HU225307B1 - The neurotrophic factor nnt-1 - Google Patents

Description

A jelen találmány folytatólagos része a 08/792019 sorozatszámú, 1997. február 3-án iktatott találmánynak, mely a hivatkozás révén részét képezi a találmánynak.

A találmány területe

A jelen találmány egy új, ΝΝΤ-1-nek jelölt polipeptiddel és rokon polipeptidekkel kapcsolatos, melyek neurotróf aktivitással rendelkeznek, az ilyen polipeptideket kódoló új nukleinsavmolekulákkal és más kapcsolódó szempontokkal is kapcsolatos.

A kapcsolódó tudományterület leírása

Számos neurológiai rendellenességet és betegséget okoznak legalább részben a neuronok bizonyos osztályainak degenerációi vagy pusztulásai. Például a Parkinson-betegséget az akaratlagos izommozgások lelassulása, az izommerevség és a remegés jellemzi. Az ilyen tüneteket legalább részben a substantia nigra nevű speciális agyi területen található dopamintermelő neuronok progresszív degenerációjával magyarázzák. Az ilyen neuronok („dopaminerg neuronok”) degenerációja a szomszédos, striatumnak nevezett agyterület dopaminszintjeinek csökkenését okozza. A striatum tartalmaz dopaminreceptorokat expresszáló neuronokat; ezek a neuronok részt vesznek a motoros aktivitás szabályozásában. A dopaminerg neuronok degenerációjának oka ismeretlen, azonban a szabad gyökök, felesleges vastartalom, környezeti toxinok, izgató aminosav neurotoxicitás és feltehetően bizonyos neurotróf faktorok hiányának tulajdonítható [Jenner, Neurology, Suppl. 3:S6-S12 (1995); Adams and Victor, eds, Principles of Neurology, Chapter 42:Degenerative Diseases of the Nervous System, McGraw Hill, NY (1993)].

Az olyan betegségek, mint az amiotrófiás laterális szklerózis (ALS; Lou Gehrig-féle betegségként is ismert), a progresszív muscularis atrophia és az örökletes motorikus és szenzorikus neuropathia (Charcot-Marie-Tooth-betegség) mind legalább részben a motorikus neuronok elhalásából adódik, mely neuronok a ventrális gerincvelőszarvban helyezkednek el.

A hippocampus, a jól meghatározott szerkezet, mely az agy cerebrális cortexének része, lényeges a hosszú távú memória kialakulásában. A hippocampus destrukciója, például ischaemia révén, az újabb emlékek képzését teheti lehetetlenné. A piramidális CA1 neuronok degenerációja, melyek a hippocampus CA1 régiójában helyezkednek el, az Alzheimer-betegség egyik jellemzője. Ugyanezek a neuronok szelektíven sebezhetők az ischaemiás és anoxiás károsodással szemben, mely esetek az olyan állapotokban következnek be, mint a stroke és a fejsérülések. Ezenkívül a CA1 piramidális hippocampusneuronok, valamint a hippocampus CA3 régiójában elhelyezkedő piramidális neuronok szelektíven sérülnek epilepsziában.

A striatum a substantia nigrából származó dopaminergtartalmú neuronok idegvégződéseinek innervációs régiója. A striatumneuronok többsége GABA-t (4-amino-vajsavat) használ neurotranszmitterként. A striatum a progresszív neurodegeneráció fő területe, mely a Huntington-féle betegségben következik be, melynek során a fő neuronveszteség a striatum GABA-hasznosító neuronjaiban következik be.

A szerotonintartalmú neuronok csoportokban helyezkednek el a hátsóagy középvonala körüli fürtökben. Ezek a neuronok a test hőmérsékletének, a hangulat és az alvás szabályozásában vesznek részt. A szerotonintartalmú neuronrendszer rendellenességei közé tartoznak például a depresszió és más hangulatbetegségek és alvászavarok.

A fotoreceptorsejtek a retinaneuronok specializált részhalmazát képezik és a látásért felelősek. A fotoreceptorsejtek sérülése és/vagy pusztulása vaksághoz vezethet. A retina degenerációját - például a retinitis pigmentosa, korral kapcsolatos pigmentdegeneráció és az állandó éjszakai vakság következtében - progresszív atrophia és a fotoreceptor külső szegmentek funkcióinak elvesztése jellemzi. Ezek a szegmentek olyan specializált szerkezetek, melyek a vizuális pigmenteket tartalmazzák, melyek a fénystimulust elektromos aktivitássá transzformálják.

Bár léteznek terápiák az ilyen betegségek tüneteinek kezelésére és súlyosságának csökkentésére (például L-dopa a Parkinson-betegség kezelésére), jelenleg nem létezik hatékony kezelés az érintett neuronok fent említett osztályainak legtöbbje degenerációjának megelőzésére vagy csökkentésére vagy gyógyításuk elősegítésére.

Jelenleg számos természetesen előforduló proteinszerű molekula létezik, melyeket a különböző neuronokra kifejtett trofikus aktivitásukra alapozva azonosítottak. Ezeket a molekulákat „neurotróf faktoroknak” nevezik. A neurotróf faktorok endogén, oldódó proteinek, melyek stimulálhatják vagy szabályozhatják a neuronok életben maradását, szaporodását és/vagy morfológiai plaszticitását [lásd Falion and Laughlin, Neurotrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA (1993)].

Az ismert neurotróf faktorok polipeptid növekedési faktorok számos különböző protein-szupercsaládjába tartoznak, aminosavszekvencia-homológiájuk és/vagy háromdimenziós szerkezetük alapján [MacDonald and Hendrikson, Cell, 73:421-424 (1993)]. A neurotróf faktorok egyik családja a neurotrofincsalád. Ez a család jelenleg az NGF-et (idegnövekedési faktor), BDNF-et (agyi eredetű neurotróf faktor), ΝΤ-3-at (neurotrofin-3), ΝΤ-4-et (neurotrofin-4) és ΝΤ-6-ot (neurotrofin-6) foglalja magában.

A CNTF (csillós neurotróf faktor) és a LIF (leukémiagátló faktor) neurotróf aktivitással rendelkező citokinpolipeptidek. Szerkezeti tulajdonságaik és receptorkomponenseik következtében ezek a polipeptidek a hematopoietikus citokinek egy, az IL-6-ot (interleukin—6), IL—11 -et (interleukin-11), G-CSF-et (granulocita telep stimuláló faktor) és oncostatin-M-et magában foglaló családjával állnak rokonságban. A jelen találmány ΝΝΤ-1-e szignifikáns hasonlóságot mutat a neurotróf faktorok ezen családjának különböző tagjaival. Lásd a 6. ábrát.

A GDNF (gliaeredetű neurotróf faktor) egy olyan neurotróf faktor, mely a TGF-beta (transzformáló növekedési faktor béta) szupercsaládba tartozik. A GDNF hatékony túlélést és differenciálódást elősegítő hatással rendelkezik a dopaminerg és motoros neuronok

HU 225 307 Β1 esetében [Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993); Yan et al., Natúré, 373:341-344 (1995)].

Míg ezekről a neurotróf faktorokról ismert, hogy fokozzák neuronok növekedését és/vagy életben maradását, sokkal kevesebbet tudunk azokról a molekulákról, melyek ezekkel a faktorokkal együtt működnek. Egy módszerben, melynek során további neurotrofinok és rokon molekulák azonosíthatók, egy állatnak egy vagy több olyan vegyületet adunk, melyről ismert, hogy hatással van az idegrendszerre, majd analizáljuk a szöveteket a vegyületekre adott neurális válaszokban részt vevő gének indukciójára. Például szkrínelhetünk olyan génekre, melyek az idegrendszer bizonyos szöveteiben indukálódnak, például az agy hipocampusrégiójában. Ezt a technikát használták Nedivi és munkatársai [Natúré, 363:718-722 (1993); Medivi etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2048-2053 (1996)] olyan új gének azonosításához, melyek az alkalmazott kainátnak (kainátsav) nevezett glutamát egy neurotranszmitter analógjára adott válaszként indukálódnak a hippocampus fogazott tekervényében.

Sok neurotróf faktort, mint például az NGF, a BDNF, az NT3, a GDNF, a bFGF, az IGF-1 és a TGF-beta, az afferens neuronaktivitás és/vagy neuronsérülés szabályoz. Ezen gének közül néhánynak az erős indukciója figyelhető meg a hippocampus fogazott tekervényében a glutamát analóg kainátra adott válaszként [Isackson, Current Opinions in Neurobiology 5:50-357 (1995)]. Úgy tűnik, hogy a kainátos kezelés fokozza az új vegyületek kiszabadulását az éber patkányok hippocampusából, és úgy tűnik, ez az aktivitás eltér az ismert neurotróf faktorok aktivitásától [Humpel et al., Science, 269:552-554 (1995)].

Azon tény ismeretében, hogy sok idegrendszeri rendellenesség és betegség még nem rendelkezik ismert gyógymóddal, szükség van a tudomány e területén olyan új vegyületek azonosítására, melyek olyan neurológiai állapotok és betegségek kezelésére szolgálnak, mint a Parkinson-kór, az amiotrófiás laterális szklerózis (ALS), az Alzheimer-kór, a stroke és a különböző, a látásra hatással levő degeneratív rendellenességek.

A jelen találmányban további bizonyítékokat mutatunk be, miszerint az NNT-1 vegyületek immunrendszer-módosító biológiai hatással rendelkeznek, részletesebben oly módon, hogy fokozzák a B-sejt- és T-sejt-termelést.

Ennek megfelelően a jelen találmány egyik célja olyan új vegyületek biztosítása, melyek hasznosak lehetnek a neuronregeneráció és a neuronfunkciók visszaállításának fokozásában.

A találmány további célja olyan módszer biztosítása, mellyel a találmányban bemutatott neurológiai betegségek kezelhetők.

A találmány további célja az is, hogy olyan módszert biztosítson, mellyel a találmányban bemutatott immunológiai betegségek kezelhetők.

Ezek és más célok világosak lesznek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára a jelen találmány leírása alapján.

A találmány összefoglalása

Egy megvalósulásban a jelen találmány egy olyan nukleinsavmolekulát biztosít, mely egy, az alábbiakat magában foglaló csoportból szelektált polipeptidet kódol:

(a) az 1. számú szekvenciában bemutatott nukleinsavmolekula;

(b) a 3. számú szekvenciában bemutatott nukleinsavmolekula;

(c) a 2. számú szekvencia polipeptidjét vagy ennek egy biológiailag aktív fragmentjét kódoló nukleinsavmolekula;

(d) egy olyan polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula, mely legalább 70 százalékban azonos a 2. számú szekvencia polipeptidjével;

(e) egy nukleinsavmolekula, mely szigorú körülmények között a fenti (a)-(d) bármelyikével hibridizálódik; és (f) egy nukleinsavmolekula, mely komplementer a fenti (a)-(e) bármelyikével.

Egy másik megvalósulásban a jelen találmány egy olyan nukleinsavmolekulát biztosít, mely az alábbiakat magában foglaló csoportból szelektált polipeptidet kódol: (a') a 4. számú szekvenciában bemutatott nukleinsavmolekula;

(b’) az 5. számú szekvencia polipeptidjét vagy annak egy biológiailag aktív fragmentjét kódoló nukleinsavmolekula;

(c’) egy olyan polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula, mely legalább 70 százalékban azonos az 5. számú szekvencia polipeptidjével;

(d’) egy olyan nukleinsavmolekula, mely szigorú körülmények között hibridizálódik a fenti (a’)-(c’) bármelyikével; és (e’) egy nukleinsavmolekula, mely komplementer a fenti (a')-(d’) bármelyikével.

Egy megint más megvalósulásban a jelen találmány olyan vektorokat biztosít, melyek ezeket a nukleinsavmolekulákat foglalják magukban, valamint ezeket a vektorokat magukban foglaló eukarióta vagy prokarióta gazdasejteket.

A jelen találmány a továbbiakban biztosít egy, az alábbiakat magában foglaló csoportból szelektált NNT-1 polipeptidet is:

(a) a 2. számú szekvencia polipeptidje;

(b) egy polipeptid, mely a 2. számú szekvencia 1-198 aminosavait jelenti;

(c) egy polipeptid, mely legalább 70 százalékban azonos az (a) vagy (b) polipeptidjével; és (d) az (a)-(c) bármelyikének egy biológiailag aktív fragmentje.

A jelen találmány a továbbiakban biztosít egy NNT-1 polipeptidet, melyet az alábbiakat magában foglaló csoportból szelektálunk:

(a’) az 5. számú szekvencia polipeptidje;

(b') egy polipeptid, mely az 5. számú szekvencia 1-198 aminosavait jelenti;

(c’) egy polipeptid, mely legalább 70 százalékban azonos az (a’) vagy (b’) polipeptidjével; és (d’) az (a’)-(c’) bármelyikének egy biológiailag aktív fragmentje.

HU 225 307 Β1

Tetszés szerint az NNT-1 polipeptid rendelkezhet vagy nem rendelkezik aminoterminális metioninnal.

Egy megint más megvalósulásban a jelen találmány eljárást biztosít egy NNT-1 polipeptid előállítására, mely eljárás során a polipeptid lehet a 2. számú szekvenciában bemutatott vagy az 5. számú szekvenciában bemutatott polipeptid, a 2. számú szekvencia 1-198 aminosavai, az 5. számú szekvencia 1-198 aminosavai vagy ezek egy biológiailag aktív fragmentje, és melyben az eljárás a következőkből áll:

(a) egy NNT-1 nukleinsavmolekula által kódolt polipeptidet egy megfelelő gazdában expresszálunk; és (b) izoláljuk a polipeptidet.

A jelen találmány a továbbiakban anti-NNT-1 antitesteket is biztosít.

A rajzok rövid leírása

Az 1. ábra a humán ΝΝΤ-1-et kódoló cDNS nukleinsavszekvenciáját mutatja be (1. számú szekvencia).

A2. ábra az ΝΝΤ-1-hez való humán genom DNS nukleinsavszekvenciáját mutatja be (3. számú szekvencia).

A 3. ábra a humán NNT-1 aminosavszekvenciáját mutatja be (1. számú szekvencia), ahogy a cDNS-ből (2. számú szekvencia) transzlálódik. Az első 27 aminosav egy jelpeptid-szekvenciát képviselhet oly módon, hogy az érett NNT-1 forma az 1. számmal jelzett leucinnál kezdődik. A * a stopkodont jelöli.

A 4. ábra az egér ΝΝΤ-1-et kódoló cDNS nukleinsavszekvenciáját mutatja be (4. számú szekvencia).

Az 5. ábra az egér NNT-1 aminosavszekvenciáját mutatja be (5. számú szekvencia), ahogy a cDNS-ből (4. számú szekvencia) transzlálódik. Az első 27 aminosav egy jelpeptid-szekvenciát képviselhet oly módon, hogy az érett egér NNT-1 forma az 1 számmal jelzett leucinnál kezdődik. A * a stopkodont jelöli.

A 6. ábra az NNT-1, az IL—11 (8. számú szekvencia), az IL—6 (9. számú szekvencia), a G-CSF (10. számú szekvencia), a cardiotrophin (11. számú szekvencia), a CNTF (12. számú szekvencia), az oncostatin (13. számú szekvencia) és a LIF (14. számú szekvencia) aminosavszekvenciáinak összehasonlítását adja meg. Minden esetekben a humán molekulát hasonlítjuk össze.

A 7. ábra a humán CNTF-hez viszonyított humán NNT-1 csirke motoros neuron aktivitás vizsgálat eredményeinek grafikonját mutatja be.

A 8. ábra a humán CNTF-hez viszonyított humán NNT-1 csirke szimpatikus neuron aktivitás vizsgálat eredményeinek grafikonját mutatja be.

A 9. ábra egy negatív kontroll egérből (#22) származó normállépet mutat be, 20* nagyítás, H&E festés.

A10. ábra egy limphoid hyperplasiás (nyíl) NNT-1 transzgenikus egérből (#62) származó lépet mutat be.

A11. ábra egy kontrollegérből származó normálmájat mutat be, 10* nagyítás, H&E festés.

A12. ábra a sinusoidokban (nyíl) és az erek körül limphoid aggregátumokkal rendelkező NNT-1 transzgenikus egérből (#60) származó májat mutat be, H&E festés.

A 13. ábra olyan eredményeket ad meg, melyek azt mutatják, hogy az NNT-1 indukálja a szérum SAA-t (p<0,001). Csoportokként 5 egér volt.

A 14. ábra olyan eredményeket ad meg, melyek azt mutatják, hogy az NNT-1 lehetővé teszi a szérumban levő kortikoszteron IL—1 általi indukcióját (p<0,01) és megnöveli a szérum kortikoszteronszintjeit az IL—1-től függetlenül (p<0,001). Csoportokként 5 egér volt.

A 15. ábra olyan eredményeket ad meg, melyek azt mutatják, hogy az NNT-1 lehetővé teszi a szérumban levő IL—6 IL—1 általi indukcióját (p<0,001). Csoportokként 5 egér volt.

A 16. ábra olyan eredményeket ad meg, melyek azt mutatják, hogy az NNT-1 blokkolja a szérum-TNF-szintek LPS által indukált növekedését (p<0,001). Az LPS-sel kezelt csoportban 10 egér volt, a többi csoportban öt.

A 17. ábra olyan eredményeket ad meg, melyek azt mutatják, hogy az NNT-1 növeli a teljes (p<0,04) és CD45-pozitív sejtek teljes számát a perifériás nyirokcsomókban egerekben (p<0,001).

A találmány részletes leírása A jelen találmány körébe tartoznak olyan

NNT-1 polipeptidek, mint a 2. számú szekvencia vagy az 5. számú szekvencia polipeptidjei és ezek rokon, biológiailag aktív peptidfragmentjei és származékai. Ezenkívül a jelen találmány körébe tartoznak olyan nukleinsavmolekulák is, melyek ezeket a polipeptideket kódolják, valamint a polipeptidek előállítására szolgáló módszerek.

/. NNT-1 proteinek/polipeptidek, ezek fragmentjei és származékai

A találmány szerinti használatban az „NNT-1 protein” vagy „NNT-1 polipeptid” bármely olyan proteinre vagy polipeptidre vonatkozik, mely az NNT-1-re itt leírt tulajdonságokkal rendelkezik. Az NNT-1 polipeptid rendelkezhet vagy nem rendelkezik aminoterminális

HU 225 307 Β1 metioninnal, attól függően például, hogy milyen módon állítják elő. Az illusztráció kedvéért az NNT-1 protein vagy NNT-1 polipeptid vonatkozik:

(1) az alábbiak bármelyikében meghatározottak szerinti NNT-1 nukleinsavmolekula által kódolt aminosavszekvenciára:

(a) az 1. számú szekvencia nukleinsavmolekulája;

(b) a 3. számú szekvencia nukleinsavmolekulája;

(c) a 2. számú szekvencia polipeptidjét vagy ennek egy biológiailag aktív fragmentjét kódoló nukleinsavmolekula;

(d) egy nukleinsavmolekula, mely egy olyan polipeptidet kódol, mely legalább 70 százalékban azonos a 2. számú szekvencia polipeptidjével;

(e) egy nukleinsavmolekula, mely szigorú körülmények között a fenti (a)-(d) bármelyikével hibridizálódik; és (f) egy nukleinsavmolekula, mely a fenti (a)-(e) bármelyikével komplementer; és (a') a 4. számú szekvencia nukleinsavmolekulája;

(b’j az 5. számú szekvencia polipeptidjét vagy ennek egy biológiailag aktív fragmentjét kódoló nukleinsavmolekula;

(c’j egy nukleinsavmolekula, mely egy olyan polipeptidet kódol, mely legalább 70 százalékban azonos az 5. számú szekvencia polipeptidjével;

(d’j egy nukleinsavmolekula, mely szigorú körülmények között a fenti (a’)-(d’) bármelyikével hibridizálódik; és (e’j egy nukleinsavmolekula, mely a fenti (a’)—(d’j bármelyikével komplementer; és (2) az NNT-1 gén természetesen előforduló allélvariánsai, melyek egy vagy több aminosavszubsztitúciót, deléciót és/vagy inzertációt eredményeznek a 2. számú vagy 5. számú szekvenciák NNT-1 polipeptidjeihez képest; és/vagy (3) kémiailag módosított származékok, valamint ezek nukleinsav- és/vagy aminosavszekvencia-variánsai, amint azt a jelen találmányban megadjuk.

A jelen találmány megvalósításakor használt NNT-1 polipeptidek lehetnek természetesen előforduló, teljes hosszúságú polipeptidek, vagy csonka polipeptidek vagy peptidek (azaz „fragmentek”).

A polipeptidek lehetnek érett formában, vagy kapcsolódhatnak egy natív vagy heterogén jelpeptidhez. Például a humán és egér NNT-1 sorrendben a 2. és 5. számú szekvenciák -27- -1 aminosavaiból álló jelpeptidekkel rendelkeznek.

A polipeptidek vagy fragmentek lehetnek kémiailag módosítottak, azaz glikoziláltak, foszforíláltak és/vagy egy polimerhez kötöttek, amint azt a későbbiekben leírjuk, és rendelkezhetnek egy aminoterminális metioninnal, attól függően, hogyan állítottuk elő ezeket. Ezenkívül a polipeptidek vagy fragmentek lehetnek a természetes előfordulású NNT-1 polipeptid variánsai (azaz tartalmazhatnak egy vagy több aminosavdeléciót, inzertációt és/vagy szubsztitúciót a természetesen előforduló NNT-1-hez viszonyítva).

A találmány szerinti használatban az „NNT-1 fragment” kifejezés egy olyan peptidet vagy polipeptidet jelent, mely a természetesen előforduló NNT-1 protein teljes hosszúságú aminosavszekvenciájánál rövidebb, de minőségileg lényegében hasonló típusú biológiai aktivitással rendelkezik, mint a korábban leírt NNT-1 polipeptid vagy NNT-1 protein. Egy ilyen fragment lehet az aminoterminusnál, a karboxiterminusnál vagy mindkettőnél csonkított, és lehet kémiailag módosított. Az ilyen NNT-1 fragmentek előállíthatók egy aminoterminális metioninnal vagy anélkül. A fragmentek aktivitása lehet nagyobb, vagy azonos vagy kisebb, mint a teljes hosszúságú (érett) NNT-1 polipeptid aktivitása. Előnyösen a fragment aktivitása a teljes hosszúságú polipeptid aktivitásának >50%-a, még előnyösebben >65%-a, legelőnyösebben >80%-a a standard aktivitási vizsgálatokkal mérve, mint amit a későbbiekben a Példák részben megadunk. A találmány példa értékű fragmentjei közé tartoznak azok a polipeptidek, melyekből az 1-20 aminosavakat eltávolítottuk az NNT-1 polipeptid C-terminusáról vagy N-terminusáról, vagy mindkettőről.

A találmány szerinti használatban az „NNT-1-származék” kifejezés vagy az „NNT-1-variáns” egy NNT-1 polipeptidre, proteinre vagy fragmentre utal, melyet 1. kémiailag módosítottunk, mint például egy vagy több polietilénglikol-molekula, cukrok, foszfátok vagy más, a vad típusú NNT-1 polipeptidhez természetes nem kapcsolódó molekula hozzáadásával és/vagy 2. mely egy vagy több nukleinsav- vagy aminosavszekvencia-szubsztitúciót, deléciót és/vagy inzertációt tartalmaz a 3. ábrán bemutatott (humán) vagy 5. ábrán bemutatott (egér) NNT-1 aminosavszekvenciához viszonyítva.

A találmány szerinti használatban a „biológiailag aktív polipeptid” kifejezés és a „biológiailag aktív fragment” kifejezés egy olyan pepiidre vagy polipeptidre utal az NNT-1 fenti leírásával összhangban, melyben az NNT-1 növekedési faktorként szolgál (a) a neuronokhoz (például motoros neuronok és/vagy szimpatikus neuronok) vagy (b) immunológiai sejtekhez, mint a B-sejtek és a T-sejtek.

Az NNT-1 olyan fragmentjei és/vagy származékai, melyek magukban nem aktívak az aktivitási vizsgálatokban, az NNT-1 receptorok modulátoraiként használhatók (például inhibitorokként vagy stimulátorokként) in vitro vagy in vivő, vagy az NNT-1 polipeptidekkel szembeni antitestek előállítására használhatók.

A jelen találmány NNT-1 aminosawariánsai előnyösen legalább 70%-ban azonosak a 2. számú szekvenciával vagy az 5. számú szekvenciával, még előnyösebben legalább 80%-ban azonosak és még előnyösebben legalább 90%-ban azonosak.

A százalékos szekvenciaazonosság olyan standardmódszerekkel határozható meg, mely módszerek általánosan használatosak két polipeptid aminosavpozícióiban levő hasonlóságok összevetésére. Példa kedvéért, a BLAST vagy FASTA számítógépes programokat használva a két polipeptidet, melyek százalékos szekvenciaazonosságát meg kell határozni, felsorakoztatjuk az optimális párosodáshoz megfelelő aminosavaikkal („a párosodott szakasz, mely magában foglalhatja egy

HU 225 307 Β1 vagy két szekvencia teljes hosszúságát vagy egy vagy mindkét szekvencia egy előre meghatározott részét). Mindkét számítógépes program megad egy „alapértelmezési” nyitóértéket és egy „alapértelmezési” résértéket, valamint egy eredménymátrixot, mint például a PAM 250-et. Egy standard eredménymátrix [lásd Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)] használható a számítógépes programmal együtt. A százalékos azonosság ezután számítható ki a programban, mint például a FASTA-ban található algoritmus használatával:

az azonos párosodások teljes száma

---í- *100 (a párosított szakaszon belüli hosszabb szekvencia hossza)+(a két szekvencia egymáshoz állítása céljából a hosszabb szekvenciába bejuttatott rések száma)

A legalább 70 százalékban azonos polipeptidek tipikusan egy vagy több aminosavszubsztitúcióval, delécióval és/vagy inzertációval rendelkeznek a vad típusú ΝΝΤ-1-hez képest. Általában a szubsztitúciók konzervatívak kell legyenek, hogy kicsi vagy semmilyen hatással ne legyenek a protein teljes nettó töltésére, polaritására vagy hidrofobicitására, de tetszés szerint növelhetik az NNT-1 aktivitását. A konzervatív szubsztitúciókat az alábbi I. táblázatban mutatjuk be.

/. táblázat

Konzervatív aminosavszubsztitúciók

Bázikus:	arginin
lizin
hisztidin
Savas:	glutaminsav
aszparaginsav
Poláros:	glutamin
aszparagin
Hidrofób:	leucin
izoleucin
valin
Aromás:	fenil-alanin
triptofán
tirozin
Kicsi:	glicin
alanin
szerin
treonin
metionin

A jelen találmány magában foglalja az NNT-1 faj homológjait; például olyan emlősfajokból származó NNT-1-homológokat, mint a kutya, macska, egér, patkány, majom, ló, sertés, kecske, nyúl, birka és más hasonló fajok, az emberen túl. Az egér cDNS-szekvenciáját a 4. és 5. számú szekvenciákban adjuk meg.

A jelen találmány a továbbiakban magában foglal kiméra polipeptideket is, mint például egy másik polipeptid egészéhez vagy egy részéhez kapcsolódó ΝΝΤ-1-et. Előnyösen a kiméra polipeptid magában foglal egy másik neurotróf faktor, például a BDNF, a GDNF, az NT-3, az NT^t, az NT-5, az NT-6 és más hasonló faktorok egészéhez vagy egy részéhez kapcsolódó NNT-1-et. A polipeptidek kapcsolódhatnak az N-től C-terminushoz, a C-től C-terminushoz vagy az N-től N-terminushoz.

II. Nukleinsavak

A találmány szerinti használatban egy nukleinsavmolekula leírására használt „NNT-1” kifejezés a fentiekben bemutatott nukleinsavmolekulára vagy annak egy fragmentjére utal.

A „szigorú körülmények” kifejezés olyan körülmények között végzett hibridizációra és mosására utal, melyek csak egy nukleinsavmolekula, például egy oligonukleotid vagy cDNS-molekula kötődését teszik lehetővé az erősen homológ szekvenciákhoz. Szigorú mosóoldat a 0,015 M NaCI, 0,005 M Na-Citrát és 0,1% SDS 55-65 °C hőmérsékleten használva. Egy másik szigorú mosóoldat a 0,2*SSC és 0,1% SDS 50-65 °C hőmérsékletek között használva. Ahol oligonukleotidpróbákat használunk a cDNS- vagy genomkönyvtárak szkrínelésére, a következő szigorú mosási körülményeket lehet használni. Az egyik eljárás 6*SSC-t használ 0,05% nátrium-pirofosztáttal 35-62 °C hőmérsékleten, az oligonukleotidpróba hosszúságától függően. Például a 14 bázispár hosszúságú próbákat 35-40 °C hőmérsékleten mossuk, a 17 bázispár hosszúságú próbákat 45-50 °C hőmérsékleten, a 20 bázispár hosszúságú próbákat 52-57 °C hőmérsékleten és a 23 bázispár hosszúságú próbákat 57-63 °C hőmérsékleten. A hőmérséklet 2-3 °C-kal emelhető, ha a háttér nemspecifikus kötődés magasnak tűnik. Egy második eljárás tetrametil-ammónium-kloridot (TMAC) használ az oligonukleotidpróbák mosásához. Az egyik szigorú mosófolyadék 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCI, pH 8,0 és 0,2% SDS. A mosási hőmérséklet ezen mosófolyadék használatakor a próba hosszúságának függvénye. Például egy 17 bázispár hosszúságú próbát ilyen körülmények között 45-50 °C hőmérsékleten mosunk.

Az NNT-1 nukleinsavmolekulák, fragmentek és/vagy származékok, melyek magukban nem kódolnak olyan polipeptideket, melyek az aktivitási vizsgálatokban aktívak, hasznosak lehetnek hibridizációs próbákként diagnosztikai vizsgálatokban az emlősszövetben vagy testfolyadékmintákban levő NNT-1 DNS vagy RNS jelenlétének mennyiségi vagy minőségi teszteléséhez.

A jelen találmány köre magában foglalja a jelen találmányban leírtak szerint a natív vagy heterogén jelpeptidekhez és/vagy kiméra polipeptidekhez kapcsolódó NNT-1 polipeptideket kódoló NNT-1 nukleinsavmolekulákat Is.

III. Az NNT-1 polipeptidek előállítására szolgáló módszerek

A) Rekombináns módszerek

A teljes hosszúságú NNT-1 polipeptid vagy ennek fragmentje olyan jól ismert rekombináns DNS technoló6

HU 225 307 Β1 giai módszerekkel állítható elő, mint ami például Sambrook és munkatársai [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)] és/vagy Ausubel és munkatársai (eds) művében került leírásra [Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY (1994)]. Az NNT-1 proteint vagy ennek fragmentjét kódoló gén vagy cDNS kinyerhető például egy genom- vagy cDNS-könyvtár szkrínelésével vagy PCR-amplifikációval. Másik lehetőségként az NNT-1 polipeptidet vagy fragmentet kódoló gén előállítható kémiai szintézissel a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára jól ismert módszerekkel, mint amilyen például Engels és munkatársai művében került leírásra [Angew. Chem. Inti. Ed., 28:716-734 (1989)]. Ezek a módszerek magukban foglalják, inter alia, a nukleinsavszintézishez való foszfotriészter-, foszforamidit- és H-foszfonát-módszereket. Egy előnyben részesített módszer az ilyen kémiai szintézishez a polimertámogatású szintézis standard foszforamiditkémiát használva. Tipikusan az NNT-1 polipeptidet kódoló DNS több száz nukleinsav hosszúságú. A körülbelül 100 nukleotidnál hosszabb nukleinsavak számos fragmentként szintetizálhatok ezen módszerek segítségével. Ezután a fragmentek egymáshoz ligálhatók a teljes hosszúságú NNT-1 polipeptid létrehozása céljából. Általában a polipeptid aminoterminusát kódoló DNS-fragment egy ATG-vel rendelkezik, mely egy metioninmaradékot kódol. Ez a metionin jelen lehet vagy hiányozhat az NNT-1 polipeptid érett formájáról, attól függően, hogy a gazdasejtben termelt polipeptid szekretálódik-e a sejtből.

Bizonyos esetekben kívánatos lehet a természetesen előforduló NNT-1 nukleinsav és/vagy aminosav variánsainak előállítása. A nukleinsawariánsok (melyekben egy vagy több nukleotidot úgy tervezünk, hogy eltérjenek a vad típusú vagy természetesen előforduló NNT-1-tői) előállíthatok hely irányította mutagenezissel vagy PCR-amplifikációval, ahol a primer(ek) a kívánt pontmutációkkal rendelkeznek (lásd Sambrook et al., supra és Ausubel et al., supra, a mutagenezises technikák leírása céljából). Az Engels és munkatársai által leírt (supra) kémiai szintézises módszerek szintén felhasználhatók az ilyen variánsok előállításához. Más, a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára ismert módszerek is használhatók. Az előnyben részesített nukleinsawariánsok azok a nukleotidszubsztitúciók, melyek az NNT-1 előállításához használandó gazdasejtkodon preferenciáját indokolják. Más előnyben részesített variánsok azok, melyek konzervatív aminosawáltozásokat tartalmaznak a fentiekben leírtak szerint (például melyben a természetesen előforduló aminosav-oldalláncok töltése vagy polaritása nem változik lényegesen egy eltérő aminosav szubsztitúciójával) a vad típushoz képest, és/vagy melyeket úgy terveztünk, hogy vagy új glikozilációs és/vagy foszforilációs helye(ke)t tartalmazzanak az NNT-1-en, vagy melyeket úgy terveztünk, hogy a meglevő glikozilációs és/vagy foszforilációs helye(ke)t deléciónak vetjük alá.

Az NNT-1 gén vagy cDNS inzertálható egy megfelelő expresszióvektorba a gazdasejtben való expresszióhoz. A vektort úgy választjuk ki, hogy az adott, alkalmazott gazdasejtben működőképes legyen (azaz a vektor kompatibilis a gazdasejt mechanizmusával, oly módon, hogy az NNT-1 gén amplifikációja és/vagy a gén expressziója bekövetkezik). Az NNT-1 polipeptid vagy annak fragmentje amplifikálható/expresszálható prokarióta, élesztőgomba-, rovar- (baculovírus-rendszerekben) és/vagy eukarióta gazdasejtekben. A gazdasejt kiválasztása legalább részben attól függ, hogy az NNT-1 polipeptid vagy ennek fragmentje glikozilálandó-e. Ha igen, élesztőgomba-, rovar- vagy emlősgazdasejteket részesítünk előnyben; az élesztőgombasejtek glikozilálják a polipeptidet, és a rovar- és emlőssejtek glikozilálhatják és/vagy foszforilálhatják a polipeptidet, ahogy az természetesen előfordul az NNT-1 polipeptiden (azaz „natív” glikoziláció és/vagy foszforiláció).

Tipikusan a bármelyik gazdasejtben használt vektornak tartalmaznia kell az 5’ szomszédos szekvenciát (melyre „promoterként” is utalnak) és más szabályozóelemeket, mint például erősítő(ke)t, replikációs origó elemet, transzkripciós terminációs elemet, egy teljes intronszekvenciát, mely egy donor és akceptor hasítási helyet tartalmaz, egy jelpeptid-szekvenciát, egy riboszómakötő hely elemet, egy poliadenilációs szekvenciát, egy polikötő régiót az expresszálandó polipeptidet kódoló nukleinsav inzertálásához és egy szelektálható markerelemet. Ezen elemek mindegyikét megtárgyaljuk az alábbiakban. Tetszés szerint a vektor tartalmazhat egy „toldalék” szekvenciát, azaz egy, az NNT-1 kódolószekvencia 5’ vagy 3’ végénél elhelyezkedő oligonukleotidszekvenciát, mely poliHis-t (amilyen a hexaHis) kódol, vagy egy másik kis immunogén szekvenciát. Ez a toldalék a proteinnel együtt expresszálódik, és affinitási toldalékként szolgálhat az NNT-1 polipeptid gazdasejtből való tisztításához. Tetszés szerint a toldalék ezt követően különböző módszerekkel, például szelektált peptidázzal eltávolítható a tisztított NNT-1 polipeptidből.

Az 5’ szomszédos szekvencia lehet homológ (azaz származhat ugyanabból a fajból és/vagy törzsből, mint a gazdasejt), heterológ (azaz származhat a gazdasejtétől eltérő fajból vagy törzsből), hibrid (azaz lehet egynél több forrásból származó 5’ szomszédos szekvenciák kombinációja), szintetikus, vagy lehet a natív NNT-1 5’ szomszédos szekvencia. Mint ilyen, az 5’ szomszédos szekvencia forrása lehet bármely egysejtű prokarióta vagy eukarióta organizmus, bármely gerinces vagy gerinctelen organizmus, vagy bármely növény, feltéve, hogy az 5’ szomszédos szekvencia működőképes a gazdasejtben, és annak mechanizmusa aktiválhatja.

A jelen találmány vektoraiban használható 5’ szomszédos szekvenciák a tudomány e területén jól ismert számos módszer bármelyikével kinyerhetők. Tipikusan a jelen találmány használható, az NNT-1 5’ szomszédos szekvenciától eltérő 5’ szomszédos szekvenciákat előzetesen azonosítani kell feltérképezéssel és/vagy

HU 225 307 Β1 restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel, és ezután a megfelelő szövetforrásból izolálhatok megfelelő restrikciós endonukleázok segítségével. Néhány esetben az 5’ szomszédos szekvencia teljes nukleinsavszekvenciája is ismerhető. A találmányban az 5’ szomszédos szekvencia szintetizálható a nukleinsavszintézishez vagy klónozáshoz fent leírt módszerek felhasználásával.

Amikor az 5’ szomszédos szekvencia egészét vagy egy részét ismerjük, akkor előállítható PCR-technológiával és/vagy egy genomkönyvtár megfelelő oligonukleotiddal és/vagy ugyanabból vagy más fajokból származó 5’ szomszédos szekvencia fragmentekkel való szkrínelésével.

Amikor az 5' szomszédos szekvencia nem ismert, akkor egy 5’ szomszédos szekvenciát magában foglaló DNS-fragment izolálható a DNS egy nagyobb darabjából, mely például egy kódolószekvenciát, vagy akár egy másik gént vagy géneket tartalmaz. Az izolálás elvégezhető restrikciós endonukleáz emésztéssel egy vagy több gondosan megválogatott enzimmel a megfelelő DNS-fragment izolálása céljából. Az emésztés után a kívánt fragment agarózgél-tisztítással, Qiagen oszlopos vagy más, a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára ismert módszerrel izolálható. Ezen cél megvalósításához a megfelelő enzimek szelekciója azonnal nyilvánvaló a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára.

A replikációs origó elem tipikusan a kereskedelemben beszerezhető prokarióta expressziós vektor egy része és a vektor gazdasejtben való amplifikációját segíti elő. A vektor egy bizonyos kópiaszámra való amplifikációja bizonyos esetekben fontos lehet az NNT-1 polipeptid optimális expressziójához. Ha a választott vektor nem tartalmaz replikációs origó helyet, egy ilyen hely kémiailag szintetizálható egy ismert szekvenciára alapozva, és a vektorba ligálható.

A transzkripciós terminációs elem tipikusan az NNT-1 polipeptid kódolószekvenciájának végétől 3’-irányban helyezkedik el, és az NNT-1 polipeptid transzkripcióját terminálja. Általában a transzkripciós terminációs elem prokarióta sejtekben egy G-C-ben gazdag fragment, melyet egy poliT-szekvencia követ. Bár az elemet könnyen lehet egy könyvtárból klónozni, vagy akár egy vektor részeként a kereskedelemben is beszerezhető, könnyen szintetizálható a nukleinsavszintézishez fent leírt módszereket használva.

A szelektálható markergén elem egy szelektív tenyésztápközegen szaporított gazdasejt életben maradásához és szaporodásához szükséges proteint kódol. A tipikus szelekciós markergének olyan proteineket kódolnak, melyek (a) rezisztenciát biztosítanak antibiotikumokkal vagy más toxinokkal szemben, például ampicillinnel, tetraciklinnel vagy kanamicinnel szemben prokarióta gazdasejtek esetében, (b) pótolják a sejt auxotróf hiányait; vagy (c) kritikus, a komplex tápközegből nem elérhető tápanyagot biztosítanak. Az előnyben részesített szelektálható markerek a kanamicinrezisztencia-gének, az ampicillinrezisztencia-gének és a tetraciklinrezisztencia-gének.

A riboszómakötő elemre, melyet általában Shine-Dalgarno-szekvenciának (prokarióták) vagy Kozakszekvenciának (eukarióták) is neveznek, az mRNStranszláció iniciációjához van szükség. Az elem tipikusan a promotertől 3'-irányban és a szintetizálandó NNT-1 polipeptid kódolószekvenciájától 5’-irányban helyezkedik el. A Shine-Dalgamo-szekvencia sokféle, de tipikusan egy polipurin (azaz magas A-G-tartalmú). Sok Shine-Dalgamo-szekvenciát azonosítottak, ezek mindegyike könnyen szintetizálható a korábban megadott és a prokarióta vektorban használt módszerekkel.

Azokban az esetekben, amikor arra van szükség, hogy az ΝΝΤ-1-et szekretáljuk a gazdasejtből, egy jelszekvencia használható az NNT-1 polipeptid abból a gazdasejtből való kiirányítására, melyben szintetizálódott, és a protein karboxiterminális része delécióval eltávolítható a membránhoz való rögzülés megakadályozása céljából. Tipikusan a jelszekvenciát az NNT-1 nukleinsavszekvencia kódolórégiójában pozícionáljuk, vagy közvetlenül az NNT-1 kódolórégió 5’-végénél. Számos jelszekvenciát azonosítottak, és ezek bármelyike felhasználható, ha működőképes a szelektált gazdasejtben, az NNT-1 génnel együtt. Ezért a jelszekvencia homológ vagy heterológ lehet az NNT-1 polipeptiddel, és homológ vagy heterológ lehet az NNT-1 polipeptiddel. Ezenkívül a jelszekvencia kémiailag is szintetizálható a fent megadott módszereket használva. A legtöbb esetben a gazdasejtből való polipeptid szekréciója egy jelpeptid jelenlétén keresztül az aminoterminális metionin polipeptidből való eltávolítását eredményezi. Az NNT-1 polipeptidek expressziójának és szekréciójának megvalósításához hasznos szekréciós szekvenciákra szolgáló példákat a TPA vezetőszekvenciák [lásd például Rickles et al., J. Bioi. Chem. 263:1563-1560 (1988) és Feng et al., J. Bioi. Chem. 265:2022-2027 (1990)] az EPO vezetőszekvenciák és a kardiotrophin vezetőszekvenciák közül szelektáljuk.

Számos esetben az NNT-1 polipeptid transzkripciója fokozódik a vektoron levő egy vagy több intron jelenlétében; ez különösen akkor igaz, amikor az NNT-1 eukarióta gazdasejtben termelődik, különösen emlősgazdasejtekben. A használt intronok előfordulhatnak természetesen az NNT-1 nukleinsavszekvencián belül, különösen ahol a használt NNT-1 szekvencia egy teljes hosszúságú genomszekvencia vagy annak egy fragmentje. Amikor az intron az NNT-1 DNS-szekvenciában nem természetesen előforduló intron (ahogy a legtöbb cDNS esetében), az intron(ok) kinyerhetők más forrásból is. Az intron 5’ szomszédos szekvenciához és az NNT-1 kódolószekvenciához viszonyított pozíciója lényeges, mivel az intron hatékonyan kell átíródjon. Mint ilyen, amikor az NNT-1 nukleinsavszekvencia egy cDNS-szekvencia, az intron előnyben részesített pozíciója a transzkripciós starthelytől 3’-irányban és a poliA transzkripciós terminációs szekvenciától 5’-irányban van. Előnyösen az NNT-1 cDNS-ek esetében az intron az NNT-1 kódolószekvencia egyik vagy másik oldalán (azaz 5’- vagy 3’-irányban) helyezkedik el oly módon, hogy így nem szakítja meg a kódolószekvenciát. Bármilyen forrásból származó bármely intron, ideértve bár8

HU 225 307 Β1 mely virális, prokarióta és eukarióta (növényi vagy állati) szervezetet, felhasználható a jelen találmány gyakorlásához, feltéve, hogy az intron kompatibilis a gazdasejttel/(sejtekkel), melyekbe inzertálják. A jelen találmány felöleli a szintetikus intronokat is. Tetszés szerint egynél több intron használható fel a vektorban.

Amikor a fenti elemek közül egy vagy több nincs jelen a használandó vektorban, ezek egyénileg előállíthatók és a vektorba ligálhatók. Az egyes elemek előállítására szolgáló módszerek jól ismertek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára, és hasonlóak a korábban megadottakhoz (azaz DNSszintézis, könyvtárszkrínelés és más hasonlók).

A jelen találmány gyakorlásához használt végső vektort tipikusan egy kiindulási vektorból szerkesztjük meg, például egy, a kereskedelemben beszerezhető vektorból. Az ilyen vektorok tartalmazhatnak vagy nem tartalmaznak néhány olyan elemet, mely részt vesz a végső vektorban. Ha a kívánt elemek egyike sem szerepel a kiindulási vektorban, az egyes elemeket egyénileg ligálhatjuk a vektorba oly módon, hogy a vektort a megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasítjuk úgy, hogy a ligálandó elem vége és a vektor végei a ligáláshoz kompatíbilisak legyenek. Bizonyos esetekben szükség lehet az egymáshoz ligálandó végek „tompává” tételére ahhoz, hogy kielégítő ligálást kapjunk eredményül. A tompává tétel elvégezhető úgy, hogy először a „ragadós végeket” megtöltjük Klenow DNS polimert vagy T4 DNS-polimerázt használva mind a négy nukleotid jelenlétében. Ez az eljárás jól ismert a tudomány e területén, és leírásra került például Sambrook és munkatársai munkájában, supra.

Másik lehetőségként, két vagy több, a vektorba inzertálandó elem először egymáshoz ligálható (ha egymás szomszédságába akarjuk pozícionálni), majd a vektorba ligálhatók.

A vektor megszerkesztésének egy másik módszere, amikor a különböző elemek összes ligálását azonos időben végezzük el egy reakciókeverékben. Ilyen esetben számos értelmetlen vagy nem működőképes vektor jön létre a nem megfelelő ligálódásnak vagy az elemek inzertálódásának köszönhetően, azonban a működőképes vektor azonosítható és restrikciós endonukleázos emésztéssel szelektálható.

A jelen találmány gyakorlásához előnyben részesített vektorok azok, melyek kompatíbilisak a bakteriális, rovar- és/vagy emlősgazdasejtekkel. Az ilyen vektorok közé tartoznak, inter alia, a pCRII (Invitrogen Company, San Diego CA), a pBSII (Stratagene Company, LaJolla, CA) és a pETL (BlueBacll; Invitroge).

A vektor megszerkesztése után és az NNT-1 nukleinsav a vektorban a megfelelő helyre való inzertálása után a teljes vektor egy megfelelő gazdasejtbe inzertálható amplifikáció és/vagy NNT-1 polipeptid expresszió céljából.

A gazdasejtek lehetnek prokarióta gazdasejtek (például E. coli) vagy eukarióta gazdasejtek (mint például élesztőgombasejt, rovarsejt vagy egy gerinces sejtje). A gazdasejt, amikor megfelelő körülmények között tenyésztjük, szintetizálhatja az NNT-1 proteint, mely ezt követően összegyűjthető a tenyésztápközegből (ha a gazdasejt a tápközegbe szekretál), vagy közvetlenül az azt termelő gazdasejtből gyűjthető össze (ha nem szekretálódik). Az összegyűjtés után az NNT-1 protein olyan módszerekkel tisztítható, mint például a molekuláris szűrő kromatográfia, az affinitáskromatográfia és más hasonló módszerek.

A gazdasejt kiválasztása részben attól függ, hogy az NNT-1 proteint glikoziláljuk-e vagy foszforiláljuk-e (mely esetben az eukarióta gazdasejteket részesítjük előnyben), valamint attól a módtól, hogyan képes a gazdasejt a proteint natív tercier szerkezetébe „tekerni” (például a diszulfidhidak megfelelő orientációja) oly módon, hogy biológiailag aktív protein készüljön a sejtben. Azonban amikor a gazdasejt nem biológiailag aktív NNT-1-et állít elő, az NNT-1 a szintézis után „feltekerhető” megfelelő kémiai körülményeket alkalmazva, az alábbiakban leírtak szerint.

A megfelelő sejtek vagy sejtvonalak lehetnek emlőssejtek, például kínaihörcsögpetefészek-sejtek (CHO) vagy 3T3 sejtek. A megfelelő emlősgazdasejtek és a transzformációhoz, tenyésztéshez, amplifikációhoz, szkríneléshez és termék-előállításhoz és tisztításhoz való megfelelő módszerek kiválasztása ismert a tudomány e területén. Más megfelelő emlőssejtvonalak a majom COS-1 és COS-7 sejtvonalak és a CV-1 sejtvonal. További példaként szolgáló emlősgazdasejtek magukban foglalják a főemlőssejtvonalakat és a rágcsálósejtvonalakat, ideértve a transzformált sejtvonalakat is. A normális diploid sejtek, a primer szövet in vitro tenyészetéből származó sejttörzsek, valamint a primer explantumok szintén megfelelőek. A szóba jöhető sejtek genotípusosan hiányosak lehetnek a szelekciós génből, vagy tartalmazhatnak egy dominánsan ható szelekciós gént. Más megfelelő emlőssejtvonalak közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a HeLa, az egér L-929, a Swiss, Balb-c vagy NIH egerekből származó 3T3 vonalak a BHK vagy HaK hörcsög sejtvonalak.

Hasonlóképpen megfelelőek gazdasejtekként a jelen találmányhoz a bakteriális sejtek. Például az E. coli különböző törzsei (például a HB101, a DHa a DH10 és az MC1061) jól ismert gazdasejtek a biotechnológia területén. A B. subtilis, a Pseudomonas spp., más Bacillus spp., Streptomyces spp. és más hasonlók szintén használhatók ebben a módszerben.

A tudomány e területén képzett szakember számára ismert számos élesztőgombatörzs szintén beszerezhető gazdasejtként a jelen találmány polipeptidjeinek expresszálásához. Ezenkívül amikor szükséges, rovarsejtek is felhasználhatók gazdasejtekként a jelen találmány módszereiben [Miller et al., Genetic Engineering 8:277-298 (1989)].

A vektor kiválasztott gazdasejtbe való inzertálása (melyre „transzformációként” vagy „transzfekcióként” is hivatkozunk) elvégezhető olyan módszerekkel, mint a kalcium-kloridos, elektroporációs, mikroinjektálásos, lipofekciós vagy DEAE-dextrános módszerekkel. A kiválasztott módszer részben a használandó gazdasejt típusának függvénye. Ezek a módszerek és más eljárások jól ismertek a tudomány e területén átlagosan képzett

HU 225 307 Β1 szakember számára, és például Sambrook és munkatársai (supra) munkájában kerültek leírásra.

A vektort tartalmazó (azaz a transzformált vagy transzfektált) gazdasejtek a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára ismert standard tápközegben szaporíthatók. A tápközegnek általában tartalmaznia kell a sejtek szaporodásához és életben maradásához szükséges minden tápanyagot. Az E. coli sejtek tenyésztéséhez megfelelő tápközeg például a Luria Tápleves (LB) és/vagy a Terrific Tápleves (TB). Az eukarióta sejtek tenyésztéséhez megfelelő tápközeg az RPMI 1640, a MÉM, a DMEM, melyek mindegyike kiegészíthető szérummal és/vagy növekedési faktorral, ahogy azt az adott, tenyésztendő sejtvonal megkívánja. A rovartenyészetekhez megfelelő tápközeg a Grace-féle, szükség szerint yeastoláttal, laktalbuminhidrolizátummal és/vagy magzati borjúszérummal kiegészített tápközeg.

Tipikusan egy csak a transzformált sejtek szelektív szaporításához használható antibiotikum vagy más vegyület adható kiegészítésként a tápközeghez. A használandó vegyületet a plazmidon jelen levő szelektálható markerelem határozza meg, mellyel a gazdasejtet transzformáltuk. Például ahol a szelektálható markerelem a kanamicinrezisztencia, a tápközeghez adott vegyület a kanamicin lesz.

A gazdasejtben termelt NNT-1 polipeptid mennyisége a tudomány e területén ismert standardmódszerekkel értékelhető. Ilyen módszerek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül a Western-lenyomat-analízis, az SDS-poliakrilamid gél elektroforézis, a nem denaturáló gélelektroforézis, a HPLC-vel történő szeparálás, az immunoprecipitáció és/vagy az aktivitásvizsgálatok, mint például a DNS kötődési gél elmozdulási vizsgálat.

Ha az NNT-1 polipeptidet úgy terveztük, hogy a gazdasejtekből szekretáljuk, a polipeptid többségét a sejt tenyésztápközegében fogjuk megtalálni. Az ily módon termelt polipeptidek tipikusan nem rendelkeznek aminoterminális metioninnal, mivel az a sejtből való szekréció során leválik. Azonban ha az NNT-1 polipeptid nem szekretálódik a gazdasejtekből, az a citoplazmában (eukarióták, Gram-pozitlv baktériumok és rovargazdasejtek esetében) vagy a periplazmában (Gram-negatív bakteriális gazdasejtekben) lesz jelen, és rendelkezhet aminoterminális metioninnal.

Az intracelluláris NNT-1 proteinhez a gazdasejteket tipikusan először mechanikusan vagy ozmotikusán feltárjuk a citoplazmatartalom pufferoldatba való kinyerése céljából. Ezután az NNT-1 polipeptid izolálható ebből az oldatból.

Az NNT-1 polipeptid tisztítása számos technika segítségével végezhető el. Ha a polipeptidet oly módon szintetizáltuk, hogy egy toldalékot, mint például Hexahisztidint (NNT-1/hexaHis) vagy más kis peptidet tartalmaz vagy a karboxil- vagy az aminoterminusán, akkor lényegében egy egylépéses folyamatban tisztítható az oldat affinitási oszlopon való átengedésével, ahol az oszlopmátrix nagy affinitással rendelkezik a toldalék iránt vagy közvetlenül a polipeptid iránt (azaz egy, az

NNT-1-et specifikusan felismerő monoklonális antitest). Például a polihisztidin nagy affinitással és specifikusan kötődik a nikkelhez, így egy nikkel affinitási oszlop (mint például a Qiagen nikkeloszlopok) felhasználható az NNT-1/poliHis tisztításához [lásd például Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)].

Ahol az NNT-1 polipeptid nem rendelkezik toldalékkal, és nem állnak rendelkezésre antitestek, más jól ismert tisztítási eljárások használhatók. Ilyen módszerek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül az ioncserés kromatográfia, a molekuláris szűrő kromatográfia, a HPLC, a natív gél elektroforézis a gélelúcióval kombinálva és a preparatív izoelektromos fokuszálás („Isoprime” készülék/technika, Hoefer Scientific). Bizonyos esetekben ezen technikák közül kettőt vagy többet is kombinálhatunk a fokozott tisztaság eléréséhez. A tisztításhoz használt előnyben részesített módszerek közé tartoznak a polihisztidintoldalékolás és ioncserés kromatográfia preparatív izoelektromos fokuszálással kombinálva.

Ha számításba vesszük, hogy az NNT-1 polipeptidet elsősorban a baktérium periplazmás üregében vagy eukarióta sejtek citoplazmájában találjuk, a periplazma vagy citoplazma tartalma, ideértve az inklúziós testeket (például Gram-negatív baktériumok), ha a feldolgozott polipeptid képzett ilyen komplexeket, extrahálható a gazdasejtből a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára ismert standardtechnikákkal. Például a gazdasejt lizálható a periplazma tartalmának kiszabadítása céljából francia préseléssel, homogenizálással és/vagy ultrahangos kezeléssel. Ezután a homogenizátum centrifugálható.

Ha az NNT-1 polipeptid inklúziós testeket képzett a periplazmában, az inklúziós testek gyakran kötődnek a belső és/vagy külső sejtmembránokhoz, és így elsődlegesen a pelletanyagban találhatók centrifugálás után. A pelletanyag ezután kezelhető egy kaotróf anyaggal, például guanldinnel vagy karbamiddal az inklúziós testek feltárásához, széttöréséhez és oldhatóvá tételéhez. Az NNT-1 polipeptid most már oldható formájában analizálható gélelektroforézissel, immunoprecipitációval és más hasonló eljárásokkal. Ha szükség van az NNT-1 polipeptid izolálására, az izolálás elvégezhető standardmódszerekkel, mint például az alábbiakban és a Marsion és munkatársai által [Meth. Enz., 182:264-275 (1990)] leírtak szerint.

Ha NNT-1 polipeptid inklúziós testek nem képződnek szignifikáns mértékben a gazdasejt periplazmájában, az NNT-1 polipeptidet elsődlegesen a felülúszóban találjuk meg a sejthomogenizátum centrifugálása után, és az NNT-1 polipeptid a felülúszóból izolálható a későbbiekben leírt módszerek segítségével.

Azokban az esetekben, amikor az az előnyös, ha az NNT-1 polipeptidet részlegesen vagy teljes egészében izoláljuk, a tisztítás elvégezhető a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára jól ismert standardmódszerekkel. Az ilyen módszerek közé tartoznak az ezekre való korlátozás nélkül az elektrofo10

HU 225 307 Β1 rézissei végzett szeparálás, melyet elektroelúció követ, a különböző típusú kromatográfiák (immunoaffinitási, molekuláris szűrési és/vagy ioncserés) és/vagy a nagynyomású folyadékkromatográfia. Bizonyos esetekben előnyös lehet ezen módszerek közül egynél többet használni a teljes tisztítás megvalósításához.

B) Kémiai szintézises módszerek

Az NNT-1 polipeptid rekombináns DNS technikákkal történő előállításán és tisztításán túl az NNT-1 polipeptidek, fragmentek és/vagy ezek származékai előállíthatok kémiai szintézises módszerekkel is (mint például szilárd fázisú peptidszintézissel) a tudomány e területén átlagosan képzett szakember számára ismert eljárásokat használva, mint amik például Merrifield et al. [J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1964)], Houghten et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132 (1985)] és Stewart és Young [Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL (1984)] által kerültek leírásra. Az ilyen polipeptidek szintetizálhatok az aminoterminuson levő metioninnal vagy metionin nélkül. A kémiailag szintetizált NNT-1 polipeptidek vagy fragmentek oxidálhatók az itt megadott irodalmi hivatkozásokban szereplő módszerekkel diszulfidhidak létrehozása céljából. Az NNT-1 polipeptidek vagy fragmentek természetes, tisztított NNT-1 polipeptidek biológiailag aktív vagy immunológiai helyettesítőiként használhatók terápiás és immunológiai eljárásokban.

IV. Kémiailag módosított NNT-1-származék

A kémiailag módosított NNT-1-készítmények (azaz „származékok”), melyekben az NNT-1 polipeptid egy polimerhez kötődik („NNT-1 polimerek”), a jelen találmány körébe tartoznak. A kiválasztott polimer tipikusan vízoldható, így a protein, melyhez kapcsolódik, nem csapódik ki vizes környezetben, például fiziológiai környezetben. A kiválasztott polimer általában oly módon módosított, hogy egyetlen reakcióképes csoportja legyen, mint például egy aktív észtercsoportja az acilezéshez és egy aldehidcsoportja az alkilezéshez, így a polimerizáció foka szabályozható, amint azt biztosítjuk a jelen módszerrel. A polimer bármilyen molekulasúlyú lehet, lehet elágazó vagy elágazás nélküli. Az NNT-1 polimerek körébe tartoznak a polimerek keverékei. Előnyösen a végtermék terápiás célból való felhasználásához a polimer gyógyszerészetileg elfogadható kell legyen.

A vízoldható polimer vagy ezek keveréke kiválasztható például a következőket magában foglaló csoportból: polietilénglikol (PEG), monometoxi-polietilénglikol, dextrán, cellulóz vagy más szénhidrátalapú polimerek, poli(N-vinil-pirrolidon)-polietilénglikol, propilénglikol-homopolimerek, egy polipropilén-oxid/etilén-oxid kopolimer, polioxietilált poliolok (például glicerol) és poli(vinil-alkohol).

Az acilezési reakciókhoz a kiválasztott polimer(ek) egy egyedüli reakcióképes észtercsoporttal kell rendelkezzenek. A reduktív alkilezéshez a kiválasztott polimer(ek) egy egyedüli reakcióképes aldehidcsoporttal kell rendelkezzenek. Egy előnyben részesített reakcióképes aldehid a polietilénglikol-propionaldehid, mely vízoldható, vagy ennek mono-(C1-C10) alkoxi- vagy aril-oxi-származékai (lásd az 5.252.714 számú US szabadalmi bejelentést).

Az NNT-1 pegilálása elvégezhető bármelyik, a tudomány e területén ismert pegilálási reakcióval, mint például ahogy az alábbi hivatkozásokban leírásra került: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; és EP 0 401 384. Előnyösen a pegilálást egy acilezési vagy egy alkilezési reakción keresztül valósítjuk meg egy reakcióképes polietilénglikol-molekulával (vagy egy analóg reakcióképes vízoldható polimerrel), amint azt az alábbiakban leírjuk.

Az acilezéssel végzett pegilálás általában magában foglalja egy polietilénglikol (PEG) aktív észterszármazékának egy NNT-1 proteinnel való reagáltatását. Bármely ismert vagy a későbbiekben felfedezett reakcióképes PEG-molekula felhasználható az NNT-1 pegilálásának végrehajtásához. Egy előnyben részesített aktivált PEG-észter az N-hidroxi-szukcinimidhez („NHS”) észterifikált PEG. A találmány szerinti használatban az „acilezés” korlátozás nélkül magában foglalja az NNT-1 és egy vízoldható polimer, mint például a PEG közötti következő típusú kötéseket: amid, karbamát, uretán és más hasonlók, ahogy leírásra került: Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994). A reakciókörülmények kiválaszthatók a pegilálás területén ismert bármely körülmény közül vagy az azóta kifejlesztettek közül, feltéve, hogy a módosítandó NNT-1-fajokat inaktiváló tényezőket, mint hőmérséklet, oldószer és pH-érték, elkerüljük.

Az acilezéssel történő pegilálás általában polipegilált NNT-1 terméket eredményez, melyben a lizin ε-aminocsoportok pegilálódnak egy acilkötő csoporton keresztül. Előnyösen a kapcsolódó kötés egy amidkötés. Az is előnyben részesül, ha a kapott termék legalább 95%-ban mono-, di- vagy tripegilált. Azonban néhány magasabb pegilációs fokú típus (az NNT-1 lizin ε-aminosavcsoportjainak maximális számáig + egy α-aminocsoport az NNT-1 aminoterminusán) is létrejön normális esetben olyan mennyiségben, ami a használt specifikus reakciókörülményektől függ. Ha szükséges, még tovább tisztított pegilált fajták szeparálhatók a keverékből, különösen a nem reagált típusok, standard tisztítási technikákkal, ideértve többek között a dialízist, a kisózást, az ultraszűrést, az ioncserés kromatográfiát, a gélszűréses kromatográfiát és az elektroforézist.

Az alkilezéssel végrehajtott pegilálás általában magában foglalja egy PEG terminális aldehidszármazékának egy proteinnel, mint például egy NNT-1-gyei redukálóanyag jelenlétében való reagáltatását. A pegilálás fokától függetlenül a PEG-csoportok előnyösen egy -CH₂-NH csoporton keresztül kapcsolódnak a proteinhez. Különös tekintettel a -CH₂-NH csoportra, erre a típusú kötésre a jelen találmányban „alkil’-kötésként hivatkozunk.

A reduktív alkilezésen keresztül végzett, monopegilált termék létrehozására irányuló származtatás az NNT-1-ben a származtatáshoz rendelkezésre álló különböző típusú primer aminocsoportok eltérő reaktivitá11

HU 225 307 Β1 sát aknázza ki (lizin versus az N-terminális). Tipikusan a reakciót olyan pH-értéken hajtjuk végre (lásd lent), mely lehetővé teszi a protein lizinmaradékai ε-aminocsoportjai és az N-terminális maradék α-aminocsoportjai közötti pKa-különbségek előnyeinek kihasználását. Az ilyen szelektív származtatással a reakcióképes csoportot, például egy aldehidet tartalmazó vízoldható polimer proteinhez való kapcsolása szabályozható. Polimer konjugációja elsődlegesen a protein N-terminális végén következik be az egyéb reakcióképes csoportok, például a lizin-oldallánc-aminocsoportok szignifikáns módosítása nélkül. A jelen találmány ΝΝΤ-1-monopolimer protein konjugátum molekulák lényegében homogén készítményét biztosítja [olyan NNT-1 proteint jelent, melyhez egy polimer molekulát kapcsoltunk lényegében csak (azaz legalább 95%-ban) egy egyedüli lokációban az NNT-1 proteinen]. Még specifikusabban, ha polietilénglikolt használunk, a jelen találmány biztosít egy olyan pegilált NNT-1 proteint is, melyből hiányoznak a lehetséges antigénkötő csoportok, és a polietilénglikol-molekula közvetlenül az NNT-1 proteinhez kapcsolódik.

Egy különösen előnyben részesített vízoldható polimer a találmányban való használathoz a polietilénglikol, melyet PEG-ként rövidítünk. A találmány szerinti használatban a polietilénglikol magában foglalja a PEG bármely formáját, melyet más proteinek származtatásához használtak, mint például a mono-(C1-C10) alkoxi- vagy aril-oxi-polietilénglikolt.

Általánosságban a kémiai származtatás elvégezhető bármilyen megfelelő körülmény között, melyet egy biológiailag aktív anyag és egy aktivált polimer molekula reagáltatásához használunk. A pegilált NNT-1 előállítására szolgáló módszerek általában a következő lépéseket kell magukban foglalják: (a) egy NNT-1 polipeptidet egy polietilénglikollal (például a PEG egy reakcióképes észter- vagy aldehidszármazékával) reagáltatunk olyan körülmények között, melyben az NNT-1 kapcsolódik egy vagy több PEG-csoporthoz, és (b) a reakciótermékeket kinyerjük. Általában az acilezési reakciók optimális reakciókörülményeit ismert paraméterek és a kívánt eredmény alapján határozzuk meg. Például minél nagyobb a PEG:protein arány, annál nagyobb a polipegilált termék százaléka.

A lényegében homogén monopolimer/NNT-1 protein konjugátum molekula létrehozásához való reduktív alkilezés általában a következő lépéseket kell magában foglalja: (a) egy NNT-1 proteint egy reakcióképes PEG-molekulával reagáltatunk reduktív alkilezési körülmények között olyan pH-értéken, mely megfelelő ahhoz, hogy lehetővé tegye az említett NNT-1 aminoterminusánál levő α-aminocsoport szelektív módosítását; és (b) a reakcióterméket kinyerjük.

Egy lényegében homogén monopolimer/NNT-1 protein konjugátum molekula populáció esetében a reduktív alkilezési reakciókörülmények olyanok, melyek lehetővé teszik a vízoldható polimer egység NNT-1 N-terminusához való kapcsolódását. Az ilyen reakciókörülmények általában pKa-különbséget eredményeznek a lizin-aminocsoportok és az N-terminus α-aminocsoportjai között (a pHa azt a pH-értéket jelenti, melyen az aminocsoportok

50%-a protonálódik és 50% nem). A pH-érték hatással van a polimer és a használt protein arányára is. Általában ha a pH-érték alacsonyabb, nagyobb feleslegben levő polimer:protein arányra van szükség (azaz minél kevésbé reakcióképes az N-terminális a-aminocsoport, annál több polimer kell az optimális körülmények biztosításához). Ha a pH-érték magasabb, a polimerprotein arány nem kell ilyen magas legyen (azaz több reakciócsoport áll rendelkezésre, így kevesebb polimer molekulára van szükség). A jelen találmány céljaira a pH-érték általában 3-5, előnyösen 4-5 közé esik.

Egy másik lényeges szempont a polimer molekulatömege. Általában minél magasabb a polimer molekulatömege, annál kevesebb proteinhez kapcsolandó polimer molekulára van szükség. Hasonlóképpen, a polimer elágazottságát is figyelembe kell venni ezen paraméterek optimalizálásakor. Általában minél nagyobb a molekulatömeg (vagy az elágazottság), annál magasabb polimerprotein arányra van szükség. Általában az itt figyelembe vett pegilálási reakciókhoz az előnyben részesített átlagos molekulatömeg körülbelül 2 kDa-körülbelül 100 kDa (a „körülbelül kifejezés ±1 kDa-t jelent). Az előnyben részesített átlagos molekulatömeg körülbelül 5 kDa-körülbelül 50 kDa, még előnyösebben körülbelül 12 kDa-körülbelül 25 kDa. A vízoldható polimer:NNT-1 protein aránya általában 1:1-100:1, előnyösen (a pegiláláshoz) 1:1-20:1 és (a monopegiláláshoz) 1:1-5:1.

A fent jelzett körülményeket használva a reduktív alkilezés lehetőséget biztosít a polimer bármely NNT-1 proteinhez való szelektív kapcsolódásához, mely NNT-1 protein egy α-aminocsoporttal rendelkezik az aminoterminusán, és biztosít egy lényegében homogén monopolimer/NNT-1 protein konjugátum készítményt. A „monopolimer/NNT-1 protein konjugátum” kifejezés a találmány szerinti használatban egy olyan készítményt jelent, mely egy NNT-1 protein molekulához kapcsolódó egyedüli polimer molekulát jelent. A monopolimer/NNT-1 protein konjugátum előnyösen egy, az N-terminusnál, de nem a lizin-amino-oldalcsoportokon elhelyezkedő polimer molekulával rendelkezik. A készítmény előnyösen 90%-nál nagyobb monopolimer/NNT-1 protein konjugátum, és még előnyösebben 95%-nál nagyobb monopolimer/NNT-1 protein konjugátum, a többi megfigyelhető molekula nem reagál (azaz nem rendelkezik polimeregységekkel). Az alábbiakban megadott példák olyan készítményt biztosítanak, mely legalább 90%-ban monopolimer/NNT-1 protein konjugátumot jelent, és körülbelül 10%-ban nem reagált proteint. A monopolimer/protein konjugátum biológiailag aktivitással rendelkezik.

A jelen reduktív alkilezéshez a redukálóanyag stabil kell legyen vizes oldószerben, és előnyösen csak a reduktív alkilezés kezdeti folyamatában képződött Schiff bázist képes redukálni. Az előnyben részesített redukálóágenst a nátrium-bór-hidridet, a nátrium-cianobór-hidridet, a dimetil-amin-boránt, a trimetil-amin-boránt és a piridin-boránt magában foglaló csoportból szelektáljuk. A különösen előnyben részesített redukálóanyag a nátrium-ciano-bór-hidrid.

HU 225 307 Β1

Más reakcióparaméterek, mint például az oldószer, a reakcióidő, a hőmérséklet stb. és a termék tisztítási módszere a proteinek vízoldható polimerekkel való származtatásával kapcsolatos irodalomban leírt információk alapján meghatározhatók.

A polimer-NNT-1 protein konjugátum molekulák keveréke acilezéssel és/vagy alkilezési módszerekkel is előállítható a fent leírtak szerint, és bárki kiválaszthatja a monopolimer/protein konjugátum arányát a keverékben. (gy tetszés szerint a különböző számú kapcsolt polimer molekulákkal (azaz di, tri, tetra stb.) rendelkező különböző proteinek keveréke előállítható és a jelen módszerrel előállított monopolimer/NNT-1 protein konjugátum anyaggal kombinálható.

Általában azok a körülmények, melyek a jelen polimer/NNT-1 alkalmazásával enyhíthetők vagy módosíthatók, azok, melyeket általánosságban az NNT-1 molekulákhoz leírtunk. Azonban a jelen találmányban leírt polimer/NNT-1 molekulák további aktivitással, fokozott vagy csökkent aktivitással, vagy más jellemzőkkel rendelkezhetnek a nem származtatott molekulákhoz képest.

V. Kombinációk

Az NNT-1 polipeptidek és ezek fragmentjei akár kémiailag módosítottak, akár nem, felhasználhatók magukban vagy más gyógyszerészeti készítményekkel, például neurotróf faktorokkal, citokinekkel, interferonokkal, interleukinekkel, növekedési faktorokkal, antibiotikumokkal, gyulladásgátló szerekkel, neurotranszmitter receptor agonistákkal vagy antagonistákkal és/vagy antitestekkel együtt a neurológiai vagy immunrendszeri rendellenességek kezelésében.

VI. Antitestek

Az NNT-1 polipeptidek, fragmentek és/vagy ezek származékai felhasználhatók a standardmódszerekkel történő antitestek előállításához. így az NNT-1 polipeptidekkel reagáló antitestek, valamint az ilyen antitestek reakcióképes fragmentjei szintén a jelen találmány körébe tartoznak. Az antitestek lehetnek poliklonális, monoklonális, rekombináns, kiméra, egyláncú és/vagy bispecifikus antitestek. Tipikusan az antitestet vagy ennek fragmentjét „humanizáljuk”, azaz úgy állítjuk elő, hogy megakadályozzuk vagy minimalizáljuk az antitestre adott immunreakciót a betegnek való alkalmazáskor. Az antitestfragment bármely olyan fragment lehet, mely reakcióképes a jelen találmány NNT-1 polipeptidével, például F_ab, F’_ab stb. A jelen találmány biztosít olyan hibridómákat is, melyeket úgy hozunk létre, hogy antigénként az NNT-1-et vagy ennek egy fragmentjét prezentáljuk a kiválasztott emlősnek, majd az emlős sejtjeit (például lépsejteket) bizonyos rákos sejtekkel fuzionáltatjuk ismert technikákat használva halhatatlanná tett sejtvonalak létrehozása céljából. Az ilyen sejtvonalak és a jelen találmány humán NNT-1 polipeptidjének egésze vagy része ellen irányuló antitestek létrehozásához használt módszerek szintén részét képezik a jelen találmánynak.

Az antitestek terápiásán használhatók, például hogy gátolják az NNT-1 receptoraihoz való kötődését.

Az antitestek a továbbiakban felhasználhatók in vivő és in vitro diagnosztikai célokra, mint például jelölt formában egy testfolyadékban levő NNT-1 jelenlétének detektálására.

VII. Terápiás készítmények és ezek alkalmazása

A találmány szerinti használatban a „hatékony mennyiség kifejezés és a „terápiásán hatékony mennyiség” kifejezések az NNT-1 azon mennyiségére utalnak, mely ahhoz szükséges, hogy az NNT-1 fent leírt egy vagy több biológiai aktivitását segítse elő.

A különböző neurológiai rendellenesség vagy betegség kezelésére szolgáló terápiás készítmény a jelen találmány körén belül szerepel. Az ilyen készítmények magukban foglalhatják egy NNT-1 polipeptid vagy ennek fragmentje (melyek bármelyike lehet kémiailag módosított) terápiásán hatékony mennyiségét egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt. A hordozóanyag lehet víz az injektáláshoz, előnyösen más, az emlősök kezelésében általánosan használt oldatokkal kiegészítve. Tipikusan egy NNT-1 terápiás vegyületet egy olyan készítmény formájában adunk, mely egy tisztított NNT-1 polipeptidet vagy fragmentet tartalmaz (mely lehet kémiailag módosított) egy vagy több fiziológiailag elfogadható hordozóval, excipiensekkel (kötőanyagokkal) vagy hígítószerekkel együtt. A semleges puffereit sóoldat vagy a szérumalbuminnal kevert sóoldat példaként szolgál a megfelelő hordozókra. Előnyösen a terméket liofilizátumként formulázzuk, megfelelő kötőanyagot (például szacharózt) használva. Más standard hordozók, hígítószerek és kötőanyagok is felhasználhatók tetszés szerint. A példaként szolgáló készítmény körülbelül 4,0-4,5 pH-értékű citrátpuffert tartalmaz, mely még NaCI-ot is magában foglalhat.

Az NNT-1-készítmények szisztémásán alkalmazhatók parenterálisan. Másik lehetőségként a készítmények intravénásán vagy szubkután alkalmazhatók. Amikor szisztémásán használjuk, a jelen találmányban való használathoz a terápiás készítmények lehetnek pirogénmentes formájú, parenterálisan elfogadható vizes oldatok. Az ilyen gyógyszerészetileg elfogadható proteinoldatok készítményei megfelelő tekintettel a pH-értékre, az izotonicitásra, a stabilitásra és más hasonló faktorokra szintén a találmány körébe tartoznak.

A jelen találmány gyakorlásához használható ΝΝΤ-1-készítmények terápiás készítményei tároláshoz is előállíthatók úgy, hogy a megfelelő tisztasági fokú, kiválasztott készítményt szabadon választható fiziológiailag elfogadható hordozókkal, kötőanyagokkal vagy stabilizátorokkal [Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro ed., Mack Publishing Company (1990)] keverjük össze egy liofilezett massza vagy vizes oldat formájában. Az elfogadható hordozók, kötőanyagok vagy stabilizátorok nem toxikusak a recipiensre, és előnyösen inertek az alkalmazott dózisban és koncentrációkban, és olyan puffereket foglalnak magukban, mint például foszfát, citrát vagy más szerves sav puffereket; antioxidánsokat, mint például aszkorbinsavat; alacsony molekulatömegű polipeptideket; proteineket, mint például szérumalbumint, zselatint

HU 225 307 Β1 vagy immunoglobulinokat; hidrofil polimereket, mint például poli(vinil-pirrolidon)-t; aminosavakat, mint például glicint, glutamint, aszparagint, arginint vagy lizint; monoszacharidokat, diszacharidokat és más szénhidrátokat, ideértve a glükózt, mannózt vagy dextrineket; kelátképző anyagokat, mint például EDTA-t; cukoralkoholokat, mint például mannitolt vagy szorbitolt; sóképző, ellentétes ionokat, például nátriumot; és/vagy nemionos felületaktív anyagokat, például Tweent, Pluronicsot vagy polietílénglikolt (PEG).

Az in vivő alkalmazáshoz való használandó NNT-1-készítmény steril kell legyen. Ez könnyen megvalósítható steril szűrőmembránon való szűréssel. Amikor az NNT-1-készítmény liofilezett, az ezen módszerekkel végzett sterilezés elvégezhető a liofilezés és reszuszcitálás előtt vagy azt követően. A parenterális alkalmazáshoz való készítményt liofilezett formában vagy oldat formájában tároljuk.

A terápiás készítményeket általában olyan tartóba helyezzük, mely steril hozzáférhetőségi hellyel rendelkezik, például egy intravénás oldat tasakban vagy fiolában, mely egy hipodermás injekciós tűvel átszúrható dugóval van lezárva.

A készítmény alkalmazási módszere összhangban van az ismert módszerekkel, például orális, intravénás injekció vagy infúzió, intraperitoneális, intracerebrális (intraparenchimális), intracerebroventrikuláris, intramuszkuláris, intraokuláris, intraarteriális vagy intralezionális módszerekkel, vagy fenntartott felszabadulási rendszerrel vagy beültetett készülékkel, mely tetszés szerint egy katéter használatát is magában foglalja. Ahol szükséges, a készítmények alkalmazhatók folyamatos infúzióval, nagy injekció adagban vagy implantációs eszközzel. Másik lehetőségként, vagy ezeken túl, az NNT-1 adható lokálisan az érintett területre egy membrán, szivacs vagy más megfelelő anyag beültetésével, mely anyagra az NNT-1 polipeptidet abszorbeáltuk.

Amikor implantációs készüléket használunk, a készülék beültethető bármely megfelelő szövetbe vagy szervbe, mint például a cerebrális ventriculumokba vagy az agyi parenchimába, és az NNT-1 bejuttatása történhet közvetlenül a készüléken keresztül nagy adagú vagy folyamatos alkalmazással vagy katéteren keresztül folyamatos infúziót alkalmazva.

Az NNT-1 polipeptidek fenntartott felszabadulású készítmény formájában is alkalmazhatók. A megfelelő fenntartott felszabadulású készítményekre példák a szemipermeábilis polimer mátrixok formázott anyagok formájában, például filmek vagy mikrokapszulák formájában. A fenntartott felszabadulású mátrixok magukban foglalják a poliésztereket, hidrogéleket, polilaktidokat (U.S. 3,733,919; EP 583481), L-glutaminsav és gamma-etil-glutamin kopolimereit [Sudman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)], poli(2-hidroxi-etil-metakrilát) [Langer et al., J. Biomed. Mater. Rés. 15:167-277 (1981) és Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)], etilén(vinil-acetát) (Langer et al., supra) vagy poli-D(-)-3-hidroxi-vajsavat (EP 133,988). A fenntartott felszabadulású készítmények magukban foglalhatnak liposzómákat is, melyek számos, a tudomány e területén ismert módszerrel állíthatók elő [például DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949],

Bizonyos esetekben kívánatos lehet, hogy az NNT-1-készítmények ex vivő módon kerüljenek felhasználásra, azaz a betegből eltávolított sejteket vagy szöveteket kezeljék, majd ezeket ezt követően ültessék vissza a betegbe.

Más esetekben az NNT-1 bejuttatható a betegbe oly módon is, hogy bizonyos sejteket implantálunk, melyeket génsebészeti manipulációnak vetettünk alá az NNT-1 polipeptid expressziója és szekretálása céljából. Az ilyen sejtek lehetnek állati vagy humán sejtek, és származhatnak a beteg saját szövetéből vagy más, humán vagy nem humán forrásból. Tetszés szerint a sejtek halhatatlanná is tehetők. A sejtek beültethetők az agyba, a mellékvesébe vagy a beteg más megfelelő testszövetébe vagy szervébe.

Bizonyos esetekben kívánatos lehet a génterápia használata az NNT-1 alkalmazásához olyan betegek esetében, akik bizonyos neurológiai vagy immunológiai rendellenességekben szenvednek. Ilyen esetekben az NNT-1-et kódoló genom DNS, cDNS és/vagy szintetikus DNS vagy ezek egy fragmentje vagy variánsa kapcsolható működőképesen egy konstitutív vagy indukálható promoterhez, mely abban a szövetben aktív, melybe a készítményt injektálják. Ez az NNT-1 DNS szerkezet, akár vektorba inzertálták, akár vektor nélkül, közvetlenül az agyba vagy más idegi vagy nem idegi szövetbe injektálható.

Másik lehetőségként egy NNT-1 DNS készítmény injektálható közvetlenül az izomszövetbe, ahol a sejtek felvehetik és a sejtekben expresszálódnak, feltéve, hogy az NNT-1 DNS működőképesen kapcsolódik egy olyan promoterhez, mely az izomszövetben aktív, például egy citomegalovírus- (CMV) promoterhez, a Rous-szarkóma-vírus- (RSV) promoterhez vagy az izom-kreatin-kináz-promoterhez.

Tipikusan a DNS-szerkezet magában foglalhat (az NNT-1 DNS-en és egy promoteren kívül) vektorszekvenciát, melyet olyan vektorokból nyertünk, mint például az adenovírusvektor, adenorokon vírusvektor, egy retrovirális vektor és/vagy egy herpesvírusvektor. A vektor/DNS szerkezet keverhető egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval vagy hordozókkal az injektáláshoz.

A terápiásán alkalmazandó NNT-1-készítmény(ek) hatékony mennyiségei függnek például a terápiás céloktól, mint például az indikációtól, hogy mely NNT-1 kerüljön használatra, az alkalmazás módjától és a beteg állapotától. Ennek megfelelően az orvos meg kell határozza a dózist, és módosítania kell az alkalmazás módját ahhoz, hogy az optimális terápiás hatást érje el. Egy tipikus napi dózis a körülbelül 0,1 pg/kg-10 mg/kg vagy még több, a fent említett tényezőktől függően. Tipikusan a klinikus addig alkalmazza az ΝΝΤ-1-készítményt, míg egy olyan dózist ér el,

HU 225 307 Β1 mely a kívánt hatást eredményezi. Ezért az NNT-1 készítmény egyszeri dózisként vagy kétszeri vagy többszöri dózisként (mely tartalmazhatja ugyanazt a dózist vagy más dózist) alkalmazható bizonyos idő alatt vagy folyamatos infúzióként implantációs készülék segítségével vagy katéterrel.

Mivel további vizsgálatokat végeznek, információ fog rendelkezésre állni a megfelelő dózisszintek tekintetében a különböző betegekben különböző állapotok kezelésére, és a tudomány e területén átlagosan képzett szakember, figyelembe véve a terápiás összefüggéseket, a kezelés alatt álló rendellenességek típusát, a recipiens korát és általános egészségi állapotát, képes lesz a megfelelő dózisok megállapítására.

Vili. Az ΝΝΤ-1-gyel kezelendő állapotok

Az NNT-1 proteinek, fragmentek és/vagy ezek származékai a központi vagy perifériás idegrendszer betegségeinek és rendellenességeinek kezelésére használhatók, mely betegségek és rendellenességek az NNT-1-expresszió mintájának megváltozásával kapcsolatosak, vagy mely betegségek és rendellenességek hasznot húzhatnak az NNT-1-nek vagy anti-NNT-1 antitesteknek való kitettség következtében.

Az NNT-1 protein és/vagy fragmentek vagy származékaik olyan betegek kezelésére használhatók, akikben a központi, autonóm vagy perifériás idegrendszer sejtjei degenerálódtak és/vagy károsodtak örökletes betegségek, trauma, mechanikai sérülés, sebészeti beavatkozás, stroke, ischaemia, fertőzés, anyagcsere-betegségek, táplálkozási elégtelenség, rosszindulatú betegségek és/vagy toxikus anyagok következtében. Még specifikusabban, az NNT-1 protein szintek módosíthatók (fel vagy le szabályozhatók) az olyan indikációk esetén, mint például az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, az amiotróf laterális szklerózis, a Charcot-Marie-Toothszindróma, a Huntington-kór, a diabétesz vagy más anyagcsere-betegség által indukált perifériás neuropathia és/vagy disztrófiák vagy a neurális retina degenerációja, mint például a retinitis pigmentosa, gyógyszer által kiváltott retinopathiák, az éjszakai vakság stacioner formái, a progresszív csap-pálcika degenerációk és más hasonlók. Miután az NNT-1 az immunrendszer sejtjeiben is expresszálódik (lásd például az V. példát az alábbiakban), hasznos lehet az immun-rendellenességek által okozott betegségek kezelésében is. Ezenkívül miután az NNT-1 expresszálódik a hematopoietikus sejtekben is (lásd az V. példát az alábbiakban), hasznos lehet a hematopoietikus rendszer rendellenességei által okozott betegségek kezelésében is.

Ezenkívül az NNT-1 proteinek, fragmentek és/vagy származékaik felhasználhatók a B-sejteket és/vagy T-sejteket, előnyösen a B-sejteket magában foglaló immunológiai rendszer betegségeinek és rendellenességeinek kezelésében is. Amint azt a jelen találmány IX—XI. példáiban is bemutatjuk, az NNT-1 B-sejt-stimuláló, kisebb mértékig T-sejt-termelést stimuláló aktivitással is rendelkezik.

Számos primer humorális immunhiány létezik, melyek potenciális céljai ezen faktoroknak. Bár valamelyest ritkán, ezek a betegségek mind krónikus betegségek, és hosszú távú kezelést igényelnek. Az első az általános, változó immunhiány vagy CVID, melyet a keringő B-sejtek meglehetősen normális szintjei jellemeznek, de melyekből hiányzik az a képesség, hogy megfelelően differenciálódjanak immunoglobulintermelő sejtekké. A CVID-del rendelkező egyének fogékonyak a visszatérő bakteriális fertőzésekkel szemben.

Egy másik ΝΝΤ-1-et célzó betegség a szelektív IgA-hiány, mely szintén visszatérő fertőzéseket eredményez, általában a tüdőre, a gasztrointesztinális és urogenitális csatornára korlátozódó betegségek. A szelektív IgA-hiány az egyik leggyakoribb ilyen betegség, mely a lakosság 0,03-0,97%-ában gyakori.

Más NNT-1-et célzó betegségek közé tartoznak a hipogammaglobulémia, az X-kapcsolt agammaglobulémia és/vagy az ezen betegségek valamelyikével kapcsolatos állapotok, mint például a visszatérő fertőzések, a veseelégtelenség vagy a giardiasis. Lásd Clin. Immunoi, and Immunopath., 40(1):13-24 (1986).

A humorális immunválaszok fokozása bizonyos vakcinákkal szemben az NNT-1 polipeptidek egy másik felhasználási területét jelentheti. Például az orális vakcinázás alkalmazását követő antitesttermelés gyakran nem kielégítő, és ezért csak korlátozott ideig tartó védelmet biztosít. Célul tűztük ki az NNT-1 hatásjavítóként való alkalmazását a vakcinázás utáni antitesttermelés fokozása céljából.

Mivel képes az LPS indukálta TNF-a-termelés gátlására, az NNT-1-et hasznosnak találtuk a sepsisek kezelésében is. Bár számos, ezt a nagyon fontos klinikai problémát megközelítő biológiai válasz módosító alapú eljárás nem bizonyult még meggyőző értékűen, fennáll a lehetősége, hogy az NNT-1 sikeres lehet ott, ahol más terápiás jelöltek nem mutatkoznak sikeresnek. A Jarish-Schwarzmann-reakció olyan klinikai állapot, mely a sepsishez hasonló, és egyértelműen az NTF toxikus hatás következménye. Egy anti-TNF antitest használata klinikailag sikeres megközelítésnek bizonyult ezen állapot kezelése során. Olyan állapotot jelent ez, ahol az NNT-1 klinikailag értékesnek bizonyult abban az értelemben, hogy anti-TNF és gyulladásgátló tulajdonságú.

IX. Az NNT-1 -inhibitorok szkrínelésére szolgáló vizsgálatok

Bizonyos esetekben kívánatos lehet az NNT-1-aktivitás gátlása vagy szintjeinek szignifikáns csökkentése. Az NNT-1-aktivitást gátló vegyületek ex vivő módon alkalmazhatók, vagy in vivő módon helyi vagy intravénás injekcióval vagy orális bejuttatással implantációs készülékkel vagy más hasonlóval. Az alábbiakban leírt vizsgálatok azokra a módszerekre nyújtanak példát, melyek az NNT-1-aktivitást gátolni képes vegyületek azonosítására használhatók.

Az értelmezés könnyítéséhez a következő definíciókat használjuk a jelen találmányban a vizsgálatok leírására.

A „tesztmolekulá(k)” kifejezés olyan molekulá(k)ra utal, mely(ek) az NNT-1 inhibitoraiként szerepel(nek)

HU 225 307 Β1 az értékelésben, tipikusan azon képességük alapján, hogy blokkolják az NNT-1 és receptora közötti kölcsönhatást.

Az NNT-1 receptor izolálható, például expressziós klónozással jelölt (például jódozott) NNT-1-et használva.

Számos in vitro, tisztított proteint használó vizsgálat végezhető el azon vegyületek tesztelésére, melyek rombolják az NNT-1-aktivitást. Az ilyen rombolás elvégezhető olyan vegyülettel, mely tipikusan gátolja az NNT-1 és receptora közötti kölcsönhatást.

Az egyik vizsgálatban tisztított NNT-1 proteint vagy ennek egy fragmentjét (például a fent leírt módszerekkel előállítva) immobilizálhatjuk mikrotiteres lemez üregeinek aljához rögzítve. Radioaktív jelölésű NNT-1 receptor, valamint a tesztmolekulá(k) adható(k) ezután vagy egyesével, vagy azonos időben az üregekhez. Inkubálás után az üregek moshatók, és szcintillációs számlálóval számolható a radioaktivitás a tesztmolekula jelenlétében történő NNT-1/receptor kötődés mértékének meghatározása céljából. Tipikusan a molekula egy sor koncentrációban kerül vizsgálatra, és egy sor kontroll-„üreg, melyekből hiányzik a tesztvizsgálat egy vagy több eleme, használható a pontosság kedvéért az eredmények értékeléséhez. Ezen vizsgálat variációja magában foglalja a receptor üregekhez való kapcsolását és a radioaktív jelölésű NNT-1 tesztmolekulával az üregekhez történő hozzáadását. Inkubálás és mosás után az üregekben megszámolhatjuk a radioaktivitást.

Számos eszköz, ideértve a radioaktív jelölést, áll rendelkezésre az NNT-1 „jelöléséhez”. Például az NNT-1 protein radioaktívan jelölhető 125-1 vagy 35-S segítségével.

Másik lehetőségként az NNT-1 fúziós protein, melyben az NNT-1-et kódoló DNS egy peptidet, például a c-myc epitópot kódoló szekvenciához fuzionálódik. Az NNT-1-myc fúziós protein könnyen detektálható a kereskedelemben beszerezhető és a myc ellen irányuló antitestekkel.

A kötővizsgálatok mikrotiterlemez-típusának alternatívája magában foglalja az NNT-1 vagy receptorának agarózgyöngyökre, akrilgyöngyökre vagy más ilyen típusú inért szubsztrátokra való immobilizálását. Az NNT-1-et vagy receptorát tartalmazó inért szubsztrát a tesztmolekulát tartalmazó oldatba helyezhető a komplementer komponenssel (vagy a receptor vagy az NNT-1 protein) együtt, melyet korábban radioaktív jelöléssel vagy fluoreszcens jelöléssel láttunk el; inkubálás után az inért szubsztrát kicsapatható centrifugálással, és az NNT-1 és a receptor közötti kötődés mértéke a fent leírt módszerekkel határozható meg. Másik lehetőségként az inért szubsztrát komplex immobilizálható egy oszlopon, és a tesztmolekula és a komplementer komponens ereszthető át az oszlopon. Az ΝΝΤ-1/receptor komplex képződése ezután értékelhető a fent megadott technikák bármelyikének felhasználásával, azaz radioaktív jelöléssel, antitestkötődéssel vagy más hasonlóval.

Egy másik típusú, az NNT-1-aktivitást gátló molekula azonosítására használható in vitro vizsgálat a Biacore vizsgálati rendszer (Pharmacia, Piscataway, NJ), mely felszíni plazmon rezonancia detektor rendszert és a gyártók használati útmutatását használja. Ez a vizsgálat lényegében a következőt foglalja magában: az NNT-1-et vagy receptorát kovalensen kötjük egy dextránnal burkolt szenzorcsiphez, melyet egy detektoron helyezünk el. A tesztmolekula és a komplementer komponens ezután injektálható azonos időben vagy egymás után a szenzorcsipet tartalmazó kamrába, és az NNT-1/receptor kötődés mértéke értékelhető a molekulatömeg-változás alapján, mely fizikailag kapcsolódik a szenzorcsip dextránnal borított oldalán; a molekulatömeg-változást mérheti a detektorrendszer.

Bizonyos esetekben kívánatos lehet kettő vagy több tesztmolekula együttes értékelése az NNT-1-aktivitás csökkentésében vagy gátlásában való használathoz. Ilyen esetekben a fent megadott vizsgálatok könnyen módosíthatók további tesztmolekulá(k) az első tesztmolekulához való szimultán vagy egymást követő hozzáadásával. A vizsgálat maradék lépései a fent megadottak szerintiek lehetnek.

X. Transzgenikus emlősök

A jelen találmány körébe tartoznak a nem humán emlősök, mint például az egerek, patkányok, kecskék vagy birkák, melyekben az NNT-1 humán ekvivalensét kódoló gént (vagy géneket) roncsoltuk („kiütöttük) oly módon, hogy ezen gén expressziós szintje szignifikánsan csökkent, vagy teljesen meg is szűnt. Ilyen emlősök előállíthatók olyan technikákkal és módszerekkel, melyek az 5,557,032 számú US szabadalmi bejelentésben kerültek leírásra. A jelen találmány továbbá magában foglal olyan nem humán emlősöket, mint például egereket, patkányokat, nyulakat, kecskéket vagy birkákat, melyekben az NNT-1-et kódoló gént (vagy az emlősökhöz való natív formájú NNT-1, vagy egy heterológ NNT-1 gén) (vagy géneket) az emlősök túlexpresszálják, és egy „transzgenikus” emlős jön létre. Az ilyen transzgenikus emlősök olyan jól ismert módszerekkel állíthatók elő, melyek például az 5,489,743 számú US szabadalmi bejelentésben és az 1994. december 8-án WO94/28122 számú PCT bejelentésben kerültek leírásra.

A következő példákat csak illusztratív céllal adjuk meg, és semmilyen módon nem szándékozunk velük a találmány körét szűkíteni.

Példák

A könyvtár-előállításhoz, DNS-klónozáshoz és proteinexpresszióhoz való standardmódszerek Sambrook et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)] és Ausubel et al. (eds.) munkájában [Current protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY (1995)] kerültek leírásra.

/. példa: A cDNS klónozása és az NNT-1-hez való genom klón

A) A cDNS-könyvtár megszerkesztése

Humán T-sejt limfóma sejteket, Jurkat sejteket szaporítunk 37 °C hőmérsékleten 5% CO₂ alatt 10% mag16

HU 225 307 Β1 zati borjúszérumot tartalmazó RPMI 400 tápközegben. A tápközeget 10 mM HEPES-sel (pH 7,5) puffereljük. Nyolc átoltás után a sejteket két csoportra osztjuk. Az egyik csoportot konfluenciáig szaporítjuk (2*10⁷ sejt/lombik), az RNS-t összegyűjtjük ezekből a sejtekből, melyek az RNS szállítóiként szolgáltak. A másik csoport a „tesztelő”-csoport, és ezeket az alábbiakban bemutatott kezeléssel aktiváljuk.

A sejteket 8 órán keresztül aktiváljuk oly módon, hogy hozzáadjuk a szuperantingens Streptococcus enterotoxin B-t és F-et (TSST) 80 ng/ml; a PCK aktivátort, PMA 50 ng/ml; kalciumionofórt, A21832 125 ng/ml. A cikloheximid protein transzláció gátlót szintén hozzáadjuk 1 mg/ml koncentrációban. Az RNS-t különböző időpontokban gyűjtjük össze a különböző sejtcsoportokból.

1. Teljes RNS előállítás

A sejteket 300*g sebességgel, 5 percig tartó centrifugálással pelletizáljuk és PBS-sel (foszfátpufferelt sóoldat) mossuk, és Ultraspec ll-ben (Biotex, Inc., TX) reszuszpendáljuk 5*10⁶ sejt/ml Ultraspec II koncentrációban. Ezután a sejteket úgy lizáljuk, hogy 21-es méretű injekciós tűn passzáljuk. A homogenizátumot jégen inkubáljuk 15 percig, majd 0,2 térfogat kloroformot adunk hozzá, jól összekeverjük, és újra jégen inkubáljuk további 10 percig, 12 000*g értéken centrifugáljuk 30 percig 30 ml-es korexcsövekben. A posztcentrifugálást és a felülúszót megőrizzük, és a maradékot leöntjük. 0,05 térfogat RNS-kötő gyantát, a Biotex forgalmazza az izolálási kit részeként, adunk hozzá 0,5 térfogat izopropanol hozzáadása után. A gyanta centrifugálással való pelletizálása után (300*g, 5 perc) a gyantát kétszer mossuk 75% Rnáz-mentes etanollal, majd levegőn megszárítjuk 50 °C hőmérsékleten 10 percig. Ezután a teljes RNS-t eluáljuk a gyantáról oly módon, hogy a gyantát 1 térfogat RN-áz-mentes vízben reszuszpendáljuk, erősen összerázzuk 1 percig, majd 13 000*g értéken centrifugáljuk 1 percig. A teljes RNS-t ezután egy új Eppendorf kémcsőbe transzferáljuk, és a gyantapelletet eltávolítjuk.

2. Poli(A)⁺RNS izolálás

Qiagen Oligotex mRNS-izolálási rendszert használunk a gyártók útmutatásának megfelelően. Az eljárást kétszer megismételjük a tiszta Poli(A)⁺ RNS kinyerése céljából. Ez különösen a véletlenszerűen prímelt könyvtár esetében fontos a riboszomális RNS kópiaszámának cDNS-ben való minimalizálása céljából. Az mRNS-integritást ezután határozzuk meg spektroszkópiával és formamid denaturáló gél elektroforézissel.

Az első szálú cDNS-t a BRL cDNS-szintézises eljárás után szintetizáljuk. A cél cDNS-ben levő maradék mRNS eltávolításához az első szál cDNS reakcióelegyet fenol/kloroformmal extraháljuk, és 2 M ammónium-acetáttal és 3 térfogat etanollal kicsapatjuk. A cDNS/mRNS hibrideket reszuszpendáljuk 0,3 M NaOH-ban 2 mM EDTA jelenlétében, és 68 °C hőmérsékleten inkubáljuk 15 percig. A hidrolízises reakciót körülbelül 1,5 M feleslegben levő tiszta Tris-HCI-dal semlegesítjük. A cDNS-t ezután fenol/kloroformmal extraháljuk, és 2 M ammónium-acetáttal és 3 térfogat etanollal kicsapatjuk, 75%-os etanollal mossuk és 7 ml steril vízben reszuszpendáljuk. Az egyszálú cDNS-t a

Boehringer Mannheim farkazó kit eljárását használva farokkal látjuk el.

3. A driver mRNS előállítása és a fotobiotinilálás

A Poli(A) RNS-t a fentiek szerint izoláljuk. Megközelítően 20 mg mennyiséget ezután kétszer fotobiotinilálunk 20 mg fotobiotin-acetátot (Sigma) használva, és mg/ml koncentrációban reszuszcitáljuk RN-áz-mentes vízben. A feleslegben levő fotobiotint vízzel telített izobutanollal eltávolítjuk, majd etanollal kicsapatjuk, és 30 ml DEPC-kezelt vízben reszuszpendáljuk.

4. Szubtraktív hibridizációs reakció

A fotobiotinilált driver mRNS-t koprecipitáljuk a tesztelő cDNS-sel, és 2 ml RN-áz-mentes vízben reszuszpendáljuk. A nukleinsavak oldatba kerülésének lehetővé tétele céljából a készítményt szobahőmérsékleten hagyjuk néhány órán keresztül, majd időközben óvatosan megkeverjük, majd újabb 20 percig inkubáljuk 68 °C hőmérsékleten. A fotobiotinilált drivert mg/ml végső koncentrációjúra oldjuk. Általában legalább 1 mg/ml driver RNS koncentrációt kell használni.

5. Poszthibridizációs hibrideltávolítás

Hibridizáció után streptavidint adunk 0,2 mg/ml végső koncentrációban hozzá és 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A streptavidint ezután eltávolítjuk fenol/kloroformos extrakcióval. Az extrahálás után a cDNS-t etanollal precipitáljuk.

A cDNS amplifikálásához a PCR során egy primer párt: AGCGCTACGGTCGACCCG GCG TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT (ACG)X (15. számú szekvencia) (Sáli T21 rögzített primer) és GGA AGG AAA AAA GCG GCC GCT ACA (16. számú szekvencia) (Notl -N9 primer). A kifizetett PCR-kitet használjuk. Tizenöt ciklust használunk az elegendő mennyiségű anyag előállításához a gélfrakcionálási megközelítéshez, hogy azonos méretű reprezentációt tegyünk lehetővé a könyvtárban. Az első primer anneálásának lehetővé tételéhez az anneálási hőmérséklet a PCR első öt ciklusában 35 °C 1 percen keresztül. A különböző méretű frakciókat képviselő cDNS-t egy gélen frakcionáljuk. Sall-adaptereket adunk a duplex cDNS-hez, melyet ezután Notl-gyel emésztünk és a pSprt vektorba klónozzuk.

B) A cDNS-klón izolálása

A könyvtárat expresszált szekvencia toldalék (est) analízissel szkríneljük. Ebből a könyvtárból az egyedi kiónokat véletlenszerűen emeljük ki és szekvenáljuk egy Applied Biosystems 373 automatizált DNS-szekvenátoron vektor primereket és Taq festék terminációs reakciókat (Applied Biosystems) használva. A véletlenszerűen kiemelt klón ΝΝΤ-1-ből nyert, kapott nukleotidszekvenciát transzlációnak vetjük alá, majd az ismert proteinszekvenciák meglevő adatbázisához hasonlítjuk a FASTA program egy módosított verzióját használva.

Egy klón (khjl-00008-f2) körülbelül 21% homológiát mutat transziáit aminosavszekvencia-szinten a CNTF-fel. A cDNS-klón teljes inzertjét szekvenáljuk, és azt találtuk, hogy egy teljes hosszúságú kiónt kódol,

HU 225 307 Β1 azaz magában foglalja az 5’-végen levő Met-t és egy stopkodont a Met-tól upstream irányban, és egy másik stopkodont a 3’-végen.

Ezen teljes hosszúságú cDNS szekvenciáját az

I. ábrán mutatjuk be. A protein előre megjósolt aminosavszekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk be. A feltételezett jelpeptid a -27 (Met) aminosavtól a -1 (Alá) aminosavig terjed.

C) A genom klón izolálása

Az NNT-1 genom DNS-ét egy humán genom P1 könyvtárból (Genome Systems Ins., St. Louis, MO; P1-2535 katalógusszám) nyerjük. A könyvtárat próbaként az NNT-1 cDNS-t használva szkríneljük. A cDNS-t radioaktív jelöléssel látjuk el Amersham Rediprime kitet (Amersham, Arlington Heights, IL; RPN-1633 katalógusszám) használva, a hibridizációs és a prehibridizációs oldat a következő: 50% formamid, 5*SSC, 5xDenhardt-féle 0,05%-os nátrium-pirofoszfát, 0,1% SDS és 100 mg/ml lazacsperma-DNS. A prehibridizáció körülbelül 1 órán át tart, és a hibridizáció körülbelül 16 órán keresztül 42 °C hőmérsékleten.

Hibridizáció után a szűrőket 0,2xSSC és 0,1% SDS elegyében mossuk 42 °C hőmérsékleten körülbelül 30 percen keresztül. Két pozitív kiónt azonosítunk, és az ezeket a kiónokat tartalmazó plazmidokat a Genom Systems Inc. eljárásainak megfelelően tisztítjuk. A plazmid DNS-t ezután közvetlenül szekvenáljuk.

Az NNT-1-et kódoló genomszekvenciát a 2. ábrán mutatjuk be (3. számú szekvencia). A gén 3 exont és 2 intront tartalmaz. A kódolórégiókat nagybetűvel, a nem kódoló régiókat, ideértve az 5’ nem transziáit régiót, az intronokat és a 3’ nem transziáit régiót kisbetűvel jelöljük.

II. példa: Az NNT-1 rekombináns emlős proteinjének előállítása

Egy humán NNT-1 cDNS-t és zászló-toldalék pepiidet tartalmazó expressziós vektort szerkesztünk meg a fúziós gén PCR-amplifikációjával. Egy szensz prímért, az 5’-végen levő Hindlll hellyel (5’-AGCAAGCTTCACCATGGACCTCCGAGCAGGGGACTC-3’) (6. számú szekvencia), mely a -27 (Met) aminosavtól a -21 (Asp) aminosavig kódol, és egy antiszensz prímért, Notl hellyel az 5’-végen, mely a zászló-toldalék peptidet kódolja, és a 3’-vég utolsó 8 aminosavát:

(5’ AGCGGGGCCGCACTACTTGRCATCGTCGRCGTCCTTGTACTCGA AGCCATGAGCCCCCAGGTGCAG 3') (7. számú szekvencia) használjuk a PCR során a fúziós gén amplifikálása céljából. A fúziós gént a P CEP4 vektorba (Invitrogen Inc., San Diego, CA) ligáljuk. Az expressziós vektort EBNA-1 293 sejtekbe transzfektáljuk lipofekcióval (BRL, Gaithersburg, MD) a gyártók útmutatásának megfelelő módszert használva. A transzfekció után 48 órával a 293 sejteket és a kondicionált tápközeget is összegyűjtjük, és Western-lenyomat-technikával analizáljuk az anti-zászló-toldalék antitesteket (Eastman Kodak Co., New Haven CT) használva. A rekombináns proteinek többségét a 293 sejtek lizátumában találjuk.

Ezért az antizászló-antitest gélt (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) használjuk a protein 293 sejtekből való kitisztítására. Egy 28-30 kd-ú proteint tisztítunk a gyártók útmutatását követve. Ezt a rekombináns proteint használjuk a biológiai funkcióvizsgálatban (a motoros neuron és szimpatikus neuron túlélési vizsgálathoz). A protein N-terminális aminosavát Leu-nak (1. számú aminosav) határoztuk meg, jelezve, hogy a potenciális jelpeptidet lehasítottuk (-27 aminosavtól -1 aminosavig).

III. példa: A rekombináns E. coli NNT-1 protein előállítása

A 2. számú szekvencia Leu (1)—Phe (198) aminosavait kódoló NNT-1 cDNS kiónját a pAMG21 vektorba inzertáljuk, mely a pCFM 1656 (ATCC 69576) egy származéka, és megfelelő restrikciós helyeket tartalmaz a gének inzertálásához a lux promotertől downstream irányban (lásd az 5,169,318 számú US szabadalmi alkalmazást, a lux expressziós rendszer leírása céljából). A használt gazdasejt az E. coli K12 CGSC 6159 törzse (Yale University genetikai törzsgyűjtemény, New Haven, CT). A gazdasejteket a vektorral transzformáljuk standard transzformációs eljárásokat használva, majd körülbelül 50 μΙ/ml kanamicint tartalmazó 2 XYT tápközegben inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. Az NNT-1 géntermék indukcióját úgy kezdjük, hogy hozzáadjuk a tápközeghez az autoindukáló N-(3-oxo-hexanoil)-DL-homoszerin laktont körülbelül 30 ng/ml végső koncentrációban, majd a tenyészetet vagy 30, vagy 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk körülbelül 6 órán keresztül, ezután a sejteket mikroszkopikusan megvizsgáljuk az inklúzlós testekre.

Az NNT-1 protein többsége az inklúziós testekben található. Ezért sejtmasszát készítünk a sejtek pelletizálásával. Az inklúziós testeket alacsony pH-értéken oldhatóvá tesszük, és a proteint ezt követően kicsapatással tisztítjuk. A proteint dializáljuk, mielőtt a mintát SDS-PAGE-ra helyeznénk a tisztítás biztosítása céljából. A gél comassie-val való festése azt jelzi, hogy a protein legalább 95%-ban tiszta.

IV. példa: Az NNT-1 neurobiológiai funkciója A) Csirke motoros neuron vizsgálat

A lumbáris gerincvelőből származó motoros neuronban (MN) gazdag tenyészetet készítünk embrionális napi E5.5 csirkékből. Az MN neuronokat 6,8% metrizamid gradienssel dúsítjuk. Röviden, a lumbáris gerincvelőket boncoljuk, a meningestől és DRG-től megtisztítjuk. A gerincvelőt L15 tápközeget (Gibco/BRL, Grand Island, NY) papainban inkubáljuk 20 percig 37 °C hőmérsékleten (Worthington Biochemical Corp, Freehold, NJ). Az enzimatikusan meglágyított gerincvelőfragmenteket egyedüli sejtekké disszociáljuk pipettázással. A sejtszuszpenziót 6,8% metrazamid- (Serva, Feinbiolchemicala, Germany) betétre rétegezzük, és a kémcsövet 500 g értéken 20 percig centrifugáljuk. A metrizamid és a sejtszuszpenzió közötti határfelületet összegyűjtjük és tenyésztápközegben hígítjuk. A frakciót ezután óvatosan egy 4%-os BSA-betétre rétegezzük és 280 g értéken

HU 225 307 Β1 centrifugáljuk 10 percig. A pelletet 10% magzati borjúszérummal kiegészített, 3,6 mg/ml glükózt, 5 ng/ml nátrium-szelenitet, 6,25 ng/ml progeszteront, 0,1 mg/ml conalbumint, 16 mg/ml putreszcint és 5 mg/ml inzulint tartalmazó L15 tápközeget tartalmazó tenyésztápközegben reszuszpendáljuk. 10 000 sejt/üreg mennyiségben 96 üregű szövettenyésztő lemezekre oltjuk. A neurotróf faktor (NNT-1 vagy CNTF) sorozatos hígításait adjuk a tenyészethez és 3 napig inkubáljuk. A 3. napon MTT-t adunk a tenyészetekhez 4,5 óra időtartamra. A formazánterméket oldhatóvá tesszük, és a lemezeket 570 nm hullámhosszon a látható interferenciához 650 nm-es szubtrakcióval leolvassuk. Az optikai denzitás (OD) leolvasási érték arányos a tenyészetben életben maradt neuronok számával. Az 570 nm-es abszorbanciaértékeket (növekvő neuron életben maradás) a háromszoros ismétlésű üregekben az NNT-1 vagy CNTF végső koncentrációinak függvényében ábrázoljuk.

Az analízis eredményeit a 7. ábrán mutatjuk be. Az 570 nm-en mért abszorbanciát az aktuális leolvasás 1000-szereseként fejezzük ki. Az eredmények azt mutatják, hogy az NNT-1 képes elősegíteni a csirke motoros neuronok szaporodását. Maximális aktivitást körülbelül 90%-os CNTF-értéknél ér el.

B) Csirke szimpatikus neuron vizsgálat

Primer csirke embrió szimpatikus lánc ganglion tenyészetet állítunk elő. Röviden, szimpatikus ganglionokat távolítunk el termékeny, patogénmentes csirketojásokból, melyeket 9 napig inkubáltunk 37,6 °C hőmérsékleten párásított légkörben. A ganglionokat kémiailag disszociáltatjuk először 10 mM HEPES-puffert (pH 7,2) tartalmazó divalens kationok nélküli Hank-féle egyensúlyi sóoldatban 37 °C hőmérsékleten 10 percig, majd a fentiek szerint módosított Hank-féle egyensúlyi sóoldatban levő 0,125% bactotripszin 1:250-ben (Difco, Detroit, Michigan) 12 percig, 37 °C hőmérsékleten. A tripszinizációt úgy állítjuk le, hogy magzati borjúszérumot adunk hozzá 10% végső koncentrációban.

Ez után a kezelés után a ganglionokat Dulbecco-féle nagy glükóztartalmú bikarbonátos, 10% magzati borjúszérumot és 10 mM HEPES-t (pH 7,2) tartalmazó módosított Eagle-féle tápközeget tartalmazó oldatba transzferáljuk, és mechanikailag disszociáltatjuk titurálással körülbelül 14-szer egy 20-as méretű, T’-os kettős súlypontozott rozsdamentes acél tűvel.

A disszociált ganglionokat ezután tenyésztápközegbe (Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközeg 10% magzati borjúszérummal, 4 mM glutaminnal, 60 mg/L penicillin-G-vel, 25 mM HEPES-sel kiegészített, pH 7,2) helyezzük 100 mm átmérőjű szövettenyésztő lemezeken (körülbelül 40 disszociált ganglion/lemez mennyiségben) két-három órára. Ezt az előszélesztést azért végezzük el, hogy az edényhez tapadó nem idegsejteket elválasszuk az edényhez nem tapadó idegsejtektől. Előszélesztés után a nem adherens idegsejteket összegyűjtjük centrifugálással, majd tenyésztápközegben reszuszpendáljuk és 50 ml/üreg mennyiségben szélesztjük a 96 üregű mikrotiter szövettenyésztő lemezek fél területére 2500 idegsejt/üreg denzitásban. A mikrotiterüregeket korábban 10 mM nátrium-borátban levő 1 mg/ml poli-L-ornitinnek (pH

8,4) tettük ki egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten, majd steril tisztított vízzel mostuk és levegőn megszárítottuk.

A neurotróf faktorok, melyeknek a sejteket kitesszük, végső koncentrációi a következők: 1. a CNTF standardhez, kilencpontos sorozatos hígítási görbék 100 ng/ml-6 pg/ml-ig terjed; 2. az NNT-1 proteinhez, kilencpontos sorozatos hígítási görbék 100 ng/ml-0,12 pg/ml-ig terjed. A neurotróf aktivitásra vizsgálandó minta sorozatos hígításának 25 ml mennyiségét adjuk minden egyes üreghez, és az edényeket 38-46 órán keresztül inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten nedvesített atmoszférában 7,5% CO2-tartalom mellett. Ezután 18 ml/üreg 1,5 mg/ml tetrazólium festék MTT oldatot (Dulbecco-féle magas glükóztartalmú, bikarbonáttal és 10 mM HEPES-sel kiegészített, pH 7,2 módosított Eagle-féle tápközegben) adunk hozzá, és a tenyészeteket 37 °C hőmérsékletű inkubátorba helyezzük 4,5 órára. Ezután 20% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 50% N,N-dimetil-formamid-oldat 75 ml mennyiségét (pH 4,7) adjuk hozzá a kristályos formazántermék feloldása céljából, és a lemezeket 37 °C hőmérsékletű inkubátorba helyezzük minimum 12 órára. Az 579 nm hullámhosszon mért abszorbanciát egy 650 nm-es referenciához viszonyítva határozzuk meg az egyes üregek esetében automata mikrotiterlemez-leolvasó segítségével. A kapott abszorbancia arányos az egyes üregekben levő élő sejtek számával, melyeket úgy határozunk meg, mint a festéket redukálni képes idegsejteket.

Az analízis eredményeit a 8. ábrán mutatjuk be. Az eredmények azt jelzik, hogy az NNT-1 elősegíti a csirke szimpatikus neuronok szaporodását.

V. példa: A szöveteloszlás

Norther-lenyomat-vizsgálata

A humán szövetek Northern-lenyomatait a Clontechtől (Palo Alto, CA) vásároljuk. A Northern-lenyomatokat egy humán NNT-1 cDNS próbával próbáljuk. Az NNT-1 5' és 3’ kódolórégióját átfogó két cDNS-fragmentet jelöléssel látjuk el, és próbaként használjuk az NNT-1 gén szövetexpressziójának analizálásához. Az eredmények azt mutatják, hogy az NNT-1 egy 2,2 kb hosszúságú transzkriptként expresszálódik a lép szöveteiben, a nyirokcsomóban és a perifériás vér limfocitákban, a csontvelőben és magzati májban, vesében, tüdőben és a colorectalis adenocarcinoma SW480 sejtekben, a Hela S3 sejtekben, a tüdőkarcinóma A 549ben, a krónikus csontvelői leukémia K-562 sejtekben, a Burkitt-féle limfóma Raji sejtekben. A gén szöveti eloszlása azt sugallja, hogy a gén részt vehet az immunrendszer fejlődésében is vagy a hematopoietikus sejtekében.

VI. példa: Az NNT-1 gén kromoszóma lokalizációja

A gén kromoszóma lokalizációját FISH-sel végezzük el. Egy 14 kb hosszúságú genomfragmentet biotinilálunk dATP-vel BRL BioNick jelölőkitet használva (15 C 1 óra). A FISH eljárást Heng et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9509-9513, 1992) szerint hajtjuk

HU 225 307 Β1 végre. Az eredmények azt mutatják, hogy a gén a 11 q13 kromoszómán helyezkedik el, mely a humán CNTF gén lokuszhoz közel helyezkedik el (11 q12 kromoszóma).

VII. példa: Az egér cDNS-klón izolálása

Egy egér részleges cDNS-klónt izolálunk PCRamplifikációval az egér 11 napos embrió cDNS-ből (Clontech, Palo Alto, CA) humán specifikus prímért használva. A teljes hosszúságú cDNS-klónt továbbá az 5’ RACE és 3’ RACE segítségével nyerjük. Az egér cDNS nukleotidszekvencia és az aminosavszekvencia sorrendben a 4. és 5. ábrán kerül bemutatásra. Az egérprotein 96%-os azonosságot mutat a humán proteinnel, ami azt jelzi, hogy a protein erősen konzervált az evolúció során. A humán proteinhez hasonlóan az egérprotein is tartalmaz egy potenciális N-kötésű glikolizációs helyet a 2. aminosavnál (Asn).

Vili. példa: Az NNT-1 összehasonlítása a család más tagjaival

Az NNT-1 aminosavszekvenciája azt sugallja, hogy a protein a CNTF (12. számú szekvencia) családba tartozik, mely magában foglalja az IL-11-et (8. számú szekvencia), az IL-6-ot (9. számú szekvencia), a kardiotrofint (11. számú szekvencia), az onkosztatint (13. számú szekvencia) és a granulocita telep stimuláló faktort (G-CSF) (10. számú szekvencia). Az NNT-1 aminosavszekvenciáját a PILEUP számítógépes program segítségével hasonlítjuk a család tagjainak összes tagja aminosavszekvenciájához, és az eredményeket a 6. ábrán mutatjuk be. Mint a család minden más tagja esetében, az NNT-1 protein szekunder szerkezete is tartalmazza becslések szerint a négy antiparalell alfa hélixeket.

IX. példa: Az NNT-1 transzgenikus egerek fenotlpusa

A) Az NNT-1 transzgenikus egerek fenotlpusa

Az NNT-1 gén által kódolt protein némi homológiát mutat a CNTF-fel, és in vitro aktivitást mutat a csontvelő- és idegsejtvizsgálatokban. Az NNT-1-transzfektált csontvelővel transzplantált egerek vizsgálata enyhe limfoproliferációt mutat a gasztrointesztinális csatornával kapcsolatos limfoid szövetben, de más nyilvánvaló fenotípusos változás nincs.

Anyagok és módszerek

Faj: Egér Törzs; BDF1 Kor: 17 hetes (120 napos)

Tesztanyag: NNT-1 (WX240) Nem: hím/nőstény

Kezelési csoportok

Csoport	Egerek száma
Negatív	22, 23, 45, 63, 65
Pozitív	35, 36, 46, 60, 62

Nem detektálható nyilvánvaló abnormalitás a két csoportban.

Teljes necropsiát végzünk a puffereit cink-formalinban fixált kiválasztott szövetekkel a hisztopatológiai vizsgálathoz (agy, szív, vesék, mellékvesék, duodenum, hasnyálmirigy, húgyhólyag, máj, tüdők, lép és bármilyen teljes léziók). A szöveteket egy éjszakán át fixáljuk a rutin hisztológlai eljárás előtt. Az adatokat JMP (SAS Institute, Cary NC) szoftverprogramot használva analizáljuk.

Tesztek: szervtömeg, testtömeg, hisztopatológia, immunológia, Northern-lenyomat.

Az NNT-1 transzgenikus egerekben a következő kezeléssel kapcsolatos változások vannak jelen.

A lépben mérsékelt-erős reaktív limfoid hiperplasia (10. ábra) mutatkozik, beleértve a follikuláris (B-sejt) és periarterioláris (T-sejt) területeket. A limfoid hiperplasia legszembetűnőbb az erősen expresszáló 62-es számú egérben volt (10. ábra), és jól korrelált a necropsiában tapasztalt splenomegaliával. A másik erősen expresszáló, 60-as számú egérben a limfoid területek csupán enyhe hiperplasiája jelentkezett, melyet mind a három vonal erős diffúz extramedulláris hematopoiesise kísért. Bár nehéz bármilyen általános következtetést levonni az NNT-1 lépre kifejtett hatására vonatkozóan ezen két erősen expresszáló egér alapján, a 62-es számú egérben tapasztalt limfoproliferáció egyezik saját tapasztalatainkkal az injektált proteinnel kapcsolatban (lásd a X. példát az alábbiakban), míg a 60-as egérben talált EMH in vivő korrelációt tükröz a korábbi in vitro csontvelőkultúra esetén tapasztaltakkal.

A 60-as számú egér májában multifokális limfocita aggregátumok voltak, és a perivasculáris résekbe infiltrálódó és a szomszédos sinusoidokba egy sajátos minta szerint benyúló plazmasejtek, melyek az intrahepatikus „limfopoiesis szigeteire” emlékeztetnek (12. ábra). Az immunohisztokémia alapján a limfoid aggregátumok B220+ sejtekből és CD3+ sejtekből állnak. Hasonló, de enyhébb és tipikusan perivasculáris limfoid infiltrátumokat találtunk a 62-es számú egérben is. A májban talált egyéb változások szórványosan fordulnak elő az egyes egerekben a kontroll- és/vagy a transzgenikus csoportokban.

A gasztrointesztinális csatorna a Peyer-féle foltok minimális-mérsékelt reaktív limfoid hiperplasiájával (béllel kapcsolatos limfoid szövet) rendelkezik. Hasonlóképpen a cervikális és mesenterikus nyirokcsomók sokkal reakcióképesebbek a transzgenikus egerekben, mint a kontrollállatokban, bár ez a változás nem volt olyan kiemelkedő jellemzője ennek a vizsgálatnak, mint az injektált NNT-1 proteinnel végzett vizsgálatunkban (lásd a X. példát lent).

A transzgenikus egerek csontvelője és központi és perifériás idegrendszere normálisnak tűnik. Általában az egyéb szövetekben bekövetkező változást szórványosan találtunk egy vagy több állatban a negatív kontroliban és/vagy a transzgenikus csoportban, és úgy értelmeztük, hogy nem transzgénnel kapcsolatos változást jelentenek.

Az ezen vizsgálatból származó adatok azt jelzik, hogy az NNT-1 transzgenikus egerek érdekes fenotípussal rendelkeznek, melyet a T- és B-limfociták és

HU 225 307 Β1 plazmasejtek proliferációja jellemez a többszörös perifériás szövetekben, ideértve a lépet, a nyirokcsomókat, a béllel kapcsolatos nyirokszövetet, a veséket és a májat. Az NNT-1 magában foglalhat extramedulláris hematopoiesist néhány perifériás szövetben, mint például a lépben és a hasnyálmirigyben, szignifikáns változások hiányában a perifériás vérben és csontvelőben. így az NNT-1 transzgenikus egerekből származó adatok általában az injektálható NNT-1 proteinnel végzett 7 napos egérvizsgálat során nyert eredményeinket támasztják alá, melyek magukban foglalják a nyirokszövet proliferációját a csontvelőre vagy központi idegrendszerre kifejtett detektálható hatás nélkül.

Érdekes módon a két erősen expresszáló NNT-1 transzgenikus nőstény egérben detektált glomerulonephritis erősen emlékeztet az MRL/Ipr (Fas-hiányos) egerekben tapasztalt spontán giomerulonephritisre, mely a poliklonális B-sejt-aktiválással kapcsolatos korai kialakulású SLE-szerű autoimmun szindrómát, többszörös autoantitesteket, keringő immunkomplexeket és a kettős negatív (CD4- CD8TCRab+ CD3+) T-sejtek szokatlan populációjának akkumulációját alakítja ki, melyek szintén a B220+-nak nevezett CD45R izoformát expresszálják, mely normálisan a B-sejtek markere (Singer et al., Curr. Opin. Immunoi., 6:913-920, 1994). Ezenkívül az NNT-1 néhány biológiai hatása az interleukin-6 hatását utánozza, mely (mint a CNTF, LIF és IL-11) a gp130 jelölő transzdukálót használja és pleiotropikus hatással van a májra, vesére, agyra, bőrre, immun- és hematopoietikus rendszerrel (Ryffel et al., Int. Rév. Exp. pathol., 34A:79-89, 1993). Ezért fontos meghatározni áramlásos citometriás analízissel, hogy a perifériás vérben vagy szövetben talált limfociták szokatlan fenotípussal rendelkeznek-e a T- és B-sejt-markerek kettős expressziójával.

B) Az NNT-1 transzgenikus alapítók FACS immunofenotipizálása

Az analizált szövetek

Perifériás vérmintákat nyerünk retroorbitális vérzésekből. Az alapító alomtárs kontroll- és ΝΝΤ-1-pozitív (PCR-rel) egerek egyes csoportjaiból kilenc mintát veszünk; egyik sem alvadt meg. Mintánként megközelítően 20-40 μΙ vért inkubálunk először Fc blokk antitesttel, majd a különböző sejtfelszíni antigénekhez való fluoreszcens antitestekkel.

Az antitesteket a markerekhez választjuk a keringő perifériás vérben levő leginkább hematopoietikus sejtpopulációk megkülönböztetéséhez. Néhány B- és T-sejt aktiválási/differenciálódási markert is kiválasztunk a könyvtár eredetét véve alapul ehhez az expresszált szekvencia toldalékhoz (est). A könyvtárat toxikus sokk szindróma toxinnal (TSST) aktivált Jurkat sejtekből (egy T-sejtvonal) hozzuk létre.

Antitestek

A nemspecifikus kötés gátlásához az előinkubáció részeként Fc blokkot, összesen 21 antitestet használunk. Az adatokat egyenként színes hisztogramokként értékeljük.

Patkány IgG fluoreszcein izotiocianát (FITC)+patkány

IgG fikoetirén (PE)

Ham IgG FITC+Ham IgG PE

CD45 FITC+GR-1 (CD97) PE----Pan leukocita vs granulocita

CD4 FITC+CD8 PE----T-sejt-alsorozatok Helper vs killer

Th1.2 FITC+B220 PE----T-sejt vs pan B-sejt-marker

CD69 FITC+CD28 PE----T&B vagy csak T-sejthez való aktiválási markerek

CD3 FITC+CTLA4 PE----Pan T-sejt vs T-sejt-aktiválás ckit FITC+Sca-1 PE----mieloid és őssejtek vs őssejtek és perifériás limfociták

CD40 FITC+CD40L PE----B-sejt-diff. Ag vs

T-sejt-ligandum ugyanehhez

CD62L FITC+CD54 PE----Aktiváló adhéziós molekulák a B- és T-sejteken CD34 FITC (az eredményeket nem analizáltuk)

Eredmények

Kifejezett növekedést figyeltünk meg az abszolút sejtszámban az NNT-1-pozitív állatok közül négyben, a B220+, a CD40+, a CD62L+ és a CD54+ sejtek esetében. Ezekkel az állatokkal kapcsolatban (# 24, 35, 60, 62) később Northern-lenyomattal megerősítettük, hogy expresszálók. A B220+ és CD40+ sejtek növekedése 2-4-szeres a kontrollokhoz képest. A CD62L+ (LECAM) és CD54+ (ICÁM) sejteké 1,5-3-szoros a kontrollcsoporthoz képest. A négy expresszálóból három növekedést mutató marker magában foglalta az Sca-1-et (2-6-szoros kontroll) és a ckitet (2-3-szoros kontroll). A további, a CD3, a CD4, a CD8, a Thy1,2-et magukban foglaló markerek mérsékelt növekedést mutatnak a négy expresszáló közül kettőben, bár nem következetes módon (bár ezek mind T-sejt-markerek, ezek közül nem mind pozitív ugyanazokban az expresszálókban). A GR1 növekedést mutat az expresszálók egyikében, azonban még nagyobb GR1+ sejtszám volt az egyik kontrollállatban, így ez feltehetően nem szignifikáns adat. A többi antitest nem volt sem pozitív, sem szignifikánsan eltérő, vagy a CD34 esetében nem lehetett értékelni.

Összefoglalás

Egy nagyon pontosan körülírt növekedést figyeltünk meg a keringő limfoid sejtek abszolút számában ezekben az egerekben. Ez a növekedés a limfoid populációkban, úgy tűnik, elsősorban a B-sejtekből áll, bár a T-sejtek számában is megfigyelhettünk némi növekedést. Egyik limfoid populáció sem mutatott aktivált sejttípusú növekedést. A keringő mieloid sejtpopulációra kicsi vagy semmilyen hatást nem fejt ki. A Ckit és Sca-1-ben bekövetkezett növekedés nem szükségszerűen korrelál az őssejtek számában bekövetkezett növekedéssel, mivel ezek a markerek megtalálhatók az érett keringősejteken is.

Az adatok azt sugallják, hogy ezen sejtek számának B-sejt által irányított proliferációja mind jól korrelál

HU 225 307 Β1 az expresszióval. Ezen állatok T-sejtjei közül néhányban a növekedés feltételezhetően néhány egyéb, a megnövekedett B-sejtek által termelt faktor másodlagos hatása. Egy érdekes megfigyelés a B-sejtekkel kapcsolatban mutatkozó enyhe, de nagyon következetes eltérés a B220+ sejtek és a CD40+ sejtek száma között. Bár ezek mindegyike B-sejt-marker, a CD40-et megtalálták a dendrites sejteken is.

X. példa: Az ΝΝΤ-1-gyel injektált egerekben mutatkozó limfoid hiperplasia

A) Egy 7 napos feltáró intravénás/szubkután vizsgálat az ΝΝΤ-1-gyel kezelt BDF1 nőstény egerek esetében

Az NNT-1 által kódolt protein némi homológiát mutat a CNTF-fel, és in vitro aktivitást mutat a csontvelőés idegsejtvizsgálatokban. Ezen vizsgálat célja az volt, hogy meghatározzuk az NNT-1 szisztémás hatásait és potenciális toxicitását, a napi alkalmazás következményeként, egerekben 7 napos vizsgálat alatt.

Anyagok és módszerek

Húsz 6 hetes, nőstény BDF1 egeret használunk a vizsgálathoz. Az egereket véletlenszerűen tesszük a következő kezelési csoportokba (n=5/csoport):

1. PBS-puffer-kontroll (intravénás dózis naponta egyszer 7 napon keresztül)

2. NNT-1 1,5 mg/kg dózisban (intravénásán)

3. NNT-1 0,15 mg/kg dózisban (intravénásán)

4. NNT-1 1,5 mg/kg dózisban (szubkután)

Az egereket a teljes necropsia előtt éheztetjük. A necropsia előtt egy órával (24 órával az utolsó dózis után) az egerek intraperitoneális BrdU injekciót kapnak (50 mg/kg dózisban a sejtproliferációs vizsgálatokhoz). Szívfelszúrással vért veszünk a hematológiai (hemoglobin, hematokit, vörösvértestszám, vérlemezkeszám, átlagos vérlemezke-térfogat, teljes és differenciált leukocitaszámok) és a klinikai kémiai paraméterek (alanin, amino-transzferáz, aszpartát-amino-transzferáz, alkalikus foszfatáz, laktát-dehidrogenáz, glükóz, karbamidnitrogén, kreatinin, teljes protein, albumin, globulin, kalcium, foszfor, teljes bilirubin, karbamidsav, koleszterin és trigliceridek) meghatározásához.

A teljes necropsiát kiválasztott szövetekkel végezzük el puffereit cink-formalinban a hisztopatológiai vizsgálatok elvégzéséhez {mellékvesék, csontvelő, csont [combcsont (femur)], agy, vakbél (cecum), proximális és disztális vastagbél, patkóbél (duodenum), nyelőcső (esophagus), szív, csipőbél (ileum), éhbél (jejunum), vesék, máj, tüdők, emlőmirigyek, petefészek, hasnyálmirigy, vázizomzat, bőr, lép, gyomor, csecsemőmirigy, pajzsmirigy, légcső, húgyhólyag, méh, hüvely, fehér és barna raktározószövet és teljes léziók}. A szöveteket egy éjszakán át fixáljuk a rutin hisztológiai eljárások előtt. A szervtömegeket mérjük a lép, máj, gyomor, vesék és a csecsemőmirigy esetében.

Eredmények

Lép: Szembetűnő limfoid hiperplasia mutatkozott a lép fehér pulpájában a periarterioláris limfoid hüvelyek (T-sejt-területek) megnagyobbodásával az NNT-1-gyei kezelt csoportokban. Azonban az extramedulláris hematopoiesis nem fokozódott nyilvánvalóan ezekben a csoportokban, ami azt sugallja, hogy ez a protein stimuláló vagy növekedési faktorhoz hasonló hatással rendelkezhet a limfociták esetében a hematopoietikus sejtek helyett in vivő.

Nyirokcsomók: Az NNT-1-gyei kezelt egerek enyhe-erős reaktív limfoid hiperplasiát mutatnak a nyirokcsomó cortex folliculáris (B-sejt) és paracorticalis (T-sejt) területein. Bár ezek a változások korai immunválaszt tükrözhetnek a rekombináns proteinnel szemben, a lépben, nyirokcsomókban, Peyer-féle foltokban és csontvelőben jelen levő általánosított reaktív limfoid hiperplasia mértéke azt sugallja, hogy ez egy specifikus kezeléssel kapcsolatos NNT-1-hatás lehet.

Összefoglalás és következtetések

Az ebből a vizsgálatból származó legjelentősebb eredmény az volt, hogy az egerek NNT-1-gyei 7 napig tartó kezelése, úgy tűnik, a limfoid szövetek proliferációját indukálja, különösen a lépben és a nyirokcsomókban levő szövetekét. Azonban ez a protein nem mutat semmilyen detektálható hatást a hematopoietikus vagy központi idegrendszerre a vizsgálat körülmények között.

B) Az NNT-1-gyei injektált egerek FACS-analízise

Reagensek és egerek: Rekombináns humán ΝΝΤ-1-et és rhlL-1-et használunk az Amgen Inc.-től (Thousand Oaks, CA). LPS-t (Escherichia coli 0111:B4) vásárolunk a LIST Biologic Laboratoriestól (Campbell CA). Körülbelül 20 g-os nőstény Balb/c egereket vásárolunk a Charles River Laboratoriestól (Wilmington, MA). Az egereket szobákban tároljuk állandó hőmérsékleten és páratartalom mellett, és 12 órás fény/sötét ciklust biztosítunk számukra. Az egerek standard laboratóriumi táplálékot és vizet kapnak ad libitum. Az állatokat is magában foglaló eljárásokat, gondozásukat az intézményes irányelvekkel összhangban végezzük, mely irányelvek megfelelnek a nemzeti és nemzetközi előírásoknak és irányelveknek (U. S. National Research Council., Guide fór the Care and Use of Laboratory Animals, 1996).

Nyirokcsomótömeg és sejtszámok: Hét egymást követő napon az egerek naponta 5 mg/kg NNT-1 vagy puffer ip. injekciót kapnak. A hetedik injekció után 24 órával az egereket elpusztítjuk a perifériás (cervikális és axilláris) nyirokcsomók összegyűjtése céljából. A nyirokcsomókat összegyűjtjük, tömegüket megmérjük, és homogenizáljuk egy sejtszuszpenzió nyerése céljából. Ezután a patkány antiegér anti-CD45R-t (anti-B220) Mab-t (Pharmingen, San Diego, CA) felhasználásával direkt IF-fel megfestett sejteket egy Sismex sejtszámlálón (Toa Medical Corporation, Köbe, Japan) megszámoljuk, és FACSCAN-ben analizáljuk a Cell Quest szoftvert (Becton and Dickinson, San Jose, CA) használva.

Statisztikai analízis: Az eredményeket átlag ±SD-ként adjuk meg. TNF-értékeket log-transzformáljuk a kitérő eloszlások minimalizálása céljából és

HU 225 307 Β1 normalizálásuk céljából. A Shapiro-Wilks-tesztet használjuk eloszlásaik normalitásának analizálásához a transzformációk előtt és után. A csoportok közötti különbségeket Student-teszttel analizáljuk. Miután a BW-t ismételten megmérjük az egyes egyedeknél, a BW-ben mutatkozó különbségeket egy csoporton belül és csoportok között varianciaanalízissel (ANOVA) teszteljük az ismételt méréseknél.

Nyirokcsomótömeg és sejtszámok: Az NNT-1 -kezelés megnöveli a teljes és a CD45-pozitív sejtek számát a perifériás nyirokcsomókban (17. ábra).

XI. példa: Az NNT-1 olyan in vivő aktivitásokat mutat, melyek az IL-6 család citokinjeire jellemző

A reagensek, egerek és statisztikai analízis a fenti X. példában leírtak szerintiek.

Szérum amiloid A (SAA) indukció, a kortikoszteron potenciálása és IL-6 indukció IL-1-gyel és az LPS indukálta TNF gátlása: NNT-1-et adunk 5 mg/kg dózisban ip. magában vagy IL—1-gyel (100 ng/egér) vagy LPS-sel (100 ng/egér). A kontrollegerek az NNT-1 oldószerét kapják (10 mM acetát sóoldatban). Vért veszünk a retroorbitális plexusból 8 órával az NNT-1 vagy sóoldat alkalmazása után SAA-meghatározás céljából, 2 órával az alkalmazás után a kortikoszteron és IL-6 és 1,5 órával az alkalmazás után a TNF meghatározásához. A kísérleteket 5 vagy 10 egeret tartalmazó csoportokon végezzük.

Az SAA-t, IL—6-ot és TNF-et a szérumban ELISA-módszerrel mérjük a kereskedelemben beszerezhető kitet (Biogen, Camarillo, CA) használva; az eredményeket sorrendben pg, ng és pg/ml értékben fejezzük ki. A kortikoszteront RIA-val mérjük egy, a kereskedelemben beszerezhető kitet (ICB Biomedical, Costa Mesa, CA) használva; az eredményeket ng/ml értékben fejezzük ki.

SAA-indukció, a kortikoszteron potenciálása és IL-6-indukcló IL-1-gyel és az LPS indukálta TNF gátlása: Az NNT-1 indukálja a keringő SAA-t (13. ábra).

Az NNT-1 potenciálja a szérum kortikoszteron vagy IL-6 indukcióját alacsony dózisú IL—1 mellett (14.

és 15. ábra). Az NNT-1 képes növelni a kortikoszteron keringő szintjeit is, ha magában injektálják.

Az NNT-1 gátolta a szérum TNF LPS általi indukcióját (16. ábra).

összefoglalás és eredmények

A gyulladásos folyamatokat a TNF termelése kíséri, ez egy olyan citokin, mely nagyban hozzájárul a szövetkárosodáshoz és a funkcionális zavarokhoz, melyek megkülönböztetik a gyulladással kapcsolatos patológiát. Gyakran az IL—1 a TNF-fel együtt termelődik, és erről szintén úgy vélik, hogy a gyulladások során patogenetikus mediátorként szerepel. A kortikoszteroidok széles spektrumú és nagyon erőteljes gyulladásgátló anyagok, melyeket az IL—1 egy hatékony negatív feed-back körrel indukál. A kortikoszteroidok gátolják a TNF és az IL—1 termelését is. Az IL-6, melyet a TNF és az IL—1 is indukál, szintén képes gátolni a TNF- és IL—1 -termelést egy másik negatív feed-back körön keresztül.

Az NNT-1 azon képessége, hogy indukálja a kortikoszteroidokat és IL—6-ot, legalábbis IL—1 jelenlétében, azt sugallja, hogy ez a molekula két fiziológiailag gyulladásgátló kört képes potenciálni. Ez a TNF- és IL—1 -termelés felgyorsított gátlásához vezethet, valamint ennek folytán a gyulladásos folyamatok felgyorsított feloldásához. Ezenkívül és a kortikoszteroidok és IL-6-termelés indukálásától függetlenül az NNT-1 a TNF-termelés direkt gátlási tulajdonságával is rendelkezik. Ez érdekes módon hozzájárul a fent jellemzett gyulladásellenes tulajdonságokhoz.

A DNS-depozitok

Az NNT-1-hez való humán genom DNS-t kódoló P1 vektort (NNT-g-PI) tartalmazó DH10B E. coli-t és az NNT-1-hez való humán cDNS-t kódoló PSPORT vektort tartalmazó DH10B E. coli-t az ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA) törzsgyűjteménynél deponáltuk 1997. január 21. sorrendben a 98294 és 98295 katalógusszámon.

SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) FELTALÁLÓ: CHANG, MING-SHI

ELLIOTT, GARY S.

SARMIENTO, ULLA SENALDI, GIORGIO (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: AZ NNT-1 NEUROTRÓF FAKTOR (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 16 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: AMGEN INC.

(B) UTCA: ONE AMGEN CENTER (C) VÁROS: THOUSAND OAKS (D) ÁLLAM: CA (E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 91320 (v) SZÁMÍTÓGÉPES LEOLVASÁSI FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: floppy lemez

HU 225 307 Β1 (B) IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Verzió #1.30 (vi) A JELEN TALÁLMÁNY ADATAI:

(A) AZ ALKALMAZÁS SZÁMA: US (B) IKTATÁSI DÁTUM:

(C) KLASSZIFIKÁCIÓ:

(vii) ELSŐBBSÉGI ADATOK:

(A) AZ ALKALMAZÁS SZÁMA: US 08/792019 (B) AZ IKTATÁS DÁTUMA: 1997. febr. 3.

(viii) ÜGYVÉD/IRODA INFORMÁCIÓ:

(A) NÉV: COOK, RÓBERT R.

(B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 31602 (C) REFERENCIA/DOKUMENTUM SZÁM: A-442B (2) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 797 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) : LOKÁCIÓ: 90...764 (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: mat_peptid (B) : LOKÁCIÓ: 171...764 (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: sig_peptid (B) : LOKÁCIÓ: 90...170 (xi) AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATTAAAGCTT CGCCGGAGCC GCGGCTCGCC CTCCCACTCC GCCAGCCTCC GGGAGAGGAG 60

CCGCACCCGG CCGGCCCAGC CCCAGCCCC ATG GAC	CTC Leu -25	CGA GCA Arg Alá	GGG Gly	GAC Asp	TCG Ser -20	113
	Met Asp -27
TGG GGG ATG TTA	GCG TGC CTG TGC ACG GTG	CTC	TGG CAC	CTC	CCT	GCA	161
Trp Gly Met Leu	Alá Cys Leu Cys Thr Val -15 -10	Leu	Trp His	Leu	Pro -5	Alá
GTG CCA GCT CTC	AAT CGC ACA GGG GAC CCA	GGG	CCT GGC	CCC	TCC	ATC	209
Val Pro Alá Leu 1	Asn Arg Thr Gly Asp Pro 5	Gly	Pro Gly 10	Pro	Ser	He
CAG AAA ACC TAT	GAC CTC ACC CGC TAC CTG	GAG	CAC CAA	CTC	CGC	AGC	257
Gin Lys Thr Tyr 15	Asp Leu Thr Arg Tyr Leu 20	Glu	His Gin 25	Leu	Arg	Ser
TTG GCT GGG ACC	TAT CTG AAC TAC CTG GGC	CCC	CCT TTC	AAC	GAG	CCA	305
Leu Alá Gly Thr 30	Tyr Leu Asn Tyr Leu Gly 35	Pro 40	Pro Phe	Asn	Glu	Pro 45
GAC TTC AAC CCT	CCC CGC CTG GGG GCA GAG	ACT	CTG CCC	AGG	GCC	ACT	353
Asp Phe Asn Pro	Pro Arg Leu Gly Alá Glu 50 55	Thr	Leu Pro	Arg	Alá 60	Thr
GTT GAC TTG GAG	GTG TGG CGA AGC CTC AAT	GAC	AAA CTG	CGG	CTG	ACC	401
Val Asp Leu Glu 65	Val Trp Arg Ser Leu Asn 70	Asp	Lys Leu	Arg 75	LeuThr

HU 225 307 Β1

449

CAG

AAC

TAC

GAG

GCC

TAC

AGC

CAC

CTT

CTG

TGT

TAC

TTG

CGT

GGC

CTC

Gin

Asn

Tyr 80

Glu

Alá

Tyr

Ser

His 85

Leu

Leu

Cys

Tyr

Leu 90

Arg

Gly

Leu

AAC

CGT

CAG

GCT

GCC

ACT

GCT

GAG

CTG

CGC

CGC

AGC

CTG

GCC

CAC

TTC

Asn

Arg 95

Gin

Alá

Alá

Thr

Alá 100

Glu

Leu

Arg

Arg

Ser 105

Leu

Alá

His

Phe

TGC

ACC

AGC

CTC

CAG

GGC

CTG

CTG

GGC

AGC

ATT

GCG

GGC

GTC

ATG

GCA

Cys 110

Thr

Ser

Leu

Gin

Gly 115

Leu

Leu

Gly

Ser

Ile 120

Alá

Gly

Val

Met

Alá 125

GCT

CTG

GGC

TAC

CCA

CTG

CCC

CAG

CCG

CTG

CCT

GGG

ACT

GAA

CCC

ACT

Alá

Leu

Gly

Tyr

Pro 130

Leu

Pro

Gin

Pro

Leu 135

Pro

Gly

Thr

Glu

Pro 140

Thr

TGG

ACT

CCT

GGC

CCT

GCC

CAC

AGT

GAC

TTC

CTC

CAG

AAG

ATG

GAC

GAC

Trp

Thr

Pro

Gly 145

Pro

Alá

His

Ser

Asp 150

Phe

Leu

Gin

Lys

Met 155

Asp

Asp

TTC

TGG

CTG

CTG

AAG

GAG

CTG

CAG

ACC

TGG

CTG

TGG

CGC

TCG

GCC

AAG

Phe

Trp

Leu 160

Leu

Lys

Glu

Leu

Gin 165

Thr

Trp

Leu

Trp

Arg 170

Ser

Alá

Lys

GAC

TTC

AAC

CGG

CTC

AAG

AAG

AAG

ATG

CAG

CCT

CCA

GCA

GCT

GCA

GTC

Asp

Phe 175

Asn

Arg

Leu

Lys

Lys 180

Lys

Met

Gin

Pro

Pro 185

Alá

Alá

Alá

Val

ACC Thr

CTG Leu

CAC His

CTG Leu

GGG Gly

GCT Alá

CAT His

GGC Gly

TTC Phe

TGACTTCTGA CCTTCTCCTC

497

545

593

641

689

737

784

190 195

TTCGCTCCCC CCC (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 225 aminosav (B) TlPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

797

Met -27

Asp

Leu -25

Arg Alá

Gly

Asp

Ser -20

Trp

Gly Met

Leu

Alá -15

Cys

Leu

Cys

Thr

Val

Leu

Trp

His

Leu

Pro

Alá

Val

Pro

Alá

Leu

Asn

Arg

Thr

Gly

-10

-5

1

5

Asp

Pro

Gly

Pro

Gly

Pro

Ser

Ile

Gin

Lys

Thr

Tyr

Asp

Leu

Thr

Arg

10

15

20

Tyr

Leu

Glu

His

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Alá

Gly

Thr

Tyr

Leu

Asn

Tyr

25

30

35

Leu

Gly

Pro

Pro

Phe

Asn

Glu

Pro

Asp

Phe

Asn

Pro

Pro

Arg

Leu

Gly

40

45

50

Alá

Glu

Thr

Leu

Pro

Arg

Alá

Thr

Val

Asp

Leu

Glu

Val

Trp

Arg

Ser

55

60

65

HU 225 307 Β1

Leu Asn Asp Lys Leu Arg Leu Thr Gin Asn Tyr Glu Alá Tyr Ser His

75 80 85

Leu Leu Cys Tyr Leu Arg Gly Leu Asn Arg Gin Alá Alá Thr Alá Glu

95 100

Leu Arg Arg Ser Leu Alá His Phe Cys Thr Ser Leu Gin Gly Leu Leu 105 110 115

Gly Ser lle Alá Gly Val Met Alá Alá Leu Gly Tyr Pro Leu Pro Gin 120 125 130

Pro Leu Pro Gly Thr Glu Pro Thr Trp Thr Pro Gly Pro Alá His Ser 135 140 145

Asp Phe Leu Gin Lys Met Asp Asp Phe Trp Leu Leu Lys Glu Leu Gin

150 155 160 165

Thr Trp Leu Trp Arg Ser Alá Lys Asp Phe Asn Arg Leu Lys Lys Lys

170 175 180

Met Gin Pro Pro Alá Alá Alá Val Thr Leu His Leu Gly Alá His Gly 185 190 195

Phe (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 5087 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genom) (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: mise jellemző (B) LOKÁCIÓ: 137...138 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /termék=„A KÖZBENSŐ >1 KB NEM SZEKVENÁLT RÉGIÓ” (Xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AACCTGCGAG TGGGCCTGGC GGATGGGATT ATTAAAGCTT CGCCGGAGCC GCGGCTCGCC 60 CTCCCACTCC GCCAGCCTCC GGGAGAGGAG CCGCACCCGG CCGGCCCAGC CCCAGCCCCA 120 TGGACCTCCG AGCAGGTTGA AAACCCAAAC TAGCCCTGCT CTTCATAACA TGACAAGCAG 180 CGCCCCATCT GATACCTAAA CCGACCAAGT CACAGCCCTC CAACTCACCC TCTGCCTGCC 240 CAGACCTCAC CACATCCTTG TGGACTCAAA CCTCAACCGC ACTAAATCAA CCAAATCCCA 300 AGTCTAAACT AATCTGAAAC TTTTAAAGTA ACCCAGTCCT TAAACCTAAC CTAGCCCAAT 360 GCCAATTATA TCTACCCTAG CCAAACCCTA ACTGCCTTTG CCAGTCCAAA GTGTCCACTG 420 AATCCTCACC TTGGTCCTCA CTGAAAATCC CAGAAAAGCA TATTTCCCCA CTGCCCACAT 480 CCCTCCTTAC AGCACCCAAC CCTGGCCTCT GGACTCCTGG TATCCTGGGA TGTCCAAACT 540 CTGCAGTGCC ATCAGCCAAC AAGCCCGACT CGTCAAATGC ACCTCTCTCC CTTCCTGTCC 600 CCACCCTTGC AGGCTGATGG AAAGGCCTCA TTGAAGTCCA ACTTTTCCCC ACCTAACACC 660 AAGAACGGGG TGAACCTCCA CACTGCCACC GTTCCCTGAG AGTGAGCACT AAATCTCCTT 720 CAATCTAACC CCACCCTACA CTTCCCACAC TCAGGAATCA CATCCTAGAA TATACCCAAA 780 ACTAAGCCCC ATAAGGCAGC CCGACCCTAG TGGTCTAACC CTATACCTTG CTTCCTATGG 840 GTGAGTCTGT TCTTGGCGGC CGCCTCTCTC CTGCTTCCTC CCTTAGAGCT GACTGTGCTC 900 AGCCTGCCAG CTCTGACATG TGCTGTCTCC CACCCTCTGA CTCCCCTCAA GCTGCAGTGG 960 GACTGGAAGA CTGGCAGGAA GCTAGGGTAC AACTGGAACA CAGGCAGGTC GACCTGCAGT 1020 CCCTAGGCCT GGCCCCGTCC CTCCATGTAC ACACATATAC ATGTTGGCAC ACACACAGTG 1080 GCACACATGC CAAAGACTCT CTCAGCTGAC ACACAGATCC ATTCTCAAGT ATCTACTGAT 1140 AGACACTCAT GCGTGCCAAG TCCTCATCCT CAAACATACA CATGCCTCTC TTTCTCTCCC 1200 GTCTTGCCAG GAGTGTTTCC CCTCCTCCAT CCCCTCTGCC TCCCATCTGG TGTCCCACCC 1260 TCACCCCCCA CCCAGCCCAA GGTGGGGACA GACACCTGAG GGGCTGCCAG CTGCTTCCCC 1320

HU 225 307 Β1

GTGTGGGCCC GGGCCGCGCT CATGCTTCTC GTCCATCCTG CCCACAGGGG ACTCGTGGGG 1380 GATGTTAGCG TGCCTGTGCA CGGTGCTCTG GCACCTCCCT GCAGTGCCAG CTCTCAATCG 1440 CACAGGGGAC CCAGGGCCTG GCCCCTCCAT CCAGAAAACC TATGACCTCA CCCGCTACCT 1500 GGAGCACCAA CTCCGCAGCT TGGCTGGGAC CTATGTGAGT ATCCAGCGTA GGAATCTGGG 1560 AGTTGGGGAG GAGTGAGGAG TTGGGGAAAG ACAGTCCTAA CCGTGGAGGG TTCTGGTAAA 1620 TGATGGGGTG AGGAGGGGCT CTTTGGCTCC CACCAGTCCC CCTGTCTGGT CTATCTCCTG 1680 CCCTTCCCTC TTAGGTGGCC CCCCCACTTC CCCATCCCTG GCCCCAGGAC TAGGCATGTG 1740 GGCAGGCCTC GCACCCGCCT TGGCCCATTG CCCCACTGGC TGCCAGCCCA GCCGCCCGCC 1800 TCCCCCTGGG GGCCGGGGAA GTCTCCTCTG TTTACACCGT GTTGTGGTGT CTCTTGCGCG 1860 GGCGGGGTTG GGTGGGGACA GAGGGGCCCC ACCTCCCATG CCTGCGTTCC AGCTCGCCTC 1920 TGCCCCCAGA CCTGGGGCCC TGCTGCTCTG GACCCAGGGG CCTCCCTTCC GTCTGCCTCT 1980 CCCATCCTAG CTGGGCCTCC TAGGGGGGTC ATGGGGGAAG GGGACTGTAG GGAACCCAGG 2040 CAGTAGTGGC AGGGGGTTTA GGGTGTGGAT GGAGGTTATG CTGTAAGGAT TTGGGGGTGG 2100 TCCAGAGGTG TTCAGAGAGC CCAGGAGAGA AGGAAGGAGG GTTGGAGGAG CCGAGGCACC 2160 ATGGGGAACC GGCCCCCTCT TCCCGTGTTC CTCTTCCACA TCCCAGACCC TACTCTGGAG 2220 CCAGGGAAAG AAAAGGGAAG AAGGTGGCGG GGGAGCTGGC TCCAGCCCCA GGATACACCG 2280 AGGAAATTAG TTTGTCTCTG TGCTTGTCAG CGTGTGAACC TCCCCCTGGG CCCTTGCCTA 2340 TCCCAGGCCT CTCCCCTTGC TTCTCCCTTC TTTCCCAGTT ATACATCTCC CTCATCCCTT 2400 TCCCTGGGCC CCAGCCGCTC CCCCGAGGGT TGGAAAGGGC TCTGCCCTCT TCCCTATACC 2460 ATGCTGTCTT CCATAGCCTT CCTCCTGTCC TACTCATGAG ACTGCCTCCA TTTCTTCCTT 2520 CTGCAACCCT GCTCCTATCA GCTGAACCCT TCTTTCGGAG TGTTAGTGAG TACCCGTCTC 2580 TCCCCAGCCC CTCAGCTGGT GGGCCTGGGT GTGTCAGCGG CAAATGGGGC TCTGGTTCCA 2640 ATGGGCCACT CTCATCTCTC TCTTGTTCCT TGTGCAGAAA ACCTTTGCTT CACTCCACTG 2700 CCCTCTCTAG TTCCCGACCC TTTTTCTCTC CTGGCTTTCC CTGCCAAATT TCTCCAAGGA 2760 GTGGTCTACA CCCTCTGCCT CCACTTCCTC TCCACCCACT CACTTCTTAA CCCCCTGCAA 2820 TCTGGCTTCC AGGCCCCAGC AATGGTTCTC TCCAAGGTCG TCAGGCACCT CCTTGCCAAG 2880 CCCGACAGTG TTTTGAAGGC TCATTCTCCT TGCTGTCTGT TTTGCAGCCA CACTGCTGAG 2940 CGCTGCTGCC TTCTCGAACT CCTCTTCCTT GGTCTCTGCA CTCTCCTGGG CCACCTTCTA 3000 CCTCTCCAGC TCCTCCAGGC TCCTCTTCCT CTCTGTCCTG CCCCCACAGC GGGCACTCTC 3060 CCAAGGTTTG CCCACCCAGC CAATCAGCAC GTCCTTCCTG AGCGTCTTGT GCGTCTCCTC 3120 CTCCTCCTTT TTCTACGCCT CTCCATTGGA GAGCTCACCA CCGCCACTGC TTCAACTGTC 3180 ACCTGCATAC AAATGATATC CTTATTGGAA AAACTCAGGG AGGCCATGAA CAAAGAAGCC 3240 TAGCATGGAG ACAGGGCCAG TGTCAGGGGA CACAAAAAAT AGAAACTTTG GGAGCAGGTA 3300 TCTCCTTGGT GGTGAGCCAG CGGCTCTGCC CTCCTCCTTC CCCATCACCC TCTCCTTTTC 3360 ACAGCTGAAC TACCTGGGCC CCCCTTTCAA CGAGCCAGAC TTCAACCCTC CCCGCCTGGG 3420 GGCAGAGACT CTGCCCAGGG CCACTGTTGA CTTGGAGGTG TGGCGAAGCC TCAATGACAA 3480 ACTGCGGCTG ACCCAGAACT ACGAGGCCTA CAGCCACCTT CTGTGTTACT TGCGTGGCCT 3540 CAACCGTCAG GCTGCCACTG CTGAGCTGCG CCGCAGCCTG GCCCACTTCT GCACCAGCCT 3600 CCAGGGCCTG CTGGGCAGCA TTGCGGGCGT CATGGCAGCT CTGGGCTACC CACTGCCCCA 3660 GCCGCTGCCT GGGACTGAAC CCACTTGGAC TCCTGGCCCT GCCCACAGTG ACTTCCTCCA 3720 GAAGATGGAC GACTTCTGGC TGCTGAAGGA GCTGCAGACC TGGCTGTGGC GCTCGGCCAA 3780 GGACTTCAAC CGGCTCAAGA AGAAGATGCA GCCTCCAGCA GCTGCAGTCA CCCTGCACCT 3840 GGGGGCTCAT GGCTTCTGAC TTCTGACCTT CTCCTCTTCG CTCCCCCTTC AAACCCTGCT 3900 CCCACTTTGT GAGAGCCAGC CCTGTATGCC AACACCTGTT GAGCCAGGAG ACAGAAGCTG 3960 TGAGCCTCTG GCCCTTTCCT GGACCGGCTG GGCGTGTGAT GCGATCAGCC CTGTCTCCTC 4020 CCCACCTCCC AAAGGTCTAC CGAGCTGGGG AGGAGGTACA GTAGGCCCTG TCCTGTCCTG 4080 TTTCTACAGG AAGTCATGCT CGAGGGAGTG TGAAGTGGTT CAGGTTGGTG CAGAGGCGCT 4140 CATGGCCTCC TGCTTCTTGC CTACCACTTG GCCAGTGCCC ACCCAGCCCC TCAGGTGGCA 4200 CATCTGGAGG GCAGGGGTTG AGGGGCCACC ACCACACATG CCTTTCTGGG GTGAAGCCCT 4260 TTGGCTGCCC CACTCTCCTT GGATGGGTGT TGCTCCCTTA TCCCCAAATC ACTCTATACA 4320 TCCAATTCAG GAAACAAACA TGGTGGCAAT TCTACACAAA AAGAGATGAG ATTAACAGTG 4380 CAGGGTTGGG GTCTGCATTG GAGGTGCCCT ATAAACCAGA AGAGAAAATA CTGAAAGCAC 4440 AGGGGCAGGG ACAGACCAGA CCAGACCCAG GAGTCTCCAA AGCACAGAGT GGCAAACAAA 4500 ACCCGAGCTG AGCATCAGGA CCTTGCCTCG AATTGTCTTC CAGTATTACG GTGCCTCTTC 4560 TCTGCCCCCT TTCCCAGGGT ATCTGTGGGT TGCCAGGCTG GGGAGGGCAA CCATAGCCAC 4620 ACCACAGGAT TTCCTGAAAG TTTACAATGC AGTAGCATTT TGGGGTGTAG GGTGGCAGCT 4680 CCCCAAGGCC CTGCCCCCCA GCCCCACCCA CTCATGACTC TAAGTGTGTT GTATTAATAT 4740 TTATTTATTT GGAGATGTTA TTTATTAGAT GATATTTATT GCAGAATTTC TATTCTTGTA 4800 TTAACAAATA AAATGCTTGC CCCAGAACTT AGTCTCTTTG CCCAGCCTCA CCCCTCCTGG 4860 TGCTCATCAG ACTCTTGCCA CCCCTGGCTC CCACTCCCTG CTTGCCTCTG GTGGAGCTGC 4920

HU 225 307 Β1

ACAGAGCTCT GGGAAGAGGC CCTCTTCCTC CCCGCACTGG GGCGATGGGC GCACCTCAGA CTTACCCACT GCTGCTGCCA CCACCAACCC CTTGATCCCT CAGTCCTCCC ACACAGCTTC TGTCCACCCC AGGTTTCCCT CACCCCACCT TTGCTAAGTC TTCCTCA (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 819 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: CDS (B) : LOKÁCIÓ: 95...769 (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: mat_peptid (B) : LOKÁCIÓ: 176...769 (ix) JELLEMZŐK:

(A) NÉV/KULCS: sig_peptid (B) : LOKÁCIÓ: 95...175 (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

TATTATTAAA GCTTCGCCGG AGCCGCGGCT CGCCCTCCCA CTCCGCCAGC CTCTGGGAGA GGAGCCGCGC CCGGCCGGCC CGGCCCCCAG CCCC ATG GAC CTC CGA GCA GGG

Met Asp Leu Arg Alá Gly -27 -25

4980

5040

5087

112

GAC Asp

TCG Ser -20

TGG Trp

GGG ATG Gly Met

TTA Leu

GCT Alá -15

TGC Cys

CTA Leu

TGC Cys

ACG Thr

GTG Val -10

CTG Leu

TGG Trp

CAC His

CTC Leu

CCT

GCA

GTG

CCA

GCT

CTT

AAT

CGC

ACA

GGA

GAT

CCA

GGC

CCT

GGC

CCC

Pro

Alá

Val

Pro

Alá

Leu

Asn

Arg

Thr

Gly

Asp

Pro

Gly

Pro

Gly

Pro

-5

1

5

10

TCC

ATC

CAG

AAA

ACC

TAT

GAC

CTC

ACC

CGC

TAC

CTG

GAG

CAT

CAA

CTC

Ser

Ile

Gin

Lys

Thr

Tyr

Asp

Leu

Thr

Arg

Tyr

Leu

Glu

His

Gin

Leu

15

20

25

CGC

AGC

TTA

GCT

GGG

ACC

TAC

CTG

AAC

TAC

CTG

GGG

CCC

CCT

TTC

AAC

Arg

Ser

Leu

Alá

Gly

Thr

Tyr

Leu

Asn

Tyr

Leu

Gly

Pro

Pro

Phe

Asn

30

35

40

GAG

CCT

GAC

TTC

AAT

CCT

CCT

CGA

CTG

GGG

GCA

GAA

ACT

CTG

CCC

AGG

Glu

Pro

Asp

Phe

Asn

Pro

Pro

Arg

Leu

Gly

Alá

Glu

Thr

Leu

Pro

Arg

45

50

55

GCC

ACG

GTC

AkC

TTG

GAA

GTG

TGG

CGA

AGC

CTC

AAT

GAC

AGG

CTG

CGG

Alá

Thr

Val

Asn

Leu

Glu

Val

Trp

Arg

Ser

Leu

Asn

Asp

Arg

Leu

Arg

60

65

70

75

CTG

ACC

CAG

AAC

TAT

GAG

GCG

TAC

AGT

CAC

CTC

CTG

TGT

TAC

TTG

CGT

Leu

Thr

Gin

Asn

Tyr

Glu

Alá

Tyr

Ser

His

Leu

Leu

Cys

Tyr

Leu

Arg

80

85

90

GGC

CTC

AAC

CGT

CAG

GCT

GCC

ACA

GCT

GAA

CTC

CGA

CGT

AGC

CTG

GCC

Gly

Leu

Asn

Arg

Gin

Alá

Alá

Thr

Alá

Glu

Leu

Arg

Arg

Ser

Leu

Alá

95

100

105

CAC

TTC

TGT

ACC

AGC

CTC

CAG

GGC

CTG

CTG

GGC

AGC

ATT

GCA

GGT

GTC

His

Phe

Cys

Thr

Ser

Leu

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Ser

Ile

Alá

Gly

Val

110 115 120

160

208

256

304

352

400

448

496

544

HU 225 307 Β1

592

ATG GCG Met Alá

ACG Thr

CTT Leu

GGC Gly

TAC Tyr

CCA Pro 130

CTG Leu

CCC Pro

CAG Gin

CCT Pro

CTG Leu 135

CCA Pro

GGG Gly

ACT Thr

GAG Glu

125

CCA

GCC

TGG

GCC

CCT

GGC

CCT

GCC

CAC

AGT

GAC

TTC

CTC

CAG

AAG

ATG

Pro

Alá

Trp

Alá

Pro

Gly

Pro

Alá

His

Ser

Asp

Phe

Leu

Gin

Lys

Met

140

145

150

155

GAT

GAC

TTC

TGG

CTG

CTG

AAG

GAG

CTG

CAG

ACC

TGG

CTA

TGG

CGT

TCA

Asp

Asp

Phe

Trp

Leu

Leu

Lys

Glu

Leu

Gin

Thr

Trp

Leu

Trp

Arg

Ser

160

165

170

GCC

AAG

GAC

TTC

AAC

CGG

CTT

AAG

AAG

AAG

ATG

CAG

CCT

CCA

GCA

GCT

Alá

Lys

Asp

Phe

Asn

Arg

Leu

Lys

Lys

Lys

Met

Gin

Pro

Pro

Alá

Alá

175

180

185

TCA

GTC

ACC

CTG

CAC

TTG

GAG

GCA

CAT

GGT

TTC

TGACCTCTGA CCCTTAACCC

Ser

Val

Thr

Leu

His

Leu

Glu

Alá

His

Gly

Phe

640

688

736

789

190 195

CCACACCTCC AGGCCCAGTC AGCTGTGCTT (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 225 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TlPUSA: protein (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

819

Met -27

Asp

Leu -25

Arg

Alá

Gly

Asp

Ser -20

Trp Gly Met

Leu

Alá -15

Cys

Leu

Cys

Thr

Val

Leu

Trp

His

Leu

Pro

Alá

Val

Pro

Alá

Leu

Asn

Arg

Thr

Gly

-10

-5

1

5

Asp

Pro

Gly

Pro

Gly

Pro

Ser

Ile

Gin

Lys

Thr

Tyr

Asp

Leu

Thr

Arg

10

15

20

Tyr

Leu

Glu

His

Gin

Leu

Arg

Ser

Leu

Alá

Gly

Thr

Tyr

Leu

Asn

Tyr

25

30

35

Leu

Gly

Pro

Pro

Phe

Asn

Glu

Pro

Asp

Phe

Asn

Pro

Pro

Arg

Leu

Gly

40

45

50

Alá

Glu

Thr

Leu

Pro

Arg

Alá

Thr

Val

Asn

Leu

Glu

Val

Trp

Arg

Ser

55

60

65

Leu

Asn

Asp

Arg

Leu

Arg

Leu

Thr

Gin

Asn

Tyr

Glu

Alá

Tyr

Ser

His

70

75

80

85

Leu

Leu

Cys

Tyr

Leu

Arg

Gly

Leu

Asn

Arg

Gin

Alá

Alá

Thr

Alá

Glu

90

95

100

Leu

Arg

Arg

Ser

Leu

Alá

His

Phe

Cys

Thr

Ser

Leu

Gin

Gly

Leu

Leu

105

110

115

Gly

Ser

Ile

Alá

Gly

Val

Met

Alá

Thr

Leu

Gly

Tyr

Pro

Leu

Pro

Gin

120

125

130

HU 225 307 Β1

Pro

Leu 135

Pro

Gly

Thr

Glu

Pro 140

Alá

Trp

Alá

Pro

Gly 145

Pro

Alá

His

Ser

Asp 150

Phe

Leu

Gin

Lys

Met 155

Asp

Asp

Phe

Trp

Leu 160

Leu

Lys

Glu

Leu

Gin 165

Thr

Trp

Leu

Trp

Arg 170

Ser

Alá

Lys

Asp

Phe 175

Asn

Arg

Leu

Lys

Lys 180

Lys

Met

Gin

Pro

Pro 185

Alá

Alá

Ser

Val

Thr 190

Leu

His

Leu

Glu

Alá 195

His

Gly

Phe (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 36 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TfPUSA: más nukleinsav (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCAAGCTTC ACCATGGACC TCCGAGCAGG GGACTC (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 64 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCGGGGCCG CACTACTTGC ATCGTCGCGT CCTTGTACTC GAAGCCATGA GCCCCCAGGT GCAG (2) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 199 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Protein (B) LOKÁCIÓ: 1...179 (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Régió (B) LOKÁCIÓ:-21...0 (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Asn -20

Cys

Val

Cys

Arg

Leu -15

Val

Leu

Val

Val

Leu -10

Ser

Leu

Trp

Pro

Asp -5

Thr

Alá

Val

Alá

Pro 1

Gly

Pro

Pro

Pro 5

Gly

Pro

Pro

Arg

Val 10

Ser

Pro

Asp

Pro

Arg 15

Alá

Glu

Leu

Asp

Ser 20

Thr

Val

Leu

Leu

Thr 25

Arg

Ser

Leu

Leu

Alá 30

Asp

Thr

Arg

Gin

Leu 35

Alá

Alá

Gin

Leu

Arg 40

Asp

Lys

Phe

HU 225 307 Β1

Pro Alá

Asp Gly Asp

His

Asn 50

Leu

Asp

Ser

Leu

Pro 55

Thr

Leu

Alá

Met

45

Ser

Alá

Gly

Alá

Leu

Gly

Alá

Leu

Gin

Leu

Pro

Gly

Val

Leu

Thr

Arg

60

65

70

75

Leu

Arg

Alá

Asp

Leu

Leu

Ser

Tyr

Leu

Arg

His

Val

Gin

Trp

Leu

Arg

80

85

90

Arg

Alá

Gly

Gly

Ser

Ser

Leu

Lys

Thr

Leu

Glu

Pro

Glu

Leu

Gly

Thr

95

100

105

Leu

Gin

Alá

Arg

Leu

Asp

Arg

Leu

Leu

Arg

Arg

Leu

Gin

Leu

Leu

Met

110

115

120

Ser

Arg

Leu

Alá

Leu

Pro

Gin

Pro

Pro

Pro

Asp

Pro

Pro

Alá

Pro

Pro

125

130

135

Leu

Alá

Pro

Pro

Ser

Ser

Alá

Trp

Gly

Gly

Ile

Arg

Alá

Alá

His

Alá

140

145

150

155

Ile

Leu

Gly

Gly

Leu

His

Leu

Thr

Leu

Asp

Trp

Alá

Val

Arg

Gly

Leu

160

165

170

Leu

Leu

Leu

Lys

Thr

Arg

Leu

175 (2) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 212 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTlPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Protein (B) LOKÁCIÓ: 1...182 (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Régió (B) LOKÁCIÓ:-30...0 (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met -30

Asn

Ser

Phe

Ser

Thr -25

Ser

Alá

Phe

Gly

Pro -20

Val

Alá

Phe

Ser

Leu -15

Gly

Leu

Leu

Leu

Val -10

Leu

Pro

Alá

Alá

Phe -5

Pro

Alá

Pro

Val

Pro 1

Pro

Gly

Glu

Asp 5

Ser

Lys

Asp

Val

Alá 10

Alá

Pro

His

Arg

Gin 15

Pro

Leu

Thr

Ser

Ser 20

Glu

Arg

Ile

Asp

Lys 25

Gin

Ile

Arg

Tyr

Ile 30

Leu

Asp

Gly

Ile

Ser 35

Alá

Leu

Arg

Lys

Glu 40

Thr

Cys

Asn

Lys

Ser 45

Asn

Met

Cys

Glu

Ser 50

Ser

Lys

Glu

Alá

Leu 55

Alá

Glu

Asn

Asn

Leu 60

Asn

Leu

Pro

Lys

Met 65

Alá

HU 225 307 Β1

Glu

Lys

Asp

Gly 70

Cys

Phe

Gin

Ser

Gly 75

Phe Asn Glu

Glu

Thr 80

Cys

Leu

Val

Lys

He

He

Thr

Gly

Leu

Leu

Glu

Phe

Glu

Val

Tyr

Leu

Glu

Tyr

85

90

95

Leu

Gin

Asn

Arg

Phe

Glu

Ser

Ser

Glu

Glu

Gin

Alá

Arg

Alá

Val

Gin

100

105

110

Met

Ser

Thr

Lys

Val

Leu

He

Gin

Phe

Leu

Gin

Lys

Lys

Alá

Lys

Asn

115

120

125

130

Leu

Asp

Alá

He

Thr

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

Thr

Asn

Alá

Ser

Leu

Leu

135

140

145

Thr

Lys

Leu

Gin

Alá

Gin

Asn

Gin

Trp

Leu

Gin

Asp

Met

Thr

Thr

His

150

155

160

Leu

He

Leu

Arg

Ser

Phe

Lys

Glu

Phe

Leu

Gin

Ser

Ser

Leu

Arg

Alá

165

170

175

Leu

Arg

Gin

Met

180 (2) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 204 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Protein (B) LOKÁCIÓ: 1...174 (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Régió (B) LOKÁCIÓ:-30...0 (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met -30

Alá

Gly

Pro

Alá

Thr -25

Gin

Ser

Pro Met

Lys -20

Leu

Met

Alá

Leu

Gin -15

Leu

Leu

Leu

Trp

His

Ser

Alá

Leu

Trp

Thr

Val

Gin

Glu

Alá

Thr

Pro

-10

-5

1

Leu

Gly

Pro

Alá

Ser

Ser

Leu

Pro

Gin

Ser

Phe

Leu

Leu

Lys

Cys

Leu

5

10

15

Glu

Gin

Val

Arg

Lys

He

Gin

Gly

Asp

Gly

Alá

Alá

Leu

Gin

Glu

Lys

20

25

30

Leu

Cys

Alá

Thr

Tyr

Lys

Leu

Cys

His

Pro

Glu

Glu

Leu

Val

Leu

Leu

35

40

45

50

Gly

His

Ser

Leu

Gly

He

Pro

Trp

Alá

Pro

Leu

Ser

Ser

Cys

Pro

Ser

55

60

65

Gin

Alá

Leu

Gin

Leu

Alá

Gly

Cys

Leu

Ser

Gin

Leu

His

Ser

Gly

Leu

70

75

80

Phe

Leu

Tyr

Gin

Gly

Leu

Leu

Gin

Alá

Leu

Glu

Gly

He

Ser

Pro

Glu

85

90

95

HU 225 307 Β1

Leu

Gly 100

Pro

Thr

Leu Asp

Thr 105

Leu

Gin

Leu Asp Val 110

Alá

Asp

Phe

Alá

Thr

Thr

He

Trp

Gin

Gin

Met

Glu

Glu

Leu

Gly

Met

Alá

Pro

Alá

Leu

115

120

125

130

Gin

Pro

Thr

Gin

Gly

Alá

Met

Pro

Alá

Phe

Alá

Ser

Alá

Phe

Gin

Arg

135

140

145

Arg

Alá

Gly

Gly

Val

Leu

Val

Alá

Ser

His

Leu

Gin

Ser

Phe

Leu

Glu

150

155

160

Val

Ser

Tyr

Arg

Val

Leu

Arg

His

Leu

Alá

Gin

Pro

165 170 (2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 201 aminosav

(B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Ser

Arg

Arg Glu 5

Gly

Ser

Leu

Glu Asp 10

Pro

Gin

Thr

Asp

Ser 15

Ser

Val

Ser

Leu

Leu Pro

His

Leu

Glu

Alá Lys

lle

Arg

Gin

Thr

His

Ser

20

25

30

Leu

Alá

His

Leu Leu

Thr

Lys

Tyr

Alá Glu

Gin

Leu

Leu

Gin

Glu

Tyr

35

40

45

Val

Gin

Leu

Gin Gly

Asp

Pro

Phe

Gly Leu

Pro

Ser

Phe

Ser

Pro

Pro

50

55

60

Arg

Leu

Pro

Val Alá

Gly

Leu

Ser

Alá Pro

Alá

Pro

Ser

His

Alá

Gly

65

70

75

80

Leu

Pro

Val

His Glu

Arg

Leu

Arg

Leu Asp

Alá

Alá

Alá

Leu

Alá

Alá

85

90

95

Leu

Pro

Pro

Leu Leu

Asp

Alá

Val

Cys Arg

Arg

Gin

Alá

Glu

Leu

Asn

100

105

110

Pro

Arg

Alá

Pro Arg

Leu

Leu

Arg

Arg Leu

Glu

Asp

Alá

Alá

Arg

Gin

115

120

125

Alá

Arg

Alá

Leu Gly

Alá

Alá

Val

Glu Alá

Leu

Leu

Alá

Alá

Leu

Gly

130

135

140

Alá

Alá

Asn

Arg Gly

Pro

Arg

Alá

Glu Pro

Pro

Alá

Alá

Thr

Alá

Ser

145

150

155

160

Alá

Alá

Ser

Alá Thr

Gly

Val

Phe

Pro Alá

Lys

Val

Leu

Gly

Leu

Arg

165

170

175

Val

Cys

Gly

Leu Tyr

Arg

Glu

Trp

Leu Ser

Arg

Thr

Glu

Gly

Asp

Leu

180

185

190

HU 225 307 Β1

Gly Gin Leu Leu Pro Gly Gly Ser Alá 195 200 (2) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 199 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met 1

Alá

Phe

Thr

Glu 5

His

Pro

Leu

Thr

Pro 10

His

Arg

Arg

Asp

Leu 15

Cys

Ser

Arg

Ser

Ile

Trp

Leu

Alá

Arg

Lys

Ile

Arg

Ser

Asp

Leu

Thr

Alá

20

25

30

Leu

Thr

Glu

Ser

Tyr

Val

Lys

His

Gin

Gly

Leu

Asn

Lys

Asn

Ile

Asn

35

40

45

Leu

Asp

Ser

Alá

Asp

Gly

Met

Pro

Val

Alá

Ser

Thr

Asp

Gin

Trp

Ser

50

55

60

Glu

Leu

Thr

Glu

Alá

Glu

Arg

Leu

Gin

Glu

Asn

Leu

Gin

Alá

Tyr

Arg

65

70

75

80

Thr

Phe

His

Val

Leu

Leu

Alá

Arg

Leu

Leu

Glu

Asp

Gin

Gin

Val

His

85

90

95

Phe

Thr

Pro

Thr

Glu

Gly

Asp

Phe

His

Gin

Alá

Ile

His

Thr

Leu

Leu

100

105

110

Leu

Gin

Val

Alá

Alá

Phe

Alá

Tyr

Gin

Ile

Glu

Glu

Leu

Met

Ile

Leu

115

120

125

Leu

Glu

Tyr

Lys

Ile

Pro

Arg

Asn

Glu

Alá

Asp

Gly

Met

Pro

Ile

Asn

130

135

140

Val

Gly

Asp

Gly

Gly

Leu

Phe

Glu

Lys

Lys

Leu

Trp

Gly

Leu

Lys

Val

145

150

155

160

Leu

Gin

Glu

Leu

Ser

Gin

Trp

Thr

Val

Arg

Ser

Ile

His

Asp

Leu

Arg

165

170

175

Phe

Ile

Ser

Ser

His

Gin

Thr

Gly

Ile

Pro

Alá

Arg

Gly

Ser

His

Tyr

180

185

190

Ile

Alá

Asn

Asn

Lys

Lys

Met

195 (2) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 252 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Protein (B) LOKÁCIÓ: 1...227

HU 225 307 Β1 (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Régió (B) LOKÁCIÓ:-25...0 (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met -25

Gly

Val

Leu

Leu Thr Gin Arg Thr Leu Leu

Ser

Leu

Val

Leu

Alá -10

-20

-15

Leu

Leu

Phe

Pro

Ser

Met

Alá

Ser

Met

Alá

Alá

Ile

Gly

Ser

Cys

Ser

-5

1

5

Lys

Glu

Tyr

Arg

Val

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Gin

Lys

Gin

Thr

Asp

Leu

10

15

20

Met

Gin

Asp

Thr

Ser

Arg

Leu

Leu

Asp

Pro

Tyr

Ile

Arg

Ile

Gin

Gly

25

30

35

Leu

Asp

Val

Pro

Lys

Leu

Arg

Glu

His

Cys

Arg

Glu

Arg

Pro

Gly

Alá

40

45

50

55

Phe

Pro

Ser

Glu

Glu

Thr

Leu

Arg

Gly

Leu

Gly

Arg

Arg

Gly

Phe

Leu

60

65

70

Gin

Thr

Leu

Asn

Alá

Thr

Leu

Gly

Cys

Val

Leu

His

Arg

Leu

Alá

Asp

75

80

85

Leu

Glu

Gin

Arg

Leu

Pro

Lys

Alá

Gin

Asp

Leu

Glu

Arg

Ser

Gly

Leu

90

95

100

Asn

Ile

Glu

Asp

Leu

Glu

Lys

Leu

Gin

Met

Alá

Arg

Pro

Asn

Ile

Leu

105

110

115

Gly

Leu

Arg

Asn

Asn

Ile

Tyr

Cys

Met

Alá

Gin

Leu

Leu

Asp

Asn

Ser

120

125

130

135

Asp

Thr

Alá

Glu

Pro

Thr

Lys

Alá

Gly

Arg

Gly

Alá

Ser

Gin

Pro

Pro

140

145

150

Thr

Pro

Thr

Pro

Alá

Ser

Asp

Alá

Phe

Gin

Arg

Lys

Leu

Glu

Gly

Cys

155

160

165

Arg

Phe

Leu

His

Gly

Tyr

His

Arg

Phe

Met

His

Ser

Val

Gly

Arg

Val

170

175

180

Phe

Ser

Lys

Trp

Gly

Glu

Ser

Pro

Asn

Arg

Ser

Arg

Arg

His

Ser

Pro

185

190

195

His

Gin

Alá

Leu

Arg

Lys

Gly

Val

Arg

Arg

Thr

Arg

Pro

Ser

Arg

Lys

200

205

210

215

Gly

Lys

Arg

Leu

Met

Thr

Arg

Gly

Gin

Leu

Pro

Arg

220

225

(2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 202 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein

HU 225 307 Β1 (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Protein (B) LOKÁCIÓ: 1...180 (ix) JELLEMZŐ:

(A) NÉV/KULCS: Régió (B) LOKÁCIÓ:-22...0 (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

Lys

Val -20

Leu

Alá Alá

Gly

Val -15

Val

Pro

Leu

Leu

Leu -10

Val

Leu

His

Trp

Lys

His

Gly

Alá

Gly

Ser

Pro

Leu

Pro

Ile

Thr

Pro

Val

Asn

Alá

-5

1

5

10

Thr

Cys

Alá

Ile

Arg

His

Pro

Cys

His

Asn

Asn

Leu

Met

Asn

Gin

Ile

15

20

25

Arg

Ser

Gin

Leu

Alá

Gin

Leu

Asn

Gly

Ser

Alá

Asn

Alá

Leu

Phe

Ile

30

35

40

Leu

Tyr

Tyr

Thr

Alá

Gin

Gly

Glu

Pro

Phe

Pro

Asn

Asn

Leu

Asp

Lys

45

50

55

Leu

Cys

Gly

Pro

Asn

Val

Thr

Asp

Phe

Pro

Pro

Phe

His

Alá

Asn

Gly

60

65

70

Thr

Glu

Lys

Alá

Lys

Leu

Val

Glu

Leu

Tyr

Arg

Ile

Val

Val

Tyr

Leu

75

80

85

90

Gly

Thr

Ser

Leu

Gly

Asn

Ile

Thr

Arg

Asp

Gin

Lys

Ile

Leu

Asn

Pro

95

100

105

Ser

Alá

Leu

Ser

Leu

His

Ser

Lys

Leu

Asn

Alá

Thr

Alá

Asp

Ile

Leu

110

115

120

Arg

Gly

Leu

Leu

Ser

Asn

Val

Leu

Cys

Arg

Leu

Cys

Ser

Lys

Tyr

His

125

130

135

Val

Gly

His

Val

Asp

Val

Thr

Tyr

Gly

Pro

Asp

Thr

Ser

Gly

Lys

Asp

140

145

150

Val

Phe

Gin

Lys

Lys

Lys

Leu

Gly

Cys

Gin

Leu

Leu

Gly

Lys

Tyr

Lys

155

160

165

170

Gin

Ile

Ile

Alá

Val

Leu

Alá

Gin

Alá

Phe

175

180

(2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 45 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AGCGCTACGG TCGACCCGGC GTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTACG (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav

HU 225 307 Β1 (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: más nukleinsav (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGAAGGAAAA AAGCGGCCGC TACA 24

Claims (20)

1. Egy NNT-1 polipeptid, amelynek biológiai aktivitása a motoros vagy szimpatetikus neuronok növekedésének stimulálása, a polipeptid az alábbiak közüli:

(a) a polipeptid a 2. vagy 5. számú szekvencia szerinti;

(b) a polipeptid a 2. vagy 5. számú szekvencia szerinti 1-198 aminosav, (c) a polipeptid az a) vagy b) pont szerinti polipeptiddel legalább 70%-ban azonos; és (d) az (a)-(c) pontok bármelyike szerinti polipeptid fragmense, amely rendelkezik az említett biológiai aktivitással.

2. Egy NNT-1 polipeptid, amelynek biológiai aktivitása a motoros vagy szimpatetikus neuronok növekedésének stimulálása, vagyis a polipeptid a 2. vagy 5. számú szekvencia szerinti vagy ennek fragmense, amely rendelkezik az említett bilológiai tulajdonsággal.

3. A 2. igénypont szerinti NNT-1 polípetid, amely nem tartalmaz terminális aminosavként metionint.

4. A 2. igénypont szerinti NNT-1 polipeptid, amely terminális aminosavként metionint tartalmaz.

5. Izolált és tisztított antitest vagy ennek fragmense, amely specifikusan kötődik egy olyan polipeptidhez, amelynek biológiai aktivitása a motoros vagy szimpatetikus neuronok növekedésének stimulálása, a polipeptid az alábbi lehet:

(a) a polipeptid a 2. vagy 5. számú szekvencia szerinti, vagy (b) a polipeptid a 2. vagy 5. számú szekvencia szerinti 1-198 aminosav.

6. Az 5. igénypont szerinti izolált és tisztított antitest vagy ennek fragmense, ahol az említett antitest monoklonális antitest vagy ennek fragmense.

7. Egy izolált nukleinsavmolekula, amely egy olyan polipeptidet kódol, amelynek biológiai aktivitása a motoros vagy szimpatetikus neuronok növekedésének stimulálása, a polipeptid az alábbi lehet:

(a) az 1. számú szekvencia szerinti nukleinsavmolekula;

(b) a 3. számú szekvencia szerinti nukleinsavmolekula;

(c) a 4. számú szekvencia szerinti nukleinsavmolekula;

(d) egy olyan polipeptidet kódoló nukleinsavmolekula, amely a 2. vagy 5. számú szekvencia szerint a -27-től a 198-ig vagy az 1-től a 198-ig található aminosavakat tartalmazza;

10 (e) egy nukleinsavmolekula, amely a d) pont szerinti polipeptiddel legalább 70 százalékban azonos polipeptidet kódol;

(f) egy nukleinsavmolekula, amely a d) vagy e) pont szerinti polipeptid olyan fragmensét kódolja, amely po15 lipeptidfragmens rendelkezik az említett biológiai tulajdonsággal.

8. Egy izolált nukleinsavmolekula, amely az 1. számú szekvencia szerinti.

9. Egy izolált nukleinsavmolekula, amely a 3. szá20 mú szekvencia szerinti.

10. Egy izolált nukleinsavmolekula, amely a 2. számú szekvencia szerinti polipeptidet kódolja.

11. Egy izolált nukleinsavmolekula, amely a 2. számú szekvencia szerinti 1-198 aminosavakat kódolja.

25

12. Egy vektor, amely a 7-11. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát tartalmazza.

13. Egy gazdasejt, amely a 12. igénypont szerinti vektort tartalmazza.

14. Eljárás egy NNT-1 polipeptid előállítására,

30 amely polipeptid biológiai aktivitása a motoros vagy szimpatetikus neuronok növekedésének stimulálása, amelynek során a következő lépéseket végezzük:

(a) a 7-11. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav által kódolt polipeptidet egy megfelelő gazdában

35 expresszáljuk; és (b) a polipeptidet izoláljuk.

15. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti NNT-1 polipeptid alkalmazása neurológiai vagy immunológiai betegség vagy rendellenesség kezelésére

40 szolgáló gyógyszer előállítására.

16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett betegség vagy rendellenesség az Alzheimer-kór, a Parkinson-kór, az amiotrofikus laterális betegség, szklerózis, a Charcot-Marie-Tooth-szindróma,

45 a Huntington-betegség, a perifériás neuropathia, a disztrófia vagy a neurális retina degenerációja.

17. A 15. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a betegség vagy rendellenesség B-sejt- vagy T-sejt-hiány.

18. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a be50 tegség vagy rendellenesség közönséges változékony immunhiány (CVID), szelektív IgA-hiány, hipogammaglobulinémia vagy X-hez kötött agammaglobulinémia.

19. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti NNT-1 polipeptid alkalmazása immunreaktivitás és an55 titesttermelés vakcinálással elért fokozására szolgáló gyógyszer előállítására.

20. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti NNT-1 polipeptid alkalmazása gyulladásos állapot kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására.