ES2210551T3

ES2210551T3 - Neuritina, un neurogeno.

Info

Publication number: ES2210551T3
Application number: ES97935335T
Authority: ES
Inventors: Lars Eyde Theill; Gregory Scott Naeve; Yoav Citri
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Amgen Inc
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Amgen Inc
Priority date: 1996-08-09
Filing date: 1997-08-07
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2017-08-07
Also published as: IL128411A; DE69725856T2; US5859197A; WO1998006843A1; EP0920501B8; CA2262465A1; CA2262465C; DK0920501T3; DE69725856D1; KR20000029912A; AU3829597A; PT920501E; US5817784A; AU714968B2; HUP9904414A3; EP0920501B1; JP2000516093A; ATE253115T1; HUP9904414A2; EP0920501A1

Abstract

SE EXPONEN EL ADN Y LAS SECUENCIAS DE AMINOACIDOS DE UN NUEVO POLIPEPTIDO DENOMINADO NEURITINA, QUE SE EXPRESA BASICAMENTE EN ZONAS SELECCIONADAS DEL CEREBRO.

Description

Neuritina, un neurógeno.

Antecedentes Campo de la invención

Esta invención se refiere a nuevas secuencias de ADN que codifican un polipéptido denominado Neuritina, que es expresado primariamente en ciertos tejidos cerebrales en respuesta a ciertos estímulos.

Técnicas relacionadas

Varios trastornos y enfermedades neurológicas están causados al menos en parte por la degeneración o muerte de clases particulares de neuronas. Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson se caracteriza por un enlentecimiento del movimiento muscular voluntario, por rigidez muscular y temblores. Tales síntomas son atribuidos, al menos en parte, a la degeneración progresiva de neuronas productoras de dopamina situadas en una región específica del cerebro denominada la sustancia nigra. La degeneración de estas neuronas ("neuronas dopaminérgicas") tiene como resultado una disminución de los niveles de dopamina en una región adyacente del cerebro denominada estriatum. El estriatum contiene neuronas que expresan receptores de dopamina; estas neuronas están implicadas en el control de la actividad motora. Se desconoce la causa de la degeneración de las neuronas dopaminérgicas, pero se ha atribuido a radicales libres, a un contenido de hierro en exceso, a toxinas medioambientales, a la neurotoxicidad de los aminoácidos excitatorios y posiblemente a una deficiencia de ciertos factores neurotróficos (Jenner, Neurology, Suplemento 3:S6-S12 [1995]; Adams y Victor, eds. Principles of Neurology, Capítulo 42: Degenerative Diseases of the Nervous System, McGraw Hill, NY [1993]).

Enfermedades tales como la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la atrofia muscular progresiva y la neuropatía motora y sensorial hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth) son todas el resultado, al menos en parte, de una degradación de las neuronas motoras que están situadas en el asta ventral de la médula espinal.

El hipocampo, una estructura bien definida que es parte del córtex cerebral del cerebro, es importante en la formación de la memoria a largo plazo. La destrucción del hipocampo, por ejemplo por isquemia, puede tener como resultado una incapacidad para formar nuevos recuerdos. La degeneración de las neuronas piramidales CA1, que están situadas en la región CA1 del hipocampo, es una característica de la enfermedad de Alzheimer. Estas mismas neuronas son vulnerables selectivamente al daño isquémico y anóxico que tiene lugar en condiciones tales como paraplejía y trauma de la cabeza. Además, las neuronas piramidales del hipocampo CA1, así como las neuronas piramidales situadas en la región CA3 del hipocampo, están dañadas selectivamente en la epilepsia.

El estriatum es la región de inervación de las terminales nerviosas de las neuronas que contienen dopamina de la sustancia nigra. La mayoría de las neuronas del estriatum utilizan GABA (ácido 4-aminobutírico) como su neurotransmisor. El estriatum es la diana principal de la neurodegeneración progresiva que tiene lugar en la enfermedad de Huntington, en la que la pérdida principal de neuronas es la de las neuronas del estriatum que utilizan GABA.

Las neuronas que contienen serotonina están localizadas en grupos que se acumulan alrededor la línea media del cerebro posterior. Estas neuronas están implicadas en el control de la temperatura corporal, del estado de ánimo y del sueño. Los trastornos del sistema de neuronas que contienen serotonina incluyen, por ejemplo, depresión, otros trastornos del estado de ánimo y trastornos del sueño.

Las células fotorreceptoras son un subgrupo especializado de neuronas de la retina y son responsables de la visión. El daño y/o la muerte de las células fotorreceptoras puede conducir a ceguera. La degeneración de la retina, tal como por retinitis pigmentosa, la degeneración macular relacionada con la edad y la ceguera nocturna estacionaria se caracterizan todas por la atrofia progresiva y la pérdida de función de los segmentos externos fotorreceptores que son estructuras especializadas que contienen los pigmentos visuales que transforman un estímulo lumínico en actividad eléctrica.

Aunque hay algunas terapias disponibles para tratar los síntomas y disminuir la gravedad de tales enfermedades (por ejemplo, la L-dopa para tratar la enfermedad de Parkinson), no existe actualmente un tratamiento eficaz para prevenir o reducir la degeneración de la mayoría de las clases de neuronas afectadas anteriormente mencionadas, ni para estimular su reparación.

Recientemente, se han identificado varias moléculas proteináceas que existen de forma natural sobre la base de su actividad trófica en varias neuronas. Estas moléculas se denominan "factores neurotróficos". Los factores neurotróficos son proteínas solubles endógenas que pueden regular la supervivencia, el crecimiento y/o la plasticidad morfológica de las neuronas (ver, Fallon y Laughlin, Neurotrophic Factors, Academic Press, San Diego, CA [1993]).

Los factores neurotróficos conocidos pertenecen a varias superfamilias de proteínas diferentes de factores de crecimiento polipeptídicos sobre la base de su homología de secuencias de aminoácidos y/o de su estructura tridimensional (MacDonald y Hendrikson, Cell, 73:421-424 [1993]). Una familia de factores neurotróficos es la familia de las neurotrofinas. Esta familia consta actualmente de NGF (factor de crecimiento nervioso), BDNF (factor neurotrófico derivado del cerebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT-4 (neurotrofina-4) y NT-6 (neurotrofina-6).

El CNTF (factor neurotrófico ciliar) y el LIF (factor inhibidor de leucemia) son polipéptidos citoquinas que tienen actividad neutrófica. En virtud de sus características estructurales y de los componentes de sus receptores, estos polipéptidos están relacionados con una familia de citoquinas hematopoyéticas que incluye IL-6 (interleuquina-6), IL-11 (interleuquina-11), G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos) y oncostatina-M.

El GDNF (factor neurotrófico derivado de la glía) es un factor neutrófico que pertenece a la superfamilia de TGF-beta (factor de crecimiento transformante beta). El GDNF presenta potentes acciones de supervivencia y de estimulación de la diferenciación para neuronas dopaminérgicas y motoras (Lin y col., Science, 260:1130-1132 [1993]; Yan y col., Nature, 373:341-344 [1995]).

Aunque se sabe que estos factores neurotróficos incrementan el crecimiento y/o la supervivencia de las neuronas, se sabe menos sobre las moléculas que trabajan junto con estos factores. Una manera de la que pueden identificarse neurotrofinas adicionales y moléculas relacionadas es la administración a un animal de uno o más compuestos que se sabe que tienen un efecto sobre el sistema nervioso, y el análisis posterior de los tejidos para determinar la inducción de los genes implicados en las respuestas neurales a los compuestos. Por ejemplo, puede realizarse una selección por genes que sean inducidos en ciertos tejidos del sistema nervioso, tales como la región del hipocampo del cerebro. Esta técnica fue utilizada por Nedivi y col. (Nature, 363:718-722 [1993]; Nedivi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2048-2053 [1996]) para identificar nuevos genes que son inducidos en la porción del girus dentado del hipocampo en respuesta a la administración de un neurotransmisor análogo del glutamato denominado kainato (ácido kaínico).

La expresión de muchos factores neurotróficos tales como NGF, BDNF, NT3, GDNF, bFGF, IGF-1 y TGF-beta está regulada por la actividad neuronal aferente y/o por el daño neuronal. Puede observarse una potente inducción de algunos de estos genes en el girus dentado del hipocampo en respuesta al análogo de glutamato kainato (Isackson, Current Opinions in Neurobiology, 5:50-357 [1995]). El tratamiento con kainato parece incrementar la liberación de nuevos compuestos procedentes del hipocampo de ratas despiertas, y esta actividad parece ser diferente de las acciones de los factores neurotróficos conocidos (Humpel y col., Science, 269:552-554 [1995]).

A la vista del hecho de que muchos trastornos y enfermedades del sistema nervioso no tienen cura, existe la necesidad en la técnica de identificar nuevos compuestos para el tratamiento de condiciones y enfermedades neurológicas tales como la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Alzheimer, la apoplejía y varios trastornos degenerativos que afectan a la visión.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos compuestos que puedan ser útiles para estimular la regeneración neuronal y restaurar las funciones neurales.

Estos y otros objetos serán obvios para una persona con experiencia habitual en la técnica a partir de la presente descripción.

Resumen de la invención

En una realización, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consta de:

(a) la molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº:1;

(b) la molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº:2;

(c) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEC ID Nº:3;

(d) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEC ID Nº:4;

(e) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos un 70 por ciento idéntico al polipéptido completo de SEC ID Nº:3 o SEC ID Nº:4; y

(f) una molécula de ácido nucleico que es el complemento de cualquiera de (a)-(e) anteriores.

En otra realización, la presente invención proporciona vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas.

En otra realización más, la presente invención proporciona células huésped que contienen estos vectores.

En una realización adicional más, la presente invención proporciona un proceso para producir un polipéptido Neuritina que comprende las etapas de:

(a) expresión de un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la Reivindicación 1 en un huésped adecuado; y

(b) aislamiento del polipéptido.

Opcionalmente, el polipéptido Neuritina es la SEC ID Nº:3 o la SEC ID Nº:4.

En otra realización más, la presente invención proporciona un polipéptido Neuritina seleccionado del grupo que consta de:

(a) el polipéptido de SEC ID Nº:3;

(b) el polipéptido de SEC ID Nº:4; y

(c) un polipéptido que es al menos un 70 por ciento homólogo al polipéptido de (a) o (b).

Opcionalmente, el polipéptido Neuritina puede ser un fragmento biológicamente activo de Neuritina, tal como los aminoácidos 25-115, 25-143, los aminoácidos 1-115, o similares.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa una secuencia de ADNc de Neuritina de rata (SEC ID Nº:1).

La Figura 2 representa una secuencia de ADNc de Neuritina humana (SEC ID Nº:2).

La Figura 3 representa la secuencia de aminoácidos traducida de longitud completa de la Neuritina de rata (SEC ID Nº:3).

La Figura 4 representa la secuencia de aminoácidos traducida de longitud completa de la Neuritina humana (SEC ID Nº:4).

La Figura 5 representa dos transferencias Northern. La Figura 5A es una transferencia Northern de varios tejidos de rata sondados con una sonda de Neuritina. Las abreviaturas son c (corazón); ce (cerebro); b (bazo); p (pulmón); h (hígado); m (músculo); r (riñón), t (testículo). La Figura 5B es una transferencia Northern de varias regiones del cerebro de ratas control (-) o de ratas tratadas con ácido kaínico (+). Las abreviaturas son Cereb (cerebelo); Hip (hipocampo), GD (girus dentado). La transferencia fue sondada con una sonda de Neuritina.

La Figura 6 representa varias transferencias Northern. La Figura 6A muestra una transferencia Northern de neuronas de hipocampo y corticales de rata tratadas con BDNF, NT-3, FGF, AMPA, NMDA o KCl. Los controles "0" no recibieron tratamiento. La Figura 6B muestra una transferencia Northern de ARN de hipocampo y cortical obtenido de ratas inyectadas con solución salina ("S") o con BDNF ("B"). "O" indica sin tratamiento.

La Figura 7 es una gráfica del curso temporal de la inducción de los niveles de ARNm de Neuritina en neuronas de hipocampo de rata E-18 en respuesta al tratamiento con BDNF o KCl.

La Figura 8 representa dos transferencias Western sondadas con un anticuerpo contra Neuritina. La Figura 8A representa una transferencia Western de células CHO transfectadas con un plásmido control ("parental") o con un plásmido que contiene el gen que codifica la Neuritina humana de longitud completa (línea celular denominada "CHO 15.4"). "PI-PLC" se refiere a fosfinositol-fosfolipasa C, y "+" y "-" se refieren a la presencia o ausencia de PI-PLC. La Figura 8B representa una transferencia Western de varios tejidos de rata. La transferencia fue sondada con un anticuerpo hacia Neuritina. Las abreviaturas de los tejidos evaluados en esta transferencia se encuentran en el texto.

La Figura 9 representa cultivos de neuronas embrionarias de rata del hipocampo ("Hip") y corticales ("Cort") incubadas en presencia (+) o ausencia (-) de Neuritina. "DiI" se refiere al tratamiento con el colorante fluorescente lipofílico DiI.

Descripción detallada de la invención

Según se utiliza en la presente, el término "Neuritina" cuando se emplea para describir una molécula de ácido nucleico se refiere a un molécula de ácido nucleico o a un fragmento de la misma que (a) tiene la secuencia de nucleótidos como la presentada en la SEC ID Nº:1 o en la SEC ID Nº:2; (b) tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos un 70 por ciento idéntico, pero que puede ser al menos un 80 por ciento o un 90 por ciento idéntico, al polipéptido codificado por cualquiera de las SEC ID N^{os}:1 ó 2; (c) es una variante alélica existente de manera natural de (a) o (b); (d) es una variante de ácido nucleico de (a)-(c) producida según se proporciona en la presente; y/o (e) es complementaria a (a)-(d).

El porcentaje de identidad de secuencias puede ser determinado por métodos estándar que son utilizados comúnmente para comparar la similitud de la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. Utilizando un programa de ordenador tal como BLAST o FASTA, dos polipéptidos son alineados para determinar la coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (ya sea a lo largo de la longitud completa de una o de ambas secuencias, o a lo largo de una porción predeterminada de una o de ambas secuencias). Los programas proporcionan una penalización de apertura "por defecto" y una penalización por huecos "por defecto", y puede utilizarse una matriz de puntuación tal como PAM-250 (una matriz de puntuación estándar; ver Dayhoff y col., en: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suplemento 3 [1978]) junto con el programa de ordenador. Posteriormente puede calcularse el porcentaje de identidad como:

\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Número total de coincidencias idénticas\+\+\cr 
------------------------------------------------------------------------------------------------------------
\+ x \+ 100\cr  [longitud de la secuencia más larga en el tramo de
coincidencia] +\+\+\cr  [número de huecos introducidos en la
secuencia más larga para alinear las dos
secuencias]\+\+\cr}

Los polipéptidos que son al menos un 70 por ciento idénticos tendrán típicamente una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos. Normalmente, las sustituciones serán conservadoras con el fin de que tengan poco o ningún efecto sobre la carga neta global, la polaridad o la hidrofobicidad de la proteína, pero opcionalmente pueden incrementar la actividad de la Neuritina. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla I siguiente.

TABLA I Sustituciones de aminoácidos conservadoras

	Básicos:	arginina
		lisina
		histidina
	Ácidos:	ácido glutámico
		ácido aspártico
	Polares:	glutamina
		asparragina
	Hidrofóbicos:	leucina
		isoleucina
		valina
	Aromáticos:	fenilalanina
		triptófano
		tirosina
	Pequeños:	glicina
		alanina
		serina
		treonina
		metionina

El término "condiciones rigurosas" se refiere a la hibridación y lavado bajo condiciones que permiten la unión solamente de una molécula de ácido nucleico tal como una sonda oligonucleotídica o una sonda de una molécula de ADNc a secuencias altamente homólogas. Una solución de lavado rigurosa es NaCl 0,015 M, citrato Na 0,005 M y SDS 0,1 por ciento, utilizada a una temperatura de 55ºC-65ºC. Otra solución de lavado rigurosa es SSC 0,2 X y SDS 0,1 por ciento utilizada a una temperatura de entre 50ºC-65ºC. Cuando se utilizan sondas oligonucleotídicas para someter a selección bibliotecas de ADNc o genómicas, pueden utilizarse las condiciones de lavado rigurosas siguientes. Un protocolo utiliza SSC 6 X con un 0,05 por ciento de pirofosfato de sodio a una temperatura de 35ºC-62ºC, dependiendo de la longitud de la sonda oligonucleotídica. Por ejemplo, sondas de 14 pares de bases son lavadas a 35-40ºC, sondas de 17 pares de bases son lavadas a 45-50ºC, sondas de 20 pares de bases son lavadas a 52-57ºC y sondas de 23 pares de bases son lavadas a 57-63ºC. La temperatura puede ser incrementada 2-3ºC cuando la unión no específica de fondo aparece elevada. Un segundo protocolo utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para el lavado de sondas oligonucleotídicas. Una solución de lavado rigurosa es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y SDS 0,2 por ciento. La temperatura de lavado utilizando esta solución es una función de la longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases es lavada a 45-50ºC aproximadamente.

El término "proteína Neuritina" o "polipéptido Neuritina", según se utiliza en la presente, se refiere a cualquier proteína o polipéptido que tenga las propiedades descritas en la presente para Neuritina. El polipéptido Neuritina puede tener o no una metionina aminoterminal, dependiendo de la manera de la que sea preparado. A manera de ilustración, proteína Neuritina o polipéptido Neuritina se refiere a (1) una secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico descrita en cualquiera de los puntos (a)-(e) anteriores y fragmentos peptídicos o polipeptídicos derivados de la misma, (2) la secuencia de aminoácidos descrita en las SEC ID N^{os}:3 ó 4 y/o (3) derivados químicamente modificados así como variantes de las secuencias de ácido nucleico y/o de aminoácidos de las mismas según se proporcionan en la presente.

Según se utiliza en la presente, el término "fragmento de Neuritina" se refiere a un péptido o polipéptido que es menor que la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la proteína Neuritina que existe de forma natural, pero que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido Neuritina o la proteína Neuritina descritos anteriormente. Tal fragmento puede estar truncado en el extremo amino, en el extremo carboxi (tal como el dominio de anclaje a GPI que son los últimos 27 aminoácidos aproximadamente del polipéptido Neuritina) y/o internamente, y puede estar modificado químicamente. Preferiblemente, el fragmento de Neuritina será uno que conserve al menos los 6 residuos de cisteína. Tales fragmentos de Neuritina pueden ser preparados con o sin una metionina aminoterminal.

Según se utiliza en la presente, el término "derivado de Neuritina" o "variante de Neuritina" se refiere a un polipéptido Neuritina o a una proteína Neuritina que 1) han sido químicamente modificados como, por ejemplo, mediante la adición de polietilén glicol u otro compuesto y/o 2) contienen una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones en la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos en comparación con la Neuritina mostrada en las Figuras 3 ó 4.

Según se utilizan en la presente, los términos "polipéptido biológicamente activo" y "fragmento biológicamente activo" se refieren a un péptido o polipéptido que tiene la actividad de la Neuritina, esto es, estimula la neuritogénesis en cultivos neuronales de hipocampo o corticales.

Según se utilizan en la presente, los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a la cantidad de Neuritina necesaria para soportar una o más actividades biológicas de la Neuritina como las descritas anteriormente.

Los polipéptidos Neuritina que tienen utilidad en la práctica de la presente invención pueden ser polipéptidos de longitud completa existentes de manera natural, o polipéptido o péptidos truncados (esto es, "fragmentos"). Los polipéptidos o fragmentos pueden ser modificados químicamente, esto es, glicosilados, fosforilados y/o ligados a un polímero, según se describe más adelante, y pueden tener una metionina aminoterminal, dependiendo de cómo sean preparados. Además, los polipéptidos o fragmentos pueden ser variantes del polipéptido Neuritina existente de forma natural (esto es, pueden contener una o más deleciones, inserciones y/o sustituciones de aminoácidos en comparación con la Neuritina existente de forma natural).

El polipéptido Neuritina de longitud completa o un fragmento del mismo pueden ser preparados utilizando métodos bien conocidos de la tecnología de ADN recombinante tales como los presentados en Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) y/o en Ausubel y col., eds., (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY [1994]). Un gen o un ADNc que codifique la proteína Neuritina o un fragmento de la misma puede ser obtenido, por ejemplo, sometiendo a selección una biblioteca genómica o de ADNc, o mediante amplificación por PCR. Alternativamente, puede prepararse un gen que codifique el polipéptido Neuritina o un fragmento mediante síntesis química utilizando métodos bien conocidos por el técnico experto tales como los descritos por Engels y col. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]). Estos métodos incluyen, inter alia, el método del fosfotriéster, de las fosforamiditas y del H-fosfonato para la síntesis de ácidos nucleicos. Un método preferido para tal síntesis química es la síntesis apoyada por polímeros utilizando la química estándar de fosforamiditas. Típicamente, el ADN que codifica el polipéptido Neuritina tendrá varios cientos de nucleótidos de longitud. Pueden sintetizarse ácidos nucleicos mayores de 100 nucleótidos aproximadamente como varios fragmentos utilizando estos métodos. Los fragmentos pueden ser luego ligados entre sí para formar el polipéptido Neuritina de longitud completa. Normalmente, el fragmento de ADN que codifica el extremo amino del polipéptido tendrá un ATG que codifica un residuo de metionina. Esta metionina puede estar presente o no en la forma madura del polipéptido Neuritina, dependiendo de si el polipéptido producido en la célula huésped es secretado por esa célula.

En algunos casos, puede ser deseable preparar variantes de ácido nucleico y/o de aminoácidos de la Neuritina que existe de forma natural. Las variantes de ácido nucleico (en las que uno o más nucleótidos son diseñados para que difieran de la Neuritina de tipo salvaje o existente de forma natural) pueden ser producidas utilizando mutagénesis dirigida a un sitio o amplificación por PCR en la que el(los) cebador(es) tenga(n) las mutaciones puntuales deseadas (ver Sambrook y col., supra, y Ausubel y col., supra, para descripciones de técnicas de mutagénesis). Los métodos que utilizan síntesis química descritos por Engels y col., supra, pueden ser también utilizados para preparar tales variantes. Pueden utilizarse también otros métodos conocidos por el técnico experto. Las variantes de ácido nucleico preferidas son aquéllas que contienen sustituciones de nucleótidos responsables de la preferencia de codones en la célula huésped que va a ser utilizada para producir Neuritina. Otras variantes preferidas son aquéllas que codifican cambios de aminoácidos conservadores según se describió anteriormente (por ejemplo, en las que la carga o la polaridad de la cadena lateral de los aminoácidos existente de manera natural no se altera sustancialmente por la sustitución por un aminoácido diferente) en comparación con el tipo salvaje, y/o las diseñadas para generar nuevo(s) sitio(s) de glicosilación y/o fosforilación en la Neuritina o las diseñadas para eliminar sitio(s) de glicosilación y/o fosforilación existente(s) en la Neuritina.

El gen o el ADNc de la Neuritina puede ser insertado en un vector de expresión apropiado para la expresión en una célula huésped. El vector es seleccionado para que sea funcional en la célula huésped particular empleada (esto es, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped, de tal manera que puede tener lugar la amplificación del gen de la Neuritina y/o la expresión del gen). El polipéptido Neuritina o un fragmento del mismo puede ser amplificado/expresado en células huésped procarióticas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucarióticas. La selección de la célula huésped dependerá al menos en parte de si el polipéptido Neuritina o el fragmento del mismo va a estar glicosilado. Si es así, son preferibles células huésped de levadura, insecto o mamífero; las células de levadura glicosilarán el polipéptido y las células de insecto y mamífero pueden glicosilar y/o fosforilar el polipéptido como tiene lugar de manera natural en el polipéptido Neuritina (esto es, glicosilación y/o fosforilación "nativa").

Típicamente, los vectores utilizados en cualquiera de las células huésped contendrán una secuencia flanqueante 5' (referida también como "promotor") y también otros elementos reguladores tales como intensificador(es), un elemento origen de replicación, un elemento de terminación de la transcripción, una secuencia intrónica completa conteniendo un sitio donante y aceptor de ayuste, una secuencia peptídica señal, un elemento sitio de unión de ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región poliadaptadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que va a ser expresado y un elemento marcador seleccionable. Cada uno de estos elementos se discute más adelante. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia "marca", esto es, una secuencia oligonucleotídica situada en el extremo 5' o 3' de la secuencia codificadora de Neuritina que codifica poliHis (tal como hexaHis) u otra secuencia inmunogénica pequeña. Esta marca será expresada junto con la proteína y puede servir como marca de afinidad para la purificación del polipéptido Neuritina procedente de la célula huésped. Opcionalmente, la marca puede ser eliminada posteriormente del polipéptido Neuritina purificado por varios medios tal como mediante la utilización, por ejemplo, de una peptidasa seleccionada.

La secuencia flanqueante 5' puede ser homóloga (esto es, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heteróloga (esto es, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula huésped), híbrida (esto es, una combinación de secuencias flanqueantes 5' procedentes de más de una fuente), sintética, o puede ser la secuencia flanqueante 5' de la Neuritina nativa. Por tanto, la fuente de la secuencia flanqueante 5' puede ser cualquier organismo unicelular procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier planta, con la condición de que la secuencia flanqueante 5' sea funcional en, y pueda ser activada por, la maquinaria de la célula huésped.

Las secuencias flanqueantes 5' útiles en los vectores de esta invención pueden ser obtenidas mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias flanqueantes 5' útiles en la presente, distintas de la secuencia flanqueante 5' de la Neuritina, habrán sido identificadas previamente mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción y pueden ser de este modo aisladas de la fuente tisular apropiada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleótidos completa de la secuencia flanqueante 5'. En la presente, la secuencia flanqueante 5' puede ser sintetizada utilizando los métodos descritos anteriormente para la síntesis o el clonaje de ácidos nucleicos.

Cuando se conoce toda o solamente una porción de la secuencia flanqueante 5', puede ser obtenida utilizando PCR y/o sometiendo a selección una biblioteca genómica con el oligonucleótido adecuado y/o con fragmentos adecuados de la secuencia flanqueante 5' de la misma especie o de otra especie.

Cuando no se conoce la secuencia flanqueante 5', puede aislarse un fragmento de ADN que contenga una secuencia flanqueante 5' de una fracción de ADN más grande que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificadora o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede ser realizado mediante digestión con endonucleasas de restricción utilizando uno o más enzimas cuidadosamente seleccionados para aislar el fragmento de ADN correcto. Después de la digestión, el fragmento deseado puede ser aislado mediante purificación en gel de agarosa, en una columna Qiagen® o con otros métodos conocidos por el técnico experto. La selección de los enzimas adecuados para alcanzar este fin será fácilmente obvia para una persona con experiencia habitual en la técnica.

El elemento origen de replicación es típicamente una parte de vectores de expresión procarióticos adquiridos comercialmente, y facilita la amplificación del vector en una célula huésped. La amplificación del vector hasta un cierto número de copias puede ser, en algunos casos, importante para la expresión óptima del polipéptido Neuritina. Si el vector de elección no contiene un sitio origen de replicación, puede sintetizarse uno químicamente sobre la base de una secuencia conocida y ligarse en el vector.

El elemento de terminación de la transcripción está situado típicamente 3' respecto al extremo de la secuencia que codifica el polipéptido Neuritina y sirve para terminar la transcripción del polipéptido Neuritina. Normalmente, el elemento de terminación de la transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli T. Aunque el elemento es fácilmente clonado a partir de una biblioteca o incluso es adquirido comercialmente como parte de un vector, puede ser también sintetizado fácilmente utilizando métodos de síntesis de ácidos nucleicos tales como los descritos anteriormente.

Un elemento gen marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos o a otras toxinas, por ejemplo, a ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huésped procarióticas, (b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en medios complejos. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina.

El elemento de unión a ribosomas, denominado comúnmente secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o secuencia de Kozak (eucariotas), es necesario para el inicio de la traducción del ARNm. El elemento está situado típicamente 3' respecto al promotor y 5' respecto a la secuencia codificadora del polipéptido Neuritina que va a ser sintetizado. La secuencia de Shine-Dalgarno varía pero típicamente es una polipurina (esto es, tiene un alto contenido en A-G). Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede ser fácilmente sintetizada utilizando los métodos expuestos anteriormente y utilizada en un vector procariótico.

En aquellos casos en los que es deseable que la Neuritina sea secretada por la célula huésped, puede utilizarse una secuencia señal para dirigir el polipéptido Neuritina hacia el exterior de la célula huésped en la que es sintetizado, y la parte carboxi-terminal de la proteína puede ser eliminada con el fin de impedir el anclaje en la membrana. Típicamente, la secuencia señal está situada en la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico de la Neuritina, o directamente en el extremo 5' de la región codificadora de la Neuritina. Se han identificado muchas secuencias señal y puede utilizarse cualquiera de las mismas que sea funcional en la célula huésped seleccionada junto con el gen de la Neuritina. Por tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga respecto al polipéptido Neuritina, y puede ser homóloga o heteróloga respecto al polipéptido Neuritina. Adicionalmente, la secuencia señal puede ser sintetizada químicamente utilizando los métodos descritos anteriormente. En la mayoría de los casos, la secreción del polipéptido a partir de la célula huésped por la presencia de un péptido señal, tendrá como resultado la eliminación de la metionina aminoterminal del polipéptido. Para facilitar la secreción, puede eliminarse la región C-terminal del polipéptido Neuritina. Esta región C-terminal tiene 27 aminoácidos de longitud aproximadamente, y muchos de los aminoácidos son hidrofóbicos; además, existe una secuencia señal de corte consenso que se encuentra en muchas proteínas ancladas a glicosilfosfatidilinositol (GPI) en esta región.

En muchos casos, la transcripción del polipéptido Neuritina es incrementada por la presencia de uno o más intrones en el vector; esto es particularmente cierto para las células huésped eucarióticas, especialmente para las células huésped de mamífero. El intrón puede estar presente de manera natural en la secuencia de ácido nucleico de la Neuritina, especialmente cuando la secuencia de Neuritina utilizada es una secuencia genómica de longitud completa o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no existe de manera natural en la secuencia de ADN de la Neuritina (como en la mayoría de los ADNcs) el(los) intrón(es) puede(n) ser obtenido(s) de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la secuencia flanqueante 5' y a la secuencia codificadora de Neuritina es importante, ya que el intrón debe ser transcrito para que sea eficaz. Por tanto, cuando la secuencia de ácido nucleico de la Neuritina es una secuencia de ADNc, la posición preferida para el intrón es 3' respecto al sitio de inicio de la transcripción y 5' respecto a la secuencia de terminación de la transcripción poliA. Preferiblemente, para los ADNcs de Neuritina el intrón estará situado en un lado o en el otro (esto es, 5' o 3') de la secuencia codificadora de Neuritina, de tal manera que no interrumpa esta secuencia codificadora. Puede utilizarse cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo vírico, procariótico o eucariótico (planta o animal), para practicar esta invención, con la condición de que sea compatible con la(s) célula(s) huésped en la(s) que se ha insertado. Están también incluidos en la presente intrones sintéticos. Opcionalmente, puede utilizarse más de un intrón en el vector.

Cuando uno o más de los elementos descritos anteriormente no estén ya presentes en el vector que va a ser utilizado, pueden ser obtenidos individualmente y ligados al vector. Los métodos utilizados para obtener cada uno de los elementos son bien conocidos por el técnico experto y son comparables a los métodos descritos anteriormente (esto es, síntesis del ADN, selección de una biblioteca y similares).

Los vectores finales utilizados para practicar esta invención son construidos típicamente a partir de un vector de partida tal como un vector comercialmente disponible. Tales vectores pueden contener o no algunos elementos que han de ser incluidos en el vector completo. Si no está presente ninguno de los elementos deseados en el vector de partida, cada elemento puede ser ligado individualmente en el vector cortando el vector con endonucleasa(s) de restricción apropiada(s), de tal manera que los extremos del elemento que va a ser ligado en el vector y los extremos del vector sean compatibles para la ligadura. En algunos casos, puede ser necesario "hacer romos" los extremos que van a ser ligados entre sí con el fin de obtener una ligadura satisfactoria. La conversión de los extremos en romos se realiza rellenando primeramente los "extremos cohesivos" utilizando ADN polimerasa Klenow o ADN polimerasa de T4 en presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento es bien conocido en la técnica y está descrito en, por ejemplo, Sambrook y col., supra.

Alternativamente, dos o más de los elementos que van a ser insertados en el vector pueden ser ligados primeramente entre sí (si van a estar situados adyacentemente y ligados posteriormente al vector.

Otro método para construir el vector es realizar todas las ligaduras de los diferentes elementos simultáneamente en una mezcla de reacción. Aquí, se generarán muchos vectores sin sentido o no funcionales debido a una ligadura incorrecta o a una inserción incorrecta de los elementos, sin embargo, el vector funcional puede ser identificado y seleccionado mediante digestión con endonucleasas de restricción.

Los vectores preferidos para practicar esta invención son aquéllos que son compatibles con células huésped bacterianas, de insecto y de mamífero. Tales vectores incluyen, inter alia, pCRII (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA) y pETL (BlueBacII; Invitrogen).

Una vez que se ha construido el vector y se ha insertado un ácido nucleico de Neuritina en el sitio correcto del vector, el vector completado puede ser insertado en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o la expresión del polipéptido Neuritina.

Las células huésped pueden ser células huésped procarióticas (tales como E. coli) o células huésped eucarióticas (tales como células de levadura, células de insecto o células de vertebrado). La célula huésped, cuando es cultivada bajo condiciones apropiadas, puede sintetizar la proteína Neuritina que puede ser recogida posteriormente del medio de cultivo (si la célula huésped la secreta al medio) o directamente de la célula huésped que la produce (si no es secretada). Después de ser recogida, la proteína Neuritina puede ser purificada utilizando métodos tales como cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de afinidad y similares.

La selección de la célula huésped dependerá en parte de si la proteína Neuritina va a estar glicosilada o fosforilada (en cuyo caso se prefieren las células huésped eucarióticas) y de la manera en la cual la célula huésped es capaz de "plegar" la proteína para formar su estructura terciaria nativa (por ejemplo, la orientación apropiada de los puentes disulfuro, etc.) de tal manera que la célula prepare una proteína biológicamente activa. Sin embargo, cuando la célula huésped no sintetiza Neuritina biológicamente activa, la Neuritina puede ser "plegada" después de la síntesis utilizando las condiciones químicas apropiadas, según se discute posteriormente.

Las células o líneas celulares adecuadas pueden ser células de mamífero, tales como las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células 3T3. La selección de células huésped de mamífero adecuadas y los métodos de transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y purificación del producto son conocidos en la técnica. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas son las líneas celulares de mono COS-1 y COS-7, y la línea celular CV-1. Células huésped de mamífero ejemplares adicionales incluyen líneas celulares de primate y líneas celulares de roedor, incluyendo líneas de células transformadas. Son también adecuadas células diploides normales, cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, así como explantes primarios. Las células candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúe de manera dominante. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, líneas celulares de hámster BHK o HaK.

De manera similar, son útiles como células huésped adecuadas para la presente invención células bacterianas. Por ejemplo, las diferentes cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, DH5\alpha, DH10 y MC1061) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. Pueden emplearse también en este método varias cepas de B. subtilis, especies de Pseudomonas, otras especies de Bacillus, especies de Streptomyces y similares.

Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica están también disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Adicionalmente, cuando se desee, pueden utilizarse células de insecto como células huésped en el método de la presente invención (Miller y col., Genetic Engineering, 8:277-298 [1986]).

La inserción (referida también como "transformación" o "transfección") del vector en la célula huésped seleccionada puede ser realizada utilizando métodos tales como el método del cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o el método del DEAE-dextrano. El método seleccionado será en parte función del tipo de célula huésped que va a ser utilizado. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el técnico experto, y están descritos en, por ejemplo, Sambrook y col., supra.

Las células huésped que contienen el vector (esto es, transformadas o transfectadas) pueden ser cultivadas utilizando medios estándar bien conocidos por el técnico experto. El medio contendrá normalmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células. Medios adecuados para el cultivo de células de E. coli son, por ejemplo, el Caldo Luria (LB) y/o el Caldo Terrific (TB). Medios adecuados para el cultivo de células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden ser suplementados con suero y/o factores de crecimiento según se requiera por la línea celular particular que esté siendo cultivada. Un medio adecuado para cultivos de insecto es el medio de Grace suplementado con yeastolato, hidrolizado de lactoalbúmina y/o suero de ternera fetal, según sea necesario.

Típicamente, se añade como suplemento al medio un anticuerpo u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de solamente las células transformadas. El compuesto a utilizar será dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el que la célula huésped fue transformada. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es resistencia a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina.

La cantidad de polipéptido Neuritina producida en la célula huésped puede ser evaluada utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis de transferencia Western, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separación por HPLC, inmunoprecipitación y/o ensayos de actividad tales como ensayos de unión a ADN por desplazamiento en gel.

Si el polipéptido Neuritina ha sido diseñado para ser secretado por las células huésped, la mayoría del polipéptido se encontrará probablemente en el medio del cultivo celular. Los polipéptidos preparados de esta forma típicamente no poseerán una metionina aminoterminal, ya que ésta es eliminada durante la secreción por la célula. Si, sin embargo, el polipéptido Neuritina no es secretado por las células huésped, estará presente en el citoplasma (para células huésped eucarióticas, bacterias gram positivas y células huésped de insecto) o en el periplasma (para células huésped bacterias gram negativas) y puede tener una metionina aminoterminal.

Para la proteína Neuritina intracelular, las células huésped son típicamente destruidas primeramente mecánicamente u osmóticamente para liberar el contenido citoplásmico a una solución tamponada. El polipéptido Neuritina puede ser aislado posteriormente de esta solución.

La purificación del polipéptido Neuritina de la solución puede ser realizada utilizando una variedad de técnicas. Si el polipéptido ha sido sintetizado de manera que contenga una marca tal como Hexahistidina (Neuritina/hexaHis) u otro péptido pequeño en su extremo carboxilo o amino, puede ser purificado esencialmente en un proceso de una etapa pasando la solución a través de una columna de afinidad en la que la matriz de la columna tenga una afinidad elevada por la marca o directamente por el polipéptido (esto es, un anticuerpo monoclonal que reconozca específicamente Neuritina). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y específicamente al níquel, por tanto puede utilizarse una columna de afinidad de níquel (tales como las columnas de níquel de Qiagen) para la purificación de Neuritina/poliHis. (Ver por ejemplo, Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]).

Cuando el polipéptido Neuritina no tiene marca y no hay anticuerpos disponibles, pueden utilizarse otros procedimientos de purificación bien conocidos. Tales procedimientos incluyen, sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de tamiz molecular, HPLC, electroforesis en gel nativo en combinación con elución del gel y enfoque isoeléctrico preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific). En algunos casos, pueden combinarse dos o más de estas técnicas para conseguir una pureza incrementada. Los métodos preferidos de purificación incluyen el marcaje con polihistidina y la cromatografía de intercambio iónico en combinación con enfoque isoeléctrico preparativo.

Si se prevé que el polipéptido Neuritina será encontrado primariamente en el espacio periplásmico de las bacterias o en el citoplasma de las células eucarióticas, el contenido del periplasma o del citoplasma, incluyendo los cuerpos de inclusión (por ejemplo, bacterias gram negativas) si el polipéptido procesado ha formado tales complejos, puede ser extraído de la célula huésped utilizando cualquier técnica estándar conocida por el técnico experto. Por ejemplo, las células huésped pueden ser lisadas para liberar el contenido del periplasma mediante una prensa francesa, homogeneización y/o sonicación. El homogenado puede ser luego centrifugado.

Si el polipéptido Neuritina ha formado cuerpos de inclusión en el periplasma, los cuerpos de inclusión pueden unirse a menudo a las membranas celulares interna y/o externa y por tanto será encontrado primariamente en el material aglutinado después de la centrifugación. El material aglutinado puede ser tratado posteriormente con un agente caotrópico tal como guanidina o urea para liberar, romper y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido Neuritina en su forma ahora soluble puede ser luego analizado utilizando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea aislar el polipéptido Neuritina, el aislamiento puede ser realizado utilizando métodos estándar tales como los descritos posteriormente y en Marston y col. (Meth. Enz., 182:264-275 [1990]).

Si no se forman en un grado significativo cuerpos de inclusión del polipéptido Neuritina en el periplasma de la célula huésped, el polipéptido Neuritina será encontrado primariamente en el sobrenadante después de la centrifugación del homogenado celular y el polipéptido Neuritina puede ser aislado del sobrenadante utilizando métodos tales como los presentados más adelante.

En aquellas situaciones en las que es preferible aislar parcialmente o completamente el polipéptido Neuritina, la purificación puede ser realizada utilizando métodos estándar bien conocidos por el técnico experto. Tales métodos incluyen, sin limitación, separación mediante electroforesis seguida por electroelución, varios tipos de cromatografía (inmunoafinidad, tamiz molecular y/o intercambio iónico) y/o cromatografía líquida de alta presión. En algunos casos, puede ser preferible utilizar más de uno de estos métodos para la purificación completa.

Además de preparar y purificar el polipéptido Neuritina utilizando técnicas de ADN recombinante, los polipéptidos Neuritina, los fragmentos y/o los derivados del mismo pueden ser preparados mediante métodos de síntesis química (tales como síntesis peptídica en fase sólida) utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los presentados por Merrifield y col. (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1964]), Houghten y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]) y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL (1984)]. Tales polipéptidos pueden ser sintetizados con o sin una metionina en el extremo amino. Los polipéptidos Neuritina o los fragmentos sintetizados químicamente pueden ser oxidados utilizando los métodos presentados en estas referencias para formar puentes disulfuro. Los polipéptidos Neuritina o los fragmentos pueden ser empleados como sustitutos biológicamente activos o inmunológicos de los polipéptidos Neuritina purificados naturales en procesos terapéuticos e inmunológicos.

Las composiciones de Neuritina químicamente modificada (esto es, "derivados") en las que el polipéptido Neuritina está unido a un polímero ("Neuritina-polímeros") están incluidas en el ámbito de la presente invención. El polímero seleccionado es típicamente soluble en agua, con el fin de que la proteína a la que está unido no precipite en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. El polímero seleccionado es normalmente modificado para que tenga un único grupo reactivo, tal como un éster activo para acilación o un aldehído activo para alquilación, de tal manera que el grado de polimerización pueda ser controlado según se proporciona en los presentes métodos. Un aldehído reactivo preferido es polietilén glicol propionaldehído, que es estable en agua, o los derivados mono alcoxi C1-C10 o ariloxi del mismo (ver la Patente de EE.UU. 5.252.714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Dentro del ámbito de los Neuritina-polímeros está incluida una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. El polímero soluble en agua o la mezcla de los mismos pueden ser seleccionados del grupo que consta de, por ejemplo, polietilén glicol (PEG), monometoxi-polietilén glicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil pirrolidona) polietilén glicol, homopolímeros de polietilén glicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico. Para las reacciones de acilación, el(los) polímero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un único grupo éster reactivo. Para alquilación reductora, el(los) polímero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un único grupo aldehído reactivo. El polímero puede tener cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado.

La pegilación de Neuritina puede ser llevada a cabo mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica, según está descrito por ejemplo en las referencias siguientes: Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; y EP 0 401 384. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o de una reacción de alquilación con una molécula reactiva de polietilén glicol (o con un polímero soluble en agua reactivo análogo) según se describe a continuación.

La pegilación por acilación implica generalmente la reacción de un derivado éster activo de polietilén glicol (PEG) con una proteína Neuritina. Puede utilizarse cualquier molécula de PEG reactiva conocida o descubierta posteriormente para llevar a cabo la pegilación de la Neuritina. Un éster de PEG activado preferido es PEG esterificado con N-hidroxisuccinimida ("NHS"). Según se utiliza en la presente, se contempla que "acilación" incluya sin limitación los tipos de enlace siguientes entre Neuritina y un polímero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano y similares, según está descrito en Bioconjugate Chem., 5:133-140 (1994). Las condiciones de reacción pueden ser seleccionadas de cualquiera de las conocidas en la técnica de pegilación o de las que se desarrollen posteriormente, siempre que se eviten aquellas condiciones tales como temperatura, solvente y pH que inactiven la especie de Neuritina a modificar.

La pegilación por acilación tiene como resultado normalmente un producto Neuritina polipegilada, en el que los grupos \epsilon-amino de la lisina son pegilados a través de un grupo de unión acilo. Preferiblemente, el enlace de conexión será una amida. También preferiblemente, el producto resultante estará al menos un 95 por ciento aproximadamente mono, di o tripegilado. Sin embargo, se formarán normalmente algunas especies con grados mayores de pegilación (hasta el número máximo de grupos \epsilon-amino de las lisinas de la Neuritina más un grupo \alpha-amino en el extremo amino de la Neuritina) en cantidades que dependen de las condiciones de reacción específicas utilizadas. Si se desea, las especies pegiladas más purificadas pueden ser separadas de la mezcla, particularmente de las especies no reaccionadas, mediante técnicas estándar de purificación, incluyendo, entre otras, diálisis, desplazamiento salino, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y electroforesis.

La pegilación por alquilación implica generalmente la reacción de un derivado aldehído terminal de PEG con una proteína tal como Neuritina en presencia de un agente reductor. Independientemente del grado de pegilación, los grupos de PEG son unidos preferiblemente a la proteína a través de un grupo -CH_{2}-NH-. Con referencia particular al grupo -CH_{2}-, este tipo de enlace es referido en la presente como un enlace "alquilo".

La derivatización mediante alquilación reductora para producir un producto monopegilado, aprovecha la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al N-terminal) disponibles para derivatización en la Neuritina. Típicamente, la reacción se realiza a un pH (ver más adelante) que permite aprovechar las diferencias de pK_{a} entre los grupos \epsilon-amino de los residuos de lisina y el del grupo \alpha-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante tal derivatización selectiva, se controla la unión a una proteína de un polímero soluble en agua que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la proteína sin modificación significativa de otros grupos reactivos tales como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. La presente invención proporciona una preparación sustancialmente homogénea de moléculas de conjugado proteína Neuritina-monopolímero, indicando una proteína Neuritina a la que se ha unido sustancialmente sólo una molécula de polímero (esto es al menos un 95% aproximadamente) en una única posición en la proteína Neuritina. Más específicamente, si se utiliza polietilén glicol, la presente invención proporciona también proteína Neuritina pegilada que carece posiblemente de grupos de unión antigénicos, y que tiene acoplada la molécula de polietilén glicol directamente a la proteína Neuritina.

Un polímero soluble en agua particularmente preferido para ser utilizado en la presente es polietilén glicol, abreviado PEG. Según se utiliza en la presente, polietilén glicol tiene la intención de incluir cualquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para derivatizar otras proteínas, tales como mono-alcoxi (C1-C10)- o ariloxi-polietilén glicol.

En general, la derivatización química puede ser realizada bajo cualquier condición adecuada utilizada para hacer reaccionar una sustancia biológicamente activa con una molécula de polímero activado. Los métodos para preparar Neuritina pegilada comprenderán generalmente las etapas de (a) reacción de un polipéptido Neuritina con polietilén glicol (tal como un derivado éster o aldehído reactivo de PEG) bajo condiciones mediante las cuales la Neuritina resulta unida a uno o más grupos del PEG, y (b) la obtención del(los) producto(s) de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación serán determinadas sobre la base de parámetros conocidos y del resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor sea la proporción PEG:proteína, mayor será el porcentaje de producto polipegilado.

La alquilación reductora para producir una población sustancialmente homogénea de moléculas de conjugado monopolímero/proteína Neuritina comprenderá generalmente las etapas de: (a) reacción de una proteína Neuritina con una molécula de PEG reactiva bajo condiciones de alquilación reductora, a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo \alpha-amino del extremo amino de dicha proteína Neuritina; y (b) la obtención del(los) producto(s) de reacción.

Para una población sustancialmente homogénea de moléculas de conjugado monopolímero/proteína Neuritina, las condiciones de la reacción de alquilación reductora son aquéllas que permitan la unión selectiva del resto polimérico soluble en agua al extremo N de la Neuritina. Tales condiciones de reacción proporcionan generalmente diferencias de pK_{a} entre los grupos amino de la lisina y el grupo \alpha-amino del extremo N (siendo el pK_{a} el pH al cual el 50% de los grupos amino están protonados y el 50% no lo están). El pH afecta también a la proporción a utilizar de polímero respecto a proteína. En general, si el pH es más bajo, se deseará un exceso mayor de polímero respecto a proteína (esto es, cuanto menos reactivo sea el grupo \alpha-amino N-terminal, más polímero se necesitará para conseguir las condiciones óptimas). Si el pH es más elevado, la proporción polímero:proteína no necesita ser tan grande (esto es, están disponibles más grupos reactivos, por lo que se necesitan menos moléculas de polímero). Para los fines de la presente invención, el pH estará generalmente en el rango de 3-9, preferiblemente 3-6.

Otra consideración importante es el peso molecular del polímero. En general, cuanto mayor sea el peso molecular del polímero, habrá un menor número de moléculas de polímero que puedan ser unidas a la proteína. De manera similar, debe tenerse en cuenta la ramificación del polímero cuando se optimizan estos parámetros. Generalmente, a mayor peso molecular (o a más ramas) mayor será la proporción polímero:proteína. En general, para las reacciones de pegilación contempladas en la presente, el peso molecular medio preferido es de 2 kDa aproximadamente a 100 kDa aproximadamente (indicando el término "aproximadamente" \pm 1 kDa). El peso molecular medio preferido es de 5 kDa aproximadamente a 50 kDa aproximadamente, preferiblemente de manera particular de 12 kDa aproximadamente a 25 kDa aproximadamente. La proporción de polímero soluble en agua respecto a la proteína Neuritina variará generalmente desde 1:1 a 100:1, preferiblemente (para polipegilación) de 1:1 a 20:1 y (para monopegilación) de 1:1 a 5:1.

Utilizando las condiciones indicadas anteriormente, la alquilación reductora proporcionará la unión selectiva del polímero a cualquier proteína Neuritina que tenga un grupo \alpha-amino en el extremo amino, y proporcionará una preparación sustancialmente homogénea de conjugado monopolímero/proteína Neuritina. El término "conjugado de monopolímero/proteína Neuritina" es utilizado en la presente para indicar una composición compuesta por una única molécula de polímero unida a una molécula de proteína Neuritina. El conjugado de monopolímero/proteína Neuritina tendrá preferiblemente una molécula de polímero situada en el extremo N, pero no en los grupos amino laterales de las lisinas. La preparación tendrá preferiblemente más de un 90% de conjugado monopolímero/proteína Neuritina, y más preferiblemente más de un 95% de conjugado de monopolímero/proteína Neuritina, no habiendo reaccionado el resto de las moléculas observables (esto es, proteína sin el resto polimérico). Los ejemplos siguientes proporcionan una preparación que tiene al menos un 90% aproximadamente de conjugado de monopolímero/proteína y un 10% aproximadamente de proteína no reaccionada. El conjugado de monopolímero/proteína tiene actividad biológica.

Para la presente alquilación reductora, el agente reductor debe ser estable en reducción acuosa y preferiblemente será capaz de reducir solamente la base de Schiff formada en el proceso inicial de alquilación reductora. Los agentes reductores preferidos pueden ser seleccionados del grupo que consta de borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, dimetilamina borano, trimetilamina borano y piridina borano. Un agente reductor particularmente preferido es cianoborohidruro de sodio.

Otros parámetros de la reacción tales como el solvente, los tiempos de reacción, las temperaturas, etc., y los medios de purificación de los productos, pueden ser determinados sobre la base de la información publicada relativa a la derivatización de proteínas con polímeros solubles en agua.

Una mezcla de moléculas de conjugado de polímero/proteína Neuritina puede ser preparada mediante métodos de acilación y/o alquilación según se describió anteriormente, y puede seleccionarse la proporción de conjugado de monopolímero/proteína para incluir en la mezcla. Por tanto, cuando se desee, puede prepararse una mezcla de varias proteínas con varios números de moléculas de polímero unidas (esto es, di, tri, tetra, etc.) y combinarse con el material del conjugado de monopolímero/proteína Neuritina preparado utilizando los presentes métodos.

Generalmente, las condiciones que pueden ser aliviadas o moduladas mediante la administración del presente conjugado de polímero/Neuritina incluyen las descritas en la presente para las moléculas de Neuritina en general. Sin embargo, las moléculas de polímero/Neuritina descritas en la presente pueden tener actividades adicionales, actividades incrementadas o reducidas u otras características en comparación con las moléculas no derivatizadas.

Las moléculas de ácido nucleico de la Neuritina, los fragmentos y/o los derivados que no codifiquen polipéptidos que sean activos en ensayos de actividad pueden ser útiles como sondas de hibridación en ensayos de diagnóstico para determinar, cualitativamente o cuantitativamente, la presencia de ADN o ARN de Neuritina en muestras de tejido o de fluidos corporales de mamífero.

Los fragmentos y/o derivados del polipéptido Neuritina que no sean activos en los ensayos de actividad pueden ser útiles como moduladores (por ejemplo, inhibidores o estimulantes) de los receptores de Neuritina in vitro o in vivo, o para preparar anticuerpos hacia polipéptidos Neuritina.

Los polipéptidos Neuritina y los fragmentos de los mismos, estén o no modificados químicamente, pueden ser empleados solos o en combinación con otras composiciones farmacéuticas tales como, por ejemplo, factores neurotróficos, citoquinas, interferones, interleuquinas, factores de crecimiento, antibióticos, antiinflamatorios, agonistas o antagonistas de receptores de neurotransmisores y/o anticuerpos, en el tratamiento de enfermedades del sistema neurológico.

Los polipéptidos Neuritina y/o los fragmentos de los mismos pueden ser utilizados para preparar anticuerpos generados mediante métodos estándar. Así, anticuerpos que reaccionan con los polipéptidos Neuritina, así como fragmentos reactivos de tales anticuerpos, son también contemplados como dentro del ámbito de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de una sola cadena y/o biespecíficos. Típicamente, el anticuerpo o el fragmento del mismo será "humanizado", esto es, preparado a fin de prevenir o minimizar una reacción inmune hacia el anticuerpo cuando es administrado a un paciente. El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier fragmento que sea reactivo con la Neuritina de la presente invención, tal como F_{ab}, F_{ab'}, etc. Están también proporcionados por esta invención los hibridomas generados mediante la presentación de Neuritina o de un fragmento de la misma como antígeno a un mamífero seleccionado, seguido por la fusión de células (por ejemplo, células esplénicas) del animal con ciertas células cancerosas para crear líneas celulares inmortalizadas mediante técnicas conocidas. Los métodos empleados para generar tales líneas celulares y tales anticuerpos dirigidos contra todo o contra porciones de un polipéptido Neuritina humana de la presente invención, están también abarcados por esta invención.

Los anticuerpos pueden ser utilizados terapéuticamente, tal como para inhibir la unión de Neuritina a su receptor. Los anticuerpos pueden ser utilizados además para fines de diagnóstico in vivo e in vitro, tal como en forma marcada para detectar la presencia de Neuritina en un fluido corporal.

Composiciones terapéuticas y administración

Están dentro del ámbito de la presente invención composiciones terapéuticas para el tratamiento de varias enfermedades del sistema neurológico. Tales composiciones pueden contener una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido Neuritina o de un fragmento del mismo (cualquiera de los cuales puede estar modificado químicamente) en mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. El material del vehículo puede ser agua para inyección, preferiblemente suplementada con otros materiales comunes en soluciones para la administración a mamíferos. Típicamente, un compuesto terapéutico con Neuritina será administrado en forma de una composición que contenga proteína purificada (que puede estar modificada químicamente) junto con uno o más vehículos, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con seroalbúmina son ejemplos de vehículos adecuados. Preferiblemente, el producto es formulado como un liofilizado utilizando excipientes apropiados (por ejemplo, sacarosa). Pueden incluirse si se desea otros vehículos, diluyentes y excipientes estándar. Otras composiciones ejemplares contienen tampón Tris de pH 7,0-8,5 aproximadamente, o tampón acetato de pH 4,0-5,5 aproximadamente, que pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado del mismo.

Las composiciones de Neuritina pueden ser administradas sistémicamente por vía parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden ser administradas intravenosamente o subcutáneamente. Cuando son administradas sistémicamente, las composiciones terapéuticas para ser utilizadas en esta invención pueden estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógenos. La preparación de tales soluciones de proteína farmacéuticamente aceptables, con respecto al pH, a la isotonicidad, a la estabilidad y similares, está dentro de la experiencia en la técnica.

Las formulaciones terapéuticas de las composiciones de Neuritina útiles para la práctica de la presente invención pueden ser preparadas para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tenga el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]) en forma de una masa liofilizada o de una solución acuosa. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores y son preferiblemente inertes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como Tween, Pluronics o polietilén glicol (PEG).

La composición de Neuritina para ser utilizada en administración in vivo debe ser estéril. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril. Cuando la composición de Neuritina está liofilizada, la esterilización utilizando estos métodos puede ser llevada a cabo antes o después de la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral será almacenada normalmente en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas son colocadas generalmente en un recipiente que tenga una abertura de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración de la composición está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo oral, inyección o infusión por vía intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intrecerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional, o mediante sistemas de liberación mantenida o mediante la implantación de un dispositivo que puede implicar opcionalmente la utilización de un catéter. Cuando se desee, las composiciones pueden ser administradas continuamente mediante infusión, inyección de un bolo o mediante un dispositivo de implantación. Alternativamente, o adicionalmente, la Neuritina puede ser administrada localmente mediante la implantación en el área afectada de una membrana, esponja, u otro material apropiado sobre el que se haya absorbido el polipéptido Neuritina.

Cuando se utiliza un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado en un tejido u órgano adecuado, tal como, por ejemplo, en un ventrículo cerebral o en el parénquina cerebral y la administración de Neuritina puede ser directamente a través del dispositivo mediante un bolo o por administración continua, o a través de un catéter utilizando infusión continua.

El polipéptido Neuritina puede ser administrado en una formulación o preparación de liberación mantenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos perfilados, por ejemplo películas o microcápsulas. Las matrices de liberación mantenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (U.S. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros del ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22:547-556 [1983]), poli(2-hidroxietil-metacrilato) (Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)], acetato de etilén vinilo (Langer y col., supra) o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988). Las composiciones de liberación mantenida pueden incluir también liposomas, los cuales pueden ser preparados mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, DE 3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 [1985]; Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 [1980]; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949).

El algunos casos, puede ser deseable utilizar las composiciones de Neuritina de manera ex vivo, esto es, tratar células o tejidos que han sido extraídos del paciente y que son luego posteriormente implantados de nuevo en el paciente.

En otros casos, la Neuritina puede ser suministrada mediante la implantación en los pacientes de ciertas células que han sido manipuladas genéticamente (utilizando los métodos descritos anteriormente) para que expresen y secreten el polipéptido Neuritina. Tales células pueden ser células humanas, y pueden proceder del propio tejido del paciente o de otra fuente, humana o no humana. Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Las células pueden ser implantadas en el cerebro, en la glándula adrenal o en otros tejidos u órganos corporales.

En ciertas situaciones, puede ser deseable utilizar métodos de terapia génica para la administración de Neuritina a pacientes que padezcan ciertas enfermedades neurológicas. En estas situaciones, ADN genómico, ADNc y/o ADN sintético que codifiquen Neuritina o un fragmento o variante de la misma, pueden ser unidos operativamente a un promotor constitutivo o inducible que sea activo en el tejido en el que la composición será inyectada. Esta construcción de ADN de Neuritina, insertada en un vector o sola sin vector, puede ser inyectada directamente en el cerebro o en otro tejido, neuronal o no neuronal.

Alternativamente, una construcción de ADN de Neuritina puede ser inyectada directamente en tejido muscular en el que puede ser captada por las células y expresada en las células, con la condición de que el ADN de Neuritina esté unido operativamente a un promotor que sea activo en el tejido muscular tal como el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor del virus del sarcoma de Rous (VSR) o el promotor de la creatina quinasa muscular. Típicamente, la construcción de ADN puede incluir (además del ADN de Neuritina y un promotor), una secuencia de un vector obtenida de vectores tales como un vector adenovirus, un vector vírico adenoasociado, un vector retrovírico y/o un vector virus herpes. La construcción vector/ADN puede ser mezclada con vehículo(s) farmacéuticamente aceptable(s) para inyección.

Una cantidad eficaz de la(s) composición(es) de Neuritina para ser utilizada terapéuticamente dependerá de, por ejemplo, los objetivos terapéuticos tales como la indicación para la que está siendo utilizada la Neuritina, la vía de administración y la condición del paciente. Por consiguiente, será necesario que el terapeuta valore la dosis y modifique la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosificación diaria típica puede variar desde 0,1 \mug/kg aproximadamente hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Típicamente, el médico administrará la composición de Neuritina hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. La composición de Neuritina puede ser administrada por tanto como una dosis única o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de Neuritina) a lo largo del tiempo, o como una infusión continua a través de un dispositivo de implantación o catéter.

A medida que se realicen más estudios, surgirá información referente a los niveles de dosis apropiados para el tratamiento de diferentes condiciones en diferentes pacientes, y el técnico con una experiencia habitual, considerando el contexto terapéutico, el tipo de enfermedad bajo tratamiento, la edad y la salud general del receptor, será capaz de determinar la dosis apropiada. Generalmente, la dosificación estará entre 0,01 \mug/kg de peso corporal (calculando la masa de la proteína sola, sin modificación química) y 300 \mug/kg (sobre la base de lo mismo).

Las proteínas Neuritina, los fragmentos y/o derivados de las mismas pueden ser utilizados para tratar enfermedades y trastornos del sistema nervioso central o periférico que puedan estar asociados con alteraciones en el patrón de expresión de Neuritina o que puedan beneficiarse de la exposición a Neuritina o a anticuerpos anti-Neuritina.

La proteína Neuritina y/o los fragmentos o derivados de la misma, pueden ser utilizados para tratar pacientes en los cuales diferentes células del sistema nervioso central, autónomo o periférico se hayan degenerado y/o hayan sido dañadas por una enfermedad congénita, un trauma, un daño mecánico, cirugía, derrame cerebral, isquemia, infección, enfermedad metabólica, deficiencia nutricional, enfermedad maligna y/o agentes tóxicos. Más específicamente, los niveles de la proteína Neuritina pueden ser modulados (regulados por incremento o por disminución) para indicaciones tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral aminotrófica, síndrome de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Huntington, neuropatía periférica inducida por diabetes o por otra enfermedad metabólica y/o distrofias o degeneración de la retina neural tales como retinitis pigmentosa, retinopatías inducidas por fármacos, formas estacionarias de ceguera nocturna, degeneración progresiva de los conos-bastones y similares.

En otras realizaciones de la presente invención, la proteína o el péptido Neuritina o fragmentos o derivados de los mismos, pueden ser utilizados junto con una implantación quirúrgica de tejido en el tratamiento de enfermedades en las que está indicada la implantación de tejidos.

Depósito de ADN

Células de E. coli conteniendo el plásmido pCRScript SK+ en el que ha sido insertado el ADNc que codifica la Neuritina humana de longitud completa (aminoácidos 1-142), han sido depositadas en la ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU.) el 9 de Agosto de 1996 con el número de acceso 98134.

Los ejemplos siguientes tienen solamente fines ilustrativos, y no deben ser considerados de ninguna manera como limitantes del ámbito de la invención.

Ejemplos Ejemplo I Clonaje del ADNc de la Neuritina

Ratas macho (Wistar) de 8-10 semanas de edad aproximadamente (230-300 gramos de peso aproximadamente) fueron inyectadas peritonealmente con 8 mg/kg de peso corporal aproximadamente de kainato (preparado en una solución madre de 5 mg/ml de kainato en solución salina tamponada con fosfato [PBS]). Seis horas más tarde aproximadamente, los animales fueron sacrificados y se extrajo la región del girus dentado (GD) del cerebro y se almacenó en N_{2} líquido. El tejido del GD de 100 animales aproximadamente fue agrupado y se preparó ARN de este tejido mediante una modificación del método del tiocianato de guanidinio ("TCG"; Chomczynski y col., Anal. Biochem., 162:156 [1987]). Después de la lisis del tejido en TCG, siguieron dos extracciones con fenol y se realizó una extracción con cloroformo, y el ARN fue precipitado y resuspendido en H_{2}O. El ARN poli(A)+ fue seleccionado utilizando columnas de oligo-(dT)-celulosa (Clontech, Palo Alto, CA). Este ARN (y el ADNc correspondiente) es referido en la presente como ARN o ADNc de "GD activado".

Para el análisis de sustracción, la construcción de la biblioteca y el sondaje del ADNc (todos los cuales se describen más adelante), el ARN fue tratado con ADNasa (libre de ARNasa; Promega, Madison, WI) para eliminar cualquier ADN genómico contaminante.

El mismo protocolo descrito anteriormente fue utilizado para preparar ARN poli(A)+ de tejido de girus dentado normal y de tejido cerebral total de ratas macho de la misma edad que no fueron tratadas con kainato.

La primera hebra de ADNc fue sintetizada en dos reacciones de 50 \mul utilizando ARN poli(A)+ de GD activado preparado según se describió anteriormente. Cada reacción contenía 5 \mug de ARN aproximadamente en 30 \mul aproximadamente de tampón de transcriptasa inversa (Gubler y col., Gene, 25:263-269 [1983]), 1 \mul de ARNasa aproximadamente (4 \mug/\mul; Promega, Madison, WI), 1 \mug aproximadamente del cebador adaptador oligo-(dT)-XbaI (Promega, Madison, WI), 30 \muCi aproximadamente de ^{32}P-dCTP (3.000 Ci/mmol aproximadamente, Amersham, Arlington Heights, IL) y 400 \mu aproximadamente de transcriptasa inversa clonada de VLM (BRL; Grand Island, NY). Después de 60 minutos aproximadamente a 37ºC aproximadamente, el ARN fue hidrolizado durante 20 minutos aproximadamente a 68ºC aproximadamente mediante la adición de 10 \mul aproximadamente de NaOH (1 N), 2 \mul aproximadamente de EDTA (0,5 M) y H_{2}O hasta 100 \mul aproximadamente. El ARN fue luego colocado sobre hielo y neutralizado posteriormente con 10 \mul aproximadamente de HCl 1 M. Se añadieron 5 \mug aproximadamente de ARN de transferencia y la mezcla fue centrifugada a través de una columna de centrifugación de Sephadex G-50. La recuperación del ADNc fue determinada comparando la radioactividad del eluato de la columna con la de la muestra aplicada originalmente a la columna. Las dos muestras de ADNc fueron agrupadas, precipitadas en etanol con acetato de NH_{4} y resuspendidas a 10 ng/\mul aproximadamente en H_{2}O.

El ADNc fue mezclado con un volumen igual de ARN poli(A)+ de cerebro de rata total (1 \mug/\mul) acoplado previamente a biotina utilizando dos ciclos de fotobiotinilación (Clontech, Palo Alto, CA; ver Sive y col., Nucleic Acids Res., 16:10937 [1988]) y posteriormente precipitado en etanol con acetato de NH_{4}. Después de la resuspensión a 100 ng/\mul aproximadamente de ADNc y 10 \mug/\mul aproximadamente de ARN en tampón formamida (formamida 40%, Hepes 50 mM, pH 7,6, NaCl 0,5 M, EDTA 2 mM), la solución fue colocada en capilares de vidrio (de 25 \mul cada uno) que fueron sellados. Los capilares fueron incubados 3 minutos aproximadamente a 68ºC y luego durante dos días a 52ºC. Los capitales se abrieron rompiéndolos y el contenido cada uno de ellos fue añadido a 180 \mul aproximadamente de tampón (Hepes pH 7,6 50 mM, NaCl 0,5 M, EDTA 2 mM). Se añadió estreptavidina (Vector Labs, Burlingame, CA) a 1 \mug por \mul aproximadamente de ARN biotinilado y las mezclas se incubaron durante 10 minutos aproximadamente a temperatura ambiente. Después de la incubación, se llevaron a cabo dos extracciones en fenol/cloroformo (1 volumen:1 volumen) y una extracción en cloroformo. La fase acuosa recuperada contenía típicamente un 10-20% del ADNc total utilizado para el clonaje de sustracción. Este ADNc de hebra sencilla fue precipitado en etanol y resuspendido en 16 \mul de agua aproximadamente.

Se añadieron al ADNc 1 \mul aproximadamente de dATP (10 mM) y 4 \mul aproximadamente de tampón TdT 5 X (Boehringer Mannheim). Después de 3 minutos aproximadamente a 100ºC y enfriamiento sobre hielo, se añadió desoxinucleotidil transferasa terminal (17 \mul, Boehringer Mannheim, Alemania) y la mezcla se incubó durante 2 horas aproximadamente a 37ºC aproximadamente. Se añadieron 2 \mug del cebador adaptador oligo-(dT)-XbaI (Promega, Madison, WI) y la mezcla se incubó durante 5 minutos aproximadamente a 60ºC. La síntesis de la segunda hebra se llevó a cabo en 50 \mul aproximadamente de volumen total que contenía tampón Hepes 90 mM pH 6,6, MgCl_{2} 10 mM, los 4 desoxinucleótidos trifosfato a una concentración de 0,5 mM cada uno aproximadamente, DTT 10 mM aproximadamente y 10 U de Klenow (Boehringer Mannheim, grado para secuenciación). Después de 6 horas aproximadamente a temperatura ambiente, se añadió otra alícuota de enzima y la mezcla fue incubada durante tres horas adicionales. La reacción fue parada con extracciones en fenol y cloroformo, después de las cuales se añadieron 5 \mug de ARN de transferencia y el ADNc fue precipitado en etanol con acetato de NH_{4}. El ADNc de doble hebra fue resuspendido en 9,6 \mul aproximadamente de H_{2}O y digerido durante 5 horas a 37ºC con 10 U del enzima de restricción XbaI (Boehringer), después de lo cual fue cargado en un gel de agarosa al 1% fino y sometido a electroforesis. Se cortó una lámina de gel que contenía moléculas de ADNc mayores de 550 pares de bases ("pb") de tamaño aproximadamente, se extrajo el ADNc utilizando QIAEX (Qiagen Corp., Chatsworth, CA) y se determinó la recuperación (un 10% aproximadamente del ADNc sustraído total) mediante contaje de la radiactividad. Este ADNc fue ligado en los brazos del vector lambda-ZAP (Strategene, La Jolla, CA) que habían sido digeridos previamente con XbaI, y tratado con fosfatasa intestinal de ternera (Boehringer Mannheim). Las ligaduras se llevaron a cabo utilizando 1 \mul aproximadamente de brazos del fago y varias concentraciones de ADNc (3-20 ng). Las ligaduras fueron empaquetadas (Gigapack, Stratagene, La Jolla, CA) y se determinó el título del fago. La biblioteca fue sembrada a baja densidad, las placas individuales fueron recogidas separadamente y plásmidos en el vector pBluescript fueron escindidos del fago siguiendo el protocolo del fabricante (ver Short y col., Nucleic Acids Res., 16:7583-7600 [1988]). Posteriormente se preparó ADN plasmídico a partir de células de E. coli previamente transformadas con los plásmidos pBluescript utilizando procedimientos estándar de minipreparación (ver Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]). De dos a cuatro \mug aproximadamente de ADN plasmídico obtenido de la minipreparación fueron digeridos con XbaI y transferidos mediante transferencia Southern a filtros Hybond N+ (Amersham, Arlington Heights, IL) utilizando procedimientos estándar.

Con el fin de preparar sondas para someter a selección los filtros que contenían el ADNc, 100 ng aproximadamente de ADNc de hebra sencilla de cada tipo (control y GD activado) fueron radiomarcados mediante la adición al mismo de una mezcla que contenía 12 \mul aproximadamente de cebadores aleatorios (Boehringer; alrededor de 90 A_{260} U/ml), 2 mCi aproximadamente de ^{32}P-dCTP (3.000 Ci/mmol; Amersham, Arlington Heights, IL), 0,6 mM aproximadamente de cada uno de dATP, dTTP y dGTP y 40 \mul de Klenow (Boehringer; 2 U/\mul aproximadamente) en 800 \mul del tampón utilizado para la síntesis de la segunda hebra del ADNc (ver anteriormente). La incubación se llevó a cabo durante una noche a temperatura ambiente en 2 alícuotas de 400 \mul. Esta reacción tuvo como resultado sondas de 1,2 x 10^{9} cpm aproximadamente.

Después de al menos 6 horas de prehibridación a 42ºC aproximadamente en tampón de hibridación (ver más adelante), las transferencias de ADNc se hibridaron a las sondas. Una transferencia fue hibridada a sondas de GD activado y una transferencia duplicada fue hibridada a sondas control (ADNc de GD normal). Las hibridaciones fueron realizadas en una solución que contenía formamida 50%, SSCPE 5 X (Sambrook y col., 1989), Denhardt 10 X, SDS 0,5%, 0,5 mg/ml de ADN transportador de esperma de arenque y la sonda de ADNc a una concentración de 1 x 10^{8} cpm/ml aproximadamente. Las transferencias fueron incubadas durante 48 horas aproximadamente en un baño de agua a 42ºC con agitación. Después de la incubación, las transferencias fueron lavadas con SSC 0,1 X, SDS 0,2%, 3 veces durante 1 hora cada vez a 68ºC. Después de la exposición a una película, se seleccionaron aquellos clones de ADNc que hibridaban más potentemente con las sondas de GD activado que con las sondas control y se volvieron a someter a selección utilizando un segundo grupo de sondas de GD activado y de sondas control preparadas según se describió anteriormente. Aquellos clones que hibridaban más potentemente con la sonda de GD activado que con la sonda control en dos experimentos de selección separados, fueron secuenciados a partir de ambos extremos (200-300 pb aproximadamente desde cada extremo hacia el interior) utilizando métodos de secuenciación estándar, y estas secuencias fueron sometidas a una búsqueda mediante análisis con FASTA (Pearson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444-2448 [1988]) en GenBank y en otras bases de datos de ADN públicas. Sobre la base de la comparación de secuencias, varios clones parecían ser nuevos. Los clones que se refieren a la presente invención fueron denominados según sigue: #784; #1441; #2090; #2268; #2282; #7547; #8032; #6734 y #7761.

Con el fin de obtener clones de ADNc de longitud completa, se construyó una segunda biblioteca de ADNc a partir de ARN de GD activado utilizando métodos similares a los descritos anteriormente. La biblioteca fue producida según se describió anteriormente utilizando ARN poli(A) de GD activado y cebadores oligo-(dT)-XbaI (Promega), pero se seleccionaron solamente como insertos los ADNcs mayores de 1,5 kb. Esta biblioteca fue sembrada a alta densidad y transferida a filtros de nailon (S&S, Keene, NH). Se generó una sonda a partir del inserto de XbaI de 0,5 kpb aproximadamente del clon #1441 mediante el aislamiento de este fragmento de restricción de XbaI utilizando el Kit de Purificación de Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA) y siguiendo las recomendaciones del fabricante. El fragmento fue posteriormente marcado radiactivamente con \alpha-^{32}P-dCTP utilizando métodos estándar (RediVue, Amersham, Arlington Heights, IL). Los filtros fueron hibridados utilizando condiciones como las descritas anteriormente. A partir de este proceso de selección se identificaron varios clones positivos. Dos de los clones positivos, 1441-10 y 1441-13, fueron seleccionados ya que tenían los insertos más largos (1,6 kpb y 1,4 kpb aproximadamente, respectivamente). Estos dos clones fueron sometidos a análisis de la secuencia del ADN en ambas hebras utilizando el método de terminación de la cadena en didesoxi con didesoxinucleótidos fluorescentes (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). La secuencia de nucleótidos fue analizada utilizando el programa del Genetics Computer Group (University of Wisconsin, Biotechnology Center, Madison, WI).

Se encontró que el clon #1441-10 tenía un inserto de 1604 pb aproximadamente, y albergaba un marco de lectura abierto (ORF) largo que codificaba una proteína de 142 aminoácidos. El ADNc de longitud completa de este clon obtenido de tejido de rata, denominado Neuritina, está mostrado en la Figura 1 (SEC ID Nº:1). La secuencia de aminoácidos de la Neuritina de rata está mostrada en la Figura 3 (SEC ID Nº:3).

El ADNc de la Neuritina humana fue clonado utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (ADN polimerasa de Pwo y tampón; Boehringer Mannheim) bajo condiciones estándar que fueron según sigue: 5 minutos de desnaturalización a 94ºC seguido por 30 ciclos de: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 56ºC y 30 segundos a 72ºC utilizando los oligonucleótidos siguientes:

CTAGTCTAGAACCATGGGACTTAAG (SEC ID Nº:5)

GGTATAGTCGACCCGTGCTCAGAA (SEC ID Nº:6)

El molde para esta reacción de PCR fue ADNc de doble hebra que fue generado a partir de 2 \mug aproximadamente de ARNm cortical humano (Clontech, Palo Alto, CA) utilizando un Kit de Amplificación de ADNc Marathon (Clontech, Palo Alto, CA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los productos amplificados del tamaño pronosticado (435 pb aproximadamente) fueron subclonados en el vector de clonaje pCR-Script Amp SK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) y ambas hebras fueron secuenciadas utilizando métodos de secuenciación estándar. La secuencia del ADNc de la Neuritina humana está mostrada en la Figura 2 (SEC ID Nº:2). La secuencia de aminoácidos pronosticada de la Neuritina humana, basada en la traducción de la secuencia del ADNc, está mostrada en la Figura 4 (SEC ID Nº:4).

El análisis de la proteína Neuritina de rata y humana revela un supuesto péptido señal hidrofóbico aminoterminal de 24 aminoácidos aproximadamente. La cola de 27 aminoácidos C-terminal está enriquecida en residuos hidrofóbicos y contiene una señal de corte consenso encontrada típicamente en las proteínas GPI (glicosil fosfatidil inositol) ancladas a la membrana. La proteína madura unida a la membrana de 91 aminoácidos (12 kilodaltons aproximadamente) y 6 residuos de cisteína. Sin embargo, esta secuencia de aminoácidos no contiene homología de la secuencia general o incluso de motivos con ninguna proteína conocida, según se determinó por la búsqueda de secuencias en las bases de datos públicas de ADN y proteínas (SWISS-PROT, PROSITE, GENBANK y PIR), sugiriendo que representa una nueva clase o familia de moléculas.

Ejemplo II Preparación de la proteína Neuritina y de anticuerpos

Un ADNc de Neuritina de rata que codificaba los aminoácidos 30 a 113 de la Neuritina ("Neuritina 30-113") fue subclonado en el vector de expresión bacteriana pCFM1656 inducible por calor (número de acceso de la ATCC 69576) para amplificación y expresión de Neuritina 30-113. Se aislaron cuerpos de inclusión que contenían la Neuritina 30-113 mediante lisis de las bacterias en 3 ml de tampón de lisis (Tris 50 mM, pH, 8,0, EDTA 1 mM y NaCl 100 mM conteniendo 10 mg de lisozima y 10 mg de Na-desoxicolato) por gramo de bacteria. Las bacterias lisadas fueron tratadas con 400 \mug de ADNasa I durante 30 minutos a 1 hora y posteriormente centrifugadas a 12000 x g aproximadamente durante 15 minutos a 4ºC aproximadamente. Los cuerpos de inclusión aglutinados fueron lavados 2-4 veces en 9 volúmenes de tampón de lisis que contenía un 0,5% de NP-40. La pureza de la Neuritina 30-113 de los cuerpos de inclusión fue determinada mediante SDS-PAGE. Los cuerpos de inclusión purificados fueron solubilizados (1:20) en urea 8 M, Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM y ditiotreitol (DTT) 5 mM durante 1-2 horas a temperatura ambiente (TA). El material no soluble fue eliminado por centrifugación a 14 kg aproximadamente durante 10 minutos a TA. La urea fue dializada lentamente frente a 1 l del tampón descrito anteriormente utilizando el curso temporal y las concentraciones de urea siguientes (toda la diálisis se realizó a 4ºC): urea 8 M a 6 M, 1 hora; de 6 M a 4 M, durante una noche; de 4 M a 2 M, 1 hora; de 2 M a 1 M, 1 hora; de 1 M a 0,5 M,1 hora; de 0,5 M a 0,25 M, 1 hora; de 0,25 a 0 M, 1 hora. La Neuritina 30-113 replegada fue analizada en geles de SDS-PAGE no reductores.

Para preparar anticuerpos hacia Neuritina, el fragmento peptídico de Neuritina:

DCQEGAKDMWDKLRK (SEC ID Nº:7)

que comprende una región interna de la proteína Neuritina madura, fue sintetizado mediante métodos estándar y utilizado para la inmunización de conejos (preparado por Berkeley Antibody Company, Berkeley, CA), teniendo como resultado la producción de un antisuero policlonal denominado AS419. Se preparó también un segundo antisuero policlonal de conejo (denominado AMG20) preparado contra el fragmento Neuritina 30-113 expresado bacterianamente y purificado a partir de los cuerpos de inclusión solubilizados según se describió anteriormente (Cocalico Biologicals Inc., Reamstown, PA). El antisuero que reaccionaba específicamente en análisis de transferencia Western de Neuritina recombinante preparada en células CHO, fue purificado por afinidad utilizando esferas de sefarosa que contenían el péptido Neuritina inmovilizado apropiado (Pierce Chemicals, Rockford, IL) seguido por una columna de proteína A/G (Pierce Chemicals) para concentrar la preparación de anticuerpos.

Neuritina recombinante de rata y humano que incluía los aminoácidos 1-115 fue expresada en células de ovario de hámster chino (células CHO; número de acceso de la ATCC CRL-9096) mediante transfección de las células con el plásmido pGREG que contenía ADNc de Neuritina de rata o humana. El pGREG fue preparado a partir del vector de expresión de mamífero pDSR\alpha2 (descrito en la solicitud de patente PCT número WO 90/14363, publicada el 29 de Noviembre de 1990).

El pGREG contiene, desde el extremo 5' al 3', una secuencia que codifica un sitio del enzima de restricción XhoI, un sitio de corte de trombina (ver la SEC ID Nº:8), un epítopo del virus del herpes simple reconocido por un anticuerpo monoclonal de Novagen (Madison, WI) (ver la SEC ID Nº:9), un epítopo de hexa-histidina para cromatografía con quelatos de metal, un codón de parada y un sitio del enzima de rectricción SalI.

LVPRGS (SEC ID Nº:8)

QPELAPEDPEDVE (SEC ID Nº:9)

La marca VHS/His fue incorporada al pDSR\alpha2 mediante PCR alterna utilizando 4 oligonucleótidos solapantes en el extremo 3' de la Neuritina y el oligonucleótido 5' descrito anteriormente (SEC ID Nº:5). Como molde para la PCR, se utilizó p1441-10. Un oligonucleótido inicial específico para el extremo 3' de la región codificadora de la Neuritina de rata incorporaba el sitio de XhoI y el sitio de corte de trombina. Tres reacciones de PCR sucesivas incorporaron progresivamente la secuencia marcada al extremo C-terminal de la Neuritina de rata. El producto resultante fue subclonado en los sitios de XbaI y SalI de pDSR\alpha2. Se produjeron construcciones marcadas adicionales utilizando los productos de PCR que contenían sitios de restricción de XbaI y XhoI.

El ADNc humano que codificaba los aminoácidos 1 a 115 (y que carecía del péptido señal de GPI carboxi terminal) fue utilizado para expresar Neuritina humana secretada que contenía el sitio de corte de trombina, los epítopos del virus del herpes simple (VHS) y de hexa-histidina (His) en su extremo C. El ADNc de Neuritina humana que carecía del péptido señal de GPI (esto es, que codificaba los aminoácidos 1-115) fue generado mediante PCR utilizando condiciones estándar y los oligonucleótidos siguientes:

CTAGTCTAGAACCATGGGACTTAAG (SEC ID Nº:10)

GGTATACTCGAGCCCGTTGCCGCT (SEC ID Nº:11)

El producto de 373 pb resultante fue subclonado en los sitios de XbaI y XhoI de pGREG. El vector resultante es denominado pDSR\alphahv15Tag.1. La marca de hexa-histidina permitía una purificación fácil de la Neuritina en una resina que contuviera níquel (Ni^{2+}) (Qiagen Inc., Chatsworth, CA).

Se preparó medio condicionado de CHO/Neuritina según sigue. Botellas rotatorias que contenían células CHO que expresaban de manera estable la versión de Neuritina 1-115 humana marcada (denominada hu15t36) fueron incubadas hasta un 80 por ciento de confluencia aproximadamente (alrededor de 48 horas) en Medio Mínimo Esencial de Dulbecco (DMEM) sin suero. El medio condicionado fue recogido eliminando por aglutinación los desechos celulares mediante centrifugación a 2500 x g aproximadamente; el sobrenadante fue almacenado a -20ºC. La Neuritina fue purificada por lotes mediante la incubación de 1 ml de resina Ni^{2+}/NTA equilibrada en PBS/100 ml de medio condicionado (proveedor de la resina Ni^{2+}/NTA: Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Las proteínas no específicas fueron eliminadas mediante lavado de la resina con tampón de lavado (Na-fosfato 20 mM, pH 6,0, y NaCl 500 mM) que contenía cantidades crecientes de imidazol (20, 40, 80 y 100 mM). La Neuritina marcada con VHS-His que se unía específicamente fue eluida con imidazol 500 mM. La proteína purificada (más de un 95 por ciento de pureza mediante SDS-PAGE y tinción con plata [BioRad Laboratories, Hercules, CA]) fue concentrada alrededor de 10 veces y diafiltrada (Millipore Corp., [Ultra-free 15, corte de peso molecular 5 K] Bedford, MA) en PBS 1 X. Se calculó que la concentración final de proteína era de 30-50 ng/ml mediante la utilización del ensayo de proteínas de Bio-Rad/Lowry con seroalbúmina bovina como estándar.

Ejemplo III Expresión tisular de Neuritina A. Análisis de transferencia Northern

Para determinar el patrón de expresión de Neuritina, se compró a Clontech (Palo Alto, CA) una transferencia Northern que contenía ARN de diferentes tejidos de rata, incluyendo corazón, cerebro, bazo, pulmón, hígado, músculo, riñón y testículo y se sondó con sondas de ARNc marcado con ^{32}P. Las sondas de ARNc fueron generadas a partir de ADNc de Neuritina de rata subclonado en pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) según sigue. Se obtuvo un fragmento de 430 pb aproximadamente del clon 1441-10 de Neuritina mediante la digestión del clon con PvuII y SmaI. Este fragmento fue subclonado en el plásmido pBluescript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) que pasó a denominarse entonces cpg15subclone#2. Para generar una sonda de ARN antisentido, el plásmido fue linealizado con BamHI, después de lo cual se llevó a cabo la transcripción in vitro utilizando polimerasa de T7 (Promega, Madison, WI) y ^{32}P-UTP.

La cantidad de ARN en cada transferencia fue determinada monitorizando la tinción con bromuro de etidio del ARN separado por tamaños y se confirmó mediante la hibridación de las transferencias con un fragmento de ADNc de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) marcado y cebado aleatoriamente.

El análisis Northern (ARN), según se muestra en la Figura 5A, identificó una única banda de ARNm de 1,6 kilobases aproximadamente expresada en el cerebro de rata; se observó una banda de mucha menor intensidad en el tejido pulmonar y había poca o ninguna hibridación al ARNm de otros tejidos.

Para determinar la expresión de Neuritina en varias regiones del cerebro, ratas adultas fueron inyectadas intraperitonealmente con 8 mg/kg aproximadamente de una solución madre de 10 mg/ml de ácido kaínico en PBS. Después de 6 horas aproximadamente, las ratas fueron sacrificadas y se disecó el tejido cerebral. Se aisló ARN de varias regiones del cerebro utilizando 1 ml aproximadamente de tampón de lisis con isotiocianato de guanidinio (Chomczynski y col., Anal. Biochem., 162:156 [1987]) por 100 mg de tejido pulverizado. Después de la lisis, la solución fue pasada sobre columnas con una membrana de gel de sílice (columnas RNeasy spin, Qiagen, Chatsworth, CA). El ARN fue fraccionado por tamaños mediante separación en geles de agarosa formaldehído 0,8-1 por ciento y transferido capilarmente a membranas de nailon (Hybond-N, Amersham, Arlington Heights, IL). Las transferencias Northern fueron sondadas con sondas de ARNc marcado con ^{32}P según se describió anteriormente. Como puede observarse en la Figura 5B, la región del girus dentado del cerebro tenía el nivel de expresión de Neuritina más elevado.

B. Hibridación in situ e inmunohistoquímica

Se llevaron a cabo hibridación in situ e inmunohistoquímica en secciones de tejido embrionario de rata y de tejido de cerebro de rata adulta que estaban fijadas en paraformaldehído e incluidas en parafina, según sigue. Embriones de ratas preñadas fueron aislados y fijados durante una noche en paraformaldehído al 4% en PBS reciente (PFA 4%/PBS) a 4ºC antes de la deshidratación y de la inclusión en parafina. Los cerebros de rata adulta fueron preparados mediante perfusión transcardíaca de animales anestesiados con paraformadehído al 4% en PBS. Los cerebros disecados fueron fijados posteriormente durante una noche a 4ºC en paraformaldehído al 4% en PBS, deshidratados e incluidos en parafina. La hibridación in situ sobre estas secciones de tejido se realizó de acuerdo con métodos establecidos (Simonet y col., J. Biol. Chem., 11:8221-8229 [1993]) utilizando una sonda de ARNc de Neuritina de rata preparada según se describió anteriormente para las transferencias Northern, excepto en que se utilizó ^{35}S-UTP en lugar de ^{32}P-UTP. Los cortes hibridados fueron expuestos a una emulsión fotográfica de Kodak y revelados después de 3-6 semanas, tiempo después del cual las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina, y los granos de plata fueron visualizados utilizando una óptica de campo oscuro.

La localización inmunohistoquímica de la Neuritina fue realizada utilizando diluciones variables de antisueros purificados por afinidad (AS419 o AMG20, descritos anteriormente), específicos para la Neuritina recombinante humana preparada en células de mamífero, sobre secciones de tejido fijadas en PFA desparafinizadas. El anticuerpo hacia Neuritina unido fue detectado con anti-inmunoglobulina de conejo producido en cabra biotinilado y avidina marcada con peroxidasa de rábano picante, utilizando el kit de tinción Vectastain Elite ABC (Vector Labs, Burlingame, CA) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes.

El análisis de hibridación in situ mostró que estaba presente ARNm de Neuritina en el límite entre el neuroepitelio y la zona en diferenciación del cerebro de rata en desarrollo tan temprano como en el día 14 embrionario (E14). El mensaje fue también localizado en las estructuras neuronales en desarrollo de la periferia, incluyendo los ganglios de la raíz dorsal y los ganglios del trigémino. La expresión parecía incrementar a lo largo del desarrollo, y parecía resultar más concentrada dentro de la zona en diferenciación ya que las estructuras individuales en el SNC están más definidas.

Se detectó ARNm de Neuritina en la mayoría de las estructuras del cerebro adulto. Las señales más abundantes se encontraron en las capas II-IV del córtex, en la formación del hipocampo, en el tálamo, la habénula y el tronco cerebral. En el hipocampo, la expresión estaba concentrada en las neuronas de la capa de células piramidales y granulosas, encontrándose niveles abundantes en las neuronas del subículum y de la región hilar del dentado. En el cerebelo, los bajos niveles de mensaje de Neuritina estaban localizados en la capa de células granulosas con un marcaje punteado disperso de las células de Purkinje.

La tinción inmunohistoquímica de los tejidos cerebrales utilizando los anticuerpos hacia Neuritina AS419 o AMG20 descritos anteriormente, muestra que la Neuritina está concentrada en los cuerpos celulares neuronales y dispersa irregularmente a lo largo de las proyecciones neuríticas en las regiones no mielinizadas del cerebro. La tinción irregular tiene como resultado una apariencia granular de las regiones inmunorreactivas, y es particularmente evidente a lo largo de las proyecciones de las neuronas del complejo subicular del hipocampo. La concentración de Neuritina a lo largo de las neuritas está también documentada en la tinción de los árboles dendríticos de las células de Purkinje positivas. La región hilar del GD contiene células potentemente inmunorreactivas dispersas que se correlacionan con el patrón observado mediante la hibridación in situ del ARNm de la Neuritina. La tinción irregular de las neuronas de Purkinje se correlaciona también con la localización puntuada del mensaje.

Ejemplo IV Bioquímica de la Neuritina y regulación de la expresión

La secuencia de aminoácidos del extremo carboxi de la Neuritina sugería la posibilidad de que la Neuritina estuviera anclada a la membrana. Para evaluar esta posibilidad, 1 x 10^{6} células CHO aproximadamente transfectadas con un plásmido vacío (denominado "parental" y sin contener el gen de la Neuritina) o con un plásmido que contenía el gen que codifica la Neuritina humana, fueron tratadas con 0,4 U/ml aproximadamente de PI-PLC (fosfatidil inositol-fosfolipasa C; Calbiochem, La Jolla, CA) preparada en 0,5 ml de tampón de liberación (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, glucosa 10 mM, sacarosa 250 mM), o con tampón de liberación solo (sin PI-PLC), siguiendo métodos publicados (Kodukula y col., J. Cell Biol., 120:657 [1993]). Después de la incubación, las células fueron centrifugadas para precipitar los desechos celulares. Los sobrenadantes fueron analizados mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Después de la electroforesis, los geles fueron transferidos a papel de nitrocelulosa y sondados con antisueros purificados por afinidad específicos de Neuritina. Los resultados están mostrados en la Figura 8A. Como puede observarse, toda la Neuritina detectable se encontraba en los sobrenadantes de las células CHO que expresaban Neuritina y que habían sido tratadas con PI-PLC, sugiriendo que la Neuritina está en efecto anclada a GPI.

El análisis de esta Neuritina anclada a GPI endógena se realizó extrayendo el tejido con el detergente Triton X-114 (Calbiochem, San Diego, CA) de acuerdo con el método descrito por Borchelt y col. (Glycobiol., 3:319 [1993]) para obtener Neuritina nativa. Se suspendieron 100 mg aproximadamente de tejido pulverizado en 0,5 ml de tampón TNE 1 X (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM) con inhibidores de proteasas (benzamidina 0,5 mM, PMSF 1 mM y 1 \mug/ml de cada una de pepstatina, leupeptina, aprotinina) y se mezclaron a 4ºC con 0,25 volúmenes aproximadamente de Triton X-114 preequilibrado con TNE 1 X. Las proteínas solubles en Triton X-114 fueron extraídas de la solución mediante incubación de la mezcla a 30ºC durante 15 minutos aproximadamente, seguido por centrifugación a 3000 g aproximadamente durante 5 minutos a temperatura ambiente para precipitar las grandes micelas de detergente que contenían las proteínas lipofílicas. Se repitió esta extracción y las fracciones solubles que contenían detergente fueron agrupadas. Para analizar las proteínas extraídas mediante transferencia Western, alícuotas de 20-40 \mul de las fracciones del detergente fueron precipitadas mediante incubación de cada alícuota con 10 volúmenes de metanol (10 minutos a 4ºC seguido por centrifugación a 14.000 g durante 15 minutos a 4ºC). La pella precipitada fue resuspendida en 40 \mul aproximadamente de tampón de muestra para SDS-PAGE (que contenía beta-mercaptoetanol), y fraccionada por tamaños en un gel de SDS al 16 por ciento-PAGE (Novex, San Diego, CA). Después de la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a un papel de nitrocelulosa utilizando procedimientos estándar de transferencia Western. La Neuritina fue detectada utilizando antisueros purificados por afinidad específicos de Neuritina (AS419 o AMG20, descritos anteriormente) como primer anticuerpo, y un anti-antisuero de conejo producido en cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante como segundo anticuerpo (diluido 1:10^{4} aproximadamente, obtenido de Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama). El anticuerpo fue detectado utilizando quimioluminiscencia incrementada sensible a peroxidasa ("ECL", Amersham, Arlington Heights, IL). Los resultados están mostrados en la Figura 8B. Como es obvio, las regiones del córtex y del hipocampo del cerebro expresaban los niveles más elevados de Neuritina. En la Calle 1 se muestra la Neuritina procedente de células CHO recombinantes, preparada según se describió anteriormente utilizando PI-PLC, como comparación. La diferencia en la migración de la Neuritina en las calles de la transferencia Western es debida presumiblemente a una movilidad alterada de la Neuritina a la que está unido algún lípido.

Para investigar la regulación de la expresión del ARNm de la Neuritina, se añadió BDNF humano recombinante, NT-3, NGF o FGF (10 ng/ml aproximadamente), KCl (50 mM aproximadamente), o los bloqueantes de canales de calcio AMPA o NMDA (10 \muM aproximadamente) a cultivos de hipocampo o de córtex de rata E18 7DIV preparados según se describe más adelante en el Ejemplo V. Se aisló ARN de cada cultivo después de seis horas de incubación aproximadamente mediante el método RNeasy (Qiagen, Chatsworth, CA). Alrededor de 5 \mug de este ARN fueron cargados en un gel, separados por electroforesis y sometidos después a transferencia Northern. La transferencia fue sondada con una sonda ARNc de Neuritina de rata que incluía la región codificadora (descrita anteriormente). Los resultados están mostrados en la Figura 6A. Como puede observarse, el tratamiento con NMDA y AMPA tuvo como resultado un incremento de 5 veces aproximadamente de los niveles de ARNm de Neuritina, y se observó una magnitud de inducción similar con concentraciones despolarizantes de KCl.

Para evaluar el efecto de BDNF sobre los niveles de expresión de Neuritina in vivo, se inyectó intraventricularmente a crías de rata en el día 4 post-natal BDNF (1-2 \mul de 10 mg/ml) o solución salina (control). Alrededor de seis horas después de la administración de BDNF o de solución salina, las crías fueron sacrificadas y se aisló el ARN total del tejido cerebral del córtex o del hipocampo. Como puede observarse en la Figura 6B, BDNF inducía el mensaje de Neuritina in vivo primariamente en el hipocampo, y en pequeño grado en el córtex.

Ejemplo V Ensayos de bioactividad de Neuritina

Se prepararon cultivos de neuronas primarias de hipocampo y córtex de embrión de rata disociando regiones cerebrales disecadas de embriones de rata en el día embrionario 18. La disociación y purificación de las neuronas embrionarias se llevó a cabo utilizando un kit para disociación de tejidos basado en papaína (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ). El tejido disecado de 10-30 embriones fue resuspendido en 2,5 ml de solución salina equilibrada de Earle (EBSS) que contenía: 50 unidades de papaína, L-cisteína 1 mM, con EDTA 0,5 mM y 500 unidades de ADNasa I. El tejido fue disociado durante 10-15 minutos con agitación suave. Las células disociadas fueron aglutinadas a 300 g durante 5 minutos, resuspendidas en 2,7 ml de EBSS, 0,3 ml de solución de ovomucoide inhibidora (10 mg/ml del inhibidor de proteasas ovomucoide y 10 mg/ml de seroalbúmina bovina) y 250 unidades de ADNasa I. La suspensión fue superpuesta sobre 5 ml de solución inhibidora ovomucoide y aglutinada a 70 g durante 6 minutos. Las células aglutinadas fueron resuspendidas en 10 ml de medio Neurobasal conteniendo B27 (Gibco/BRL, Grand Island, NY) y pasadas a través de un tamiz para células de nailon de 40 \mum de retícula (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). Para el análisis del ARN, las neuronas disociadas fueron sembradas en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos Falcon (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) prerrevestidas con poli-L-ornitina (obtenida de Sigma, St. Louis, MO, y utilizada a una concentración de 0,1 mg/ml aproximadamente en Na-Borato 150 mM, pH 8,4) y laminina (obtenida de Gibco/BRL, Grand Island, NY, y utilizada a una concentración de 1 \mug/ml en PBS aproximadamente). La siembra de las neuronas se realizó a una densidad de 2 x 10^{5} por cm^{2} aproximadamente para las neuronas de hipocampo y de 3 x 10^{5} por cm^{2} aproximadamente para las neuronas corticales. Las células fueron cultivadas en medio Neurobasal (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con suplemento B-27 1 X (Gibco/BRL, Grand Island, NY) y 50 mg/ml de sulfato de gentamicina (Gibco/BRL, Grand Island, NY). El contenido de células gliales de cada cultivo después de siete días de cultivo era inferior al cinco por ciento, según se determinó mediante recuento de las células positivas para la proteína ácida fibrilar glial (PAFG), las cuales fueron identificadas mediante tinción de inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo específico para este marcador específico de células gliales. Las células fueron tratadas según se describió después de 7 a 8 días de cultivo.

El ensayo de crecimiento de neuritas fue llevado a cabo utilizando neuronas de hipocampo y corticales preparadas según se describió anteriormente. Las células fueron sembradas en placas de 35 mm revestidas con poli-L-lisina (20 \mug/ml en PBS) a una densidad de 5 x 10^{3} células por cm^{2} aproximadamente en presencia o ausencia de Neuritina purificada en Ni^{2+} (preparada según se describió anteriormente). El crecimiento de neuritas fue determinado después de cuatro días de cultivo mediante tinción de los cultivos vivos con el colorante lipofílico no específico DiI (10 \muM, visualizado con un filtro de 565 nm), durante 30 minutos aproximadamente a 37ºC, seguido por 3 lavados en medio Neurobasal suplementado con B-27 (ver anteriormente) antes del análisis.

Para examinar la función biológica de la Neuritina, se produjo una versión de Neuritina marcada con histidina que carecía de los 27 aminoácidos carboxiterminales en células de ovario de hámster chino (CHO) y se purificó a partir de medio condicionado sin suero mediante cromatografía de afinidad con Ni^{2+} hasta más de un noventa por ciento de homogeneidad, según se determinó mediante tinción con plata de geles de SDS-poliacrilamida (ver anteriormente). Neuronas de hipocampo y corticales de embriones de rata E18 fueron sembradas en placas revestidas con poli-lisina en presencia de 150 ng/ml aproximadamente de esta Neuritina recombinante. Se añadió el mismo volumen a los controles utilizando una fracción de afinidad a Ni^{2+} equivalente derivada de medio condicionado de células CHO transfectadas con el vector de expresión vacío. Después de cuatro días en cultivo, las neuronas sembradas en presencia de Neuritina presentaban una extensa neuritogénesis en comparación con los cultivos control, según se muestra en la Figura 9. Las células tratadas con Neuritina tenían árboles de neuritas mucho más ramificados y un número incrementado de neuritas que se extendían desde el soma en comparación con las células control. Las células que se tiñeron de manera no específica con el colorante fluorescente lipofílico DiI, revelaban una sorprendente diferencia en la organización del soma y de los lamelipodios de las neuritias (Figura 9). Las células control no tratadas tenían cuerpos celulares aplanados y anchos lamelipodios, aparentemente desenfocados, a lo largo de la longitud o hacia el extremo de muchas neuritas, mientras que las células tratadas con Neuritina tenían cuerpos celulares bien diferenciados con finas extensiones bien definidas. Se observó una actividad neuritogénica similar con Neuritina bacteriana purificada.

Depósito del ADNc de Neuritina

El ADNc que codifica la Neuritina humana de longitud completa ha sido depositado en la ATCC (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, EE.UU.) el 9 de Agosto de 1996 con el número de acceso 98134.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): CESIONARIO: Amgen Inc.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVO NEUROGÉN

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: AMGEN INC.

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(B): CALLE: 1840 DEHAVILLAND DRIVE

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(C): CIUDAD: THOUSAND OAKS

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(D): ESTADO: CA

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): ZIP: 91320-1789

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatenIn Release #1.0, Versión #1.30

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/694.579

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(B): FECHA DE REGISTRO: 09 DE AGOSTO DE 1996

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: OLESKI, NANCY A.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 34.688

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: A-413

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1604 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:

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1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 435 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:

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2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 142 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:

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3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 142 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:

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4

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\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:5:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN SINTÉTICO"

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:

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\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGTCTAGA ACCATGGGAC TTAAG

\hfill

25

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN SINTÉTICO"

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:

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\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATAGTCG ACCCGTGCTC AGAA

\hfill

24

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:7:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:7:

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\sa{Asp Cys Gln Glu Gly Ala Lys Asp Met Trp Asp Lys Leu Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:8:

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\sa{ Leu Val Pro Arg Gly Ser}

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:9:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN SINTÉTICO"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGTCTAGA ACCATGGGAC TTAAG

\hfill

25

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "ADN SINTÉTICO"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATACTCG AGCCCGTTGC CGCT

\hfill

24

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Claims

1. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consta de:

(a): la molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº:1;

(b): la molécula de ácido nucleico de SEC ID Nº:2;

(c): una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEC ID Nº:3;

(d): una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEC ID Nº:4;

(e): una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es al menos un 70 por ciento idéntico al polipéptido completo de SEC ID Nº:3 o de SEC ID Nº:4; y

(f): una molécula de ácido nucleico que es el complemento de cualquiera de las (a)-(e) anteriores.

2. La molécula de ácido nucleico que es la SEC ID Nº:1.

3. La molécula de ácido nucleico que es la SEC ID Nº:2.

4. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEC ID Nº:3.

5. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de SEC ID Nº:4.

6. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

7. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 2.

8. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3.

9. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4.

10. Un vector que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 5.

11. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 6.

12. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 7.

13. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 8.

14. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 9.

15. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 10.

16. Un proceso para producir un polipéptido Neuritina que comprende las etapas de:

(b) aislamiento del polipéptido.

17. El proceso de la reivindicación 16, en el que el polipéptido es la SEC ID Nº:3 o la SEC ID Nº:4.

18. Un polipéptido Neuritina seleccionado del grupo que consta de:

(a) el polipéptido de SEC ID Nº:3;

(b) el polipéptido de SEC ID Nº:4; y

(c) un polipéptido que es al menos un 70 por ciento idéntico al polipéptido de (a) o (b).

19. Un polipéptido Neuritina que es el polipéptido de la SEC ID Nº:4 o un fragmento biológicamente activo del mismo que tiene actividad neuritogénica.

20. El polipéptido Neuritina de la reivindicación 19 que no posee una metionina aminoterminal.

\newpage

21. El polipéptido Neuritina de la reivindicación 20 seleccionado del grupo que consta de: aminoácidos 25-115; aminoácidos 1-115 y aminoácidos 1-113.

22. Un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente al polipéptido Neuritina humana de la SEC ID Nº:4.

23. El anticuerpo de la reivindicación 22 que es un anticuerpo monoclonal.