizációs lépés alkalmazásával.
Szakember számára rutin műveletek dolga a próbával szomszédos DNS régió szegmentjeinek szubklónozása és szekvenciájának meghatározása, és ezáltal a humán GDNF-gén teljes szekvenciájának, vagy annak egy részének meghatározása. Ha ezekben a kiónokban nem lehet a teljes humán GDNF-gént megtalálni, akkor az is rutinművelet szakember számára, hogy „sétáljon” a kromoszómán, és klónozza az ekörül a régió körül található átlapoló szegmenteket, hogy ezáltal megkapja és szekvenálja a gén további részét.
Az előzőkben említett eljárás, és számos más eljárás, amelyek nyilvánvalóak szakember számára, használhatók más humán génkönyvtár átvizsgálására. Például az előzőkben ismertetett próba és hibridizációs protokoll alkalmazásával egy humán cDNS-könyvtárat vizsgáltunk át. amelyet a humán putamenből kivont A+-RNS-ből készítettünk. Ezt a könyvtárat, amelyet a lambda-gtlO vektorban készítettek, a Clontech-től vásároltuk (Palo Alto, CA) (katalógusszám #HL1092a, Lót# 1561). Ezt a könyvtárat Escherichia coli LE392-sejtekre szélesztettük [Maniatis és mtsai MolecularCloning: ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] (összesen körülbelül 250 000 tarfolt), körülbelül 20 000 tarfolt per lemez sűrűségben, és hibridizációval vizsgáltuk át, az előzőkben leírt körülmények között. A hibridizálást követően a szűrőlapokat kétszer mossuk szobahőmérsékleten 0,2 X SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban, majd kétszer 50 °C-ra előmelegített 0,1 X SSPE, 0,1% SDS összetételű oldatban. A szűrőlapokat hagyjuk a levegőn megszáradni, majd filmre helyezzük. 3 napig exponáljuk -70 ’C-on erősítő fóliákkal, majd a filmeket előhívjuk. 8 kettős pozitív kiónt tudtunk azonosítani.
Hat, egy humán genomi könyvtárból származó lambdaFIXII-klónt azonosítottunk hibridizációval egy patkány-GDNF-próba alkalmazásával, és tarfolt tisztítással homogenitásig tisztítottuk (lásd az előzőkben). Az egyes fágok lizátumait Maniatis és munkatársai által közölt módszerrel állítjuk elő [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Ezekből a klónokból az alábbi módszerrel állítunk elő DNS-t: annyi DN-áz I-et (Pharmacia) és RN-áz A-t (Sigma) adunk az egyes tenyészetek 5 ml-éhez, hogy 1 μg/ml legyen a végkoncentrációjuk. Az oldatot 1 óra hosszat inkubáljuk 37 ’C-on. Ezután 5 ml 20%-os polietilén-glikolt (Sigma), 2 mól/1 NaCl-t adunk hozzá, és az oldatot 1 óra hosszat 0 ’C-on inkubáljuk. A lambda-fágot centrifugálással ülepítjük (12 000 x g, 10 perc). A fág üledéket 250 μΐ TE pufferben (10 mmól/1 TRIS-HCI pH = 7,4,1 mmól/1 EDTA) szuszpendáljuk, majd egymás után a következőkkel extraháljuk: a. kloroform: b. fenol; c. fenol:kloroform 1:1 arányú elegye; d. kloroform. Annyi ammónium-acetátot adunk hozzá, hogy a végkoncentrációja 0,25 mól/1 legyen, majd a DNS-t 2 térfogat etanol hozzáadásával kicsapjuk, és 10 000 x g-vel centrifugáljuk. A DNS-üledéket TE-ben szuszpendáljuk.
Minden egyes lambda-izolátumból származó DNS-t különböző restrikciós enzimmel emésztünk, majd a fragmenseket agaróz gélen végzett elektroforézissel elválasztjuk [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. A DNS-fragmenseket két azonos nylon membránra visszük át (Schleicher és Schüll), és patkány-GDNF-ből származó, radioaktívan jelzett próbával hibridizáljuk. A patkány-GDNF-ben van egy EcoRI hasítási hely a 356-os és 357-es nukleotidok között (a 13. ábra számozását követve). Ez belehasít az érett GDNF kódoló szekvenciájába. Annak meghatározásához, hogy a humán genomi kiónok rendelkeznek-e hasítási hellyel egy ezzel homológ pozícióban, a humán kiónok emésztésére használt restrikciós enzimek közül az egyik az EcoRI volt. Specifikusan jelzett próbákat készítünk mind a patkány GDNF EcoRI hasítási helye előtti régiókra (1-es próba), mind a patkány-GDNF hasítási helye utáni régiókra (2-es próba). Az 1-es próba 268 bázispár hosszúságú, és a patkány-GDNF 5’-nem-transzlálódó régiójából 14 bázispárt, valamint a kódoló szekvenciából 253 bázispárt tartalmaz (az 1-85-ös aminosavakat). Úgy állítjuk elő hogy a lambda-ZapII76.1 DNS Polimeráz-láncreakcióval amplifikáljuk, a PD1 oligonukleotidot (GACGGGACTCTAAGATG) (szekvencia-azonosítószám: 15) és a DHD23-as oligonukleotidot (GCIGCIGC(C/T)TG(T/C)TT(A/G)TCIGG) (szekvenciaazonosítószám: 16) használva indító molekulaként. A fenti próba készítéséhez használt reakciókörülmények ugyanazok, mint amik az előzőkben voltak, azzal a különbséggel, hogy a reakció 30 ciklusból áll:
’C 1 percig, 50 ’C 1,5 percig, 72 ’C 1,5 percig. A 2-es próba 195 bp hosszúságú, és 17 nukleotidot tartalmaz a patkány-GDNF 3’-nem-transzlálódó szekvenciájából, valamint 178 bázist a kódoló szekvenciából (153-211-es aminosavak). Polimeráz-láncreakcióval állítjuk elő, az LF2 oligonukleotid indító molekula (CGAGACAATGTACGACA) (szekvencia-azonosítószám: 17), és a PD2 indító molekula felhasználásával (CTCTGGAGCCAGGGTCA) (szekvencia-azonosítószám: 18) a lambda-ZapPII76.1-et használva DNS templátként. A reakciókörülmények ugyanazok, mint az 1-es próbánál.
HU 211 984 A9
A hat lambda-klónból öt azonos hibridizációs mintázatot adott. Az 1-es próba egy körülbelül 700 bázispár méretű EcoRI-fragmenshez hibridizálódott, a 2-es próba egy körülbelül 2,8 kb méretű EcoRI-fragmenshez hibridizálódott. Az a tény, hogy a két próba két különböző EcoRI-fragmenshez hibridizálódott, erősen arra utalt, hogy a humán GDNF-gén egy homológ EcoRI hasítási helyet tartalmaz. A 700 bp és az 1,8 kb méretű EcoRIfragmenseket egymástól függetlenül pBluescript SKplazmidba (Stratagene) szubklónoztuk. Ennek a két fragmensnek a nukleotid szekvenciáját a 2B. példában leírtak alapján határozzuk meg. Ezeknek a DNS-fragmenseknek a szekvenciáját a 19. ábrán mutatjuk be (szekvencia-azonosítószám: 5). A szekvenciából világos, hogy létezik egy intron a prepro-GDNF 52-es aminosava előtt. Nincs intron a génnek abban a részében, amely az érett humán GDNF-et kódolja. Az érett humán GDNF származtatott aminosav-szekvenciája 93%-ban homológ az érett patkány-GDNF-fel. Ez körülbelül ugyanolyan mértékű aminosav homológia, mint amit az egyéb neurotróf faktoroknál találtak a patkány- és humán fehérjéknél [a patkányés a humán CNTF aminosav-szekvenciája között 83%-os a homológia, McDonald és mtsai., Biochimica et Biophysica Acta, (1991), in press], A patkány- és a humán NGF aminosav-szekvenciája közötti homológia 95%-os, a BDNF-nél 100%-os, az ΝΤ-3-nál 100%-os [Hallbook és mtsai., Neuron, 6, 845-855 (1991)].
A teljes humán prepro-GDNF szekvencia izolálásához egy radioaktívan jelzett hibridizációs próbát használunk, amely a már meghatározott humán GDNF szekvenciáján alapul, ezzel a szekvenciával humán cDNS-könyvtárakat vizsgálunk át. Mivel a cDNS-ek a processzált mRNS másolatai, ezért az intronok nincsenek benne és így a teljes kódoló szekvenciát kaphatjuk meg. Egy másik eljárás szerint most hogy az intronnak a kódoló szekvenciához viszonyított helyzete ismert, egy olyan hibridizációs próbát készíthetünk a patkánycDNS-klónból, amely specifikus az intron előtti szekvenciára, és ezt a próbát használhatjuk egy genomi könyvtár átvizsgálására olyan kiónok izolálása érdekében, amelyek az 5’-exonokat tartalmazzák.
D. A humán repro-GDNF első50 aminosavát kódoló nukleotid szekvencia
Amint azt a 2C. példában részleteztük, létezik egy intron, amely a humán prepro-GDNF 51-es aminosavánál vágja el a nukleotid szekvenciát. Abból a célból hogy meghatározzuk a molekula ezen részének a szekvenciáját, egy humán genomi könyvtárat vizsgálunk át egy olyan próbával, amely a patkány-prepro-GDNF N-terminális kódoló szekvenciájából származik, és egy hibridizálódó kiónt szekvenálunk, amelyről igazoljuk, hogy tartalmazza a humán prepro-GDNF 1-50-es aminosavainak kódoló szekvenciáját, amint az a 22. ábrán látható (szekvencia-azonosítószám: 8).
A könyvtár átvizsgáláshoz PCR-próbát szintetizálunk, a 2C. példában leírtak alapján. A használt oligonukleotid indító molekulák az alábbiak:
PD1 = 5’->CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG>3’ (szekvencia-azonosítószám: 19):
LFA = 5’->CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC >3’ (szekvencia-azonosítószám 20).
A PCR-reakciók körülményei (mind a „hideg” mind a 32P jelzés) ugyanazok, mint amit a 2B. példában leírtunk, azzal a különbséggel, hogy a reakció 25 vagy 30 ciklusból állt: 95 ’C 1 percig; 50 ’C 1,5 percig és 72 ’C 1 percig. Ennek a reakciónak a terméke tartalmazza a patkány-prepro-GDNF kódoló szekvencia első 122 bázispáiját, és a feltételezett iniciátor ATG-kodontól 5’-irányban 14 bázispárt (lásd a 13. ábrát és a szekvencia-azonosítószám: 3-at). A humán genomi könyvtárnak ezzel a próbával való átvizsgálását ugyanúgy végezzük, ahogy a 2C. példában leírtuk. Az érett humán GDNF-et hordozó kiónok azonosítására használt szűrőlapokat kétszer 15 percig mossuk forrásig melegített ionmentesített vízben, majd a 2C. példában leírtak alapján mossuk. A szűrőlapokat 3 napig filmre tesszük -70 ’C-on, erősítő fóliákat használva. Előhíváskor számos dupla pozitív figyelhető meg, amelyeknek változik az intenzitásuk. Tizenkét, viszonylag erős pozitív kiónt választunk ki, és ezek közül tízet tarfolt tisztításnak vetjük alá, több egymást követő hibridizációs lépésben, a vizsgálatnál alkalmazott körülmények között.
Ezeknek a rekombináns fágoknak a klónozott DNS-eit Southern-blot hibridizálással vizsgáljuk. Egy körülbelül 1000 bp méretű Alul-fragmenst találtunk, amely hibridizál a vizsgáló próbához, ezt a Smal restrikciós enzimmel emésztett pBluescript SK-plazmidba szubklónozzuk, így kapjuk a pBSSK-lambda3AluIplazmidot. Ezt az Alul-fragmenst tovább szubklónozzuk, hogy a megfelelő DNS-fragmens további szekvenálását megkönnyítsük. A tisztított pBSSK-lambda3AluI DNS-t egy sorozat restrikciós enzimmel emésztjük, amelyek a vektorba csak egyszer hasítanak bele (a polilinker-régióban), és az emésztési termékeket agaróz-gélelektroforézissel elemezzük. Két restrikciós enzimet azonosítottunk így (PstI és SacI), amelyek egyszer vágnak bele a klónozott DNS-be. A 22. ábrán látható a PstI és SacI hasítási térképe. A Southern-blot vizsgálat kiderítette, hogy a klónozott szegmentnek az régiója, amely a vizsgáló próbával hibridizál, a klónozott Alul-szegmens SacI és PstI hasítási helye között található. Ennélfogva a szekvenáláshoz a pBSSKlambda3AluI-plazmidból két deléciós származékot készítünk. Az egyik példában egy kis, körülbelül 300 bp méretű Pstl-fragmenst vágunk ki, az alábbiak szerint: a plazmidot PstI restrikciós enzimmel emésztjük, majd ligáljuk és Escherichia coli-ba transzformáljuk. A transzformánsok között keressük azokat, amelyekből a kis Pstl-fragmens hiányzik. Ezzel párhuzamosan, a 300 bp méretű Sacl-fragmenst hasonlóképpen kivágjuk a pBSSK-lambda3AluI-pIazmidból, hogy egy második deléciós származékot állítsunk elő. Ezt a két deléciós plazmidot használjuk templátként a szekvenálási reakciókban. A szekvenálást a 2B. példában leírtak alapján végezzük.
A 22. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 8) látható az így kapott szekvencia 233 bázispárja. Ez a szekvencia egy 151 bázispár méretű régiót tartalmaz, amely magas23
HU 211 984 A9 fokú homológiát mutat a patkány-prepro-GDNF kódoló szekvencia első 151 bázispárjával; 88%-os homológia aminosav szinten és 95%-os homológia DNS szinten. Ebből azt a következtetést lehet levonni, hogy ez a régió egy olyan exon része, amely a humán prepro-GDNF 50 N-terminális csoportjának kódoló szekvenciáját hordozza, valamint az 51-es aminosav kodonjának az első nukleotidját. A közvetlenül 3’-irányban emellett a 151 bázispáros szekvencia mellett található szekvencia homológ az emlős intronok 5’-végének konszenzus szekvenciájával [Shapiro és Senapathy, Nucleic Acids Research, /5, 7155-7174 (1987)]. A feltételezett iniciátor ATG mellett közvetlenül 5’-irányban található szekvencia a patkányszekvenciával 28 bázispár hosszan erős homológiát mutat; a 28 csoportból 27 azonos. Ennél a pontnál a 3'-irányban található szekvenciák élesen eltérnek. A divergenciapont körüli szekvencia jelentős homológiát mutat az emlős intronok 3’-végének konszenzus szekvenciájával [Shapiro és Senapathy, Nucleic Acids Research, 15, 7155-7174 (1987)]. Tehát valószínűnek tűnik, hogy ez egy illesztési pont, jóllehet erre nincs közvetlen bizonyíték. A humán prepro-GDNF-et tartalmazó nyitott leolvasási keret legalább 27 bázispár hosszan túlnyúlik 5'irányban az iniciátor ATG-n. Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, lehetséges, hogy a prepro-GDNF egyéb formái is keletkezhetnek, amelyek további aminosavakat tartalmazhatnak 5’-irányban. Ezek a formák is processzálhatok úgy, hogy az az érett GDNF-molekula keletkezzen, amelyet tisztítottunk és szekvenáltunk (lásd 1. példa).
Az itt és a 2C. példában bemutatott nukleotid szekvenciák egy humán prepro-GDNF teljes kódoló szekvenciáját tartalmazzák, amely jelentős homológiát mutat a patkány-prepro-GDNF-fel, amelyet sikeresen expresszáltunk emlőssejtekben (lásd 5. példa) biológiailag aktív patkány-GDNF előállítása céljából.
3. példa: A GDNF alkalmazása a kísérletes Parkinson-kór megelőzésében
Ebben a példában azokat a eljárásokat írjuk le, amelyekkel majmokban Parkinson-kórt lehet előidézni, ha az állatoknak megfelelően adjuk be az MPTP neurotoxint (1 -metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridin). Emellett leírjuk azokat az eljárásokat is, amelyekkel az MPTP-nek kitett állatoknak GDNF-et adunk be, azzal a céllal, hogy az ilyen állatokban megelőzzük a Parkinson-kór kialakulását.
A. GDNF adagolása kísérletes Parkinson-kór kialakítása céljából MPTP-vel kezelt majmoknak: Egy rozsdamentes kanült ültethetünk be a jobboldali agykamrába, és összekötjük egy bőr alá ültetett ozmotikus minipumpával (Alzet 202). A minipumpa különböző koncentrációjú GDNF-et tartalmaz, illetve negatív kontrollként a hígítószerét. A pumpa 0,5 μΐ/óra mennyiséget adagol 14 napig. Két nappal a knülpumpa beültetése után a majmok (Cebus apella) 0,6 mg/kg-os MPTP injekciót kapnak a jobb karotid artériába. Hat héttel az indító beültetés után az állatokat sóoldattal perfundáljuk, és agyukat gyorsan eltávolítjuk. Az agyat jégen felboncoljuk, és a kaudális magból valamint a putamenből szövetdarabokat távolítunk el. A feketeállományt rögzítőbe tesszük. A kaudális-putamen szövetet HPLC-vel vizsgáljuk dopaminra, a feketeállományt a tirozin-hidroxiláz (TH) immunreaktivitás szempontjából dolgozzuk fel.
B. A GDNF hatásossága: A feketeállomány dopaminerg idegsejtjeinek és a kaudális putamenbe való axonális projekcióinak a degenerációja kísérletes Parkinsonkórt okoz ebben a majom modellben. Számos kísérleti indikáció mutat arra, hogy a GDNF megelőzheti, illetve csökkenthető ennek a neuronális degenerációnak a súlyosságát. A GDNF például megelőzheti a TH pozitív sejttestek elvesztését a feketeállományban. Ez azt mutatja, hogy a GDNF megvédi a nigrális dopaminerg idegsejteket az MPTP toxikus hatásaitól. A HDNF megelőzheti a TH pozitív szálak elvesztését a kaudátum-putamenből. Ez azt mutatja, hogy a GDNF megvédi a nigrális dopaminerg neuronok axonális projekcióit az MPTP toxikus hatásaitól. A GDNF megelőzheti a dopamintartalom elvesztését a kaudátum-putamenből. Ez arra utal, hogy a GDNF megvédi a nigrális dopaminerg neuronokból a kaudátumputamenbe kinyúló axonokat és dopamintartalmukat az MPTP káros hatásaitól.
4. példa: A GDNF biológiai aktivitása és potenciális klinikai alkalmazása
A tisztított GDNF fokozza az embrionális középagyi sejtek tenyészeteiben jelenlevő dopaminerg neuronok dopamin felvételét mind dúsított, mind kémiailag meghatározott táptalajban, amint azt az 1. példában igazoltuk. Ez azt mutatja, hogy a GDNF egy neurotróf faktora ezeknek a dopaminerg idegsejteknek. Ily módon a GDNF hasznosnak bizonyulhat ezeknek a neuronoknak a Parkinson-kórban előforduló degenerációjának kezelésében. Emellett a GDNF hasznosnak bizonyulhat egyéb agyi dopaminerg neuronok helytelen működésének kezelésében. Az ilyen helytelen működés skizofréniában és más, neuroleptikummal való kezelést igénylő rendellenességekben fordul elő.
A. A tisztított GDNF elősegíti a paraszimpatikus és szimpatikus idegsejtek túlélését tenyészetben:
1. A neurontúlélési vizsgálati eljárás:
Anyagok
A 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazóliumbromidot (MTT) a SIGMA Chemical Co.-tól (St. Louis, Missouri) vásároljuk. A borjúmagzat szérumot a Hyclone Laboratories-tól vásároljuk (Loga, Utah). A tenyésztő táptalajokat és a sóoldatokat az Irvine Scientific-től vásároljuk (Santa Analizál, Califomia). A szaporító lemezeket a Costar-tól vásároljuk (Cambridge, Massachusetts). A patogénmentes termékeny csirke embrió tojásokat a Spafas-tól vásároljuk (Roanoke Illinois).
A vizsgálati eljárás
A primer csirke embrió ciliáris ganglionok és szimpatikus lánc ganglionok tenyészetét a már leírt módszerekkel állítjuk elő [Collins, Develop. Bioi., 65, 50 (1978); Manthorpe és mtsai., Develop. Brain Rés., 25, 191 (1986)]. Röviden, a ciliáris vagy szimpatikus ganglionokat eltávolítjuk a termékeny, patogénmentes
HU 211 984 A9 csirketojásokból, amelyeket 8-10 napig inkubáltunk, 38 C-on, nedvesített atmoszférában. A ganglionokat kémiailag választjuk el, oly módon hogy először Hankféle kiegyensúlyozott sóoldattal hozzuk érintkezésbe, amely nem tartalmaz kétértékű kationokat, de tartalmaz 10 mmól/1 HEPES puffért (pH = 7,2), a kezelés 10 percig tart 37 °C-on, majd olyan oldattal hozzuk érintkezésbe, amely 0,125% baktotripszin l:250-et (Difco, Detroit, Michigan) tartalmaz az előzőkben leírt módon módosított Hank-féle kiegyensúlyozott sóoldatban; a kezelés 12 percig tart 37 °C-on. A tripszinezést úgy állítjuk le, hogy 10% végkoncentrációban borjúmagzat szérumot adunk a reakcióelegyhez.
Ezután a kezelés után a ganglionokat Dulbecco-féle magas glükóztartalmú módosított Eagle-táptalajra visszük (bikarbónát nélkül), amely 10% borjúmagzat szérumot és 10 mmól/1 HEPES-t (pH = 7,2) tartalmaz, majd mechanikusan szétválasztjuk, oly módon hogy körülbelül tízszer átbocsátjuk egy üveg Pasteur pipettán, amelynek a nyílását tűzben políroztuk, és olyan átmérőt állítottunk be rajta, hogy 2 másodpercre legyen szükség a pipetta feltöltésére.
A disszociált ganglionokat azután szaporító táptalajra szélesztjük (Dulbecco-féle módosított Eagle-táptalaj, amelyet 10% borjúmagzat szérummal, 4 mmól/1 glutaminnal, 60 mg/1 penicillin-G-vel és 25 mmól/1 HEPESsel (pH = 7,2) egészítettünk ki) 100 mm átmérőjű szövettenyésztő lemezekre (40 disszociált ganglion lemezenként), három óra hosszat. Ezt az előszélesztést azért végezzük, hogy elválasszuk a nem-neuronális sejteket, amelyek a lemezhez tapadnak, az idegsejtektől, amelyek nem tapadnak a lemezhez. Három óra elteltével a nem-tapadó idegsejteket centrifugálással kinyerjük, szaporító táptalajban szuszpendáljuk, majd 50 μΐ/luk mennyiségben 96 lukas mikrotiter szövettenyésztő lemez felére osztjuk szét, 1500 idegsejt/luk sűrűségben. A mikrotiter lukakat korábban 1 mg/ml poli-L-omitin-oldattal kezeljük 10 mmól/1 borát (pH = 8,4) oldatban, éjszakán át, majd desztillált vízzel mossuk és levegőn szárítjuk.
A neurotróf aktivitásra vizsgált minta sorozathígításából tíz μΐ-t adunk az egyes lukakhoz, majd a lemezeket 20 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk 7,5% széndioxidot tartalmazó nedvesített atmoszférában. A ciliáris ganglionoknál 18 óra, a szimpatikus ganglionoknál 40 óra elteltével lukanként 15 μΐ, 1,5 mg/ml-es MTT-tetrazólium festéket adunk hozzá Dulbecco-féle magas glükóztartalmú módosított Eagle-táptalajban (bikarbónát nélkül), amely 10% borjúmagzat szérumot és 10 mmól/1 HEPES-t (pH = 7,2) tartalmaz, majd a tenyészeteket 4 órára 37 °Cos inkubátorba tesszük. Ezután 75 μΐ HCl-oldatot adunk hozzá (6,7 ml 12 mól/1 HC1 egy liter izopropanolban oldva), és az egyes lukak tartalmát harmincszor trituráljuk, hogy feltörjük a sejteket és szuszpendáljuk a festéket. Az egyes lukaknái meghatározzuk a 570 nm-es abszorbanciát a 690 nm-es referenciához viszonyítva, automatikus mikrotiter lemezleolvasó alkalmazásával (Dynatech, Chantilly, Virginia). Azoknak a lukaknak az abszorbanciáját, amelyekbe nem tettünk neurotróf ágenst (negatív kontrollok), kivonjuk a mintát tartalmazó lukak abszorbanciájából. A kapott abszorbancia arányos az egyes lukakban levő élő sejtek számával, mint olyan idegsejteké, amelyek képesek a festéket redukálni. A neurotróf aktivitás trofikus egységeinek számát úgy határozzuk meg mint annak a hígításnak a reciprokát, amely az idegsejtek maximális túlélésének 50%-át adják. A specifikus aktivitást úgy határozzuk meg, hogy a trofikus egységek számát elosztjuk a mintában levő fehérje mennyiségével.
Eredmények
Amint az 15. ábrán látható, a tisztított GDNF elősegíti a csirke embrió ciliáris ganglionok paraszimpatikus idegsejtjeinek túlélését tenyészetben. Amint az a 16. ábrán látható, a tisztított GDNF elősegíti a csirke embrió szimpatikus ganglionjaiból származó szimpatikus idegsejtjeinek túlélését tenyészetben.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GDNF túlélési faktorként hat a szimpatikus és paraszimpatíkus neuronokra. Ily módon tehát hasznos lehet az autonóm (azaz paraszimpatikus vagy szimpatikus) idegrendszer különböző károsodásainak kezelésében. Az ilyen sérülés beállhat metabolikus kondíciók miatt, amilyen például a cukorbetegség vagy a helytelen veseműködés. Az ilyen sérülés bekövetkezhet a betegek különböző kemoterápiás ágensekkel való kezelésének következtében, amilyenek például a rák kemoterápiás ágensekkel, mint például a ciszplatin és vinkrisztin, illetve az AIDS kemoterápiás ágensekkel, mint például a ddl-vel és ddC-vel való kezelés következtében. Az ilyen sérülés genetikai állapotok következtében is beállhat, ilyen például a diszautonómia. Az ilyen sérülés traumás sérülés következtében is beállhat.
5. példa: A GDNF expressziója állati sejtekben
A. Rekombináns plazmidok készítése COS-sejtekben való expresszióhoz
ApBluescript SK-76.1 egy körülbelül 1,5 kb méretű Smal-fragmense tartalmazza a teljes GDNF kódoló szekvenciáját, ezt szubklónozzuk a pSG5-plazmid vektorban [Green és mtsai., Nucleic Acids Research, /6, 369 (1988)], amelyet arra a célra terveztek, hogy a kiónozott gének tranziens módon expresszálódjanak az SV40 T-antigént expresszáló sejtekben, amilyenek például a COS-sejtek.
A GDNF-cDNS DNS-szekvenciája (13. ábra) (szekvencia-azonosítószám: 3) és restrikciós endonukleázos térképezés egy olyan Smal-fragmenst azonosít, amelyet a vektorban levő polilinker Smal hasítási hely (a cDNS-klón 5’-végétől 5’-irányban 18 bázispár távolságban van) és egy másik Smal hasítási hely (körülbelül 1500 bázispár távolságban) határol, amely körülbelül 800 bázispár távolságban 3’-irányban az érett GDNF kódoló szekvenciájának végétől. Ezt a Smalfragmenst pSG5-ben klónozzuk, az alábbiak szerint. A tisztított pSG5-plazmid DNS-t (Stratagene) EcoRI restrikciós enzimmé emésztjük, majd borjúbél alkalikus foszfatázzal (CIAP) kezeljük (Promega), a gyártó előírásai szerint. Ezt követően a vektort elektroforézisnek vetjük alá, majd eluáljuk az agaróz gélből. A tisztított pBluescript SK-76.1-plazmid DNS-t EcoRI metilázzal metilezzük, majd Smal restrikciós enzimmel emésztjük, és a 2A. példában leírtak alapján EcoRI linker
HU 211 984 A9 molekulával ligáljuk. Az EcoRI emésztést és agaróz gélelektroforézist követően a számunkra érdekes, körülbelül 1,5 kb méretű Smal-fragmenst (amely most EcoRI metilezve van és linkerrel van ellátva) eluáljuk, és ligáljuk az EcoRI-gyel emésztett és foszfatázozott pSG5 vektorral. A ligálási termékeket használjuk kompetens Escherichia coli XLl-Blue transzformálására, a CaCl2 eljárás alkalmazásával [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Az ampicillin rezisztens transzformánsokat szelektáljuk, és restrikciós endonukleázos emésztéssel majd agaróz gélelektroforézissel vizsgáljuk bennük a rekombináns plazmidokat. Az EcoRI enzimmel való emésztés azt mutatja, hogy a legtöbb transzformáns hordozza a számunkra érdekes inszertet tartalmazó plazmidot. A BamHI restrikciós enzimmel végzett emésztéssel meg lehet határozni a klónozott GDNF-nek a vektorban levő SV40 promoterhez viszonyított orientációját (lásd a BamHI helyet a 15-ös pozícióban a 13. ábrán látható szekvenciában). Mindkét orientációt megkaptuk.
Két transzformánst választunk a további elemzéshez; az egyik tartalmazza a pSG5::rGDNF-7 jelű plazmidot, amely a GDNF-gént a helyes orientációban tartalmazza ahhoz, hogy az SV40 promoterről RNS transzkriptumok expresszálódjanak, míg a másik egy olyan plazmidot tartalmaz, amelynek jele pSG5::rGDNF-4, és a GDNF-gént az ellentétes orientációban tartalmazza; ebben az SV40 promoterről iniciálódó RNS transzkriptumokról nem keletkezik GDNF. Mindkét ilyen plazmidnak a tisztított preparátumát CsCl sűrűséggradiens centrifugálással tisztítjuk a COS-sejtekben való expresszió céljából.
B A GDNF expressziója COS-7-sejtekben
Az ezekből a konstrukciókból származó plazmidDNS-t alkalikus lízis módszerével állítjuk elő, majd CsCl sűrűséggradiens centrifugálással tisztítjuk [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)]. Ezt a DNS-t transzfektáljuk COS-7-sejtekbe Sompyrac és Dánná módszerével [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 8, 7575-7578 (1981)]. Kontrollként ekvivalens COS-sejt tenyészeteket transzfektálunk a GDNF inszertet az ellentétes orientációban tartalmazó plazmidvektor-DNS-sel, ami nem teszi lehetővé a GDNF-fehéije expresszióját. 100 mm-es tenyésztő lemezenként 30 pg lipofektint és 0,3-1 pg plazmid-DNS-t használunk. 24 órás transzfekció után a táptalajt leszívjuk, és OptiMEM I 1/2 3% FCS-sel helyettesítjük. A tenyészeteket 48 óra hosszat inkubáljuk, majd az alábbiak szerint nyerjük ki;
a) a táptalajt (a kondicionált táptalajt vagy CM-et) leszívjuk és -80 ’C-on tároljuk:
b) a sejtréteghez 5 ml PBS + 2,5 mmól/1 EDTA összetételű oldatot adunk, majd 3 percig 25 ’C-on tartjuk; azután a sejteket pipettával leszívjuk a lemezről és 5 percig 1000 x g-vel centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk és a sejtüledéket -80 ’C-on tároljuk.
A CM-et Centricon 10 koncentrátorokban koncentráljuk, és vizsgáljuk a biológiai aktivitását. A sejtüledékeket ultrahangos besugárzással feltárjuk 500 pl 10 mmól/1 EDTA pH = 7,0, plusz 1 mmól/1 benzamidin, 100pmól/l PMSF, 1 mmól/1 E-amino-N-kapronsav összetételű pufferben. A sejtlizátumokat 14 000 x g-vel 5 percig centrifugáljuk, majd vizsgáljuk a felülúszók biológiai aktivitását.
C. Az expresszált GDNF biológiai vizsgálata
A GDNF-et expresszáló és kontroll plazmidokkal (ezek a GDNF kódoló szekvenciát a helytelen orientációban tartalmazzák) transzfektált COS-sejtekből származó sejtlizátumok és tenyészlevekben vizsgáljuk mind a dopamin felvétel fokozásának képességét a középagyi neuronokbán (lásd 1. példa) és azt a képességét, hogy fokozza a szimpatikus ganglion neuronok túlélését (lásd 4. példa). A COS-sejt tenyésztő táptalaj (17. ábra) és a sejtlizátum (nem közölt adatok) fokozza a dopamin felvételt, amint az a GDNF-től várható. Amint az a 18. ábrán látható, a COS-sejt tenyészetének közege és sejtlizátuma fokozza a szimpatikus láncneuronok túlélését, amint az a GDNF-től várható.
Ezek az eredmények világosan mutatják, hogy a GDNF-gén expressziója egy állati sejtben egy olyan fehérje expresszióját eredményezi, amelynek a biológiai aktivitása ugyanaz, mint a tisztított GDNF-é.
6. példa: A humán GDNF expressziója Escherichia coli-ban
A Humán GDNF-et kódoló plazmid készítése
A humán GDNF szekvencia információ felhasználásával (2C. példa) szintetikus oligonukleotidokat készítünk (PD3 és PD4) indító molekulaként a humán GDNF-gén amplifikálásához, és egy plazmidról való expresszióhoz Escherichia coli-ban. A PD3 (szekvencia-azonosítószám: 21) és PD4 (szekvencia-azonosítószám: 22) oligonukleotidok szekvenciái a következők: PD3:
’ >CGCGG ATCC AATCGG AGG AA AAAAA ATG TC ACC AG ATA AAC AA AT>3 ’
PD4:
’ >CGCGGTACCC AGTCTCTGG AGCCCGG A>3 ’.
A PD3 oligonukleotid 46 nukleotid hosszúságú. A 3’-végen levő 17 nukleotid tökéletesen megegyezik a humán GDNF-génnel, abban a régióban, amelyik az érett fehérje N-terminálisát kódolja. Ezt a 17 nukleotidot egy transzlációs iniciációs kodon (ATG) előzi meg, úgyhogy az érett humán GDNF a megfelelő aminosavval kezdődjön Escherichia coli-ban. A többi nukleotidot úgy tervezzük meg, hogy az Escherichia coli-ban a jó expresszióhoz szükséges egyéb szignálokat szolgáltassák valamint egy BamHI endonukleáz restrikciós hasítási helyet, amely ahhoz kell, hogy egy GDNF expressziós plazmidot készítsünk.
A PD4 oligonukleotid 26 nukleotid hosszúságú. A 3’-végen található 17 nukleotid tökéletesen illeszkedik a humán GDNF 3’-végén levő 17 nukleotiddal, a stopkodontól számítva 3’-irányban.
Ez az oligonukleotid emellett olyan szekvenciákat is szolgáltat, amelyek ahhoz szükségesek, hogy egy
HU 211 984 A9
KpnI restrikciós hasítási hely jöjjön létre egy GDNF expressziós plazmid készítésénél.
A humán GDNF amplifikálásánál használatos reakciókörülmények az alábbiak: a reakciótérfogat összesen 100 μΐ, és 1 ng olyan lambda-klónt tartalmaz, amelyben benne van a humán GDNF-gén, 20-20 pmól a PD3 és PD4 oligonukleotidokból, 20 mmól/1 TRISHC1 pH = 8,8, 10 mmól/1 KC1, 6 mmól/1 ammóniumszulfát, 1,5 mmól/1 MgCl2, és 0,1% Triton X-100 öszszetételű oldatban. A reakcióelegyet 5 percre 95 ”C-ra melegítjük, 44 ’C-ra hűtjük, majd 2 egység Pfu DNS polimerázt (Stratagene) adunk hozzá). A reakció 30 ciklusból áll: 72 ’C 1,5 percig, 95 ’C 1 percig, és 44 ’C 1,5 percig. A reakció végén MgCl2-t adunk hozzá 10 mmól/1 végkoncentrációban. 5 egység DNS polimeráz-I nagy (Klenow-) fragmenst (Promega) adunk hozzá, és a reakcióelegyet 10 percig 37 ’C-on inkubáljuk. Ezután 10 μΐ 3 mól/1 nátriumacetátot és 220 μΐ etanolt adunk hozzá, majd az oldatot 15 percig 12 000 x g-vel centrifugáljuk a DNS kicsapása céljából. A kicsapott DNS-t 100 μΐ 50 mmól/1 TRIS-HC1 pH = 8, 50 mmól/1 NaCl, 10 mmól/1 MgCl2, 20 egység BamHI és 20 egység KpNi összetételű oldatban szuszpendáljuk, majd 1 óra hosszat 37 ’C-on inkubáljuk. Agaróz gélen végzett elektroforézis után egy megfelelő méretű DNS-frag10 menst azonosítottunk és tisztítottunk egy UltrafreeMC Filter Unit-tal (Millipore). Ezt a fragmenst egy Escherichia coli expressziós vektorba (pT3XI-2) Egáljuk (az alábbiakban ismertetjük): A ligálási körülmények az alábbiak: a reakcióelegy össztérfogata 5 μΐ, és tartalmaz 10 ng pT3XI-2 DNS-t, amelyet KpnI és BamHI restrikciós enzimmel linearizáltunk, 5 ng az előzőkben ismertetett humán GDNF DNS-fragmenst, 50 mmól/1 TRIS-HC1 pH = 7,6, 10 mmól/1 MgCl2, 1 mmól/I ATP, 1 mmól/1 DTT, 5% polietilén-glikol-800 és 1 egység T4 DNS ligáz (Bethesda Research Laboratories) összetételű oldatban. A reakciót 2 óra hosszat 14 ’C-on inkubáljuk.
ApT3XI-2 vektort az alábbiak szerint állítjuk elő. Ehhez a konstrukcióhoz a kiindulási plazmidot, a pKK223-3-at (Brosius és Holy,1984) a Pharmacia-tól vásároljuk. A pKK223-3-plazmid egy részleges tetraciklin rezisztencia gént tartalmaz. Ezt a nem működő gént helyettesítjük egy, a pBR322-plazmidban levő komplett tetraciklin rezisztencia génnel. A pKK2233-plazmidot teljesen megemésztjük Sphl enzimmel és részlegesen emésztjük BamHI enzimmel. Egy 4,4 kb méretű fragmenst gélen tisztítunk, majd egy szintetikus adapterrel kombináljuk (szekvencia-azonosítószám: 23):
5' GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3' 3' ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5'
BglII Clal valamint egy 539 bázispár méretű DNS-fragmenssel, amely a pBR322-plazmid (PL Biochemicals, 27-489ΙΟΙ ) tetraciklin rezisztencia génjének Clal, Sphl emésztményét tartalmazza. A keletkezett plazmid jele pCJl.
Ezután egy New England Biolabs-tól vásárolt Xhol linkért építünk be a pCJl Pvull hasítási helyére, így hozzuk létre a pCJX-I-plazmidot. Ez az inszerció elrontja a rop gént, amely a plazmid kópiaszámát szabályozza. Ez35 után egy EcoRI-fragmenst amely a lacl gént tartalmazza, tisztítunk a pMC9-plazmidból [Calos és mtsai. (1983)], majd Xhol restrikciós enzimmel beépítjük az EcoRI adapterek Xhol hasítási helyére. A pKK223-3-plazmid polilinker régióját azután egy olyan polilinkerrel helyettesítjük, amely további hasítási helyeket tartalmaz, EcoRI és PstI enzimekkel végzett hasítás után (szekvencia-azonosítószám: 24):
5' AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3'3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5 ' .
Az így kapott plazmidvektor jele pCJX-1.
Végezetül, a tetraciklin rezisztencia gént egy hasonló génnel helyettesítjük amelyben felismerési helyek voltak találhatók a HindlII, BamHI és Sáli enzimek számára, de biszulfit mutagenezissel elroncsoltuk. Az alábbi eljárást használjuk a pBR322 tetraciklin rezisztencia génjének mutáltatására. A pBR322plazmidot HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, majd nátrium-biszulfittal mutagenizáljuk (Shortle és Botstein, 1983). A mutagenizált DNS-t Egáljuk, így kapunk egy cirkuláris DNS-t, majd HindlII-mal emésztjük, hogy minden olyan plazmidot linearizáljunk, amely elkerülte a mutagenezist. Escherichia coli JM109 (Yanisch-Perron és mtsai., 1985). Tetraciklin rezisztens plazmidokat izolálunk, és ellenőrizzük, hogy elveszett-e a HindlII hasítási hely a tetraciklin rezisztencia génből. A sikeresen mutagenizált plazmid jele pTl. Hasonló eljárással mutagenizáljuk a BamHI hasítási helyei a pTl-plazmidban, így kapjuk a pT2-plazmidot. A pT2-plazmidot azután mutagenizáljuk a Sáli hasítási hely eltávolítása céljából, így kapjuk a pT3-plazmidot. A pT3-plazmidnak egy Clal-Styl-fragmensét, amely a mutált tetraciklin rezisztencia gént hordozza, izoláljuk, és arra használjuk, hogy a pCJX-1 homológ fragmensét kicseréljük, így kapjuk a pT3Xl-2-plazmidot. A mutált tetraciklin rezisztencia gén még egy működőképes fehérjét kódol. A tac-promoter régió mögé egy polilinkert építünk be, amely egyéb helyek mellett BamHI és KpnI restrikciós hasítási helyeket is tartalmaz, amelyeket arra lehet használni, hogy a géneket Escherichia coliban való expresszió céljából klónozzuk.
A vektort két óra hosszat Egáljuk az érett humán GDNF konstrukcióval, majd 2 μΐ reakcióelegyet használunk az Eicurean Coli SURE szuperkompetens Escherichia coli transzformálására (Stratagene), a gyártó
HU 211 984 A9 előírásai szerint. Az egyik rekombináns plazmid DNSszekvenciáját meghatározzuk a 2B. példában leírtak alapján. A szekvencia megerősítette, hogy ez a plazmid tartalmazza teljes érett humán GDNF-et kódoló szekvenciát.
B. A humán GDNF expressziója Escherichia coli-ban
A humán GDNF-et kódoló DNS-szekvenciát hordozó plazmidot Escherichia coli JM107-fi-rMCB0005 törzsbe, a JM107 egy TI rezisztens variánsába [Yanisch-Perron és mtsai. (1985)] transzformáljuk, a Sambrook és munkatársai által leírt (Maniatis és mtsai., MolecularCloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] CaCl2 eljárás alkalmazásával. Az egyik rekombinánst 50 ml LB-táptalajon [Maniatis és mtsai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)] növesztjük lOOgg/ml ampicillin (Sigma) jelenlétében, éjszakán át 37 ’C-on rázatva. A következő napon a tenyészetet 1:70 arányban hígítjuk LB-táptalajban, amely 100pg/ml ampicillint tartalmaz, és 5 óra hosszat 37 ’C-on rázatjuk. A sejtekből 20 ml-t centrifugálással kinyerünk (centrifugálás 8000 x g-vel tíz percig). Az üledéket 4 ml 10 mmól/1 EDTA-ban (pH = 7,4) szuszpendáljuk. A sejteket French Press-sel tárjuk fel (salmonella Instruments) 124 105 hektopaszkál nyomáson. A lizátumot 12 000 x g-vel centrifugáljuk 15 percig 4 ’C-on. Az üledéket 10 mmól/1 EDTA-ban szuszpendáljuk. Kiderült, hogy viszonylag több GDNF akkumulálódik, ha hagyjuk, hogy a fermentáció 37 ’C vagy 30 ’C helyett 42 ’C-on játszódjon le.
A jelenleg legelőnyösebbnek tartott eljárás magas szintű GDNF expresszióra Escherichia coli-ban, a 6A. példában ismertetett rekombináns plazmid alkalmazásával (amelyben az érett humán GDNF-et kódoló szekvenciát a pT3XI-2 vektorba klónoztuk) az alábbiak szerint. Egy tízliteres fermentációhoz egy 500 ml-es inokulumot növesztünk LB táptalajban (pH = 7), amely I5pg/ml tetraciklint tartalmaz, 37 C-on, egy kétliteres, torlóval ellátott rázott lombikban 2-3 közötti A600 optikai sűrűségig. Ezt a tenyészetet használjuk 10 liter szaporító táptalaj oltására amelynek összetétele: 12 g/1 tripton, 24 g/1 élesztőkivonat, 25 g/1 glicerin, 1,3 g/I K2HPO4, 0,4 g/1 KH2PO4, 0,1 ml 4:1 arányú keverék Macol 19:GE60-ból, valamint 15 mg/1 tetraciklin-HCl. Ezt a tenyészetet szaporítjuk körülbelül 12-18 óra hosszat 42 ’C-on körülbelül 12-20-as optikai sűrűségig (A^). A fermentáció pH-ját 7,0-n tartjuk, és az oldott oxigént 30%-os telítésen tartjuk. A fermentáció után a tenyészetet 4 ’C-ra hűtjük, majd a sejteket centrifugálással kinyerjük.
A humán GDNF termelése az előzőkben ismertetett plazmidról nem specifikus erre az Escherichia coli törzsre, hanem előállítható bármely alkalmas törzsben is. A plazmidot két másik Escherichia coli törzsbe is transzformáltuk, az Escherichia coli JM 108-ba (Yanisch-Perron és mtsai., 1985), valamint a SURE törzsbe (Stratagene). Mindkét említett törzsben egy új, megfelelő molekulasúlyú fehérjecsík lehető láthatóvá Coomassie Blue festéssel, poliakrilamid-gélen végzett elektroforézis után.
A szuszpendált anyag egy alikvot részét poliakrilamid-gélen elektroforetizáljuk. A gélt Coomassie Blue-val festjük. A várt, GDNF-nek megfelelő molekulasúlyú fehérje (15 000 dalton) csak azokban a tenyészetekben található meg, amelyek a humán rekombináns GDNF-plazmidot tartalmazzák, azokban nem, amelyek csak a pT3XI-2 vektort tartalmazzák. A kinyert fehérjét standard N-terminális szekvenálási eljárásnak vetjük alá, és ennek a fehérjének az első 22 aminosava azonos a 19. ábrán bemutatott humán GDNF aminosav-szekvenciájával, megerősítve ezzel, hogy a humán GDNF helyesen expresszálódik Escherichia coli-ban.
C. Λ baktériumok által termelt rekombináns humán GDNF helyes térbeli szerkezetének kialakítása és biológiai aktivitása
Az anyagok előkészítése a helyes térszerkezet kialakításához: Acl Escherichia coli JM107 transzformánst (pT3X12::huGDNF) stacioner fázisig növesztjük 37 ’C-on élesztőkivonat (#0127-01 Difco Laboratories, Detroit, MI) és tripton (#0123-05 Difco Laboratories, Detroit, MI) alapú komplex táptalajban növesztjük (24 g/1 élesztőkivonat, 12 g/1 tripton, 5 g/1 glicerin, 1,3 g/1 K2JPO4, 0,4 g/1 KH2PO4, 0,1 ml/1 Macol 19/GE60 (4:1), 15 mg/1 tetraciklin) IPTG indukció nélkül. A sejteket 16 000 x g-vel centrifugáljuk JA10 rotorban 4 ’C-on 20 percig, majd a sejtpasztát -20 ’Con tároljuk.
A sejteket az alábbiak szerint dolgozzuk fel: 5 g sejtpasztát homogenizálunk 40 ml 10 mmól/I EDTAval (pH = 7,0) jégen, OCI Instruments homogenizátor felhasználásával. A kapott szuszpenziót French-pressszel háromszor feltárjuk 137 895 hektopaszkál nyomással, majd 30 000 x g-vel centrifugáljuk JA20 rotorban 1 percig 4 ’C-on. A felülúszót elöntjük, majd az üledéket homogenizáljuk, és az előzőkben leírt módon centrifugáljuk. Az egyik megvalósítási mód szerint a reextrakcióból származó üledéket 40 ml 25 mmól/1 TRIS-HCI pH = 7,4 pufferrel centrifugáljuk az előzőkben leírt módon, majd a felülúszót elöntjük. Az üledéket 20 ml 50 mmól/1 TRIS-HCI pH = 8,0 pufferrel homogenizáljuk, amely 8 mól/1 karbamidot tartalmaz 30 mmól/1 β-merkaptoetanolt hozzáadva, illetve anélkül, majd az előzőkben leírt módon centrifugáljuk és a felülúszót megtartjuk. Ezt a felülúszót nevezzük TU extraktnak. Az előnyös megvalósítási mód szerint az üledéket homogenizáljuk 40 ml 10 mmól/1 TRIS-HCI pH = 8,0 pufferben, amely 1 mmól/1 EDTA-l, 1 % NP40et tartalmaz, a előzőkben leírt módon centrifugáljuk, és felülúszót elöntjük. Az üledéket szulfonilezéssel viszszük oldatba az alábbiak szerint: Az üledéket 25 ml 20 mmól/1 nátrium-foszfát pH=7,4 pufferben homogenizáljuk, amely 8 mól/1 karbamidot, 100 mmól/1 nátrium-szulfitot és 10 mmól/1 nátriumtetrationátot tartalmaz. A szulfonilezést 4 ’C-on hagyjuk lejátszódni éjszakán át kevertetve, majd centrifugáljuk, 16 000 x g-vel 10 percig 4 ’C-on, az oldat tisztítása céljából.
HU 211 984 A9
A TU kivonat részleges tisztítása a természetes térszerkezet kialakítása előtt: A TU kivonatot részlegesen tisztítjuk ioncserélő kromatográfiával S-Sepharose Fást Flow gyantán (Pharmacia). Az oszlopot egyensúlyba hozzuk, majd szobahőmérsékleten futtatjuk 25 mmól/1 TRIS-HC1 pH = 7,4 pufferben, amely 8 mól/1 karbamidot és 30 mmól/1 β-merkaptoetanolt tartalmaz (A puffer). A minta felvitele és A pufferrel az alapvonal optikai sűrűségének eléréséig folytatott mosása után az oszlopot 10% oszloptérfogat/perc sebességgel mossuk 5 oszloptérfogattal, a mosófolyadék összetétele A puffer és 100 mmól/I TRIS-HC1 pH = 9,0, amely 8 mól/1 karbamidot, 500 mmól/1 NaCl-t és 30 mmól/1 β-merkaptoetanolt tartalmaz (B puffer). Az oszlopfrakciókat 280 nm-en figyeljük, és SDS-PAGE-eljárással vizsgáljuk. A GDNF fő fehérjecsúcsként eluálódott a gradiens 60-70%-ánál. A GDNF-ben gazdag frakciókat egyesítjük a természetes térszerkezet kialakításához (25. ábra).
A szulfonilezett kivonat részleges tisztítása a természetes térszerkezet kialakítása előtt: A szulfonilezett kivonatot ioncserélő kromatográfiával részlegesen tisztítjuk Q-Sepharose Fást Flow gyantán (Pharmacia). Az oszlopot egyensúlyba hozzuk majd 4 ’C-on 10 mmól/I TRIS-HC1 pH = 8,0 pufferrel futtatjuk, amely 4 mól/1 karbamidot tartalmaz (A puffer). A minta felvitele és az A pufferrel alapvonal optikai sűrűségig való mosása után, az oszlopot percenként 5 százalék oszloptérfogat/perc sebességgel eluáljuk összesen 5-5 oszloptérfogatnyi A pufferrel, valamint TRIS-HC1 pH = 8,0 pufferrel, amely 4 mól/1 karbamidot és 500 mmól/1 NaCl-t tartalmaz (B puffer). Az oszlopfrakciókat 280 nm-en követjük és SDS-PAGE-eljárással elemezzük. A GDNF fő fehérje csúcsként a gradiens 50%-nál eluálódik. A GDNF-ben gazdag fiakciókat egyesítjük a természetes térszerkezet kialakítása céljából.
A részlegesen tisztított TU kivonat természetes térszerkezetének kialakítása: A GDNF-nek, amelyet az előzőkben leírt módon részlegesen tisztítottunk, az alábbiak szerint alakítjuk ki a természetes térszerkezetét: 4 ml egyesített oszlop-eluátumhoz amely körülbelül 1 mg/ml koncentrációban tartalmazza a GDNF-t, 5 mmól/1 ditiotreitolt adunk. A csövet lezárjuk, hogy kizárjuk a levegőt, majd 15 percig 25 ’C-on tartjuk. Ezután oxidált dinátrium-glutation sót adunk hozzá 15 mmól/1 koncentrációban, a csövet ismét lezárjuk, hogy a levegőt kizárjuk, majd 15 percig 25 ’C-on tartjuk. Ezt az oldatot azután 14 térfogat térszerkezet kialakító pufferben hígítjuk (100 mmól/1 Na2HPO4; 10 mmől/1 etanolamin pH = 8,3, amely 4 mól/I karbamidot tartalmaz; 5% polietilén-glikol 300; és 2 mmól/1 cisztein), majd 3 napig argon alatt tartjuk 5 ’C-on.
A részlegesen tisztított szulfonilezett kivonat természetes térszerkezetének kialakítása
Az előzőkben leírt módon részlegesen tisztított GDNF természetes térszerkezetét az alábbiak szerint alakítjuk ki: Az egyesített körülbelül 3 mg/ml koncentrációban GDNF-et tartalmazó oszlop-eluátumokat 19 térfogat térszerkezet kialakító pufferrel hígítjuk (100 mmól/I Na2HPO4; 10 mmól/1 etanolamin pH = 8,3, amely 4 mól/1 karbamidot tartalmaz; 5% polietilén-glikol 300; és 2 mmól/1 cisztein), majd 3 napig argon alatt tartjuk 5 ’C-on.
A természetes térszerkezetűvé visszaalakított GDNF elemzése SDS-PAGE-eljárással: A baktériumokból extrahált GDNF, ha előzőleg nem hozzuk érintkezésbe redukáló ágenssel, akkor monomerként vándorol SDSPAGE-eljárás során, látszólagos molekulasúly körülbelül 16 kD, a molekulasúly standard fehérjék vándorlásához viszonyítva. Nincs kimutatható GDNF a dimer pozíciójában. Ha a GDNF-et redukáló ágens hatásának tesszük ki (30-150 mmól/1 β-merkaptoetanol), akár az extrakció során, akár éppen az SDS-PAGE-eljárás előtt, de még a természetes térszerkezet kialakítása előtt, akkor egy olyan pozícióba vándorol, amely megkülönböztethetetlen a nem-redukált fehérjétől, látszólagos molekulasúlya körülbelül 16 kD (26. ábra, 6-os és 13-as sáv). Ez azt mutatja, hogy a baktériumsejtekből preparált GDNF nem dimerizálódik a természetes térszerkezet kialakítása előtt.
A természetes térszerkezetnek az előzőkben leírt módon való kialakítása után, a baktérium által termelt GDNF legnagyobb része a nem-redukáló SDS-PAGEeljárás során látszólagos dimerként vándorol, molekulasúlya körülbelül 30 kD (26. ábra, 2-es sáv). Ha a természetes térszerkezetű GDNF-et az SDS-PAGE-eljárás előtt 150 mmól/1 β-merkaptoetanollal redukáljuk, akkor ismét a körülbelül 16 kD méretű monomer pozíciójába vándorol (23. ábra, 5-ös sáv). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a GDNF természetes térszerkezetének kialakítása azt eredményezi, hogy a fehérje egy diszulfidhíddal összekötött dimer lesz. Természetes térszerkezetű GDNF-et redukció nélkül SDS-PAGE-eljárásnak vetjük alá, majd a gélt a minta futásának hosszában kivágjuk, a kivágott csíkot felszeleteljük, és vizsgáljuk, hogy van-e biológiai aktivitásuk a szimpatikus ganglion neuron túlélési vizsgálatban (lásd alább). Az egyetlen kimutatható aktivitás a dimer pozíciójában volt található, jelezve ezzel, hogy a dimer biológiailag aktív.
A természetes térszerkezetűvé alakított GDNF elemzése fordított fázisú HPLC-vel: Az S-Sepharose vagy Q-Sepharose kromatográfiával részlegesen tisztított, de természetes térszerkezetűvé még nem alakított GDNF a fordított fázisú HPLC során amint azt az alábbiakban bemutatjuk, körülbelül 21 perces retenciós idővel vándorol. A természetes térszerkezet kialakítása után a GDNF azonos körülmények között körülbelül 15 perces retenciós idővel vándorol. A retenciós idő eltolódása várható a GDNF térszerkezetének sikeres kialakításától. A fordított fázisú HPLC vizsgálatoknál a természetes térszerkezet sikeres kialakítása után gyakran látható, hogy a retenciós idő eltolódik.
Ezeknek a mintáknak a fordított fázisú HPLC vizsgálatát az alábbiak szerint végezzük: 1 ml/perc áramlási sebesség mellett: Egy 0,46x25 cm-es C-4 oszlopot (Vydac #214TP54) fejlesztünk ki az alábbiak szerint: A-oldat = 0,1%-os trifluorecetsav (TFA) vízben; B-oldat = 0,1% TFA acetonitrilben; 0,5-1,5 perc között a B-oldat mennyiségét 5%-ról 25%-ra növeljük; 1,5-31,5 perc között a B-oldat mennyiségét 25%-ról 55%-ra növeljük.
A természetes térszerkezetűvé alakított GDNF elemzése biológiai vizsgálatokkal: A természetes térszerkeze29
HU 211 984 A9 tűvé alakított GDNF biológiai vizsgálatát mind csirkeembrió (E10) szimpatikus ganglion neuron túlélési vizsgálatban (4A. példa), mint a patkányembrió (Elő) középagyi tenyészet dopamin felvétel biológiai vizsgálatában (1B. példa) vizsgáljuk. A természetes térszerkezet kialakítása előtt ha a GDNF-et 30 mmól/1 β-merkaptoetanol hatásának tesszük ki, és S-Sepharose vagy Q-Sepharose kromatográfiával tisztítjuk az előzőkben leírt módon, akkor nem mutat kimutatható biológiai aktivitást a középagyi tenyészet dopamin felvételének vizsgálata során, és nagyon lecsökkent aktivitást mutat a szimpatikus neuron túlélési vizsgálatban. Az S-Sepharose-zal kromatografált anyag látszólagos ED50-értéke a szimpatikus neuron túlélési vizsgálatban körülbelül 1 pg/ml, ami körülbelül 333-szor alacsonyabb mint a természetes térszerkezetűvé alakított rhGDNF-é (lásd a továbbiakban). A Q-Sepharose-zal kromatografált anyag esetében a látszólagos ED50-érték a szimpatikus neuron túlélési vizsgálatban körülbelül 3 pg/ml, ami körülbelül 100-szor alacsonyabb, mint a természetes térszerkezetűvé alakított rhGDNF-é (lásd az alábbiakban). A természetes térszerkezet kialakítása után, β-merkaptoetanollal érintkezésbe hozva, vagy anélkül, mindkét biológiai vizsgálatban teljesen aktív (27-28. ábra). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy A GDNF-nek jelentős biológiai aktivitása lesz a természetes térszerkezet kialakításától, és azt is mutatják, hogy a természetes térszerkezet kialakítása előtti csökkent, vagy hiányzó biológiai aktivitás nem a β-merkaptoetanollal való érintkezés következménye.
A természetes térszerkezetűvé alakított rekombináns humán GDNF (rhGDNF) ED50-értéke ezekben a biológiai vizsgálatokban hasonló a B49-sejt kondicionált táptalajból izolált patkány-GDNF-nél korábban megfigyelt ED50-értékhez. A szimpatikus neuron túlélési vizsgálatban az rhGDNF ED50-értéke körülbelül 3 ng/ml (27. ábra), a patkány-GDNF ED50-értéke pedig körülbelül 5 ng/ml volt. A középagyi tenyészet dopamin felvételi vizsgálatában az rhGDNF ED50-értéke körülbelül 30 pg/ml (28. ábra), a patkány-GDNF-é pedig körülbelül 50 pg/ml. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az rhGDNF-nek egy jelentős része sikeresen felvette a természetes térszerkezetet, és biológiailag teljesen aktív lett.
7. példa: GDNF-elleni antitestek termelése és izolálása
Az rhGDNF-elleni antitesteket az alábbi eljárás szerint állítjuk elő. Az eljárásban hivatkozunk adjuvánsra, immunizációs protokollra és állatfajra, de nem korlátozzuk magunkat ezekre. Emellett a GDNF-elleni antitesteket előállíthatjuk a természetes térszerkezetbe vitt, natív GDNF-fel, vagy a denaturált, inaktív fehérjével amint azt az alábbi eljárásban ismertetjük, illetve a humán vagy állati eredetű GDNF folytonos peptid szakaszaival.
A monoklonális antitesteket a számos standard protokoll egyike szerint állíthatjuk elő [lásd Antibodies, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory (1988); ISBN 087969-314-1, szerk. Harlow és Dávid Lane], Röviden, egy ilyen, monoklonális antitestek előállítását célzó eljárás általában, de nem kizárólagosan magában foglalja a megfelelő állat immunizálását és ezekben az állatokban az immunizáló protokoll hatására létrejövő immunválasz követését, az antitestet termelő sejtek immunizálását, amilyenek például a nyirokszervek egy vagy több reagáló állatban, ezeknek a sejteknek a fuzionáltatásátegy megfelelő sejtvonallal, például mielómasejtekkel, hibridómák előállítása céljából, amelyek antitesteket szekretáló örökéletű sejtek, és hibridómák progresszív izolálását, ameddig egysejtes kiónokat kapunk, amelyek a keresett monoklonális antitesteket termelik.
A nyulakban poliklonális antitesteket az alábbiak szerint állítunk elő: Két ml steril sóoldatot, amely 0,005-0,25 mg rhGDNF-et tartalmaz, a RIBI adjuváns MPL-TDM-CWS emulzió (RIBI ImmunoChem Research, Inc.) egy tartóedényébe injektáljuk, majd vortexeljük, ameddig emulzió jön létre (az előállító előírásai szerint). Érzéstelenített New Zealand nőstény fehér nyulakat injekciózunk a RIBI által javasolt immunizációs protokollt követve. Egy ml adjuváns antigén emulziót az alábbiak szerint adunk be;
0,30 ml intradermális (0,05 ml hat különböző helyre)
0,40 ml intramuszkuláris (0,20 ml a két hátsó lábba)
0,10 ml szubkután (nyaki régió)
0,20 ml intraperitonálisan
Az állatokat minden 4-6. héten ugyanezzel a protokollal injekciózzuk, a folyamat fenntartása céljából. Az állatokból vért veszünk az első injekció előtt, és 10-14 nappal az egyes emlékeztető injekciók után, hogy vizsgáljuk az antitest termelődését, pl. neutralizációs vizsgálattal vagy egy standard ELISA-val.
A neutralizációs vizsgálatot az alábbiak szerint hajtjuk végre, az El6 középagyi tenyészet felhasználásával. A nyúl tesztszérumot Dulbecco-féle minimális eszenciális táptalajban hígítjuk, amely 25 mmól/1 HEPES-sel (pH = 7,4) van pufferelve, és 5 mg/ml szarvasmarha szérumalbumint tartalmaz (a továbbiakban BSA5 néven hivatkozunk rá). Ezután a vizsgálati lukakhoz adjuk (25 μΐ hígított tesztszérum 500 μΐ szövettenyésztő oldatához, majd 30 percig 37 ”C-on inkubáljuk. Ezután 25 μΐ rhGDNF-et adunk hozzá rhGDNF-et tartalmazó 6,32 ng/ml koncentrációjú BSA5 hígított törzsoldatban, 0,316 ng/ml végkoncentrációban. A dopamin felvételt nyolc nap elteltével mérjük tenyészetben, az előzőkben leírt módon. A második emlékeztető injekció után kapott antiszérummmal kapott eredményeket az alábbiakban mutatjuk be a neutralizációs vizsgálat során (lásd az alábbi 2. táblázatot).
2. táblázat
Nyúl sorsz. Antigén *Neut. EC50 +ELISA EC50
1604 természetes konf. rhGDNF 20x10* 25x103
2257 természetes konf. rhGDNF 12x10* 7xl03
2506 természetes konf. rhGDNF 2xlO3 3x103
9380 denaturált rhGDNF 2xl03 2xl03
* a GDNF által serkentett dopamin felvétel 50%-os semlegesítéséhez tartozó antiszérum hígítás + az ELlSA-ban mért maximum (plató) jel 50%-ához tartozó antiszérum hígítás
HU 211 984 A9
Az antiszérumok GDNF-antitest titerét egy standard ELISA-ban is meghatároztuk az alábbi eljárás alkalmazásával: Mikrotiter lemezeket (96 lukas, Nunc maxisorp) borítunk lukanként 100 μΐ rhGDNFfel 1,0 pg/ml 50 mmól/1 nátrium-bikarbonát (pH = 5
9,6) pufferben, éjszakán át 4 °C-on. A lemezeket négyszer mossuk lemezmosó pufferrel (PWB foszfáttal puffereit sóoldat H = 7,2, 0,5% Tween 20-at tartalmaz), majd 2 óra hosszat blokkoljuk 25 °C-on 200 μΐ per luk 2%-os szarvasmarha szérumalbuminnal, fősz- 10 fáttal puffereit fiziológiai sóoldatban (pH=7,2). A lemezeket ismét mossuk PWB-vel, majd a szérummintákat, amelyeknek meg akarjuk határozni a titerét (100 μΐ 20%-os normál kecskeszérumban és PWBben hígítva), hozzáadjuk a lukakhoz. A lemezeket 1,5 15 óra hosszat inkubáljuk 35 C-on, majd ismét mossuk PWB-vel. Az alkalikus foszfatázzal konjugált kecske anti-nyúl IgG-t (Jackson Immunochemicals) 1:2500 hígításban hozzáadjuk az egyes lukakhoz (100 μΐ), majd 1,5 óra hosszat 35 ’C-on inkubáljuk. A lemeze- 20 két az előzőkben leírt módon PWB-vel mossuk. Ezután p-NPP szubsztrátot (dinátrium-p-nitrofenilfoszfát; Sigma Cat. No. MP389) adunk az egyes lukakhoz (100 μΐ 1,0 mg/ml koncentrációjú p-NPP 10%-os dietanolaminban, pH = 9,8), majd a lemezt 25 ’C-on 25 inkubáljuk. A szín kifejlődését a lemezek 405490 nm-en való leolvasásával követjük, egy lemezleolvasóval (Molecular Devices Enax).
Az antiszérumokat arra is használjuk, hogy a GDNF-et kimutassuk és mennyiségileg meghatározzuk 30 Western-blot-tal, az alábbiak szerint: SDS-PAGE-eljárást végzünk az U. K. Laemmli által leírt alapvető eljárás szerint [Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)], egy 12,5%-os akrilamid elválasztó gélt és 4,5%-os akrilamid felvivő gélt használva. A géleket 35 (16x14x0,15 cm) elektroforetizáljuk 40 mA állandó áramerősséggel, 3 óra hosszat. A redukcióhoz/denaturáláshoz a mintákat 100 ’C-on 10 percig mintafelvivő pufferben melegítjük, amely 1% SDS-t és 150 mmól/1 β-merkaptoetanolt tartalmaz. 40
A Western-blotoláshoz a gélt azután Immobilon-P membránra visszük (Millipore Cat. No. IPVH 151 50) mA állandó áramerősséggel, 16 óra alatt, 25 mmól/1 TRIS-bázis, 192 mmól/1 glicin, 0,1% SDS és 20% metanol összetételű oldatban, és az alábbiak szerint dől- 45 gozzuk fel:
1) A membránt egy óra hosszat blokkoljuk 25 ’C-on blokkoló pufferben (10 mmól/1 TRIS, pH = 7,4;
150 mmól/I NaCl; 0,05% Tween 20; 4% fölözött tej; és 0,02% nátrium-azid), enyhe rázatás közben. 50
2) A membránt azután 25 ’C-on 2 óra hosszat inkubáljuk enyhe rázatás közben blokkoló pufferben, amely hígított primer GDNF-elleni antiszérumot tartalmaz.
3) A membránt mossuk (4 ötperces mosás) blokkoló pufferben.
4) A membránt ezután 25 ’C-on 2 óra hosszat inkubáljuk enyhe rázatás közben blokkoló pufferben, amely hígított szekunder antitesteket tartalmaz (alkalikus foszfatázzal konjugált affinitás-tisztított kecske anti-nyúl IgG: Cappel Cat. No., 59299).
5) A membránt mossuk (4 ötperces mosás) blokkoló pufferrel, amely nem tartalmaz fölözött tejet.
6) A membránt 50 ml előhívó pufferben kifejlesztjük (összetétele 100 mmól/1 TRIS-HC1 pH = 9,5, 100 mmól/1 NaCl, 5 mmól/1 MgCl2), 165 μΙ NBTvel és 83 μΐ BCIP-vel (Promega kit Cat No. P3771) 25 ’C-on enyhe rázatás közben, ameddig a keresett festődést elérjük).
8. példa: GDNF-et szekretáló membránba zárt sejtek készítése és betegekbe történő beültetése A GDNF-et szekretáló sejteket féligáteresztő membránokba zárhatjuk, hogy idegkárosodásban szenvedő betegekbe juttassuk be. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a beteg Parkinson-kórban szenved, és a GDNF-et szekretáló sejteket a beteg striátumába juttatjuk be, hogy a dopaminerg sejttesteket GDNF-fel lássuk el.
A találmány egy megvalósítási módja szerint a GDNF szekretálására megváltoztatott sejteket - azaz azokat, amelyeket az előző, 5. és 6. példában ismertettünk, biológiailag kompatibilis, beépíthető és kivehető polimer burokba viszünk. Ezeket a burkokat úgy tervezhetjük, hogy lehetővé tegyék a szekretálódó GDNF bejutását a beépített sejteket körülvevő szövetekbe, miközben megakadályozzák, hogy a környező szövetekből olyan faktorok jussanak el a sejtekhez, amelyek károsak a sejtekre.
Azokat a sejteket, amelyeket úgy változtattunk meg, hogy GDNF-et szekretáljanak, féligáteresztő membránokba zárhatjuk, a WO 91/10425 számú PCT bejelentésben leírt módszerre, amely a „Cell Capsule Extrusion Systems” névre hallgat. A membránba zárt sejteket a striátumba építhetjük be, standard sebészeti eljárások alkalmazásával.
A SZEKVENCIÁK FELSOROLÁSA
KZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 aminosav
TÍPUSA: aminosav
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
FRAGMENSTÍPUS: N-terminális fragmens
AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Pro Asp Lys Gin Alá Alá Alá Leu Pro 5 10
Gin Alá Alá Alá Alá Ser Pro Asp Asn 20 25
Arg Arg Glu Arg Asn Xaa 15
HU 211 984 A9
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI HOSSZA: 13aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris FRAGMENSTÍPUS: belső fragmens A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Xaa Ile Leu Lys Asn Leu Gly Arg Val Arg Arg Leu 10
A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 890 bázispár 5 TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: patkány-GDNF-et kódoló nukleinsav-szekvencia
GCC GCC 54 Alá Alá -85
A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCCCGGGCT GCAGGAATTC GGGG GTC TAC GGA GAC CGG ATC CGA GGT Val Tyr Gly Asp Arg Ile Arg Gly -90
GCC GGA CGG GAC TCT AAG ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG GCT GTC TGC 92
Alá Gly Arg Asp Ser Lys Met Lys Leu Trp Asp Val Val Alá Val Cys
-80 -75 -70
CTG GTG TTG CTG CAC ACC GCG TCT GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG 140
Leu Val Leu Leu His Thr Alá Ser Alá Phe Pro Leu Pro Alá Gly Lys
-65 -60 -55
AGG CTT CTC GAA GCG CCC GCC GAA GAC CAC TCC CTC GGC CAC CGC CGC 188
Arg Leu Leu Glu Alá Pro Alá Glu Asp His Ser Leu Gly His Arg Arg
-50 -45 -40
GTG CCC TTC GCG CTG ACC AGT GAC TCC AAT ATG CCC GAA GAT TAT CCT 236
Val Pro Phe Alá Leu Thr Ser Asp Ser Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro
-35 -30 -25 -20
GAC CAG TTT GAT GAC GTC ATG GAT TTT ATT CAA GCC ACC ATC AAA AGA 284
Asp Gin Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gin Alá Thr Ile Lys Arg
-15 -10 -5
CTG AAA AGG TCA CCA GAT AAA CAA GCG GCG GCA CTT CCT CGA AGA GAG 332
Leu Lys Arg Ser Pro Asp Lys Gin Alá Alá Alá Leu Pro Arg Arg Glu
1 5 10
AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA GG AAT TCC AGA GGG AAA 380
Arg Asn Arg Gin Alá Alá Alá Alá Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys
15 20 25
GGT CGC AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAT CGG GGG TGC GTC TTA ACT GCA 428
Gly Arg Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Alá
30 35 40 45
ATA CAC TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT TTG GGC TAC GAA ACC AAG GAG 476
Ile His Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu
50 55 60
GAA CTG ATC TTT CGA TAT TGT AGC GGT TCC TGT GAA GCG GCC GAG ACA 524
Glu Leu Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Alá Alá Glu Thr
65 70 75
ATG TAC GAC AAA ATA CTA AAA AAT CTG TCT CGA AGT AGA AGG CTA ACA 572
Met Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr
80 85 90
AGT GAC AAG GTA GGC CAG GCA TGT TGC AGG CCG GTC GCC TTC GAC GAC 620
Ser Asp Lys Val Gly Gin Alá Cys Cys Arg Pro Val Alá Phe Asp Asp
95 100 105
GAC CTG TCG TTT TTA GAC GAC AGC CTG GTT TAC CAT ATC CTA AGA AAG 668
Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys
110 115 120 125
CAT TCC GCT AAA CGG TGT GGA TGT ATC TGA CCCTGGCTCC AGAGACTGCT 718
His Ser Alá Lys Arg Cys Gly Cys Ile
GTGTATTGCA
CCAGAAAGGA
AAGGACGAAG
130
TTCCTGCTAC
AGATAAGGAC
GCAGCCATCT
ACTGCGAAGA
CAAGAAGGCA
GTGGGAGCCT
AAGGGACCAA
GAGGCAGAGG
GTAGAAGGAG
GGTTCCCAGG
CGGAAGAAGA
GCCCAGCTAC
AAATATTTGC
AGAAGAAAAG
AG
778
838
890
HU 211 984 A9
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 134 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: az érett patkány-GDNF kikövetkeztetett aminosav sorrendje
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ser Pro Asp Lys Gin Alá Alá Alá Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg
1 5 10 15
Gin Alá Alá Alá Alá Ser Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg
20 25 30
Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Alá Ile His Leu
35 40 45
Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Xle
50 55 60
Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Glu Alá Alá Glu Thr Met Tyr Asp
65 70 75 80
Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ser Arg Arg Leu Thr Ser Asp Lys
85 90 95
Val Gly Gin Alá Cys Cys Arg Pro Val Alá Phe Asp Asp Asp Leu Ser
100 105 110
Phe Leu Asp Asp Ser Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Alá
115 120 125
Lys Arg Cys Gly Cys Ile
130
Az 5. AZONOSITOSZAMU SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 562 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy szálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG
NÉV/MEGJELÖLÉS: humán GDNF-et kódoló nukleinsav-szekvencia
A 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATTTTCTCTT TTCTTTTTGA ACAGCA
AAT ATG CCA GAG GAT TAT CCT GAT CAG Asn Met Pro Glu Asp Tyr Pro Asp Gin
TTC GAT GAT GTC ATG GAT TTT ATT CAA GCC ACC ATT AAA AGA CTG AAA 101
Phe Asp Asp Val Met Asp Phe Ile Gin Alá Thr Ile Lys Arg Leu Lys
AGG TCA CCA GAT AAA CAA ATG GCA GTG CTT CCT AGA AGA GAG CGG AAT 149
Ser Pro Asp Lys Gin Met Alá Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn
1 5 10 15
CGG CAG GCT GCA GCT GCC AAC CCA GAG AAT TCC AGA GGA AAA GGT CGG 197
Arg Gin Alá Alá Alá Alá Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg
20 25 30
AGA GGC CAG AGG GGC AAA AAC CGG GGT TGT GTC TTA ACT GCA ATA CAT 245
Arg Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Alá Ile His
35 40 45
TTA AAT GTC ACT GAC TTG GGT CTG GGC TAT GAA ACC AAG GAG GAA CTG 293
Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu
50 55 60
ATT TTT AGG TAC TGC AGC GGC TCT TGC GAT GCA GCT GAG ACA ACG TAC 341
Ile Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Alá Alá Glu Thr Thr Tyr
65 70 75
GAC AAA ATA TTG AAA AAC TTA TCC AGA AAT AGA AGG CTG GTG ACT GAC 389
Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp
80 85 90 95
AAA GTA GGG CAG GCA TGT TGC AGA CCC ATC GCC TTT GAT GAT GAC CTG 437
Lys Val Gly Gin Alá Cys Cys Arg Pro Ile Alá Phe Asp Asp Asp Leu
100 105 110
TCG TTT TTA GAT GAT AAC CTG GTT TAC CAT ATT CTA AGA AAG CAT TCC 485
Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser
115 120 125
HU 211 984 A9
GCT AAA AGG TGT GGA TGT ATC TGA CTCCGGCTCC AGAGACTGCT GTGTATTGCA 539 Alá Lys Arg Cys Gly Cys Ile
130
TTCCTGCTAC AGTGCAAAGA AAG 562
A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI; A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 134 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: az érett humán GDNF kikövetkeztetett aminosav sorrendje
A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LE 10 ÍRÁSA:
Ser Pro Asp Lys Gin Met Alá Val Leu Pro Arg Arg Glu Arg Asn Arg
1 5 10 15
Gin Alá Alá Alá Alá Asn Pro Glu Asn Ser Arg Gly Lys Gly Arg Arg
20 25 30
Gly Gin Arg Gly Lys Asn Arg Gly Cys Val Leu Thr Alá Ile His Leu
35 40 45
Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu Leu Ile
50 55 60
Phe Arg Tyr Cys Ser Gly Ser Cys Asp Alá Alá Glu Thr Thr Tyr Asp
65 70 75 80
Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg Arg Leu Val Ser Asp Lys
85 90 95
Val Gly Gin Alá Cys Cys Arg Pro Ile Alá Phe Asp Asp Asp Leu Ser
100 105 110
Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr His Ile Leu Arg Lys His Ser Alá
115 120 125
Lys Arg Cys Gly Cys Ile
130
Az 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú 35
TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: oligonukleotid hibridizációs próba EGYÉB INFORMÁCIÓ: a 3., 15. és 18. pozícióban N jelentése: inozin 40
A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCNGAYAARC ARGCNGCNGC
A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI HOSSZA: 223 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: humán GDNF-et kódoló nukleinsav-szekvencia
A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTCTCTCCCC CACCTCCCGC CTGCCCGCGC A GGT GCC GCC GCG GGA CGG GAC TTT 55 Gly Alá Alá Alá Gly Arg Asp Phe
AAG ATG AAG TTA TGG GAT GTC GTG GCT GTC TGC CTG GTG CTG CTC CAC 103
Lys Met Lys Leu Trp Asp Val Val Alá Val Cys Leu Val Leu Leu His
1 5 10 15
ACC GCG TCC GCC TTC CCG CTG CCC GCC GGT AAG AGG CCT CCC GAG GCG 151
Thr Alá Ser Alá Phe Pro Leu Pro Alá Gly Lys Arg Pro Pro Glu Alá
20 25 30
ccc GCC GAA GAC CGC TCC CTC GGC CGC CGC CGC GCG CCC TTC GCG CTG 199
Pro Alá Glu Asp Arg Ser Leu Gly Arg Arg Arg Alá Pro Phe Alá Leu
35 40 45
AGC AGT GAC TGTAAGAACC GTTCC 223
Ser Ser Asp
HU 211 984 A9
A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 12 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy szálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: kapcsoló oligonukleotid („linker”)
A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCGAATTCG GG
A10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 7 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Pro Asp Lys Gin Alá Alá Alá
All. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy szálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: a pBluescript-SK-76.1-ből származó szekvenciarészlet
All. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCW GMW GYM WGM CCW 33
A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI.
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 11 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Glu Arg Asn Arg Gin Alá Alá Alá Alá Ser Pro
A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI.
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: DHD-26 jelű oligonukleotid EGYÉB INFORMÁCIÓ, a 9. és 12. pozícióban N jelentése: inozin
A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ARRTTYTTNA RNATYTZRTC 20
A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA
ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 7 aminosav TÍPUSA: aminosav TOPOLÓGIÁJA: lineáris
A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu
A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA
ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PD1 jelű láncindító oligonukleotid
A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;
GACGGGACTC TAAGATG
A16. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: DHD23 jelű láncindító oligonukleotid
EGYÉB INFORMÁCIÓ: a 3., 6. és 18. pozícióban
N jelentése: inozin
A 16. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCNGCNGCYT GYTTRTCNGG
A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: LF2 jelű láncindító oligonukleotid
A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGAGACAATG TACGACA
A 18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA
ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PD2 jelű láncindító oligonukleotid
A 18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
HU 211 984 A9
CTCTGGAGCC AGGGTCA
A 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy szálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS : PD1 jelű láncindító oligonukleotid
A 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCCGAATTCG ACGGGACTCT AAGATG 26 A 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 24 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: LFA jelű láncindító oligonukleotid
A 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGGTGGCCAG AGGGAGTGGT CTTC 24
A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI HOSSZA: 46 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PD3 jelű láncindító oligonukleotid
A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGGATCCA ATAAGGAGGA AAAAAAATGT CACCAGATAA ACAAAT 4 6
A 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egyszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: PD4 jelű láncindító oligonukleotid
A 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCGGTACCC AGTCTCTGGA GCCGGA 26
A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 33 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kétszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: adapter fragmens a pCJlplazmidhoz
A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCTAGAAT TGTCATGTTT GACAGCTTAT CAT A 24. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 37 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kétszálú TOPOLÓGIÁJA: lineáris EGYÉB SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: polilinker-szekvencia a pCJX 1 -1 -plazmidhoz
A 24. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA

Claims (82)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, melynek specifikus aktivitása legalább körülbelül 12 000 TU/pg.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, melynek specifikus aktivitása legalább körülbelül 24 000-szer nagyobb, mint a B49 kondicionált táptalaj specifikus aktivitása.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, melynek molekulasúlya nem-redukáló SDS-PAGE-eljárással meghatározva körülbelül 31-42 kD-nak adódik.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neurotróf faktor, amely tartalmaz egy dimer polipeptidet, amelynek specifikus aktivitása legalább körülbelül 12 000 TU/pg.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, melynek molekulasúlya redukáló SDS-PAGE-eljárással meghatározva körülbelül 20-23 kD-nak adódik.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amely tartalmaz egy monomer szekvenciát.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amely tartalmazza az alábbi aminosav-szekvenciát:
    (Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-ArgArg-Glu-(Arg)-Asn-( )Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro(Asp)-(Asn).
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amely tartalmazza a 14. ábrán bemutatott érett, patkányból származó neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciáját (szekvencia-azonosítószám: 4).
    HU 211 984 A9
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amely tartalmazza a 19. ábrán bemutatott érett, emberből származó neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciáját (szekvencia-azonosítószám: 5).
  11. 11. Alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, azzal jellemezve, hogy:
    (a) látszólagos molekulasúlya nem-redukáló SDSPAGE-eljárással meghatározva körülbelül 31-42 kDnak adódik;
    (b) látszólagos molekulasúlya redukáló SDS-PAGE-eljárással meghatározva körülbelül 20-23 kD-nak adódik; és (c) specifikus aktivitása legalább körülbelül 12 000 TU/mg.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, azzal jellemezve továbbá, hogy tartalmazza a 14. ábrán bemutatott érett, patkányból származó neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciáját (szekvencia-azonosítószám: 4).
  13. 13. A 11. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, azzal jellemezve továbbá, hogy tartalmazza a 19. ábrán bemutatott érett, emberből származó neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciáját (szekvencia-azonosítószám: 5).
  14. 14. A 11. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, melyet rekombináns DNS technológiával állítottak elő.
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, melyet rekombináns DNS technológiával állítottak elő.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amely tartalmazza a 14. ábrán bemutatott érett, patkányból származó neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciáját (szekvencia-azonosítószám: 4).
  17. 17. A 15. igénypont szerinti alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amely tartalmazza a 19. ábrán bemutatott érett, emberből származó neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciáját (szekvencia-azonosítószám: 5).
  18. 18. Gyógyászati készítmény, amely az alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor hatásos mennyiségét gyógyászatilag elfogadható hordozóban tartalmazza.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az említett faktor aminosav-szekvenciája megegyezik a 14. ábrán bemutatott érett, patkányból származó neurotróf faktoréval (szekvencia-azonosítószám: 4).
  20. 20. A 18. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az említett faktor aminosav-szekvenciája megegyezik a 19. ábrán bemutatott érett, emberből származó neurotróf faktoréval (szekvencia-azonosítószám: 5).
  21. 21. A 18. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az említett faktort rekombináns DNS technológiával állították elő.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az említett faktor aminosav-szekvenciája megegyezik a 14. ábrán bemutatott érett, patkányból származó neurotróf faktoréval (szekvencia-azonosítószám: 4).
  23. 23. A 21. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amelyben az említett faktor aminosav-szekvenciája megegyezik a 19. ábrán bemutatott érett, emberből származó neurotróf faktoréval (szekvencia-azonosítószám: 5).
  24. 24. Eljárás alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy B49 jelű glioblasztóma-sejtek felhasználásával szérummentes kondicionált növesztő táptalajt állítunk elő;
    a kondicionált táptalajt betöményítjük; a betöményített kondicionált táptalajt heparin-Sepharose-kromatográfiának vetjük alá:
    az említett heparin-Sepharose-kromatográfia során kapott frakciókat gyors protein-folyadékkromatográfiának vetjük alá; és az említett gyors protein-folyadékkromatográfiával kapott frakciókat fordított fázisú nagy-hatékonyságú folyadék-kromatográfiának vetjük alá.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve továbbá, hogy a fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfia során kapott frakciókat preparatív SDS-PAGE-eljárásnak vetjük alá; és a preparatív SDS-PAGE-eljárás során kapott frakciókat fordított fázisú nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiának vetjük alá.
  26. 26. Tisztított és izolált nukleinsav-szekvencia, amely neuroglia-eredetű neurotróf faktort kódol.
  27. 27. A 26. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia. amely azonos a 13. ábrán bemutatott érett, patkányból származó neroglia-eredetű neurotróf faktor aminosavszekvenciáját kódoló patkánynukleinsav-szekvenciával (szekvencia-azonosítószám: 3).
  28. 28. A 26. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, amely azonos a 19. ábrán bemutatott érett, emberből származó neroglia-eredetű neurotróf faktor aminosavszekvenciáját kódoló humán nukleinsav-szekvenciával (szekvencia-azonosítószám: 5).
  29. 29. Tisztított és izolált nukleinsav-szekvencia, amely neuroglia-eredetű prepro-neurotróf faktort kódol.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, amely azonos a 13. ábrán bemutatott patkányneurogliaeredetű prepro-neurotróf faktort kódoló patkánynukleinsav-szekvenciával (szekvencia-azonosítószám: 3).
  31. 31. A 29. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, amely azonos a 19. ábrán (szekvencia-azonosítószám: 5) és a 22 ábrán (szekvencia-azonosítószám: 8) bemutatott humán neuroglia-eredetű prepro-neurotróf faktort kódoló humán nukleinsav-szekvenciával.
  32. 32. A 26. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, amely érett patkány-neuroglia-eredetű neurotróf faktort kódol.
  33. 33. A 32. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, amely a 14. ábrán bemutatott érett, patkány-neurogliaeredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciáját kódolja (szekvencia-azonosítószám: 4).
    HU 211 984 A9
  34. 34. A 26. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, amely érett humán neuroglia-eredetű neurotróf faktort kódol.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, amely a 19. ábrán bemutatott érett humán neurogliaeredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciáját kódolja (szekvencia-azonosítószám: 5).
  36. 36. A 26. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencia, amely az alábbi, GDNF-kódoló nukleinsav szekvenciák valamelyikével azonos (a) a 13. ábrán bemutatott patkányeredetű preproGDNF aminosav-szekvenciáját kódoló nukleinsavszekvencia (szekvencia-azonosítószám: 3);
    (b) a 13. ábrán bemutatott patkány eredetű érett GDNF aminosav-szekvenciáját kódoló nukleinsavszekvencia (szekvencia-azonosítószám: 3);
    (c) a 19. ábrán bemutatott humán prepro-GDNF aminosav-szekvenciáját kódoló nukleinsav-szekvencia (szekvencia-azonosítószám: 8);
    (d) a 19. ábrán bemutatott humán érett GDNF aminosav-szekvenciáját kódoló nukleinsav-szekvencia (szekvencia-azonosítószám: 5);
    (e) egy dopaminerg aktivitással rendelkező, a GDNF egy részletéhez kötődő antitest által felismert aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav-szekvencia; és (f) egy nukleinsav-szekvencia, amely (1) hibridizálódik az (a), (b), (c) vagy (d) pontban említett szekvenciák komplementeréhez, és (2) dopaminerg aktivitással rendelkező aminosav-szekvenciát kódol.
  37. 37. Eljárás idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy az ilyen kezelésre szoruló betegnek a neuroglia-eredetű neurotróf faktor gyógyászatilag hatásos mennyiségét beadjuk.
  38. 38. A 37. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett idegkárosodás a Parkinson-kór.
  39. 39. Gyógyászati készítmény Parkinson-kór megelőzésére vagy kezelésére amely a neuroglia-eredetű neurotróf faktor hatásos mennyiségét tartalmazza gyógyászatilag elfogadható hordozóban.
  40. 40. Gyógyászati készítmény helytelenül működő dopaminerg idegsejtek kezelésére vagy dopaminerg idegsejtek károsodásának megelőzésére, amely a neuroglia-eredetű neurotróf faktor hatásos mennyiségét gyógyászatilag elfogadható hordozóban tartalmazza.
  41. 41. Eljárás helytelenül működő dopaminerg idegsejtek kezelésére vagy dopaminerg idegsejtek károsodásának megelőzésére, azzal jellemezve, hogy az ilyen kezelésre szoruló betegnek a neuroglia-eredetű neurotróf faktor gyógyászatilag hatásos mennyiségét beadjuk.
  42. 42. Rekombináns DNS-molekula, amely expressziós szabályozó elemeket tartalmaz funkcionálisan neuroglia-eredetű neurotróf faktort kódoló nukleinsavszekvenciához kapcsolva.
  43. 43. Gazdasejt, amely 42. igénypont szerinti vektorral van transzformálva.
  44. 44. Rekombináns DNS eljárás neuroglia-eredetű neurotróf faktor előállítására azzal jellemezve, hogy:
    (a) neuroglia-eredetű neurotróf faktort kódoló
    DNS-szekvenciát olyan expressziós vektorba szubklónozunk, amely tartalmazza a DNS-szekvencia expressziójához szükséges szabályozó elemeket;
    (b) az említett expressziós vektorral gazdasejtet transzformálunk;
    (c) a gazdasejteket a vektor sokszorozódására és a neuroglia-eredetű neurotróf faktor expresszálódására alkalmas körülmények között tenyésztjük; és (d) a neuroglia-eredetű neurotróf faktort kinyerjük a gazdasejttenyészetből.
  45. 45. A 44. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejt állati sejt.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejt COS7-sejt.
  47. 47. A 44. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejt baktériumsejt.
  48. 48. A 47. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejt Escherichia coli sejt.
  49. 49. A 48. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, azzal jellemezve továbbá, hogy tartalmaz egy olyan lépést, amelyben a kinyert neuroglia-eredetű neurotróf faktor természetes térszerkezetét visszaalakítjuk.
  50. 50. Rekombináns DNS eljárás neuroglia-eredetű neurotróf faktor előállítására azzal jellemezve, hogy (a) a 43. igénypont szerinti gazdasejtet a vektor sokszorozódására és a neuroglia-eredetű neurotróf faktor expresszálódására alkalmas körülmények között tenyésztjük; és (b) a neuroglia-eredetű neurotróf faktort kinyerjük a gazdasejt tenyészetéből.
  51. 51. Az 50. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, amelyben az említett gazdasejt állati sejt.
  52. 52. Az 51. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, amelyben az említett gazdasejt COS-7-sejt.
  53. 53. Az 50. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, amelyben az említett gazdasejt baktériumsejt.
  54. 54. Az 53. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, amelyben az említeti gazdasejt Escherichia coli sejt.
  55. 55. Az 54. igénypont szerinti rekombináns DNS eljárás, azzal jellemezve továbbá, hogy tartalmaz egy olyan lépést, amelyben a kinyert neuroglia-eredetű neurotróf faktor természetes térszerkezetét visszaalakítjuk.
  56. 56. Alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amelyet a 24. igénypont szerinti eljárással állítottak elő.
  57. 57. Alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amelyet az 55. igénypont szerinti eljárással állítottak elő.
  58. 58. Alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amelyet a 44. igénypont szerinti eljárással állítottak elő.
  59. 59. Alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amelyet az 50. igénypont szerinti eljárással állítottak elő.
    HU 211 984 A9
  60. 60. Alapvetően megtisztított ellenanyagok, melyek felismerik a neuroglia-eredetű neurotróf faktort.
  61. 61. A 60. igénypont szerinti ellenanyagok, amely ellenanyagok monoklonális ellenanyagok.
  62. 62. A 60. igénypont szerinti ellenanyagok, amely ellenanyagok poliklonális ellenanyagok.
  63. 63. Eljárás idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére, azzal jellemezve, hogy neuroglia-eredetű neurotróf faktorokat szekretáló sejteket ültetünk be ilyen kezelésre szoruló betegekbe.
  64. 64. A 63. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett beteg Parkinson-kórban szenved.
  65. 65. A 63. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett sejtek a 42. igénypont szerinti sejtek.
  66. 66. A 63. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett sejtek a természetben előforduló, neurogliaeredetű neurotróf faktort szekretáló sejtek.
  67. 67. A 63. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett sejteket biokompatibilis, szemipermeábilis membránban tartjuk.
  68. 68. A 63. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosavszekvenciája azonos a 19. ábrán látható érett humán neuroglia-eredetű neurotróf faktoréval (szekvenciaazonosítószám : 5).
  69. 69. A 63. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosavszekvenciája azonos a 14. ábrán látható érett patkányból származó neuroglia-eredetű neurotróf faktoréval (szekvencia-azonosítószám: 4).
  70. 70. Gyógyászati segédeszköz, amely betegbe beültetve idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére szolgál, azzal jellemezve, hogy tartalmaz:
    egy szemipermeábilis membránt; és az említett membránba kapszulázott sejtet, amely neuroglia-eredetű neurotróf faktort szekretál;
    az említett membrán áteresztő az említett neuroglia-eredetű neurotróf faktorra nézve, és átjárhatatlan azokra, a betegből származó faktorokra nézve, amelyek az említett sejtekre károsak.
  71. 71. A 70. igénypont szerinti gyógyászati segédeszköz. amelyben az említett sejtek a 42. igénypont szerinti sejtek.
  72. 72. A 70. igénypont szerinti gyógyászati segédeszköz, amelyben az említett sejtek a természetben előforduló, neuroglia-eredetű neurotróf faktort szekretáló sejtek.
  73. 73. A 70. igénypont szerinti gyógyászati segédeszköz, amelyben az említett neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciája azonos a 19. ábrán látható érett humán neuroglia-eredetű neurotróf faktoréval (szekvencia-azonosítószám: 5).
  74. 74. A 70. igénypont szerinti gyógyászati segédeszköz, amelyben az említett neuroglia-eredetű neurotróf faktor aminosav-szekvenciája azonos a 14. ábrán látható érett patkányból származó neuroglia-eredetű neurotróf faktoréval (szekvencia-azonosítószám: 4).
  75. 75. Alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor, amely alapvetően azonos a csatolt példákban bemutatottak valamelyikével.
  76. 76. Eljárás alapvetően megtisztított neuroglia-eredetű neurotróf faktor előállítására, amely eljárás alapvetően azonos a leírásban található példákban bemutatottak valamelyikével.
  77. 77. Neuroglia-eredetű neurotróf faktor, melyet a 24., 25. vagy 76. igénypont szerinti eljárással állítottak elő.
  78. 78. Tisztított és izolált nukleinsav-szekvencia, amely olyan neuroglia-eredetű neurotróf faktort kódol, amely alapvetően azonos a leírásban található példákban bemutatottak valamelyikével.
  79. 79. Gyógyászati készítmény Parkinson-kór megelőzésére vagy kezelésére, amely alapvetően azonos a leírásban található példákban bemutatottak valamelyikével.
  80. 80. Rekombináns DNS eljárás neuroglia-eredetű neurotróf faktor előállítására, amely eljárás alapvetően azonos a leírásban található példákban bemutatottak valamelyikével.
  81. 81. Alapvetően megtisztított ellenanyagok, amelyek felismerik a neuroglia-eredetű neurotróf faktort, és amelyek alapvetően azonosak a leírásban található példákban bemutatottak valamelyikével.
  82. 82. Gyógyászati segédeszköz idegkárosodás megelőzésére vagy kezelésére, amely alapvetően azonos a leírásban található példákban bemutatottak valamelyikével.
HU95P/P00478P 1991-09-20 1995-06-28 Neuroglial derived neurothrophic factors HU211984A9 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US76468591A 1991-09-20 1991-09-20
US77410991A 1991-10-08 1991-10-08
US78842391A 1991-11-06 1991-11-06
US85541392A 1992-03-19 1992-03-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU211984A9 true HU211984A9 (en) 1996-01-29

Family

ID=27505700

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400717A HU220795B1 (hu) 1991-09-20 1992-09-17 Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére
HU95P/P00478P HU211984A9 (en) 1991-09-20 1995-06-28 Neuroglial derived neurothrophic factors

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400717A HU220795B1 (hu) 1991-09-20 1992-09-17 Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére

Country Status (21)

Country Link
US (7) US7226758B1 (hu)
EP (2) EP1243652A3 (hu)
KR (1) KR100242093B1 (hu)
AT (1) ATE275197T1 (hu)
AU (2) AU679167B2 (hu)
CA (1) CA2119463C (hu)
DE (1) DE69233407T2 (hu)
DK (1) DK0610254T3 (hu)
ES (1) ES2225819T3 (hu)
FI (1) FI117556B (hu)
GE (1) GEP20002243B (hu)
HK (2) HK1017816A1 (hu)
HU (2) HU220795B1 (hu)
IL (5) IL103223A (hu)
MX (1) MX9205293A (hu)
NO (1) NO321382B1 (hu)
NZ (1) NZ244392A (hu)
PT (1) PT100879B (hu)
SG (1) SG48145A1 (hu)
TW (1) TW401422B (hu)
WO (1) WO1993006116A1 (hu)

Families Citing this family (143)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5981165A (en) * 1991-07-08 1999-11-09 Neurospheres Holdings Ltd. In vitro induction of dopaminergic cells
CA2170751A1 (en) * 1993-09-01 1995-03-09 Timothy J. Cunningham Neuron regulatory factor for promoting neuron survival
AU1443095A (en) * 1993-12-22 1995-07-10 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel nucleic acid sequences isolated from glial cells
DK0755446T3 (da) * 1994-04-25 2007-01-29 Genentech Inc Cardiotrophin og anvendelser deraf
US7258983B2 (en) 1994-04-25 2007-08-21 Genentech, Inc. Cardiotrophin-1 compositions and methods for the treatment of tumor
US6472585B1 (en) 1994-04-25 2002-10-29 Genentech, Inc. Cardiotrophin-1 defective mouse
US5534615A (en) * 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5853385A (en) * 1994-08-26 1998-12-29 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated PC12 cell transplants for treatment of Parkinson's disease
US5733875A (en) * 1994-11-15 1998-03-31 Amgen Inc. Methods of using GDNF as a neuroprotective agent
JP3093974B2 (ja) * 1995-06-27 2000-10-03 住友ベークライト株式会社 神経細胞用培養液、その製造方法及びこれを用いる神経細胞の培養方法
US6743628B1 (en) 1995-08-28 2004-06-01 Washington University Method of cell culture using neurturin
US5739307A (en) * 1995-08-28 1998-04-14 Washington University Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor
US6184200B1 (en) 1995-09-28 2001-02-06 Amgen Inc. Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor
US5731284A (en) * 1995-09-28 1998-03-24 Amgen Inc. Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5641750A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5641749A (en) * 1995-11-29 1997-06-24 Amgen Inc. Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product
WO1997019693A1 (en) * 1995-11-29 1997-06-05 Amgen Inc. Method for treating sensory neuropathy using glial cell line-derived neurotrophic factor (gdnf) protein product
US5905027A (en) * 1995-12-27 1999-05-18 Uab Research Foundation Method of diagnosing and treating gliomas
US5837681A (en) * 1996-02-23 1998-11-17 Amgen Inc. Method for treating sensorineural hearing loss using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US5929041A (en) * 1996-02-23 1999-07-27 Amgen Inc. Method for preventing and treating sensorineural hearing loss and vestibular disorders using glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF) protein product
NZ329482A (en) 1996-03-14 2000-05-26 Univ Washington A growth factor persephin related to the GDNF/neurturin family of growth factors Methods of treating conditions related to persephin deficiency detecting gene alterations and identifying other members of the family are included
DK0888385T3 (da) 1996-03-14 2003-12-15 Genentech Inc GDNF receptor og anvendelser deraf
US7015316B1 (en) 1996-03-14 2006-03-21 Washington University Polynucleotides encoding human persephin and related growth factors
US6222022B1 (en) * 1996-03-14 2001-04-24 Washington University Persephin and related growth factors
US5741778A (en) * 1996-03-19 1998-04-21 Amgen Inc. Method for treating Huntington's disease using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product
US6299895B1 (en) 1997-03-24 2001-10-09 Neurotech S.A. Device and method for treating ophthalmic diseases
US6455277B1 (en) * 1996-04-22 2002-09-24 Amgen Inc. Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides
US7138251B1 (en) 1996-04-22 2006-11-21 Amgen Inc. Polynucleotides encoding a neurotrophic factor receptor
AU2677797A (en) * 1996-04-25 1997-11-12 Genetic Therapy, Inc. Viral vectors including polynucleotides encoding neurotrophic factors and uses therefor
CA2262884C (en) * 1996-07-29 2004-06-08 Biopharm Gmbh Egf-like factor from chromaffin granules and glia cell-derived neurotrophic factor with survival-promoting activity on daergic neurons
JP2001512306A (ja) 1997-01-08 2001-08-21 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド タンパク質の産生方法
US6025157A (en) * 1997-02-18 2000-02-15 Genentech, Inc. Neurturin receptor
US6372453B1 (en) 1997-02-18 2002-04-16 Genetech, Inc. Neurturin receptor
US6777196B2 (en) 1997-02-18 2004-08-17 Genentech, Inc. Neurturin receptor
US7885697B2 (en) 2004-07-13 2011-02-08 Dexcom, Inc. Transcutaneous analyte sensor
US6042579A (en) * 1997-04-30 2000-03-28 Medtronic, Inc. Techniques for treating neurodegenerative disorders by infusion of nerve growth factors into the brain
SI1005358T1 (en) * 1997-07-30 2003-06-30 Amgen Inc. Use of a neurturin protein product for preventing and treating hearing loss
US6043221A (en) * 1997-07-30 2000-03-28 Amgen Inc. Method for preventing and treating hearing loss using a neuturin protein product
CA2299586C (en) * 1997-08-05 2007-09-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Human glial cell line-derived neurotrophic factor promoters, vectors containing same, and methods of screening compounds therewith
DK1064376T3 (da) 1998-03-23 2006-07-24 Genentech Inc GFR-alpha3 og dets anvendelser
US7026138B1 (en) 1998-03-23 2006-04-11 Genentech, Inc. Polynucleotides encoding GFRα3
DE19816186A1 (de) * 1998-04-14 1999-10-21 Univ Muenchen L Maximilians GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten
US6593133B1 (en) 1998-07-06 2003-07-15 Nsgene A/S Neurotrophic factors
US6284540B1 (en) * 1998-09-29 2001-09-04 Washington University Artemin, a novel neurotrophic factor
US7060676B2 (en) 1999-12-20 2006-06-13 Trustees Of Tufts College T. cruzi-derived neurotrophic agents and methods of use therefor
US20040014082A1 (en) * 2000-08-11 2004-01-22 Invitrogen Corporation Highly homogeneous molecular markers for electrophoresis
US6426065B1 (en) * 2000-11-07 2002-07-30 Clairol Incorporated Use of tris(hydroxymethyl)aminomethane in cold permanent waving processes
US7442370B2 (en) 2001-02-01 2008-10-28 Biogen Idec Ma Inc. Polymer conjugates of mutated neublastin
US7276580B2 (en) 2001-03-12 2007-10-02 Biogen Idec Ma Inc. Neurotrophic factors
NZ529126A (en) 2001-03-28 2010-07-30 Biogen Idec Inc Use of neublastin polypeptides for treating allodynia, hyperalgesic pain and phantom pain
US20030050273A1 (en) * 2001-08-29 2003-03-13 Keiya Ozawa Compositions and methods for treating neurodegenerative diseases
US8364229B2 (en) * 2003-07-25 2013-01-29 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
US7613491B2 (en) * 2002-05-22 2009-11-03 Dexcom, Inc. Silicone based membranes for use in implantable glucose sensors
US20030228295A1 (en) * 2002-04-25 2003-12-11 Svendsen Clive N. Use of human neural stem cells secreting GDNF for treatment of parkinson's and other neurodegenerative diseases
US20060088899A1 (en) * 2002-05-31 2006-04-27 Alvarez Vernon L Combination chemotherapy with chlorotoxin
US7528112B2 (en) 2002-11-15 2009-05-05 Drexel University Small survival-promoting/immunomodulatory peptide for treatment of brain damage, neurodegenerative disorders, and inflammatory disorders
US7388079B2 (en) * 2002-11-27 2008-06-17 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
US20050048041A1 (en) * 2003-01-13 2005-03-03 Rao Mahendra S. Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
EP1587545A2 (en) * 2003-01-13 2005-10-26 Mahendra S. Rao Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
US20040209810A1 (en) * 2003-02-24 2004-10-21 Gill Steven S. Method of treating Parkinson's disease in humans by intraputaminal infusion of glial cell-line derived neurotrophic factor
US8946151B2 (en) 2003-02-24 2015-02-03 Northern Bristol N.H.S. Trust Frenchay Hospital Method of treating Parkinson's disease in humans by convection-enhanced infusion of glial cell-line derived neurotrophic factor to the putamen
NZ543365A (en) 2003-04-18 2009-02-28 Biogen Idec Inc Polymer-conjugated glycosylated neublastin
US7875293B2 (en) * 2003-05-21 2011-01-25 Dexcom, Inc. Biointerface membranes incorporating bioactive agents
EP1636260B1 (en) 2003-06-10 2009-02-18 Nsgene A/S Improved secretion of neublastin
EP1648298A4 (en) * 2003-07-25 2010-01-13 Dexcom Inc OXYGEN-IMPROVED MEMBRANE SYSTEMS FOR IMPLANTABLE DEVICES
US9763609B2 (en) 2003-07-25 2017-09-19 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
US9135402B2 (en) 2007-12-17 2015-09-15 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
US7591801B2 (en) 2004-02-26 2009-09-22 Dexcom, Inc. Integrated delivery device for continuous glucose sensor
US7920906B2 (en) 2005-03-10 2011-04-05 Dexcom, Inc. System and methods for processing analyte sensor data for sensor calibration
WO2005021065A2 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 New York University Indirect delivery of growth factors into the central nervous system
EP1660659A2 (en) * 2003-09-05 2006-05-31 Licentia, Ltd. Gdnf-related neuropeptides
US7598059B2 (en) 2003-10-02 2009-10-06 Biogen Idec Ma Inc. Neublastin expression constructs
CN1897977A (zh) * 2003-10-20 2007-01-17 Ns基因公司 帕金森氏病的体内基因治疗
US9247900B2 (en) 2004-07-13 2016-02-02 Dexcom, Inc. Analyte sensor
US8093205B2 (en) 2003-12-01 2012-01-10 Medtronic, Inc. Method for treating a stroke by implanting a first therapy delivery element in the CNS and a second therapy delivery element in a damaged tissue of the CNS to promote neurogenesis
US20050123526A1 (en) * 2003-12-01 2005-06-09 Medtronic Inc. Administration of growth factors for neurogenesis and gliagenesis
WO2005079257A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Dexcom, Inc. Biointerface with macro- and micro- architecture
US20050208090A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
GB2414934A (en) * 2004-06-11 2005-12-14 Gill Steven Streatfield Treatment of Parkinson's disease with GDNF
EP1773401B1 (en) * 2004-06-21 2013-01-02 Medtronic, Inc. Medical systems and methods for delivering compositions to cells
US8722862B2 (en) 2004-08-19 2014-05-13 Biogen Idec Ma Inc. Refolding transforming growth factor beta family proteins
EA013565B1 (ru) 2004-08-19 2010-06-30 Байоджен Айдек Ма Инк. Варианты полипептидов нейбластина, способы их получения и их применение
US8133178B2 (en) 2006-02-22 2012-03-13 Dexcom, Inc. Analyte sensor
CA2619017A1 (en) 2005-08-16 2007-02-22 Copenhagen University Gdnf derived peptides
US8741260B2 (en) * 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
US8053569B2 (en) * 2005-10-07 2011-11-08 Armagen Technologies, Inc. Nucleic acids encoding and methods of producing fusion proteins
US8124095B2 (en) * 2005-10-07 2012-02-28 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of erythropoietin to the CNS
AU2006308312A1 (en) * 2005-10-28 2007-05-03 Nsgene A/S Implantable Biocompatible Immunoisolatory Vehicle for Delivery of GDNF
ATE480559T1 (de) * 2005-12-14 2010-09-15 Licentia Ltd Verwendungen eines neurotrophischen faktors
TWI501774B (zh) 2006-02-27 2015-10-01 Biogen Idec Inc 神經性病症之治療
WO2007120381A2 (en) * 2006-04-14 2007-10-25 Dexcom, Inc. Analyte sensor
DK2019683T4 (da) 2006-04-25 2022-08-29 Univ California Indgivelse af vækstfaktorer til behandling af CNS-lidelser
WO2007127839A2 (en) * 2006-04-26 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for convection enhanced delivery of high molecular weight neurotherapeutics
EP1872790A1 (en) 2006-06-26 2008-01-02 DeveloGen Aktiengesellschaft New formulation for increasing bioavailability of neurturin
US8759297B2 (en) * 2006-08-18 2014-06-24 Armagen Technologies, Inc. Genetically encoded multifunctional compositions bidirectionally transported between peripheral blood and the cns
KR100770440B1 (ko) * 2006-08-29 2007-10-26 삼성전기주식회사 질화물 반도체 발광소자
US8637459B2 (en) 2006-11-08 2014-01-28 Emory University Enhancing a population of insulin releasing cells using GFR-A1 agonists
TWI445544B (zh) 2007-05-01 2014-07-21 Biogen Idec Inc 增進血管形成之組合物及方法
US20090011040A1 (en) * 2007-05-02 2009-01-08 Naash Muna I Use of compacted nucleic acid nanoparticles in non-viral treatments of ocular diseases
US20200037874A1 (en) 2007-05-18 2020-02-06 Dexcom, Inc. Analyte sensors having a signal-to-noise ratio substantially unaffected by non-constant noise
WO2008157288A2 (en) 2007-06-13 2008-12-24 Wayne State University Board Of Governors A baclofen solution for low-volume therapeutic delivery
WO2008157308A2 (en) * 2007-06-13 2008-12-24 Wayne State University Board Of Governors A zwitterion solution for low-volume therapeutic delivery
CA2694762A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing alpha-l-iduronidase activity in the cns
EP4098177A1 (en) 2007-10-09 2022-12-07 DexCom, Inc. Integrated insulin delivery system with continuous glucose sensor
US8417312B2 (en) 2007-10-25 2013-04-09 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
FI20070808A0 (fi) 2007-10-25 2007-10-25 Mart Saarma GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt
US9839395B2 (en) 2007-12-17 2017-12-12 Dexcom, Inc. Systems and methods for processing sensor data
GB0803352D0 (en) 2008-02-22 2008-04-02 Ntnu Technology Transfer As Oligopeptidic compounds and uses thereof
US20090247855A1 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
FI20080326A0 (fi) 2008-04-30 2008-04-30 Licentia Oy Neurotroofinen tekijä MANF ja sen käytöt
CA2724384A1 (en) 2008-05-15 2009-11-19 Transmolecular, Inc. Treatment of metastatic tumors
EP2396408B1 (en) 2009-02-12 2017-09-20 CuRNA, Inc. Treatment of glial cell derived neurotrophic factor (gdnf) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gdnf
CA2748889A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Armagen Technologies, Inc. Compositions and methods for blood-brain barrier delivery of igg-decoy receptor fusion proteins
US20110002897A1 (en) 2009-06-11 2011-01-06 Burnham Institute For Medical Research Directed differentiation of stem cells
ES2725200T3 (es) 2009-10-09 2019-09-20 Armagen Inc Métodos y composiciones para aumentar la actividad de iduronato 2-sulfatasa en el SNC
WO2011064437A2 (es) 2009-11-26 2011-06-03 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Vectores virales y procedimientos útiles en la preparación de gdnf
DK2531206T3 (en) 2010-02-04 2017-09-11 Morphotek Inc CHLOROTOXIN POLYPEPTIDES AND CONJUGATES AND USE THEREOF
KR101972173B1 (ko) 2010-05-11 2019-04-24 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 클로로톡신 변이체, 접합체, 및 이의 사용 방법
MX2013006216A (es) 2010-12-02 2013-10-17 Neurotech Usa Inc Lineas celulares que secretan andamios de anticuerpos anti-angionicos y receptores solubles y sus usos.
UA112981C2 (uk) 2011-04-11 2016-11-25 Елі Ліллі Енд Компані Варіант людського gdnf
US20130053666A1 (en) 2011-08-26 2013-02-28 Dexcom, Inc. Polymer membranes for continuous analyte sensors
EP4338797A3 (en) 2011-12-02 2024-06-12 Armagen, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
US9788765B2 (en) 2012-09-28 2017-10-17 Dexcom, Inc. Zwitterion surface modifications for continuous sensors
CA2913029A1 (en) 2012-12-10 2014-06-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Lipocalin fusion partners
US9737250B2 (en) 2013-03-15 2017-08-22 Dexcom, Inc. Membrane for continuous analyte sensors
EP2968462B1 (en) 2013-03-15 2020-12-23 The Jackson Laboratory Methods for promoting wound healing and hair growth
US11559580B1 (en) 2013-09-17 2023-01-24 Blaze Bioscience, Inc. Tissue-homing peptide conjugates and methods of use thereof
US10369329B2 (en) 2014-01-30 2019-08-06 Renishaw Plc Neurosurgical apparatus and method
CN106460062A (zh) 2014-05-05 2017-02-22 美敦力公司 用于scd、crt、crt‑d或sca治疗识别和/或选择的方法和组合物
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
GB201506052D0 (en) 2015-04-09 2015-05-27 Renishaw Plc Movement disorder
CA2986769A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Neurotech Usa, Inc. Use of encapsulated cell therapy for treatment of ophthalmic disorders
JP6983765B2 (ja) 2015-12-30 2021-12-17 デックスコム・インコーポレーテッド 分析物センサのための酵素固定化接着層
WO2017181149A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Blaze Bioscience, Inc. Methods of treating breast cancer
EP3538560A4 (en) 2016-11-10 2020-06-17 Keros Therapeutics, Inc. GDNF FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE
EP4307999A1 (en) 2021-03-19 2024-01-24 Dexcom, Inc. Drug releasing membrane for analyte sensor
AU2022345089A1 (en) 2021-09-15 2024-05-02 Dexcom, Inc. Bioactive releasing membrane for analyte sensor
EP4442830A1 (en) 2021-11-29 2024-10-09 Shanghai Regenelead Therapies Co., Ltd. Aadc/gdnf polynucleotide, and use thereof in treating parkinson's disease
CA3228457A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Dexcom, Inc. Sensing systems and methods for diagnosing, staging, treating, and assessing risks of liver disease using monitored analyte data
WO2023164584A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Dexcom, Inc. Sensing systems and methods for providing decision support around kidney health and/or diabetes
US20230389844A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 Dexcom, Inc. Sensing systems and methods for diagnosing kidney disease
US20240090802A1 (en) 2022-09-02 2024-03-21 Dexcom, Inc. Continuous analyte sensor devices and methods
WO2024145651A1 (en) 2022-12-30 2024-07-04 Dexcom, Inc. Sensing systems and methods for hybrid glucose and ketone monitoring

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4518526A (en) * 1982-12-22 1985-05-21 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
EP0154434B1 (en) 1984-02-17 1993-01-27 Genentech, Inc. Human transforming growth factor and precursor or fragment thereof, cells, dna, vectors and methods for their production, compositions and products containing them, and related antibodies and diagnostic methods
US4886747A (en) 1985-03-22 1989-12-12 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding TGF-β and its uses
US5284763A (en) 1985-03-22 1994-02-08 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding TGF-β and its uses
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5427780A (en) 1985-10-30 1995-06-27 Biogen, Inc. Composition comprising Mullerian inhibiting substance-like polypeptides
EP0233838A3 (en) * 1986-02-04 1990-01-31 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Neurite-promoting factor and process for the manufacture thereof
US5187076A (en) * 1986-07-01 1993-02-16 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding BMP-6 proteins
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5158881A (en) * 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US5324819A (en) 1988-04-08 1994-06-28 Stryker Corporation Osteogenic proteins
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
US5250414A (en) 1988-11-04 1993-10-05 Erziehungsdirektion Of The Canton Zurich Diagnostic methods using neurite growth regulatory factors
KR100196540B1 (ko) 1988-11-04 1999-06-15 마틴 이. 샤브 축색성장 조절인자
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5017735A (en) 1989-07-24 1991-05-21 Catalytica, Inc. Selective sorption of 2,6-diisopropylnaphthalene
AU6174490A (en) * 1989-08-04 1991-03-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions; purified preparation of neural progenitor regulatory factor
CA2064787A1 (en) * 1989-08-11 1991-02-12 Joe E. Springer Dopaminergic neurotrophic factor for treatment of parkinson's disease
US5215969A (en) 1989-08-11 1993-06-01 Hahnemann University Dopaminergic neurotrophic factor for treatment of Parkinson's disease
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
US5270181A (en) 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules

Also Published As

Publication number Publication date
SG48145A1 (en) 1998-04-17
FI941285A (fi) 1994-03-18
HUT66137A (en) 1994-09-28
HK1017816A1 (en) 1999-11-26
HU9400717D0 (en) 1994-06-28
EP0610254B1 (en) 2004-09-01
IL103223A (en) 2005-06-19
TW401422B (en) 2000-08-11
GEP20002243B (en) 2000-09-25
MX9205293A (es) 1993-05-01
NO321382B1 (no) 2006-05-02
PT100879A (pt) 1994-02-28
CA2119463A1 (en) 1993-04-01
AU679167B2 (en) 1997-06-26
FI117556B (fi) 2006-11-30
PT100879B (pt) 1999-08-31
ES2225819T3 (es) 2005-03-16
EP1243652A3 (en) 2003-03-26
US20020197675A1 (en) 2002-12-26
AU694387B2 (en) 1998-07-16
US7226758B1 (en) 2007-06-05
DE69233407D1 (de) 2004-10-07
KR940702505A (ko) 1994-08-20
EP0610254A4 (en) 1995-05-03
AU2681192A (en) 1993-04-27
US6093802A (en) 2000-07-25
IL140654A0 (en) 2002-02-10
US6362319B1 (en) 2002-03-26
HK1047438A1 (zh) 2003-02-21
CA2119463C (en) 2003-09-16
EP0610254A1 (en) 1994-08-17
FI941285A0 (fi) 1994-03-18
NZ244392A (en) 1995-03-28
NO940922L (no) 1994-05-19
HU220795B1 (hu) 2002-05-28
US6015572A (en) 2000-01-18
IL121913A0 (en) 1998-03-10
IL103223A0 (en) 1993-02-21
IL140653A0 (en) 2002-02-10
WO1993006116A1 (en) 1993-04-01
DK0610254T3 (da) 2005-01-10
US5935795A (en) 1999-08-10
NO940922D0 (no) 1994-03-15
KR100242093B1 (ko) 2000-02-01
EP1243652A2 (en) 2002-09-25
IL147488A0 (en) 2002-08-14
ATE275197T1 (de) 2004-09-15
DE69233407T2 (de) 2005-09-08
AU1900197A (en) 1997-09-18
US6221376B1 (en) 2001-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU211984A9 (en) Neuroglial derived neurothrophic factors
ES2236686T3 (es) Factores mitogenicos gliales, su preparacion y uso.
DE69121208T2 (de) Neuer neurotropischer faktor
ES2234015T3 (es) Gen relacionado con el aguti.
DE60223511T2 (de) Neurotrophe faktoren
KR100334739B1 (ko) 절단된신경교세포주-유래신경영양성인자단백질산물
US7511009B2 (en) Retinal pigmented epithelium derived neurotrophic factor
US6262024B1 (en) Neuron regulatory factor for promoting neuron survival
KR20000029912A (ko) 뉴리틴,신경유전자
JPS62501841A (ja) Ｅｂｚｄ蛋白質
JP2968840B2 (ja) グリア由来神経栄養因子
US20040175795A1 (en) Glial derived neurotrophic factor
DE69032471T2 (de) Proteine mit onkostatin-m-aktivität und verfahren zu ihrer herstellung
WO1993002206A1 (en) Purification of recombinant ciliary neurotrophic factor and c-terminal truncated ciliary neurotrophic factor and methods for treating peripheral nerve damage

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: AMGEN INC., US