DE69121208T2

DE69121208T2 - Neuer neurotropischer faktor

Info

Publication number: DE69121208T2
Application number: DE69121208T
Authority: DE
Inventors: Arnon Rosenthal
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1990-09-25
Filing date: 1991-09-24
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2011-09-25
Also published as: AU8756491A; ATE140966T1; AU654302B2; DK0550665T3; JP2004344175A; JPH06501617A; US6037320A; JP2006087434A; JP2007209349A; GR3021371T3; DE69121208D1; JP2003159083A; EP0550665B1; EP0550665A1; US5830858A; CA2092567A1; WO1992005254A1; CA2092567C; ES2093112T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Anmeldung betrifft Proteine, die am Wachstum, an der Regulierung oder der Aufrechterhaltung von Nervengewebe beteiligt sind. Insbesondere betrifft sie aus Nerven stammende Faktoren mit Homologie zu NGF.

Hintergrund der Erfindung

Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist ein Protein, das auf die Entwicklung sensorischer und sympathischer Neuronen des peripheren Nervensystems einen großen Einfluß ausübt. NGF wirkt über spezifische Zelloberflächenrezeptoren auf reagierende Neuronen ein, um das neuronale Überleben zu unterstützen, Neuritenauswuchs zu fördern und die neurochemische Differenzierung zu verstärken. Die NGF-Wirkungsweise wird begleitet von Änderungen in neuronalen Membranen (Connolly et al., 1981, J. Cell. Biol. 90: 176; Skaper und Varon, 1980, Brain Res. 197: 379), im Phosphorylierungszustand neuronaler Proteine (Yu, et al., 1980, J. Bio. Chem. 255: 10481; Haleqoua und Patrick, 1980, Cell 22: 571) und in der Häufigkeit bestimmter mRNAs und Proteine, die bei der neuronalen Differenzierung und Funktion wahrscheinlich eine Rolle spielen (Tiercy und Shooter, 1986, J. Cell. Bio. 103: 2367).
Cholinergische Vorderhirnneuronen reagieren ebenfalls auf NGF und erfordern NGF möglicherweise zur Nahrungsversorgung (Hefti, 1986, J. Neurosci., 6: 2155). Die Verteilung und Ontogenese von NGF und seines Rezeptors im Zentralnervensystem (CNS) legt nahe, daß NGF als zielabstammender neurotropher Faktor für basale cholinergische Vorderhirnneuronen wirkt (Korsching, Nov/Dez 1986, Trends in Neuro. Sci., S. 570-573).
Während einige Tierhomologe zu NGF bekannt sind, wurde erst kürzlich ein offenkundig eigenständiger Nervenwachstumsfaktor identifiziert, der trotzdem eine gewisse Homologe zu NGF aufweist (Leibrock et al., 1989, Nature 341: 149). Dieser als aus Gehirn stammender neurotropher Faktor ("brain-derived neurotrophic factor", BDNF) und jetzt auch als NT-2 bezeichneter Faktor wurde aus Schweinehirn gereinigt und eine Teil-Aminosäuresequenz sowohl anhand des N-terminalen Endes als auch anhand von nach Spaltungen gereinigten Fragmenten bestimmt. Die längste Sequenz, die aus mehreren überlappenden Fragmenten zusammengesetzt wurde, diente dazu, zwei Oligonukleotidsätze zu synthetisieren, die zum Primen der Amplifikation einer genomischen Schweineschablone mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet wurden. Die Nukleotidsequenz zwischen den zwei Primern wurde bestimmt und diente dazu, spezifische Primer für weitere PCRs auf einer komplementären DNA- Schablone zu synthetisieren, die durch reverse Transkription der gesamten RNA, die aus der oberen kleinen Erhebung des Schweinehirns isoliert wurde, erhalten wurde. Die so erhaltene Nukleotidsequenz enthielt einen offenen Leserahmen, der für ein Protein mit 252 Aminosäuren kodiert, beginnend mit dem ersten Methionincodon nach vier innerhalb des Rahmens befindlichen Stopcodons. Leibrock et al. mutmaßen, daß kein Grund zur Annahme besteht, daß BDNF und NGF die einzigen Mitglieder einer Familie neurotropher Proteine mit gemeinsamen strukturellen und funktionellen Eigenschaften sein sollten und die Autoren hoffen, daß diese gemeinsamen strukturellen Merkmale dazu dienen könnten, die Entdeckung anderer Mitglieder zu erleichtern.
In den letzten Jahren wurde ein weiterer neuartiger neurotropher Faktor entdeckt, der eng verwandt mit βNGF und BDNF ist; er wird als neuronaler Faktor (NF) oder Neurotrophin-3 (NT-3) bezeichnet (Hohn et al., 1990, Nature 344: 339; Maisonpierre et al., 1990, Science 247: 1446; Rosenthal et al., 1990, Neuron 4: 767). Sowohl BDNF als auch NT-3 teilen etwa 50% ihrer Aminosäuren mit βNGF. Große Mengen an mRNA, die für BDNF und NT-3 kodieren, treten im Gehirn erwachsener Nagetiere auf. βNGF, BDNF und NT-3 unterstützen das Überleben ausgewählter Populationen an sensorischen Hühnerneuronen, was auf eine unabhängige Rolle bei der Regulation des neuronalen Überlebens während der Entwicklung schließen läßt.
Das neuronale Überleben und Wachstum wird auch durch Wachstumsfaktoren für nichtneuronale Zellen beeinflußt, einschließlich dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), den Epidermis-Wachstumsfaktor und die insulinartigen Wachstumsfaktoren (Morrison et al., 1987, Science 238: 72; Walicke, 1988, J. Neurosci. 8: 2618; Bhat, 1983, Dev. Brain Res. 11: 315). Der basische FGF (bFGF) unterstützt das anfängliche Überleben und den anschließenden Faserauswuchs disassoziierter fötaler Nagetierneuronen in Kultur. Während Neuronen aus vielen Gehirnregionen betroffen sind, variiert der Anteil überlebender Neuronen unter den Gehirnregionen, wobei dies nahelegt, daß Subpopulationen von Neuronen auf bFGF reagieren (Morrison et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 7537; Walicke et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3012). Da BFGF keine Signalsequenz aufweist, die für freigesetzte Proteine typisch ist, und die im Gehirn vorhandenen bFGF-Mengen viel größer als jene von βNGF und BDNF sind, wurde die Frage gestellt, ob bFGF eine physiologische Rolle als neurotropher Faktor spielt, und vermutet, daß bFGF als "Verletzungsfaktor" wirkt, der im Falle von Zellzerstörung freigesetzt wird (Thoenen et al., 1987, Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 109:145).
Ein weiterer neurotropher Faktor mit potentieller therapeutischer Eignung für Störungen des peripheren Nervensystems, der ziliare neurotrophe Faktor (CNTF), wurde kloniert und exprimiert (Lin et al., 1989, Science, 246: 1023). CNTF, der aus Ischiasnerven erwachsener Kaninchen gereinigt wurde, wirkt auf das periphere Nervensystem ein und ist mit NGF anscheinend überhaupt nicht verwandt.
Es ist ein Ziel der Erfindung, einen vierten neurotrophen Faktor in der NGF-Familie zu identifizieren und für einen solchen Faktor kodierende Nukleinsäure zu erhalten.
Ein weiteres Ziel ist die Synthetisierung eines derartigen neuen Faktors in rekombinanter Zellkultur.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung von Varianten und modifizierten Formen eines solchen neuen Faktors.
Ein zusätzliches Ziel ist die Erzeugung von Immunogenen zum Bilden von Antikörpern sowie die Gewinnung von Antikörpern, die einen solchen neuen Faktor bzw. seine Variante oder seine modifizierte Form binden können.
Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung diagnostischer oder therapeutischer Zusammensetzungen, die einen solchen neuen Faktor bzw. seine Varianten oder modifizierten Formen umfassen, und Verfahren zur therapeutischen Behandlung.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese und andere für Fachleute auf dem Gebiet offenkundige Ziele der Erfindung werden erreicht, indem als erstes eine Nukleinsäuresequenz bereitgestellt wird, die zumindest einen Abschnitt der Kodiersequenz für einen neuartigen, aus Nerven stammenden Faktor umfaßt, der mit NGF, BDNF und NT-3 verwandt ist und nachstehend als neurotropher Faktor 4 (NT-4) bezeichnet wird.
In einem Aspekt bietet die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure, die für NT-4 kodiert. In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung einen diese Nukleinsäure umfassenden Vektor. In einem dritten Aspekt bietet die Erfindung eine diese Nukleinsäure umfassende rekombinante Wirtszelle. In einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, die NT-4 aus einer Tierspezies umfaßt und frei von kontaminierenden Polypeptiden dieser Tierspezies ist.
Die für NT-4 kodierende Nukleinsäure wird auch in Hybridisierungsassays verwendet, um Nukleinsäuren mit deutlicher Sequenzhomologie zur für NT-4 kodierenden Nukleinsäure zu identifizieren und zu isolieren.
NT-4 oder Fragmente davon (die auch durch in vitro-Verfahren synthetisiert werden können) werden (durch rekombinante Expression oder kovalente in vitro-Verfahren) an ein immunogenes Polypeptid fusioniert, das seinerseits dazu dient, ein Tier zu immunisieren, um Antikörper gegen ein NT-4-Epitop zu bilden. anti-NT-4 wird aus dem Serum immunisierter Tiere gewonnen. Alternativ dazu werden monoklonale Antikörper aus Zellen des immunisierten Tiers in herkömmlicher Weise gewonnen. Antikörper, die durch routinemäßiges Screenen identifiziert werden, binden sich an NT-4, zeigen aber mit NGF, BDNF oder NT-3 keine deutliche Kreuzreaktion. Immobilisierte anti-NT-4- Antikörper eignen sich vor allem zur (in vitro- oder in vivo-)Diagnose oder Reinigung von NT-4.
Substitutions-, Deletions- oder Insertionsmutanten von NT-4 werden durch in vitro- oder rekombinante Verfahren hergestellt und hinsichtlich Immunkreuzreaktivität mit NT-4 oder hinsichtlich antagonistischer oder agonistischer NT-4-Aktivität gescreent.
NT-4 wird auch in vitro derivatisiert, um immobilisierten NT-4 und markierten NT-4 herzustellen, und zwar insbesondere zu Diagnosezwecken von NT-4 oder seiner Antikörper bzw. zur Affinitätsreinigung von NT-4-Antikörpern.
NT-4 bzw. eine Variante oder modifizierte Form davon oder anti-NT-4-Antikörper wird insbesondere zur therapeutischen Verwendung in physiologisch annehmbaren Vehikeln formuliert. Solche Vehikel sind z.B. Formulierungen mit Langzeitfreisetzung.
In einem weiteren Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von NT-4 bzw. eine Variante oder modifizierte Form davon, umfassend das Kultivieren einer transformierten Wirtszelle und das Gewinnen des erwünschten Polypeptids aus der Wirtszellenkultur.
Es stellte sich heraus, daß NT-4 eine breite Gewebeverteilung aufweist und strukturell mit NGF, BDNF und NT-3 verwandt ist. Sein Vorhandensein im Gehirn und Muskelgewebe zeigt an, daß es sich als Therapeutikum für neurodegenerative Erkrankungen und beschädigte Nervenzellen eignet, z.B. für Nerven, die infolge eines Traumas beschädigt sind.
Daher bietet die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Behandlung einer neurodegenerativen Krankheit oder beschädigter Nervenzellen, das die Verabreichung einer wirksamen Menge an NT-4 oder einer Variante oder modifizierten Form davon an ein Säugetier umfaßt.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt die Teil-Nukleotidsequenz für das menschliche NT-4-Gen (SEQ ID NR.1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.2), einschließlich der gesamten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für reifen menschlichen NT-4. Der Pfeil zeigt an, wo die reife Sequenz beginnt, der Stern zeigt an, wo die Sequenz beginnt, um die Homologie zu anderen Mitgliedern der Familie neurotropher Faktoren zu berechnen, und das Stopcodon ist eingekreist. Die Aminosäuren sind vom N-Terminus des reifen Bereichs an numeriert.
Fig. 2 zeigt die Homologien unter den Aminosäuresequenzen von menschlichem NT-2 (SEQ ID NR.3), NT-3 (SEQ ID NR.4) und NGF (SEQ ID NR.5) sowie den reifen und teilweise den Vorläuferabschnitt von NT-4 (SEQ ID NR.6). Die Stellen der sense- (NGX- 34) und antisense- (AR1) Primerstellen auf der Sequenz sind mit vertikalen ausgefüllten Pfeilen markiert, der Start des reifen Bereichs ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Fig. 3 zeigt die Nukleotidsequenz einer für einen Teil von menschlichem NT-4β kodierenden cDNA (SEQ ID NR.7) und die abgeleitete Aminosäuresequenz dieses Teils von NT-4β (SEQ ID NR.8).
Fig. 4 zeigt die Nukleotidsequenz einer genomischen DNA, die für menschlichen NT-4γ kodiert (SEQ ID NR.9) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR.10). Der erste im Rahmen befindliche Met-Rest befindet sich an den Nukleotidpositionen 356- 358 und ist das mutmaßliche Startcodon von menschlichem NT-4γ.
Fig. 5 zeigt die Nukleotidsequenz einer genomischen DNA, die für menschlichen NT- 4Δ kodiert (SEQ ID NR. 11), und die abgeleitete Aminosäuresequenz dieses abschnitts von NT-4Δ (SEQ ID NR.12).
Fig. 6 zeigt die Homologien unter den Aminosäuresequenzen von menschlichem NT-4, NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ (SEQ ID NR.12). Der Pfeil zeigt, wo die Sequenz des reifen menschlichen NT-4 beginnt.

Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Der hierin verwendete Ausdruck "NT-4" bezieht sich auf ein Polypeptid mit der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz von reifem menschlichem NT-4, Aminosäuresequenz- Varianten eines solchen Polypeptids und Aminosäuresequenz-Varianten, umfassend ein lmmunepitop oder eine andere biologisch aktive Stelle des entsprechenden Polypeptids, sowie modifizierte Formen von reifem menschlichem NT-4 und Aminosäuresequenz- Varianten, worin das Polypeptid oder Peptid durch Substitution mit einer anderen Gruppe als einer natürlich vorkommenden Aminosäure kovalent modifiziert wurde; allerdings unter der Voraussetzung, daß diese bestimmte Aminosäuresequenz-Variante bzw. ihre modifizierte Form neuartig und gemäß dem Stand der Technik unbekannt ist und nicht NGF, BDNF oder NT-3 einer beliebigen Tierspezies oder ein beliebiges Fragment bzw. eine modifzierte Form eines solchen NCF, BDNF oder NT-3 ist.
Die NT-4-Nukleinsäure ist RNA oder DNA, die für ein NT-4-Polypeptid kodiert oder an eine derartige DNA hybridisiert, unter strengen Bedingungen stabil daran gebunden bleibt und eine Länge von mehr als etwa 10 Basen aufweist; allerdings unter der Voraussetzung, daß eine solche hybridisierende Nukleinsäure gegenüber allen Nukleinsäuren des Stands der Technik neuartig ist, einschließlich jener, die für Nukleinsäure die für NGF, BDNF oder NT-3 kodiert, kodiert bzw. komplementär zu ihr ist. Strenge Bedingungen sind jene, die (1) eine niedrige Ionenstärke und eine hohe Temperatur für das Waschen, z.B. 0,15 M NaCl/0,015 M Natriumcitrat/0,1% NaDodSO&sub4; bei 50ºC, oder (2) ein Denaturierungsmittel wie z.B. Formamid während der Hybridisierung vorsehen, z.B. 50% (vol/vol) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphat- Puffer bei pH 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42ºC.
Für NT-4 kodierende DNA wird aus Gehirngewebe-cDNA-Bibliotheken oder genomischer DNA oder durch in vitro-Synthese gewonnen. Hybridisierende Nukleinsäure wird im allgemeinen durch in vitro-Synthese erhalten. Die Identifizierung von NT-4-DNA erfolgt am besten durch Sondieren menschlicher cDNA oder genomischer Bibliotheken durch markierte Oligonukleotidsequenzen, die gemäß bekannter Kriterien aus der Sequenz von Fig. 1 ausgewählt werden, u.a. gemäß dem Kriterium, daß die Sequenzen eine ausreichende Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein sollten, sodaß falsche Positive minimiert werden. Typischerweise reicht ein ³²P-markiertes Oligonukleotid mit etwa 30 bis 50 Basen aus, besonders wenn das Oligonukleotid ein oder mehrere Codons für Methionin oder Tryptophan enthält. Isolierte Nukleinsäure ist DNA, die identifiziert und von kontaminierender Nukleinsäure getrennt ist, die für andere Polypeptide aus der Nukleinsäurequelle kodiert. Die Nukleinsäure kann zu diagnostischen Zwecken markiert werden.
Aminosäuresequenz-Varianten von NT-4 sind Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der in Fig. 1 dargestellten Sequenz von reifem menschlichem NT-4 durch die Insertion, Deletion und/oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäurereste innerhalb der Sequenz aus Fig. 1 unterscheidet. Aminosäuresequenz-Varianten sind im allgemeinen nach einem Vergleich der Aminosäuren, die an jeder Position innerhalb der Sequenzen vorhanden sind, nachdem die Sequenzen ausgerichtet wurden, um für maximale Homologie zu sorgen, zu zumindest 75% (und oft zu mehr als 85%) zu reifem menschlichem NT-4 homolog.
Aminosäuresequenz-Varianten von NT-4 können in der Natur vorkommen oder synthetisch erzeugt werden, z.B. durch Einführung geeigneter Nukleotidänderungen in eine zuvor isolierte NT-4-DNA oder durch in vitro-Synthese des erwünschten Variantenpolypeptids. Wie bereits erwähnt, umfassen solche Varianten Deletionen, Insertionen oder Substitutionen aus bzw. von einer oder mehreren Aminosäureresten innerhalb der für reifen menschlichen NT-4 in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz. Jede beliebige Kombination an Deletion, Insertion und Substitution wird gemacht, um eine Aminosäuresequenz-Variante von NT-4 zu erhalten, vorausgesetzt, daß das resultierende Variantenpolypeptid eine erwünschte Eigenschaft besitzt. Die Aminosäureänderungen können auch zu weiteren Modifizierungen von NT-4 bei der Expression in rekombinanten Wirten führen, z.B. das Einführen oder Verschieben von Glykosylierungsstellen oder das Einführen von Membranankersequenzen (gemäß PCÜ WO 89/01041, veröffentlicht am 9.Februar 1989).
Vorzugsweise wird eine Aminosäuresequenz-Variante von NT-4, die in der Natur vorkommt, einschließlich z.B. ein natürlich vorkommendes Allel, durch rekombinante Mittel hergestellt, indem eine geeignete genomische Wirtszellen-DNA oder cDNA mit der Nukleotidkodiersequenz für eine solche natürlich vorkommende Variante exprimiert wird. Andere Aminosäuresequenz-Varianten von NT-4 werden durch das Vornehmen vorbestimmter Mutationen in einer zuvor isolierten NT-4-DNA hergestellt. Es gibt zwei hauptsächliche Variablen, die man bei der Durchführung solcher vorbestimmter Mutationen bedenken muß: den Ort der Mutationsstelle und die Art der Mutation. Im allgemeinen hängt die Wahl des Orts und der Art der Mutation von der zu modifizierenden NT-4-Eigenschaft ab. Beispielsweise werden NT-4-Antagonistenkandidaten oder Superagonisten anfänglich ausgewählt, indem Aminosäurereste lokalisiert werden, die zwischen NGF, BDNF, NT-3 und NT-4 identisch oder in hohem Maße konserviert sind. Diese Reste werden dann nach der Reihe modifiziert, z.B. durch (1) Substitution mit konservativen Mitteln und dann mit radikaleren Selektionen, je nach den erzielten Ergebnissen, (2) Deletion des Zielrests oder (3) Insertion von Resten der gleichen oder einer unterschiedlichen Klasse neben der lokalisierten Stelle, oder Kombinationen der Optionen 1-3.
Ein nützliches Verfahren ist das sogenannte "Ala-Scannen". Hier wird ein Aminosäurerest oder eine Gruppe von Zielresten identifiziert und durch Alanin oder Polyalanin substituiert. Jene Domänen, die funktionale Empfindlichkeit gegenüber den Alanin-Substitutionen aufweisen, werden dann verfeinert, indem weitere oder andere Varianten an oder für die Stellen der Alanin-Substitution eingeführt werden.
Natürlich sind solche Variationen, die z.B. NT-4 zu NGF, BDNF oder NT-3 umwandeln, im Schutzbereich der Erfindung nicht enthalten; das gleiche trifft auch auf beliebige andere NT-4-Varianten oder Polypeptidsequenzen zu, die weder neuartig noch gemäß dem Stand der Technik unbekannt sind. Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenz-Variation vorbestimmt ist, muß die Art der Mutation an sich nicht vorbestimmt sein. Z.B. zur Optimierung der Leistung einer Mutation an einer konkreten Stelle erfolgt das Ala-Scannen oder die Zufallsmutagenese am Zielcodon oder -bereich, und die exprimierten NT-4-Varianten werden hinsichtlich der optimalen Kombination der erwünschten Aktivität gescreent.
Aminosäuresequenz-Deletionen reichen im allgemeinen von etwa 1 bis 30 Resten, noch bevorzugter von etwa 1 bis 10 Resten, und sind typischerweise angrenzend. Deletionen können in Bereichen niedriger Homologie unter BDNF, NGF, NT-3 und NT-4 durchgeführt werden, um die Aktivität von NT-4 zu modifizieren. Es ist wahrscheinlicher, daß Deletionen aus NT-4 in Bereichen beträchtlicher Homologie mit BDNF, NT-3 und NGF die biologische Aktivität von NT-4 deutlicher modifizieren. Die Anzahl aufeinanderfolgender Deletionen wird so ausgewählt, daß die tertiäre Struktur von NT-4 in der betroffenen Domäne bewahrt wird, z.B. β-Faltblattstruktur oder α- Helix.
Aminosäuresequenz-Insertionen umfassen amino- und/oder carboxylterminale Fusionen, deren Länge von einem Rest bis zu Polypeptiden mit 1000 oder mehr Resten reicht, sowie Insertionen innerhalb der Sequenz von einzelnen oder mehreren Aminosäureresten. Die Insertionen innerhalb der Sequenz (d.h. Insertionenn innerhalb der reifen NT-4-Sequenz) können im allgemeinen von etwa 1 bis 10, vorzugsweise von 1 bis 5, am bevorzugtesten von 1 bis 3, Resten reichen. Ein Beispiel einer terminalen Insertion ist die Fusion einer heterologen N-terminalen Signalsequenz an den N- Terminus des NT-4-Moleküls, um die Sekretion von reifem NT-4 aus rekombinanten Wirten zu erleichtern. Solche Signale sind im allgemeinen zur beabsichtigten Wirtszelle homolog und enthalten STII oder lpp für E.coli, α-Faktor für Hefe und virale Signale wie z.B. Herpes-gD für Säugetierzellen. Andere Insertionen umfassen die Fusion eines immunogenen Polypeptids, z.B. eines bakteriellen oder Hefeproteins, an die N- oder C- Termini von NT-4.
Die dritte Gruppe von Varianten sind jene, worin zumindest ein Aminosäurerest in NT- 4, und vorzugsweise nur einer, entfernt und ein anderer Rest an seiner Stelle eingefügt wurde. Ein Beispiel ist die Ersetzung von Arginin und Lysin durch andere Aminosäuren, um den NT-4 gegenüber Proteolyse durch Serinproteasen resistent zu machen, wodurch eine Variante von NT-4 gebildet wird, die stabiler ist. Die interessantesten Stellen für die Substitutionsmutagenese sind Stellen, wo die in BDNF, NGF, NT-3 und NT-4 vorgefundenen Aminosäuren in bezug auf die Sperrigkeit der Seitenkette, Ladung oder Hydrophobie deutlich unterschiedlich sind, wo aber auch ein hohes Maß an Homologie an der ausgewählten Stelle innerhalb verschiedener Tieranaloge von NGF, NT-3 und BDNF festzustellen ist (z.B. unter allen Tier-NGFs, allen Tier-NT-3s und allen BDNFs). Diese Analyse ergibt vor allem Reste, die an der Differenzierung der Aktivität der trophischen Faktoren beteiligt sein können, und daher können Varianten an diesen Stellen solche Aktivitäten bewirken. Beispiele für solche Stellen in reifem menschlichem NT-4, numeriert vom N-terminalen Ende, sowie Beispiele für Substitutionen sind NT-4 (G78TK, H, Q oder R) (SEQ ID NR. 13, 14, 15 bzw. 16) und NT-4 (R85TE, F, P, Y oder W) (SEQ ID NR. 17, 18, 19, 20 bzw. 21). Andere interessante Stellen sind jene, an denen die Reste unter den BDNF, NGF, NT-3 und NT-4 aller Tierspezies identisch sind, wobei dieser Konformationsgrad auf die Bedeutung bei der Erzielung einer biologischen Aktivität, die allen vier Faktoren gemeinsam ist, hinweist. Diese Stellen, insbesondere jene, die in eine Sequenz von zumindest 3 anderen identisch konservierten Stellen fallen, werden in relativ konservativer Weise substituiert. Solche konservativen Substitutionen sind in Tabelle 1 unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" aufgelistet. Wenn solche Substitutionen zu einer Änderung der biologischen Aktivität führen, werden größere Änderungen, die in Tabelle 1 als "Substitutionsbeispiele" bezeichnet oder wie weiter unten in bezug auf die nachstehenden Aminosäureklassen beschrieben werden, eingeführt und die Produkte gescreent. Tabelle 1
Stellen, die für konservative Substitutionen besonders geeignet sind, umfassen (numeriert vom N-Terminus des reifen menschlichen NT-4) R11, G12, E13, V16, D18, W23, V24, D26, V40, L41, Q54, Y55, F56, E58, T59, G77, R79, G80, H85, W86, A99, L100, T101, W110, R111, W112, I113, R114, I115, D116 und A118. Cysteinreste, die nicht an der Beibehaltung der richtigen Konformation von NT-4 beteiligt sind, können auch substituiert werden (im allgemeinen mit Serin), um die oxidative Stabilität des Moleküls zu verbessern und fehlerhafte Vernetzung zu verhindern. Andere als in diesem Absatz angeführte Stellen eignen sich für die oben allgemein beschriebenen Deletions- oder Insertionsuntersuchungen.
Deutliche Modfifikationen bezüglich der funktionalen oder immunologischen Identität werden durch Auswahl von Substitutionen erzielt, die sich in ihrem Einfluß auf die Beibehaltung (a) der Struktur des Polypeptidrückgrats im Bereich der Substitution, z.B. als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) der Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) der Masse der Seitenkette signifikant voneinander unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste werden nach gemeinsamen Seitenketteneigenschaften in Gruppen eingeteilt:
(1) hydrophob: Norleucin, met, ala, val, leu, ile;
(2) neutral-hydrophil: cys, ser, thr;
(3) sauer: asp, glu;
(4) basisch: asn, gln, his, lys, arg;
(5) Reste, die die Kettenausrichtung beeinflussen: gly, pro; und
(6) aromatisch: trp, tyr, phe.
Nichtkonservative Substitutionen führen zum Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen durch ein anderes. Solche substituierten Reste können auch in die oben angeführten konservativen Substitutionsstellen oder (noch bevorzugter) in die verbleibenden (nichtkonservierten) Stellen eingeführt werden.
Beispiele von NT-4-Varianten sind: NT-4(E67TS oder T) (SEQ ID NR.22 bzw. 23) (fügt eine N-gebundene Glykosylierungsstelle hinzu); NT-4-(R83-Q94) (SEQ ID NR.24); NT- 4(G1-C61) (SEQ ID NR.25 (so dargestellte Varianten sind Fragmente, die die angeführten Reste enthalten);
(auf diese Weise dargestellte Varianten umfassen auch Deletionen des angeführten Restbereichs);
Dazu gehört auch NT-4, worin Position 70 mit einem anderen Aminosäurerest als G, E, D oder P; Position 71 mit einem anderen Aminosäurerest als A, P oder M; und/oder Position 83 mit einem anderen Aminosäurerest als R, D, S oder K substituiert ist; sowie zyklisierte NT-4-Fragmente, einschließlich zyklischer Polypeptide, umfassend die Sequenzen
Innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung befinden sich auch BDNF, NT-3 und NGF- Aminosäuresequenz-Varianten mit analogen Strukturen zu den hierin angeführten NT-4- Varianten. Beispielsweise sind die analogen Positionen von NGF, NT-3 und BDNF in Analogie zu der gleichen Mutation bei Position 70 von NT-4 mit einem anderen Rest als D, E bzw. P substituiert.
DNA, die für Aminsoäuresequenz-Varianten von NT-4 kodiert, kann aus einer natürlichen Quelle isoliert werden (im Fall von natürlich vorkommenden Aminosäuresequenz-Varianten), oder sie kann durch stellenspezifische Mutagenese von DNA hergestellt werden, die für eine früher gebildete Variante oder eine Nicht- Variantenversion von NT-4 kodiert. Stellenspezifische Mutagenese ermöglicht die Herstellung von NT-4-Varianten durch die Verwendung spezifischer Oligonukleotidsequenzen, die für die DNA-Sequenzen der erwünschten Mutation sowie für eine ausreichende Anzahl angrenzender Nukleotide kodieren, um eine Primersequenz ausreichender Größe und Sequenzkomplexität bereitzustellen, um ein stabiles Duplex auf beiden Seiten der zu überbrückenden Deletionsschnittstelle zu bilden. Typischerweise ist ein Primer mit einer Länge von etwa 20 bis 25 Nukleotiden vorzuziehen, wobei etwa 5 bis 10 Reste auf beiden Seiten der Schnittstelle der Sequenz geändert werden. Im allgemeinen ist das Verfahren der stellenspezifischen Mutagenese auf dem Gebiet bekannt, wie die z.B. durch Veröffentlichungen z.B. von Adelman et al., 1983, DNA 2: 183 zum Ausdruck kommt.
Es ist zu beachten, daß das Verfahren der stellenspezifischen Mutagenese typischerweise einen Phagenvektor verwendet, der sowohl in einzel- als auch in doppelstrangiger Form existiert. Typische, für die stellengerichtete Mutagenese geeignete Vektoren sind u.a. Vektoren wie der M13-Phage, wie dies z.B. durch Messing et al., 1981, Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA (A. Walton, Hg., Elsevier, Amsterdam) geoffenbart ist. Diese Phagen sind im Handel erhältlich und ihre Verwendung allgemein für Fachleute auf dem Gebiet bekannt. Auch Plasmidvektoren, die einen einzelstrangigen Phagen-Replikationsursprung enthalten (Veira et al., 1987, Meth. Enzymol. 153:3), können dazu dienen, einzelstrangige DNA zu erhalten. Alternativ dazu werden Nukleotidsubstitutionen durch in vitro-Synthetisieren des geeigneten DNA-Fragments und dessen Amplifizieren durch Polymerase- Kettenreaktionsverfahren (PCR), die auf dem Gebiet an sich bekannt sind, eingeführt.
Im allgemeinen wird die stellengerichtete Mutagenese gemäß der vorliegenden Erfindung zunächst durch Erhalten eines einstrangigen Vektors durchgeführt, der in seiner Sequenz eine DNA-Sequenz enthält, die für das relevante Protein kodiert. Ein Oligonukleotid-Primer, der die erwünschte mutierte Sequenz trägt, wird im allgemeinen synthetisch gebildet, z.B. durch das Verfahren nach Crea et al., 1978, Proc. Nat. Acad. Sci. 75: 5765. Dieser Primer wird dann mit dem einzelstrangigen, die Proteinsequenz enthaltenden Vektor anneliert und DNA-polymerisierenden Enzymen wie z.B. dem E.coli-Polymerase I-Klenow-Fragment ausgesetzt, um die Synthese des mutationstragenden Strangs abzuschließen. Somit wird ein Heteroduplex geschaffen, in dem ein Strang für die ursprüngliche nichtmutierte Sequenz kodiert und der zweite Strang die erwünschte Mutation trägt. Dieser Heteroduplexvektor wird dann zum Transformieren geeigneter Zellen, z.B. der JM101-Zellen, verwendet, und Klone werden ausgewählt, die rekombinante Vektoren enthalten, die die mutierte Sequenzanordnung tragen.
Nach der Auswahl eines solchen Klons kann der mutierte Bereich entfernt und zur Proteinproduktin in einen geeigneten Vektor eingebracht werden, im allgemeinen einen Expressionsvektor der Art, die typischerweise bei der Transformation eines geeigneten Wirts zum Einsatz kommt.
Man erwartet nicht, daß die meisten Deletionen und Insertionen - und insbesondere Substitutionen - von Aminosäuren in NT-4 radikale Änderungen seiner Eigenschaften bewirken und einzelne Substitutionen bewahren zumindest ein Immunepitop im NT-4- Polypeptid.
Da es oft schwierig ist, im vorhinein die Eigenschaften eines Varianten-NT4 zu bestimmen, ist zu beachten, daß einiges Screenen erforderlich ist, um eine Variante mit einer erwünschten Eigenschaft zu identifizieren. Man kann hinsichtlich verstärkter trophischer Aktivität, Spezifizität des differentiellen neuronalen Zelltyps, Stabilität in rekombinanter Zellkultur oder in Plasma (z.B. gegen proteolytische Spaltung), Besitz antagonistischer Aktivität, oxidativer Stabilität, der Fähigkeit, in hohen Ausbeuten sekretiert zu werden, u. dgl. screenen. Beispielsweise wird eine Änderung der immunologischen Beschaffenheit des NT-4-Polypeptids, z.B. die Affinität für einen bestimmter Antikörper, durch einen Immunassay des kompetitiven Typs gemessen. Die Änderungen bezüglich der Verstärkung oder Unterdrückung neutrotrophischer Aktivitäten durch die Mutantenkandidaten werden durch Assays über den Dendritenauswuchs oder das Überleben von Explantatzellen gemessen. Modifizikationen solcher Proteineigenschaften wie z.B. der Redox- oder thermischen Stabilität, Hydrophobie, Empfindlichkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder die Neigung zur Aggregatbildung mit Trägern oder zu Multimeren werden durch auf dem Gebiet allgemein bekannte Verfahren untersucht.
Trypsin- oder andere Protease-Spaltungsstellen werden durch Untersuchung der Aminosäurekodiersequenz auf gepaarte basische Aminosäurereste, z.B. Kombinationen angrenzender Arginyl- und Lysinylreste, identifiziert. Diese werden gegenüber Protease inaktiv gemacht, indem einer der Reste durch einen anderen Rest substituiert wird, vorzugsweise ein basischer Rest wie z.B. Glutamin oder ein hydrophober Rest wie z.B. Serin; indem einer oder beide basischen Reste gelöscht werden; indem ein Prolylrest unmittelbar nach dem letzten basischen Rest eingefügt wird; oder indem ein anderer Rest zwischen den zwei basischen Resten eingefügt wird.
Eine Aminosäuresequenz-Variante von NT-4 wird typischerweise durch rekombinante Mittel erzeugt, d.h. durch Expression von für den Varianten-NT-4 kodierender Nukleinsäure in rekombinanter Zellkultur, und gegebenenfalls durch Reinigung des Variantenpolypeptids aus der Zellkultur, z.B. durch einen Bioassay auf die Aktivität der Variante oder durch Adsorption an eine Immunaffinitätssäule mit polyklonalen Kaninchen-anti-NT-4-Antikörpern (die sich an zumindest ein Immunepitop der Variante binden, die auch in nativem NT-4 vorhanden ist). Kleine Peptidfragmente in der Größenordnung von 40 Resten oder weniger werden günstigerweise durch in vitro- Verfahren erzeugt.
Sobald man für NT-4 kodierende DNA gewonnen hat, wird sie anschließend typischerweise in einen replizierbaren Vektor ligiert, um weiter kloniert oder exprimiert zu werden. Vektoren erfüllen in Zusammenwirkung mit kompatiblen Wirtszellen (einem Wirt-Vektor-System) zwei Funktionen. Eine Funktion ist die Erleichterung des Klonierens der DNA, die für den NT-4 kodiert, d.h. die Herstellung brauchbarer Mengen an Nukleinsäure. Die andere Funktion ist die Lenkung der Expression von NT- 4. Eine oder beide dieser Funktinen werden durch das Vektor-Wirt-System erfüllt. Die Vektoren enthalten je nach Funktion, die sie zu erfüllen haben, sowie je nach Wirtszelle, die zum Klonieren oder Exprimieren ausgewählt wird, unterschiedliche Komponenten.
Jeder Vektor enthält DNA, die - wie oben beschrieben - für NT-4 kodiert. Typischerweise ist dies DNA, die für den NT-4 in reifer Form kodiert, wobei diese am Aminoterminus mit einem Sekretionssignal verbunden ist. Das Sekretionssignal ist vorzugsweise die NT-4-Präsequenz, die normalerweise die Sekretion von NT-4 aus menschlichen Zellen in vivo lenkt. Geeignete Sekretionssignale enthalten jedoch auch Signale aus anderen Tier-NT-4, Signale aus NGF, NT-2 oder NT-3, virale Signale oder Signale aus sekretierten Polypeptiden der gleichen oder einer verwandten Spezies.
Wenn die Signalsequenz aus einem anderen neurotrophischen Polypeptid stammt, kann sie die in Fig. 2 dargestellte Vorläufersequenz sein, die sich vom einleitenden Methionin- (M) Rest von NT-2, NT-3 oder NGF bis zum Arginin- (R) Rest knapp vor der ersten Aminosäure des reifen Proteins erstreckt, oder eine Konsens- bzw. Kombinationssequenz aus zwei oder mehreren dieser Vorläufer sein, wobei homologe Bereiche der Vorläufer berücksichtigt werden. Die DNA für einen solchen Vorläuferbereich ist im Leserahmen an für den reifen NT-4 kodierende DNA ligiert.
Expressions- und Kloniervektoren enthalten eine Nukleotidsequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren selektierten Wirtszellen zu replizieren. Im allgemeinen ist in Kloniervektoren diese Sequenz eine, die es dem Vektor ermöglicht, sich unabhängig von den Wirtschromosomen zu replizieren, und enhält Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind aus einer Vielzahl an Bakterien, Hefe und Viren allgemein bekannt. Der Replikationsursprung aus dem allgemein bekannten Plasmid pBR322 eignet sich für die meisten gramnegativen Bakterien, der 2 µ Plasmidursprung für Hefe und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) eignen sich zum Klonieren von Vektoren in Säugetierzellen. Ursprünge sind für Säugetier-Expressionsvektoren nicht erforderlich (der SV40-Ursprung kann typischerweise nur deswegen verwendet werden, weil er den frühen Promotor enthält). Die meisten Expressionsvektoren sind "Shuttle"- Vektoren, d.h. sie sind zur Replikation in zumindest einer Klsse von Organismen fähig, können aber zur Expression in einen weiteren Organismus transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E.coli kloniert und dann der gleiche Vektor zur Expression in Hefe- oder Säugetierzellen transfiziert, obwohl er sich nicht unabhängig vom Wirtszellenchromosom replizieren kann.
DNA wird auch durch Insertion in das Wirtsgenom kloniert. Dies erfolgt günstigerweise mit Bazillusspezies, z.B. indem eine DNA-Sequenz, die komplementär zu einer in genomischer Bazillus-DNA vorgefundener DNA ist, in den Vektor eingeführt wird. Die Transfektion von Bazillus mit diesem Vektor führt zur homologen Rekombination mit dem Genom und Insertion von NT-4-DNA. Die Gewinnung genomischer, für NT-4 kodierender DNA ist jedoch komplexer als jene eines exogen replizierten Vektors, da eine Restriktionsenzym-Spaltung notwendig ist, um die NT-4-DNA auszuschneiden.
Expressions- und Kloniervektoren sollten eine Selektionsgen enthalten, das man auch als selektierbaren Marker bezeichnet. Typischerweise handelt es sich dabei um ein Gen, das für ein Protein kodiert, das für das Überleben oder das Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle erforderlich ist. Das Vorhandensein dieses Gens stellt sicher, daß jede beliebige Wirtszelle, die den Vektor löscht, keinen Vorteil hinsichtlich des Wachstums oder der Reproduktion gegenüber transformierten Wirten erzielt. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, (b) auxotrophische Mängel ausgleichen oder (c) entscheidende Nährstoffe bereitstellen, die aus komplexen Medien nicht erhältlich sind, z.B. das Gen, das für D- Alanin-Racemase für Bazillen kodiert.
Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39; Kingsman et al., 1979, Gene 7: 141; Tschemper et al., 1980, Gene 10: 157). Das trp1-Gen bietet einen Selektionsmarker für einen Hefe-Mutantenstamm, der nicht in Tryptophan wachsen kann, z.B. ATCC Nr.44076 oder PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Das Vorhandensein der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszellengenom sorgt dann für eine wirkungsvolle Umgebung zum Nachweis von Transformation durch das Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. Ebenso werden Hefestämme, denen Leu2 fehlt (ATCC 20.622 oder 38.626), durch bekannte Plasmide, die das Leu2-Gen tragen, komplementiert.
Beispiele für bekannte selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat- Reductase (DHFR) oder Thymidin-Kinase. Solche Marker ermöglichen die Identifizierung von Zellen, die die Fähigkeit besitzen, die NT-4-Nukleinsäure aufzunehmen. Die Säugetier-Zelltransformanten werden unter Selektionsdruck gestellt, dem einzig und allein die Transformanten standhalten können, da sie den Marker aufgenommen haben. Der Selektionsdruck wird ausgeübt, indem die Transformanten unter Bedingungen kultiviert werden, bei denen die Konzentration des Selektionsmittels im Medium nach und nach geändert wird, was zur Amplifikation sowohl des Selektionsgens als auch der für NT-4 kodierenden DNA führt. Die Amplifikation ist der Vorgang, durch den Gene, für die eine größerer Bedarf bei der Herstellung eines für das Wachstum entscheidenden Proteins besteht, tandemartig mehrfach innerhalb der Chromosome aufeinanderfolgender Generationen rekombinanter Zellen eingebaut werden. Steigende Mengen an NT-4 werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zunächst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält, identifiziert. Eine geeignete Wirtszelle ist in diesem Fall die chinesische Hamstereierstock- (CHO) Zellinie, der DHFR-Aktivität fehlt und nach dem von Urlaub und Chasin, 1980, Pro. Natl. Acad. Sci. 77: 4216 beschriebenen Verfahren gebildet und vermehrt wurde. Eine besonders nützliche DHFR ist eine Mutanten-DHFR, die gegenüber Mtx hochresistent ist (EP- 117.060A). Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Mtx-Mengen ausgesetzt. Dies führt zur Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehrerer Kopien anderer DNA, die die Expressionsvektoren enthalten, z.B. die für NT-4 kodierende DNA. Alternativ dazu können Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor transformiert wurden, der für NT-4, DHFR-Protein und Aminoglycosid 3'- Phosphotransferase (APH) kodierende DNA-Sequenzen umfaßt, durch das Zellwachstum in einem Medium, das ein Aminoglykosid-Antibiotikum wie z.B. Kanamycin oder Neomycin oder G418 enthält, ausgewählt werden. Da eukaryotische Zellen normalerweise keine endogene APH-Aktivität exprimieren können Gene, die für APH-Protein kodieren (üblicherweise als neor-Gene bezeichnet) als dominante selektierbare Marker in einem breiten Bereich eukaryotischer Wirtszellen verwendet werden, wodurch man Zellen, die durch den Vektor transformiert werden, leicht identifizieren kann.
Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Anpassung an die Synthese von NT-4 in rekombinanter Wirbeltier-Zellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., 1981, Nature 293: 620; Mantei et al., 1979, Nature 281: 40; und Levinson et al., EP- 117.060A und 11 7.058A beschrieben. Ein besonders nützliches Plasmid zur Säugetier- Zellkulturexpression von NT-4 ist pRK5 (EP-307.247) oder pSVI6B (PCT-Veröffentl.Nr, WO90/08291, veröffentlicht am 13.6.1991).
Expressionsvektoren sollten im Gegensatz zu Kloniervektoren einen Promotor enthalten, der durch den Wirtsorganismus erkannt wird und operabel mit der NT-4-Nukleinsäure verbunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die sich stromaufwärts vom Startcodon eines Strukturgens (im allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1000 bp) befinden und die Transkription und Translation von Nukleinsäure, die unter ihrer Kontrolle steht, regulieren. Sie fallen typischerweise in zwei Klassen, induzierbare und konstitutive Promotoren. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Transkriptionsmengen aus unter ihrer Kontrolle stehender DNA als Reaktion auf bestimmte Änderungen der Kulturbedingungen, z.B. die Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffs oder ein Temperaturwechsel, initiieren. Derzeit sind viele Promotoren bekannt, die durch eine Vielzahl potentieller Wirtszellen erkannt werden. Diese Promotoren werden operabel mit für NT-4 kodierender DNA verbunden, indem sie durch Restriktionsenzymspaltung aus ihrem Ursprungsgen entfernt werden, gefolgt von Insertion 5' vom Startcodon für NT-4. Dies bedeutet nicht, daß der genomische NT-4- Promotor ungeeignet ist. Heterologe Promotoren führen jedoch im allgemeinen zu einer größeren Transkription und höheren Ausbeuten exprimierten NT-4.
Nukleinsäure ist operabel verbunden, wenn sie in eine funktionale Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz gesetzt ist. Beispielsweise wird DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel mit DNA für ein Polypeptid verbunden, wenn sie als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer wird operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflußt; oder eine Ribosomenbindestelle ist operabel mit einer Kodiersequenz verbunden, wenn sie so positioniert ist, daß die Translation erleichtert wird. Im allgemeinen bedeutet "operabel verbunden", daß die verbundenen DNA-Sequenzen angrenzend und - im Falle eines Sekretionsleaders - angrenzend und im Leserahmen angeordnet sind. Das Verbinden erfolgt durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen. Wenn solche Stellen nicht existieren, werden gemäß herkömmlichen Verfahren synthetische Oligonukleotidadaptoren oder -linker verwendet.
Promotoren, die sich zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten eignen, sind u.a. die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., 1978, Nature 275: 615; Goeddel et al., 1979, Nature 281: 544), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp) Promotorsystem (Goeddel, 1980, Nucleic Acids Res. 8: 4057 und EPO-36.776) und Hybridpromotoren wie z.B. der tac-Promotor (H. de Boer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21). Andere bekannte bakterielle Promotoren sind jedoch auch geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen wurden bereits veröffentlicht, wodurch Fachleute auf dem Gebiet in der Lage sind, sie operabel an für NT-4 kodierende DNA (Siebenlist et al., 1980, Cell 20: 269) unter Einsatz von Linkern oder Adaptoren, um erforderliche Restriktionsstellen zu bieten, zu ligieren. Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.) Sequenz, die operabel mit der für NT-4 kodierenden DNA verbunden ist.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 2073) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; Holland, 1978, Biochemistry 17: 4900, z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Isomerase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglukose- Isomerase und Glukokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der durch Wachstumsbedingungen regulierten Transkription sind, sind die Promotorbereiche für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoff-Stoffwechsel assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactose- Verwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung bei der Hefeexpression werden ausführlicher in R. Hitzeman et al., EP-73.657A beschrieben. Hefeenhancer werden ebenfalls günstigerweise mit Hefepromotoren verwendet.
Die Transkription von für NT-4 kodierender DNA in Säugetier-Wirtszellen wird durch Promotoren reguliert, die aus den Genomen von Viren, wie z.B. aus Polyoma, Cytomegalievirus, Adenovirus, Retroviren, Hepatitis B-Virus und am bevorzugtesten aus Simianvirus 40 (SV40), bzw. aus heterologen Säugetierpromotoren wie z.B. dem Actinpromotor, erhalten werden. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden günstigerweise als SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält (Fiers et al., 1978, Nature, 273: 113). Natürlich eignen sich auch Promotoren aus der Wirtszelle oder verwandten Spezies.
Die Transkription von für NT-4 kodierender DNA in Säugetierzellen kann durch Insertion einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert werden. Ein Enhancer ist eine Nukleotidsequenz (üblicherweise von etwa 10-300 bp, die auf einen Promotor einwirkt, um seine Transkription in einer Weise zu steigern, die relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig ist. Viele Enhancersequenzen sind aus Säugetier-Genen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man aber einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus. Beispiele sind der SV40- Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), der frühe Cytomegalovirus-Promotorenhancer, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Der Enhancer kann an einer Position 5' oder 3' von der für NT-4 kodierenden Sequenz in den Vektor gespleißt werden, doch er befindet sich vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen verwendet werden (Hefe, Pilze, Insekten, Pflanzen, Tiere, menschliche oder kernhältige Zellen aus anderen multizellularen Organismen) enthalten auch Sequenzen, die für die Transkriptionstermination und für die Stabilisierung der mRNA notwendig sind. Solche Sequenzen stammen üblicherweise aus den untranslatierten 5'- und manchmal auch aus den untranslatierten 3'-Bereichen eukaroytischer oder viraler DNAs oder cDNAs. Diese Bereiche enthalten Bereiche, die als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Abschnitt der für NT-4 kodierenden MRNA transkribiert werden. Die untranslatierten 3'-Bereiche enthalten auch Transkriptionsterminationsstellen.
Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der vorliegenden Vektoren sind die oben beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten sind z.B. gramnegative oder grampositive Organismen wie E.coli oder Bazillen. Ein bevorzugter Klonierwirt ist E.coli 294 (ATCC 31.446), obwohl auch andere gramnegative oder grampositive Prokaryoten wie E.coli B, E.coli X1776 (ATCC 31.537), E.coli W3110 (ATCC 27.325), Pseudomonas-Spezies oder Serratia marcescens geeignet sind.
Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie z.B. filamentöse Pilze oder Hefe geeignete Wirte für für NT-4 kodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae bzw. herkömmliche Backhefe ist der am häufigsten verwendete niedere eukaryotische Wirtsmikroorganismus. Einige andere Gattungen, Spezies oder Stämme stehen jedoch auch zur Verfügung und sind hierin geeignet.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von NT-4 stammen aus multizellulären Organismen. Solche Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Im Prinzip ist jede höhere eukaryotische Zellkultur brauchbar, ob sie aus Wirbeltier- oder Wirbellosenkultur stammt, doch Zellen aus Säugetieren wie z.B. dem Menschen sind vorzuziehen. Die Vermehrung solcher Zellen in Kultur ist an sich allgemein bekannt (Tissue Culture, 1973, Kruse und Patterson, Hg., Academic Press, New York). Beispiele geeigneter Säugetier-Wirtszelllinien sind VERO- und HeLa-Zellen, chinesische Hamstereierstock-Zellinien, die W138-, BHK-, COS-7-, MDCK-Zellinien und die menschliche embryonale Nierenzellinie 293.
Wirtszellen werden mit den oben beschriebenen Expressions- oder Kloniervektoren transformiert und in herkömmlichen Nährstoffmedien, die so modifiziert sind, wie es für das Induzieren von Promotoren oder Selektieren von Transformanten, die amplifizierte Gene enthalten, geeignet ist, kultiviert. Die Kulturbedingungen, z.B. Temperatur, pH- Wert u.dgl., sind günstigerweise die gleichen wie bei der Wirtszelle, die zum Klonieren oder Exprimieren ausgewählt wird, wie dies der Fall sein kann, und werden für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig sein.
NT-4 wird vorzugsweise als sekretiertes Protein aus Kulturmedium gewonnen, obwohl er bei direkter Expression ohne Sekretionssignal auch aus Wirtszell-Lysaten gewonnen werden kann. Wenn NT-4 in einer rekombinanten Zelle aus nichtmenschlichem Ursprung exprimiert wird, ist er somit vollkommen frei von Proteinen menschlichen Ursprungs. Es ist jedoch erforderlich, NT-4 von rekombinanten Zellproteinen zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im wesentlichen als Protein homogen sind. Als erster Schritt wird Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um teilchenförmige Zellbruchstücke zu entfernen. NT-4 wird anschließend von kontaminierenden löslichen Proteinen z.B. durch Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Ethanolfällung, reversed-phase-HPLC; Chromatographie auf Silika- oder auf einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussieren; SDS-PAGE; Ammoniumsulfat-Fällung; oder Celelektrophorese unter Verwendung von z.B. Sephadex G-75 gereinigt. NT-4-Varianten, in denen Reste bezogen auf nativen NT-4 einer Deletion, Insertion oder Substitution unterzogen wurden, werden in gleicher Weise wie nativer NT-4 gewonnen, wobei wesentliche Veränderungen der Eigenschaften, die durch die Variation zustandekommen, berücksichtigt werden. Die Herstellung einer NT-4-Fusion mit einem anderen Protein, z.B. einem bakteriellen oder viralen Antigen, erleichtert die Reinigung, da eine Immunaffinitätssäule, die Antikörper gegen das Antigen enthält, verwendet werden kann, um das Fusionsprotein zu adsorbieren. Ein Protease-Inhibitor wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann dazu verwendet werden, den proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, wobei Antibiotika enthalten sein können, um das Wachstum zufällig vorhandener Kontaminanten zu verhindern. Es ist für Fachleute auf dem Gebiet offenkundig, daß Reinigungsverfahren, die sich für nativen NT-4 eignen, möglicherweise einer Modifizierung bedürfen, um Änderungen der Beschaffenheit von NT-4 oder seiner Varianten nach der Expression in rekombinanter Zellkultur zu berücksichtigen.
Peptidfragmente von NT-4 und modifizierte Formen von NT-4 sind auch im Schutzbereich der Erfindung enthalten. Peptidfragmente mit bis zu etwa 40 Aminoresten können günstigerweise durch in vitro-Synthese hergestellt werden.
Kovalente Modifizierungen werden durch Umsetzen von Zielaminosäureresten eines NT-4-Polypeptids oder Peptidfragments mit einem organischen Derivatisierungsmittel, das mit ausgewählten Seitenketten der N- oder C-terminalen Reste reagieren kann, hergestellt.
Cysteinyl reste werden am gebräuchlichsten mit α-Halogenacetaten (und entsprechen den Ammen) wie z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Reaktion mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidazolyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleimiden, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa- 1,3-diazol derivatisiert.
Histidylreste werden durch Reaktion mit Diethylpyrocarbonat bei einem pH-Wert von 5,5-7,0 derivatisiert, da dieses Mittel für die Histidyl-Seitenkette relativ spezifisch ist. Parabromphenacylbromid ist ebenfalls geeignet; die Reaktion erfolgt vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei einem pH-Wert von 6,0.
Lysinyl- und aminoterminale Reste werden mit Bernstein- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Die Derivatisierung mit diesen Mitteln bewirkt die Umkehr der Ladung der Lysinylreste. Andere geeignete Reagentien zum Derivatisieren von α-aminohältigen Resten sind z.B. Imidoester wie Methylpicolinimidat; Pyridoxalphosphat, Pyridoxal; Chlorborhydrid; Trinitrobenzolsulfonsäure; O-Methylisoharnstoff; 2,4-Pentandion; und die durch Transaminase katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
Arginylreste werden durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagentien modifiziert, z.B. Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Die Derivatisierung von Argininresten erfordert es, daß die Reaktion aufgrund des hohen pKa der funktionalen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen stattfindet. Außerdem können diese Reagentien mit den Lysingruppen sowie der &epsi;-Aminogruppe des Arginin reagieren.
Die spezifische Modifikation der Tyrosylreste kann unter besonderer Berücksichtigung der Einführung spektraler Marker in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazonium-Verbindungen oder Tetranitromethan erfolgen. Am häufigsten werden N- Acetylimidizol und Tetranitromethan dazu verwendet, O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3- Nitroderivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von ¹²&sup5;I oder ¹³¹I odiert, um markierte Proteine zur Verwendung bei Radioimmunassays herzustellen, wobei das oben beschriebene Chloramin T-Verfahren geeignet ist.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R') wie z.B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4- ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonium-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid selektiv modifiziert. Weiters werden Aspartyl- und Glutamylreste durch Reaktion mit Ammoniumionen zu Asparaginyl- und Glutaminylresten umgewandelt.
Die Derivatisierung mit bifunktionalen Mitteln eignet sich zum Vernetzen von NT-4 mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung beim Verfahren zum Reinigen von anti-NT-4-Antikörpern und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel sind z.B. 1,1-bis(Diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N- Hydroxysuccinimidester, z.B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionale Imidoester, einschließlich Disuccinimidylestern wie z.B. 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat), und bifunktionale Maleimide wie z.B. bis-N-Maleimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie z.B. Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben lichtaktivierbare Zwischenprodukte, die Vernetzungen in der Gegenwart von Licht bilden können. Alternativ dazu werden wasserunlösliche Matrizen wie z.B. durch Bromcyan aktivierte Kohlehydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patentschriften 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; und 4.330.440 beschriebenen wurden, zur Proteinimmobilisierung verwendet.
Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu korrespondierenden Glutamyl- und Aspartylresten deamidiert. Alternativ dazu werden diese Reste unter schwach sauren Bedingungen deamidiert. Beide Formen dieser Reste sind im Schutzbereich dieser Erfindung enthalten.
Andere Modifikationen sind z.B. die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, S.79-86), die Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxylgruppe. NT-4 wird auch mit nicht-proteinhältigen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylenen, in der Weise kovalent verbunden, die in US-A-07/275.296 oder den US-Patentschriften 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben ist.
NT-4 in gereinigter Form, d.h. in einer Form, in der NT-4 im wesentlichen frei von anderen Polypeptiden oder Peptiden ist, kann in Mikrokapseln, die z.B. durch Koacervationsverfahren oder durch Grenzflächen-Polymerisation (z.B. Hydroxymethylcellulose oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln) hergestellt werden, in kolloidalen Arzneimittel-Zufuhrsystemen (z.B. Liposome, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikel und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen werden. Solche Verfahren werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, 1980, (A.Osol, Hg.) beschrieben.
Man ist der Ansicht, daß NT-4 als Mittel zur Verbesserung des Überlebens von oder zum Bewirken des Auswuchses von Nervenzellen geeignet ist. Daher eignet er sich zur Therapie degenerativer Störungen der Nervensystems (sogenannter "neurodegenerativer Erkrankungen") einschließlich solcher Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Huntington-Chorea, ALS, periphere Neuropathien und andere Zustände, die durch Nekrose oder den Verlust von Neuronen (ob zentrale, periphere oder motorische Neuronen) gekennzeichnet sind. Darüber hinaus kommt er zur Behandlung beschädigter Nervenzellen in Frage, z.B. von Nerven, die durch traumatische Zustände wie Verbrennungen und Wunden, Diabetes, Nierenfunktionsstörung und die toxischen Wirkungen von Chemotherapeutika, die zur Krebs- und AIDS-Behandlung eingesetzt werden, beschädigt werden. Er eignet sich weiters als Komponente von Kulturmedien zur Verwendung beim Kultivieren von Nervenzellen in vitro. Schließlich sind NT-4-Präparate zweckmäßige Standards in Assays auf NT-4 und Rezeptorbindeassays vom kompetitiven Typ, wenn er mit Radioiod, Enzymen, Fluorophoren, Spinmarkern u.dgl. markiert ist.
Therapeutische Formulierungen von NT-4 werden zur Lagerung durch Vermischen von NT-4, der den erwünschten Reinheitsgrad aufweist, gegebenenfalls mit physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, s.o.) in der Form lyophilisierten Materials oder wäßriger Lösungen hergestellt. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für die Empfänger bei den ausgewählten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch und umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste); Proteine wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon, Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlehydrate einschließlich Glukose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. Tween, Pluronics oder PEG.
NT-4, der zur in vivo-Verabreichung verwendet werden soll, muß steril sein. Dies erfolgt am besten mittels Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen vor oder nach der Lyophilisierung und Rekonstitution. NT-4 wird üblicherweise in lyophilisierter Form gelagert.
Therapeutische NT-4-Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einen Behälter mit einer sterilen Zugangsöffnung gefüllt, z.B. ein Beutel oder ein Fläschen für Infusionslösungen mit einem durch eine hypodermische Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen.
NT-4 wird gegebenenfalls mit anderen neurotrophischen Faktoren kombiniert oder gemeinsam mit ihnen verabreicht, z.B. mit NGF, NT-3 und/oder BDNF, und mit anderen herkömmlichen Therapien für degenerative Nervenstörungen eingesetzt.
Die Art der NT-4- oder NT-4-Antikörperverabreichung entspricht bekannten Verfahren, z.B. Injektion oder Infusion auf intravenösem, intraperitonealem, intrazerebralem, intramuskulärem, intraokularem, intraarteriellem oder intraläsionalem Weg, durch örtliche Verabreichung oder durch Systeme mit Langzeitfreisetzung (siehe unten). NT-4 wird mittels Dauerinfusion in die Flüssigkeitsansammlungen des CNS eingebracht, obwohl auch Bolusinjektion in Frage kommt. NT-4 wird vorzugsweise in die Ventrikel des Gehirns oder in anderer Weise in das CNS oder die Rückenmarksflüssigkeit eingebracht. Er sollte durch einen Verweilkatheter unter Verwendung einer Dauerverabreichungvorrichtung wie z.B. einer Pumpe oder es kann durch Implantierung, z.B. intrazerebrale Impiantierung eines Vehikels zur Langzeitfreisetzung, zugeführt werden. Genauer gesagt kann NT-4 durch chronisch implantierte Kanülen injiziert oder mit Hilfe osmotischer Minipumpen chronisch infundiert werden. Subkutane Pumpen stehen zur Verfügung, die Proteine durch kleine Rohrleitungen an die Hirnventrikel abgeben. Hochmoderne Pumpen können durch die Haut hindurch nachgefüllt werden und ihre Zufuhrrate kann ohne chirurgischen Eingriff eingestellt werden. Beispiele geeigneter Verabreichungsverfahren und Zufuhrsysteme mit einer subkutanen Pumpenvorrichtung oder intrazerebroventrikularer Dauerinfusion durch ein zur Gänze implantiertes Arzneimittel-Zufuhrsystem sind jene, die bei der Verabreichung von Dopamin, Dopamin-Agonisten und cholinergischen Agonisten an Alzheimer-Patienten und Tiermodelle für die Parkinson-Krankheit zur Anwendung kommen; siehe Harbaugh, 1987, J. Neural Transm. Suppl., 24: 271; und DeYebenes et al., 1987, Mov. Disord. 2: 143. NT-4-Antikörper wird in gleicher Weise oder durch Zufuhr in den Blutstrom oder die Lymphe verabreicht.
Geeignete Beispiele von Präparaten mit Langzeitfreisetzung sind halbdurchlässige Polymermatrizen in der Form ausgebildeter Gegenstände, z.B. Filme oder Mikrokapseln. Matrizen mit Langzeitfreisetzung sind z.B. Polyester, Hydrogele, Polylactide (US-A-3.773.919, EP-58.481), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl- L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167; Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98), Ethylenvinylacetat (Langer et al., ebda.) oder Poly-D-(-)-hydroxybuttersäure (EP-133.988A). NT-4-Zusammensetzungen mit Langzeitfreisetzung enthalten auch liposomal eingeschlossenen NT-4. NT-4 enthaltende Liposome werden durch an sich bekannte Verfahren hergestellt (Epstein et al., 1985, Proc. Nat. Acad. Sci. 82: 3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030; DE-3.218.121A; EP-52.322A; EP-36.676A, EP-88.046A; EP-143.949A; EP-142.641 A; JP-A-83-118.008; US-A- 4.485.045 und 4.544.545; und EP-102.324A). Üblicherweise sind die Liposome vom kleinen (etwa 200-800 Ängström) unilamellaren Typ, worin der Lipidanteil mehr als etwa 30 Mol-% Cholesterin beträgt, wobei der gewählte Anteil auf die optimale NT-4- Therapie eingestellt wird.
Eine wirksame, therapeutisch zu verwendende NT-4-Menge hängt z.B. von den therapeutischen Zielen, der Verabreichungsart und dem Zustand des Patienten ab. Demzufolge ist es erforderlich, daß der Therapeut die Dosierung einstellt und die Verabreichungsart allenfalls ändert, um die optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische tägliche Dosierung kann von etwa 1 µg/kg bis zu 100 mg/kg oder mehr reichen, wobei dies von den oben angeführten Faktoren abhängt. Typischerweise verabreicht der Kliniker NT-4, bis eine Dosierung erreicht ist, die die Neuronenfunktion repariert, beibehält oder im günstigsten Fall wiederherstellt. Der Fortschritt dieser Therapie wird durch herkömmliche Assays problemlos kontrolliert.
Polyklonale Antikörper gegen NT-4 werden im allgemeinen durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen von NT-4 und eines Adjuvans in Tieren gebildet. Es kann zweckmäßig sein, NT-4 oder ein die Ziel-Aminosäuresequenz enthaltendes Fragment an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder- Thyroglobul in oder Sojabohnen-Trypsininhibitor unter Verwendung eines bifunktionalen oder derivatisierenden Mittels, z.B. Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl&sub2; oder R¹N = C = NR.
Tiere werden gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg oder 1 µg Konjugat (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina vollständigem Freund-Adjuvans kombiniert und die Lösung an mehreren Stellen intradermal injiziert wird. Ein Monat später erhalten die Tiere mittels subkutaner Injektion an mehreren Stellen eine Auffrischungsimpfung mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Konjugatmenge in vollständigem Freund-Adjuvans. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum auf anti-NT-4-Titer untersucht. Die Tiere erhalten Auffrischungsimpfungen, bis der Titer einen Plateauwert erreicht. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat des gleichen NT-4-Polypeptids aufgefrischt, das jedoch an ein unterschiedliches Protein und/oder durch ein unterschiedliches Vernetzungsmittel konjugiert ist. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Auch Aggregationsmittel wie z.B. Alum dienen dazu, die Immunreaktion zu steigern.
Monoklonale Antikörper werden gebildet, indem Milzzellen aus immunisierten Tieren gewonnen und die Zellen in herkömmlicher Weise, z.B. durch Fusion mit Myelomzellen oder durch EB-Virustransformation und Screenen hinsichtlich den erwünschten Antikörper exprimierender Klone, immortalisiert werden.
NT-4-Antikörper eignen sich für diagnostische Assays auf NT-4 oder seine Antikörper. Die Antikörper werden in gleicher Weise wie der oben beschriebene NT-4 markiert und/oder auf einer unlöslichen Matrix immobilisiert. In einer Ausführungsform eines Rezeptorbindeassays wird eine Antikörperzusammensetzung, die sich an alle oder eine ausgewählte Vielzahl von Mitgliedern der NT-4-Familie bindet, auf einer unlöslichen Matrix immobilisiert, die Probe wird mit der immobilisierten Antikörperzusammensetzung in Kontakt gebracht, um alle Mitglieder der NT-4-Familie zu adsorbieren, und dann werden die immobilisierten Familienmitglieder mit einer Vielzahl von Antikörpern kontaktiert, die für jedes Mitglied spezifisch sind, wobei jeder Antikörper individuell als spezifisch für ein vorbestimmtes Familienmitglied identifizierbar ist, z.B. durch eindeutige Markierungen wie diskrete Fluorophore o.dgl. Durch Bestimmung der Gegenwart und/oder Menge jeder eindeutigen Markierung können der relative Anteil und die Menge jedes Familienmitglieds ermittelt werden.
NT-4-Antikörper eignen sich auch zur Affinitätsreinigung von NT-4 aus rekombinanter Zellkultur oder natürlichen Quellen. NT-4-Antikörper, die nachweisbar nicht mit NGF, NT-3 oder BDNF reagieren, können dazu verwendet werden, NT-4, der frei von diesen anderen Familienmitgliedern ist, zu reinigen.
Zweckmäßige diagnostische Assavs für NT-4 und seine Antikörper sind an sich allgemein bekannt. Zusätzlich zum oben beschriebenen Bioassay sind kompetitive, Sandwich- und sterische Hemmungs-Immunassayverfahren nützlich. Die kompetitiven und Sandwichverfahren sehen einen Phasentrennungsschritt als integralen Bestandteil des Verfahrens vor, während sterische Hemmungsassays in einem einzigen Reaktionsgemisch erfolgen. Im wesentlichen werden die gleichen Verfahren für den Assay von NT-4 und NT-4-bindenden Substanzen angewendet, obwohl bestimmte Verfahren je nach Molekulargewicht der untersuchten Substanz bevorzugt werden. Daher wird die zu untersuchende Substanz hierin als Analyt bezeichnet, ungeachtet ihres sonstigen Status als Antigen oder Antikörper; und Proteine, die sich an den Analyten binden, werden Bindepartner genannt, gleichgültig, ob sie Antikörper, Zelloberflächen- Rezeptoren oder Antigene sind.
Analytische Verfahren für NT-4 oder seine Antikörper verwenden alle eines oder mehrere der folgenden Reagentien: markierten Analytenanalog, immobilisierten Analytenanalog, markierten Bindepartner, immobi lisierten Bindepartner und sterische Konjugate. Die markierten Reagentien sind auch als "Tracer" bekannt.
Die verwendete Markierung ist jede nachweisbare Funktionalität, die die Bindung des Analyten und seines Bindepartners nicht beeinträchtigt. Zahlreiche Markierungen sind zur Verwendung im Immunassay bekannt, beispielsweise Enzyme wie z.B. Meerrettich- Peroxidase, Radioisotope wie z.B. ¹&sup4;C und ¹³¹I, Fluorophore wie z.B. Seltenerdchelate oder Fluorescein, stabile freie Radikale u.dgl. Herkömmliche Verfahren kommen zur kovalenten Bindung dieser Marker an Proteine oder Polypeptide zur Anwendung. Solche Bindeverfahren eignen sich zur Verwendung mit NT-4 oder seinen Antikörpern, die alle proteinhältig sind.
Die Immobilisierung von Reagentien ist für bestimmte Assayverfahren erforderlich. Die Immobilisierung führt zum Trennen des Bindepartners von jedem Analyten, der frei in Lösung bleibt. Dies wird üblicherweise entweder durch Insolubilisieren des Bindepartners oder des Analytenanalogs vor dem Assayverfahren erzielt, z.B. durch Adsorption an eine wasserunlösliche Matrix oder Oberfläche (Bennich et al., US-A- 3.720.760), durch kovalentes Kuppeln (z.B. mittels Glutaraldehyd-Vernetzung) oder durch anschließendes Insolubilisieren des Partners oder Analogs, z.B. durch Immunfällung.
Andere Assayverfahren, die als kompetitive oder Sandwichassays bezeichnet werden, sind allgemein bekannt und werden im Bereich der kommerziellen Diagnostik in großem Umfang angewendet.
Kompetitive Assays beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Analogs (des "Tracers"), mit dem Probenanalyten um eine begrenzte Anzahl an Bindestellen auf einem gemeinsamen Bindepartner zu konkurrieren. Der Bindepartner wird im allgemeinen vor oder nach dem Konkurrieren insolubilisiert, und dann werden der Tracer und der Analyt, die am Bindepartner gebunden sind, vom ungebundenen Tracer und Analyten getrennt. Diese Trennung erfolgt durch Dekantieren (wenn der Bindepartner prämsolubilisiert wurde) oder durch Zentrifugieren (wenn der Bindepartner nach der kompetitiven Reaktion gefällt wurde). Die Menge an Probenanalyt ist umgekehrt proportional zur Menge an gebundenem Tracer, wie dies durch die Menge an Markersubstanz gemessen wird. Dosis-Reaktions-Kurven mit bekannten Analytenmengen werden erstellt und mit den Versuchsergebnissen verglichen, um die Menge an in der Probe vorhandenem Analyten zu quantifizieren. Diese Assays werden ELISA-Systeme genannt, wenn Enzyme als nachweisbare Marker verwendet werden.
Eine weitere Art eines kompetitiven Assays (als "homogener" Assay bezeichnet) erfordert keine Phasentrennung. Hier wird en Konjugat eines Enzyms mit dem Analyten hergestellt und solcherart verwendet, daß beim Binden des Antianalyten am Analyten die Gegenwart von Antianalyt die Enzymaktivität modifiziert. In diesem Fall werden NT- 4 oder seine immunologisch aktiven Fragmente mit einer bifunktionalen organischen Brücke an ein Enzym wie z.B. Peroxidase konjugiert. Konjugate werden zur Verwendung mit Anti-NT-4 ausgewählt, sodaß die Bindung von Anti-NT-4 die Enzymaktivität der Markierung inhibiert oder potenziert. Dieses Verfahren wird an sich unter dem Namen EMIT allgemein praktiziert.
Sterische Konjugate werden in sterischen Hinderungsverfahren für homogene Assays verwendet. Diese Konjugate werden durch kovalentes Binden eines niedermolekularen Haptens an einen kleinen Analyten synthetisiert, sodaß ein Antikörper gegen Hapten im wesentlichen nicht imstande ist, das Konjugat zur gleichen Zeit wie Antianalyt zu binden. Gemäß diesem Assayverfahren bindet der in der Probe vorhandene Analyt Antianalyt, wodurch das Antihapten das Konjugat binden kann, was zu einer Änderung der Beschaffenheit des Konjugathaptens führt, z.B. zu einer Änderung der Fluoreszenz, wenn das Hapten ein Fluorophon ist.
Sandwichassays sind besonders zur Bestimmung von NT-4 oder NT-4-Antikörpern geeignet. In sequentiellen Sandwichassays dient ein immobilisierter Bindepartner zum Adsorbieren von Probenanalyt, die Probe wird z.B. durch Waschen entfernt, der gebundene Analyt dient dazu, markierten Bindepartner zu adsorbieren, und gebundenes Material wird dann vom Resttracer getrennt. Die Menge an gebundenem Tracer ist direkt proportional zum Probenanalyten. In simultanen Sandwichassays wird die Probe vor dem Hinzufügen des markierten Bindepartners nicht abgetrennt. Ein sequentieller Sandwichassay unter Verwendung eines monoklonalen anti-NT4-Antikörpers als ein Antikörper und eines polyklonalen anti-NT-4-Antikörpers als anderer Antikörper eignet sich zum Prüfen von Proben auf NT-4-Aktivität.
Obig werden lediglich Beispiele für diagnostische Assaycs hinsichtlich NT-4 und Antikörper beschrieben. Andere Verfahren, die jetzt oder in Zukunft zur Bestimmung dieser Analyten entwickelt werden, sind im Schutzbereich der Erfindung enthalten, einschließlich des oben beschriebenen Bioassays.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung und sind keinesfalls einschränkend.

BEISPIEL

Versuche, für NT-4 kodierende DNA zu identifizieren und aus menschlichen genomischen und cDNA-Bibliotheken mittels NGF- und BDNF-Sonden zu isolieren waren erfolglos. Zum Identifizieren des NT-4-Gens war es stattdessen erforderlich menschliche genomische DNA unter Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren (Mullis et al., 1987, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263) Menschliche genomische Plazenta-DNA (hergestellt nach dem Verfahren von Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, siehe Abschnitt über die Bildung einer genomischen DNA-Bibliothek) diente als Schablone für die obigen Primer, da die aktiven Formen von NGF, BDNF und NT-3 durch ein einziges Exon kodiert werden (Leibrock et al., s.o.; Hohn et al., s.o.; Maisonpierre et al., s.o.; Rosenthal et al., s.o.).
Die Aminosäuresequenzen für NGF, BDNF und NT-3 wurden auf Bereiche gemeinsamer Homologie untersucht. Einige dieser Bereiche wurden identifiziert und einstrangige Primerpools gebildet, die Restriktionsstellen für Sal, Xba und EcoRI enthielten und die komplementär zu sämtlichen möglichen DNA-Sequenzen für die Plus- und Minusstränge der ausgewählten NGF, BDNF- und NT-3-Sequenzen waren.
Der Primerpool für den sense-Strang entsprach den Resten 50-58 von (reifem menschlichem βNGF) NGF, bezeichnet als NGX-54. Der Sense-Primer umfaßt die folgende Sequenz von Alternativen (SEQ ID NR.93, 94, 95 bzw. 96):
Der Primerpool für den Antisense-Strang entsprach den Resten 102-110 von NGF (als AR1 bezeichnet) und umfaßte die folgenden Sequenzen von Alternativen (SEQ ID NR.97, 98, 99 bzw. 100):
Man beachte, daß jede Primersequenz eine Restriktionsstelle an ihrem 5'-Ende aufweist, um die Klonierung der amplifizierten Sequenzen zu erleichtern. Eine vorsichtige Auswahl der Amplifikationsbedingungen ermöglichte die Amplifikation der NT-4- Sequenz trotz der Tatsache, daß diese Pools deutlich größer als die herkömmlichen Pools waren, die bislang für kürzere Aminosäuresequenzen verwendet wurden (32- bis 32.000fache Entartung). (Lee et al., 1988, Science 239: 1288; Strathmann et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. 86: 7407; Leibrock et al., s.o.). Die Primer dienten zur Bildung amplifizierter DNA, die dann sequenziert wurde. Die Amplifikationsbedingungen waren wie folgt:

I. PCR mit menschlicher genomischer Plazenta-DNA

denat. 95ºC 5' einmal am Anfang denat. 95ºC 1'} annell. 55ºC 1 '} 45 Zyklen erweit. 72ºC 1'}
erweit.... 72ºC 15
10 µl 10 x Puffer (am Ende = 50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,4, 3,0 mM MgCl&sub2;)
3 µl menschliche genomische DNA (3 µg)
7,5 ng/µl Primer (etwa 1 µg = 2,6µM 33 mer, daher 10³ degen = nM, 10&sup6; = pM)
7,5 ng/µl Primer
10 µl 10 x dNTPs (am Ende = 0,2 mM dNTPs)
1 µl Taq-Polymerase
61 µl dH&sub2;O
100 µl VT

II. Schneiden mit SalI und EcoRI, Erzeugen und Gelreinigen von Fragmenten der erwarteten Größe, etwa 210 bp, und Subklonieren in den Vektor auf M13-Basis, M13mp18 (Pharmacia)

NGF-, BDNF- und NT-3-Klone wurden durch Hybridisierung mit Oligonukleotiden, die aus den einzelnen Bereichen ihrer jeweiligen cDNA-Sequenzen stammen, identifiziert. Plasmide, die nichthybridisierende Inserts enthielten, wurden sequenziert (Smith, 1980, Meth. Enzymol. 65: 560) und ihre potentiellen Translationsprodukte auf Homologie mit NGF, BDNF und NT-3 analysiert.
Dieses Verfahren zeigte die Gegenwart von etwa 500 NGF-, BDNF- und NT3-Klonen und 78 nicht verwandten Klonen. Weiters wurden drei DNA-Fragmente, die für einen Teil eines neuartigen, mit NGF-verwandten Faktors kodieren, identifiziert und gesamt als NT-4 bezeichnet. Die geringe Anzahl an durch PCR erzeugten NT-4-Klonen war ein Ergebnis der schlechten Homologie zwischen seiner DNA-Sequenz und den PCR- Primern.
Das Screenen einer menschlichen fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek (Rosenthal et al., 1987, EMBO J. 6: 3641) unter Verwendung des genomischen Plazentaklons als Sonde ergab keine positiven Klone. Um einen vollständigen menschlichen NT-4-Homolog zu erhalten, wurde auch eine menschliche genomische Bibliothek gescreent (Maniatis et al., 1978, Cell 15: 687) und ein 6 kb-DNA-Fragment isoliert. Dieses Fragment enthielt einen einzigen offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid mit 168 Aminosäuren kodierte, das das reife NT-4-Polypeptid umfaßte.
Die vollständige Nukleotidsequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem reifem NT-4 und zumindest eines Teils seines Vorläuferbereichs ist in Fig. 1 dargestellt. Der gesamte Vorläuferbereich einschließlich der Signalsequenz kann so sein wie zwischen dem dargestellten Anfangs-Methionin und dem letzten Arg der Spaltungsstelle vor dem Beginn der reifen Sequenz gezeigt ist. Wenn dies der Fall ist, ist der Vorläuferbereich von NT-4 viel kürzer als die Vorläuferbereiche von NGF, BDNF und NT-3, die in Fig. 2 gezeigt sind. Die Zuordnung des Initiationscodons für NT-4 erfolgte auf der Grundlage der Anordnung des lnitiationscodons in NGF, BDNF und NT- 3. Die Aminosäuresequenz von reifem menschlichem NT-4 besitzt etwa 46%, 55% und 52% Sequenzhomologie (Identität) mit reifem menschlichem NGF, BDNF bzw. NT-3, bezogen auf die Ausrichtung der Sequenzen, wie sie in Fig. 2 gezeigt ist.
Die aktiven reifen Formen von NGF, BDNF und NT-3 sind Homodimere von 13-14 kD- Proteinen, die aus ihren etwa 30 kD-Vorläufern gebildet werden (Leibrock et al., s.o.; Maisonpierre et al., so.; Hohn et al., s.o.; Greene und Shooter, 1980, Ann Rev. Neurosci. 3: 353). Die NT-4-Vorläufer-Proteinsequenz wies auch eine potentielle tetrabasische Spaltungsstelle vor dem Beginn des reifen Bereichs auf, was anzeigte, daß alle vier Mitglieder dieser Proteinfamilie ähnlich verarbeitet werden können. Die Verarbeitung an dieser Stelle würde zu einem 13-14 kD-Polypeptid (d.h. mit 130 Aminosäuren) führen.
Zur Bewertung der möglichen Funktion von NT-4 wurde seine Gewebeverteilung durch Northern Blot-Analyse bestimmt Bei der Ratte wurde NT-4-mRNA in unterschiedlichen Mengen in jedem untersuchten Gewebe vorgefunden, d.h. im Herz, in Muskeln, in der Niere, Leber und Milz, im Darm, in der Lunge, im Rückenmark und in verschiedenen Gehimregionen, einschließlich des Kleinhirns und der Hirnrinde. Diese breite Organlokalisierung von NT-4-mRNA legte nahe, daß im peripheren Nervensystem NT-4 als zielabstammender trophischer Faktor für sympathische, sensorische und/oder motorische Neuronen dienen könnte. Diese Theorie wird durch Exprimieren von DNA, die für rekombinanten menschlichen NT-4 kodiert, und Prüfen seiner unterschiedlichen Aktivitäten untersucht.

BEISPIEL II

Es wird erwartet, daß die folgende Arbeitsvorschrift zum Exprimieren von NT-4-DNA und Reinigen des resultierenden NT-4 ausreichend NT-4 für Assayzwecke liefert. Dieses Beispiel umfaßt auch erwartete Assays, die zum Testen des gereinigten NT-4 und zum Vergleichen von diesen mit NGF dienen.
Ein Expressionsvektor auf Cytomegalievirus-Basis mit Namen pRK5 (beschrieben in Gorman et al., 1990, DNA and Protein Engineering Techniques 2:1 und in EP-A 307.247, veröffentlicht am 15.März 1989) wird als Expressionvektor verwendet. Die genomische NT-4-DNA wird aus dem Phagen, in dem sie kloniert wurde, geschnitten. Dieses DNA- Fragment wird dann in pRK5, der zuvor mit den geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten wurde, um das DNA-Fragment aufzunehmen, wobei dabei herkömmliche Ligationsverfahren zur Anwendung kommen, ligiert. (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Der resultierende Vektor trägt den Namen pRK-5hNT-4.
Eine menschliche embryonale 293-Nierenzellinie (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36: 59) wird bis zur Konfluenz gezüchtet. 10 µg der NT-4-Plasmid-DNA (pRK-5hNT-4) wird mit 1 µg DNA, die für das VA-RNA-Gen kodiert (Thimmappaya et al., 1982, Cell 31: 543), vermischt und in 500 µl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA und 0,227 M CaCl&sub2; aufgelöst. Es werden unter Wirbelbewegungen 500 µl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl und 1,5 mM Na&sub3;PO&sub4; zugetropft; anschließend läßt man 10 min lang bei 25ºC die Bildung des Niederschlags zu. Der suspendierte Niederschlag wird dann den Zellen zugegeben (in Platten mit 100 mM) und läßt ihn sich dann vier Stunden lang im Inkubator absetzen. Das Medium wird abgesaugt und 2 ml 20% Glyzerin in phosphatgepufferter Salzlösung 30 s lang zugegeben. Die Zellen werden zweimal mit 5 ml serumfreiem Medium gewaschen, dann wird frisches Medium zugegeben, und die Zellen werden fünf Tage lang inkubiert.
Die 293-Zellen werden in gleicher Weise mit pRK5 alleine transfiziert.
24 Stunden nach den Transfektionen wird das Medium ersetzt und Zellen 12 Stunden lang in Gegenwart von 200 µCi/ml ³&sup5;S-Cystein und 200 µCi ³&sup5;S-Methionin inkubiert. Konditioniertes Medium wird anschließend gesammelt, durch Lyophilisierung fünffach konzentriert und auf ein 15%iges SDS-Gel aufgebracht, das danach verstärkt, getrocknet und zwei Stunden lang einem Film ausgesetzt wird. Diese Daten sollen die Gegenwart eines Polypeptids von etwa der erwarteten Größe (14-15 kD) anzeigen.
Eine Expression von NT-4 in größerem Maßstab erfolgt mittels des Dextransulfat- Verfahrens (Sompayrac und Danna, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 12: 7575) durch transientes Einführen von 700 µg pRK-5hNT-4 in die menschliche embryonale 293- Nierenzellinie, die in einem 3-Liter Belco-Mikroträger-Drehkolben bis zur maximalen Dichte (1,5 Liter) gezüchtet wird. Die Zellen werden zuerst durch Zentrifugieren aus dem Drehkolben konzentriert und mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und dann wird der DNA-Dextran-Niederschlag vier Stunden lang auf dem Zellpellet inkubiert. Die Zellen werden 90 Sekunden lang mit 20% Glyzerin behandelt, mit einem Medium wie z.B. 50:50 DMEM:F-12-Medium gewaschen und wieder in einen 3 Liter- Drehkolben eingebracht, der 1,5 Liter des obigen Mediums plus 5 µg/ml Rinderinsulin und 0,1 µg/ml Rindertransferrin enthält. Die obige Arbeitsvorschrift wird für drei getrennte 3 Liter-Kulturen angewendet.
Nach 4 Tagen werden etwa 5 Liter der konditionierten Medien aus der oben beschriebenen Expression in größerem Maßstab zentrifugiert und filtriert, um Zellen und Zellteile zu entfernen, und 100fach konzentriert. Der Puffer, Salze und andere kleine Moleküle werden durch Dialyse gegen 25 mM Natriumborat, pH 9,0, und 4 M Harnstoff ausgetauscht und auf eine 5 x 5 cm DEAE Sepharose Fast-Flow-Ionenaustausch-Chromatographiesäule (Pharmacia, Inc.) aufgebracht. Der pH-Wert des Säuleneffluents (495 ml) wird durch Zugabe von 0,1 Volumina von 250 mM 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure- (MOPS) Puffer neutral gestellt (pH 7,0), um eine Endzusammensetzung von 25 mM MOPS, pH 7,0, und 4 M Harnstoff zu ergeben. Diese Probe wird auf eine 2,5 x 2,5 cm S-Sepharose-Ionenaustausch-Chromatographiesäule (Pharmacia) aufgebracht, gewaschen und mit 25 mM MOPS, pH 7,0, 4 M Harnstoff und 0,5 M NaCl (40 ml) eluiert.
Zwei unterschiedliche Assays zeigen die Gegenwart von rekombinantem menschlichem NT-4 im S-Sepharose-Salzeluat (130 ng/ml, 5 µg insgesamt): 1) 48-stündiges Überleben und Neuritenauswuchs in drei Arten von embryonalen peripheren Hühner- Ganglionenneuronen: paravertebrale sympathische Ketten-Ganglionneuronen, sensorische Rückenmarksneuronen von dorsalen Rückenmarkswurzel-Ganglien (lumbosakraler Bereich) und Knoten-Ganglionneuronen; und 2) Immunkreuzreaktivität in einem ELISA-Assay (Lucas et al., 1989, J. Endocrinol. 120: 449) unter Verwendung polyklonaler Antikörper gegen menschlichen β-NGF, die wie oben im Beschreibungsabschnitt mittels β-NGF als Immunogen und nicht mittels NT-4 gebildet werden können. Das S-Sepharose-Eluat wird gegen 1 M Essigsäure und 4 M Harnstoff dialysiert, zehnfach konzentriert, auf eine S-300-Sephacryl-Gelfiltrationssäule (1,5 x 44 cm) aufgebracht und im gleichen Puffer chromatographiert;
Aliquote Anteile von 200 µl werden aus jeder gesammelten 1 ml-Fraktion entnommen, gegen 1 M Essigsäure dialysiert, lyophilisiert und erneut in 30 µl Laemmli-SDS-PAGE- Probenpuffer (Laemmli, 1970, Nature 227: 680) aufgelöst. Menschlicher β-NGF wird in ähnlicher Weise erhalten. Nach der SDS-PAGE zeigt das silbergefärbte Gel ein einziges, deutlich gefärbtes Polypeptid mit etwa 15 kD an. Ein 3 ml-Pool von aus der S-300-Säule eluierten Fraktionen, die diesem durch SDS-PAGE analysierten Bereich entsprechen, wird angelegt und 1 ml (0,5 nmol) einer N-terminalen Aminosäuresequenz-Analyse durch Edman-Abbau ausgesetzt, die auf einem automatischen Prototyp-Aminosäuresequenzierer (Kohr, EP-257.735) durchgeführt wird. Die N-terminale Sequenzanalyse ergibt eine einzelne Sequenz, die mit einem Glycinrest beginnt, der durch die tetrabasische Spaltungssequenz, die in einem Arginin endet, und durch die Verarbeitung von präprongf zu reifem β-NGF vorhergesagt wird.
Die anfänglichen Sequenzierzyklen können quantifiziert werden, um die gewonnene Menge an gereinigtem NT-4 aus dem Dreisäulen-Verfahren anzuzeigen. Der gereinigte rekombinante menschliche NT-4 wird gegen 0,1% Essigsäure dialysiert, um eine Endkonzentration von 3,25 µg/ml zu ergeben. Dieses Stammaterial kann zu neuronalem Zellmedium (DMEM mit hohem Glukoseanteil und 10% fötalem Rinderserum) bei verschiedenen Konzentrationen von 4 bis 60 ng/ml verdünnt werden, um verschiedene Bioassays durchzuführen.
Für eine in größerem Umfang stattfindende Produktion von NT-4 ist der bevorzugte Vektor ein durch SV40 gesteuerter Vektor wie z.B. der obige pSVI6B, die bevorzugten Wirtszellen sind chinesische Hamstereierstock-Zellen, und das bevorzugte Kulturmedium ist ein DMEM- oder ein 1:1 DMEM:F12-Medium mit erhöhten Glukosemengen, um die Produktausbeute zu optimieren, oder das in US-A-4,767,704 beschriebene serumfreie Medium.
Gereinigter NT-4 wird auf neurotrophische Aktivitäten an verschiedenen Arten primärer, embryonaler, 10 Tage alter Küken-Neuronen analysiert, wie dies durch Davies in: Nerve Growth Factors, 1989 (R.A. Rush, Hg., John Wiley & Sons, Boston) S.95-109 beschrieben wird. Somit werden paravertebrale sympathische Kettenglanglien (SG), Rückenmarkswurzel- (lumbosakrale) Ganglien (DRG) und Knotenganglien (NG) werden aus 10 Tage alten Kükenembryonen ausgeschnitten. Die neuronalen Zellen werden aus den Ganglien mit Trypsin oder Pancreatin (GIBCO) dispergiert und zweimal vorplattiert, um die Anzahl nichtneuronaler Zellen zu reduzieren. Die Zellen werden gezählt und in eine 96-Napf-Gewebekulturplatte gegeben, die mit Polyornithin (500 µg/ml) und Laminin (10 µg/ml) vorbehandelt wurde. (Lindsay et al., 1985, Dev. Bio. 112: 319). Die Anzahl der zugegebenen Zellen sind bei SG und DRG 4000 Zellen pro Napf, bei NG 2000 Zellen pro Napf.
Gereinigter Mäuse-Unterkieferdrüse-βNGF, der in den Assays verwendet wird, stammt von Biomedical Technologies, Inc. und wurde in 0,1% Essigsäure in einer Konzentration von 10 µg/ml aufgelöst. Es wird gereinigter rekombinanter menschlicher NT-4 verwendet, der bei einer Endkonzentration von 3,25 µg/ml gegen 0,1% Essigsäure dialysiert wird. Die Zellen werden mit oder ohne Faktoren 48 Stunden lang inkubiert und phasenhelle Zellkörper, die ausgeprägte Neunten aufweisen, die fünfmal so lang sind wie der Zellkörper, gezählt. Einzelne Perikaryonen können in den Kulturen von DRG- und NG-Neuronen gezählt werden. Die Perikaryonen der SG-Neuronen ballen sich jedoch zu Zellanhäufungen zusammen und die Zellaggregate werden gezählt. Das Zellüberleben bei maximaler Reaktion beträgt etwa 20-40% für DRG- und NG- Neuronen, während SG-Neuronen wahrscheinlich einen höheren Wert aufweisen, da Zellanhäufungen gezählt werden. Vier Versuche werden durchgeführt, die jeweils NGF und NT-4 verwenden.
Man erwartet, daß NT-4 bei peripheren Neuronen am aktivsten ist. In Wirbeltieren stammen Neuronen aus zwei unterschiedlichen embryonalen Quellen: der Neuralleiste und den Neuralplakoden (LeDouarin und Smith, 1988, Ann. Rev. Cell Biol. 4: 375) Zellen aus der Neuralleiste lassen Neuronen und die unterstützenden Zellen des peripheren Nervensystems entstehen, und die Zellen aus den Plakoden einige sensorische Zellen und Schädel neuronen.
Die aus der Neuralleiste stammenden sensorischen Rückenmarkswurzel-Ganglienzellen (DRG) ragen in das CNS und periphere Gewebe und hängen von neurotrophen Faktoren aus beiden Zielen ab (Lindsay et al., 1985, Dev. Biol. 112: 319). Diese zweifache Abhängigkeit ist ein möglicher Mechanismus, das Überleben nur jener Neuronen sicherzustellen, die alle geeigneten Verbindungen bilden. Sensorische Knotenganglien (NG) aus Plakoden, die auch doppelt verbunden sind und auf den CNS-Faktor BDNF reagieren, reagieren aber nicht auf den peripher abstammenden trophischen Faktor (NGF). Somit kann die periphere Zielinnervation durch NG-Neuronen wahrscheinlich durch einen alternativen Mechanismus oder andere Faktoren sichergestellt werden.
Das Vorhandensein von NT-4 im Gehirn und in der Peripherie läßt auf zusätzliche Funktionen schließen und erhöht die Chance, daß er für die Behandlung von Krankheiten wie der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit oder der Huntington- Chorea, die durch Hirnneuronen-Degeneration verursacht werden, und/oder zur Behandlung traumageschädigter Nerven bzw. zur Verhinderung der Schädigung peripherer Nervenzellen herangezogen werden kann. NT-4 konnte in einem bereits bestehenden Tierläsionsmodell wie jenem von Hefti, s.o., oder in alten Ratten oder Affen auf zentrale neurologische Funktionen untersucht werden.

BEISPIEL III

Zur Identifizierung natürlich vorkommender Aminosäuresequenz-Varianten von NT-4 wurde das obige genomische DNA-Fragment, das die Kodiersequenz für reifen menschlichen NT-4 umfaßt, als Hybridisierungssonde verwendet, um hinsichtlich homologer DNAs in der menschlichen fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek (Rosenthal et al., 1987, EMBO J., 6: 3641) und in der menschlichen genomischen Lymphozyten- DNA-Bibliothek (Stratagene, La Jolla, CA) zu screenen.
Die Hybridisierung und das Waschen von Filtern, die die Bibliotheks-DNAS enthielten erfolgte unter Bedingungen hoher Strenge: die Hybridisierung einer radiomarkierten NT- 4-Sonde an die Filtern wurde in einer Lösung von 50% Formamid, 5 x SSC (1 x = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 2 x Denhardt-Lösung (1 x = 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin) und 10% Dextransulfat bei 42ºC 20 h lang durchgeführt. Das Waschen der Filter erfolgte in einer wäßrigen Lösung aus 0,1 x SSC und 0,1% SDS bei 42ºC.
Drei DNAS wurden identifiziert, die eine deutliche Sequenzhomologie mit der für reifen menschlichen NT-4 kodierenden DNA aufwiesen. Die vollständigen Nukleotidsequenzen dieser homologen DNAs ist in Figuren 3, 4 und 5 zu sehen ebenso wie die abgeleitete Aminosäuresequenz der Polypeptide, für die sie kodieren, welche Polypeptide als NT-4β, NT-4γ bzw. NT-4Δ bezeichnet werden. Die für menschlichen NT-4β kodierende DNA mit der in Fig. 3 dargestellten Sequenz wurde aus der menschlichen fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek isoliert. Die in Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz scheint für einen Abschnitt von menschlichem NT-4β zu kodieren. Eine cDNA voller Länge, die für die Gesamtheit von menschlichem NT-4β kodiert, wird problemlos durch Sondieren der menschlichen fötalen Gehirn-cDNA-Bibliothek mit der in Fig. 3 gezeigten cDNA erhalten. Die für menschlichen NT-4γ kodierende DNA mit der in Fig. 4 dargestellten Sequenz wurde aus der menschlichen genomischen Lymphozyten-DNA-Bibliothek isoliert. Die für menschlichen NT-4Δ kodierende DNA mit der in Fig. 5 gezeigten Sequenz wurde auch aus der menschlichen genomischen Lymphozyten-DNA-Bibliothek isoliert.
Fig. 6 zeigt die Homologien zwischen den Aminosäuresequenzen von menschlichem NT-4, NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ. Die Aminosäuresequenz von menschlichem NT-4 besitzt zumindest etwa 75% Sequenzhomologie (Identität) zu NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ, bezogen auf die Ausrichtung der in Fig. 6 gezeigten Aminosäuresequenzen. Wie dies aus der Figur hervorgeht, sind NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ Aminosäuresequenz-Varianten des hierin definierten menschlichen NT-4, die sich durch diverse Aminosäureinsertionen und -substitutionen von menschlichem NT-4 unterscheiden.
Da NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ natürlich vorkommende Aminosäuresequenz-Varianten von menschlichem NT-4 sind, kann man erwarten, daß NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ ebenso wie NT-4 eine Rolle bei der Regulierung des normalen Wachstums und/oder der Entwicklung von Wirbeltier-Neuralgewebe spielen. NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ werden am besten durch rekombinante Mittel durch Expression in einer geeigneten Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der die für diese Polypeptide kodierende DNA umfaßt, wie dies oben beschrieben ist, hergestellt. NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ werden wie NT-4 auf neurotrophe Aktivitäten, wie oben beschrieben, analysiert.
Zusammenfassend gesagt ist NT-4 ein neuartiger trophischer Faktor mit einer breiten Gewebeverteilung. Er ergänzt NGF, BDNF und NT-3, die trophische Faktoren für einige periphere Neuronen sind. NT-4β, NT-4γ und NT-4Δ sind neuartige Aminosäuresequenz Varianten von NT-4. Jeder dieser Faktoren kann wahrscheinlich alleine oder gemeinsam auf definierten Untergruppen von Neuronen wirken, um die korrekten neuronalen Verbindungen sowohl im peripheren als auch im Zentralnervensystem herzustellen.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:

(i) ANMELDER: GENENTECH, INC.
ROSENTHAL, ARNON
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: NEUARTIGER NEUROTROPHISCHER FAKTOR
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 100
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Genentech, Inc.
(B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd
(C) STADT: South San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94080
(v) COMPUTERIESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: 5,25 Zoll, 360 Kb Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patin (Genentech)
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHDATUM: 24. September 1991
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 07/648482
(B) ANMELDUNGSDATUM: 31. Jänner 1991
(vii) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: 07/587707
(B) ANMELDUNGSDATUM: 25. September 1990
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Hensley, Max D.
(B) REGISTRATIONSNUMMER: 27.043
(C) KENNZAHL/ZEICHEN: 666P2
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 415/266-1994
(B) TELEFAX: 415/952-9881
(C) TELEX: 910/371-7168

(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID NR.1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 634 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 210 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN;
(A) LÄNGE: 247 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 4:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 257 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.4:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 241 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 6:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 168 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.7:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 685 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 7:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 8:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 216 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 8:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 9:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1190 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 9:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 10:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 257 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 10:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 11:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 971 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(xl.) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 11:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 12:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 168 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 12:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 13:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR.13:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 14:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 14:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 15:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 15:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 16:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNC: SEQ ID NR. 16:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 17:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 17:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 18:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 18:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 19:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 19:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 20:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 20:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 21:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 21:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 22:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 247 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 22:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 23:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 23:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.24:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 12Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 24:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 25:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 61 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 25:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 26:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 26:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 27:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 27:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 28:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 62 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 28:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 29:

(i) SEQUENZEIGENSCNAFTEN:
(A) LÄNGE: 74 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(3) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 29:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 30:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 103 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 30:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 31:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 105 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 31:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 32:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 32:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 33:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 33:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 34:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 34:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 35:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 35:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 36:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 9 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 36:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR.37:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 59 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 37:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 38:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 18 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 38:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 39:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 42 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 39:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 40:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 40:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 41:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 19 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NR. 41:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 42:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 58 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 42:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 43:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 43:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 44:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NR. 44:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 45:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 45:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 46:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG; SEQ ID NR. 46:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 47:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 47:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 48:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 91 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 48:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 49:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 91 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 49:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 50:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 92 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 50:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 51:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 132 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 51:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 52:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 142 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 52:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 53:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 129 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 53:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 54:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 129 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 54:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 55:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 124 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi.) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 55:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 56:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 107 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 56:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 57:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 126 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 57:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 58:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 114 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 58:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 59:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 59:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 60:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(Dl TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 60:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 61:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 61:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 62:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 62:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 63:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE; linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 63:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 64:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 64:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 65:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 65:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 66:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 66:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 67:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 67:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 68:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 68:

2) IN FORMATION FÜR SEQ ID NR. 69:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 69:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 70:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 70:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 71:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 71:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 72:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 72:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 73:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 130 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 73:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 74:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 74:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 75:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 75:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 76:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 76:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 77:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 77:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 78:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 78:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 79:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 79:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 80:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 80:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 81:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 81:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 82:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 82:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 83:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 83:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 84:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 84:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 85:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 85:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 86:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 86:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 87:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 87:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 88:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 88:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 89:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 89:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 90:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 90:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 91:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 91:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 92:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 4 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 92:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 93:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 47 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 93:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 94:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 47 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 94:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 95:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 47 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 95:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 96:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 47 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 96:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 97:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 97:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 98:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 98:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 99:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 99:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 100:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 100:

Claims

1. Isolierte Nukleinsäure, die für ein neurotrophes Protein kodiert, umfassend eine Aminosäuresequenz, die zumindest zu 75% homolog mit der in Fig. 1 dargestellten Sequenz von reifem NT-4 ist.

2. Isolierte Nukleinsäure, die für NT-4 kodiert, umfassend die in einer der Figuren 1, 3, 4 und 5 dargestellte Aminosäuresequenz.

3. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, die für ein neurotrophes Protein kodiert umfassend eine Aminosäuresequenz, die zumindest zu 85% homolog mit der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz von reifem menschlichem NT-4 ist.

4. Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2, die für ein neurotrophes Protein kodiert umfassend die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz von reifem menschlichem NT- 4.

5. Isolierte Nukleinsäure, umfassend die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz von reifem menschlichem NT-4.

6. Nukleinsäure, die an DNA hybridisiert, welche unter strengen Bedingungen für reifen menschlichen NT-4 aus Fig. 1 kodiert, und die für ein Polypeptid kodiert, das ein Immunepitop des reifen menschlichen NT-4 umfaßt.

7. Nukleinsäure nach Anspruch 6, umfassend die in Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz von menschlichem NT-4β.

8. Nukleinsäure nach Anspruch 6, umfassend die in Fig. 4 dargestellte Nukleotidsequenz von menschlichem NT-4γ.

9. Nukleinsäure nach Anspruch 6, umfassend die in Fig. 5 dargestellte Nukleotidsequenz von menschlichem NT-4Δ.

10. Vektor, umfassend die Nukleinsäure nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

11. Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 10.

12. Verfahren zur Herstellung eines neurotrophen Proteins, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 11 und das Gewinnen des neurotrophen Proteins aus der Wirtszellenkultur.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin das Protein aus dem Wirtszellen- Kulturmedium gewonnen wird.

14. Zusammensetzung, die menschlichen NT-4 umfaßt und frei von kontaminierenden menschlichen Polypeptiden ist, wobei der NT-4 die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz von reifem menschlichem NT-4 aufweist.

15. Zusammensetzung, die menschlichen NT-4 umfaßt und frei von kontaminierenden menschlichen Polypeptiden ist, wobei der NT-4 die in einer der Figuren 3, 4 und 5 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

16. Isoliertes, neurotrophes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest zu 75% homolog mit der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz von reifem menschlichem NT-4 ist.

17. Isoliertes, neurotrophes Protein mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest zu 85% homolog mit der in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz von reifem menschlichem NT-4 ist.

18. Protein nach Anspruch 16 oder 17, umfassend ein Immunepitop des reifen menschlichen NT-4 aus Fig. 1.

19. Protein nach Anspruch 16, das die in Fig. 3 dargestellte Aminosäuresequenz von menschlichem NT-4β aufweist.

20. Protein nach Anspruch 16, das die in Fig. 4 dargestellte Aminosäuresequenz von menschlichem NT-4γ aufweist.

21. Protein nach Anspruch 16, das die in Fig. 5 dargestellte Aminosäuresequenz von menschlichem NT-4Δ aufweist.

22. Zusammensetzung, umfassend reifen menschlichen NT-4 aus Fig. 1, der mit einem immunogenen Polypeptid oder einem Nicht-proteinpolymer verbunden ist.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge an reifem menschlichem NT-4 aus Fig. 1 oder eines neurotrophen Proteins nach einem der Ansprüche 16 bis 21 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, die weiters NGF, BDNF oder NT-3 umfaßt.

25. Antikörper, der befähigt ist, reifen menschlichen NT-4 aus Fig. 1 zu binden, der jedoch nicht befähigt ist, NGF, BDNF oder NT-3 zu binden.

26. Monoklonaler Antikörper, der befähigt ist, reifen menschlichen NT-4 aus Fig. 1 zu binden.

27. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 26, der mit NGF, BDNF oder NT-3 nicht kreuzreagiert.

28. Verwendung eines Polypeptids, umfassend die in Fig. 1 dargestellte Aminosäuresequenz von reifem menschlichem NT-4 oder eines neurotrophen Proteins nach einem der Ansprüche 16 bis 21 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung oder von geschädigten Nervenzellen in einem Säugetier.

29. Verwendung nach Anspruch 28, worin das Säugetier ein Mensch ist.

30. Verwendung nach Anspruch 28, worin auch eine wirksame Menge von NGF, BDNF oder NT-3 eingesetzt wird.

31. Verwendung nach Anspruch 28, worin die neurodegenerative Erkrankung Huntington-Chorea, Alzheimer-Krankheit, ALS oder Parkinson-Krankheit ist und die Schädigung der Nervenzellen auf ein Trauma zurückzuführen ist.

32. Verfahren zum in vitro- oder in vivo-Nachweis von NT-4, umfassend die Verwendung eines Antikörpers nach Anspruch 25.

33. Verfahren zum Reinigen von NT-4, umfassend das Schicken eines Gemisches von NT-4 über eine Säule, an der ein Antikörper nach Anspruch 25 gebunden ist.

34. Isoliertes Protein nach einem der Ansprüche 16 bis 21 mit zumindest einer Aminosäuresubstitution, worin die zur Substitution ausgewählte Aminosäureposition bei BDNF, NGF, NT-3 und NT-4 nicht konserviert und bei beliebigen Speziesanalogen von BDNF, NGF, NT-3 oder NT-4 konserviert ist.

35. Isoliertes Protein nach einem der Ansprüche 16 bis 21 mit zumindest einer Aminosäuresubstitution an einer Aminosäureposition, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: R11, G12, E13, V16, D18, W23, V24, D26, V40, L41, Q54, Y55, F56, E58, T59, G77, R79, G80, H85, W86, A99, L100, T101, W110, R111, W112, I113, R114, I115, D116 und T118 (ausgehend vom N-Terminus von reifem menschlichem NT-4 numeriert, siehe Fig. 1).

36. Isolierte Nukleinsäure, die für ein Protein nach Anspruch 35 kodiert.