NO321382B1 - Nye rensete og isolerte neurotrofiske proteiner, nukleinsyresekvensen som koder for disse proteiner, ny vektor og vertscelle som inneholder nevnte vektor, en fremgangsmate for fremstilling av nevnte proteiner, en innretning for a behandle nerveskade, en farmasoytisk sammensetning samt anvendelse av nevnte proteiner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rensete og isolerte neurotrofiske faktorer og glial avledet neurotrofisk faktor (GDNF) som er i stand til å fremme dopaminopptak i dopaminerge neuroner. Også innbefattet i oppfinnelsen er en nukleinsyresekvens, en ny vektor så vel som en transformert eller transfektert vertscelle som innbefatter nevnte vektor.

Videre innbefatter nevnte oppfinnelse en fremgangsmåte for å produsere nevnte glialcellelinje-avledet neutrotrofisk faktor (GDNF), samt en innretning for å behandle nerveskade.

Endelig vedrører oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning inneholdende nevnte protein og en farmasøytisk egnet bærer, og anvendelsen av nevnte protein for å fremstille en farmasøytisk sammensetning for å forebygge eller behandle en rekke tilstander og sykdommer.

Antistoffer mot GDNF samt fremgangsmåter for å identifisere medlemmer av GDNF familien til neurotrofiske faktorer er beskrevet. Fremgangsmåter for å forhindre eller behandle nerveskader ved implantering derav inn i pasientceller som utskiller GDNF er også beskrevet.

Neurotrofiske faktorer er naturlige proteiner som finnes i nervesystemet eller i ikke-nervevev stimulert av nervesystemet og hvor funksjonen er å fremme overlevelsen og opprettholde den fenotypiske differensieringen av nerve og/eller glialceller (Varon og Bunge 1979 Ann. Rev. Neuroscience 1:327, Thoenen og Edgar 1985 Science 229:238). På grunn av denne fysiologiske rollen kan neurotrofiske faktorer være nyttige for behandling av degenerasjonen av nervecellene og tap av differensiert funksjon som oppstår i forskjellige neurodegenerative sykdommer.

For at en spesiell neurotrofisk faktor er potensielt nyttig for behandling av nerveskade må klassen eller klassene av skadede nerveceller være ansvarlig for faktoren. Forskjellige neurotrofiske faktorer påvirker vanligvis spesielle forskjellige klasser av nerveceller. Det er derfor tilrådelig å ha for hånden forskjellige neurotrofiske faktorer for å behandle hver av klassene av skadede neuroner som kan oppstå med forskjellige former av sykdom eller skade.

Neurotrofiske faktorer kan beskyttet reagerende neuroner overfor forskjellige urelaterte inngrep. For eksempel vil den neurotrofiske faktor nervevekstfaktoren (NGF) redde en signifikant del av senoriske neuroner fra døden forårsaket ved kutting av deres aksonale prosesser (Rien et al. 1987 J. Neurocytol 16:261; Otto et al. 1987 J. Neurosci 83:156) fra ontogenetisk død i løpet av embryonisk utvikling (Hamburger et al. 1984 J. Neurosci. 4:767) og fra skade forårsaket ved administrering av taksol eller cisplatin (Apfel et al. 1991 Ann Neurol. 29:87). Denne generelle beskyttelsen har ført til konseptet som innbefatter at dersom en neurotrofisk faktor beskytter reagerende neuroner overfor eksperimentell skade så kan den være nyttig for behandling av sykdommer som involverer skade på de neuronene i pasienter til tross for at etiologien kan være ukjent.

En gitt neurotrofisk faktor må, i tillegg til å ha riktig neuronal spesifisitet, være tilgjengelig i tilstrekkelige mengder slik at de kan bli anvendt som en farmasøytisk behandling. På grunn av at neurotrofiske faktorer vanligvis er til stede i meget små mengder i vev (for eksempel Hofer og Barde 1988 Nature 331:261; Lin et al. 1989 Science 246:1023), så vil det være uhensiktsmessig å fremstille farmasøytiske mengder av neurotrofiske faktorer direkte fra dyrevev. Som et alternativ kan det være ønskelig å lokalisere genet for en neutrofisk faktor og anvende genet som grunnlag for å etablere et rekombinant ekspresjonssystem for å produsere potensielt ubegrensede mengder av proteinet.

Oppfinnerne til denne oppfinnelsen beskriver en fremgangsmåte for å screene biologiske prøver for neurotrofisk aktivitet på embryoniske forløpere av substantia nigra dopaminerge neuroner som degenererer i Parkinsons sykdom. Denne bioanalysen for identifisering av neurotrofiske faktorer som kan være nyttige for behandling av Parkinsons sykdom er basert på en analyse som tidligere er beskrevet (Friedman et al. 1987 Neuro. Sei. Lett. 79:65-72, spesifikt inkorporert heri som referanse) og implementert med modifikasjoner i foreliggende oppfinnelse. Denne analysen ble anvendt for å screene forskjellige potensielle kilder for neurotrofisk aktivitet rettet mot dopaminerge neuroner. Foreliggende oppfinnelse beskriver karakterisering av en ny neurotrofisk faktor som ble renset fra en slik kilde, kondisjonert kulturmedium fra en glioblastomcellelinje,B49 (Schubert et al. 1974 Nature 249:224-27, spesifikt inkorporert heri med denne referansen). Det kondisjonerte mediet fra denne cellelinjen ble tidligere rapportert å inneholde dopaminerg neurotrofisk aktivitet (Bohn et al. 1989 Soc. Neurosci. Abs. 15:277). I denne tidligere rapporten ble kilden til neurotrofisk aktivitet ikke renset, karakterisert kjemisk eller vist å være konsekvensen av et enkelt middel i kondisjoneringsmediet. Nerveskade blir forårsaket av betingelser som kompromitterer overlevelsen og/eller riktig funksjon av en eller flere typer nerveceller. Slik nerveskade kan oppstå fira mange forskjellige årsaker og noen av disse er angitt nedenfor.

Nerveskade kan oppstå ved fysisk skade som forårsaker degenerasjon av aksonale prosesser og/eller nervecellelegemer nære ved skadestedet. Nerveskade kan også oppstå på grunn av temporær eller permanent opphør av blodstrømning til deler av nervesystemet, som ved slag. Nerveskade kan også oppstå på grunn av frivillig eller ufrivillig eksponering for neurotoksiner, så som cancer og AIDS kjemoterapeutiske midler henholdsvis cisplatina og dideoksycytidin (ddC). Nerveskade kan også oppstå på grunn av kroniske metaboliske sykdommer, så som diabetes eller nyresvikt. Nerveskade kan også oppstå på grunn av neurodegenerative sykdommer så som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og amyotrofisk lateral sklerose (ALS) som kommer fra

degenerering av spesifikke neuronale populasjoner.

Foreliggende oppfinnelse beskriver en ny neurotrofisk faktor. Neurotrofiske faktorer er naturlige proteiner som fremmer de normale funksjonene til spesifikke nerveceller og/eller beskytter de samme cellene mot forskjellige former for skade. Det er disse egenskapene som tyder på at GDNF kan være nyttige for behandling av forskjellige former av nerveskade inkludert de formene som er angitt ovenfor.

Parkinsons sykdom er identifisert ved et unikt sett av symptomer som innbefatter rigiditet, bradykinese, seborrhea, "festination gait", flekset posture, spyttavsondring og en "pill rolling" tremor. Sykdommen oppstår i alle raser i verden og gjennomsnittlig begynnende alder er 60 år.

Etter år med forskjellige teorier og kontroverser er det fremkommet at det er et biokjemisk grunnlag for Parkinsons sykdom som hovedårsak (se for eksempel Bergman, 1990 Drug Store Newa, 12:IP19). Av spesiell viktighet for forståelsen av Parkinsons sykdom er områdene av hjernen kjent som substantia nigra basal ganglia og spesielt corpus striatum. Substantia nigra som er et bilateralt parret lag av pigmentert kroppsstoff i midthjemen, er involvert med dopamintransmisjon, mens den normale basale gangliafunksjonen involverer en serie interaksjoner og feed back systemer som er assosiert med substantia nigra og delvis formidlet av dopamin, acetylcholin og andre forbindelser.

I Parkinsonssykdom er det en feilfunksjon av den dopaminerge aktiviteten til substantia nigra som blir forårsaket av neuronal degenerasjon. Dette resulterer i en tilstand med dopamin mangel og et skifte i balansen mellom aktivitet og cholinerg overvekt. Til tross for at det ikke er noen økning i konsentrasjonen av acetylcholin overvelder de eksitatoriske virkningene på sentralnervesystemet (dvs. tremorer) ved denne cholinerge mediatoren de inhiberende virkningene av tappet dopamin.

Den mest effektive behandlingen for Parkinsonssykdom frem til nå er oral administrering av levodopa. Levodopa penetrerer sentralnervesystemet og blir enzymatisk omdannet til dopamin i basal ganglia. Det antas at de fordelaktige virkningene av levodopa derfor er i økende konsentrasjon av dopamin i hjernen. Hverken levodopa eller noen av de mindre kjente medisinene som blir anvendt stopper derimot progresjonen av sykdommen som blir forårsaket av degenerasjon av dopaminerge neuroner.

Andre forskere har rapportert eksistensen av dopaminerg aktivitet i forskjellige biologiske kilder. IPCT søknad W091/01739 til Springer et al. ble en dopaminerg neurotrofisk aktivitet identifisert i et ekstrakt avledet fra celler fra det perifere nervesystemet. Aktiviteten som ble identifisert ble ikke renset, men kom fra en faktor med en molekylvekt på mindre enn 10.000 dalton. Faktoren ble isolert fra isjasnerve fra rotte, men er ikke CNTF som også finnes i nerver (Lin et al. 1989 Science 246:1023).

IUS-PS 5.017.735 til Appel et al, blir dopaminerg aktivitet identifisert i et ekstrakt fra caudat-putamen vev. Ingen faktorer som gir opphav til aktiviteten ble renset og den tilsynelatende molekylvekten til aktivitet inneholdende fraksjoner var relativt liten. Se også Niijima et al. 1990 Brain Res. 528:151-154 (kjemisk deafferent striatum fra voksen rottehjeme); Lo et al. 1990 Soc. Neurosci. Abstr. 16:809 (striatal-avledet neurotrofisk faktor). Andre kjente neurotrofiske faktorer er også blitt vist å ha dopaminerg aktivitet, for eksempel hjerneavledet neurotrofisk faktor (PDNF) og sur og basisk fibroblast vekstfaktorer.

GDNF ifølge foreliggende oppfinnelse ble isolert basert på dets evne til å fremme den funksjonelle aktiviteten og overlevelsen i cellekulturen til dopaminerge nerveceller isolert fra embryo mesemcephalon fra rotter. Disse dopaminerge nervecellene er embryoniske forløpere til dopaminerge nerveceller i substantia nigra fra voksne som degenererer i Parkinsons sykdom. GDNF kan derfor være nyttig for å redusere den neuronale degenerasjonen som forårsaker symptomene ved Parkinsons sykdom.

GDNF kan videre være nyttig for å behandle andre former for skade på eller uriktig funksjon til dopaminerge nerveceller i humane pasienter. Slik skade eller feilfunksjon kan oppstå ved schizofreni og andre former for psykoser. Aktuelle behandlinger for slike tilstander krever ofte medikamenter som er aktive ved dopaminreseptorer og tyder på at uriktig funksjon av dopaminerge neuroner som inerverer disse reseptorbærende neuronale populasjoner kan være involvert i sykdomsprosessen.

Basert på tidligere erfaring med andre neurotrofiske faktorer vil nye former for nerveskade som kan bli behandlet med GDNF fremkomme når mer blir kjent når det gjelder forskjellige typer av nerveceller som reagerer overfor denne neurotrofiske faktoren. Nervevekstfaktoren (NGF) fremkom som en potensiell nyttig behandling for Alzheimers sykdom når det oppdaget at NGF virker som en neurotrofisk faktor for basale forhjerne cholinerge neuroner som degenererer i Alzheimers sykdom. (Williams, et al. 1986 Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:9231). Fremgangsmåte er beskrevet i foreliggende oppfinnelse for å bestemme andre former for nerveskade som kan bli behandlet med GDNF.

Patrick Aebischer og medarbeidere har beskrevet anvendelsen av semipermeable, implanterbare membraninnretninger som er nyttige som midler for levering av medikamenter i visse tilfeller. De er for eksempel foreslått innkapsling av celler som utskiller neurotransmitterfaktorer og implantering av slike innretninger inn i hjernen til pasienter som lider av Parkinsons sykdom se US-PS 4.892.538 til Aebischer et al.; US-PS 5.011.472 tol Aebischer et al.; US-PS 5.106.627 til Aebischer et al.; PCT-søknad WO91/10425; PCT-søknad WO91/10470; Winn et al. 1991 Exper. neurol. 113:322-329; Aebischer et al. 1991 Exper. Neurol. 111:269-275; og Tresco et al. 1992 ASAIO 38:17-23.

I artikkelen med tittel "Release of nerve growth factor by human glial cells in culture " fra Norrgren et al., beskrives ikke-transformerte glial celler fra mennesker, som oppnås fra hjemebiopsier som frigir en faktor som induserer nerveutvekst. (Norrgren et al., 1980, Exper. Cell Research 130: 31 - 39).

Videre viser Bakhit et al., Brain Research, vol. 560,19971, sider 76-83, en undersøkelse hvor det ble undersøkt om glialceller blir mobilisert for å øke produksjonen av NGF når nervene fra hippocampus utsettes for ødelegging.

Sofer et al., Bio/Techniques, vol. 1, nr. 4, 1983, sider 198-203 beskriver utviklingen av optimale kromatografiske renseprosedyrer for proteiner.

Ingen av ovennevnte publikasjoner foregriper foreliggende oppfinnelsen siden ingen av disse angir eller foreslår GDNF-proteiner og nukleinsyrer som koder for disse. Referansene beskriver eksistensen og aktiviteten til NGF, men beskriver ikke NGF som et neurotrofisk protein som er i stand til å øke dopaminopptaket i kulturer av mesencefaliske neuroner. Videre er heller ikke fremgangsmåten og anvendelsen ifølge oppfinnelsen vist i nevnte mothold.

Foreliggende oppfinnelse angår et renset og isolert neurotrofisk protein som er i stand til å fremme dopaminopptak i dopaminerge neuroner, kjennetegnet ved at de omfatter en aminosyresekvens som fremsatt under og/eller biologiske ekvivalenthomologer derav:

Lys Arg Cys Gly Cys Ile (SEQ ID NO:6).

Foretrukne trekk ved proteinet ifølge oppfinnelsen er definert i kravene 2 til 12 og vist detaljert i følgende beskrivelse.

I en utførelsesform blir vesentlig renset GDNF oppnådd med en spesifikk aktivitet på minst omtrent 24.000 ganger høyere enn den spesifikke aktiviteten til B49 kondisjonert medium. Vesentlig renset GDNF har en spesifikk aktivitet på minst omtrent 12.000 TU/ug.

Vesentlig renset GDNF ifølge foreliggende oppfinnelse har en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 31-42 kD på ikke-reduserende SDS-PAGE og omtrent 20-23 kD på reduserende SDS-PAGE. Vesentlig renset GDNF har en aminoterminal sekvens omfattende vesentlig følgende aminosyresekvens (SEQ ID NO:l)

(Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-( )-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn).

Aminosyresekvensen til modne og "pre-pro" former av rotte GDNF er angitt i figurene 13 og 14 (SEQ IS NO:3 og SEQ ID NO:4). Aminosyresekvensen til moden human GDNF er som vist i den understrekede del av fig, 19 (aminosyrerester 1 til 134 av SEQ ID NO:5og aminosyrerester 1 til 134 av SEQ ID NO: 6). Aminosyresekvensen til pre-pro formen av human GDNF er angitt i figurene 19 (SEQ ID NO: 5) og 22 (SEQ ID NO:8).

Oppfinnelsen vedrører dessuten en nukleinsyresekvens, kjennetegnet ved at den koder for en hvilken som helst av de neurotrofiske proteinene som definert i kravene 1,2 eller 5.

En foretrukket utførelsesform av nukleinsyresekvensen ifølge oppfinnelsen er vist i krav 14.

Oppfinnelsen innbefatter dessuten en vektor, kjennetegnet ved at den uttrykker regulatoriske elementer som er operativt koblet til en nukleinsyresekvens ifølge kravene 13 eller 14.

Videre er det tilveiebrakt en transformert eller transfektert vertscelle isolert fra dens miljø, kjennetegnet ved at den omfatter vektoren ifølge oppfinnelsen.

Foretrukne trekk ved vertscellen ifølge oppfinnelsen fremgår av medfølgende krav 17 til 21.

Videre defineres en fremgangsmåte for å produsere glialcellelinje-avledet neutrotrofisk faktor, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: (a) dyrking av en vertscelle transformert eller transfektert med en nukleinsyresekvens som koder en neurotrofisk faktor ifølge kravene 1, 2, 5 eller

14,

(b) opprettholde nevnte vertscelle under betingelser som er egnet for ekspresjon av

glialcellelinje-avledet neurotrofisk av nevnte vertscelle; og

(c) eventuelt, isolering av glialcellelinje-avledet neurotrofisk faktor uttrykt ved

nevnte vertscelle.

Foretrukne trekk ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremgår av medfølgende krav 23 til 25.

Oppfinnelsen angår dessuten en innretning for å behandle nerveskade, kjennetegnet ved at den omfatter

(a) en semipermeabel membran egnet for implantasjon; og

(b) celler innkapslet inne i nevnte membran, hvor nevnte celler sekreterer en

neurotrofisk faktor ifølge krav 1;

hvor nevnte membran er permeabel for den neurotrofiske faktoren, og impermeabel for materialer skadelige for nevnte celler.

En foretrukket utførelsesform av innretningen ifølge oppfinnelsen er vist i medfølgende krav 27 og 28.

Også beskrevet er kloning av rotte GDNF genet fra et cDNA bibliotek dannet fra B49 cellelinjen. Nukleinsyresekvensen kodende for moden og pre-pro rotte GDNF er angitt i fig. 13 (SEQ ID NO:3). Fremgangsmåten for oppnåelse av et humant gen kodende for GDNF er også beskrevet. Nukleinsyresekvensen som koder for moden human GDNF er som angitt i fig. 19 (SEQ IS NO:5). Nukleinsyresekvensen som koder for de første 50 aminosyrene i pre-pro segmentet til human GDNF er som angitt i fig. 22 (SEQ ID NO: 8).

Foreliggende oppfinnelse omfatter også farmasøytiske sammensetninger omfattende et neurotrofisk protein ifølge oppfinnelsen sammen med en farmasøytisk egnet bærer. Foretrukne trekk ved den farmasøytiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen fremgår av kravene 30 til 35.

Oppfinnelsen vedrører endelig en anvendelse av et neurotrofisk protein ifølge oppfinnelsen for å fremstille en farmasøytisk sammensetning for å forebygge eller behandle nervecelleskade som skyldes infarkt, diabetisk polyneuropati, eller toksisk neuropati forårsaket av et terapeutisk middel, og/eller forebygge eller behandle nervecelleskade eller sykdom som skyldes fysisk skade, iskemi, eksponering til neurotoksiner, kroniske, metabolske sykdommer eller neurodegenerativ sykdom og/eller forebygge eller behandle feilaktig fungerende dopaminerge nerveceller som vist ved Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom eller amyo tro fisk lateral sklerose.

I det følgende beskrives figurene i detalj.

Figur 1 angir resultater av heparin sepharose kromatografi på en oppløsning av konsentrert B49 glioblastomceller seru-fritt vekstkondisjonert medium. Resultatene viser eluatet O.D.290 (-)»ledeevne (-A-) og GDNF aktivitet i TU (-0-). Fraksjoner merket med en strek ble slått sammen for ytterligere rensing. Figur 2 angir resultater av FPLC superose kromatografi fra sammenslåtte fraksjoner ifølge fig. 1. Resultatene er vist for O.D.280 (") °S GDNF aktivitet i TU (-0-). Figur 3 angir resultatene av RP-HPLC på fraksjon 14 fra fig. 2. Resultatene er vist av O.D.214 med GDNF aktivitet i TU vist nedenfor. Figur 4 angir resultatene av analyser av sølvfarget SDS-PAGE av fraksjonene 3-10 oppnådd fra fig. 3 ovenfor. Kolonne S inneholder molekylvektsstandarder. Figur 5 angir resultatene av preparativ SDS-PAGE på fraksjonene 5 og 6 fra fig. 4. Gelbitene ble testet for GDNF aktivitet i TU. Gelbitene ble også korrelert med molekylvekt ved anvendelse av molekylærvektsmarkører (Amersham). Figur 6 angir resultatene av RP-HPLC på fraksjonene 16-23 fra fig. 5. Kromatogram A inneholder prøven og kromatogram B er en kontroll (sammenslått gelekstrakt fra tilsvarende biter på en blank kolonne). Figur 7 angir resultatene av analyser ved sølvfarget SDS-PAGE av topp 3 fra figur 6A

(kolonne 1) og en molekylvektskontroll (kolonne S).

Figur 8 (SEQ ID NO: 1) beskriver den amino-terminale aminosyresekvensen oppnådd fra renset GDNF. Tom parentes indikerer en posisjon hvor aminosyren ikke var mulig å bestemme ved anvendelse av de anvendte sekvenseringsteknikkene. Når residiene er angitt i parenteser var det visse uklarheter når det gjelder identifikasjon av det residiet. Den fullstendig korrekte amino-terminale aminosyresekvensen er vist i figur 19 (SEQ ID NO: 5) nedenfor. Figur 9 angir resultatene av RP-HPLC på trypsinspaltet renset GDNF. Kromatogram A inneholder prøven og kromatogram B er en kontroll (bare inneholdende trypsin). Figur 10 angir resultatene av RP-HPLC av topp 37 fra fig. 9 etter behandling med cyanogenbromid. Figur 11 angir resultatene av RP-HPLC på reduksjonsproduktet av topp 1 fra fig. 10. Figur 12 (SEQ ID NO: 2) angir en indre aminosyresekvens oppnådd fra renset GDNF. Figur 13 (SEQ ID NO: 3) angir nukleinsyresekvensen oppnådd for rotte GDNF avledet fra en B49 celle bibliotek cDNA klon _ZapII76.1. Også vist er den gitte aminosyresekvensen for GDNF. Nukleinsyresekvensen som koder for moden GDNF er streket under. Den amino-terminale sekvensen til den mest foretrukne pre-pro formen av GDNF er merket med en stjerne.

Figur 14 (SEQ ID NO: 2) angir den gitte aminosyresekvensen til moden GDNF.

Figur 15 angir resultatene av renset B49 celle GDNF og human rekombinant CNTF for å fremme overlevelsen av parasympatetiske neuroner fra kylling embryo ciliære ganglia. Økende optisk tetthet på Y-aksen representerer øket neuronal overlevelse. X-aksen representerer reduserende konsentrasjoner av hver neurotrofisk faktor. Kurven merket med kontroll er lik volumene av inaktive HPLC fraksjoner ved siden av de som inneholder GDNF anvendt for å danne kurven merket GDNF. Figur 16 angir resultatene av renset B49 celle GDNF og human rekombinant CNTF for å fremme overlevelsen av sympatetiske neuroner fra kylling embryo symptatetisk kjedeganglier. Økende optisk tetthet på Y-aksen representerer økende neuronal overlevelse. X-aksen representerer reduserende konsentrasjoner av hver neurotrofisk faktor. Kurven merket kontroll er lik volumene av inaktive HPLC fraksjoner ved siden av de som inneholder GDNF anvendt for å danne kurven merket GDNF. Figur 17 angir resultatene av bioanalyse av COS celle kondisjonert medium for evnen til å øke dopaminopptaket til mesencefaliske dopaminerge neuroner i kultur. Y-aksen representerer mengden av radiomerket dopamin som er tatt opp i forhold til økende mengder av konsentrert COS celle kulturmedium på X-aksen. Kurvene merket B-l representerer serumfritt kondisjonert medium fra COS celler transfektert med GDNF genet i riktig orientering for ekspresjon av GDNF. Kurven merket C-l representerer det serumfrie kondisjonerte mediumet fra COS celler transfektert med GDNF genet i motsatt orientering og som forhindre ekspresjon av GDNF. Figur 18 angir resultatene av bioanalysen til COS celle kondisjonert medium for evnen til å øke overlevelsen i kultur av symptatetiske neuroner fra den sympatetiske kjeden i kylling embryor. Y-aksen presenterer mengden av MTT farge redusert av kulturer og er proporsjonal med den neuronale overlevelsen. X-aksen representerer økende fortynning av konsentrert COS celle kulturmedium. Kurven merket GDNF representerer det serumfrie kondisjonerte mediet fra COS celler transfektert med GDNF genet i riktig orientering for ekspresjon av GDNF. Kurven merket kontroll representerer serumfritt kondisjonert medium fra COS celler transfektert med GDNF genet i motsatt orientering som forhindrer ekspresjon av GDNF. Figur 19 (SEQ ID NO: 5) angir en del av nukleinsyresekvensen oppnådd for human GDNF som beskrevet i eksempel 2 se nedenfor, inkludert hele delen av genet kodende for moden human GDNF. Også angitt er den gitte aminosyresekvensen for moden human GDNF. Aminosyresekvensen for moden human GDNF er streket under. Figur 20 angir evnen som GDNF har til å stimulere dopaminopptaket og tyrosinhydroksylase (TH) immunfarging i dopaminerge neuroner. Kulturene ble etablert som beskrevet i eksempel IB. GDNF ble tilsatt på utsåingsdagen og tappet etter 9 dager in vitro. A. <3>H-DA opptaket ble målt etter 15 dager in vitro. B. Kulturene ble fiksert etter 16 dager in vitro med 4% paraformaldehyd, omfattende vasket, permeabilisert med 0,2% Triton x-100 og farget med polyklonalt antistoff mot TH (Eugine Tech International, Allendale, NJ). Primær antistoff binding ble visualisert ved anvendelse av et Vectastain ABC kit (Vector LAbs, Burlingame, CA). Figur 21 angir spesifisiteten til GDNF overfor dopaminerge neuroner. Kulturer ble etabler som beskrevet i eksempel IB. GDNF ble tilsatt på utsåingsdagen. A. ^H-DA opptaket ble målt etter 7 dager in vitro. B. l^OGABA opptaket ble målt etter 8 dager in vitro. Cellene ble inkubert og behandlet som for <3>H-DA opptaket, med unntagelse av at opptaksbufferen består av Kreb-Ringers fosfastbuffer, pH 7,4. inneholdende 5,6 mM glukose, 1,3 mM EDTA, 10 um aminooksyeddiksyre (for å forhindre GABA nedbrytningen), 2mM fl-alanin (for å inhibere glia opptaket av GABA) og 0,1 um ^ C-GABA (150 mCi/mmol, New England Nuclear, Boston, MA). I nærvær av 1 mM diammoamørsyre (DABA), som er en potent inhibitor av <14>C-GABA opptaket til GABA neuroner, ble -opptaket redusert til 10%. Kontrollverdiene i nærvær av DABA ble substrahert fra de eksperimentelle verdiene. Figur 22 (SEQ ID NO: 8) angir en del av nukleinsyresekvensen oppnådd for human GDNF, som beskrevet i eksempel 2D nedenfor, inkludert den kodende sekvensen til aminosyrene 1-50 av human pre-pro GDNF. Også angitt er den gitte aminosyresekvensen for de første 50 aminosyrene av human pre-pro GDNF. Denne informasjonen sammen med den kodende sekvensinformasjonen gitt i figur 19 tilveiebringer den fullstendige kodende sekvensen for human pre-pro GDNF og den gitte aminosyresekvensen for det humane pre-pro GDNF proteinet. Figur 23 angir et kart av SacII og Pstl seter innenfor plasmidet pBSSK- y3AluI, som beskrevet i eksempel 2D nedenfor. Figur 24 angir spesifisiteten til GDNF overfor dopaminerge neuroner. Kulturene ble dannet som beskrevet i eksempel IB. GDNF ble tilsatt på utsåingsdagen og opptaket ble målt etter 6 dager in vitro. A angir dopaminopptaket og B angir serotoninopptaket. Figur 25 angir Coomassie blå farget SDS-PAGE kjørt under reduserende betingelser av fraksjoner fra kromatografi av et bakterielt ekstrakt inneholdende urefoldet GDNF på S-sepharose kolonne før refolding (se eksempel 6C). Kolonnene 2-8 representerer påfølgende fraksjoner fra kolonneeluatet. Fraksjonene 3-5, anriket for GDNF, ble slått sammen for refolding. Kolonne 1 er en molekylvektsstandard (SDS-70L, Sigma). Figur 26 angir Coomasie blåfarget SDS-PAGE av GDNF oppløsning, før refolding (kolonne 6 og 13) etter refolding (kolonne 2) og etter refolding og påfølgende tilbakereduksjon med 150mM 2-merkaptoetanol (kolonne 5). Materialet før refolding og etter tilbakereduksjon som ble kjørt som en monomer ved omtrent 16 kDA. GDNF etter vellykket refoldingskjøringer (uten reduksjon) som en dimer ved omtrent 30 kDa (se eksempel 6C). Kolonne 15 er molekylvektsstandarder (SDS-70L, Sigma). Figur 27 angir resultatene av en bioanalyse ved anvendelse av refoldet GDNF og måler evnen til å fremme overlevelsen av kyllingembryo sympatetiske neuroner i kultur. Bioanalyseprosedyren er som beskrevet i eksempel 4A. Optisk tetthet (proporsjonal med antall overlevende neuroner) på Y-aksen er plottet mot GDNF konsentrasjonen på X-aksen (bestemt ved laser-densitometriscanning av coomassie blå fargede SDS-PAGE geler). Beregnet ED50 av refoldet GDNF for kyllingembryo sympatetisk neuron overlevelse er på omtrent 3 ng/ml. Figur 28 angir resultatene av en bioanalyse ved anvendelse av refoldet GDNF, måling av evnen til å øke dopaminopptaket til nigral dopaminerge neuroner i kulturer i rotteembryonisk mesencefalon. Bioanalyseprosedyren er som beskrevet i eksempel IB. Dopaminopptaket på Y-aksen er plottet mot GDNF konsentrasjonene på X-aksen. Beregnet ED50 av refoldet GDNF for øket dopaminopptak i disse kulturene er omtrent 3pg/ml.

Det vil nå i detalj bli referert til foretrukne utførelsesformer ifølge oppfinnelsen som sammen med de følgende eksemplene beskriver prinsippene ifølge oppfinnelsen.

Før foreliggende oppfinnelse var GDNF ikke blitt identifisert som en diskret biologisk aktiv forbindelse og det eksisterte ikke i en vesentlig ren form. Som beskrevet heri er det gitt en detaljert beskrivelse av GDNF sammen med en beskrivelse av: fysiske, kjemiske og biologiske karaktertrekk, anvendelse derav, dannelsen derav, nyttige sammensetninger som inneholder disse, nukleinsyresekvenser kodende for dette, vektorer inneholdende slike nukleinsyresekvenser, vertsceller transformert av slike vektorer, rekombinante teknikker for produksjon derav og andre aspekter ifølge oppfinnelsen.

GDNF er et protein som kan bli identifisert i eller oppnådd fra glialceller og som utviser neurotrofisk aktivitet. GDNF er et dopaminerg neurotrofisk protein som er kjennetegnet delvis av dets evne til å øke dopaminopptaket på embryoniske forløpere av substantia nigra dopaminerge neuroner og videre ved dets evne til å fremme overlevelsen av parasympatetiske og sympatetiske nerveceller. Vesentlig renset GNDF er ytterligere karakterisert på flere måter:

1. det har en spesifikk aktivitet på minst omtrent 12.000 TU/ug.

2. Det har en molekylvekt på reduserende SDS-PAGE på omtrent 20-23 kD.

3. Det har en molekylvekt på ikke-reduserende SDS-PAGE på omtrent 31 -42 kD.

4. Det har en spesifikk aktivitet på minst omtrent 24.000 ganger høyere enn den spesifikke aktiviteten til B49-kondisjonert medium. 5. Det har evnen til å oppregulere tyrosin hydroksylase immunreaktiviteten i mesencefalisk kultur. 6. Den har den aminoterminale aminosyresekvensen som vist i figur 8 (SEQ ID NO: 1) 7. Det har den indre aminosyresekvensen som vist i figur 12 (SEQ ID NO: 2). GDNF ifølge foreliggende oppfinnelse er mer fullstendig beskrevet i detalj nedenfor. Det er å bemerke at dette aspektet ifølge oppfinnelsen dekker et hvilket som helst dopaminerg neurotrofisk protein som har en aminoterminal aminosyresekvens som er lik eller vesentlig homolog med den som er gitt i figur 8 (SEQ ID NO: 1). Foreliggende oppfinnelse innbefatter også et hvilket som helst dopaminerg neurotrofisk protein med en indre aminosyresekvens som er lik eller vesentlig homolog med den som er gitt i figur 12 (SEQ ID NO: 2).

Foreliggende oppfinnelse innbefatter et nytt dopaminerg neurotrofisk protein som er definert heri som glial avledet neutrofisk faktor (GDNF). GDNF er blitt identifisert i og isolert fra et serum-fritt vekstkondisjonert medium av B49 glioblastomceller i en vesentlig renset form.

GDNF er blitt renset og karakterisert, og delaminosekvensene til det rensede materialet er blitt oppnådd. Basert på den partielle aminosyresekvensen som er blitt oppnådd er DNA prøver blitt konstruert for oppnåelse av en rotte cDNA klon som kan bli anvendt i rekombinant produksjon av GDNF. Nukleinsyresekvensen til en slik klon og den gitte aminosyresekvensen til rotte GDNF er gitt i figurene 13 (SEQ ID NO: 3) og 14 (SEQ ID NO: 4).

Den amino-terminale aminosyresekvensen til GDNF er blitt bestemt og er vist i figur 8 (SEQ ID NO: 1). En del av den indre aminosyresekvensen til GDNF er også blitt bestemt og er vist i figur 12 (SEQ ID NO: 2). Renset GDNF har en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 31-42 kD på SDS-PAGE under ikke-reduserende betingelser og omtrent 20-23 kD på SDS-PAGE under reduserende betingelser. Uten å være begrenset til noen teori er det postulert at denne informasjonen er i samsvar med GDNF som er en glykosylert, disulfid-bundet dimer i dets naturlig forekommende tilstand.

Som beskrevet i større detalj i eksempel 6C nedenfor fører ekspresjon av det humane

GDNF genet i et bakterielt ekspresjonssystem til produksjonen av rekombinant human GDNF eller rhGDNF. Materialet isolert etter ekspresjonen er vesentlig biologisk ikke-aktivt og eksisterer som en monomer. Etter refolding eksisterer GDNF som en biologisk aktiv disulfid-bundet dimer. GDNF er derfor en disulfid-bundet dimer i dets naturlige biologiske aktive form. Foreliggende oppfinnelse innbefatter derimot GDNF i både monomerisk og dimerisk og biologisk ikke-aktiv og biologisk aktiv form.

Prøver ble dannet basert på nukleinsyresekvensen til rotte GDNF for å klone det genomsike DNA genet kodende for human GDNF. Det humane genet kodende for moden GDNF og aminosyresekvensen til human moden GDNF er gitt i figur 18 (SEQ ID NO: 5).

GDNF kan også bli karakterisert ved dets evne til å øke dopaminopptaket på embryoniske forløpere av substantia nigra dopaminerge neuroner som beskrevet i eksempel 1 nedenfor. GDNF kan videre bli karakterisert ved dets evne til å fremme overlevelsen av parasympatetiske og sympatetiske nerveceller som beskrevet i eksempel 4 nedenfor.

GDNF kan bli karakterisert i tillegg ved dets evne til å oppregulere tyrosinhydroksylase immunreaktiviteten i mesencefaliske kulturer. Et eksempel på denne karakteristikken er beskrevet i eksempel 1E og vist i figur 20.1 tillegg er det vist at GDNF har en viss spesifisitet overfor dopaminergikse neuroner relativt til neuroner generelt. For eksempel var dette demonstrert ved den begrensede virkningen på gamma-aminosmørsyre (GABA) opptaket i neuroner inneholdende GABA. Dette er også beskrevet i eksempel 1E og vist i figur 21. GDNF er også blitt vist å ha begrenset, om noen, virkningen på serotoninopptaket i serotonergiske neuroner. Dette er beskrevet i eksempel 1E og vist i figur 24.

I denne beskrivelsen skal en hvilken som helst referanse til glial cellelinjeavledet neurotrofisk faktor blir konstruert for å referere til neurotrofiske faktorer av en hvilken som helst opprinnelse som er vesentlig homolog med og som er biologisk ekvivalent med GDNF som er karakterisert og beskrevet heri. Grad av homologi mellom rotte og humant protein er omtrent 93% og alle pattedyr GDNF vil ha en lignende høy grad av homologi. Slike GDNF kan eksistere som dimerer i deres biologiske aktive form.

Foreliggende oppfinnelse omfatter glykosylerte og ikke-glykosylerte former av GDNF samt forkortede former av naturlig forekommende og rekombinant GDNF som beskrevet heri. I en ytterligere utførelsesform er GDNF modifisert ved kobling av en eller flere polyetylenglykol (PEG) eller andre repeterende polymeriske deler. Foreliggende opprinnelse omfatter også GDNF rekombinant produsert i bakterielle ekspresjonssystemer inneholdende et amino-terminalt metionin rest.

Med "biologisk ekvivalent" som anvendt i beskrivelsen og kravene menes sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse som kan demonstrere noen eller alle av disse neutrotrofiske egenskapene på en lignende måte, men ikke nødvendigvis i samme grad som GDNF isolert fira B49 kondisjonert medium. Med "vesentlig homolog" som anvendt i beskrivelsen og kravene menes en grad av homologi med GDNF isolert fira B49 kondisjonert medium i overskudd av det som blir angitt i tidligere rapportert GDNF. Grad av homologi i overskudd av 70%, fortrinnsvis i overskudd av 80%, og fortrinnsvis i overskudd av 90%, 95% eller 99%. Prosentandel homologi som beskrevet heri blir beregnet som prosentandel av aminosyreresidiene som finnes i den minste av de to sekvensene som er i samsvar med identiske aminosyreresidier i sekvensen som sammenlignet med 4 gap i en lengde på 100 aminosyrer kan bli innført for å behjelpe oppstillingen som angitt av Dayhoff i Atlas of Protein Sequence and Structrue Vol. 5, s. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, DC, spesifikt inkorporert heri som referanse. Også innbefattet som vesentlig homolog er et hvilket som helst GDNF som kan bli isolert ved kryssreaktivitet med antistoffer mot GDNF beskrevet heri eller hvor genene kan bli isolert ved hybridisering med genet eller med segmenter av genet for GDNF beskrevet heri.

En foretrukket GDNF ifølge foreliggende oppfinnelse er blitt isolert fra B49 kondisjonert medium og er blitt isolert i en vesentlig renset form. En ytterligere foretrukket GDNF blir dannet ved rekombinant DNA teknologi for å tilveiebringe GDNF i en vesentlig renset form. Ifølge foreliggende oppfinnelse menes "ren form" eller "vesentlig ren form", når anvendt for å referere til GDNF beskrevet heri, et preparat som er vesentlig fri for andre proteiner som ikke er GDNF. GDNF ifølge foreliggende oppfinnelse er minst 50% ren, fortrinnsvis 75% ren og mer foretrukket er 80%, 95% eller 99% ren. I en utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse er GDNF proteinpreparatet av en slik vesentlig ren form slik at det muliggjøres at fagfolk innenfor dette området kan bestemme i det minste deler av dets aminosyresekvens uten først å utføre ytterligere rensningstrinn.

I en foretrukket utførelsesform ifølge denne oppfinnelsen blir GDNF renset fra B49 kondisjonert medium som beskrevet i eksempel 1 nedenfor. Med informasjonen angitt heri vil det være innlysende for fagfolk innenfor dette området at andre sekvenser av GDNF kan bli identifisert og at rensing av GDNF fra slike kilder kan bli oppnådd generelt ifølge fremgangsmåten for rensing presentert heri..

Den dopaminerge aktiviteten til GDNF blir anvendt for ålette rensningsprosessen. Bioanalyse for dopaminerg neutrofiske aktiviteter er beskrevet i eksempel IB nedenfor. Kulturer av dissosierte mesencefaliske celler blir dannet enten i serumrike eller serumfrie omgivelser. Prøver som skal bli testet for dopaminerg aktivitet blir avsaltet og i serier tilsatt til cellekulturene og skålene blir inkubert i 6 dager ved 37°C i en fuktig atmosfære inneholdende 6,5% CO2. Kulturene, i nærvær av testmaterialet blir deretter inkubert ved 37°C med tritiert dopamin (^H-DA). Dopaminopptaket blir stoppet, cellene vasket og dopaminopptaket analysert ved scintillasjonstelling av oppnådd tritium i kulturene.

Rensing av GDNF er beskrevet nedenfor i detalj i eksempel 1C. Rensningsprosessen er beskrevet i tabell I. Kondisjonert medium utgangsmaterialer blir dannet fra B49 glioblastomceller ved å plassere cellene i serumfritt medium i to dager når det kondisjonerte mediet blir samlet og tappet.

Denne syklusen blir gjentatt for å oppnå høsting tre ganger av det kondisjonerte mediet for hver batch av B49 cellene. Det kondisjonerte mediet blir sentrifugert og konsentrert omtrent 10 ganger før ytterligere rensning.

Det første prepareringstrinnet av denne Tåblandingen definert heri som serumfritt vekstkondisjonert medium av B49 glioblastomer er innføring av det kondisjonerte mediet inn i en heparin sepharose kolonne ekvilibrert med 50 mM NaPI buffere, pH 8,0, inneholdende 0,15 N NaCl. En gradient bufferoppløsning dannet av 50 mM NaPi, pH 8,0 inneholdende 1,5 N NaCl blir ført inn i kolonnen etter at elueringen er stabilisert. Fraksjoner fra denne kromatografien blir målt for GDNF aktivitet og fraksjoner inneholdende GDNF aktivitet blir slått sammen for ytterligere rensning.

Sammenslåtte fraksjoner blir utsatt for hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC) på en Sepharose kolonne med en oppløsningsmiddelbuffer bestående av 50 mM NaPi buffer, pH 7,4 inneholdende 0,5 N NaCl. Igjen blir GDNF aktiviteten til fraksjonene som blir oppnådd bestemt. En enkelt fraksjon fra denne prosedyren blir deretter surgjort og applisert på en C8 revers fase høyytelse væskekromatografi (HPLC) kolonne. Fraksjoner identifisert inneholdende GDNF aktivitet blir kombinert for ytterligere rensning og for proteinsekvensering. Som vist i tabell 1 nedenfor har GDNF oppnådd ved dette punktet en spesifikk aktivitet på omtrent 24.000 ganger i overskudd av det kondisjonerte mediet. Aminoterminal sekvensering av proteinet oppnådd ved dette punktet gir den aminoterminale sekvensen som vist i figur 8 (SEQ OD NO: 1).

Ytterligere rensning av GDNF oppnådd fra HPLC kan bli oppnådd ved å utføre preparativ SDS-PAGE på fraksjoner inneholdende GDNF aktivitet. Tilsatt til proteininneholdende fraksjoner er buffer inneholdende glycerol og SDS og oppløsningen blir kjørt på ikke-redusert 15% SDS-PAGE med elektroforese utført ved 10°C ved 40 mA/gel i 2 timer. Delen av gelen som tilsvarer en molekylvekt på omtrent 30-42 kD er blitt vist å inneholde GDNF aktivitet ifølge bioanalysen. En annen HPLC kromatografi av materialet isolert fra SDS-PAGE tilveiebringer en enkelt topp av GDNF som vist i figur 6.

Aminoterminale sekvenser til GDNF ble bestemt for materialet fra HPLC før og etter preparativ SDS-PAGE. Prosedyrene anvendt for oppnåelse av aminosyresekvenser av renset GDNF er gitt i eksempel ID. Den aminoterminale sekvensen ble oppnådd med en gassfase proteinsekvenator. Indre sekvenser ble oppnådd fra materialet oppnådd ved HPLC som ikke var blitt ytterligere renset ved preparativ SDS-PAGE. Den indre aminosyresekvensene ble oppnådd ved inkubering av renset GDNF med trypsin. Trypsinfragmentene som ble oppnådd ble separert ved HPLC. Et fragment ble funnet å inneholde de første 13 aminosyreresidiene til den aminoterminale sekvensen av ubehandlet protein. Et annet fragment ble behandlet med CNBr, renset ved HPLC, redusert og på ny renset på HPLC. Aminosyresekvensen som er oppnådd er vist i figur 12 (SEQ ID NO:2). Sekvensene angitt i parenteser ble bestemt ved en mindre sikkerhetsgrad.

Foreliggende beskrivelse viser fremgangsmåter for kloning av genet for GDNF og genet som ble identifisert kodende for GDNF. En detaljert prosedyre for kloning av gener fra rotte og mennesker for GDNF er gitt nedenfor i eksempel 2. Igjen er det å bemerke at fagfolk kan anvende andre metoder for kloning av et slikt gen i lys av beskrivelsen heri. Kloning av gener fra andre arter kodende for GDNF vil fremkomme i lys av beskrivelsene og prosedyrene beskrevet heri.

Rotte GDNF genet beskrevet heri ble oppnådd fra et cDNA bibliotek konstruert fra poly A+ RNA isolert fra B49 celler som ble screenet med en degenerert oligonukleotidprøve basert på aminosyresekvensen oppnådd fra renset GDNF. cDNA ble oppnådd ifølge standardprosedyrer, behandlet for å inneholde EcoRI-spaltede linkere og skutt inn i Zap II kloningsvektoren. Den anvendte hybriteringsprøven ble <32>p<->merket og besto av følgende degenererte oligonukleotid (SEQ ID NO: 7):

Flere positive kloner ble oppnådd og en klon (XZapII76.1) ble positivt identifisert ved DNA sekvensering og koder for en del av GDNF som ikke ble anvendt for konsumering av den degenererte prøven.

Prosedyrer for oppnåelse av nukleotidsekvensen til cDNA klonen innbefattet i X,ZapII76.1 er gitt i eksempel 2B nedenfor. Nukleotidsekvensen til de første 877 baseparene av 5' enden til cDNA klonen ble bestemt og vist i figur 13 (SEQ ID NO:3). I figur 13 inneholder den viste klonen en åpen leseramme (ORF) med 227 aminosyrer som innbefatter amino-terminusen til renset GDNF og er i samsvar med sekvensen for et indre peptid oppnådd ved spaltning av renset GDNF.

Aminosyresekvensen angitt i figur 14 (SEQ ID NO: 4) viser aminosyresekvensen for "moden GDNF". Med "moden GDNF" menes sekvensen til renset GDNF oppnådd fra B49 kondisjonert medium. Renset GDNF kan selvfølgelig eksistere som en dimer eller annen multimer og kan bli glykosylert eller kjemisk modifisert på andre måter. Moden GDNF kan bli forkortet ved karboksylterminusen, spesielt ved proteolytisk prosessering av lys-arg residiene 6 og 5 residier fra den karboksylterminale enden. Undersøkelse av nukelinsyresekvensen til _ZaplI76.1 rotte klonen som vist i fig. 13 (SEQ ID NO: 3) tyder på at GDNF opprinnelig blir translatert som et pre-pro-GDNF polypeptid og at proteolytisk prosessering av signalsekvensen og "pro" delen av dette molekylet resulterer i renset GDNF som har samme modne sekvens som den som blir oppnådd fra B49 kondisjonert medium. Det blir postulert at pre-pro-GDNF polypeptidet begynner ved det første ATG--methionin kodende — kodonet ved 5' enden av klonen (posisjon 50 i figur 13). Foreliggende oppfinnelse innbefatter derfor hvilke som helst og alle pre-pro GDNF polypeptidene som kan bli translatert fra genet vist i figur 13, samt hvilke som helst og alle pre-pro-GDNF polypeptider translatert fra en mer fullstendig klon som lett kan bli oppnådd av fagfolk innenfor dette området ved anvendelse av standard laboratorieprosedyrer og klonen beskrevet heri.

Oversikt over rotte nukleinsyresekvensen gitt i fig. 13 (SEQ ID NO: 2) viser at den antatte aminosyresekvensen lokalisert mellom posisjonene 518 og 538 er Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu som er i samsvar med aminosyresekvensen bestemt for et peptid avledet fra renset moden GDNF ved hjelp av metoden beskrevet i seksjonen for indre sekvens i eksempel 1 nedenfor. Et TGA stopp kodon i posisjon 683 terminerer ORF. Den antatte lengden til renset GDNF er dermed på 134 aminosyreresidier og den antatte molekylvekten til dette polypeptidet er 14,931. To potensielle N-koblede glykosyleirngsseter oppstår i posisjonene 425 og 533. Glykosylering ved en eller begge av disse setene kan øke moelkylvekten til molekylet.

Serinresten i posisjon 281 som tilsvarer begynnelsen av sekvensen til renset moden GDNF kommer etter sekvensen lys-arg som tilveiebringer et potensielt proteolytisk spaltningssete for prosessering av en antatt forløperform av GDNF for å produsere formen av molekylet som blir renset fra B49 cellene. Et potensielt translasjonsinitieringskodon (ATG) oppstår i posisjon 50 i sekvensen og blir etterfulgt av en potensiell sekretorisk signalsekvens. Sekvenser som flankerer dette ATG viser tilstrekkelig likhet med Kozak konsensus sekvensen (Kozak 1987 Nucleic Acids Res. 15:125-48) for å indikere at dette ATG kan bli anvendt som et translasjonelt initeringssete. Dette ATG er 5' ATG i sekvensen til cDNA klonen. Disse faktaene tyder på at det er et potensielt startsete for translasjons av en forløperform av GDNF.

Disse ovenfor angitte trekkene til nukleotidsekvensen til rotte cDNA klonen tyder på muligheten av at GDNF innledningsvis blir translatert som et pre-pro GDNF polypeptid og at proteolytisk prosessering av signalsekvensen og "pro" delen av dette molekylet resulterer i produksjon av formen av GDNF som blir renset fra B49 celle kondisjonert medium. Tilstedeværelse av andre former av GDNF er også i samsvar med sekvensdataene. To andre potensielle ATG translasjonsstart oppstår innenfor 681 bp ORF: en i posisjon 206 og andre 242. Disse ATG er beliggende oppstrøms for start av den amino-terminale sekvensen til renset GDNF. I eukarytoer oppstår translasjonen initiering generelt med 5'-ytterst ATG av mRNA (Kozak, supra, og det er tilfellet der en del av translasjonsinitieringen oppstår ved en nedstrøms ATG. Alternative forløperformer av GDNF kan oppstå ved translasjonen initiering av disse ATG kodonene. Proteolytisk prosessering av disse polypeptidene kan resultere i produksjon av den samme formen av renset GDNF observert i B49 cellekondisjonert medium. Den åpne leserammen utgår gjennom 5'-enden av sekvensen til cDNA klonen. Det er derfor mulig at initiering av translasjonen oppstår ved en oppstrøms ATG ikke til stede i cDNA klonen. GDNF kan derved bli translatert som en større forløper inneholdende aminosyresekvensen beskrevet her og ytterligere oppstrømssekvens. Prosessering av en slik hypotetisk forløperform kan også føre til produksjon av renset form av GDNF rapportert heri. Det vil være mulig å detektere potensielle oppstrøms ATG start ved sekvensering av 5'-enden til mRNA inneholdende GDNF genet via primer ekstensjon med revers transkriptase (Maniatis et al. ovenfor). I tillegg kan andre cDNA kloner bli oppnådd fra B49 bibliotek og 5-enden av disse klonene kan bli sekvensert. Størrelsen på 5' mRNA beliggende oppstrøms for den første ATG kan bli bestemt ved teknikker ifølge "Sl kartlegging" (Maniatis et al. ovenfor) og/eller enkel størrelsesberegning av primer ekstensjonsproduktene til revers transkriptase reaksjonen. I det forskjellige antatte former av det primære translasjonsproduktet som inneholder sekvensene kodende for renset GDNF kan bli postulert definerer den partielle DNA sekvensen presentert her for cDNA klonen innbefattet i den rekombinante fagen _ZapII76.1 klart den kodende sekvensen som utgjør renset GDNF polypeptid isolert fra 349 cellekondisjonert medium.

I eksempel 2C nedenfor er kloningen av det humane genet som koder for GDNF beskrevet. Et humant genomisk bibliotek ble screenet med en prøve avledet fra rotte cDNA klonen beskrevet i eksempel 2B. En genomisk DNA klon av humant GDNF genet blir identifisert og sekvensen av genet kodende for moden human GDNF er gitt i fig. 19 (SEQ ID NO: 5).

Sekvensen angitt i fig. 19 for genet for human GDNF angir ikke hele den kodende sekvensen for pre-pro delen av GDNF. Prosessen for oppnåelse av den kodende sekvensen for de første femti aminosyrene til human pre-pro GDNF er beskrevet nedenfor i eksempel 2D. Sekvensen oppnådd er angitt i fig. 22 (SEQ ID NO: 8). Kart av plasmid pB55K- X.3Alul anvendt for å oppnå sekvensen er vist i fig. 23.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter nukleinsyresekvenser kodende for GDNF. Relativt sterkt homologe sekvenser kodende for rotte (fig. 13) (SEQ ID NO: 3) og human (fig. 19) (SEQ ID NO: 5) GDNF er gitt heri. Også innbefattet innenfor rammen av denne oppfinnelsen er vesentlig like nukleinsyresekvenser som koder for de samme eller meget homologe aminosyresekvenser. Med preparering av en konstruksjon for ekspresjon av moden GDNF i et bakterielt ekspresjonssystem så som E. coli kan for eksempel visse kodoner i nukleinsyresekvensen gitt i fig. 19 (SEQ ID NO: 5) bli substituert med kodoner som lettere blir uttrykt i E. coli ifølge velkjente og standardprosedyrer. Like modifiserte nukleinsyresekvenser kan bli innbefattet innenfor rammen av denne oppfinnelsen.

Spesifikke nukleinsyresekvenser kan bli modifisert av fagfolk innenfor dette området. Foreliggende oppfinnelse innbefatter derfor også alle nukleinsyresekvenser som koder for aminosyresekvenser for moden rotte og moden human GDNF som angitt i figurene 14 (SEQ ID NO: 4) og 19 (SEQ ID NO: 5) og pre-pro rotte GDNF som angitt i figur 13 (SEQ ID NO: 3) og for pre-pro human GDNF som angitt i figurene 19 (SEQ ID NO: 5) og 22 (SEQ ID NO: 8). Foreliggende oppfinnelse inkorporerer også nukleinsyresekvenser som vil hybridisere med alle slike nukleinsyresekvenser, eller komplementer av nukleinsyre sekvenser etter behov, og koder for et polypeptid som har dopaminerg aktivitet. Foreliggende oppfinnelse innbefatter også nukleinsyresekvenser som koder for polypeptider med dopaminerg aktivitet og som blir gjenkjent av antistoffer som blir bundet til GDNF.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter også vektorer omfattende ekspresjonsregulatoriske elementer operabelt koblet til hvilke som helst av nukleinsyresekvensen innbefattet innenfor rammen av oppfinnelsen. Foreliggende oppfinnelse inkorporerer også vertsceller, av forskjellige former, som er blitt transformert med vektor omfattende ekspresjonsregulatoriske elementer operabelt koblet til hvilke som helst av nuklein-syresekvensene innbefattet innenfor rammen av denne oppfinnelsen.

Ekspresjon av GDNF i COS celler er beskrevet nedenfor i eksempel 5. Genet kodende for GDNF angitt i figur 13 ble subklonet inn i plasmidvektor pSG5 som er en vektor konstruert for forbigående ekspresjon av klonede genceller så som COS celler. Plasmider inneholdende GDNF genet i riktig og uriktig orientering ble selektert og DNA transfektert inn i COS-7 celler. Etter dyrkning ble de transformerte cellene høstet. COS-7 kondisjonert medium ble testet for bioaktivitet i både dopaminerg analyse og sympatetisk ganglia neuron analyse. Det kondisjonerte mediet fra cellene inneholdende genet for GDNF i riktig orientering ble funnet å ha biologisk aktivitet i begge analysene og indikerer at biologisk aktivt GDNF var blitt vellykket produsert via rekombinante DNA prosesser.

En foretrukket utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse blir human moden GDNF dannet ved rekombinant DNA teknologi i et bakterielt ekspresjonssystem.

Ekspresjon av humant GDNF i E. coli er beskrevet nedenfor i eksempel 6. Den delen av det humane GDNF genet som koder for moden humant GDNF som vist i figur 19 ble anvendt for å danne en human GDNF konstruksjon. En slik konstruksjon ble ligert inn i en plasmidvektor som ble transformert inn i E. coli stamme JM107. Etter dyrking av de transformerte vertscellene ble produsert GDNF høstet. En del med ventet molekylvekt for moden human GDNF (omtrent 15000 dalton) ble oppnådd og aminoterminal sekvensering bekreftet at det oppnådde proteinet var modent humant GDNF.

Refolding og naturering av humant GDNF uttrykt i E. coli er beskrevet nedenfor i eksempel 6C. I utførelsesformen ifølge oppfinnelsen ble uttrykt proteininneholdende ekstrakt oppnådd delvis renset før refolding ved ionebyttekromatografi på S-Sepharose Fast Flow harpiks. Refolding ble oppnådd ved tilsetning av først ditiothreitol og deretter glutationdinatriumsalt og deretter en refoldingsbuffer til GDNF-inneholdende ekstrakt. Refoldet rhGDNF var vesentlig fullstendig biologisk aktiv og eksisterte som en disulfid-bundet dimer i den biologiske aktive formen. GDNF før refolding og etter reduksjon av refoldet materiale eksisterte i en monomer tilstand og var vesentlig biologisk inaktiv.

GDNF kan også bli produsert ved ekspresjon i andre ekspresjonssystemer. Med nukleinsyresekvensen kodende for moden human GDNF som vist i figur 19 kan fagfolk for eksempel innenfor dette området produsere GDNF i andre ekspresjonssystemer. Vektorer inneholdende nukleinsyresekvensen kodende for GDNF operabelt koblet til ekspresjonsregulatoriske elementer kan bli transformert inn i andre mikroorganisme vertsceller inkludert Bacillus, Pseudomonas og gjær. Baculovirus ekspresjonssystemet kan også bli anvendt.

Som nevnt ovenfor angår oppfinnelsen også en anvendelse av proteinet ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et preparat for å behandle/forebygge nerveskade hos pasienter som lider derav.

En sykdom eller medisinsk indikasjon er ansett å være nerveskade dersom overlevelsen eller funksjonen av nerveceller og/eller aksonale prosesser blir kompromitert. I en foretrukket utførelsesform oppstår en slik nerveskade som resultat av en av følgende tilstander: 1) fysisk skade som forårsaket degenerering av aksonale prosesser og/eller nervecelle legemet nær ved skadestedet, 2) iskemia som i slag 3) utsetting for neurotoksiner så som cancer og AIDS kjemoterapeutiske midler cisplatinum og dideoksycytidin (ddC), 4) kroniske metabolske sykdommer, så som diabetes eller nyrefeilfunksjon og 4) neurodegenerative sykdommer så som Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og amyotrofisk lateral sklerose (ALS) som forårsaker degenerasjon av spesifikke neuronal populasjoner. En ikke utelukkende liste av tilstander som involverer nerveskade innbefatter Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, Amyotrofisk Lateral Sklerose, slag, diabetisk polyneuropati, toksisk neuropati forårsaket av cancer kjemoterapeutiske midler taksol eller cisplatin eller vincristin, toksisk neuropati forårsaket av AIDS kjemoterapeutiske midler ddl eller ddC og fysisk skade på nervesystemet så som det som blir forårsaket ved fysisk skade av hjernen og ryggmargen eller kuttskader på arm og hånd.

Metoder for å produsere GDNF er også beskrevet heri. En beskrevet fremgangsmåte består av isolering av GDNF fra forskjellige kilder, så som glial cellelinje kondisjonert medium. En annen metode innbefatter isolering av gener ansvarlige for kodende GDNF, kloning av genet i egnede vektorer og celletyper og uttrykking av genet for å produsere GDNF. Sistnevnte metode som er et eksempel på rekombinante DNA metoder generelt er en foretrukket fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse. Rekombinante DNA metoder er delvis foretrukket på grunn av at de kan oppnå sammenlignbare høyere mengder av protein med større renhet. Rekombinant humant GDNF er det mest foretrukne proteinet for fremstilling av terapeutiske sammensetninger og for behandling av nerveskade.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter midler for å identifisere og klone gener som koder for proteiner med felles aminosyresekvenshomologi som GDNF samt alle slike identifiserte proteiner. En pattedyrgenfamilie omfattende tre neurotrofiske faktorer er blitt beskrevet (Leibrock et al. 1989 Nature 341:149-152, Maisonpierre et al. 1990 Science 247:1446-1451). De modne formene av de tre proteinene som omfatter denne familien (nervevekstfaktor (NGF), hjerneavledet neurotrofisk faktor (BDNF) og neutrotrofin-3 (NT-3)) har felles omtrent 50% aminosyre identitet med hverandre. Posisjonene til de seks cysteinresidiene til stede i hvert av disse proteinene blir nøyaktig konservert. Til tross for at de er strukturert like utviser disse tre proteinene forskjellig vevsfordeling (Ernfors et al. 1990 Neuron 5:511-526, Maisonpierre et al. 1990 Neuron 5:501-509 og Phillips et al. 1990 Science 250:290-294) og forskjellige in vitro aktiviteter (Rosenthal et al. 1990 Neuron 4:767-773, Whittemore et al. 1987 Brain Res Rev 12:439).

GDNF utviser ingen signifikant homologi med noen av de tidligere beskrevne proteinene, men uidentifiserte gener kan eksistere som koder for proteiner som har vesentlig aminosyresekvens homologi med GDNF og som virker in vivo som neurotrofiske faktorer med forskjellige mønstre for vevsspesifikk fordeling og/eller forskjellige spektre når det gjelder aktiviteter. Slike proteiner kan utgjøre medlemmer av GDNF familien av neurotrofiske faktorer. DNA sekvensene til rotte og humane GDNF gener presentert i figurene 13 (SEQ IS NO:3) og 19 (SEQ ID NO: 5) og 22 (SEQ ID NO: 8) kan bli anvendt for å identifisere nye medlemmer av en slik antatt "GDNF genfamilie".

Som en konsekvens av konservering av aminosyresekvensen blant proteinproduktene til medlemmene av en genfamilie så som "NGF-genfamilien" angitt ovenfor eller "GDNF-genfamilien", er det betraktelig konservering av sekvensen på DNA nivået. Under hensiktsmessige hybridiseringsbetingelser kan nukleinsyre "krysshybridisering" oppstå mellom gener innenfor familien, dvs. en nukleinsyreprøve avledet fra sekvensen til en av familiemedlemmene vil danne et stabilt hybrid dupleksmolekyl med nukeinsyremolekyler fra forskjellige medlemmer av familien som har relaterte sekvenser, men ikke identiske, med prøven (Beltz et al. 1983 Methods in Enzymology 100:266-285). Man kan derfor screene for gener relatert ved sekvenshomologi med GDNF ved å danne unike eller degenererte DNA (eller RNA prøver) basert på sekvensen til GDNF fra rotte, menneske eller hvilke som helst andre arter og utføre hybridiseringseksperimenter med forskjellige mål DNA (eller RNA) under betingelser som vil muliggjøre stabil dannelse av uriktig parrede nukleinsyreduplekser.

Slike hybridiseringsbetingelser som ofte blir betegnet "redusert stringenthet" er beskrevet i litteraturen (Beltz et al. supra, Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press) og innbefatter som oftest reduksjon i temperaturen til hybridiseringsreaksjonen når den blir utført i vandig oppløsning og/eller reduksjon i konsentrasjon av formamid i hybridiseringssystemene som normalt anvender oppløsninger inneholdende 50% formamid. Andre midler for redusering av hybridiserings stringentheten er også blitt beskrevet og kan bli anvendt (Sambrook et al., supra). Nukleinsyremålene i disse hybridiseringseksperimentene kan innbefatte: 1) genomiske DNA bibliotek inneholdende humane, rotter eller andre pattedyrarter, eller andre DNA arter klonet inn i en hvilken som helst hensiktsmessig vektor inkludert bakteriofager, plasmider, cosmider, kunstige gjærkromosomer eller andre vektortyper. 2) cDNA bibliotek dannet fra RNA fra hvilke som andre vevstyper oppnådd fra hvilke som helst av ovennevnte organismer eller oppnådd fra kulturen av en hvilken som helst primær celle oppnådd fra hvilke som helst av ovennevnte organismer, eller fra en hvilken som helst type av stabil cellelinje som eksisterer eller produsert fra en hvilken som helst primær cellekultur, 3) genomisk DNA som beskrevet under nr. 1 ovenfor som blir spaltet med restriksjonsenzymer og preparert for Southem blot analyse ved gelelektroforese og overføring på en fast bærer, 4) RNA som beskrevet i punkt nr. 2 som blir utsatt for elektroforese og overføring til en fast bærer for Northern blot analyse. Slik RNA kan innbefatte totalt cellulært RNA eller fraksjonert, poly A<+> RNA. 5) Produkter fra polymerasekjedereaksjoner (PCR) som anvender oligonukleotidprimere basert på sekvenser som oppstår i GDNF og som anvender som templater hvilke som helst av nukleinsyrekildene beskrevet under punkt nr. 1 til og med 4.

Hvilken som helst nukleinsyresekvens som blir demonstrert å hybridisere til GDNF basert prøve under empirisk bestemte sett av hybridiseringsbetingelser kan bli klonet og sekvensert ved hvilke som helst av forskjellige teknikker velkjente for fagfolk innenfor dette området og graden av sekvenshomologi kan bli direkte bestemt for å identifisere medlemmer av en GDNF genfamilie. En slik hybridiseringsmetode ble anvendt for å klone NT-3 ved screening med en prøve basert på NGF sekvensen (Kaisho et al. 1990 FEBS Letters 266:187-191).

En alternativ metode for identifisering av GDNF familiemedlemmer involverer anvendelse av polymerasekjedereaksjon (PCR) for å amplifisere sekvenser fra GDNF familiemedlemmene etterfulgt av kloning og analysering av amplifiserte sekvenser. Degenererte (eller ikke-degenererte) oligonukleotidprimere for PCR kan bli syntetisert basert på sekvensen til GDNF. Når konservering av cysteinbeliggenheten og konservering av aminosyresekvensene i nærheten av custeinresidiene som blir observert for NGF familien er kjent representerer regionene rundt cysteinene i moden GDNF innlysende kandidater for primersyntese, men forskjellige andre primere kan også bli valgt fra både modne og pre-pro deler av proteinet. PCR reaksjonene kan bli utført under betingelser med redusert sammensmeltningstemperaturer som muliggjør amplifikasjon og ikke bare GDNF sekvensen, men sekvensene av hvilke som helst GDNF familiemedlemmer. Se Innis et al. 1990 PCR Protocols: A Guide to methods and Applications, Academic Press. Produktene av slike PCR reaksjoner kan bli størrelsesselektert ved gelelektroforese, klonet inn i en hensiktsmessig vektor og klonet DNA sekvensert for å identifisere GDNF familiemedlemmer. Alternativt kan klonene først ble screenet ved hybridisering til en prøve spesifikk for GDNF under betingelser med høy stringenthet for å identifisere GDNF kloner. Hvilke som helst av klonene som ikke hybridiserer til GDNF under høy stringenthet kan deretter bli sekvensert eller så kan slike kloner bli hybridisert til en GDNF prøve under betingelser med redusert stringenthet og hvilke som helst av klonene som hybridiserer til GDNF prøven under disse betingelsene kan deretter bli sekvensert.

En annen metode ved anvendelse av PCR for kloning av GDNF familiemedlemmer kan være å merke produktene til PCR reaksjonen beskrevet ovenfor og anvende de produktene som en prøve for å screene nukleinmål nummerert ovenfor under betingelser med høy og/eller lav stringenthet. Hybridiseringskloner eller nukleinsegmenter kan bli analysert som beskrevet ovenfor for å identifisere GDNF kloner og familiemedlemmer. En slik metode er blitt anvendt for å klone NT-3 basert på sekvensene til NGF og BDNF (Maisonpierre et al. 1990 Science 247:1446-1451).

Fagfolk innenfor dette området er kjent med de forskjellige analysene som er tilgjengelige for å indikere hvilke neuroner som kan reagere overfor behandling med GDNF og bestemmelse av andre mottagelige neuroner mottagelige for GDNF kan bli utført uten omfattende eksperimentering.

Fagfolk innenfor dette området kan lett bestemme om message for GDNF blir uttrykt i kroppen og hvilket nivå GDNF proteinet er i hver av disse regionene. Fagfolk innenfor dette området kan også bestemme beliggenheten av bindingssetene for GDNF i nervesystemet. Disse informasjonene vil muliggjøre at fagfolk innenfor dette området kan bestemme neuronaltype som reagerer overfor GDNF og som igjen kan foreslå hensiktsmessige kliniske indikasjoner for dette proteinet. Egnet cellekultur og dyreeksperimenter kan deretter bli utført for å bestemme sannsynligheten av at GDNF er nyttig for behandling av slike indikasjoner.

Renset GDNF isolert fra B49 kondisjonert medium er også blitt vist å fremme overlevelsen av parasympatetiske og sympatetiske nerveceller i kulturer. Disse resultatene er beskrevet i detalj i eksempel 4.

På grunn av at det er mulig at den neurotrofiske funksjonen til GDNF blir ødelagt av en eller flere diskrete og separable deler blir det også betraktet at man kan anvende en terapeutisk sammensetning hvor den aktive ingrediensen består av den delen (eller de delene) av GDNF som kontrollerer den GDNF neurotrofiske funksjonen.

Terapeutisk eller farmasøytisk sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse kan fortrinnsvis anvendes parenteralt ved injeksjon eller direkte inn i cerebral spinal fluidet (CSF) til kontinuerlig infusjon fra en implantert pumpe. Andre effektive administrasjonsformer, så som parenteral sakte-frigjørende formuleringer, inhaleringsstoffer, oralt aktive formuleringer eller suppositorier kan også anvendes. Administrering i sammenheng med en eller flere midler som kan fremme penetrering av GDNF over blod-hjerne barrieren kommer også i betraktning. En foretrukket bærer er fysiologisk saltvannsoppløsning, men det blir betraktet at andre farmasøytiske akseptable bærere, så som kunstig CSF også kan bli anvendt. I en foretrukket utførelsesform blir det betraktet at bæreren og GDNF utgjør en fysiologisk kompatibel sakte-frigjørende formulering. Det primære oppløsningsmiddelet i en slik bærer kan være enten vandig eller ikke-vandig av natur. I tillegg kan bæreren inneholde andre farmakologisk-akseptable eksipienter for modifisering eller opprettholdelse av pH, osmolaritet, viskositet, klarhet, farge, sterilitet, stabilitet, oppløsningsrate eller lukt på formuleringen. Bæreren kan videre inneholde ytterligere andre farmakologiske akseptabel eksipienter for modifisering eller opprettholdelse av stabiliteten, oppløsningsraten, frigjøringen eller absorpsjon eller penetreringen over blod-hjeme barrieren til GDNF. Slike eksipienter er forbindelser som vanligvis blir anvendt for å formulere doseringer for parenteral administrering i enten enhetesdose eller flerdoseform eller for direkte infusjon inn i CSF ved kontinuerlig eller periodisk infusjon fra en implantert pumpe.

Når den terapeutiske sammensetningen er blitt formulert, kan den bli lagret i sterile beholdere som en oppløsning, suspensjon, gel, emulsjon, fast stoff eller dehydrert eller lyofilisert pulver. Slike formuleringer kan bli lagret enten i en klar for bruk form eller krever rekonstitusjon rett før administreringen. Foretrukket lagring av slike formuleringer er ved temperaturer som er på minst 4°C og fortrinnsvis ved -70°C.

Parenteral administrering av formuleringer inneholdende GDNF er fortrinnsvis via en subkutan, intramuskulær, intratekal eller intracerebral vei. For å oppnå den ønskede dosen av GDNF kan gjentatte daglige eller mindre frekvente subkutane eller intramuskulære injeksjoner bli administrert, eller så kan GDNF bli infusert kontinuerlig eller periodisk fra en implantert pumpe. Doseringsfrekvensen vil avhenge av farmakokinetiske parametere til GDNF ved formuleringen og administrasjonsveien som blir anvendt.

For å oppnå ønsket dose av GDNF til dopaminerge og andre skadede nerveceller hvor cellelegemene er innenfor hjernen og ryggmargen blir det betraktet av GDNF kan bli administrert inn i hjernen eller ryggmargsubarachnoid området eller intracerebroventrikulært. Administreringen kan være subkutan eller periodisk og bli oppnådd ved en konstant- eller programmerbarstrømnings implanterbar pumpe eller ved periodiske injeksjoner. Administreringen kan også oppstå i sammenheng med midler som muliggjør at GDNF penetrerer blod-hjerne barrieren.

Det kommer også i betraktning at visse formuleringer inneholdende GDNF blir administrert oralt. GDNF som blir administrert på denne måten blir fortrinnsvis innkapslet. Innkapslet GDNF kan bli formulert med eller uten de bærerne som vanligvis blir anvendt ved dannelse av faste doseringsformer. Kapselen er fortrinnsvis konstruert slik at den aktive delen av formuleringen blir frigjort ved det tidspunktet i gastro-tarmkanalen når biotilgjengeligheten er maksimal og den pre-systemiske degraderingen er minimal. Ytterligere eksipienter kan bli innbefattet for å lette absorpsjonen av GDNF. Fortynningsmidler, smaksstoffer, lavt smeltende vokser, vegetabilske oljer, smøremidler, suspenderingsmidler, tablettoppløsende midler og bindemidler kan også bli anvendt.

Uansett administrasjonsmåle blir den spesifikke dosen beregnet ifølge omtrentlig kroppsvekt eller kroppsoverflateareal til pasienten. Ytterligere forbedring av beregningene nødvendige for å bestemme hensiktsmessig dosering for behandling som involverer hver av ovennevnte formuleringer blir rutinemessig utført av fagfolk innenfor dette området og høre inn under rutinene som blir utført uten unødig eksperimentering, spesielt i lys av doseringsinformasjonen og analysene beskrevet heri. Disse doseringene kan bli bekreftet gjennom anvendelse av etablerte analyser for å bestemme doseringer anvendt i sammenheng med hensiktsmessige dose-responsdata.

GDNF kan bli terapeutisk administrert ved implantering inn i pasientceller som kan syntetisere og utskille en biologisk-aktiv form av GDNF. Slike GDNF-produserende celler kan være celler som er naturlige produsenter av GDNF (analog med B49 celler) eller de kan være celler hvor evnen til å produsere GDNF er blitt hemmet ved transformering med GDNF genet i en form egnet for å fremme ekspresjonen og utskillelsen. For å minimalisere en potensiell immunologisk reaksjon i pasienter fra administrering av GDNF fra en fremmed art er det foretrukket at naturlig-GDNF-produserende celler er av human opprinnelse og produserer human GDNF. Man kan likeledes transformere celler til å uttrykke human GDNF ved anvendelse av en ekspresjonskonstruksjon kodende for human GDNF ved hjelp av metoder som analoger til de som blir anvendt i eksemplene 5 og 6 nedenfor.

Celler som kan naturlig utskille human GDNF kan bli identifisert ved anvendelse av følgende redskaper: (1) oligonukleotider som representerer en del av messenger RNA for human GDNF eller som er komplementær med en del av messenger RNA for human GDNF kan bli anvendt for å oppdage cellelinjer som produserer human GDNF message ved Northem blot analyse, RNase beskyttelse, in situ hybridisering, polymerasekjedereaksjon eller andre beslektede metoder eller (2) polyklonale eller monoklonale antistoffer som gjenkjenner human GDNF kan bli anvendt for å oppdage cellelinjer hvor ekstraktene eller det kondisjonerte kulturmediet inneholder GDNF protein ved Western blot analyse, ELISA analyse, radioimmunologisk analyse eller andre beslektede metoder. En foretrukket strategi er å screene det kondisjonerte kulturmediet fra en serie celler med human opprinnelse med antistoffer mot human GDNF ved metodene ifølge (2) ovenfor for å oppdage celler som utskiller GDNF inn i kulturmediet. Bekreftelse av GDNF produsert på denne måten kommer fra rensnings-og aminosyresekvensanalyser utført med GDNF produsert av B49 celler og utskilt i deres kulturmedium. Eksempel 7 nedenfor beskriver produksjonen og isoleringen av antistoffer mot human rekombinant GDNF.

Celler som naturlig utskiller eller celler transformert til å utskille human GDNF kan bli anvendt for å behandle pasienter. Humane eller ikke-humane dyreceller kan bli implantert i pasienter i semi-permeable polymeriske former for å muliggjøre frigjøring av GDNF, men forhindre ødeleggelse av cellene fra pasientens immunsystem. Alternativt kan pasientens egne celler, transformert for å produsere GDNF eks vivo bli implantert direkte inn i pasienten uten slik innkapsling.

Metodologi for membraninnkapsling av levende celler er kjent for fagfolk innenfor dette området og preparering av de innkapslede cellene og implantering derav i pasienter kan bli oppnådd uten unødig eksperimentering. Se US-PS 4.892.538; 5.011.472 og 5.106.627, spesifikt inkorporert heri som referanse. Et system for innkapsling av levende celler er beskrevet i PCT søknad W091/10425 til Aebischer et al., spesifikt inkorporert heri som referanse. Se også PCT søknad WO 91/10470 til Aebischer et al., Win et al 1991 Exper. Neurol. 113:322-329; Aebischer et al. 1991 Exper. Neurol. 111:269-275; Tresco et al. 1992 ASAIO 38:17-23, og hver er spesifikt inkorporert heri som referanse.

Celler som utskiller GDNF kan spesielt bli implantert i pasienter med Parkinsons sykdom i striatum for å tilveiebringe GDNF til terminale områder av nigral dopaminerge neuroner og inn i nigra for å tilveiebringe GDNF til dopaminerge cellelegemer. Disse lokalt tilførte GDNF kan fremme spredning og reinervering av striatum ved dopaminerge terminaler og vil forhindre eller hemme den ytterligere degenereringen av dopaminerge nerveceller.

Disse cellene blir enten valgt på grunn av deres naturlige evne til å danne GDNF eller omkonstruert for å utskille GDNF.

Det er å bemerke at anvendelse av det som blir beskrevet i foreliggende oppfinnelse overfor et spesifikt problem hører inn under området for fagfolk innenfor dette området i lys av det som er beskrevet heri. Eksempler på representative anvendelser ifølge foreliggende oppfinnelse fremkommer fra følgende eksempler.

Eksempler

Eksempel 1: Rensing og sekvensering av GDNF.

Et eksempel beskriver metoder for bioanalyse og rensing av GDNF. Det beskriver også metoder for preparering av B49 cellelinje kondisjonert medium som er utgangsmateriale for rensing. Metoder for oppnåelse av aminosyresekvensen til renset GDNF og partielle aminosyresekvenser oppnådd fra renset protein er også beskrevet.

A. Materialer. Bestemte gravide rotter kom fra Zivie Miller lab, Allison Park, PA. Dersom det ikke er spesifisert var alle reagensene fra Sigma Chemical Co., St. Louis,

MO.

B. Bioanalyse for dopaminerge neurotrofiske aktiviteter

Kulturbetin<g>elser: Dissosierte mesencefaliske cellekulturer ble dannet som tidligere beskrevet (Friedman and Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79:65-72), med mindre modifikasjoner. Rostral mesencefalisk tegmentum fra hjernene til Sprague-Dawley rotte embryor med 16. gestasjonsdag ble dissektert under mikroskopet under sterile betingelser, samlet i Ca<2+> og mg^2+ - fritt Dulbeccos fosfatbuffret saltvann (Gibco, Gaithersburg, MD) og dissosiert mekanisk ved svak triturering. Cellene ble sådd ut i 100 ul pr. brønn inn i 16-mm diameter vevskulturbrønner (Falcom, Lincoln Park, NJ, 24-brønns skål) inneholdende 400 ul medium for å tilveiebringe en tetthet på 2,5-3,5 x 10^ celler pr. brønn. Kulturbrønnene har tidligere vært eksponert for 0,1 mg/ml oppløsning av poly L-omithin i 10 mM natriumborat, pH 8,4, i 3 timer ved 37°C, vasket tre ganger i milliQ H2O og en gang i Earles balanserte saltoppløsning (Gibco). Fdrmediet (10/10) besto av minimal essensielt medium (MEM, Gibco) supplert med glukose (33 mM), natriumbikarbonat (24,5 mM), glutamin (2 mM), HEPES (15 mM), penicillin G (5 U/ml), streptomycin (5 ug/ml), 10% varmeinaktivert føtalt kalveserum (Gibco) og 10% varmeinaktivert hesteserum (Gibco). Kulturene ble oppbevart ved 37°C i vannmettet atmosfære inneholdende 6,5% CH2. Etter 3 timer når det meste av cellene var blitt adherert til bunnen av brønnen ble mediet erstattet med 500 ul friskt medium. Ved dette tidspunktet ble en seriefortynning av prøven som skulle bli analysert for GDNF aktivitet tilsatt til hver brønn i duplikat og skålene ble inkubert i en 37°C inkubator. Etter en uke ble kulturene behandlet i 24 timer med fluordeoksyuridin (13 Hg/ml) og uridin (33 ug/ml) for å forhindre omfattende glial proliferering og påfølgende foret med ovennevnte medium uten føtalt kalveserum. Formediet ble skiftet hver uke. Alternativt ble kjemisk definert serumfritt medium anvendt hvor serumet ble erstattet med en blanding av proteiner, hormoner og salter. Det definert mediet (DM) besto av en blanding av MEM og Fl2 næringsblanding (begge Gibco, 1:1, vol/vol) med glukose (33 mM), glutamin (2 mM), NaCHC-3 (24,5 mM), HEPES (15 mM), supplert med transferrin (100 ug/ml), insulin (25 ug/ml), putrescin (60 uM), progesteron (20 nM). natriumselenit (30 nM), penicillin G (5 U/ml) og streptomycin (5 ug/ml). Osmolariteten til DM ble justert til 325 ved tilsetning av milli-Q H2O. (110-125 ml H2O/I). Ved anvendelse av DM framkom færre ikke-neuronale celler ifølge morfologi eller ved farging for glial fibrillært surt protein (GFAP), som er et astrocytt-spesifikt cytbskjellet protein. GDNF er aktivt for stimulering av dopamin opptaket i både serum-inneholdende og definert medium. Alle analysene oppnådd i følgende eksempler ble utført i serum-inneholdende medium.

Den funksjonelle statusen til dopaminerge neuroner kan bli vurdert i disse kulturene ved måling av dopaminopptaket ved spesifikk "oppfanger" transportmidler i dopaminerge neuroner og ved telling av antall neuroner positive for dopaminsyntetisk enzymthyrosinhydroksylase ved anvendelse av immun histokjemi. Muligheten av signifikant kontaminering av kulturene med noradrenerge neuroner som også kan transportere dopamin og også inneholder tyrosinhydroksylase ble utelukket ved forsiktig disseksjon og ved demonstrering av at dopamin transportere har den farmakologiske profilen som er karakteristisk for dopaminerge og ikke noradrenerge neuroner. Dopaminopptaket i disse kulturene er inhibert av GBR12909 som er en inhibitor til monoamintransporteren på dopaminerge neuroner med en ED50 på 20 nM. I kontrast til dette er minst 300-ganger mer desipramin, en inhibitor av monoamintransporter eller noradrenerge neuroner, nødvendige for å inhibere dopaminopptaket i deres kulturer. Disse verdiene er de som er blitt rapportert for monoamintransporteren i dopaminerge neuroner.

Preparering av prøve: Før analysering for dopaminerg neurotrofisk aktivitet i mesencefaliske cellekulturer ble alle prøvene dannet fra trinn 1 til trinn 3 av rensningen (se seksjon C nedenfor) avsaltet som følger. 100 ul medium 10/10 (som en bærer) ble tilsatt til en Centricon-10 (Amicon) og latt sitte i 10 minutter. Alikvoter av prøven som skulle bli analysert ble tilsatt til Centricon etterfulgt av 1 ml Dulbeccos høy glukose modifisert Eagle medium uten bikarbonat, men inneholdende 10 mM HEPES, pH 7,2 (oppløsning A) og sentrifugert ved 5000 xg i 70 minutter. Resten (omtrent 0,1 ml) ble bragt tilbake til 1,1 ml med frisk oppløsning A og rekonsentrert to ganger. Prøven ble filtrert gjennom en 0,11 um ultrafri-MC steril Durapore enhet (Millipore, Bedford MA)

før tilsetning til kulturbrønnen.

3H- dopamin opptak: Opptak av tritiert dopamin (<3>H-DA) ble utført i kulturer på dag 6 eller dag 7 som tidligere beskrevet (Friedman og Mytilineou (1987) Neurosci. Lett. 79:65-72) med mindre modifikasjoner og alle oppløsningene ble opprettholdt ved 37°C. Kulturmediet ble fjernet, skylt 2 ganger med 0,25 ml opptaksbuffer som består av Krebs-Ringers fosfatbuffer, pH 7,4, inneholdende 5,6 mM glukose, 1,3 mM EDTA, 0,1 mM ascorbinsyre og 0,5 mM pargylin som er en inhibitor av monoaminoksydase. Kulturene ble inkubert med 0,25 ml 50 nM <3>H-DA (New England Nuclear, Boston, MA sp. act 36-37 Ci/mmol) i 15 minutter ved 37°C. <3>H-DA opptaket ble stoppet ved fjerning av inkubasjonsblandingen og cellene ble deretter vasket to ganger med 0,5 ml opptaksbuffer. For å frigjøre <3>H-DA fra cellene ble kulturene inkubert med 0,5 ml 95% etanol i 30 min. ved 37°C og deretter tilsatt til 10 ml EcoLite (ICN, Irvine, CA) og opptelt på en scintillasjonsteller. Blankverdiene ble oppnådd ved tilsetning til opptaksbufferen 0,5 mM GBR-12909 (RBI), en spesifikk inhibitor av høy-affinitetsopptakspumpen til dopaminneuroner (Heikkila et al. 1984 Euro J. Pharmacol. 103:241-48) og var vanligvis mindre enn 5% av <3>H-DA opptaket i ubehandlede kontrollkulturer. Antall trofiske enheter (TU) av GDNF aktiviteten ble definert som det reciproke av fortynningen som ga 50% av maksimal stimulering av <3>H-DA opptaket til kulturen. Spesifikk aktivitet ble bestemt ved å dele antall TU med mengden av protein til stede i prøven.

C. Rensing av GDNF.

Utgangsmateriale: B49 glioblastomceller oppnådd fra D. Schubert, Salk Institute, La Jolla, CA. (Se Schubert et al. 1974 nature 249:224-27) ble dyrket til konfluens i DMEM medium inneholdende 10% føtalt kalveserum, 4 mM glutamin, 50 U/ml penicillin-G og 50 ug/ml Streptomycin i kulturflasker (225 cm^, Costar, Cambridge, MA). Det serumfrie vekst-kondisjonerte mediet (CM) ble dannet ved vasking av kulturen en gang med 10 ml serumfritt medium og deretter plassering av cellene i 50 ml pr. flaske serumfritt medium i 2 dager. CM ble oppsamlet og cellene ble komplementert med friskt serumfritt medium hver annen dag deretter helt til dag 6. Kombinert CM fra 3 høstinger fra hver batch av celler ble sentrifugert ved 5000 xg i 20 min. ved 4°C for å fjerne celler og debris. Supematanten ble konsentrert omtrent 10-ganger via Amicon konsentrator (YM 10 membran) og sentrifugert ved 40.000 xg i 20 minutter ved 4°c. Supematanten ble filtrert gjennom 0,2 u Micro kultur kapsel (Gelman Sciences) og lagret ved 4°C i opp til 1 måned.

Trinn 1. Heparin Se<p>harose kromatografi: Ovennevnte preparing (200 mg protein) ble applisert på en kolonne (1 x 25 cm) Heparin Sepharose CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ) ekvilibrert med 50 mM NaPi buffer, pH 8,0, inneholdende 0,15 NaCl (buffer A). Kolonnen ble deretter vasket med samme buffer helt til den optimale tettheten ved 280 nm (O.D280)av eluatat gikk tilbake til grunnlinjen og eluerte med en 100 ml lineær gradient som går fra buffer A inn i 50 mM NaPi, pH 8,0, inneholdende 1,5 N NaCl (buffer B). To ml fraksjoner ble samlet. Fraksjonene ble analysert for ledningsevne og GDNF aktivitet. Figur 1 viser en slik kromatografi. Profilen av eluerte proteiner er plottet som O.D280- Påført sammen er plott acv ledningsevnen og GDNF aktiviteten målt i hver fraksjon. Fraksjoner indikert ved strek med topp GDNF aktivitet (rundt 0,6 - 0,8 N NaCl) ble slått sammen for ytterligere analyser.

Trinn 2. FPLC Superosekormatografi: Ovennevnte blanding ble konsentrert til 0,4 ml via Amicon konsentrator (Amicon, MA, YM 10 membran) og kromatografert på en hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC) Superose 12 kolonne (Pharmacia) i 50 mM NaPi buffer, pH 7,4, inneholdende 0,5 N NaCl med en strømningsrate på 0,5 ml/min. Etter 14 min. eluering ble fraksjonene på 0,5 ml samlet inn i silikonbehandlede mikrosentirfugerør inneholdende 5 ul 0,4% Tween 20. Alikvoter fra hver fraksjon ble analysert for GDNF aktivitet. Figur 2 viser en slik kromatografi med proteinprofil gitt ved O.D.280°S met^ GDNF aktivitetsmønsteret lagt på hverandre. 85% av GDNF aktiviteten applisert på kolonnen ble isolert i fraksjonene nr. 12-15.

Trinn 3. RP- HPLC: Fraksjon nr. 14 fra ovenfor ble surgjort med 10 ul 25% trifluoreddiksyre (TFA). Halvparten av det surgjorte materialet ble applisert på en "narrow bore Aquapore RP-300 C-8" revers fase HPLC kolonne (Brownlee column, Applied Biosystems, San Jose, CA), 2,1 x 220 mm, og eluert med en H2O/0,l% TFA: 80% acetonitirl/0,085% TFA gradient. Proteininneholdende fraksjoner ble samlet manuelt inn i silikonbehandlede mikrosentrifugerør basert på UV absorpsjonen ved 214 nm. Alikvoter fra hver fraksjon ble analysert for GDNF aktivitet. Figur 3 viser en slik kromatografi med proteinprofilen bestemt ved O.D.214 og med aktivitetsmønsteret i lavere panel. Fraksjonene 5 og 6 inneholdt omtrent 90% av aktiviteten isolert i RP-HPLC, mens fraksjon 7 utgjorde gjenværende 10% av aktiviteten. Figur 4 viser en sølvfarget SDS-PAGE gel kjørt av fraksjonene rundt GDNF aktivitetstoppen vist i figur 3.

Trinn 4. Preparativ SDS- PAGE: Fraksjonene 5 og 6 inneholdende topp GDNF aktivitet ble slått sammen og konsentrert til 20 ul i nærvær av 10 ul 0,4% Tween 20 på en speed vac. Tilsatt til prøven ble 1 ul 1 M Tris base og 5 ul 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, inneholdende 40% glycerol og 5% SDS og kjørt på ikke-redusert 15% SDS-PAGE (Laemmli 1970 Nature 277:680-684) (slab of 0,075 x 14 x 11,5 cm, 20 well-comb, 0,075 x 0,4 x 2,8 cm/prøvebrønn). Elektroforesen ble utført ved 10°C ved 40 mA/gel i 2 timer. Gelstrimmelen ble kuttet i 1,14 mm biter. Hver bit ble kuttet i to mindre biter og eluert med 3 sekvensielle skift av 25 ul 5 mM NaPI, pH 6,7 inneholdende 0,01% Tween 20 over en 20 timer periode med kontinuerlige risting ved 4°C. 3 alikvoter av det eluerte materialet ble kombinert, analysert for GDNF aktivitet (figur 5) og eluatet med høyest aktivitet (fra gelbit nr. 16-23 tilsvarende 30-42 kD i figur 5) ble slått sammen. En blank gelstrimmel (hvor det på toppen bare ble applisert SDS-PAGE prøvebuffer før elektroforese) ble prosessert som en kontroll.

Trinn 5. RP- HPLC: Det sammenslåtte geleluatet ble konsentrert til omtrent 150 ul på en speed vac, surgjort med 20 ul 25% TFA og kjørt på RP-HPLC som beskrevet i trinn 3. Proteininneholdende fraksjoner ble samlet manuelt inn i silikonbehandlede mikrosentrifugerør basert på O.D214 og analysert for GDNF aktivitet. Figur 6 viser resultatene av en slik kromatografi. Som en kontroll ble eluatet fra blanke gelbiter med lignende størrelse også kjørt på RP-HPLC. Den eneste signifikante O.D214 toppen i prøven over kontrollprofilen (figur 6, panel A vs. B) er topp 3 som inneholder 70% GDNF aktivitet belastet på HPLC kolonnen. Figur 7 viser topp 3 kjørt på en sølvfarget SDS-PAGE gel. Den eneste synlige fargingen er et meget bredt bånd mellom 30-42 kD som faller sammen med GDNF aktivitetsprofilen observert i preparativ SDS-PAGE (figur 5). Oppsummering av en typisk rensning er gitt i tabell I.

D. Aminosyresekvensen til renset GDNF.

Amino- terminal sekvens: Topp 3 i figur 6 ble sekvensert med en gass fase protein sekvenseringsanordning (Applied Biosystems). Den oppnådde sekvensen er vist i figur 8. Sekvensering av fraksjoner med topp GDNF aktivitet etter trinn 3 i rensningen (fraksjonene 5 og 6 i fig. 3) viste også en enkelt sekvens som er identisk med den i figur 8 oppnådd med den rensede prøven. Det eneste materialet som disse forskjellige fraksjonene har til felles er materialet som er utflytende mellom 30-42 kDa. De kontaminerende båndene utenfor 30-42 kD regionene som sees i sølvfarget gel til fraksjonene 5 og 6 i figur 4 kan a) være for små i mengde (<1 picomol) for å bli sekvensert ved gjeldende teknologi, b) være relatert til 30-42 kD utflytende bånd i sekvens eller c) ha en blokkert aminoterminus.

Indre sekvens: GDNF preparatet etter trinn 3 i rensningen beskrevet ovenfor ble anvendt som utgangsmateriale for åoppnå den indre sekvensen. Fraksjonene 5 og 6 i figur 3 ble slått sammen på et silikonbehandlet sentrifugerar inneholdende 9 ul 0,4% Tween og konsentrert til 40 ul på en speed vac. Det ble tilsatt 160 ul 1% NH4HCO3 inneholdende 2,5 M guanidin hydroklorid og 1 ug trypsin til prøven og prøven ble inkubert over natt ved 37°C. Blandingen ble surgjort med 20 ul 25% TFA, konsentrert til omtrent 150 ul på en speed vac og peptider ble separert på en "narrow bore" Aquapore RP-300 C(" revers fase HPLC kolonne (Brownlee kolonne), 2,1 x 220 mm og eluert med en H2O/0,l% TFA:80% acetonitirl/0,085% TFA gradient. Peptid inneholdende fraksjoner ble samlet manuelt i silikonbehandlede mikrosentirfugerør basert på absorpsjon ved 214 nm. Figur 9 viser resultatene av en slik kromatografi. Sekvensen til topp 10 i figur 9 ble bestemt å være identisk med de første 13 aminosyreresidiene av den aminoterminale sekvensen til ubehandlet protein vist i figur 8 (SEQ ID NO: 1). Topp 37 i figur 9 ble ytterligere behandlet med CNBr. Prøven ble konsentrert til 20 ul på en speed vac. Det ble tilsatt til prøven 70 ul 90% maursyre og 5 mg CNBr og prøven ble inkubert i mørket over natt ved romtemperatur. Denne blandingen ble konsentrert til 20 ul på en speed vac, fortynnet med 100 ul 0,1% TFA og separert på revers fase HPLC som beskrevet ovenfor. Figur 10 viser resultatene av en slik kromatografi. Topp 1 i figur 10 ble konsentrert til 20 ul i nærvær av 5 ul 0,4% Tween 20 på en speed vac. Tilsatt til prøven ble 100 ul 1% NH4HCO3 og 5 ul 50 mM ditiothreitol og prøven ble inkubert ved romtemperatur i 1 time. Blandingen ble surgjort med 10 ul 25% TFA, konsentrert til 100 ul på en speed vac og separert på revers fase HPLC som ovenfor. Figur 11 viser resultatene av en slik kromatografi. Både toppene 33 og 34 i figur 11 ga en identisk sekvens (figur 12) (SEQ ID NO: 2).

E. Karaktertrekk til GDNF.

Mobilitet på SDS- PAGE: Uten varmebehandling av prøven og under ikke-reduserende betingelser ble GDNF kjørt som et utflytende bånd mellom 31-42 kD på SDS-PAGE. Når prøven blir oppvarmet ved 100°C i 3 min. i nærvær av reduksjonsmiddel 4% 13-merkaptoetanol), beveger GDNF seg som adskilte flere bånd mellom 20-23 kD. På grunn av at omtrent 50% av bioaktiviteten applisert på gelen kan bli isolert under førstnevnte (ikke-reduserende), men ikke sistnevnte (reduserende) betingelser, kan GDNF være en disulfidbundet dimer og bare aktiv som en dimer. På grunn av at en enkelt aminoterminus tyder på at GDNF preparatet er homogent med hensyn på primær kjernestruktur så tyder det utflytende eller de mange båndene på et heterogent glykosylert protein.

Spesifikk aktivitet: Renset GDNF hadde en beregnet spesifikk aktivitet på omtrent 17 trofiske enheter/ng og dette indikerer på at halv-maksimal stimulering av dopaminopptak oppstår ved relativ lav konsentrasjon av omtrent 60 pg/ml. Den spesifikke aktiviteten målt for renset GDNF kan bli noe undervurdert på grunn av delvis inaktivering av GDNF i løpet av rensningen ved utsetting for de sure organiske opp-løsningsmidlene anvendt i RP-HPLC og de denaturerende betingelsene i SDS-PAGE.

Spesifisiteten til GDNF: GDNF ble renset på grunnlag av dets evne til å forsterke opptak av dopamin i dopaminneuroner (fig. 20A). For å bestemme om GDNF også oppregulerer en annen indeks på overlevelse og/eller modning av dopaminneuroner ble tyrosinhydroksylase (TH) immunreaktiviteten i mesencefaliske kulturer også målt. TH er en markør som er spesifikk for dopaminneuroner i kulturene. Oppregulering av immunreaktiviteten til GDNF kan være forårsaket av den økte overlevelsen av dopaminneuroner og/eller en økning i produksjonen av TH pr. dopaminneuroner. Renset GDNF tilsatt på utsåingsdagen og kulturer undersøkt 8 dager senere resulterte i et 10 ganger høyere antall TH<+> neuroner i forhold til kontrollene uten GDNF. Dersom en annen dose av GDNF ble tilsatt på dag 9 og kulturene undersøkt 7 dager senere (16 dager in vitro), kunne en lignende doseavhengig økning i forhold til kontrollen fortsatt observeres (fig. 20B). GDNF kan dermed understøtte overlevelsen av av dopaminneuroner og/eller øke ekspresjonen av TH genet i mesencefaliske dopaminneuroner.

For å demonstrere at GDNF utøver en spesifikk stimulerende virkning på modningen og/eller overlevelsen av dopaminneuroner og ikke en generell virkning på alle neuronene ble reagerbarheten til GDNF på neuroner inneholdende y-aminosmørsyre (GABA) som også er til stede i mesencefaliske kulturer, analysert. H<3->dopamin (<3>H-DA) og <l>^C-GABA opptaket ble målt i søsterkulturene til mesencefaliske celler som var blitt dyrket med forskjellige konsentrasjoner av GDNF av 15 og 16 dager. Som beskrevet ovenfor forsterker GDNF <3>H-DA opptakskapasiteten til mesencefaliske dopaminneuroner -^150% over kontroll uten GDNF (fig. 21 A). GDNF hadde ingen signifikant virkning på kapasiteten som GABA neuroner har til å ta opp ^C GABA på grunn av at <14>C-GABA opptak i nærvær av GDNF bare var omtrent -^-20% høyere enn kontrollen (fig. 21B). Dette er også illustrert ved økning i <3>H-DA/<14>C-GABA opptaksforholdet som er beregnet (fig. 21C). Disse data indikerer at dopamin og GABA mesencefaliske neuroner reagerer forskjellig på tilstedeværelse av GDNF og den stimulerende virkningen til GDNF på <3>H-DA opptaket i mesencefaliske kulturer er spesifikk for dopamin i forhold til GABA neuroner.

Disse observasjonene belyser videre hvorfor GDNF kan bli anvendt for å behandle Parkinsons sykdom eller andre forstyrrelser som involverer dopaminerge neuroner. Disse resultatene demonstrerer at GDNF oppregulerer minst to viktige egenskaper til dopaminerge neuroner: dopaminopptaket og TH enzymnivåene. Resultatene demonstrerer også at virkningene av GDNF er i det minste delvis spesifikke for dopaminerge neuroner på grunn av at GABA neuroner ikke blir påvirket på samme måte.

I tillegg til dopaminerge og GABA-erge neuroner er det en annen neuronal populasjon, serotonerge neuroner, ved rotteembryo mesencefaliske kulturer. Noen faktorer så som epidermal vekstfaktor (EGF) som øker dopaminopptaket til dopaminerge neuroner i mesencefaliske kulturer øker også serotoninopptaket til serotonerge neuroner og GABA opptaket til GABA-ergiske neuroner. Se, Casper et al. 1991 J. Neurosci, 30:372. Dette indikerer at disse faktorene ikke er spesifikke for dopaminerge neuroner.

I kontrast til dette øker GDNF ikke opptaket av serotonin til serotonerge neuroner. <3>H-serotoninopptaket ble målt på samme måte som for <3>H-DA opptaket som beskrevet i eksempel IB med unntagelse av at opptaksbufferen inneholdt 50nM <3>H-serotonin (11 Ci/mol, Amersham, Arlington Heights, IL) i stedenfor <3>H-DA. I nærvær av 10 um citalpram (oppnådd fra Dr. C. Mytilineou, Mount Sinai School of Medicine), ble en kjent potent inhibitor av serotoninopptaket i serotoninneuroner, <3>H-serotonin opptaket redusert til 15%. Kontroll verdi ene i nærvær av citalpram ble subtrahert fra de eksperimentelle verdiene vist i figur 24.

I kontrast til uspesifikke faktorer som EGF øker GDNF ikke GABA opptaket (figur 21) og serotonin opptaket (figur 24) under betingelsene hvor dopaminopptaket blir signifikant øket. Disse og resultatene beskrevet ovenfor indikerer at GDNF er spesifikk for dopaminerge neuroner i mesencefaliske kulturer når sammenlignet med GABAergiske og serotonerge neuroner til stede i de samme kulturene. En slik spesifisitet forsterker anvendbarheten av GDNF for behandling av Parkinsons sykdom som blir betraktet å være en sykdom som er spesifikk for mesencefaliske (nigral) dopaminerge neuroner.

Eksempel 2. Kloning av genet for GDNF.

A. Kloning av en cDNA kopi av rottegenet som koder for GDNF.

For å klone genet kodende for GDNF ble et cDNA bibliotek konstruert fra poly A<+ >RNA isolert fra B49 celler og dette biblioteket ble screenet med en degenerert oligonukleotid prøve basert på aminosyresekvensen oppnådd fra renset GDNF. En cDNA klon som hybridiserer til denne prøven ble bestemt ved DNA sekvensering og inneholder DNA sekvenser som er beliggende 3' for sekvensene anvendt i den degenererte oligonukleotid prøven som koder for en aminosyresekvens til stede i GDNF og beliggende karboksyterminalt for aminosyresekvensen som den screenende oligoprøven er basert.

Kulturbetingelsene for B49 cellelinjen er beskrevet i detalj i eksempel 1 ovenfor. For RNA preparering ble cellene dyrket til nær konfluens i seruminneholdende medium, vasket en gang i serumfritt medium (DMEM) og dyrket i 4 dager i DMEM med et mediumskift etter to dager. Cellene ble deretter høstet og total RNA ekstrahert ved hjelp av metoden til Chomczynski og Sacchi 1987 Analytical Biochemistry 162:156-159. Polyadenylert DNA ble dannet fra dette total RNA ved passering over en oligo dT celluloseaffinitetskolonne som beskrevet av Maniatis et al. 1989 Molecular Cloning 2nd Edition, CSH Press.

Syntese av cDNA ble uført ved anvendelse av M-MLV RNaseH revers transkriptase (Bethesda Research Lab, Gaithersburg, MD) ifølge protokollene beskrevet. Den første standardreaksjonen ble primet med en oligo dT]5 primer (Pharmacia) og innbefattet også 8 enheter RNasin (Promega, Madison, WI) pr 5 ug poly A<+> RNA. Syntese av den andre tråden ble gjort direkte av E. coli DNA polymerasel, E. coli RNaseH og E. coli DNA ligase (alle fra BRL) ifølge protokollen. For å lette kloningen ble cDNA behandlet med T4 DNA polymerase (BRL) for å produsere butte ender og metylert med EcoRI metylase (BRL). Disse trinnene ble utført i henhold til protokollene til enzym forhandleren. cDNA ble deretter ekstrahert to ganger med et volum av en 1:1 blanding av fenol og kloroform og den vandige fraksjonen ble presipitert med 1/2 volum 7,5 M NH4AC og 3 vol ved romtemperatur. Presipitatet ble isolert ved sentrifugering i 15 min. ved romtemperatur, ved 16000 xg, vasket med 70% etanol, vakuum tørket og resuspendert i 50 ul, 50 mM Tris-HCl (7,6), 10 mM MgCl2,1 mM ATP, 1 mM DDR, 5% PEG8000, inneholdende 500 picomol fosforylert linker (CCCGAATTCGGG, Pharmacia) (SEQ ID NO.9) og 3 enheter T4 DNA ligase (BRL). Linkerligering ble utført ved 16°C over natt (+■ 16 t.). Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med fenol/kloroform og presipitert som ovenfor. Den vaskede pelleten ble tørket og resuspendert i 50 ul EcoRI spaltningsbuffer (100 mM Tris-HCl (7,5), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 0,025% Triton X-100) hvor det ble tilsatt 400 enheter EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA). Reaksjonen ble inkubert ved 37°C i 21. Etter presipitering (som ovenfor) ble pelleten resuspendert i EcoRI spaltningsbuffer og en ny runde med EcoRI spaltning ble utført som beskrevet ovenfor. Denne reaksjonen ble presipitert og resuspendert i 40 ul 10 mM Tris-HCl (8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl. Dette cDNA som nå inneholder EcoRI-spaltede linkere ble størrelsesfraksjonert ved sentrifugering gjennom en sephacryl S-300 (Pharmacia) spinkolonne ved omtrent 1100 g i 5 min. Gjennomstrømningen fra denne kolonnen ble oppsamlet, etanolpresipitert som ovenfor og resuspendert i 10 mM Tris-HCl (8,0), 1 mM EDTA ved en konsentrasjon på omtrent 0,1 ug/ul.

Et cDNA bibliotek ble konstruert i AZapII (Stratagene, La Jolla, CA) kloningsvektoren. 1 ug EcoRI-spaltet og fosfatasebehandlede vektorarmer (oppnådde fra Stratagene) ble ligert til 0,1 ug EcoRI linker cDNA i en 5 ul ligering ved anvendelse av omtrent 3 Weiss enheter T4 DNA ligase (NEB) i 50 mM Tris-HCl (7,6), 7 mM MgCI2,1 mM DTT, 5% PEG8000 og 1 mM ATP. Ligeringene ble utført ved 16°C over natt. Ligeringene ble pakket i Gigapackll Gold pakkingsekstrakter (oppnådd fra Stratagene) ifølge protokollen til forhandleren. Bibliotekene ble sådd ut for titrering og screening på XLI-Blue vert fra Stratagene.

Fra en slik ligering og pakking ble omtrent 270.000 plaquedannende enheter sådd ut på totalt 12,150 mm diameter, petriskåler. Duplikate nitrocellulose filter løft ble dannet fra disse skålene etter prosedyrene beskrevet av Maniatis et al. Filtrene ble hybridisert til følgende <32p.>merket degenererte oligonukleotid (SEQ ID NO:7) (I = inosin):

Denne sekvensen er basert på aminosyresekvensen (figur 8) (SEQ ID NO: 1) oppnådd rundt aminoterminusen til renset GDNF (SEQ ID NO: 10) som beskrevet i eksempel 1 ovenfor:

oligonukleotidet ble merket med <32>p avledet fra <32p_>ATP (Amersham, Arlington Heights, IL) ved anvendelse av T4 polynukleotidkinase (Pharmacia eller United States Biochemical, Cleveland, OH). Hybridiseringsreaksjonene ble utført i 6X SSPE, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml tRNA (SIGMA, St Louis, MO) og 2X Denhardts (.4 mg/ml hver av

ficoll, polyvinylpyrrolidin, BSA fraksjon V) reagens, ved 50°C over natt (omtrent 161.). Hybridiseringsoppløsningen inneholdt 2-3 x 1()<6> cpm merket oligo pr. ml oppløsning. Etter hybridisering ble filtrene vasket to ganger ved romtemperatur i 2X SSPE, 0,1% SDS og to ganger i samme oppløsning forvarmet til 50°C. Filtrene ble lufttørket og eksponert for film i 7 dager ved -70°C ved anvendelse av intensiverende sjikt.

De fremkalte filmene ble undersøkt for å identifisere plaque som hybridiserer til screenings oligonukleotidet. I denne primære screeningen ble 24 antatt duplikate positiver identifisert. Områdene av biblioteksskålene som tilsvarer de positive signalene ble tatt ut, resuspendert og på ny sådd ut for en annen runde med screening via hybridiseringsprosedyren beskrevet ovenfor. I denne andre screeningen ble 8 av de opprinnelige 24 testet som positive, mens 16 ga negative resultater. Disse 8 positivene ble plaquerenset ved hjelp av en eller to ytterligere runder med hybridisering og 6 av disse ble deretter analysert ved DNA sekvensering for å bestemme om de inneholdt DNA sekvenser som kunne kode for GDNF.

Fagmid delen av XZApII fagen som inneholder de klonede innskuddene blir referert til som pBluescript SK-. pBluescript SK- fagmid ble spaltet ut fra hver av XZaplI rekombi-nanter som hybridiserte til oligonukleotidprøven. Prosedyren for in vivo avspaltning av rekombinant pBluescript SK-plasmid fra XZapII vektoren er beskrevet i detalj i forhandlerens protokoller. Koinfeksjon av XZapII og en Ml3 "hjelper" fag resulterte i pakking av en enkelt-trådet DNA kopi av rekombinant pBluescript innenfor et infeksiøst Ml 3 virus. Når et slikt virus infiserer en sensitiv celle blir enkelttrådet DNA omdannet til et dobbelttrådet DNA og blir propagert vertikalt som et plasmid. Seleksjon for denne hendelsen blir oppnådd fra det ampicillin resistente genet som blir kodet på pBluescript SK-. E. coli XLl-Blue derivatene inneholdende det "rescued" rekombinante pBluescript SK-plasmidet fra hver av de 8 positive XZapH klonene ble dermed lett oppnådd ifølge protokollene beskrevet av Stratagene og anvendelse av "hjelper" fagen gitt sammen med XZapII vektoren. For DNA sekvensering ble dobbelt-trådet plasmid DNA preparert fra 6 av disse rekombinante plasmidene ved hjelp av en "mini-prep" proseydre basert på Birnboim og Doily 1979 NAR 7:1513-1523. DNA sekvenseringsreaksjonene ved anvendelse av dideoksy-kjede termineringsmetoden ble utført ved anvendelse av disse templatene og screeningsoligoen som primer. Reagenser for screening ble oppnådd fra United Stated Biochemical som et kit (Sequenase Version 2,0) og sekvenseringsprosedyrene ble utført ifølge protokollene gitt av forhandleren. En klon, pBluescript SK-76.1, avledet fra klonen XZapII76.1 ga følgende sekvens (SEQ ID NO: 11):

5' > GAG AGG AAC CGG CAA GCT GCA GCT GCC AGC CCA > 3'

T AA TAT A T

Denne sekvensen kan bli translatert til følgende aminosyresekvens (SEQ IS NO: 12):

Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro

som matcher aminosyresekvensen bestemt for en region av amino-terminusen til GDNF begynnende 5 aminosyrerester karboksyterminal for enden til aminosyresekvensen anvendt for å danne screening oligo/sekvenseringsprimeren. Dette resultatet demonstrerte at cDNA klonen innbefattet i XZapII76.1 og koder for en del av, eller hele, GDNF proteinet renset fra B49 cellekondisjonert medium.

B. Nukleotidsekvensen til regionen av cDNA klonen ZaoII76. 1 som innbefatter den kodende sekvensen til GDNF.

Nukleotidsekvensen til de første 877 baseparene av 5' enden til cDNA klonen ble bestemt. Denne regionen ble funnet åinneholde en åpen leseramme (ORF) på 227 aminosyrer som innbefatter aminosyresekvensen oppnådd for amino-terminusen av renset GDNF og en sekvens som er i samsvar med det indre peptidet oppnådd ved spaltning av renset GDNF. De karboksyterminale 134 aminosyrene bestemt for denne ORF omfatter den antatte aminosyresekvensen til renset moden GDNF protein. De foregående 93 aminosyrene innbefatter et potensielt initering ATG kodon etterfulgt av en antatt sekresjons signalsekvens og inneholder potensielle proteolytiske prosesseringsseter for spaltning av en forløper eller "pre-pro" form av proteinet for å danne den modne, rensede formen av GDNF beskrevet ovenfor i eksempel 1.

Templat DNA for sekvenseringsreaksjonene innbefatter enkelt-trådet og dobbelt-trådede versjoner av plasmid pBluescript SK-76.1 DNA. Dobbelt-trådet DNA ble dannet fra kulturer av XLl-Blue (pBluescript SK-76.1) ved en "boiling prep" prosedyre (Anal. Biochem 114:193:97) og separert i bånd i en CsCl tetthetsgradient. Enkelt-trådet templat ble produsert ved infeksjon med XLl-Blue (pBluescript SK-76.1) med et "hjelper" Ml3 fag fra Stratagene ved anvendelse av de relevante protokollene som kommer sammen med fagen. Enkelt-trådede oligonukleotidprimere på 15 til 23 nukleotider i lengde ble syntetisert på Applied Biosystems (Foster City, CA) DNA syntetisator, modell 380A syntetisator og generelt anvendt uten rensing. Sekvensbestemmelsen ble utført ved anvendelse av dideoksy-kjedet terrnineringsmetoden. De anvendte reagensene var innbefattet i sekvenaseversjon 2.0 kitet (United Stated Biochemical) og anvendt i henhold til protokollene som var vedlagt.

Nukleotidsekvensen til de første 877 nukleotidene av 5' enden til cDNA klon X,ZapII76.1, som inneholder den kodende sekvensen for renset modent GDNF protein er vist i figur 13 (SEQ ID NO: 3) sammen med aminosyresekvensen til en 681 basepar åpen leseramme (ORF) som finnes innenfor denne sekvensen. Sekvensen som tilsvarer renset moden GDNF begynner i posisjon 281 med et serin residie og er vist i figur 14 (SEQ ID NO: 4). DNA sekvensen oppnådd for denne regionen angir en aminosyresekvens som er i perfekt samsvar med de første 23 residiene av aminosyresekvensen observert ved aminoterminusen til renset GDNF (se eksempel 1).

Basert på en analyse av genet som vist i figur 13 er det sannsynlig at GDNF innledningsvis blir translatert som et pre-pro GDNF polypeptid og at den proteolytiske prosesseringen av signalsekvensen og "pro" delen av dette molekylet resulterer i produksjon av den formen av GDNF som er renset fra B49 celle kondisjonert medium. Det mest sannsynlige setet for translasjonsinitiering for en slik pre-pro form er ATG kodonet som er i posisjon 50 i sekvensen ifølge figur 13 (SEQ ID NO: 3).

C. Klonin<g> av det humane genet som koder for GDNF

Aminosyresekvensene til mange neutrotrofiske faktorer blir sterkt konservert i forskjellige pattedyrarter (Hallbook, et al. 1991 Neuron 6:845-858; McDonald, et al. 1991 BBA (in press)). Som en konsekvens av konserveringen av aminosyresekvensene er det betraktelig konservering av nukleotidsekvenser til genene som koder for disse proteinene. Det er derfor generelt sant at genet som koder for en neurotrofisk faktor i en pattedyrart kan kryss-hybridisere (dvs. danne en stabil dobbelttrådet DNA hybrid) med genene som koder for faktoren i andre pattedyrarter under hensiktsmessig sammen-smeltningsbetingelser. Denne egenskapen ble anvendt for å identifisere klonede humane DNA segmenter som innbefatter genet for GDNF.

En humant genomisk bibliotek konstruert i vektoren X.FIXII ble oppnådd fra Stratagene (katalog nr. 946203) og screenet ved anvendelse av en <32>P-merket prøve avledet fra rotte cDNA klonen til GDNF (pBluescript SK-76.1) bekskrevet ovenfor i eksempel 2B. Prøven besto av omtrent 250 bp av den kodende sekvensen fra moden GDNF ved spesifikk amplifikasjon ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen (Saiki et al. 1985 Science 230:1350) og ble produsert som følger. En 50 \ i\ eller 100 ul PCR reaksjon ble utført ved anvendelse av <lng XZap0076.1 DNA som templat og 10-20 pmol hver av to oligonukleotidprimere basert på sekvensen fra rotte GDNF. En oligo var "screenings oligo" (også betegnet DHD-21) beskrevet i eksempel 2A ovenfor, mens den andre oligoen (DHD-26) (SEQ ID NO: 13) hadde sekvensen:

som er basert på aminosyresekvensen (Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu) (SEQ ID NO: 14) oppnådd fra et indre peptid spaltningsprodukt av GDNF (se eksempel 1). Reaksjonen ble utført i 10 mM Tris-HCl (pH 8.3 ved 25°C), 50 mM KC1,1,5 mM MgCl2,10 ug/ml BSA (Promega R3961), .2mM hver av dNTP (Pharmacia), ved anvendelse av 2,5-5 u polymerase (USB). Reaksjonen besto av 30 sykluser: 95°C i 1 minutt, 44°C i 1 1/2 minutt og 72°C i 1 1/2 minutt. Produktet fra denne reaksjonen ble observert ved agarose gelelektroforese å være omtrent 250 bp som er i samsvar med posisjonene til de to primerene i cDNA sekvensen vist i figur 13. Dette umerkede fragmentet ble eluert fra gelen ved sentrifugering med en ultrafri-MC filterenhet (Millipore, Bedford, MA) ifølge vedlagte protokoller og anvendt som templat i påfølgende PCR merkingsreaksjoner ved anvendelse av de samme to oligomerene. Disse reaksjonene ble utført under identiske betingelser med unntagelse av at konsentrasjonen av kald dCTP ble redusert til 12,5 uM og 2,5 uM 3000-5000 Ci/mmol a-<32>P-dCTP (AMERSHAM) ble tilsatt til reaksjonen. Produktene fra merkingsreaksjonen ble sendt over en BioSpin 6 spin kolonne (BioRad, Richmond, CA). Gjennomstrømningen fra denne kolonnen ble anvendt som prøve for å screene det humane genomiske biblioteket.

Biblioteket ble sådd ut ved anvendelse av E. coli stamme PLK17 fra Stratagene. Tjuefire 150 mm petriskåler hver inneholdende omtrent 50000 plaque ble preparert. Duplikate nitrocellulosefilterløfl ble preparert fra hver skål ifølge prosedyren beskrevet av Maniatis et al. ovenfor. Disse 48 filtrene ble prøvet med 250 x 10^ cpm av PCR prøven (denaturert ved behandling med 0,5 N NaOH) beskrevet ovenfor i 250 ml 6x SSPE, 0,1 % SDS, 2x Denhardts reagens, 0,1 mg/ml tRNA og 30% formamid (USB) ved 42°C over natt (h- 16 t.). Filtrene ble deretter vasket to ganger i 250 ml 2x SSPE, 0,1% SDS ved romtemperatur og 2 ganger i 1,61 0,1 x SSPE, 0,1% SDS forvarmet til 50°C. Filtrene ble tørket ved romtemperatur og plassert under film i 6 dager ved -70°C med intensiverende skjermer. Filmene ble utviklet og registrert. 6 sterke dupliserende positiver ble observert. Området av bibliotek skålene tilsvarende postive signaler ble tatt ut, resuspendert og på ny platet for en annen runde for screening via ovennevnte detaljerte hybridiseringsprosedyrer. Alle 6 ble igjen testet som positive og ble plaque-

renset via en ytterligere runde med utsåing og hybridisering.

Det er rutinemessig å subklone og sekvensere segmentet til DNA rundt regionen som hybridiserer med prøven og dermed bestemme hele eller en del av sekvensen til det humane genet for GDNF. Dersom hele det humane GDNF genet ikke er representert disse klonene er det også rutinemessig å screene langs genomet og klone overlappende segmenter av DNA rundt denne regionen for å oppnå og sekvensere eventuelt gjenværende deler av genet.

Ovenfor angitte prosedyrer og forskjellige andre som er innlysende for fagfolk innenfor dette området kan bli anvendt for å screene andre humane genbibliotek. For eksempel ved anvendelse av ovennevnte prøve og hybridiseringsprotokoll ble et humant cDNA bibliotek screenet konstruert fra A<+> RNA ekstrakter fra humant putamen. Dette biblioteket innbefattet i kloningsvektoren XgtlO ble oppnådd fra Clontech (Palo Alto, CA) (katalog nr. HL1092a, Lot nr. 1561). Dette biblioteket ble sådd ut (e omtrent 250.000 plaque) på E. coli LE392 (Maniatis et al. supra) i en tetthet på omtrent 20.000 plaque pr. plate og screenet ved hybridisering under betingelsene beskrevet ovenfor. Etter hybridisering ble filtrene vasket to ganger ved romtemperatur i 0,2x SSPE, 0,1% SDS og to ganger i 0,1 x SSPE, 0,1 SDS på forhånd varmet til 50°C. Filtrene ble lufttørket ved romtemperatur og plassert under film. Etter eksponering i 3 dager ved 70°C med intensiverende sikter ble filmene utviklet og 8 duplikate positiver ble identifisert. 6 A.FIX II kloner fra et humant genomsik bibliotek ble identifisert ved hybridisering med en rotte GDNF prøve og plaque-renset til homogenisitet (se ovenfor). Lysater av hvert fag ble preparert ved hjelp av metoden til Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory manual; 1989). DNA ble dannet fra disse klonene ved følgende prosedyre: DNAase I (Pharmacia) og RNAase A (Sigma) ble tilsatt til 5 ml av hver kultur for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1 ug/ml. Oppløsningen ble inkubert ved 37°C i 1 time. Deretter ble 5 ml 20% polyetylenglykol (Sigma), 2M NaCl tilsatt og oppløsningen ble inkubert ved 0°C i 1 time. -fagene ble pelletert ved sentrifugering ved 12.000 x g i 10 min. Fagpelleten ble resuspendert i 250 ul TE (10 mM TRIS, pH 7,4, ImM EDTA) og deretter ekstrahert med et likt volum: a. kloroform, b. fenol, c. en 1:1 blanding av kloroform og fenol og d. kloroform. Ammoniumacetat ble tilsatt for å oppnå en sluttkonsentrasjon på .25M og DNA ble presipitert ved tilsetning av to volum etanol og sentrifugert ved 10.000 x g. DNA pelleten ble resuspendert i TE.

DNA fra hver av de 6 lambda isolatene ble spaltet med forskjellige restriksjonsendonukleaser og fragmentene separert ved elektroforese gjennom en agarosegel (Sambrook et al.). DNA fragmentene ble overført til to identiske nylon-membraner (Schleicher og Schuell) og hybridisert med radiomerkede prøver fra rotte GDNF. I rotte GDNF er det et EcoRI sete mellom nukleotidene 356 og 357 (ifølge nummereringen i fig. 13). Dette spalter innenfor den kodende sekvensen til moden GDNF. For å bestemme om de humane genomiske GDNF klonene har et sete ved en homolog posisjon ble EcoRI anvendt som en av restriksjonsendonukleasene for spaltning av de humane klonene. Spesifikt radiomerkede prøver ble dannet for regionene av genet som enten er oppstrøms (prøve 1) eller nedstrøms (prøve 2) for EcoRI setet i rotte GDNF. Prøve 1 hadde en lengde på 268 pb og består av 14 pb av 5' utranslaterte sekvensen til rotte GDNF og 254 bp av den kodende sekvensen (aminosyrene 1 til og med 85). Det ble dannet ved amplifikasjon av XZapII76.1 DNA ved anvendelse polymerasekjedereaksjon og oligonukleotid primerene PD1

(GACGGGACTCTAAGATG) (SEQ ID NO: 15) og DHD23 (GCIGCIGC(C/T)-TG(T/C)TT(A/G)TCIGG) (SEQ ID NO: 16). Reaksjonsbetingelsene for preparering av prøven er som beskrevet ovenfor med unntagelse av at reaksjonen består av 30 sykluser: 95°C i 1 minutt, 50°C i 1 1/2 minutt og 72°C i 1 1/2 minutt. Prøve to var 195 bp langt og besto av 17 nukleotider av 3' utranslatert sekvens av rotte GDNF og 178 bp av den kodende sekvensen (aminosyrene 153 til og med 211). Det ble preparert ved anvendelse av polymerasekjedereaksjonen og oligonukleotidprimerene LF2 (CGAGACAATGTACGACA) (SEQ ID NO: 17( og PD2

(CTCTGGAGCCACCCTCA) (SEQ ID NO: 18) og XZAPII76.1 som DNA templat. Reaksjonbetingelsene var de samme som for prøve 1.

Fem av de seks X klonene hadde identiske hybridiseringsmønstre. Prøve 1 hybridiserte til et omtrent 700 bp EcoRI fragment og prøve 2 hybridiserte til et omtrent 2,8 Kb EcoRI fragment. Det faktumet at de to prøvene hybridiserte til to forskjellige EcoRI DNA fragmenter tyder på at det humane GDNF genet inneholder et homologt EcoRI sete. 700 bp og 1,8 Kb EcoRi fragmenter ble subklonet separat inn i Bluescript SK-(Stratagene). Nukleotidsekvensene til disse to fragmentene ble bestemt som beskrevet i eksempel 2B. Sekvensen til disse DNA fragmentene er vist i figur 19 (SEQ ID NO: 5). Fra sekvensen fremkommer det at det er et intron før aminosyre 52 til pre-proGDNF. Det er ikke noe intron i delen av genet som koder for moden human GDNF. Den antatte aminosyresekvensen til moden human GDNF er 93% homolog med moden rotte GDNF. Dette er omtrent samme grad av aminosyresekvenshomologi som finnes blant rotter og humane proteiner for andre neurotrofiske faktorer (aminosyresekvens homologi mellom rotte og human CNTF er 83%, McDonald et al. BBA (1991) (in press). Aminosyre sekvenshomologien mellom rotte og human NGF er 95%, BDNF er 100% og NT-3 er 100%; Hallbook et al. 1991 Neuron 6:845-855).

For å oppnå fullstendig human pre-proGDNF sekvens kan en radiomerket hybridiseirngsprøve bli basert på sekvensen av human GDNF allerede oppnådd og denne prøven kan anvendes for å screene humane cDNA bibliotek. På grunn av at cDNA er kopier av prosessert mRNA er intronene ikke til stede og sekvensen til den fullstendig kodende sekvensen kan bli oppnådd. Nå som posisjonen til introner relativt til den kodende sekvensen er kjent kan en hybridiseringsprøve som er spesifikk for sekvensene oppstrøms for intronet bli dannet fra rotte cDNA klonen og denne prøven kan bli anvendt for å screene et genomisk bibliotek for kloner som inneholder 5' eksoner.

D. Nukleotidsekvensen som koder for de første 50 aminosyrene til human pre-proGDNF

Som beskrevet i eksempel 2C er det et intron som splitter nukleotidsekvensen som tilsvarer aminosyre 51 av human pre-pro GDNF. For å oppnå sekvensen av denne delen av molekylet ble et humant genomisk bibliotek screenet med en prøve avledet fra den aminoterminalt kodende sekvensen til rotte pre-proGDNF og en hybridiseringsklon ble sekvensert og vist å inneholde den kodende sekvensen til aminosyrene 1 til og med 50 av human pre-proGDNF som vist i figur 22 (SEQ ID NO: 8).

For denne bibliotek screeningen ble en PCR prøve syntetisert som beskrevet i eksempel 2C. Anvendte oligonukleotidprimere var:

PD1 = 5<*> > CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG > 3* (SEQ ID NO: 19)

LFA = 5' >CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC > 3' (SEQ ID NO: 20)

Betingelsene for PCR (både "kald" og <32>P-merking) reaksjonene var som beskrevet i eksempel 2B med unntagelse av at reaksjonen besto av 25 eller 30 sykluser: 95°C i 1 min., 50°C ill/2 min. og 72°C i 1 min. Produktet av denne reaksjonen inneholder de første 122 bp av rotte pre-proGDNF kodende sekvensen og 14 basepar 5' til den antatte initiator ATG (se figur 13 og SEQ ID NO: 3). Betingelsene for screening av det humane genomiske biblitoket med denne prøven var som beskrevet i eksempel 2C. De samme filterløftene anvendt for å identifisere kloner som inneholder sekvenser for moden human GDNF ble vasket 2 ganger i 15 min. i deionisert-destillert H2O oppvarmet til koking, prøvebehandlet over natt og vasket ifølge protokollen beskrevet i eksempel 2C. Filtrene ble eksponert for film i 3 dager ved -70°C med intensiverende skjerm. Når fremkalt, ble mange duplikate positiver med varierende intensiteter observert. 12 relativt sterke positiver ble plukket og 10 av disse ble plaque-renset ved suksessive runder av hybridisering under betingelsene for screening.

Klonede DNA fra disse rekombinante fagene ble analysert ved Southern blot hybridisering. Et omtrent 1000 bp Alul fragment ble funnet å hybridisere til screeningsprøven og ble subklonet inn i Smal-spaltet pBluescript SK- for å produsere pBSSK-X3AluI. Dette klonede Alul fragmentet ble ytterligere subklonet for å lette sekvensering av det relevante DNA segmentet. Renset pBSSK-X,3AluI DNA ble spaltet med en serie av restriksjonsenzymer som spalter vektoren bare en gang (innenfor polylinkerregionen) og spaltningsproduktene ble analysert ved agarose gelelektroforese. To restriksjonsenzymer (Pstl og SacII) ble dermed identifisert og blir spaltet en gang innenfor klonet DNA. Figur 22 viser et kart av SacII og Pstl setene. Southern blots viser at regionen av det klonede segmentet som hybridiserte til screeningsprøven var lokalisert mellom SacII og Pstl setene til det klonede Alul segmentet. For sekvensering ble dermed to delsjonsderivater av pBBSK-X3AluI konstruert. I et tilfelle ble det lille, omtrent 200 bp, Pstl fragmentet deletert som følger: plasmidet ble spaltet med Pstl og spaltningen ligert og transformert inn i E. coli. Transformanter ble screenet for de som mangler det lille Pstl fragmentet. Parallelt ble 300 bp SacII fragmenter likeledes deletert fra pBSSK-X3AuI for åprodusere den andre delesjonsderivatet. Disse to delesjons-plasmidene ble anvendt som templater for sekvenseringsreaksjonene. Sekvenseringen ble utført som beskrevet i eksempel 2B.

Figur 22 (SEQ ID NO: 8) presenterer 233 basepar av sekvensen oppnådd på denne måten. Denne sekvensen inneholder en region på 151 bp som utviser en meget høy homologi grad med de første 151 bp av den kodende sekvensen for rotte pre-proGDNF, 88% identitet på aminosyrenivå og 95% identitet på DNA nivå. Den kan dermed konkluderes med at denne regionen er en del av eksonet som bærer den kodende sekvensen til amino-terminale 50 residier av human pre-proGDNF og det første nukleotidet til kodonet for residiet 51. Sekvensen rett 3" for denne 151 bp sekvensen er homolog med konsensussekvensen for 5' enden til pattedyrintroner (Shapiro og Senapathy 1987 Nucl. Acids. Res. 15:7155-7174). Sekvensen rett 5' for antatt initiator ATG viser sterk homologi med rottesekvensen for 28 bp og 27 av 28 residier er identiske. Her divergerer oppstrøms sekvensen meget. Sekvensen rundt divergenspunkter viser betraktelig homologi med konsensussekvensen for 3' enden av pattedyr intronene. (Shapiro og Senapathy, supra). Det er sannsynlig at dette er et spleisesete til tross for at det ikke er noe klart bevis for dette. Den åpne leserammen inneholdende humane pre-proGDNF rager minst 27 basepar oppstrøms for initiator ATG. Som beskrevet i foretrukne utførelsesformer ovenfor er det mulig at andre former av en pre-proGDNF kan bli produsert som inneholder ytterligere oppstrøms aminosyrer. Disse formene kan også bli prosessert for å produsere modent GDNF molekyl som er blitt renset og sekvensert (se eksempel 1).

Nukleotidsekvensene presentert her og i eksempel 2C inneholder hele den kodende sekvensen for human pre-proGDNF som utviser omfattende homologi med rotte pre-proGDNF som er blitt vellykket uttrykt i pattedyrceller (se eksempel 5) for å produsere aktiv rotte GDNF.

Eksempel 3: Anvendelse av GDNF for å forhindre eksperimentell Parkinsonisme.

Dette eksempelet beskriver metoder for å danne eksperimentell Parkinsonisme i aper ved hensiktsmessig administrering til dyrene av neurotoksin MPTP (l-metyl-4-fenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridin). Det beskrives også metoder for administrering av GDNF til dyr utsatt for MPTP for å lindre utviklingen av Parkinsonisme i slike dyr.

A. Administrering av GDNF i aper behandlet med MPTP for å produsere eksperimentell Parkinsonisme

En rustfri-stålkanyle kan bli implantert i høyre lateral ventrikkel og koblet til en subkutant implantert osmotisk minipumpe (Alzet 2002). Minipumpen inneholder GDNF i forskjellige konsentrasjoner eller fortynningsmiddelet som en neagtiv kontroll. Pumpen leverer 0,5 ul/t. i 14 dager. 2 dager etter kanyle-pumpe implanteringen mottar apene (Cebus apella) en injeksjon av 0,6 mg/kg MPTP inn i høyere carotid arterie. 6 uker etter den første implanteringne ble dyrene perfusert med saltvann og hjernen ble hurtig fjernet. Hjernen ble dissekert på is og vevsbiter blir fjernet fra caudat kjernen og putamen. Substantia nigra blir plassert i fikseringsmiddel. Caudat-putamen vevet blir analysert ved HPLC-EC for dopamin og substantia nigra blir bearbeidet for tyrosin hydroksylase (TH) immunreaktivitet.

B. Effektiviteten til GDNF.

Degenerasjon av nigral dopaminerge nerveceller og aksonale projeksjoner til caudat/putamen forårsaker eksperimentell Parkinsonisme i denne apemodellen. Det er flere eksperimentelle indikasjoner på at GDNF kan forhindre eller redusere alvorligheten av denne neuronale degenerasjonen. GDNF kan for eksempel forhindre tapet av TH positive nervecellelegemer i substantia nigra. Dette indikerer sparing av GDNF til nigral dopaminerge nerveceller fra de toksiske virkningene til MPTP. GDNF kan også forhindre tapet av TH positive fibere i caudat/putamen. Dette indikerer sparing av GDNF til aksonale projeksjoner av nigral dopaminerge neuroner fra de toksiske virkningene av MPTP. GDNF kan også forhindre tapet av dopamininnholdet i caudat/putamen. Dette indikerer sparing av toksiske virkninger til MPTP ved GDNF av aksoner og deres dopamininnhold som utgår fra nigral dopaminerge neuroner til caudat/putamen.

Eksempel 4: Biologiske aktiviteter og potensielle kliniske indikasjoner for GDNF.

Renset GDNF øker dopaminopptaket til dopaminerge neuroner til stede i kulturer av embryoniske mesencefalsike nerveceller i både anriket og definert kulturmedium som demonstrert i eksempel 1. Dette indikerer at GDNF er en neutrotrofisk faktor for disse dopaminerge nervecellene. GDNF kan derfor vise seg å være nyttig for behandling av degenerasjonen til disse neuronene som oppstår i Parkinsons sykdom. GDNF kan videre vise seg å være nyttig for behandling av uriktig virkning av andre hjemedopaminerge neuroner. Slik uriktig virkning kan oppstå ved schizofreni og andre forstyrrelser som krever behandling med neuroleptiske midler.

A. Renset GDNF fremmer overlevelsen av parasvmpatiske og s<y>mpatetiske nerveceller i kultur:

1. Analyse for neuronal overlevelse:

Materialer

3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid (MTT) ble oppnådd fra Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. Føtalt kalveserum ble oppnådd fra Hyclone Laboratories, Logan, Utah. Dyrkningsmediet og saltoppløsningene ble oppnådd fra Irvine Scientific, Santa Ana, California. Kulturskålene ble oppnådd fra Costar,

Cambridge, Massaschussetts. Anvendelseskvalitet patogen-frie fertile kylling-embryoegg ble oppnådd fra Spafas, Roanoke, Illinois.

Analyser

Kulturer av primære kyllingbryo ciliære ganglia og sympatetisk kjedeganglia ble preparert som tidligere beskrevet (Collins 1978 Develop. Biol. 65:50; Manthorpe et al. 1986 Develop. Brain Res. 25:191). Ciliære eller sympatetiske gangliga ble fjernet fra fertile, patogen frie kyllingegg som var blitt inkubert i 8 og 10 dager ved 38°C i en fuktig atmosfære. Gangliene ble kjemisk dissosiert ved eksponering først for Hanks balanserte saltoppløsning uten divalente kationer inneholdende 10 mM HEPES buffer pH 7,2 i 10 min. ved 37°C, og deretter ved eksponering for en oppløsning av 0,125% baktotrypsin 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) i Hanks balanserte saltoppløsning modifisert som ovenfor i 12 min. ved 37°C. Trypsineringen ble stoppet ved tilsetning av føtalt kalveserum til en sluttkonsentrasjon på 10%.

Etter denne behandlingen ble gangliene overført til en oppløsning bestående av Dulbeccos høy glukose modifisert Eagel medium uten bikarbonat inneholdende 10% føtalt kalveserum og 10 mM HEPES, pH 7,2 og ble mekanisk dissosiert ved trituering omtrent 10 ganger gjennom en glass pasteur pipette hvor åpningen var blitt polert i ild og utdratt til en diameter at det tok 2 minutter for å fylle opp pipetten.

Dissoiserte ganglia ble deretter sådd ut i kulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagel medium supplementer! med 10% føtalt kalveserum, 4 mM glutamin, 60 mg/l penicillin-G, 25 mM HEPES, pH 7,2) i 100 mm diameter vevskulturskåler (40 dissosierte ganglia pr skål) i 3 timer. Denne pre-utplatingen ble utført for å separere ikke-neuronale celler som adhererer til skålen, fra nerveceller, som ikke adhererer. Etter 3 timer ble de ikke-adherente nervecellene samlet ved sentrifugering, resuspendert i kulturmedium og sådd ut i 50 ul pr brønn på halvt område av 96 brønn mikrotiter vevskulturskåler i en tetthet på 1500 nerveceller pr brønn. Mikrotiterbrønnene var på forhånd blitt eksponert for en 1 mg/ml oppløsning av poly-L-omitin i 10 mM natirumborat, pH 8,4 over natt ved 4°C, vasket i destillert vann og lufttørket. 10 ul av en seriefortynning av prøven som skulle bli analysert for neurotrofisk aktivitet ble tilsatt til hver brønn og skålene ble inkubert i 20 timer ved 37°C i en fuktig atmosfære inneholdende 7,5% C02- Etter 18 timer for ciliære og 40 timer for sympatetiske ganglia ble 15 ul pr brønn av en 1,5 mg/ml oppløsning av tetrazol farge MTT i Dulbeccos høy glukose modifisert Eagel medium uten bikarbonat inneholdende 10 mM HEPES, pH 7,2 tilsatt og kulturene plassert i 37% inkubator i 4 timer. Deretter ble 75 ul av en oppløsning av 6,7 ml 12 M HC1 pr liter isopropanol tilsatt og inneholdende fra hver brønn ble trituert 30 ganger for å åpne cellene og suspendere fargestoffet. Absorbansen av 570 nm ble bestemt relativt til en 690 nm referanse for hver brønn ved anvendelse av en automatisk mikrotiterplate avleser (Dynatech, Chantilly, Virginia). Absorbansen til brønnene som ikke hadde mottatt neurotrofisk middel (negative kontroller) ble subtrahert fra absorbansen til prøve-inneholdende brønner. Den resulterende absorbansen i forhold til antall levende celler i hver brønn er definert som de nervecellene som kan redusere fargestoffet. Antall neurotrofiske enheter av neurotrofisk aktivitet ble definert som det resiproke av fortynningen som ga 50% av maksimal overlevelse av nervecellene. Den spesifikke aktiviteten ble bestemt ved å dele antall trofiske enheter med mengden av protein til stede i prøven.

Resultater

Som illustrert i figur 15 fremmer renset GDNF overlevelsen i kultur av parasympatetiske nerveceller fra kyllingembryo ciliære ganglia. Som illustrert i figur 16 fremmer renset GDNF overlevelsen i kultur av sympatetiske nerveceller fra kyllingembryosympatitsk kjedeganglie.

Disse resultatene indikerer at GDNF virker som en overlevelsesfaktor for parasympatetiske og sympatetiske neuroner. De kan derfor være nyttige for behandling av forskjellige former for nerveskade i det autonome (dvs. parasympatetiske og sympatetiske) nervesystemet. En slik skade kan oppstå fra metaboliske tilstander så som diabetes eller nyrefeilfunksjon. En slik skade kan også oppstå fra behandling av pasienter med forskjellige kjemoterapeutiske midler, så som cancer kjemoterapeutiske midler cisplatin og vincristin, eller AIDS kjemoterapeutiske midler ddl og ddC. En slik skade kan også oppstå ut fra de genetiske tilstandene så som dysautonomi. En slik skade kan også oppstå ut fra traumatisk skade.

Eksempel 5: Ekspresjon av rekombinant GDNF i dvreceller

A. Konstruksjon av rekombinante plasmider for COS celleekspresjon

Et omtrent 1,5 kb Smal fragment av pBluescript SK-76.1 som inneholder hele den GDNF kodende sekvensen ble subklonet inn i plasmid vektor pSG5 (Green et al. 1988 Nucl. Acids. Res. 16:369) som er konstruert for forbigående ekspresjon av klonede gener i celler som uttrykker SV40 antigen så som COS cellene.

DNA sekvensen til GDNF cDNA (figur 13) (SEQ ID NO: 3) og restriksjons endonukleasekartlegging identifiserte et Smal fragment angitt ved et Smal sete beliggende i polylinkeren til vektoren (18 bp 5' til 5' enden av cDNA klonen) og et Smal sete (-5-1500 bp der fra) beliggende innenfor cDNA klonen omtrent 800 bp 3' for enden av den kodende sekvensen for moden GDNF. Dette Smal fragmentet ble klonet inn i pSG5 som følger. Renset pSG5 plasmid DNA (Stratagene) ble spaltet med EcoRi og behandlet med kalvetarm alkalisk fosfatase (CIAP), (Promega) ifølge forhandlerens protokoller. Deretter ble vektoren elektroforert og eluert fra en agarosegel. Renset pBluescript SK-76.1 plasmid DNA ble metylert med EcoRI metylase, spaltet med Smal og ligert med EcoRI linkermolekylet beskrevet i eksempel 2A. Etter EcoRI spaltning og agarose gelelektroforese ble det omtrent 1,5 kb Smal fragmentet av interesse (nå EcoRI metylert og koblet) ble eluert og ligert til EcoRI spaltet og fosfatasebehandlet pSG5 vektor. Ligeringsproduktene ble anvendt for å transformere kompetente E. coli XLI-blå ved anvendelse av CaCl2 prosedyren (Maniatis et al. supra). Ampicillinresistente transformanter ble samlet og analysert for rekombinante plasmider ved restriksjonsendonuklease spaltning og agarose gelelektroforese. Spaltning med EcoRI indikerer at de fleste transformantene inneholdt plasmider som bærer det ønskede innskuddet. Spaltning med BamHI identifiserte orienteringen av det klonede GDNF genet relativt til SV40 promoteren til stede i vektoren (merk BamHI setet i posisjon 15 i sekvensen i figur 13). Begge orienteringene ble oppnådd.

To transformanter ble valgt for ytterligere analyse, et inneholdt et plasmid, betegnet pSG5::rGDNF-7 inneholdende GDNF genet i riktig orientering for at det blir uttrykt i RNA transkripter initiert ved SV40 promoteren, mens det andre inneholdt et plasmid, betegnet pSG5::rGDNF-4, inneholdende GDNF genet i motsatt orientering, hvor RNA transkriptene som begynner ved SV40 promoteren ikke vil uttrykke GDNF. Rensede preparater av begge disse plasmidene ble dannet ved CsCl tetthetsgradient sentrifugering for anvendelse i COS celle ekspresjonseksperimenter.

B. Ekspresjon av GDNF i COS- 7 celler.

Plasmid DNA fra disse konstruksjonene ble dannet ved fremgangsmåten for alkalisk lysering etterfulgt av CsCl tetthetssentrifugering (Maniatis et al., supra). Dette DNA ble transfektert inn i COS-7 celler ved hjelp av metoden til Sompaayrac og Danna (1981 proe. Nati. Acad. Sei. USA 78:7575-7578). Som en kontroll ble ekvivalente COS cellekulturer transfektert med plasmid vektor DNA inneholdende GDNF innskuddet i riktig orientering, og dette vil ikke muliggjøre ekspresjon av GDNF proteinet. Pe 100 mm kulturskål ble 30 ug lipofectin og 0,3-1 ug plasmid DNA anvendt.

Etter transfektering i 24 timer ble mediet sugd av og erstattet med OptiMEM I ± 3% FCS. Kulturene ble inkubert i 48 timer og høstet som følger:

a) mediet (kondisjonert medium eller CM) ble sugd ut og lagret ved -80°C,

b) 5 ml BPS + 2,5 mm EDTA bie tilsatt til celleteppet og oppbevart ved 25°C i 3 min. og deretter ble cellene pipettert ut av skålen og sentrifugert ved 1000 x g i 5 minutter. Supematanten ble fjernet og cellepelletene ble lagret ved -80°C.

CM ble konsentrert 30-ganger på Centricon 10 konsentratorer og analysert for bioaktivitet. Cellepelletene ble sonikert i 500 (il 10 mM EDTA, pH 7,0, pluss 1 mM benzamidin, 100 (im PMSF, 1 mM E-amino-n-capronsyre. Cellelysatene ble sentrifugert ved 1400 x g i 5 minutter og supematantene analysert for bioaktivitet.

C. Bianalyse av uttrykt GDNF

Cellelysatet og kulturmediet fra COS celler transfektert med GDNF-uttrykkende og kontrollplasmider (med GDNF kodende sekvens i uriktig orientering) ble analysert for både evnen til å øke dopaminopptaket i kulturene til mesencefaliske neuroner (se eksempel 1) og for evnen til å øke overlevelsen av sympatetiske ganglianeuroner (se eksempel 4). COS celle kulturmediet (figur 17) og cellelysatet (data ikke vist) økte dopaminopptaket som ventet for GDNF. Som vist i figur 18 økte COS cellekulturmediet og cellelysatet overlevelsen av sympatetisk kjedeneuroner som ventet for GDNF.

Disse resultatene indikerer klart at ekspresjonen av GDNF genet i en dyrecelle resulterer i produksjonen av et protein med de biologiske aktivitetene demonstrert for renset

GDNF.

Eksempel 6: Eks<p>resjon av human GDNF i E. coli

A. Kontruksion av et plasmid som koder for human GDNF

Ved anvendelse av sekvensinfirmasjonen til det humane GDNF genet (eksempel 2C) ble syntetiske oligonukleotider PD3 og PD4 dannet som primere for amplifikasjon av det humane GDNF genet og ekspresjonen derav fra en plasmid ekspresjonsvektor i E. coli. Sekvensene til oligonukleotidene PD3 (SEQ ID NO: 21) og PD4 (SEQ ID NO: 22) er

PD3: 5' CGCGGATCCAATAAGGAGGAAAAAAAATGTCACCAGATAAACAAAT 3'

PD4: 5' CGCGGTACCCAGTCTCTGGAGCCGGA 3<*>

Oligonukleotid PD3 er 46 nukleotider langt. De 17 nukleotidene ved 3' enden matcher perfekt med det humane GDNF genet i regionen som koder for N-terminusen til det modne proteinet. Før disse 17 nukleotidene er et translasjonsiniteringskodon, ATG, slik at syntesen av moden human GDNF vil begynne ved den riktige aminosyren i E. coli. De andre nukleotidene er konstruert for å tilveiebringe andre signaler som synes nødvendig for god ekspresjon i E. coli samt et BamHI endonukleaserestriksjonssete nødvendig for konstruksjon av GDNF ekspresjonsplasmidet.

Oligonukleotid PD4 er 26 nukleotider langt. De 17 nukleotidene ved 3' enden matcher fullstendig med 17 nukleotider av det humane GDNF genet 3' for stoppkodonet. Dette oligonukleotidet tilveiebringer også sekvenser som er nødvendige for rekonstruksjon av et Kpnl restriksjonsendonukleasesete for konstruksjon av GDNF ekspresjonsplasmidet.

Reaksjonsbetingelsene for ampiifikasjonen av human GDNF er som følger: det totale reaksjonsvolumet var 100 ul og inneholdt l ng av en XDNA klon inneholdende det humane GDNF genet, 2+ pmol hver av PD3 og PD4,20 mM Tris-HCl pH8,8,10 mM KC1, 6 mM (NH4)2So4,1,5 mM MgCl2 og 0,1% Triton X-100. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 95°C i 5 minutter, avkjølt til 44°C og 2 enheter Pfu DNA polymerase (Strategene) ble tilsatt. Reaksjonen besto av 30 sykluser: 72°C i 1 1/2 minutt, 95°C i 1 minutt og 44°C ill/2 minutt. Ved slutten av reaksjonen ble MgCl2 tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 mM. 5 enheter DNA polymerase I stort (Klenow) fragment (Promega) ble tilsatt og reaksjonen inkubert ved 37°C i 10 minutter. Deretter ble 10 ul 3M NaAc og 220 ul EtOH tilsatt og oppløsningen ble sentrifugert ved 12.000 x g i 15 minutter for å presipitere DNA. Presipitert DNA ble resuspendert i 100 u>l 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 20 enheter BamHI og 20 enheter Kpnl og inkubert ved 37°C i 1 time. Et DNA fragment med riktig størrelse ble identifisert etter elektroforese gjennom en agarosegel og renset ved anvendelse av et ultrafri-MC filterenhet (Millipore). Dette fragmentet ble ligert inn i en E. coli ekspresjonsvektor, pT3XI-2, (beskrevet nedenfor). Ligeringsbetingelsene var som følger: det totale reaksjonsvolumet var 5 ul og inneholdt 10 ng pT3XI-2 DNA linearisert med Kpnl og BamHI, 5 ng humant GDNF DNA fragment som beskrevet ovenfor, 50 mM Tris.HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, ImM DTT, 5% polyetylenglykol-8000 og 1 enhet T4 DNA ligase (Bethesda Research Laboratories). Reaksjonen ble inkubert ved 14°C i 2

timer.

Vektoren pT3XI-2 ble konstruert på følgende måte. Utgangsplasmidet for denne konstruksjonen var plasmid pKK223-3 (Brosius og Holy, 1984) oppnådd fra Pharmacia. Plasmid pKK223-3 inneholder et partielt gen for tetrasyklinresistens. Dette ikke funksjonelle genet ble erstattet av et fullstendig tetrasyklinresistensgen innbefattet på plasmid pBR322. Plasmid pKK223-3 ble fullstendig spaltet med SphI og delvis med BamHI. Et 4.4 kilobasepar fragment ble gelrenset og kombinert med en syntetisk adapter (SEQ ID NO: 23):

og et 539 baseparfragment av DNA fra en Clal, SphI spaltning av tetrasyklinresistensgenet til pBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01). Det resulterende plasmidet var betegnet pCJl.

Deretter ble en Xhol linker oppnådd fra New England Biolabs skutt inn i plasmid pCJl PvuII sete for å danne plasmid pCJX-1. Dette innskuddet ødelegger rop genet som kontrollerer plasmid kopi antallet. Deretter ble et EcoRI fragment inneholdende lad genet renset fra plasmid pMC9 (Calos et al., 1983) og deretter skutt inn i Xhol setet med Xhol til EcoRi adaptere. Polylinker regionen i plasmid pKK223-3 ble deretter erstattet med en polylinker inneholdende ytterligere seter ved spaltning med EcoRI og Pstl (SEQ ID NO: 24):

Plasmidvektoren oppnådd på denne måten er betegnet pCJXI-1.

Til slutt ble tetrasyklinresistensgenet erstattet med et lignende gen som hadde gjenkjenningsseter for restriksjonsenzymene Hindlil, BamHI og Sali ødelagt ved bisulfit mutagenese. Følgende prosedyre ble anvendt for å mutere tetrasyklin resistensgenet til pBR322. Plasmid pBR322 ble spaltet med Hindlil og deretter mutagenisert med natriumbisulfit (Shortle og Botstein, 1983). Mutagenisert DNA ble ligert for å danne sirkulært DNA og deretter spaltet med Hindlil for å linearisere eventuelt plasmid som unngikk mutagenesen. E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985).

Tetrasyklinresistente plasmider ble isolert og undersøkt for tap av Hindlil setet i tetrasyklinresistens genet. Vellykket mutert plasmid ble betegnet pTl. En lignende prosedyre ble utført for å mutagenisere BamHI setet i pTl og ga plasmid pT2. Plasmid pT2 ble igjen mutagenisert for å fjerne Sali sete for dannelsen av plasmid pT3. Et Clal-Styl-fragment av pT3 inneholdende det muterte tetrasyklin resistens genet ble isolert og anvendt for å erstatte det homologe fragmentet til pCJXI-1 for å danne pT3XI-2. Det muterte tetrasyklin resistens genet koder fortsatt for et funksjonelt protein. Nedstrøms for tac promoter regionen ble en polylinker innført og inneholder blant andre seter, BamHI og Kpn I restriksjonsseter som er nyttige for kloning av gener for ekspresjon i E. coli.

Etter 2 timer ligering av vektoren med den humane modne GDNF konstruksjonen ble 2 ul av reaksjonsblandingen anvendt for åtransformere Epicurian Coli SURE,?,, superkompetente E. coli celler (Stratagene) ifølge forhandlerens instruksjoner. DNA sekvensen til en av de rekombinante plasmidene ble bestemt som beskrevet i eksempel 2B. Sekvensen bekreftet at dette plasmidet inneholdt den fullstendig kodende sekvensen til det humane GDNF genet kodende for moden human GDNF.

B. Ekspresjon av human GDNF i E. coli

Det rekombinante plasmidet inneholdende DNA sekvenser kodende for human GDNF ble transformert inn i E. coli stamme JM107ørMCB0005, en Tl resistent variant av JM104 (Yanisch-Perron et al. (1985)) ved anvendelse av CaCl2 metoden beskrevet i Sambrook et al. (1989). En av rekombinantene ble dyrket i 50 ml LB medium (Sambrook et al.) med 100 ug/ml ampicillin (Sigma) med risting ved 37°C over natt. Neste dag ble kulturen fortynnet 1:70 i LB medium med 100 ug/ml ampicillin og dyrket i 5 timer med risting ved 37°C. 20 ul celler ble høstet ved sentrifugering ved 8000 x g i 10 minutter. Peletten ble resuspendert i 4 ml 10 mM EDTA pH 7,4. Cellene ble ødelagt ved anvendelse av en French Pressure Cell (SLM Instruments) ved 18.000 psig. Lysatet ble sentrifugert ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4°C. Pelleten ble resuspendert i 10 mM EDTA. Det ble oppdaget at relativt mere GDNF akkumulerer dersom fermenteringen foregår ved 42°C i stedenfor 37°C eller 30°C.

Den foretrukne metoden for oppnåelse av høye nivåer GDNF ekspresjon i E. coli ved anvendelse av det rekombinante plasmidet beskrevet i eksempel 6A (hvor den kodende sekvensen for human moden GDNF er klonet i ekspresjonsvektor pT3XI-2) er som følger. For 101 fermentering blir et 500 ml inokulum dyrket i LB medium (pH 7) inneholdende 15 ug/ml tetrasyklin ved 37°C i en 21 risteflaske til en optisk tetthet (Ag6o) på mellom 2 og 3. Denne kulturen blir anvendt for å inokulere 101 vekstmedium inneholdende: 12 g/1 trypton, 24 g/l gjærekstrakt, 25 g/l glycerol, 1,3 g/l K2HPO4, 0,4 g/l, KH2PO4, 0,1 ml/l 4:1 blanding av Macoll9:GE60, og 15 mg/l tetrasyklin HC1. Denne kulturen ble dyrket i omtrent 12 til 18 timer ved 42°C til optiske tettheter på omtrent 12 til 20 (Aggø). pH til fermenteringen blir opprettholdt ved 7,0 og oppløst oksygen blir opprettholdt ved 30% metning. Deretter postfermentering, avkjøling av kulturen ved 4°C og høsting av cellene ved sentrifugering.

Produksjon av human GDNF fra dette plasmidet beskrevet ovenfor er ikke spesifikk for denne stammen av E. coli, men kan bli produsert i en hvilken som helst egnet stamme. Plasmidet er blitt transformert inn i to andre stammer av E. coli, JM108 (Yanisch Perron et al., 1985) og SURE<®> (Stratagene). I begge disse stammene er et nytt proteinbånd med riktig molekylvekt blitt visualisert ved Coomassie Blue farving etter elektroforese gjennom en polyakrylamid gel.

En alikvot av det resuspenderte materialet ble elektroforert gjennom en polyakrylamidgel. Gelen ble farget med Coomassie Blue. Et protein med ventet molekylvekt for GDNF (15.000 dalton) var bare til stede i kulturer som inneholdt det rekombinante humane GDNF plasmidet, men ikke i kulturer som bare inneholdt vektor pT3XI-2. Det isolerte proteinet ble utsatt for standard aminoterminal sekvenseringsprosedyrer og de første 22 aminosyrene av dette proteinet er identiske med aminosyresekvensen til human GDNF som vist i fig. 19 som bekrefter at human GDNF blir riktig uttrykt i E. coli.

C. Refolding og bioaktivitet til rekombinant humant GDNF produsert i bakterier

Preparering av materiale for refoldin<g>. E. coli transformant JM107 (pT3X12::huGDNF) ble dyrket til stasjonær fase ved 37°C i et gjærekstrakt (#0127-01 Difco laboratories, Detroit, MI) og trypton (#0123-05 Difco Laboratories, Detroit, MI) basert kompleksmedium (24 g/l gjærekstrakt, 12 g/l trypton, 5 g/l glycerol. 1,3 g/l K2HPO4, 0,4 g/l KH2PO4,0,1 ml/l macol 19/GE60 (4:1), 15 mg/l tetrasyklin) uten IPTG induksjon. Cellene ble sentrifugert ved 16.000 x g i en JA10 rotor ved 4°C i 20 minutter og cellepastaen lagret ved -20°C.

Cellene ble prosessert som følger: 5 g cellepasta ble homogenisert med 40 ml 10 mM

EDTA, pH 7,0 på is ved anvendelse av en OCI instrument homogenisator. Oppslemmingen ble French-presset tre ganger ved 20.000 psi og deretter sentrifugert ved 30.000 x g i en JA 20 rotor i 10 minutter ved 4°C. Supematanten ble fjernet og pelleten ble homogenisert og sentrifugert som ovenfor. I en utførelsesform ble pel leten fra reekstraheringen homogenisert med 40 ml 25 mM Tris, pH 7,4, sentrifugert som ovenfor og supematanten fjernet. Pelleten ble homogenisert med 20 ml 50 mM Tris, pH 8,0, inneholdende 8 M urea med eller uten tilsetning av 30 mM 2-merkaptoetanol, sentrifugert som ovenfor og supematanten bevart. Supematanten blir referert til som TU ekstraktet. I den foretrukne utførelsesformen ble pelleten homogenisert i 40 ml 10 mM Tris, pH 8,0, inneholdende 1 mM EDTA, 1% NP-40, sentrifugert som ovenfor og supematanten fjernet. Pelleten ble oppløst ved sulfonylering som følger: pelleten ble homogenisert i 25 ml 20 mM natriumfosfat, pH 7,4 inneholdende 8 M urea, 100 mM natriumsulfit og 10 mM natriumtetrationat. Sulfonyleringen ble utført ved 4°C over natt med omrøring og deretter sentrifugert ved 16.000 x g, 4°C i 10 minutter for å klargjøre oppløsningen.

Delvis rensing av TU ekstraktet før refolding.

TU ekstraktet ble delvis renset ved ionebyttekromatografi på S-sepharose Fast Flow harpiks (Pharmacia). Kolonnen ble ekvilibrert og kjørt ved romtemperatur i 25 mM Tris, pH 7,4, inneholdende 8 M urea og 30 mM 2-merkaptoetanol (buffer A). Etter applisering av prøving og vasking med buffer A til grunnlinje optisk tetthet ble kolonnen eluert ved 10% kolonnevolum pr. minutt med 5 kolonne volum hver av buffer A og 100 mM Tris, pH 9,0, inneholdende 8 M urea, 500 mM NaCl og 30 mM 2-merkaptoetanol (buffer B). Kolonnefraksjonene ble registrert ved 280 nm og analysert ved SDS-PAGE. GDNF eluerte som hovedproteintopp ved 60-70% av gradienten. Fraksjoner anriket i GDNF ble slått sammen for refolding (fig 25).

Delvis rensing av sulfonylert ekstrakt før refolding.

Det sulfonylerte ekstraktet ble delvis renset ved ionebyttekromatografi på Q-Sepharose Fast Flow harpiks (Pharmicia). Kolonnen ble ekvilibrert og kjørt ved 4°C i 10 mM Tris, pH 8,0 inneholdende 4 M urea (buffer A). Etter applisering av prøven og vasking med buffer A til grunnlinje optisk tetthet ble kolonnen eluert som 5% kolonnevolum pr minutt med 5 kolonnevolum hver av buffer A og 10 mM tris, pH 8,0 inneholdende 4 M urea og 500 mM NaCl (buffer B). Kolonnefraksjonene ble registrert ved 280 nm og analysert ved SDS-PAGE. GDNF eluerte ved hovedproteintoppen ved 50% av gradienten. Fraksjoner anriket i GDNF ble slått sammen for refolding.

Refolding av delvis renset TU ekstrakt.

GDNF delvis renset som beskrevet ovenfor ble refoldet som følger: til 4 ml sammenslått kolonneeluat inneholdende GDNF ved omtrent 1 mg/ml ble ditiotreitol tilsatt til 5 mM. Røret ble satt lokk på for å utelukke luft og oppbevart ved 25°C i 15 minutter. Deretter ble oksydert glutationdinatriumsalt tilsatt til 15 mM, røret ble på ny satt lokk på for å utelukke luft og oppbevart ved 25°C i 15 minutter. Denne oppløsningen ble deretter fortynnet med 14 volum refoldingsbuffer (100 mM Na2HP04), 10 mM etanolamin, pH 8,3, inneholdende 4 M urea, 5% polyetylenglykol 300, og 2 mM cystein) og oppbevart under argon ved 5°C i 3 dager.

Refolding av delvis renset sulfonvlert ekstrakt. GDNF delvis renset som beskrevet ovenfor ble refoldet som følger: sammenslått kolonneeluat inneholdende GDNF ved omtrent 3 mg/ml ble fortynnet med 19 volum refoldingsbuffer (100 mM Na2HP04 Tris, pH 8,3, inneholdende 4 M urea, 5% polyetylenglykol 300 og 3 mM cystein) og oppbevart under argon ved 5°C i 3 dager.

Analyse av refoldet GDNF ved SDS- PAGE.

GDNF ekstraktet fra bakterier uten tidligere eksponering for reduksjonsmidler migreres som en monomoer på SDS-PAGE ved en tilsynelatenede molekylvekt på omtrent 16 kDa sammenlignet med migrering av molekylvektstandardproteinene. Det er ingen detekterbar GDNF ved posisjonen til en dimer. GDNF, eksponert for reduksjonsmiddel (30-150 mM 2-merkaptoetanol) enten i løpet av ekstraheringen eller like før SDS-PAGE, men før refoldingen, migrerer ved en posisjon som ikke kan sjeines fra det ikke-reduserte bakterielle proteinet, med en tilsynelatende molekylvekt på omtrent 16 kDa (fig. 26, kolonnene 6 og 13). Dette indikerer ar GDNF preparert fra de bakterielle cellene ikke blir dimerisert før refoldingen.

Etter refoldingen som ovenfor migrerer det meste av det bakterielt-produserte rekombinante GDNF på ikke-reduserende SDS-PAGE som en tilsynelatende dimer ved omtrent 30 kDa (figur 26, kolonne 2). Reduksjon av refoldet GDNF med 150 mM 2-merkaptoetanol før SDS-PAGE forårsaket at dette igjen migrerer ved posisjonen til monomeren ved omtrent 16 kDa (fig. 23, kolonne 5). Disse resultatene indikerer at refolding av GDNF forårsaket at proteinet blir en disulfid-bundet dimer. SDS-PAGE av refoldet GDNF ble kjørt uten reduksjon og gelen spaltet langs lengden og bitene analysert for bioaktivitet i sympatetisk ganglianeuron overlevelsesanalyse (se nedenfor). Den eneste detekterbare bioaktiviteten var ved posisjonen av dimeren som indikerer at dimeren er biologisk aktiv.

Analvse av refoldet GDNF på revers- fase HPLC CRP- HPLCV GDNF delvis renset ved S-sepharose eller Q-sepharose kromatografi, men før refolding, migrerte på RP-HPLC, som angitt nedenfor med en retensjonstid på omtrent 21 minutter. GDNF etter refolding migrerte under identiske betingelser med en retensjonstid på omtrent 15 minutter. Et skifte i retensjonstid er ventet for vellykket refolding av GDNF. Det ses ofte at et skifte i retensjonstider på RP-HPLC observeres etter refolding av proteinene.

RP-HPLC av disse prøvene ble utført som følger: ved en strømningsrate på 1 ml/minutt: 0.46X25 cm C-4 kolonne (VyDac #214TP54) ble utviklet som følger: Oppløsningsmiddel A = 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i vann, oppløsningsmiddel B = 0,1% TFA i acetonitril, fra 0,5 til 1,5 minutter, B blir øket fra 5% til 25%, fra 1,5 til 31,5 minutter, det blir øket fra 25% til 55%.

Analyse av refoldet GDNF ved bioanalvser.

Refoldet GDNF ble bioanalysert i både kyllingembryo (E10) symptateiske ganglia neuron overlevelsesbioanalyse (eksempel 4A) og rotte embryo (El6) mesencefalisk kultur dopaminopptaks bioanalyse (eksempel IB). For refolding utviste GDNF eksponert for 30 mM 2-merkaptoetanol og renset ved S-Sepharose eller Q-Sepharose kromatografi som ovenfor, ingen detekterbar bioaktivitet i mesencefalisk kultur dopamin opptaksanalysen og meget redusert bioaktivitet i sympatetisk neuron overlevelses bioanalysen. Tilsynelatende ED50 i sympatetisk neuron overlevelsesbioanalysen av S-sepharose kromatografert materiale var omtrent 1 ug/ml som er omtrent 333-ganger lavere enn refoldet rhGDNF (se nedenfor). For Q-sepharose kromatografert materiale var tilsynelatende EDSO i sympatetisk neuronoverlevelsesbioanalysen omtrent 3 ug/ml som er omtrent 100-ganger lavere enn refoldet rhGDNF (se nedenfor). Etter refolding var GDNF med eller uten på forhånd eksponering for 2-merkaptoetanol tilsynelatende fullstendig aktiv i begge bioanalysene (figurene 27-28). Dette resultatet indikerer at GDNF ervervet signifikant bioaktivitet ved refolding og også at den reduserte og fraværende bioaktiviteten før refoldingen var forårsaket av eksponering for 2-merkaptoetanol.

ED50 til refoldet rekombinant human GDNF (rhGDNF) i disse bioanalysene var lik det som var observert på forhånd for rotte GDNF renset fra B49-celle kondisjonert medium. I sympatetisk neuronoverlevelsesbioanalysen var ED50 for rhGDNF omtrent 3 ng/ml (fig. 27) og ED50 for rotte GDNF var omtrent 5 ng/ml. I mesencefalisk kulturdopaminopptaksanalysen var ED50 for rhGDNF omtrent 30 pg/ml (fig 28) og for rotte GDNF omtrent 50 pg/ml. Disse resultatene indikerer at en vesentlig del av rhGDNF blir vellykket refoldet og var fullstendig biologisk aktiv.

Eksempel 7: Produksjon og isolering av antistoffer mot GDNF.

Antistoffer mot rhGDNF ble dannet ved følgende prosedyre. Denne prosedyren innbefatter, men er ikke begrenset til, dette adjuvantet, denne immuniseringsprotokollen og dyreartene. Antistoffer mot GDNF kan bli dannet ved anvendelse av refoldet, nativt protein eller denaturert, innaktivt protein som i prosedyren angitt nedenfor eller med kontinuerlige peptider ifølge GDNF sekvensen fra mennesker eller andre dyrearter.

Monoklonale antistoffer kan bli dannet ved hjelp av en av de mange standardprosedyrene (se Antibodies, a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory 1988 ISBN 978969-314-2 av Ed Harlow og David Lane). En slik prosedyre for dannelsen av monoklonale antistoffer innbefatter vanligvis, men ikke esklusivt, immunisering av hensiktsmessige dyr og registrering av antistoffresponsen til disse dyrene overfor immuniseringsprotokollen, isolering av antistoff produserende celler så som fra et lymfoid organ til et eller flere reagerende dyr, fusjonering av disse cellene med en hensiktsmessig cellelinje så som myelom celler for å produsere hybridomer som er antistoffutskillende udødelige celler og screening for progressivt å isolere hybridomer helt til enkelt cellekloner blir oppnådd som produserer det ønskede monoklonale antistoffet.

Polyklonale antistoffer i kaniner ble dannet som følger: to milliliter sterilt saltvann inneholdende 0,005-0,25 mg rhGDNF ble injisert inn i en beholder av RIBI adjuvant MPL-TDM-CWS emulsjon (RIBI ImmunoChem Research, Inc.) og vorteksbehandlet for å danne en emulsjon ifølge forhandlerens instruksjoner. Bedøvde hvite New Zealand hunnkaniner ble injisert ifølge den foreslåtte immuniseringsprotokollen fra RIBI. En milliliter adjuvant antigen emulsjon ble administrert som følger:

0,30 ml intradermalt (0,05 ml i hver av seks steder)

0,40 ml intramuskulært (0,20 ml inn i hvert bakre ben)

0,10 ml subskutan (nakkeregion)

0,20 ml intraperetonealt.

Dyrene ble injisert på ny (boosted) hver 4-6 uke ved hjelp av samme protokoll. Blod ble tappet fra dyrene før den første injeksjonen og 10-14 dager etter hver "boost" for å teste for antistoffproduksjon med en nøytraliserende analyse eller en standard ELISA.

Den nøytraliserende analysen ble utført som følger ved anvendelse av rotte El6 mesencefalisk kulturanalyse. Kanin testserum ble fortynnet inn i Dulbeccos minimal essensielt medium bufret med 25 mm HEPES til pH 7,4 inneholdende 5 mg/ml bovint serumalbumin (referert til som BSA5). Dette ble igjen tilsatt til analysebrønnene (25 ul fortynnet testserum inn i 500 ul vevskulturoppløsning) og inkubert ved 37° i 30 minutter. Deretter ble rhGDNF tilsatt som 25 ul av en stamfortynnet oppløsning i BSA5 inneholdende rhGDNF ved 6.32 ng/ml for en endelig rhGDNF konsentrasjon på 0,316 ng/ml i analysen. Dopaminopptaket ble målt etter 8 dager i kultur ved den tidligere beskrevne prosedyren. Resultater med antisera fra den andre "boost" er vist nedenfor for nøytraliseringsanalysen (referes til tabell 2 nedenfor).

Antisera ble også titret for GDNF antistoffer i en standard ELISA ved følgende prosedyre: mikrotiterskåler (96 brønn, Nunc maksisorp) ble belagt med 100 ul pr. brønn rhGDNF i 1,0 ug/ml i 50 mM natriumbikarbonat, pH 9,6 beleggsbuffer over natt ved 4°C. Skålene ble vasket 4 ganger med platevaskebuffer (PWB, fosfatbuffret fysiologisk saltvann, pH 7,2 inneholdende 0,5% Tween 20) og deretter blokkert i 2 timer ved 25°C med 200 (il pr brønn 2% bovin serumalbumin i fosfatbuffret fysiologisk saltvann, pH 7,2. Skålene ble åpå ny vasket med PWB og serumprøvene som skulle bli titrert (100 ul fortynnet i 20% normalt geiteserum og PWB) ble tilsatt til brønnene. Skålene ble inkubert i 1,5 timer ved 35°C og vasket på ny med PWB. Alkalisk fosfatase konjugert geite anti-kanin IgG (Jackson Immunochemicals) ved en 1:2500 fortynning i PWB ble tilsatt til hver brønn (100 (il) og inkubert i 1,5 timer ved 35°C. Skålene ble vasket med PWB som før. Deretter ble p-NPP substrat (dinatrium p-nitrofenylfosfat; Sigma Cat. No. MP389) tilsatt til hver brønn (100 ul 1,0 mg/ml p-NPP i 10% dietanolamin, pH 9,8) og skålen inkubert ved 25°C. Fargeutviklingen ble bestemt ved avlesning av skålene ved 405-490 nm på en plateavleser (Molecular Devices Enax).

Antisera ble også anvendt for å detektere og kvantifisere GDNF på Western blot som følger: natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) ble utført ved hjelp av prosedyren først beskrevet av U.K. Laemmli (Nature 227:680-685 (1970)) ved anvendelse av en 12 1/2% akrylamid oppløsningsmiddelgel og 4 1/2% akrylamid stablegel. Gelene (16X14X0.15 cm) ble elektroforert ved 40m amp konstant strøm i 3 timer. For reduksjon/denaturering ble prøvene oppvarmet ved 100°C i 10 minutter i prøvebuffer inneholdende 1% SDS og 150 mM 2-merkaptoetanol.

For Western blotting ble gelen deretter transblottet på Jmmobilon-P membran

(Millipore Cat. No. 1PVH 151 50) ved 80m amp konstantstrøm i 16 timer i 25 mM Trisbase, 192mM glycin, 0,1% SDS, og 20% metanol og bearbeidet som følger: 1) Membranen ble blokkert i 1 time ved 25°C i blokkeringsbuffer (10 mM Tris, pH 7,4 inneholdende 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20,4% skummet melk og 0,02%

natriumazid) med forsiktig risting.

2) Membranen ble deretter inkubert ved 25°C i 2 timer ved forsiktig risting i blokkeringsbuffer inneholdende fortynnet primært antisera mot GDNF.

3) Membranen ble vasket (4 5-minutt vaskinger) i blokkeringsbuffer.

4) Membranen ble deretter inkubert ved 25°C i 2 timer ved forsiktig risting i blokkeringsbuffer inneholdende fortynnet sekundært antistoff (alkalisk fosfatase

konjugert affinitetesrenset geite anti-kanin IgG, Cappel Cat. nr. 59299).

5) Membranen ble vasket (4 5-minutt vaskinger) med blokkeringsbuffer uten skummet melk. 6) Membranen ble utviklet i 50 ml utviklingsbuffer (100 mM Tris, pH 9,5 inneholdende 100 mM naCl og 5 mM MgCl2) med 165 ul NBT og 83 ul BCIP (Promega kit nr. P3771) ved 25°C med forsiktig risting helt til ønsket farving blir oppnådd.

Eksempel 8: Preparering av membran innkapslede celler som utskiller GDNF og implantering i pasienten.

Celler som utskiller GDNF kan bli innkapslet i semipermeable membraner for implantering i pasienter som lider av nerveskader. I en foretrukket urførelsesform ble pasienten som lider av Parkinsons sykdom og innkapslede celler som utskiller GDNF implantert inn i striatum til pasienten for å tilveiebringe GDNF til dopaminerge cellelegemer.

I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir celler som er blitt omkonstruert for å utskille GDNF, som de som er preparert og beskrevet i eksemplene 5 og 6 ovenfor, inkorporert i biokompatible, implanterbare og mottagelige polymeriske innskudd. Innskuddene kan bli konstruert for åmuliggjøre at utskilt GDNF går inn i vevet som omgir de implanterte cellene, mens faktorer fra omgivende vev som kan være skadelige for cellene blir forhindret.

Cellene som er blitt omkonstruert for å utskille GDNF kan bli innkapslet inn i slike semipermeable membraner ifølge fremgangsmåten beskrevet i publisert PCT søknad

WO 91/10425 med tittel Cell Capsule Extrusion Systems. Membraninnkapslede celler kan bli implantert inn i striatum før standardkirurgiske prosedyrer.

Claims (36)

1. Renset og isolert neurotrofisk protein som er i stand til å fremme dopaminopptak i dopaminerge neuroner, karakterisert ved at de omfatter en aminosyresekvens som fremsatt under og/eller biologiske ekvivalenthomologer derav:

2. Protein ifølge krav 1, karakterisert ved at graden av homologi til aminosyresekvensen er over 70%.

3. Protein ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at det er glykosylert.

4. Protein ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at det er ikke-glykosylert.

5. Protein ifølge krav 4, karakterisert ved at aminosyresekvensen har en metioninrest i den aminoterminale enden.

6. Protein ifølge krav 1 til 5, karakterisert ved at det er produsert ved rekombinant teknologi eller kjemisk syntese.

7. Protein ifølge krav 1 til 6, karakterisert ved at det er produsert ved tilfesting av én eller flere polymere deler.

8. Protein ifølge krav 7, karakterisert ved at den polymere delen er polyetylenglykol.

9. Protein ifølge ethvert av kravene 1 til 8, for anvendelse til å forebygge eller behandle ufullstendig funksjonerende dopaminerge nerveceller.

10. Protein ifølge krav 9, karakterisert ved at det anvendes til å forebygge og behandle Parkinsons sykdom.

11. Protein ifølge krav 9, karakterisert ved at det anvendes til å forebygge og behandle Alzheimers sykdom.

12. Protein ifølge krav 9, karakterisert ved at det anvendes til å forebygge og behandle amyotrofisk lateral sklerose.

13. Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den koder for en hvilken som helst av de neurotrofiske proteinene som definert i kravene 1,2 eller 5.

14. Nukleinsyresekvens ifølge krav 13, karakterisert ved at den omfatter: (a) en sekvens som fremsatt i SEQ ID nr.: 3 og 5 som koder for glialcellelinje-avledet neurotrofisk faktor; (b) en kombinasjon av SEQ ID nr.: 5 og 8 som koder for en fullengde human pre-proform av glialcellinjeavledet neurotrofisk faktor; (c) en nukleinsyresekvens som koder for en aminosyresekvens med dopaminerg aktivitet, hvor nevnte aminosyresekvens er gjenkjent ved et antistoff som bindes til en del av glialcellinjeavledet neurotrofisk faktor; og (d) en nukleinsyresekvens som (1) hybridiseres til den komplementære sekvensen i (a), (b) eller (c) og (2) koder for en aminosyresekvens med dopaminerg aktivitet.

15. Vektor, karakterisert ved at den uttrykker regulatoriske elementer som er operativt koblet til en nukleinsyresekvens ifølge kravene 13 eller 14.

16. Transformert eller transfektert vertscelle isolert fra dens miljø, karakterisert ved at den omfatter vektoren ifølge krav 15.

17. Vertscelle ifølge krav 16, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av mammalske celler og bakterielle celler.

18. Vertscelle ifølge krav 16, karakterisert ved at den er en COS-7-celle eller E. coli.

19. Vertscelle ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte celle er egnet for human implantasjon og hvor nevnte celle uttrykker og sekreterer glialcellelinje-avledet neurotrofisk faktor.

20. Vertscelle ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte celle blir transformert eller transfektert ex vivo.

21. Vertscelle ifølge krav 16, karakterisert ved at nevnte celle er omsluttet i en semipermeabel membran egnet for human implantasjon.

22. Fremgangsmåte for å produsere glialcellelinje-avledet neurotrofisk faktor, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: (a) dyrking av en vertscelle transformert eller transfektert med en nukleinsyresekvens som koder en neurotrofisk faktor ifølge kravene 1,2, 5 eller 14, (b) opprettholde nevnte vertscelle under betingelser som er egnet for ekspresjon av glialcellelinje-avledet neurotrofisk av nevnte vertscelle; og (c) eventuelt, isolering av glialcellelinje-avledet neurotrofisk faktor uttrykt ved nevnte vertscelle.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 21 eller 22, karakterisert v e d at den ytterligere omfatter trinnet med å refolde den isolerte glialcellelinje-avledede neurotrofiske faktoren.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 21 eller 22, karakterisert ved at nevnte vertscelle er en prokaryotcelle.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 21 eller 22, karakterisert v e d at nevnte vertscelle er en eukaryotcelle.

26. Innretning for å behandle nerveskade, karakterisert ved at den omfatter (a) en semipermeabel membran egnet for implantasjon; og (b) celler innkapslet inne i nevnte membran, hvor nevnte celler sekreterer en neurotrofisk faktor ifølge krav 1; hvor nevnte membran er permeabel for den neurotrofiske faktoren, og impermeabel for materialer skadelige for nevnte celler.

27. Innretning ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte celler er naturlig forekommende celler som sekreterer nevnte neurotrofiske faktor.

28. Innretning ifølge krav 26, karakterisert ved at nevnte celler har blitt modifisert for å sekretere nevnte neurotrofiske faktor ved hjelp av en nukleinsyresekvens som omfatter: (a) en sekvens fremsatt i SEQ ID nr. 3 og 5; (b) en kombinasjon av SEQ ID nr. 5 og 8 som koder for fullengde human pre-pro-form av GDNF; (c) en nukleinsyresekvens som koder for en aminosyresekvens med dopaminerg aktivitet, hvor nevnte aminosyresekvens gjenkjennes ved et antistoff som bindes til en del av GDNF; og (d) en nukleinsyresekvens som (1) hybridiserer til den komplementære sekvensen i (a), (b) eller (c) og (2) koder for en aminosyresekvens med dopaminerg aktivitet.

29. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et neurotrofisk protein ifølge ethvert av kravene 1 til 8 i kombinasjon med en farmasøytisk egnet bærer.

30. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 29, karakterisert v e d at den anvendes for å forebygge eller behandle nervecelle-ødeleggelse eller sykdom eller feilaktig fungerende nerveceller.

31. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 30, karakterisert v e d at den anvendes til å forebygge eller behandle Parkinsons sykdom.

32. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 30, karakterisert v e d at den anvendes til å forebygge eller behandle Alzheimers sykdom.

33. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 30, karakterisert v e d at den anvendes til å forebygge eller behandle amyotrofisk lateral sklerose.

34. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 30, karakterisert v e d at den anvendes til å forebygge eller behandle nervecelleskade eller sykdom som skyldes fysisk skade, iskemi, eksponering til neurotoksiner, koniske, metabolske sykdommer eller neurodegenerativ sykdom.

35. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 34, karakterisert v e d at den anvendes til å behandle en nervecelles hode som skyldes infarkt, diabetisk polyneuropati eller toksisk neuropati forårsaket av et terapeutisk middel.

36. Anvendelse av et neurotrofisk protein ifølge ethvert av kravene 1 til 8 for å fremstille en farmasøytisk sammensetning for å forebygge eller behandle nervecelleskade som terapeutisk middel og/eller forebygge eller behandle nervecelleskade eller sykdom som skyldes fysisk skade, iskemi, eksponering til neurotoksiner, kroniske, metabolske sykdommer eller neurodegenerativ sykdom, og/eller å forebygge eller behandle feilaktig fungerende dopaminerge nerveceller, som vist ved Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom eller amyotrofisk lateral sklerose.