ES2234015T3 - Gen relacionado con el aguti. - Google Patents
Gen relacionado con el aguti.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO GEN DENOMINADO ART, QUE SE EXPRESA PRIMARIAMENTE EN REGIONES DETERMINADAS DEL CEREBRO, ASI COMO ENLOS TEJIDOS ADRENALES Y PULMONARES. SE DESCRIBEN ASIMISMO POLIPEPTIDOS CODIFICADOS POR ART, ASI COMO PROCEDIMIENTOS DE PREPARACION DE ADN Y SECUENCIAS AMINOACIDAS DE ART.
Description
Gen relacionado con el agutí.
Esta invención se refiere a nuevas secuencias
génicas humanas y proteínas codificadas por las secuencias génicas.
Más específicamente, la invención se refiere a un nuevo gen,
denominado "ART", que se expresa en tejidos seleccionados e
incrementa la absorción de alimento.
El gen agutí está presente en la mayoría de los
mamíferos, aunque su función en mamíferos distintos de los roedores
no está clara. El producto del gen agutí regula la producción
relativa de pigmento negro o amarillo en el pelo de muchos animales,
incluyendo ratones, ardillas y lobos (A.G. Searle, Comparative
Genetics of coat color in mammals, Academic Press, New York, NY
[1968]).
El gen agutí de ratón se ha clonado y secuenciado
(Bultman et al., Cell, 71:1195-1204
[1992]), y codifica una proteína de 131 aminoácidos que se secreta.
La proteína agutí parece actuar como antagonista del receptor de
melanocortina-1 ("MC1r"), que se expresa en
melanocitos (véanse Takeuchi, J. Invest. Dermatol.,
92:239S-242S [1989]; Jackson, Nature,
362:587-588 [1993]). El MC1r, cuando está ocupado
por hormona estimulante de melanocitos (a-MSH), hace
que el melanocito sintetice pigmento negro (véase Jackson, arriba)
y, por tanto, parece que el agutí bloquea la acción de la
a-MSH, produciendo por tanto pelos con pigmento
amarillo (Lu et al., Nature,
371:799-802 [1994]).
De forma similar, Willard et al.
(Biochemistry, 34:12341-12346 [1995]) han
mostrado que la proteína agutí de ratón parcialmente purificada
actúa como un antagonista potente de a-MSH en el
receptor MC1, en cultivos celulares de melanoma de ratón B16F10. La
escisión proteolítica de proteína agutí en el aminoácido 83 genera
un fragmento C-terminal que es comparable en
actividad a la proteína agutí completa, sugiriendo que el dominio
activo de la proteína agutí se localiza en su extremo
C-terminal (Willard et al., arriba). Este
fragmento C-terminal tiene 10 cisteínas (la molécula
completa tiene 11 cisteínas).
En seres humanos, el gen agutí se expresa en la
piel, corazón, testículos, ovario y tejido adiposo. Esta expresión
tisular diversa sugiere que el agutí puede estar implicado en
procesos fisiológicos distintos de la producción de pigmentación
(Wilson et al., Human Mol. Gen.,
4:233-230 [1995]; Kwon et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 91:9760-9764 [1994]).
Se han identificado varios fenotipos dominantes
que proceden de la sobreexpresión de agutí en ratones transgénicos.
Estos incluyen, por ejemplo. obesidad, hiperinsulinemia, diabetes y
susceptibilidad incrementada a tumores (véase Manne et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 92:4721-4724 [1995]). El
grado y el tiempo de iniciación de la obesidad y la hiperinsulinemia
parecen estar relacionados con el nivel de expresión del gen agutí
(Manne et al., arriba). Además, estos fenotipos no parecen
estar relacionados con la producción en exceso de pigmento amarillo,
ya que ratones que tienen un receptor MC1 inactivo, muestran el
mismo fenotipo.
Los ratones mutantes que sobreexpresan el
producto del gen agutí tienen niveles incrementados de calcio
intracelular en el músculo esquelético (Zemel et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 92:4728-4732 [1995]. Aunque no
se conoce el mecanismo por el que el agutí produce este efecto, no
parece originarse por la liberación de depósitos intracelulares de
calcio o de una velocidad de flujo de calcio reducida. Debido a que
el músculo esquelético es importante en la absorción de insulina, y
este proceso está regulado en parte por los niveles de calcio, este
calcio intracelular incrementado podría explicar en parte la
hiperinsulinemia observada en ratones mutantes de agutí.
De forma interesante, el ratón agutí comparte
alguna homología en la secuencia de aminoácidos con ciertas toxinas
de araña y serpiente que se direccionan a receptores de
neurotransmisores o canales de iones específicos (Manne et
al., arriba; Ichida et al., Neurochem. Res.,
18:1137-1144 [1993]; Figueiredo et al.,
Toxicon, 33:83-93 [1995]). Esta homología está
restringida principalmente al extremo terminal de la proteína agutí,
en el que las toxinas y agutí comparten 8 residuos de cisteína. En
las toxinas, estos residuos de cisteína forman 4 uniones disulfuro
que son críticas para la actividad de la toxina. Las relaciones de
actividad estructurales que usan NMR tridimensional predicen que las
uniones disulfuro se requieren para formar la estructura terciaria
precisa para bloquear los canales de calcio (Kim et al., J. Mol.
Biol., 250:659-671 [1995]).
A la vista de las homologías de la secuencia
aminoácida del agutí con las toxinas de la araña y la serpiente, y
los resultados obtenidos de ratones mutantes que sobreexpresan el
agutí, se ha sugerido que el agutí puede ser un miembro de una nueva
clase de moléculas que regulan la actividad de los receptores de
melanocortina de ciertos tipos de proteínas de los canales de calcio
(Manne et al., arriba).
En seres humanos, hay actualmente cinco
receptores de melanocortina conocidos y se denominan
MC1r-MC5r. Dos de estos, MC1r y MC2r, muestran
especificidad relativa para los ligandos a-MSH y
ACTH, respectivamente. MC1r y MC2r se expresan en melanocitos y en
la glándula adrenal, respectivamente (Mountjoy et al.,
Science, 257:1248-1251 [1992]). MC3r se
expresa en regiones específicas del cerebro, mientras que MC4r se
expresa más ampliamente por todo el cerebro, y MC5r se expresa en
numerosos tejidos periféricos (Roselli-Reyfuss et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90:8856-8860 [1993]; Mountjoy et al.,
Science, arriba; Labbe et al., Biochemistry,
33:4543-4549 [1994]). Los ligandos y funciones
biológicas de MC3r, MC4r y MC5r son desconocidos actualmente.
Se ha sugerido recientemente un papel para los
receptores de melanocortina en el control central de la obesidad,
mediante la observación de que la inyección de la hormona
concentradora de melanina (MCH) en el cerebro de ratas, estimula una
respuesta de alimentación (Qu et al., Nature,
380:243-247 [1996]). Aunque la MCH no tiene
homología de la secuencia aminoácida con el agutí, los anticuerpos
frente a MCH reconocen también epítopes en el agutí, y la MCH
presenta tambíen actividad antagonista en el receptor MC1.
A la vista de la variedad de trastornos
fisiológicos y enfermedades (obesidad, insulinemia, diabetes) en las
que se ha implicado a la MCH y al agutí, y a la vista del hecho de
que el agutí y la MCH antagonizan los receptores MC, existe una
necesidad de identificar y analizar genes y proteínas relacionados
en el estado de la técnica, que puedan estar implicados en estos
mismos trastornos.
Consecuentemente, un objeto de la invención es
proporcionar un compuesto que pueda modular, bien directa o
indirectamente, la señalización del receptor de melanocortina, los
niveles de calcio intracelulares y/o la composición grasa del cuerpo
(como el nivel de tejido adiposo y/o su distribución, los niveles de
glucosa circulante y/o los niveles de insulina).
Un objeto adicional de la invención es
proporcionar un compuesto que puede incrementar la absorción de
alimento.
Éste y otros objetivos serán evidentes en seguida
para un técnico medio en la materia.
En una realización, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado
del grupo formado por:
- (a)
- la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº:4;
- (b)
- la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº:5;
- (c)
- la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº:6;
- (d)
- la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº:9:
- (e)
- una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:7;
- (f)
- una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:8;
- (g)
- una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:10;
- (h)
- una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:11;
- (i)
- una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico, al menos en un 70 por ciento, a los polipéptidos de SEQ ID Nº:7, SEQ ID Nº:8, SEQ ID Nº:10 o SEQ ID Nº:11, teniendo dicho polipéptido la actividad biológica de incrementar la absorción de alimento en un mamífero; y
- (j)
- una molécula de ácido nucleico que es el complemento de cualquiera de (a)-(i) anteriores
En otra realización, la invención proporciona un
vector que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada del
grupo indicado anteriormente, y una célula hospedadora que comprende
el vector.
En otra realización adicional, la invención
proporciona un procedimiento para producir un polipéptido
relacionado con el agutí (ART), que comprende las siguientes
etapas:
(a) expresar un polipéptido codificado por un
ácido nucleico seleccionado del grupo indicado anteriormente, en el
que el ácido nucleico se ha insertado en un hospedador adecuado;
y
(b) aislar el polipéptido.
La invención proporciona además un polipéptido
relacionado con el agutí (ART), seleccionado del grupo formado
por:
(a) el polipéptido de SEQ ID Nº:7;
(b) el polipéptido de SEQ ID Nº:8;
(c) el polipéptido de SEQ ID Nº:10;
(d) el polipéptido de SEQ ID Nº:11:
(e) un fragmento biológicamente activo del
polipéptido de (a), (b), (c) o (d), teniendo dicho fragmento la
actividad biológica de incrementar la absorción de alimento en un
mamífero; y
(f) un polipéptido que es idéntico, al menos en
un 70 por ciento, al polipéptido relacionado con el agutí (ART) de
una cualquiera de (a) a (d), teniendo dicho polipéptido la actividad
biológica de incrementar la absorción de alimento en un mamífero, en
el que el polipéptido relacionado con el agutí (ART), puede poseer o
no una metionina amino-terminal.
Asimismo, se describe un método para incrementar
la absorción de alimento en un mamífero, que comprende administrar
un polipéptido relacionado con el agutí (ART) al mamífero.
Las Figuras 1A y 1B representan la secuencia del
DNA genómico de ART humano (SEQ ID Nº:4).
La Figura 2 representa el DNAc de ART procedente
de tejido cerebral humano (SEQ ID Nº:5).
La Figura 3 representa el DNAc de ART procedente
de tejidos periféricos humanos (SEQ ID Nº:6).
La Figura 4 representa la secuencia aminoácida
totalmente traducida del DNAc de ART humano (SEQ ID Nº:7).
La Figura 5 representa un polipéptido ART humano
truncado (SEQ ID Nº:8).
La Figura 6 representa una transferencia Northern
de varios tejidos humanos, según se indica. La transferencia empleó
una sonda con un DNAc de ART, según se describe en los Ejemplos.
La Figura 7 representa el DNA genómico del ratón,
empezando con el exón 2 (el primer exón codificador) y también
contiene los exones 3 y 4, así como los correspondientes intrones
(SEQ ID Nº:9).
La Figura 8 representa la secuencia aminoácida
completa traducida del DNAc de ART de ratón (SEQ ID Nº:10).
La Figura 9 representa la secuencia aminoácida de
un polimorfismo del gen ART humano. Como es evidente, el aminoácido
en posición 45 (Leu en la Figura 4) es Pro en esta secuencia
polimórfica (SEQ ID Nº:11).
La Figura 10 es un gráfico del patrón de
comportamiento alimentario de ratas a las que se ha inyectado el
polipéptido ART humano. El eje X representa el tiempo tras la
inyección de ART al cual se midió la absorción de alimento; el eje Y
representa la cantidad acumulativa de alimento consumido en gramos.
A las ratas se les inyecto PBS solo (testigo, ART sin plegar
(testigo), 0,075, 0,3, 3,0 ó 7,5 nmol de ART plegado, en un volumen
de aproximadamente 2 \mul. Se indican las líneas de error
estándar. El análisis estadístico de los datos, en su caso, se
indica como: *=ps<0,006-0,001 frente a PBS, y
#=ps<0,01-0,0001 frente a ART sin plegar.
Según se usa aquí, el término "ART", cuando
se usa para describir una molécula de ácido nucleico, se refiere a
una molécula de ácido nucleico o su fragmento que (a) tiene la
secuencia nucleotídica según se indica en SEQ ID Nº:4, SEQ ID Nº:5,
o SEQ ID Nº:6; (b) tiene una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido que es idéntico, al menos en un 70 por
ciento, preferiblemente idéntico al menos en un 80 por ciento, y más
preferiblemente idéntico al menos en un 90 por ciento, al
polipéptido codificado por cualquiera de las SEQ ID N^{OS}: 4, 5 ó
6; (c) es una variante alélica presente en la naturaleza de (a) o
(b); (d) es una variante de ácido nucleico de (a)-(c), producida
según se indica aquí; y/o (e) es complementaria a (a)-(d).
El porcentaje de identidad de secuencia se puede
determinar mediante métodos estándar que se usan normalmente para
comparar la semejanza en posición de los aminoácidos de dos
polipéptidos. Usando un programa de ordenador como BLAST o FASTA, se
alinean dos polipéptidos para una coincidencia óptima de sus
aminoácidos respectivos (bien a lo largo de toda la longitud de una
o ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de
una o ambas secuencias). Los programas proporcionan un valor de
corrección inicial por defecto y un valor de corrección de hueco por
defecto, y se puede usar una matriz de puntuación como PAM 20 (una
matriz de puntuación estándar; véase Dayhoff et al., en:
Atlas of protein sequence and structure, vol. 5, suplemento 3
[1978]), conjuntamente con el programa de ordenador. El porcentaje
de identidad se puede calcular entonces como:
Los polipéptidos que son idénticos, al menos en
un 70 por ciento, tendrán típicamente una o más sustituciones,
deleciones y/o inserciones de aminoácidos. Normalmente, las
sustituciones serán conservativas, de forma que tendrán poco o
ningún efecto sobre la carga neta total, polaridad o hidrofobicidad
de la proteína. Las sustituciones conservativas se indican en la
Tabla I debajo:
| Básicos: | arginina | |
| lisina | ||
| histidina | ||
| Ácidos: | ácido glutámico | |
| ácido aspártico | ||
| Polares: | glutamina | |
| asparagina | ||
| Hidrófobos: | leucina | |
| isoleucina | ||
| valina | ||
| Aromáticos: | fenilalanina | |
| triptófano | ||
| tirosina | ||
| Pequeños: | glicina | |
| alanina | ||
| serina | ||
| treonina | ||
| metionina |
El término "condiciones restrictivas" se
refiere a la hibridación y lavado en condiciones que permiten sólo
la unión de una molécula de ácido nucleico como un oligonucleótido o
una sonda de molécula de DNAc a secuencias altamente homólogas. Una
solución de lavado restrictiva es NaCl 0,015 M, citrato sódico 0,005
M y SDS al 0,1 por ciento, usado a una temperatura de
55ºC-65ºC. Otra solución de lavado restrictiva es
SSC 0,2 X y SDS al 0,1 por ciento, usada a una temperatura de
50ºC-65ºC. Cuando se usan sondas oligonucleotídicas
para escrutar genotecas o bibliotecas de DNAc, se pueden usar las
siguientes condiciones de lavado restrictivas. Un protocolo usa SSC
x 6 con pirofosfato sódico al 0,05 por ciento a una temperatura de
35ºC-62ºC, dependiendo de la longitud de la sonda
oligonucleotídica. Por ejemplo, sondas de 14 pares de bases se lavan
a 35-40ºC, sondas de 17 pares de bases se lavan a
45-50ºC, sondas de 20 pares de bases se lavan a
52-57ºC y sondas de 23 pares de bases se lavan a
57-63ºC. La temperatura se puede incrementar
2-3ºC, cuando la unión inespecífica de fondo parece
elevada. Un segundo protocolo utiliza cloruro de
tetrametil-amonio (TMAC) para lavar las sondas
oligonucleotídicas. Una solución de lavado restrictiva es TMAC 3 M,
Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y SDS al 0,2 por ciento. La
temperatura de lavado que usa esta solución está en función de la
longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases se
lava a aproximadamente 45-50ºC.
El término "proteína ART" o "polipéptido
ART", según se usa aquí, se refiere a cualquier proteína o
polipéptido que tiene las propiedades descritas aquí para ART. El
polipéptido ART puede o no tener una metionina
amino-terminal, dependiendo de la forma en que se
prepare. A modo de ilustración, la proteína ART o el polipéptido ART
incluye una secuencia aminoácida codificada por la molécula de ácido
nucleico indicada en cualquiera de los artículos (a)-(e) anteriores
y fragmentos peptídicos o polipeptídicos derivados de la misma; la
secuencia aminoácida indicada en SEQ ID N^{os}: 7 ó 8 y/o
derivados modificados químicamente, así como sus variantes de
secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos, como las
proporcionadas aquí.
Según se usa aquí, el término "fragmento
ART" se refiere a un péptido o polipéptido que es menor que la
secuencia aminoácida completa de la proteína ART presente en la
naturaleza, pero tiene sustancialmente la misma actividad biológica
que el polipéptido ART o la proteína ART descritos anteriormente.
Tal fragmento puede estar truncado en el extremo amino, el extremo
carboxilo y/o internamente, y puede estar modificada químicamente.
Preferiblemente, el fragmento ART será un fragmento
carboxilo-terminal que retenga al menos los 10
residuos de cisteína C-terminales. Tales fragmentos
ART se pueden preparar con o sin metionina
amino-terminal. Un fragmento ART preferido se
muestra en SEQ ID Nº:8.
Según se usa aquí, el término "derivado de
ART" o "variante de ART", se refiere a un polipéptido ART o
proteína ART que: 1) se ha modificado químicamente, como por ejemplo
mediante la adición de polietilenglicol u otro compuesto y/o 2)
contiene una o mas sustituciones, deleciones y/o inserciones de
secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos.
Según se usan aquí, los términos "polipéptido
biológicamente activo" y "fragmento biológicamente activo"
se refieren a un péptido o polipéptido que tiene actividad ART (es
decir, es capaz de modular la actividad señalizadora de un receptor
de melanocortina, es capaz de modular los niveles de calcio
intracelulares, y/o es capaz de modular el metabolismo
lipídico).
Según se usan aquí, los términos "polipéptido
biológicamente activo" y "fragmento biológicamente activo",
se refieren a un péptido o polipéptido que tiene actividad ART (es
decir, es capaz de modular la actividad señalizadora de un receptor
de melanocortina, es capaz de modular los niveles de calcio
intracelulares y/o es capaz de modular el metabolismo lipídico).
Según se usan aquí, los términos "cantidad
efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva", se
refieren a la cantidad de ART necesaria para mantener una o más
actividades biológicas de ART, como se mostró anteriormente.
Los polipéptidos ART que se usan en la puesta en
práctica de la presente invención pueden ser polipéptidos completos
existentes en la naturaleza, o polipéptidos o péptidos truncados (es
decir, "fragmentos"). Los polipéptidos o fragmentos pueden
estar modificados químicamente, es decir, glicosilados, fosforilados
y/o ligados a un polímero, según se describe más adelante, y pueden
tener una metionina amino-terminal, dependiendo de
como se preparen. Además, los polipéptidos o fragmentos pueden ser
variantes del polipéptido ART existente en la naturaleza (es decir,
pueden contener una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones
de aminoácidos, comparadas con el ART existente en la
naturaleza).
El polipéptido ART completo o su fragmento se
puede preparar usando métodos de tecnología de DNA recombinante como
los indicados en Sambrook et al. (Molecular cloning: a
laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY [1989]) y/o Ausubel et al, editores,
(Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc
y Wiley and Sons, NY [1994]). Se puede obtener un gen o DNAc que
codifique la proteína ART o su fragmento, por ejemplo escrutando una
genoteca o biblioteca de DNAc, o mediante amplificación por PCR.
Alternativamente, se puede preparar un gen que codifique para el
polipéptido ART o su fragmento mediante síntesis química, usando
métodos bien conocidos para el experto en la técnica, como los
descritos por Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed.,
28:716-734 [1989]). Estos métodos incluyen, entre
otros, los métodos del fosfotriéster, fosforamidita, y
H-fosfonato para la síntesis de ácidos nucleicos. Un
método preferido para dicha síntesis química es la síntesis
mantenida por polímero, usando química de fosforamidita estándar.
Típicamente, el DNA que codifica para el polipéptido ART tendrá
varios cientos de nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos
mayores de aproximadamente 100 nucleótidos se pueden sintetizar como
varios fragmentos, usando estos métodos. Los fragmentos se pueden
ligar entre sí para formar el polipéptido ART completo. Normalmente,
el fragmento de DNA que codifica el extremo amino del polipéptido,
tendrá un ATG, que codifica un residuo de metionina. Esta metionina
puede estar o no presente en la forma madura del polipéptido ART,
dependiendo de si el polipéptido producido en la célula hospedadora
se secreta desde esa célula.
En algunos casos, puede ser deseable preparar
variantes de ácido nucleico y/o aminoácido de ART. Las variantes de
ácido nucleico (en las que se diseñan uno o más nucleótidos para que
se diferencien del tipo de ART silvestre o existente en la
naturaleza) se pueden producir usando mutagénesis dirigida o
amplificación PCR, en la que el cebador o cebadores tienen las
mutaciones puntuales deseadas (véase Sambrook et al., arriba,
y Ausubel et al., arriba, para descripciones de las técnicas
de mutagénesis). Los métodos que usan síntesis química descritos por
Engels et al., arriba, también se pueden usar para preparar
tales variantes. También se pueden usar otros métodos conocidos para
el experto en la técnica. Las variantes de ácido nucleico preferidas
son aquellas que contienen sustituciones de nucleótidos responsables
de la preferencia de codón en la célula hospedadora que se va a usar
para producir ART. Otras variantes preferidas son aquellas que
codifican para cambios de aminoácidos conservativos (p.ej., en los
que la carga o polaridad de la cadena lateral aminoácida existente
en la naturaleza no se altera sustancialmente por sustitución con un
aminoácido diferente), comparados con el tipo silvestre, y/o
aquellas diseñadas para generar un punto o puntos nuevos de
glicosilación y/o fosforilación en ART, o aquellas diseñadas para
eliminar un punto o puntos de glicosilación y/o fosforilación
existentes en ART.
El gen o DNAc de ART se pueden insertar en un
vector de expresión apropiado para su expresión en una célula
hospedadora. El vector se selecciona para que sea funcional en la
célula hospedadora particular empleada (es decir, el vector es
compatible con la maquinaria de la célula hospedadora, de forma que
se pueda producir la amplificación y/o expresión del gen ART). El
polipéptido ART o su fragmento se pueden amplificar/expresar en
levadura procariota, células hospedadoras de insectos (sistemas de
baculovirus) y/o eucariotas. La selección de la célula hospedadora
dependerá, al menos en parte, de si el polipéptido ART o su
fragmento se tiene que glicosilar. Si es así, se prefieren las
células hospedadoras de levadura, insectos o mamíferos; las células
de levadura glicosilarán el polipéptido, y las células de mamíferos
e insectos pueden glicosilar y/o fosforilar el polipéptido, como
ocurre en la naturaleza en el polipéptido ART (es decir,
glicosilación y/o fosforilación "nativa").
Típicamente, los vectores usados en cualquiera de
las células hospedadoras contendrán una secuencia flanqueadora en 5'
(también denominada "promotor") y otros elementos reguladores,
así como un intensificador o intensificadores, un elemento origen de
replicación, un elemento de terminación transcripcional, una
secuencia de intrón completa que contenga un punto de escisión de
donador y aceptor, una secuencia de péptido señal, un elemento de
punto de unión del ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una
región de policonector para insertar el ácido nucleico que codifica
el polipéptido a expresar, y un elemento marcador seleccionable.
Cada uno de estos elementos se analiza más adelante. Opcionalmente,
el vector puede contener una secuencia "marcadora", es decir,
una secuencia oligonucleotídica localizada en el extremo 5' ó 3' de
la secuencia que codifica ART, que codifica poliHis (como hexaHis) u
otra secuencia inmunógena pequeña. Este marcador se expresará junto
con la proteína, y puede servir como un marcador de afinidad para la
purificación del polipéptido ART procedente de la célula
hospedadora. Opcionalmente, el marcador se puede eliminar
posteriormente del polipéptido ART purificado mediante diversos
medios, como por ejemplo usando una peptidasa seleccionada.
La secuencia flanqueadora 5' puede ser homóloga
(es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula hospedadora),
heteróloga (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa
de la célula hospedadora), híbrida (es decir, una combinación de
secuencias flanqueadoras 5' de más de una fuente), sintética, o
puede ser la secuencia flanqueadora 5' del ART nativo. Como tal, la
fuente de la secuencia flanqueadora 5' puede ser un organismo
procariota unicelular o eucariota, cualquier organismo vertebrado o
invertebrado o cualquier planta, con la condición de que la
secuencia flanqueadora 5' sea funcional en la maquinaria de la
célula hospedadora y pueda ser activada por la misma.
Las secuencias flanqueadoras 5' útiles en los
vectores de esta invención pueden obtenerse por cualquiera de los
diversos métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente,
secuencias flanqueadoras 5' útiles aquí, distintas de la secuencia
flanqueadora 5' de ART, se habrán identificado previamente mediante
mapeo y/o mediante digestión con endonucleasa de restricción y, por
tanto, se pueden aislar desde la propia fuente de tejido, usando las
endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, se puede
conocer la secuencia nucleotídica completa de la secuencia
flanqueadora 5'. Aquí, la secuencia flanqueadora 5' se puede
sintetizar usando los métodos descritos anteriormente para la
síntesis o clonación de ácidos nucleicos.
Cuando se conoce toda la secuencia flanqueadora
5' o sólo una parte, se puede obtener usando PCR y/o escrutando una
genoteca con oligonucleótidos apropiados y/o fragmentos de secuencia
flanqueadora 5' de la misma especie o de otras.
Cuando la secuencia flanqueadora 5' no se conoce,
se puede aislar un fragmento de DNA que contenga una secuencia
flanqueadora 5', de un tramo mayor de DNA que puede contener, por
ejemplo, una secuencia codificadora o incluso otro gen o genes. El
aislamiento se puede lograr mediante digestión con endonucleasa de
restricción, usando una o más enzimas seleccionadas cuidadosamente
para aislar el fragmento de DNA apropiado. Tras la digestión, el
fragmento deseado se puede aislar mediante purificación en gel de
agarosa, columna de Qiagen® u otros métodos conocidos por el experto
en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este
propósito será inmediatamente evidente para el técnico medio en la
materia.
El elemento origen de replicación es típicamente
una parte de vectores de expresión procariotas adquiridos en el
comercio, y ayuda a la amplificación del vector en una célula
hospedadora. La amplificación del vector hasta un cierto número de
copias puede ser importante, en algunos casos, para la expresión
óptima del polipéptido ART. Si el vector elegido no contiene un
punto de origen de replicación, se puede sintetizar uno químicamente
basándose en una secuencia conocida, y ligarlo en el vector.
El elemento de terminación de la transcripción se
localiza típicamente 3' respecto al extremo de la secuencia que
codifica el polipéptido ART, y sirve para terminar la transcripción
del polipéptido ART. Normalmente, el elemento de terminación de la
transcripción en células procariotas es un fragmento rico en
G-C, seguido por una secuencia poli T. Aunque el
elemento se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso se
puede comprar como parte de un vector, también se puede sintetizar
fácilmente usando métodos de síntesis de ácidos nucleicos, como los
descritos anteriormente.
Un elemento de gen marcador seleccionable
codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento
de una célula hospedadora, cultivada en un medio de cultivo
selectivo. Genes marcadores de selección típicos codifican proteínas
que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas,
p.ej., ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células
procariotas; (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula
o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles de medios
complejos. Marcadores seleccionables preferidos son el gen de
resistencia de la kanamicina, el gen de resistencia de la
ampicilina, y el gen de resistencia de la tetraciclina.
El elemento de unión al ribosoma, llamado
normalmente secuencia de Shine-Dalgarno
(procariotas) o secuencia de Kozak (eucariotas), es necesario para
la iniciación de la traducción del RNAm. El elemento está localizado
típicamente 3' respecto del promotor y 5' respecto de la secuencia
codificadora del polipéptido ART que se va a sintetizar. La
secuencia de Shine-Dalgarno es variada pero es
típicamente una polipurina (es decir, que tiene un elevado contenido
de A-G). Se han identificado muchas secuencias de
Shine-Dalgarno, cada una de las cuales se puede
sintetizar fácilmente usando métodos indicados anteriormente, y se
puede usar en un vector procariota.
En aquellos casos en los que es deseable que se
secrete ART desde la célula hospedadora, se puede usar una secuencia
señal para dirigir el polipéptido ART fuera de la célula hospedadora
en la que se sintetiza. Típicamente, la secuencia señal se sitúa en
la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico ART, o
directamente en el extremo 5' de la región codificadora de ART. Se
han identificado muchas secuencias señal, y cualquiera de ellas que
sea funcional en la célula hospedadora se puede usar conjuntamente
con el gen ART. Por tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o
heteróloga al polipéptido ART, y puede ser homóloga o heteróloga al
polipéptido ART . Adicionalmente, la secuencia señal se puede
sintetizar químicamente usando métodos descritos anteriormente. En
la mayoría de los casos, la secreción del polipéptido desde la
célula hospedadora a través de la presencia de un péptido señal,
producirá la eliminación de la metionina
amino-terminal del polipéptido.
En muchos casos, la transcripción del polipéptido
ART se incrementa por la presencia de uno o más intrones en el
vector; esto es particularmente cierto para células hospedadoras
eucariotas, especialmente células hospedadoras de mamífero. El
intrón puede existir en la naturaleza en la secuencia de ácido
nucleico de ART, especialmente cuando la secuencia ART usada es una
secuencia genómica completa o uno de sus fragmentos. Cuando el
intrón no existe en la naturaleza en la secuencia de DNA de ART
(como para la mayoría de los DNAc), el intrón o intrones se pueden
obtener de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la
secuencia flanqueadora 5' y la secuencia codificadora de ART, es
importante, ya que el intrón se debe transcribir para ser efectivo.
De forma similar, cuando la secuencia de ácido nucleico ART es una
secuencia de DNAc, la posición preferida para el intrón es 3'
respecto del punto de iniciación de la transcripción, y 5' respecto
de la secuencia de poliA, de terminación de la transcripción.
Preferiblemente, para DNAc de ART, el intrón se localizará a un lado
u otro (es decir, 5' ó 3') de la secuencia codificadora de ART, de
forma que no interrumpa esta secuencia codificadora. Cualquier
intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo vírico,
procariota o eucariota (planta o animal), se puede usar para poner
en práctica esta invención, con la condición de que sea compatible
con la célula o células hospedadoras en las que se inserte. También
se incluyen aquí intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede usar
más de un intrón en el vector.
Cuando uno o más de los elementos indicados
anteriormente no están ya presentes en el vector que se va a usar,
se pueden obtener individualmente y ligarlos en el vector. Los
métodos usados para obtener cada uno de los elementos son bien
conocidos para el experto en la técnica, y son comparables con los
métodos indicados anteriormente (es decir, síntesis de DNA,
escrutinio de bibliotecas, y similares).
Los vectores finales usados para poner en
práctica esta invención, se construyen típicamente a partir de
vectores de partida, como un vector disponible en el comercio. Tales
vectores pueden o no contener algunos de los elementos destinados a
estar incluidos en el vector completo. Si ninguno de los elementos
deseados está presente en el vector de partida, cada elemento se
puede ligar individualmente en el vector, cortando el vector con la
endonucleasa o endonucleasas de restricción apropiadas, de forma que
los extremos del elemento se liguen en el interior del vector y los
extremos del vector sean compatibles para el ligamiento. En algunos
casos puede ser necesario "hacer romos" los extremos a ligar
entre sí, a fin de obtener un ligamiento satisfactorio. La obtención
de extremos romos se logra rellenando primeramente los "extremos
pegajosos", usando DNA-polimerasa de Klenow o
DNA-polimerasa de T4, en presencia de los cuatro
nucleótidos. Este procedimiento se conoce bien en la técnica y se
describe por ejemplo en Sambrook et al., arriba.
Alternativamente, dos o más de los elementos a
insertar en el vector se pueden ligar primeramente entre sí (si se
van a colocar adyacentes entre sí) y luego ligarlos en el
vector.
Otro método para construir el vector es realizar
todos los ligamientos de los distintos elementos simultáneamente en
una mezcla de reacción. En este caso, se pueden generar muchos
vectores no funcionales o sin sentido, debido al ligamiento o
inserción inadecuada de los elementos, aunque el vector funcional se
puede identificar y seleccionar mediante digestión con endonucleasa
de restricción.
Los vectores preferidos para poner en práctica
esta invención son aquellos que sean compatibles con células
hospedadoras bacterianas, de insectos y de mamíferos. Tales vectores
incluyen, entre otros, pCRII (Invitrogen Company, San Diego, CA),
pBSII (Stratagene Company, LaJolla, CA) y pETL (BlueBacII;
Invitrogen).
Una vez que se ha construido el vector y el ácido
nucleico ART se ha insertado en el punto apropiado del vector, el
vector completo se puede insertar en una célula hospedadora adecuada
para amplificación y/o expresión del polipéptido ART.
Las células hospedadoras pueden ser células
hospedadoras procariotas (como E. Coli) o eucariotas (como
una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de
vertebrado). La célula hospedadora, cuando se cultiva en condiciones
apropiadas, puede sintetizar proteína ART que puede recogerse
posteriormente del medio de cultivo (si la célula hospedadora la
secreta al medio), o directamente de la célula hospedadora que la
produce (si no se secreta). Tras la recogida, la proteína ART se
puede purificar usando métodos como la cromatografía de tamiz
molecular, cromatografía de afinidad y similares.
La selección de la célula hospedadora dependerá
en parte de si la proteína ART se tiene que glicosilar o fosforilar
(en cuyo caso se prefieren las células hospedadoras eucariotas), y
de la forma en que la célula hospedadora es capaz de "plegar"
la proteína en su estructura terciaria nativa (p.ej. orientación
adecuada de puentes disulfuro, etc.), de forma que la célula prepara
la proteína biológicamente activa. Sin embargo, cuando la célula
hospedadora no sintetiza ART biológicamente activa, la ART se puede
plegar después de la síntesis, usando condiciones químicas
apropiadas, como se analiza más adelante.
Células o líneas celulares apropiadas pueden ser
células de mamífero, como células de ovario de hamster chino (CHO) o
células 3T3. La selección de células hospedadoras de mamífero
adecuadas y métodos de transformación, cultivo, amplificación,
escrutinio y producción y purificación del producto se conocen en la
técnica. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas son las líneas
celulares COS-1 y COS-7 de mono, y
la línea celular CV-1. Células hospedadoras de
mamífero ejemplares adicionales incluyen líneas celulares de
primates y líneas celulares de roedores, incluyendo líneas celulares
transformadas. También son adecuadas células diploides normales,
cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido
primario, así como explantes primarios. Las células candidatas
pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o
pueden contener un gen de selección que actúe de forma dominante.
Otras líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen, pero no
están limitadas a, HeLa, células L-929 de ratón,
líneas 3T3 derivadas de líneas celulares de ratones Swiss,
Balb-c o NIH y líneas celulares de hamster BHK o
HaK.
De manera similar, las células bacterianas son
útiles como células hospedadoras para la presente invención. Por
ejemplo, las diversas cepas de E. Coli (p.ej., HB101,
DH5\alpha, DH10, y MC1061) se conocen bien como células
hospedadoras en el campo de biotecnología. Se pueden emplear en este
método varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otras
Bacillus spp., Streptomyces spp. y similares.
También están disponibles muchas cepas de células
de levaduras conocidas para los expertos en la técnica, como células
hospedadoras para la expresión de los polipéptidos de la presente
invención. Adicionalmente, cuando se desee, se pueden utilizar
células de insectos como células hospedadoras en el método de la
presente invención (Miller et al., Genetic engineering
8: 277-298 [1986]).
La inserción (también denominada
"transformación" o "transfección") del vector en la célula
hospedadora seleccionada, se puede lograr usando métodos tales como
cloruro cálcico, electroporación, microinyección, lipofección o el
método del DEAE-dextrano. El método seleccionado en
parte estará en función del tipo de célula hospedadora que se va a
usar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos
para el experto en la técnica, y se muestran, por ejemplo, en
Sambrook et al., arriba.
Las células hospedadoras que contienen el vector
(es decir, transformadas o transfectadas), se pueden cultivar usando
medios estándar bien conocidos para el experto en la técnica. Los
medios contendrán normalmente todos los nutrientes necesarios para
el crecimiento y supervivencia de las células. Medios adecuados para
cultivar células de E. Coli son, por ejemplo, caldo de Luria
(LB) y/o caldo Terrific (TB). Medios adecuados para cultivar células
eucariotas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales se pueden
complementar con suero y/o factores de crecimiento, según se
requiera por la línea celular particular que se esté cultivando. Un
medio adecuado para cultivos de insectos es el medio de Grace,
complementado con extracto acuoso de levadura, hidrolizado de
lactalbúmina y/o suero bovino fetal, según se precise.
Típicamente, sólo se añade como complemento a los
medios un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento
selectivo de las células transformadas. El compuesto a usar se
determinará por el elemento marcador seleccionable presente en el
plásmido con el que se transformó la célula hospedadora. Por
ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es la resistencia
a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será
kanamicina.
La cantidad de polipéptido ART producida en la
célula hospedadora se puede evaluar usando métodos estándar
conocidos en el estado de la técnica. Tales métodos incluyen, sin
limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel
de poliacrilamida-SDS, electroforésis en gel no
desnaturalizante, separación HPLC, inmunoprecipitación y/o ensayos
de actividad, como ensayos de unión de DNA y desplazamiento en
gel.
Si el polipéptido ART se ha diseñado para que se
secrete desde las células hospedadoras, la mayoría del polipéptido
se encontrará probablemente en el medio de cultivo celular. Los
polipéptidos preparados de esta forma no poseerán típicamente una
metionina amino-terminal, ya que está se elimina
durante la secreción desde la célula. Sin embargo, si el polipéptido
ART no se secreta desde las células hospedadoras, estará presente en
el citoplasma (para células hospedadoras eucariotas, bacterias
gram-positivas y células hospedadoras de insectos) o
en el periplasma (para células hospedadoras de bacterias
gram-negativas), y puede tener una metionina
amino-terminal.
Para proteína ART intracelular, típicamente, las
células hospedadoras primero se disgregan mecánica u osmóticamente
para liberar los contenidos citoplasmáticos en una solución
tamponada. El polipéptido ART se puede aislar entonces de esta
solución.
La purificación del polipéptido ART desde la
solución se puede lograr usando diversas técnicas. Si el polipéptido
se ha sintetizado de forma que contenga un marcador, como
hexahistidina (ART/hexaHis) u otro péptido pequeño, bien en su
extremo carboxilo o amino, se puede purificar esencialmente en un
proceso de una etapa, haciendo pasar la solución a través de una
columna de afinidad, en la que la matriz de la columna tiene una
elevada afinidad para el marcador o para el polipéptido directamente
(es decir, un anticuerpo monoclonal que reconozca específicamente
ART). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y
especificidad al níquel, por tanto se puede usar una columna de
afinidad de níquel (como las columnas de níquel de Quiagen), para la
purificación de ART/poliHis. (Véase por ejemplo, Ausubel et
al., editores, Current protocols in molecular biology,
sección 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).
Cuando el polipéptido ART no tiene marcador y no
hay anticuerpos disponibles, se pueden usar otros procedimientos
bien conocidos para purificación. Tales procedimientos incluyen, sin
limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de
tamiz molecular, HPLC, electroforesis en gel nativo, en combinación
con elución en gel e isoelectroenfoque preparativo (técnica/máquina
"Isoprime", Hoefer Scientific). En algunos casos, se pueden
combinar dos o más de estas técnicas para lograr una pureza
incrementada. Métodos preferidos de purificación incluyen el marcaje
con poliHistidina y la cromatografía de intercambio iónico, en
combinación con el isoelectroenfoque preparativo.
Si se anticipa que el polipéptido ART se
encuentra principalmente en el espacio periplásmico de las bacterias
o el citoplasma de las células eucariotas, los contenidos del
periplasma o citoplasma, incluyendo los cuerpos de inclusión (p.ej.
bacterias gram-negativas) si el polipéptido tratado
ha formado tales complejos, se pueden extraer de la célula
hospedadora usando cualquier técnica estándar conocida por el
experto en la técnica. Por ejemplo, las células hospedadoras se
pueden lisar para liberar los contenidos del periplasma mediante una
prensa francesa, homogeneización y/o tratamiento con ultrasonidos.
Luego, el homogeneizado se puede centrifugar.
Si el polipéptido ART ha formado cuerpos de
inclusión en el periplasma, los cuerpos de inclusión pueden unirse a
menudo a las membranas celulares internas y/o externas y, por tanto,
se encontrarán principalmente en el material de los glóbulos, tras
la centrifugación. El material de los glóbulos se puede tratar
después con un agente caotrópico, como guanidina o urea para
liberar, disgregar y solubilizar los cuerpos de inclusión. El
polipéptido ART, ahora en su forma soluble, se puede analizar
entonces usando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o
similares. Si se desea aislar el polipéptido ART, se puede lograr el
aislamiento usando métodos estándar, como los indicados más adelante
y en Marston et al., (Meth. Enz.,
182:264-275 [1990]).
Si los cuerpos de inclusión del polipéptido ART
no se forman hasta un grado significativo en el periplasma de la
célula hospedadora, el polipéptido ART se encontrará principalmente
en el sobrenadante, tras la centrifugación del homogeneizado
celular, y el polipéptido ART se puede aislar del sobrenadante
usando métodos como los indicados más adelante.
En aquellas situaciones en las que es preferible
aislar parcial o completamente el polipéptido ART, la purificación
se puede lograr usando métodos estándar bien conocidos por el
experto en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación,
separación por electroforesis seguida de electroelución, varios
tipos de cromatografía (inmunoafinidad, tamiz molecular y/o
intercambio iónico), y/o cromatografía líquida de alta presión. En
algunos casos, puede ser preferible usar más de uno de estos métodos
para la purificación completa.
Además de preparar y purificar el polipéptido ART
usando técnicas de DNA recombinante, los polipéptidos ART, sus
fragmentos y/o derivados se pueden preparar por métodos de síntesis
química (como síntesis peptídica en fase sólida), usando métodos
conocidos en la técnica, como los indicados por Merrifield et
al., (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1964]), Houghten et
al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82:5132 [1985]), y
Stewart y Young (Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem.
Co. , Rockford, IL [1984]). Tales polipéptidos se pueden sintetizar
con o sin metionina en el extremo amino. Los polipéptidos ART o sus
fragmentos, sintetizados químicamente se pueden oxidar usando
métodos indicados en estas referencias, para formar puentes
disulfuro. Los polipéptidos ART o sus fragmentos se pueden emplear
como sustitutos inmunológicos o biológicamente activos para
polipéptidos ART naturales, purificados, en procesos terapéuticos e
inmunológicos.
Las composiciones de ART modificado químicamente
(es decir, "derivadas"), en las que el polipéptido ART se
conecta con un polímero ("polímeros-ART") se
incluyen en el alcance de la presente invención. El polímero
seleccionado es típicamente hidrosoluble, de forma que la proteína a
la que está unido no precipita en medio acuoso, como un medio
fisiológico. El polímero seleccionado, normalmente se modifica para
que tenga un solo grupo reactivo, como un éster activo para
acilación, o un aldehído para alquilación, de forma que el grado de
polimerización se puede controlar, tal y como se prevé en los
presentes métodos. Un aldehído reactivo preferido es el
propionaldehído de polietilenglicol, que es estable en agua o sus
derivados monoalcoxi C1-C10 o ariloxi (véase patente
de EE.UU. 5.252.714). El polímero puede ser lineal o ramificado. En
el alcance de los polímeros-ART se incluye una
mezcla de polímeros. Preferiblemente, para el uso terapéutico de la
preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente
aceptable. El polímero hidrosoluble o su mezcla se puede seleccionar
del grupo formado por, por ejemplo, polietilenglicol (PEG),
monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u
otros polímeros basados en carbohidratos,
poli-(N-vinil-pirrolidona)
polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de
óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados
(p.ej., glicerol) y alcohol de polivinilo. Para las reacciones de
acilación, el polímero o polímeros seleccionados deberían tener un
único grupo éster reactivo. Para la alquilación reductora, el
polímero o polímeros seleccionados deberían tener un único grupo
aldehído reactivo. El polímero puede tener cualquier peso molecular
y puede ser lineal o ramificado.
La pegilación de ART se puede realizar mediante
cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en el estado de
la técnica, como se describe por ejemplo en las siguientes
referencias: Focus on growth factors 3(2):
4-10 (1992); EP-0154316 y
EP-0401384. Preferiblemente, la pegilación se
realiza a través de una reacción de acilación o una reacción de
alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un
polímero hidrosoluble reactivo análogo), como se describe más
adelante.
La pegilación por acilación implica generalmente
hacer reaccionar un derivado de éster activo de polietilenglicol
(PEG) con una proteína ART. Para realizar la pegilación de ART se
puede usar cualquier molécula de PEG reactiva conocida o descubierta
posteriormente. Un éster de PEG activado preferido es PEG
esterificado con N-hidroxisuccinimida ("NHS").
Según se usa aquí, se considera que "acilación" incluye sin
limitación los siguientes tipos de uniones entre ART y un polímero
hidrosoluble como PEG: amida, carbamato, uretano y similares, como
se describe en Bioconjugate Chem. 5:133-140
(1994). Las condiciones de reacción se pueden seleccionar de
cualquiera de las conocidas en la técnica de pegilación o aquellas
desarrolladas posteriormente, con el requisito de que se eviten las
condiciones tales como temperatura, disolvente y pH, que
inactivarían la sustancia ART a modificar.
La pegilación por acilación produce normalmente
un producto de ART polipegilado, en el que los grupos
\varepsilon-amino de lisina se pegilan a través de
un grupo acilo de unión. Preferiblemente, la unión de conexión será
una amida. También preferiblemente, el producto resultante será, al
menos aproximadamente en un 95 por ciento, mono, di- o tripegilado.
Sin embargo, se formarán normalmente algunas especies con grados
mayores de pegilación (hasta el número máximo de grupos
\varepsilon-aminoácido de lisina de ART más un
grupo \alpha-amino en el extremo amino de ART), en
cantidades dependientes de las condiciones de reacción específicas
usadas. Si se desea, se pueden separar especies pegiladas más
purificadas de la mezcla, particularmente especies que no han
reaccionado, mediante técnicas de purificación estándar, incluyendo,
entre otras, diálisis, desplazamiento salino, ultrafiltración,
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en
gel y electroforesis.
La pegilación por alquilación generalmente
implica hacer reaccionar un derivado aldehído terminal de PEG con
una proteína como ART, en presencia de un agente reductor.
Independientemente del grado de pegilación, los grupos PEG se unen
preferiblemente a la proteína mediante un grupo
-CH_{2}-NH-. Haciendo particular referencia al
grupo -CH_{2}-, este tipo de unión se denomina aquí unión
"alquilo".
La derivatización a través de alquilación
reductiva para producir un producto monopegilado, explota la
reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino
primarios (lisina frente a la N-terminal),
disponibles para derivatización en ART. Típicamente, la reacción se
realiza a un pH (ver más adelante) que permite beneficiarse de las
diferencias de pK_{a} entre los grupos
\varepsilon-amino de los residuos de lisina y los
del grupo \alpha-amino del residuo
N-terminal de la proteína. Mediante tal
derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero
hidrosoluble que contiene un grupo reactivo como un aldehído, a una
proteína: la conjugación con el polímero se produce
predominantemente en el extremo N-terminal de la
proteína, sin modificación significativa de otros grupos reactivos,
como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. La presente
invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de
moléculas conjugadas de proteína monopolímero-ART
(designando una proteína ART a la que se ha unido una molécula de
polímero, sustancialmente solo (es decir, al menos aproximadamente
95%) en una única localización sobre la proteína ART). Más
específicamente, si se usa polietilenglicol, la presente invención
proporciona también proteína ART pegilada que carece de grupos que
se unen a antígenos, y que tienen la molécula de polietilenglicol
acoplada directamente a la proteína ART.
Un polímero hidrosoluble particularmente
preferido para usarlo en la presente invención es el
polietilenglicol, abreviadamente PEG. Según se usa aquí, el
polietilenglicol se entiende que abarca cualquiera de las formas de
PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, como
mono-alcoxi(C1-C10)- o
ariloxi-polietilenglicol.
En general, la derivatización química se puede
realizar en cualquier condición adecuada usada para hacer reaccionar
una sustancia biológicamente activa con una molécula de polímero
activada. Los métodos para preparar ART pegilado comprenderán
generalmente las etapas de (a) hacer reacccionar un polipéptido ART
con polietilenglicol (como p.ej. un éster reactivo o un derivado
aldehído de PEG), en condiciones en las que ART se une a uno o más
grupos PEG y (b) obtener el producto o productos de reacción. En
general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de
acilación se determinarán basándose en parámetros conocidos y en el
resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción
PEG:proteína, mayor será el porcentaje de producto polipegilado.
La alquilación reductiva para producir una
población sustancialmente homogénea de molécula conjugada de
mono-polímero/proteína ART, comprenderá generalmente
las siguientes etapas: (a) hacer reaccionar una proteína ART con una
molécula de PEG reactiva, en condiciones de alquilación reductiva, a
un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo
\alpha-aminoácido en el extremo amino de dicha
proteína ART; y (b) obtener el producto o productos de reacción.
Para una población sustancialmente homogénea de
moléculas conjugadas de monopolímero/proteína ART, las condiciones
de reacción de alquilación reductiva son aquellas que permiten la
unión selectiva del resto polímero hidrosoluble al extremo
N-terminal del ART. Tales condiciones de reacción
proporcionan generalmente diferencias de pK_{a} entre los grupos
amino de lisina y el grupo \alpha-amino del
extremo N-terminal (siendo el pK_{a} el pH el que
50% de los grupos amino están protonados y 50% no lo están). El pH
también afecta a la proporción de polímero a proteína a usar. En
general, si el pH es inferior, se deseará un mayor exceso de
polímero frente a proteína (es decir, cuanto menos reactivo sea el
grupo \alpha-amino N-terminal, más
polímero se necesitará para lograr condiciones óptimas). Si el pH es
mayor, no se precisa que la proporción de polímero:proteína sea tan
elevada (es decir, están disponibles más grupos reactivos, por lo
que se necesitan menos moléculas de polímero). Para los fines de la
presente invención, el pH estará generalmente en el intervalo de
3-9, preferiblemente 3-6.
Otra consideración importante es el peso
molecular del polímero. En general, cuanto mayor sea el peso
molecular del polímero, menor número de moléculas de polímero
estarán unidas a la proteína. De forma similar, la ramificación del
polímero se tiene que tener en cuenta cuando se optimicen estos
parámetros. Generalmente, cuanto mayor sea el peso molecular (o
cuanto más ramificaciones), mayor será la proporción
polímero:proteína. En general, para las reacciones de pegilación
consideradas aquí, el peso molecular medio preferido es de
aproximadamente 2kDa a aproximadamente 100 kDa (indicando el término
"aproximadamente" \pm 1kDa). El peso molecular medio
preferido es de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa,
particularmente preferible de aproximadamente 12 kDa a
aproximadamente 25 kDa. La proporción de polímero hidrosoluble a
proteína ART variará generalmente de 1:1 a 100:1, preferiblemente
(para polipegilación) de 1:1 a 20:1 y (para monopegilación) de 1:1 a
5:1.
Usando las condiciones indicadas anteriormente,
la alquilación reductiva proporcionará la unión selectiva del
polímero a cualquier proteína ART que tenga un grupo
\alpha-amino en el extremo
amino-terminal, y proporcionará una preparación
sustancialmente homogénea de conjugado de monopolímero/proteína ART.
El término "conjugado de monopolímero/proteína ART" se usa aquí
para denominar una composición compuesta por una única molécula de
polímero unida a una molécula de proteína ART. El conjugado de
monopolímero/proteína ART tendrá preferiblemente una molécula de
polímero localizada en el extremo N-terminal, pero
no en los grupos amino laterales de lisina. La preparación será
preferiblemente más del 90% de conjugado de monopolímero/proteína
ART, y más preferiblemente más del 95% de conjugado de
monopolímero/proteína ART, quedando el resto de moléculas
observables sin reaccionar (es decir, proteína carente del resto de
polímero). Los ejemplos más adelante proporcionan una preparación
que es al menos aproximadamente 90% de conjugado de
monopolímero/proteína y aproximadamente 10% de proteína sin
reaccionar. El conjugado de monopolímero/proteína tiene actividad
biológica.
Para la presente alquilación reductiva, el agente
reductor debería ser estable en solución acuosa y, preferiblemente,
debería ser capaz de reducir sólo la base de Schiff formada en el
proceso inicial de alquilación reductiva. Los agentes reductores
preferidos se pueden seleccionar del grupo formado por borohidruro
sódico, cianoborohidruro sódico, borano de
dimetil-amina, borano de
trimetil-amina y borano de piridina. Un agente
reductor particularmente preferido es el cianoborohidruro
sódico.
Se pueden determinar otros parámetros de
reacción, como disolvente, tiempos de reacción, temperaturas, etc.,
y medios de purificación de productos, basándose en la información
publicada relativa a la derivatización de proteínas con polímeros
hidrosolubles.
Se puede preparar una mezcla de moléculas
conjugadas de polímero-proteína ART, mediante
métodos de acilación y/o alquilación, como se describió
anteriormente, y se puede seleccionar la proporción de conjugado de
monopolímero/proteína a incluir en la mezcla. Por tanto, si se
desea, se puede preparar una mezcla de varias proteínas con diversos
números de moléculas de polímero unidas (es decir, di-, tri-,
tetra-, etc.), y combinarla con el material conjugado de
monopolímero/proteína ART preparado usando los presentes
métodos.
Generalmente, las enfermedades que se pueden
aliviar o modular mediante la administración del presente
polímero/ART incluyen aquellas descritas aquí para las moléculas ART
en general. Sin embargo, las moléculas de polímero/ART aquí
descritas pueden tener actividades adicionales, actividades
incrementadas o reducidas, u otras características, comparadas con
las moléculas no derivatizadas.
Las moléculas de ácido nucleico ART, fragmentos
y/o derivados que no codifican polipéptidos por sí mismas, que son
activas en ensayos de actividad, pueden ser útiles como sondas de
hibridación en ensayos diagnósticos destinados a ensayar, bien
cualitativa o cuantitativamente, la presencia de DNA o RNA de ART en
muestras de tejidos o fluidos corporales de mamíferos.
Los fragmentos y/o derivados de polipéptido ART
que no son activos por sí mismos en ensayos de actividad, pueden ser
útiles como moduladores (p.ej. inhibidores o estimulantes) de los
receptores de ART in vitro o in vivo, o para preparar
anticuerpos frente a polipéptidos ART.
Los polipéptidos ART y sus fragmentos, estén o no
químicamente modificados, se pueden emplear solos o en combinación
con otras composiciones farmacéuticas, como, por ejemplo, factores
neurotróficos, citoquinas, interferones, interleuquinas, factores de
crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios, agonistas o
antagonistas y/o anticuerpos de receptores de neurotransmisores, en
el tratamiento de trastornos del sistema endocrino.
Los polipéptidos ART y/o sus fragmentos se pueden
usar para preparar anticuerpos generados mediante métodos estándar.
Por tanto, los anticuerpos que reaccionan con los polipéptidos ART,
así como los fragmentos reactivos de tales anticuerpos, se
consideran también incluidos en el alcance de la presente invención.
Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales,
recombinantes, quiméricos, de cadena única y/o biespecíficos, etc.
Los fragmentos de anticuerpos pueden ser cualquier fragmento que sea
reactivo con el ART de la presente invención, como Fab, Fab', etc.
Asimismo, la presente invención proporciona los hibridomas generados
presentando el ART o uno de sus fragmentos, como un antígeno a un
mamífero seleccionado, seguido de fusión de las células (p.ej.
células del bazo) del animal, con ciertas células cancerosas, para
crear líneas celulares inmortalizadas por técnicas conocidas. La
presente invención abarca también los métodos empleados para generar
tales líneas celulares y anticuerpos dirigidos contra todo el
polipéptido ART humano de la presente invención, o partes del
mismo.
Los anticuerpos se pueden usar terapéuticamente,
por ejemplo para inhibir la unión del ART a su receptor. Los
anticuerpos se pueden usar adicionalmente para propósitos
diagnósticos in vivo e in vitro, por ejemplo en forma
marcada para detectar la presencia del ART en un fluido
corporal.
Las composiciones terapéuticas para tratar
diversos trastornos del sistema endocrino y/o neuroendocrino, como
la resistencia a glucocorticoides, síndrome de Cushing (bien
genético o producido por producción ectópica de ACTH, debida a
tumores pituitarios, carcinomas pulmonares pequeños, o tumores
adrenales), hiperplasia adrenal congénita, otros trastornos del eje
hipotalámico-pituitaria (HPA), y/o obesidad, están
incluidos en el alcance de la presente invención. Tales
composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente
efectiva de un polipéptido ART o de uno de sus fragmentos
(cualquiera de los cuales puede estar modificado químicamente),
mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El material
del vehículo puede ser agua para inyección, preferiblemente
complementada con otros materiales comunes en soluciones para
administración a mamíferos. Típicamente, un compuesto terapéutico de
ART se administrará en forma de una composición que comprende
proteína purificada (que puede estar modificada químicamente), junto
con uno o más vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente
aceptables. Vehículos apropiados ejemplares son solución salina
tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica.
Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado, usando
excipientes apropiados (p.ej. sacarosa). Se pueden incluir, si se
desea, otros vehículos, diluyentes y excipientes estándar. Otras
composiciones ejemplares comprenden tampón Tris de pH
aproximadamente 7,0-8,5, o tampón acetato de pH
aproximadamente 4,0-5,5, que puede incluir además
sorbitol o un sustituto adecuado del mismo.
Las composiciones de ART se pueden administrar
sistémicamente, por vía parenteral. Alternativamente, las
composiciones se pueden administrar por vía intravenosa o
subcutánea. Cuando se administran sistémicamente, las composiciones
terapéuticas para uso en esta invención pueden estar en forma de una
solución acuosa exenta de pirógenos, parenteralmente aceptable. La
preparación de tales soluciones de proteína farmacéuticamente
aceptables, teniendo en cuenta el pH, isotonicidad, estabilidad y
similares, está comprendida en el estado de la técnica.
Las formulaciones terapéuticas de composiciones
de ART, útiles para poner en práctica la presente invención se
pueden preparar para almacenamiento, mezclando la composición
seleccionada, que tenga el grado deseado de pureza, con vehículos,
excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables opcionales
(Remington's Pharmaceutical Sciences, edición decimooctava,
editor A.R. Gennaro, Mack Publishing Company [1990]) en forma de una
torta liofilizada o una solución acuosa. Los vehículos, excipientes
o estabilizadores aceptables son atóxicos para los receptores y son
preferiblemente inertes a las dosis y concentraciones empleadas, e
incluyen tampones como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos;
antioxidantes como ácido ascórbico; polipéptidos de peso molecular
bajo; proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas;
polímeros hidrófilos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos como
glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina; monosacáridos,
disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o
dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azúcares alcoholes, como
manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, como sodio; y/o
tensioactivos no iónicos como Tween, Pluronics o polietilenglicol
(PEG).
La composición de ART a usar para administración
in vivo tiene que ser estéril. Esto se logra fácilmente
mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.
Cuando la composición de ART se liofiliza, la esterilización que se
usa en estos métodos se puede llevar a cabo antes o a continuación
de la liofilización y reconstitución. La composición para
administración parenteral se almacenará normalmente en forma
liofilizada o en solución.
Las composiciones terapéuticas se colocan
generalmente en un recipiente que tiene una abertura de acceso
estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que
tiene un tapón perforable por una aguja de inyección
hipodérmica.
La vía de administración de la composición está
de acuerdo con métodos conocidos, p.ej. oral, inyección o infusión,
mediante vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral
(intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular,
intraocular, intraarterial o intralesional, o mediante sistemas de
liberación prolongada o dispositivo de implantación que puede
implicar, opcionalmente, el uso de un catéter. Si se desea, las
composiciones se pueden administrar de forma continua mediante
infusión, inyección en embolada, o mediante dispositivo de
implantación. Alternativa o adicionalmente, el ART se puede
administrar localmente vía implantación en el área afectada de una
membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual se ha
absorbido el polipéptido ART.
Cuando se utiliza un dispositivo de implantación,
el dispositivo se puede implantar en cualquier tejido u órgano
adecuado como, por ejemplo, en un ventrículo cerebral o en el
parénquima cerebral, y el suministro de ART puede ser directamente a
través del dispositivo, mediante administración en embolada o
continua, o a través de un catéter usando infusión continua.
El polipéptido ART se puede administrar en una
formulación o preparación de liberación prolongada. Ejemplos
adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen
matrices polímeras semipermeables en forma de artículos conformados,
p.ej., películas o microcápsulas. Las matrices de liberación
prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (EE.UU.
3.773.919, EP-58.481), copolímeros de ácido
L-glutámico y
gama-etil-L-glutamato
(Sidman et al, Biopolymers, 22: 547-556
[1983]),
poli(2-hidroxietil-metacrilato)
(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res.,
15:167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12
:98-105 [1982]), acetato de
etilen-vinilo (Langer et al., arriba) o ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico
(EP-133.988). Las composiciones de liberación
prolongada también pueden incluir liposomas, que se pueden preparar
mediante cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica
(p.ej., DE 3.218.121; Epstein et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 82:3688-3692 [1985]; Hwang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 [1980];
EP-52.322; EP-36.676; EP- 88.046;
EP-143.949).
En algunos casos, puede ser deseable usar
composiciones de ART de forma ex vivo, es decir, tratar
células o tejidos que se han eliminado del paciente y que
posteriormente se implantan de nuevo en el paciente.
En otros casos, el ART se puede suministrar a
través de implante en ciertas células del paciente que se han
obtenido mediante ingeniería genética (usando métodos descritos
anteriormente), para expresar y secretar polipéptido ART. Tales
células pueden ser células humanas, y se pueden derivar del propio
tejido del paciente o de otra fuente, bien humana o no humana.
Opcionalmente, las células se pueden inmortalizar. Las células se
pueden implantar en el cerebro, la glándula adrenal o en otros
tejidos corporales u órganos.
En ciertas situaciones, puede ser deseable usar
métodos de terapia génica para administración de ART a pacientes
que padezcan ciertos trastornos del sistema endocrino y/o
neuroendocrino, como la resistencia a glucocorticoides, síndrome de
Cushing (bien genético o causado por producción ectópica de ACTH
debida a tumores pituitarios, carcinomas pulmonares pequeños, o
tumores adrenales), hiperplasia adrenal congénita, otros trastornos
del eje hipotalámico-pituitaria (HPA), y/o obesidad.
En estas situaciones se puede ligar el DNA genómico, DNAc y/o DNA
sintético que codifica para ART o uno de sus fragmentos o variantes,
de forma que sea capaz de funcionar, a un promotor constitutivo o
inducible que sea activo en el tejido en el se vaya a inyectar que
la composición. Esta construcción de DNA de ART se puede inyectar
directamente en el cerebro o en otro tejido neuronal a tratar.
Alternativamente, la construcción de DNA de ART
se puede inyectar en tejido muscular, donde puede ser absorbido al
interior de las células y expresado en las mismas, con la condición
de que el DNA de ART esté ligado de forma que sea capaz de
funcionar, a un promotor que sea activo en tejido muscular, como el
promotor del citomegalovirus (CMV), promotor del virus del sarcoma
de Rous (RSV), o promotor de creatina-quinasa
muscular. Típicamente, la construcción de DNA puede incluir (además
del DNA de ART y un promotor), una secuencia de vector obtenida de
vectores como el vector de adenovirus, vector de virus asociado a
adenovirus, vector retroviral y/o vector del virus del herpes. La
construcción vector/DNA se puede mezclar con un vehículo o vehículos
farmacéuticamente aceptables para inyección.
La cantidad efectiva de la composición o
composiciones de ART para emplear terapéuticamente dependerá, por
ejemplo, de los objetivos terapéuticos como la indicación para la
que se está usando el ART, la vía de administración y el estado del
paciente. Consecuentemente, el terapeuta necesitará valorar la dosis
y modificar la vía de administración según se requiera, para obtener
el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede variar
de aproximadamente 0,1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo
de los factores mencionados anteriormente. Típicamente, un médico
administrará la composición de ART hasta alcanzar una dosis que
logre el efecto deseado. La composición de ART se puede administrar,
por tanto, en una única dosis, o como dos o más dosis (que pueden
contener o no la misma cantidad de ART), a lo largo del tiempo, o
como una infusión continua a través de un dispositivo de
implantación o catéter.
A medida que se lleven a cabo estudios
adicionales, surgirá información relativa a los niveles de
dosificación apropiados para el tratamiento de diversas condiciones
en varios pacientes, y el trabajador medio, considerando el contexto
terapéutico, el tipo de trastorno que se esté tratando, la edad y
estado de salud general del receptor, será capaz de determinar la
dosificación adecuada. Generalmente, la dosis estará entre 0,01
\mug/kg de peso corporal (calculando la masa de proteína sola, sin
modificación química) y 300 \mug/kg (basada en lo mismo).
Las proteínas de ART, sus fragmentos y/o
derivados se pueden utilizar para tratar enfermedades y trastornos
del sistema endocrino, que pueden estar asociados con alteraciones
en el patrón de expresión de ART o que pueden beneficiarse de la
exposición a ART o anticuerpos anti-ART.
La proteína ART y/o sus fragmentos o derivados,
se pueden usar para tratar pacientes en los que diversas células del
sistema endocrino y/o nervioso han degenerado y/o se han dañado por
enfermedad congénita, cirugía, traumatismo, ataque, isquemia,
infección, enfermedad metabólica, deficiencia nutricional, cáncer
y/o sustancias tóxicas.
En otras realizaciones de la invención, la
proteína ART y/o sus fragmentos o derivados, se pueden usar para
tratar trastornos o enfermedades del sistema endocrino y/o
neuroendocrino, como resistencia a glucocorticoides, síndrome de
Cushing (bien genético o producido por la producción de ACTH
ectópica debida a tumores de la pituitaria, carcinomas pulmonares
pequeños o tumores adrenales), hiperplasia adrenal congénita, otras
alteraciones del eje hipotalámico-pituitaria (HPA)
y/o obesidad. Además, las composiciones de ART pueden ser útiles
para modular los niveles de calcio intracelulares.
Además, la proteína ART o sus fragmentos
peptídicos o derivados, se pueden usar conjuntamente con la
implantación quirúrgica de tejido en el tratamiento de enfermedades
en las que está indicada la implantación de tejido.
Se buscó en la base de datos de secuencias de DNA
de la Universidad de Washington/Merck, denominada EST (marcadores de
secuencia expresados) con un perfil de secuencia (Gribsov et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:4355 [1987] y Luethy et al.,
Protein Science, 3:139-146 [1994], usando un
alineamiento de secuencia de los genes agutí humano y de ratón
(empezando en el aminoácido 22 del agutí, tanto humano como de
ratón), junto con la tabla de sustitución de aminoácidos PAM250
(Dayhoff et al, en: Atlas of protein sequence and
structure, vol. 5, suplemento 3 [1978]).
A fin de buscar secuencias aminoácidas homólogas
en la base de datos, cada entrada en la base EST se tradujo
primeramente mediante ordenador, de DNA a secuencia de aminoácidos,
antes de la búsqueda. Se encontró un depósito en la base de datos
EST de un clon de DNAc, H63735, que tenía homología con este perfil
de secuencia. El depósito que contenía la secuencia del extremo
opuesto de este clon de DNAc, H63298, se examinó pero no mostró
ninguna homología con el perfil de secuencia.
La cepa de E. coli que contenía el clon de
DNAc correspondiente a H63735 y H63298 (cepa número 208641), se
obtuvo de Genome Systems Inc., St. Louis, MO. El DNA de este clon se
preparó usando métodos Miniprep estándar (Sambrook et al.,
Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]). El DNA se purificó
haciéndolo pasar a través de una columna de Qiagen (Qiagen,
Chatsworth, CA) y siguiendo el protocolo del fabricante. Tras la
purificación, el DNA se secuenció usando el método de terminación de
cadena didesoxi estándar. Cuando este DNA purificado se digirió con
las endonucleasas de restricción EcoRI y HindIII, se
obtuvieron dos fragmentos de aproximadamente 1,2 y 0,3 kb, indicando
que el clon contenía un inserto de aproximadamente 1,5 kb. La
secuencia de los cebadores T3 y T7 del vector de secuenciación,
producía una secuencia que era prácticamente idéntica a las
secuencias depositadas, indicando que el clon 208641 contenía el DNA
usado para generar los depósitos H63735 y H63298.
El análisis de la secuencia de DNAc completa del
clon 208641 confirmó la presencia de homología con el gen agutí en
el extremo carboxilo, rico en cisteína. La comparación de la
secuencia de DNAc del clon 208641 con la secuencia original
depositada en la base de datos (H63735), reveló un error en la
secuencia depositada. Específicamente, un nucleótido de guanina
extra estaba presente en posición 164 de H63735, produciendo una
mutación de cambio de marco y un codón de terminación prematura
interno al marco cuando H63735 se traducía. Este error, cuando se
corrigió, reveló una homología de secuencia adicional entre la
secuencia del perfil y H63735. Asimismo, la corrección de este error
produjo una homología de secuencia adicional entre el clon 208641 y
el gen agutí. Sin embargo, incluso con la corrección de este cambio
de marco, la secuencia de proteína predicha de 208641 a partir del
marco de lectura abierto, produjo una proteína de 94 aminoácidos,
comparada con 132 aminoácidos para el agutí humano. Además, la
homología de proteína predicha, se reducía enormemente hacia el
extremo amino. Esto sugirió que 208641 era realmente no un DNAc
genuino, sino más bien un híbrido de DNAc-intrón
genómico de DNA parcialmente escindido, y esto se confirmó cuando se
obtuvo la secuencia del clon genómico humano (SEQ ID Nº:4), como se
describe más adelante.
Para valorar el patrón de expresión génica del
clon, se escrutaron transferencias Northern de nilón que contenían
aproximadamente 2 \mug por banda de RNA poliA de varios tejidos
humanos (laboratorios Clontech, Palo Alto, CA), para la presencia de
ART, sondando las transferencias con una sonda de aproximadamente
600 pb (obtenida digiriendo el clon 208641 con NcoI y
NotI y aislando el fragmento de 600 pares de bases, usando el
kit de purificación en gel de Qiagen [Qiagen, Chatsworth, CA]) y
siguiendo el protocolo del fabricante. Este fragmento de 600 pares
de bases aislado se marcó radiactivamente con
a-^{32}P-dCTP, usando métodos
estándar (RediVue, Amersham, Arlington Heigths, IL), en una reacción
con cebadores aleatorios (RediPrime, Amersham). La radiactividad que
no se había incorporado se excluyó mediante cromatografía de
exclusión por tamaños (columnas Quickspin,
Boehringer-Mannheim). Los filtros de Northern se
hibridaron durante la noche a aproximadamente 42ºC en tampón que
contenía formamida al 50%, SDS al 2%, Denhardts 10X, 100 mg/ml de
DNA de esperma de salmón, y SSPE 5X. Los filtros se lavaron después
en SSC 2X, SDS al 0,05% a temperatura ambiente durante
aproximadamente 40 minutos con tres cambios de solución de lavado,
seguidos por 30 minutos a aproximadamente 50ºC en SSC 0,1X, SDS al
0,1%. Las señales de hibridación se detectaron colocando los filtros
durante la noche en una casete de un generador de imágenes de
fósfo-
ro.
ro.
La hibridación de los filtros de Northern con la
sonda NcoI-NotI de 600 pares de bases, revelo
un patrón sorprendente y relativamente específico de expresión de
ART, como se muestra en la Figura 6. El punto de expresión más
abundante era la corteza adrenal, seguido por la médula adrenal,
hipotálamo, núcleo subtalámico y testículos. Se detectó una señal de
hibridación débil en el pulmón. Cuando las intensidades relativas de
las señales de hibridación se cuantificaban en un generador de
imágenes de fósforo y se expresaban en relación con la corteza
adrenal, se obtenían los siguientes valores: corteza adrenal, 100;
médula adrenal, 46; hipotálamo, 23; testículos, 15; núcleo
subtalámico, 11; y pulmón 3,6. Los filtros se sondaron entonces con
una sonda de beta-actina, para verificar la carga
igual de RNA y la colocación precisa de los marcadores de tamaño de
RNA.
El examen de la transferencia Northern en
referencia a los marcadores de tamaño, reveló una diferencia
interesante en la longitud del transcrito de ART entre el cerebro y
los tejidos periféricos, que podía deberse a una escisión de exón
alternativa. El tamaño del transcrito era aproximadamente 0,8 kb
para los tejidos cerebrales, mientras que los tejidos periféricos
tenían un transcrito más pequeño, de aproximadamente 0,5 kb. Para
resolver si esto representaba la escisión alternativa de exones
codificadores y/o no traducidos, se clonó el DNAc del núcleo
subtalámico y la glándula adrenal, como se describe más
adelante.
Los intentos iniciales para clonar el DNAc
completo usando bibliotecas de fagos estándar fueron infructuosos,
lo cual se debió lo más probablemente al pequeño tamaño del
transcrito, que quedaba excluido durante la preparación de tales
bibliotecas. Consecuentemente, se intentó un método de clonación más
sofisticado y técnicamente problemático, que utilizaba PCR. Para
obtener el clon de DNAc humano completo, correspondiente al clon
208641, se transcribió inversamente RNA poliA humano de la glándula
adrenal, el núcleo subtalámico y el pulmón (Clontech, Palo Alto, CA;
números de catálogo 6571-1, 6581-1 y
6524-1, respectivamente), se sintetizó una segunda
hebra de DNAc y se ligó a cebadores adaptadores, usando el kit de
amplificación de DNAc Marathon (Clontech, Palo Alto, CA), siguiendo
el protocolo del fabricante. Los productos de DNAc finales se
purificaron a partir de cebadores adaptadores sin ligar (kit de
limpieza de PCR, Qiagen, Chatsworth, CA), y se usaron como moldes
para reacciones RACE posteriores, usando PCR. Se realizó PCR para
cada DNAc, usando los siguientes cebadores:
CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC (SEQ ID Nº:1)
TAGCCCCGACCCTGACGTTGGC (SEQ ID Nº:2)
y usando los componentes del kit de
PCR Advantage (Clontech, Palo Alto, CA). Después de una etapa de
desnaturalización inicial (94ºC durante 3 minutos), las reacciones
se ciclaron 5 veces a 94ºC durante 15 segundos y luego 72ºC durante
2 minutos; 5 veces a 94ºC durante 15 segundos y luego 70ºC durante 2
minutos; y 25 ciclos a 94ºC durante 15 segundos y luego 68ºC durante
2 minutos. Todas las reacciones se llevaron a cabo en una máquina de
PCR 2400 de Perkin
Elmer.
Una alícuota de cada mezcla de reacción de PCR se
sometió a electroforesis en gel de agarosa, y las bandas que
migraban a aproximadamente 600 pares de bases se escindieron y
purificaron (kit de Extracción en Gel, Qiagen, Chatsworth, CA) y se
usaron como molde para PCR posterior, usando el cebador de SEQ ID
Nº:2 y el cebador:
ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC (SEQ ID Nº:3)
Las condiciones de PCR fueron las
mismas descritas
anteriormente.
Se sometió a electroforesis en agarosa una
alícuota de esta segunda reacción PCR, y las bandas que migraban a
aproximadamente 600 pares de bases se escindieron, purificaron y
clonaron en un plásmido (kit de clonación TA, Invitrogen, San Diego,
CA). A continuación, se transformaron células hospedadoras
bacterianas con el plásmido, y se cultivaron durante la noche para
purificación del DNA. El DNA del plásmido se aisló entonces desde
las células hospedadoras bacterianas, usando el protocolo Miniprep
de Qiagen, se digirieron con EcoRI y se sometieron a
electroforesis, para confirmar la presencia y tamaño de los
insertos. Los clones que contenían diversos tamaños de insertos se
secuenciaron usando varios cebadores T7 y M13. La secuenciación de
los clones indicaba un polimorfismo en la segunda posición del codón
135, correspondiente a los aminoácidos predichos Leu (CTG) o Pro
(CCG, véanse Figuras 4 y 9). Las secuencias obtenidas se usaron para
determinar qué clones tenían insertos que contuvieran DNAc de ART, y
para diseñar cebadores oligonucleotídicos para la porción 5' del
DNAc de ART. Cuando se secuenciaron varios de dichos insertos, sólo
los tamaños mayores de inserto de 700 pares de bases y 500 pares de
bases para el núcleo subtalámico y la glándula adrenal,
respectivamente, contenían transcritos de ART. Ambos insertos
contenían el mismo marco de lectura abierto (ORF), pero diferían en
la cantidad de región 5' sin traducir. Este ORF coincidía con la
secuencia de 208641 en la región 3'.
Para la reacción RACE 3', se usó un
oligonucleótido en la hebra de sentido directo, que solapaba con el
producto RACE 5' en aproximadamente 180 pares de bases, con la SEQ
ID Nº:1. Este producía un amplicón del mismo tamaño (aproximadamente
300 pares de bases) en los tres tejidos. La secuencia de este
amplicón era la misma en los tres tejidos, y también coincidía con
la secuencia del clon 208641. La secuencia del DNAc de ART de la
glándula adrenal y el pulmón ("tejidos periféricos"), se
muestra el la Figura 3 (SEQ ID Nº:6).
La secuencia combinada de las reacciones RACE del
núcleo subtalámico se muestra en la Figura 2 (SEQ ID Nº:5). Como se
mencionó anteriormente, la secuencia de la glándula adrenal y del
pulmón era idéntica a esta secuencia, excepto por la longitud de la
región 5' sin traducir. Esta secuencia de DNAc contiene codones de
terminación internos al marco del punto de inicio de la traducción
presumido, una señal de poliadenilación y una cola de poliA. La
proteína predicha para este ORF contiene 132 aminoácidos, una
secuencia de péptido señal, y 11 cisteínas, y esta secuencia se
muestra en la Figura 4 (SEQ ID Nº:7). Este péptido señal está
formado por los primeros 20 aminoácidos, y el polipéptido maduro
empieza en el aminoácido 21 (Ala).
Se hibridaron filtros de elevada densidad
maculados con DNA procedente del DNA genómico humano (obtenido de
Genome Systems Inc., St. Louis, MO) con la sonda de DNAc
NcoI-NotI de 600 pares de bases marcada con
a-^{32}P-dCTP (véase Ejemplo I) en
tampón RapidHyb (Amersham, Arlington Heights, IL; número de catálogo
RPN 1636), a aproximadamente 65ºC, durante aproximadamente 4 horas.
Los filtros se lavaron a continuación en SSC 2X que contenía SDS al
0,2% a temperatura ambiente durante 30 minutos, y luego en SSC 0,2X
que contenía SDS al 0,2% a 65ºC durante 30 minutos. Los filtros se
colocaron en casetes de autorradiografía con Hyperfilm (Amersham) y
se colocaron a -80ºC durante la noche. Después se reveló la película
y se registraron las coordenadas de los clones P1 que hibridaban con
la sonda. Las cepas bacterianas que contenían estos clones P1
positivos se obtuvieron de Genome Systems Inc., y el DNA de estas
cepas se aisló (Qiagen Miniprep System, Qiagen, Chatswoth, CA).
Una alícuota de DNA se digirió con EcoRI,
se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa al 0,9% y las
bandas que migraban a aproximadamente 2-3 kb se
escindieron, purificaron y subclonaron en un plásmido
(Bluescript-KSIII, Stratagene), digerido previamente
con EcoRI. El DNA se aisló de bacterias que contenían
insertos (Qiagen Miniprep System), se digirieron con EcoRI,
se sometieron a electroforesis, se transfirieron a filtros de nilón
(Turboblotter, S&S, Keene, NH), y se reticularon con UV
(Stratagene, La Jolla, CA). Estos filtros se hibridaron después con
la sonda NcoI-NotI, según se describió
anteriormente, para identificar clones que contenían secuencias ART.
Se encontró que un clon que contenía un fragmento EcoRI de
aproximadamente 2,3 kb, hibridaba con la sonda ART. A continuación,
se secuenció el DNA de este clon, y la secuencia de ácido nucleico
de este DNA genómico de ART se muestra en la Figura 1 (SEQ ID Nº:4).
Cuando la secuencia de este clon genómico se comparó con la
secuencia de DNAc obtenida de la glándula adrenal y del cerebro, se
encontró que la secuencia que codificaba ART estaba dividida en 3
exones. Además, se encontró que la secuencia 5' sin traducir
presente en el DNAc cerebral era un exón separado, localizado en
posición 5' respecto a estos 3 exones codificadores. Por tanto, el
gen ART parece estar compuesto por tres exones codificadores y un
exón no traducido, escindido de forma variable.
Es posible que los transcritos de ART más
pequeños que se identificaron en las transferencias Northern de los
tejidos periféricos se deban a la ausencia de este exón no
codificador. De forma interesante, se sabe que el agutí de ratón usa
exones no codificadores escindidos alternativamente, durante
diferentes fases del ciclo de crecimiento del pelo.
Se preparó un péptido sintético que contenía los
aminoácidos 79-132 de ART, usando química de
protección de fase sólida FMOC. La secuencia de este péptido se
indica en la Figura 5 (SEQ ID Nº:8). Para volver a plegar el péptido
ART, se disolvieron aproximadamente 5,0 mg de polvo liofilizado en
25 ml de Tris-HCl 20 mM y urea 4 M (pH 7,0). Esta
mezcla se agitó lentamente durante la noche a temperatura ambiente.
Tras la agitación, la muestra se concentró en una célula agitada
Amicon (Beverly, MA) usando un umbral de membrana de 3 kDa. El
volumen final tras la concentración era aproximadamente 1 ml. Esta
muestra se diluyó después con aproximadamente 15 ml de
D-PBS 1X estéril (Gibco/BRL, Grand Island, NY), y
luego se volvió a concentrar hasta un volumen final de
aproximadamente 1 ml. La célula agitada se aclaró dos veces con
aproximadamente 2 ml de D-PBS, y estos 4 ml de
solución se añadieron a la muestra. Esta solución de muestra, ahora
aproximadamente de 5 ml, se concentró más en un dispositivo Amicon
Centricon 3, hasta un volumen final de aproximadamente 0,5 ml
(equivalente a aproximadamente 10 mg/ml). La muestra se filtró en
condiciones estériles en un dispositivo de filtro Spinex de 0,22
\mum de Costar (Cambridge, MA) y se almacenó a 4ºC.
Esta muestra de péptido se administró a ratas,
como se describe en el Ejemplo V, más adelante.
Se escrutó una genoteca de tejido hepático de
ratón (Stratagene, La Jolla, CA), para el DNA genómico de ART de
ratón, usando la sonda de DNAc NcoI-NotI de
600 pares de bases, marcada con
a-^{32}P-dCTP (véase Ejemplo I) en
tampón RapidHyb (Amersham, Arlington Heigths, IL; nº de catálogo RPN
1636) a aproximadamente 65ºC, durante aproximadamente 4 horas. Los
filtros se lavaron a continuación en SSC 2X que contenía SDS al
0,2% a 65ºC durante 30 minutos. Los filtros se colocaron en casetes
de autorradiografía con Hyperfilm (Amersham, Arlington Heights, IL)
y se colocaron a -80ºC durante la noche. Después se reveló la
película y se identificó un clon que se unía a la sonda.
Este clon, denominado m-ARTg, se
purificó en placa usando métodos estándar, las bacterias se lisaron
y luego se aisló el DNA usando una columna Maxiprep de Qiagen
(Chatsworth, CA). El DNA purificado se digirió con XbaI, y se
encontró un fragmento de aproximadamente 2,8 kb, que hibridaba con
la sonda de DNAc de ART humano. Este fragmento de 2,8 kb se subclonó
en el vector pBlueScript (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenció.
La región codificadora de esta secuencia se indica en la Figura 7.
Se encontró que los puntos de escisión donador/aceptor en este gen
eran comparables a aquellos en el DNA genómico de ART humano,
indicando que el gen ART de ratón también tiene tres exones
codificadores (2, 3 y 4) y un exón no codificador (exón 1). La
secuencia aminoácida predicha del ART de ratón se muestra en la
Figura 8. Esta secuencia es idéntica, en aproximadamente un 81%, a
la secuencia del polipéptido ART humano.
A ratas macho de Long-Evans que
pesaban 300-500 gramos, se les implantó de forma
crónica en el cerebro una cánula de calibre 22, dirigida al
ventrículo lateral. Las coordenadas estereotáxicas para las cánulas
eran aproximadamente: 0,8 mm anterior/posterior; 1,4 mm
media/lateral; y 3,5 mm dorsall/ventral. Un estilete de 3,5 mm y
calibre 28 permanecía dentro de la cánula implantada, hasta que el
animal estuvo preparado para una inyección. Se administraron
soluciones de péptido ART o testigo con un inyector de calibre 28
que se extendía aproximadamente 1 mm más allá de la punta de la
cánula.
Se disolvió péptido ART en PBS (pH
aproximadamente 7,0) y se inyectó en el ventrículo lateral, en dosis
que variaban de aproximadamente 0,075 nmoles a aproximadamente 7,5
nmoles, en un volumen de aproximadamente 2 \mul. Los testigos
fueron PBS y una versión sin plegar de ART, a aproximadamente 7,5
nmol. Se realizaron mediciones de alimentación de platos previamente
pesados que contenían una mezcla de comida molida para roedores,
azúcar y leche condensada (45%:28%:27%). A las ratas se les ofreció
esta mezcla junto con su comida habitual aproximadamente 24 horas
antes de la inyección. Aproximadamente una hora y una hora y media
antes de la infusión, se eliminó la comida habitual, pero se dejó
que las ratas continuaran alimentándose de la mezcla endulzada. Las
inyecciones se realizaron a las 8:30 am o a las 8:30 pm. La
absorción de alimento se valoró pesando los platos a lo largo del
tiempo a los 90 minutos, 4 horas, 8 horas, 12 horas y 24 horas
después de la inyección. Se usaron 10-12 ratas por
grupo.
Los resultados se muestran en la Figura 10. Como
se puede observar, aquellas ratas que recibían ART plegado
incrementaban la absorción de alimento, comparadas con los testigos.
Además, existe una correlación entre la cantidad de ART inyectado y
la cantidad de alimento que comen las ratas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: AMGEN INC.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVO GEN RELACIONADO CON AGUTÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 11
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: AMGEN INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1840 DEHAVILLAND DRIVE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: THOUSAND OAKS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CALIFORNIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO: 91320-1789
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- SOPORTE LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn licencia nº 1.0, Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- OLESKI, NANCY A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Nº DE REGISTRO: 34.688
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/Nº DE EXPEDIENTE: A-402A
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGCCCCGAC CCTGACGTTG GC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "oligonucleótido"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCACTATA GGGCTCGAGC GGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2371 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 830 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNAc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 479 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNAc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 132 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA:proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 734 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 131 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID Nº:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 11:
Claims (32)
1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un
polipéptido seleccionado del grupo formado por:
- (a)
- la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº:4;
- (b)
- la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº:5;
- (c)
- la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº:6;
- (d)
- la molécula de ácido nucleico de SEQ ID Nº:9;
- (e)
- una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:7;
- (f)
- una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:8;
- (g)
- una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:10;
- (h)
- una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEQ ID Nº:11;
- (i)
- una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico, al menos en un 70 por ciento, a los polipéptidos de SEQ ID Nº:7, SEQ ID Nº:8, SEQ ID Nº:10 o SEQ ID Nº:11, teniendo dicho polipéptido la actividad biológica de incrementar la absorción de alimento en un mamífero; y
- (j)
- una molécula de ácido nucleico que es el complemento de cualquiera de (a)-(i) anteriores.
2. La molécula de ácido nucleico que es SEQ ID
Nº:4.
3. La molécula de ácido nucleico que es SEQ ID
Nº:5.
4. La molécula de ácido nucleico de SEQ ID
Nº:6.
5. La molécula de ácido nucleico de SEQ ID
Nº:9
6. Una molécula de ácido nucleico que codifica el
polipéptido de SEQ ID Nº:7.
7. Una molécula de ácido nucleico que codifica el
polipéptido de SEQ ID Nº:8.
8. Una molécula de ácido nucleico que codifica el
polipéptido de SEQ ID Nº:10.
9. Una molécula de ácido nucleico que codifica el
polipéptido de SEQ ID Nº:11.
10. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 1.
11. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 2.
12. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 3.
13. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 4.
14. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 5.
15. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 6.
16. Un vector que comprende la molécula de ácido
nucleico de la reivindicación 9.
17. Una célula hospedadora que comprende el
vector de la reivindicación 10.
18. Una célula hospedadora que comprende el
vector de la reivindicación 11.
19. Una célula hospedadora que comprende el
vector de la reivindicación 12.
20. Una célula hospedadora que comprende el
vector de la reivindicación 13.
21. Una célula hospedadora que comprende el
vector de la reivindicación 14.
22. Una célula hospedadora que comprende el
vector de la reivindicación 15.
23. Una célula hospedadora que comprende el
vector de la reivindicación 16.
24. Un procedimiento para producir un polipéptido
relacionado con el agutí (ART), que comprende las siguientes
etapas:
(a) expresar un polipéptido codificado por el
ácido nucleico de la reivindicación 1, en un hospedador adecuado;
y
(b) aislar el polipéptido.
25. El procedimiento de la reivindicación 24, en
el que el polipéptido se selecciona del grupo formado por: SEQ ID
Nº:7, SEQ ID Nº:8, SEQ ID Nº:10 y SEQ ID Nº:11.
26. Un polipéptido relacionado con el agutí
(ART), seleccionado del grupo formado por:
(a) el polipéptido de SEQ ID Nº:7;
(b) el polipéptido de SEQ ID Nº:8;
(c) el polipéptido de SEQ ID Nº:10;
(d) el polipéptido de SEQ ID Nº:11;
(e) un fragmento biológicamente activo del
polipéptido de (a), (b), (c) o (d), teniendo dicho fragmento la
actividad biológica de incrementar la absorción de alimento en un
mamífero; y
(f) un polipéptido que es idéntico, al menos en
un 70 por ciento, al polipéptido relacionado con el agutí (ART) de
una cualquiera de (a) a (d), teniendo dicho péptido la actividad
biológica de incrementar la absorción de alimento en un
mamífero.
27. El polipéptido ART de la reivindicación 26,
que no posee una metionina amino-terminal.
28. El polipéptido ART de la reivindicación 26,
que posee una metionina amino-terminal.
29. Un método no terapéutico para incrementar la
absorción de alimento en un mamífero, que comprende administrar el
polipéptido codificado por el ácido nucleico de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, o el polipéptido de una cualquiera de
las reivindicaciones 26 a 28, al mamífero.
30. Un polipéptido codificado por el ácido
nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o el
polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, para
uso en un método para incrementar la absorción de alimento en un
mamífero.
31. Uso de un polipéptido codificado por el ácido
nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el
polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, para
la fabricación de un medicamento para incrementar la absorción de
alimento en un mamífero.
32. Una composición terapéutica que comprende un
polipéptido codificado por el ácido nucleico de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, o el polipéptido de una cualquiera de
las reivindicaciones 26 a 28, y un vehículo, excipiente o diluyente
fisiológicamente aceptable.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1750596P | 1996-05-10 | 1996-05-10 | |
| US17505P | 1996-05-10 | ||
| US757541 | 1996-11-27 | ||
| US08/757,541 US5766877A (en) | 1996-05-10 | 1996-11-27 | Genes encoding art, an agouti-related transcript |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2234015T3 true ES2234015T3 (es) | 2005-06-16 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| EP (1) | EP0917571B1 (es) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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