ES2226097T3 - Factor neurotrofico nnt-1. - Google Patents

Factor neurotrofico nnt-1.

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ES2226097T3
ES2226097T3 ES98906215T ES98906215T ES2226097T3 ES 2226097 T3 ES2226097 T3 ES 2226097T3 ES 98906215 T ES98906215 T ES 98906215T ES 98906215 T ES98906215 T ES 98906215T ES 2226097 T3 ES2226097 T3 ES 2226097T3
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Abstract

Se describen ácidos nucleicos que codifican nuevos factores neurotróficos, denominados NNT-1. Se describen también secuencias de aminoácidos para polipéptidos NNT-1, procedimientos de preparación de polipéptidos NNT-1 y otros aspectos relacionados. Dichos polipéptidos presentan una actividad estimulante de la producción de células B y/o células T y reducen las respuestas inflamatorias.

Description

Factor neurotrófico NNT-1.
Antecedentes Campo de la invención
Esta invención se refiere a un nuevo polipéptido denominado NNT-1 y a polipéptidos relacionados que tienen actividad neurotrófica, a nuevas moléculas de ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos, y a otros aspectos relacionados.
Descripción de la técnica relacionada
Una serie de trastornos y enfermedades neurológicos están provocados, al menos en parte, por la degeneración o muerte de clases concretas de neuronas. Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson se caracteriza por una ralentización del movimiento voluntario de los músculos, una rigidez muscular y temblores. Estos síntomas se atribuyen, al menos en parte, a la degeneración progresiva de las neuronas productoras de dopamina localizadas en una región específica del cerebro, denominada sustancia negra. La degeneración de estas neuronas ("neuronas dopaminérgicas") produce una disminución en los niveles de dopamina en una región adyacente del cerebro, denominada cuerpo estriado. El cuerpo estriado contiene neuronas que expresan receptores para la dopamina; estas neuronas están implicadas en el control de la actividad motora. La causa de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas es desconocida, pero se ha atribuido a los radicales libres, el exceso de contenido en hierro, las toxinas ambientales, la neutoxicidad de aminoácidos excitatorios y, probablemente, una deficiencia en ciertos factores neurotroficos (Janner, Neurology, suple. 3:S6-S12 (1995); Adams y Victor, eds., Principles of Neurology, capítulo 42: Degenerative Diseases of the Nervous System, McGraw Hill, NY (1993)).
Las enfermedades como la esclerosis lateral amiotrófica ("amyotrophic lateral sclerosis", ALS; también denominada enfermedad de Lou Gehrig), la atrofia muscular progresiva, y la neuropatía sensorial y motora hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth) están todas provocadas, al menos en parte, por un deterioro de las neuronas motoras que están localizadas en el cuerno ventral de la médula espinal.
El hipocampo, una estructura bien definida que es parte de la corteza cerebral del cerebro, es importante en la formación de la memoria a largo plazo. La destrucción del hipocampo, por ejemplo por una isquemia, puede producir una incapacidad para formar nuevos recuerdos. La degeneración de las neuronas piramidales CA1, que están localizadas en la región CA1 del hipocampo, es una característica de la enfermedad de Alzheimer. Estas mismas neuronas son selectivamente vulnerables a las lesiones isquémicas y anóxicas que se producen en trastornos como los accidentes cerebrovasculares y los traumatismos cefálicos. Además, las neuronas hipocámpicas piramidales CA1, así como las neuronas piramidales localizadas en la región CA3 del hipocampo, son selectivamente lesionadas en la epilepsia.
El cuerpo estriado es la región de inervación de los nervios terminales de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. La mayoría de las neuronas del cuerpo estriado utilizan GABA (ácido 4-aminobutírico) como neurotransmisor. El cuerpo estriado es la diana principal de la neurodegeneración progresiva que se produce en la enfermedad de Huntington, en la que la pérdida principal de neuronas es la que se produce en las neuronas que utilizan GABA del cuerpo estriado.
Las neuronas que contienen serotonina están localizadas en grupos agrupados alrededor de la línea media del cerebro posterior. Estas neuronas están implicadas en el control de la temperatura corporal, los estados emocionales y el sueño. Los trastornos del sistema de neuronas que contienen serotonina incluyen, por ejemplo, depresión, otros trastornos del estado emocional y trastornos del sueño.
Las células fotorreceptoras son un subgrupo especializado de neuronas retinianas y son responsables de la visión. Las lesiones y/o muerte de las células fotorreceptoras puede conducir a la ceguera. La degeneración de la retina, como por la retinitis pigmentosa, la degeneración macular relacionada con el envejecimiento, y la ceguera nocturna estacional, están todas caracterizadas por la atrofia progresiva y la pérdida de función de los segmentos externos de los fotorreceptores, que son estructuras especializadas que contienen los pigmentos visuales que transforman un estímulo luminoso en actividad eléctrica.
Aunque existen algunas terapias disponibles para tratar los síntomas y disminuir la gravedad de estas enfermedades (por ejemplo, L-dopa para tratar la enfermedad de Parkinson), en la actualidad no existe ningún tratamiento eficaz para evitar o reducir la degeneración de la mayoría de las clases, mencionadas anteriormente, de neuronas afectadas, o para estimular su reparación.
En fechas recientes, se han identificado varias moléculas proteicas que aparecen en la naturaleza, basándose en su actividad trófica sobre diversas neuronas. Estas moléculas se denominan "factores neurotróficos". Los factores neurotróficos son proteínas solubles endógenas que pueden estimular o regular la supervivencia, crecimiento y/o plasticidad morfológica de las neuronas (véase Fallon y Laughlin, Neurtrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA (1993)).
Los factores neurotróficos conocidos pertenecen a varias superfamilias proteicas diferentes de factores del crecimiento polipeptídicos, basadas en su homología de la secuencia de aminoácidos y/o su estructura tridimensional (MacDonald y Hendrikson, Cell, 73:421-424 (1993)). Una familia de factores neurotróficos es la familia de la neurotrofina. Esta familia consiste, en la actualidad, en NGF (factor del crecimiento nervioso), BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT-4 (neurotrofina-4), y NT-6 (neurotrofina-6).
El CNTF (factor neutrotrófico ciliar) y LIF (factor inhibidor de leucemia) son polipéptidos de citoquina que tienen actividad neurotrófica. En virtud de sus características estructurales y los componentes del receptor, estos polipéptidos están relacionados con una familia de citoquinas hematopoyéticas que incluyen IL-6 (interleuquina-6), IL-11 (interleuquina-11), G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos), y oncostatina-M. El NNT-1 de la presente invención muestra una similitud significativa con diversos miembros de esta familia de factores neurotróficos. Véase la figura 6.
El GDNF (factor neurotrófico derivado de la glía) es un factor neurotrófica que pertenece a la superfamilia de TGF-beta (factor del crecimiento beta transformante). El GDNF muestra unas potentes acciones de supervivencia y estimulación de la diferenciación en neuronas dopaminérgicas y motoras (Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993)); Yan et al., Nature, 373:341-344 (1995)).
Aunque se sabe que estos factores neurotróficos aumentan el crecimiento y/o supervivencia de las neuronas, se sabe menos acerca de las moléculas que trabajan junto con estos factores. Una manera en la que pueden identificarse otras neurotrofinas y moléculas relacionadas es administrar a un animal uno o más compuestos, de los cuales se sabe que tienen un efecto sobre el sistema nervioso, y después analizar los tejidos para detectar la inducción de genes implicados en las respuestas neuronales a los compuestos. Por ejemplo, se pueden seleccionar genes que son inducidos en ciertos tejidos del sistema nervioso, como la región hipocámpica del cerebro. Esta técnica fue utilizada por Nedivi et al. (Nature, 363:718-722 (1993); Nedivi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2048-2053 (1996)) para identificar nuevos genes que son inducidos en la porción del gyrus dentatus del hipocampo en respuesta a la administración de un análogo de un neurotransmisor de glutamato, denominado cainato (ácido caínico).
La expresión de muchos factores neurotróficos, como NGF, BDNF, NT3, GDNF, bFGF, IGF-1 y TGF-beta está regulada por la actividad neuronal aferente y/o por las lesiones neuronales. Puede observarse una fuerte induccón de algunos de estos genes en el gyrus dentatus del hipocampo en respuesta al análogo del glutamato cainato (Isackson, Current Opinions in Neurobiology, 5:50-357 (1995)). El tratamiento con cainato parece aumentar la liberación de nuevos compuestos del hipocampo en ratas alerta, y esta actividad parece ser diferente de las acciones de factores neurotróficos conocidos (Humpel et al., Science, 269:552-554 (1995)).
En vista del hecho de que muchos trastornos y enfermedades del sistema nervioso no tienen cura conocida, existe una necesidad en la técnica de identificar nuevos compuestos para tratar trastornos y enfermedades neurológicos, como la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), la enfermedad de Alzheimer, los accidentes cerebrovasculares y diversos trastornos degenerativos que afectan a la visión.
En la presente se presentan además pruebas de que los compuestos de NNT-1 pueden tener una actividad biológica modulando el sistema inmunológico, en particular provocando un aumento en la producción de células B y células T.
Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar nuevos compuestos que pueden ser útiles para estimular la regeneración de neuronas y restaurar las funciones neurales.
Otro objeto de la invención es proporcionar un método para tratar enfermedades neurológicas, como las indicadas en la presente.
Otro objeto más de la invención es proporcionar un método para tratar enfermedades inmunológicas, como las indicadas en la presente.
Estos y otros objetos serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la presente descripción.
Sumario de la invención
En una realización, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
(a) la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1;
(b) la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:3;
(c) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:2, o un fragmento biológicamente activo de éste;
(d) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos 70% idéntico al polipéptido de la SEQ ID NO:2;
(e) una molécula de ácido nucleico que se hibrida bajo condiciones rigurosas con cualquiera de (a)-(d) anteriores; y
(f) una molécula de ácido nucleico que es el complemento de cualquiera de (a)-(e) anteriores.
En otra realización, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:
(a') la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:4;
(b') una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:5, o un fragmento biológicamente activo de éste;
(c') una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos 70% idéntico al polipéptido de la SEQ ID NO:5;
(e') una molécula de ácido nucleico que es el complemento de cualquiera de (a')-(c') anteriores.
En otra realización, la invención proporciona vectores que comprenden estas moléculas de ácidos nucleicos, y células hospedantes procariotas o eucariotas que comprenden los vectores.
La invención proporciona además un polipéptido NNT-1 que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) el polipéptido de la SEQ ID NO:2;
(b) el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1-198 de la SEQ ID NO:2;
(c) un polipéptido que es al menos 70% idéntico al polipéptido de (a) o (b); y
(d) un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (a)-(c).
La invención proporciona además un polipéptido NNT-1 seleccionado del grupo que consiste en:
(a') el polipéptido de la SEQ ID NO:5;
(b') el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1-198 de la SEQ ID NO:5;
(c') un polipéptido que es al menos 70% idéntico al polipéptido de (a') o (b'); y
(d') un fragmento biológicamente activo de cualquiera de (a')-(c').
Opcionalmente, el polipéptido NNT-1 puede o no tener una metionina amino-terminal.
En otra realización, la invención proporciona un proceso para producir un polipéptido NNT-1, en el que el polipéptido puede ser la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5, los aminoácidos 1-198 de la SEQ ID NO:2, los aminoácidos
1-198 de la SEQ ID NO:5, o un fragmento biológicamente activo de éstos, y en el que el proceso comprende:
(a) expresar un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de NNT-1 en un hospedante adecuado; y
(b) aislar el polipéptido.
La invención proporciona además anticuerpos anti-NNT-1.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa la secuencia del ácido nucleico del cDNA que codifica el NNT-1 humano (SEQ ID NO:1).
La figura 2 representa la secuencia del ácido nucleico del DNA genómico humano de NNT-1 (SEQ ID NO:3).
La figura 3 representa la secuencia de aminoácidos del NNT-1 humano (SEQ ID NO:1), según está traducida a partir del cDNA (SEQ ID NO:2). Los primeros 27 aminoácidos pueden representar una secuencia peptídica señal, de manera que la forma madura de NNT-1 comienza en la leucina indicada como número 1. El asterisco indica el codón de terminación.
La figura 4 representa la secuencia del ácido nucleico del cDNA que codifica el NNT-1 murino (SEQ ID NO:4).
La figura 5 representa la secuencia de aminoácidos del NNT-1 murino (SEQ ID NO:5), según está traducida a partir del cDNA (SEQ ID NO:4). Los primeros 27 aminoácidos pueden representar una secuencia peptídica señal, de manera que la forma madura de NNT-1 murino comienza en la leucina indicada como número 1. El asterisco indica el codón de terminación.
La figura 6 representa una comparación de las secuencias de aminoácidos de NNT-1, IL-11 (SEQ ID NO:8), IL-6 (SEQ ID NO:9), G-CSF (SEQ ID NO:10), cardiotrofina (SEQ ID NO:11), CNTF (SEQ ID NO:12), oncostatina (SEQ ID NO:13) y LIF (SEQ ID NO:14). En cada caso, se compara la molécula humana.
La figura 7 representa una gráfica de los resultados de un ensayo de la actividad de neuronas motoras de pollito para el NNT-1, comparado con el CNTF humano.
La figura 8 representa una gráfica de los resultados de un ensayo de la actividad de neuronas simpáticas de pollito para el NNT-1, comparado con el CNTF humano.
La figura 9 representa un bazo normal de un ratón control negativo (nº 22), objetivo 20x, tinción H&E.
La figura 10 representa un bazo de un ratón transgénico NNT-1 (nº 62) con hiperplasia linfoide (flecha).
La figura 11 representa un hígado normal de un ratón control, objetivo 10x, tinción H&E.
La figura 12 representa un hígado de un ratón transgénico NNT-1 (nº 60) con agregados linfoides en sinusoides (flecha) y alrededor de los vasos, tinción H&E.
La figura 13 representa los datos que demuestran que el NNT-1 induce SAA sérico (p<0,001). Había cinco ratones por grupo.
La figura 14 representa los datos que demuestran que el NNT-1 potencia la inducción por IL-1 de corticosterona en suero (p<0,01), y aumenta los niveles séricos de corticosterona también independientemente de IL-1 (p<0,001). Había cinco ratones por grupo.
La figura 15 representa los datos que demuestran que el NNT-1 potencia la inducción por IL-1 de IL-6 en suero (p<0,001). Había cinco ratones por grupo.
La figura 16 representa los datos que demuestran que el NNT-1 bloquea el aumento, inducido por LPS, de los niveles de TNF séricos (p<0,001). Había diez ratones en los grupos tratados con LPS, cinco en los otros.
La figura 17 representa los datos que demuestran que el NNT-1 aumenta los recuentos de células totales (p<0,04) y de células CD45-positivas en nódulos linfáticos periféricos en ratones (p<0,001).
Descripción detallada de la invención
Se incluye dentro del alcance de la invención los polipéptidos NNT-1, como los polipéptidos de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5, y sus derivados y fragmentos polipeptídicos biológicamente activos relacionados. Se incluye también dentro del alcande de la presente invención las moléculas de ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos, y los métodos para preparar los polipéptidos.
I. Proteínas/polipéptidos NNT-1, sus fragmentos y derivados
La expresión "proteína NNT-1" o "polipéptido NNT-1", tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier proteína o polipéptido que tiene las propiedades descritas en la presente para NNT-1. El polipéptido NNT-1 puede o no tener una metionina amino-terminal, dependiendo, por ejemplo, de la manera en que se prepara. Como ilustración, la proteína NNT-1 o el polipéptido NNT-1 se refiere a:
(1) una secuencia de aminoácidos codificada por las moléculas de ácidos nucleicos de NNT-1 según se define en una cualquiera de las siguientes cuestiones:
(a) la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1;
(b) la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:3;
(c) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:2, o un fragmento biológicamente activo de éste;
(d) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos 70% idéntico al polipéptido de la SEQ ID NO:2;
(e) una molécula de ácido nucleico que es el complemento de cualquiera de (a)-(d) anteriores; y
(a') la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:4;
(b') una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:5, o un fragmento biológicamente activo de éste;
(c') una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos 70% idéntico al polipéptido de la SEQ ID NO:5;
(d') una molécula de ácido nucleico que es el complemento de cualquiera de (a')-(c') anteriores; y
(2) los variantes alélicos que aparecen en la naturaleza del gen NNT-1 que producen una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos, comparado con el polipéptido NNT-1 de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5, y/o
(3) los derivados químicamente modificados.
Los polipéptidos NNT-1 que pueden utilizarse en la práctica de la presente invención pueden ser polipéptidos de longitud completa que aparecen en la naturaleza, o polipéptidos o péptidos truncados (es decir, "fragmentos").
Los polipéptidos pueden encontrarse en la forma madura, o pueden estar unidos a un péptido señal nativo o heterogéneo. Por ejemplo, el NNT-1 humano y murino tienen péptidos señal en los aminoácidos -27 a -1 de las SEQ ID NO:2 y 5, respectivamente.
Los polipéptidos o fragmentos pueden modificarse químicamente, es decir, pueden glicosilarse, fosforilarse y/o unirse a un polímero, como se describe a continuación, y pueden tener una metionina amino-terminal, dependiendo del modo en que se preparan. Además, los polipéptidos o fragmentos pueden ser variantes del polipéptido NNT-1 que aparece en la naturaleza (es decir, pueden contener una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones de aminoácidos, comparados con el NNT-1 que aparece en la naturaleza).
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "fragmento de NNT-1" se refiere a un péptido o polipéptido que es menor que la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína NNT-1 que aparece en la naturaleza, pero que tiene cualitativamente un tipo sustancialmente similar de actividad biológica, como el polipéptido 
\hbox{NNT-1}
o la proteína NNT-1 descrita anteriormente. Este fragmento puede estar truncado en el extremo amino-terminal, el extremo carboxi-terminal o ambos, y puede estar químicamente modificado. Estos fragmentos de NNT-1 pueden prepararse con o sin una metionina amino-terminal. La actividad de los fragmentos puede ser mayor, igual o menor que el polipéptido NNT-1 de longitud completa (maduro). Preferiblemente, la actividad del fragmento es \geq50%, más preferiblemente \geq65%, y lo más preferible \geq80% de la actividad del polipéptido de longitud completa, según se mide mediante un ensayo de actividad convencional, como los indicados en la sección de ejemplos de la presente. Algunos ejemplos de fragmentos de esta invención incluyen los polipéptidos en los que de 1 a 20 aminoácidos se eliminan del extremo C-terminal, del extremo N-terminal o de ambos terminales del polipéptido NNT-1.
Tal como se utiliza en la presente, la expresión "derivado de NNT-1" o "variante de NNT-1" se refiere a un polipéptido, proteína o fragmento de NNT-1 que 1) se ha modificado químicamente, como por ejemplo, mediante la adición de una o más moléculas de polietilenglicol, azúcares, fosfatos u otras de estas moléculas que no estan unidas en la naturaleza al polipéptido NNT-1 de tipo salvaje y/o 2) contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones en la secuencia de aminoácidos o ácido nucleico, comparado con la secuencia de aminoácidos de NNT-1 indicada en la figura 3 (humano) o figura 5 (murino).
Tal como se utiliza en la presente, las expresiones "polipéptido biológicamente activo" y "fragmento biológicamente activo" se refieren a un péptido o polipéptido según la anterior descripción para NNT-1, en el que NNT-1 actúa como un factor del crecimiento para (a) neuronas (por ejemplo, neuronas motoras y/o neuronas simpáticas) o (b) células inmunológicas, como células B y células T.
Los fragmentos y/o derivados de NNT-1 que, en sí mismos, no son activos en ensayos de actividad pueden resultar útiles como moduladores (por ejemplo, inhibidores o estimulantes) de los receptores NNT-1 in vitro o in vivo, o para preparar anticuerpos contra polipéptidos NNT-1.
Los variantes de aminoácidos de NNT-1 de esta invención son preferiblemente al menos 70% idénticos a la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5, más preferiblemente al menos aproximadamente 80% idénticos, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 90% idénticos.
El porcentaje de coincidencia de secuencia puede determinarse mediante métodos convencionales que se utilizan habitualmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Como ejemplo, utilizando un programa de ordenador como BLAST o FASTA, los dos polipéptidos en los que se va a determinar el porcentaje de coincidencia de secuencia se alinean para un apareamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos (la "extensión apareada", que puede incluir la longitud completa de una o ambas secuencias, o una porción predeterminada de una o ambas secuencias). Cada programa de ordenador proporciona una penalización de apertura "por defecto" y una penalización de hueco "por defecto", y una matriz de puntuación, como PAM 250. Una matriz de puntuación convencional (véase Dayhoff et al., en: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3. (1978)) puede utilizarse junto con el programa de ordenador. El porcentaje de coincidencia entonces puede calcularse utilizando un algoritmo contenido en un programa como FASTA, como:
Número total de apareamientos idénticos
--------------------------------------------------------------------------------------------------- x 100
\begin{minipage}[t]{115mm}[longitud de la secuencia más larga dentro de la extensión apareada] + [número de huecos introducidos en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias]\end{minipage}
Los polipéptidos que son al menos 70% idénticos, de forma típica, tendrán una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos, comparados con el NNT-1 de tipo salvaje. Normalmente, las sustituciones son conservativas, para que se produzca poco o ningún efecto sobre la carga, polaridad o hidrofobicidad neta globla de la proteína, pero opcionalmente pueden aumentar la actividad de NNT-1. Las sustituciones conservativas se indican en la tabla I a continuación.
TABLA I Sustituciones de aminoácidos conservativas
Básicos: arginina
lisina
histidina
Ácidos: ácido glutámico
ácido aspártico
Polares: glutamina
asparagina
Hidrófobos: leucina
isoleucina
valina
Aromáticos: fenilalanina
triptófano
tirosina
Pequeños: glicina
alanina
serina
treonina
metionina
La invención también incluye homólogos de especies de NNT-1; por ejemplo, los homólogos de NNT-1 de una especie de mamífero como perro, gato, ratón, rata, mono, caballo, cerdo, cabra, conejo, oveja y similares, se contemplan además del ser humano. Las secuencias de cDNA murino y de la proteína se proporcionan en las SEQ ID NO:4 y 5.
La invención incluye además polipéptidos quiméricos, como NNT-1 unido a todo o una porción de otro polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido quimérico comprende NNT-1 unido a todo o una porción de otro factor neurotrófico, como BDNF, GDNF, NT-3, NT-4, NT-5, NT-6 y similares. Los polipéptidos pueden unirse N al C-terminal, C al C-terminal, o N al N-terminal.
II. Ácidos nucleicos
Tal como se utiliza en la presente, el término "NNT-1", cuando se utiliza para describir una molécula de ácido nucleico, se refiere a una molécula de ácido nucleico o un fragmento de ésta, como se indicó anteriormente.
La expresión "condiciones rigurosas" se refiere a una hibridación y un lavado utilizando condiciones que permiten sólo la unión de una molécula de ácido nucleico, como una sonda de oligonucleótido o molécula de cDNA, a secuencias altamente homólogas. Una disolución de lavado rigurosa es NaCl 0,015 M, citrato de Na 0,005 M, y SDS al 0,1%, utilizada a una temperatura de 55ºC-65ºC. Otra disolución de lavado rigurosa es 0,2 x SSC y SDS al 0,1%, utilizada a una temperatura de entre 50ºC-65ºC. Cuando se utilizan sondas de oligonucleótidos para seleccionar bancos genómicos o de cDNA, pueden emplearse las siguientes condiciones de lavado rigurosas. Un protocolo utiliza 
\hbox{6 x SSC}
con pirofosfato de sodio al 0,05%, a una temperatura de 35ºC-62ºC, dependiendo de la longitud de la sonda de oligonucleótido. Por ejemplo, sondas de 14 pares de bases se lavan a 35-40ºC, sondas de 17 pares de bases se lavan a 45-50ºC, sondas de 20 pares de bases se lavan a 52-57ºC, y sondas de 23 pares de bases se lavan a 57-63ºC. La temperatura puede aumentar 2-3ºC cuando la unión no específica de fondo parece alta. Un segundo protocolo utiliza el cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para lavar las sondas de oligonucleótidos. Una disolución de lavado rigurosa es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, y SDS al 0,2%. La temperatura de lavado utilizando esta disolución es una función de la longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases se lava a aproximadamente 45-50ºC.
Las moléculas de ácidos nucleicos, fragmentos y/o derivados de NNT-1 que, en sí mismas, no codifican polipéptidos que son activos en ensayos de actividad, pueden ser útiles como sondas de hibridación en ensayos de diagnóstico para ensayar, de modo cualitativo o cuantitativo, la presencia de DNA o RNA de NNT-1 en muestras de fluido corporal o tejido de mamífero.
Las moléculas de ácidos nucleicos de NNT-1 que codifican los polipéptidos NNT-1 unidos a péptidos señal nativos o heterogéneos y/o polipéptidos quiméricosm, según se describió anteriormente en la presente, también están incluidos dentro del alcance de esta invención.
III. Métodos para preparar los polipéptidos NNT-1 A. Métodos recombinantes
El polipéptido NNT-1 de longitud completa o un fragmento de éste puede prepararse utilizando métodos de la tecnología del DNA recombinante conocidos, como los indicados en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) y/o Ausubel et al., eds. (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY (1994)). Un gen o cDNA que codifica la proteína NNT-1 o un fragmento de ésta puede obtenerse, por ejemplo, seleccionando un banco de cDNA o genómico, o mediante amplificación por PCR. Como alternativa, un gen que codifica el polipéptido NNT-1 o un fragmento puede prepararse mediante síntesis química utilizando métodos muy conocidos por los expertos en la técnica, como los descritos en Engels et al. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 (1989)). Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos de fosfotriéster, fosforamidita y H-fosfonato para la síntesis de ácidos nucleicos. Un método preferido para esta síntesis química es la síntesis con soporte de polímero utilizando la química de fosforamidita convencional. De modo típico, el DNA que codifica el polipéptido NNT-1 tendrá una longitud de varios cientos de nucleótidos. Utilizando estos métodos pueden sintetizarse ácidos nucleicos mayores que aproximadamente 100 nucleótidos como varios fragmentos. Los fragmentos entonces pueden acoplarse entre sí para formar el polipéptido NNT-1 de longitud completa. Normalmente, el fragmento de DNA que codifica el amino-terminal del polipéptido tendrá un ATG, que codifica un resto metionina. Este metionina puede o no estar presente en la forma madura del polipéptido NNT-1, dependiendo de que el polipéptido producido en la célula hospedante se segregue de esa célula.
En algunos casos, puede ser deseable preparar variantes de ácidos nucleicos y/o aminoácidos del NNT-1 que aparece en la naturaleza. Los variantes de ácidos nucleicos (en los que uno o más nucleótidos se diseñan para que sean diferentes del NNT-1 de tipo salvaje o que aparece en la naturaleza) pueden producirse utilizando mutagénesis específica dirigida a sitio o amplificación con PCR, en los que el(los) cebador(es) tiene(n) las mutaciones puntuales deseadas (véase Sambrook et al., supra, y Ausubel et al., supra, para las descripciones de las técnicas de mutagénesis). La síntesis química utilizando métodos descritos por Engels et al., supra, también puede utilizarse para preparar estos variantes. También pueden utilizarse otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los variantes de ácidos nucleicos preferidos son los que contienen sustituciones de nucleótidos que representan la preferencia de codones en la célula hospedante que se va a utilizar para producir el NNT-1. Otros variantes preferidos son los que codifican cambios de aminoácidos conservativos, según se describió anteriormente (por ejemplo, en los que la carga o polaridad de la cadena lateral del aminoácido que aparece en la naturaleza no se altera sustancialmente mediante la sustitución con un aminoácido diferente), comparado con el tipo salvaje y/o los diseñados para generar un(os) nuevo(s) sitio(s) de glicosilación y/o fosforilación sobre NNT-1, o los diseñados para delecionar un(os) sitio(s) de glicosilación y/o fosforilación sobre NNT-1.
El gen o cDNA de NNT-1 puede insertarse en un vector de expresión apropiado para la expresión en una célula hospedante. El vector se selecciona para que sea funcional en la célula hospedante concreta que se emplea (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedante, de forma que la amplificación del gen NNT-1 y/o la expresión del gen puede producirse). El polipéptido NNT-1 o un fragmento de éste puede amplificarse/expresarse en células hospedantes procariotas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucariotas. La selección de la célula hospedante dependerá, al menos en parte, de si el polipéptido NNT-1 o un fragmento de éste se va a glicosilar. Si es así se prefieren células hospedantes de levadura, de insecto o de mamífero; las células de levadura glicosilan el polipéptido, y las células de insecto y mamífero pueden glicosilar y/o fosforilar el polipéptido, como se produce en la naturaleza en el polipéptido NNT-1 (es decir, la glicosilación y/o fosforilación "nativa").
De modo típico, los vectores utilizados en cualquiera de las células hospedantes contendrán una secuencia flanqueante 5' (también denominada "promotor") y otros elementos reguladores, así como un(os) potenciador(es), un elemento de origen de la replicación, un elemento de terminación de la transcripción, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de escisión donante y aceptor, una secuencia de péptido señal, un elemento de sitio de unión a ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región policonectora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que se va a expresar, y un elemento marcador seleccionable. Cada uno de estos elementos se analiza a continuación. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia "marcador", es decir, una secuencia oligonucleotídica localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia codificadora de NNT-1, que codifica poliHis (como hexaHis) u otra secuencia inmunogénica pequeña. Este marcador se expresa junto con la proteína, y puede servir como marcador de afinidad para la purificación del polipéptido NNT-1 a partir de la célula hospedante. Opcionalmente, el marcador puede eliminarse posteriormente del polipéptido NNT-1 purificado mediante diversos medios, como utilizando una peptidasa seleccionada, por ejemplo.
La secuencia flanqueante 5' puede ser homóloga (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula hospedante), heteróloga (es decir, de una especie diferente de la especie o cepa de la célula hospedante), híbrida (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes 5' de más de una fuente), sintética, o puede ser la secuencia flanqueante 5' del NNT-1 nativa. Como tal, la fuente de la secuencia flanqueante 5' puede ser cualquier organismo unicelular procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, con la condición de que la secuencia flanqueante 5' sea funcional y pueda activarse por la maquinaria de la célula hospedante.
Las secuencias flanqueantes 5' útiles en los vectores de esta invención pueden obtenerse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. De modo típico, una secuencia flanqueante 5' útil en la presente que es diferente de la secuencia flanqueante 5' de NNT-1 se ha identificado previamente mediante cartografiado y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción y, por tanto, puede aislarse a partir de la fuente de tejido adecuada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos completa de la secuencia flanqueante 5' puede ser conocida. En este caso, la secuencia flanqueante 5' puede sintetizarse utilizando los métodos descritos anteriormente para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos.
Cuando toda o sólo una porción de la secuencia flanqueante 5' es conocida, puede obtenerse utilizando PCR y/o mediante selección de un banco genómico con oligonucleótidos adecuados y/o fragmentos de la secuencia flanqueante 5' de la misma u otra especie.
Cuando no se conoce la secuencia flanqueante 5', un fragmento de DNA que contiene la secuencia flanqueante 5' puede aislarse a partir de un trozo mayor de DNA que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificadora o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede realizarse mediante digestión con endonucleasas de restricción utilizando una o más enzimas cuidadosamente seleccionadas para aislar el fragmento de DNA apropiado. Después de la digestión, el fragmento deseado puede aislarse mediante una purificación en gel de agarosa, una columna Qiagen® u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. A un experto en la técnica le resultará en seguida evidente la selección de enzimas apropiadas para realizar este objetivo.
El elemento de origen de la replicación, de forma típica, es una parte de los vectores de expresión procariotas que se adquieren en el mercado, y ayuda a la amplificación del vector en una célula hospedante. La amplificación del vector hasta un cierto número de copias puede, en algunos casos, ser importante para la expresión óptima del polipéptido NNT-1. Si el vector elegido no contiene un sitio de origen de la replicación, se puede sintetizar de modo químico basándose en una secuencia conocida, y acoplarse en el vector.
El elemento de terminación de la transcripción se localiza, de modo típico, 3' del extremo de la secuencia codificadora del polipéptido NNT-1, y actúa para terminar la transcripción del polipéptido NNT-1. Normalmente, el elemento de terminación de la transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C, seguido de una secuencia poliT. Aunque el elemento se clona con facilidad a partir de un banco, o incluso se adquiere en el mercado como parte de un vector, también puede sintetizarse con facilidad utilizando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos, como los descritos anteriormente.
Un elemento de gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedante cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores seleccionables típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células hospedantes procariotas; (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en un medio complejo. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina.
El elemento de unión a ribosomas, denominado habitualmente secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o secuencia de Kozak (eucariotas) es necesario para el inicio de la traducción del mRNA. El elemento se localiza, de modo típico, 3' al promotor y 5' a la secuencia codificadora del polipéptido NNT-1 que se va a sintetizar. La secuencia de Shine-Dalgarno es variada, pero, de modo típico, es una polipurina (es decir, tiene un alto contenido en 
\hbox{A-G).}
Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede sintetizarse con facilidad utilizando métodos indicados anteriormente, y utilizarse en un vector procariota.
En los casos en los que resulta deseable que el NNT-1 se segregue a partir de la célula hospedante, puede utilizarse una secuencia señal para dirigir el polipéptido NNT-1 fuera de la célula hospedante en la que se sintetiza, y la parte carboxi-terminal de la proteína puede delecionarse para evitar el anclaje a la membrana. De modo típico, la secuencia señal se coloca en la región codificadora de la secuencia del ácido nucleico de NNT-1, o directamente en el extremo 5' de la región codificadora de NNT-1. Se han identificado muchas secuencias señal, y cualquiera de ellas que sea funcional en la célula hospedante seleccionada puede utilizarse junto con el gen NNT-1. Por tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga con el polipéptido NNT-1, y puede ser homóloga o heteróloga con el polipéptido NNT-1. Además, la secuencia señal puede sintetizarse de modo químico utilizando los métodos indicados anteriormente. En la mayoría de los casos, la secreción del polipéptido a partir de la célula hospedante mediante la presencia de un péptido señal resulta en la eliminación de la metionina amino terminal del polipéptido. Los ejemplos de secuencias secretoras útiles para realizar la expresión y secreción de los polipéptidos NNT-1 se seleccionan de las secuencias conductoras tPA (véase, por ejemplo, Rickles et al., J. Biol. Chem., 263:1563-1560 (1988), y Feng et al., J. Biol. Chem., 265:2022-2027 (1990)), las secuencias conductoras EPO y las secuencias conductoras de cardiotrofina.
En muchos casos, la transcripción del polipéptido NNT-1 aumenta por la presencia de uno o más intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando NNT-1 se produce en células hospedantes eucariotas, en especial en células hospedantes de mamífero. Los intrones utilizados pueden aparecer en la naturaleza dentro de la secuencia del ácido nucleico de NNT-1, en especial cuando la secuencia NNT-1 utilizada es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de ésta. Cuando el intrón no aparece en la naturaleza dentro de la secuencia de DNA de NNT-1 (como la mayoría de los cDNA), el(los) intrón(es) puede(n) obtenerse de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la secuencia flanqueante 5' y la secuencia codificadora de NNT-1 es importante, puesto que el intrón debe transcribirse para ser eficaz. Como tal, cuando la secuencia del ácido nucleico de NNT-1 es una secuencia de cDNA, la posición preferida para el intrón es 3' con respecto al sitio de inicio de la transcripción, y 5' con respecto a la secuencia de terminación de la transcripción de poliA. Preferiblemente para los cDNA de NNT-1, el intrón se localiza en un lado u otro (es decir, 5' o 3') de la secuencia codificadora de NNT-1, de modo que no interrumpe esta secuencia codificadora. Puede utilizarse cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo vírico, procariota y eucariota (vegetal o animal), en la práctica de esta invención, con la condición de que sea compatible con la(s) 
\hbox{célula(s)}
hospedante(s) en la(s) que se inserta. También se incluyen en la presente los intrones sintéticos. Opcionalmente, puede utilizarse más de un intrón en el vector.
Cuando uno o más de los elementos indicados anteriormente no están ya presentes en el vector que se va a utilizar, pueden obtenerse de modo individual y acoplarse al vector. Los métodos utilizados para obtener cada uno de los elementos son muy conocidos por los expertos en la técnica, y son comparables a los métodos indicados anteriormente (es decir, síntesis de DNA, selección de bancos y similares).
Los vectores finales utilizados para practicar esta invención se construyen, de modo típico, a partir de un vector de partida, como un vector disponible en el mercado. Estos vectores pueden o no contener algunos de los elementos que se van a incluir en el vector acabado. Si ninguno de los elementos deseados está presente en el vector de partida, cada elemento puede acoplarse de modo individual en el vector cortando el vector con una(s) endonucleasa(s) de restricción apropiada(s), de forma que los extremos del elemento que se va a acoplar y los extremos del vector son compatibles para el acoplamiento. En algunos casos, puede resultar necesarios hacer que los extremos sean "romos" para poder acoplarse, con el fin de obtener un acoplamiento satisfactorio. La formación de extremos romos se realiza rellenando, en primer lugar, los "extremos pegajosos" utilizando la DNA-polimerasa de Klenow o la DNA-polimerasa T4 en presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento es muy conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.
Como alternativa, dos o más de los elementos que se van a insertar en el vector pueden acoplarse primero entre sí (si se van a colocar adyacentes entre sí) y después acoplarse en el vector.
Otro método para construir el vector es realizar todos los acoplamientos de los diversos elementos de modo simultáneo en una mezcla de reacción. En este caso, se generarán muchos vectores sin sentido o no funcionales debido a un acoplamiento o inserción inadecuada de los elementos, aunque el vector funcional puede identificarse y seleccionarse mediante digestión con endonucleasas de restricción.
Los vectores preferidos para practicar esta invención son los que son compatibles con células hospedantes bacterianas, de insecto y/o de mamífero. Estos vectores incluyen, entre otros, pCRII (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, CA) y pETL (BlueBacII, Invitrogen).
Después de que se haya construido el vector y se haya insertado un ácido nucleico de NNT-1 en el sitio adecuado del vector, el vector acabado puede insertarse en una célula hospedante adecuada para la amplificación y/o la expresión del polipéptido NNT-1.
Las células hospedantes pueden ser células hospedantes procariotas (como E. coli), o células hospedantes eucariotas (como una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de vertebrado). La célula hospedante, cuando se cultiva bajo condiciones apropiadas, puede sintetizar la proteína NNT-1, que posteriormente se recoge a partir del medio de cultivo (si la célula hospedante la segrega hacia el medio), o directamente a partir de la célula hospedante que la produce (si no se segrega). Después de la recogida, la proteína NNT-1 puede purificarse utilizando métodos como la cromatografía de tamices moleculares, la cromatografía de afinidad y similares.
La selección de la célula hospedante dependerá, en parte, de si la proteína NNT-1 va a ser glicosilada o fosforilada (en cuyo caso se prefieren células hospedantes eucariotas), y de la manera en la que la célula hospedante es capaz de "plegar" la proteína para formar su estructura terciaria nativa (por ejemplo, la orientación adecuada de los puentes disulfuro, etc.), de modo que la proteína biológicamente activa es preparada por la célula. Sin embargo, cuando la célula hospedante no sintetiza NNT-1 biológicamente activo, el NNT-1 puede "plegarse" después de la síntesis utilizando condiciones químicas apropiadas, según se analiza a continuación.
Las células o líneas celulares apropiadas pueden ser células de mamífero, como células de ovario de hámster chino (CHO) o células 3T3. La selección de células hospedantes de mamífero y métodos adecuados para la transformación, cultivo, amplificación, selección, y producción y purificación del producto es conocida en la técnica. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas son las líneas celulares COS-7 y COS-1 de mono, y la línea celular CV-1. Otros ejemplos de células hospedantes de mamífero incluyen líneas celulares de primates y líneas celulares de roedores, incluyendo líneas celulares transformadas. También resultan adecuadas las células diploides normales, las cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, así como explantes primarios. Las células candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección de acción dominante. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, y líneas célulares de hámster BHK o HaK.
Similarmente útiles como células hospedantes adecuadas para la presente invención son las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH5\alpha, DH10 y MC1061) son muy conocidas como células hospedantes en el campo de la biotecnología. Diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus ssp., Steptomyces spp. y similares también pueden emplearse en este método.
Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células hospedantes para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Además, cuando se desee, pueden utilizarse células de insecto como células hospedantes en el método de la presente invención (Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298 (1986)).
La inserción (también denominada "transformación" o "transfección") del vector en la célula hospedante seleccionada puede realizarse utilizando métodos como el método del cloruro de calcio, la electroporación, la microinyección, la lipofección o el método de DEAD-dextrano. El método seleccionado estará, en parte, en función del tipo de célula hospedante que se va a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son muy conocidos por los expertos en la técnica, y se indican, por ejemplo, en Sambrook et al., supra.
Las células hospedantes que contienen el vector (es decir, transformadas o transfectadas) pueden cultivarse utilizando medios convencionales muy conocidos por los expertos en la técnica. El medio contendrá, habitualmente, todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células de E. coli son, por ejemplo, caldo de cultivo Luria (LB) y/o caldo de cultivo Terrific (TB). Los medios adecuados para cultivar células eucariotas son RPMI 1640, MEM, DMEM, los cuales pueden suplementarse con suero y/o factores del crecimiento, según lo requiera la línea celular concreta que se está cultivando. Un medio adecuado para los cultivos de insecto es el medio de Grace suplementado con levadurolato, hidrolizado de lactoalbúmina y/o suero de ternera fetal, según sea necesario.
De modo típico, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo sólo de las células transformadas se añade como suplemento al medio. El compuesto que se va a utilizar será dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el que se transforma la célula hospedante. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es la resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina.
La cantidad de polipéptido NNT-1 producido en la célula hospedante puede evaluarse utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, sin limitación, análisis de la transferencia Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación mediante HPLC, inmunoprecipitación y/o ensayos de actividad, como ensayos de desplazamiento en gel de unión de DNA.
Si el polipéptido NNT-1 se ha diseñado para ser segregado a partir de células hospedantes, la mayor parte del polipétido puede encontrarse en el medio de cultivo celular. Los polipéptidos preparados de esta manera, de modo típico, no poseerán una metionina amino-terminal, puesto que se elimina durante la secreción a partir de la célula. Sin embargo, si el polipéptido NNT-1 no se segrega a partir de las células hospedantes, estará presente en el citoplasma (para celulas hospedantes eucariotas, bacterias gram-positivas y de insecto), o en el periplasma (para células hospedantes bacterianas gram-negativas), y puede tener una metionina amino-terminal.
Para la proteína NNT-1 intracelular, las células hospedantes, de modo típico, primero se rompen de modo mecánico u osmótico para liberar los contenidos citoplásmicos hacia una disolución tamponada. El polipéptido NNT-1 entonces puede aislarse a partir de esta disolución.
La purificación del polipéptido NNT-1 a partir de la disolución puede realizarse utilizando una diversidad de técnicas. Si el polipéptido se ha sintetizado de forma que contiene un marcador, como hexahistidina (NNT-1/hexaHis) u otro péptido pequeño en su extremo carboxilo-terminal o amino-terminal, puede purificarse esencialmente mediante un proceso en una etapa, haciendo pasar la disolucion a través de una columna de afinidad, en la que la matriz de la columna tiene una alta afinidad por el marcador o por el polipéptido directamente (es decir, un anticuerpo monoclonal que reconoce, de modo específico, el NNT-1). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad al níquel y, por tanto, puede utilizarse una columna de afinidad de níquel (como las columnas de níquel de Qiagen) para la purificación de NNT-1/poliHis (véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, sección 10.11.8, Jonh Wiley & Sons, Nueva York (1993)).
Cuando el polipéptido NNT-1 no tiene marcador y no se encuentran disponibles anticuerpos, pueden utilizarse otros procedimientos muy conocidos para la purificación. Estos procedimientos incluyen, sin limitación, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de tamices moleculares, la HPLC, la electroforesis en gel nativo en combinación con elución del gel, y el enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific). En algunos casos, dos o más de estas técnicas pueden combinarse para lograr mayor pureza. Los métodos preferidos para la purificación incluyen el marcaje con polihistidina y la cromatografía de intercambio iónico en combinación con el enfoque isoeléctrico preparativo.
Si se prevé que el polipéptido NNT-1 se encontrará principalmente en el espacio periplásmico de bacterias o el citoplasma de células eucariotas, los contenidos del periplasma o citoplasma, incluyendo los cuerpos de inclusión (por ejemplo, bacterias gram-negativas) si el polipéptido procesado ha formado estos complejos, pueden extraerse de la célula hospedante utilizando cualquier técnica convencional conocida por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células hospedantes pueden lisarse para liberar los contenidos del periplasma mediante una prensa francesa, homogeneización y/o sonicación. El homogeneizado puede centrifugarse después.
Si el polipéptido NNT-1 ha formado cuerpos de inclusión en el periplasma, los cuerpos de inclusión pueden unirse, a menudo, a las membranas celulares internas y/o externas y, por tanto, se encontrarán principalmente en el material sedimentado después de la centrifugación. El material sedimentado entonces puede tratarse con un agente caotrópico, como guanidina o urea, para liberar, disgregar y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido NNT-1, que se encuentra ahora en forma soluble, puede entonces analizarse utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea aislar el polipéptido NNT-1, el aislamiento puede lograrse utilizando métodos convencionales, como los indicados a continuación y en Marston et al. (Meth. Enz., 182:264-275 (1990)).
Si los cuerpos de inclusión del polipéptido NNT-1 no se forman en un grado suficiente en el periplasma de la célula hospedante, el polipéptido NNT-1 se encontrará principalmente en el sobrenadante después de la centrifugación del homogeneizado celular, y el polipéptido NNT-1 puede aislarse del sobrenadante utilizando métodos como los indicados a continuación.
En las situaciones en las que es preferible aislar parcial o completamente el polipéptido NNT-1, la purificación puede lograrse utilizando métodos convencionales muy conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, sin limitación, una separación mediante electroforesis seguida de electroelución, diversos tipos de cromatografía (de inmunoafinidad, de tamices moleculares y/o de intercambio iónico) y/o cromatografía líquida de alta presión. En algunos casos, puede resultar preferible utilizar más de uno de estos métodos para una purificación completa.
B. Métodos de síntesis químicas
Además de preparar y purificar el polipéptido NNT-1 utilizando técnicas de DNA recombinante, los polipéptidos, fragmentos y/o derivados de NNT-1 pueden prepararse mediante métodos de síntesis química (como la síntesis peptídica en fase sólida) utilizando métodos conocidos en la técnica, como los indicados en Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1964)), Houghten et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132 (1985)), y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL (1984)). Estos polipéptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en el extremo amino-terminal. Los polipéptidos o fragmentos NNT-1 sintetizados de modo químico pueden oxidarse utilizando métodos indicados en estas referencias bibliográficas para formar puentes disulfuro. Los polipéptidos o fragmentos NNT-1 pueden emplearse como sustitutos biológicamente activos o inmunológicos para polipéptidos NNT-1 naturales purificados en procesos terapéuticos e inmunológicos.
IV. Derivados de NNT-1 químicamente modificados
Las composiciones de NNT-1 químicamente modificadas (es decir, "derivados"), en las que el polipéptido NNT-1 está unido a un polímero ("polímeros de NNT-1") se incluyen dentro del alcance de la presente invención. El polímero seleccionado es, de modo típico, soluble en agua de forma que la proteína a la cual está unida no precipita en un medio acuoso, como un medio fisiológico. El polímero seleccionado normalmente se modifica para que tenga un único grupo reactivo, como un éster activo para la acilación o un aldehído para la alquilación, de modo que el grado de polimerización puede controlarse según se proporciona en los presentes métodos. El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o no ramificado. Se incluye dentro del alcance de los polímeros de 
\hbox{NNT-1}
una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para el uso terapéutico del producto final de la preparación, el polímero será farmacéuticamente aceptable.
El polímero soluble en agua, o sus mezclas, puede seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), monometoxipolietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli(N-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y poli(alcohol vinílico).
Para las reacciones de acilación, el(los) polímero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un único grupo éster reactivo. Para la alquilación reductora, el(los) polímero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un único grupo aldehído reactivo. Un aldehído reactivo preferido es propionaldehído de polietilenglicol, que es hidroestable, o sus derivados de monoalcoxi C1-C10 o monoariloxi C1-C10 (véase la patente de EEUU nº 5.252.714).
La pegilación de NNT-1 puede llevarse a cabo mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica, como se describe, por ejemplo, en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992); documento EP 0154316; y documento EP 0401384. Preferiblemente, la pegilación se realiza mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se describe a continuación.
La pegilación mediante acilación implica, en general, hacer reaccionar un derivado de éster activo de polietilenglicol (PEG) con una proteína NNT-1. Puede utilizarse cualquier molécula de PEG reactiva conocida o posteriormente descubierta para realizar la pegilación de NNT-1. Un éster de PEG activado preferido es PEG esterificado con
N-hidroxisuccinimida ("NHS"). Tal como se utiliza en la presente, se contempla que "acilación" incluya, sin limitación, los siguientes tipos de enlaces entre NNT-1 y un polímero soluble en agua, como PEG: amida, carbamato, uretano y similares, como se describe en Bioconjugate Chem., 5:133-140 (1994). Las condiciones de reacción pueden seleccionarse de cualquiera de las conocidas en la técnica de la pegilación, o de las que se desarrollen posteriormente, con la condición de que se eviten condiciones como la temperatura, el disolvente y el pH, que inactiven la especie NNT-1.
La pegilación mediante acilación normalmente produce un producto NNT-1 polipegilado, en el que los grupos \varepsilon-amino de la lisina están pegilados a través de un grupo de enlace acilo. Preferiblemente, el enlace conector será una amida. También preferiblemente, el producto resultante estará al menos aproximadamente 95% mono-, di- o tripegilado. Sin embargo, algunas especies con grados mayores de pegilación (hasta el número máximo de grupos \varepsilon-aminoácido de lisina de NNT-1, más un grupo \alpha-amino en el extremo amino-terminal de NNT-1) se formarán normalmente, en cantidades que dependen de las condiciones de reacción concretas utilizadas. Si se desea, pueden separarse más especies pegiladas purificadas de la mezcla, en particular especies sin reaccionar, mediante técnicas de purificación convencionales, incluyendo, entre otras, diálisis, desalación, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, y electroforesis.
La pegilación mediante alquilación implica, en general, hacer reaccionar un derivado de aldehído terminal de PEG con una proteína, como NNT-1, en presencia de un agente reductor. Independientemente del grado de pegilación, los grupos PEG están unidos preferiblemente a la proteína a través de un grupo -CH_{2}-NH-. Haciendo referencia particularmente al grupo -CH_{2}-, este tipo de enlace se indica en la presente como un enlace "alquilo".
La derivatización a través de la alquilación reductora para producir un producto monopegilado aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al extremo N-terminal) disponibles para la derivatización en NNT-1. De modo típico, la reacción se realiza a un pH (véase a continuación) que permite aprovechar las diferencias de pK_{a} entre los grupos \varepsilon-amino de los restos lisina y el grupo \alpha-amino del resto N-terminal de la proteína. Mediante esta derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo, como un aldehído, a una proteína: la conjugación con el polímero se produce predominantemente en el extremo N-terminal de la proteína, sin una modificación significativa de otros grupos reactivos, como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de moléculas conjugadas de proteína NNT-1-monopolímero (lo cual significa una proteína NNT-1 a la cual se unido una molécula de polímero sustancialmente sólo (es decir, al menos aproximadamente 95%) en una única localización sobre la proteína NNT-1). De modo más específico, si se utiliza polietilenglicol, la presente invencion también proporciona una proteína NNT-1 pegilada que carece de grupos de enlace probablemente antigénicos, y que tiene la molécula de polietilenglicol acoplada directamente a la proteína NNT-1.
Un polímero soluble en agua particularmente preferido para utilizar en la presente es polietilenglicol, abreviado PEG. Tal como se utiliza en la presente, "polietilenglicol" pretende incluir cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, como mono(alcoxi C1-C10)- o mono(ariloxi C1-C10)polietilenglicol.
En general, la derivatización química puede realizarse bajo cualquier condición adecuada utilizada para hacer reaccionar una sustancia biológicamente activa con una molécula de polímero activada. Los métodos para preparar NNT-1 pegilado comprenden, en general, las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido NNT-1 con polietilenglicol (como un derivado de aldehído o éster reactivo de PEG) bajo condiciones en las que el NNT-1 se une a uno o más grupos PEG, y (b) obtener el(los) producto(s) de la reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación se determinarán basándose en parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción de PEG:proteína, mayor será el porcentaje de producto polipegilado.
La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de moléculas conjugadas de monopolímero/proteína NNT-1 comprende, en general, las etapas de (a) hacer reaccionar una proteína NNT-1 con una molécula de PEG reactiva bajo condiciones de alquilación reductora, a un pH adecuado que permita la modificación selectiva del grupo \alpha-amino en el extremo amino-terminal de dicha proteína NNT-1; y (b) obtener el(los) producto(s) de la reacción.
Para una población sustancialmente homogénea de moléculas conjugadas de monopolímero/proteína NNT-1, las condiciones de la reacción de la alquilación reductora son las que permiten la unión selectiva del resto polímero soluble en agua al extremo N-terminal de NNT-1. Estas condiciones de reacción, en general, proporcionan las diferencias de pK_{a} entre los grupos amino de la lisina y el grupo \alpha-amino del extremo N-terminal (el pK_{a} es el pH al cual 50% de los grupos amino están protonados y 50% no). El pH también afecta a la razón entre polímero a proteína que se va a utilizar. En general, si el pH es menor, se deseará un mayor exceso de polímero a proteína (es decir, cuanto menos reactivo sea el grupo \alpha-amino N-terminal, más polímero se necesita para lograr las condiciones óptimas). Si el pH es mayor, la razón polímero:proteína necesaria no será tan grande (es decir, hay más grupos reactivos disponibles, así que se necesitan menos moléculas de polímero). Para los fines de la presente invención, el pH se encontrará, en general, en el intervalo de 3-5, preferiblemente 4-5.
Otra consideración importante es el peso molecular del polímero. En general, cuanto mayor sea el peso molecular del polímero, menor es el número de moléculas de polímero que pueden unirse a la proteína. De forma similar, debe considerarse la ramificación del polímero cuando se optimizan estos parámetros. En general, cuanto mayor sea el peso molecular (o cuanto más ramificaciones haya), mayor será la razón polímero:proteína. En general, para las reacciones de pegilación contempladas en la presente, el peso molecular medio preferido es desde aproximadamente 2 kDa a aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica \pm 1 kDa). El peso molecular medio preferido es desde aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa, y es particularmente preferible desde aproximadamente 12 kDa a aproximadamente 25 kDa. La razón entre polímero soluble en agua a proteína NNT-1 variará, en general, desde 1:1 a 100:1, preferiblemente (para la polipegilación) desde 1:1 a 20:1, y (para la monopegilación) desde 1:1 a 5:1.
Utilizando las condiciones indicadas anteriormente, la alquilación reductora proporcionará la unión selectiva del polímero a cualquier proteína NNT-1 que tiene un grupo \alpha-amino en el extremo amino-terminal, y proporcionará una preparación sustancialmente homogénea de conjugado de monopolímero/proteína NNT-1. La expresión "conjugado de monopolímero/proteína NNT-1" se utiliza en la presente para indicar una composición compuesta de una única molécula de polímero unida a una molécula de proteína NNT-1. El conjugado de monopolímero/proteína NNT-1 tendrá preferiblemente una molécula de polímero localizada en el extremo N-terminal, pero no en los grupos laterales amino de la lisina. La preparación será preferiblemente mayor que 90% de conjugado de monopolímero/proteína 
\hbox{NNT-1,}
y más preferiblemente mayor que 95% de conjugado de monopolímero/proteína NNT-1, estando sin reaccionar el resto de las moléculas observables (es decir, proteína que carece del resto polímero). Los ejemplos a continuación proporcionan una preparación que es al menos aproximadamente 90% de conjugado de monopolímero/proteína, y aproximadamente 10% de proteína sin reaccionar. El conjugado de monopolímero/proteína tiene actividad biológica.
Para la presente alquilación reductora, el agente reductor debe ser estable en una disolución acuosa, y preferiblemente es capaz de reducir sólo la base de Schiff formada en el proceso inicial de la alquilación reductora. Los agentes reductores preferidos pueden seleccionarse del grupo que consiste en borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, dimetilaminaborano, trimetilaminaborano y piridinborano. Un agente reductor particularmente preferido es cianoborohidruro de sodio.
Otros parámetros de la reacción, como disolvente, tiempos de reacción, temperaturas, etc., y medios de purificación de los productos, pueden determinarse basándose en la información publicada con relación a la derivatización de las proteínas con polímeros solubles en agua.
Una mezcla de moléculas conjugadas de polímero-proteína NNT-1 puede prepararse mediante métodos de acilación y/o alquilación, según se describió anteriormente, y se puede seleccionar la proporción de conjugado de monopolímero/proteína que se va a incluir en la mezcla. Por tanto, cuando se desee puede prepararse una mezcla de diversas proteínas con diversos números de moléculas de polímero unidas (es decir, di-, tri-, tetra-, etc.), y combinarse con el material de conjugado de monopolímero/proteína NNT-1 preparado utilizando los presentes métodos.
En general, los trastornos que pueden aliviarse o modularse mediante la administración del polímero/NNT-1 de la presente incluyen los descritos en la presente para las moléculas de NNT-1 en general. Sin embargo, las moléculas de polímero/NNT-1 descritas en la presente pueden tener otras actividades, actividades potenciadas o reducidas, u otras características, comparadas con las moléculas no derivatizadas.
V. Combinaciones
Los polipéptidos NNT-1 y sus fragmentos, tanto si están químicamente modificados como si no, pueden emplearse por sí solos, o junto con otras composiciones farmacéuticas, como por ejemplo factores neurotróficos, citoquinas, interferones, interleuquinas, factores del crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios, agonistas o antagonistas de receptores de neurotransmisores y/o anticuerpos, en el tratamiento de trastornos del sistema neurológico o inmunológico.
VI. Anticuerpos
Los polipéptidos, fragmentos y/o derivados NNT-1 pueden utilizarse para preparar anticuerpos generados mediante métodos convencionales. Por tanto, también se contemplan dentro del alcance de la presente invención anticuerpos que reaccionan con los polipéptidos NNT-1, así como los fragmentos reactivos de dichos anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena sencilla y/o biespecíficos. De forma típica, el anticuerpo o su fragmento estará "humanizado", es decir, se prepara para evitar o minimizar una reacción inmunológica frente al anticuerpo cuando se administra a un paciente. El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier fragmento que sea reactivo con el NNT-1 de la presente invención, como F_{ab}, F_{ab'}, etc. La invención también proporciona hibridomas generados presentando el NNT-1 o un fragmento de éste como antígeno a un mamífero seleccionado, seguido de la fusión de las células (por ejemplo, células de bazo) del mamífero con ciertas células cancerosas para crear líneas celulares inmortalizadas mediante técnicas conocidas. Los métodos empleados para generar estas líneas celulares y anticuerpos dirigidos contra todo o parte de un polipéptido NNT-1 humano de la presente invención también se incluyen en la invención.
Los anticuerpos pueden utilizarse de modo terapéutico, como para inhibir la unión de NNT-1 a su receptor. Los anticuerpos pueden utilizarse además para fines de diagnóstico in vivo e in vitro, como en forma marcada para detectar la presencia de NNT-1 en un fluido corporal.
VII. Composiciones terapéuticas y su administración
Tal como se utiliza en la presente, las expresiones "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a la cantidad de NNT-1 necesaria para sostener una o más actividades biológicas de NNT-1, como se indicó anteriormente.
Las composiciones terapéuticas para tratar diversos trastornos o enfermedades neurológicos se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Estas composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido NNT-1 o un fragmento de éste (cualquiera de los cuales puede estar químicamente modificado) mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El material vehículo puede ser agua para inyección, preferiblemente suplementada con otros materiales habituales en disoluciones para la administración a mamíferos. De modo típico, un compuesto terapéutico de NNT-1 se administrará en forma de una composición que comprende el polipéptido NNT-1 purificado o un fragmento de éste (que puede estar químicamente modificado) junto con uno o más vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. La disolución salina tamponada neutra o la disolución salina mezclada con albúmina de suero son ejemplos de vehículos apropiados. Preferiblemente, el producto se formula como un liofilizado utilizando excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa). Otros vehículos, diluyentes y excipientes convencionales pueden incluirse si se desea. Un ejemplo de una composición comprende tampón citrato de pH aproximadamente 4,0-4,5, que también puede incluir NaCl.
Las composiciones de NNT-1 pueden administrarse de modo sistémico por vía parenteral. Como alternativa, las composiciones pueden administrarse por vía intravenosa o subcutánea. Cuando se administran de modo sistémico, las composiciones terapéuticas para utilizar en esta invención pueden estar en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable apirógena. La preparación de estas disoluciones de proteínas farmacéuticamente aceptables, tomando en consideración el pH, la isotonicidad, la estabilidad y similares, se encuentra dentro de la técnica.
Las formulaciones terapéuticas de las composiciones de NNT-1 útiles para practicar la presente invención pueden prepararse para su conservación mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990)) en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores y son preferiblemente inertes a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes, como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; azúcar-alcoholes, como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).
La composición de NNT-1 que se utiliza para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue con facilidad mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición de NNT-1 está liofilizada, la esterilización utilizando estos métodos puede realizarse antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para la administración parenteral se conserva, habitualmente, en forma liofilizada o en disolución.
Las composiciones terapéuticas, en general, se colocan en un recipiente que tiene un acceso estéril, por ejemplo, una bolsa para disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede punzarse mediante una aguja de inyección hipodérmica.
La vía de administración de la composición se ajusta a los métodos conocidos, por ejemplo, vía oral, mediante inyección o infusión por las vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida o dispositivos de implantación, que pueden implicar, opcionalmente, el uso de un catéter. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse de forma continua mediante infusión, inyección en embolada o mediante un dispositivo de implantación. Como alternativa o además, el NNT-1 puede administrarse de forma local mediante una implantación sobre el área afectada de una membrana, esponja u otro material apropiado en el cual se ha absorbido el polipéptido NNT-1.
Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, como por ejemplo, en un ventrículo cerebral o en el parénquima cerebral, y la administración del NNT-1 puede realizarse directamente a través del dispositivo mediante una administración en embolada o continua, o a través de un catéter utilizando infusión continua.
El polipéptido NNT-1 puede administrarse en una formulación o preparación de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímeros semipermeables en forma de artículos con forma, por ejemplo películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (documento U.S. 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros del ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamina (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al., supra), o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980); documento EP 52.322; documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949).
En algunos casos, puede resultar deseable utilizar composiciones de NNT-1 de una manera ex vivo, es decir, para tratar células o tejidos que se han retirado del paciente y que posteriormente se implantan de nuevo al paciente.
En otros casos, el NNT-1 puede administrarse a través de la implantación en pacientes de ciertas células que se han modificado genéticamente para que expresen y segreguen el polipéptido NNT-1. Estas células pueden ser células animales o humanas, y pueden derivarse del tejido del propio paciente o de otra fuente, humana o no humana. Opcionalmente, las células pueden inmortalizarse. Las células pueden implantarse en el cerebro, las glándulas adrenales o en otros tejidos u órganos corporales adecuados del paciente.
En ciertas situaciones, puede resultar deseable utilizar métodos de terapia génica para la administración de 
\hbox{NNT-1}
a pacientes que sufren ciertos trastornos neurológicos o inmunológicos. En estas situaciones, el DNA genómico, cDNA y/o DNA sintético que codifica NNT-1 o un fragmento o variante de éste puede unirse operablemente con un promotor constitutivo o inducible que es activo en el tejido en el que la composición se va a inyectar. Este constructo de DNA de NNT-1 insertado en un vector, o por sí solo sin vector, puede inyectarse directamente al cerebro u otro tejido neuronal o no neuronal.
Como alternativa, un constructo de DNA de NNT-1 puede inyectarse directamente en tejido muscular, en el que puede ser captado por las células y expresado en las células, con la condición de que el DNA de NNT-1 esté unido operablemente a un promotor que es activo en tejido muscular, como el promotor de citomegalovirus (CMV), el virus del sarcoma de Rous (RSV), o el promotor de creatina-quinasa muscular. De forma típica, el constructo de DNA puede incluir (además del DNA de NNT-1 y un promotor), secuencias de vector obtenidas de vectores como vector de adenovirus, vector de virus adenoasociado, un vector retrovírico y/o un vector de herpes virus. El constructo de DNA/vector puede mezclarse con un(os) vehículo(s) farmacéuticamente aceptable(s) para la inyección.
Una cantidad eficaz de la(s) composición(es) de NNT-1 para ser empleada terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, como la indicación para la cual se está utilizando el NNT-1, la vía de administración y el trastorno del paciente. Por consiguiente, será necesario que el médico valore la dosificación y modifique la vía de administración si se requiere, para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede variar desde aproximadamente 0,1 \mug/kg hasta 10 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. De modo típico, un médico administrará la composición de NNT-1 hasta que se alcance una dosificación que logre el efecto deseado. La composición de NNT-1, por tanto, puede administrarse como una dosis única, o como dos o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de NNT-1) a lo largo del tiempo, o como una infusión continua mediante un dispositivo de implantación o catéter.
A medida que se lleven a cabo más estudios, surgirá información con respecto a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversos trastornos en diversos pacientes, y el experto en la técnica, considerando el contexto terapéutico, el tipo de trastorno bajo tratamiento, la edad y salud general del receptor, será capaz de averiguar la dosificación apropiada.
VIII. Trastornos que se tratan con NNT-1
Las proteínas, fragmentos y/o derivados de NNT-1 pueden utilizarse para tratar enfermedades y trastornos del sistema nervioso central o periférico, que pueden estar asociados con alteraciones en el patrón de expresión de 
\hbox{NNT-1,}
o que pueden beneficiarse de la exposición al NNT-1 o anticuerpos anti-NNT-1.
La proteína NNT-1 y/o los fragmentos o derivados de ésta pueden utilizarse para tratar pacientes en los que diversas células del sistema nervioso central, autónomo o periférico se han degenerado y/o se han dañado por enfermedad congénita, traumatismo, lesión mecánica, cirugía, accidentes cerebrovasculares, isquemia, infección, enfermedad metabólica, deficiencias nutricionales, malignidades y/o agentes tóxicos. De modo más específico, los niveles de proteínas NNT-1 pueden modularse (infra- o sobrerregularse) para indicaciones como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, el síndrome de Charcot-Marie-Tooth, la enfermedad de Huntington, la neuropatía periférica inducida por diabetes u otro trastorno metabólico y/o distrofias o degeneración de la retina neural, como retinitis pigmentosa, retinopatías inducidas por fármacos, formas estacionarias de ceguera nocturna, degeneración progresiva de los conos-bastones y similares. Puesto que el NNT-1 también se expresa en células del sistema inmunológico (véase el ejemplo V a continuación), también puede ser útil para tratar enfermedades provocadas por trastornos inmunológicos. Además, puesto que el NNT-1 también se expresa en células hematopoyéticas (véase el ejemplo V a continuación), también puede ser útil para tratar enfermedades provocadas por trastornos del sistema hematopoyético.
Además, las proteínas, fragmentos y/o derivados de NNT-1 pueden utilizarse para tratar enfermedades y trastornos del sistema inmunológico que implican a células B y/o células T, preferiblemente células B. Como se muestra en los ejemplos IX-XI de la presente, el NNT-1 tiene una actividad de estimulación de la producción de células B y, en un grado menor, de células T.
Existen varias inmunodeficiencias humorales primarias que son dianas potenciales para este factor. Aunque algo raras, estas enfermedades son todas crónicas y requieren un tratamiento a largo plazo. La primera es la inmunodeficiencia variable común o CVID, que se caracteriza por unos niveles casi normales de células B en la circulación, pero que carecen de la capacidad para diferenciarse de modo apropiado en células que producen inmunoglobulina. Los individuos con CVID son susceptibles a infecciones bacterianas recurrentes.
Otra enfermedad diana de NNT-1 es la deficiencia de IgA selectiva, que también da como resultado infecciones recurrentes, normalmente limitadas al pulmón, el tracto gastrointestinal y urogenital. La deficiencia de IgA selectiva es una de las más comunes de estas enfermedades, y tiene una prevalencia de entre 0,03%-0,97% de la población.
Otras enfermedades diana de NNT-1 incluyen diversas formas de hipogammaglobulinemia, agammaglobulinemia ligada a X y/o trastornos relacionados con una de estas enfermedades, como infecciones recurrentes, deficiencias renales o giardasis. Véase, Clin. Immunol. and Immunopath., 40(1):13-24 (1986).
La estimulación de la respuesta inmunológica humoral a ciertas vacunas puede ser otro uso de los polipéptidos NNT-1. Por ejemplo, la producción de anticuerpos después de la administración de vacunas orales a menudo es baja y, por tanto, protege durante un periodo limitado de tiempo. Se prevé el uso de NNT-1 como adyuvante para mejorar la producción de anticuerpos después de la vacunación.
Debido a su capacidad para inhibir la producción de TNF-\alpha inducida por LPS, el NNT-1 puede encontrar uso en el tratamiento de la sepsis. Aunque muchos planteamientos basados en la modificación de la respuesta biológica a la solución de este problema clínico muy importante han demostrado no tener una validez convincente, sigue existiendo la posibilidad de que el NNT-1 pueda tener éxito en donde otros candidatos terapéuticos han fallado. La reacción de Jarish-Schwarzmann es un trastorno clínico que se parece a la sepsis, y es estrictamente consecuencia de la acción tóxica del TNF. El uso de un anticuerpo anti-TNF ha demostrado ser un planteamiento de éxito clínico frente al tratamiento de este trastorno. Este es un trastorno en el que el NNT-1 puede mostrar un valor clínico, en términos de sus propiedades anti-TNF y antiinflamatorias.
IX. Ensayos para seleccionar inhibidores de NNT-1
En algunas situaciones, puede resultar deseable inhibir o disminuir significativamente el nivel de actividad NNT-1. Los compuestos que inhiben la actividad NNT-1 pueden administrarse de una manera ex vivo, o de una manera in vivo mediante inyección local o intravenosa, o mediante administración oral, dispositivo de implantación o similares. Los ensayos descritos a continuación proporcionan ejemplos de métodos útiles para identificar compuestos que pueden inhibir la actividad NNT-1.
Para facilitar la lectura, se utilizan las siguientes definiciones en la presente para describir los ensayos.
La(s) "molécula(s) de ensayo" se refiere(n) a la(s) molécula(s) que está(n) siendo evaluada(s) como inhibidor de NNT-1, de forma típica en virtud de su capacidad potencial para bloquear la interaccion del NNT-1 con su receptor.
El receptor de NNT-1 puede aislarse, por ejemplo, mediante clonación de expresión utilizando NNT-1 marcado (por ejemplo, yodado).
Pueden realizarse varios tipos de ensayos in vitro utilizando proteína purificada para identificar los compuestos que interrumpen la actividad NNT-1. Esta interrupción puede realizarse mediante un compuesto que, de forma típica, inhibe la interacción del NNT-1 con su receptor.
En un ensayo, la proteína NNT-1 purificada o un fragmento de ésta (preparado, por ejemplo, utilizando los métodos descritos anteriormente) puede inmovilizarse mediante su unión al fondo de pocillos de una placa de microvaloración. Entonces puede añadirse a los pocillos el receptor de NNT-1 marcado de modo radiactivo, así como la(s) molécula(s) de ensayo, de uno en uno o simultáneamente. Después de la incubación, los pocillos pueden lavarse y contarse utilizando un contador de centelleo para la radiactividad, para determinar el grado de unión del receptor/NNT-1 en presencia de la molécula de ensayo. De modo típico, la molécula se ensaya a lo largo de un intervalo de concentraciones, y puede utilizarse una serie de pocillos "control" que carecen de uno o más elementos de los ensayos para lograr precisión en la evaluación de los resultados. Una variación de este ensayo implica unir el receptor a los pocillos, y añadir el NNT-1 marcado de modo radiactivo junto con la molécula de ensayo a los pocillos. Después de una incubación y lavado, los pocillos pueden contarse para determinar la radiactividad.
Hay varios medios disponibles, incluyendo el marcaje por radiactividad, para "marcar" el NNT-1. Por ejemplo, la proteína NNT-1 puede marcarse de modo radiactivo utilizando 125-I o 35-S. Como alternativa, puede utilizarse una proteína de fusión de NNT-1, en la que el DNA que codifica NNT-1 está condensado con la secuencia codificadora de un péptido, como el epitopo c-myc. La proteína de fusión de NNT-1-myc puede detectarse con facilidad con anticuerpos disponibles en el mercado dirigidos contra myc.
Una alternativa a los ensayos de unión de tipo placa de microvaloración comprende inmovilizar NNT-1 o su receptor sobre esferas de agarosa, esferas acrílicas u otros tipos de estos sustratos inertes. El sustrato inerte que contiene el NNT-1 o su receptor puede colocarse en una disolución que contiene la molécula de ensayo, junto con el componente complementario (el receptor o la proteína NNT-1) que se ha marcado de modo radiactivo o de modo fluorescente; después de la incubación, el sustrato inerte puede precipitarse mediante centrifugación, y puede ensayarse la cantidad de unión entre NNT-1 y el receptor utilizando los métodos descritos anteriormente. Como alternativa, el complejo del sustrato inerte puede inmovilizarse en una columna y hacer pasar la molécula de ensayo y el componente complementario a través de la columna. La formación del complejo de receptor/NNT-1 puede entonces evaluarse utilizando cualquiera de las técnicas indicadas anteriormente, es decir, marcaje radiactivo, marcaje con anticuerpos o similares.
Otro tipo de ensayo in vitro que es útil para identificar una molécula que inhibe la actividad NNT-1 es el sistema de ensayo Biacore (Pharmacia, Piscataway, NJ) que utiliza un sistema de detector de resonancia de plasmón de superficie, y siguiendo el protocolo del fabricante. Este ensayo implica esencialmente la unión covalente de NNT-1 o su receptor a un chip detector revestido con dextrano, que está localizado en el detector. La molécula de ensayo y el componente complementario pueden entonces inyectarse en la cámara que contiene el chip detector de forma simultánea o secuencial, y puede evaluarse la cantidad de unión de receptor/NNT-1 basándose en el cambio en la masa molecular que está físicamente asociada con el lado revestido de dextrano del chip detector; el cambio en la masa molecular puede medirse mediante el sistema detector.
En algunos casos, puede resultar deseable evaluar dos o más moléculas de ensayo juntas para su uso en la disminución o inhibición de la actividad NNT-1. En estos casos, los ensayos indicados anteriormente pueden modificarse con facilidad añadiendo esta(s) molécula(s) de ensayo adicional(es) de forma simultánea o posterior a la primera molécula de ensayo. El resto de las etapas en el ensayo puede ser como se indicó anteriormente.
X. Mamíferos transgénicos
También se incluyen dentro del alcance de la presente invención mamíferos no humanos, como ratones, ratas, conejos, cabras u ovejas en los que el gen (o genes) que codifica el equivalente humano de NNT-1 se ha interrumpido ("eliminado"), de modo que el nivel de expresión de este gen disminuye significativamente o se elimina por completo. Estos mamíferos pueden prepararse utilizando técnicas y métodos como los descritos en la patente de EEUU nº 5.557.032. La presente invención incluye además mamíferos no humanos como ratones, ratas, conejos, cabras u ovejas en los que el gen (o genes) que codifica el NNT-1 (la forma nativa de NNT-1 para el mamífero, o un gen NNT-1 heterólogo) está sobreexpresado por el mamífero, creando, con ello, un mamífero "transgénico". Estos mamíferos transgénicos pueden prepararse utilizando métodos muy conocidos como los descritos en la patente de EEUU
nº 5.489.743, y la solicitud de patente PCT nº WO94/28122, publicada el 8 de diciembre, 1994.
Se pretende que los siguientes ejemplos sean sólo ilustrativos, y no debe considerarse que limiten el alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplos
Los métodos convencionales para la preparación de bancos, clonación de DNA y expresión de proteínas se indican en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)), y en Ausubel et al., eds. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, Nueva York, NY (1995)).
Ejemplo I Clonación de cDNA y clon genómico para NNT-1 A. Construcción de un banco de cDNA
Se cultivaron células de linfoma de células T humano, células Jurkat, a 37ºC bajo una atmósfera de CO_{2} al 5% en medio RPMI 400 que contiene suero bovino fetal al 10%. El medio se tamponó con HEPES 10 mM, pH 7,5. Después de 8 transferencias, las células se dividieron en dos grupos. Un grupo se cultivó hasta la confluencia 
\hbox{(2 x 10 ^{7} }
células/matraz), y el RNA recogido de estas células sirvió como RNA "conductor". El otro grupo era el grupo de "ensayo" y se activaron con el siguiente tratamiento.
Las células se activaron durante 8 horas añadiendo los superantígenos F(TSST) y enterotoxina B de estreptococos 80 ng/ml; el activador de PKC, PMA 50 ng/ml; el ionóforo de calcio A21832 125 ng/ml. También se añadió el inhibidor de la traducción de proteínas cicloheximida a una concentración de 1 mg/ml. El RNA se recogió de los diferentes grupos de células en diferentes momentos de tiempo.
1. Preparación de RNA total
Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 300 x g durante 5 minutos y se lavaron con PBS (disolución salina tamponada con fosfato), y se resuspendieron en Ultraspec II (Biotex, Inc., TX) a una concentración de 
\hbox{5
x 10 ^{6} }
células/ml de Ultraspec II. Las células entonces se lisaron mediante cuatro transferencias a través de una jeringa de calibre 21. El homogeneizado se incubó en hielo durante 15 minutos, entonces se añadieron 0,2 volúmenes de cloroformo, se mezcló bien y se reincubó en hielo durante 10 minutos más, y se centrifugó a 12000 x g durante 30 minutos en tubos corex de 30 ml. El sobrenadante de la poscentrifugación se guardó y se rechazó el residuo. Se añadieron 0,05 volúmenes de la resina de unión de RNA comercializada por Biotex como parte del kit de aislamiento, después de la adición de 0,5 volúmenes de isopropanol. Después de sedimentar la resina mediante centrifugación 
\hbox{(300 x g}
durante 5 minutos), la resina se lavó dos veces con etanol exento de RNasa al 75%, y se secó al aire a 50ºC durante 10 minutos. El RNA total entonces se eluyó de la resina resuspendiendo la resina en 1 volumen de agua exenta de RNasa, agitando en vórtice vigorosamente durante 1 minuto, y después centrifugando a 13000 x g durante 1 minuto. El RNA total entonces se trasladó a un nuevo tubo Eppendorf y el sedimento de la resina se rechazó. 2. Aislamiento de poli(A)^{+} RNA
Se utilizó el sistema de aislamiento de mRNA Oligotex de Qiagen como describe el fabricante; el procedimiento se repitió dos veces para obtener poli(A)^{+} RNA puro. Esto es especialmente importante para un banco cebado aleatoriamente para minimizar el número de copias de RNA ribosómico en el cDNA. Entonces se determinó la integridad del mRNA mediante espectrocopía y electroforesis en gel desnaturalizante de formamida.
La primera cadena del cDNA se sintetizó siguiendo el protocolo de síntesis de cDNA BRL. Para eliminar el mRNA residual del cDNA diana, la reacción de la primera cadena del cDNA se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con acetato de amonio 2 M y 3 volúmenes de etanol. Los híbridos de cDNA/mRNA entonces se resuspendieron en NaOH 0,3 M en presencia de EDTA 2 mM y se incubaron a 68ºC durante 15 minutos. La reacción de hidrólisis se neutralizó con un exceso de aproximadamente 1,5 M de Tris HCl puro. El cDNA entonces se extrajo con fenol/cloroformo y se reprecipitó con acetato de amonio 2 M y 3 volúmenes de etanol, se enjuagó con etanol al 75%, y se resuspendió en
7 ml de agua estéril. La cadena sencilla de cDNA se adaptó siguiendo el protocolo del kit de adaptación de Boehringer Mannheim.
3. Preparación de mRNA conductor y fotobiotinilación
El poli(A) RNA se aisló como se describió anteriormente. Entonces se fotobiotiniló aproximadamente 20 mg dos veces con 20 mg de acetato de fotobiotina (Sigma), y se reconstituyó a una concentración de 1 mg/ml en agua exenta de RNasa. El exceso de fotobiotina se eliminó con isobutanol saturado con agua, se precipitó con etanol y se resuspendió en 30 ml de agua tratada con DEPC.
4. Reacción de hibridación de sustracción
El mRNA conductor fotobiotinilado se coprecipitó con el cDNA de ensayo y se resuspendió en 2 ml de agua exenta de RNasa. Para permitir que los ácidos nucleicos se integren en la disolución, la preparación se dejó a temperatura ambiente durante unas pocas horas con una agitación suave intermitente, seguida de otras 20 horas de incubación a 68ºC. El conductor fotobiotinilado se disolvió hasta una concentración final de 2 mg/ml. En general, debe utilizarse una concentración de RNA conductor de al menos 1 mg/ml.
5. Eliminación de los híbridos después de la hibridación
Después de la hibridación se añadió estreptavidina hasta una concentración final de 0,2 mg/ml y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La estreptavidina entonces se eliminó con una extracción con fenol/cloroformo. Después de la extracción, el cDNA se precipitó con etanol.
Un par de cebadores: AGCGCTACGGTCGACCCG GCG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT (ACG)X (SEQ ID NO:15) (cebador anclado Sal I T21) y GGA AGG AAA AAA GCG GCC GCT ACA (SEQ ID NO:16) (cebador Not I -N9) se utilizaron en la PCR para amplificar el cDNA. Se empleó el kit de PCR usado. Se utilizaron quince ciclos para generar material suficiente para el planteamiento de fraccionación en gel para permitir una representación de igual tamaño en el banco. Para permitir la reasociación del primer cebador, la temperatura de reasociación de los cinco ciclos iniciales de la PCR se realizó a 35ºC durante 1 minuto. El cDNA que representa las fracciones de diferente tamaño se fraccionó en un gel. Se añadieron adaptadores SalI al cDNA dúplex, que entonces se digirió con NotI y se clonó en el vector pSport.
B. Aislamiento del clon de cDNA
El banco se seleccionó mediante análisis de marcador de secuencia expresado (est). Los clones individuales de este banco se escogieron al azar y se secuenciaron en un secuenciador de DNA automático 373A de Applied Biosystems utilizando un cebador de vector y reacciones de terminación de tinte Taq (Applied Biosystems). La secuencia de nucleótidos resultante obtenida del clon de NNT-1 escogido al azar se tradujo, y después se comparó con la base de datos existente de secuencias de proteínas conocidas utilizando una versión modificada del programa FASTA.
Un clon (khjl-00008-f2) tenía aproximadamente 21% de homología al nivel de secuencia de aminoácidos traducida con CNTF. El inserto completo del clon de cDNA se secuenció y se encontró que codificaba un clon de longitud completa, es decir, contiene Met en el extremo 5' y un codón de terminación cadena arriba de Met, y otro codón de terminación en el extremo 3'.
La secuencia de este cDNA de longitud completa se muestra en la figura 1. La secuencia de aminoácidos predicha de la proteína se muestra en la figura 3. El péptido señal putativo abarca desde el aminoácido -27 (Met) hasta el aminoácido -1 (Ala).
C. Aislamiento del clon genómico
El DNA genómico de NNT-1 se obtuvo de un banco P1 genómico humano (Genome Systems Inc., St. Louis, MO; nº de catálogo P1-2535). El banco se seleccionó utilizando el cDNA de NNT-1 como sonda. El cDNA se marcó de modo radiactivo utilizando el kit Rediprime de Amersham (Amersham, Arlington Heights, IL; nº de catálogo RPN-1633), y la disolución de hibridación y prehibridación era: formamida al 50%, 5 x SSC, 5 x disolución de Denhardt, pirofosfato de sodio al 0,05%, SDS al 0,1%, y DNA de esperma de salmón 100 mg/ml. La prehibridación se realizó durante aproximadamente 1 hora, y la hibridación se realizó durante aproximadamente 16 horas a 42ºC.
Después de la hibridación, los filtros se lavaron en 0,2 x SSC y SDS al 0,1% a 42ºC durante aproximadamente 30 minutos, y después se expusieron a una película. Se identificaron dos clones positivos, y los plásmidos que contenían estos clones se purificaron según los protocolos de Genome Systems Inc. El DNA del plásmido entonces se secuenció directamente.
La secuencia genómica que codifica el NNT-1 aparece en la figura 2 (SEQ ID NO:3). El gen consiste en 3 exones y 2 intrones. Las regiones codificadoras se presentan en la parte de arriba, mientras que las regiones no codificadoras, incluyendo la región 5' sin traducir, los intrones y la región 3' sin traducir se presentan en la parte de abajo.
Ejemplo II Preparación de la proteína de mamífero recombinante de NNT-1
Se construyó un vector de expresión que contiene cDNA de NNT-1 humano y un péptido de bandera-marcador mediante amplificación de PCR del gen de fusión. Un cebador sentido con un sitio Hind III en el extremo 5':
(5'-AGCAAGCTTCACCATGGACCTCCGAGCAGGGGACTC-3') 
\hskip0,5cm
(SEQ ID NO:6)
que codifica desde el aminoácido -27 (Met) al aminoácido -21 (Asp) y un cebador antisentido con un sitio NotI en el extremo 5' que codifica el péptido bandera-marcador y los últimos 8 aminoácidos en el extremo 3'
(5'-AGCGGGGCCGCACTACTTGRCATCGTCGRCGTCCTTGTACTCGAAGCCATGAGCCCCCAGGTGCA
G-3') 
\hskip0,5cm
(SEQ ID NO:7)
se utilizó en la PCR para amplificar un gen de fusión. El gen de fusión se acopló al vector P CEP4 (Invitrogen Inc., San Diego, CA). El vector de expresión se transfectó en células EBNA-1 293 con lipofectina (BRL, Gaithesburg, MD) utilizando el método recomendado por el fabricante. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células 293 y el medio condicionado se recogieron y se analizaron mediante un análisis de la transferencia Western utilizando el anticuerpo anti-bandera-marcador (Eastman Kodak Co., New Haven, CT). La mayor parte de la proteína recombinante se encontró en el lisado de células 293. Por tanto, se utilizó el gel de anticuerpos anti-bandera (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) para purificar la proteína del lisado de células 293. Se purificó una proteína de 28-30 kd siguiendo el protocolo del fabricante. Esta proteína recombinante se utilizó en el análisis de la función biológica (para el ensayo de supervivencia de neuronas motoras y neuronas simpáticas). Se determinó que el aminoácido N-terminal de la proteína era Leu (aminoácido 1), indicando que el péptido señal potencial se ha escindido (aminoácido -27 a aminoácido -1).
Ejemplo III Preparación de la proteína NNT-1 en E. coli recombinante
Un clon de cDNA de NNT-1 que codifica los aminoácidos Leu (1) a Phe (198) de la SEQ ID NO:2 se insertó en el vector pAMG21, que es un derivado de pCFM 1656 (nº de registro ATCC 69576) y contiene sitios de restricción apropiados para la inserción de genes cadena abajo del promotor lux PR (véase la patente de EEUU nº 5.169.318 para una descripción del sistema de expresión lux). La célula hospedante utilizada fue E. coli K12, cepa CGSC 6159 (cepa genética de Yale University, New Haven, CT). Las células hospedantes se transformaron con el vector utilizando procedimientos de transformación convencionales, y después se incubaron en medio 2 XYT que contiene aproximadamente kanamicina 50 ul/ml a 30ºC. La inducción del producto del gen NNT-1 comenzó añadiendo el autoinductor lactona de N-(3-oxohexanoil)-DL-homoserina al medio de cultivo hasta una concentración final de aproximadamente 30 ng/ml, y los cultivos se incubaron a 30ºC o 37ºC durante aproximadamente 6 horas después de lo cual las células se estudiaron mediante microscopía para detectar cuerpos de inclusión.
La mayoría de la proteína NNT-1 se encontró localizada en los cuerpos de inclusión. Por tanto, se preparó una pasta de células sedimentando las células. Los cuerpos de inclusión se solubilizaron a un pH bajo y la proteína se purificó mediante precipitación secuencial. La proteína se dializó antes de cargar una muestra en un SDS-PAGE para evaluar la pureza. Una tinción de Coomassie del gel indicó que la proteína era al menos 95% pura.
Ejemplo IV Función neurobiológica del NNT-1 A. Ensayo de neuronas motoras de pollitos
Se preparó un cultivo enriquecido con neuronas motoras (NM) a partir de la médula espinal lumbar a partir de pollitos embriónicos del día E5.5. Las neuronas NM se enriquecieron utilizando un gradiente de metrizamida al 6,8%. Brevemente, se diseccionaron médulas espinales lumbares, se retiraron las meninges y DRG. Las médulas espinales se incubaron en papaína que contiene medio L15 (Gibco/BRL, Grand Island, NY) durante 20 minutos a 37ºC (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). Los fragmentos de la médula espinal enzimáticamente ablandados se disociaron en células individuales mediante un pipeteado. La suspensión celular entonces se dispuso en capas sobre un cojín de metrizamida al 6,8% (Serva, Feinbiochemicala, Alemania), y el tubo se centrifugó a 500 g durante 20 minutos. La interfase entre el cojín de metrizamida y la suspensión celular se recogió y se diluyó en medio de cultivo. La fracción entonces se dispuso en capas suavemente sobre un cojín de BSA al 4% y se centrifugó a 280 g durante 10 minutos. El sedimento se resuspendió en medio de cultivo que contiene medio L15 con suero bovino fetal al 10% suplementado con glucosa 3,6 mg/ml, selenita de sodio 5 ng/ml, progesterona 6,25 ng/ml, conalbúmina 0,1 mg/ml, putrescina 16 mg/ml, e insulina 5 mg/ml. Se sembraron 10.000 células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se añadieron diluciones en serie del factor neurotrófico (NNT-1 o CNTF) al cultivo y se incubó durante 3 días. En el día 3 se añadió MTT al cultivo durante 4,5 horas. El producto de formazán se solubilizó y las placas se leyeron a una longitud de onda de 570 con una resta de 650 nm para la interferencia visible. La lectura de la densidad óptica (DO) era proporcional al número de neuronas supervivientes en el cultivo. La absorbancia a 570 nm (mayor supervivencia de neuronas) en pocillos por triplicado se representa gráficamente como una función de la concentración final de 
\hbox{NNT-1}
o CNTF.
Los resultados del análisis se presentan en la figura 7. La absorbancia a 570 nm se expresa como 1000 veces la lectura real. Los resultados demuestran que NNT-1 puede sostener el crecimiento de neuronas motoras de pollitos. Su máxima actividad alcanza aproximadamente 90% la de CNTF.
B. Ensayo de neuronas simpáticas de pollito
Se prepararon cultivos de ganglios de la cadena simpática de embrión de pollito primarios. Brevemente, se retiraron ganglios simpáticos de huevos de gallina exentos de patógenos fértiles que se habían incubado durante 9 días a 37,6ºC en una atmósfera humidificada. Los ganglios se disociaron de modo químico mediante exposición primero a una disolución salina equilibrada de Hanks sin cationes divalentes, que contiene tampón HEPES 10 mM, pH 7,2 durante 10 minutos a 37ºC, y después mediante una exposición a una disolución de bactrotripsina al 0,125% 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) en disolución salina equilibrada de Hanks modificada como anteriormente durante 12 minutos a 37ºC. La tripsinización se detuvo mediante la adición de suero de ternera fetal hasta una concentración final de 10%.
Después de este tratamiento los ganglios se trasladaron a una disolución que consiste en medio de Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido en glucosa con bicarbonato que contiene suero de ternera fetal al 10% y HEPES 10 mM, pH 7,2, y se disociaron de modo mecánico mediante trituración durante aproximadamente 14 veces a través de una aguja de acero inoxidable de doble eje 1'' de calibre 20.
Los ganglios disociados entonces se colocaron en placa en medio de cultivo (medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero de ternera fetal al 10%, glutamina 4 mM, penicilina-G 60 mg/l, HEPES 25 mM, pH 7,2) en placas de cultivo de tejidos de 100 mm de diámetro (aproximadamente 40 ganglios disociados por placa) durante dos a tres horas. Este precultivo en placa se realizó para separar las células no neuronales, que se adhieren a la placa, de las células nerviosas, que no se adhieren. Después del precultivo en placa, las células nerviosas no adherentes se recogieron mediante centrifugación, se resuspendieron en medio de cultivo y se cultivaron en placa en 50 ml por pocillo en placas de cultivo de tejidos de microvaloración de 96 pocillos de semiárea a una densidad de 2500 células nerviosas por pocillo. Los pocillos de microvaloración se habían expuesto previamente a una disolución 1 mg/ml de poli-L-ornitina en borato de sodio 10 mM, pH 8,4, durante la noche a 4ºC, se lavaron en agua purificada estéril y se secaron al aire.
Las concentraciones finales de factores neurotróficos a las cuales se expusieron las células son las siguientes: 1) para el patrón de CNTF, curvas de dilución en serie de nueve puntos que varían desde 100 ng/ml a 6 pg/ml; 2) para la proteína NNT-1, curvas de dilución en serie de nueve puntos que varían desde 100 ng/ml a 0,12 pg/ml. Se añadieron 25 ml de una dilución en serie de la muestra que se va a ensayar para detectar actividad neurotrófica a cada pocillo y las placas se incubaron durante 38-48 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada que contienen CO_{2} al 7,5%. Después se añadieron 18 ml por pocillo de una disolución 1,5 mg/ml del tinte de tetrazolio MTT en medio Eagle modificado de Dulbecco con alto contenido en glucosa con bicarbonato que contiene HEPES 10 mM, pH 7,2, y los cultivos se colocaron en un incubador a 37ºC durante 4,5 horas. Después se añadieron 75 ml de una disolución de N,N-dimetilformamida al 50% que contiene dodecilsulfato de sodio al 20%, pH 4,7, para disolver el producto de formazán cristalino y las placas se incubaron en un incubador a 37ºC durante un mínimo de 12 horas. Se determinó la absorbancia a 579 nm con relación a un patrón de 650 nm para cada pocillo utilizando un lector de placas de microvaloración automático. La absorbancia resultante es proporcional al número de células vivas en cada pocillo, definidas como las células nerviosas capaces de reducir el tinte.
Los resultados del análisis se presentan en la figura 8. Los resultados demuestran que NNT-1 sostiene el crecimiento de neuronas simpáticas de pollito.
Ejemplo V Análisis de la transferencia Northern de la distribución tisular
Se adquirieron análisis de la transferencia Northern de tejidos humanos en Clontech (Palo Alto, CA). Los análisis de la transferencia Northern se sondaron con una sonda de cDNA de NNT-1 humano. Dos fragmentos de cDNA que abarcan la región codificadora 5' y 3' del NNT-1 se marcaron y se utilizaron como sonda para analizar la expresión tisular del gen NNT-1. El resultado demuestra que NNT-1 se expresa como un trancripto de 2,2 kb en los tejidos del bazo, nódulos linfáticos y linfocitos de sangre periférica, médula ósea e hígado fetal, riñón, pulmón, células de adenocarcinoma colorrectal SW840, células Hela S3, carcinoma de pulmón A 549, células de leucemia mielógena crónica K-562, y células Raji de linfoma de Burkitt. La distribución tisular del gen sugiere que el gen también puede estar implicado en el desarrollo del sistema inmunológico o de células hematopoyéticas.
Ejemplo VI Localización cromosómica del gen NNT-1
La localización cromosómica del gen se realizó mediante FISH. Un fragmento genómico de 14 kb se biotiniló con dATP utilizando el kit de marcaje BioNick de BRL (15 C, 1 hora). El procedimiento para FISH se realizó según Heng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9509-9513, 1992. El resultado demuestra que el gen está localizado en el cromosoma 11 q13 que está cerca del locus del gen CNTF humano (cromosoma 11 q12).
Ejemplo VII Aislamiento de un clon de cDNA de ratón
Se aisló un clon de cDNA parcial de ratón mediante amplificación con PCR a partir de cDNA de embrión de ratón de 11 días (Clontech, Palo Alto, CA) utilizando el cebador específico humano. El clon de cDNA de longitud completa se obtuvo además mediante 5' RACE y 3' RACE. La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos del cDNA de ratón se muestra en las figuras 4 y 5, respectivamente. La proteína de ratón comparte 96% de coincidencia con la proteína humana, indicando que la proteína se ha conservado en gran medida a lo largo de la evolución. Al igual que la proteína humana, la proteína de ratón también contiene un sitio de glicosilación N-unido potencial en el aminoácido 2 (Asn).
Ejemplo VIII Comparación de NNT-1 con otros miembros de la familia
La secuencia de aminoácidos de NNT-1 sugiere que la proteína pertenece a la familia del CNTF (SEQ ID NO:12), que incluye IL-11 (SEQ ID NO:8), IL-6 (SEQ ID NO:9), cardiotrofina (SEQ ID NO:11), oncostatina (SEQ ID NO:13) y el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) (SEQ ID NO:10). Se comparó la secuencia de aminoácidos de NNT-1 con todos los miembros de la familia mediante el programa de ordenador PILEUP, y los resultados aparecen en la figura 6. Al igual que todos los otros miembros de esta familia, se predijo que la estructura secundaria de la proteína NNT-1 contendría cuatro alfa-hélices antiparalelas.
Ejemplo IX Fenotipo de ratones transgénicos NNT-1 A. Fenotipo de ratones transgénicos NNT-1
La proteína codificada por el gen NNT-1 presentaba algo de homología con CNTF y actividad in vitro en ensayos de células de médula ósea y nerviosas. Los estudios de ratones transplantados con médula ósea transfectada con NNT-1 demuestran una pequeña linfoproliferación en tejidos linfoides asociadas al tracto gastrointestinal, pero no se observaron otros cambios fenotípicos obvios.
Materiales y métodos
Especie: ratón
Cepa: BDF1
Edad: 17 semanas (120 días)
Artículo de ensayo: NNT-1 (WX240)
Sexo: macho/hembra
Grupos de tratamientos
Grupo nº de ratón
Negativo 22, 23, 45, 63, 65
Positivo 35, 36, 46, 60, 62
No se detectaron anomalías obvias en los dos grupos.
Se realizó una necropsia macroscópica con tejidos seleccionados fijados en formaldehído de cinc tamponado para el examen histopatológico (cerebro, corazón, riñones, glándulas adrenales, duodeno, páncreas, vejiga, hígado, pulmones, bazo y lesiones macroscópicas). Los tejidos se fijaron durante la noche antes del procesamiento histológico rutinario. Los datos se analizaron utilizando el programa informático JMP (SAS Institute, Cary, NC).
Ensayos: peso de los órganos, peso corporal, histopatología, inmunohistología, análisis de la transferencia 
\hbox{Northern.}
Los siguientes cambios relacionados con el tratamiento se encontraban presentes en los ratones transgénicos 
\hbox{NNT-1.}
El bazo tenía una hiperplasia linfoide reactiva de moderada a marcada (figura 10), que implica a las áreas folicular (células B) y periarteriolar (células T) en los ratones transgénicos. La hiperplasia linfoide era más destacada en el ratón nº 62 de alta expresión (figura 10), y se correlaciona bien con la esplenomegalia observada en la necropsia. El otro ratón de alta expresión nº 60 sólo tenía una hiperplasia suave de las áreas linfoides, acompañada de hematopoyesis extramedular difusa masiva de los tres linajes. Aunque es difícil sacar conclusiones generales acerca de los efectos esplénicos del NNT-1 basándose en estos dos ratones de alta expresión, la linfoproliferación observada en el ratón nº 62 está de acuerdo con los descubrimientos de los inventores con la proteína inyectada (véase el ejemplo X A a continuación), mientras que la hematopoyesis extramedular encontrada en el ratón nº 60 puede reflejar una correlación in vivo de los descubrimientos previos en cultivos de médula ósea in vitro.
El hígado del ratón nº 60 tiene agregados multifocales de linfocitos y células plasmáticas infiltrados en los espacios perivasculares y expandiéndose hacia los sinusoides adyacentes en un patrón peculiar que parece "islas de linfopoyesis" intrahepáticas (figura 12). Mediante inmunohistoquímica, se descubrió que los agregados linfoides estaban compuestos de células B220+ y células CD3+. También se descubrieron infiltrados linfoides típicamente perivasculares similares, pero más suaves, en el ratón nº 62. Otros cambios que se encontraron en el hígado se produjeron de modo esporádico en ratones individuales en los grupos control y/o transgénico.
El tracto gastrointestinal presentaba una hiperplasia linfoide reactiva de mínima a moderada de los parches de Peyer (tejido linfoide asociado al intestino). De forma similar, los nódulos linfáticos cervicales y mesentéricos eran más reactivos en los ratones transgénicos que en los controles, aunque este cambio no era una característica tan destacada de este estudio como en el estudio de los inventores con la proteína NNT-1 inyectada (véase el ejemplo 
\hbox{X A}
a continuación).
La médula ósea, y el sistema nervioso central y periférico de los ratones transgénicos parecían normales. En general, los cambios en los otros tejidos se encontraron de modo esporádico en uno o más animales en los grupos de control negativo y/o transgénico, y se interpretó que no estaban relacionados con los transgenes.
Los datos de este estudio indican que los ratones transgénicos NNT-1 tenían un interesante fenotipo caracterizado por la proliferación de linfocitos T y B y células plasmáticas en múltiples tejidos periféricos, incluyendo el bazo, los nódulos linfáticos, el tejido linfoide asociado al intestino, los riñones y el hígado. El NNT-1 también puede inducir la hematopoyesis extramedular en algunos tejidos periféricos, como el bazo y el páncreas, en ausencia de cambios significativos en la sangre periférica o la médula ósea. Por tanto, los datos de los ratones transgénicos NNT-1 en general apoyan los descubrimientos del estudio de los inventores de ratones de 7 días con proteína NNT-1 inyectable (ejemplo X A a continuación), que indujo la proliferación de tejidos linfoides sin efectos detectables sobre la médula ósea o el sistema nervioso central.
De manera interesante, la glomerulonefritis detectada en los dos ratones hembra transgénicos NNT-1 de alta expresión se parece mucho a la glomerulonefritis espontánea observada en los ratones MRL/lpr (deficientes en Fas), que desarrollan una aparición temprana del síndrome autoinmunológico de tipo SLE asociado con la activación de células B policlonales, autoanticuerpos múltiples, complejos inmunológicos en la circulación y acumulación de una población inusual de células T doble negativo (CD4- CD8- TCRab+ CD3+) que también expresan la isoforma CD45R denominada B220+, que normalmente es un marcador de células B (Singer et al., Curr. Opin. Immunol., 6:913-920, 1994). Además, algunos de los efectos biológicos del NNT-1 también imitan a los de la interleuquina-6, que (como el CNTF, LIF e IL-11) utiliza el transductor de señal gp130 y tiene efectos pleiotrópicos sobre el hígado, riñón, cerebro, piel, sistemas inmunológico y hematopoyético (Ryffel et al., Int. Rev. Exp. Pathol., 34A:79-89, 1993). Por tanto, es importante determinar si los linfocitos encontrados en los tejidos o sangre periféricos tienen un fenotipo inusual con expresión dual de marcadores de células T y B mediante un análisis de citometría de flujo.
B. Inmunofenotipificación FACS de fundadores transgénicos NNT-1 Tejidos analizados
Se obtuvieron muestras sanguíneas de sangre periférica mediante sangrado retroorbital. Se recibieron nueve muestras de cada grupo de control de reproductor de la camada fundador y NNT-1 positivo (mediante PCR); ninguna estaba coagulada. Se incubaron aproximadamente 20-40 ul de sangre por muestra, primero con anticuerpo de bloqueo Fc, seguido de anticuerpos fluorescentes para diversos antígenos de la superficie celular.
Se eligieron anticuerpos como marcadores para diferenciar las poblaciones celulares más hematopoyéticas en la sangre periférica en circulación. Además se eligieron algunos marcadores de la activación/diferenciación de células B y T basándose en el origen del banco para esta secuencia marcadora expresada (est). El banco se creó a partir de células de Jurkat (una línea de células T) activadas con toxina del síndrome del choque tóxico (TSST).
Anticuerpos
Bloqueador Fc (CD32/16): como parte de la preincubación para bloquear la unión no específica, se utilizó un total de 21 anticuerpos. Los datos se analizaron como histogramas de un color.
Isotiocianato de fluoresceína (FITC) de IgG de rata + ficoeritreno (PE) de IgG de rata
FITC de IgG de Ham + PE de IgG de Ham
FITC de CD45 + PE de GR-1 (CD97) - - - - - - bandeja de leucocitos frente a granulocitos
FITC de CD4 + PE de CD8 - - - - - - subgrupos de células T helper frente a asesinas
FITC de Th1.2 + PE de B220 - - - - - - bandeja de marcador de células B frente a células T
FITC de CD3 + PE de CD28 - - - - - - marcadores de activación para T y B o sólo células T
FITC de CD3 + PE de CTLA4 - - - - - - bandeja de células T frente a activación de células T
FITC de ckit + PE de Sca-1 - - - - - - células mieloides y progenitoras frente a linfocitos progenitores y periféricos
FITC de CD40 + PE de CD40L - - - - - - Ag dif. de células B frente a ligando de células T para lo mismo
FITC de CD62L + PE de CD54 - - - - - - activación de moléculas de adhesión sobre células B y T
FITC de CD34 (los datos no se analizan)
Resultados
Se observó un aumento pronunciado en los números celulares absolutos para cuatro de los animales NNT-1 positivos para células B220+, CD40+, CD62L+ y CD54+. Después se confirmó que estos cuatro animales (nº 24, 35, 60, 62) resultaron expresadores mediante un análisis de la transferencia Northern. El aumento en las células B220+ y CD40+ varía desde 2-4 veces por encima del control. Las CD62L+ (LECAM) y CD54+ (ICAM) varían desde 1,5-3 veces por encima del control. Los marcadores que muestran un aumento en tres de los cuatro expresadores incluyen Sca-1 (2-6 veces el control) y ckit (2-3 veces el control). Otros marcadores, incluyendo CD3, CD4, CD8, Thyl.2, muestran aumentos modestos en dos de los cuatro expresadores, aunque no de manera coherente (aunque todos son marcadores de células T, no todos resultaron positivos en los mismos expresadores). El GR1 mostró un aumento en uno de los expresadores, pero había un número celular de GR1+ aún mayor es uno de los controles animales, así que probablemente esto no sea significativo. El resto de los anticuerpos no eran positivos, no eran significativamente diferentes o, en el caso de CD34, eran imposibles de analizar.
Sumario
Se observó un aumento muy definido en el número absoluto de células linfoides en la circulación en estos ratones. Este aumento en la población linfoide parece consistir principalmente en células B, aunque también puede observarse algún aumento en los números de células T. Ninguna de las poblaciones linfoides parece mostrar un aumento en los tipos de células activadas. Se observa poco o ningún efecto sobre la población de células mieloides en la circulación. Los aumentos en ckit y Sca-1 no se correlacionan necesariamente con un aumento en las células progenitoras, puesto que estos marcadores se encuentran también en células maduras en la circulación.
Los datos sugieren una proliferación dirigida de células B, puesto que estos números celulares se correlacionan bien con la expresión. Los aumentos en algunas células T de los animales pueden ser probablemente un efecto secundario de que se está produciendo algún otro factor(es) por el aumento de células B. Una observación interesante con respecto a las células B es una ligera diferencia, pero muy constante, entre los números de células B220+ y células CD40+. Aunque ambos son marcadores de células B, también se encuentra CD40 en células dendríticas.
Ejemplo X Hiperplasia linfoide en ratones inyectados con NNT-1 A. Un estudio de siete días exploratorio intravenoso/subcutáneo en ratones hembra BDF1 tratados con NNT-1
La proteína codificada por NNT-1 tiene cierta homología con CNTF y la actividad in vitro en ensayos de células de la médula ósea y nerviosas. El objetivo de este estudio es determinar el efecto sistémico y la toxicidad potencial de la proteína NNT-1 cuando se administra a diario a ratones durante 7 días.
Materiales y métodos
Se utilizaron veinte ratones BDF1 hembra de 6 semanas en el estudio. Los ratones se asignaron al azar a los siguientes grupos de tratamiento (n = 5/grupo):
1. Control de tampón PBS (dosificación intravenosa una vez diaria durante 7 días)
2. NNT-1 a 1,5 mg/kg (intravenoso)
3. NNT-1 a 0,15 mg/kg (intravenoso)
4. NNT-1 a 1,5 mg/kg (subcutáneo)
Los ratones no se sometieron a ayuno antes de la necropsia macroscópica. Una hora antes de la necropsia (24 horas después de la última dosificación), los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de BrdU (a 50 mg/kg para los estudios de proliferación celular). Se obtuvo sangre a través de una punción cardíaca para la determinación de la hematología (hemoglobina, hematocrito, recuento de eritrocitos, recuento de plaquetas, volumen medio de plaquetas, recuentos de leucocitos totales y diferenciales) y los parámetros de la química clínica (alanina-aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, lactato-deshidrogenasa, glucosa, nitrógeno de urea, creatinina, proteína total, albúmina, globulina, calcio, fósforo, bilirrubina total, ácido úrico, colesterol y triglicéridos).
La necropsia macroscópica se realizó con tejidos seleccionados fijados con formaldehído de cinc tamponado para el estudio histopatológico (glándulas suprarrenales, médula ósea, hueso (fémur), cerebro, ciego, colon proximal y distal, duodeno, esófago, corazón, íleon, yeyuno, riñones, hígado, pulmones, glándulas mamarias, ovarios, páncreas, músculo esquelético, piel, bazo, estómago, timo, glándulas tiroides, tráquea, vejiga urinaria, útero, vagina, tejido adiposo blanco y marrón, cualquier lesión macroscópica). Los tejidos se fijaron durante la noche antes del procesamiento histológico rutinario. Se obtuvo el peso de los órganos para el bazo, hígado, estómago, riñones y timo.
Resultados
Bazo. Había una hiperplasia linfoide destacada en la pulpa blanca del bazo, con un aumento de las cubiertas linfoides periarteriolares (áreas de células T) y folículos (áreas de células B) en los grupos tratados con NNT-1. Sin embargo, el grado de hematopoyesis extramedular al parecer no aumentó en estos grupos, lo cual sugiere que esta proteína puede tener efectos de tipo factor del crecimiento o estimulantes sobre los linfocitos, en lugar de otras células hematopoyéticas in vivo.
Nódulos linfáticos. Los ratones tratados con NNT-1 tenían una hiperplasia linfoide reactiva de suave a marcada de las áreas foliculares (células B) y paracorticales (células T) de la corteza del nódulo linfoide. Aunque este cambio puede reflejar una respuesta inmunológica temprana a la proteína recombinante, el grado de hiperplasia linfoide reactiva generalizada que estaba presente en el bazo, nódulos linfáticos, parches de Peyer y médula ósea sugiere que éste puede ser un efecto relacionado con el tratamiento específico de NNT-1.
Sumario y conclusiones
El descubrimiento más significativo derivado de este estudio es que el tratamiento con NNT-1 de ratones durante 7 días pareció inducir la proliferación de tejidos linfoides, en particular en el bazo y los nódulos linfáticos. Sin embargo, esta proteína no parece tener efectos detectables sobre los sistemas hematopoyético o nervioso central bajo las condiciones de este estudio.
B. Análisis FACS de ratones inyectados con NNT-1
Reactivos y ratones. El rhIL-1 y NNT-1 recombinante eran de Amgen Inc., Thousand Oaks, CA. El LPS (Escherichia coli 0111:84) se adquirió en LIST Biologic Laboratories, Campbell, CA. Los ratones Balb/c hembra de aproximadamente 20 g se adquirieron en Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Los ratones se alojaron en habitaciones mantenidas a temperatura y humedad constantes y se sometieron a un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los ratones recibieron una dieta de laboratorio convencional y agua sin limitación. Los procedimientos que implican a los animales y su cuidado se realizaron según las líneas directrices institucionales conformes a la política y leyes nacionales e internacionales (U.S. National Research Council, Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 1996).
Peso de los nódulos linfáticos y recuentos celulares. Durante siete días consecutivos, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal diaria de 5 mg/kg de NNT-1 o tampón. Veinticuatro horas después de la séptima inyección, los ratones se sacrificaron para la recolección de los nódulos linfáticos periféricos (cervicales y axilares). Los nódulos linfáticos se reunieron, se pesaron y se homogeneizaron para preparar una suspensión celular. Las células entonces se contaron con un contador de células Sismex (Toa Medical Corporation, Kobe, Japón), se tiñeron mediante IF directa utilizando un Mab anti-CD45R anti-ratón de rata (anti-B220) (Pharmingen, San Diego, CA) y se analizaron en un FACSCAN utilizando el programa informático Cell Quest (Becton and Dickinson, San Jose, CA).
Análisis estadístico. Los resultados se expresan como media \pm DE. Los valores de TNF se transformaron de forma logarítmica para disminuir su distribución sesgada y llevarlos a la normalidad. Se utilizó el ensayo de Shapiro-Wilks para analizar la normalidad de su distribución antes y después de la transformación. Las diferencias entre grupos se analizaron mediante el ensayo de la t de Student. Puesto que el peso corporal se midió repetidamente en cada individuo, se ensayaron las diferencias en peso corporal dentro y entre los grupos mediante el análisis de la varianza (ANOVA) para medidas repetidas.
Peso de los nódulos linfáticos y recuentos celulares. El tratamiento con NNT-1 aumentó los recuentos de células CD45-positivas y totales en nódulos linfáticos periféricos (figura 17).
Ejemplo XI El NNT-1 muestra actividades in vivo características de las citoquinas de la familia IL-6
Los reactivos, ratones y análisis estadísticos son como se indican en el ejemplo X B anterior.
Inducción del amiloide sérico A (SAA), potenciación de la corticosterona e inducción de IL-6 por IL-1 e inhibición de TNF inducido por LPS. El NNT-1 se administró por vía intraperitoneal a una dosis de 5 mg/kg, por sí solo o junto con IL-1 (100 ng/ratón) o LPS (100 ng/ratón). Los ratones control recibieron el disolvente para el NNT-1 (acetato 10 mM en disolución salina). Se extrajo sangre del plexo retroorbital 8 horas después de la administración de NNT-1 o disolución salina para la determinación del SAA, 2 horas después para la corticosterona e IL-6, y 1,5 horas después para el TNF. Los experimentos se realizaron en grupos de cinco o diez ratones.
El SAA, IL-6 y TNF se midieron en el suero mediante ELISA utilizando kits disponibles en el mercado (Biogen, Camarillo, CA); los resultados se expresan en \mug, ng y pg/ml, respectivamente. La corticosterona se midió mediante RIA utilizando un kit disponible en el mercado (ICB Biomedical, Costa Mesa, CA); los resultados se expresan en ng/ml.
Inducción de SAA, potenciación de corticosterona e inducción de IL-6 por IL-1, e inhibición de TNF inducido por LPS. El NNT-1 induce SAA en la circulación (figura 13).
El NNT-1 potencia la inducción por una dosis baja de IL-1 de IL-6 o corticosterona sérica (figuras 14 y 15). El NNT-1 también muestra la capacidad de aumentar los niveles en la circulación de corticosterona cuando se inyecta por sí sola.
El NNT-1 inhibe la inducción por LPS de TNF sérico (figura 16).
Sumario de los resultados
Los procesos inflamatorios están acompañados por la producción de TNF, una citoquina responsable, en gran medida, de las lesiones en tejidos y el deterioro funcional que distinguen a las patologías relacionadas con la inflamación. A menudo se coproduce IL-1 con TNF, y también se cree que es un mediador patogénico durante la inflamación. Los corticosteroides son agentes antiinflamatorios de amplio espectro y muy potentes, que son inducidos por IL-1 a través de un eficaz circuito de retroalimentación negativa. Los corticosteroides inhiben la producción de TNF e IL-1. La 
\hbox{IL-6,}
que también es inducida por TNF e IL-1, también es capaz de inhibir la producción de TNF e IL-1 a través de otro circuito de retroalimentación positiva.
La capacidad del NNT-1 para inducir corticosteroides e IL-6, al menos en presencia de IL-1, sugiere que esta molécula tiene la capacidad de potenciar dos circuitos antiinflamatorios fisiológicos. Esto puede conducir a una inhibición acelerada de la producción de TNF e IL-1, y, por tanto, a una resolución acelerada de los procesos inflamatorios. Además e independientemente de la inducción de la producción de corticosteroides e IL-6, el NNT-1 muestra la propiedad de bloquear directamente la producción de TNF. Esto se añade, de modo interesante, a las características antiinflamatorias indicadas anteriormente.
Depósito de DNA
Las células E. coli DH10B que contienen el vector P1 que codifica el DNA genómico humano para NNT-1 (NNT-g-PI) y las células E. coli DH10B que contienen el vector PSPORT que codifica el cDNA humano para NNT-1 se han depositado en el ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EEUU) el 21 de enero, 1997, y se les asignaron los números de registro 98294 y 98295, respectivamente.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: CHANG, MING-SHI
\hskip3,9cm
ELLIOTT, GARY S. 
\hskip3,9cm
SARMIENTO, ULLA 
\hskip3,9cm
SENALDI, GIORGIO 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: EL FACTOR NEUROTRÓFICO NNT-1
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: AMGEN INC.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: ONE AMGEN CENTER
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: THOUSAND OAKS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 91320
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/792.019
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de febrero, 1997
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: COOK, ROBERT R.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 31.602
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: A-442B
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 797 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 90..764
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: pépido_mad
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 171..764
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido_señ
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 90..170
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 225 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 5087 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: característica_misc
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 137..138
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
INFORMACIÓN ADICIONAL: 
\hskip0,2cm
/producto = "REGIÓN NO SECUENCIADA INTERMEDIA DE >1 KB"
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
3
4
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 819 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 95..769
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: pépido_mad
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 176..769
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: péptido_señ
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 95..175
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
6
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 225 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
8
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCAAGCTTC ACCATGGACC TCCGAGCAGG GGACTC 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 199 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..178
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: región
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: -21..0
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 212 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..182
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: región
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: -30..0
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 204 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..174
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: región
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: -30..0
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 201 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 199 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 252 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..227
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: región
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: -25..0
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 202 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: proteína
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..180
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: región
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: -22..0
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCGCTACGG TCGACCCGGC GTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTACG 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAAGGAAAA AAGCGGCCGC TACA 
\hfill
24

Claims (20)

1. Un polipéptido NNT-1, que tiene la actividad biológica de estimular el crecimiento de neuronas motoras o simpáticas, seleccionado de
(a) el polipéptido de la SEQ ID NO:2 o NO:5,
(b) el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1-198 de la SEQ ID NO:2 o NO:5,
(c) el polipéptido que es al menos 70% idéntico al polipéptido (a) o (b); y
(d) un fragmento de uno de (a)-(c), que tienen dicha actividad biológica.
2. Un polipéptido NNT-1, que tiene la actividad biológica de estimular el crecimiento de neuronas motoras o simpáticas, que es el polipéptido de la SEQ ID NO:2 o NO:5, o un fragmento del polipéptido que tiene dicha actividad biológica.
3. Un polipéptido NNT-1 según la reivindicación 2, que no posee una metionina de aminoácido terminal.
4. Un polipéptido NNT-1 según la reivindicación 2, que posee además una metionina de aminoácido terminal.
5. Un anticuerpo aislado y purificado, o su fragmento, que se une de modo específico a un polipéptido que tiene la actividad biológica de estimular el crecimiento de neuronas motoras o simpáticas, seleccionándose el polipéptido de
(a) el polipéptido de la SEQ ID NO:2 o NO:5, o
(b) el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1-198 de la SEQ ID NO:2 o NO:5.
6. Un anticuerpo aislado y purificado, o su fragmento, según la reivindicación 5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o su fragmento.
7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido, en el que dicho polipéptido tiene la actividad biologica de estimular el crecimiento de neuronas motoras o simpáticas, seleccionado de
(a) la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1;
(b) la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:3;
(c) la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:4;
(d) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que consiste en los aminoácidos -27 a 198, o 1 a 198 de la SEQ ID NO:2 o NO:5;
(e) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos 70% idéntico al polipéptido de (d) anterior; y
(f) una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido de (d) o (e) anterior, en el que dicho fragmento de polipéptido tiene dicha actividad biológica.
8. Una molécula de ácido nucleico aislada de la SEQ ID NO:1.
9. Una molécula de ácido nucleico aislada de la SEQ ID NO:3.
10. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO:2.
11. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica los aminoácidos 1-198 de la SEQ ID NO:2.
12. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.
13. Una célula hospedante que comprende un vector según la reivindicación 12.
14. Un proceso para producir un polipéptido, en el que dicho polipéptido tiene la actividad biológica de estimular el crecimiento de neuronas motoras o simpáticas, que comprende las etapas de:
(a) expresar un polipéptido codificado por un ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en un hospedante adecuado; y
(b) aislar el polipéptido.
15. El uso de un polipéptido NNT-1 según una cualquiera de las reivindicacioens 1 a 4 para la fabricación de un medicamento para tratar un paciente que padece una enfermedad o trastorno neurológico o inmunológico.
16. Un uso según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad o trastorno se selecciona de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad amiotrófica lateral, esclerosis, síndrome de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Huntington, neuropatía periférica, distrofia, o degeneración de la retina neural.
17. Un uso según la reivindicación 15, en el que dicha enfermedad o trastorno se caracteriza por una deficiencia de células B o células T.
18. Un uso según la reivindicación 17, en el que dicha enfermedad o trastorno es la inmunodeficiencia variable común (CVID), la deficiencia de IgA selectiva, la hipogammaglobulinemia, y la agamaglobulinemia ligada a X.
19. El uso de un polipéptido NNT-1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medicamento para estimular la inmunorreactividad y la producción de anticuerpos después de una vacunación.
20. El uso de un polipéptido NNT-1 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno inflamatorio en un paciente que lo necesite.
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