KR20110126732A - 뉴블라스틴 변형체 - Google Patents

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안토니 로소만도
로라 실비안
알. 블레이크 페핀스키
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바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 선별된 아미노산 잔기를 치환시킨 뉴블라스틴 폴리펩티드에 관한 것이다. 하나 이상 선별된 아미노산을 치환시킨 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 헤파린 결합이 감소되고 혈청 노출은 증가하였다. 또한, 본 발명은 포유동물의 질환을 치료하고 RET 수용체를 활성화시키기 위한 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

뉴블라스틴 변형체 {NEUBLASTIN VARIANTS}
본 출원은 2004년 8월 19일 가출원된 가출원 제60/602,825호 및 2005년 6월 24일 가출된원 가출원 제60/694,067호를 우선권으로 주장한다. 상기 문헌은 전체로 본 발명의 참조 문헌으로 포함한다.
본 발명은 단백질 화학, 분자 생물학, 및 신경생물학에 관한 것이다.
아르테민 및 이노빈으로도 알려진 뉴블라스틴(Neublastin)은 도파민 작용성 뉴런(neurons) 등과 같은 말초 신경계 및 중추 신경계의 뉴런 생존을 촉진하는 24-kDa의 동형이량체 분비 단백질이다 (Baudet 등, 2000, Development, 127:43335; Rosenblad 등, 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2):199; GenBank AF120274). 뉴블라스틴을 코딩하는 유전자는 이미 클로닝되어 서열이 확인되었다 (Roseblad 등, 2000, Mol. Cell Neurosci., 15(2):199; Baloh 등, Neuron, 21:1291).
뉴블라스틴은 신경교질 세포계-유래 신경성장인자(GDNF) 리간드 패밀리 구성원 중 하나이다. 세포 수준에서, GDNF 구성원들은 수용체 타이로신 키나제 (receptor tyrosine kinase), RET를 활성화시킨다. RET는 공동수용체이며, RET에 리간드 특이성을 제공하는 글리코실포스파티딜 이노시톨(GPI) 연결된 막 단백질인, GDNF 패밀리 수용체 알파(GFRalpha)와 결합된다. 4종의 GFRalpha가 알려져 있다(GFRalpha 1-4). 뉴블라스틴은 3원 신호전달(signaling) 복합체를 형성하는 RET와 함께 GFRalpha3에 결합하며 (Baudet 등, 2000, Development, 127:43335; Baloh 등, Neuron, 21:1291), 이는 외상수용성 감각 뉴런상에 널리 존재한다 (Orozco 등, 2001, Eur. J. Neurosci., 13(11):2177). 이들 뉴런은 동통 및 외상을 탐지하게 된다. 따라서, 뉴블라스틴은 신경병증의 일반적인 치료 및 보다 구체적으로는 신경병증성 동통 치료 분야에서 임상 적용된다.
뉴블라스틴 및 다른 GDNF 패밀리 구성원들은 TGF 베타(Transforming Growth Factor beta) 수퍼패밀리의 구성원이며, 따라서 시스테인 노트 구조를 형성하는 유사한 간격을 갖는 7개의 보존 시스테인 잔기가 존재하는 특징이 있다 (Saarma, 1999, Microsc. Res. Tech., 45:292). 각각의 단량체는 단단한 노트 구조를 형성하도록 3번째 이황화 결합을 둘러싼 닫힌 루프 구조를 형성하는 두 개의 이황화 결합을 함유한다. 각각의 단량체 내에 함유된 7번째 시스테인은 내부분자 이황화 결합을 형성하는데, 이는 단량체들을 공유 결합시켜 최종 이량체 산물을 형성시킨다 (Rattenholl 등, 2000, J. Mol. Biol., 305:523).
TGF 베타 패밀리 구성원들은 신호(signal) 펩티드와 프로-도메인(pro-domain)이 절단된 후 최종적으로 성숙한 동형이량체로 분비되는 프리(pre) 프로(pro) 단백질로 합성된다 (예를 들어, Rattenholl 등, 2000, J. Mol. Biol., 305:523; Fairlie 등, 2001, J. Biol. Chem., 276(20):16911 참조). 이들 신호 펩티드 및 프로-도메인은 모두 TFG 베타 패밀리 구성원의 분비가 적절하도록 매개한다 (Rattenholl 등, 2000, J. Mol. Biol., 305:523; Rattenhol 등, 2001, Eur. J. Neurosci., 268:3296).
본 발명의 요약
본 발명은 적어도 부분적으로 뉴블라스틴이 헤파린 황산염과 결합하며 뉴블라스틴 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기가 이러한 결합에 관여한다는 발견에 기초한다. 선별된 아미노산 잔기의 치환을 통해서 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드에 의한 헤파린 결합이 감소되고 이들 변형체의 생체활성 및 생체이용도가 증가됨을 발견하였다.
일 측면에 있어서, 본 발명은 서열번호 1의 15 - 113 아미노산에 80 % 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드로 특징되며, 상기 아미노산 서열은 (i) 서열번호 1의 위치 48에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (ii) 서열번호 1의 위치 49에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산으로 치환시킴) ; 및 (iii) 서열번호 1의 위치 51에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산으로 치환시킴)으로 이루어진 군으로 부터 선택된, 서열번호 1에 대해서 하나 이상의 치환을 함유한다. 상기 폴리펩티드는, 이량체화될 때, GFRalpha 3 및 RET를 함유하는 복합체 (complex)에 결합한다.
구체예에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 위치 48 및 위치 49에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산을 함유한다. 예를 들어, 서열번호 1의 위치 48 및 위치 49의 아르기닌 잔기를 비보존 아미노산 잔기 (예를 들어, 글루타민산)로 치환할 수 있다.
일부 구체예에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 15 - 113과 90 % 이상, 95 % 이상, 또는 98 % 이상 동일하다.
또한 본 발명에서 개시하는 폴리펩티드는 서열번호 2의 15 -113 아미노산, 서열번호 3의 15 -113 아미노산, 서열번호 4의 15 - 113 아미노산, 서열번호 5의 15 -113 아미노산, 서열번호 8의 15 -113 아미노산, 또는 서열번호 9의 15 - 113 아미노산을 함유한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 2의 10 - 113 아미노산, 서열번호 3의 10 - 113 아미노산, 서열번호 4의 10 - 113 아미노산, 서열번호 5의 10 - 113 아미노산, 서열번호 8의 10 - 113 아미노산, 또는 서열번호 9의 10 - 113 아미노산을 함유한다. 일부 구체예에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열, 서열번호 3의 아미노산 서열, 서열번호 4의 아미노산 서열, 서열번호 5의 아미노산 서열, 서열번호 8의 아미노산 서열, 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 함유한다.
또한 본 발명에서 개시하는 폴리펩티드는 서열번호 1의 15 - 113의 아미노산에 80 % 이상이 동일하며, 상기 아미노산 서열은 (i) 서열번호 1의 위치 20에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산 (예를 들어, 세린을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (ii) 서열번호 1의 위치 21에 상응하는 위치에 글루타민 이외의 아미노산 (예를 들어, 글루타민을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (iii) 서열번호 1의 위치 32에 상응하는 위치에 히스티딘 이외의 이마노산 (예를 들어, 히스티딘을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (iv) 서열번호 1의 위치 33에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (v) 서열번호 1의 위치 39에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (vi) 서열번호 1의 위치 46에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산 (예를 들어, 세린을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (vii) 서열번호 1의 위치 68에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (viii) 서열번호 1의 위치 72에 상응하는 위치에 글리신 이외의 아미노산 (예를 들어, 글리신을 비보존 아미노산으로 치환시킴); (ix) 서열번호 1의 위치 73에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산 (예를 들어, 세린을 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); 및 (x) 서열번호 1의 위치 94에 상응하는 위치에 발린 이외의 아미노산 (예를 들어, 발린을 비보존 아미노산으로 치환시킴)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열번호 1에 대해, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 폴리펩티드는, 이량체화될 때, GFRalpha 3 및 RET를 함유하는 복합체에 결합한다. 일부 구체예에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 15 - 113 아미노산에 90 % 이상, 95 % 이상, 또는 98 % 이상 동일하다.
본 발명에서는 또한 서열번호 1에 80 % 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 개시하며, 여기서 상기 아미노산 서열은 (i) 서열번호 1의 위치 7에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); (ii) 서열번호 1의 위치 9에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴); 및 (iii) 서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산 (예를 들어, 아르기닌을 글루타민산과 같은 비보존 아미노산 잔기로 치환시킴)으로 이루어진 군으로부터 선택된, 서열번호 1에 대해서, 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 폴리펩티드는, 이량체화될 때, GFRalpha 3 및 RET를 함유하는 복합체에 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1에 90 % 이상, 95 % 이상, 또는 98 % 이상 동일하다.
본 발명은 또한, 비자연적으로 발생한 중합체(non-naturally occuring polymer)에 접합된 본 발명에서 기술한 폴리펩티드를 함유하는 접합체(conjugate)를 특징으로 한다. 상기 중합체의 예로는 수용성 합성 중합체 예컨대, 폴리알킬렌 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)이다.
본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드 및 이종의 아미노산 서열을 함유하는 융합 단백질을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 접합체, 또는 융합 단백질의 2종을 함유하는 이량체를 특징으로 한다.
본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 이량체, 접합체, 또는 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 약학 조성물을 특징으로 한다.
본 발명은 전술한 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 핵산, 상기 핵산을 함유하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 함유하는 세포를 개시한다.
본 발명은 또한 (i) 전술한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공하는 단계, 및 (ii) 상기 세포를 핵산 발현이 가능한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 개시한다.
본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 이량체, 접합체, 융합 단백질, 또는 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 포유동물에 투여함으로서 포유동물의 신경계 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 이량체, 접합체, 융합 단백질, 또는 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 포유동물에 투여함으로서 포유동물의 신경병증성 동통을 치료하는 방법을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 전술한 폴리펩티드, 이량체, 접합체, 융합 단백질, 또는 약학 조성물의 유효량을 포유동물에 투여함으로서 포유동물에서 RET 수용체를 활성화시키는 방법을 특징으로 한다.
전술한 선별된 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 장점은 야생형 뉴블라스틴과 비교하여 헤파린 결합능이 감소한다는 것이다. 헤파린 결합이 감소하면 생체내에서 변형 폴리펩티드의 제거율 (clearance)이 감소하게 된다.
위치 48 및 위치 49의 아미노산이 치환된 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 단일 아미노산 변이체들 및/또는 야생형 뉴블라스탄에 비해 예상외로 헤파린 결합능이 상당히 감소하며 효능 및 생체이용도가 상당히 증가하는 것을 발견하였다. 예를 들어, 이중 변이체는 야생형 뉴블라스틴에 비해 혈청 노출에 있어서 대략 185 배 증가된 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 이중 변이체는 야생형 뉴블라스틴에 비해 시험관내에서 발현이 5 배 이상 증가하였으며, 그에 따라 단백질의 대량 생산이 용이해졌다.
이들 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 장점 및 예상밖의 특성들로 인해 (야생형 단백질을 사용한 치료 방법에 비해) 낮은 투여량으로 단백질을 사용하여 개체를 치료할 수 있게 되었으며, 및/또는 투여 간격을 늘릴 수 있게 되었다.
달리 한정하지 않으면, 본 발명에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속한 분야의 당 업자들에게 일반적으로 통용되는 의미로 사용한 것이다. 본 발명에서 기술한 바와 유사하거나 동일한 방법 및 재료들을 본 발명의 실시 또는 시험을 위해 사용할 수 있으며, 이하 대표적인 방법 및 재료들을 기술한다. 본 발명에서 언급한 모든 출판물, 특허 출원서, 특허, 및 다른 문헌들은 전체로 본 발명의 참조문헌으로 포함한다. 분쟁시, 본 출원은, 정의들을 포함하여, 제어할 수 있다. 본 발명의 재료, 방법 및 구체예들은 단지 설명을 위한 것이며 이에 한정하고자 함은 아니다.
본 발명의 다른 특징 및 장점들은 이하 구체적인 설명, 및 청구항들을 통해 분명해 질 것이다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 선별된 아미노산 잔기가 치환된 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명에서 첨부된 실시예에 개시된 바와 같이, 야생형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 특정 잔기들이 헤파린 결합에 중요하다는 것을 확인하였다. 헤파린 결합은 생체내에서 뉴블라스틴의 제거에 기여하는 것으로 여겨지기 때문에, 이들 특정 잔기를 하나 이상 치환하는 것으로 헤파린 결합이 감소되어 변형 폴리펩티드의 혈청 노출이 증가할 것으로 기대된다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드
성숙한 야생형 인간 뉴블라스틴은 113 아미노산 길이이며 다음의 아미노산 서열을 갖는다:
AGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (서열번호 1).
본 발명에서 개시한 폴리펩티드는 뉴블라스틴 폴리펩티드에서 하나 이상 선별된 아미노산 잔기가 치환된다. 하나 이상의 이들 잔기의 변이를 통해서 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드가 야생형 뉴블라스틴에 비해 헤파린 결합능이 감소하거나 없어질 것으로 기대된다. 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해서, (i) 위치 48, 49, 또는 51의 하나 이상에서 아르기닌 잔기, 및/또는 (ii) Ser 46, Ser 73, Gly 72, Arg 39, Gln 21, Ser 20, Arg 68, Arg 33, His 32, Val 94, Arg 7, Arg 9, 또는 Arg 14의 하나 이상에서의 아미노산 치환을 함유한다. 달리 언급이 없으면, 본 발명에서 위치 번호로 나타낸 뉴블라스틴 아미노산 잔기에 대한 인용번호는 서열번호 1에 대한 잔기들을 번호매기기 위해 언급한 것이다.
치환을 위해 선정된 뉴블라스틴 아미노산 잔기 (예를 들어 위치 48, 49, 및/또는 51의 아르기닌 잔기)는 비보존 아미노산 잔기 (예를 들어, 글루타민산) 또는 보존 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 첨부된 실시예에서 상세히 설명한 바와 같이, Arg 48, Arg 49, 및/또는 Arg 51을 비보존 아미노산으로 치환시키면 헤파린 결합 활성은 감소하되 뉴블라스틴의 생 활성은 유지하는 (또는 보다 강화된) 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 본 발명에서 확인한 아미노산 잔기 (예를 들어, 위치 48, 49, 및/또는 51의 아르기닌 잔기)를 치환할 수 있는 아미노산의 예로는 글루타민산, 아스파르트산, 및 알라닌을 포함한다.
이량체화될 때, 생물학적으로 활성이 있는 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 GFRalpha 3 및 RET를 함유하는 3원 복합체에 결합한다. 이 복합체에 결합하는 것을 확인하기 위한 모든 방법을 사용하여 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정할 수 있다. 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 3원 복합체-결합능을 탐지하기 위한 분석법의 예가 국제 공개 특허 제WO00/01815 및 실시예 7에 기술되어 있다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드에 대해 또한 뉴블라스틴 신호전달 캐스캐이드 (cascade)를 야기하는 능력을 측정할 수 있다. 예를 들어, 실시예 6에서 기술되는 키나제 수용체 활성화 (KIRA) 분석법을 사용하여 RET 자기인산화를 유도할 수 있는 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 능력을 측정할 수 있다 (또한, Sadick 등, 1996, Anal. Biochem., 235(2):207 참조).
본 발명에서 확인한 특정 아미노산의 치환뿐만 아니라, 다음 부분에서 설명하는 바와 같이, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 다른 아미노산 위치에서 하나 이상의 첨가, 치환, 및/또는 결실을 함유할 수 있다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 여기서 기술한 하나 이상의 아미노산 치환을 가지며, 또한 길이도 다양하다. 성숙한 인간 뉴블라스틴 폴리펩티드 (서열번호 1)가 프리 프로 뉴블라스틴의 카르복시 말단의 113 아미노산으로 이루어졌으나, 상기 113 아미노산 전부가 유용한 뉴블라스틴 생 활성을 얻기 위해 필요한 것은 아니다. 아미노 말단을 절단하는 것이 허용된다. 따라서, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 서열번호 1의 카르복시 말단의 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 또는 113 아미노산 (즉, 이의 길이는 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 또는 113 아미노산일 수 있다)에 본 발명에 따른 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 여기서 기술되는 하나 이상의 아미노산 치환 (및 선택적으로 절단)을 가질 뿐만 아니라, 서열도 다양하다. 구체적으로, 뉴블라스틴 생 활성의 두드러진 손실없이 뉴블라스틴 서열의 특정 아미노산을 치환할 수 있다. 구체예에 있어서, 폴리펩티드는 (i) 본 발명에서 기술한 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하고, (ii) 서열번호 1에 70 % 이상, 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상 또는 99 % 이상 동일하다 (또는 서열번호 1의 15 -113 아미노산에 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 또는 99 % 동일하다). 서열번호 1과 서열이 다른 (또는 서열번호 1의 15 - 113 아미노산과 서열이 다른) 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 하나 이상의 보존 아미노산 치환, 하나 이상의 비보존 아미노산 치환, 및/또는 하나 이상의 결손 또는 삽입을 포함할 수 있다.
도 1은 야생형 인간, 마우스, 및 래트의 프리 프로 뉴블라스틴 폴리펩티드를 정렬한 도면이다. 도 1의 수직선들은 뉴블라스틴의 성숙한 113 아미노산 형태 (왼쪽 수직선) 및 104 아미노산 형태 (오른쪽 수직선)의 시작을 나타낸다. RRXR 헤파린 결합 모티프는 박스로 나타내었다. 이러한 자연적으로 발생한, 생 활성이 있는 뉴블라스틴 형태의 정렬을 통해서 생 활성의 제거없이 치환할 수 있는 특정 잔기의 예 (즉, 이들은 인간, 마우스, 및 래트 형태간에 보존적이지 않다)를 나타낼 수 있다.
아미노산 서열간의 동일성 퍼센트는 블라스트 (BLAST) 2.0 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다. 서열 비교는 무갭 정렬 (ungapped alignment) 및 기본 매개변수 (default parameters) (블라섬 62 메트릭스, 11의 갭 존재 코스트, 1의 잔기 랩 당 코스트, 및 0.85의 람다 비율)를 사용하여 수행할 수 있다. 블라스트 프로그램에서 사용되는 수학적 알고리즘은 Alschul 등의 Nucleic Acids Reserch (1999, 25:3389-3402)에 기술되어 있다.
보존 치환은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 보존 치환은 하기의 아미노산 군 내에서 이루어지는 치환을 포함하는 것이다: 발린, 알라닌 및 글리신; 류신, 발린, 및 이소류신; 아스파르트산 및 글루타민산; 아르파라긴 및 글루타민; 세린, 시스테인, 및 쓰레오닌; 라이신 및 아르기닌; 및 페닐알라닌 및 티로신. 비극성 소수성 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메타오닌을 포함한다. 극성의 중성 아미노산은 글리신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하 (염기) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하 (산성) 아미노산은 아스파르트 산 및 글루타민산을 포함한다. 상기 언급한 극성, 염기성 또는 산성 군들의 한 구성원을 동일한 군의 다른 구성원으로 임의 치환하는 것은 보존 치환이라 할 수 있다.
비보존 치환은 (i) 전기양성의 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Arg, His 또는 Lys)을 전기음성 잔기 (예를 들어, Glu, 또는 Asp)로 치환하는 것, (ii) 친수성 잔기 (예를 들어, Ser 또는 Thr)을 소수성 잔기 (예를 들어, Ala, Leu, Ile, Phe, 또는 Val)으로 치환하는 것, (iii) 시스테인 또는 프롤린을 다른 임의의 잔기로 치환하는 것, 또는 (iv) 벌키한 소수성 또는 방향족 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Val, Ile, Phe 또는 Trp)를 보다 작은 측쇄를 갖는 잔기 (예를 들어, Ala, Ser), 또는 측쇄가 없는 잔기 (예를 들어, Gly)로 치환하는 것을 포함한다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 예는 하기 표 1에 나타내었다. 상응하는 야생형 위치와 비교하여 변이된 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 아미노산 잔기는 굵게 표시하고 밑줄을 표시하였다. 또한, 치환을 위한 백그라운드로 사용한 뉴블라스틴 폴리펩티드 (113, 99 또는 104 아미노산 길이)를 하기 표 1에 나타내었다.
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변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 선택적으로 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 부분 (moiety)과 같은 폴리알킬렌 글리콜 부분)와 있다. 일부 구체예에서, 상기 중합체는 뉴블라스틴 폴리펩티드의 N 말단의 부위에서 상기 폴리펩티드와 결합한다. 일부 구체예에서, 상기 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 서열번호 1 (또는 서열번호 1의 아미노산 15- 113)에 대해서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 중합체가 결합할 수 있는 내부 중합체 결합 부위를 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 중합체는 위치 14, 위치 39, 위치 68, 및 위치 95로 이루어진 군으로부터 선택된 잔기 (서열번호 1의 서열에 따라서 번호매김)에서 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드와 결합한다. 내부 중합체 결합 부위를 제공하는 뉴블라스틴 변형체의 예가 국제공개특허 제WO02/060929호 및 제WO04/069176호에 기술되어 있다 (상기 문헌의 내용을 본 발명의 참조문헌으로 포함시킨다).
폴리펩티드는 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드에 더하여 선택적으로 이종의 아미노산 서열을 함유할 수 있다. 아미노산 서열을 언급할 때 사용한 "이종의 (heterologous)"는 외부 공급원으로부터 특정 숙주 세포로 유래되거나, 또는 동일 숙주 세포로부터 유래된 서열이라면, 원래 형태에서 변형된 서열이다. 이종 서열의 예로는 이종 신호 서열 (예를 들어, 고유 래트 알부민 신호 서열, 변형 래트 신호 서열, 또는 인간 성장 호르몬 신호 서열) 또는 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 정제를 위한 서열 (예를 들어, 히스티딘 표지)을 포함한다.
뉴블라스틴 폴리펩티드는 당 분야에서 알려진 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 자연적으로 발생한 뉴블라스틴 폴리펩티드는 표준 단백질 분리법을 사용하여 세포 또는 조직 원으로 부터 분리할 수 있다. 다르게는, 표준 펩티드 합성법을 사용하여 변이된 뉴블라스틴 폴리펩티드를 화학적으로 합성할 수 있다. 짧은 아미노산 서열의 합성은 펩티드 분야에서 잘 확립되어 있으며, 예를 들어, 스튜어트(Stewart) 등의 고상 펩티드 합성(Solid Phase Peptide Synthesis) (2nd ed., 1984)을 참조한다.
일부 구체예에서, 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 제조한다. 예를 들어, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 벡터, 예를 들어, 발현 벡터에 삽입시켜서, 세포에 상기 핵산을 도입시킬 수 있다. 적당한 세포로는 예를 들어, 포유 세포 (예를 들어, 인간 세포 또는 CHO 세포), 진균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 세균 세포를 포함한다. 재조합 세포에서 발현될 때, 바람직하게, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 발현이 가능한 조건하에서 상기 세포를 배양한다. 상기 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 원한다면 세포 현탁물로 부터 회수할 수 있다. 여기서, "회수하다(recovered)"는 세포 성분들 또는 회수 과정 전에 존재하는 배양 배지로부터 변이된 폴리펩티드를 이동시킨다는 의미이다. 회수 과정은 하나 이상의 리폴딩 (refolding) 또는 정제 단계를 포함할 수 있다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 당 분야에서 알려진 임의의 몇 가지 방법을 사용하여 제작할 수 있다. 이러한 방법 중 하나로는 특정 부위 돌연변이법 (site-directed mutagenesis)이 있으며, 이는 코딩되는 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 단일 아미노산 (또는, 원한다면, 사전 결정한 적은 수의 아미노산 잔기들)을 바꾸기 위해서 특정 뉴클레오타이드 (또는 원한다면, 적은 수의 특정 뉴클레오타이드)를 변화시키는 것이다. 다양한 특정 부위 돌연변이 키트가 판매되고 있다. 그 중 하나는 클론테크 래버래토리사 (캘리포니아, 팔로 알토)에서 판매하는 "Transformer Site Directed Mutagenesis Kit"이다.
약학 조성물
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 치료학적 유효량의 상기 폴리펩티드 및 하나 이상의 보조제(adjuvants), 부형제, 담체, 및/또는 희석제를 함유하는 약학 조성물로 제공할 수 있다. 허용가능한 희석제, 담체 및 부형제는 통상적으로 수용체의 항상성(예를 들어, 전해질 균형)에 역효과가 없는 것이다. 허용가능한 담체는 생체적합성, 불활성 또는 생흡수성 염, 완충제, 올리고- 또는 다당류, 중합체류, 점도-개선제, 보존제 등을 포함한다. 담체의 일례로는 생리 식염수 (0.15 M NaCl, pH 7.0 내지 7.4)이다. 담체의 다른 예로는 50 mM 인산 나트륨, 100 mM 염화 나트륨이다. 약학 조성물의 제제화 및 투여법에 관한 자세한 기술은 예를 들어, 레밍턴의 약과학 (REMINGTONS\'S PHARMACEUTICAL SCIENCES)(Maack Publishing Co., Easton, Pa.)에서 확인할 수 있다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 함유하는 약학 조성물의 투여는 전신 또는 국부 투여일 수 있다. 약학 조성물은 비경구 및/또는 주사제 이외 (non-parenteral) 투여용으로 적합하도록 제제화할 수 있다. 구체적인 투여 형태로는 피하, 정맥, 근육내, 복강내, 경피, 척수강내, 경구, 직장, 구강, 국부, 비측, 눈, 관절내, 동맥내, 지주막하, 소기관지, 림프, 질, 및 자궁내 투여를 포함한다.
비경구 투여용으로 적합한 제제로는 알맞게 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 멸균 수성 조제를 함유하는 것으로, 수용체의 혈액과 등장성인 것이 바람직하다 (예를 들어, 생리 식염수 용액). 제제들은 1회 용량 또는 다회 용량 형태로 주어질 수 있다.
제제의 예로는 본 발명에서 기술한 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 및 다음의 완충 성분을 포함한다: 숙신산 나트륨 (예를 들어, 10 mM); NaCl (예를 들어, 75 mM); 및 L-아르기닌 (예를 들어, 100 mM).
경구 투여용으로 적합한 제제는 미리정해진 양의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 각각 함유한 캡슐, 카세제(cachets), 정제, 또는 로젠지(lozenges)와 같은 개별 단위로 존재하거나; 시럽, 엘릭시르(elixir), 또는 물약(draught)과 같이 수성 액체 또는 비수성 액체에 현탁된 현탁액으로 존재할 수 있다.
약학 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 당 분야의 당업자에 의해서 확인할 수 있는 투약 처방법에 따라서 투여할 수 있다. 예를 들어서, 조성물은 개체에, 예를 들어, 1회분량 당 개체의 체중 1 ㎏ 당 0.01 ㎍ 내지 1000 ㎍ (0.01 ㎍/㎏ 내지 1000 ㎍/㎏)의 투약량으로 전신 투여할 수 있다. 다른 구체예에서, 투약량은 1회분량 당 개체의 체중 1 ㎏ 당 1 ㎍ 내지 100 ㎍ (1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎍/㎏)이다. 다른 구체예에서, 1회분량 당 개체의 체중 1 ㎏ 당 1 ㎍ 내지 30 ㎍ (1 ㎍/㎏ 내지 30 ㎍/㎏), 예를 들어 1회분량 당 개체의 체중 1 ㎏ 당 3 ㎍ 내지 10 ㎍ (3 ㎍/㎏ 내지 10 ㎍/㎏)이다.
치료 효능을 최적화하기 위해서, 우선 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 다양한 투약 처방법으로 투여한다. 1회분 용량 및 처방법은 예를 들어, 포유 동물의 종, 이의 면역 상태, 포유 동물의 체중등을 포함하는 요인에 따라 좌우된다. 통상적으로, 조직 내 단백질 수준은 예를 들어, 소정의 치료 처방법의 효율을 결정하기 위한 임상 실험 과정의 일부로 적절한 스크리닝 분석법을 사용하여 모니터한다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드에 대한 투약 빈도는 당업자 및 의사의 임상 판단에 의한다. 통상적으로, 투여 처방법은 최적 투여 변수를 확립할 수 있는 임상 시도를 통해 정해진다. 그러나, 실시자가 개체의 연령, 건강상태, 체중, 성별 및 의학 상태에 따라서 투약 처방을 다양화할 수 있다. 또한 투약 빈도는 신경병증에 대한 급성 및 만성 치료에 따라서 다양할 수 있다. 또한, 투약 빈도는 예방 요법 또는 치료 요법인지에 따라서도 다양할 수 있다.
치료 방법
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 신경 또는 신경원 세포의 신진대사, 성장, 분화, 또는 생존을 조절하는 데 유용하다. 구체적으로, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 살아있는 동물, 예를 들어, 인간의 향신경성 제제의 활성에 반응하는 장애 또는 질병을 치료하거나 경감시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약한 조성물)는 배근신경절의 뉴론, 또는 무릎 신경절, 추체신경절 및 결절 신경절; 제8뇌 신경의 전정청각 복합체; 삼차신경절의 상하악골엽의 외배측 극; 및 삼차신경중뇌핵 등의 임의 조직의 뉴론을 포함하는, 지각 신경 세포 또는 망막 신경절 세포의 손상으로 특징되는 장애를 치료하는 방법에 사용할 수 있다.
일부 구체예에 있어서, 지각 신경 및/또는 자율신경계 뉴론을 치료할 수 있다. 구체적으로, 외상수용성 및 기계적수용성 뉴론의 치료, 보다 구체적으로는 A-델타 섬유, C-섬유 및 A-베타 섬유 뉴론을 치료할 수 있다. 또한, 자율신경계의 교감신경 및 부교감신경 뉴론을 치료할 수 있다.
일부 구체예에서, 근위축성 측색 경화증 ("ALS") 및 척수성 근이 영양증과 같은 운동 뉴론 질병을 치료할 수 있다. 다른 구체예에서, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 외상성 손상 후 신경 회복을 강화시키기 위해서 사용할 수 있다. 선택적으로, 또는 추가적으로, 중합체-결합 뉴블라스틴 폴리펩티드, 또는 변이 뉴블라스틴 폴리펩티드의 융합 또는 접합체를 함유하는 메트릭스를 갖는 신경 유도 통로를 사용할 수 있다. 이러한 신경 유도 통로는 예를 들어, 미국특허 제5,834,029호에 개시되어 있다.
일부 구체예에서, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약학 조성물)은 황반변성, 망막색소 상피 변성증, 녹내장, 및 유사 질환으로 고통받는 환자의 망막 내 광수용체 손실을 포함하여, 다양한 눈의 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다.
일부 구체예에서, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약학 조성물)는 신경병증성 동통 치료, 촉각성 이질통의 치료, 신경병증성 동통 민감도 손실의 수복(reducing), 바이러스 감염 및 바이러스성 신경병증의 치료, 통증성 당뇨 신경병증의 치료, 및 신경계 장애 치료를 위해 사용된다. 상기 방법들을 이하 좀 더 구체적으로 설명한다.
1. 신병병증성 동통의 치료
본 발명의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약학 조성물)는 유효량의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 단독으로 개체에 투여하는 단계, 또는 진통마취제제, 항부정맥제, 국소 진통제, 국소 마취제, 항경련제, 항우울증제, 부신피질호르몬 및 비스테로이드성 항염제 (NSAIDS)로 이루어진 군으로부터 선택한 유효량의 무통-유도 화합물을 또한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 신경병증 동통을 치료하는 데 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 무통-유도 화합물은 항경련제이다. 다른 구체예에서, 무통-유도 화합물은 가바펜틴((1-아미노메틸)사이클로헥산 아세트산) 또는 프로가바린(S-(+)-4-아미노-3-(2-메틸프로필)부탄산)이다.
본 발명에서 개시한 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약학 조성물)는 말초 신경병증과 관련된 동통 치료에 사용할 수 있다. 치료할 수 있는 말초 신경병증 중에는 외상성 신경증-유래 신경병증, 예를 들어, 신체 상해 또는 질병 상태로 야기되는 것들, 뇌의 물리적 손상, 척수의 물리적 손상, 뇌 손상에 의한 발작, 및 신경퇴화와 관련된 신경 장애 등이 있다.
본 발명의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약학 조성물)는 다수의 말초 신경병증의 치료에 사용할 수 있는데, 말초 신경병증은 (a) 외상성 신경증-유래 신경병증, (b) 화학요법-유래 신경병증, (c) 독소-유래 신경병증 (이에 한정되는 것은 아니지만 알콜 중독, 비타민 B6 중독, 헥사카본 중독, 아미오다론, 클로람페니콜, 디설피람, 이소니아지드, 금, 리튬, 메트로니다졸, 미소니다졸, 니트로퓨란토인에 의해 유래된 신경병증 포함), (d) 치료 약물-유래 신경병증 동통 (항암제, 특히 택솔, 택소테르, 시스플라스틴, 노코다졸, 빈크리스틴, 빈디신 및 빈블라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 항암제; 및 항바이러스 제제, 구체적으로 ddI, DDC, d4T, 포스카르넷, 댑손, 메트로니다졸, 및 이소니아지드로 이루어진 군으로부터 선택된 항바이러스 제제에 의해 야기된 동통)을 포함하는 약물-유래 신경병증, (e) 비타민-결핍-유래 신경병증 (이에 한정되는 것은 아니나 비타민 B12 결핍, 비타민 B6 결핍, 및 비타민 E 결핍을 포함함), (f) 특발성 신경병증, (g) 당뇨성 신경병증, (h) 병원체-유래 신경 손상, (i) 염증-유래 신경 손상, (j) 신경퇴화, (k) 유전성 신경병증 (이에 제한되는 것은 아니나 프라이드라히 운동실조, 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증, 탄지에르 병, 페브리씨 병을 포함), (l) 대사 질환 (이에 제한적이지는 않으나 신부전증 및 갑상선 기능 저하증을 포함), (m) 감염성 및 바이러스성 신경병증 (이에 제한적이지는 않으나 나병, 라임 병, 바이러스, 구체적으로 헤르페스 바이러스 (예를 들어, 포진후 신경통을 유발할 수 있는 대상 포진 바이러스), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 파필로마 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 감염과 연관된 신경병증성 동통), (n) 자가면역 신경병증 (이에 제한되는 것은 아니나 길랑-바레 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, 미결정 유의성 단일클론감마병증 및 다발성 신경병증을 포함), (o) 삼차 신경통 및 압박 증후군 (이에 제한적인 것은 아니지만 카르펠 터널을 포함), 및 (p) 외상후 신경통, 환상지 증후군, 다발성 경화증통, 복합부위 통증증후군 (이에 제한적이지는 않으나 반사성 교감신경 퇴행위축, 작열통을 포함함), 종양 관련 동통, 혈관염/혈관병증성 신경병증, 및 좌골신경통을 포함하는 그외 신경병증성 동통 신드롬 등을 포함한다. 신경병증성 동통은 이질통, 통각과민, 자발통 또는 환상통으로 나타날 수 있다.
2. 촉각성 이질통의 치료
본 발명의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약학 조성물)은 개체의 촉각성 이질통을 치료하는 데 사용할 수 있다. "촉각성 이질통 (tactile allodynia)이라는 용어는 통상적으로 정상적으로 무해한 피부 자극 (예를 들어, 접촉)에 의해 통증이 일어나는 개체의 상태를 의미한다.
일부 구체예에서,약학적으로 유효량의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 개체에 투여하여 촉각성 이질통을 치료한다. 이와 관련된 구체예에서, 촉각성 이질통은 유효량의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 단독으로 개체에 투여하거나, 또는 진통마취제제, 항부정맥제, 국소 진통제, 국소 마취제, 항경련제, 항우울증제, 부신피질호르몬 및 비스테로이드성 항염제(NSAIDS)로 이루어진 군으로부터 선택한 유효량의 무통-유도 화합물과 함께 유효량의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 개체에 투여하여 치료할 수 있다. 일 구체예에서, 무통-유도 화합물은 항경련제이다. 다른 바람직한 구체예에서, 무통-유도 화합물은 가바펜틴((1-아미노메틸)사이클로헥산 아세트산) 또는 프리가바린 (S-(+)-4-아미노-3-(2-메틸프로필)부탄산)이다.
일부 구체예에서, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 이에 한정되는 것은 아니나 항암제 또는 항바이러스 제제를 포함하는 치료체와 함께 투여된다. 항암제는 택솔, 택소테르, 시스플라스틴, 노코다졸, 빈크리스틴, 빈디신 및 빈블라스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 항암제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항바이러스 제제는 ddI, DDC, d4T, 포스카르넷, 댑손, 메트로니다졸, 및 이소니아지드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
3. 동통 민감도 손실의 수복 치료
다른 구체예에서, 본 발명의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약학 조성물)는 신경병증으로 고생하는 개체에 있어서 동통 민감도 손실을 수복(recuding)하기 위한 방법에 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 신경병증은 당뇨성 신경병증이다. 일부 구체예에서, 동통 민감도 손실은 열 동통 민감도 손실이다. 이 방법은 예방 및 치료적인 처치를 모두 포함한다.
예방 처치법에 있어서, 동통 민감도 손실이 진행될 위험이 있는 개체 (초기 단계의 신경병증을 겪을 것으로 예상되는 개체)에게 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 투여하게 된다. 이러한 환경하에서 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 처리하는 것은 위험가능성이 있는 환자를 예방적으로 처치하는 역할을 하게된다.
치료적인 처치법에서, 신경병증을 앓은 결과 동통 민감도를 손실한 경험이 있는 개체 (신경병증 후기 단계로 예상되는 개체)에게 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 투여한다. 이러한 상황하에서 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 처치하는 것은 개체에 적절한 동통 민감도를 회복시켜주는 역할을 하게된다.
4. 바이러스 감염 및 바이러스성 신경병증의 치료
감염성 및 바이러스성 신경병증의 예방적 처치를 고려해 볼 수 있다. 예방적 처치는 바이러스 감염 확인 후 및 신경병증 동통의 발병 전에 내려진다. 처치 동안, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 투여하여, 이에 제한되는 것은 아니나 신경병증 동통과 관련된 나병, 라임 병, 바이러스, 구체적으로 헤르페스 바이러스 (예를 들어, 포진후 신경통을 유발할 수 있는 대상 포진 바이러스), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 및 파필로마 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 감염과 연관된 신경병증 동통을 포함하는 신경병증 동통의 출현을 방지한다. 다른 구체예에서, 나타날 수 있는, 신경병증 동통의 중증도를 줄이기 위해 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 투여한다.
급성 바이러스 감염 증상은 종종 발진을 동반한다. 다른 증상으로는 예를 들어, 헤르페스 조스터 감염 (대상 포진)의 일반적인 합병증으로, 감염된 신체 부위에서 지속통이 발전하는 증상을 포함한다. 포진 후 신경통은 한달 이상 지속될 수 있으며, 발진과 유사한 모든 증상이 사라진 후 몇 달간 나타날 수도 있다.
5. 통증성 당뇨 신경병증의 치료
통증성 당뇨 신경병증의 예방적 처치를 고려할 수 있다.
당뇨 신경병증의 예방적 처치는 당뇨병 또는 당뇨병-관련 증상의 초기 진단 결정 후 및 신경병증 동통의 발병 전에 시작한다. 또한 통증성 당뇨 신경병증의 예방학적 처치는 개체가 진행성 당뇨병 또는 당뇨-관련 증상 위험이 있다고 판단될 때 시작한다. 처치 동안, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 투여하여 신경병증성 동통의 출현을 방지하게 된다. 다른 구체예에서, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 투여하여 이미 나타난 신경병증 동통의 중증도를 감소시킨다.
6. 신경계 장애의 치료
본 발명의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드 (및 이를 포함하는 약학 조성물)를 개체(예를 들어, 인간)의 신경계 장애를 치료 또는 예방하기 위해 사용할 수 있는데, 유효량의 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드, 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 함유하는 조성물, 또는 폴리알킬렌 부분, 예컨대 PEG와 커플링된 안정한, 수용성 결합성 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 이를 필요로 하는 개체에 투여하여 사용할 수 있다.
신경계 장애는 말초신경계 장애, 예컨대 말초 신경병증 또는 신경병증 동통 신드롬이다. 치료 대상으로는 인간이 바람직하다.
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 이에 제한적인 것은 아니나 손상(lesioned) 뉴론 및 외상(traumatized) 뉴론을 포함하는 뉴론의 결손을 치료하는 데 유용하다. 외상을 경험한 말초 신경은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 연수 신경 또는 척수 신경을 포함한다. 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 신경 퇴행성 질병, 예를 들어, 뇌허혈성 신경 손상; 신경병증, 예를 들어, 말초신경병증, 알츠하이머 병, 헌팅턴 병, 파킨슨 병, 근위축성 측색 경화증 ("ALS")의 치료에 유용하다. 이와 같이 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드는 기억 장애, 예컨대 치매성 기억 장애 치료에 사용할 수 있다.
도 1은 야생형 인간 (서열번호 10), 마우스 (서열번호 11), 및 래트 (서열번호 12)의 프리 프로 뉴블라스틴 단백질을 정렬시켜 나타낸 도면이다. 좌우 수직선은 각각 성숙 113 아미노산 및 104 아미노산 형태의 시작을 나타낸다. RRXR 헤파린 결합 모티프 (motif)는 박스로 나타내었다.
도 2A는 야생형 뉴블라스틴 (피크 D) 및 3개의 단독 Arg 에서 Glu 치환 변이체 (피크 A, B, 및 C)에 대한 양이온 용리 프로파일을 나타내는 그래프이다 (경사선은 컬럼으로부터 용리된 임의의 부피에 대한 이론적인 염화나트륨 농도를 나타낸다). 데이타는 용리된 샘플의 OD280 값으로 나타내었다.
도 2B는 야생형 뉴블라스틴 (피크 H) 및 3개의 단독 Arg 에서 Glu 치환 변이체들 (피크 E, F, 및 G)의 헤파린 세파로스 용리 프로파일을 나타내는 그래프이다 (경사선은 컬럼으로부터 용리되는 임의의 부피에 대한 이론적인 염화나트륨 농도를 나타낸다). 데이타는 용리된 샘플의 OD280 값으로 나타내었다.
도 3A 및 3B는 헤파린 존재 (2A) 또는 부재 (2B) 하에서 음이온 크로마토그래피한 후 야생형 뉴블라스틴을 SDS/PAGE한 사진이다.
도 4는 뉴블라스틴 CHO 세포 결합 분석 결과를 나타내는 그래프이다. SDS/PAGE 및 밀도 분석 (desitometry) 후, 야생형 및 Arg48E 변이체 뉴블라스틴 밴드의 OD 값을 각 샘플의 헤파린 농도에 대해서 그래프로 작성하였다.
도 5는 야생형 인간 NBN 113, 야생형 인간 NBN 104, Arg48E, Arg49E, Arg51E, 및 Arg48, 49E를 사용하여 헤파린 결합 ELISA를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 야생형 래트 NBN 113, Arg51E, Arg48E, Arg49E, 및 래트 NBN 113의 KIRA 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7A는 야생형 인간 뉴블라스틴 및 Arg48, 49E 변이 인간 뉴블라스틴 (113 아미노산 형태)의 KIRA 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
*도 7B는 야생형 인간 뉴블라스틴, Arg48, 49E 변이 인간 뉴블라스틴 (104 아미노산 형태), Arg48, 51E 인간 뉴블라스틴 (113 아미노산 형태), 및 Arg49, 51E 인간 뉴블라스틴 (113 아미노산 형태)의 KIRA 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 야생형 인간 뉴블라스틴, Arg48E, Arg49E, Arg51E, Arg48, 49E, 및Arg48, 49, 51E 뉴블라스틴 형태의 3원 복합체 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 야생형 뉴블라스틴, Arg48E, Arg49E, Arg51E, Arg48, 49E, 및 Arg48, 49, 51E 뉴블라스틴 형태의 3원 복합체 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 단일 환제 (bolus) 7 ㎎/㎏을 피하 주사한 후 야생형 뉴블라스틴 및 Arg48, 49E의 약리역학을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다 (뉴블라스틴 혈장 농도는 뉴블라스틴 검출 ELISA를 통해 측정하였다).
도 11은 단일 환제 1 ㎎/㎏을 정맥 주사한 후 야생형 뉴블라스틴 및 Arg48, 49E의 약리역학을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다 (뉴블라스틴 혈장 농도는 뉴블라스틴 검출 ELISA를 통해 측정하였다).
도 12는 단일 환제 (bolus) 7 ㎎/㎏을 피하 주사 후 2X10K PEG화된 Arg48, 49E 뉴블라스틴의 약리역학 결과 (데이타를 1 ㎎/㎏ 밑에 외삽시켜 나타냄) 및 단일 환제 1 ㎎/㎏을 정맥 주사한 후 2X10K PEG화된 Arg48, 49E 뉴블라스틴의 약리역학 결과를 나타내는 그래프이다 (뉴블라스틴 혈장 농도는 뉴블라스틴 검출 ELISA를 사용하여 측정하였다).
도 13은 야생형 뉴블라스틴 또는 Arg48, 49E를 코딩하는 플라스미드로 트랜스팩션된 CHO 세포에서의 상대적인 뉴블라스틴 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
도 14는 Arg48, 49E 이중 변이체가 트랜스팩션된 최고(leading) CHO 세포주 및 야생형 뉴블라스틴이 트랜스팩션된 최고 CHO 세포주에서의 상대적인 뉴블라스틴 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
[실시예]
이하, 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하나 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 디자인 및 합성
인간 뉴블라스틴을 결정화하고 서로 매우 근접해 있는 4개의 뉴블라스틴 잔기: Arg14, Arg48, Arg49, 및 Arg51과 상호작용하는 황산염 이온들의 3원자(triad)를 밝혀내었다. 이 3원자 및 이들간의 상대적인 공간배열에 기초하여서, 뉴블라스틴의 이 영역이 헤파린 황산염-결합 도메인일 것으로 예측하였다. 이후, 이미 알려진 헤파린 황산염의 구조를 상기 황산염 3원자 위치의 뉴블라스틴에 도킹시켰다(인-실리코). 이 위치에 헤파린 황산염이 정확하게 들어맞았으며, 뉴블라스틴 내의 이 영역에 헤파린 황산염의 결합 가능성이 있음을 확인하였다.
또한 뉴블라스틴 결정화 데이타를 통해서 다음의 아미노산 잔기들이 상기 황산염 이온의 3원자와, 또는 뉴블라스틴과 상호작용하는 하나 이상의 3종의 다른 황산염 이온들과의 추가적인 상호작용을 제공한다는 것을 밝혀내었다: Ser46, Ser73, Gly72, Arg39, Gln21, Ser20, Arg68, Arg33, His32 및 Val94. 결정 구조로 밝혀진 황산염 결합 부위외에도, 뉴블라스틴은 N-말단의 3-9 잔기에 헤파린 황산염 결합 부위 보존 서열(GPGSRAR)을 함유하고 있다. 이 영역은 결정 구조에서 비구조적이지만 글리코사미노글리칸 결합시 정렬되는 듯하다. 이 영역은 결정 구조에서 보이는 3종의 황산염 클러스터와 공간적으로 밀접한 듯하다(Arg 14는 단백질의 힌지 영역의 정 중앙에 위치하는 헤파린-결합 부위에 기여한다).
상기의 유력한 헤파린 황산염-결합 도메인에 대한 생물학적 타당성을 조사하기 위해서, 성숙한 113 아미노산의 인간 뉴블라스틴(서열번호 1) 내에 3개의 개별적인 단일 아미노산 잔기를 치환하였다. 황산염을 끌어당기는 것에서 밀어내는 것으로 잔기의 전하가 바뀌도록, 그리고 주변 아르기닌 잔기들을 전위적으로 안정하도록, 각각 위치 48(변형체 명칭 "Arg48E; 서열번호 2), 위치 49(변형체 명칭 "Arg49E"; 서열번호 3), 및 위치 51(변형체 명칭 "Arg51E"; 서열번호 4)의 아르기닌 잔기들을 글루타메이트로 교체하였다(즉, 3개의 서로 다른 단일 아미노산 변형 구조체를 제조하였다). 대장균(E. coli) 응집체(inclusion bodies)로부터 단백질들을 리폴딩(refolding)시키고 정제하였다 (국제공개특허 제WO04/069176호 참조). 구조적인 완전성을 확인하고 정확한 잔기의 치환을 확인하기 위해서 각각의 뉴블라스틴 변형체을 분석하였다. 3종의 모든 변이체가 야생형-인간 뉴블라스틴과 구조적으로 거의 유사하였다.
실시예 2 : 음이온 및 헤파린 세파로스 크로마토그래피
변형 뉴블라스틴 폴리펩티드에 대한 생화학적 분석을 더 수행하여 각각의 변이에 의해 헤파린 결합에 미치는 영향을 확인하였다. 헤파린 세파로스 및 양이온 크로마토그래피를 모두 수행하였다. 야생형 인간 뉴블라스틴은 분명히 pI가 11,31로 염기성 단백질이기 때문에, 뉴블라스틴은 양이온계 수지에 효과적으로 결합하게 된다. 아르기닌에서 글루타메이트로의 단일 전환으로 pI가 10.88로 감소하였다. 그러나, 이렇게 낮아진 pI 때문에 야생형 대조구와 비교하여 변이체의 양이온 수지-결합이 급격하게 변한다거나 용리 프로파일이 변할 것으로는 생각되지는 않았다.
각각의 변이체들(야생형 뉴블라스틴 대조구와 함께)에 대해 양이온 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 샘플들을 5 mM의 인산염(pH 6.5) 및 150 mM의 염화나트륨을 함유한 완충용액에 존재하는 수지에 충진시키고, 초기 농도 150 mM로 시작하여 마지막 1 M 염화 나트륨의 직선 염 농도 구배로 용리하였다. ∼800 mM의 염화나트륨 농도에서 야생형 뉴블라스틴이 용리된 반면(도 2A; 피크 D), 3종의 각 변이체들은 대략 500 mM의 염 농도 범위 내에서 용리되었으며, 이는 이들의 pI가 보다 낮음을 의미한다. Arg49E 및 Arg51E(도 2A; 피크 B 및 C)는 Arg48E(도 2A; 피크 A)이 용리되는데 필요한 것보다 약간 높은 염 농도에서 용리되었다(각각, 520 mM 대 490 mM). 이러한 차이는 Arg48이 다른 두 변이에 비해 보다 표면 접근적이며 양이온 결합에 보다 기여하는 것으로 추측할 수 있다.
Arg에서 Glu로의 치환이 헤파린 결합에 효과가 있는지 확인해 보기 위해서, 상기 3종의 각 변이체들(야생형 인간 뉴블라스틴과 함께)에 대해 헤파린 세파로스 크로마토그래피를 수행하였다(도 2B). 결합 및 용리 조건은 양이온 크로마토그래피에서 사용한 것과 유사하였다. 그러나, 관찰된 용리 프로파일은 양이온 수지 용리 프로파일과 상당히 달랐다. 야생형 뉴블라스틴은 대략 720 mM 염화 나트륨(도 2B; 피크 H)에서 용리된 반면, Arg51E, Arg49E, 및 Arg48E는 570 mM(도 2B; 피크 G), 510 mM(도 2B; 피크 F), 및 450 mM(도 2B; 피크 E) 농도의 염화 나트륨에서 각각 용리되었다. 특히 Arg48E가 헤파린 결합에 상당한 효과가 있는 것으로 나타났다. 함께 수행된, 이들 크로마토그래피 프로파일을 통해서 각 변이들에 의해 헤파린에 대한 뉴블라스틴의 친화력이 분명히 감소하는 것을 알 수 있었다.
실시예 3: 음이온 크로마토그래피
6.5의 표준 pH 조건 및 150 mM의 염화 나트륨 농도에서, 뉴블라스틴은 음이온 수지에 결합하지 않는다. 이와 반대로, 동일한 조건하에서 헤파린 황산염은 음이온 수지에 결합하게 된다.
뉴블라스틴을 16-kDa-헤파린 황산염과 1 : 1 몰비로 미리 혼합하고 상술한 조건을 사용하여 음이온 메트릭스에 적용하였고, 600 mM 염화나트륨 농도에서 뉴블라스틴이 결합되고 용리되었다(도 3B의 "FT"로 표시된 레인). 이는 뉴블라스틴이 헤파린 황산염과의 상호작용을 통해서 음이온 메트릭스에 결합되었다는 것을 의미한다. 헤파린이 없을 경우에는, 뉴블라스틴은 음이온 수지에 결합하지 않았으며(도 3A에 "FT"로 표시된 레인), 600 mM의 염화 나트륨 농도에서도 뉴블라스틴은 용리되지 않았다(도 3A, "용리"라고 표시한 레인). 이 결과들은 뉴블라스틴이 헤파린에 붙을 수 있음을 보여주는 증거라 할 수 있다.
실시예 4: 중국 햄스터 난소 세포의 결합 실험
뉴블라스틴은 이미 알려진 바와 같이 중국 햄스터의 난소 (CHO) 세포의 표면에 비특이적으로 결합한다. 뉴블라스틴의 CHO 세포-결합 분석을 수행하여 이 상호작용이, 적어도 부분적으로, 세포 표면의 헤파린 황산염 분자에 대한 뉴블라스틴의 결합을 통해서 매개되는지 확인하였다.
16kD 헤파린 황산염의 양을 점차 증가시키는 것과 함께 야생형 인간 뉴블라스틴(40 ㎍) 또는 Arg48E 변이체를 상기 2종의 뉴블라스틴 형태에 완전하게 결합하는 세포 농도의 CHO 세포 (106 세포)와 미리 혼합하고 37℃에서 4시간 동안 항온반응시켰다. 반응 후, 상기 세포들을 원심분리로 펠렛화하고 상등액에 남아있는 비결합 뉴블라스틴으로 SDS/PAGE 분석을 수행하였다. 각 단백질 밴드를 밀도분석법(densitometry)을 통해 양을 측정한 후, 각 샘플에 대해서 최종 광학 밀도값을 헤파린 농도에 대한 그래프로 나타내었다(도 4).
낮은 두 농도의 헤파린에서, 야생형 및 변이 뉴블라스틴 형태 모두 상등액에서 동일한 양의 단백질이 확인되었다. 그러나, 헤파린 농도가 0.5 ㎍/㎖ 이상 증가하게되면, 상등액에서 Arg48E 변이체보다 야생형 뉴블라스틴이 더욱 확인되었다. 이러한 결과를 통해서 야생형 뉴블라스틴과의 결합에 대해 헤파린이 세포 표면-결합 헤파린과 경쟁하는 것이라 추측할 수 있는 반면(즉, 헤파린과 야생형 뉴블라스틴의 결합으로 세포 표면에서 야생형이 떨어짐), Arg48E 변이체에 대해서는 헤파린이 쉽게 경쟁할 수 없다. 헤파린 농도가 가장 높을 때(50 ㎍/㎖), Arg48E 변이체는 세포 표면에서 용리되기 시작하였으며, 이는 헤파린과 Arg48E 변이체간의 이온 상호작용에 의한 것으로 생각되었다.
실시예 5 : 야생형 뉴블라스틴 및 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드의 헤파린 결합
뉴블라스틴의 헤파린-결합 부위로서 상기 확인된 아르기닌 3원자의 역할을 좀 더 조사해보기 위해서, 헤파린 결합 ELISA를 수행하였다. 간략하게, 96-웰 플레이트를 항-뉴블라스틴의 단일클론 항체로 코팅하고, 세척한 후 뉴블라스틴 형태 중 하나를 첨가하였다. 다음으로 플레이트에 바이오틴화시킨 헤파린을 첨가하였다. 추가적인 세척 단계 후, 화학발광 기질과 결합된 스트레파비딘-HRP를 사용하여 뉴블라스틴/헤파린 복합체를 확인하였다. 이 헤파린-결합 ELISA를 사용하여 야생형 인간 뉴블라스틴 113 아미노산 (서열번호 1) 및 104 아미노산 (서열번호 1의 아미노산 10 - 113) 형태와 단일 아미노산 치환 (Arg48E, Arg49E, 및 Arg51E; 서열번호 2 - 4) 및 이중 치환 (Arg48, 49E; 서열번호 5)을 함유하는 변형 뉴블라스틴 폴리펩티드를 비교하였다.
야생형 뉴블라스틴은 모두 ∼1 ng/㎖ 헤파린의 EC50에서 헤파린과 결합하였다. Arg49E 및 Arg51E는 ∼10 ng/㎖의 EC50에서 결합하여 비교적 효율이 낮았으나, 최대 결합은 결국 동일하였다(도 5). 세 개의 단일 변이체들 중에서, Arg48E가 ∼100 ng/㎖의 EC50으로, 헤파린 결합에서 가장 효율적이었으나, 비변형 뉴블라스틴 형태와 비교했을 때는 헤파린 결합치는 여전히 동일하였다(도 5). Arg48E 변이체는 비변형 뉴블라스틴 형태와 비교했을 때 헤파린 결합에서는 효율이 100배 이하였으며 다른 단일 치환 변이체들과 비교했을 때는 효율이 10배 이하였다. Arg48 및 Arg49를 모두 글루타메이트로 치환했을 때, 헤파린 결합은 거의 없어졌으며, 그 결과 최대 헤파린 결합이 7-배 감소하였으나, EC50은 단일 변이체의 범위 내로 존재하였다. 이러한 결과를 통해서 헤파린-결합 부위로 추정되는 부위에서 이의 중심적인 위치로 인해 Arg48은 헤파린 결합에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
실시예 6 : 야생형 뉴블라스틴 및 헤파린 결합 변이체들의 키나제 수용체 활성화 분석
세포-기반의 생물학적 분석법에서 헤파린-결합 부위 변이체들이 뉴블라스틴 수용체의 신호전달에 영향을 주는지 확인하기 위해서, 야생형 뉴블라스틴과 함께 변이 뉴블라스틴 형태들에 대해 키나제 수용체 활성화(KIRA) 분석법을 수행하였다.
Arg에서 Glu로 단일 치환한 각각의 변이체들은 KIRA 활성에 있어서 비변형 대조구와 동일하였으며, 이를 통해서 이들 변이체들이 야생형과 구조적으로 유사하며 뉴블라스틴 수용체 및 신호전달 캐스케이드를 활성화시킬 수 있을 것이라 생각되었다(도 6). 또한, 이들 결과를 통해서 헤파린과 뉴블라스틴의 결합이 수용체 활성화를 위해서 요구되는 것은 아니라고 생각된다.
Arg48, 49E 이중 변이체 (서열번호 5; 113 아미노산 형태)에 대해 KIRA 분석을 수행하였을 때, 야생형 인간 뉴블라스틴 대조구와 비교하여 최대 수용체 활성화는 증가되면서 EC50은 대략 1 정도의 크기(order of magnitude)로 왼쪽으로 이동하였다(도 7A). 이와 유사하게, Arg48, 49E 이중 변이체(서열번호 7 ; 104 아미노산 형태)는 또한 야생형 뉴블라스틴에 비해 그 효과가 증가한 것으로 나타났다(도 7B). Arg48, 51E 및 Arg49, 51E 이중 변이체들(각각 서열번호 9 및 서열번호 8; 113 아미노산 형태)은 각각 KIRA 활성에 있어서 비변형 뉴블라스틴 대조구와 유사하였다.
실시예 7 : 3원 복합체(ternary complex) 분석법
야생형 인간 뉴블라스틴 및 각각의 헤파린 변이체들에 대해서 약간의 다른 2 종의 프로토콜을 사용하여 3원 복합체 분석(ternary complex analysis)을 수행하였다. 첫 번째 프로토콜에서는 포획 항체로 코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하기 전에 뉴블라스틴의 수용체 성분(GFRalpha3 및 RET)을 뉴블라스틴과 함께 하나의 풀(pool)에서 결합시키는 것이다(도 8). 두 번째 프로토콜에서는 상기 성분들을 ELISA 플레이트에 GFRalpha3를 먼저 넣고, 다음으로는 뉴블라스틴, 그리고 RET를 순차적으로 첨가하였다(도 9).
상기 성분들을 풀로 함께 첨가하였을 때, Arg48E 및 Arg48,49E에 대해 모두 결합이 최대로 이루어졌으며, 이를 통해서, 이들 뉴블라스틴 형태들이 그들의 수용체에 대해서 높은 친화력을 가짐을 알 수 있었다. 야생형 뉴블라스틴은 Arg49E 변이체와 유사한 친화력으로 결합하는 것으로 나타난 반면, Arg51E 및 3중 변이체(Arg48, 49 및 51 모두를 글루타메이트로 치환함)는 수용체 결합이 가장 낮았다.
수용체 성분들을 순차적으로 첨가하였을 때, Arg48E의 수용체 결합이 가장 좋게 나타났다. 그러나, 이러한 조건하에서, 이중 변이체는 Arg51E 변이체와 유사하게 수용체와 약하게 결합하였다. Arg49E 및 야생형 뉴블라스틴은 관찰되는 최대 및 최소 결합의 중간 정도로 수용체에 대한 친화력을 나타내었다. 3중 변이체는 이 조건하에서는 결합하지 않았다.
전체적으로, 상기 결과를 통해서 뉴블라스틴의 이의 수용체에 대한 친화도에 Arg48이 중추적인 역할을 하고 있음을 알 수 있다.
실시예 8 : 근자외선 및 원자외선 CD 분석
뉴블라스틴의 2차 및 3차 구조에 대한 이중 변이의 효과를 더욱 조사하기 위해서, Arg48, 49E 이중 변이에 대해서 원근 UV CD 분석을 수행하였다. 2차 및 3차 구조에서 근소한 차이가 탐지되었으나, 이중 변이의 구조는 야생형 뉴블라스틴의 것과 매우 유사하였다.
실시예 9 : 뉴블라스틴 Arg48, 49E 이중 변이체의 약물동력학적 분석
인간 뉴블라스틴은 래트(rat)에 정맥(IV) 또는 피하(SC) 주사하였을 경우, 전체 생물학적 이용가능성이 1% 미만으로 낮은 약물동력학(PK)을 나타내었다. 이렇게 생물학적 이용가능성이 낮은 이유 중 하나로는 헤파린에 의한 제거(clearance)때문일 수 있다. 래트에서 헤파린에 의한 제거가 인간 뉴블라스틴이 빠르게 제거되는 데 관여하는 지를 확인하기 위해서, Arg48, 49E 이중 변이체(야생형 대조구와 함께)에 대해 PK 분석을 수행하였다.
모든 형태들을 개별적으로 래트에 7 ㎎/㎏ SC로 투여하였다. 혈청 샘플을 1시간 부터 시작하여 96 시간까지 회수하였으며, 뉴블라스틴에 대한 분석을 하였다(도 10). 야생형 뉴블라스틴에 대해 곡선에서 관찰되는 면적(AUC)은 ∼109인 반면 이중 변이체에 대해 관찰되는 AUC는 20,145였다. 이는 이중 변이체가 AUC에서 185배 증가한 것을 나타내며(야생형 뉴블라스틴에 비해) 혈청 노출도 상당히 증가되었음을 나타낸다.
야생형 및 이중 변이 뉴블라스틴에 대해서 또한 IV 투여(1 ㎎/㎏) 후 PK 분석을 실시하였다. 이중 변이체의 초기 혈장 농도는 투여 5분 후 야생형 대조구(사각형)에 비하여 대략 6배(다이아몬드) 높았으나 1시간 이내에 빠르게 야생형 수준으로 내려왔다(도 11). 이 결과는 뉴블라스틴의 이중 변이가 혈청 노출이 증가하는데 도움을 주나 전체적인 제거율에는 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다.
SC 관찰 소견과 함께 고려하면, 헤파린-결합은 SC 투여 후 특히 적절하게 보였는데, 아마도 저류물-유사(depot-like) 효과를 야기한 것일 것이다. 뉴블라스틴이 순환되면, 이중 변이체 및 야생형 분자들이 제거되는 비율은 거의 동일하다.
래트에서 뉴블라스틴이 순환으로 부터 제거되는 비율을 알기 위해서, 뉴블라스틴의 야생형 및 이중 변이 형태를 SPA-계 커플링 화학법을 사용하여 10kDa PET로 PEG화시켰다. 뉴블라스틴은 고유의 라이신 잔기가 없는 동형이량체이므로, 상기 10-kDa 부분이 각 단량체의 아미노 말단을 특이적으로 표지화시키게 된다. 2X10K PEG화된 인간 이중 변이 뉴블라스틴을 균질하게 정제하였고, PK 분석전에 구조 및 생물학적 분석을 수행하였다.
2X10K PEG Arg48, 49E 이중 변이체를 래트에 IV(1 ㎎/㎏) 또는 SC(7 ㎎/㎏)로 투여하고 분석을 위해서 다양한 시간 시점에서 혈청을 회수하였다. IV 투여 후, 2X10K PEG 이중 변이로 통상적인 알파 및 베타 단계를 갖는 10 ㎍/㎖의 이론적 Cmax(다이아몬드)를 얻었다(도 12). PEG화된 이중 변이체의 SC 투여를 통해서 투여 24시간에 40 ng/㎖의 Cmax를 확인하였다(도 12). 상기 약물이 순환에 도달하면, 제거율은 IV 투여분의 것과 평행하였다. 이들 구조물의 생물학적 이용성은 비-PEG화 또는 PEG화된 야생형 인간 뉴블라스틴이 1% 미만인 것과 비교하여 대략 10% 였다.
실시예 10 : 중국 햄스터 난소 세포에서의 뉴블라스틴 헤파린-결합 변이체의 발현
야생형 및 변이 뉴블라스틴을 코딩하는 플라스미드 구조물을 CHO 세포에서 발현시켰고 분비되는 가용성 단백질의 양을 ELISA를 통해 측정하였다. 본 실험에서 사용되는 플라스미드 구조물은 (i) 야생형 인간 뉴블라스틴의 카르복시 말단의 104 아미노산, 또는 (ii) Arg48, 49E 이중 변이체(104 아미노산 형태)에 융합된 인간 성장 호르몬 시그날 펩티드(SigPep)(플라스미드에 인트론을 갖거나 또는 갖지 않음)를 함유하는 융합 단백질을 코딩한다.
다음은 본 실험에서 사용한 뉴블라스틴 융합 단백질의 아미노산 서열이다. 뉴블라스틴 서열은 앞부분의 경우에 해당하는 형태이다. 인간 성장 호르몬 시그날 펩티드 서열은 뒷부분의 경우의 형태이다. 시그날 펩티드와 뉴블라스틴 서열의 접합부는 캐럿(^)으로 표시하였다. 위치 48 및 49의 아미노산은 밑줄로 나타내었다.
SigPep-NBN(야생형):matgsrtslllafgllclswlqegsa^AAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSC RR ARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (서열번호 13).
SigPepNBN(Arg48,49E):matgsrtslUafgllclswlqegsa^AAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSC EE ARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG (서열번호: 14).
CHO 세포를 각각의 상기 뉴블라스틴 형태를 코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션하고 384-웰 플레이트에서 배양하였다. 몇 주 후에, 성장중인 세포를 함유하는 웰들을 새로운 96-웰 배양 플레이트로 옮겼다. 조정 배지(conditioned medium)를 ELISA로 분석하여 가용성 뉴블라스틴의 적정가를 측정하였다. 테스트한 각 플라스미드에 대한 누적 흡광도 값(오류 바에 대한 1 표준 편차에 따른 평균 값)을 확인하였다.
Arg48,49E 이중 변이체를 코딩하는 플라스미드로 CHO 세포를 트랜스팩션한 결과 야생형 뉴블라스틴을 코딩하는 플라스미드로 트랜스팩션된 세포와 비교하여, 높은 수준으로 재조합 단백질을 발현하는 세포주의 수가 상당히 증가하였다(도 13).
각 트랜스팩션한 세포주로부터 뛰어난 세포주를 더욱 증가시켰다. 고정된 세포 수를 3일 간 배양하였고 총 세포 수, 생존율, 및 적정가를 결정하였다. 최고(leading) Arg48, 49E 이중 변이 세포주에서 발현된 뉴블라스틴의 적정가는 최고 야생형 뉴블라스틴 세포주보다 대략 5배 정도 높았다.
다른 실시예
본 발명을 구체적 설명과 함께 기술하였으나, 상술한 내용은 단지 설명을 위한 것이며 첨부된 청구항의 범주에서 정의한 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니다. 다른 면, 장점 및 변형들도 이하 청구항의 범주내에 속한다.
<110> Biogen Idec MA Inc. <120> NEUBLASTIN VARIANTS <130> 13751-065WO1 <140> PCT/US2005/029637 <141> 2005-08-18 <150> US 60/602,825 <151> 2004-08-19 <150> US 60/694,067 <151> 2005-06-24 <160> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30 Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45 Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys 65 70 75 80 Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95 Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110 Gly <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary variant of human Neublastin polypeptide <400> 2 Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 1 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Val Asn Ser 85 90 95 Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110 Gly <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary variant of human Neublastin polypeptide <400> 4 Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30 Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg 35 40 45 Arg Ala Glu Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys 65 70 75 80 Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95 Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110 Gly <210> 5 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary variant of human Neublastin polypeptide <400> 5 Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu 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Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys 65 70 75 80 Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95 Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110 Gly <210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary variant of human Neublastin polypeptide <400> 9 Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys 1 5 10 15 Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His 20 25 30 Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Glu 35 40 45 Arg Ala Glu Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala 50 55 60 Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys 65 70 75 80 Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser 85 90 95 Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu 100 105 110 Gly <210> 10 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp 1 5 10 15 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Mus musculus <400> 11 Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg 1 5 10 15 Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu 20 25 30 Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro 35 40 45 Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His 50 55 60 Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg 65 70 75 80 Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala 85 90 95 Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala 100 105 110 Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg 115 120 125 Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser 130 135 140 Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg 145 150 155 160 Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly 165 170 175 Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys 180 185 190 Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr 195 200 205 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peptide <400> 14 Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly 20 25 30 Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly 35 40 45 His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly 65 70 75 80 Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro 85 90 95 Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn 100 105 110 Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys 115 120 125 Leu Gly 130

Claims (3)

  1. 서열번호 1의 아미노산 15 - 113과 80 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 48 위치에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 49 위치에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산; 및
    서열번호 1의 51 위치에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1에 대한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고,
    상기 폴리펩티드는 이량체화될 때, GFRalpha3 및 RET를 함유하는 복합체에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  2. 서열번호 1의 아미노산 15 - 113과 80 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열은
    서열번호 1의 위치 20에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 위치 21에 상응하는 위치에 글루타민 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 위치 32에 상응하는 위치에 히스티딘 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 위치 33에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 위치 39에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 위치 46에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 위치 68에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 위치 72에 상응하는 위치에 글리신 이외의 아미노산;
    서얼변호 1의 위치 73에 상응하는 위치에 세린 이외의 아미노산; 및
    서열번호 1의 위치 94에 상응하는 위치에 발린 이외의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1에 대한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며,
    상기 폴리펩티드가 이량체화될 때, GFRalpha3 및 RET를 함유하는 복합체에 결합하는 것인 폴리펩티드.
  3. 서열번호 1과 80 % 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 아미노산 서열은,
    서열번호 1의 위치 7에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산;
    서열번호 1의 위치 9에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산; 및
    서열번호 1의 위치 14에 상응하는 위치에 아르기닌 이외의 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호 1에 대해 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고,
    상기 폴리펩티드가 이량체화될 때, GFRalpha3 및 RET를 함유하는 복합체에 결합하는 것인 폴리펩티드.
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